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Tincin Simple y Tincin Gram

Kelly Paola Guanoquiza Zambrano


Laboratorio de Microbiologa I, Facultad de Ciencia e Ingeniera en Alimentos, Universidad
Tcnica de Ambato

Resumen
Las tinciones cumplen un papel muy importante en la observacin de microorganismos
microscpicos como es el caso de las bacterias, ya que permiten teir o fijar sus
estructuras morfolgicas ya sea en estado vivo o inerte. En la prctica realizada se
utiliz especficamente dos tipos de tincin: tincin simple y tincin gram para
diferenciar las formas bacterianas de varios cultivos puros de bacterias. En la primera
muestra por tincin simple se observaron bacilos, en la segunda y tercera muestra
ambas por tincin de Gram se observaron de igual manera bacilos siendo stos Gram
negativos.
Introduccin
Los microorganismos vivos o activos generalmente son incoloros (excepto algas y
cianobacterias), por lo que no se observaran con facilidad en un microscopio ptico de
campo claro debido a la falta de contraste entre las clulas y el medio circundante. La
tincin es un mtodo sencillo para incrementar el contraste entre la clula y su entorno
y por lo tanto contribuye a mejorar la imagen observada. Las tcnicas de tincin con
diversos colorantes facilitan la observacin al aumentar notablemente el contraste,
existen dos tipos de tinciones que son las ms utilizadas con las bacterias: tincin
simple y tincin diferencial de Gram (Ramos, Seplveda, Barragn & Gonzlez, 2012).
La tincin simple o directa utiliza un solo colorante, el cual deber se bsico para que la
clula bacteriana se tia, destacando la morfologa general de la clula de manera
rpida; al emplearse un nico colorante, todas las clulas se observarn del color del
colorante empleado. Los colorantes ms empleados son cristal violeta, azul de
metileno y fucsina fenicada, estos colorantes difieren en la velocidad y grado en que
tien (Cavallini, Coronado, Chavarra & Hidalgo, 2005).
La tincin de Gram es un procedimiento de gran utilidad empleado en los laboratorios
especficamente en donde se manejan pruebas microbiolgicas, se la define tambin
como tincin diferencial, ya que emplea dos colorantes y clasifica a las bacterias en
dos grandes grupos: bacterias Gram negativas y bacterias Gram positivas. La reaccin

de la tincin de Gram se basa en la cantidad de peptidoglicano presente en las


paredes celulares de las bacterias (Jcome, Durn, Castro & Pea, 2013).
El objetivo primordial de la prctica es identificar las diferentes formas (cocos, bacilos,
espirilos, etc.) y agrupaciones de las bacterias utilizando la tcnica de tincin simple,
as como clasificar a las bacterias ya sea como Gram negativas o Gram positivas
utilizado la tcnica de tincin de Gram.
Material y mtodos
En todas las tcnicas de tincin es necesario realizar un frotis con los cultivos puros de
bacterias. Para preparar un frotis se coloc una gota de agua estilada sobre un
portaobjetos limpio y seco, con un asa de transferencia previamente flameada se tom
una pequea cantidad de clulas de cultivos puros de bacterias y se la coloc sobre la
gota de agua destilada. Posteriormente se mezcl uniformemente las clulas
bacterianas con el agua destilada y se esparci la suspensin a lo largo del
portaobjetos. Al terminar este paso se flame nuevamente el asa con el fin de
esterilizarla. Se dej secar al ambiente, una vez seco se traspas el portaobjetos por
la llama mnimo tres veces para fijar el frotis. Se rotul cada muestra con los cdigos
correspondientes de los cultivos de bacterias utilizadas.
Para el proceso de tincin simple se cubri totalmente el frotis preparado
anteriormente con azul de metileno y se dej actuar el colorante por un minuto, se
elimin el exceso de colorante utilizando agua destilada. Se dej secar al aire y
posteriormente se observ con el objetivo de inmersin 100x.
Para la tincin diferencial de Gram, se ti cada muestra con violeta de cristal
dejndola actuar por un minuto y se lav con agua destilada. Despus se cubri con
lugol la suspensin por un minuto y se lav con agua destilada eliminando excesos del
colorante. Para decolorar la muestra se utiliz etanol al 95% por 30 segundos y
nuevamente se lav con agua destilada. Finalmente se ti la muestra con safranina
por un minuto, se lav el exceso de colorante y se dej secar a temperatura ambiente
y se procedi a observar en el objetivo de inmersin 100x.
Resultados

Tabla N1: Forma y agrupacin de las clulas bacterianas por tincin simple

Bacteria TG022
Lente 100X

Forma: Bacilos
Agrupacin: Estreptobacilos
Tabla N2: Clasificacin de las bacterias por tincin diferencial de Gram

Bacteria TG024

Bacteria TG123

Lente 100X

Lente 100X

Forma: Bacilos
Gram negativo

Forma: Bacilos
Gram negativo

Discusin
Las tinciones juegan un papel muy importante en la observacin de microorganismos
microscpicos como las bacterias, ya que fijan o tien la estructura morfolgica de
stas. En los laboratorios que manejan principalmente muestras microbiolgicas se
utilizan dos tipos de tincin: la tincin simple y la tincin de Gram. En la presente
prctica al realizar el experimento de tincin simple se utiliz un nico colorante bsico
que fue el azul de metileno, con el fin de teir de manera uniforme a todas las clulas
bacterianas, la coloracin que adquieren stas clulas se debe a que el azul de
metileno es un colorante que posee iones cargados positivamente y las estructuras
celulares de los microorganismos poseen iones cargados negativamente por lo que se
atraen mutuamente y las clulas de los microorganismos se tien. Al observar la
bacteria TG022 (tincin simple) en el lente de inmersin 100x, las clulas bacterianas
presentaron forma cilndrica, forma caracterstica de los bacilos y agrupacin
estreptobacilos ya que consista en una cadena de bacterias unidas de punta a punta.

En el experimento de la tincin de Gram se utiliz 4 soluciones principales, primero se


utiliz cristal violeta (colorante catinico) que penetra en todas las clulas bacterianas
tanto Gram positivas como Gram negativas a travs de la membrana bacteriana,
despus se coloc lugol o mordiente el cual facilita la adhesin del cristal violeta en la
muestra, luego se coloca alcohol por 30 segundos como agente descolorante. Si las
bacterias son Gram positivas mantendrn el color violeta ya que tienen mayor
porcentaje de cido teicoico en su estructura pero si son Gram negativas se decoloran.
Finalmente se coloc safranina que es el colorante de contraste y sirve para teir las
clulas bacterianas que no lograron retener el color violeta, las bacterias que absorben
este colorante y que adquieren un color rosado se conocen como Gram negativas. Al
observar las bacterias TG024 y TG123 en el lente de inmersin 100x, las clulas
bacterianas presentaron en ambas muestras forma cilndrica es decir bacilos y
presentaron un color rojizo por lo que se clasifican como Gram negativas.
Cuestionario

Por qu se utilizan colorantes bsicos en la tincin simple? Nombre 3


ejemplos.

Se utilizan colorantes bsicos porque son molculas cargadas positivamente que se


atraen mutuamente con las estructuras celulares de los microorganismos las cuales
poseen iones cargados negativamente, lo que hace posible la tincin. Los colorantes
ms utilizados son el Cristal Violeta, el Azul de Metileno y la Fucsina.

Sealar las diferencias entre la tincin simple y la tincin diferencial de Gram.


Tabla N 3: Diferencias entre tincin simple y Gram

Tincin Simple
Se utiliza un solo colorante
Proporciona informacin acerca

Tincin diferencial de Gram


Se utiliza dos o ms colorantes
Se utiliza para distinguir tipos de

de la forma, tamao y tipo de agrupacin

microorganismos

(Gram

positivos

de los microorganismos.

Las estructuras se tien con la

Gram negativos).

las estructuras

misma tonalidad.

diferencian en funcin de los diferentes

celulares

o
se

colorantes que se utilizan.


Elaborado por: Guanoquiza K, 2015.

Cul es la funcin del lugol y del alcohol en la tincin de Gram?

El lugol se emplea para retener el color cristal violeta, el I2 entra en las clulas y forma
con el colorante cristal violeta un complejo insoluble en agua.

El alcohol-acetona acta como disolvente orgnico o decolorante que se utiliza como


lavado para eliminar el colorante no fijado.

Escriba las diferencias entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas y 2
ejemplos de cada grupo.

Gram positivas
Se tien de color azul o violeta.
Poseen una capa gruesa de

Gram negativas
Se tien de color rosado.
Poseen una capa delgada de

peptidoglicano

Resistencia a la decoloracin.

No tienen su capa susceptible a

peptidoglicano.

Se decolora con mayor facilidad.

Solubles en solventes orgnicos

la accin de solventes orgnicos

Tienen pared celular gruesa.


Ejemplos:
Clostridium,
Bacillus

como el alcohol

Tienen pared celular delgada.


Ejemplos: Escherichia coli, Salmonella

Anthrasis.

typhi

Conclusiones
Se identific las diferentes formas y agrupaciones que poseen las bacterias,
principalmente utilizando la tcnica de tincin simple la cual utiliza un nico colorante
bsico, en este caso se utiliz el azul de metileno que tie de manera uniforme a las
clulas bacterianas. La forma que present la bacteria TG022 fue cilndrica es decir
bacilo y agrupacin estreptobacilos.
Se clasific a las bacterias como Gram negativas o Gram positivas, utilizando la tincin
de Gram, que se basa principalmente en la coloracin que presentan las clulas
bacterianas, Las bacterias TG024 y TG123 presentaron color rosado y con forma de
bacilos es decir son Gram negativas. No hubo presencia de bacterias Gram positivas
debido a que no se encontraron clulas bacterianas de color azul violeta.

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