1.

Cromatografa en capa fina (TLC)

Aunque la incluyamos en este apartado, la TLC puede ser, de acuerdo con la
composicin de la capa cromatogrfica y de su forma de preparacin, bien de
reparto o de adsorcin. As, si la capa de adsorbente se deposita como una
suspensin acuosa que se deja secar a temperatura ambiente (caso ms
frecuente), ser la pelcula de agua depositada sobre las partculas de
adsorbente quien actuar de fase estacionaria, por lo que con solventes
orgnicos la particin supondr, al menos mayoritariamente, equilibrios de
reparto lquido-lquido (cromatografa de reparto). Por el contrario, si la capa de
adsorbente se seca por calentamiento en estufa, la particin supondr
equilibrios de adsorcin slidolquido (cromatografa de adsorcin). En este
mtodo se utilizan como soporte placas de vidrio, plstico, aluminio, etc. en las
que se deposita una fina capa de adsorbente (gel de slice, almidn, polvo de
celulosa, etc.) cuyo espesor puede ajustarse a conveniencia.
En el mercado se encuentran disponibles ya fabricadas placas comerciales. A la
altura de 1,5 cm (aproximadamente) de una de las bases se marca dbilmente
con un lpiz fino una lnea teniendo cuidado de no romper la capa adsorbente.
Esta lnea servir de base para situar las muestras a analizar. Con una
micropipeta de vaciado automtico se depositan 5 l sobre un punto o varios en
la lnea de base (lnea de aplicacin) teniendo siempre cuidado de no tocar la
placa con la punta de la pipeta para no daarla. Tras aplicacin de la muestra,
se deja secar a temperatura ambiente o con ayuda de un pequeo secador. A
continuacin la placa se introduce en una cubeta que contiene el disolvente de
desarrollo adecuado en cada caso, cuyo nivel no debe nunca llegar a la lnea de
siembra. Su ascenso por capilaridad produce el efecto cromatogrfico. Si se
realizan dos desarrollos consecutivos con eluyentes apropiados en cada caso, se
habla de cromatografa bidimensional.
Las sustancias se visualizan en la placa una vez desarrollada mediante su color,
absorcin ultravioleta o revelado especfico que produce una reaccin coloreada.
Para su cuantificacin, se raspa la parte donde se ubique el componente que se
quiere medir, se extrae con los disolventes adecuados y se analiza segn el
mtodo empleado. La diversidad de adsorbentes (ver anteriormente) y
eluyentes disponibles, permiten que esta tcnica sea de utilidad para separar e
identificar un amplio repertorio de biomolculas: aminocidos, hidratos de
carbono, lpidos, protenas, etc. Una vez revelada la placa se puede establecer
un coeficiente de relacin entre la distancia alcanzada por el frente y la
distancia alcanzada por una sustancia especfica, a esta relacin se conoce con
el nombre de Rf (Rf = distancia de la sustancia/frente de la fase mvil)

2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO

2.1. Equipamiento Bao termostatizado.
Placas de vidrio recubiertas con gel de slice activado (20 x 20 cm).

Cmaras de cromatografa.
Cmaras secadoras.
Cmara de revelado con vapor de yodo.
Estufa de desecacin (40 200 C).
2.2. Material
Pipetas de 1 5 ml.
Micropipetas o pipetas de pistn.
Vasos de precipitado.
Lpiz.
2.3. Reactivos : Agua destilada.

Solventes orgnicos.

3. PROTOCOLO A REALIZAR
3.1. Extraccin de los lpidos de la muestra biolgica
3.1.1. Se toma 1 ml de suero.
3.1.2. Se agregan 2 ml de una mezcla cloroformo-metanol (2:1)
3.1.3. Se pone la muestra en un bao termostatizado a 50C durante 30 min.
3.1.4. Se enfra y dejan separar las fases.
3.1.5. Se centrifuga a 3000 rpm durante 10 min y se separa la fase clorofrmica,
pasndola a un tubo de vidrio hasta su total desecacin en un bao o corriente de aire.
3.2. Aplicacin y desarrollo cromatogrfico
3.2.1. Se reextrae el extracto seco con 0.5 ml de cloroformo.
3.2.2. Se indica en la placa de vidrio con gel de slice la lnea de aplicacin u origen,
siempre por encima de la mezcla del eluyente presente en la cmara separadora.
3.2.3. Se aplican las muestras en volmenes de 5, 10 y 20 L y se colocan controles en
igual cantidad.
3.2.4. Se introduce la placa en la cmara separadora conteniendo el solvente adecuado.
3.2.5. Se deja desarrollar la placa hasta que la lnea de frente del solvente haya
recorrido 1315 cm desde la lnea de aplicacin.
3.3. Revelado cromatogrfico
3.3.1. Se introduce la placa, una vez finalizado el desarrollo de la muestra, en una
cmara saturada de vapores de yodo.
3.3.2. Se compara el desarrollo de las muestras con el de los controles y tablas.
4. RESULTADOS
Tras pocos minutos de exposicin al sublimado de yodo, aparecen una serie de
fracciones o manchas cuya intensidad y superficie vara con la cantidad de muestra
aplicada. El raspado de estas manchas y su correspondiente extraccin con solventes
apropiados permitir la medicin cuantitativa de las diferentes fracciones, menester
que puede conseguirse mediante procedimientos espectrofotomtricos o con sistemas
tales como la cromatografa gaseosa y HPLC. El desarrollo cromatogrfico de estas
muestras proporcionar las fracciones que se muestran esquemticamente en las
figuras A (lpidos neutros) y B (fosfolpidos).

SOLUCIONES Los solventes orgnicos

(eluyentes) utilizados segn el tipo
de lpidos a separar estarn
constituidos por: Lpidos neutros:
ter de petrleo, ter etlico y cido
actico (85/15/2) Fosfolpidos:
cloroformo, metano y agua (65/25/4)

Introduccin
La cromatografa en capa fina se basa en la preparacin de una capa, uniforme, de
un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos
esenciales son, pues, un adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga
las placas durante la extensin, otro para aplicar la capa de adsorbente, y una
cmara en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es preciso tambin poder
guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas.
La fase mvil es lquida y la fase estacionaria consiste en un slido. La fase
estacionaria ser un componente polar y el eluyente ser por lo general menos
polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con
mayor velocidad sern los menos polares.
Polaridad de los compuestos orgnicos en orden creciente:
hidrocarburos < olefinas < fluor < cloro < nitro < aldehdo
aldehdo < ester < alcohol < cetonas < aminas < cidos < amidas
Ventajas de la cromatografa en capa fina
La cromatografa en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros
mtodos cromatogrficos (en columna, en papel, en fase gaseosa, ...) ya que el
utillaje que precisa es ms simple. El tiempo que se necesita para conseguir las
separaciones es mucho menor y la separacin es generalmente mejor. Pueden
usarse reveladores corrosivos, que sobre papel destruiran el cromatograma. El
mtodo es simple y los resultados son fcilmente reproducibles, lo que hace que
sea un mtodo adecuado para fines analticos.
Adsorbentes
Al realizar la eleccin del adsorbente se debe tener en cuenta el tamao de las
partculas del adsorbente, cuanto ms finamente dividido est mayor ser su
adhesin al soporte, aunque tambin se le puede aadir un adherente (yeso,...).
Algunos de los adsorventes ms utilizados son:
Celulosa
Almidn
Azucares
Gel de slice (silicagel)
xido de aluminio (almina)
Carbn activo (carbn en polvo)
Kieselguhr

Los tres primeros se utilizan para extraer componentes polifuncionales de plantas y

animales.
Silicagel
El gel de slice o cido silcico es uno de los ms utilizados, es dbilmente cido, su
pH oscila entre 4-5. Con lo cual no se deber utilizar con sustancias que se
corrompan con los cidos. Los geles de slice normales suelen contener impurezas
de hierro y/o aluminio, este factor tambin se debe tener en cuentas respecto al uso
de componentes. El tamao del grano suele ser de 10 a 40 micras () y el tamao
de poro vara de 20 a 150.
Generalmente lleva incorporado un agente aglomerante, yeso (sulfato de clcico
semihidratado), para proporcionar firmeza al adsorbente. Tambin han sido
incorporados dos indicadores del ultravioleta, juntos o por separados (amarillo y/o
verde), en diversos tipos de gel de slice.
Se trata de un adsorbente polar, pero puede ser tratado con hidrocarburos para
neutralizar los grupos -OH, de forma que se haga apto para separar componentes
lipfilos (esteroides, cidos grasos, ceras, vitaminas liposolubles, etc). A este
proceso se le denomina cromatografa de fase reversa (silanizado).
Almina
La almina u xido de aluminio es un adsorbente ligeramente bsico debido a que
en el proceso de extraccin de la almina a partir de la bauxita quedan algunas
molculas de hidrxido de aluminio adheridas a la almina, dndole a sta un
carcter bsico. No consigue un desarrollo tan alto de la sustancia depositada como
el gel de slice.
La almina puede ser tratada qumicamente para conseguir alminas cidas,
bsicas y neutras. Puede contener aglomerantes y/o indicadores ultravioletas. Es un
adsorbente de carcter polar, de tal forma que retendr con mayor avidez a los
componentes polares.
Preparacin de placas.
El adsorvente se desle en agua destilada. Para mezclar la papilla homogneamente
es preferible agitar de modo mecnico. La proporcin de adsorbente y agua
depende del tipo de adsorbente. Dos parte de agua y una de adsorbente pueden
tomarse como norma general, no obstante, habrn de consultarse la instrucciones
del fabricante.
Originariamente se utilizaban, como soporte del adsorbente, lminas de vidrio, pero
en la actualidad tambin se utilizan lminas de otros compuestos orgnicos ms
flexibles. Dependiendo del tipo de separacin que se desee (cualitativa o
preparativa) se utilizar un tamao de placa u otro. En general para realizar una
separacin preparativa de un gramo de muestra es necesario una placa de vidrio de
20x20 cm., 35 gramos de adsorbente y 80 ml. de agua destilada.
Las propiedades de la fase estacionaria pueden alterarse mediante la adicin de
compuestos tales como disoluciones tamponadoras para mantener el pH deseado.

En la preparacin de las placas tambin se pueden adicionar indicadores

fluorescentes o aglomerantes.
Cabe destacar la adicin de nitrato de plata (AgNO3), a este proceso se le denomina
argentacin, y se utiliza para separar componentes insaturados.
El espesor de la placa es otro factor a tener en cuenta al preparar la placa, en
general suele ser de:
0.1-0.2 mm. para separaciones analticas.
0.5- 2 mm. para separaciones preparativas.
La placa debe quedar libre de grumos y rugosidades, que afectaran al desarrollo
del proceso cromatogrfico. Para ello existen en el mercado extensores que se
utilizan para crear de forma mecnica placas homogneas del espesor deseado. Si
no se disponer de extensor, el proceso a seguir es el siguiente:
Mezclar en un Erlenmeyer el agua y el adsorbente.
Agitar enrgicamente.
Extender la papilla sobre el soporte de vidrio.
Hacer oscilar la papilla de un lado a otro.
Golpear con el dedo la parte inferior del soporte.
Las placas, normalmente, se dejan reposar un corto espacio de tiempo despus de
cubrirlas; luego se colocan en bandejas metlicas. En este momento puede
activarse el agente adsorbente, bien dejando las placas reposar toda la noche a
temperatura ambiente, bien calentndolas durante 30-60 minutos a 105-110 C (las
placas de celulosa no deben calentarse ms de 10 minutos a 105 C) para expulsar
as el aire. Es conveniente dejar secar las placas inicialmente al aire, para evitar los
agrietamientos que se produciran por efecto del cambio de temperatura.
Aplicacin de las muestras
Los productos a examinar se disolvern, cuando sea posible, en un disolvente
orgnico no polar que tenga un punto de ebullicin lo suficientemente bajo para que
se evapore despus de la aplicacin.. Sin embargo a menudo se necesitan
disolventes polares; la mezcla cloroformo:metanol (1:1) es efectiva.
Frecuentemente se emplean disoluciones al 1%, de manera que al aplicar 2 l
resulta en la carga 20 g de producto slido. Muchos reactivos de revelado llegan a
detectar 0.1 g de material; por esto con esta carga puede llegarse a observar un
5% de impurezas.
Existen una gran variedad de micropipetas y microjeringuillas para realizar el
proceso de siembra de la muestra a analizar. Tambin pueden usarse tubos
capilares. El proceso de siembra se realiza tocando con la punta del capilar
(micropipeta, jeringuilla, etc) sobre la placa preparada. Dejando una distancia al
borde inferior de un centmetro aproximadamente. El punto de aplicacin de la
muestra se denominatoque.

Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de forma que
en la placa solo quedar la muestra a analizar.
Eleccin del eluyente
La eleccin del eluyente depender lgicamente del componente que se va a
separar y del material en que la separacin se lleva a cabo.Principales eluyentes en
orden creciente de polaridad:
Eter de petrleo.
Eter dietlico.
Ciclohexano.
Acetato de etilo.
Tetracloruro de carbono.*
Piridina.
Benceno.*
Etanol.
Cloroformo.*
Metanol.
Diclorometano.
Agua.
cido actico.
*compuestos cancergenos.
En la eleccin del eluyente influyen varios factores:
Precio.
Pureza.
No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad).
No utilizar compuestos muy voltiles.
Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores).
La eleccin del eluyente se realiza de forma emprica. Hay que estudiar la polaridad
del componente y probar con eluyentes cada vez menos polares.

a) Toque de la muestra sin aplicar ningn eluyente.

b) Aplicando un eluyente poco polar.
c) Aplicando un eluyente ms polar.

Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares, podemos seguir utilizando la

misma placa para aplicar otros eluyentes ms polares, hasta dar con el ms
apropiado.
Otra tcnica para realizar la eleccin del eluyente consiste en sembrar varias
muestras distanciadas suficientemente, y aplicar con un tubo capilar distintos
eluyentes sobre el centro de cada muestra. Esto permite desarrollar cada eluyente
radialmente por capilaridad, de forma que se aprecie el eluyente con el cual la
separacin se realiza de una manera ms eficaz.
Desarrollo de la cromatografa
El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el
mtodo ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda por una placa
casi en vertical, por la accin de la capilaridad. La cromatografa se realiza en una
cubeta. Para conseguir la mxima saturacin posible de la atmsfera de la cmara,
las parades se tapizan con papel impregnado del eluyente. A veces pueden
obtenerse separaciones mejores sin poner papeles en las paredes, cosa que no
debe olvidarse.
Generalmente el eluyente se introduce en la cmara una hora antes del desarrollo,
para permitir la saturacin de la atmsfera. El tiempo de desarrollo, por lo general,
no llega a los 30 minutos. El tiempo de una cromatografa cualitativa suele ser de
un par de minutos, mientras que el tiempo de una cromatografa preparativa puede
llegar a un par de horas.
Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado, o hasta que se
alcance una lnea dibujada a una distancia fija desde el origen. Esto se hace para
estandarizar los valores de RF. Frecuentemente esta distancia es de 10 cm.; parece
ser la ms conveniente para medir valores de RF. Despus del desarrollo, las placas
pueden secarse rpidamente con una corriente de aire caliente.
La mejor posicin de desarrollo para un componente es el punto medio entre el
origen y el frente del eluyente, ya que permite separar las impurezas que se
desplazan con mayor y menor velocidad. El frente del eluyente nunca debe llegar a
tocar el borde de la placa.
Si la placa se estropea por accin del aire o de la luz, se secar en una cmara que
contenga un gas inerte o aislada de la luz.
Localizacin de sustancias
Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posicin de
dichos compuestos, para ello existen dos tipos de mtodos:
Mtodos qumicos.
Mtodos fsicos.
Mtodos qumicos
Consisten en ralizar una reaccin qumica entre un reactivo revelador y los
componentes separados, para ello se pulveriza la placa con los reactivos

reveladores con la ayuda de un pulverizador de vidrio y una pera de goma, o

mediante un dispositivo que proporcione aire comprimido.
Es preferible pulverizar con las placas en posicin horizontal. Si el reactivo revelador
es peligroso o muy corrosivo, la pulverizacin deber realizarse en una vitrina de
gases bien ventilada.
La pulverizacin se realizar poco a poco. En cromatografa en capa fina no puede
realizarse el baado del cromatograma (en cromatografa en papel s).
Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos
coloreados con los componentes orgnicos (con tonos amarillo-marrn), pero las
manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente sealar las manchas
aparecidas.
Otro reactivo revelador bastante utilizado es el cido sulfrico, que reacciona con
los componentes orgnicos produciendo manchas negras.
El tamao de las manchas no est relacionado con la cantidad de componente
separado.
Adems de estos reveladores generales, existen otros especficos:
2,4 - dinitrofenilhidracina (para aldehidos y cetonas).
Verde de bromocresol (para cidos carboxlicos).
Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas).
Ninhidrina (para aminocidos).
Mtodos fsicos.
El ms comn consiste en aadir al adsorbente un indicador fluorescente. De tal
forma que al colocar la placa bajo una lmpara ultravioleta, y dependiendo del
indicador y de la longitud de onda, aparecen manchas fluorescentes en las zonas en
las que hay componentes, o en otros casos aparece toda la placa fluorescente
excepto donde hay componentes.
Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal) con lo que
pueden ser detectados directamente en una lmpara de ultravioleta.
Constantes Rf Y Rx
La constante RF (Ratio of Front) es simplemente una manera de expresar la posicin
de un compuesto sobre una placa como una fraccin decimal, mide la retencin de
un componente. Se define como:

La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la

mancha, los clculos se simplifican si el denominador es 10. Para que los RF sean
reproducibles deben ser fijadas una serie de condiciones (Espesor de la placa, fase

mvil, fase estacionaria, cantidad de muestra). El mximo valor de RF que se puede

alcanzar es de 1, lo ideal es un RF entre 0.65 y 0.7.
Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la misma
placa y se desarrolla con varios eluyentes. Una vez desarrollados se calculan
los RF y si son distintos, puede deducirse con toda seguridad que no se trataba del
mismo compuesto. Por el contrario si los RF son iguales los compuestos pueden ser
iguales o no serlo.
Si se sospecha que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la misma
placa con el mismo eluyente u otros de menor polaridad, hasta apreciar una
separacin mnima. En este caso no se pueden usar reveladores qumicos, ya que
alteraran los compuestos, sino indIcador ultravioleta.
Tambin se puede operar de la manera siguiente: Se selecciona un compuesto (X),
que tenga una posicin de desarrollo conveniente; todos los dems compuestos
sobre la placa se relacionan con ste. De esta manera se tiene el , RX , ya que: