Sade Intestinal:

Probiticos
Alda Luiza Santos Lerayer

Centro de P & D de Laticnios -TECNOLAT ITAL

alerayer@ital.sp.gov.br

Composio da Flora Intestinal

Efeitos Nocivos/Patognicos

Funes Promotoras de Sade

2

Patognicas

Produo de toxinas
Diarria/infeces
Danos ao fgado
Cncer
Encefalopatias
Produo de
Carcinognicos
Putrefao
Intestinal

P. aeruginosa
Proteus
Staphylococci
Clostridia
Veillonellae

Enterococci
E. coli
Lactobacilli
8
Streptococci
Eubacteria
Bifidobacteria

Inibio do Crescimento
de Bactrias Nocivas
Estimulao
do Sistema
Imunolgico
Absoro de
Minerais

Bacteroides
(G.R.Gibson;M.B.Roberfroid)

11
UFC./g de fezes - escala log10

Sntese de vitaminas

Patognicos e Compostos Txicos

Escherichia coli e Clostridia:

Amnia:
toxina que
que ataca
ataca oo fgado
fgado ee crebro
crebro
Amnia: toxina
Aminas:
carcinognicas
Aminas: carcinognicas
Nitrosoaminas:
carcinognicas
Nitrosoaminas: carcinognicas
Fenis
promotores de
de cncer
cncer
Fenis ee Cresis:
Cresis: promotores
Indol
carcinognicos
Indol ee Escatol:
Escatol: carcinognicos
cido
carcinognico ee ativo
ativo promotor
promotor de
de cncer
cncer de
de colo.
colo. A
A
cido Bilitico
Bilitico Secundrio:
Secundrio: carcinognico
transformao
transformao de
de primrio
primrio para
para secundrio
secundrio depende
depende do
do pH
pH do
do clon
clon
Agliconas:
mutagnicas
Agliconas: mutagnicas

Bacteroidaceae e Streptococcus faecalis: Nitrosoaminas

Nitrosoaminas
cido
cido Bilitico
Bilitico Secundrio
Secundrio
Agliconas
Agliconas
Proteus:
Amnia
Amnia
Aminas
Aminas
Indol
Indol
(Mizota)
(Mizota)

 Probiticos interagem no organismo juntamente

com a flora intestinal
Competio para

Competio para
ocupar os 200 m2
superfcie mucosa - a
maior rea do corpo
interagindo com o
ambiente

102

Mais de 400 espcies

bacterianas no nosso
trato GI (1014 m.o./g)

Proteus
Staphylococci
Clostridia
Veilionellae

Balanceamento
entre efeitos
benficos e
potencialmente
nocivos.
Equilbrio pode ser afetado por:

dieta
antibiticos
estresse
tratamentos quimoterpicos
DISBIOSE INTESTINAL:
desequilbrio da flora do trato GI

104 c

Enterococci
Lactobacilli
108

Prebiticos

Streptococci
Bifidobacteria

1011

A lim en t o s Fu n c io
Probiticos

Potencial de trazer benefcios

sade ou de reduzir o risco de
doenas crnicas, alm das suas
funes nutritivas bsicas

Estudos genticos de
humanos e
microrganismos
determinaro:
como tais interaes
podem afetar a sade e
longevidade humanas
que sistemas de
comunicao so usados
e
como podero ser
influenciados para
beneficiar os hospedeiros

Mtodos moleculares usados para avaliar diretamente a diversidade de espcies e para enumerar
microrganismos presentes em amostras gastrointestinais.
A informao originada dos genes 16S rRNA amplificados diretamente das amostras usando PCR pode ser usada para
caracterizar as espcies, desenhar grupos especficos de primers para D/TGGE (denaturing ou temperature gradient gel
electrophoresis) ou construir sondas (oligonucleotdeos) para enumerao direta dos grupos filogeneticamente relacionados
de bactrias usando hobridizao in situ (FISH) ou dot blot.

Definio
Probiticos so organismos vivos que, quando ingeridos em
concentraes adequadas, afetam beneficamente a sade do consumidor

(Reid et al., 2003)

Conceito Probitico: mais de 100 anos

C onhecim ento cientfico e ferram entas para avaliao
de efeitos benficos sade e potencialpara prevenir
doenas so recentes

Probiticos - Fatos
Habitat e local de ao:

mucosas F intestino
Interagem no organismo juntamente com a flora

intestinal

Lactobacillus e Bifidobacterium
Exercem efeitos benficos no hospedeiro
12

Prebitico
Ingrediente alimentar no
digervel pela maioria dos
microrganismos do intestino,
que afeta beneficamente o

Prebiticos
possuem
ligaes
qumicas
diferenciadas entre as unidades de acares,
resistentes hidrlise pela acidez do estmago e
enzimas digestivas do trato gastrointestinal superior
e do intestino

1. Deve permanecer
estvel sob
condies
cidas e com as
secrees do
intestino delgado

hospedeiro pelo estmulo

seletivo do crescimento e/ou
atividade de um nmero
limitado de bactrias
probiticas que tm
potencialidade de melhorar a
sade do hospedeiro
(Sanders et al., 1999).

3. Deve ter um
metabolismo seletivo

2. Deve se
transferir
intacto no
clon

No hidrolisados nem absorvidos no intestino delgado

No so utilizados pela flora bucal (baixa cariogenicidade)
No intestino grosso so fonte de carbono para bactrias bfidas
FATORES BIFIDOGNICOS

Simbitico =

Probiticos + prebiticos

So alimentos funcionais que em geral

deveriam conter um componente prebitico
que favorea o efeito do probitico
associado.
Dose efetiva:

- crianas: 1 a 3 g/d

Prebiticos contm misturas de

carboidratos com cadeias de diferentes
tamanhos dificultando determinao da
dose dos componentes ativos

- adultos: 5 a 15 g/d
Estudos adicionais so necessrios

Caractersticas desejveis nos

microrganismos Probiticos
PARA QUE AFETEM BENEFICAMENTE A SADE DO
CONSUMIDOR DEVEM:

Ser habitantes normais do trato gastrointestinal

XSobreviver

aps passagem pelo estmago (resistncia ao suco

gstrico e bile)
- linhagens variam seleo

- encapsulao

16

Sobrevivncia de linhagens de
Bifidobacterium no estmago humano

icfu/g)
ff bacte
Log 10
Bifido
/g)
10 ((Bifido
bacteria
ria icfu
Log

Bifidobacterium
Bifidobacterium animalis
animalis DN-173
DN-173 010
010 survives
survives in
in the
the human
human stomach
stomach

88
77
66
Produto 1 com 14 dias

55

Bio
Bio after
after 14
14 days
days conservation
conservation

Produto 1 com 24 dias

Bio
Bio after
after 24
24 days
days conservation
conservation

44

Produto 2 com 14 dias

Product
Product n2
n2 after
after 14
14days
days
conservation
conservation

33

n=10
N=10
n=10

22
11
00

30
30

60
60

90
90

Tempo
(minutos)
Time
(minutes)
Time
(minutes)

Caractersticas Desejveis nos Microrganismos

Probiticos

Caractersticas Desejveis nos Microrganismos Probiticos

Ter identificao taxonmica precisa
Colonizar a mucosa intestinal
Manter viabilidade e atividade no intestino
Estar ativos no alimento antes de seu consumo
Ser continuamente ingeridos
Dose mnima: 107 ufc/g

Quantos probiticos viveis atingem

os stios-alvo ???
18

Efeitos Benficos
(9)
tratamento e preveno de

(1)

Restaura flora intestinal

diarria aguda causada por
normal aps uso de
rotavrus em crianas
antibiticos balanceamento
da flora especialmente em Inibio de crescimento e
criancas e idosos
adeso de enteropatgenos

Reduz pH intestinal
(2)
Influncia positiva na flora
intestinal

(8)

Inibe crescimento de
patognicos e putrefativos
Protege contra infeces
intestinais

Estimula resposta do
sistema imunolgico

Bifidobacteria

Imunomoduladorasao contra clulas

malgnas

(3)
Melhora do funcionamento
intestinal

(7)

Elimina constipao leve

(4)

(5)

Reduz
Aumento da
colesterol tolerncia e
digesto da
lactose

(adaptado de Gibson; Roberfroid -1994)

(6)
Produz
vitaminas do
complexo B,
cido flico

Reduz amnia e
outros compostos
txicos
Estudos in vitro e in vivo
com L. rhamnosus GG,
bifidobactrias e
Propionibacterium sp.,
mostraram decrscimo do
cancergeno aflatoxina

Efeitos Profilticos e Teraputicos

Atividade
anticancergena
Atividades
dos
probiticos
que podem

Atividade suprimida

Referncia

Crescimento celular e
deficincia de clulas em
cultura de tecido

Barricault et al., 1995

Criptas aberrantes em cultura

de tecido de animais

Rowland et al., 1998; Rao et

al.,1999

Tumores em ratos (clon,

fgado, mama)

Reddy & Riverson, 1993; Goldin

et al., 1996; Adachi, 1992

Atividades enzimticas

Ling et al., 1994

interferir
na reduo
do risco de
cncer

(nitroredutase, -glucuronidase,
azoredutase, 7-- dehidroxilase, etc)

involvidas na converso de
procarcingenos nas fezes de
animais de lab. e de humanos;

McConnel & Tannock, 1993

Goldin et al., 1980

nem todos os parmetros foram

positivamente influenciados em
todos os estudos

Atividade mutagnica

Renner & Munzner, 1991

Genotoxicidade

Venturi et al., 1997

Sanders (1999)

No h evidncias clnicas suficientes para provar uma correlao

entre probiticos e efeitos anticancergenos.

Biomarcadores
bioqumicos, moleculares ou baseados em alteraes patolgicas
(proliferao aumentada de clulas) e gua fecal
Validao da genotoxicidade da gua fecal necessria, porm:
gua fecal de voluntrios sadios que se alimentaram com iogurte
probitico (L. acidophilus, B. longum, 300g/dia) apresentou
genotoxicidade modificada em relao a amostras de indivduos que
consumiram iogurte no probitico (Oberreuther-Moschner et al., 2004)

Mecanismo envolvido no efeito anticncer dos probiticos?

Efeitos Profilticos e Teraputicos

Helicobacter pylori
Bacilo espiralado Gram negativo

Coloniza a mucosa gstrica

Associada ao des. de gastrite crnica, lcera e
cncer de estmago
in vitro e em animais: Lactobacilos e bifidobactrias

inibiram o crescimento ou adeso do patgeno e

diminuir a atividade da enzima urease, necessria para
a sua permanncia no ambiente estomacal.

Urease
Uria

Amnia

Aumento de pH no estmago,
promovendo colonizao do m.o.
Helicobacter pylori na mucosa gstrica

Tratamento normal: inibidores

antimicrobianos. Levam ao
Porm, a erradicao de H. pylori no pode
aparecimento de bactrias
ser confirmada por bipsias do estmago
resistentes.
www.galenored.com/socgastro/ images/BatchImage9.jpg

Efeitos Profilticos e Teraputicos

. REDUO DOS NVEIS DE COLESTEROL
. MODULAO DA ABSORO DE AMNIA
. SNTESE DE VITAMINAS DO COMPLEXO B
. ABSORO DE CLCIO
. MODULAO DO SISTEMA IMUNOLGICO

Imunomodulao In vitro e In vivo por linhagens probiticas

Probitico

Alvo

Avaliao

Bifidobacteria,
lactobacilli ,
L. lactis

PBMC

In vitro

Lactobacilli

Clulas
dendrticas
Ratos (ig)

In vitro

L. casei.
L. acidophilus
Ratos (ig)
Lactobacilli,
bifidobacteria.
S.thermophilus
Ratos (oral)
Lactobacilli
L. casei

Ratos (ig)

L. casei Shirota Ratos (ig) +

OVA
Humanos (oral)
B. bifidum,
L. johnsonii Lal
L. johnsonii Lal Humanos (oral)

In vivo
Ex vivo
In vivo
Ex vivo
In vitro
In vitro
Ex vivo

In vivo
Ex vivo
In vivo
Ex vivo
In vivo
Idosos (oral)
B. lactis
Ex vivo
Humanos (oral) In vivo
B. lactis
Ex vivo
Crianas (oral) In vivo
L. rhamnosus
GG
Enterite por
rotavrus
In vivo
Bifidobacteria Humano
L. johnsonii Lal (oral)+
S.typhi
Humano (oral) In vivo
L. rhamnosus
GG
Saudvel ou
alrgico

Efeito

Mercenier et al., 2002

Referncia

Miettinen et al., 1996;

TNF-, IL-1, IL-6, IL-12, IL-18,
Miettinen et al., 1998
IFN-.Bactria viva > morta. Especificidade de
linhagens. Correlao mRNA - protenas (exceto IL18)
Christensen et al, 2002
IL-12, IL-6, TNF- e MHC II (L. casei > outras
LAB >L.reuteri). Alta variao entre linhagens
Perdigon
Fagocitose e atividade linfocitria
et al., 1988
Tejada- Simon et al.,
Pequena variao de TNF-, IL 12, INF-,
1999
NO, IgA, IgG in vivo. CK de clulas peritoniais
reestimuladas in vitro.
Vitini et al., 2000
IEL, IgA + clulas (todas as linhagens)
+
+
CD4 (L.casei), CD8 (L.plantarum)
Perdigon et al., 1991
Proteo contra S. typhimurium especifidade
intestinal, IgA
Matsuzaki et al.,1998
IgE anti-OVA,Th1 CK, Th2 CK in vitro
fagocitose de granulcitos e moncitos

INF (PBMC), fagocitose (PMN)

Schiffrin et al., 1995;

Schinffrin et al 1997
Donnet-Hughes et al.,
1999
Arunachalam et al., 2000

fagocitose (PMN) e atividade NK

Chiang et al., 2000

IgA, IgM, IgG, anti-rotavirus IgA

Kaila et al., 1992; Kaila

et al., 1995

IgA total e IgA anti-S.typhi

Link-Amster et al., 1994

Indivduos saudveis receptores de fagocitose

(neutrfilos,moncitos). Indivduos alrgicos a
leite:Regulao

Pelto et al., 1998

fagocitose

: induo ou aumento; : inibio ou decrscimo; G+: gram positiva; G-: gram negativa; Th: T helper; NK: natural killer; CK: citocinas; M: macrfago;
ig: intragstrico; ip: intraperitonial; iv: intravenoso; PBMC: clulas sanguneas mononuclerares perifricas; PMN: clulas mononucleares polimrficas
PP: Peyers Patch, OVA: ovoalbumina.

Mercado de Produtos Probiticos

Alimentos Funcionais no mundo: 1998: US$ 22 bi
2010: US$ 250 bi
Aumentando mundialmente e no Brasil procura maior por alimentos
que promovem sade foco estratgico de marketing
Probiticos: 2 3% do mercado de funcionais (diversos produtos)
10 20% do mercado de queijos - devendo ser to
grande quanto esse mercado em poucos anos
Para isso:
- Necessidade de novas culturas probiticas isolamento, seleo e
caracterizao;
- Comprovao das alegaes funcionais Biomarcadores Garantia de permanncia
de bactrias viveis durante toda vida
comercial do produto.

25

Tcnicas para a identificao de

bactrias
Cultivo em meio seletivo
L.acidophilus

L. paracasei

B. longum
L. paracasei

D
D
N

L. paracasei

L
L
L
L
L

F
P

B.longum
L.acidophilus

Testes bioqumicos

Hibridizao DNA DNA

RAPD

Perfil metablico
(Biolog)

Mtodos de
referncia

Perfil Gentico (PCR-DGGE do rDNA 16S)

Taxonomia molecular
Identificao
conclusiva

Biomarcadores
(enzimas, cidos orgnicos monitorados por microarray de
mRNA - chip de proteoma)

Rastreamento
Produto
probitico

Investigaes
clnicas

Assegura integridade do estudo/produto

Prebitico
Probitico
simbitico

Avaliao global da expresso gnica de bactrias

probiticas durante trnsito no TI por transcriptoma
(Corthier & Anba, 2003)

Bactria lctica ou probitica

Ingesto via alimento lctico
Sequncia do Genoma da bactria conhecido
DNA total
isolado da
condio I

Marcao com fluorescncia RT

Hibridizao no Chip de DNA

DNA total
isolado da
condio II
Marcao com fluorescncia RT

Anlise
28

RNA

Sntese de cDNA

Purificao e concentrao
do DNA marcado

purificao
marcao com Cy3 ou Cy5

Hibridizao em lmina de array para a bactria em estudo

Seqnciamento de genomas de bactrias probiticas

Bactria

Linhagem

Tamanho
(Mb)

Responsvel

Instituio

2,0
2,0

D. Pridmore
T. Klaenhammer

Nestl, CH

Finalizados
Lactobacillus johnsonii NCC533
L. acidophilus
ATCC700396

NCFM
L. plantarum
WCFS1
Bifidobacterium longum NCC2705

NCSU, EUA
WCFS, NL

3,3
2,3

M. Kleerebezem
F. Arigoni

Nestl, CH

BL23
CNRZ32
LAN001
NCIMB8807

2,6
2,4
2,4
2,4

J. Deutscher, A Hartke
J. Steele
M. Lubbus
D. Jan Sinderen

INRA/CNRZ

ATCC6207

2,6

H. Pel, J. Sikkema

DSM, Frierland C. Dairy

Food, NL

Em andamento
L. casei
L. helveticus
L. rhamnosus
Bifidobacterium breve
Propionibacterium
freudenreichii

Projeto conjunto: Genome Institute/LAB Genome Consortium (JGI/LABGC)

L. gasseri
ATCC33323
1,8
T. Klaenhammer
L. casei
ATCC334
>2,2
J. Broadbent
Bifidobacterium
longum

DJ010A

2,1

D.OSullivan

Univ. Caen, FR
Univ. Winconsin, EUA
Univ. College Cork, IRL

NCSN, EUA
Utah Univ., EUA
Univ. Minnesota, EUA

Fonte: Klaenhammer, T. et al. (2002); Reid, G. et al. (2003)

33

Genes com potencial probitico funcional identificados

Funo proposta
Resistncia a pH cido

Potencial
envolvimento
de genes
atpBEFHAGDC

Produto do gene

Referncias

F1F0-ATPase

Kullen and
Klaenhammer, 1999

Resistncia a Bile

bsh

Hidrlise de sais biliares

Moser and Savage,

2001

lacZ

-galactosidase

Mustapha et al., 1997

Excluso de patgenos

pln operon

Produo de plantaricina

Diep et al., 1996

Colonizao / Adeso

cnb

Protena ligada colgeno

Roos et al., 1996

bspA

Proteina de superfcie A

Turner et al., 1999

dlt

cido lipoteicico

Granato et al., 1999

mub

Adeso/muco

Roos, 1999

slpA/B

Protena de camada S

Boot and Pouwels,

Alivio da intolerncia
lactose

1996
Aglutinao
Agregao

aggH

Auto agregao
Auto-aglutinao

Roos et al., 1999

Estudos feitos na Blgica:

55 produtos probiticos do

mercado foram examinados

(alimentos
funcionais
e
suplementos).

Somente 11 de 55 (20%)
continham
organismos
embalagem

todos
listados

os
na

9 dentre os 55 (16%), no
continham
ingredientes
listados

nenhum
dos
funcionais

11 dentre 30 (37%) produtos

Clemens, 2001

secos
no
ingredientes vivos

continham