Generacin y caracterizacin de un panel de anticuerpos

monoclonales especficos frente a IgE canina mediante el uso

de antgenos recombinantes
Garca-Gallo Pinto, M.1; Llorente Gmez, M.1; Martn Lpez, L.1; Kremer Barn, L.1, Mas Fontao, A.2,
lvarez lvarez, J.2
Protein Tools Unit & Departamento de Inmunologa y Oncologa, CNB-CSIC, Cantoblanco Madrid
Tlf. 915854570; lkremer@cnb.csic.es; 2ALERGOVET S.L.; C/ Luis Cabrera 92- 28002 Madrid.
Tlf. 914134472; jalvarez@alergovet.com
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Objetivo

El diseo de un tratamiento eficaz de la alergia en perros implica la determinacin individual de aquellos

alergenos relacionados con la enfermedad. Esto se puede realizar mediante la deteccin de inmunoglobulina
E (IgE) especfica en suero, utilizando tcnicas in vitro. Uno de los problemas ms importantes en el estudio
del sistema inmune canino es la falta de anticuerpos bien caracterizados frente a componentes especficos del mismo. As, existen pocos trabajos de investigacin dirigidos al desarrollo de reactivos especficos,
sensibles y eficaces para la deteccin de IgE canina, molcula que representa aproximadamente el 0,003%
[1] de las inmunoglobulinas circulantes. Debido a la gran dificultad para conseguir inmungenos a partir
de preparaciones de IgE libres de IgG, inmunoglobulina mayoritaria, muchos de los reactivos disponibles
muestran reactividad cruzada con IgG, produciendo falsos positivos y, por tanto, un diagnstico equivocado.
Para solventar esta limitacin, en este trabajo se plante el desarrollo de nuevos anticuerpos monoclonales
(mAb) frente a IgE canina, empleando en su generacin un antgeno recombinante absolutamente libre de
IgG, combinando esto con una exhaustiva caracterizacin molecular de los anticuerpos generados.

Materiales y mtodos

Para la generacin de mAb se emple como antgeno una molcula de IgE canina recombinante (rIgE) producida
en Alergovet S.L., que comprende los dominios CH2-CH3-CH4 de la regin constante de la cadena pesada de IgE
canina [2]. Como inmungeno se utiliz rIgE conjugada a la hemocianina de moluscos (KLH), emulsionada con
adyuvante de Freund, e inyectada subcutneamente a ratones de la cepa BALB/c. La seleccin de ratones inmunizados se realiz mediante titulacin de anticuerpos anti-rIgE en suero, empleando un ELISA de captura de anticuerpos
por rIgE unida a la placa del ensayo. Para generar hibridomas productores de mAb especficos de rIgE, se extrajeron linfocitos de bazo del ratn seleccionado como mejor respondedor, que se fusionaron con clulas de mieloma
murino. Se estudi la presencia de anticuerpos especficos en ensayos de ELISA frente a rIgE y a albmina bovina
como control negativo. Los hibridomas que presentaron la mejor relacin seal frente al fondo fueron sometidos a
dos rondas sucesivas de clonacin por dilucin lmite. La seleccin de los hibridomas se hizo mediante el anlisis de
sobrenadantes celulares en dos tipos de ELISA de captura de anticuerpo: directo frente a rIgE e indirecto frente a diferentes alergenos. En este ltimo ensayo, se determin la cantidad de IgE presente en los sueros de perros alrgicos
y en sueros de perros sanos (control negativo). Durante la seleccin de clones se estudi la interaccin de los mAb
con IgG e IgM de perro, eligindose los clones productores de mAb especficos. Tambin se analiz la capacidad de
unin simultnea de los diferentes mAbs a rIgE mediante ELISA de competicin.

Resultados

El estudio de los sueros de todos los ratones inmunizados demostr un buen nivel de anticuerpos frente a rIgE, emplendose para la realizacin de la fusin celular el ratn con el ttulo de anticuerpos ms alto. Se analizaron los sobrenadantes de ms de 3.000 hibridomas y los positivos en dicho ensayo fueron estudiados en un ELISA indirecto de
determinacin de IgE especfica en sueros de perros, empleando como antgeno diferentes alergenos. Se obtuvieron 20
pocillos positivos, que contenan mAb especficos para rIgE con capacidad de reconocer IgE nativa. Los hibridomas
de cuatro de estos pocillos se clonaron mediante dilucin lmite. Todos los mAb presentaron alta especificidad para el
reconocimiento de IgE especfica y ninguno ellos reaccion frente a IgG o IgM purificadas de perro. Adems, mediante
ensayos de competicin se determin los mAb interaccionan con eptopos diferentes dentro de la molcula de rIgE.

Conclusiones
Alergovet en colaboracin con el CNB-CSIC, ha desarrollado un panel de anticuerpos monoclonales especficos frente a IgE canina, empleando un antgeno recombinante. Ningn mAb interacciona con IgG o IgM
canina, evitando falsos positivos. Adems, todos los mAbs son capaces de detectar IgE especfica en sueros de
perros alrgicos al ensayar los alergenos ms frecuentemente implicados en las alergias caninas. Por ltimo,
se ha demostrado que los mAb interaccionan con eptopos diferentes de la molcula de IgE, lo que permite
su empleo en una mezcla oligoclonal, una novedosa herramienta molecular para la determinacin de IgE
especfica en perro, que incrementa la sensibilidad de la tcnica manteniendo su especificidad.

Bibliografa
[1] Tizard, IR. (2009) Los anticuerpos:receptores solubles de antgeno en Tizard, IR. Introduccin a la Inmunologa
Veterinaria pp. 170-180, Barcelona, Ed. Elsevier
[2] Alvarez J. and Zalve V. (2010) Vet Dermatol 21(5): 536

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Tipo: ORAL