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Caracterizacin molecular de
la poli (A) polimerasa (EhPAP) en
Entamoeba histolytica
T E S I S
PRESENTA
NDICE
LISTA DE ABREVIATURAS
LISTA DE FIGURAS
iv
LISTA DE TABLAS
vi
RESUMEN
vii
ABSTRACT
viii
1.
INTRODUCCIN
1.1
1.2
Taxonoma de E. histolytica
1.3
1.4
Epidemiologa de la amibiasis
2.
ANTECEDENTES
2.1
eucariontes
2.2
10
11
12
14
2.3
poliadenilacin
16
2.4
20
20
21
21
22
22
22
2.5
23
24
2.5.2 Poliadenilacin
26
2.6
Readenilacin citoplsmica
28
2.7
30
2.8
31
2.8.1 Generalidades
31
35
2.9
36
36
38
39
2.10
41
44
46
48
JUSTIFICACION
OBJETIVOS
49
49
49
5 MATERIALES Y METODOS
50
50
50
52
53
5.3.2 Ligacin
56
56
57
58
59
61
62
63
64
66
66
67
69
69
70
6 RESULTADOS
73
6
73
81
81
6.2.2 Ligacin
84
87
90
92
95
95
96
97
7 DISCUSION
101
8 CONCLUSIONES
106
9 BIBLIOGRAFIA
108
LISTA DE ABREVIATURAS
3 UTR
regin 3 no traducida
5 UTR
regin 5 no traducida
aa
aminocidos
ATP
trifosfato de adenosina
cdk
cDNA
CTD
CF I m
CF II m
CPSF
CstF
DEPC
dietilpirocarbonato
DNA
cido desoxirribonucleico
DSE
DTT
ditiotreitol
dNTPs
didesoxinucletidos trifosfatados
dT
didesoxitimidina
EhPap
EhPgp5
EDTA
EC
extractos citoplsmicos
EN
extractos nucleares
8
FIP 1
G1
G2
GT
enzima guanililtransferasa
kb
kilobases
kDa
kiloDaltones
LB
MDR
microgramos
microlitros
micromolar
ml
mililitros
mM
milimolar
MT
enzima metiltransferasa
nt
nucletidos
OMS
PAGE
PAP
PAPB
pb
pares de bases
PBS
PCR
pre-RNAm
rpm
RNA
cido ribonucleico
RNAm
RNApol II
RNA polimerasa II
RNPsn
RT
transcripcin reversa
RTP
TAE
TBE
U1 RNPsn
U2 RNPsn
U2AF
USE
xg
gravedades
10
LISTA DE FIGURAS
13
15
19
25
27
32
33
40
42
43
47
51
54
74
76
79
80
82
83
85
86
88
89
12
91
93
94
98
100
13
LISTA DE TABLAS
45
77
14
RESUMEN
En eucariontes, la poliadenilacin del extremo terminal 3 del pre-RNAm es esencial
para el transporte, estabilidad y traduccin del RNAm. Se identific y se clon el gen
que codifica para la protena poli(A) polimerasa nuclear (EhPAP) en Entamoeba
histolytica. Mediante un alineamiento de secuencias de distintas PAPs de otros
eucariontes se demostr que EhPAP contiene una regin de unin al RNA y un dominio
cataltico central descritos en otras PAPs nucleares pertenecientes a la familia de las
nucleotidil transferasas. La EhPAP recombinante expresada en bacterias se us para
generar anticuerpos especficos, los cuales reconocieron dos isoformas de la EhPAP de
60 y 63 kDa en extractos nucleares y citoplsmicos en ensayos de Western blot. Por
ensayos de RT-PCR de la expresin el RNAm gen EhPap en las fases del ciclo celular
se observ un incremento en las fases G1 y S.
15
ABSTRACT
In eukaryotes, polyadenylation of pre-mRNA 3 end is essential for mRNA export,
stability and translation. Here we identified and cloned a gene codifying for putative
nuclear poly(A) polymerase (EhPAP) in Entamoeba histolytica. Protein sequence
alignments with eukaryotic PAPs showed that EhPAP has the RNA-binding region and
the PAP central domain with the catalytic nucleotidyl transferase domain described for
the other nuclear PAPs. Recombinant EhPAP expressed in bacteria was used to
generate specific antibodies, which recognized two EhPAP isoforms of 60 and 63 kDa in
nuclear and cytoplasmic extracts by Western blot assay. RT-PCR assay showed that
EhPap mRNA expression is about 10- and 7-fold increased in G1 and S phase,
respectively, through cell cycle progression.
16
1. INTRODUCCIN
1.1 Antecedentes histricos de la amibiasis
El trmino amiba proviene del griego amoibe que significa cambio (morfologa y
gran movilidad), de ah el nombre de la enfermedad conocida como amibiasis. La
amibiasis humana es una infeccin del tracto gastrointestinal producida por el parsito
protozoario Entamoeba histolytica al ser ingerido en agua o alimentos contaminados por
heces fecales (Schaudinn, 1903). Desde el siglo XVIII se consider una enfermedad
tropical, sin embargo, actualmente se sabe que es una enfermedad distribuida
mundialmente con predominio en las ciudades con grandes concentraciones humanas y
que ataca fundamentalmente a grupos con desnutricin y deficientes prcticas de
higiene.
17
18
19
Reino:
Protista
Subreino:
Protozoo
Phylum:
Sarcomastigophora
Superclase:
Rhizopoda
Clase:
Lobosea
Subclase:
Gymnamoebida
Orden:
Amoebida
Suborden:
Tubulina
Familia:
Entamoebidae
Gnero:
Entamoeba
Especie:
histolytica
20
piridina
(NAD/NADP)
transhidrogenasa
(PNT:
pyridine
nucleotde
transhydrogenase, por sus siglas en ingls), que es una protena de tipo mitocondrial,
junto con la enzima metablica, piruvato: ferrodoxin-oxidoreuctasa (POR) (Huber y
col.,,1988); y la alcohol dehidrogenasas ADH1, ADHE, ADH3 (Yang, 1994). Adems,
diferentes grupos de investigacin, han identificado una serie de pequeos organelos a
los cuales han llamado mitosoma, crypton (Tovar y col., 1999, Mai y col., 1999, Ghosh y
col., 2000) o Ehko (Orozco y col., 1997, Marchat y col., 2002), los cuales contienen DNA
y/o protenas especficas que comparten con algunas caractersticas biolgicas de la
mitocondria. La razn por la que se considera a este organelo una mitocondria
remanente, se ha predicho por la deteccin de los genes de las protenas
mencionadas que tienen como blanco la mitocondria en otros eucariontes (Ghosh y col.,
2000).
1.3
Los trofozotos, una vez en el intestino delgado, pueden tener diferentes destinos
los cuales podran estar relacionados por malos hbitos alimenticios, el alcoholismo, el
uso de esteroides y problemas del sistema inmune. Por lo tanto: 1) pueden habitar el
intestino grueso como comensal, dividirse y alimentarse de desechos orgnicos,
azcares y bacterias; 2) pueden invadir la mucosa intestinal produciendo disentera
amibiana aguda (con una duracin de 14 das) o crnica (ms de 15 das); 3) tambin
22
1.4
Epidemiologa de la amibiasis
23
24
Etapa infectiva
Etapa diagnstica
Ingesta de
quistes maduros
Excrecin en
heces fecales
Colonizacin no invasiva
Enfermedad intestinal
Enfermedad extraintestinal
Trofozotos
Salida del
husped
Multiplicacin
Desenquistamiento
Trofozotos
Quiste
25
1.1
de
stos
present
abscesos
hepticos
entre
1999-2000
(http://www.ssa.gob.mx).
2. ANTECEDENTES
2.1 Generalidades sobre la regulacin de la expresin gnica en eucariontes
En todos los seres vivos, la regulacin de la expresin gnica es de gran
importancia ya que de esta depende el buen funcionamiento del organismo. Con los
recientes anlisis de genomas de diferentes organismos, principalmente en eucariontes,
se
ha
observado
que
slo
una
pequea
fraccin
del
material
gentico,
aproximadamente el 1.5%, codifica para protenas, mientras que la mayor parte del
DNA genmico participa en la regulacin de la expresin gentica (Mignone, 2002). La
informacin gentica se encuentra contenida en el DNA nuclear y mitocondrial, la cual
se traduce a protenas por medio del RNAm, que es el encargado de llevar la
informacin contenida en el DNA, hacia afuera del ncleo. Es en este proceso en donde
se encuentran diversos niveles o puntos de control que regulan la expresin gentica.
En eucariontes, los principales puntos de control se dan a nivel de: i) la transcripcin,
que permite la sntesis del pre-RNAm (transcrito primario) a partir del DNA por medio de
la RNA polimerasa II (RNA pol II) y otros factores de transcripcin; ii) el procesamiento
del pre-RNAm, por medio del cual se genera un RNAm maduro funcional que pueda ser
traducido a protena; en este procesamiento se incluye principalmente el capping, el
26
27
28
29
30
Sitio de splicing 5
pre-RNAm
Sitio de ramificacin
Sitio de splicing 3
Regin
rica en Py
(~15b)
Frecuencia
(%)
31
32
33
Producto ligado
RNAm
34
2.3
El procesamiento de la 3UTR del pre-RNAm, requiere de secuencias cisreguladoras, las cuales se han estudiado ampliamente en eucariontes superiores (Zhao,
1999; Colgan, 1997; Wahle, 1995; Wahle 1999) y estas incluyen:
35
3. El elemento ro abajo (DSE: down stream element por sus siglas en ingls), rico
en GU/U, est localizado de 20-40 nt ro abajo del sitio de corte. Esta secuencia
slo est presente en un 70% de los pre-RNAm de mamferos. Este elemento no
es tan conservado y puede ser de dos tipos: un elemento rico en U y un
elemento rico en GU. El elemento rico en U es una cadena corta de residuos de
U, mientras que el elemento rico en GU tiene el consenso YGUGUUYY (Y =
pirimidina). Esta secuencia DSE puede tener slo uno de estos elementos, o
ambos, que en este caso trabajan juntos sinrgicamente. Sin embargo, algunos
elementos ro abajo no contienen ninguno de estos dos motivos. Mutaciones
puntuales en cualquiera de estos elementos no alteran su funcin, sin embargo,
si se pierden grandes fragmentos de esta secuencia, se puede inhibir su funcin
al no ser identificada por los factores de procesamiento del 3 terminal. La
proximidad de estas secuencias ro abajo del sitio de poliadenilacin pueden
afectar la posicin del sitio de corte y la eficiencia del mismo.
36
1.
Un elemento posicionador (PE: Position element, por sus siglas en ingls) rico
en A que funciona como la seal de poliadenilacin representada por la
secuencia AAUAAA, la cual puede ser no conservada y presentar una
variante que es AAAAAA y se localiza de 10 a 30 nt ro arriba del sitio de
corte. Slo un 50% de todos los RNAm la presentan (Wahle y Seller, 1992)
2.
3.
4.
37
38
Mamferos
STOP
10-30 nt
30 nt
USE
SP
Sitio Poli(A)
DSE
U-rica
AAUAAA
CA
U/GU-rica
3 UTR
S. cerevisiae
STOP
10-30 nt
EE
PE
Sitio Poli(A)
UAUAUA
AAUAAA
Py(A)n
AAAAAA
3 UTR
39
40
41
42
cuales se sabe que tambin participan como coactivadores del la RNA polimerasa II en
humano.
por
las
protenas
Cft1p/Yhh1p,
Cft2p/Ydh1p,
Brr5/Ysh1p
Yth1p,
43
45
RN
Po A
lI
I
CPSF
160
STOP
5
AAUAAA
CT
D
30 K
77K
64 K
50 K
rica G/U
CstF
73K
PAP
FIP1
100 K
25
CIP1
72
CA
68
Sitio de
corte
59
CF I
PcfII
CF II
46
CTD (McCracken y col., 1997). Cuando la RNA pol II identifica la seal poliadenilacin
AAUAAA en el pre-RNAm que se est sintetizando, existen dos posibles mecanismos
de cmo participa este factor en el procesamiento del extremo 3 (Li y col., 2001):
1) CPSF y CstF se disocian del CTD y se unen a las secuencias AAUAA y DSE
rica en GU del RNAm, respectivamente, para iniciar el corte del extremo 3
(Dantonel y col., 1997; McCracken y col., 1997) bien
2) CPSF y CstF permanecen asociados con el CTD, ya que ste tambin
participa en el corte del extremo 3 (Hirose y Manley, 1998)
2.5.2 Poliadenilacin
Inmediatamente despus del corte se inicia la poliadenilacin, donde la protena
PAP que contina unida al CPSF, comienza a agregar adeninas en el extremo 3. La
adicin de los primeros 10 residuos de adeninas se lleva a cabo con lentitud, a partir de
la cual le sigue una polimerizacin rpida de hasta 250 residuos de adenosina extras.
(Zhao y col., 1999). Tambin es necesaria la PABP II que se une a la cola de adeninas,
formando un complejo cuaternario junto con las protenas CPSF, PAP y el sustrato de
RNA. Esta protena estabiliza la unin de PAP al RNA en el extremo 3 y da soporte a
la sntesis de la cola de poli(A), al unirse a 10 adeninas del tracto recin sintetizado.
Adems de que facilita la agregacin de adeninas, permitiendo que sea ms rpida
(Bienroth y col., 1993) (Fig. 6). El RNAm maduro sale del ncleo ayudado por las
protenas que interactan con el cap del extremo 5 y la cola de poli (A) que son las
47
48
CPSF
160
30 K AAUAAA
STOP
PAB
100 K
P1
CI
PAP
II
73K
I
fI
Pc
II
A
AA
AA
AA
AA
AA
AA
CF
160
PAB
PAP
II
AA
AA
A
A
AA
A
A
AA
A
A
AAA
AAA
A
AAAAAA
A
A
AAAAAA
A AAA
49
encargadas del transporte del RNAm y guiarlo hacia el citoplasma para ser identificado
por los ribosomas y ser traducido a protenas. Una vez que el RNAm se encuentra en
citoplasma y es traducido, comienza a ser degradado progresivamente por medio de
ribonucleasas especficas. Este proceso lo podemos dividir en tres fases principales:
50
51
54
Dominio
central cataltico
Dominio de
unin al RNA
HsPAP
689 aa
F/YGS DD
CK2 CK2
cAMP
NLS1
NLS2
55
56
57
duplicacin
gnica,
procesamiento
alternativo
de
RNA
modificaciones
58
2.9
63
64
Ciclina B
Ciclina D
Cdk 2
Cdk 4, 6
E2F Rb
E2F
Rb
Ciclina A
Ciclina E
Cdk 2
Cdk 2
65
RNAm del gen de la PAP durante la fase M del ciclo celular puedan tambin generar
este fenmeno.
66
67
Genmico
Genmico
Genmico
Genmico
Genmico
Genmico
Genmico
Genmico
68
Figura 11. Esquema de las secuencias cis-reguladoras del procesamiento del preRNAm en E. histolytica. La seal de poliadenilacin se localiza de 10-30 nt ro arriba del
sitio de corte y poliadenilacin. Se localizan 2 secuencias ricas en U, una est
localizada ro arriba del sitio de corte y la otra se encuentra de 3-30 nt ro abajo del sitio
de corte. El codn de paro (TAA) est remarcado (lnea superior roja)
69
Codn
de paro
variable
pre-RNAm
UAAUU
UA(A/U)UU
Seal de
poliadenilacin
10-30 nt
3-30 nt
Rica en
N
U
Rica en
U
Sitio de
poliadenilacin
70
1)
o con alguna
3)
4)
72
Protena
Nmero
de acceso b
Valor E
Prote na
Nmero
de acceso b
Valor E
nd: no determinado
a TIGR Banco de informaci n del proyecto de secuenciaci n genmica de la E. histolytica
b Banco de datos Swiss -Prot/TrEMBL
c Participaci n en el procesamiento del extremo 3 terminal del pre -RNAm no ha sido estudiado experiementalmente
experiemntalmente
Protena
73
Figura 12. Modelo de la maquinaria del procesamiento del extremo 3 del pre-RNAm E.
histolytica. (A) Reconocimento de la seal de poliadenilacin por medio del CPSF, PAP
y Fip1. (B) EhCstF se une a la secuencia rica en U, localizada ro abajo del sitio de
poliadenilacin y se une a la subunidad 160 del CPSF. Los factores de corte CFIm y
CFIIm reconocen el sitio de poliadenilacin y realizan el corte. (C) Despus del corte,
PAP se une al CPSF para sintetizar la cola de poli (A). Las interacciones entre estas
protenas y el RNA son hipotticas.
74
rica U
Seal de
poliadenilacin
rica U
rica U
Sitio de
corte
rica U
rica U
rica U
Degradacin
75
JUSTIFICACION
En eucariontes se sabe que el procesamiento del extremo 3 del pre-RNAm es un
76
OBJETIVOS
5.
MATERIALES Y METODOS
Molecular
Evolutionary
Genetics
Analysis:
MEGA
79
TA-EhPAP
Secuenciacin
de la EhPAP
pRSET-EhPAP
Secuenciacin
Anlisis in silico de
la secuencia de protenas
Induccin de la expresin de
EhPAP recombinante en E. coli
Trofozotos de la clona
L6 sincronizados en el
ciclo celular
Purificacin de la
EhPAP recombinante
Trofozotos
clona A
Extraccin
RNA total
RT-PCR
Generacin de
anticuerpos en ratones
Extractos
nucleares y
citoplsmicas
Western
blot
80
clonacin mltiple. El inserto se clona ro abajo del promotor T7 el cual se activa por
medio de la T7 RNA polimerasa, que es producida por las bacterias BL21(DE3) pLysS
en presencia de IPTG (isopropil -D-thiogalactoside) adems de producir la lisozima T7
que reduce la expresin basal del gen clonado. El inserto se clona en marco de lectura
abierta con una secuencia nucleotdica que codifica para un tracto de 6 histidinas
(6xHis tag) en el extremo NH2 de la protena recombinante. Este tracto de histidinas
funciona como un dominio de unin al metal Niquel y permite purificar posteriormente la
protena recombinante mediante cromatografa de afinidad. El vector pRSET contiene
genes de resistencia a antibiticos (ampicilina y cloranfenicol) que permiten la seleccin
de las bacterias que contienen el plsmido (Fig. 14).
se
82
Figura 14. Esquema del vector pRSET-A. Diseado para una alta expresin y
purificacin de protenas de genes clonados en bacterias E.coli, ya que presenta un
promotor T7 (PT7), un codon de inicio de la transcripcin (ATG), un tracto de
polihistidinas (6xHis), una secuencia del gen 10 del fago T7 estabilizador el transcrito
(Xpress epitope) un sitio de unin a ribosomas (RBS) y una secuencia de
reconocimiento del corte de enteroquinasa (EK por sus siglas en ingls), adems del
sitio de restriccin mltiple (MCS) y el codon de paro. Presenta adems un gen de
resistencia a antibiticos (ampicilina)
83
84
85
5.3.2 Ligacin
Una vez que se obtuvo el gen EhPap y el plsmido pRSET-A cortados y
purificados, se realiz la ligacin. Se prepar la siguiente mezcla: 50 ng de plsmido
pRSET-A linearizado, 80 ng de inserto EhPap, 2 l de amortiguador 10X de la ligasa, 2
l de ligasa T4 (1U/l, Invitrogen) y 2l de agua, en un volumen final de 20 l. La
mezcla se incub durante toda la noche a una temperatura de 15C. Para comprobar
que hubo una correcta ligacin del gen EhPap en el plsmido pRSET-A, se
transformaron bacterias E. coli (DH5) competentes con la mezcla de ligacin y se
seleccionaron las clonas que crecieron en las placas de LB ampicilina. Finalmente, se
obtuvo el DNA plasmdico mediante minipreparaciones de DNA y se analiz la
presencia del inserto mediante restriccin enzimtica.
86
87
Se hicieron
88
89
alcanzar una
90
91
(DE3) pLysS junto con el mismo volumen de un amortiguador 2X (2.5ml de Tris-HCl 0.5
M pH 6.8, 0.4 mg de SDS, 2 ml de glicerol, 200 l de -mercaptoetanol y 0.1 mg de azul
de bromofenol en un volumen final de 10 ml), se calentaron a 100C durante 5 minutos
para desnaturalizar a las protenas. Tanto los componentes del amortiguador como el
glicerol, adems de ayudar a la desnaturalizacin de las protenas, permiten que las
muestras se mantengan juntas y no floten; mientras que el colorante permite observar
la migracin de las protenas en el gel y saber en que momento detener la
electroforesis. Tambin se cargaron 10 g de marcador de peso molecular para
protenas preteido (Invitrogene). La electroforesis se realiz con una corriente de 100
V durante 1h 30 min aproximadamente. El gel se ti con azul de Coomasie (0.25 g de
Coomassie R-250, 250 ml de metanol y 35 ml de cido actico en un volumen final de
500 ml) durante 20 min y se aclar con una solucin desteidora (Etanol 150 ml, Ac.
actico 50 ml, y agua bidestilada 300 ml) hasta visualizar las bandas proticas (Ausubel
1994).
protena
EhPAP
recombinante
fue
purificada
bajo
condiciones
desnaturalizantes mediante cromatografa de afinidad, usando columnas de agarosaniquel (Ni-NTA) de Qiagen, las cuales interaccionan con el tracto de histidinas en el
extremo amino de la EhPAPr. A cada una de las pastillas obtenidas del cultivo masivo,
se le agregaron 5 ml de buffer de lisis (NaH2PO4 100mM, Tris-Cl 10mM, Urea 8M, pH
8), se dejaron en agitacin durante una hora aproximadamente para lisar a las bacterias
y liberar las protenas. Se centrifug durante 30 min a 10,000 x g a temperatura
92
ambiente para que todos los detritos bacterianos se quedaron en las paredes y el fondo
del tubo cnico y separarlos de las protenas contenidas en el buffer de lisis, el cual se
recuper. El sobrenadante se pas por la columna siete veces para que se uniera la
EhPAPr al niquel y despus se lav dos veces con 4 ml de buffer de lavado (NaH2PO4
100mM, Tris-Cl 10mM, Urea 8M pH 6.3) para eliminar las protenas que no se unieron a
la columna o que tuvieron una unin inespecfica. Se eluyeron protenas de unin dbil
a la columna de niquel (protenas pequeas generalmente) con 2 ml de buffer D (pH
5.9) y la EhPAPr se eluy finalmente con 2 ml de buffer E (NaH2PO4 100mM, Tris-Cl
10mM, Urea 8M pH 4.5). Las fracciones as obtenidas se analizaron por SDS-PAGE al
10% para comprobar la purificacin de la EhPAPr y su identidad se confirm por
Western blot con el anticuerpo de ratn antihistidinas.
5.7
5.8
94
por ella corre un plexo sanguneo. La sangre obtenida en la pipeta Pasteur se coloc en
tubos eppendorf con la ayuda de un bulbo, cuidando de no expulsarla muy
violentamente para no lisar a los eritrocitos. La sangre obtenida se incub a 37C
durante 1hr. El cogulo que se form en la superficie del tubo eppendorf se separ de
las paredes con un palillo de madera para obtener una mayor cantidad de suero. Se
centrifugaron a 1,500 rpm durante 5 min y se separ el suero de los eritrocitos en
eppendorfs nuevos. Se hicieron alcuotas y se guardaron a -20 hasta su utilizacin.
95
5.9
colchicina (Orozco 1983, 1988), la cual se us para medir la expresin del RNAm de
EhPap en el ciclo celular. Los trofozotos de las clona A y L6 se cultivaron en medio
TYI-S-33 complementando con 20% de suero fetal bovino y 6% de la mezcla de
vitaminas a 37 C(Diamond 1978).
96
97
suave en una solucin de PBS pH 7.4 (NaCl 137mM, KH2PO4 1.47 mM, NaH2PO412
H2O 6.47 mM y KCl 2.68 mM) con Tween-20 al 0.05% y leche descremada al 5%. La
membrana as bloqueada se guard a -20 C o bien se incub toda la noche a 4C con
agitacin suave con el primer anticuerpo diluido en PBS-Tween (0.05%)-leche (5%). Al
da siguiente se hicieron 3 lavados con PBS-Tween (0.05%) de 10 min cada uno y la
membrana se incub durante 2 hrs a temperatura ambiente y con agitacin suave con
el segundo anticuerpo diluido en PBS-Tween (0.05%), se hicieron 3 lavados con PBSTween de 10 min cada uno. Se revel por el sistema de ECL Plus Western Blottign
Detection Reagents (Amersham Biosciences) en placas radiogrficas.
98
5.13
Cuando se trabaja con RNA todo el material debe estar libre de RNasa, para lo
cual es necesario trabajar con guantes, limpiar la zona donde se va a trabajar al igual
que las pipetas con solucin libre de RNasas. Los tubos eppendorf deben ser nuevos y
estriles y slo se deben tomar con los guantes puestos. La obtencin del RNA total de
los trofozotos en las diferentes fases se realiz con el reactivo Trizol Reagent
(invitrogen). Los trofozotos sincronizados en cada fase del ciclo celular, se incubaron
10 min en hielo para despegarlos y se vaciaron en 2 tubos Falcon de 50 ml nuevos. Se
centrifugaron durante 7 min a 2500 rpm a 4C y se elimin el medio de cultivo. Se
99
5.14
100
en bao mara a 64C por 10 minutos. Se aadieron al tubo con la mezcla inicial 2 l de
oligo dT (100 ng/l) desnaturalizado a 64C por 10 minutos, 4 l de Buffer 5X de la
enzima Superscript II (Invitrogene) (RT), 2 l de dNTPs (20 mM), 2 l de DTT 0.1M y 1
l de RNAout 40 U/l. Se incub el tubo a 25C durante 5 minutos y se la agreg 1 l
de la enzima Superscript II (200 U/l) (Invitrogen). Se incub a 42C durante una hora,
guardando la mezcla final de cDNA a -20C. Se tom 1/5 del cDNA sintetizado y se
realiz una PCR en las siguientes condiciones: 4 l cDNA; 1 l oligo en sentido (100
ng/l); 1 l oligo en antisentido (100 ng/l); 1 l dNTPs (20 mM); 5 l Buffer 10X de la
Taq polimerasa; 1 l MgCl2 50 mM, 0.5 l Taq 5U/l (Invitrogen); 35 l H2O para un
volumen total de 50 l. Los oligos utilizados para amplificar el gen EhPap fueron: EhPap
IR sentido: 5AGATTAAATGTATATGG 3 y el EhPap IR antisentido: 5
CCATAATTTAATAGTACG 3. Para el gen de actina se us, el oligo sentido 5
AGCTGTTCTTTCATTATATGC -3, y el antisentido 5 TTCTCTTTCAGCAGTAGTGGT
3. Se realiz la PCR en el termociclador (Techne Genios) con el siguiente programa:
94C, 5 min; 25 ciclos de 95C, 1 min; Tm (C), 1 min; 72C, 1 min; 72 C, 7 min. La Tm
para los oligos de EhPap fue de 40C y para los oligos de actina de 51C.
Los productos de amplificacin obtenidos para cada una de las fases del ciclo
celular, se resolvieron mediante una electroforesis en un gel de agarosa al 1% en
amortiguador TBE 1X (Tris-borato, Tris 90 mM, EDTA 2mM pH 8 y cido brico 90
mM), a 100 V, durante 1 hr. El gel se ti en una solucin de EtBr y se observ en el
transiluminador de luz UV.
101
102
6.
RESULTADOS
Figura 15. Secuencia de la protena EhPAP de 522 aa obtenida del banco de datos del
proyecto de secuencia del genoma de la E. histolytica (http://www.tigr.org)
104
MACELKEFLV
YVYGSYRLNV
SMIYLNIEFD
SEEAFRVMVR
YSSWDWLRTP
EIVHEFSSEG
LSEIEEIIEA
DASIKKRSEI
ENSIPNEEKK
KNDMYPMGDQ
YGNNSDIDAC
LNFSRTAYTS
TIKLWTKKRG
VMLGTNDDFN
VNDWAKLFKP
NVIPNGFLDE
PTKFAHSVKR
EQLKKEMKQE
VEKKRKAISK
IVSNSTITRD
LPDNLDILNE
IYGYVYCFLN
DKKKEGVIQI
RHLFCGYYIF
ENEKYFYYVG
SITKSQEIKE
ANTIVKNSST
MTEYIQQWGK
DFYDGLYAEL
NILKNMDELD
GISIEILVAQ
LTPASPSENA
IEFIVTSSSL
MNVKRDCPVD
TSSQVPSSAI
DDDFMKRFTR
KIYIESAGVA
LNNPDVKELK
TRAINGVRNT
VISENYQLDN
AFSITKFSLE
EGLTTTIGKF
ISTPLNSFLS
TETFDIPTKP
KN
DDTDVKAATI
QIPSKRSPHL
DIIDAFVPNH
VRLLEKFFQV
MIKRELKRGQ
ESGLVNLMKG
IVNSGKDLIV
SIEQQLKAKE
60
120
180
240
300
360
420
480
522
105
106
107
108
109
Protena
Organismo
Nmero
E-valor
de acceso
Identidad
Homologa
(%)
(%)
PAP
Caenorhabditis elegans
Q9U2P3
3e-43
25
43
PAP
Homo sapiens
P51003
6e-42
25
47
PAP
Arabidopsis thaliana
Q7XJ91
1e-39
26
47
PAP
Plasmodium falciparum
Q6LF18
1e-38
27
48
PAP 1
Saccharomyces cerevisiae
P29468
2e-35
32
52
110
111
112
113
114
100
200
300
400
500
600
700
800
aa
H. sapiens
C. elegans
S. cerevisiae
A. thaliana
P. falciparum
E. histolytica
115
116
Figura 19. rbol filogentico sin raz de las PAPs de diferentes organismos. El
diagrama fue creado con el programa MEGA a partir de alineamientos obtenidos
mediante clustalw y usando las secuencias completas de las protenas. Se observ que
la EhPAP evolutivamente se encuentra cercana a las PAPs de otros protozoarios como
Plasmodium. La barra representa la distancia filogentica entre cada PAP.
117
H. sapiens
C. elegans
S. cerevisiae
A. thaliana
P. falciparum
E. histolytica
0.2
118
119
120
Lpez-Camarillo, 2003). Por medio de una restriccin enzimtica, con las enzimas
BamHI y HindIII (New England Biolabs) se liber el gen EhPap y conjuntamente se
lineariz el vector pRSET-A. Las reacciones de digestin se llevaron a cabo en
presencia del amortiguador 2 y fueron incubadas a 37C durante toda la noche. Al da
siguiente, se realiz una elecroforesis en un gel de agarosa al 1% TBE 1X y se observ
que la resticcin enzimtica se llev a cabo correctamente. El vector pRSET-A
linearizado present un tamao molecular de 2.9 kb (carril 1), mientras que el vector TA
linearizado present un tamao molecular de 3.1 kb (carril 2). Por otro lado, en ese
mismo carril se observa el gen EhPap liberado, que present un tamao molecular
esperado de 1.6 kb (Fig. 21). Para aislar tanto al vector pRSET-A como al gen EhPap,
se realiz nuevamente una electroforesis usando un gel de agarosa al 1% en TAE 1X y
se cort la banda correspondiente al gen y al vector linearizado y se purificaron
utilizando el kit de Gene Clean II (descrito en materiales y mtodos). Con el DNA
purificado se realiz una elecroforesis en un gel de agarosa al 1% TBE 1X para verificar
la integridad del DNA purificado y estimar la concentracin de cada uno de los
fragmentos EhPap y pRSET-A usando diferentes concentraciones de una dilucin de
1:10 (Fig. 22).
6.2.2 Ligacin
Se realiz la ligacin del gen EhPap en el vector pRSET-A usando una relacin
1:5 de vector: inserto, 2 l de ligasa T4 DNA ligase (1U/l) y amortiguador 10X de la
ligasa en presencia de ATP. La mezcla se incub durante toda la noche a 15C. Como
control se realiz una reaccin de ligacin usando slo el vector linearizado.
121
122
pb
23,130
9,416
6,557
4,361
2,322
2,027
123
vector
pRSET-A purificado (2.9 kb). B. Cuantificacin del gen EhPap purificado (1.6 kb). En
ambas figuras la dilucin es de 1/10 l. Carril 1, 1 l de la dilucin; carril 2, 3 l de la
dilucin; carril 3, 5 l de la dilucin; carril 4, 2 l del purificado del vector pRSET en
panel A y 2 l del gen EhPap purificado en el B. La flecha muestra el vector linearizado
(pRSET-A) y el asterisco indica el gen EhPap liberado por medio de una restriccin
enzimtica con las enzimas BamHI y HindIII. M, marcadores de tamao molecular
Hind III.
124
pb
23,130
4,361
2,322
pb
23,130
9,416
6,557
4,361
2,322
2,027
125
126
127
Kb
3.0
2.0
1.5
128
Figura 24. Electroferograma que muestra la secuencia de nucleotidos del gen EhPap
clonado en el vector pRSET-A. Se muestra el ATG inicial de la EhPAP.
129
130
131
Figura 25. Expresin de la protena EhPAPr. A SDS-PAGE al 10% teido con azul de
Coomassie donde se observa la expresin de la protena recombinante. B Ensayo de
Western blot donde se identifica a la protena recombinante con el anticuerpo antihistidinas. En ambas figuras: carril 1, protenas totales de bacterias E.coli BL21 (DE3)
pLysS transformadas sin inducir; carril 2, protenas totales de bacterias E.coli BL21
(DE3) pLysS transformadas e inducidas. La flecha indica una banda de 66 kDa que
corresponde a la EhPAPr. El asterisco seala una banda inespecfica, probablemente
de una protena bacteriana.
132
B
kDa
kDa
172
250
110
150
79
111
75
62
50
48
37
36
*
24
19
25
133
134
Figura 26. Purificacin de la EhPAPr mediante cromatografa de columna de agarosaNiquel (Ni-NTA). PAGE al 10% de las diferentes fracciones de la purificacin. Carril 1,
protenas totales de bacteria E.coli BL21 (DE3) pLysS transformadas con el plsmido
pRSET-EhPap sin inducir; carril 2, lisado clarificado obtenido en el amortiguador B pH 8
de lisis; carril 3, protenas totales contenidas en el amortiguador B pasado 7 veces por
la columna de Niquel; carril 4, fraccin recuperada del lavado de la columna con
amortiguador C pH 6.3; carril 5, fraccin recuperada con el amortiguador D de pH 5.9;
carril 6, elucin de la protena EhPAPr en el amortiguador E pH 4.5. La flecha indica a
la EhPAPr.
135
kDa
172
110
79
62
48
36
24
19
136
137
B
kDa
181
115
82
63
48
kDa
172
110
79
62
48
36
37
24
25
19
138
Obtencin
de
suero
preinmune
1a inmunizacin (100 g)
50 l de adyuvante
completo de Freund
Da 10: 2a inmunizacin (100 g)
50 l de adyuvante
incompleto de
Freund
Da 21: 3a inmunizacin (100 g)
50 l de adyuvante
Da 0:
volumen final de
100 l
complementando
con PBS pH 7.4
139
incompleto de
Freund
Da 30: obtencin de suero
la
ausencia
de
142
A
kDa
115
C
1
B
2
kDa
115
82
150
63
100
75
82
63
48
48
50
37
37
37
25
25
143
cuales amplificaron un fragmento interno de 405 pb del gen EhPap. Como control se
usaron oligos para el gen de actina. Se realiz una electroforesis de los productos de
amplificacin en un gel de agarosa al 1% TBE 1X y las diferencias en la cantidad de
transcrito EhPap durante las fases del ciclo celular se analizaron por densitometra.
Los valores obtenidos para el RNAm del gen EhPap se normalizaron como los
valores de actina en cada fase y se expresaron en porcentaje, tomando como 100% el
valor de actina. Los estudios muestran que el RNAm de EhPap se expresa
principalmente en la fase G1 (que corresponde a un 83% con respecto a la expresin
del RNAm de actina) y en la fase S (con un 56 % con respecto a la expresin del RNAm
de actina). Es interesante resaltar que el gen EhPap no parece expresarse en la fase M
ni el la fase G2 (Fig. 29 A y C), sin embargo, no se descarta que la expresin del RNAm
de este gen en las fases M y G2 sea tan baja que no se puede detectar a travs de
ensayos de RT-PCR utilizando RNA total como molde. En contraste, la expresin del
RNAm del gen de actina permanece casi constante durante la progresin del ciclo
celular (Fig. 29 B).
144
Figura 29. Anlisis de la expresin del RNAm del gen EhPap durante el ciclo celular. A.
RT-PCR semi-cuantitativa de EhPap del RNAm total de trofozotos de la L6
sincronizados en las fases M, G1, S y G2. B Control positivo del gen de actina. C.
Anlisis densitomtrico de los niveles de RNAm del gen EhPap y actina en la clona L6
sincronizada. El producto de actina que fue tomado como el 100% de los pixeles en
cada linea y los niveles de los productos de EhPap fueron expresados en pixeles con
respecto a actina en cada linea. Fases del ciclo celular: M, mitosis; G1; S, sntesis; G2
145
actina
EhPap
actina
146
7. DISCUSION
La amibiasis humana es causada por el parsito protozoario E. histolytica que a
nivel mundial afecta aproximadamente del 10 al 12 % de la poblacin, adems de que
representa un grave problema de salud pblica en Mxico. Para poder entender las
bases moleculares del proceso de infeccin de este parsito es necesario conocer los
factores que regulan la expresin gentica en las diferentes etapas de su ciclo de vida,
quiste y trofozoto, as como en las fases del ciclo celular. Dentro del estudio de la
expresin gentica en eucariontes, se encuentran diversos niveles de control que
permiten que la expresin se lleve a cabo de manera eficaz. En E. histolytica no se han
reportado estudios sobre el procesamiento del pre-RNAm el cual incluye principalmente
al capping, el splicing y la reaccin de corte y poliadenilacin, los cuales han sido bien
estudiados en eucariontes superiores (Day y Tuite, 1998; Mignone, 2002; Proudfoot
2002).
proticos y de secuencia que permiten que se lleve a cabo el procesamiento del preRNAm, y que algunos de estos factores no son exclusivos de un proceso, sino que
pueden participar simultneamente en diversos eventos tales como la transcripcin, el
splicing y el capping.
reportado adems, que durante el ciclo celular de los eucariontes, la PAP se inactiva en
la fase M al ser hiperfosforilada por la p34cdc2/ciclina B, inhibiendo su funcin. Este
fenmeno origina que los transcritos celulares no sean poliadenilados afectando de esta
manera su eficiencia de traduccin, lo cual disminuye la expresin gentica de manera
general. Recientemente se ha reportado que la estabilidad del RNAm del gen EhPgp5
participa de manera importante en la regulacin del fenotipo de resistencia a mltiples
frmacos en E. histolytica (Lpez-Camarillo., 2003) en donde se demostr que hay un
incremento en la vida media y el tamao de la cola de poli (A) en el RNA m en
trofozotos de la clona C2 crecidos a altas concentraciones de emetina. Sin embargo,
se desconocen los mecanismos que determinan el aumento en la longitud del tracto de
poli (A) y el papel que podra tener la poli(A) polimerasa en la regulacin del tracto de
poli(A).
148
dominio F/YGS y que es el responsable de la unin del ATP (Pfam PF01909); mientras
que en el extremo carboxilo se encuentra un dominio de unin a RNA de los
aminocidos 322-444 aa (Pfam PF04926). Es interesante resaltar que la EhPAP no
presenta una seal de localizacin nuclear tpica (NLS1), lo que sugiere que para
llevarse a cabo la translocacin nuclear de EhPAP otros factores o secuencias pueden
estar involucrados. Al realizar una comparacin de la secuencia de la EhPAP con la
PAP II de humano se observ que no presenta aproximadamente 100 aa en el extremo
C-terminal donde se localiza la segunda seal de localizacin nuclear de humano (NLS
2) y que es un dominio rico en serina y treonina (Fig. 18). En eucariontes superiores, se
ha estudiado el mecanismo del transporte nuclear, el cual est regulado por medio de
diversas protenas que se unen a una seal de localizacin nuclear (NLS) la cual es
conservada en la mayora de las protenas, sin embargo se ha demostrado que no es la
nica y que se han identificado otras seales tales como la seal NES (nuclear export
signal, por sus siglas en ingls) la cual es una secuencia rica en leucina localizada en el
extremo C- terminal, mientras que en el extremo N- terminal tambin se han identificado
en algunas protenas seales de localizacin nuclear conocidas como APE 1. Ambas
seales suplen la funcin de la seal de localizacin nuclear tipica (NLS 1), (Moroianu,
1998, Xiao y col., 2001; Jackson y col., 2005).
151
8. CONCLUSIONES
4.
152
6. En la fase M y G2 del ciclo celular, la expresin gentica del RNAm del gen EhPap
disminuy con respecto a las fases S y G1 de este gen y con la expresin del gen de
actina en todas las fases en ensayos de RT-PCR.
153
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