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Tecnologia de PCR e RT-PCR em tempo real e suas aplicaes na rea mdica


Real time PCR and RT-PCR technology and its applications in the medicine field

Sabrina Nascimento
Estudante de Mestrado, Disciplina de Bioqumica da Faculdade de Medicina do ABC.

Eloah Rabello Suarez


MSc, Mestre, Disciplina de Bioqumica da Faculdade de Medicina do ABC. Disciplina de Biologia Molecular da Universidade Federal de So Paulo.

Maria Aparecida da Silva Pinhal PhD


Disciplina de Bioqumica da Faculdade de Medicina do ABC. Disciplina de Biologia Molecular da Universidade Federal de So Paulo.
Correspondncia:
Maria Aparecida da Silva Pinhal
Professora titular da Disciplina de Bioqumica
Faculdade de Medicina do ABC
Avenida Prncipe de Gales, 821
CEP 09060-650 - Santo Andr - SP
Tel.: (11) 4993-5499 - Fax: (11) 4993-5426
E-mail: maspinhal@yahoo.com.br
RBM Nov 10 V 67 Especial Oncologia
Indexado LILACS: S0034-72642010006400002

Unite rm os: R T-PC R , PC R e m te m po re al, t cnicas de pe squisa, aplicao m dica.


Unte rm s: R T-PC R , re al tim e pcr, inve stigative te chnique s, m e dical aplication.

Sumrio
O dogma central da biologia molecular formado por trs processos, a sntese de DNA (replicao) sntese de RNA (transcrio) e
sntese de protenas (traduo). Tais processos podem ocorrer in vitro por mecanismos que mimetizam os mecanismos de replicao
e transcrio por reao de amplificao em cadeia da DNA polimerase (PCR) e por RT-PCR, que corresponde reao de transcrio
reversa, seguida da amplificao por PCR. Howard Temin, em 1961, foi pioneiro em juntar evidncias que comprovaram certa
inconsistncia com o dogma central da biologia molecular para provar a existncia da transcriptase reversa. Temin focava seus
estudos em retrovrus, o Rous sarcoma vrus (RSV), capaz de transformar clulas normais em clulas tumorais. Temin props que o
mecanismo de transformao do RSV seria a converso do seu material gentico RNA em DNA e comprovou que o mecanismo de
transformao de clulas normais em tumorais era bloqueado por inibidores da sntese de DNA. Tal hiptese foi confirmada por outro
pesquisador, David Baltimore, na mesma poca que conseguiu isolar a enzima transcriptase reversa do vrus de leucemia murina
Rauscher (R-MLV). Temin e Baltimore receberam o Prmio Nobel de Fisiologia e Medicina, em 1975, pela descoberta da transcriptase
reversa1. Tal descoberta promove continuamente o desenvolvimento de inmeras tcnicas para pesquisas em sade e avano nas
reas de investigao clnica e preciso no diagnstico e tratamento de doenas. Este artigo tem como objetivo revisar os princpios
e atualidades da tecnologia de amplificao por tempo real e suas importantes aplicaes em medicina.
Sumary
The molecular biology central dogma is composed by three process, DNA synthesis (replication) RNA synthesis (trsnacription) and
protein synthesis (translation). These processes can occur by in vitro mimetic replication and transcription mechanisms using
polymerase chain reaction (PCR) and RT-PCR, that correspond to the reverse transcription, followed by PCR amplification. In 1961,
Howard Temin began to gather evidence that was inconsistent with the molecular biology central dogma in order to prove
transcriptase reverse existence. Temin focused his studies on Rous sarcoma vrus (RSV), capable of transforming normal cells into
cancerous cells. Temin proposed that the transforming mechanism is converting RNA of RSV into DNA and proved that the
mechanisms to transform normal cells to tumoral cells was inhibit by DNA synthesis. This hypothesis was confirmed by another
research, David Baltimore, at the same time was able to isolated the enzyme transcriptase reverse from leukemia murine Rauscher
virus (R-MLV). Temin and Baltimore received the Nobel Prize for Physiology and Medicine in 1975 for the discovery of reverse
transcripatase1. This discovery promotes continuously so many development of techniques for health research and improvement in
the clinical investigation and more precise diagnostic and disease treatment. This article has the aim to revise the actual principles of
real time amplification technology and its important medical applications.
Numerao de pginas na revista impressa: 7 19
Resumo
O dogma central da biologia molecular formado por trs processos, a sntese de DNA (replicao) sntese de RNA (transcrio) e
sntese de protenas (traduo). Tais processos podem ocorrer in vitro por mecanismos que mimetizam os mecanismos de replicao
e transcrio por reao de amplificao em cadeia da DNA polimerase (PCR) e por RT-PCR, que corresponde reao de transcrio
reversa, seguida da amplificao por PCR. Howard Temin, em 1961, foi pioneiro em juntar evidncias que comprovaram certa
inconsistncia com o dogma central da biologia molecular para provar a existncia da transcriptase reversa. Temin focava seus
estudos em retrovrus, o Rous sarcoma vrus (RSV), capaz de transformar clulas normais em clulas tumorais. Temin props que o

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mecanismo de transformao do RSV seria a converso do seu material gentico RNA em DNA e comprovou que o mecanismo de
transformao de clulas normais em tumorais era bloqueado por inibidores da sntese de DNA. Tal hiptese foi confirmada por outro
pesquisador, David Baltimore, na mesma poca que conseguiu isolar a enzima transcriptase reversa do vrus de leucemia murina
Rauscher (R-MLV). Temin e Baltimore receberam o Prmio Nobel de Fisiologia e Medicina, em 1975, pela descoberta da transcriptase
reversa1. Tal descoberta promove continuamente o desenvolvimento de inmeras tcnicas para pesquisas em sade e avano nas
reas de investigao clnica e preciso no diagnstico e tratamento de doenas. Este artigo tem como objetivo revisar os princpios
e atualidades da tecnologia de amplificao por tempo real e suas importantes aplicaes em medicina.
Introduo
Para que a amplificao de segmentos de DNA ocorra por PCR convencional, tambm denominado PCR semiquantitativo, necessrio
um par de oligonucleotdeos iniciadores especficos que reconheam o DNA que deve ser amplificado, denominado primers
desoxirribonucleotdeos trifosfatados e a enzima DNA polimerase, como exemplo a Taq DNA polimerase, muito utilizada nos ensaios em
laboratrios. Os ciclos da PCR esto esquematizados na Figura 1 e so representados por desnaturao da dupla fita do DNA, por
rompimento das pontes de hidrognio, reconhecimento dos primers com o segmento especfico do DNA (anelamento ou hidridizao),
seguido da polimerizao da nova fita de DNA pela incorporao dos nucleotdeos extremidade 3 dos primers iniciadores, assim as
cadeias sofrem extenso no sentido 5- 3.
Pode ser observado na Figura 1 que os ciclos de anelamento e extenso da PCR em tempo real ou PCR quantitativo (qPCR) ocorrem
concomitantemente, isto porque o produto obtido em tal reao deve apresentar no mximo 100 pb, o que no ocorre para o PCR
semiquantitativo.
A reao de transcrio reversa, seguida da reao da polimerase em cadeia (RT-PCR), possui como molde inicial a molcula de RNA,
como previamente citado e gera cDNA, a partir de desoxirribonucleotdeos trifostatados. A reao inicial de transcrio reversa ocorre
em geral a 420C, por 30 a 60 minutos. Aps a obteno do cDNA uma alquota desta amostra de cDNA utilizada para a reao de
amplificao por PCR.

Figura 1 - Esquema comparativo das reaes de amplificao por PCR convencional e em tempo real. Os ciclos da PCR convencional,
tambm denominada PCR semiquantitativa, so diferentes quando comparados aos ciclos da PCR em tempo real ou quantitativa
(qPCR), como podemos observar nos esquemas acima. No eixo Y est representado a temperatura (0C) e no eixo X o tempo
(minutos).
Sntese de cDNA
O DNA complementar (cDNA), isto , a fita de DNA sintetizada pela transcriptase reversa a partir do molde de RNA corresponde
forma mais conveniente de se manipular a sequncia de codificao do RNA mensageiro (RNAm), isto porque o RNA uma molcula
facilmente degradada por enzimas denominadas RNases. Para a sntese do cDNA necessrio o molde de RNAm, os
desoxirribonucleotdeos trifosfatados, dNTPs (dGTP, dCTP, dATP e dTTP), a enzima transcriptase reversa e oligonucleotdeos
iniciadores, tambm denominados primers. Trs tipos diferentes de primers so usados para a sntese de cDNA: 1) No caso de RNAm
de eucariotos que possuem uma cauda de poliadenosinas na extremidade 3da molcula (cauda poli-A), utilizado um primer
denominado oligo-dT, que contm 18 nucleotdeos de timidina e, consequentemente, hibridizar com todos os RNAs mensageiros de
clulas eucariticas simultaneamente 2) Opcionalmente, pode ser utilizado um coquetel de primers, chamado comumente de Random
primers que aleatoriamente se ligam s molculas de RNAm (no exclusivamente) e servem de molde para a reao da transcrio
reversa eobteno do cDNA 3) A terceira opo pode ser uma sequncia de oligonucleotdeo especfica ao RNAm que o alvo de
amplificao da transcriptase reversa. Tal opo menos frequentemente utilizada, tendo em vista que as molculas de RNA
mensageiro representam apenas aproximadamente 1% do RNA total presente nas clulas e, consequentemente, a probabilidade de um
primer desenhado para uma molcula especfica de RNA hibridizar com seu RNA-alvo muito pequena antes de uma reao de
amplificao.
Uma vantagem da utilizao de primers de oligo (dT), que sua sequncia-alvo linear, contendo dezoito nucleotdeos que
facilmente sofrem hibridizao. Os random primers que possuem sequncias aleatrias, so oligmeros curtos com sequncias
variveis, normalmente apresentam seis ou nove nucleotdeos constitudos por todas as combinaes possveis das quatro bases
nitrogenadas. Como existem todas as combinaes possves na mistura destes primers, os mesmos podem ligar em qualquer parte do
RNA. Portanto, tais primers podero tambm hibridizar com molculas de RNA transportadores e RNA ribossmicos, podendo, deste
modo, interferir na converso exclusiva dos RNAs mensageiros em cDNA. Deste modo, os random primers apresentam a vantagem de
apresentar teoricamente, altos rendimentos em contraposio aos primers de oligo dT, sendo essencial sua utilizao quando a
expresso de um determinado gene muito limitada. A utilizao de primers que apresentam sequncias especficas desenhadas para
hibridizarem com o RNA mensageiro (RNAm) alvo a estratgia preferida quando um nmero limitado de RNAs mensageiros sero
analisados. A eficincia da hibridizao de primers especficos para a sequncia de RNAm dependente da conformao do RNAmalvo, definida por suas estruturas secundrias e tercirias3.
Existem diversas vantagens na utilizao de reaes de PCR em tempo real, como mostra a Figura 2. O mtodo qualitativo, que era
aplicado como semiquantitativo antes da criao do PCR em tempo real, baseado na amplificao das sequncias-alvo seguidas por
eletroforese em gel de agarose para deteco do DNA amplificado com um corante capaz de intercalar no DNA e fluorescer sob
exposio luz ultra-violeta, tal como o brometo de etdio. Esta metodologia possui inmeras desvantagens, dentre elas podemos
destacar o fato de permitir a deteco dos produtos de reao apenas no final de todos os ciclos de termociclagem (entre 25 e 30
ciclos), momento no qual o DNA-alvo se encontra amplificado em condies de saturao, como observado na Figura 2. Mesmo aps
correo pela intensidade de expresso de genes endgenos utilizados como controle da reao, housekeeping, muitas vezes no
possvel detectar diferenas na expresso de determinados genes, no sendo possvel observar diferenas reais de expresso gnica.
Portanto, em estudos de anlises de PCR semiquantitativa deve ser realizada uma padronizao do nmero de ciclos de termociclagem
para deteco da reao no incio da fase exponencial de amplificao de cada amostra, o que bastante varivel e pode resultar em
falso-negativos.

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Figura 2 - Comparao entre o PCR quantitativo e semiquantitativo. A curva indica na fase exponencial a capacidade de deteco de
reaes pela tcnica de PCR em tempo real, utilizando fluorforos. Entretanto, nas reaes de PCR semiquantitativo a deteco das
reaes de amplificao realizada por eletroforese e a visualizao do DNA feita utilizando-se brometo de etdio. Na PCR
semiquantitativa a reao s pode ser visualizada em altos ciclos de amplificao, isto , em condio de saturao,
consequentemente, pequenas diferenas de expresso gnica dificilmente podem ser detectadas em tal ensaio.
A tcnica de PCR em tempo real, por sua vez, permite a deteco, ciclo a ciclo, com elevada sensibilidade e especificidade da
intensidade de fluorescncia emitida em decorrncia da amplificao da sequncia de DNA-alvo, possibilitando a anlise comparativa
da expresso de tal gene entre as amostras logo no ncio da fase exponencial de amplificao, em que no h saturao da
amplificao, eliminando um vis da tcnica semiquantitativa (Figura 2).
Em alguns casos as reaes de RT e PCR podem ser combinadas em uma nica reao. Tal processo conveniente quando se analisa
apenas um ou poucos genes. No entanto, as condies ideais para a reao de RT e PCR em tempo real geralmente so processadas
separadamente, visto que as reaes que ocorrem em uma nica etapa tendem a apresentar menor sensibilidade, quando comparadas
normalmente com os resultados obtidos de reaes que ocorrem em duas etapas4.
Durante a realizao qRT-PCR falsos sinais positivos podem surgir a partir da amplificao do gene ou pseudogene no caso de
contaminao das amostras por DNA genmico. Este problema pode ser evitado se os primers utilizados na PCR subsequente
transcrio reversa, hibridizarem em dois xons diferentes, de forma que tenha pelo menos um ntron entre as regies de hibridizao.
Outro cuidado a ser tomado a no contaminao com DNA, portanto o tratamento das amostras com DNase e testes para verificar
se houve contaminao por DNA genmico deve ser constante para toda a reao5.
Cumpre ser observado que a eficincia das reaes de amplificao por RT-PCR depende de diversos fatores, tais como: o cuidado
nas pipetagens, a qualidade e integridade das amostras (molde de RNA e cDNA), desenho dos primers, condies de termociclagem
(temperatura de desnaturao, anelamento dos primers), qualidade e quantidade dos reagentes e tambm o tamanho do produto a
ser amplificado. Condies especficas para cada experimento devem ser padronizadas.
O desenho dos primers um dos principais fatores limitantes para a eficincia da tcnica da PCR em tempo real e deve seguir uma
srie de regras. Os primers devem apresentar temperatura de anelamento ideal entre 58 e 60C para eficincia do ciclo padro de
termociclagem que consiste em uma primeira etapa de desnaturao realizada geralmente em 95C por 10 minutos, e 35 ciclos de
95C por 15 segundos para abertura das fitas, seguida de 60C por 60 segundos para anelamento dos primers e extenso dos
fragmentos pela DNA polimerase. Se as sequncias-alvo forem de cDNA, os primers devem ser desenhados para uma regio localizada
entre dois xons, evitando-se a amplificao de DNA genmico por eventual contaminao. Deve ser verificada tambm a
possibilidade de formao de homodmeros, heterodmeros e de hairpin entre os primers (Figura 3). Para evitar a formao de tais
estruturas, indesejveis principalmente quando so aplicados sistemas de fluorescncia que reconhecem inespecificamente fita dupla
de DNA, devemos verificar o valor de variao de energia livre de Gibbs (DG) para a ocorrncia destas interaes. O valor de DG deve
ser positivo, indicando menor probabilidade de formao espontnea destes dmeros indesejveis entre os primers. Pela mesma razo,
os produtos de amplificao devem apresentar entre 80 e 150 pares de bases (pb) e a quantidade de guanina e citosina no deve
ultrapassar 50% do total de bases nitrogenadas presentes nos primers, uma vez que tais bases fazem trs ligaes de hidrognio em
suas interaes (enquanto adenina e timina fazem apenas duas), podendo formar estruturas dimricas indesejveis entre os primers,
com maior fora de interao, reduzindo a eficincia da interao dos mesmos com o DNA-alvo.
Transcriptase reversa seguida da reao da polimerase em cadeia em tempo real (RT-PCR em tempo real)
Por ser uma tcnica de elevada sensibilidade e acurcia, a PCR em tempo real tem sido uma ferramenta aplicada em diversas reas
biomdicas, destacando-se na pesquisa bsica e no diagnstico clnico-laboratorial.

Figura 3 - Esquema da formao de harpin. A formao da estrutura de harpin representa o pareamento intracadeia por pontes
de hidrognio entre bases nitrogenadas de um segmento do primer que serve de iniciador em reaes de PCR ou RT-PCR. Tal
estrutura impede a utilizao de tal primer nas reaes de amplificaes.
Na pesquisa biomdica bsica a aplicao mais frequente da RT-PCR (PCR aps transcrio reversa) em tempo real na determinao
da expresso absoluta ou relativa de um gene de interesse. Neste caso a extrao do RNA da amostra realizada, seguida por
converso deste RNA em cDNA pela tcnica de transcrio reversa e, finalmente, amplificao do cDNA por PCR (ao da DNA
polimerase). Este cDNA utilizado nas reaes da PCR em tempo real, aplicando-se oligonucleotdeos iniciadores (primers) especficos
para a sequncia gnica-alvo que se deseja estudar/avaliar. Nas reaes de amplificao esto associados compostos que emitem
fluorescncia e apresentam correlao direta com o nmero de cpias amplificadas do gene-alvo (DNA amplificado). Durante a
amplificao, um programa de computador especfico (software) constri em tempo real um grfico relacionando os ciclos de
termociclagem com a intensidade de fluorescncia emitida durante a amplificao do DNA nas amostras, ciclo a ciclo. A partir deste
grfico se deve traar uma linha de maneira paralela ao eixo referente ao nmero de ciclos (abscissas), na altura em que se inicia a
fase exponencial da amplificao gnica (incio da elevao exponencial na emisso da fluorescncia). Este parmetro representa o
limiar de deteco, ou seja, o nmero mnimo de ciclos para amplificao, e denominado threshold pelo sistema de anlise
software utilizado. O ponto em que o threshold cruza com a linha de amplificao da amostra, permite determinar o nmero de
ciclos necessrios para o incio da amplificao da sequncia gnica-alvo presente no DNA de cada amostra. Este valor denominado
Ct (Cycle Threshold) e permite a quantificao relativa do DNA de cada uma das amostras, aps ser corrigido pelos Ct dos genescontrole endgenos e das amostras-controle.

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O Ct proporcional ao logaritmo da quantidade inicial de expresso do gene-alvo em uma determinada amostra, quanto menor for o
nmero inicial do Ct obtido do gene-alvo existente na amostra, comparativamente com outro gene, porque houve maior amplificao
do gene-alvo e, consequentemente, o mesmo apresenta maior expresso (Figura 4).
A expresso gnica relativa determinada a partir da comparao da expresso do gene-alvo com um ou mais genes denominados
housekeeping ou genes endgenos-controle. Tais genes so utilizados como controles internos da expresso gnica, uma vez que
apresentam expresso teoricamente constante, ou seja, sofrem pequena oscilao na expresso mediada por fatores reguladores
externos, tais como hormnios, fatores de crescimento, entre outros. Devido a esta propriedade, tais genes so utilizados para
correo da expresso gnica do gene-alvo. Como exemplos de genes housekeeping podem ser citados: ciclofilina, gliceraldedo 3fosfato desidrogenase, protena ribossomal 36B4, b-actina, RNA ribossmico 18S, receptor de transferrina, entre outros2.
A seguir sero apresentados alguns detalhes tcnicos especficos que devem ser seguidos para o entendimento de quem deseja
realizar ensaios de RT-PCR ou PCR em tempo real, bem como sero apresentados exemplos da aplicao de tais metodologias e suas
variaes nas diversas reas clnicas e bsicas da medicina.

Figura 4 - Determinao dos ciclos de amplificao de amostras por reao em tempo real. A) amplificao de um determinado
segmento gnico que identifica um determinado marcador tumoral em clulas neoplsicas B) amplificao do mesmo segmento
gnico em clulas no neoplsicas. O Ct pode ser determinado pela interseco da linha do limiar de deteco da reao
threshold, com a linha da amplificao gnica de cada amostra. Observa-se menor Ct (17) para o incio da fase exponencial de
amplificao do marcador tumoral em clulas neoplsicas (A), indicando que tal marcador apresenta maior expresso em clulas
tumorais, comparativamente s clulas no neoplsicas (B), que apresentam Ct=26, isto , menor expresso.

Figura 5 - Tcnicas de RT-PCR por tempo real. A) Reao de tempo real com sistema TaqMan. 1A) sonda fluorescente hibridiza na
regio-alvo que deve ser amplificada pelo primer sense. A sonda possui fluorforo ligado na extremidade 5(reporter = R),
responsvel pela emisso da fluorescncia e um composto que bloqueia a emisso desta fluorescncia (quencher =Q) 2A) durante a
extenso a partir do primer sense, a DNA polimerase cliva o reporter e a fluorescncia emitida 3A) a cada ciclo de amplificao
ocorre liberao de fluorescncia, portanto, a reao de amplificao diretamente proporcional fluorescncia emitida. B) Reao
de tempo real com sistema SYBR Green. 1B) os fluorforos presentes no SYBR Green ligam-se em toda a dupla fita de DNA
formada, emitindo fluorescncia 2B) Durante a desnaturao da dupla fita a fluorescncia drasticamente reduzida 3B) durante a
extenso das novas fitas, no processo de polimerizao da DNA polimerase, os fluorforos se ligam s duplas fitas em formao,
resultando na emisso de fluorescncia.
TaqMan versus Sybr Green
Comercialmente existem vrias especificaes para os instrumentos disponveis para realizao da tcnica de PCR em tempo real,
incluindo diferentes formatos de sondas de cidos nucleicos aplicveis, comprimentos de onda de excitao e deteco de fluorforos
especficos, o nmero mximo de amostras por corrida, volumes de reao e tempos de termociclagem. No entanto, em relao aos
reagentes de amplificao, h dois sistemas precursores, SybrGreen e TaqMan, que deram origem a diferentes produtos similares

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disponveis atualmente no mercado. Cada um destes sistemas apresenta vantagens e desvantagens, que podem ser observadas
analisando-se a Tabela 1. O mecanismo de funcionamento de ambos os mtodos est ilustrado na Figura 5, itens A e B. Os itens 1, 2
e 3A da Figura 5 esquematizam o funcionamento do sistema TaqMan de amplificao de DNA por tempo real. No item 1A pode ser
observada a hidridizao de sonda fluorescente na regio complementar-alvo que deve ser amplificada na fita 5-3. A sonda possui
um fluorforo ligado na extremidade 5, tambm conhecido por reporter (R), o qual responsvel pela emisso da fluorescncia, e um
composto denominado quencher (Q) localizado no terminal 3 que impede a emisso da fluorescncia do reprter. Em 2A, durante a
extenso a partir do primer sense realizada pela DNA polimerase, ocorre clivagem do reprter, com consequente emisso da
fluorescncia, sendo que a cada ciclo de amplificao ocorre liberao de fluorescncia (Figura 5, item 3A), portanto, a reao de
amplificao diretamente proporcional fluorescncia emitida. A Figura 5, item B, mostra o funcionamento do sistema SYBR Green
de amplificao de DNA por tempo real. Os fluorforos presentes no SYBR Green se ligam em toda a dupla fita de DNA formada,
emitindo fluorescncia (Figura 5, item 1B). Durante a desnaturao da dupla fita, a fluorescncia drasticamente reduzida (Figura 5,
item 2B). Porm, como podemos verificar no item 3B (Figura 5), durante a extenso das novas fitas por ao da DNA polimerase, os
fluorforos se ligam s duplas fitas em formao, resultando na emisso de fluorescncia, que tambm diretamente proporcional
amplificao do DNA-alvo6.

Figura 6 - Determinao da curva de dissociao na reao de RT-PCR tempo real. A) curva de dissociao ideal, formao de um
nico produto B) formao de dois picos, sendo um com temperatura entre 80 e 87C, relativo ao produto de amplificao e um
nico pico de baixa intensidade, com temperatura de dissociao inferior, sugerindo a formao de produto inespecfico na reao
de amplificao C) dmeros de primers, formao de uma ondulao na base da curva sugerindo a presena de dmeros de primers
ou outros produtos inespecficos.
Curva de dissociao dos primers
Para a realizao da curva de dissociao dos primers, tambm denominada curva de melting, deve-se ajustar o aparelho para
iniciar a temperatura por volta dos 70C e variar de grau em grau at no mximo 95C. Este procedimento realizado pelo aparelho
aps o ciclo de amplificao da PCR em tempo real. Neste processo pode ser determinado o ponto correspondente temperatura de
dissociao dos primers de suas sequncias-alvo. A incluso da curva de dissociao essencial para verificar se houve formao de
um nico produto ou se produtos inespecficos tambm foram formados. O aparecimento de um nico pico na curva de melting
sugere a existncia de um nico produto (Figura 6A), porm, se for observado o aparecimento de vrios picos na curva, pode-se
considerar a hiptese de formao de produtos inespecficos na reao (Figura 6B) ou a eventual formao de dmeros de primers,
denominados primer-dimers (Figura 6C). Durante a padronizao da reao se sugere a realizao de eletroforese em gel de agarose
para confirmao da presena destes produtos indesejveis6.
Padronizao da PCR em tempo real
A padronizao da concentrao dos primers de cada amostra realizada com um cDNA-controle, isto , uma amostra de cDNA
obtido de clulas ou tecido que apresenta expresso conhecida da sequncia a ser amplificada pelo conjunto de primers. necessria
a realizao de uma diluio seriada dos primers para a padronizao da melhor concentrao para a realizao da amplificao.
Sugere-se, primeiramente, a utilizao do cDNA-controle concentrado para a padronizao e os primers variando nas diluies de 0,5
M a 3,0 M. Aps a determinao da menor concentrao dos primers capaz de amplificar o cDNA adequadamente, partimos para a
elaborao da curva de eficincia. Para obteno da melhor eficincia da reao, devem ser realizadas diluies seriadas em base
duas das amostras de cDNA, utilizando as mesmas concentraes de primers determinadas previamente. Como a amplificao
exponencial, deve haver uma diferena de um Ct na amplificao de cada uma das diluies seriadas realizadas, sendo que a mais
concentrada, por exemplo, 1:2, deve apresentar um Ct menor que a mesma amostra diluda 1:4, como podemos observar na Figura 7.
Quando traamos uma reta relacionando a potncia da diluio (abscissas) e o Ct (ordenadas), ser obtida a chamada curva de
eficincia do primer, a qual deve apresentar o valor de R2 mais prximo possvel de 1 (100%). Se a eficincia do primer for um pouco
menor que 100%, a mesma deve ser usada na correo dos clculos de expresso relativa, uma vez que a reao no ir mais
apresentar 21 cpias por ciclo e sim 2x, sendo x igual eficincia dos primers. A Figura 8 mostra uma curva de eficincia ideal obtida
de uma reao de RT-PCR padronizada para reao de tempo real, evidenciando os valores obtidos de Ct em relao s diferentes
concentraes de amostras de cDNA. Uma srie de fatores pode influenciar esta anlise e a otimizao da reao consiste em
compensar esses fatores para obter a razo de 16.
Aps a padronizao das condies adequadas para a reao e a realizao das amplificaes de DNA, devem ser realizados os
clculos para determinao da expresso relativa ou absoluta de DNA nas amostras. Na determinao da expresso relativa deve ser
calculada, primeiramente, a relao entre o gene referncia (controle endgeno ou housekeeping) e o gene-alvo (gene em estudo)
em todas as amostras. Este ndice denominado DCt. Deve ser calculado o -DDCt, que a correo do DCt das amostras pelo DCt do
grupo controle, o qual pode ser calculado subtraindo-se o DCt da amostra pela mdia dos DCts da triplicata de seus controles. Este
valor deve ser multiplicado por -1. Em seguida, deve-se calcular 2-(DDCt), se a eficincia do primer for 100%, ou seja, se a
amplificao estiver sendo feita de maneira exponencial em base 2. Caso contrrio, o nmero 2 deve ser corrigido pela eficincia dos
primers, determinada previamente. O 2DDCt deve ser considerado 1 para a amostra-controle, pois, valor de DCt da amostra, menos
o valor obtido da prpria amostra igual a zero e 20 = 1 6.

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Figura 7 - Padronizao da reao de RT-PCR tempo real. Diluio em srie das amostras de cDNA-controle obtido de clulas ou
tecidos para a mesma concentrao de primers. A reao de amplificao realizada de forma exponencial, portanto observa-se
que a cada diluio do cDNA em base 2, o nmero de ciclos (Ct) aumenta uma vez.
Tanto a expresso gnica relativa quanto a absoluta determinada pela PCR em tempo real utilizam o valor de Ct como referncia para
a quantificao da expresso de determinada sequncia gnica-alvo. Entretanto, na quantificao absoluta o valor Ct comparado
com uma curva padro de amplificao do gene-alvo utilizando-se um padro com concentrao inicial conhecida (nmero de cpias
de DNA/uL) em diferentes diluies. Desta maneira o Ct determinado na amostra desconhecida pode ser relacionado com o Ct
determinado na curva padro, o qual se relaciona diretamente a uma concentrao especfica de DNA.
Aplicaes da PCR em tempo real
Perfilamento gentico ou microarray
No campo da pesquisa bsica, a PCR em tempo real tem sido utilizada tambm para a validao de resultados de microarray. O
microarray uma tcnica de hibridizao que permite a investigao da anlise da expresso de milhares de genes ao mesmo
tempo. Para tal, utiliza matrizes contendo sondas complementares a diversos genes e permite, por tcnicas de hibridizao com o
cDNA-alvo marcado com fluorforo, avaliar a expresso gnica. Alguns arrays possuem todo o genoma de um organismo e podem ser
utilizados para avaliar alteraes da expresso gnica (transcriptoma). O problema que o mtodo basicamente qualitativo e no
permite uma anlise estatisticamente confivel e de fcil correlao. Por tal motivo a PCR em tempo real utilizada como uma tcnica
de apoio para validar e quantificar os genes escolhidos nas anlises de microarray8.
Polimorfismos
A identificao de mutaes pontuais (ou polimorfismos de nucleotdeos), muito utilizadas nas reas clnica e de pesquisa bsica,
pode ser feita por anlise da curva de dissociao obtida aps a amplificao por PCR em tempo real.
Esta tcnica adequada para avaliar mutaes, incluindo polimorfismos contendo um nico nucleotdeo modificado, substituindo
muitas vezes outras tcnicas muito mais trabalhosas e de maior custo como sequenciamento, ensaios de polimorfismo de conformao
de fita nica ou anlises de polimorfismo de fragmentos de restrio (RFLP)9.
Para deteco de mutaes na sequncia-alvo necessria a anlise do produto amplificado (amplicon) na curva de dissociao, que
realizada automaticamente aps a termociclagem por PCR em tempo real.

Figura 8 - Curva de eficincia ideal para um determinado par de primers. Esta curva desenhada colocando-se a concentrao
predeterminada por espectrofotometria dos cDNAs diludos no eixo das abscissas e o Ct para amplificao de cada cDNA no eixo das
ordenadas utilizando-se para tal reao um determinado par de primers. A reta mdia traada a partir da mdia de Cts de cada
diluio de cDNA deve apresentar seu R2 o mais prximo possvel de 1,00, indicando 100% de eficincia de um determinado par de
primers em amplificar o cDNA-alvo exponencialmente a cada ciclo.
Portanto, para a deteco destas mutaes necessria a utilizao da tcnica de PCR em tempo real baseada no uso de sondas de
hibridizao, denominada FRET (fluorescence resonance energy transfer - energia de ressonncia transferida por fluorescncia).
Nesta tcnica so utilizadas duas sondas de DNA desenhadas que sofrem hibridizao prximas, no produto da PCR, sendo que a
extremidade 3 da primeira sonda fique prxima extremidade 5 da sonda adjacente. A primeira sonda apresenta um fluorforo ligado
a sua extremidade 3 e a segunda sonda apresenta um fluorforo aceptor da fluorescncia emitida pela primeira sonda em sua
extremidade 5. Se ambas as sondas sofrem hibridizao, o produto-alvo da PCR, a fluorescncia da extremidade 3 absorvida pelo
aceptor localizado na extremidade 5 da segunda sonda e, assim, o segundo fluorforo excitado e emite luz em outro comprimento
de onda, o qual detectado pelo aparelho. Se as duas sondas no hibridizam, devido a no existncia de uma sequncia de DNA
complementar, no ocorre o FRET entre os dois fluorforos e, consequentemente, no h emisso da ltima fluorescncia10.
Como a temperatura aumenta durante a curva de melting, a sonda doadora de fluorescncia ir dissociar-se do amplicon, resultando
em uma diminuio da fluorescncia. Se houver qualquer mutao na regio de hibridizao do amplicon, a sonda doadora ligar de
maneira mais fraca e se dissociar do amplicon em temperaturas mais baixas11.
Genotipagem e discriminao allica
Alm da anlise da curva de melting, a tcnica de PCR multiplex tambm pode ser aplicada. Neste caso vrios produtos gnicos
diferentes so amplificados no mesmo tubo. Em tal ensaio so utilizados primers sintticos marcados com fluorforos com emisso em
diferentes comprimentos de onda, permitindo a mltipla deteco dos polimorfismos. Entretanto, este tipo de ensaio apresenta maior
dificuldade de realizao, pois conforme os diferentes produtos se acumulam durante o processo, as diferentes reaes competem
pelos reagentes. Para minimizar este problema, devem ser utilizadas quantidades limitantes de primers devendo ser muito bem
desenhados para evitar complementaridade entre si. Alm disso, a utilizao de sondas preferencial ao uso de primers marcados
com fluorescncia3. Este tipo de anlise pode ser aplicada na genotipagem de indivduos ou organismos experimentais permitindo, por
exemplo, a discriminao allica ou a deteco de mutaes pontuais que predisponham os indivduos a doenas genticas
particulares.
Deteco de translocaes cromossmicas
Em relao s aplicaes em oncologia, a PCR em tempo real permite a deteco e, em certos casos, a quantificao de
translocaes cromossmicas ou de seus transcritos de fuso gnica em uma amostra do paciente para uso na determinao de
doena residual mnima ou para avaliar a possibilidade de progresso da doena. Pode ser citada, como exemplo, a deteco de
alguns dos possveis produtos de rearranjos encontrados na leucemia linfoblstica aguda, a avaliao do produto de fuso do gene
AML-1/MTG8 utilizado como marcador de doena residual mnima na leucemia mieloblstica aguda, a resposta de pacientes ao
tratamento com interferon por medida do produto de fuso dos genes BCR-ABL, frequentemente encontrado na leucemia mieloide
crnica, entre outros12.

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Farmacogentica
O uso da PCR em tempo real no campo da farmacogentica tem sido ampliado atualmente no intuito de analisar a expresso gnica
em resposta a determinados tratamentos medicamentosos. Tal anlise permite uma melhor seleo do medicamento para um paciente
e permite a determinao da cintica de ao de um medicamento atravs da avaliao da expresso do gene-alvo em resposta ao
tratamento ou a resposta de transportadores ou enzimas do metabolismo que facilitem a distribuio ou a eliminao do frmaco.
Pode, ainda, auxiliar no teste de novos medicamentos e na verificao de seu potencial mutagnico, por exemplo13. A resposta aos
medicamentos varia muito entre os indivduos, o que faz com que a escolha de um determinado frmaco seja muitas vezes difcil.
Diversos fatores genticos afetam o metabolismo e o transporte de medicamentos no organismo, sendo as principais causas da
variao individual ao tratamento medicamentoso. A existncia de polimorfismos nos genes que codificam para as enzimas que
metabolizam medicamentos separa a populao em geral em diferentes classes de indivduos em funo de suas capacidades
metablicas relacionadas a uma determinada enzima. Dessa maneira os mtodos de genotipagem permitem determinar ou predizer o
status metablico do indivduo e saber se ele apresentar o risco de ineficcia ou de toxicidade a um determinado medicamento que
depende de uma determinada enzima para exercer sua atividade. A validao clnica de testes farmacogenticos ir contribuir de
maneira significativa para o rpido desenvolvimento da farmacogentica dentro da prtica mdica corrente, com a perspectiva de uma
individualizao do tratamento medicamentoso e melhora na resposta teraputica. Diversos estudos farmacogenticos tm sido
realizados na rea oncolgica, permitindo um tratamento cada vez mais individualizado e eficiente14,15.
O uso do tempo real em microbiologia e doenas infecto-contagiosas
A PCR em tempo real tambm permite a distino de sequncias especficas dentro de uma mistura complexa de DNA o que faz com
que, na rea de apoio ao diagnstico, tal tcnica seja utilizada na determinao especfica da presena e quantidade de
determinados vrus, bactrias ou fungos. Devido relao entre a carga viral e a gravidade da doena, a PCR em tempo real, por ser
um mtodo quantitativo, capaz de mensurar indiretamente a progresso da doena e a eficcia das terapias antivirais.
O uso da PCR em tempo real na deteco e identificao de bactrias tambm um campo em expanso. Atualmente, quando uma
amostra chega ao laboratrio clnico necessrio primeiro que a bactria presente na amostra cresa em meio de cultura, somente
assim a mesma pode ser identificada de maneira presuntiva. Ainda, para determinar o espectro de sensibilidade aos antibiticos de
cada cepa, a mesma deve crescer em uma placa contendo meio de cultura na presena de pequenos discos de papel impregnados de
antibiticos, ou seja, a identificao associada ao antibiograma demora no mnimo trs dias para ser concluda. A substituio deste
processo pelo uso da PCR em tempo real, principalmente no sentido de viabilizar o rpido acesso ao espectro de sensibilidade da
bactria, facilitaria infinitamente a prescrio adequada de antibiticos. Um dos principais impactos sentidos seria a minimizao da
utilizao em massa de antibiticos de amplo espectro de alta potncia em casos desnecessrios, reduzindo os custos associados.
Alm disso, permitiria a deteco precoce de cepas multirresistentes a antibiticos, evitando sua disseminao16.
A PCR em tempo real tem sido utilizada na deteco de Mycobacterium tuberculosis, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes,
e Neisseria gonorrhoeae. A anlise de mutaes tem permitido monitorar a resistncia aos antibiticos de cepas de Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermidis, Helicobacter pylori, Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium12.
Um crescente volume de artigos publicados demonstra a utilidade da PCR em tempo real relacionada rea microbiolgica. A elevada
sensibilidade e especificidade, associada a um curto tempo para a liberao dos resultados e facilidade de realizao da tcnica, tem
feito da PCR em tempo real uma metodologia atrativa na substituio da cultura convencional e dos ensaios baseados em antgenos
(10).
Entretanto existem limitaes no uso da PCR em tempo real aplicada microbiologia. Em contraposio aos mtodos de cultura
bacteriana tradicionais, esta tcnica baseada na amplificao do DNA bacteriano e, portanto, no diferencia entre patgenos vivos
e mortos12. A associao de ambas as tcnicas: crescimento tradicional da bactria em meios de cultura, com posterior identificao
e determinao do espectro de sensibilidade a antibiticos por PCR em tempo real poderia ser uma estratgia adotada para controlar
este problema.
As bactrias tradicionalmente identificadas por imunoensaios diretos, tais como estreptococos do grupo A, comuns em infeces de
garganta e Clostridium difficile e Escherichia coli O157:H7 presente nas fezes, possuem disponveis reagentes e kits especficos para
sua deteco por tempo real, como, por exemplo, o Light-Cycler Strep-A para uso no LightCycler da Roche Diagnostics Corporation
para deteco de estreptococos do grupo A e os kits IDI-StrepB assay para uso com o SmartCycler, da Infectio Diagnostics, Inc.,
Sainte-Foy, Quebec, Canada LightCycler StrepB pts1, Roche Diagnostics Corporation para deteco de estreptococos do grupo B10.
As bactrias de crescimento lento e/ou difcil em cultura tambm se beneficiaram das tcnicas de tempo real para sua identificao,
como exemplos podem ser citadas: Anaplasma phagocytophila, Bartonella henselae, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Ehrlichia
spp., Legionella spp., Mycoplasma pneumonia, Chlamydophila pneumonia, assim como bactrias para as quais ainda no existem
mtodos de identificao tais como a Tropheryma whipplei. A PCR em tempo real tem sido utilizada tambm na identificao de
agentes causadores de pneumonia comunitria, tais como: Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Legionella spp. e
Streptococcus pneumoniae, de agentes causadores da meningite: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae e Haemophilus
influenzae10.
Por ser uma tcnica que permite a obteno de resultados rpidos, a PCR em tempo real tem sido utilizada atualmente na
identificao de potenciais agentes de bioterrorismo, tais como Bacillus anthracis e Yersinia pestis.
Outro campo de aplicao da PCR em tempo real dentro da microbiologia a identificao de genes bacterianos envolvidos na
resistncia teraputica com antibiticos em contraposio s tcnicas de antibiograma em placa. Tal abordagem essencial para a
identificao de cepas de Staphylococcus aureus meticilina (oxacilina)-resistentes (MRSA) ou Enterococcus spp. resistentes a
vancomicina (VRE), as quais representam uma ameaa sade e altos custos associados. Dois fabricantes apresentam kits
comercialmente disponveis na deteco de VRE ou MRSA utilizando plataformas de tempo real: a Infectio Diagnostic, Inc., que
recebeu aprovao de um kit para deteco direta de MRSA de swabs nasais utilizando o aparelho SmartCycler. A Roche
Diagnostics Corporation possui o ensaio de deteco para VRE (Light Cycler vanA/vanB) e para MRSA (LightCycler mecA detection
assay), ambos padronizados para uso no LightCycler10.
Tambm foram desenvolvidos pares de primers que permitem a distino pela PCR em tempo real de polimorfismos referentes aos loci
narG, oxyR, and RD1 do complexo de Mycobacterium tuberculosis, permitindo a diferenciao entre Mycobacterium tuberculosis,
Mycobacterium bovis e Mycobacterium bovis BCG, respectivamente10.
A PCR em tempo real tem sido padronizada para a deteco e quantificao de patgenos virais em humanos. Dentre eles podemos
destacar: vrus do herpes simples, vrus do varicella Zoster, citomegalovrus, Epstein-Barr vrus, enterovrus, poliomavrus, parvovrus,
vrus do sarcoma de Rous, parinfluenza, influenza, entre outros10,17. Na rotina assistencial de alguns laboratrios de referncia seu
emprego limitado para determinao da carga viral, com poucas excees, de um grupo reduzido de vrus com grande interesse
econmico, para os quais esto disponveis kits comerciais bem padronizados. Dentre eles podemos citar o HIV-1 e 2 e os vrus das
hepatites.
Os primeiros testes aplicados na deteco do HPV, vrus do papiloma humano, que possui diversos subtipos associados ao
desenvolvimento do cncer de colo uterino, foram desenvolvidos baseados nas tcnicas de biologia molecular com o uso de sondas de
oligonucleotdeos marcadas com fsforo radioativo complementares s sequncias dos subtipos oncognicos. Estes testes no eram
muito eficientes porque no conseguiam detectar vrios subtipos de HPV ao mesmo tempo. O kit atual de deteco dos HPVs por
captura hbrida detecta os subtipos atravs de dois grupos de sondas fluorescentes diferentes misturadas: as capazes de detectar os
subtipos de alto risco e as capazes de detectar os de baixo risco, entretanto no capaz de discernir qual o subtipo especfico que
est alterado dentro destes grupos. Com o uso da PCR em tempo real se consegue determinar no somente o gentipo do vrus, mas
tambm a carga viral a partir das curvas de cintica resultantes do ensaio18. A atual pandemia causada pelo vrus da influenza A
(H1N1)v tornou necessria a procura por metodologias que permitissem a distino entre os diferentes tipos de vrus da influenza. A
maior parte dos laboratrios mundiais realizava somente a deteco do vrus influenza responsvel pela gripe comum. Recentemente,
pesquisadores desenvolveram ensaios que utilizam a tcnica de PCR em tempo real para identificar facilmente os tipos e subtipos dos

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vrus da influenza A e B19.
Algumas reaes de PCR multiplex esto sendo realizadas com o intuito de permitirem a deteco simultnea de patgenos em casos
de suspeita de coinfeco, comuns em alguns tipos de doena, como na Aids. Nestes casos so detectados simultaneamente, por
exemplo, o vrus da imunodeficincia humana-1 (HIV-1) e o Treponema pallidum, agente etiolgico causador da sfilis20.
Na deteco de adenovrus, testes cada vez mais otimizados e rpidos tm sido desenvolvidos. Um novo mtodo conhecido como
Hyper-PCR utiliza uma enzima Taq DNA polimerase de alta velocidade e um tubo com espessura fina que permite mudanas de
temperatura decorrentes da termociclagem ainda mais rpidas em um aparelho especial. O tempo total na deteco de adenovrus por
esta metodologia, excluindo o tempo referente a extrao do material gentico, de 17 minutos, ou seja, bem inferior PCR em
tempo real convencional a qual, neste caso, teve como tempo de durao 62 minutos (21).
Em relao aplicao da PCR em tempo real na deteco de fungos, os principais ensaios padronizados tiveram como alvo diferentes
espcies de Aspergillus. A razo para tal esforo o fato de que a rpida deteco de Aspergillus spp. pode reduzir a extensa
morbidade e mortalidade associadas aspergilose invasiva. Alguns ensaios foram desenvolvidos para a deteco de outros fungos,
tais como Candida spp. e Pneumocystis jiroveci. Na deteco de parasitas a PCR em tempo real tem sido aplicada principalmente na
deteco do agente etiolgico causador da malria, o Plasmodium falciparum. Alguns outros parasitas possuem ensaios padronizados,
tais como: Babesia, Trypanosoma, Toxoplasma, Leishmania, Trichomonas, Cryptosporidium, Entamoeba e Giardia spp10.
Na indstria alimentcia e na agricultura a PCR em tempo real tem sido utilizada na identificao de micrbios, parasitas ou organismos
geneticamente modificados. Na rea forense o uso desta tcnica permite resultados de elevada sensibilidade, especificidade e
velocidade, o que de grande valia em maior parte das investigaes criminais em que o tempo crucial para a soluo do caso e a
quantidade de amostra normalmente limitada22.
Concluso
Nos ltimos anos a reao em cadeia de polimerase por tempo real emergiu como uma tcnica amplamente utilizada na investigao
biolgica devido capacidade de amplificao e deteco simultneas de quantidades muito pequenas de sequncias especficas de
cidos nucleicos. Como uma ferramenta de pesquisa extremamente til na determinao da expresso gnica resultante da ao de
diversos fatores. No diagnstico clnico-molecular a PCR em tempo real pode ser utilizada para avaliao da carga viral ou bacteriana,
determinao da resistncia a antibiticos e at mesmo para o prognstico de tumores malignos.
Devido realizao das etapas de amplificao dos cidos nucleicos e deteco do produto amplificado no interior de um nico tubo
durante a PCR em tempo real traz inmeras vantagens na utilizao desta tcnica como ferramenta na pesquisa e diagnstico. Dentre
elas podemos citar: reduo do risco de contaminao cruzada, curto tempo necessrio para a realizao da tcnica, permite rpidos
resultados, alm de apresentar execuo simples associada excelente sensibilidade e especificidade. Cumpre ser observado que
atualmente a utilizao das tecnologias de amplificaes por tempo real ainda permanecem com uso limitada devido aos elevados
custos relacionados aos reagentes e, principalmente, aos sistemas de deteco empregados. Entretanto, tal vis possui a tendncia
de resoluo em curto prazo com a ampliao e importncia das aplicaes multidisciplinares do uso rotineiro da PCR e RT-PCR em
tempo real, como citado neste artigo.

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