Departamento de Biologa - Biologa Molecular 2015

Laboratorio de Biologa Molecular

Mdulo 2: Clonacin de un gen en vector plasmdico
Este mdulo tiene como objetico el clonar una secuencia gnica vegetal, correspondiente al cDNA del
gen de la protena inhibidora de poligalacturonasas (Pgip) de kiwi (Actinidia deliciosa) en un vector
plasmdico replicable en E.coli. Se enmarca dentro de los temas de ADN recombinante y Transformacin
Gentica /transfeccin.
El mdulo consta de 3 prcticas seguidas:
1. Ligacin de la secuencia gnica al vector plasmdico y transformacin de clulas de E.coli con los
productos de ligacin.
2. Purificacin de ADN plasmdico recombinante tras un proceso de seleccin /screening de clones
recombinantes (Minipreparacin plasmdica)
3. Anlisis electrofortico de los plsmidos recombinantes purificados con fines de confirmacin.
Objetivos del mdulo:
General: Clonar el gen de la protena inhibidora de poligalacturonasas de kiwi pgip en el vector plasmdico
pCR2.1
Objetivos especficos:
-

Realizar ligaciones del inserto gnico al vector plsmidico pCR2.1

Seleccionar y tamizar transformantes recombinantes mediante alfacomplementacin
Purificar plsmidos recombinantes a partir de los clones identificados obtenidos
Analizar electroforticamente los plsmidos recombinantes verificando la presencia del inserto

Introduccin y marco terico:

Muchos hongos fitopatgenos son parsitos intracelulares de las clulas vegetales. Tal es el caso por ejemplo del
hongo Puccinia spp. causante de la enfermedad llamada roya blanca en la flor de crisantemo. Para invadir las clulas
vegetales, estos hongos poseen enzimas lticas capaces de degradar la pared celular vegetal, la cual est compuesta
de polmeros complejos en su mayora formados por polisacridos. Entre las enzimas invasivas frecuentemente
encontradas estn las poligalacturonasas, capaces de hidrolizar el cido poligalacturnico, un componente
estructural de las paredes celulares vegetales. Algunas especies de plantas, como el kiwi (Actinidia deliciosa), han
mostrado ser ms resistentes a la invasin de hongos fitopatgenos que utilizan este tipo de enzimas y se ha logrado
demostrar que en esta resistencia participan protenas sintetizadas y secretadas por la clula vegetal capaces de
inhibir la actividad ltica de las poligalacturonasas, recibiendo por tanto el nombre de protenas inhibidoras de
poligalacturonasas o Pgip. No todas las plantas poseen este tipo de protenas, el crisantemo, por ejemplo, flor de
gran importancia comercial a nivel productivo en Colombia, es muy susceptible a los hongos del gnero Puccinia
como mencionado anteriormente. Una estrategia para intentar aumentar la resistencia del crisantemo podra

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entonces consistir en la utilizacin de la transformacin gentica para transferir el gen de resistencia pgip de Kiwi a
plantas de crisantemo. As, la correcta expresin de este transgen en crisantemo podra protegerlo de hongos
fitopatgenos que utilicen poligalacturonasas como enzimas invasivas. Se utilizara como sistema de transformacin
gentica del crisantemo a la bacteria Agrobacterium tumefaciens.
En esta estrategia de mejoramiento vegetal, el primer paso consiste entonces en clonar el gen pgip de Kiwi (en este
caso sera el ADNc correspondiente a dicho gen y cuyo tamao es de 1030 pb) en un vector bacteriano plasmdico,
para poder posteriormente subclonarlo en un vector replicable en A. tumefaciens.

I.

Prctica 1 (primera semana) : Ligacin y transformacin:

Prelaboratorio: los estudiantes debern repasar los fundamentos tericos siguientes:

ADN recombinante

Estrategias de clonacin de un fragmento de ADN en un vector plasmdico y mtodos de seleccin.

Fundamentos de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).
Transformacin gentica de bacterias y plantas.
Buscar especficamente informacin de la tcnica A/T cloning y de la -complementacin para el
tamizaje de clones recombinantes en E.coli, esto para entender el fundamento de esta prctica.
Buscar informacin acerca de las caractersticas particulares de la cepa E. coli DH5como receptora del
plsmido recombinante segn fundamento del tamizaje mencionado.
Buscar qu funcin cumple el IPTG y el X-gal

METODOLOGA:
1. Ligacin del producto de PCR al vector pCR2.1:
La Taq polimerasa tiene como particularidad el aadir al extremo 3OH de cada cadena copiada una base de
adenina: as, los fragmentos de DNA amplificados siempre tendrn una base de adenina colgando en sus extremos
3OH. De esta manera los productos de PCR pueden ligarse fcilmente a vectores previamente cortados y
cuyos bordes posean una base de timina en cada extremo 5OH.
Existen numerosos vectores comerciales prediseados con este fin, en este laboratorio utilizaremos el vector
pCR2.1 (Invitrogen), cuyo mapa se encuentra en el anexo 1 y , como se indica, viene previamente cortado y con
las bases de timina colgantes.
La ligacin consiste en unir covalentemente dos fragmentos de DNA creando un enlace fosfodiester entre las dos
cadenas que los forman, la enzima encargada de sto es la DNA ligasa (purificada del fago T4):
5- P + 3- OH + ATP 5-P-3 + ADP + Pi
Para esta reaccin se les suministran:
- Tubo vector (V): 2 ul de ADN vector (50 ng)
- Tubo 2X: Ligation buffer: buffer de ligacin a una concentracin 2X
- Tubo L: Ligasa de bacterifago T4 a 2 U/ul
- Tubo PGIP o inserto: ADNc del gen pgip de Kiwi amplificado por PCR (100 ng/ uL)
Sabiendo que la ligacin se va a hacer con 200 ng del inserto, 2 ul del vector, y 2 unidades de ligasa, calcular
los volmenes a mezclar y el volumen necesario de buffer de ligacin 2X que habr que aadir previamente a la
mezcla (La mezcla se hace en el tubo que contiene el vector y el buffer debe quedar a concentracin 1X).

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El buffer de ligacin 2X empleado es un buffer de ligacin rpida (contiene ATP), y la T4 DNA ligasa viene ms
concentrada para una mayor eficiencia y rapidez en la ligacin. La ligasa es muy sensible a temperatura
ambiente, favor mantenerla siempre en hielo antes de la reaccin.
Incubar al menos 15 min esta mezcla a temperatura ambiente antes de pasar a hielo y transformar.
2. Transformacin de E. coli DH5 termocompetentes (Mtodo del CaCl2, Sambrook et al., 1989).
Encender el bao a 42C con suficiente antelacin!
Tras 15 min a temp. ambiente, pasar el tubo con la mezcla de ligacin a hielo por 1 minuto. En hielo tambin
encontrar el vial de clulas competentes (80 ul).
LAS CLULAS COMPETENTES SON MUY SENSIBLES A CAMBIOS DE TEMPERATURA: DEBEN
ESTAR SIEMPRE EN HIELO ANTES Y DESPUES DEL CHOQUE TERMICO Y NO SE DEBEN AGITAR.
Transformar 80 l de bacterias E. coli DH5 competentes segn el siguiente protocolo:
- Pipetear la totalidad de la mezcla de ligacin (fra) y aadrsela cuidadosamente a las clulas competentes (NO
AGITAR).
- Incubar en hielo 25 min agitando muy suavemente de vez en cuando.
- Someter las clulas a un choque trmico a 42 C por 30 segundos. No mezclar.
- Tras el choque, volver a incubar inmediatamente en hielo por al menos 5 minutos.
- Agregar 1 mL de caldo LB precalentado a 37C e incubar 40 minutos a 37 C.
- Durante este tiempo precalentar a 37C cajas Petri con agar LB suplementado con Kanamicina (Km, 50
ug/ml), IPTG (200 ug/ml) y Xgal (50 ug/ml).
- Con ayuda de un rastrillo de vidrio esterilizado (flameado), sembrar y esparcir por toda la caja 50 a 400 ul de la
suspensin bacteriana e incubar toda la noche a 37 C.
3. Da siguiente: observacin de las colonias crecidas en las cajas y seleccin de clones positivos para una futura
inoculacin de cultivos y purificacin del plsmido recombinante (Miniprep).
Los resultados se analizarn en taller o laboratorio siguiente.
PARA DISCUTIR DURANTE LOS TIEMPOS DE INCUBACIN:
- Tamaos esperados del plsmido recombinante
- Seleccin de transformantes vs tamizaje de recombinantes
- Resultados esperados: Complementacin:
- Diferentes estrategias a emplear para confirmacin de la insercin.
Glosario Informacin adicional:
-IPTG: isopropil-tio--galactosido = anlogo estructural de la lactosa no metabolizable (inductor gratuito del
promotor lac)
- X-Gal: sustrato artificial de la enzima -galactosidasa cuyo producto de hidrlisis genera un producto de color
azul.
- Pptido de la -galactosidasa: pptido situado en la regin N-terminal cataltica de la enzima y por ende
indispensable para su actividad (hidrlisis de lactosa o sustratos anlogos)
- E. coli DH5 Cepa de E. coli mutante lacZ M15 = delecionada en la regin del pptido del gen lacZ.
- Mapa del vector pCR2:1 (anexo 1)

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Buffers/Medios usados en esta prctica:
- caldo LB
10 g/l bactotriptona
5 g/l extracto de levadura
10 g/l NaCl
Autoclavar.

- Medio LB-agar
Por cada litro de medio LB agregar 15 g de agar.
Autoclavar y dejar entibiar: una vez tibio aadir el
antibitico, IPTG y Xgal mezclar y servir
inmediatamente en cajas Petri estriles.

Cuando corresponda agregar al medio LB agar 50 g/ml de Kanamicina (preparada a 50 mg/ml y esterilizada por
filtracin), 200 g/ml de IPTG (preparado a 200 mg/ml y esterilizado por filtracin) y 50 g/ml de Xgal
(preparado a 50 mg/ml en metanol).
Materiales:
Tubos Eppendorf (1.5 mL) estriles
Se necesitan dos baos termostticos: uno a 42C y otro a 37 C
Cajas Petri estriles (1 por grupo)
Rastrillos o pipetas de vidrio de 10 mL estriles (para esparcir /sembrar clulas).

Anexo1: Mapa del plsmido vector pCR2.1.

BIBLIOGRAFA y recursos en internet:

- Sambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniatis, 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. ed.
Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
- Ausubel F, Brent R, Kingston R et al., Ed. (1994). Current Protocols in Molecular Biology. New York,
John Wiley and Sons, Inc.
- Ramanathan, V., C.G. Simpson, G. Thow, P.P.M. Lannetta, R.J. McNicol and B. Williamson. 1997.
cDNA cloning and expression of polygalacturonase inhibiting proteins (PGIPs) from red raspberry (Rubus
idaeus). Journal of Experimental Botany, Vol. 48, No. 311, pp. 1185-1193.

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II.

Prctica 2 (segunda semana) : PURIFICACIN DE ADN PLASMIDICO

En esta prctica se buscar purificar el ADN plasmdico recombinante previamente obtenido en la prctica de
clonacin anterior.
Con este fin ser necesario que un da antes de la prctica cada grupo se dirija al laboratorio indicado por el
tutor para inocular el clon en un tubo con 3 mL de caldo LB suplementado con Kanamicina (50 ug/mL) a
partir del cual se realizar la extraccin de ADN plasmdico.
INTRODUCCIN y MARCO TERICO: PLSMIDOS
Aunque comnmente se afirma que el genoma de los procariotas consta de un solo cromosoma, algunas
especies de bacterias pueden en realidad poseer varios cromosomas y adems portar uno o varios elementos
genticos accesorios extracromosmicos, llamados plsmidos.
Los plsmidos son elementos genticos extracromosmicos con capacidad de replicacin autnoma, es decir
que su replicacin puede ser independiente de la del cromosoma. Los plsmidos bacterianos estn formados
por ADN de cadena doble y, salvo algunas excepciones, son circulares. Algunos plsmidos pueden, adems,
integrarse en el cromosoma bacteriano de manera reversible: slo en este caso se replican junto con el
cromosoma, y reciben el nombre de episomas.
Dentro de la clula el nmero de copias de un mismo plsmido puede por tanto variar debido a su autonoma
de replicacin: as cada tipo de plsmido tiene un nmero promedio de copias por clula caracterstico. Por
regla general, se pueden distinguir dos grandes tipos de plsmidos: los de bajo nmero de copias (< 5) cuya
replicacin est estrictamente controlada y los de alto nmero de copias (> 10 y hasta 100 copias) con control
de replicacin relajada. Existe una gran diversidad de tamao para los plsmidos: hay plsmidos muy pequeos
de unas 2 kb, hasta plsmidos muy grandes como por ejemplo algunos plsmidos de bacterias del gnero
Pseudomonas que alcanzan las 500 kb. Incluso en ciertas bacterias del gnero Rhizobium encontraremos los
llamados megaplsmidos que llegan a tener ms de 1000 kb y que pueden ser incluso ms grandes que los
cromosomas! As el tamao no es un criterio de definicin para un plsmido, sino el hecho que sean material
extracromosmico.
As, a diferencia de los cromosomas, los plsmidos no suelen ser indispensables para la viabilidad de la bacteria,
muchos de ellos incluso se pierden en ausencia de una presin selectiva, sin afectar la viabilidad de la bacteria.
Pero, aunque no sean esenciales para el crecimiento, los plsmidos ofrecen a las bacterias que los portan
ventajas selectivas en condiciones particulares y/o en determinados ambientes.
Algunas de las funciones codificadas por los plsmidos bacterianos son:
Resistencia a antibiticos y/o metales pesados
Virulencia en ciertas bacterias patgenas: produccin de toxinas, factores de penetracin en tejidos,
adherencia, etc.
Produccin de bacteriocinas (protenas txicas producidas por bacterias que matan a otras de la misma
especie o de especies diferentes).
Catabolismo de determinadas fuentes de carbono (azcares, hidrocarburos, etc.)
Induccin de tumores y capacidad de transformacin gentica en plantas (Agrobacterium).
Interacciones simbiticas y fijacin de nitrgeno (Rhizobium).
Los plsmidos pueden transferirse naturalmente entre bacterias de la misma especie o entre especies o gneros
muy distintos, tanto por conjugacin, como por captura del plsmido del medio extracelular. Esto hace que
sean vectores importantes de transferencia horizontal de material gentico, incluso entre grupos
bacterianos filogenticamente alejados.
De manera controlada, en el laboratorio, se puede por tanto transferir plsmidos entre bacterias utilizando
sistemas de transferencia naturales (conjugacin), o mtodos artificiales de transfromacin bacteriana
(electroporacin, transformacin por choque trmico entre otros).

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Finalmente, en biologa molecular, los plsmidos son importantes herramientas de trabajo, ya que son
molculas de ADN vector, es decir que sirven para recibir y transportar un fragmento de ADN de cualquier
organismo (p ej un gen humano, un gen vegetal) insertado en el plsmido con el fin de multiplicarlo dentro de
una bacteria (generalmente Escherichia coli ) en forma clonal, o bien con el fin de estudiar dicho fragmento
(secuenciacin, ensayos in vivo, produccin de protenas recombinantes en bacterias, etc). As este tipo de
plsmidos empleados a nivel de laboratorio son idneos en ingeniera gentica y se modifican
artificialmente o disean para fines especficos: Existen vectores de clonacin, vectores de expresin,
etc... segn la finalidad del mismo.
En estos casos, su tamao suele ser pequeo, lo que tambin facilita su manipulacin e introduccin en una
bacteria (transformacin).
En la prctica de laboratorio, realizaremos una extraccin de ADN plasmdico derivado de un proceso de
clonacin de un inserto de inters por tcnicas de ADN recombinante. El plsmido recombinante, se extraer a
partir de un cultivo de bacterias Escherichia coli utilizando la tcnica llamada de lsis alcalina.
Esta tcnica permite extraer fcilmente y rpidamente una gran cantidad de ADN plasmdico y con una pureza
aceptable, es decir no contaminado con ADN genmico, ni protenas (nucleasas y otras) u otros compuestos
bacterianos.

Esta prctica busca entonces que el estudiante se familiarice con una de las tcnicas de rutina en Biologa
Molecular y comprenda la importancia de cada uno de los pasos del protocolo de extraccin, as como de
de los reactivos empleados.
PROCEDIMIENTOS DE BIOSEGURIDAD:
Esta prctica debe realizarse con elementos de proteccin contra riesgo biolgico y qumico: bata, guantes
y tapabocas.
Se debe evitar el traslado del cultivo bacteriano de una mesa a otra, as como la manipulacin de las
bacterias y soluciones fuera de la mesa de trabajo.
Los desechos biolgicos tanto lquidos como slidos deben ser recolectados y esterilizados antes de ser
descartados.
En el laboratorio est prohibido el uso de celulares, tabletas reproductores de msica y
similares.
PRELABORATORIO:

Investigue acerca del papel de cada uno de los reactivos que componen las soluciones buffer
utilizadas en la extraccin de DNA plasmdico

Cul es la utilidad de los plsmidos bacterianos en estudios de Biologa Molecular.

EXTRACCION DE ADN PLASMDICO A PEQUEA ESCALA (MINIPREP) POR EL MTODO
DE LSIS ALCALINA.
METODOLOGA:
- REACTIVOS (todas las soluciones deben esterilizarse por autoclave)
Soluciones madre:
Tris HCl pH 8.0
1M
EDTA (Na)2
0.5M

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Buffer P1 (buffer de resuspensin):
Tris-HCl 25 mM, pH 8.0.
EDTA 10 mM.
Glucosa 50 mM.
Buffer P2 (buffer de lisis): (Se debe preparar al momento de usar)
NaOH 0.2 N (IRRITANTE!)
SDS 1 % (p/v)
Buffer P3 (buffer de neutralizacin):
Acetato de sodio 3.0 M, pH 5.2 (CIDO!)
Isopropanol
Etanol absoluto al 70% (v/v)
H2O milliQ autoclavada
PROCEDIMIENTO
Se partir de un cultivo del clon recombinante elegido en 3 mL de caldo LB suplementado con
Kanamicina (50 ug/mL), e incubado durante 14-16h (una noche) a 37C.
1. En un tubo Eppendorf (1.5ml), centrifugar 1.5ml del cultivo bacteriano por 5 minutos a 10000
rpm en microcentrfuga.
2. Descartar el sobrenadante en el frasco previsto para tal fin. En caso de observar un pellet
bacteriano muy pequeo, repetir los pasos 1 y 2 y dejar escurrir el tubo sobre una toalla de papel.
3. Resuspender completamente el sedimento bacteriano en 200 ul de buffer de resuspensin P1 con
ayuda de la micropipeta (CUIDADO! Evitar contaminar la pipeta con bacterias!).
4. Agregar 400 ul de buffer de lsis P2. (CUIDADO! Este buffer es irritante por contacto
con la piel). Mezclar SUAVEMENTE por inversin del tubo (4-5 veces). Incubar a temperatura
ambiente 5 minutos.
5. Agregar 300 ul de buffer P3 fro (CUIDADO! este buffer es cido: evitar contacto con piel y
ojos). Mezclar inmediatamente e incubar en hielo por 5 minutos.
6. Centrifugar 10 minutos a 12000 rpm.
7. Recuperar cuidadosamente el sobrenadante y transferirlo a otro tubo Eppendorf de 1.5 ml nuevo.
8. Agregar 0.7 volmenes de isopropanol fro, agitar por inversin 4-5 veces y centrifugar
inmediatamente a 14000rpm durante 10 minutos.
9. Descartar el sobrenadante cuidadosamente.
10. Lavar el sedimento de ADN con 200 ul de etanol al 70 % (no agitar ni resuspender).
11. Centrifugar 5 minutos a 14000rpm.
12. Descartar el sobrenadante cuidadosamente.
13. Secar durante 5 minutos a 37 C y resuspender en 30 ul de agua destilada autoclavada.
14. Conservar a -20C hasta visualizar la calidad de la extraccin mediante electroforesis en gel de
agarosa al 1% (p/v).

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III.

Prctica 3 (tercera semana) : Anlisis electrofortico del plsmido recombinante en

gel de agarosa:

Para la prctica de esta semana, ser necesario referirse a la gua del mdulo anterior, en su apartado
sobre electroforesis ya que la preparacin del gel ser exactamente idntica.
En esta prctica emplearemos un gel de de agarosa al 2% en buffer TAE 1X.
El objetivo ser verificar la extraccin adecuada de ADN plasmdico as como verificar los tamaos del
plsmido recombinante realizando un anlisis de restriccin (corte con enzima de restriccin) con el fin de
confirmar la presencia o no del inserto.
En esta prctica se realizar una evaluacin prctica individual del pipeteo de la muestra y
su siembra en el gel.
Cada persona ser llamada por uno de los dos tutores segn orden de nmeros de grupos y se le indicar
la mezcla a realizar (muestra, agua, buffer de carga y/o enzima de restriccin ) a preparar y sembrar . Se
le presentarn las muestras, los reactivos las puntas y pipetas y realizar el slo la mezcla y la siembre bajo
supervisin y gua de un tutor.
Favor anotar bien el carril en donde sembr la muestra que le toc y si corresponde a plsmido sin cortar
o a plsmido cortado para la observacin final de resultados que se har al final de la prctica y necesaria
para el informe.
No olvidar correr en los carriles sobrantes 5 ul de marcador de peso molecular (1 kb DNA ladder)
Condiciones de Electroforesis:
Conectar debidamente los electrodos a la fuente de poder: dejar correr el gel durante al menos 1h a
mximo 80 V para obtener una buena resolucin.
Durante la electroforesis o espera : discutir los resultados esperados y posibles
interpretaciones.
Al final: Visualizar el resultado de electroforesis bajo luz UV en el transiluminador previsto. Anotar los
resultados para la interpretacin y elaboracin del informe del mdulo.

(OJO: USAR GAFAS DE PROTECCIN DURANTE LA OBSERVACION, ADEMS DE LOS

GUANTES AL MANIPULAR EL GEL).