MTODO PARA LA CUENTA DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS.

OBJETIVOS

Realizar adecuadamente mediante el mtodo de cuenta en placa, el nmero de

mohos y levaduras viables presentes en productos alimenticios destinados al
consumo humano.
Evaluar la calidad microbiolgica de un alimento, que sea factible de estar
contaminado con estos microorganismos, tomando como referencia la NOM-111SSA1-1994.
Comprender el fundamento de todas las etapas del mtodo de deteccin y
cuantificacin de mohos y levaduras en alimentos.

GENERALIDADES

Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente, pueden

encontrarse como flora normal de un alimento, o como contaminantes en equipos mal
sanitizados. Ciertas especies de hongos y levaduras son tiles en la elaboracin de algunos
alimentos, sin embargo tambin pueden ser causantes de la descomposicin de otros
alimentos. Debido a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y levaduras
se manifiestan en los alimentos donde el crecimiento bacteriano es menos favorable. Estas
condiciones pueden ser bajos niveles de pH, baja humedad, alto contenido en sales o
carbohidratos, baja temperatura de almacenamiento, la presencia de antibiticos, o la
exposicin del alimento a la irradiacin. Por lo tanto pueden ser un problema potencial en
alimentos lcteos fermentados, frutas, bebidas de frutas, especias, oleaginosas, granos,
cereales y sus derivados y alimentos de humedad intermedia como las mermeladas, cajetas,
especias, etc.

Los hongos y levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como pectinas, carbohidratos como
polisacridos, cidos orgnicos, protenas y lpidos. Tambin pueden causar problemas a
travs de: (a) sntesis de metabolitos txicos (micotoxinas), (b) resistencia al calor,
congelamiento, antibiticos o irradiacin y (c) habilidad para alterar sustratos no favorables
permitiendo el crecimiento de bacterias patgenas. Pueden tambin causar malos olores y
sabores y la decoloracin de las superficies de alimentos.

El trmino moho se suele aplicar para designar a ciertos hongos filamentosos multicelulares
cuyo crecimiento en la superficie de los alimentos se suele reconocer fcilmente por su
aspecto aterciopelado o algodonoso, a veces pigmentado. Generalmente todo alimento
enmohecido se considera no apto para el consumo. La identificacin y clasificacin de los
mohos se basa en observaciones macroscpicas y microscpicas.

Hifas y micelio. El talo de los mohos est formado por una masa de filamentos
ramificados, llamados hifas, llamndose micelio al conjunto de las hifas. Las hifas pueden
ser sumergidas o areas. Tambin se pueden clasificar en hifas vegetativas o en
crecimiento, las cuales se encargan de la nutricin del moho, y en hifas frtiles o hifas que
producen los rganos reproductores. Los mohos se dividen en dos grupos: septados, es
decir, provistos de tabiques transversales que dividen a las hifas, y no septados cenocticos,
cuyas hifas estn formadas por cilindros sin tabiques transversales. Este tipo de hifas posee
ncleos diseminados a lo largo del cilindro y se les denomina multicelular. Determinadas
estructuras del micelio o determinados rganos ayudan a identificar a los mohos. Por
ejemplo los rizoides o anclajes de los gneros Rhizopus o Absidia, la clula basal del
gnero Aspergillus y la ramificacin dicotmica, o en forma de Y, del gnero Geotrichum.
rganos o estructuras reproductoras. Los mohos se reproducen principalmente por medio
de esporas asexuales. Algunos mohos tambin producen esporas sexuales. A tales hongos se
les denomina perfectos, los cuales se dividen en Oomycetes y
Zygomycetes si no son septados, o bien en Ascomycetes y Basidiomycetes si son septados,
en contraposicin a los mohos imperfectos, Fungi Imperfecti, los cuales slo poseen
esporas asexuales.
Esporas asexuales. Los mohos producen gran cantidad de esporas asexuales, son
pequeas, ligeras y resistentes a la desecacin. Se diseminan fcilmente por la atmsfera
para sedimentar y originar el talo de un nuevo moho. Los tres tipos principales de esporas
asexuales son: (1) conidios, (2) artrosporas u oidios y (3) esporangiosporas. Los conidios se
separan, o crecen, en determinadas hifas frtiles denominadas conidiforos y generalmente
son libres, es decir, no se encuentran dentro de ningn receptculo, en contraposicin a las
esporangiosporas, las cuales se encuentran dentro de un esporangio o receptculo, situado
en el extremo de una hifa frtil, el esporangiforo. Las artrosporas se forman por
fragmentacin de una hifa. El extremo engrosado del esporangiforo se denomina
columnela y adopta formas tpicas en cada una de las distintas especies de mohos. Algunos
mohos poseen conidios comprimidos uno contra otro, dispuestos en cadenas, y que nacen
de una clula especializada, el esterigma o filide situada en el extremo del conidiforo.

Propiedades fisiolgicas. En comparacin con la mayora de las levaduras y de las

bacterias, la mayora de los mohos necesitan menor cantidad de humedad disponible. Un
porcentaje total de humedad por debajo del 14 al 15 por ciento en la harina o en algunos
frutos secos impedir o retardar mucho el crecimiento de los mohos. Los mohos podran
considerarse mesfilos, es decir, que son capaces de crecer bien a temperaturas normales.
La temperatura ptima de la mayora se encuentra alrededor de los 25 a 30C, aunque
algunos son psicrtrofos y algunos son termfilos. Son aerobios, esto es cierto por lo menos
en los mohos que crecen en la superficie de los alimentos. Casi todos los mohos son
capaces de crecer dentro de un amplio intervalo de pH (pH comprendido entre 2 y 8.5),
aunque la mayora crece mejor a pH cido. Son capaces de utilizar muchos tipos de
alimentos, que van desde sencillos a complejos. Poseen enzimas hidrolticas, y de aqu que
algunos se utilicen para la produccin industrial de las amilasas, pectinasas, proteasas y
lipasas.

Algunos gneros de mohos importantes en alimentos.

Mucor. Intervienen en la alteracin de algunos alimentos y se utilizan en la fabricacin de

otros. M. rouxii se utiliza para la sacarificacin del almidn, para la maduracin de quesos
y para la fabricacin de algunos alimentos orientales.
Rhizopus. La especie R. stolonifer, o moho del pan, es muy comn e interviene en la
alteracin de algunos alimentos: bayas, frutas, hortalizas, pan, etc.
Aspergillus. Los aspergilos son mohos muy abundantes. Algunas especies intervienen en
las alteraciones que experimentan los alimentos, mientras que otros son de utilidad para
preparar determinados alimentos. A. niger se utiliza para la produccin industrial de cido
ctrico y glucnico y de algunas enzimas. A. flavus se utiliza para la fabricacin de ciertos
alimentos orientales y en la obtencin de enzimas.
Se han reportado casi 50 especies de Aspergillus como productores de metabolitos txicos
denominados en general micotoxinas. Las de mayor importancia son: las denominadas
aflatoxinas (producidas por A. flavus, A. parasiticus y A. nomius); la ocratoxina A
producida por A. ochraceus, A. carbonarius y A. niger; sterigmatocistina producida
principalmente por A. versicolor; el cido ciclopiaznico producidas por A. flavus y A.
tamarii. La citrinina, patulina y cido peniclico tambin son producidas por especies de
Aspergillus, las txinas tremorgnicas son producidas por A. terreus (territremas), A.
fumigatus (fumitremorgenas) y A. clavatus (triptoquivalina).

Las aflatoxinas son derivados de la difurancumarina. Las aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 se

producen en la naturaleza por los mohos ya mencionados. Las letras B y G se refieren a los
colores de flurescencia por sus nombres en ingls ( azul y verde, respectivamente)
observados bajo longitudes de onda en la regin UV, y los subndices 1 y 2 se refieren a sus
patrones de separacin cromatogrficos. Las aflatoxinas M1 y M2 se producen por la
hidroxilacin de las respectivas aflatoxinas B. La aflatoxina B1 tal vez sea el carcingeno
de hgado ms potente para animales incluyendo al humano. La ocratoxina A y la citrinina
afectan la funcin renal. Las toxinas tremorgnicas afectan el sistema nervioso central.
Penicillium. Es otro gnero de mohos de frecuente incidencia y de importancia en los
alimentos, P. expansum produce la podredumbre blanda de las frutas; P. digitatum y P
italicum producen la podredumbre de frutas ctricas. Las especies P. camemberti, P.
roqueforti se utilizan en la maduracin de quesos.
Se han reportado ms de 80 especies de Penicillium como productores de micotoxinas.
Estas micotoxinas pueden dividirse en dos grupos: las que afectan la funcin del heptica o
renal, y las neurotoxinas. Las principales micotoxinas producidas por Penicillium son,
ocratoxina A, citrinina, patulina, cido ciclopiaznico, citreoviridina, penitremo A, toxina
PR y roquefortina y el cido secalnico. De stas la ocratoxina A es sin duda la ms
importante, es un carcingeno renal y es producida por P. citrinum, P. viridicatum, P.
verrucosum. La principal fuente de esta toxina es el pan de centeno o trigo, o a travs de
cerdos alimentados con estos cereales cuya carne es posteriormente consumida por
humanos.
Se recomienda consultar la bibliografa para conocer otros gneros de mohos con
importancia en los alimentos.

Levaduras y hongos levaduriformes.

El trmino levadura se refiere a aquellos hongos que generalmente no son filamentosos,
sino unicelulares y de forma ovoide o esferoide, y que se reproducen por gemacin o por
fisin.
Las levaduras que se encuentran en los alimentos pueden ser benficas o perjudiciales. Las
levaduras se utilizan en la elaboracin de alimentos como el pan, la cerveza, vinos, vinagre
y quesos, tambin se utilizan en la obtencin de enzimas y alimentos fermentados. Las
levaduras son perjudiciales cuando producen la alteracin del sauerkraut, de los zumos de
frutas, de los jarabes, de la melaza, de la miel, de las carnes, del vino, de la cerveza y de
otros alimentos.
Los caracteres morfolgicos de las levaduras se determinan mediante su observacin
microscpica. Su forma puede ser desde esfrica a ovoide, alimonada, piriforme, cilndrica,

triangular e incluso alargada. La mayora se reproducen asexualmente por gemacin

multicelular o por gemacin polar. Unas pocas especies se reproducen por fisin.
En los cultivos en placas de agar es difcil diferenciar las colonias de levaduras de las
colonias bacterianas; la observacin microscpica de los microorganismos es la nica
forma segura de diferenciarlas. La mayora de las colonias jvenes de levaduras son
hmedas y algo mucosas; la mayora de las colonias son blancuzcas, aunque algunas tienen
un color crema o rosado. Son oxidativas, fermentativas, o bien su actividad metablica es a
la vez de ambos tipos.
La mayora de las levaduras crecen mejor con un alto contenido de humedad. No obstante,
crecen mejor que la mayora de las bacterias en sustratos que contienen elevadas
concentraciones de solutos (por ejemplo carbohidratos o cloruro de sodio), es decir son
osmotolerantes. Sin embargo la mayora de las levaduras necesitan mayor humedad que los
mohos. Para la mayora de las levaduras la Aw mnima de crecimiento oscila entre 0.88 y
0.94. El intervalo de temperaturas de crecimiento es parecido al de los mohos, con una
temperatura ptima en torno a los 25 a 30C y una temperatura mxima en torno a los 35 a
47C. Crecen mejor en aerobiosis, aunque las especies de tipo fermentativo son capaces de
crecer, aunque lentamente, en anaerobiosis. Los azcares son la fuente energtica ms
apropiada para las levaduras, aunque las oxidativas, pueden oxidar los cidos orgnicos y el
alcohol.

Algunos gneros de importancia en alimentos son:

Schizosaccharomyces. Levaduras de este gnero se han encontrado en frutas tropicales, en

la melaza y en la miel.
Saccharomyces. La especie S. cerevisiae se emplea en muchas industrias alimentarias,
como en la fermentacin del pan, fermentacin de la cerveza, fermentacin de los vinos, en
la produccin de alcohol, glicerol e invertasa.
Kluyveromyces. K. marxianus (antes Saccharomyces fragilis) se utiliza en la obtencin de
productos lcteos por su capacidad de fermentar la lactosa.
Zygosaccharomyces. Las levaduras de este gnero son importantes por su capacidad para
crecer en medios con elevadas concentraciones de azcar (osmfilas), intervienen en la
alteracin de la miel, jarabes y melazas, y tambin en la fermentacin de la salsa de soya y
de algunos vinos.

Pichia. Crecen en la superficie de los lquidos formando una pelcula. P. membranafaciens

produce una pelcula en la superficie de las cervezas y vinos.

Debaromyces. Forman pelcula en la superficie de las salmueras. D. kloeckeri crece en la

superficie de los quesos y de los embutidos.
Hanseniaspora. Estas levaduras tienen forma de limn y crecen en los zumos de frutas.
Torulopsis. Originan problemas en las fbricas de cervezas. T. sphaerica fermenta la
lactosa, alterando productos lcteos. Otras especies alteran la leche condensada azucarada,
los concentrados de zumos de frutas y los alimentos cidos.
Candida. La especie C. utilis se cultiva para la obtencin de protena unicelular para
incorporarla tanto a alimentos destinados al consumo humano como a piensos. La especie
C. krusei se utiliza junto con los cultivos iniciadores de productos lcteos. C. lipolytica
produce alteracin de la mantequilla y margarina.
Brettanomyces. Producen grandes cantidades de cido e intervienen en la fermentacin de
la cerveza belga de tipo lambic, de las cervezas inglesas y de los vinos franceses.
Trichosporon. Estas levaduras crecen mejor a temperaturas bajas, encontrndose en las
fbricas cerveza y en la superficie de vacuno refrigerada.
Rhodotorula. Estas levaduras de color rojo, rosa o amarillo, pueden producir manchas en
la superficie de los alimentos como en la superficie de las carnes, o zonas de color rosado
en el sauerkraut.

FUNDAMENTO

El mtodo se basa en inocular una cantidad conocida de muestra, en un medio de cultivo

selectivo especfico, aprovechando la capacidad de este grupo microbiano de utilizar como
nutrientes a los polisacridos que contiene el medio. La hidrlisis de estos compuestos se
efecta por enzimas que poseen estos microorganismos. La sobrevivencia de los hongos y
levaduras a pH cidos se pone de manifiesto al inocularlos en el medio de cultivo
acidificado a un pH de 3.5. As mismo, la acidificacin permite la eliminacin de la
mayora de las bacterias. Finalmente, las condiciones de aerobiosis y la incubacin a una
temperatura de 25 1 C da como resultado el crecimiento de colonias caractersticas para
este tipo de microorganismos.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, conteniendo 90.0 mL de solucin

amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 agua peptonada al 0.1%, estril a.

3 tubos de 16 x 150 mm, conteniendo 9.0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos

de pH 7.2 agua peptonada al 0.1%, estriles con tapn de algodn a.

4 tubos 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar papa dextrosaa .
4 tubos 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar extracto de malta a.

NOTA
La Norma Oficial Mexicana utiliza nicamente el agar papa dextrosa para la deteccin y
cuantificacin de estos grupos de microorganismos. Sin embargo se sugiere para la
cuantificacin de las levaduras, la utilizacin del agar extracto de malta acidificado ya que
es un medio ms rico en nutrientes y adecuado para el desarrollo de este grupo microbiano.

SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES

Solucin colorante de lactofenol azul de algodn b.

Colorantes para tincin de Gram b.
Solucin estril de cido tartrico al 10.0 % a.

MATERIAL Y EQUIPO

Vaso de licuadora estril o bolsa para Stomachera.

Motor para licuadora o Stomachera.
Pipetas graduadas estriles de 1 mL con tapn de algodn a.
Pipetas graduadas estriles de 10 mL con tapn de algodn a.
Pipetas Pasteur estriles a, b
Propipetaa, b
Cajas de Petri estriles (una se utiliza para pesar la muestra) a.
Utensilios estriles para la manipulacin de muestras: cuchillos, cucharas,
tenedores, etc. a
Incubadora con termostato que pueda ser mantenido a 251C a.
Bao de agua con control de temperatura y circulacin mecnica mantenida a
451C a.
Portaobjetos, cubreobjetos, diurex b.
Microscopio ptico b.
Asa bacteriolgica y asa micolgicab.
Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal
cuadriculada y lente amplificador b.

NOTAS
a) Material necesario para el inicio de la prctica.
b) Material necesario para los 3, 4 y/o 5 das despus de iniciada la prctica.

Fig. Versin para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD). Facultad de Qumica,

UNAM (Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 20099.

PROCEDIMIENTO

1. Pesar 10.0 g de muestra en una caja Petri estril y pasarla a un matraz Erlenmeyer
que contenga 90.0 mL de una solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 agua
peptonada al 0.1%.
2. Homogeneizar la muestra con la solucin anterior en un vaso de licuadora estril o
pasarla a una bolsa de Stomacher y homogeneizar durante 10.0 seg en el caso de la
licuadora a velocidad mnima, 30.0 seg en el Stomacher a una velocidad normal.
Esta es la dilucin primaria.
3. De la suspensin o solucin anterior, tomar 1.0 mL y transferirlo a un tubo de
ensayo que contenga 9.0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.2,
agitar y repetir esta operacin tantas veces como diluciones sean necesarias. Se debe
utilizar una pipeta estril para cada dilucin.

NOTA

Los microorganismos filamentosos forman las colonias a partir de una espora o de un

fragmento de hifa o de un cmulo de hifas. Debido a esto, el nmero de UFC/mL puede
variar dependiendo de las condiciones de homogeneizacin de la muestra (a mayor tiempo
de homogeneizacin mayor ser la ruptura de las hifas y por lo tanto se aumentaran las
UFC / mL), por lo que se debe poner especial cuidado en esta etapa. Los tiempos de
homogeneizacin citados en esta metodologa son los recomendados en la Norma Oficial
Mexicana para este grupo microbiano.

4. Colocar por duplicado en cajas Petri estriles, 1.0 mL de cada una de las diluciones
de la muestra, utilizando una pipeta estril.
5. Fundir el medio contenido en los tubos de 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar papa
dextrosa y/o de agar extracto de malta estriles. Enfriarlos y mantenerlos a 45C.
6. Para lograr acidificar los medios a un pH de 3.5, adicionar por cada 100.0 mL de
agar, 1.4 mL de cido tartrico al 10% esterilizado por filtracin en

7. membrana, o bien esterilizar la solucin a 121C1C durante 15 minutos. Esto

significa que a cada tubo conteniendo 20.0 mL del medio fundido y mantenido a
45C se le deber adicionar 0.3 mL del cido, o colocarlas en la caja de Petri
teniendo precaucin de que no toque la muestra antes de agregar el medio de
cultivo.
8. Despus de la acidificacin, utilizar un tubo de medio acidificado como testigo y
medir el pH para corroborar que se encuentre a 3.5 utilizando un potencimetro.
9. En cada caja de Petri con inculo, verter de 15.0 a 20.0 mL de agar papa dextrosa
acidificado y/o agar extracto de malta acidificado, fundidos y mantenidos a 45C.
El tiempo transcurrido entre la preparacin de las diluciones y el momento en que es
vertido el medio de cultivo no debe de exceder de 20.0 min.
10. Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis
en el sentido de las manecillas del reloj, seis en sentido contrario y seis de atrs
hacia adelante, sobre una superficie lisa, teniendo cuidado de no humedecer con el
medio la tapa de la caja de Petri. Permitir que la mezcla en las cajas Petri
solidifique, dejndolas reposar sobre una superficie horizontal fra.
11. Verificar la esterilidad de los medios acidificados para lo cual se verter en una caja
de Petri sin inculo, de 15.0 a 20.0 mL del agar papa dextrosa acidificada y/o agar
extracto de malta acidificado. Despus de la incubacin estas cajas no debern
presentar desarrollo de colonias.
12. Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 251C.
13. Contar las colonias de cada placa despus de 3, 4 y 5 das de incubacin. Despus
de 5 das, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si
alguna de las cajas muestra crecimiento extendido de mohos o si es difcil contar
colonias bien aisladas, considerar la cuantificacin de 4 das de incubacin o incluso
las de 3 das. En este caso, se informa el perodo de incubacin en los resultados de
los anlisis.
14. Realizar una tincin hmeda para mohos con colorante de lactofenol azul de
algodn, para un examen microscpico y una posible identificacin de los mohos
que se hayan desarrollado.
15. Realizar una tincin de Gram para la observacin microscpica de las levaduras
obtenidas.
16. Contar las colonias de cada placa representativa, despus de 3, 4 y 5 das de
incubacin (a 26 1C o a temperatura ambiente).

17. Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el
informe. Multiplicar por el inverso de la dilucin.
18. Informar las unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL)
de mohos y levaduras (cada uno en forma independiente), incubadas a 251C
durante 5 das.
19. Describir las caractersticas macroscpicas y microscpicas observadas, de los
mohos y/o levaduras desarrollados a partir de la muestra analizada.
20. Si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de hongos, o si es difcil
contar las colonias, considerar el desarrollo de estos microorganismos a los 4 das
de incubacin y an a los 3 das. En este caso se debe informar el periodo de
incubacin de 3 4 das, en los resultados del anlisis.

CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS

Para elaborar un informe de resultados se sugiere seguir las indicaciones que a continuacin
se expresan:

ANLISIS CUANTITATIVO

Para hacer un reporte de la parte cuantitativa de este anlisis, se deben seleccionar las
placas que contengan entre 10 y 150 colonias (representatividad estadstica).
Posteriormente, contar las colonias presentes y calcular el nmero de hongos y levaduras
por separado. De esta manera se puede calcular las unidades formadoras de colonias por
gramo o por mililitro dependiendo del estado fsico de la muestra analizada. Esto se logra
multiplicando el nmero de UFC encontradas en una caja representativa, por el inverso de
la dilucin correspondiente a esa caja.

En el caso de las placas que contienen menos de 10 colonias (UFC) de hongos y/o
levaduras, se debe reportar el nmero obtenido de UFC indicando la dilucin
correspondiente.

En el caso de no encontrar colonias caractersticas de hongos y/o levaduras, el resultado a

reportar es: menos de 10 UFC/g bien menos de 10 UFC/mL (Sensibilidad del Mtodo)
Para cualquiera de los casos citados se deber reportar el tiempo de incubacin en el que se
realiz la cuantificacin.
Para cualquiera de los casos citados se deber reportar por separado el resultado de la
cuantificacin de hongos y de levaduras.
Reportar las observaciones macroscpicas y microscpicas de los diferentes tipos de
colonias de mohos y levaduras obtenidas durante el anlisis. Si es posible reportar el o los
gneros probables (Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez.
2009).

Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para
el Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.