ANLISIS CLNICO

DIAGNOSTICO ANEMIA HEMOLTICA

FUNDAMENTO
ANEMIA HEMOLTICA AGUDA
Bajo

condiciones

crticas

puede

ocurrir

hemlisis

intravascular

masiva

hemoglobinuria. El fallo renal es la complicacin ms importante y puede llegar a ser

letal. La hemlisis se produce rpidamente luego de un estrs oxidativo en los
eritrocitos, generalmente desencadenado por agentes infecciosos, frmacos, agentes
qumicos o alimentos. En pases como China y Taiwn, con una rica tradicin en
medicina naturista, la mayora de las crisis hematolgicas son debidas al consumo de
hierbas

medicinales .

Por lo general la hematuria se resuelve dentro de los 4 a 7 das. Se piensa que esto es
debido a que los eritrocitos ms viejos que tienen la actividad de G6PD ms baja son
los que se hemolizan primero. Una vez que esta poblacin eritrocitaria se ha
eliminado, los glbulos ms jvenes y reticulocitos, que tienen una mayor actividad,
son capaces de manejar el dao oxidativo sin hemlisis. La duracin de la
bilirrubinemia no conjugada depender del estado de normalidad heptica del
paciente.
En ciertos casos particulares como en la ciruga cardaca con circulacin
extracorprea (CEC), los pacientes estn sometidos a un estrs oxidativo intenso. Las
clulas rojas de una persona deficiente de G6PD son incapaces de mantener la
homeostasis,

dando

como

resultado

hemlisis

intensa.

Tambin se han reportado casos de pacientes que luego de 48 horas de la

instauracin de un tratamiento de quimioterapia, son internados de urgencia debido a
crisis

hemoltica,

produciendo

anemia

severa,

intensa

hematuria

metahemoglobinemia
ANEMIA HEMOLTICA CRNICA NO ESFEROCTICA
Una minora de pacientes con dficit de G6PD pueden presentar anemia sin necesidad
de ser expuestos a agentes externos desencadenantes de hemlisis. Estos pacientes
corresponden a la clasificacin de variantes tipo I de deficiencia de G6PD y poseen
mutaciones especficas y poco frecuentes.
Estos pacientes generalmente son evaluados por presentar anemia e ictericia, ya sea
en el perodo neonatal o en forma recurrente durante la infancia y adultez.

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La severidad de la anemia puede tener un amplio rango, desde ser subclnica hasta
necesitar transfusiones. Esta anemia es por lo general normoctica, pero en ocasiones
puede ser macroctica debido a la cantidad de reticulocitos (hasta 20% o ms) los
cuales incrementan el volumen corpuscular medio, cambiando y ensanchando la curva
de distribucin de las clulas rojas en el hemograma.
La hiperbilirrubinemia se presenta sin alteraciones en enzimas hepticas, baja
concentracin de haptoglobina y valores incrementados de lactato deshidrogenasa
El diagnstico definitivo de la deficiencia de G6PD se basa en la determinacin de la
actividad de la enzima en eritrocitos en forma cuantitativa midiendo la tasa de
produccin NADPH a partir de NADP.

Materiales y Mtodos
1.

muestras residuales de sangre seca en papel de filtro

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE G6PD

PROCEDIMIENTO
ENSAYO COMERCIAL CUANTITATIVO
Se utiliza el mtodo espectrofotomtrico cuantitativo para la determinacin de la
actividad de G6PD en muestras de sangre seca en papel de filtro Neonatal G-6-PD,
ZenTech, Belgium. En este mtodo, las muestras se eluyeN en un buffer y una alcuota
del eludo se incuba con un reactivo en presencia de NADP. La enzima G6PD presente
en la muestra catalizara la oxidacin de la glucosa 6-fosfato a 6-fosfogluconato. El
NADPH producido reacciona con un reactivo de color, en el cual una sal de tetrazolio
es reducida produciendo una reaccin de color que se mide a 550 nm y es
directamente proporcional a la actividad de G6PDH presente en la muestra. Los
resultados se calculan evaluando el aumento de la absorbancia por minuto de los
desconocidos contra una curva realizada con estndares de actividad enzimtica
conocida. El valor obtenido se corrige a una concentracin de hemoglobina
normalizada mediante la lectura a 405 nm.
ENSAYO FLUOROMTRICO

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Discos de 3 mm de las muestras de sangre seca se incuban durante 2 horas a 37 C
en buffer Trietanolamina/EDTA, pH: 7,6 conteniendo 30 moles/L de glucosa-6-fosfato,
como sustrato y 15 moles/L de NADP. Luego de la precipitacin con etanol la
formacin de NADPH es medida en un Fluormetro Victor 2D Fluorometer, Perkin
Elmer utilizando una longitud de onda de excitacin de 355 nm y una longitud de onda
de emisin de 460 nm. La curva de calibracin es realizada con los estndares
comerciales provistos por la firma ZenTech con valores de actividad enzimtica
conocidos expresados en U/gHb.
La comparacin de los mtodos se realiza siguiendo la gua "Comparacin de
mtodos y estimacin del sesgo utilizando muestras de pacientes" EP09-A2 de Clinical
and Laboratory Standard Institute (CLSI) . El intervalo de referencia para los valores de
actividad de la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa relacionada a la cantidad de
hemoglobina contenida en la muestra fue establecido y verificado de acuerdo a las
normas para la definicin, establecimiento y verificacin de intervalos de referencia en
el laboratorio clnico elaboradas por Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI
28 A3E) .

REFRENCIA

SCIELO .BIOQUMICA CLNICA. Deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa en

recin nacidos en Argentina. (En lnea). Citado en http://www.scielo.org.ar/scielo.php?
pid=S0325-29572014000200002&script=sci_arttext

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DIAGNOSTICO DE ENFERMEDAD DE VON WILLEBRANT

PRUEBA PARA EL DIAGNSTICO DE LA ENFERMEDAD DE VON WILLEBRANT

ENSAYO DE LA ACTIVIDAD DEL COFACTOR RISTOCETINA DEL FACTOR VON
WILLEBRAND (FVW: RCO O FVW: ACT)
INTRODUCCIN
El ensayo del cofactor ristocetina es esencial para el diagnstico de la enfermedad de
von Willebrand (EvW). Si bien la prueba de agregometra plaquetaria inducida por
ristocetina (en el plasma rico en plaquetas) puede llevarse a cabo cuando se realizan
los estudios de agregometra plaquetaria, dicha prueba no es lo sufi cientemente
sensible, de manera que podra detectar una agregacin defi ciente en los trastornos
distintos de la EvW. El ensayo FvW:RCo es especialmente til para la deteccin de la
EvW de tipo 2A, 2B y 2M en las que el antgeno del FvW (FvW:Ag) puede resultar
normal o casi normal mientras que el FvW:RCo es notablemente bajo.
ENSAYO DE COFACTOR RISTOCETINA
El mtodo que se describe a continuacin combina un mtodo de ensayo
macroscpico y la tcnica de fi jacin de plaquetas de Evans y Austen.
REACTIVOS
Plasma de referencia
Plaquetas fi jadas lavadas
Las plaquetas humanas normales fi jadas con formaldehdo se preparan a partir de
concentrados plaquetarios, como los usados para el tratamiento de pacientes con
alteraciones plaquetarias, mediante el mtodo de Evans y Austen (1977). Ver el
apartado Preparacin de plaquetas fi jadas .
Ristocetina (Ristocetin A SO4 Macrofarm Ltd., Third Floor, 27 Cockspur Street,
Trafalgar Square, Londres, SW1Y 5BN) Diluir 100 mg de polvo en 3,3 ml de solucin
salina. Colocar 0,1 ml en tubos de plstico con tapa y conservar a 70 C. La solucin
madre (stock) preparada tiene una concentracin de 30 mg/ml. La concentracin final

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necesaria en el tubo de ensayo es de 1,0 mg/ml. Para la dilucin de 1 en 4 que
requiere el ensayo ser necesaria una solucin que tenga una concentracin de 4,0
mg/ml. Para obtener dicha concentracin, aadir 0,65 ml de solucin salina a 0,1 ml de
solucin madre con una concentracin de 30 mg/ml. (plaquetas 0,2 + ristocetina 0,1 ml
+ tampn 0,1 debera dar un tiempo testigo >60 segundos).
Tampn salino-citrato-albmina 6g%
Preparar el citrato con la solucin salina (1 parte de citrato trisdico 0,11 M: 5 partes
de solucin salina normal) y aadir 1,2 g de albmina de suero bovino.
MTODO
1. Usando el tampn salino-citrato-albmina, diluir el plasma normal y el plasma de
prueba de la siguiente forma:
Plasma estndar: 1/2, 1/4, 1/8;
Plasma de prueba: 1/2, 1/4, 1/8.
2. Probar cada dilucin a temperatura ambiente de la siguiente forma:
i. En un tubo de coagulacin de vidrio colocar:
0,2 ml de plaquetas fijadas lavadas (concentracin de 800 109/l en solucin de
suspensin).
0,1 ml de plasma diluido.
ii. Mezclar bien, procurando evitar que se generen burbujas. Aadir 0,1 ml de
ristocetina (4,0 mg/ml, para alcanzar una concentracin final de 1,0 mg/ml).
iii. Poner en marcha el cronmetro e inclinar enrgicamente el tubo de un lado a otro
contra un fondo oscuro y con una lmpara que enfoque el tubo.
iv. Anotar el tiempo que tarda en formarse un agregado de un tamao notorio.
Probar cada dilucin por duplicado y por triplicado si la diferencia entre los duplicados
es >10%.
CLCULO
Representar el tiempo que tardan en aglutinarse las diluciones de plasma normal
contra la dilucin/concentracin en una hoja para escala logartmica doble de 2 ciclos.

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Representar los tiempos obtenidos con las diluciones del plasma de prueba. Los grfi
cos deben mostrar lneas rectas y paralelas.
Hacer una lectura de la concentracin del cofactor ristocetina en el plasma de prueba
a partir del estndar y corregir la dilucin y el valor del estndar de la forma que se
indic para los ensayos de una etapa de factor VIII (ver el captulo 23 de manual de
laboratorio 1).
El rango normal deber establecerse dentro del laboratorio, pero por lo general se
encuentra aproximadamente entre 50 y 150 UI/dl.
PREPARACIN DE PLAQUETAS FIJADAS
Figura 29.1. Reactivos para la preparacin de plaquetas fi jadas

MTODO
Emplear plaquetas lo ms frescas posibles conservadas en citratofosfatodextrosa (al igual que en la extraccin de productos sanguneos) o
colocar sangre en citrato 0,109 M y preparar plasma rico en plaquetas (PRP).
Dejar el PRP en un recipiente de plstico tapado a temperatura ambiente
durante una hora y luego a 37 C durante otra hora. Mezclar nueve partes de
PRP con una parte de la solucin de EDTA. Dejar reposar a temperatura
ambiente durante 2 minutos.
Aadir un volumen igual de solucin fi jadora a 4 C y dejar durante toda la
noche a 4 C.
Centrifugar a 280 g durante 20 minutos. Retirar el sobrenadante y dejar
escurrir el pellet plaquetario.
Aadir la solucin de lavado en una cantidad equivalente al 2% del volumen
inicial del PRP y resuspender las plaquetas.
Volver a diluir al 25% del volumen del inicial PRP y dejar a 4 C durante 1 hora.

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Centrifugar a 280 g durante 20 minutos, dejar escurrir y resuspenderen la
solucin de suspensin para su uso inmediato o en la solucinconservadora a
4 C para su uso posterior.
Resuspender hasta alcanzar una concentracin de aproximadamente 800
109/l.
Las plaquetas se asentarn durante su conservacin y formarn sedimentos sueltos.
Antes de dar inicio a un ensayo, retirar la solucin conservadora de la parte superior
de las plaquetas y sustituir con el mismo volumen de solucin de suspensin. Las
plaquetas permanecern estables durante al menos 2 meses.

REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

MANUAL DE LABORATORIO. Diagnstico de la hemofilia y otros trastornos de la

coagulacin. 2ed. (en lnea).Citado en : http://www1.wfh.org/publication/files/pdf1284.pdf