PONTIFCIA UNIVERSIDADE CATLICA DO PARAN

ESCOLA DE SADE E BIOCINCIAS

CURSO DE BIOTECNOLOGIA

ALINE CAMPOS
DIEGO BRITO
MARIA HELENA DA ROSA FARFAN
VALRIA HOLTMAN

CROMATOGRAFIA EM PAPEL

CURITIBA

2015

ALINE CAMPOS
DIEGO BRITO
MARIA HELENA DA ROSA FARFAN
VALRIA HOLTMAN

CROMATOGRAFIA EM PAPEL
Relatrio
tcnico
apresentado
na
disciplina de Mtodos Analticos do Curso
de Graduao em Biotecnologia da
Pontifcia Universidade Catlica do
Paran como forma parcial de avaliao
referente 1a Parcial.
Orientador: Prof. Maria Cristina Vasconcellos

Curitiba, abril de 2015SUMRIO

1 INTRODUO..........................................................................................................3
2 REVISO BIBLIOGRFICA....................................................................................4
3 METODOLOGIA.......................................................................................................7
3.1 ANLISE CROMATOGRFICA DO CORANTE DE UM SUCO DE UVA.......8
3.2 IDENTIFICAO DE AMINOCIDOS.............................................................8
4 DISCUSSO.............................................................................................................8
4.1 CLCULOS......................................................................................................8
4.2 DISCUSSES................................................................................................10
5 CONCLUSO.........................................................................................................11
REFERNCIAS...........................................................................................................12

INTRODUO
Neste relatrio sero exibidos os resultados obtidos durante o experimento de

dosagem colorimtrica do azul de metileno, utilizando tcnicas de espectrofotometria

com o auxlio da lei de Beer.
DIEGO.

REVISO BIBLIOGRFICA
O termo cromatografia tem sido aplicado a diversos sistemas e tcnicas, nos

quais os componentes de uma mistura so separados com base nas diferenas de

velocidade com que so transportados atravs de uma fase fixa estacionria, por
uma fase mvel lquida ou gasosa (SKOOG, 2010).
A cromatografia em papel a tcnica mais simples de cromatografia.
Utilizam-se pequenas quantidades das amostras, sendo da ordem de microgramas a
miligramas; apresenta boa capacidade de resoluo, a anlise rpida, desde
minutos ou demorada, at horas, e fcil eluir as substncias do papel. Essa
tcnica usada, preferencialmente, na separao e identificao de compostos
polares como antibiticos hidrossolveis, cidos orgnicos e ons metlicos.
classificada como cromatografia por partio devido fase estacionria e a fase
mvel serem lquidas (COLLINS, 2006).
A cromatografia lquido-lquido em papel tem a separao ou distribuio dos
seus componentes de acordo com as diferentes solubilidades relativas desses
componentes com as fases mvel e estacionria, que so imiscveis entre si. Assim,
os componentes menos solveis na fase estacionria se movimenta mais
rapidamente ao longo do papel, enquanto os mais solveis na fase estacionria
sero seletivamente retidos no papel, apresentando uma movimentao mais lenta
(VOGEL, 2002).
Esse mecanismo de separao acontece devido celulose presente no
papel. A celulose formada por duas mil ou mais unidades de glicose anidra, ligadas
por tomos de oxignio. A gua, um lquido polar, tem alta afinidade pelas hidroxilas
de cada glicose, formando com elas ligaes de hidrognio. Dessa forma a gua fica
retida, funcionando como fase estacionria. Enquanto isso, os lquidos menos
polares, como solventes orgnicos, so repelidos por esta estrutura, funcionando
como fase mvel (COLLINS, 2006).
Ento, define-se por fase estacionria um lquido ou um suporte slido de
grande rea, onde a amostra colocada e onde ocorrer o processo de separao;
e por fase mvel, um lquido ou uma mistura de lquidos que fluem atravs do papel,
com a funo de arrastar e separar os componentes da amostra (COLLINS, 2006).

Ainda segundo Collins (2006), existem outros termos que so utilizados na

cromatografia em papel e que so de fundamental importncia saber suas
definies:
Revelador ou agente cromognico um agente fsico, que pode ser a luz
UV, por exemplo, ou um agente qumico, como vapores de iodo, que so utilizados
para tornar visveis as substncias separadas pela cromatografia em papel, quando
estas no apresentam cor;
Resoluo a distncia mnima entre duas manchas enquanto ainda
possvel distingui-las separadamente;
Desenvolvimento o movimento dos componentes da amostra quando
deslocados pela fase mvel. Quanto a sua direo, pode ser: ascendente, de baixo
para cima; descendente, de cima para baixo; horizontal, de um lado para o outro
quando o papel estiver na horizontal; e circular, de um ponto central para a periferia
de um crculo imaginrio;
Aplicao deposio da soluo da amostra no ponto de partida no papel
cromatogrfico;
Frente da fase mvel linha de chegada da fase mvel, visvel quando se
retira o papel da cuba cromatogrfica;
Distncia percorrida (dr) distncia percorrida pela fase mvel, do ponto de
partida at a linha de chegada;
Fator de retardamento (Rf) quociente entre as distncias percorridas
simultaneamente do ponto de partida at o centro de maior concentrao da mancha
do soluto, e at a frente da fase mvel;
Cmara ou cuba cromatogrfica recipiente de tampa hermeticamente
fechada, onde se coloca o papel cromatogrfico.
A partir da cromatografia em papel possvel fazer a anlise qualitativa em
funo do fator de retardamento e das cores apresentadas e, utilizando um
densmetro, fazer a anlise quantitativa. Tambm possvel fazer a extrao dos
componentes separados mediante um solvente adequado (COLLINS, 2006).
A fase mvel, na cromatografia lquido lquido de papel, movimenta-se em
fluxo ascendente pelo fenmeno de capilaridade, sendo no incio um movimento
rpido e diminuindo gradativamente, podendo estagnar-se quando a fora
ascendente da capilaridade for neutralizada pela ao da gravidade (COLLINS,
2006).

Como j exposto, a anlise qualitativa de uma substncia realiza-se atravs

da cor da mancha e de seu fator de retardamento (Rf), e este pode ser determinado
a partir da expresso:
Rf = dr, distncia(cm,mm) percorrida pela substncia
dm, distncia(cm,mm) percorrida pela frente da fase mvel
Onde, a distncia percorrida pelo soluto em um tempo determinado medida
desde o ponto de aplicao at o centro da mancha, e a distncia percorrida pela
fase mvel, desde o ponto de partida at o ponto extremo atingido pela linha de
chegada (COLLINS, 2006).
Mantendo as caractersticas do papel, a qualidade e a quantidade da fase
mvel, a temperatura, o volume e a concentrao da amostra, o Rf um valor
caracterstico de cada substncia. Devido a essas variveis, aconselha-se trabalhar
com padro e amostra de forma a mais semelhante possvel e fazer a anlise de
ambas nas mesmas condies, evitando a ocorrncia de erros (COLLINS, 2006).
Outros erros que podem ocorrer esto relacionados com a difuso da
concentrao da difuso lateral e do equilbrio incompleto do soluto, da fase mvel e
da fase estacionria. Por difuso lateral, o erro pode ocorrer quando o soluto e a
fase mvel percorrem distncias distintas entre si. A separao incompleta (ou
superposio das manchas) pode ocorrer por causa da movimentao do soluto de
regies de maior para regies de menor concentrao, ou ainda, o erro pode ocorrer
por fluxo rpido, no existindo um tempo ideal de contato do soluto entre a fase
mvel e a fase estacionria (COLLINS, 2006).
A seleo do papel cromatogrfico uma varivel muito importante e deve ser
testada de acordo com a amostra a ser analisada. Collins, (2006) afirma que, para
usos especiais indicado modificar o papel e que os mais utilizados so:
Papel acetilado til na separao de substncias hidrfobas;
Papel impregnado o papel umedecido com silicone, parafina,
dimetilformamida ou aminas de alta massa mola. utilizado na separao de
substncias moderadamente hidrfobas ou hidrfilas;
Papel carregado disperso de resinas poliestirnicas de dimetros
reduzidos. So trocadoras de ons, nas fibras de celulose o que permite a separao
de substncias inorgnicas e orgnicas ionizadas ou ionizveis;

Papel de fibra de vidro as fibras de vidros substituem as fibras de celulose.

til em condies extremas se temperatura e de acidez, e o papel deve ser
impregnado com suspenses aquosas de slica gel ou alumina;
Papel tratado com cido brico utilizado para separar substncias anfteras
ou com muitas hidroxilas;
Papel recoberto com adsorvente como a slica compatibiliza as vantagens
da celulose e da slica, permitindo que a separao ocorra pelos mecanismos de
partio e adsoro;
A varivel que possui maior efeito nas separaes dos componentes da
amostra a fase mvel. Por isso deve-se levar em considerao a natureza
qumica, a viscosidade e a polaridade das substncias que se deseja separar da
amostra para, ento escolher a fase mvel (COLLINS, 2006).
Outra varivel importante a temperatura. Esta deve ser controlada e
mantida constante durante toda a anlise para manter a reprodutibilidade do fator de
retardamento (Rf). E ela tambm capaz de aumentar a capacidade de resoluo
da tcnica quando escolhida adequadamente (COLLINS, 2006).
conveniente dividir a cromatografia em papel em duas categorias, de
acordo com as polaridades relativas das fases mvel e estacionria. A cromatografia
em papel com fase normal utilizado quando a fase estacionria polar e a fase
mvel no polar. A ordem de eluio do soluto baseia-se no princpio de que as
substncias no polares preferem a fase mvel e sero eludos primeiros, e que as
substncias polares preferem a fase estacionria e sero eludos depois (VOGEL,
2002).
Quando a fase estacionria for aquosa, o papel saturado com vapor de
gua ou vapor de gua e outro solvente, antes de iniciar o desenvolvimento
cromatogrfico. Quando a fase estacionaria for no-aquosa, o papel tratado com
soluo de acetona e dimetilformamida, antes de iniciar o processo cromatogrfico
(COLLINS, 2006).
Na cromatografia em papel com fase reversa, a fase estacionria no polar
e a fase mvel polar. A ordem de eluo normalmente oposta cromatografia
em papel com fase normal, isto , as substncias polares so eludas antes e as no
polares depois (VOGEL, 2002).

O papel tratado com substncias hidrfobas como parafina, leo e silicone,

dissolvidas em solventes orgnicos como ter de petrleo ou hexano (COLLINS,
2006).
A cromatografia com fase reversa muito til por ser verstil e eficaz. Isto se
deve ao fato de praticamente todas as molculas orgnicas serem parcialmente
hidrofbicas e serem capazes de interagirem com fases estacionrias no polares
(VOGEL, 2002).

3
3.1

METODOLOGIA
ANLISE CROMATOGRFICA DO CORANTE DE UM SUCO DE UVA
Obteno do corante:
Preparou-se uma soluo concentrada de suco de uva Tang, pesou-se 1g de

p do suco, diluindo-o em 20 mL de gua deionizada. Acidificou-se com cido

tartrico e foi adicionado 0,3g de l branca tratada. Continuou-se o aquecimento
com ebulio moderada por cerca de 10 minutos. A l foi retirada do cido e foi
lavada com gua corrente.
A l foi transferida para outro bcker de 100 mL, contendo 2 mL de cido
tartrico, o conjunto foi aquecido por no mximo 5 minutos e a l foi novamente
lavada em gua corrente. A operao foi repetida at que a gua de lavagem fosse
incolor.
Transferiu-se a l para um bcker de 100 mL contendo 10 mL de gua
deionizada com 10 gotas de hidrxido de amnio PA. Aqueceu-se tudo por cerca de
5 minutos at que o corante foi solubilizado. A partir desse ponto o corante estava
pronto para ser usado na anlise cromatogrfica.
Corrida cromatogrfica:
Com uma rgua e uma lapiseira foram feitas as medidas de margens superior
(3 cm), inferior (2 cm) e laterais (3 cm) no papel cromatogrfico, observando com
cuidado para que a distncia de corrida das amostras tenha no mnimo 15 cm de
altura.
Num bcker de 250 mL misturou-se 50 mL de n-butanol, 20 mL de etanol, 20
mL de gua deionizada e 10 mL de hidrxido de amnio, resultando na soluo de
fase mvel. Transferiu-se a soluo para a cuba redonda, homogeneizou-a e deixoua tampada.
Aplicou-se a amostra em duplicada na parte central do papel. O papel foi
grampeado em forma de cone, com espao entre os grampos, para evitar que a
corrida ocorresse no sentido horizontal.
O papel com a amostra foi introduzido na cuba de vidro, com cuidado para
que o nvel da fase mvel ficasse abaixo do ponto de aplicao da amostra.

10

3.2

IDENTIFICAO DE AMINOCIDOS
Em um bcker de 250 mL misturou-se os solventes n-butanol (40 mL), cido

actico (10 mL) e gua destilada (50 mL), na proporo de 4:1:5, obteve-se 100 mL
da soluo, que foi transferida, homogeneizada e tampada na cuba cromatogrfica.
O papel cromatogrfico foi medido e recortado com margens laterais de 2 cm,
margens inferior e superior de 2 cm cada, com uma altura interna de corrida com 6
cm e uma largura total de no mnimo 16 cm.
Os padres foram tirosina, vanilina, alanina e histialina a 5% e a 0,5%.
Com o auxlio do capilar, aplicaram-se os padres na linha inferior da
esquerda para a direita e por ltimo foi aplicada a amostra direita dos padres.
O papel cromatogrfico com os padres e a amostra foi grampeado em uma
forma de cilindro e foi introduzido na cuba cromatogrfica, at que a fase mvel
chegasse na marcao final de corrida.
Retirou-se o papel da cuba que foi posto para secar na estufa de 90-100C;
aps a secagem, mergulhou-se o papel em uma soluo 0,2% de ninidrina, que
reage com o grupo amina provocando uma reao reveladora de cor prpura.
Retirou-se o papel da soluo e deixou-o secar em estufa novamente para a
revelao.

11

4
4.1

RESULTADOS E DISCUSSO
CLCULOS

4.1.1 Anlise Cromatogrfica do Corante de um Suco de Uva

Figura 1: Cromatografia da tcnica de anlise de corantes.

Formulrio:
Razo de Frente = Distncia percorrida pelo padro/amostra (dA)
Distncia percorrida pela fase mvel (dT)
Vermelho 40:
A1 = 5,1 cm = 0,29
17,2 cm

A2 = 5,2 cm = 0,30
17,2 cm

Bordeaux 5:
B1 = 12,8 cm = 0,74
17,2 cm

B2 = 11,6 cm = 0,67
17,2 cm

12

Azul Brilhante:
C1 = 13,4 cm = 0,77

C2 = 12,1cm = 0,70

17,2 cm

17,2 cm

4.1.2 Identificao de Aminocidos

Figura 2: Cromatografia da tcnica de identificao de aminocidos.

Formulrio:
Razo de Frente = Distncia percorrida pelo padro/amostra (dA)
Distncia percorrida pela fase mvel (dT)
Amostra 3

Amostra 4

Rf = 1,3 cm = 0,2955 0,30

Rf = 0,8 cm = 0,1818 0,20

4,4 cm

4,4 cm

4.2

DISCUSSES

4.2.1 Anlise Cromatogrfica do Corante de um Suco de Uva

A tcnica tinha por objetivo a qualificao dos corantes presentes em um
preparo slido de suco de uva, a embalagem do produto apresentava que no
preparo havia trs corantes: vermelho 40, bordeaux 5 e azul brilhante. Essas trs
substncias foram encontradas no cromatograma atestando assim o que dito na
embalagem do produto.
A mancha do corante bordeaux 5 apresentou formao de uma pequena
cauda, o que pode comprometer anlise do componente j que a formao de cauda
mostra que a cromatografia no foi precisa, a formao de cauda pode ter sido
causada por uma aplicao excessiva de amostra nos pontos de aplicao ou a
amostra pode ter sido preparada de forma muita concentrada.
A mancha do corante vermelho 40 apresentou uma forma bem delimitada sem
que houvesse a formao de cauda. Esse corante ficou posicionado a cima do
corante bordeaux 5, mostrando uma maior afinidade com a fase mvel,
demonstrando assim que o vermelho 40 e mais apolar que o bordeaux 5, j que este
ficou abaixo na corrida cromatogrfica.
O corante azul brilhante apresentou uma pequena mancha logo cima do
corante vermelho 40, mostrando que ligeiramente mais apolar que o vermelho 40 e
possui a maior afinidade com a fase mvel em comparao com os outros dois
corantes.
Algumas alternativas para melhor distanciar o azul brilhante do vermelho 40
seria aumentar a concentrao da amostra, consequentemente aumentaria a
colorao de cada mancha, porm tornaria o azul mais visvel e seria mais fcil de
isol-lo; aumentar a altura da fase estacionria, entretanto uma opo pouco
vivel, pois demora muito; outro mtodo consiste em trocar uma ou mais
substncias da soluo de fase mvel para que torne-a mais apolar, fazendo com
que ela tenha mais afinidade com a substncia menos polar, no caso, o azul
brilhante.
No experimento houve duas aplicaes de amostra, essa aplicao foi feita
para que se pudesse realizar o experimento em duplicata. Porm, as corridas no

apresentaram uniformidade, levando a Rf com uma grande variao. Essa variao

pode ser relacionada com o preparo do papel de cromatografia, uma vez que o
papel utilizado apresentava desnvel, o que comprometeu a delimitao da borda
inferior, fazendo com que esta ficasse com uma diferena de 0,2 cm.

4.2.2 Identificao de Aminocidos

Para esse experimento foram testados sete padres para uma amostra. Na
preparao da fase mvel, foram-se usados trs solventes: n-butanol, cido actico
e gua deionizada, todos polares (n-butanol menos polar ao ser comparado aos
outros solventes) resultando em uma fase com tendncia polar; em comparao, a
fase estacionria do sistema, o papel cromatogrfico, possui tendncia apolar, o
oposto de sua fase mvel.
Aps a insero da fase estacionria na cuba cromatogrfica contendo a fase
mvel, o experimento levou cerca de meia hora, at ser interrompido, impedindo a
fase mvel de subir at a linha almejada. Em vez de percorrer os 6 cm de distncia
previsto, a fase mvel percorreu apenas 4,4 cm de altura no papel cromatogrfico.
O papel foi retirado da cuba e foi secado em estufa para ento ser
mergulhado em uma soluo de ninidrina, um agente revelador que faz
complexao com o aminocido colorindo-o com uma pigmentao que varia entre
tonalidades de rosa at o roxo, e foi ento levado de volta para a estufa, pois o calor
faz a reao da ninidrina com os aminocidos acontecer.
Os padres e a amostra foram aplicados no papel cromatogrfico na seguinte
ordem: 1 - Tirosina 5%; 2 Vanilina 5%; 3 Alanina 5%; 4 Histialina 5%; 5
Alanina 0,5%; 6 Tirosina 0,5%; 7 Histialina 0,5%; 8 Amostra.
Ao retirar o papel da estufa, percebe-se um resultado incerto, muitas manchas
de colorao roxa e rosa claro provenientes de marcas de dedos aparecem na borda
e perto das margens tracejadas, amostras como: 2, 5 e 8, no apresentaram
nenhuma mancha no seu desenvolvimento, j a amostra 1 demonstrou um borro
amarelado no incio, desaparecendo logo em seguida, enquanto isso as amostras 3
e 4 tiveram manchas roxas bem definidas; nas amostras 6 e 7, manchas de uma
tonalidade roxa muito clara pareceram apenas borres mal demarcados no papel.

A partir desses resultados foi possvel afirmar que a anlise de cromatografia

de papel no foi conclusiva e nem efetiva no experimento de identificao de
aminocidos de uma amostra comparando-a com padres. Muitas manchas
atrapalharam a visualizao dos padres e da amostra, e nenhum padro de
aminocido de concentrao 0,5% foi claramente definido, o que pode ter relao
com a baixa concentrao dificultando a obteno de resultados. O curto tempo do
experimento, que teve de ser interrompido poderia tambm afetar os resultados e a
disposio/distncia percorrida de manchas com maior afinidade com a fase mvel,
se mais manchas fossem visveis para anlise.
Apenas os padres 3 e 4 (Alanina 5% e Histialina 5%, respectivamente) foram
visveis, apresentando manchas arroxeadas e oblongas, ou seja, formaram cauda, o
que pode ser resultado de uma aplicao em excesso do produto. Esses padres
tiveram uma baixa razo de frente, ou seja, sua distncia percorrida no papel foi
pouca em comparao com a distncia total percorrida pela fase mvel. Pode-se
dizer ento, que esses aminocidos possuem uma tendncia mais polar, uma vez
que interagiram mais com as hidroxilas da fase estacionria (ficando retidas por
primeiro) do que com a fase mvel.

CONCLUSO
Aps o estudo feito atravs da anlise qumica espectrofotomtrica realizado

em sala de aula, foram obtidas solues com a finalidade de comparar o seu valor
de absorbncia com o seu valor de concentrao, fazendo assim, a curva de
calibrao.
A curva de calibrao um grfico que fornece a relao da absorbncia com
a concentrao, sendo elas diretamente proporcionais. Ao realizar a curva de
calibrao, conseguimos obter o valor de concentrao desconhecida de alguma
substncia que sabe-se a absorbncia.
DIEGO!

REFERNCIAS
VOGEL, Arthur I. Anlise Qumica Quantitativa. 6 Edio. So Paulo: LTC, 2002.
SKOOG, Douglas A. Fundamentos de Qumica Analtica. 8 Edio. So Paulo:
Cengage Learning, 2006.
COLLINS, Carol H., BRAGA, Gilberto L., BONATO, Pierina S. Fundamentos de
Cromatografia. Campinas, So Paulo: Editora da UNICAMP, 2006.