Sunteți pe pagina 1din 21

MINISTERIO DE SALUD

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD


CENTRO DE INFORMACIN Y DOCUMENTACIN CIENTFICA

POLIMORFISMO GENTICO DE
Echinococcus granulosus AISLADOS DE
DIFERENTES HOSPEDEROS DE REAS
ENDMICAS DEL PER

SERIE INFORMES TCNICOS N62

M.SC.: ELIZABETH SNCHEZ ROMAN


BLGO. OMAR CCERES REY
Y
DR. CSAR NQUIRA VELARDE

[2002]

POLIMORFISMO GENTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE DIFERENTES HOSPEDEROS DE


REAS ENDMICAS DEL PER

TITULO DE LA INVESTIGACIN

POLIMORFISMO GENTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE


DIFERENTES HOSPEDEROS DE REAS ENDMICAS DEL PER

NOMBRES Y APELLIDOS COMPLETOS DE LOS INVESTIGADORES (Mencionar


afiliacin institucional, telfono, direccin y correo electrnico de cada uno).

Autores
M.Sc.: Elizabeth Snchez Roman
Laboratorio de Biotecnologa y Biologa Molecular del Centro Nacional en Salud
Pblica- INS. Telf. 4719920 anexo 129. Capac Yupanqui 1400 Jess Mara
esanchez@ins.gob.pe

Blgo.: Omar Cceres Rey


Laboratorio de Biotecnologa y Biologa Molecular del Centro Nacional en Salud
Pblica- INS. Telf. 4719920 anexo 129. Capac Yupanqui 1400 Jess Mara
ocaceres@ins.gob.pe
Coautores
Dr. : Csar Nquira Velarde
Laboratorio de Zoonosis Parasitaria del Centro Nacional en Salud Pblica- INS.
Telf. 4719920 anexo 137. Capac Yupanqui 1400 Jess Mara
cnaquira@ins.gob.pe

POLIMORFISMO GENTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE DIFERENTES HOSPEDEROS DE


REAS ENDMICAS DEL PER

Apoyo Tcnico
Tec. Lab. David Garca Neyra
Divisin de Biotecnologa y Biologa Molecular del Centro Nacional en Salud
Pblica- INS
Telf. 4719920 anexo 129. Cpac Yupanqui 1400 Jess Mara
leongarcia2000@yahoo.com.mx

DIVISIN EN LA CUAL SE VA A TRABAJAR

Divisin de Biologa Molecular y Divisin de Parasitologa del Centro Nacional en Salud


Pblica del Instituto Nacional de Salud

POLIMORFISMO GENTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE DIFERENTES HOSPEDEROS DE


REAS ENDMICAS DEL PER

RESUMEN ESTRUCTURADO

Introduccin: Echinococcus granulosus es un pequeo platelminto parsito, que causa la


hidatidosis qustica en el hombre y en animales domsticos. Esta zoonosis constituye un
importante problema de Salud Pblica principalmente en la regin sierra del Per, donde
existen reas hiperendmicas. Existen evidencias que en muchas reas endmicas del
mundo circulan un complejo de variantes intraespecficas o cepas de Echinococcus
granulosus los cuales pueden tener implicancia en la patogenicidad, infectividad a humanos
y patrones de desarrollo diferentes que en conjunto afectan la epidemiologa del parsito.
Objetivos: Conocer los genotipos, que circulan en el pas, de la poblacin de Echinococcus
granulosus de hospederos domsticos (ovino, vacuno, caprino y porcino) provenientes de
diferentes reas endmicas del Per. Metodologa: Protoescolices de Echinococcus
granulosus sern colectados de los hospederos domsticos, a los cuales se les aislar el
ADN. Se realizara PCR para amplificar los genes de la Citocromo Oxidasa I (COI) y NAD
deshidrogenasa I (NDI), los productos de amplificacin de ambos genes sern sometidos a
la tcnicas de SSCP para determinar si existe o no variaciones en estos genes los cuales son
indicadores de la existencia de polimorfismo gentico. Se comprobara el polimorfismo
secuenciando los productos de PCR y realizando la tcnica de RAPD para determinar con
exactitud las variantes genticas de este cstode.
Cabe mencionar que para este proyecto se tiene colectado el material biolgico de algunas
reas endmicas del Per (Cuzco, Puno, Arequipa, Junn y Huancavelica) faltando colectar
material de los departamentos de Ayacucho, Cajamarca, Ica y Ucayali.
El monto solicitado ser de 40,000 nuevos soles

POLIMORFISMO GENTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE DIFERENTES HOSPEDEROS DE


REAS ENDMICAS DEL PER

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La enfermedad hidatdica unilocular causada por el estado qustico de Echinococcus


granulosus

(Batsch 1786), es una de las ms importantes zoonosis parasitarias, que

constituye un problema de Salud Pblica en varias zonas del mundo.


E. granulosus es el cstode ms pequeo que se conoce, tiene un ciclo de vida complejo
que envuelve dos hospederos (Thompson, R.C.A. et al. 1995, Thompson, R.C.A. 1986): La
forma adulta del parsito infecta un hospedero definitivo que siempre es un carnvoro como
el perro domstico y otros cnidos; Mientras que la forma qustica o larvaria (metacstode)
se desenvuelve en hospederos intermediarios que son principalmente ungulados (ganado
ovino, vacuno, caprino y porcino entre otros).
A nivel mundial se ha reportado que existen varias cepas de Echinococcus granulosus en
distintas reas endmicas y en diferentes hospedadores intermediarios (McManus, D.P. &
Smyth, J.D. 1986) estas cepas fueron caracterizadas utilizando en criterios morfolgicos,
biolgicos, bioqumicos y caractersticas epidemiolgicas (Eckert, J. & Thompson, R.C.A
1997, Lymbery, J. et. al 1990, Thompson, R.C.A & Lymbery, A. J. 1988, McManus, D.P &
MacPherson, C.N.L 1984), que sugieren que algunas variantes son ms infectivas que otras
para el hombre. Estudios basados principalmente en estos criterios indican diferencias de
Echinococcus entre ganado vacuno/perro; cerdo/perro; reno/perro en Europa (Eckert, J. &
Thompson, R.C.A.1988).
Por otro lado estudios bioqumicos realizados en cepas de Echinococcus granulosus
aislados de hospederos intermediaros como oveja, ganado vacuno, cabra y humanos
difieren ligeramente en sus perfiles isoenzimticos, composicin bioqumica bsica y
metabolismo, mientras que las cepas aisladas de camello y cabra muestran diferencias
considerables (McManus, D.P 1981, MacPherson, & McManus, D.P. 1982).

POLIMORFISMO GENTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE DIFERENTES HOSPEDEROS DE


REAS ENDMICAS DEL PER

Las tcnicas moleculares tambin permitieron comprobar la existencia de las cepas o


variantes genticas de Echinococcus granulosus, inicialmente se utiliz hibridacin con
sondas de ADN marcadas con istopos radioactivos (McManus, D.P and Rishi, A.K. 1989)
hasta tcnicas ms modernas tales como el PCR y su anlisis utilizando enzimas de
restriccin PCR-RFLP (Zhang, L. et. al. 1998, Bowles, J. et. al. 1994, Bowles, J. and
McManus, D.P 1993a), Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) (Scout, J.C. and
McManus, D.P. 1994), Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) (Zhang, L. et. al
1999, Passer, R.B. et. al 1998) y secuenciamiento de ADN (Bowles, J. & McManus, D.P.
1993b, Bowles, J. et.al. 1992). Estas tcnicas han sido ampliamente utilizados para
caracterizar variantes dentro de la especie de Echinococcus granulosus a los cuales se les
conoce como G, actualmente existen ocho genotipos descritos G1-G8 (Kamenetzky, L. et.al
2002)
En las reas endmicas del Per existen un amplio rango de hospedadores intermediarios de
Echinococcus granulosus (ovejas, ganado vacuno, cabras, porcinos y auqunidos)
incluyendo el hombre, en los cuales probablemente existan variantes genticas. Por lo que
nuestro estudio estar dirigido a la determinacin de estas variantes utilizando
protoesclices obtenidos de los diferentes hospedadores intermediarios procedentes de las
distintas reas endmicas del Per, utilizando para ello tcnicas moleculares.

JUSTIFICACIN Y USO DE LOS RESULTADOS (Mencionar la importancia del estudio y los


beneficios que se obtendrn de sus resultados para la poblacin) (Mximo 1 pgina):

La identificacin de las diferentes cepas de Echinococcus granulosus es un punto de


estudio muy importante ya que existe evidencias que en muchos reas endmicas del
mundo, existen un complejo de variantes intraespecficos o cepas de Echinococcus

POLIMORFISMO GENTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE DIFERENTES HOSPEDEROS DE


REAS ENDMICAS DEL PER

granulosus los cuales pueden tener diferencias en lo que respecta a infectividad,


antigenecidad

susceptibilidad

quimioterapia,

patognesis

caractersticas

epidemiolgicas del parsito en relacin con su hospedero intermediario y al hombre


(Thompson, R.C.A et. al. 1995)
Como resultado del trabajo contaremos con la informacin del polimorfismo gentico de
las poblaciones de Echinococcus granulosus que circulan en las reas endmicas del Per,
datos que son importantes tomar en cuenta para estudios epidemiolgicos dirigidos a un
posterior establecimiento de programas efectivos para el control de la hidatidosis
FUNDAMENTO TERICO (describir las teoras que sustentan la investigacin o antecedentes de
otros estudios similares ya publicados) (Mximo media pgina):

Ocho genotipos de Echinococcus granulosus han sido descritas: la de ciervo, de oveja, de


oveja de Tasmania, de caballo, de bovino, de puerco, bfalo y de camello (Thompsom,
R.C.A. and McManus, D.P. 2002). El genotipo est relacionado al hospedero intermediario
en la cual una mayor proporcin de quistes con determinada variantes gentica fue
identificada, esto no significa que una cepa infecte solamente el hospedero intermediario
que le dio su nombre. Por ejemplo el genotipo de oveja infecta adems de oveja, buey,
cabra, puerco, caballo y es la principal causa de infeccin en humanos ( Schantz, et. al.,
1995).
Los ocho genotipos descritos para Echinococcus granulosus presentan diferencias en su
distribucin geogrfica, en el grado de infectividad para diferentes hospederos
intermediarios (Schantz, et.al., 1995) en sus sistemas metablicos (McManus, D.P. and
Bryant, C. 1995) y en las secuencias de genes mitocondriales COI (citocromo C oxidasa I)
y NDI (NAD deshidrogenasa I) (Bowles, et. al. 1995, 1992).

POLIMORFISMO GENTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE DIFERENTES HOSPEDEROS DE


REAS ENDMICAS DEL PER

Las diferencias entre los genotipos de Echinococcus granulosus representan una de los
puntos principales a ser considerados en cualquier estudio epidemiolgico dirigido al
establecimiento del programa de control de la hidatidosis. Estas diferencias no solo reflejan
distintas caractersticas biolgicas, con importantes implicaciones en el estudio serolgico a
nivel poblacional y en el desarrollo futuro de estrategias para quimioterapia y vacunacin,
sino tambin refleja el potencial infectivo de estos diferentes genotipos para el hombre.

Existen pocos trabajos sobre la distribucin de Echinococcus granulosus en los diferentes


pases de Amrica Latina, con excepcin de Argentina (Kamenetzky, L. et.al 2002,
Rosenzvit, M. et.al. 1999), ningn otro pas ha reportado como estn distribuidos los
diferentes genotipos de este parsito en sus respectivos pases.
En el Per existen varios estudios con respecto a este cstode pero todos ellos son solo
estudios de seroprevalencia y diagnostico de campo, por lo que este proyecto seria el
primero en iniciar estudios de Epidemiologa Molecular de Echinococcus granulosus en el
pas.
OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIN (Incluir sujetos, tiempo y lugar):

Objetivo General:
Determinar la variabilidad gentica o polimorfismo gentico de Echinococcus
granulosus circulantes en las diferentes reas endmicas del Per.
Objetivos Especficos:
Estandarizacin de los procedimientos para la extraccin de ADN a partir de
protoesclices de Echinococcus granulosus.
Determinacin del Polimorfismo gentico del parsito utilizando PCR-SSCP de
los genes COI y NDI

POLIMORFISMO GENTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE DIFERENTES HOSPEDEROS DE


REAS ENDMICAS DEL PER

Confirmacin del polimorfismo por secuenciamiento de los genes COI y NDI y


aplicacin de la tcnica de RAPD.
Anlisis y distribucin de los genotipos de Echinococcus granulosus en las
diferentes reas endmicas del pas

HIPTESIS :
Echinococcus granulosus presenta variantes genticas o polimorfismo gentico distribuidos
en las diferentes reas endmicas del Per.
METODOLOGA
Tipo de estudio
Es un estudio Descriptivo y Analtico cuya duracin es de un ao
rea de estudio (Describir las caractersticas del rea relevantes para el estudio)
La zona Sierra del Per es considerada rea endmica a Hidatidosis sobre todo aquellas
donde existe crianza de ganado ovino, bovinos entre otros. Por esta razn se visitaran los
camales en donde se beneficia al ganado para colectar el lquido hidatdico de los
departamentos de Ica, Ayacucho, Cajamarca y Ucayali.
Sujetos (Mencionar el tamao de la poblacin y el nmero de sujetos en la poblacin con la
condicin a estudiar en el centro de salud u hospital donde se realizar el estudio)
Se obtendr liquido hidatdico de por lo menos 10 animales de cada especie (ovino, vacuno,
etc.) sacrificados e infectados con el parsito en cada camal de un rea endmica del Per.
Los datos de las muestras obtenidas sern registradas en una ficha epidemiolgica
elaborada para tal fin ( anexo I ).

POLIMORFISMO GENTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE DIFERENTES HOSPEDEROS DE


REAS ENDMICAS DEL PER

Se procurara obtener, en todo momento, las capas germinativas de cada quiste elegido.
Criterios de Inclusin y Exclusin
Criterios de Inclusin: Se obtendrn muestras de lquido hidatdico transparente de
pulmn y/o hgado de ganado ovino, bovino, caprino y camlidos.
Criterios de Exclusin: No se tomaran en cuenta lquido hidatdico contaminado (color
amarillo) ni quistes calcificados.
Diseo Muestral (Determinar el tamao mnimo muestral y el tipo de muestreo empleado)
Se trabajara con 10 animales de cada especie que presente quistes hidatdicos y que lleguen al camal
para ser sacrificados, por lo tanto el muestreo es al azar pues depender de la existencia de animales
infectados del total de animales sacrificados en el camal.

DESCRIPCIN DE LA INTERVENCIN PROPUESTA


Material biolgico
Para la obtencin del material biolgico se acudirn a los camales o mataderos de ganados
de las reas endmicas de hidatidosis (Ayacucho, Cajamarca, Ica y Ucayali). El lquido
hidatdico de Echinococcus granulosus sern colectados por aspiracin de los quistes de
pulmn y/o hgado de ovejas, ganado vacuno, cabras y cerdos infectados.

las muestras colectadas en esta oportunidad as como las muestras previamente colectadas
(Cuzco, Arequipa, Puno, Junn y Huancavelica) sern centrifugados a 5000 r.p.m por 10
minutos con la finalidad de colectar los protoesclices, los cuales sern lavados con
solucin salina isotnica para luego ser fijados en alcohol al 95% y mantenidos a -20C
hasta su procesamiento.

POLIMORFISMO GENTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE DIFERENTES HOSPEDEROS DE


REAS ENDMICAS DEL PER

Aislamiento y purificacin de ADN.


En el laboratorio, los protoesclices sern descongelados y lavados por una vez con PBS
1X por centrifugacin a 5000 r.p.m por 5 minutos, el pellet obtenido ser resuspendido en
buffer de lisis (100 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl) al cual se le
aadir SDS al 1% y Proteinasa K 1 mg/ml (concentracin final) e incubado a 55C por al
menos 2 horas o hasta cuando la solucin este transparente, esto es con la finalidad de lisar
a los parsitos (Maizels, R.M et. al. 1990)
El ADN ser extrado con fenol/cloroformo/alcohol isoamlico (25:24:1) por 2 veces y una
vez con cloroformo/alcohol isoamlico, luego el ADN ser precipitado con acetato de Sodio
3M y alcohol absoluto en fro. Finalmente el ADN ser lavado con alcohol al 70%, secado,
resuspendido en buffer TE estril y guardado a 4C. Alternativamente se utilizara el mtodo
de extraccin de ADN utilizando sales de guanidina.
Se utilizar tambin el kit Genomic Prep (QIAGEN) para extraer el ADN genmico de los
parsitos los cuales sern utilizados para realizar la tcnica de RAPD.
PCR de protoesclises E. granulosus.
Regiones del ADN mitocondrial sern amplificados utilizando primers reportados para tal
fin; en ese sentido, regiones del gen de la NADH deshidrogenasa I (NDI) y del Citocromo
C oxidasa subunidad I (COI) sern amplificados por PCR segn el procedimiento seguido
por Zhang, L. y cols. (1999). Los productos de amplificacin sern visualizados en un gel
de agarosa al 1.5% al teirlos con bromuro de etidio.
SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism)

POLIMORFISMO GENTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE DIFERENTES HOSPEDEROS DE


REAS ENDMICAS DEL PER

Para realizar sta tcnica, 10 ul. del producto de PCR ser mezclado con 10 ul. de buffer
SSCP (10 mM NaOH, 95% formamida, 0.05% azul de bromofenol y 0.05% xylene
cyanole), denaturado a 95C por 5 minutos e inmediatamente colocado a -20C por 10
minutos.
Un volumen de 3.5 ul. de cada muestra sern colocados en los pocillos de un gel de
poliacrilamida no denaturante tipo secuenciamiento (0.6X MDE: Mutation Detection
Enhancement) y sometido a una electroforesis convencional a 7 W por 20 horas y a 20C.
Las diferencias de corrida sern visualizadas al teir el gel con nitrato de plata segn el
procedimiento descrito por Bassam, B. J. y cols. (1991).
Secuenciamiento de los fragmentos genticos NDI y COI
Para confirmar las diferentes variantes de Echinococcus granulosus detectados por SSCP,
los productos amplificados por PCR de los genes NDI (525 pb) y COI (460 pb) sern
secuenciados y analizados utilizando un secuenciador automtico de ADN (ALF Express,
Amersham Biosciences) para observar las mutaciones presentes en cada variante.
RAPD-PCR de protoesclices de Echinococcus granulosus.
Para evidenciar y confirmar las variantes de Echinococcus granulosus, se utilizar la
tcnica de RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA-Polymerase Chain
Reaction), en este caso DNA genmico e intacto extrado de E. granulosus ser sometido a
un PCR utilizando 4 primers aleatorios reportados (Scott J.C. and McManus D.P 1994).
Los patrones obtenidos sern visualizados en un gel de agarosa al 1.5% teido con bromuro
de etidio. Los diversos productos de amplificacin sern analizados utilizando software
informticos especializados (Gel Compar II) para determinar las variantes de Echinococcus
granulosus.

POLIMORFISMO GENTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE DIFERENTES HOSPEDEROS DE


REAS ENDMICAS DEL PER

Finalmente los resultados de las tcnicas de SSCP y de RAPD-PCR sern confrontados y


analizados simultneamente para determinar cuales son las variantes genticas de
Echinococcus granulosus presentes en las diferentes reas endmicas del pas.
DEFINICIONES OPERACIONALES DE LAS VARIABLES

Polimorfismo Gentico: Variacin a nivel de un gen o regin de ADN que presentan los
individuos de una misma especie, esta variacin ocurre en la secuencia de los
nucletidos de la regin de ADN elegida para el anlisis y que es producto de
mutaciones que suceden a lo largo del tiempo.

SSCP: Tcnica molecular muy utilizada para evidenciar mutaciones en una regin
pequea de ADN, se basa en la movilidad electrofortica diferente de las molculas de
ADN de simple hebra, la diferencia en la movilidad es resultado de las diferentes
estructuras secundarias adoptadas por las simples hebras de ADN.

RAPD: Tcnica molecular muy til para determinar polimorfismo gentico en los
organismos, esta basada en la tcnica de PCR cuya diferencia es que utiliza primers o
iniciadores pequeos (10 bases) cuya secuencia es al azar. Se emplean 2 o 3 pares de
primers los cuales originan un patrn de bandas de amplificacin el cual es especfico
para cada especie o variante gentica.

INDICADORES PARA EL MONITOREO (Describir los indicadores que servirn para supervisar y
monitorear al estudio, este tem necesariamente debe ser llenado)

Numero de muestras de protoescolices obtenidos

Numero de muestras ADN extrados

Numero de PCR realizados

Numero de anlisis de polimorfismo (SSCP. RAPD) realizados

CONTROL DE CALIDAD (Describir los procedimientos que asegurarn la calidad de la


recoleccin de datos, de las actividades (p. ej.: lectura de lminas) u otros pertinentes)

POLIMORFISMO GENTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE DIFERENTES HOSPEDEROS DE


REAS ENDMICAS DEL PER

Todas las muestras de protoesclices sern corroboradas de que son Echinococcus granulosus al
realizarse las mediciones morfomtricas de los ganchos del rostelo; los anlisis moleculares sern
realizados utilizando controles positivos de los diferentes genotipos reportados para Echinococcus
granulosus de otros pases.
ANLISIS DE LOS DATOS (Mencionar las variables dependientes e independientes, las pruebas
estadsticas a utilizar, y el software)
Se utilizar el programa LabWorks 4.0 (UVP) para capturar las imgenes de los geles producto del
SSCP y del RAPD, luego se usar el programa Gel Compar II (Applied Maths) para determinar
exactamente la variabilidad de las cepas y el programa MEGA 2 para analizar las relaciones
filogenticas entre los genotipos de Echinococcus granulosus.
ASPECTOS TICOS (Mencionar si habr consentimiento informado en estudios que impliquen
humanos y explique. Mencionar si solicitar aprobacin de algn Comit de tica)

El presente estudio no implica trabajo con muestras humanas

POLIMORFISMO GENTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE DIFERENTES HOSPEDEROS DE


REAS ENDMICAS DEL PER

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Bassam, B. J; Caetano-Anolls, G y Gresshoff, P. M. Fast and sensitive silver


staining of DNA in polyacrylamide gels. 1991. Anal. Biochem. 196: 80-83.

Bowles, J.; Blair, D. & Mc Manus, D.P. A molecular phylogeny of the genus
Echinococcus. 1995. Parasitology. 110: 317-328.

Bowles, J.; Blair, D. & Mc Manus, D.P. Molecular genetic characterization of the
cervid strain (Northern form) of Echinococcus granulosus. 1994. Parasitology 109:
215-221

Bowles, J.; Blair, D. & Mc Manus, D.P Genetic variants within the genus
Echinococcus identified by mitochondrial DNA sequencing. 1992. Molecular and
Biochemical Parasitology 54: 165-174

Bowles, J and Mc Manus, D.P. Rapid discrimination of Echinococcus species and


strains using a polymerase chain reaction-based RFLP method. 1993a. Molecular and
Biochemical Parasitology 57: 231-240

Bowles, J and Mc Manus, D.P. NADH dehydrogenase 1 gene sequences compared for
species and strains of the genus Echinococcus. 1993b. Int. J. Parasitol. 23(7): 969-972

Eckert, J. & Thompson R.C.A. Echinococcus strains in Europa. 1988. Tropical


Medicine and Parasitology. 39: 1-8.

Eckert, J. & Thompson R.C.A Intraspecific variation of Echinococcus granulosus and


related species with emphasis on their infectivity to humans. 1997 Acta Tropica. 64: 1934.

POLIMORFISMO GENTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE DIFERENTES HOSPEDEROS DE


REAS ENDMICAS DEL PER

Gasser R. B; Zhu X. and McManus D. P. Display of sequence variation in PCRamplified mitochondrial DNA regions of Echinococcus by single-strand conformation
polymorphism. 1998. Acta Tropica 71: 107-115

Kamenetzky, L; Gutierrez, A. M; Canova S. G; Haag K. L; Guarnera, E. A; Parra,


A; Garcia, G. E and Rosenzvit, M. C. Several strains of Echinococcus granulosus
infect livestock and humans in Argentina. 2002. Infection, Genetics and Evolution 2:
129-136

Lymbery A. J, Thompson R. C. A and Hobbs R.P Genetic diversity and genetic


differentiation in Echinococcus granulosus (Batsch, 1786) from domestic and sylvatic
host on the mainland of Australia. Parasitology 1990, 101: 283-289

Macpherson, C.N.L. & Mc Manus, D.P. A comparative estudy of Echinococcus


granulosus from human and animal host in Kenya using isoelectric focusing and
isoenzyme analisis. 1982. Internacional Journal for Parasitology. 12: 515-521.

Mc Manus, D.P. A biochemical study of adult and cytic stages of Echinococcus


granulosus of human and animal origen from Kenya. 1981. Journal of Helmintology.
55: 21-27.

Mc Manus, D.P. & Bryant, C. Biochemestry physiology and molecular biology of


Echinococcus. In: Echinococcus and Hydatid disease. 1995. CAB International.
Willingford.

Mc Manus, D.P. & Smyth, J.D. Hydatidosis: Changing concepts in epidemiology and
speciation. 1986. Parasitology Today 2: 163-168.

POLIMORFISMO GENTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE DIFERENTES HOSPEDEROS DE


REAS ENDMICAS DEL PER

Mc Manus, D.P. and McPherson C. N. L. Strain characterization in the hydatid


organism, Echinococcus granulosus: Current status and new perspectives. 1984 Annals
Trop. Med. Parasit. 78(3): 193-198

Mc Manus, D.P. and Rishi A. K. Genetic heterogeneity within Echinococcus


granulosus: Isolates from different hosts and geographical areas characterized with
DNA probes. 1989 Parasitology 99: 17-29

Maizels, R. M; Blaxter, M. L; Robertson, B. D y Selkirk, M. E. Parasite antigens,


Parasite genes: A laboratory manual for molecular parasitology. 1990. Cambridge
University Press.

Rosenzvit, M. C; Zhang, L. H; Kamenetzky, L; Canova S. G; Guarnera, E. A and


McManus D. P. Genetic variation and epidemiology of Echinococcus granulosus in
Argentina. 1999. Parasitology 118: 523-530.

Schantz, P. M. ; Chai, J.; Craing, P.S.; Eckert, J..; Jenkings, D.I.; Macpherson,
C.N.L. & Thakur, A. Epidemiology and Control of Hydatid disease Echinococcus and
Hydadtid disease. 1995. CAB International, Willingford.

Scott, J. C and McManus, D. P. The Random amplification of polymorphic DNA can


discriminate species and strains of Echinococcus. 1994. Trop. Med. Parasitol. 45(1):1-4.

Thompson R.C.A. Biology and systematic of Echinococcus: in The Biology of


Echinococcus granulosus and Hydatid Disease. 1986. (Ed Thompson R.C.A.) p 5-43.
London :Allen Unwin.

Thompson R.C.A. & Lymbery, A.J. The nature extent and significance of variation
within the gens Echinococcus. 1988. Advances in Parasitology. 27:210-263.

POLIMORFISMO GENTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE DIFERENTES HOSPEDEROS DE


REAS ENDMICAS DEL PER

Thompson, R.C.A.; Lymbery, A.J. and Constantine, C.C. Variation in Echinococcus.


1995. Advances in Parasitology. 35: 145-175.

Thompson R.C.A. and McManus D. P Towards a taxonomic revision of the genus


Echinococcus. 2002. Trends in Parasitology 18(10): 452-457

Zhang, L; Gasser, R. B; Zhu, X. y McManus, D. P Screening for different genotypes


of Echinococcus granulosus within China and Argentina by single-strand conformation
polymorphism (SSCP) analysis. 1999. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 93: 329-334.

Zhang, L; Eslami A ; Hosseini S. H and McManus, D. P Indication of the presence


of two distinct strains of Echinococcus granulosus in Iran by mitochondrial DNA
markers. 1998 Am. J. Trop. Med. Hyg. 59(1): 171-174

POLIMORFISMO GENTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE DIFERENTES HOSPEDEROS DE


REAS ENDMICAS DEL PER

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDAD/MES

Obtencin de material biolgico:


Ica
Ayacucho
Cajamarca
Ucayali
Extraccin de DNA de protoesclices de E.
granulosus
Estandarizacin de tcnicas moleculares
Procesamiento de muestras utilizando tcnicas
moleculares.
Anlisis de datos
Elaboracin de informe

9 10 11 12

x
x
x
x
x x x x
x x x
x x x x x
x

x
x

PRESUPUESTO
PRESUPUESTO DETALLADO
RUBRO

Recursos humanos

COSTO
NMERO DE
UNITARIO UNIDADES
03 Bilogos
01 Mdico
01 Tec. Lab.

TOTAL

800.00
1500.00

02 viales
01 Frasco

1600.00
1500.00

1800.00

02 viales

3600.00

6800.00

1 kit

6800.00

3600.00

1 kit

3600.00

110.00
500.00
3500.00

01 frasco
01 frasco
01 Kit

110.00
500.00
3500.00

MATERIALES E INSUMOS
Insumos:
Marcador de DNA 100 pb
MDE (Mutation Detection Enhancement) gel
de poliacrilamida x 250 mL
Enzima DNA polimerasa de alta fidelidad,
termoactivable 5U/ul x 500 U
Kit de secuenciamiento TermoSequenase Cy5
Dye terminador kit x 100 Rxns
Enzima DNA polimerasa termoactivable
5U/ul x 1000U
Tiosulfato de Sodio pentahidratado x 1kg
Nitrato de plata x 100 g
Kit purificacin Qiaquick para productos de
PCR x 250 rxns

POLIMORFISMO GENTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE DIFERENTES HOSPEDEROS DE


REAS ENDMICAS DEL PER

Materiales de laboratorio:
8000.00
Software LabWorks 4.0
700.00
Tubos para PCR de 0.2ml (caja x 1000)
Tubos de microcentrifuga x 1,5 ml (caja x 400.00
500 unidades)
Fotografias instantneas Polaroid 665 caja x 150.00
10 fotos
500.00
Tips con filtro de 200 ul (caja x 1000)
600.00
Tips con filtro de 20 ul (caja x 1000)
500.00
Tips con filtro 0,5-10 ul (caja x 1000)
Sub Total

01 unidad
01 caja
03 cajas

8000.00
700.00
1200.00

04 cajas

600.00

01 caja
01 caja
01 caja

500.00
600.00
500.00

33310.00

PRESUPUESTO MENSUALIZADO
RUBRO/MES
RECURSOS
HUMANOS
MATERIALES
E INSUMOS
Pasajes
terrestres ida y
vuelta a Ica
Pasajes areos
ida y vuelta a
Ayacucho,
Cajamarca y
Ucayali
Viticos por 6
das

TOTAL

1
x

2
x

3
x

4
x

6
x

7
x

8
x

9
x

10
x

11
x

12
x

TOTAL
33310.00
20 soles x
2 personas
= 80.00

5
x

480soles x
2 personas
x 3 dptos
= 2880.00

110soles x
2 personas
x 6 dias x
4 dptos =
5280.00

41550.00

POLIMORFISMO GENTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE DIFERENTES HOSPEDEROS DE


REAS ENDMICAS DEL PER

ANEXO I

FICHA EPIDEMIOLOGICA DE MUESTRAS DE PROTOESCOLICES PARA


ESTUDIO DE POLIMORFISMO GENETICO

Tipo de muestra:
Cdigo de la muestra:
Fecha de obtencin de la muestra:...
Tipo de hospedero intermediario: Ovino ( ), Vacuno ( ), Caprino ( ), Otros ( )..
Lugar de procedencia del hospedero intermediario:
Departamento:
Localidad:...
Matadero:
rgano de procedencia de la muestra:

Hgado ( )

Pulmn ( )

Medio de transporte de la muestra:


Alcohol al 96 % ( )
Solucin de formol al 10% ( )

S-ar putea să vă placă și