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INTRODUCCIN
Los seres superiores estn defendiendo constantemente su integridad biolgica frente
a agresiones, esencialmente externas. De no ser as, moriran como consecuencia de
tumores e infecciones de bacterias, virus, hongos, etc. Para que estos fenmenos de defensa
se lleven a cabo, los organismos disponen de un conjunto de elementos especiales, conocido
como sistema inmune. La capacidad de defensa se adquiere antes de nacer y se madura y
consolida en los primeros aos de la vida fuera del seno materno.
La inmunologa es la ciencia que estudia los procesos moleculares y celulares
implicados en la defensa de la integridad biolgica del organismo a travs de la identificacin
de las sustancias propias y deteccin de las sustancias extraas y su destruccin. En cada
organismo, los mecanismos de defensa son muy diversos y heterogneos, aunque siempre
existe una actuacin integrada de todos ellos. Los mecanismos de defensa pueden ser de tipo
inespecfico y especfico. Los mecanismos inespecficos estn constituidos por las barreras
naturales, tales como la piel, mucosas y otros que estn protegiendo constantemente al
individo de contagios externos (Figura 1.). Otros elementos naturales de actuacin son la
lisozima de la saliva, lgrimas y secreciones nasales que tienen capacidad de romper la unin
de azcares en las paredes bacterianas, lo que puede inducir su lisis. Tambin entre estos
mecanismos inespecificos se encuentra la respuesta inmune inespecfica que estn
constituidos fundamentalmente por los componentes de la respuesta inmune especifica.
Entendemos por respuesta inmune todos aquellos eventos desarrollados por el sistema
inmune al objeto de defender la integridad biolgica del individuo frente a cualquier agresin
(estimulo antignico). La respuesta inmune puede ser, pues, de tipo inespecfica o innata y
especfica
La respuesta inespecfica o innata es la primera barrera defensiva del organismo y no
requiere sensibilizacin previa. La respuesta especfica o adquirida se desarrolla solo frente a
la sustancia extraa que indujo su iniciacin y en ella participan prioritariamente los linfocitos y
las sustancias liberadas por los mismos, anticuerpos y citocinas (Figura 1.).
El sistema inmune se encuentra ubicado en los rganos linfoides y en su accin
participan una serie de clulas, clulas inmunocompetentes, y molculas, entre las que
destacan las inmunoglobulinas, linfocinas y otras (Figura1.). Las distintas clulas
inmunocompetentes se recogen en la Figura 1.4.
Todas las sustancias que tienen la capacidad de estimular al sistema inmune, se
conocen como antgenos y las partes del mismo que tienen capacidad inmungena, se
conocen como determinantes antgnicos o eptopos.
Generalmente el sistema inmune responde de forma unitaria, por lo que la divisin en
respuesta inespecfica y especfica es ms terica que real. Lo que s ocurre es que,
dependiendo de las circunstancias, en unos casos predomina una u otra de estas modalidades
de respuesta inmune.
La Inmunologa es una ciencia de gran amplitud que comprende diversas reas:
Inmunogentica, Inmunobiologa, Inmunopatologa o Inmunologa clnica, Inmunofarmacologa,
Inmunologa veterinaria, etc., todas ellas en continua expansin.
RESPUESTA INMUNE INESPECIFICA.
La finalidad de la respuesta inmune tanto inespecfica como especifica es la defensa de
la integridad biolgica del individuo, actuando como un sistema de mantenimiento de la
homeostasis del organismo, al igual que lo hace, por ejemplo, el sistema respiratorio o el
sistema nervioso.
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estmulo de ciertas citocinas (Figura 1.13)producidas por los linfocitos T colaboradores. Slo
cuando confluyen estos estmulos, el antignico y el mediado por las citocinas, se produce la
activacin, proliferacin y diferenciacin de los linfocitos B hasta la formacin de clulas
memoria y clulas plasmticas productoras de inmunoglobulinas, que sern el elemento efector
final de la respuesta humoral. En la Figura 1.14 se muestra un esquema con una visin
general de la respuesta inmune.
Caractersticas respuesta inmune especfica
La respuesta inmune especifica se caracteriza por ser de carcter clonal, reconocer
unos antgenos y no otros (especificidad), desarrollar memoria y ser autoregulable.
Especificidad. Se sabe que cada antgeno estimula solo a aquel linfocito o
grupo de linfocitos que han desarrollado y en consecuencia poseen en su membrana
los receptores capaces de reconocer y unirse especficamente a l. Estos receptores,
tal como se ha indicado anteriormente, son las inmunoglobulinas de superficie cuando
se trata de linfocitos B o el TCR cuando se trata de linfocitos T.
Clonalidad. Cuando un linfocito o grupo de linfocitos es activado, este prolifera
y se diferencia en mltiples clulas derivadas, todas ellas con idnticos receptores de
superficie. Se dice entonces que todas estas clulas constituyen lo que se denomina
clon celular. Tanto la especificidad como la clonalidad de la respuesta inmune fueron
originariamente definidos en los aos cincuenta por varios inmunlogos entre los que
se encontraba Burnet y se conoci despus por la teora de seleccin clonal de Burnet.
Esta teora deca que cada antgeno estimular a aquel linfocito o grupo de linfocitos
que poseen en su membrana receptores capaces de reconocer y unirse
especficamente a l y que como consecuencia se produca su proliferacin y
diferenciacin en clulas con las mismas caractersticas de reconocimiento que los
linfocitos originales (Figura 1.15). Este carcter clona, le confiere a este tipo de
respuesta el carcter de gran eficiencia en cuanto que cada individuo solo pone en
marcha aquellos elementos, celulares y moleculares, que le son necesarios para una
determinada accin.
Memoria Inmunolgica. Otra caracterstica importante de este tipo de
repuesta es que el organismo mantiene memoria de un estmulo a otro cuando son de
la misma ndole. Eso se debe a la permanencia de linfocitos sensibilizados de larga
vida despus de un estmulo antignico.
Autorregulacin. Este tipo de respuesta dispone de mecanismos internos de
control, de tal forma que la intensidad de la misma se regula por accin de diversos
tipos de molculas entre las que destacan las inmunoglobulinas y sobre todo las
citocinas. En la Figura 1.16 se recogen las distintas fases de la respuesta inmune.
Respuesta primaria y secundaria.
Cuando por primera vez un antgeno se pone en contacto con el organismo, se produce
una respuesta inmune que se denomina respuesta primaria. Por el contrario, cuando al cabo de
un tiempo el mismo antgeno vuelve a activar al sistema inmune, se produce una respuesta que
denominamos respuesta secundaria o adaptativa (Figura 1.). Ambas respuestas son, cualitativa
y cuantitativamente, diferentes. Las diferencias esenciales son:
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Ello se debe a que cuando un antgeno activa por primera vez a los linfocitos B, stos
necesitan tiempo para diferenciarse en las clulas plasmticas responsables de la sntesis de
inmunoglobulinas, mientras que cuando se trata de la respuesta secundaria, gracias a la
permanencia de las clulas memoria, se alcanza mucho antes el nivel de clulas plasmticas.
Resulta as, que la respuesta ser de menos intensidad que tras un segundo estmulo en que
ha aumentado el nmero de linfocitos sensibles gracias a la permanencia de clulas memoria
con receptores idneos para tal antgeno.
Estos sistemas funcionan de forma secuencial, envindose informacin entre ellos para
una eficaz eliminacin del patgeno. As, una vez que entra el patgeno superando las
barreras fsico-qumicas, se pone en funcionamiento el sistema inmune innato, con clulas y
factores solubles que van a tratar de eliminarlos. Tras la activacin de este sistema, es
nicamente en los vertebrados donde puede ponerse en marcha el sistema inmune especfico
adaptativo, aunque coordinado con los componentes del sistema inmune innato. Como
ejemplos de esta cooperacin se encuentran el papel desempeado por los macrfagos como
clulas presentadoras de antgeno a los linfocitos T; los anticuerpos IgM e IgG son capaces de
activar el sistema del complemento por la va clsica; o la citotoxicidad dependiente de
anticuerpo por parte de las clulas natural killer.
CONCEPTO DE ANTIGENO Y HAPTENO
Se entiende por antgeno toda sustancia con capacidad para generar una respuesta
inmune, esto es que posee capacidad de ser reconocida como extraa por el sistema inmune.
Sabemos que prcticamente cualquier tipo de molcula biolgica, incluyendo azcares, lpidos,
hormonas, metabolitos intermediarios, carbohidratos complejos, fosfolpidos, cidos nuclicos y
protenas pueden ser antgenos. Si se quiere producir anticuerpos contra pequeas molculas,
stas deben unirse antes de la inmunizacin a una macromolcula. En este sistema, la
molcula pequea recibe el nombre de determinantes antgenos (Figura 1. ).
Los anticuerpos frente a un antgeno se unen a sus grupos determinantes. Esta
capacidad de unin antgeno-anticuerpo (Ag-Ac), es la caracterstica ms importante y comn
de todas las inmunoglobulinas. Esta unin es no covalente y dbil, de tal forma que la reaccin
es reversible, encontrndose los antgenos y los anticuerpos libres en equilibrio dinmico con
los unidos. En general los antgenos son de mayor tamao que la zona que participa en la
unin con el anticuerpo, de modo que un anticuerpo solo se une a una zona muy restringida del
antgeno. A esta zona del antgeno que participa en la unin con el anticuerpo se le denomina
epitopo o determinante antignico. La mayora de los antgenos poseen mltiples eptopos, con
lo que pueden unir mltiples anticuerpos a la vez siempre que los eptopos estn
suficientemente alejados entre ellos para que no existan interferencias estricas que lo impidan
Clsicamente se llamaba antgeno a toda molcula capaz de generar un anticuerpo. En
la actualidad sin embargo, se considera antgeno a cualquier molcula capaz de unirse a un
anticuerpo independientemente de que pueda, por si sola, generarlo. Aquellas molculas que
adems sean capaces de generar un anticuerpo se les denomina inmunogenas. En este
sentido existen molculas demasiado pequeas que llamamos haptenos, que para generar
anticuerpos necesitan ir unidas a molculas mas grandes llamadas carrier. Una vez que se han
generado de este modo, anticuerpos contra el hapteno, ste puede unirse a los anticuerpos. El
hapteno es por tanto, una molcula antignica pero no inmungena.
Tras la unin antgeno-anticuerpo (Ag-Ac), las sustancias extraas (o antgenos) son
neutralizadas y posteriormente destruidas por las inmunoglobulinas a travs de mecanismos,
que pueden ser diferentes segn el tipo de inmunoglobulina que participa.
INMUNOPATOLOGA
Hay multitud de casos en los que los sistemas de defensa son en s causa de
enfermedad. Esto es, por ejemplo, lo que ocurre cuando el individuo reacciona incluso frente a
sustancias que en principio son inocuas, como es el polen de plantas, etc. Entonces se habla
de reacciones de hipersensibilidad(Figura 1. ) .
En otros casos, por razones todava no muy bien conocidas, el sistema inmune
reacciona frente a componentes propios, que destruye, ocasionando graves trastornos, o
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Los linfocitos son clulas de tamao pequeo con un ncleo muy voluminoso y
provistas de una membrana citoplasmtica de especial importancia en la regulacin de su
funcionalidad. Estas clulas se dividen en linfocitos T y linfocitos B.
Ambos tipos de linfocitos al igual que todas las clulas sanguneas derivan de una
clula progenitora pluripotencial que en el feto se encuentra en el hgado y despus del
nacimiento en la mdula sea. A esta clula precursora comn se le denomina CFU-LH o
Unidad formadora de colonias linfoides y hematopoyticas (Figura 2.). Posteriormente esta
clula se diferenciar para dar lugar, por un lado, a la clula madre hematopoytica
pluripotencial (CFU-GMEM) para las series eritroctica, granuloctico-macrofgica y
megacarioctica. Por otro lado, dar lugar a una clula progenitora unipotencial (CFU-L),
especfica para la serie linfoide.
Cada una de estas clulas progenitoras continuar diferencindose hacia otras clulas
inmaduras, originndose as las CFU-E (precursor eritroctico), CFU-GM (precursor
mielomonoctico) y CFU-Meg (precursor megacarioctico) a partir de la clula precursora
hematopoytica.
De la clula madre linfoidea derivarn dos clulas precursoras, CFU-T y CFU-B, que
tras un proceso de maduracin, conocido como linfopoyesis, originarn los linfocitos T y B
respectivamente. En sangre perifrica la proporcin de linfocitos T es aproximadamente de un
70% mientras que la proporcin de linfocitos B es de un 15%. En la Figura 2. se muestra
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Linfopoyesis
Las clulas pluripotentes, en las aves, se diferencian y transforman en clulas tambin
inmaduras, que emigran, unas hacia el timo y otras hacia la bolsa de Fabricio, donde se
transforman y maduran en linfocitos T o timo dependiente y linfocitos B o bolsa dependiente,
respectivamente (figura 2.3). En los mamferos, y entre ellos el hombre, estos procesos se
realizan en el timo (linfocitos T) y en la propia mdula sea (linfocitos B) (Figura 2. ).
Veamos a continuacin los aspectos ms importantes de la linfopoyesis en el timo y en
la bolsa de Fabricio o en los rganos equivalentes a la misma en los mamferos.
Linfopoyesis T
El timo es un rgano situado en la parte superior del mediastino anterior, donde
maduran los linfocitos T. El timo presenta su mximo desarrollo en el feto y en el nio,mientras
que a partir de los 10-12 aos comienza un proceso atrfico y degenerativo con gran invasin
grasa, de tal forma que en el adulto slo quedan residuos del mismo (Figura 2. ).
Los precursores de los linfocitos T, durante el proceso de maduracin intratmica,
reciben el nombre de timocitos. Durante esta fase mueren muchos timocitos, aproximadamente
el 95 por 100 de ellos, debido a que se eliminan aquellos que reconocen los antgenos propios
del organismo. El resto de las clulas abandonan el timo, va sangunea, como linfocitos T
maduros. Estos linfocitos colonizan los rganos linfoideos secundarios, situndose en la zona
paracortical de los ganglios linfticos y vainas paracorticales linfocticas del bazo.
Se han identificado algunos factores de transcripcin que son imprescindibles para la
diferenciacin de los linfocitos a lo largo de la linfopoyesis. Entre estos destacan PU.1 e
IKAROS que controlan el desarrollo de clulas T y B mientras que GATA-3 solo afecta el
compromiso de las clulas T y E2A, EBF y Pax controlan el compromiso B.
En el timo se han identificado clulas precursoras que poseen capacidad de generar
clulas T, NK, B y clulas dendrticas del timo, y a lo largo de su diferenciacin los precursores
mas evolucionados van perdiendo paulatinamente la capacidad de generar clulas B, NK y
clulas dendrticas en este orden.
Durante el proceso de maduracin intratmico, los timocitos adquieren una serie de
molculas nuevas en su superficie. Estas molculas van apareciendo secuencialmente en los
diferentes estados de maduracin intratmica as como, en general, en todos los procesos de
maduracin y diferenciacin hematopoyticos. Se les denomina marcadores de diferenciacin
hematopoytica ya que son propios de los diferentes estados madurativos y pueden ser
utilizados para definirlos. Se denominan con las siglas CD (cluster of differentiation o grupo de
diferenciacin) seguido de un nmero ordinal. La CFU-T, no expresa todava en su superficie
ninguno de los marcadores de los linfocitos T. Posteriormente estas clulas, ya en el timo,
maduran distinguindose varios estados diferenciativos con la presencia de diferentes
marcadores de superficie. As en los timocitos inmaduros aparecen los marcadores CD7 y CD2,
aadindose en un estadio posterior de maduracin (timocito comn), el marcador CD1.
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linfocinas, entre las que destacan la interleucina-2 (IL-2), la interleucina-4 (IL-4) y interfern
gamma. Fenotpicamente, la caracterstica esencial de esta subpoblacin linfocitaria viene
definida por la presencia de la molcula CD4 en la superficie celular. Esta molcula es de gran
importancia funcional y tambin se utiliza para la cuantificacin de esta subpoblacin. Se
distinguen dos poblaciones diferentes de estas clulas, Th1 y Th2. La Th1 produce IL-2 e
interern gamma mientras que la Th2 produce IL-4, 5y 6.
Clulas T citotxicas (Tc).
Una vez activada esta subclase de linfocitos T, adquiere capacidad citotxica, siendo,
por tanto, los principales responsables de los fenmenos de citotoxicidad de la respuesta
inmune clular. Estas clulas se caracterizan por expresar el marcador CD8 y, al igual que lo
hacen los linfocitos Th, el complejo TCR-CD3 y otras molculas importantes funcionalmente
tales como CD2 y LFA-1.
Clulas T supresoras (Ts) y/o reguladoras.
Estos tipos de clulas poseen accin reguladora de la respuesta inmune. La
regulacin de la actividad del sistema inmune es de gran importancia en todo el
comportamiento del mismo y, sobre todo, en el desarrollo de tolerancia frente a los
componentes propios del organismo. Estas clulas expresan en su membrana molculas CD8
al igual que lo hacen los linfocitos T citotxicos y su mecanismo de accin no solo no es muy
bien conocido en la actualidad sino que tambin la propia presencia de estas clulas se est
cuestionando.
Clulas Asesinas Naturales (NK)
En la dcada de los aos 70 Herberman observ que los linfocitos obtenidos de
individuos sanos eran capaces de destruir clulas tumorales sin que existiera sensibilizacin
previa. La citotoxicidad mediada por estas clulas se denomin citotoxicidad natural, y a las
clulas encargadas de desarrollar esta actividad se las denomin Natural Killer (NK) o clulas
asesinas naturales. Estas clulas representan aproximadamente el 10% de las clulas
mononucleares de sangre perifrica y fenotpicamente no poseen marcadores ni de los
linfocitos T ni de los linfocitos B y corresponden con un tercer tipo de clulas linfoides conocido
anteriormente como linfocitos nulos o tercera poblacin. Desde el punto de vista morfolgico la
mayora de las clulas con actividad NK corresponden con los linfocitos granulares grandes
(LGL) por su gran tamao y la presencia de abundantes grnulos citoplasmticos (Figura 2.
10). Aunque hoy se sabe que los linfocitos pequeos tambin pueden desarrollar esta accin
citotxica.
Las clulas NK se definen como linfocitos que no reorganizan los genes de las
inmunoglobulinas ni tampoco los del TCR y que, por tanto, no expresan sus productos as
como tampoco el complejo CD3 completo. Por el contrario, expresan en su superficie las
molculas CD16 y CD56 y para su accin citoltica no requieren la expresin de molculas del
MHC en la clula diana. Estas clulas son responsables de la citotoxicidad celulomediada
dependiente de anticuerpos (ADCC), es decir, destruyen clulas con antgenos extraos en su
superficie frente a los que se han producido anticuerpos.
Las clulas NK contribuyen a la defensa frente a clulas infectadas por virus, bacterias,
hongos y parsitos. Pero la principal actividad de la clula NK es su capacidad de actuar frente
al crecimiento de clulas tumorales impidiendo su expansin y la formacin de metstasis. El
sndrome de Shediack-Higashi es una deficiencia selectiva de actividad NK y cursa con una
alta incidencia de tumores.
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Los macrfagos son clulas grandes con un solo ncleo, un aparato de Golgi muy
desarrollado, gran cantidad de lisosomas y muy ricos en enzimas de diferentes tipos, entre los
que destacan proteasas, peroxidasas y lipasas. Estas clulas poseen, adems de la capacidad
fagoctica ya indicada, capacidad de adherencia a los tejidos, al vidrio y al plstico, as como
una gran movilidad en estas superficies (quimiotaxis). Los macrfagos tienen una vida media
de varios meses. Poseen tambin gran actividad metablica, sobre todo en lo que se refiere a
sntesis de protenas, incluso cuando se encuentran en reposo. En la Figura 2.12 se muestra
una imagen al microscopio electronico de barrido correspondiente a un macrfago.
Los macrfagos poseen en su membrana una serie de receptores de gran importancia
funcional, como son los receptores para la fraccin Fc de la IgG, receptores para las fracciones
C3bi y C3b del complemento que se conocen como CD-11b y CD-35 y los receptores para
interleucinas e interferones, todos ellos, de gran inters en la iniciacin de la respuesta
inmune.
Granulocitos
El otro grupo de clulas, los granulocitos neutrfilos, se caracterizan por poseer una
vida muy corta (vida media de menos de 48 horas) por lo que se encuentran en continua
renovacin, para mantener los niveles sanguneos. Son clulas de gran tamao cuya
caracterstica ms llamativa es la segmentacin del ncleo en varios lbulos. Se les denomina
tambin polimorfonucleares neutrfilos. En la sangre estas clulas se encuentran en perodo de
trnsito hacia los tejidos, donde esencialmente ejercen sus funciones, al igual que ocurre con
los otros tipos de polimorfonucleares : eosinfilos y basfilos (Figura 2. ).
Otras clulas
Adems de las clulas tratadas hasta el momento, hay otras clulas que pueden
intervenir como clulas inmunocompetentes. Estas son los eosinfilos, basfilos, clulas
cebadas, clulas dendrticas y clulas de Langerham.
Las clulas dendrticas, son de gran importancia en la presentacin antignica a los
linfocitos y se encuentran en los ganglios linfticos y en el bazo. Fenotpicamente stas clulas
se caracterizan por poseer en su membrana una gran densidad de molculas de
histocompatibilidad de clase II. En la Figura 2.se muestra una imagen de microscopia
electrnica de barrido correspondiente a una clula dendrtica.
Las clulas de Langerham de la epidermis, cuya caracterstica morfolgica ms
llamativa es la presencia de grnulos en raqueta de tenis denominados grnulos de Birbeck,
tambin son ricas en antgenos MHC-clase II. Su misin es captar y transportar los antgenos
extraos hasta los ganglios linfticos de la proximidad, a travs de los vasos linfticos. Durante
su paso por los vasos linfticos estas clulas se adaptan y cambian de morfologa
denominndoselas clulas a vela. Una vez en el ganglio linftico las clulas a vela se
introducen en la paracorteza que es el rea de las clulas T, se interdigitan y presentan el
antgeno a los linfocitos T. Ahora estas clulas presentadoras reciben la denominacin
de clulas interdigitadas reticulares por su particular disposicin en los ganglios. En la
ANTIGENOS DE DIFERENCIACION
En la membrana plasmtica de los linfocitos se han podido identificar mltiples
molculas, gracias al empleo de la tecnologa de los anticuerpos monoclonales (AcMo). A
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cada lobulillo se puede distinguir una zona externa o corteza, que contiene la gran mayora de
los timocitos, y una zona interna o medular que es pobre en timocitos (Figura 2.).
El estroma del timo est constituido fundamentalmente por la malla de clulas
epiteliales que adoptan diferentes formas. En la mdula se hallan tambin clulas dendrticas
interdigitadas, derivadas de la mdula sea, que son clulas presentadoras de antgeno. En la
unin corticomedular se hallan tambin macrfagos. En la mdula existen, adems, unas
estructuras denominadas corpsculos de Hassal formados por clulas epiteliales y macrfagos
dispuestos de forma concntrica. Las clulas epiteliales del timo, tanto de la corteza como de
la mdula, expresan una gran riqueza en molculas del MHC clase II, imprescindibles para el
reconocimiento de autoantgenos por los linfocitos T.
Bursa de Fabricio y su equivalente en mamferos
En las aves, los linfocitos B se diferencian en la bolsa de Fabricio, rgano constituido
por un segmento intestinal con pliegues dirigidos hacia una luz central. Estos pliegues se
componen de tejido linfoide formando corteza y mdula. En los mamferos, islotes de tejido
linfoide en el hgado fetal y en la mdula sea fetal y adulta se ocupan de la produccin de
linfocitos B.
Organos linfoides secundarios
Bazo
Se trata de un rgano situado en el hipocondrio izquierdo, detrs del estmago y cerca del
diafragma. Su superficie externa se compone de una cpsula fibrosa con algunas fibras
musculares lisas y penetra profundamente en el parnquima del rgano. Bsicamente, en el
bazo se distingue la pulpa roja que es un reservorio vascular para hemates y la pulpa blanca
que contiene el tejido linfoide, el cual se dispone alrededor de una arteriola central,
presentando reas T y B. Las clulas T se disponen ms prximas y alrededor de la arteriola
central, mientras las clulas B se disponen exteriores a la misma. Tambin son frecuentes las
clulas reticulares dendrticas y macrfagos en el centro germinal, as como macrfagos
especializados en la zona marginal (rea que rodea a los folculos linfoides) que junto a las
clulas foliculares dendrticas de los folculos primarios (folculos no estimulados sin centro
claro germinal) se ocupan de la presentacin del antgeno al linfocito B (Figura 2.)
Ganglios linfticos
Conforman junto a los vasos linfticos una compleja red corporal cuya funcin es filtrar los
antgenos procedentes del espacio extracelular y la linfa durante su circulacin desde la
periferia hasta el ducto torcico.
Los ganglios linfticos, en el humano, son redondeados u ovoides y presentan un hilio
donde los vasos sanguneos entran y salen respectivamente. Bsicamente, se distingue un
rea B denominada crtex, un rea T denominada paracrtex y un rea medular central (Figura
2.).
El paracrtex, contiene linfocitos T y abundantes clulas presentadoras de antgeno
(clulas interdigitantes o histiocitos de la zona T) quienes presentan abundantes antgenos
MHC clase II en superficie. La zona medular presenta algunos cordones linfoides separados
por espacios vasculares (senos medulares) que contienen la mayor parte de las clulas
plasmticas y los macrfagos sinusales de los ganglios linfticos.
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Una vez que los linfocitos B y T abandonan los rganos primarios, pasan al torrente
circulatorio, a travs del cual circulan por el organismo. A los tejidos llegan a travs del torrente
sanguneo, siendo recogidas por los vasos perifricos del sistema linftico que las conduce a
los distintos ganglios linfoideos, de donde pueden de nuevo volver a la sangre y a los diferentes
tejidos o almacenarse en el bazo (Figura 2.22). En la Tabla 2.8 se recoge la proporcin de
leucocitos en sangre.
De esta forma el contacto de los linfocitos con los antgenos se puede establecer en el
organismo a nivel de los diferentes tejidos, sistema linftico, bazo y sangre, aunque es
fundamentalmente a nivel de los ganglios y el bazo donde se puede desarrollar una respuesta
inmune, ejerciendo una accin, bien local en ganglios y bazo, o bien general, dado que los
elementos efectores (las inmunoglobulinas y linfocitos activados) pueden ser distribuidos por
toda la economa a travs del sistema circulatorio y linftico. En la Figura 2. se representa un
esquema de las circulaciones sangunea y linftica con la distribucin porcentual de los
linfocitos en sangre, bazo y rganos linfticos.
TEMA 3. INMUNOGLOBULINAS
INTRODUCCION
A finales del siglo XIX, Von Behring observ que los sueros de animales que haban
padecido difteria contenan sustancias que neutralizaban el efecto de la toxina diftrica. A estas
sustancias, que se caracterizaban por ser termolbiles y no dializables, se les denomin
anticuerpos, debido a su capacidad de reconcer a las toxinas bacterianas.
En 1937 Tiselius descubre la electroforesis y aplica este nuevo mtodo al
fraccionamiento de protenas plasmticas, identificando as los anticuerpos como las protenas
del suero que se desplazan ms lentamente. Esta fraccin recibi el nombre de g-globulina,
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Cadenas pesadas.
Estas cadenas poseen unos cuatrocientos aminocidos establecindose entre algunos
de ellos puentes disulfuro (intracatenarios) que asocian unos 60 aminocidos y que condicionan
la estructura secundaria del polipptido. Por ejemplo, las cadenas pesadas de la IgG1 poseen 440
aminocidos y los puentes disulfuro unen el aminocido 22 con el 96, el 144 con el 200, el 261
con el 321 y el 367 con el 425.
Estas dos cadenas pesadas estn unidas la una a la otra por puentes disulfuro
intercatenarios, ya indicados anteriormente, y que pueden ser de uno a cinco dependiendo del
tipo de inmunoglobulina.
En estas cadenas pesadas, y a nivel de los puentes disulfuro intercatenarios, hay una
zona de unos 15 aminocidos, de gran flexibilidad debido a su estructura y constituye lo que se
denomina zona bisagra por donde se deforma la molcula de inmunoglobulina cuando se
produce la unin con el antgeno, facilitndose as su acoplamiento con ste. Los loci de los
genes que codifican para la cadena pesada se localizan en el brazo largo del cromosoma 14.
Parte variable y constante de las cadenas ligeras y pesadas.
Estructuralmente, las cadenas ligeras poseen dos partes: una corresponde al extremo
carboxlico que diferencia las cadenas ligeras en dos tipos k y l, y constituye la parte constante
de las cadenas ligeras (CL). La otra corresponde al extremo amnico, que es muy variable y
constituye la parte variable de las cadenas ligeras (VL) y corresponde a la zona de interaccin
con el antgeno. Las partes constante y variable son prcticamente de igual tamao en las
cadenas ligeras.
Tambin las cadenas pesadas poseen una parte variable y otra constante.
Aproximadamente el tercio del extremo amnico de estas cadenas se caracteriza por ser
estructuralmente muy variable, por lo que se conoce como parte variable de las cadenas pesadas
(VH). La estructura de este fragmento, al igual que en las cadenas ligeras, depende del tipo de
antgeno que reconoce, dado que este extremo tambin participa en la unin de la
inmunoglobulina con el antgeno. Por el contrario, aproximadamente los dos tercios del extremo
carboxlico de todas las cadenas pesadas de un mismo tipo de inmunoglobulinas poseen una
estructura idntica. De ah que esta parte de las cadenas pesadas se conozca como parte
constante de las cadenas pesadas (CH).
Esta parte constante es diferente segn la clase de inmunoglobulina que consideremos,
determinando la existencia de cinco tipos de cadenas pesadas: g, a, m, d y e que definen a su
vez las cinco clases de inmunoglobulinas: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE respectivamente. (Figura 3. ).
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pesadas y para las regiones kappa y lambda de las cadenas ligeras. Existen cinco isotipos de
cadena pesada (M, G, A, D y E) y dos de cadena ligera (k y l). As diremos que el isotipo de una
determinada inmunoglobulina es G1 o que esa inmunoglobulina es de la clase G y subclase 1,
que a su vez puede tener unas cadenas ligeras del isotipo kappa o lambda.
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Km en las cadenas ligeras k que dan lugar a tres alotipos: Km (12), Km (1) y Km (3),
cuyas diferencias estructurales se recogen en la tabla 3.5.
IDIOTIPOS
Los antisueros homlogos que referamos anteriormente que se producen al inmunizar
animales con inmunoglobulinas de otro animal de la misma especie, tambin pueden ir dirigidos
contra las regiones hipervariables de las cadenas H y/o L de las inmunoglobulinas. Todas las
inmunoglobulinas que poseen los mismos determinantes antignicos en sus regiones
hipervariables se dice que pertenecen al mismo idiotipo, o que poseen los mismos determinantes
idiotipicos. Los determinantes idiotpicos son exclusivos para las molculas producidas por un
clon determinado de clulas productoras de anticuerpos. Todos los animales tienen una
representacin de todas las regiones hipervariables posibles, generadas por recombinacin
gentica (como veremos en el capitulo 5). Estas en condiciones normales, no dan lugar a una
masiva produccin de anticuerpos al encontrarse cada una en cantidades muy pequeas, cuando
experimentalmente inyectamos una cantidad suficiente de inmunoglobulinas de una especificidad
determinada, se desarrollara una respuesta de anticuerpos contra el idiotipo de esa
inmunoglobulina en particular (Figura 3.). Los idiotipos parecen tener importancia fisiolgica en la
regulacin del sistema inmune. Segn la teora de la red de Jerne, frente a los idiotipos se
formaran anticuerpos que al unirse a los mismos formaran un entramado (red) de anticuerpos
unidos a otros anticuerpos que tendran como accin final la regulacin del proceso de sntesis de
nuevas inmunoglobulinas. Como decamos anteriormente, cada uno de los idiotipos se encuentra
representado en tan pequea cantidad que pasa desapercibido para el sistema inmune, sin
embargo, cuando un determinado clon de clulas B reconoce su antgeno especifico, prolifera, se
diferencia a clula plasmtica y produce una gran cantidad de inmunoglobulinas de una misma
especificidad, sus determinantes idiotipicos pasaran a encontrarse en mucha mayor cantidad y
ahora s darn lugar a una respuesta de anticuerpos contra ellos, anticuerpos anti-idiotipo, que
podrn unirse a las inmunoglobulinas que ocasionaron su generacin. La unin de los
anticuerpos anti-idiotipo al idiotipo que los origino podr dar lugar al bloqueo de las
inmunoglobulinas solubles que compartan ese idiotipo o unirse a las inmunoglobulinas de
membrana presentes en linfocitos B de la misma especificidad, o incluso a las regiones
hipervariables del receptor para el antgeno de la clula T que reconocen ese mismo antgeno,
con efectos en cada uno de los casos inhibidores o estimuladores. Los idiotipos se encontraron
mediante estudios serolgicos, al observarse que cuando en un conejo se inyectaban anticuerpos
antisalmonella de otro conejo del mismo alotipo, producan anticuerpos que reaccionaban con el
anticuerpo inyectado, incluso aunque los dos conejos fueran genticamente idnticos. Estos
anticuerpos anti-idiotipo, en la mayora de los casos, estn dirigidos contra la estructura exclusiva
de la porcin fijadora de antgeno y por tanto solo reconocen a inmunoglobulinas de la misma
especificidad, sin embargo en algunos casos, los anticuerpos anti-idiotipo pueden estar dirigidos
contra zonas de la regin hipervariable distintas de la porcin fijadora del antgeno y en este caso
podrn unirse a inmunoglobulinas de varias especificidades distintas regulando la respuesta
inmune frente a varios antgenos.
DISTRIBUCIN DE LAS INMUNOGLOBULINAS.
Las inmunoglobulinas se encuentran distribuidas en todos los fluidos orgnicos de la
economa de los vertebrados y en las membranas de los linfocitos B y clulas plasmticas. Las
cantidades relativas de cada una de las clases de inmunoglobulinas en los diferentes
compartimentos del organismo son muy diferentes.
En el torrente sanguneo predomina la IgG mientras que en las secreciones (saliva,
lgrimas, secrecin bronquial, as como en el lquido cefalorraqudeo y mucosas) la IgA es la
predominante. Los niveles de inmunoglobulinas sricas fluctan ampliamente en funcin de
diversos aspectos, tales como el estado nutricional, la edad, etc. Los valores normales en suero
de un hombre adulto (entre 20 y 40 aos) se recogen en la tabla 3.6.
Ontognicamente se producen mltiples cambios en los niveles de inmunoglobulinas
desde el nacimiento hasta los 8 10 aos, en que estos se estabilizan. En la figura 3.17 se
expresan las concentraciones de inmunoglobulinas desde antes del nacimiento hasta los 5 aos
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de edad. Los niveles de Ig G son muy altos en la vida fetal y en las primeras semanas de vida
extrauterina, debido a que esta inmunoglobulina es la nica que pasa de la madre al feto a travs
de la placenta. Durante la lactancia, descienden los niveles de IgG por catabolismo de esas
molculas que no son repuestas por carecer el nio an de la capacidad de sntesis de las
mismas. Tambin en la edad fetal se sintetizan pequeas cantidades de IgM (Figura 3.).
Cuando las inmunoglobulinas se encuentran insertas en la membrana de los linfocitos
(inmunoglobulinas de membrana), actan como receptores de las seales de activacin
antignicas por su capacidad de reconocimiento del antgeno constituyendo el receptor para el
antgeno del linfocito B.
SUPERFAMILIA DE LAS INMUNOGLOBULINAS
La estructura de las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas posee ciertas
similitudes entre s (por ejemplo, la estructura en dominios equivalentes). Esto hizo pensar que
ambas cadenas procedan de una molcula ancestral comn. Idntica similitud se ha observado
con lab-2-microglobulina y con una gran cantidad de molculas, todas ellas agrupadas, por tanto,
bajo el mismo epgrafe de superfamilia de las inmunoglobulinas. Estas molculas son: el receptor
T para el antigeno, las molculas de histocompatibilidad clase I y II, LFA-3, ICAM-1 y otras
muchas que irn siendo estudiadas en diferentes captulos de este libro, especialmente en el
captulo 8, donde se estudian las molculas de adhesin (Figura 3.).
FUNCIN DE LAS INMUNOGLOBULINAS.
La funcin esencial de las inmunoglobulinas es la de unirse al antgeno. De esta manera
las inmunoglobulinas actan como receptoras de seales antignicas o bien pueden colaborar en
la destruccin antignica. La primera funcin se presenta cuando las inmunoglobulinas se
encuentran insertas en la membrana de los linfocitos B (inmunoglobulinas de membrana), y para
la segunda requieren la colaboracin del complemento, macrfagos, neutrfilos y clulas NK, que
tienen la propiedad de unir las inmunoglobulinas por su extremo Fc.
Unin antgeno anticuerpo.
Los eptopos de un antgeno pueden estar formados por aminocidos consecutivos en la
secuencia de la protena, como las protenas se encuentran normalmente dobladas sobre si
mismas segn lo que llamamos estructura terciaria, en la mayora de los casos los anticuerpos
generados contra este tipo de eptopos solo reconocern a la protena desnaturalizada o
linearizada y por ello se les llama epitopos lineales. En la mayora de los casos los eptopos
suelen estar formados por aminocidos del antigeno que solo se encuentran suficientemente
cerca unos de otros en la protena nativa, es decir en la protena que tiene estructura terciaria
conservada, es decir una conformacin adecuada, por lo que a estos eptopos se les llama
epitopos conformacionales (Figura 3. ). Cuando inmunizamos un animal con una protena,
generaremos una serie de anticuerpos dirigidos contra los distintos eptopos de la misma, todos
esos anticuerpos se encontraran circulando en el suero del animal al que, una vez extraido,
llamaremos antisuero. El tipo de anticuerpos que compondrn ese antisuero depender en gran
medida de la forma en que hayamos preparado la protena para la inmunizacin, si la hemos
preparado desnaturalizada, solo existirn eptopos lineales, mientras que si hemos inyectado la
protena en su estado nativo, coexistirn en el antisuero anticuerpos que reconozcan eptopos
conformacionales con otros que reconozcan eptopos lineales. En el caso de anticuerpos
monoclonales, todas los anticuerpos procedern de un clon de clulas plasmticas y por tanto
estarn dirigidos contra un solo eptopo que ser de un tipo u otro. La importancia radica, en que
dependiendo del tipo de epitopos que reconozcan los anticuerpos, las aplicaciones diagnosticas o
de investigacin sern distintas. En general, los anticuerpos que reconocen epitopos lineales
sern tiles para tcnicas de Western Blot (donde se analiza la protena generalmente
desnaturalizada) mientras los que reconocen eptopos conformacionales lo sern para tcnicas
de inmunofluoresencia, inmunoprecipitacin, etc.
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Paratopo.
Las inmunoglobulinas se unen a los epitopos de los antgenos por sus sitios activos,
constituidos como se ha indicado anteriormente, por los segmentos variables de las cadenas
pesadas y ligeras (Figura 3. ) y donde intervienen principalmente las regiones hipervariables.
Esta zona de unin al eptopo se conoce con el nombre de paratopo.
Fuerzas de unin Ag-Ac
La unin del antgeno (Ag) con el anticuerpo (Ac) o inmunoglobulina es semejante a la
que se establece entre la enzima y su substrato o entre protenas que pertenecen a cualquier va
de sealizacin intracelular. Estas interacciones se deben a la formacin de mltiples enlaces no
covalentes (enlaces de hidrogeno, interacciones electrostticas, de Van der Waals e hidrfobas),
cada uno de los cuales por si solos son dbiles. Sin embargo, como se establecen mltiples
interacciones, la fuerza total de la unin puede ser muy elevada. Para que las interacciones
mencionadas lleguen a ser efectivas, los grupos entre los que se establece deben estar situados
a distancias muy cortas, y para que esto sea posible y se puedan producir un gran numero de
interacciones, el eptopo y el paratopo deben encajar perfectamente, dependiendo de ello la
fuerza de la interaccin que conocemos con el nombre de afinidad. La afinidad esta interaccin
es de vital importancia, por cuanto de ello depender tanto la utilidad diagnsitca y de
investigacin de un anticuerpo como su importancia fisiopatolgica. Para cuantificar la afinidad de
una interaccin, deberemos entender primero una serie de conceptos de los que nos ocuparemos
a continuacin. Al tratarse de uniones no covalentes, la unin Ag/Ac ser reversible de modo que
cuando el antgeno y el anticuerpo se mezclan en solucin, se estarn formando y disociaciando
complejos constantemente de acuerdo con la siguiente ecuacin:
KA
Ag + Ac = == Ag-Ac
KD
donde ka representa la constante de velocidad y kd la de disociacin.
Llegara un momento en que la velocidades de asociacin y disociacin se igualen, es
decir, que el numero de complejos Ag/Ac que se formen sea el mismo que el que se disocie,
entonces decimos que se ha llegado a una situacin de equilibrio dinmico. Una forma indirecta
de medir la afinidad de la interaccin de una pareja Ag/Ac, ser medir la velocidad de asociacin
y disociacin antes de que se llegue al equilibrio, lo cual puede realizarse actualmente mediante
biosensores. Cuanto mayor sea la velocidad de asociacin y menor la de disociacin mayor ser
la afinidad de la interaccin de esa pareja Ag/Ac. Otra forma complementaria y ms directa de
cuantificar la afinidad de la interaccin Ag/Ac, es hacerlo una vez que se ha alcanzado el
equilibrio y utilizando concentraciones bajas de anticuerpo. En estas condiciones la concentracin
de antgeno que permite que la mitad de los anticuerpos estn unidos a ellos y la otra mitad libre,
medida en molaridad, se denomina constante de disociacin (KD) y es una medida directa de la
afinidad de la interaccin. Cuanto menor sea la KD mayor ser la afinidad puesto que indica que
es necesaria una menor concentracin de antgeno para que la mitad de los anticuerpos estn
ocupados. La inversa de la KD es la constante de asociacin (KA) cuyo valor es directamente
proporcional a la afinidad de la interaccin. Para determinar experimentalmente estas constantes
tendremos que conocer las concentraciones de antgeno libre y unido, para lo cual existen varios
mtodos entre los que destacan anlisis mediante dialisis de equilibrio (Figura 3.). Esta tcnica
se basa en la utilizacin de una membrana semipermeable de un poro tal, que permita el paso de
un antgeno suficientemente pequeo (un hapteno) pero no del anticuerpo. A concentraciones
bajas de antgeno, la concentracin de anticuerpo libre ira bajando rpidamente hasta que se
alcance el equilibrio, puesto que todo el antgeno que entre a travs de la membrana
semipermeable quedara retenido por el anticuerpo. Realizando el experimento anterior con varias
concentraciones de antgeno, podremos encontrar aquella en la que la mitad del anticuerpo se
encuentra unido al antgeno que como hemos dicho corresponde a la KD. La afinidad que
hayamos calculado corresponder exclusivamente a la de la interaccin de esa pareja Ag/Ac. Un
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determinado anticuerpo podr unirse a mas de un antgeno con afinidades distintas en cada
caso.
Avidez de la unin Ab-Ac
Como apuntbamos anteriormente, el fenmeno de la unin Ag/Ac es en realidad mucho
ms complejo, pues cada uno de los antgenos poseen varios eptopos distintos, por lo que
podrn unir mas de un anticuerpo. Cada molcula de anticuerpo, por su parte, podr unir al
menos dos molculas de antigeno, una por cada Fab y en el caso de la IgM hasta diez molculas
(como se comento anteriormente las inmunoglobulinas IgM se ensamblan en unidades
funcionales constituidas por cinco molculas de anticuerpo). Finalmente en un antgeno, un
determinado eptopo puede estar representado varias veces siendo capaz de unir varias
molculas del mismo anticuerpo. La fuerza total de la interaccin que considera todas las
interacciones eptopo/paratopo que tienen lugar entre antgenos y anticuerpos multivalentes (con
varios sitios de unin), se denomina avidez y es mucho mayor que la suma de las afinidades
puesto que las distintas interacciones se estabilizan entre ellas. Estas interacciones multivalentes
poseen una gran importancia fisiopatolgica por cuanto cuando se encuentren Ag y Ac en
solucin, como es el caso del plasma o los tejidos, se formaran agregados constituidos por
muchas molculas que denominamos Inmunocomplejos. A concentraciones equivalentes de Ag y
Ac estos inmunocomplejos sern de gran tamao y podrn quedar atrapados en los tejidos,
iniciando una respuesta inflamatoria y dando lugar a las llamadas enfermedades por deposito de
inmunocomplejos.
Especificidad de la unin Ag-Ac
La unin entre el Ag y la Ig tiene una gran especficidad, de tal manera que una Ig se
unir fundamentalmente y con mayor avidez, a un antgeno determinado. En algunos casos la
inmunoglobulina podr unirse a antgenos con eptopos muy similares, aunque en este caso la
afinidad de la unin es mucho menor (Tabla 3.7). Tambin es posible que un mismo eptopo se
encuentre con dos antgenos diferentes en cuyo caso el anticuerpo reaccionara con los dos
antgenos, dicindose entonces que existe una reactividad cruzada.
La consecuencia final de la accin de las inmunoglobulinas es la de destruir al antgeno
y/o neutralizar los efectos nocivos de los mismos. Para la consecucin de estos objetivos todas
las inmunoglobulinas poseen, como ya se ha indicado, una caracterstica esencial y comn, que
es la de unirse especficamente al antgeno, caracteristica que depende como hemos dicho, de
sus regiones hipervariables contenidas en el fragmento Fab. Sin embargo, tanto la neutralizacin
como la destruccin del antgeno, lo consiguen de muy diversas formas, dependiendo del tipo y
manera de encontrarse el antgeno y tambin del tipo de inmunoglobulina que interviene en cada
caso utilizando para ello, las regiones constantes y concretamente sus extremos Fc.
Tras la unin del antgeno y la inmunoglobulina, sta puede anular la accin del antgeno
por neutralizacin, precipitacin o aglutinacin del mismo. As si la Ig es especfica para una
toxina bacteriana, cuando se produce la unin Ag-Ac (toxina-antitoxina), quedan neutralizados los
efectos txicos de la toxina. De ah que clsicamente, cuando no se conoca la estructura de las
inmunoglobulinas, se las denominase antitoxinas, precipitinas o aglutininas, en funcin de la
reaccin que se detectaba en cada caso.
Propiedades biolgicas de las inmunoglobulinas.
Los fenmenos de neutralizacin, precipitacin y aglutinacin de los antgenos no son
suficientes por s solos para la destruccin y total eliminacin de stos. Para ello, adems de las
inmunoglobulinas se requiere de la colaboracin de otros muchos elementos, tales como el
sistema del complemento, macrfagos, polimorfonucleares o clulas NK.
Podemos decir que las inmunoglobulinas, al detectar los antgenos y producirse la
subsiguiente unin a ellos, actan como trans-ductores de la informacin de la presencia de los
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mismos que seran destruidos por el complemento, macrfagos, los polimorfonucleares o clulas
NK a los que dan especificidad.
Opsonizacin.
Cuando se produce la unin de antgeno e inmunoglobulina G se producen una serie de
cambios alostricos en el extremo Fc de la IgG que hacen que se una a receptores que se
encuentran en la membrana de macrfagos y polimorfonucleares. A este fenmeno se le
denomina opsonizacin (Figura 3.). Al producirse esta unin, los macrfagos se activan,
inicindose el fenmeno de fagocitosis y subsiguiente destruccin de los complejos antgeno
anticuerpo por los procesos lticos intracelulares, propios de la accin de los enzimas contenidos
en los lisosomas de estas clulas. Estos receptores pueden ser de distinta naturaleza,
conociendose en la actualidad tres de estos receptores: FcgRI, FcgRII y FcgRIII, conocidos en la
actualidad como CD64, CD32 y CD16 respectivamente. Adems de en los macrfagos estos
receptores se encuentran en otras clulas como plaquetas, linfocitos B y NK (Tabla 3.8). Cuando
se produce la unin a clulas NK estas se activan y lisan a las clulas portadoras del antgeno
por un mecanismo conocido como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
Cuando la inmunoglobulina que se une a un antgeno es de las clases IgM o IgG, en sus
extremos Fc se producen ciertos cambios alostricos gracias a los cuales stas adquieren la
propiedad de fijar y activar uno de los componentes del complemento. Las fracciones activas del
complemento poseen diferentes acciones muy importantes en la defensa del organismo, una de
las cuales es la lisis celular. Este fenmeno se conoce con el nombre de citotoxicidad mediada
por el complemento.
Adems de estas funciones, las inmunoglobulinas tienen la capacidad de ser esenciales
en el fenmeno de reconocimiento del antgenos por parte de linfocitos B cuando se encuentran
ligadas a la membrana celular de estas clulas como inmunoglobulinas de membrana
constituyendo el receptor para el antgeno del linfocito B. Esta propiedad ser estudiada
extensamente en captulos posteriores.
En la actualidad y utilizando tcnicas de Ingeniera Gentica, podemos construir
anticuerpos monoclonales que contengan una especificidad determinada y que sean del isotipo
que deseemos para que predominen unas u otras funciones biolgicas. Incluso podemos, con
fines teraputicos generar anticuerpos monoclonales de una determinada especificidad en
ratones y posteriormente aislar el ADN que codifica para las regiones hipervariables que
confieren la especificidad y fusionarlo con el ADN que codifica para las regiones constantes
humanas, estos anticuerpos monoclonales humanizados tendrn indudables ventajas desde el
punto de vista teraputico al no ser considerados como extraos por el sistema inmune humano
(ver captulo 4).
Propiedades y funcin de cada una de las inmunoglobulinas
Aunque en los apartados anteriores se ha hecho mencin a las propiedades y funcin de las
inmunoglobulinas, a continuacin estudiaremos brevemente y por separado las caractersticas
funcionales ms importantes de cada una de ellas (Figura 3.).
Inmunoglobulina G.
Son las inmunoglobulinas ms abundantes y representan ms del 70 % de las Igs sricas
totales; las diferentes subclases se presentan en proporciones muy diferentes. La IgG 1 es la
subclase ms frecuente (ms del 60 %), seguida de la IgG 2 (aproximadamente un 18 %),
mientras que IgG3 e IgG4 se encuentran en mucha menor proporcin.
Esta Ig posee capacidad neutralizante, precipitante, de fijar complemento, de unirse a clulas
NK y a macrfagos (opsonizacin) y son capaces de atravesar activamente las membranas
biolgicas. La propiedad de atravesar activamente las membranas biolgicas es de sumo inters
por lo que, adems de ejercer esta inmunoglobulina, su efecto en toda la economa del
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Inmunoglobulina M.
Los anticuerpos del tipo IgM son los que mas rpidamente se forman en respuesta a un
estmulo antignico (Respuesta primaria). Esta Ig se caracteriza tambin por poseer capacidad
neutralizante, precipitante, aglutinante, fijar complemento, activar la respuesta inmune, sin
embargo no atraviesa activamente las membranas biolgicas. Esta ltima propiedad hace que
esta inmunoglobulina ejerza su accin normalmente en los espacios intravasculares.
Representa del 5 al 10 % de las Igs sricas totales y junto a la IgD es la ms frecuentemente
encontrada en la superficie de los linfocitos B como inmunoglobulina de membrana.
Inmunoglobulina A.
Esta inmunoglobulina posee capacidad neutralizante y precipitante, mientras que su
capacidad de fijar complemento y de opsonizacin son muy dbiles, limitndose su efecto a
neutrfilos y no a macrfagos.
La propiedad ms importante de esta inmunoglobulina viene determinada por su capacidad
de unirse por el extremo Fc a la pieza secretora, gracias a la cual puede ser secretada por las
mucosas y glndulas exocrinas, ejerciendo su accin ms importante en la superficie de mucosas
y lquidos biolgicos (sobre todo IgA2), tales como el liquido cefaloraquideo, secrecin bronquial,
lgrima, saliva, etc. Esto es importante porque as protegen precisamente los puntos ms
vulnerables del organismo, esto es, las puertas de entrada al mismo, como son ojos, boca,
aparato digestivo, sistema respiratorio, vagina, etc. No olvidemos que, por ejemplo, si
desplegamos la mucosa del aparato respiratorio, la superficie que cubriramos es de unos 300
2
m , superficie que se encuentra en contacto directo con el exterior a travs del aire que se
respira. Se deduce de ello que, sin duda, deben ser importantes los mecanismos de defensa local
entre los cuales la IgA tiene un papel esencial.
Esta inmunoglobulina se encuentra tambin en la leche materna. Los niveles de todas las
inmunoglobulinas, a excepcin de la IgG en recin nacidos son muy bajos, siendo por tanto de
gran significacin el hecho de que la IgA se transfiera desde la madre al lactante a travs de la
secrecin lctea. De ah que tengamos que insistir en que los lactantes se amamanten en el
mayor grado posible directamente por las madres y no con leche de otros orgenes, a lo que
actualmente existe excesiva tendencia.
La IgA recibida de la madre ejerce un importante papel de defensa a nivel de todo el aparato
digestivo. En ello parece que influyen las especiales caractersticas de pH gstrico del lactante
que es menos cido que en el adulto y una especial resistencia de esta inmunoglobulina frente al
mismo, por lo que no se destruye a su paso por el estmago.
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Inmunoglobulina D. .
La concentracin de esta inmunoglobulina en suero es muy baja. Hasta fechas muy recientes
no se haba demostrado que esta inmunoglobulina posea capacidad de unirse a antgenos, por
lo que se dudaba de que actuase con funcin de anticuerpo. Sin embargo, aunque actualmente
se ha demostrado su accin de anticuerpo, no se conoce con precisin cules son sus funciones
especficas, aunque se piensa que colabora de forma importante en la activacin de linfocitos B al
actuar como receptor en la superficie de los mismos.
Inmunoglobulina E.
En muchos individuos alrgicos esta inmunoglobulina se presenta en grandes cantidades. El
estmulo para su sntesis puede proceder de una gran variedad de antgenos, a los que en este
caso se conocen como alergenos. Estos alergenos pueden penetrar en el organismo a travs de
la piel o de las mucosas respiratoria, ocular, del aparato digestivo, etc., as como por inyectables,
como es el caso de la penicilina u otros medicamentos.
La vida media de la IgE en sangre perifrica es de 24-48 horas. No tiene capacidad de
atravesar la placenta, por lo tanto, las reacciones de hipersensibilidad inmediata no pueden
transferirse de manera pasiva de la madre al feto. Sin embargo, puede existir una predisposicin
de tipo familiar a padecer enfermedades de naturaleza alrgica. Esta predisposicin parece estar
relacionada con una tendencia a producir anticuerpos de tipo IgE en la respuesta secundaria
frente a antgenos, en lugar de IgG que seria la respuesta normal en individuos no alrgicos.
La IgE se encuentra en forma libre en sangre (Tabla 3.10) en donde se observa que los
niveles cambian a lo largo de la edad. Tambin la IgE se encuentra en otros lquidos biolgicos
as como unida a basfilos y clulas cebadas, gracias a la propiedad que tiene esta
inmunoglobulina de unirse por su extremo Fc a receptores de superficie presentes en dichas
clulas. Estas clulas se caracterizan por encontrarse en la piel y mucosas y por contener
abundantes grnulos citoplasmticos, ricos en sustancias vasoactivas que liberan una vez se
activan.
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Esto fue puesto de manifiesto empleando tcnicas de digestin enzimtica del DNA de
clulas B y posterior hibridacin con sondas de DNA complementario (cDNA), mediante la
tcnica deSouthern Blot (ver capitulo Mtodos). Mediante esta tcnica, se pudo observar que
usando un cDNA marcado radioactivamente como sonda correspondiente a parte de
una cadena pesada, ste se una a segmentos de DNA de lneas celulares de ratn que
contenan el cromosoma 12. Por otra parte, empleando igualmente sondas de cDNA marcadas
radioactivamente frente al DNA de cadenas ligeras de tipo k, stas se unen a clulas que
contienen el cromosoma 6, mientras que las sondas para DNA de cadenas ligeras l lo hacen
al cromosoma 16. En la tabla 4.1 se especifica, tanto en humano como en ratn, el cromosoma
donde se encuentran estos segmentos de genes.
Segmentos de genes y sntesis de inmunoglobulinas.
Otra caracterstica importante de la formacin de inmunoglobulinas es que, en la
sntesis de cada una de las cadenas de inmunoglobulinas participan varios segmentos de
genes de cuyas combinaciones resultan los diversos genes funcionales, responsables directos
de la codificacin de cada una de las cadenas de inmunoglobulinas. Esto explica las mltiples
posibilidades de formacin del gran nmero de inmunoglobulinas partiendo de un limitado
material gentico. La codificacin multignica de las inmunoglobulinas fue demostrada tambin
por Tonegawa analizando DNA de clulas embrionarias de ratn y de un mieloma tambin de
ratn.
Tipos de segmentos gnicos
Estos segmentos codifican por separado la parte variable, la parte constante y las
partes por las que ambas regiones se unen, esto es, las regiones bisagra. Los segmentos que
codifican la parte variable son de dos tipos, segmentos V y segmentos D, responsables de la
variabilidad y diversidad de las inmunoglobulinas respectivamente. Le siguen los segmentos
J o de unin, responsables de unir los fragmentos anteriores con los segmentos C que
codifican para la parte constante. El nmero de segmentos responsables de la codificacin de
la parte constante es muy limitado en relacin con el nmero de segmentos que codifican la
parte variable de las inmunoglobulinas (Figura 4.2).
En las clulas embrionarias los segmentos de una misma clase se encuentran
separados del resto de tal forma que, por una parte, se encuentran los segmentos V, por otra
los D, los J y los C. Estos segmentos estn contenidos en los exones, que son aquellos
fragmentos de DNA que sern transcritos para dar lugar a la sntesis de protenas, y que se
encuentran separados entre s por fragmentos de DNA no codificadores de protenas
denominados intrones.
En consecuencia se puede concluir que: La sntesis de las cadenas ligeras y pesadas
de las inmunoglobulinas est regulada por cromosomas distintos. En esta sntesis participan
varios segmentos de genes que combinados dan lugar a los genes funcionales responsables
de la codificacin de las cadenas de las inmunoglobulinas.
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que se une a la regin amplificadora del gen k. En la Figura 4.5 se muestra un esquema del
proceso por el cual se eliminan los segmentos de genes que no se van transcribir.
Unin de segmentos de genes
Otro mecanismo importante en la regulacin del reordenamiento de los genes de las
inmunoglobulinas es el que controla las uniones entre los genes V, D y J. Es decir, cuales son
las seales que hacen que un gen D identifique, dentro del cromosoma, la secuencia de un gen
J con el que puede unirse, y, a su vez, el gen V identifique la secuencia del complejo DJ ya
formado. Los reconocimientos y uniones de unos genes con otros estn controlados por
combinaciones de secuencias de DNA que se encuentran conservadas y son nicas de los
genes de las inmunoglobulinas. Estas secuencias estn formadas por un heptmero
palindrmico, un espaciador variable de 23 pares de bases y un nonmero palindrmico
(Figura 4.6). Este motivo va a reconocer otro formado por un nonmero de secuencia igual
pero invertida al anterior, continuado por un espaciador variable de 12 pares de bases y un
heptmero cuya secuencia es, otra vez, igual pero invertida al heptmero anterior. La longitud
conservada de los espaciadores no es casual, en tanto que se ha sugerido que 12 pares
corresponde a una vuelta de la hlice de DNA, y 23 a dos. As, los segmentos que contienen
un espaciador de 12 bases slo se pueden unir a otro de 23. Esto asegura, en el caso de las
cadenas pesadas, que los genes se reordenen en el orden correcto.
El mecanismo exacto por el que estas secuencias conservadas regulan la unin de los
genes de las inmunoglobulinas no se conoce todava con exactitud. Los modelos actualmente
considerados para explicar este fenmeno implican la formacin de un bucle en el DNA, lo que
conlleva la aproximacin de las secuencias reguladoras entre s. Al ser los heptmeros y
nonmeros de secuencia igual pero invertida, ello hace que al formarse el bucle cada uno de
ellos se encuentre con su complementario, permitiendo de esta manera la unin del DNA. Se
especula que las recombinasas (que pudieran ser codificadas por RAG-1 y/o RAG-2) tengan a
estas estructuras como diana de su mecanismo de accin. Aunque, como ya hemos sealado,
no podemos excluir que la actividad recombinasa a este nivel sea modulada por otros genes
todava no descubiertos.
CAMBIO DE ISOTIPO DE LAS INMUNOGLOBULINAS.
Cuando las clulas B reconocen al antgeno, una poblacin de las mismas secretarn
IgM llevando a cabo la respuesta primaria, mientras que, en menor medida, otras clulas van a
comenzar a producir IgG, IgA e IgE. Esto quiere decir que las clulas B tienen la propiedad
decambiar la subclase o isotipo de las inmunoglobulinas que producen Por tanto, en respuesta
a un mismo antgeno se van a generar anticuerpos que van a mantener su parte variable, pero
van a ser diferentes en los segmentos constantes que van a ensamblar.
Se cree que el cambio de isotipo se produce por dos mecanismos. El primer
mecanismo implica que las clulas B cambian su isotipo tiene lugar esta vez a nivel de DNA,
as una clula que ha sido comprometida a producir anticuerpos de un determinado isotipo, va
a sufrir una deleccin de todos los genes C a excepcin del correspondiente a la subclase que
va a ser producida (Figura 4.7). El segundo mecanismo es conocido como splicing
alternativo (Figura 4.8). Este proceso molecular genera polimorfismo proteico debido a la
transcripcin alternativa de los exones
Estos fenmenos pueden ser influenciados por ciertas citocinas. As por ejemplo, la IL4 induce el cambio de isotipo de IgM a IgG1 o bien a IgE.
CAUSAS DE LA DIVERSIDAD DE LAS INMUNOGLOBULINAS.
La diversidad de las inmunoglobulinas deriva de la variabilidad de las cadenas ligeras y
pesadas, por una parte, y por otra de las diversas posibilidades de unirse entre s estas
cadenas.
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exclusin allica no est completamente definido. No obstante, se piensa que una vez
producido un reordenamiento efectivo de los genes de las inmunoglobulinas, la protena
madura va a enviar una seal negativa de manera que la clula no produzca nuevos
reordenamientos. As, la presencia de un reordenamiento completo de la cadena pesada va
suponer el envo de una seal que inhiba nuevos reordenamientos de otras cadenas pesadas,
por un lado, y por el otro va a hacer que se inicien los reordenamientos correspondientes a las
cadenas ligeras, comenzando por las cadenas k. Si no se produjeran reordenamientos
productivos de k, entonces se permitira el reordenamiento de l. El ensamblaje final de las
cadenas pesadas y ligeras impedira nuevos reordenamientos, como ya hemos discutido,
mientras que si no se consiguieran reordenamientos productivos en ninguno de los dos alelos
de k y l, entonces la clula B entrara en un fenmeno de muerte celular programada, cesando
su maduracin y siendo posteriormente eliminada. El proceso de exclusin allica tiene como
fin asegurar que cada una de las clulas B produce un nico tipo de anticuerpo, a fin de evitar
el reconocimiento de ms de un eptopo mediante la produccin de anticuerpos multireactivos.
FASES FINALES DE LA SINTESIS DE INMUNOGLOBULINAS.
El RNA mensajero correspondiente al pptido a sintetizar se forma mediante la
transcripcin de los segmentos V, D, J y C ya reagrupados, de manera que la informacin de
estas regiones se transcribe en un solo mRNA al que se aade la cola de poliadenilacin (poliA). Tambin se transcribe el segmento L (Figura 4.9).
Las partes del RNAm correspondientes a los segmentos intrnicos es eliminada. Esta
eliminacin implica los procesos de corte del RNAm y posterior unin de los extremos exnicos
restantes. Despus, el RNAm abandonar el ncleo para alcanzar los ribosomas en donde se
producir la sntesis de los pptidos mediante el proceso de traduccin.
En el proceso de traduccin en el ribosoma se sintetizan los pptidos. Una vez
formados los pptidos de una Ig se produce la glicosilacin de los mismos en el propio retculo
endoplsmico, as como su ensamblaje para la formacin de la Ig completa, antes de ser
secretada por la clula. El proceso de ensamblaje parece desarrollarse en las siguientes fases:
H+H H2+LH2L+LH2L2. En el caso de la IgM, parece que por el contrario se unen primero
una cadena pesada con una ligera, uniendose esta media molcula a su otra media
independientemente formada.
Una vez que se ha producido el ensamblaje de la inmunoglobulina, esta molcula tiene
dos opciones funcionales. Una primera es la de permanecer en la membrana de las clulas B,
convirtiendose de esta forma en el receptor de las clulas B para el antgeno. La segunda
opcin es la de ser secretada al medio, con la funcin de interaccionar directamente con el
antgeno y conseguir su destruccin. La nica diferencia entre ambas es que las formas de Igs
de membrana tienen en la regin carboxi-terminal de la cadena pesada un fragmento aadido
de 19 aminocidos. La decisin de optar entre una forma u otra es tomada a nivel de
transcripcin del RNA, una vez ms mediante un proceso de splicing. En el caso que nos
ocupa, el proceso conlleva la transcripcin adicional de dos exones (M1 y M2) situados en la
regin 3' del gen CH, lo que a su vez da como resultado que se genere el fragmento de 19
aminocidos que origina una regin transmembrana hidroflica continuada por una muy corta
regin intracitoplasmtica. Si esto ocurre as, se origina el anclaje de la molcula a la superficie
celular, dando por tanto lugar a una inmunoglobulina de superficie, mientras que si estos dos
exones no son transcritos, la hidrofobicidad conferida a la inmunoglobulina hace que la
molcula no pueda anclarse a la superficie y sea secretada.
ANTICUERPOS MONOCLONALES PRODUCIDOS POR HIBRIDOMAS
Cuando se realiza una inmunizacin con el objeto de producir anticuerpos frente a un
antgeno, se produce una gran variabilidad de inmunoglobulinas que poseen funcin de
anticuerpo frente a los diferentes epitopos del antgeno. Esta producin de inmunoglobulinas es
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de tipo policlonal debido a que son muchos y muy diversos clonos linfocitarios los que se
activan y diferencian para la produccin de anticuerpos (Figura 4.10).
Este fenmeno es de gran utilidad biolgica por cuanto ofrecen una amplia barrera de
proteccin del organismo al formarse una gran variabilidad de anticuerpos. Sin embargo, los
antisueros as obtenidos, aunque se han utilizado ampliamente y han sido de gran inters en el
conocimiento de la biologa y la bioqumica de las inmunoglobulinas (inmunoprecipitaciones e
inmunoblotting), ofrecen serias dificultades para su uso, por ejemplo, en la identificacin de
sustancias u otros fines anlogos, debido a la gran heterogeneidad estructural y funcional que
poseen.
Este problema se ha obviado desde que Georges Kholer y Cesar Milstein en
1975 (Figura 4.11)consiguieron la produccin de anticuerpos monoespecficos, conocidos
como anticuerpos monoclonales (AcMo). Con ello se abri un amplio campo en la Inmunologa
y la Biologa Molecular en general puesto que estos anticuerpos son de una gran utilidad por
cuanto tienen la capacidad de reaccionar frente a un solo eptopo del antgeno y son entre si
homogneos.
Fundamentos de la produccin de anticuerpos monoclonales.
El mtodo seguido para la produccin de estos anticuerpos consiste en la unin
(fusin) de una clula B productora de anticuerpos , con una clula de gran capacidad de
crecimiento (clulas de mieloma) con lo cual se forma un hbrido (hibridoma) que posee la
informacin gentica necesaria para la sntesis del anticuerpo deseado, que le es aportada por
la clula B, y una activa capacidad de sntesis proteica al tiempo que puede multiplicarse
tanto in vivo como in vitro indefinidamente, propiedades estas ltimas que son aportadas por la
clula mielomatosa(Figura 4.12). De esta manera, se pueden producir innumerables tipos de
hibridomas de acuerdo con el tipo de anticuerpo que interesa. Al ser cada uno de los
anticuerpos as producidos homogneos, ofrecen patrones de reaccin de gran especificidad
con los antgenos utilizados en la inmunizacin.Kholer y Milstein para la puesta a punto de
esta tcnica escogieron eritrocitos de oveja como inmungenos, ya que el anticuerpo contra
tales clulas se detectaba fcilmente mediante la tcnica de placas hemolticas de Jerne. Esta
tcnica se basa en la deteccin de la formacin de anticuerpos frente a glbulos rojos de
carnero, comprobando la capacidad ltica de los glbulos frente al complemento. As,
mezclando clulas de mieloma de ratn con clulas de bazo procedentes de ratones
inmunizados con glbulos rojos de carnero en presencia de un agente promotor de la fusin
celular, identificaron con xito las clulas hbridas en un medio selectivo y observaron que
segregaban inmunoglobulinas de ambos progenitores. Algunas segregaban anticuerpos contra
los eritrocitos. Haban logrado por tanto, aislar clones que segregaban una sola especie
molecular de anticuerpo y que, adems, podan mantenerse en cultivo. Por primera vez se
haban desarrollado cultivos continuos de clulas hbridas que segregaban un anticuerpo
monoclonal de especificidad predefinida.
Una vez seleccionado el hibridoma adecuado, ste puede conservarse largo tiempo
congelado. En cualquier momento el clon puede hacerse crecer para la produccin de
anticuerpos por inyeccin a ratones o siembra en cultivo. Generalmente el clon se inyecta
intraperitonealmente generndose ascitis extraordinariamente ricas en anticuerpos, de donde
son fcilmente purificables. Cuando el clon se ha cultivado in vitro el anticuerpo se recolecta a
partir del sobrenadante del cultivo.
Tecnologa de la obtencin de AcMo.
Generalmente se comienza por inmunizar a ratones de la cepa BALB/C con el antgeno
frente al cuale se desea obtener el anticuerpo. El protocolo de inmunizacin suele ajustarse a
tres dosis del material antignico que se administran intraperitonealmente, con intervalos de
unas dos semanas. Aproximadamente a los veinte das de la primera dosis, se comprueba la
presencia de anticuerpos dirigidos frente al antgeno en el suero del ratn.
Comprobada la presencia de anticuerpos se procede al aislamiento de las clulas B
productoras de los mismos del bazo de los animales, en condiciones de esterilidad. Las clulas
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as obtenidas sern utilizadas para su fusin con clulas mielomatosas, generalmente del tipo
NSI.
La lnea mielomatosa NSI procede de un mieloma inducido en la cepa BALB/C que ha
perdido la capacidad de secretar inmunoglobulinas, por lo que no interferir en la produccin de
anticuerpos con los hibridomas que se obtengan. Mientras los linfocitos B, sensibilizados frente
al antgeno correspondiente aportan al hbrido los genes que codifican las cadenas ligeras y
pesadas de las inmunoglobulinas, la lnea mielomatosa dota al hbrido de la capacidad de
crecimiento ilimitado propia de las clulas tumorales y, por tanto, de la posibilidad de
desarrollarse tanto in vitro como in vivo.
Esta lnea mielomatosa se ha hecho resistente a la 8- azaguanina porque carece de la
enzima HGPRT (hipoxantin-guanidin- fosforibosil-transferasa). La sntesis de su DNA la tiene
que realizar a travs de la va de novo que obtiene nucletidos a partir de aminocidos y
azcares. La aminopterina bloquea la sntesis de novo de nucletidos, por lo que las clulas de
la lnea NSI no sobrevivirn en presencia de este frmaco. Esta caracterstica permitir eliminar
las clulas NSI que no se han podido fusionar en el medio rico en aminopterina. Las clulas
NSI no fusionadas morirn, mientras que los hbridos podrn seguir creciendo porque poseen
la enzima HGPRT, aportada por los esplenocitos.
La fusin celular entre los esplenocitos del ratn inmunizado y la lnea mielomatosa
NSI se realiza en el medio de cultivo adecuado que contiene, adems de los nutrientes
necesarios para un cultivo celular, polietilen glicol (PEG) que es un detergente capaz de
disolver parte de la membrana celular permitiendo as la formacin de clulas que contienen
dos ncleos (fusin celular).Posteriormente se procede a la seleccin de los hbridos que se
inicia a partir de las 24 horas despus de la fusin. Para ello se aade medio de cultivo con
HAT (mezcla de hipoxantina aminopterina y timidina), a cada uno de los pocillos de las placas
en donde se encontraban las clulas en cultivo.
Hacia la tercera semana, se retira la aminopterina de los cultivos aandindose medio
HT (hipoxantina-timidina) y, por ltimo, durante la cuarta semana las clulas se mantienen slo
en medio de cultivo. Terminado este proceso se estudian los sobrenadantes de los hbridos
para determinar si producen anticuerpos.
Los hibridomas productores de anticuerpos se expanden y si siguen siendo positivos se
clonan cuando se estabilizan en cultivo.
La clonacin tiene como objetivo aislar el hibridoma productor del anticuerpo deseado y que
todas las clulas que lo constituyen procedan de la misma clula progenitora, dado que los
hibridomas productores de anticuerpos se encuentran mezclados en cultivo con otros
hibridomas que, o bien no son productores o sintetizan anticuerpos que no interesan.
Utilidad de los anticuerpos monoclonales.
Un anticuerpo monoclonal es un reactivo biolgico homogneo en su actividad, en
contraste con los antisueros convencionales que son una mezcla variable de inmunoglobulinas.
El uso ms generalizado de los AcMo se centra:
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disulfuro cada uno de ellos. Cuando se analizan los aminocidos de las cadenas ligeras, se
observa que los dominios a-2 y b-2 pertenecen a la superfamilia de las Igs, mientras que los
a-1 y b-1, que son los que presentan mayor diversidad presentan homologa con los dominios
alfa-1 y alfa-2 de los antgenos clase I. Se aprecian tres zonas donde es ms frecuente la
variabilidad. Un tercer dominio corresponde a la regin de cada cadena que atraviesa la
membrana celular, contiene unos 30 aminocidos y es de naturaleza hidrofbica. Finalmente,
el cuarto dominio, corresponde a la parte citoplasmtica de la molcula, es de naturaleza
hidroflica y contiene de 10 a 16 aminocidos..
Estructura tridimensional.
El anlisis de la estructura tridimensional de los antgenos de histocompatibilidad de
clase I y clase II, determinada mediante cristalografa, demuestra que los dominios estn
estructurados de forma diferente. As, dentro de los antgenos clase I, el dominio alfa-3 y
labeta-2-microglobulina estn organizados en estructura de hoja plegada b. Por el contrario los
dominios a1 y a2 constan cada uno de ellos de una sola zona formada por cuatro fragmentos
en estructura de hoja plegada b seguido de otro segmento organizado en forma de a-hlice.
Esta organizacin delimita una hendidura denominada sitio de unin al pptido (peptide
binding groove) en el que los residuos ms polimrficos se encuentran en el suelo y las
paredes de la hendidura. En esa hendidura se localiza un pptido que no pertenece a la
molcula y de aproximadamente 8-10 aminocidos. Ese pptido procede de protenas
endgenas, como veremos en el captulo siguiente e interacciona con las molculas de
histocompatibilidad mediante fuerzas no covalentes entre sitios concretos de ambas
estructuras. Un determinado antgeno de histocompatibilidad puede unirse a pptidos
diferentes siempre que stos posean uno o varios motivos que interaccionen con zonas de la
molcula cuya estructura suele estar condicionada por residuos polimrficos.
La estructura tridimensional de los antgenos de clase II tambin ha sido determinada
por cristalografa y es semejante a la de los antgenos de clase I. Los dos dominios proximales
(a2 y b2) son los equivalentes al dominio alfa-3 y a la beta-2-microglobulina de los antgenos
clase I, mientras que los dos dominios distales (alfa-1 y beta-1) de los antgenos clase II se
corresponden con los dominios alfa-1 y alfa-2 de la molcula clase I. La hendidura donde se
ubica el pptido se forma entre los dominios alfa-1 y beta-1 de las molculas clase II.
Distribucin tisular de las molculas clase I y II.
Las molculas de clase I se encuentran presentes en la mayora de las clulas
nucleares del organismo pero no en todas, dado que, en algunas localizaciones, su expresin
es mnima o incluso nula, como sucede en el endotelio, glndulas de Brunner duodenales,
trofoblasto velloso o neuronas del sistema nervioso central.
La expresin de las molculas de clase II se encuentra fundamentalmente restringida a
macrfagos, monocitos, linfocitos B y cuando estn activados tambin en linfocitos T y NK.
Igualmente se encuentra expresado en alta densidad en otras clulas que actan como
presentadoras de antgenos, tales como clulas dendrticas del bazo, epidrmicas de
Langerhans o clulas endoteliales. Tambin se encuentran en progenitores hematopoyticos,
clulas leucmicas y clulas de diferentes tipos de tumores.
Esta distribucin diferencial de las molculas de histocompatibilidad de clase I y II se
encuentra directamente relacionada con la diferente funcin de cada tipo de molculas. Los
niveles relativos de las molculas HLA en diferentes rganos y tejidos es muy variado (Figura
5.5).
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Es reconocida por ciertos receptores inhibidores, tales como KIR2DL4, ILT-2 y ILT-4 y,
en consecuencia posee, capacidad de inhibir la lisis mediada por clulas NK y ciertas
clulas T.
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empleo de tcnicas de biologa molecular que han permitido aislar y secuenciar estos genes.
Gracias a estas tcnicas de biologa molecular se ha descubierto la existencia en esta regin
de numerosos genes y pseudogenes pero solamente una minora tienen estructura clase I o
clase II mientras que la mayora no estn relacionados estructuralmente.
Cada clula del organismo, (excepto las clulas germinales), poseen un haplotipo
procedente del padre y otro de la madre. La mayora de los genes del MHC son altamente
polimrficos, es decir pueden ser estructuralmente diferentes entre individuos de la misma
especie. No obstante, como se vio al hablar de la estructura, existen zonas muy conservadas,
prcticamente idnticas en todos los individuos y zonas altamente variables.
Cada especificidad definida en la superficie celular representara un alelo diferente a
nivel genmico. Como se muestra en la tabla 5.3, se han descrito numerosos alelos para los
diferentes loci HLA. Dado que cada individuo posee dos de cada uno de estos alelos, el
nmero de combinaciones tericas posibles en la poblacin considerada en su conjunto es muy
alto.
A menudo se describen nuevas especificidades asociadas a otras previamente
establecidas. Estas nuevas especificidades se suelen denominar especificidades subtpicas
que aparecen por divisin de otras anteriores y a las antiguas especificidades supertpicas. As
por ejemplo, las especificidades HLA-B51 y HLA-B52 se consideran como productos de la
divisin del antgeno HLA-B5. De hecho la secuenciacin de los genes HLA ha demostrado que
el polimorfismo que es detectado a nivel serolgico es slo una parte del que se encuentra a
nivel genmico. As por ejemplo existen numerosos subtipos de HLA-A2 y numerosos subtipos
de HLA-B27. Ello ha hecho que se establezca un nuevo sistema de nomenclatura para los
diferentes alelos HLA que utiliza la letra del loci seguida de 4 dgitos tal como se muestra en el
Apndice. Los dos primeros dgitos seran los de la especificidad serolgica y los otros dos
indicaran la especificidad detectada por secuenciacin.
Los haplotipos heredados de cada padre van a determinar el genotipo del hijo, es decir,
el genotipo de ste ser la suma de un haplotipo procedente de padre y otro procedente de la
madre. En la Figura 5.9 se ilustra grficamente todo lo anteriormente expuesto. En una familia
determinada en la que el padre tiene los haplotipos (a) = A2, B8, Cw1, DR1 y (b) = A3, B7,
Cw3, DR4 y la madre los haplotipos (c) = A2, B7, Cw2, DR2 y (d) = A11, B13, Cw3, DR5 los
hijos podrn heredar cuatro combinaciones distintas de estos haplotipos, siendo (a,b), (b,c) y
(b,d) los posibles genotipos resultantes.
Tras la secuenciacin completa del Complejo Mayor de Histocompatibilidad en el 1999
se conoce que esta regin la forman ms de 200 loci, muchos de los cuales an son
funcionalmente desconocidos, aunque posiblemente la mitad juegue un papel en la funcin del
sistema inmune. Probablemente el estudio del polimorfismo de esta regin ayudar a
comprender por qu unas personas desarrollan unas enfermedades y otras no, en todo caso
este avance ser una importante herramienta para el estudio filogentico, la biologa y la
evolucin de las familias de multigenes, las poblaciones y la enfermedad.
Loci HLA-A, B, C.
La regin que codifica las molculas de clase I est dividida en tres loci, conocidos
como A, B y C, que codifican tres tipos de cadenas pesadas para las distintas molculas de
clase I. Algunos de estos genes han sido estudiados mediante tcnicas de hibridacin de DNA
y se ha demostrado que se encuentran divididos en exones e intrones, encontrndose una
estructuracin homloga a los genes que codifican la b-2 microglobulina, las inmunoglobulinas
y otros tipos de protenas.
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Gen HLA-E: Este gen presenta una secuencia parecida a la molcula Qa1
murina, que une pptidos hidroflicos de la secuencia leader de las molculas
MHC clsicas. Se expresa en pequeas cantidades en la superficie de la
clula, y su expresin est regulada por la presencia de las otras molculas de
histocompatibilidad presentadas en la superficie celular y es TAP dependiente.
Gen HLA- F: Este gen es muy similar en estructura y secuencia a los genes
de las molculas clsicas. Se trancribe en una gran variedad de clulas y
tejidos presentando un polimorfismo limitado.
Regin HLA-D
En la regin D se localizan los genes que codifican las molculas HLA-DR, HLA-DQ y
HLA-DP. Su anlisis bioqumico demuestra que se trata de molculas de clase II compuestas,
como ya hemos indicado, por una cadena a y otra b.
Las molculas HLA-DR y HLA-DQ se estudiaron por serologa y los antgenos HLA-DP
fueron inicialmente definidos por estudios funcionales, mediante estimulacin secundaria
de linfocitos previamente sensibilizados (PLT).
El empleo de tcnicas de biologa molecular han permitido el aislamiento y secuenciacin de
los genes de esta regin, de manera que hoy se conoce con precisin que la regin D posee
un elevado nmero de genes.
Los genes de la familia DR comprenden un gen DRA que codifica la cadena DRalfa y
posee escaso polimorfismo y al menos cuatro genes DRB (DRB1, 3, 4, 5) que codifican
cadenas DRbeta que contienen gran polimorfismo. Se han descrito otra serie de pseudogenes
DRB (DRB2, 6, 8) sin conocerse an su funcin y expresin. La cadena proteica DRalfa puede
combinarse (Figura 5.10). con las diferentes cadenas beta codificadas por los genes DRB
dando origen a las molculas de clase II portadoras de las especificidades HLA-DR (la unin de
los productos de los genes HLA-DRA y HLA-DRB1 y las especificidades HLA-DRw51, 52 y 53
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(la unin de los productos de los genes HLA-DRA y HLA-DRB5, DRB3 o DRB4,
respectivamente).
Tanto las familias DQ como DP contienen dos pares de genes, es decir dos genes a y
dos genes b, prximos entre s y todos polimrficos. Slo uno de estos pares, DQA1 y DQB1 y
DPA1 y DPB1, codifican las cadenas a y b de las molculas de clase II HLA-DQ y HLA-DP
respectivamente. Los otros 2 pares de genes DQA2, DQB2 y DQB3 (pseudogen) y DPA2 y
DPB2 poseen un limitado polimorfismo y no se encuentran expresados en la superficie celular.
Adems existe otra subregin que contiene un gen a, denominado DNA, y un gen beta, DOB,
que podran codificar un nuevo tipo de molculas clase II.
Por otra parte tambin se han localizado una nueva pareja de genes, HLA-DM, no
polimrficos, que se encuentran implicados en el proceso de procesamiento y presentacin de
antgeno como se expone en el prximo captulo. Cada uno de estos genes esta estructurado
en secuencias de intrones y exones relacionados con los dominios estructurales de la protena
codificada por ellos.
Tipaje HLA.
Se denomina tipaje HLA, al anlisis llevado a cabo en el laboratorio para conocer los alelos
HLA de un determinado individuo mediante mtodos serolgicos, anlisis de genes por
biologa molecular (Figura 5.11). y mtodos celulares.
El tipaje HLA tiene especial inters en las siguientes situaciones:
La mayora de los genes del HLA son altamente polimrficos, como ya se explic en el
apartado anterior, y cada especificidad definida en la superficie celular representara un alelo
diferente a nivel genmico. As se han descrito numerosos alelos para los diferentes loci HLA.
Mtodo Serolgico.
El mtodo serolgico ms comnmente utilizado es el test de microlinfocitotoxicidad,
que se realiza enfrentando una poblacin de linfocitos a una batera de sueros o anticuerpos
monoclonales que son especficos para cada uno de los antgenos posibles. Posteriormente se
aade complemento de tal manera que en los pocillos en los que se encuentre el antisuero
especfico para los antgenos de un individuo determinado, se producir la lisis celular que
podr ser visualizada al microscopio. Para visualizar la lisis, actualmente se usan una tcnica
fluorescente con una mezcla de anaranjado de acridina y bromuro de etidio. El bromuro de
etidio se fija al ADN de las clulas muertas (que aparecen de color rojo) y desplaza al
anaranjado de acridina que tie a las clulas vivas de color verde brillante. Los cultivos se
incuban y se hacen las lecturas de viabilidad celular (Figura 5.12). .
Para llevar a cabo la tipificacin de los antgenos de clase II se utilizan poblaciones
purificadas de linfocitos B, ya que en estas clulas los antgenos de clase II se expresan ms
abundantemente que en los linfocitos T (de hecho, las clulas T expresan cantidades
significativas de molculas MHC de clase II slo cuando estn activadas). Los linfocitos B se
separan haciendo pasar suspensiones de linfocitos totales a travs de una columna
empaquetada con fibra de nylon. Por sus propiedades adherentes, las clulas B se retienen en
el nylon y posteriormente se despegan por manipulacin mecnica de la columna de la que
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previamente se han eliminado, por lavado, las clulas no adherentes. Existe a su vez, otro
mtodo ms utilizado y menos perjudicial para la separacin de las clulas B que consiste en el
uso de microesferas magnticas acopladas a anticuerpos contra antgenos especficos de
estas clulas (el antgeno CD19, por ejemplo). La sangre se mezcla con las esferas y luego
stas se separan en un campo magntico (con un imn) y se lavan para proceder a su
tipificacin por serologa.
Mtodos de Biologa Molecular:
Las tcnicas de biologa molecular ms usadas (no las nicas) para detectar polimorfismos
en el ADN utilizan los mtodos de:
a. Secuenciacin directa del ADN.
b. Anlisis del tamao de los fragmentos de restriccin del ADN (RFLPrestriction
fragment lenght polymorphism).
c.
La secuenciacin directa del ADN no es prctica para su uso rutinario. Actualmente son
utilizadas tcnicas de PCR-SBT en la que se secuencian los fragmentos amplificados mediante
PCR.
La tcnica de RFLP incluye la fragmentacin del ADN con enzimas de restriccin, la
separacin electrofortica de los fragmentos, la transferencia de los fragmentos separados a
membranas de nylon, la hibridacin con sondas, de secuencias conocidas, marcadas con
istopos radiactivos o con enzimas y la deteccin del producto por autorradiografa,
quimioluminescencia o colorimetra. La tcnica de PCR permite amplificar segmentos
particulares de ADN en pocas horas (ver capitulo sobre mtodos inmunolgicos).
Las tcnicas que actualmente ms se utilizan para realizar tipaje HLA son PCR-SSO y
PCR-SSP. La PCR-SSO (Figura 5.13). que se basa en: amplificacin de la zona polimrfica
del ADN por PCR, hibridacin con oligonucletidos especficos de secuencia (SSO) fijados a
membranas de nylon. Con la tcnica de PCR-SSP (Primers especficos de secuencia) slo se
consigue amplificacin en aquellas muestras en las que los primers reconozcan el alelo para
los que son especficos por lo tanto lo nico que se hace es probar la existencia o no de los
productos amplificados.
Mtodos Celulares
Tambin existe la posibilidad de detectar los antgenos de histocompatibilidad
por mtodos celulares mediante el cultivo de mezclas de linfocitos, del donante y del receptor.
Esta reaccin que se conoce como CML (cultivo mixto de linfocitos), se basa en la propiedad
que tienen los linfocitos de proliferar cuando se incuban en presencia de linfocitos portadores
de antgenos HLA diferentes. Los linfocitos con antgenos idnticos no estimulan las respuestas
proliferativas entre ellos. La proliferacin celular se puede cuantificar utilizando diferentes
3
tcnicas, aunque la ms comn mide la incorporacin de timidina tritiada ( HT) por las clulas
proliferantes. En una variante de la reaccin, denominada CML unidireccional, las clulas
estimuladoras se tratan previamente con mitomicina C para inhibir su capacidad de divisin
celular, sin modificar su viabilidad (la mitomicina se combina con los husos cromticos evitando
la segregacin cromosmica y la mitosis) y as las clulas slo funcionan como antgeno. Los
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este proceso evolutivo apoya que el polimorfismo es esencial para la funcin de los antgenos
de histocompatibilidad.
FUNCION MOLECULAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD
Las molculas de histocompatibilidad presentes en las clulas del organismo son
marcadores para las clulas del sistema inmunitario de "lo propio" (el yo inmunolgico) e
intervienen de manera fundamental en la educacin tmica de los linfocitos T (Tabla 5.5).
La funcin biolgica de las molculas de histocompatibilidad es la de presentar
pptidos antignicos para la activacin de los linfocitos T. Los linfocitos T que reconocen
molculas HLA clase I y su pptido pertenecen a la subpoblacin citotxica. Las clulas T que
reconocen molculas HLA clase II en su la mayora tienen funcin reguladora produciendo
citocinas. Las molculas de histocompatibilidad de un individuo son antignicas para otro y por
lo tanto activan el sistema inmune (rechazo de trasplantes).
HLA Y ENFERMEDAD
Desde hace varias dcadas se sabe que el padecimiento de ciertas enfermedades se
asocia con el incremento en la frecuencia de un determinado alelo HLA. Esta asociacin
cuando tiene un valor estadsticamente significativo, se viene considerando como un factor de
susceptibilidad o un marcador de riesgo a padecer la enfermedad, que puede cifrarse
estadsticamente como riesgo relativo (RR) y da una idea de la mayor o menor probabilidad
que tiene un sujeto a padecer una determinada enfermedad si presenta dicho marcador o alelo
HLA con respecto a aquellos individuos que no lo tienen.
Efectivamente, a pesar del gran polimorfismo de las molculas HLA y de la ampliacin
del nmero de subtipos allicos de clase I y de clase II, hoy se conocen mltiples
enfermedades que estn asociadas a clase I y otras a clase II (Tabla 5.6). El nmero de
enfermedades asociadas a alelos de clase I es menor que el de las asociadas a clase II.
Las causas de esta asociacin HLA y enfermedad no es conocida completamente. Por
ejemplo en espondilitis anquilopoytica (EA), enfermedad invalidante y que afecta a las
articulaciones de la columna principalmente, y en la que se ha descrito una fuerte asociacin
con HLA-B27, se ha podido observar que ciertos pptidos antignicos de origen articular
serian capaces de formar un complejo con HLA-B27 especficamente que inducira fenmenos
de autoinmunidad, bien por generar en la molcula B-27 modificaciones conformacionales que
la haran no ser reconocida como propia, bien por generar complejos HLA-pptido con cierta
similitud con antgenos bacterianos que provocaran reacciones cruzadas autoagresivas en
individuos HLA-B27, previamente sensibilizados a tales antgenos bacterianos.
En el caso de la diabetes mellitus insulin dependiente (DMID), enfermedad que cursa
con una destruccin selectiva de los islotes de Langerhans del pncreas, con infiltracin
linfocitaria, se considera que es el resultado de una respuesta autoagresiva frente a antgenos
presentes en la membrana celular mediada por linfocitos T.
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Los linfocitos, las nicas clulas con receptores especficos de antgeno, son
responsables de iniciar y llevar a cabo la respuesta inmune adaptativa. Los linfocitos B
interaccionan con el antgeno mediante su receptor (BCR), una inmunoglobulina de membrana
(mIg) que reconoce determinantes antignicos tridimensionales en protenas y otras molculas
antignicas, solubles o particuladas, en estado nativo. En cambio, el receptor clonotpico de los
linfocitos T (TCR) reconoce complejos moleculares en la membrana de las clulas
presentadoras de antgeno (APC), formados por molculas del Complejo Principal de
Histocompatibilidad (MHC) de clase I (MHC-I) o de clase II (MHC-II) (ver ms adelante) y
pptidos antignicos resultantes de la degradacin intracelular del antgeno. Las clulas T, por
tanto, a diferencia de los linfocitos B, necesitan de clulas presentadoras de antgeno (APC)
accesorias que captan el antgeno, lo procesan y lo presentan en la membrana.
El TCR interacciona molecularmente con el pptido contenido en la cavidad de las
molculas del MHC y con las propias molculas presentadoras, de forma que el reconocimiento
del antgeno por el linfocito T, tal como se ha visto en captulos anteriores, queda restringido
por el MHC (Figura 6.1). El fenmeno de la restriccin por el MHC del reconocimiento de
antgeno fue originalmente descrito por Zinkernagel y Doherty (1974) en la respuesta de los
linfocitos T al virus de la linfocoriomeningitis (LCV). Estos investigadores demostraron que las
clulas T citotxicas especficas de virus slo reconocen las clulas infectadas si stas
expresan determinadas molculas de histocompatibilidad en su superficie. Este trabajo mereci
el Premio Nobel de Medicina en 1996.
CELULAS PRESENTADORAS DE ANTIGENO
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Las molculas del MHC son glicoprotenas de membrana cuya funcin es presentar el
antgeno en forma de pptidos a los linfocitos T en la respuesta immune. Las molculas del
MHC se dividen en dos clases: de clase I y de clase II y, aunque ambas son protenas de
membrana, la va biosinttica y de exocitosis que utilizan es distinta e influye en el tipo y origen
de los pptidos que presentan.
VIA BIOSINTETICA DE MHC-I
Las molculas de clase I estn formadas por una cadena pesada (cadena alfa) y la
beta2-microglobulina (beta2-m) cuya asociacin se lleva a cabo en el retculo endoplasmtico
(RE) con la ayuda de diversas chaperonas, desde donde siguen la ruta constitutiva de
exocitosis hacia la membrana celular. Esto es, las molculas del MHC-I generadas en el RE
pasan al aparato de Golgi, despus pasan a travs del tras-Golgi y por va vesicular, llegan a la
membrana celular (Figura 6.2).
Sin embargo, el heterodmero alfa-beta2m formado en el RE es inestable en
condiciones fisolgicas y requiere de la unin de un pptido para alcanzar una conformacin
estable que le permita la salida del retculo endoplsmico. La cadena pesada a se une a una
molcula de 88 kDa llamada calnexina, chaperona de MHC-I por excelencia, que funciona
unindose a protenas de nueva sntesis que an no se han plegado o ensamblado
correctamente, retenindolas en el RE. Cuando la beta 2m se une a la cadena a, la calnexina se
desplaza para que MHC-I se una a otras chaperonas, entre ellas la calreticulina, cuya funcin
es parecida a la calnexina. El complejo calreticulina-alfa-beta2m se une a una tercera
chaperona llamada tapasina que a su vez se une a la subunidad TAP1 del transportador de
pptidos asociado a la membrana TAP (ver ms adelante). Esta asociacin estabiliza a los
heterodmeros alfa-beta2m parcialmente plegados hasta que se asocian a un pptido (ver fig.
va de clase I). Los dmeros TAP, formados por las subunidades TAP-1 y TAP-2 se encargan
de transportar pptidos de degradacin citoslica al interior del RE. Cuando TAP proporciona
un pptido con afinidad adecuada para poderse unir a la molcula de clase I, se forma el
complejo estable MHC-I/pptido, que se separa de las chaperonas e inicia la va de exocitosis
hacia la superficie celular, donde queda expuesto el pptido para su posterior reconocimiento
por un linfocito T CD8+ especfico.
TAP
La mayora de pptidos presentados por MHC-I derivan de protenas citoslicas. Para
transportar pptidos al interior del RE, las clulas han adaptado una molcula transportadora
de una familia de molculas conocida con el nombre de transportadores-ABC (ATP-binding
cassette (ABC)-transporters) encargados del transporte de iones, azcares, aminocidos e
incluso protenas. El transportador de pptidos, conocido con el nombre de TAP (Transporter
Associated with antigen Processing) est compuesto por dos protenas homlogas, TAP1 y
TAP2. El heterodmero TAP1/TAP2 conserva las caractersticas esenciales de los
transportadores-ABC: cada cadena contiene 6 dominios transmembrana, es decir, atraviesa 6
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veces la membrana del RE, y dos dominios hidroflicos de unin a ATP. Estas dos cadenas se
disponen en la membrana con la posibilidad de generar un poro por el que accede el sustrato al
interior del RE. El mecanismo de transporte propuesto de los pptidos generados en el
citoplasma, es el siguiente: el pptido interacciona con la parte citoplasmtica de TAP
provocando la hidrlisis del ATP que induce un cambio conformacional del transportador
permitiendo el paso del sustrato al lumen del RE. Las molculas TAP se han descrito en
humanos, ratones y ratas. Se ha demostradouna preferencia en el tamao, de 8-12 aa, y de
secuencia del pptido transportado, por lo que se ha involucrado a TAP en la seleccin de
pptidos que se van a unir al MHC-I. La mayora de los pptidos no se unen a MHC-I y son
rpidamente transportados de nuevo al citosol donde son degradados por mecanismos an
desconocidos. Los genes que codifican las subunidades TAP-1 y TAP-2 estn dentro del MHC.
PROTEASOMA
Los pptidos transportados por TAP se generan por degradacin de protenas en el
citosol celular. Existen varios sistemas de degradacin de protenas en el citosol de los cuales
el complejo multicataltico llamado proteasoma es el ms directamente involucrado en la
generacin de pptidos para clase I. El proteasoma es un complejo proteico multienzimtico de
alto peso molecular resultado de la asociacin de distintas subunidades con capacidad
cataltica, muy abundante y ubicuo, que se encuentra en arqueobacterias, eubacterias y
eucariotas, y en estos ltimos se localiza en el citosol y en el ncleo. Estructuras de este tipo
se hallan muy conservadas entre especies: en eucariotas superiores se han descrito
proteasomas formados por ms de 25 subunidades distintas, en levaduras presentan hasta 14
subunidades y en bacterias se ha descrito el proteasoma de Thermophlasma acidophilum,
formado por slo 2 subunidades distintas (Figura 6.3). La gran estabilidad de los enzimas en
estos microorganismos termoflicos ha permitido la cristalizacin del proteasoma, revelando
una estructura en forma de cilindro formado por las subunidades que encaran su centro
cataltico hacia el interior. Los dos extremos estn compuestos por subunidades estructurales
denominadas alfa. Los dos anillos internos estn constitudos por subunidades denominadas
beta y forman una cmara donde se produce la proteolisis. Las protenas citoslicas
semidesnaturalizadas se introducen dentro del cilindro quedando a merced de las actividades
catalticas de las subunidades del proteasoma.
En vertebrados, las subunidades beta1, beta2 y beta5 son substituidas por otras tres:
beta1i, (LMP2) beta2i (MECL-1) y beta5i (LMP-7), cuya expresin se modula en presencia de
IFN-gamma (inmunoproteasoma). Las subunidades inducibles se sustituyen de forma
cooperativa en la estructura del proteasoma dando lugar al inmunoproteasoma. Los genes que
codifican para LMP-2 y LMP-7 se localizan en la regin del MHC-II por lo que, igual que en el
caso de TAP, se ha sugerido un papel selectivo del inmunoproteasoma en la generacin de
pptidos capaces de unirse a MHC-I.
VIA BIOSINTETICA DE MHC-II
Las molculas del MHC de clase II estn formadas por dos cadenas alfa y beta que se
sintetizan en el RE, a las que posteriormente se une una cadena llamada invariable (Ii), no
polimrfica. Los heterodmeros aparecen como agregados transitorios de elevado peso
molecular, puesto que una vez se han ensamblado las dos cadenas se forman trmeros de
dmeros alfa/beta. Por su parte la Ii una vez sintetizada tambin se dispone en forma de trmero
generndose finalmente un nonmero formado por tres molculas alfa/beta/Ii, (alfa/beta/Ii) 3. La
calnexina tambin se une a la Ii en el RE despus de generarse, en cambio los dmeros
alfa/beta se unen a otra chaperona llamada BiP (binding protein), miembro de la famlia de las
protenas de estrs trmico o heat shock proteins (hsp).
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Las molculas del MHC son receptores de pptido que unen pptido por defecto, es
decir, necesitan formar complejo con un pptido para convertirse en molculas estables y
maduras. En estado de reposo celular, las molculas del MHC estn ocupadas por pptidos
propios, endgenos o exgenos. Cuando el organismo es atacado por un agente extrao,
como por ejemplo un virus, estos pptidos naturales son desplazados por los pptidos vricos
que durante la infeccin sern mayoritarios en el interior de la clula presentadora. Debido al
polimorfismo de las molculas del MHC, cada molcula de histocompatibilidad presenta una
secuencia distinta en el lugar de unin al pptido lo cual implica que existan preferencias en
cuanto al patrn de pptidos que se unirn a cada molcula de MHC. Por otra parte, los
pptidos que se unen a las molculas de MHC-I y MHC-II presentan caractersticas peculiares
que describen a continuacin (Figura 6.7).
Pptidos unidos por MHC-I
Las molculas de clase I unen pptidos cortos, de 8-10 aa. En general, cada molcula
de clase I puede unir de 2.000 a 10.000 pptidos distintos, pero dichos pptidos presentan
restricciones en su secuencia, motivos estructurales especficos de cada alelo. Estas
restricciones se limitan principalmente a los aminocidos en posicin 2 y 9 del pptido que son
los "puntos de anclaje" a determinados residuos de la hendidura en la molcula de clase
I (Tabla 6.1). Los aminocidos de anclaje se unen en sus cadenas laterales
a bolsillos especficos de los sitios de unin de cada alelo. El resto del pptido, los aminocidos
del 3 al 8, queda en medio de la cavidad de unin sobre una base de molculas de agua, lo
cual da gran plasticidad al complejo. Estos residuos estn involucrados en la interaccin con el
TCR.
Pptidos unidos por MHC-II
Las molculas de clase II, a diferencia que las de clase I, unen pptidos de mayor
tamao que oscilan entre 12 y 34 aa, aunque el tamao preferido para todos los alelos
estudiados es de 12 a 17 aa. La forma de unin del pptido a la cavidad de unin es tambin
distinta. En la hendidura de MHC-II el pptido queda unido por su secuencia central (core),
quedando libres los extremos del pptido a cada lado de la hendidura. La variabilidad
observada en la secuencia de dichos pptidos tambin se halla sujeta a una cierta restriccin
que depende del alelo del MHC-II. Aunque las posiciones de anclaje del pptido a la hendidura
no son tan constantes como para MHC-I, los aminocidos en dos o tres posiciones extremas
(generalmente, 2 o 4 y 9) de la secuencia central del pptido son las posiciones principales de
anclaje al MHC y por lo tanto las que definen el motivo estructural especfico de alelo (Tabla
6.2). Los pptidos que se unen a las molculas MHC-II son mayores que los de MHC-I y varan
en longitud. Debido diferencia de tamao de los pptidos aislados, los residuos de anclaje se
hallan en distintas posiciones. No obstante, la secuencia interna del pptido se une a la cavidad
presenta rasgos comunes: por ejemplo, en el alelo HLA-DR3, los residuos que ocupan la
posicin 4 (P4) estn cargados negativamente como el cido asprtico (D) o el cido glutmico
(E) y en la posicin 9 (P9) son residuos hidrofbicos como tirosina (Y), leucina (L), prolina (P) o
fenilalanina (F).
OTRAS MOLECULAS PRESENTADORAS DE ANTIGENO
Se han caracterizado tres genes que codifican molculas que se denominan molculas
de HLA de clase I no clsicas: HLA-G, HLA-E y HLA-F, que presentan gran homologa con las
molculas clsicas de MHC-I (HLA-A, -B y -C) y que tambin se asocian con la beta2m. HLA-E
y HLA-F se expresan en la mayora de tejidos fetales y adultos.
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TCR. Heterodmero con dos subunidades proticas, denominadas alfa y beta, unidas
covalentemente por puentes disulfuro. Es la porcin especfica del receptor, por lo tanto
polimrfica, y en ella se d la variacin clonotpica que va a permitir el reconocimiento
8
de los ms de 10 antgenos diferentes. Existe una variante del TCR que se encuentra
en unas pocas clulas T, y est formada por cadenas gamma y delta en lugar de las
cadenas alfa y beta. Este heterodmero no se asocia covalentemente, y su funcin an
no est claramente determinada
CD3. Es la porcin invariante del complejo y est formado por al menos 3 monmeros
unidos no covalentemente, denominados gamma, delta y epsilon. El complejo CD3 fue
descubierto por anticuerpos monoclonales, OKT3 y Leu4, y sus secuencias
nucleotdicas se averiguaron alfa partir del anlisis de cDNA. Es el encargado de
transmitir la seal del reconocimiento antignico al interior celular. Al complejo CD3 se
le asocia un gran homodmero intracitoplasmatico .
Todos los componentes del receptor de la clula T son protenas de membrana, y estn
formadas por una secuencia, dominio N-terminal extracelular, dominio transmembrana y
dominio citoplsmico C-terminal.
Estructura bioqumica del receptor clonotpico (TCR)
Cadena TCR-alfa.
Es una cadena glicosilada cida que esta divida en los siguientes dominios (Figuras
7.3; Figura 7.4 y Tabla 7.1):
Un pptido lder.
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Cadena TCR-beta.
Es una cadena glicosilada con estructura similar a la ya mencionada TCR-alfa. Consta de
un pptido leader y tres dominios diferentes (Figura 7.3; Figura 7.4 y Tabla 7.1).
Extracelular, con una regin variable, una de unin y otra constante que posee 4
cistenas
Es conocido como la estructura de las cadenas alfa y beta guardan una cierta homologa
secuencial con los dominios de las inmunoglobulinas.
Estructura bioqumica del complejo CD3
Cadena CD3-delta.
CD3-delta es una glicoprotena constituida por tres dominios bien diferenciados: a) dominio
extracelular, que lleva dos oligosacridos unidos; b) un dominio transmembranal, y c)
un dominio intracitoplasmtico (Tabla 7.1 y figura 7. 5).
Cadena CD3-epsilon.
Es una protena no glicosilada. Est constituda por tres dominios: a) extracelular,
comprendiendo los residuos 1 al 107; b) transmembranal, de marcado caracter hidrofbico, que
comprende los resduos 105 a 130. Al igual que ocurre en el caso del CD3-delta, aparece un
asprtico en posicin 115, intuyndose que est implicado en una funcin parecida y
c)intracelular, constituido por dos porciones clramente diferenciadas.
Cadena CD3-gamma
Es tambin una glicoprotena de estructura similar a las anteriores y su funcin se cree que
es fundamentalmente estructural y/o de interaccin con otros correceptores (CD2, CD4, CD8,
etc.).
Cadena CD3-zeta.
Tiene una estructura distinta de los otros pptidos del complejo CD3, ya que su dominio
extracelular es de mucho menor tamao que el extracelular. Es de gran inters sealar las 6
tirosinas en el dominio intracelular, que se fosforilan cuando el receptor de la clula T se activa.
El segmento transmembrana de la cadena z tiene una gran homologa con la subunidad g del
receptor Fc de la IgE, y es requerido tanto para su expresin como para la transduccin de
seal (figura 7.6). La subunidad zeta se encuentra asociada al TCR en forma de homodmero
zz, o, con menor frecuencia, como heterodmero unido a otra protena, llamada h que proviene
del mismo gen que zeta por splicing alternativo.
Dentro del dominio citoplasmtico de todas las cadenas que forman el CD3 (g,d,e y en la
cadena z) existen unas regiones denominadas ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based
Activating Motif) que son ricas en tirosinas y susceptibles de ser fosforiladas en el proceso de
transduccin de seales de activacin hacia el interior celular.
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Al igual que ocurre en las inmunoglobulinas, los genes que codifican las cadenas alfa y
beta del TCR estn formadas a partir de la unin de elementos gnicos separados. El
reordenamiento gnico, tanto de las inmunoglobulinas como del TCR, es dependiente de la
presencia de secuencias de DNA especficas adyacentes a los segmentos gnicos de
reordenamiento. Mediante este proceso se genera una enorme diversidad de receptores.
El gen TCR-alfa
La organizacin gnica de la cadena a se puede dividir en cuatro regiones (en sentido 3'5')(Figura 7.9):
Una regin constante, que se reparte en cuatro exones, y que codifica para la regin
constante de la cadena (C-alfa)
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Entre los segmentos gnicos V-alfa y J-alfa se encuentran los genes V(D)J del TCRdelta
El gen TCR-beta
Hay dos genes constantes, usados de forma intercambiable en todos los tipos de
clulas T, denominados C-beta1 y C-beta2, repartidos en cuatro exones que codifican el
dominio constante y una porcin del pptido de unin, regin bisagra y la cistena de unin
entre las cadenas alfa y beta, el dominio transmembrana y la fraccin citoplasmtica,
respectivamente(figura 7.9).
Genes del receptor gamma/delta-TCR
La organizacin gentica de los loci del gamma-TCR, localizado en el cromosoma 7,
est constituda por una serie de 14 genes variables, seguido de dos segmentos diferentes de
genes J-C. La diversidad de combinaciones generadas es muy limitada. Adems, una de las
regiones constantes es defectiva y podra eliminar uno de los genes V-gamma, no pudiendo
participar como molcula funcional (una caracterstica de la regin constante es que en el 2
exn se ha perdido el residuo de cistena, implicado en la formacin del puente disulfuro
intercatenario).
Estructura gentica del complejo CD3
Los genes que codifican para CD3gamma y CD3delta se encuentran muy prximos en
las especies analizadas. En humanos, ambos genes estn localizados en el brazo largo del
cromosoma 11 y estn separados por 1,5 Kb, aproximadamente. El gen CD3delta est
constitudo por cinco exones . El gen CD3-gamma tiene 7 exones. Las uniones exn-intrn
estn localizadas en posiciones homlogas en los dos genes, con la excepcin de que el gen
CD3-gamma contiene los dos exones adicionales. Una caracterstica del gen CD3d es el alto
nivel de conservacin de la secuencia de nucletidos situada 1000 bases por delante del codn
de iniciacin.
El gen CD3-epsilon est constitudo por 9 exones, dos de los cuales son inusualmente
pequeos. Las caractersticas ms importantes de estos genes son: a) mediante el estudio
comparado de secuencias se ha podido confirmar la relacin de estos genes con la
superfamilia de las inmunoglobulinas; b) la expresin de los genes CD3 parece estar
coordinada y regulada por factores reguladores superpuestos (se ha demostrado mediante la
utilizacin de mutantes, los cuales expresaban las cadenas alfa y beta, pero carecan de todo
el complejo CD3) y c) estos genes son transcritos sin promotores TATA, secuencia
caracterstica de eucariotas.
Reordenamiento de los genes del receptor clonotpico
Las secuencias adyacentes a la zona 5' de los segmentos J tienen, en homologa a las
inmunoglobulinas, determinadas secuencias, formadas por un heptmero y un nonmero, y
espaciadores muy conservativas implicados, como seal de reconocimiento, en el
reordenamiento somtico. Las regiones D tambin estn rodeadas de estas seales de
reconocimiento. Gracias a la existencia de regiones espaciadoras en D y J, es posible la
asociacin D-V J-V.
El mecanismo de reordenamiento sigue tres etapas (Figura 7.10):
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En la seleccin positiva los timocitos se unen mediante su TCR con baja afinidad a las
molculas HLA clase I y II de las clulas epiteliales del timo en cuyo caso sobreviven mientras
que aquellos timocitos que no participan en este tipo de unin mueren por apoptosis. En
definitiva estos linfocitos que se seleccionan positivamente son rescatados de su muerte por
apoptosis. En este proceso participan tambin los pptidos propios presentados por las
molculas de histocompatibilidad tambin propias de cada individuo. En este proceso tambin
participan los receptores CD4 y CD8 de estos timocitos que como sabemos son doblemente
+
+
positivos (CD4 y CD8 ). Incluso experimentos bloqueando con anticuerpos monoclonales tanto
los receptores CD4 como CD8 han demostrado que la participacin de uno u otro de estos
receptores hace que los timocitos deriven hacia linfocitos T citotxicos o linfocitos T
colaboradores, segn que participe el receptor CD8 o CD4 respectivamente. Este tipo de
seleccin se efecta principalmente en el cortex del timo.
Seleccin negativa de los linfocitos T.
Este tipo de seleccin conduce a la muerte por apoptosis de aquellos timocitos que
reconocen con gran avidez mediante su TCR a las molculas de histocompatibilidad I o II
presentes en clulas dendrticas del timo. En este caso esta demostrado que los pptidos
propios presentados por las molculas HLA son de gran importancia. Este tipo de seleccin es
especialmente importante eliminando aquellos clonos celulares que al reconocer lo propio (HLA
ms pptidos propios) pueden tener capacidad autoreactiva una vez han madurado.
Precisamente al eliminar estas clulas se evita esto y la posibilidad de desarrollo de
enfermedades autoinmunes en el futuro. Es de destacar, como veremos en el capitulo de
activacin de linfocitos T, que cuando este tipo de unin de alta afinidad se produce en clulas
maduras, en lugar de muerte por apoptois, se produce una activacin linfocitaria. Este tipo de
seleccin se efecta principalmente en la mdula del timo.
Una vez producida la seleccin positiva y negativa, las clulas supervivientes (menos del
2% del total) dejan de expresar uno de los dos correceptores (CD4 o CD8), dando lugar a
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clulas CD4 CD8 TCRalfa-beta o CD4 CD8 TCRalfa-beta maduras (la regulacin de la mutua
exclusin de los genes CD4 y CD8 no est an esclarecida).
Reconocimiento del antgeno por el receptor de la clula T
Una vez en la periferia, el linfocito T tiene la capacidad de migrar a travs del cuerpo,
adherindose tanto funcional como no funcionalmente a distintos tipos celulares, sobre los que
reconoce antgenos exgenos. Por otro lado, una clula presentadora de antgeno que ha
procesado una protena antignica determinada expresar en su superficie celular un largo
nmero de diferentes complejos MHC/antgeno. Los pptidos que son reconocidos por las
clulas T deben tener una estructura secundaria en a-hlice. Se ha visto que todos los
pptidos antignicos son anfipticos, con una cara hidroflica y otra hidrofbica, pudiendo
interaccionar una de las caras con el complejo TCR/CD3 y la otra con la molcula de MHC,
respectivamente(Figura 7.14). Por esta razn, el reconocimiento de la asociacin MHC/pptido
antignico es un proceso dinmico que incluye un primer paso de complejas interacciones
clula-clula, antes de que se produzca un contacto productivo que d lugar a la activacin
celular.
Reconocimiento de superantgenos
Se denominan superantgenos a aquellos antgenos capaces de reaccionar con
distintas molculas MHC de clase II y TCR de un mismo individuo. Pueden ser exgenos (como
las toxinas de ciertos estafilococos), si provienen del exterior, o endgenos (como el retrovirus
MMTV), si se reproducen en la lnea germinal (Figura 7.15).
El reconocimiento del superantgeno se distingue del reconocimiento del pptido
antignico convencional por tres caractersticas fundamentales: la especificidad de la clula T a
los superantgenos est determinada por la regin variable de la cadena beta, siendo
independiente de otros componentes del receptor de la clula T; el superantgeno tiene dos
sitios de unin, uno para la molcula MHC de clase II, fuera de la hendidura de reconocimiento
peptdico, y otro para el TCR, situado en la regin Vb fuera del sitio clsico de unin al complejo
MHC-antgeno (esta caracterstica hace posible que un mismo superantgeno pueda
interaccionar con distintas clulas del repertorio T). Como consecuencia del reconocimiento
de superantgenos exgenos en periferia, se produce la activacin celular y fuerte expansin
de las clulas T implicadas en el reconocimiento.
ENFERMEDADES ASOCIADAS Al COMPLEJO TCR/CD3.
Alteraciones de diferente ndole del TCR/CD3 pueden dar lugar a enfermedades a
veces de difcil diagnstico.
Receptor clonotpico: oligoclonalidad y enfermedad
Los linfocitos T constituyen, en condiciones normales, una poblacin policlonal en la que
estn representados, en proporciones equivalentes, todas las regiones V de las cadenas TCRalfa y TCR-beta. Sin embargo, diferencias en la configuracin de los genes del receptor
clonotpico o en la seleccin intratmica pueden afectar al repertorio de linfocitos T, existiendo
una reduccin de determinados clones y un aumento de los niveles de otros. Estas alteraciones
pueden detectarse analizando la expresin de las regiones V de las cadenas alfa y beta de
estas clulas, y se ha demostrado que se asocian a ciertas enfermedades autoinmunes como
la artritis experimental inducida por colgeno.
Complejo CD3 y transduccin de la seal
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CITOCINAS
Son molculas de bajo peso molecular, normalmente entre 15-30 KDa, constituidas por
120-180 aminocidos. Aunque en general estn producidas por leucocitos, determinadas
citocinas pueden tambin ser secretadas por otros muchos tipos celulares. Originariamente se
estableci el trmino linfocina para denominar productos biolgicos producidos por linfocitos en
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TNF. Los factores de necrosis tumoral fueron descritos inicialmente por su capacidad
de causar necrosis en algunos tumores. Con posterioridad , sin embargo, ganaron
protagonismo por las numerosas funciones que ejercen sobre las respuestas inmunes.
Se han descrito dos molculas estrechamente relacionadas, el TNF-alfa y el TNF-beta,
con elevada homologa en su secuencia aminoacdica. El TNF-alfa es producido
fundamentalmente por monocitos y macrfagos en respuesta a antgenos bacterianos,
tales como el LPS, siendo esta citocina el principal responsable del shock sptico
asociado a bacteriemias. Tambin puede ser producido por linfocitos T y B, NK,
fibroblastos y mastocitos. Junto con la IL-1 est implicado en los procesos inflamatorios
derivados de los procesos infecciosos, elevando la temperatura corporal y produciendo
caquexia y sueo al actuar sobre el SNC. Por otra parte, induce la expresin de
molculas de adhesin y estimula la produccin de IL-8 por clulas del endotelio
vascular, lo que contribuye a la extravasacin de linfocitos, neutrfilos y monocitos. El
TNF-beta o linfotoxina, es producido exclusivamente por linfocitos T activados,
aunque se une a los mismos receptores que el TNF-alfa e induce funciones similares.
I n m u n o l o g a O n l i n e | 71
IL-10. Es producida por linfocitos del tipo Th2, as como tambin por
monocitos/macrfagos, linfocitos B, queratinocitos y otros varios tipos celulares. Es la
citocina inmunosupresora por excelencia, inhibiendo la sntesis de muchas otras
citocinas, entre las que podemos citar IFN-gamma, TNF-alfa, IL-2, IL-12, y la expresin
de MHC-II y molculas de adhesin en monocitos. Tambin tiene efectos
antiproliferativos sobre muchos tipos celulares. La IL-10 ejerce adems mltiples
actividades inmunomoduladoras. Se ha visto que es un cofactor para el crecimiento de
lneas y colonias de clulas mastocticas in vitro. Regula las funciones mediadas por
linfocitos B induciendo la sntesis de IgG, y por linfocitos T, influyendo en el desarrollo
de timocitos y clulas T. Tambin ejerce efectos reguladores sobre la angiognesis. El
virus de Epstein Barr secreta una protena que posee una gran homologa estructural
con la IL-10 humana (vIL-10), y que tras unirse con baja afinidad al propio receptor de
la IL-10, ejecuta actividades biolgicas similares. Relacionadas estructural y
funcionalmente con la IL-10 se han descrito recientemente nuevas molculas tales
como la IL-19, IL-20 e IL-22, cuyas funciones son todava poco conocidas (Figura 9.4).
IL-18. Esta citocina est estrechamente relacionada en sus funciones biolgicas con la
IL-12, ya que posee la misma capacidad de induccin de IFN-gamma en linfocitos T y
clulas NK. Sin embargo, es producida por diferentes tipos celulares que la IL-12,
siendo las clulas adrenales y de Kupffer las principales fuentes de produccin de la IL18.
I n m u n o l o g a O n l i n e | 72
Interferones tipo I. Los interferones fueron inicialmente descritos como agentes producidos
por clulas infectadas por virus. Posteriormente se descubri que adems de su capacidad
antiviral ejercan efectos reguladores sobre la proliferacin y la diferenciacin de varios tipos
celulares y tenan capacidad de modular el sistema inmune. Se clasificaron en dos grupos. Los
interferones tipo I, que incluyen el IFN-alfa y el IFN-beta, con capacidad principalmente
antiviral y antiproliferativa, y el IFN-gamma (tipo II), al que nos referiremos posteriormente, con
un mayor efecto inmunomodulador. El IFN-gamma es producido fundamentalmente por
monocitos y macrfagos, mientras que el IFN-alfa es secretado por fibroblastos y algunas
clulas epiteliales. Ambos incrementan la expresin de molculas de MHC de clase I. En
algunos casos se ha observado que poseen actividad antitumoral, posiblemente debido a su
efecto antiproliferativo sobre las clulas tumorales, y modulador sobre el sistema inmune.
I n m u n o l o g a O n l i n e | 73
IL-15. Es secretada por una amplia variedad de clulas, entre las que se incluyen
clulas epiteliales, monocitos, msculo esqueltico, hgado, pulmn y placenta. Aunque
no es una citocina producida por linfocitos Th1 se incluye en este apartado por su
similitud funcional con la IL-2, con la que comparte la mayora de sus actividades
biolgicas, como la estimulacin de clulas NK, y la proliferacin y diferenciacin
linfocitaria.
IFN. Es producido por linfocitos Th1, LTC y por clulas NK. Adems de su efecto
antiviral posee una importante actividad inmunomoduladora. Incrementa la expresin
de antgenos de HLA de clase I y II en varios tipos celulares, lo que facilita su funcin
presentadora de Ag y activa a los macrfagos, incrementando su capacidad tumoricida
y de defensa contra las infecciones. Acta de forma autocrina sobre las propias clulas
NK que lo producen, aumentando su actividad citoltica y, como consecuencia,
incrementando su efecto antitumoral. Sobre los linfocitos Th2 inhibe la proliferacin, de
manera que su presencia durante la estimulacin antignica induce la diferenciacin de
linfocitos T hacia clulas efectoras tipo Th1 favoreciendo, por lo tanto, el desarrollo de
las respuestas inflamatorias (Figura 9.5).
IL-4. Es producida por linfocitos Th2, mastocitos, basfilos, clulas del estroma de la
mdula sea y, posiblemente, por determinadas subpoblaciones de clulas NK. Es
una citocina muy pleiotrpica, ya que ejerce numerosos efectos en diferentes tipos
celulares. Promueve la diferenciacin de linfocitos T vrgenes hacia clulas de tipo Th2,
inhibiendo la generacin de clulas Th1. Posee efectos inmunosupresores, ya que
inhibe la produccin de deteminados mediadores inflamatorios de los macrfagos e
induce la produccin de IL-1Ra, que bloquea la accin de la IL-1. Por otra parte,
promueve el desarrollo de las respuestas inmunes humorales a travs de la induccin
del crecimiento y diferenciacin de linfocitos B, produciendo el cambio isotpico hacia
IgG4 e IgE e incrementando la expresin de molculas CD23 en linfocitos B, basfilos
y eosinfilos. Por todo ello, los efectos de esta citocina se han relacionado con el
desarrollo de los procesos alrgicos y con el incremento de IgE en las infecciones
parasitarias
IL-13. Es producida por linfocitos T activados del tipo Th2, compartiendo muchas de
sus funciones con la IL-4 con la que se encuentra genticamente relacionada. Es una
citocina con actividad inmunosupresora ya que inhibe, junto con la IL-4 y la IL-10, la
produccin de citocinas inflamatorias por los monocitos (IL-1beta, TNF-alfa, IL-8, IL-6).
Por otra parte, esta citocina incrementa la proliferacin y diferenciacin de monocitos y
clulas B, incrementa la expresin de CD23 y promueve el cambio de clase de
inmunoglobulinas hacia la produccin de IgE
I n m u n o l o g a O n l i n e | 74
IL-16. Est producida por los linfocitos T CD8+ donde se acumula y se secreta en
respuesta a la estimulacin con serotonina o histamina. Originariamente se identific
como factor quimiotctico de linfocitos, recibiendo el nombre de linfotactina, debido a
su efecto atrayente sobre los linfocitos T CD4+. En la actualidad es el nico miembro
de la familia C de quimiocinas (vase ms adelante).
I n m u n o l o g a O n l i n e | 75
*** QUIMIOCINAS
Su nombre proviene de citocinas quimiotcticas a que muchas de ellas poseen
propiedades quimioatrayentes, regulando el trasvase de leucocitos hacia rganos y tejidos. Las
quimiocinas secretadas se unen a proteoglicanos y a protenas de la matriz extracelular donde
se cree permanecen inmovilizadas sin pasar a la circulacin. Esta capacidad de unin a la
matriz extracelular favorece la permanencia de las quimiocinas en su lugar de produccin y
apoya el concepto de que la migracin de los leucocitos se realiza a travs de un gradiente
slido.
La caracterstica bioqumica comn de estas molculas es la conservacin de 4
residuos de cistena que se unen formando dos puentes disulfuro, esenciales para la actividad
de la molcula. Dependiendo de si las dos primeras cistenas estn o no separadas por otro
aminocido se han clasificado en quimiocinas CXC (cis-X-cis), y quimiocinas CC (cis-cis).
Hay otras 2 quimiocinas, la linfotactina y la fractalkina, que pertenecen a otras subfamilias por
tener caractersticas bioqumicas diferentes.
La molcula ms representativa de la familia CXC es la IL-8 (CXCL8). Es sintetizada
por todos los tipos de leucocitos, as como por otros muchos tipos celulares (fibroblastos,
clulas endoteliales, hepatocitos, astrocitos. etc.) y clulas tumorales (melanoma, carcinoma de
ovario,pulmonar, etc.) en respuesta a una amplia variedad de estmulos. La primera actividad
biolgica descrita fue la activacin de neutrfilos, en los que induca degranulacin, cambios
morfolgicos y quimiotaxis. Luego se observ que tambin era quimiotctico para eosinfilos y
basfilos. Es tambin un potente factor angiognico. Dentro de la familia CC se encuentran
laeotaxina, importante en los procesos alrgicos por ser quimiotctica para eosinfilos,
elRANTES que es quimiotctico para linfocitos T de memoria, y la protena quimioatrayente de
monocitos (MCP-1).
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-11
Los receptores funcionales son de alta afinidad (10 -10 M), es decir, nicamente son
necesarias bajas concentraciones de citocinas para una unin efectiva con su receptor y para
desencadenar su correspondiente efecto biolgico. Adems, estos receptores se expresan en
un nmero bajo en la superficie celular generalmente de unos pocos cientos a unos pocos
miles de receptores por clula. La distribucin de algunos de ellos, como por ejemplo los de la
IL-2 y de la IL-5, est restringida a unos pocos tipos celulares mientras que otros, entre los que
se pueden citar los de la IL-1, IL-4 e IL-6, se encuentran distribuidos en una amplia variedad
de tipos celulares. La expresin de los receptores de citocinas en la superficie celular puede
ser constitutiva, es decir, tiene lugar sin necesidad de ningn estmulo fisiolgico o, por el
contrario, puede requerir que la clula sea activada previamente. En general, la activacin
celular incrementa el nmero de receptores por clula.
Muchos de los receptores de citocinas son complejos multicatenarios compuestos de
una cadena que se une especficamente a la citocina (cadena especfica) y de una cadena que
transduce las seales al interior de la clula y que es compartida por otros receptores de
citocinas (cadena comn). Para la transduccin de seales se requiere, en general, de la unin
de varias cadenas especficas (homodmeros) o de la cadena especfica con la comn
(heterodmeros). En algunos casos, es necesaria la interaccin de tres cadenas para la
formacin de receptores de alta afinidad. La transduccin de seales puede tener lugar por
mecanismos comunes a todas las familias de receptores o por mecanismos especficos de
cada una de ellas. Como comentaremos en este captulo, muchas de las caractersticas
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Los receptores que pertenecen a esta familia se pueden subdividir a su vez en dos
clases relacionadas evolutivamente. La clase 1 est compuesta por la mayora de los receptores
de citocinas mientras que en la clase 2 se incluyen los receptores para los IFNs (Tabla 9.6).
Receptores de clase 1. Las cadenas polipeptdicas que forman parte de esta clase de
receptores se caracterizan por poseer en su regin extracitoplasmtica dos pares de
residuos de cistena conservados en el extremo distal y un motivo Tryp-Ser-X-Tryp-Ser
(WSXWS, donde X es un aminocido no conservado) en su extremo carboxiterminal. La
presencia de este dominio permite la unin eficiente del ligando al receptor. En la regin
citoplasmtica no se han encontrado secuencias con actividad cataltica pero existen
cidos hidrofbicos denominados respectivamente box1 y box2 que son necesarios para
la transduccin de seales al interior de la clula.
Los receptores que forman parte de esta clase son complejos multicatenarios y la mayora de
ellos adems de poseer una o ms cadenas especficas de unin al ligando comparten una
misma cadena que interviene en la transduccin de seales al interior de la clula. Dentro de esta
clase se incluyen las cadenas de transduccin comunes bc y gc, la cadena b del IL-2R, as como
la cadena especfica de los receptores de la IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-9, GM-CSF, EPO
(eritropoyetina) y TPO (trombopoyetina) (Tabla 9. 1). La cadena de transduccin comn gp130 y
los receptores especficos de la IL-6, IL-11, IL-12, G-CSF, factor inhibidor de la leucemia (LIF) y
oncostatina M (OSM) pertenecen a esta familia aunque su regin extracitoplasmtica distal
presenta tambin dominios similares a los de las inmunoglobulinas, por lo que tienen una
estructura de tipo mixto entre la de la superfamilia de las inmunoglobulinas y la de la superfamilia
de receptores de citocinas (Figura 9.1 y Tabla 9.5). Adems, dentro de esta familia se incluyen
receptores para otras molculas que no tienen funciones especficas inmunitarias, como el
receptor de la hormona del crecimiento (GHR), de la prolactina (PRLR) y el del factor neurotrfico
ciliar (CNTFR).
Los receptores de esta familia pueden ser agrupados segn la cadena comn (gp130, bc
o gc) que comparten y a travs de la cual se transmiten las seales al interior de la clula. Esta
cadena no interviene en la unin con el ligando mientras que la cadena especfica, generalmente
denominada a, se une a la citocina aunque con baja afinidad. La oligomerizacin de una cadena
especfica, o de la cadena especfica con alguna de las cadenas comunes es necesaria para la
formacin del receptor funcional de alta afinidad. As se pueden establecer diferentes modelos de
receptores (Figura 9.10), de los cuales el ms sencillo es el formado nicamente por
homodimerizacin de su cadena especfica como es el caso del G-CSFR, EPOR y TPOR. Otro
modelo consiste en la heterodimerizacin de la cadena especfica y alguna de las cadenas
comunes de transduccin de seales. De este modo, los receptores para la IL-6, IL-11, LIF, OSM y
CNTF se forman por heterodimerizacin de su cadena especfica de unin con el ligando y de una
o dos cadenas gp130. Los receptores para la IL-3, IL-5 y GM-CSF son, en cambio, heterodmeros
que constan de su cadena especfica y de una nica cadena comn bc. Varios receptores de
interleucinas, el IL-2R, IL-4R, IL-7R e IL-9R, estn formados por su cadena especfica y la cadena
gc. El receptor de la IL-2 ha sido ampliamente estudiado y se ha comprobado que la transduccin
de seales tiene lugar por receptores con distinta afinidad que resultan de la unin de dos o de tres
-9
cadenas. El receptor de afinidad intermedia (10 M) est compuesto por la cadena especfica b
(IL-2Rb) y por la cadena comn, gc, implicada en la transduccin de seales mientras que el
-11
receptor de alta afinidad (10 M) es un complejo trimolecular que consta de las dos cadenas
anteriores ms la cadena especfica a (IL-2Ra).
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RECEPTORES DE QUIMIOCINAS
Las quimiocinas son un tipo de citocinas estructuralmente semejantes que se caracterizan
por ejercer una actividad quimiotctica y estimuladora sobre clulas de tipo inflamatorio. Esta
familia de molculas puede ser dividida en dos clases, CC y CXC, segn variaciones en un motivo
de cistenas que se encuentra conservado en todos los receptores de esta familia. En las de tipo
CXC, los dos residuos de cistena estn separados por un aminocido no conservado mientras
que en las de tipo CC las dos cistenas estn adyacentes.
Los receptores a los que se unen las quimiocinas presentan caratersticas muy diferentes
a los receptores de las otras familias de receptores de citocinas. Actualmente se han clonado
muchos de ellos y se ha comprobado que presentan una estructura similar a los receptores de la
familia de la rodopsina ya que consisten en una regin extracelular corta, contienen 7 dominios
transmembranales muy conservados y estn asociados a protenas de unin con nucletidos de
guanina (protena G) que intervienen en la transduccin de seales. Dentro de esta familia de
receptores, se pueden distinguir los receptores especficos y los compartidos segn su
especificidad de unin con el ligando. Los especficos unen un ligando en concreto siendo el
ejemplo ms representativo el IL-8RA o CXCR1 que nicamente une a IL-8. Por el contrario, los
receptores compartidos pueden unir a ms de una quimiocina del tipo CXC o a ms de una
quimiocina del tipo CC. Receptores de este tipo son, por ejemplo, el IL-8RB o CXCR2 que une a
IL-8 y a otras quimiocinas CXC y el CCR1 cuyos ligandos son quimiocinas del tipo CC.
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La identificacin de los Stats y su relacin con las cinasas Jak ha sido posible gracias a los
estudios realizados sobre la induccin de transcripcin en respuesta a los IFNs. Hasta el momento
se han identificado 6 componentes de esta familia. No parece existir un patrn especfico de
activacin receptor-Stat ya que un Stat puede ser activado por mltiples receptores y la unin de
una citocina con su receptor puede activar varios Stats. Por otra parte, existe una cierta relacin
entre grupos de receptores que comparten una misma cadena de transduccin de seales y
determinados Stats. As, los receptores que comparten la cadena bc activan el Stat5 mientras que
los que utilizan la cadena gp130 activan preferentemente el Stat3.
Determinadas caractersticas funcionales de las citocinas pueden ser explicadas ahora por
los recientes conocimientos adquiridos sobre la composicin y los mecanismos de activacin de
sus receptores. Las citocinas son redundantes, es decir, varias citocinas ejercen efectos biolgicos
similares sobre un mismo tipo celular. El que algunos receptores de citocinas sean complejos
oligomricos que comparten una misma cadena de transduccin de seales puede explicar este
hecho. En estos receptores, la sealizacin tendra lugar por vas comunes producindose la
I n m u n o l o g a O n l i n e | 82
transcripcin de los mismos genes. Este fenmeno ha sido mejor observado en las citocinas que
utilizan receptores que son miembros de la superfamilia de los receptores de citocinas. Por
ejemplo, la IL-3 y el GM-CSF que utilizan receptores que comparten la cadena beta como
transductora de seales tienen funciones muy parecidas en el sistema hematopoytico. En el caso
de las citocinas que utilizan la cadena gp130 (IL-6, LIF, CNTF, OSM, e IL-11), todas ellas son
capaces de inducir la produccin de protenas de fase aguda en el hgado. Respecto a las
citocinas cuyos receptores comparten la cadena gamma como transductora de seales (IL-2, IL-4,
IL-7, IL-9 e IL-15), todas son factores de crecimiento de clulas T. Este hecho es de gran
importancia en la inmunodeficiencia combinada severa ligada al cromosoma X (XSCID) en la que
no se produce un desarrollo normal de clulas T debido a la falta de una cadena transductora
funcional por mutaciones en la cadena gamma.
Otro mecanismo que explicara la redundancia de las citocinas es el hecho de que no
exista una elevada especificidad de unin entre una citocina y su receptor como es el caso de las
quimiocinas y sus receptores. Muchas de ellas tienen efecto quimiotctico sobre un mismo tipo
celular lo que puede ser explicado porque comparten un mismo receptor.
La pleiotropa es otra caracterstica funcional de las citocinas ya que algunas realizan
mltiples funciones diferentes en distintos tipos celulares. El empleo de varias rutas de
sealizacin as como la activacin de mltiples cinasas y factores de transcripcin que tiene lugar
como consecuencia de la unin de las citocinas a sus receptores puede explicar la diversidad
funcional de las mismas.
RECEPTORES SOLUBLES
Adems de existir como protenas de membrana, muchos receptores de citocinas son
sintetizados como protenas solubles. La existencia de estos receptores ha modificado en gran
manera el conocimiento sobre la interaccin citocina-receptor y la regulacin de las distintas
funciones de las citocinas. A nivel molecular, los mecanismos ms comunes de generacin de las
formas solubles de los receptores son la rotura proteoltica del receptor expresado en la membrana
y el procesamiento alternativo del ARNm (Tabla 9.7). El receptor soluble del CNTF (sCNTFR) se
forma por un mecanismo de rotura lpidica y en el caso de la forma soluble del receptor de la IL-6
(sIL-6R), no se conoce su mecanismo de generacin.
Los receptores solubles pueden ejercer varios efectos biolgicos (Figura 9. 4) si bien el
ms comn es el de antagonistas de su receptor equivalente en la membrana mediante competicin por la unin con el ligando para prevenir la sealizacin al interior de la clula. Receptores
solubles de este tipo son, por ejemplo, los de la IL-1, IL-4 y TNF-alfa ya que producen una
inhibicin dosis dependiente de la funcin del receptor de membrana. Cuando los receptores
solubles se generan por proteolisis de los receptores de membrana, disminuye el nmero de
receptores funcionales a los que se puede unir la citocina en la superficie celular y por tanto,
tambin se produce una inhibicin en la sealizacin al interior de la clula.
Adems de las funciones inhibidoras de los receptores solubles, se ha comprobado que,
en algunos casos, estos receptores pueden facilitar la sealizacin inducida por la unin con su
citocina en clulas que no expresen el receptor funcional completo de membrana. Este mecanismo
se ha observado en las formas solubles de receptores (Figura 9.13).
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ACTIVACIN DE LINFOCITOS T
INTRODUCCIN
La activacin de los linfocitos T se produce tras el reconocimiento por parte del
TCR/CD3 de la molcula HLA y el pptido presentado por la misma junto con otros procesos,
como son la activacin de ciertas molculas accesorias presentes en su membrana. Tambin
en este proceso de activacin se hace mas eficiente si los linfocitos reciben el estimulo de
ciertas citocinas mediante su unin a los receptores especficos presentes tambin en la
membrana de estos linfocitos.
Una vez activados los linfocitos T, estos prioritariamente producirn citocinas o factores
+
+
citotxicos, segn se trate de linfocitos T CD4 o CD8 . De esta manera se desarrollar la
+
respuesta inmune. Los linfocitos T CD4 colaborarn en la posterior activacin de otras clulas,
+
+
tales como NK, T CD8 , linfocitos B o macrfagos. A su vez los linfocitos T CD8 tras su
activacin ejercern su funcin citotxica destruyendo clulas blanco (Figura 10.1).
Fenmenos de interaccin celular.
El proceso de reconocimiento vara si el receptor de la clula T est formado por el
+
+
heterodmero alfa/beta (clulas T alfa/beta CD4 o CD8 ) o si es del tipo gamma/delta (clulas
Tgamma/delta CD4 /CD8 ), ya que en estas ltimas no existe funcin coestimuladora por parte
de las molculas accesorias CD4 y CD8 (no se puede producir la unin MHC-CD4 o MHCCD8). Como se dijo anteriormente, las molculas de histocompatibilidad "no clsicas" pueden
presentar pptidos antignicos a los receptores gamma/delta.
En muchos casos la unin del antgeno con el TCR no es suficiente para dar lugar a
una respuesta inmune eficaz. Para que esta respuesta se lleve a cabo se requiere la
participacin de una serie de molculas conocidas globalmente como accesorias, y cuya
funcin es precisamente la de contribuir al desarrollo de una respuesta inmune efectiva
facilitando la interaccin entre las distintas clulas. Se forma as lo que se viene en denominar
sinapsis entre linfocitos T y clula presentadora de antgeno (Figura 10.2). Las principales
molculas que estn implicadas en este fenmeno de reconocimiento son el CD4, CD8, CD2,
CD45 y CD28 y sus ligandos respectivos. Todas estas molculas de adhesin tambin juegan
un importante papel en la transduccin de seales y activacin de la clula T. En la Figura
10.3 se recoge un esquema de las distintas posibilidades de activacin de los linfocitos T segn
las molculas que intervienen en los procesos de reconocimiento y adhesin intercelular.
Molculas CD4 y CD8.
Las molculas CD4 y CD8 son glicoprotenas cuyos ligandos naturales son las
molculas del MHC de clase II y de clase I respectivamente. La molcula CD4 pertenece a la
superfamilia de las inmunoglobulinas y esta formada por una sola cadena. La molcula CD8
pertenece tambin a la superfamilia de las Igs, pero su estructura difiere considerablemente de la
anterior, al estar formada por dos cadenas homlogas, alfa y beta, que pueden formar
heterodmeros o, en menor proporcin, homodmeros (alfa/alfa).
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fosforiladas en residuos tirosina, as su funcin esta regulada por procesos fosforilacindesfosforilacin de estos aminocidos. Por este motivo, un dominio SH2 puede interactuar con
una fosfotirosina adyacente en la misma o en otra molcula. Cuando es sobre la misma
molcula contribuye al control de su propia actividad enzimtica. En otras ocasiones, la enzima
con el dominio SH2 interacciona a travs de dicho motivo con otras protenas previamente
fosforiladas en tirosina por otra cinasa.
Esta interaccin es responsable de su activacin y de la de otros substratos. Este es el
caso de la enzima ZAP-70 que se activa cuando a travs de sus dominios SH2 se une a las
cadenas que han sido previamente fosforiladas por c-fyn o c-lck. ZAP-70 desempea un papel
crtico en el mantenimiento de la cascada de seales que se pone en marcha tras el
reconocimiento del antgeno por el TCR. En este sentido, esta enzima es un acoplador de
seales desde la superficie celular al ncleo por fosforilacin de los adaptadores Lat y SLP-76.
Lat es una protena transmembrana cuya funcin, una vez fosforilada, es organizar complejos
multimoleculares en determinados subdominios lipdicos de la membrana plasmtica. Estos
complejos contienen protenas claves en la sealizacin al interior de la clula como son la
PLC-gamma1 (fosfolipasa C), el Grb-2 (growth factor binding protein), SLP-76, la PI3K y Vav-1
FOSFATASA CD45
El CD45, LCA (Antgeno comn leucocitario) o T200 es una de las glicoprotenas ms
abundantemente expresadas en la superficie de clulas hematopoyticas, pudindose detectar
hasta un milln de molculas por clula El CD45 presenta una larga regin citoplasmtica que
contiene dos dominios catalticos con actividad fosfatasa, una regin intra-membrana y una regin
aminoterminal extracelular que se encuentra glicosilada y que vara en su estructura. Esta
variedad ha sido explicada despus del clonaje e identificacin del gen que, codificada dicha
protena, el cual gracias a que puede transcribir de forma alternativa los tres exones (A, B y C) que
codifican la porcin aminoterminal de la protena. Esta transcripcin alternativa puede generar
hasta ocho diferentes ARN mensajeros que traducen al menos seis diferentes isoformas del CD45
en la membrana celular (Figura 10.7).
El ligando del CD45 no se conoce y la existencia de estas diferentes isoformas pueden
indicar que los ligandos del CD45 sean mltiples y medien diferentes funciones en diferentes
subpoblaciones de linfocitos T.
Diferentes sistemas experimentales han demostrado que el CD45 juega un papel
predominante en los procesos de activacin celular mediados por la ocupacin del TCR. Aunque
terica, la funcin que ms frecuentemente se atribuye al CD45 es la de defosforilar la tirosina de
regulacin negativa de c-lck y c-fyn, con lo que estas cinasas se activaran autofosforilndose y
fosforilando con toda probabilidad otros substratos prximos (como la cadena del CD3). No
obstante, el CD45 podra defosforilar tambin a la tirosina de c-lck y c-fyn previamente
autofosforilada conduciendo a una inhibicin de estas cinasas.
Aunque estos modelos son hipotticos, se acumulan continuamente evidencias de que el
CD45 pude regular positiva o negativamente los procesos de activacin celular. En este ltimo
caso es importante destacar que la regin citoplasmtica del CD45 puede ser fosforilada
va Protena Cinasa C (PKC) en residuos serina y como se ver a continuacin en el tiempo es
posterior a los procesos de fosforilacin en tirosina descritos anteriormente por lo que es posible
que esta fosforilacin de CD45 sea necesaria para inducir su actividad fosfatasa de regulacin
negativa. En la Figura 10.8 se muestra la estructura de una tirosin cinasa p56.
PLC-gamma-1
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Despus del reconocimiento antignico por parte del TCR esta PLC-gamma-1, se fosforila
en tirosina y se activa dentro de los complejos multimoleculares lipdicos de la membrana
plasmtica donde induce la hidrlisis de su substrato especfico, el fosfatidilinositol bifosfato
(PIP2), generndose los metabolitos inositol trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG) (Figura 10.9). El
IP3 se une a un receptor especfico (IP3R) localizado en unas estructuras especficas del retculo
endoplsmico facilitando la liberacin del calcio intracelular de sus compartimentos y aumentando
la concentracin de estos iones en el espacio libre intracelular. El IP3, posiblemente en conjuncin
con su metabolito, el IP4, puede regular los canales de calcio de la membrana plasmtica
permitiendo la entrada de calcio del exterior al interior celular.
El calcio intracelular puede estimular la enzima calmodulina, que es una serina/treonina
cinasa que puede activar a su vez a la fosfatasa calcineurina. Adems de la activacin del sistema
calmodulina/calcineurina, los niveles altos de calcio intracelular tambin ayudan a la activacin de
otras cinasas como son algunas isoenzimas de las protena cinasas C (PKC) y posiblemente
algunas cinasas activadas por mitgenos (MAPKs). El otro metabolito de la hidrlisis del PIP2,
el diacilglicerol es el principal responsable de la activacin de las enzimas protena cinasas C.
PROTEINA CINASAS C
Las protena cinasas C (PKCs) son una familia de isoenzimas que estn ampliamente
distribuida en tejidos y rganos de mamferos. Esta familia de serina/treonina protena cinasas
est constituida por varias subfamilias que engloban distintas isoformas. Hasta el momento, se
conocen 11 isoenzimas de PKC diferentes, clasificadas segn su estructura y necesidad de
cofactores para su activacin. Aunque todas las isoformas de PKC se activan mediante
fosfolpidos, estas isoenzimas en particular se diferencian marcadamente en su sensibilidad
hacia el calcio. Teniendo en cuenta este factor, podemos clasificar estos 11 genes de PKC de
mamferos conocidos hasta ahora en las siguientes subfamilias:
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GAP-RAS
La familia de los proto-oncogenes Ras comprende al menos tres genes que codifican
otras tantas protenas denominadas Ha , Ki y N-Ras, que juegan un papel crtico en el control de la
proliferacin celular.
Las tirosinas cinasas activadas por la ocupacin del TCR no solamente inducen la
hidrlisis de fosfolpidos, sino que tambin activan vas de sealizacin a travs de Ras y
mediadas por Lat. Este adaptador fosforilado por ZAP-70 se une a otro adaptador intermediario
(Grb-2) que contiene dominios SH2 y SH3. Este ltimo se une a protenas especficas
fosforiladas en tirosina a travs de su dominio SH2 y a una protena de intercambio de
nucletidos de guanina (Sos) mediante su dominio SH3. La protena de intercambio acta
entonces sobre la forma inactiva de Ras (ras-GDP) convirtindola en su forma activa (RasGTP), el cual se une y retiene a c-Raf cerca de la membrana plasmtica. Esta accin mediada
por Ras, hace que Raf se active y acte como una cinasa de MAPK (MAPKK) que a su vez
activa y fosforila una o ms MAPKs, incluyendo a ERK-1 y ERK-2, las cuales tras dicha
activacin migran al ncleo donde regulan por fosforilacin a determinados factores de
transcripcin involucrados en la proliferacin y diferenciacin celular. La inactivacin de Ras
GAP
(Ras-GTP) se debe a la accin de la protena p120
o protena activadora de GTPasa que es la
responsable de hidrolizar el GTP unido a Ras y convertirlo en GDP (Ras-GDP) por lo que se la
puede considerar como un regulador negativo de Ras. Esta cascada de sealizacin termina con
la fosforilacin de determinados factores de transcripcin que participan en la activacin y
funcionalidad de los linfocitos T (Fig. 10.9).
'
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todos los tipos celulares y est implicado en la activacin de multitud de genes en respuesta a
inflamacin, infeccin y otras situaciones de stress que requieren una rpida reprogramacin
de la expresin gnica..
Este factor de transcripcin est formado por una familia de protenas que presentan una
alta homologa entre ellas y que est compuesta principalmente por las protenas p50, p52, p65,
RelB, y c-rel. Estas protenas pueden estar formando distintos complejos entre ellas siendo los
mas comunes p50/p50 y p50/p65. Los distintos complejos tienen distintas afinidades por los sitios
de unin al DNA y posiblemente tengan diferentes actividades transactivadoras. Esto se puede
entender por el hecho de que la regin de DNA que se una a NF-kB es GGGRNNYYCC, este
decmero palindrmico no es exactamente igual en todos los genes que contienen una regin NFkB y as, estas pequeas diferencias pueden ser las responsables de las diferentes afinidades de
los complejos NF-kB/rel por el DNA.
Los complejos de NF-B se encuentran retenidos en el citoplasma por molculas
llamadasinhibidores de NF-B o IB. Dos de las ms estudiadas en linfocitos T son IB-a e IB-b
que en condiciones de reposo estn unidas a los dmeros de NF-kB enmascarando as su
seal de localizacin nuclear (NLS), previniendo de esta forma el desplazamiento de NF-kB al
ncleo La activacin de linfocitos T va TCR/CD3, IL-1 o TNF entre otros estmulos extracelulares
inducen una cascada de cinasas y proteasas que median la degradacin de IB por un proceso
combinado de fosforilacin, ubiquitinacin y proteolisis, como consecuencia del cual se producen
la liberacin de NF-B/rel y su translocacin al ncleo (Figura 10.9).
Adems de participar en la transcripcin de la IL-2 y de su receptor se ha demostrado que
NF-B puede trans-activar tambin un amplio nmero de genes en linfocitos T como son la cadena
beta del TCR, genes HLA de clase I y clase II, beta-2-microglobulina, molculas de adhesin como
ICAM-1, otras linfocinas como IL-6, IL-8 y el G-CSF, proto-oncogenes como c-myc y tambin se
une a las regiones promotoras (LTR) de virus como el HIV y HTLV-1.
La activacin de NF-kB representa el paradigma del control de protenas mediante un
proceso de ubiquitinacin y degradacin en el proteasoma integrado a la cascada de
fosforilaciones. Recientemente, ha habido un gran progreso en lo que concierne a la ruta de
seales de NF-kB, especialmente las relacionadas con las citocinas proinflamatorias, IL-1 y
tumor necrosis factor alfa.
Activador de protena 1 ( AP-1)
A diferencia de NF-KB, AP-1 (Activador protein 1) es un factor de transcripcin
exclusivamente nuclear que se activa por fosforilacin mediada por determinadas cinasas que se
translocan al ncleo e inducen en este factor una modificacin postranslacional que le hace activo.
El factor de transcripcin AP-1 (Activator Protein 1) est formado por protenas ubicuas
pertenecientes a las familias Jun (c-Jun, v-Jun, JunB y JunD), Fos (c-Fos, FosB,Fra1 y Fra2) o
ATF (ATF2 y ATF3) capaces de unirse a una secuencia consenso de ADN denominada TRE
(TPA response element, TGACTCA) regulando la transcripcin de alto nmero de genes que
incluye genes de citokinas proinflamatorias entre otros. Los miembros de las familias Jun o ATF
forman homodmeros o heterodmeros con los miembros de las otras dos familias, pero en el
caso de las proteinas Fos, stas solo forman heterodmeros. La integracin de las seales
transmitidas por las distintas MAPKs (ERK, p38, JNK) activadas tras la activacin del receptor
TCR provoca la unin de determinados factores de transcripcin (TCF, SRF) a los genes que
codifican para Fos y Jun, aumentando su presencia en el ncleo. Posteriormente, Fos y Jun
son fosforilados por FRK y JNK respectivamente (cinasas reguladoras de Fos y Jun). De este
modo, ambos factores de transcripcin activados, dimerizan y se unen a regiones especficas
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de los promotores de genes como la IL-2 y otros genes que participan en la respuesta inmune
e inflamatoria (Figura 10.9).
Factor nuclear de clulas T activadas ( NF-AT).
La familia de protenas NF-AT (Nuclear Factor of Activated T cells) est constituida al
menos por cuatro miembros NF-AT1/p, NF-AT2/c, NF-AT3, y NF-AT4/x, presentando cada uno
de ellos, excepto NF-AT3, varias isoformas probablemente derivadas de splicing (corte y
empalme) alternativo del mismo gen. Todas las isoformas presentan dos regiones de
secuencia homlogas entre ellas, el dominio de unin al ADN (DBD) y la regin homloga para
NF-AT (NHR). El DBD, comprendido aproximadamente entre los aminocidos 400 y 700, es la
zona ms conservada entre los miembros de la familia NFAT. La regin NHR constituye el
dominio principal de transactivacin de la protena y es el sitio de anclaje donde se une la
fosfatasa calcineurina, que cuando se activa defosforila mltiples residuos fosforilados de esta
zona, controlando as la translocacin nuclear de NF-AT. En un principio NF-AT se identific en
clulas T como un complejo rpidamente inducible que se una al elemento distal de respuesta
a antgeno en el promotor del gen de la IL-2. Su induccin requiere la sealizacin por calcio y
se inhibe con drogas inmunosupresoras como CsA y FK506, que inhiben la actividad fosfatasa
de la calcineurina. El complejo NF-AT activo unido al ADN est formado por un componente
citoslico presente en clulas T y por un componente nuclear ubicuo. El componente citoslico
est constituido por los miembros de la familia NF-AT mientras que el componente nuclear est
formado por miembros de la familia Fos y Jun que constituyen el factor de transcripcin AP-1.
En los ltimos aos se ha identificado la existencia de miembros de la familia NF-AT en otras
clulas del sistema inmune distintas a los linfocitos T y donde tambin regulan la expresin de
numerosos genes de citocinas (IL-4, TNFalfa y GM-CSF) y de receptores de superficie (FasL,
CD40L). La expresin de NF-AT3 y NF-AT4 tambin ha sido descrita en clulas fuera del
sistema inmune, lo que explicara en parte los efectos secundarios de la CsA fuera del sistema
inmune.
Como se ha comentado anteriormente, la activacin fisiolgica del TCR da lugar a la
++
movilizacin de Ca y con ello la activacin de la fosfatasa calcineurina que defosforila a
NFAT, altamente fosforilado en clulas T en reposo. La translocacin al ncleo, el aumento de
afinidad para unirse al ADN y la induccin de la actividad transcripcional de NF-AT estn
regulados por esta defosforilacin. La asociacin fsica entre la calcineurina y NFAT sigue
incluso en el ncleo donde la calcineurina sigue defosforilando al factor mientras los niveles de
calcio intracelulares sigan altos. En gran parte las secuencias de reconocimiento para NF-AT
necesita de la cooperacin de protenas AP-1 para transactivar dichos genes. Adems, esta
interaccin entre AP-1 y NFAT con el ADN, confiere al complejo NFAT/AP1:ADN una
estabilidad 20 veces superior a la que presentan los complejos NFAT:ADN. Por tanto las rutas
de sealizacin que convergen en la activacin de AP-1 van a afectar la actividad
transcripcional mediada por los complejos NFAT/AP-1.
ACTIVACIN DE LINFOCITOS B
INTRODUCCION
Los linfocitos B son clulas especializadas que poseen receptores con distribucin
clonal que tras interaccionar con su ligando especfico (antgeno) secretan inmunoglobulinas
(Ig) denominadas ahora anticuerpos (Ac). En su biografa hay que distinguir dos fases:
1.
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2.
Los linfocitos B memoria adems de haber perdido la mIgD (al menos la mayora de
ellos), en virtud del mecanismo de recombinacin de los genes de la parte constante (genes C)
de las Ig, han cambiado la regin constante de su mIg, de forma que en lugar de expresar
mIgM, expresan mIgG o mIgA o mIgE o combinaciones de mIgM/mIgG o mIgM/mIgA o incluso
mIgM/mIgG/mIgA. Esas mIg siguen expresando el mismo tipo de cadenas ligeras y las mismas
regiones VH y VL, aunque levemente modificadas por la aparicin de cambios puntuales (hasta
diez) en ciertos aminocidos de las regiones determinantes de la complementariedad, lo quein
vivo causan una mayor afinidad del anticuerpo por el Ag. Esos cambios se deben al fenmeno
de hipermutacin somtica de los genes que codifican las regiones VH y/o VL (vaseEstructura
y gentica de las Ig). Los linfocitos B memoria son los precursores inmediatos de las ASC
productoras de IgG o IgA o IgE de la respuesta secundaria, y se generan en el centro
germinal (vide infra, Respuesta de anticuerpos). Aparte de las diferencias de las mIg, no hay
ningn marcador conocido que permita distinguir de forma inequvoca, clulas B memoria de
los linfocitos B primarios (Figura 11.1).
REPERTORIO DE ESPECIFICIDADES DEL ANTICUERPO
El hecho de que los genes V de las Ig se distribuyen clonalmente, es decir, que cada
linfocito B exprese una nica regin VH y una nica regin VL y por tanto una nica
especificidad antignica distinta de la expresada por los otros linfocitos B, constituye el punto
esencial de la teora de la seleccin clonal, segn la cual el Ag exgeno se une (selecciona) a
los linfocitos B cuyas Ig de membrana sean especficas (complementarias) para l. El repertorio
o catlogo de especificidades anticuerpo distribuidas entre los linfocitos B recientemente
formados y que no han tenido contacto todava con el Ag exgeno, se denomina repertorio
primario o preinmune. Los segmentos de genes VH y VL expresados por las clulas B
primarias, tal como se vea en el captulo 5, se hallan en configuracin germinal (no han
experimentado hipermutaciones somticas, como ocurre tras la respuesta al Ag) y su repertorio
surge de los mecanismos recombinatorios de los distintos segmentos gnicos VH DH y JH
(cadena pesada) y VL y JL (cadena ligera) usados, as como del ensamblamiento de una
region VH con una regin VL para formar una zona comn de unin al Ag. Esas posibilidades
combinatorias pueden determinar un repertorio potencial que parece tender al infinito,
8
9
calculndose que, en el ratn, pueda ser de 10 10 . Ello garantiza que cualquier Ag exgeno
de los mltiples (potencialmente millones) presentes de forma natural o artificialmente creados
por el hombre, que entre en el organismo pueda tener oportunidad de encontrar (seleccionar),
aunque sea en muy bajas proporciones, linfocitos B que lo reconozcan. Sin embargo, por
estudios de frecuencia de clulas B especficas contra antgenos definidos (hapteno-portador)
6
7
se infiere que el repertorio realmente utilizado parece ser mucho menor (10 -10 ).
RECEPTOR DE CELULAS B (BCR).
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Las cadenas m libres, es decir no unidas a cadenas ligeras, aunque estn codificadas
con los exones apropiados para expresarse en la membrana, no pueden hacerlo. Para ello,
adems de su ensamblamiento a las cadenas ligeras, se requiere la expresin del
heterodmero Ig-alfa e Ig-beta. Las cadenas m producidas por las clulas pre-B tardas (cuando
todava no se han reordenado los genes V de las cadenas ligeras) quedan retenidas en el
retculo endoplsmico unidas a la protena copuladora de las Ig (BiP) una
molcula carabina (que es idntica a la protena grp78), donde se degradan. Recientemente se
ha visto que una pequea parte de las cadenas m de las clulas pre-B no quedan retenidas en
I n m u n o l o g a O n l i n e | 94
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madura hacia ASC. Ello llevo a hipotetizar que las clulas B necesitaban dos seales para su
diferenciacin terminal, una proveniente del puenteo de la Ig de membrana y otra segunda
seal proveniente de alguna clula accesoria.
Segunda seal. Papel de los linfocitos T
Los experimentos que involucraban a las clulas T en la diferenciacin de clulas B tienen
su base en experimentos muy antiguos de cooperacin entre clulas provenientes de mdula
sea (linfocitos B) y timo (linfocitos T). Estos experimentos se interpretaron bajo la hiptesis de
que las clulas B eran capaces de producir anticuerpos pero para ello requeran el auxilio de
clulas T. Veamos la naturaleza de esta segunda seal:
2. Molculas de membrana. Se ha demostrado que tanto los linfocitos B como las clulas
T que han reconocido antgeno expresan en su membrana transitoriamente molculas
de activacin, con ligandos recprocos. As, las clulas B expresan las molculas de
activacin CD80 y CD86 que interaccionan con CD28 presente en linfocitos T mientras
que la molcula de activacin de linfocitos T CD40-L se une a CD40 presente en
linfocitos B.C) Cooperacin entre factores solubles y molculas de activacin. Diversos
abordajes experimentales han demostrado que las molculas de activacin presentes
en linfocitos T y B activados con ligandos recprocosunidas a la secrecin de
interleucinas por linfocitos T son las seales que hacen diferenciarse a linfocitos B que
han contactado con el antgeno y por tanto constituyen conjuntamente la segunda
seal.(Figura 11.5).
Cooperacin linfocitos T y B.
Veremos separadamente los procesos relacionados con la activacin de linfocitos T y despus de
linfocitos B.
Activacin de linfocitos T.
Al igual que los linfocitos B, las clulas T necesitan el puenteo de su receptor
antignico para la modificacin de su fisiologa y con ello la ganancia de ciertas funciones que
antes no tena, tales como secrecin de factores solubles, expresin en membrana de
molculas de activacin, etc. El receptor de linfocitos T no reconoce, tal y como lo hacen los
linfocitos B, una enorme variedad de estructuras moleculares (incluyendo hidratos de carbono)
sino que est sesgado para el reconocimiento de molculas del complejo principal de
histocompatibilidad (MHC) debido a un proceso de seleccin que tiene lugar en el timo. Las
molculas codificadas en el MHC son capaces de alojar pptidos en un hendidura que aparece
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segundas seales que permitiran la diferenciacin terminal de estas clulas B que secretaran
inmunoglobulinas anti-hapteno
Dado que los linfocitos T han sufrido un proceso de seleccin en timo por el que se han
seleccionado aquellos con una cierta afinidad por molculas MHC propias y considerando que
previamente han reconocido el antgeno (ms exactamente un pptido de l) en el contexto de
molculas MHC propias presentes en la clula accesoria presentadora de antgeno, es lgico
que las clulas T slo cooperan con clulas B que hayan unido el antgeno y lo hayan
presentado en molculas MHC idnticas a las presentes en clulas dentrticas, que en
coondiciones fisiolgicas son tambin las presentes en clulas T. Como las molculas MHC
son polimrficas en poblaciones, las clulas B, T y dentrticas deben expresar el mismo alelo
MHC al que se une el pptido para cooperar entre s, fenmeno por ello denominado
restriccin allica HLA.
Otras vias de activacin de clulas B.
Entre estas vas destacan las son antgenos T independientes de aquellas que son antgeno T
dependientes, segn el grado de necesidad de que participen estos linfocitos en la respuesta inmune.
Antgenos T independientes.
Algunos antgenos son capaces de despertar una respuesta de anticuerpos en
ausencia de clulas T. Este tipo de antgenos se ha dividido en dos grupos, los denominados
antgenos T independientes 1 (TI-1) o 2 (TI-2). Los antgenos TI-1 son antgenos de la pared
bacteriana que inducen una diferenciacin policlonal de clulas B murinas independiente de la
especificidad de su receptor clonotpico, ya que este no interviene en el reconocimiento. El
ejemplo clsico en el modelo experimental murino es la respuesta a LPS (Figura 11. 7).
Por el contrario, los antgenos TI-2 son estructuras repetids, normalmente hidratos de
carbono, que son reconocidos por el receptor B. Las caractersticas moleculares de los Ag TI-2
hacen que se produzca un puenteo de varias molculas de Igs (un nmero crtico parece ser
de 12-16). Este puenteo masivo local favorece la activacin de linfocitos B, an en la ausencia
de una interaccin T:B membrana-membrana. Cmo ya hemos desarrollado, los hidratos de
carbono no puede activar clulas T al no contener aminocidos en su estructura molecular. As,
el puenteo masivo de Igm por antgenos TI-2 provoca un estado de activacin en el linfocito B,
en el cual los contactos membrana-membrana con linfocitos T no son necesarios. Sin embargo
parece que factores solubles producidos por clulas T o no T (mastocitos) s juegan un cierto
papel en este tipo de respuesta.
Tanto los antgenos TI-1 como TI-2 se encuentran sobre todo en bacterias, sugiriendo
que la respuesta antibacteriana pueda tener un componente T independiente. Este parece ser
el caso, ya que las inmunodeficiencias T genticas o adquiridas no suelen asociarse a un
aumento exagerado de infecciones bacterianas. De hecho, recientemente se ha descrito la
activacin policlonal de linfocitos B tras su interaccin con DNA bacteriano en un proceso en el
que no interviene el BCR, por lo que este DNA podra considerarse un antgeno TI-1.
Es de destacar que en general, los epitopos reconocidos por las clulas B no
corresponden a los reconocidos por los linfocitos T (Figura 11. 8). Una vez que las clulas B
se activan adecuadamente, stas se transforman en clulas plasmticas (Figura 11. 9) o en
clulas memoria que por su situacin de preactivadas responden con gran eficacia en
estmulos posteriores.
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ACTIVACION DE CLULAS NK
INTRODUCCION
La funcin citotxica de las clulas NK fue la primera accin asignada a estas clulas y
el motivo de su descubrimiento (Tabla 12.2). Para que las clulas NK ejerzan su funcin
citotxica se requiere la identificacin, a travs de los receptores implicados, de las clulas blanco.
Entre estos receptores destacan receptores de activacin y otro grupo recientemente descrito de
receptores que tienen como ligando molculas de histocompatibilidad clase I y que pueden ser de
tipo inhibidor o activador (Figura 12.1). En este fenmeno adems intervienen ciertas citocinas y
molculas de adherencia facilitadoras de la interaccin celular.
Mediante la accin citoltica, las clulas NK pueden destruir un amplio espectro de
clulas, tanto anormales (infectadas por virus o tumorales) como incluso normales (alognicas).
Esta lisis se realiza de manera directa, lisis natural, o bien mediante la participacin de
anticuerpo,citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos o ADCC (Figura 12.2).
La citotoxicidad natural consiste en lisis de una gran variedad de clulas de manera
espontnea y sin necesidad de un periodo de sensibilizacin previa. De ah la denominacin dada
de NK (de natural killer) debido a que la capacidad citoltica que presentan lo hacen, a
diferencia de las clulas T citotxicas, de una manera natural, esto es sin necesidad de un
aprendizaje preliminar. Esto implica que estas clulas no requieren un proceso de preparatorio
de activacin para destruir clulas en los trminos que lo hacen los linfocitos T citotxicos,
pero sin duda la activacin por clulas blanco o por citocinas hace que esta funcin sea mas
eficiente.
Krre y cols. observaron que variantes de una misma lnea celular tumoral
manifestaban distinto grado de sensibilidad a la lisis NK, que se correlacionaba inversamente
con la expresin de molculas de clase I del MHC (Figura 12.3). Por otra parte, la transfeccin
de clulas diana con molculas del MHC-I les confera resistencia. Los autores propusieron la
teora de missing self para explicar los fenmenos de citotoxicidad natural. As hoy se
considera que pese a que las clulas NK son responsables de mecanismos de citolisis
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inespecfica no restringida por el MHC, se sabe que la funcin de las clulas NK est regulada en
parte por el reconocimiento de molculas MHC de clase I (MHC-I) en la clula diana.
La citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC), implica la presencia de
anticuerpos que son reconocidos por su extremo Fc por los receptores CD16 presentes en las
clulas NK y tambin en otras clulas, como son los macrfagos. Cuando el CD16 reconoce su
ligando activa la maquinaria ltica de la clula NK.
FUNCIN SECRETORA DE LAS CLULAS NK
Hoy se sabe que las clulas NK mas positivas para el CD56 (CD56
) poseen mayor
dim
capacidad para producir citocinas que las clulas mas dbiles para esta molcula (CD56 ). A
dim
bright
su vez las clulas NK CD56 poseen mayor capacidad citotxica que las CD56
.
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NKp46,
NKp44 y
NKp30.
3. Adems existe otro grupo de receptores que son heterodmeros formados por la
asociacin de dos molculas diferentes con dominio lectina tipo C como es el CD94
que se puede unir a miembros de las superfamilia de molculas NKG2. Estos
receptores pueden tener accin inhibidora, que es como originariamente se
descubrieron, pero pueden poseer tambin accin activante de acuerdo con la
estructura de la parte citoplasmatica de sus molculas.
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molculas HLA. En la tabla 12.6 se recoge una lista de estos receptores y las molculas que
reconocen (Figura 12.6).
Segn el nmero de dominios presentes en la molcula del receptor a la palabra KIR,
se aaden los sufijos 2D y 3D que indican el nmero de los dominios de inmunoglobulina que
poseen y la letra L (long) o S (short) segn que la cola citoplasmtica de estas molculas sea
larga o corta respectivamente (Tabla 12.6). Estos receptores pueden ser de tipo inhibidor o de
tipo activante. En este ltimo caso estos receptores se asocian de manera covalente con la
molcula DAP-12.
La distribucin de estos receptores en las clulas NK no es homognea y cada clon NK
puede expresar uno o varios tipos de estos receptores. Se aprecian claras diferencias en la
expresin de cada receptor cuando se estudian distintos individuos, y hay indicios en los que
el repertorio de receptores est regulado durante el desarrollo por factores genticos,
incluyendo presumiblemente la influencia del propio MHC. A estos receptores recientemente se
les ha dado la denominacin de CD158 seguido de una letra (ente a y k) segn el tipo de
receptor.En la Figura 12.7, se recogen los distintos tipos de receptores y las molculas que
reconocen y en la Figura 12.8 se recoge un modelo de la estructura tridimensional de esta
molcula unida a un antgeno de histocompatibilidad.
Los genes que codifican estos receptores se encuentran localizados en el cromosoma
19 en humanos en una en donde se codifican tambin los receptores ILTs, Fca y
NKp46 (Figura 12.9).
Receptores NK tipo ILT
Otro grupo de receptores, que tambin pertenece a la superfamilia de las
inmunoglobulinas, se conocen como ILTs (immunogloobulin like transcripts) o como
LIR (leukocyte Ig-like receptor).Alguno de estos receptores reconocen molculas HLA-G y la
protena UL18 (LIR1 y LIR2) del citomegalovirus humano y tiene una distribucin muy extensa
en diferentes tipos de clulas incluyendo no solo clulas NK sino tambin monocitos y ciertas
clulas de tipo polimorfonuclear (Tabla 12.7). A estos receptores recientemente se le ha dado
la denominacin de CD85 seguido de una letra (a-m) para definir el tipo de receptor .
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Tal como se ha indicado con anterioridad, tanto los receptores KIR, ILT como el
homodmero de CD94 con distintos miembros de la familia de NKG2, pueden ejercer acciones
inhibidoras como activantes. El que ejerzan una u otra accin depende de la cola
citoplasmatica de dichas molculas y de las cinasas con las cuales se asocien.
Mecanismos de inhibicin.
Los receptores inhibidores se caracterizan por poseer en sus dominios
intracitoplasmticos los motivos YxxL-26-YxxL, denominados ITIM (immunoreceptor tyrosinebased inhibitory motifs) (Figura 12.12). Estos motivos tienen la propiedad de unirse al dominio
SH2 que contiene las tirosin fosfatasas, SHP-1 y SHP-2, y as producir inhibicin de la
citotoxicidad. En la figura 12.13 se representan un ejemplo de cada uno de los dos tipos de
receptores, inhibidores y activadores.
Es de destacar que esta accin inhibidora ejercida por los receptores inhibidores
despus de reconocer a su ligando (HLA clase I) en la clulas tiene una gran importancia
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fisiolgica, pues esto previene la destruccin de las clula normales del husped. Esto se debe
a que, como se sabe, la mayora de las clulas del organismo expresan molculas de
histocompatibilidad clase, incluidas las molculas HLA-E. Precisamente cuando una clula deja
de expresar molculas de histocompatibilidad, entones pude ser destruida por las clulas NK al
no ser frenada su actividad por no actuar los receptores de tipo inhibidosr (Figura 12.14),
Estos mismos fenmenos has sido descritos para linfocitos T, en los que el efecto
activador mediado por el TCR-CD3, puede ser bloqueado por accin de un receptor de tipo
inhibidor(Figura 12.15). Los receptores de este grupo son KIR2DL, KIR3DL, ILT-2, NKG2A y
NKG2B.
Mecanismos de activacin.
Aunque los receptores de antgenos HLA se describieron primero como receptores de
tipo inhibidor por su capacidad de bloquear la citotoxicidad dependiente de clulas NK,
posteriormente se han encontrado receptores muy homlogos, que diferan solo en los
dominios intracelulares y que funcionaban induciendo seales de tipo activador. Estos
receptores poseen una parte citoplasmtica muy corta, carecen de la secuencias ITIMs y
tienen la propiedad de asociarse a las molcula DAP-12. Estos receptores son KIRD2S,
NKG2C, NKG2E y NKG2H.
El DAP-12 es un homodimero conocido tambin como KARAP (Killer activating
receptor associated protein), gracias al cual se lleva a cabo la transmisin de seales en el
citoplasma de la clula. La molcula DAP12 se caracteriza por contener en su parte
citoplasmtica un dominio conocido como ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activating
motif) y tiene la capacidad de unir las cinasas ZAP-70 y Syk.
ACTIVACION NK Y RESPUESTA INMUNE INNATA.
Las clulas NK forman parte de la primera barrera defensiva del individuo junto
con macrfagosy polimorfonucleares (Figura 12.16). Constituyen as parte de la respuesta
inmune innata. Ciertas citocinas que potencian el efecto de estas clulas son producidas
precisamente por macrfagos en las primeras fases de la infeccin (Tabla 12.9). Las clulas
NK actan destruyendo clulas (por ejemplo infectadas por virus) y produciendo citocinas y
quimiocinas, que intervienen regulando el sistema inmune y el proceso inflamatorio (Figura
12.17).
INMUNOPATOLOGIA DE LAS CLULAS NK.
Las clulas NK son de especial importancia en las primeras fases de la infeccin,
especialmente frente a virus, de ah que cuando estas clulas no actan correctamente, el
individuo se hace mas vulnerable a la infecciones virales. Por ejemplo en individuos infectados
por HIV-1, se ha podido comprobar que las clulas NK han disminuido su capacidad citoltica,
lo que puede explicar que el virus HIV-1 se desarrolle con mas facilidad. De igual manera ha
podido ser comprobado que las clulas NK infiltrantes de tumores poseen menor capacidad
citoltica que las clulas NK normales, probablemente por un aumento de expresin de
receptores de tipo inhibidor.
Por otra parte una excesiva capacidad citotxica de las clulas NK pueden inducir
estados de prdida de la tolerancia normal y contribuir al desarrollo de enfermedades de tipo
autoinmune.
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Recientemente se ha visto que las clulas NK, pueden ser utilizadas en terapia antitumoral. Para ello despus de su extraccin del individuo y cultivo con Il-2, IL-12 o IL-15, son
posteriormente reinyectadas en el enfermo en forma de clulas LAK (citokyne activated
lymphocytes). En enfermos con SIDA, tambin se esta tratando de potenciar la respuesta
inmune innata y en especial estas clulas NK, mediante la administracin de IL-2, con
resultados que son prometedores.
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C5b lo que permite, en uno y otro caso, poder entrar en la va terminal o ltica que conduce a la
lisis celular o bacteriana (Figura 13.1)
Una vez producida la activacin del complemento, toda la serie de reacciones
subsiguientes se llevan a cabo por un proceso multiplicador, de tal forma que, aunque la
activacin comienza por un nmero limitado de molculas, son muchos los factores con
actividad biolgica que aparecen en el curso de las reacciones. La accin de las molculas
puede ser local, en el sitio de su produccin, pero tambin puede ejercerse a distancia por
dispersin a otras zonas. Un esquema general de las reacciones del complemento en su
conjunto es complejo (Figura 13.2).
VIA ALTERNATIVA
Esta va es ms antigua desde el punto de vista evolutivo- que la clsica,
diferencindose adems de sta en que la va alternativa no necesita anticuerpos para
activarse, por lo que es un mecanismo de defensa importante en los estadios iniciales de la
infeccin cuando todava no se han sintetizado cantidades importantes de anticuerpos.
Funciona de forma continua a un bajo nivel y solo en presencia de determinados factores se
amplifica. Por ello, podemos distinguir dos situaciones para la va alternativa: en estado de
reposo y en estado de activacin.
La va alternativa en estado de reposo
En condiciones normales, en el plasma, el factor C3 se escinde continuamente y de
forma lenta, en un proceso que se denomina marcapasos de C3, dando lugar a C3b y
quedando as su enlace tioester interno expuesto. Si no se une a la superficie de algn
microorganismo C3b permanece en fase fluida y se combina con una molcula de agua,
quedando as su enlace tioester hidrolizado y el C3b inactivo (Figura 13.3) El factor B es
equivalente al factor C2 de la va clsica.
El factor D circula en la sangre de forma activada aunque no es perjudicial para el
organismo, debido a su baja concentracin. Este factor tiene actividad esterasa de tipo serina y
unindose al complejo C3bB rompe a B en una pequea fraccin, Ba, que se libera y en una de
mayor peso molecular, Bb, que se mantiene unida al complejo (C3bBb). Este complejo, que
permanece en la fase fluida, tiene actividad convertasa de C3 de la va alternativa, es decir que
puede degradar a C3 en dos fracciones: C3a y C3b, radicando la actividad proteoltica del
complejo en la molcula Bb.
El factor C3b puede unirse covalentemente mediante enlace ster o amida a las
membranas celulares (Figura 13.4), incluso a las propias, captando ms factor B y amplificando
el proceso, lo que permitira la entrada en la va ltica. No obstante, en condiciones normales o
de reposo, esto no ocurre ya que C3b tiene una vida media muy corta. Por otra parte, los
sistemas de regulacin que se comentarn ms abajo mantienen en un bajo nivel el
funcionamiento de este circuito.
Amplificacin de la va alternativa
Cuando C3b se une a las membranas de bacterias, hongos y parsitos, los
mecanismos de regulacin que bloquean la amplificacin en el estado de reposo no funcionan.
El factor C3b sobre estas membranas capta factor B formando el complejo C3bB sobre el que
acta el factor D liberando Ba y quedando el complejo C3bBb que tiene actividad convertasa
de C3, siendo Bb la molcula responsable de la actividad proteoltica. Esa convertasa libera
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su
Se inicia tras la unin Ag-Ac y siempre que el anticuerpo que participe en ello sea del tipo IgM
o IgG de las clases IgG1, IgG2 o IgG3. Los anticuerpos solubles o libres no activan el
complemento, solo se activa este sistema cuando se forman complejos antgenoanticuerpo (Ag-Ac). En el caso de la IgG, que es una Ig monomrica, se necesitan al menos
dos complejos Ag-Ac cercanos para que las fracciones Fc de la IgG unan y activen el factor C1.
En el caso de la IgM, al ser una molcula pentamrica, solo es necesario un complejo Ag-Ac.
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Las molculas C2, C4 y el factor B (Bf) estn codificadas por genes ubicados en el
cromosoma 6, entre los loci HLA-B y HLA-DR del Complejo Principal de Histocompatibilidad
humano (MHC, Major Histocom-patibility Complex). El resto de los componentes del sistema
del complemento no estn vinculados a HLA. Mientras que el factor B y C2 estn codificados
por un solo locus, existen dos loci que codifican C4, C4a y C4b.
Otros genes que codifican componentes del sistema complemento tambin se
encuentran agrupados. As en el brazo corto del cromosoma 1 del hombre se localizan los
genes que codifican las cadenas alfa y beta de C8 y las cadenas alfa y beta de C1q. Los
genes C6 y C7, que se han originado por duplicacin, se detectan en el cromosoma 5.
En el brazo largo del cromosoma 1 se encuentra la regin RCA (regulators of
complement activation) que contiene genes ligados que codifican distintas protenas
reguladoras: CR1, CR2, DAF, H, C4BP y MCP.
RECEPTORES PARA FACTORES DEL COMPLEMENTO
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Muchas de las funciones del complemento se llevan a cabo tras la unin de fragmentos
de algunos factores del complemento a receptores especficos presentes en la superficie de
varios tipos de clulas (Tabla 13.2). Los mejor conocidos son los que tienen como ligando a
fragmentos de C3.
CR1 (Receptor de complemento tipo 1, CD35).
Sus ligandos son los fragmentos C3beta, iC3beta y C4beta. Se encuentra sobre todo
en las clulas del sistema fagoctico mononuclear, en los neutrfilos, en los linfocitos T y B y en
los eritrocitos. En las clulas fagocitarias facilita la fagocitosis de partculas opsonizadas por
sus ligandos. En los eritrocitos facilita su unin a inmunocomplejos opsonizados por C3beta y
C4beta. Estos inmunocomplejos son retirados de la superficie de los hemates en el hgado y
bazo por los fagocitos. De esta forma los hemates quedan con sus receptores libre para
continuar el aclaramiento de inmunocomplejos de la circulacin (ver mas adelante).
CR2 (Receptor de complemento tipo 2, CD21).
Sus ligandos son C3b, la forma inactiva de ste, iC3b y sus fragmentos de
degradacin C3delta y C3deltagamma. Este receptor se encuentra en los linfocitos B, en las
clulas dendrticas foliculares y en algunas clulas epiteliales.
El CR2 se encuentra en las clulas B formando un complejo trimolecular junto con otras
dos protenas, CD19 y CD81. Este complejo es el llamado correceptor del linfocito B y enva
seales al interior de la clula B que facilitan su respuesta una vez unida al antgeno por su
receptor (inmunoglobulina + molculas Ig-alfa e Ig-beta).
En las clulas dendrticas foliculares CR2 sirve para atrapar en los centros germinales
complejos Ag-Ac opsonizados por iC3beta o C3deltagamma.
El CR2 es el receptor usado por el virus de Epstein-Barr para invadir a las clulas B.
Este virus es el causante de la enfermedad mononucleosis infecciosa y est relacionado con
tumores como el linfoma de Burkitt y el carcinoma nasofarngeo.
CR3 (Receptor de complemento tipo 3, Mac-1, CD11bCD18).
Se encuentra en fagocitos mononucleares, neutrfilos, clulas cebadas y NK. La
cadena beta de CR3 (CD18) se encuentra en otras dos molculas (LFA-1 y p150,95). CR3,
LFA-1 y p150,95 pertenecen a la familia de las integrinas.
El ligando de CR3 es iC3b por lo que participa en la fagocitosis de partculas
opsonizadas por este factor. Pero en los fagocitos y neutrfilos se une tambin a ICAM-1. Esta
molcula se encuentra en los endotelios por lo que facilita el anclaje de fagocitos a las clulas
endoteliales para posteriormente abandonar los vasos por diapdesis.
CR4 (CD11cCD18, p150,95).
Su ligando es tambin iC3b y probablemente la funcin de CR4 es similar a la de CR3.
CR4 es abundantemente expresado por las clulas dendrticas por lo que se usa como
marcador para identificarlas.
FUNCIONES DEL COMPLEMENTO
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Estas funciones se llevan a cabo por diferentes fracciones del complemento activas.
La tabla 13.2 muestra la accin fisiolgica de stas. Los factores activos frecuentemente
desarrollan su funcin conectando con distintos receptores de membrana. La Tabla
13.2 expone los receptores de membrana para las distintas fracciones del complemento.
Comentamos,
a
continuacin,
las
funciones
biolgicas
fundamentales.
Las
acciones anafilotxicas,quimiotxicas y opsonizantes del complemento lo convierten en un
factor fundamental en la potenciacin de la inflamacin, fenmeno bsico en la defensa frente
a la infeccin
Accin citoltica
Una vez puesta en marcha la cascada del complemento, si se forma el complejo final
C5b67, y sobre l se acopla la fraccin C8 y molculas de C9, se produce la lisis de las clulas
sobre cuyas membranas se ha adosado dicho complejo. La lisis se produce por la formacin de
mltiples poros formados por el complejo C5b6789 (Figura 13.10). Como se ha explicado
anteriormente, a este efecto se puede alcanzar por la unin del Ag-Ac (va clsica) o por la
activacin grmenes (va alternativa). Por uno u otro mecanismo se produce la lisis de gran
nmero de bacterias, tales como bacteridium, salmonella, shigella, escherichia, vibrio,
treponema y otras clulas. Todas estas acciones se agrupan bajo la denominacin conocida de
citotoxicidad dependiente del complemento.
Accin anafilotxica
Las fracciones C3a y C5a, conectando con receptores de membrana (C3aR,
C5aR, Tabla 13.2), ejercen una accin anafilotxica, esto es, poseen una potente accin
activadora sobre los mastocitos y basfilos que en consecuencia, liberan mediadores de la
inflamacin. Las sustancias vasoactivas liberadas incrementan la permeabilidad capilar, lo que
facilita la afluencia de leucocitos y molculas al foco inflamatorio.
Accin quimiotxica
Las fraccin C5a posee una potente actividad quimiotxica, que determina la atraccin
de leucocitos al foco inflamatorio.
Accin facilitadora de la fagocitosis (opsonizacin)
Los macrfagos y polimorfonucleares neutrfilos presentan
en
sus
membranas
receptores (CR1, CR3 y probablemente CR4, Tabla 13.2) capaces de unir la molcula C3b y
sus derivados resultantes de la activacin del complemento. De esta forma, si el C3b est
fijado sobre la superficie de un germen, los fagocitos pueden conectar con ste mediante los
receptores para C3b, facilitndose as, el fenmeno de la fagocitosis. Esta actividad facilitadora
de la fagocitosis se denomina opsonizacin. La fagocitosis de microorganismos dependiente de
C3b e iC3b es probablemente el mayor mecanismo de defensa frente a las infecciones
bacterianas (Figura 13.11).
Otra funcin de especial importancia ligada a la capacidad inductora de la fagocitosis
de cierto factores del complemento es la de aclaramiento de inmunocomplejos.
Aclaramiento de inmunocomplejos
En condiciones normales, se pueden detectar inmunocomplejos solubles circulando en
sangre. Estos inmunocomplejos son potencialmente peligrosos, pues de precipitar en algn
tejido activaran el complemento e iniciaran un foco inflamatorio. No obstante, existe un
mecanismo fisiolgico de aclaramiento de inmunocomplejos. Los eritrocitos, las clulas ms
abundantes de la sangre, presentan CR1 en su membrana y mediante este receptor captan
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inmunocomplejos circulantes a travs del factor C3b. Cuando los hemates atraviesan el hgado
o el bazo, los macrfagos de estos rganos, mediante sus receptores CR1, CR3 o CR4, unen
los inmunocomplejos a travs de C3b (o mediante receptores para Fc a travs de IgG) y los
fagocitan. Los eritrocitos quedan libres para captar nuevos inmunocomplejos (Figura 13.12)..
Accin reguladora de la respuesta inmune
El factor C3b tiene importantes funciones reguladoras de la respuesta inmune. As, el
C3b o sus derivados (C3d), unido a membranas facilita la cooperacin entre las clulas
inmunes y acta en la estimulacin de las clulas T y B probablemente debido a su capacidad
de promover la adhesin clula-clula.
Las clulas presentadoras del antgeno tienen receptores para el complemento, lo que
permite su conexin con el antgeno para su posterior presentacin.
MECANISMOS DE REGULACION DEL COMPLEMENTO
Inhibicin de C3
La regulacin de C3, al ser ste el factor central en la activacin del complemento, es
probablemente el mecanismo de regulacin ms importante.
El factor H (FH) es una protena plasmtica homloga a la C4BP que tiene la capacidad
de unir C3b en la fase fluida. El Factor I ataca entonces C3b liberando una pequea fraccin
C3f y convirtindolo en iC3b. Por otra parte FH tambin promueve la disociacin del complejo
C3bBb. Un defecto en este tipo de regulacin acontece en un tipo de glomerulonefritis
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(membranosa tipo II), en la que aparecen autoanticuerpos (factores nefrticos) que se une al
complejo C3bBb, estabilizndolo y hacindolo resistente a la accin de FH.
Los receptores de membrana CR1, DAF y MCP actan sobre el C3b de forma
semejante a su actuacin sobre C4b: inhiben la unin o facilitan la disociacin C3bBb (CR1,
DAF) o actan como cofactores del factor I en la degradacin de C3b unido a la membrana
(CR1, MCP). En este caso C3b tambin se degrada a iC3b, sobre el que el factor I puede
seguir ejerciendo su actividad cataltica originando las fracciones C3c y C3dg.
Todos estos mecanismos inhiben la capacidad de C3b de formar convertasa de C5, as
como de que C3b medie la adherencia celular. Sin embargo iC3b s mantiene la capacidad de
adherencia a clulas fagocticas por los receptores de estas clulas para iC3b (CR1, CR3 y
CR4)(Tabla 13.2).
Inhibicin del MAC