Educao

Quim. Nova, Vol. 32, No. 5, 1338-1341, 2009

COMPARAO ENTRE MTODOS DE QUANTIFICAO EM CROMATOGRAFIA GASOSA: UM
EXPERIMENTO PARA CURSOS DE QUMICA
Carolina Bastos Pereira Ligiero, Lindomar Augusto dos Reis, Gabrieli Lessa Parrilha, Milton Baptista Filho e Maria
Cristina Canela*
Centro de Cincia e Tecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Av. Alberto Lamego, 2000, 28013602 Campos dos Goytacazes RJ, Brasil
Recebido em 23/4/08; aceito em 3/2/09; publicado na web em 7/5/09

COMPARISON OF QUANTIFICATION METHODS IN GAS CHROMATOGRAPHY: AN EXPERIMENT FOR CHEMISTRY

COURSES. This article describes an experiment designed to teach quantitative determination in gas chromatography (GC) in Organic
and Analytical Chemistry practical classes. The experiment consisted of extracting and analyzing eugenol from clove seeds to perform
a quantitative approach aimed at comparing results obtained by external and internal calibration procedures. Therefore, this experiment
proved to be very effective tool to enhance students awareness on the need to understand different types of calibration in GC and on how
to avoid common experimental errors, and to find the best ways to eliminate their interference during the quantitative analysis phase.
Keywords: GC; quantitative analysis; teaching.

INTRODUO
A cromatografia gasosa um tpico apresentado nos cursos de
Qumica, tanto nas disciplinas de Qumica Analtica como de Qumica
Orgnica. No primeiro caso, a cromatografia gasosa mostrada na
maioria das vezes como uma ferramenta analtica quantitativa, uma vez
que o cromatgrafo est ligado a um detector capaz de responder a um
determinado composto de maneira proporcional a sua concentrao.1,2
No caso da Qumica Orgnica, um enfoque maior dado ao aspecto
qualitativo e de separao de misturas, embora a sua utilizao em
termos quantitativos tambm ocorra. A cromatografia gasosa normalmente utilizada como ferramenta analtica nos laboratrios de Qumica
Orgnica durante o curso de graduao.3 Os livros de Qumica Orgnica,
entretanto, raramente trazem teorias sobre o assunto, apenas ressaltando
um dos detectores utilizados que o espectrmetro de massas.4
A difuso e o desenvolvimento da cromatografia gasosa se deram
por seu potencial para realizar anlises quantitativas com velocidade
e rapidez na determinao de compostos orgnicos presentes em
concentraes relativamente baixas em diferentes tipos de amostras.
As matrizes complexas normalmente sofrem diferentes processos de
extrao e o composto de interesse pode ser ento quantificado atravs
desta tcnica, que passa assim a ter grande importncia na pesquisa
cientfica bsica e nas suas aplicaes na indstria.
O mtodo direto para anlises cromatogrficas quantitativas envolve
a preparao de uma srie de solues-padro de composies prximas
concentrao do analito na amostra, com o objetivo de realizar uma
calibrao externa. Os cromatogramas dos padres so ento obtidos,
e as alturas ou as reas dos picos terminam lanados em um grfico em
funo da concentrao. Idealmente a curva obtida deve ser uma reta que
passa pela origem e a concentrao da amostra obtida a partir da equao desta reta.5 Porm, algumas vezes se obtm curvas com coeficientes
lineares positivos ou negativos, cabendo ao analista a realizao de um
tratamento criterioso dos dados da curva. As fontes mais importantes de
erros analticos atravs do uso deste mtodo so as incertezas no volume
da amostra e na preparao dos padres, alm de problemas durante o
processo de injeo. As amostras so normalmente pequenas e as incertezas associadas injeo de um volume reprodutvel deste tamanho com
*e-mail: mccanela@uenf.br

uma microsseringa podem chegar a um erro relativo alto.5

Outro mtodo que pode ser utilizado para anlises quantitativas
com maior preciso a padronizao interna. Nesta metodologia podem ser minimizadas as incertezas introduzidas na injeo da amostra
devido s pequenas quantidades de amostras injetadas e diferentes
analistas. especialmente indicada para tcnicas com pouca reprodutibilidade, como no caso das injees manuais.6 Na padronizao
interna uma quantidade de uma substncia medida cuidadosamente,
que atua como padro interno, introduzida em cada padro e na
amostra, e a razo entre as reas do pico do analito e do padro interno
funcionam como parmetro analtico.3,5 Na escolha de um composto
como padro interno deve-se observar que o pico referente ao padro
esteja bem resolvido dos demais picos dos componentes da amostra
e elua prximo ao sinal do analito. O padro interno deve, ainda, ser
altamente puro, no reagir com nenhum dos componentes da amostra
e ser quimicamente similar ao analito de interesse.6
Alm da escassa disponibilidade de propostas de experimentos
utilizando cromatografia gasosa em Qumica Orgnica na literatura,
mais raro ainda encontrar experimentos com uma abordagem
quantitativa que ressaltem a funo da padronizao interna nesta
tcnica instrumental.7
Este trabalho prope a realizao de um experimento para ser
ministrado nas disciplinas de laboratrio de Qumica Orgnica ou
Analtica com o objetivo de oferecer aos seus participantes aprendizado
sobre cromatografia gasosa e ainda sobre como conduzir comparaes
entre a qualidade dos resultados obtidos com os diferentes mtodos
quantitativos. Alm disso, pretende mostrar como o erro de injeo
atravs de diferentes analistas pode influenciar no resultado final de uma
anlise quantitativa. Neste caso, o mtodo de experimentao envolve
a quantificao do teor de eugenol no leo extrado de cravo-da-ndia
atravs dos mtodos de calibrao direta e padro interno.
PARTE EXPERIMENTAL
Obteno do leo de cravo-da-ndia
O leo essencial foi obtido atravs da utilizao de 16 g de
cravo-da-ndia e 200 mL de gua destilada pelo mtodo de destilao por arraste de vapor (Figura 1). A mistura foi colocada em

Comparao entre mtodos de quantificao em cromatografia gasosa

Vol. 32, No. 5

um balo de fundo redondo com prolas de vidro, adaptado a um

condensador com um bquer para coleta do destilado. O lquido
do balo foi aquecido em uma manta aquecedora at a ebulio.
O produto obtido apresentou-se como uma emulso (gua misturada ao leo de cravo). O arraste a vapor foi finalizado quando
o volume no balo atingiu cerca de 50mL. O lquido resultante
foi extrado em um funil de separao com 3 pores de 50 mL
de diclorometano (Vetec). As trs pores orgnicas foram ento
reunidas, secadas com sulfato de sdio (Syntht) e submetidas
evaporao em evaporador rotatrio, fornecendo ento 1,94g de
leo de cravo (12%).

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Condies cromatogrficas
As anlises cromatogrficas foram realizadas em um cromatgrafo a gs acoplado a um detector de ionizao em chama (CG-DIC)
modelo Shimadzu 17A, utilizando uma coluna DB-1 J&W de 30 m,
dimetro interno 0,25 mm e espessura do filme de 0,25 m. A temperatura do injetor e do detector foram mantidas em 200 e 230 oC,
respectivamente, e a programao do forno foi de 50 at 230 oC com
uma taxa de aquecimento de 15 oC min-1. O gs carregador utilizado
foi o hidrognio com uma vazo na coluna de 1,8 mL min-1. O volume
de injeo foi de 1 L.
Tratamento dos dados
Os tratamentos estatsticos e a gerao dos grficos foram feitos
no software Origin7.
RESULTADOS E DISCUSSO

Figura 1. Aparato experimental para extrao por arraste de vapor

A Figura 2 mostra o cromatograma obtido a partir da injeo de

um dos padres. Os sinais com tempos de reteno de 5,32 e 6,29 min
referem-se carvona (padro interno) e ao eugenol, respectivamente.
possvel observar na figura que a resoluo obtida permitiu a separao completa dos dois componentes, no havendo sobreposio dos
picos cromatogrficos. Os valores obtidos para as reas dos padres
e a razo entre as reas so apresentados na Tabela 2.

Preparo dos padres para as curvas de calibrao

Foram confeccionadas cinco solues-padro com diferentes
concentraes de eugenol obtido comercialmente (Firmenich) em
25 mL de diclorometano (Vetec). Como padro interno adicionou-se
uma quantidade fixa de 46 mg (1,84 g L-1) de carvona (Firmenich) a
cada padro. As massas e concentraes de eugenol em cada padro
so mostradas na Tabela 1.
Tabela 1. Preparao dos padres
Massa de eugenol (mg)

Concentrao de eugenol
(g L-1)

20,8

0,83

31,2

1,25

52,0

2,08

72,8

2,91

93,6

3,74

Padro

Figura 2. Cromatograma do padro contendo eugenol e carvona

Tabela 2. Resultados das injees dos padres

rea Eugenol

rea Carvona

Razo reas Eugenol/

Carvona

33423

87415

0,382

49625

88792

0,559

60810

69865

0,870

120861

102089

1,184

176752

111873

1,580

Padro
Preparo da amostra analtica
Uma alquota de 51 mg da amostra do leo essencial extrada
do cravo-da-ndia foi diluda para 25 mL de diclorometano. Como
padro interno foram adicionados 46 mg de carvona, conforme feito
anteriormente com os padres.
Injeo das amostras
As injees das solues-padro para a construo das curvas de
calibrao foram feitas por um mesmo analista. A amostra de leo
de cravo-da-ndia foi injetada por quatro analistas diferentes. Os
cromatogramas obtidos foram integrados e as curvas de calibrao
foram feitas utilizando-se as reas dos picos.

A curva de calibrao direta, Figura 3, foi obtida atravs de um

grfico da concentrao de eugenol versus a rea dos respectivos
sinais. O valor do coeficiente de correlao linear (R) de 0,97007,
maior que o valor crtico tabelado de Pearson para N= 5 (N o nmero
de pontos da curva) indica uma correlao linear significativa entre
os dados. J a curva para calibrao interna, Figura 4, foi construda

Ligiero et al.

1340

Quim. Nova

Figura 3. Curva de calibrao externa do eugenol

Figura 4. Curva de calibrao utilizando padro intern

usando a concentrao de eugenol versus a razo entre as reas dos

sinais de eugenol e carvona de cada soluo-padro. O valor de R=
0,99867 mostra que a correlao linear para este caso foi mais significativa que para a curva anterior.
Idealmente as curvas de calibrao deveriam passar pela origem, porm, isso no foi observado para as curvas obtidas. Desta
forma, levou-se em considerao o valor dos desvios referentes
a cada parmetro das equaes das retas (coeficientes lineares e
angulares), fornecido pelo software utilizado na confeco dos
grficos, para avaliar a significncia dos mesmos (Tabela 3). Para
que o parmetro seja estatisticamente significativo, a razo entre o
valor do parmetro e o desvio deve ser maior que o valor tabelado
para o t de Student.8 Em um modelo linear, o nmero de graus de
liberdade (GL) dado por GL= N - 2, onde N o nmero de pontos da curva. Para um limite de confiana de 95%, o t de Student
tabelado igual a 3,182; desta forma, os valores dos coeficientes

lineares foram considerados estatisticamente no significativos para

as duas curvas, no sendo utilizados nas equaes das retas para os
clculos das concentraes.
A anlise da amostra extrada do cravo-da-ndia foi feita em
replicata por quatro analistas, o que um procedimento comum nos
casos em que a prtica realizada por uma equipe e onde todos devem
participar. A Tabela 4 mostra os resultados obtidos por cada analista
levando em considerao os dois tipos de calibrao.
Por anlise de varincia one-way dos resultados obtidos para os
dois tipos de calibrao, Tabela 5, foi possvel constatar que as mdias
das duas metodologias so significativamente diferentes a um nvel
de confiana de 95%.9
Assim sendo, atravs desta prtica foi possvel demonstrar a pouca
reprodutibilidade que existe nos resultados quando vrios analistas
esto envolvidos na injeo de uma amostra com fins quantitativos
na tcnica de cromatografia gasosa e, principalmente, que a utili-

Tabela 3. Anlise estatstica de significncia dos parmetros das curvas

Parmetros

Valores Obtidos

Desvio

t calculado

Calibrao Direta
Coeficiente Linear (A)

0,44844

Coeficiente Angular (B)

1,94074.10

0,28912
-5

1,55105 no significativo

2,80483.10

6,91928 significativo

-6

0,97007

Eq. da Reta usada nos Clculos

Y= 94074.10-5 X
Calibrao Interna

Coeficiente Linear (A)

-0,09426

0,07437

1,26747 no significativo

Coeficiente Angular (B)

2,46856

0,07361

33,5357 significativo

0,99867

Eq. da Reta usada nos Clculos

Y= 2,46856 X

Tabela 4. Resultados obtidos com diferentes analistas

rea Eugenol

rea Carvona

Razo reas
Eugenol/Carvona

Cal. Dir. Conc.

Eugenol (g L-1)

Cal. Int. Conc.

Eugenol (g L-1)

64339

102144

0,630

1,249

1,555

62623

97877

0,640

1,215

1,579

63283

101065

0,626

1,228

1,570

55828

88254

0,633

1,083

1,563

Analista

Comparao entre mtodos de quantificao em cromatografia gasosa

Vol. 32, No. 5

Tabela 5. Resultados da ANOVA para as duas calibraes

Fonte

CONCLUSO

GL

SQ

MQ

F-crtico

Modelo

0,278269190

0,278269190

97,31001

9,28

Residual

0,0171576919 0,00285961531

zao de padronizao interna infere um desvio muito menor nos

resultados (Tabela 6). Este fato indica uma maior suscetibilidade a
erros na medida de volume e de manuseio do operador do mtodo de
calibrao externa. Os desvios relativos para o clculo de eugenol na
amostra com a calibrao externa e interna foram de 6,272 e 0,673%,
respectivamente. O percentual de eugenol obtido no leo atravs da
calibrao do padro interno foi compatvel com o valor apresentado
na literatura (70 a 90%)3, enquanto que para a calibrao externa o
valor encontrado foi inferior ao esperado.
Tabela 6. Comparao entre as diferentes calibraes
Percentual
Desvio Relade Eugenol
tivo (%)
no leo

Concentrao
Mdia (gL-1)

Desvio
Padro

Externa

1,194

0,075

58,525

6,272

Interna

1,567

0,011

76,810

0,673

Calibrao

1341

Com este experimento possvel demonstrar para os alunos as

diferenas entre os dois tipos de padronizao, bem como fornecer
a eles a oportunidade de realizar calibraes.

Este trabalho apresenta uma proposta de experimento empregando

a cromatografia gasosa para ser utilizada em uma aula de Qumica
Orgnica e Analtica, onde os alunos podero aprender a realizar
anlises quantitativas atravs de calibrao externa e interna. A partir
do experimento proposto possvel proporcionar aos participantes a
observao e assimilao dos principais fatores que influenciam uma
anlise quantitativa na cromatografia gasosa e as diferenas entre as
calibraes, os erros que podem ocorrer, e os procedimentos necessrios para minimiz-los atravs do uso de padro interno.
REFERNCIAS
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