MTODOS DE LISIS CELULAR PARA BACTERIAS, HONGOS Y LEVADURAS

Lisis alcalina.

Mayor susceptibilidad: bateras gram negativas.

Consiste en la lisis de clulas utilizando una solucin con NaOH y SDS, ambos
con la capacidad de solubilizar la membrana y pared celular. Esto supone una
ventaja por su simpleza, lo barato y que es fcil de aplicar a gran escala, sin
embargo tiende a ser un tratamiento no selectivo, lisando indistintamente cualquier
tipo de clula en suspensin. Esta metodologa es recomendada cuando se quiere
aislar enzimas estables a pH alcalino, usualmente de bacterias neutrfilas.

Materiales.
-

Solucin de lisis alcalina I

50 mM glucosa, 25 mM Tris-Cl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0). Guardar a
4C
Solucin de lisis alcalina II
0.2 N NaOH, 1% (w/v) SDS . Preparar la solucin al momento.
Cajas petri con medio LB

Metodologa.
1. Crecer E. coli (gram -) en medio LB (3 ml) durante 14 a 16 horas, a 37 C y
con agitacin constante a 200 rpm.
2. Una vez dado el crecimiento microbiano en el medio de cultivo, centrifugar
2 ml de este a 13000 rpm, durante 30 segundos.
3. Remover el sobrenadante dejando del pellet libre de medio.
4. Resuspender la pastilla en 100 L de solucin Alcalina I fra, mezclar
vigorosamente con ayuda del vortex.

5. Adicionar 200 L de solucin de lisis II recin preparada, cerrar el tubo y

mezclar invirtiendo el tubo cinco veces, No usar vortex (observar el
aspecto y viscosidad de la disolucin).
6. Guardar en hielo la espera de la siguiente metodologa
Al final de este proceso la clula estar completamente lisada y lista para
continuar con una metodologa mas especfica como extraccin de ADN
plasmdico, etc.

Lisis enzimtica.

Mayor susceptibilidad: bateras gram negativas y positivas.

Mtodo suave con las clulas, que se utiliza especialmente para la extraccin de
ADN bacteriano total o plasmdico, siendo la lisozima la enzima de eleccin. La
lisozima acta desestabilizando la pared celular de bacterias Gram negativas, ya
que rompe las uniones glucosdicas entre los polisacridos N-acetilglucosamina
(NAG) y el cido N-acetilmurmico (NAM).
La desventaja que este mtodo presenta es que es caro debido a la lisozima,
adems esta tiene que ser eliminada tras la extraccin de ADN. Esto no lo hace
recomendable para empleo a gran escala.

Materiales.
-

Tris-HCl2 (0.1M pH 8).

Sulfato de magnesio (10 mM).
Lisozima (20 mg/ml)
ARNasa (7000 U/ml).
Proteinasa K (20 mg/ml).

Metodologa.
1. Cultivar las bacterias en medio slido, durante el tiempo necesario para
obtener un crecimiento abundante pero de clulas jvenes.
2. En un microtubo de 1.5 ml agregar 0.5 ml de sulfato de magnesio (10 mM) y
resuspender en l una asada de bacterias.
3. Agregar una asada pequea de bacterias (calculando una cantidad de 2
colonias

medianas)

homogeneizar

perfectamente

pipeteando

suavemente.
4. Incubar en hielo durante 10 min.
5. Centrifugar a 7000 rpm durante 5 min. a 4 C.
6. Eliminar totalmente el sobrenadante colocando los tubos boca-abajo en un
-

papel secante.
Agregar 300 l de buffer Tris-HCl2 (0.1M pH 8) (tampn biolgico para
mantener el pH de la solucin constante) y resuspender las clulas

pipeteando suavemente varias veces.

7. Adicionar 40 l de lisozima (20 mg/ml) y 5l de ARNasa (7000 U/ml).
8. Incubar a 37 C por 5 min., posteriormente a -20C durante 10 min. y
finalmente a 85 C durante 10 min. Entre cada incubacin, mezclar
vigorosamente.
9. Agregar 20 l de proteinasa K (20 mg/ml) (digiere las protenas de las
membranas celulares).
10. Incubar a 70C durante 10 min., durante la incubacin invertir manualmente
5-10 veces
11. Mezclar vigorosamente durante 10 seg. y llevar a temperatura ambiente.
Al final de este proceso la clula estar completamente lisada.

Bibliografa

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plsmido recombinante. Departamento de Bioqumica y Biologa
Molecular, Campus Universitario de Rabanales.
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Zrate Segura, P., Jimnez Sierra, C., Badillo Corona, J., Garibay Orijel, C., &
Oliver Salvador, M. (2009). MANUAL DEL LABORATORIO DE
BIOTECNOLOGA MOLECULAR. Mxico D. F.: Instituto Politcnico Nacional.
Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologa. Laboratorio de
Biotecnologa Molecular.