3.2.2.2 PARMETROS RELACIONADOS CON LA EFICACIA.

Experimentalmente la eficacia se relaciona con la anchura de pico, de manera

que una separacin es eficaz cuando proporciona picos estrechos (es decir, si
existen pequeas diferencias entre el tiempo que tardan las distintas molculas
de un analito en alcanzar el detector).
Calculo del ancho de la base del pico W b y a mitad de la altura de pico
W1/2h.
Si asumimos que el pico es simtrico, con forma gaussiana, e ancho en la base
(Wb) y a mitad de la altura (W1/2h) para ese pico vendr determinado por:

W b =4
W 1 /2 h=2.354
Donde = desviacin estndar de la banda.

W1/2h
1/2h

Wb

Figura 1. Ancho de la base y a mitad de la altura para un pico gaussiana, y curvas

gaussianas con la misma media y diferente desviacin estndar.

Sin embargo, el ancho de banda Wb no puede ser tomado como una medida de
la eficacia, es preciso relacionar la anchura del pico con su tiempo de retencin
tr. As, la eficacia se puede expresar segn el nmero de platos tericos N,
que se calcula:

N=

tr
4

( )

N=16

tr
Wb

( )

N=5.54

tr
W 1/ 2 h

Cuanto mayor sea N, mayor ser la capacidad del sistema cromatogrfico para
separar analitos que difieren poco en su tiempo de retencin y por lo tanto ms
eficaz.
Altura de plato H. Es la altura equivalente a un plato terico, la cual se
calcula de acuerdo con:

H=

L
N

Donde L es la longitud de la columna y N el nmero de platos tericos. Cuanto

menor sea H mayor ser la eficacia.
Para que stos parmetros sean tiles para calcular la eficacia, es necesario,
por un lado, informar sobre el valor de k del analito que se ha utilizado y debe
ser un valor k>5.
3.2.2.3. PARMETROS RELACIONADOS CON LA MEDIDA DE SEPARACIN.
Para describir lo bien que se separan 2 analitos en un sistema cromatogrfico,
se utilizan los siguientes parmetros.
Factor de separacin . Indica la selectividad de un sistema cromatogrfico
para separar una pareja de analitos o bandas adyacentes.

K B k B tr B
= =
K A k A tr A

Donde A es el compuesto menos retenido y B es el compuesto ms retenido,

segn esta definicin de siempre ser mayor que 1, >1. Cuanto mayor sea
ms fcil ser la separacin de 2 analitos en una mezcla.
Sin embargo a solo tiene en cuenta la retencin de los analitos y no considera
la eficacia del sistema cromatogrfico. Por lo tanto existe otro parmetro que si
toma en cuenta ambos aspectos.
Resolucin Rs. Es la distancia entre los mximos de los picos dividida entre el
ancho promedio de los mismos en la base.

Rs=

t r Bt r A

( W bAW bB) 0.5

Rs=1.18

t r B t r A

( W 1 /2 hAW 1/ 2 hB )

Una Rs> o igual a 1.5 representa el caso ideal donde se produce la separacin
completa entre bandas de analitos adyacentes, esto es una separacin hasta la
lnea base, sin embargo un valor de Rs=1 o mayor se considera adecuado
Para conseguir una buena separacin en un tiempo mnimo, resulta
conveniente desarrollar una ecuacin que relacione Rs con el factor de
retencin, el factor de separacin y con el nmero de platos tericos.

Rs=

N 1/ 2
4

kB
1

1+ k B

( )( ) ( )

3.2.3 APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFA EN COLUMNA.

La cromatografa permite la separacin de numerosas especies qumicas,
incluso si stas se encuentran estrechamente relacionadas entre s. Pero
adems, la cromatogrfia permite tambin la identificacin de las especies
separadas y su posterior cuantificacin.
Anlisis Cualitativo.
Los parmetros relacionados con la retencin (tr, tr, Vr y Vr) proporcionan
informacin para poder identificar analitos en las muestras. Para ello se
compara el cromatograma obtenido para una disolucin problema de la
muestra con el obtenido para una disolucin patrn de analito que se quiere
identificar (o buscar) en la misma, con la precaucin de que ambos
cromatogramas se deben haber obtenido bajo las mismas condiciones
cromatogrficas. La no coincidencia de stos parmetros en ambos
cromatogramas indica que la identificacin no es positiva, es decir, que el
analito buscado no se encuentra presente en la muestra.
La coincidencia solamente implica una posibilidad en la identificacin positiva,
porque en la muestra podra haber otro compuesto cuyos parmetros de
retencin coincidan con los del analito buscado.
Un parmetro que funciona mucho mejor en el anlisis cualitativo es la
retencin relativa o factor de separacin, , ya que se calcula como el cociente
entre el tr para el analito buscado y el trde otro compuesto (denominado
patrn interno, SI) inyectado junto con el analito tanto en la disolucin patrn
como en la disolucin problema de la muestra.

tr analito
tr SI

Anlisis Cuantitativo
El anlisis cuantitativo se basa en la relacin del rea (o altura) del pico del
analito (A) con su concentracin de acuerdo con:

A=f analito C
El rea o altura de pico obtenida para un analito en el cromatograma (A) es
igual a su concentracin (C) multiplicada por un factor de respuesta (f) que es
una medida de la sensibilidad del detector hacia ese compuesto.
Si se recurre a la altura de pico, se deben mantener estables las condiciones
cromatogrficas, las variables ms importantes a controlar son: la
temperatura, el flujo de fase mvil y la velocidad de inyeccin.
Por este motivo, es mejor usar el rea A, con fines cuantitativos ya que es
independiente de los efectos de ensanchamiento de banda producidos por
modificaciones en las condiciones cromatogrficas a lo largo del anlisis.
El principal mtodo de anlisis cuantitativo es el calibrado con patrn
externo o adiciones estndar. En este caso se preparan varias disoluciones
patrn que contienen concentraciones crecientes y conocidas del analito. El
rea de cada pico cromatogrfico se representa frente a la concentracin del
analito en las disoluciones patrn.
La pendiente y la ordenada en el origen de la mejor lnea recta que pase por
los puntos puede calcularse estadsticamente mediante anlisis de regresin
utilizando el mtodo de los mnimos cuadrados. Se obtiene entonces una recta
de calibrado (A=mC+b) gracias a la cual podr determinarse la concentracin
del analito en la muestra problema.
Mtodo del patrn interno.
Se utiliza cuando la cantidad de muestra a inyectar vara de un anlisis a otro
por razones difciles de controlar.
El mtodo se basa en aadir tanto a las disoluciones patrn como a la
disolucin problema de la muestra una cantidad fija de una sustancia pura
(patrn interno, SI). Se determinan las reas de los picos cromatogrficos para
el analito y para el SI y se calcula el cociente de las reas. Entonces, se
representan estos cocientes frente a las concentraciones del analito en las
disoluciones patrn y se obtiene la recta de calibrado. A partir de la relacin de

reas obtenida para los picos del analito y SI en la disolucin problema,

podremos conocer su concentracin interpolando en la recta.