Sunteți pe pagina 1din 55

1)Regulile sanitaro-igienice i regimul antiepidemic n laboratoarele microbiologice n raport cu

riscul infecios.
Activitatea n laboratoarele de microbiologie implic riscul contractrii unor infec ii , care pot fi
agravate.Prevenirea infeciilor de laborator i rspndirii lor eventuale n colectivitate impune
cunoaterea:*riscul potenial reprezentat de microorganismele manipulate, *cilor prin care ele ptrund n
organism *metodelor corecte de limitare a accesului acestor organisme la cile de transmitere i por ile de
intrare n organism.Organizaia Mondial a Sntii clasific agen ii infec io i n 4 grupe de risc infec ios
individual i pentru colectivitate.Primul grup reprezint un risc individual redus i colectiv redus(microbi
nepatogeni pentru adultul sntos, posibil oportuni ti pentru gazda imunocompromis:vaccinuri vii
atenuate,Bacillus subtilis,epidermidis.)Grupul doi reprezint un risc individual moderat i colectiv
redus(nematode,trematode,protozoare
parazite
pentru
om,
fungi
dermatofi i
sau
oportuniti,bacterii,virusuri, gonococi,meningococi, bacilii tuberculozei, ricketsii,virusul gripal,bacil
difteric etc.)Grupul 3 reprezint un risc individual mare i colectiv redus(rickettsii tifos,febre ptate,
bacilii tuberculozei,fungi dimorfi, virusurile hepatitelor B,C,virusul CML, meningococ, Yersinia pestis
etc.) Grupul 4 reprezint un risc individual mare i colectiv mare(virusurile febrelor
hemoragice:Junin,Marburg,Lassa,Ebola, virusul encefalitei acariene de primvar-var).
Un laborator este autorizat s manipuleze microorgaisme cu un anumit grad de risc numai in msura n
care personalul este pregtit, are dotrile necesare i poate aplica metodele de siguran pentru a preveni
rspndirea agenilor infecioi n mediul unde sunt manipula i sau men inu i. Organiza ia Mondial a
Sntii a stabilit 4 niveluri de exigen.1 i al 2-lea nivel-laboratoarele de bazn care se manipuleaz
microorganisme cu risc de gradul 1 sau2, nivelul 3-laboratoare cu regim restrictiv, n care se manipuleaz
microorganime cu risc de gradul 3, nivelul 4-laboratoarele cu regim de maxim restric ie, n care se
manipuleaz microorganisme cu risc de gradul 4, funcioneaz n regim de exigen special .
La fel n laboratoarele de microbiologie diferen iem 3 bariere neiinfec ioase:
Bariere primare, care previn rspndirea unui microb n laborator;
Bariere secundare, care protejeaz personalul n cazul dep irii accidentale de ctre microorganisme a
barierelor primare;
Bariere teriare , care previn rspndirea n comunitate a microorganismelor care au dep it barierile
primare i secundare.
2)Tehnica de prelevare, ambalare i condiiile de transportare a materialului recoltat n infeciile
sistemului respirator.
Exudatul nazofaringian se prelev pentru diagnosticul tusei convulsive, a unor pneumonii intersti iale i a
portajului de microbi patogeni cum sunt meningococii,streptococii piogeni, bacilii difterici etc.Mai u oar
este prelevarea pernazal.Se utilizeaz tampon confec ionat pe tij din srm de crom nichel cu lungimea
de 20 cm i grosimea de 1mm.Una din extremiti este ndoit, nmuiat n colodiu i nf urat strns cu
vat.Extrimitatea liber este ndoit n bucl pentru a facilita manipularea.Aceste tampoane se pot ob ine
din secia de ORL.Capul pacientului este imobilizat i tamponul introdus blnd n lungul plan eului nazal
pn atinge peretele posterior al nazofaringelui.Este lsat cteva secunde pe loc, apoi rotit u or , pentru a-l
ncrca cu exudat,i retras.Cantitatea de prelevat cre te cnd tamponul se retrage i se rensereaz n
aceeai poziie, prima tamponare stimulnd secreia de mucus nazofaringian.
Prelevarea pe cale bucal se face cnd abordarea pernazal nu este posibil.Se utilizeaz un tampon
obinuit cu tij de srm.Extremitatea care poart tamponul este ndoit n unghi drept in momentul
scoaterii din tub. Tamponul, introdus prin gur in faringe, este trecut cu atenie in spatele palatului moale,
pentru a terge peretele posterion al nazofaringelui .La introducere i la scoatere se va evita contaminarea
tamponului cu secreii faringiene i bucale.
Moartea microbilor infectani poate fi cauzat de: razele solare directe; deshidratare; modificri de pH;
autoliz; oxigenul atmosferic in cazul anaerobilor strici. De aceea, odat recoltate, probele trebuie
examinate in cel mai scurt timp posibil sau conservate prin refrigerare i medii de transport adecvate.
Refrigerarea. La 0C (container izoterm cu ghea umed) sau la 4C (frigider) majoritatea microbilor
patogeni supravieuiesc cele cteva ore necesare transportului, iar multiplicarea contaminanilor este
oprit. De exemplu, semiviaa majoritii virusurilor (intervalul n care infeciozitatea suspensiei virale
scade cu 50%) se msoar n ore la temperatura camerei, n zile la 4C i n luni la 70C. Puine
bacterii nu rezist la refrigerare: meningococul, gonococul, Haemophilus influenzae.

Mediile de transport asigur supravieuirea microorganismelor prevenind desicarea, variaiile de pH,


oxidarea i autoliza. Un indicator, cum este rou fenol, permite monitorizarea vizual a pH-ului cnd
aceast condiie este critic pentru supravieuirea unor microbi (e.g. virusuri).
Microbii care sunt izolai pe culturi de celule sau embrioni de gin (ca virusurile i chlamidiile) se
transport n medii cu antibiotice (penicilin, streptomicin, nistatin).
3)Microscopul optic. Principiile construciei i tehnica microscopiei.
Examenul microscopic permite depistarea rapid a microbilor, observarea morfologiei, reaciilor de
culoare i a unor detalii structurale necesare identificrii lor. De aceea microscopul optic este
indispensabil oricrui laborator de microbiologie, iar microbiologul trebuie s cunoasc tehnicile de
microscopie.
Microscopul este format, in esen, din dou sisteme de lentile cuplate:

obiectivul, sistem de lentile cu distana focal de ordinul mm, situat ctre obiectul examinat;

ocularul, sistem de lentile cu distana focal de ordinul cm, situat ctre ochiul examinatorului.
Obiectivul formeaz imaginea primar, real mrit i rsturnat a obiectului plasat imediat dincolo de
distana focal. Ocularul funcioneaz ca o lup: reia imaginea primar, format imediat nuntrul
distanei sale focale, i o transform in imagine virtual, mult mrit, rsturnat i obinut la distana
minim a vederii clare a observatorului (2025 cm), care corespunde aproximativ nivelului mesei
portobiect a microscopului .
Descrierea microscopului optic
Orice microscop are n compunere o parte mecanic, un sistem optic i un sistem de iluminare .Detalii
privind forma i amplasarea diferitelor componente ale acestor sisteme pot varia n raport cu firma
productoare.
Partea mecanic
Piciorul suport i asigur stabilitatea aparatului. Pe picior se articuleaz braul microscopului care
poart corpul cu tubul microscopului i masa portobiect .
Micarea tubului n axul optic al microscopului este asigurat prin deplasarea corpului cu ajutorul
dispozitivelor de focalizare grosier i fin acionate prin butoane.Domeniul de lucru al micrii fine este
limitat la cca 1,7 mm i este indicat prin dou repere gravate pe corpul microscopului i un indicator pe
culisa micrii fine . Pentru a pstra capacitatea de deplasare a tubului n cele dou sensuri, indicatorul
trebuie adus la mijlocul cursei, marcat de cele dou repere.
Condensorul este focalizat printr-un buton .
Masa portobiect este prevzut cu deschidere central pentru luminarea obiectului, supori reglabili
pentru fixarea lamei portobiect i butoane care controleaz micrile mesei pe direcie transversal i
longitudinal .
Sistemul optic
Sistemul optic este purtat de tubul microscopului. Obiectivele se adapteaz la partea inferioar a tubului
prin capul revolver , care, prin rotire, le aduce dup dorin n axul optic. Un pinten acionat cu un resort
face s se perceap un declic la poziionarea corect a fiecrui obiectiv in axul microscopului. Ocularele
se adapteaz prin telescopare la partea superioar a tubului. Microscoapele moderne sunt prevzute cu cap
binocular, care adapteaz ocularele la distana interpupilar a observatorului i permit corecii pentru
ametropiile interoculare.
Sistemul de iluminare
Sursa de lumin. Pentru iluminarea preparatului se poate folosi lumina din surs exterioar dirijat ctre
preparat prin deschiderea mesei portobiect cu ajutorul unei oglinzi . La microscoapele moderne sursa de
lumin i dispozitivele de dirijare a fascicolului luminos (diafragma de cmp, oglinda i butoanele pentru
reglarea oglinzii) sunt incluse n piciorul microscopului.
Condensorul de cmp luminos este un sistem de lentile care focalizeaz lumina asupra preparatului,
contribuind esenial la luminozitatea imaginii.Un bun condensor este acromat i adaptabil la apertura
numeric a obiectivului.
4)Microscopul cu fond ntunecat. Principiile construciei i tehnica microscopiei.

Microscupul cu fond ntunecat este indicat pentru examen electiv pentru depistarea rapid a spirocheilor,
organisme foarte fine, puin refringente i mobile, care nu pot fi observate la preparate microscopice
uzuale.
Principiu: n condiii de iluminare obinuit rmn invizibile, cnd se afl n calea unei raze de lumin,
care nu este direcional spre ochiul observatorului (condiie a obscuritii), devin vizibile prin lumina
difractat i reflectat difuz pe suprafaa lor, i indic astfel observatorului traiectoria acestei raze.
Condensorul pentru cmp ntunecat oprete accesul spre obiectiv a razelor de lumin directe (creeaz
fondul ntunecat) i ilumineaz oblic obiectul. Parte din razele difractate i reflectate de ctre obiectul
iluminat oblic ptrund in obiectiv i formeaz imaginea luminoas a obiectului pe fondul negru al
cmpului. Microscopia pe fond negru obiectul floteaz intr-o pelicul de lichid pentru a evita reflexia
total a razelor nainte ca acestea s-l lumineze.
Necesar.
1.
Condensor cu oglinzi sferice concentrice, care nlocuiete condensorul pentru cmp luminos
la un microscop optic.
2.
Surs de lumin cu mare intensitate i diafragma iris.
3.
Lame de microscop cu grosimea de 1,0 mm. Numai pe asemenea lame preparatul este plasat
-in focarul conden- sorului (distana focal de 1,2 mm).
4.
Ulei de cedru.
5.
Camer obscur.
Procedura:
1.Se centreaz diafragma de cmp folosind condensorul de cmp luminos i obiectivul 10X
2.Se nlocuiete condensorul de cmp luminos cu cel pentru iluminarea cu fond negru.
3.Se depune o pictur de ulei de cedru pe lentila superioar a condensorului, ridicat la nivelul mesei
portobiect.
4.Se pune preparatul ntre lam i lamel peste pictura de ulei de cedru de pe lentila condensorului.
5.Se examineaz preparatul cu obiectivul 10X apoi, cu un obiectiv uscat mai puternic, dup necesitate. Cu
ct obiectivul are o apertur mai mare fondul cmpului microscopic este mai puin ntunecat. De aceea
pentru examinare cu imersia trebuie folosit un obiectiv prevzut cu diafragma iris.
Dup examinare, se depune preparatul ntr-un recipient cu soluie dezinfectant. Microscopia pe fond
ntunecat se folosete pentru evidenierea n preparate native a agen ilor cauzali ai sifilisului,tifosului
recurent, leptospirozei i altor boli ,precum i pentru studierea mobilit ii microorganismelor.
5) De demonstrat tehnica pregtirii preparatelor native din culturi pure de bacterii. Metodele de
studiere. Aplicarea practic
Frotiul este materialul microbian (produs patologic, cultur) etalat n strat subire pe suprafaa unei lame
speciale de sticl in vederea microscopiei. Pentru frotiuri folosim lame de microscop curate, degresate i
marcate la o extremitate cu indicativul materialului microbian examinat. Efectuarea frotiului cuprinde trei
timpi :
1.Etalarea. O ans de produs microbian fluid este ntins n strat ct mai subire i uniform pe o suprafa
de 12 cm ptrai in centrul lamei. Similar, o seciune dintr-o colonie bacterian pe mediu solid,
prelevat cu acul, poate fi suspensionat ntr-o pictur de ap in centrul lamelei. La etalare ansa i acul
se manipuleaz cu micri lente pentru a nu crea aerosoli contaminani la ruperi brute ale peliculei de
lichid.
Cu fragmentele de esuturi se efectueaz amprente: pe suprafaa de seciune a probei se aplic lama
pentru ca n poriunea ei central s rmn amprenta subire a esutului.
1.Uscarea frotiului se face la temperatura camerei, dar mai indicat este s fie grbit in aer cald sau pe
platin nclzit la 75C.
3Fixarea face frotiul mai aderent la lam, amelioreaz colorabilitatea structurilor celulare i omoar
microorganismele. Pentru studiul bacteriilor i multor fungi uzual este fixarea prin cldur. Lama, cu
frotiul uscat n sus, se nfierbnt trecnd-o de 23 ori, cca 5 secunde, prin flacra unui bec de gaz.
Pentru studiul protozoarelor este indicat fixarea cu alcool metilic.
La pregtirea frotiului din culturi bacteriene crescute n medii compacte pe lama rcit se aplic o
pictur de soluie izotopic de clorur de sodiu sau ap. Eprubeta cu cultur se fixeaz n mna stng cu
degetul mare i cel indicator. Ansa bacteriologic se sterilizeaz n flacra spirtierei. Dopul de vat se
fixeaz cu mezinul de la mna dreapt, se extrage din eprubet i se pstreaz n aceast poziie. Marginile
eprubetei se sterilizeaz prin flambare n flacra spirtierei, apoi n eprubet prin flacr se introduce ansa.
Ansa rcit de suprafaa intern a peretelui eprubetei se atinge de marginea mediului nutritiv la hotar cu

sticla (n caz c ansa nu va fi ndeajuns de rece, va produce un trosnet uor i va topi mediul). Cu ansa
rece se atinge cultura de microorganisme de pe suprafaa mediului. Ansa apoi se extrage, rapid marginele
epmbetei se flambeaz, se astup cu dopul trecut prin flacr i eprubeta se instaleaz n stativ. Toate
aciunile descrise au loc numai deasupra flcrii. Cultura se introduce cu ansa ntr-o pictur de ap pe
lam i se extinde uniform prin micri de rotaie pe o suprafa cu diametrul 1-1,5 cm (aproximativ de
dimensiunile monedei de 10-15 cop.), apoi ansa se flambeaz.
6)De demonstrat tehnica pregtirii frotiurilor din culturi pure de bacterii i colorarea prin metoda
Gram.
Frotiul din snge se prepar n modul urmtor. Cu un ac steril se n- eap degetul inelar de la mna sting,
n prealabil dezinfectat. Prima pictur se nltur cu vata uscat, apoi de pictura de snge aprut se
atinge suprafaa lamei bine degresat. Lama imediat se aeaz pe mas fixind-o cu mina sting, se atinge
pictura de sge cu marginea altei lame lefuite i puin mai nguste, sub un unghi de 45 . Cu o micare
uoar a lamei lefuite pictura se extinde n sting, neajungnd 1-1,5 cm de margine. Frotiul pregtit
corect este de culoare glbuie, uor transparent.
Frotiuri-amprente se pregtesc din organele interne ale cadavre lor, din produse alimentare de
consistent solid (came, ornai, unc i altele). Suprafaa organelor i a produselor alimentare se arde cu
bisturiul incandescent i din acest secte se taie o poriune de material. Fragmentul, cu suprafaa tiat se
atinge de lam n dou-trei locuri.
Uscarea i fixarea frotiului. Frotiuriie subiri se usuc rapid la temperatura camerei, iar cele mai groase se
usuc n termostat sau prin nclzire deasupra flcrii.Pentru ceasta lama se fixeaz de margini cu
degetele mare i indicator,iar cel mijlociu se plaseaz sub lam pentru a dirija gradul de nclzire i
evitarea coagulrii proteinei bacteriene i modificarea structurii celulare.
Frotiuriie uscate snt fixate n flacra spirtierei pentru a inactiva i a fixa bacteriile de lam i a evita
eluia lor n procesul de colorare.
Microorganismele omorte au o capacitate mai pronunat de a asimila coloranii i, totodat, ele nu
prezint pericol pentru cei care lucreaz.
Coloraia Gram. Metoda Gram, propus n 1884, n-a pierdut importanta practic pn n timpul
de fa. Aceast metod de colorare permite divizarea bacteriilor n gram-pozitive i gram-negative,
i nlesnete diagnosticul diferenial al unor boli infecioase.
Pregtirea soluiilor da colorani pentru coloraia Gram. Pentru aceast metod snt necesari
urmtorii colorani: 1-violat de genianA fenicat sau violet de metil, soluie apoas; 2 - soluia
Lugol; 3 - sloool 96%; 4 - fucsinA Pfaiffer.
Soluia violet de genian fenicat
Violet de genian - 1 g Aloool 95% - 10 ml Fenol cristal - 2 g Ap distilat - 100 ml
Violetul de genian, violetul de metil i violetul cristal snt colorani din seria trifenilmetanului, ceea
ce permite folosirea lor cu acelai succes n coloraia Gram.
Violet de metil n soluia apoas
Violet de metil - 0,2 g Ap destilat - 100 ml Aceast soluie este mai stabil.
Soluia Lugol
lodur de potasiu 2g, lod cristal 1 g Ap distilat - 100 ml
La nceput se pregtete soluia concentrat de iodur de potasiu, n care se dizolv iodul, apoi se
adaug ap distilat.
Coloraia Gram are patru etape.
1) Pe frotiul fixat se aplic soluia apoas a violetului de metil, timp de 1-2 min (la coloraia prin metoda
Sinev frotiul se acoper cu o hrtie de filtru, n prealabil mbibat cu soluia violetului de genian i
uscat, pe care apoi se aplic 2 picturi de ap), apoi soluia se vars.
2)Frotiul se prelucreaz cu soluia Lugol (1 mm) i ea se vars fr a-l spla cu ap.
3)Frotiul se decoloreaz cu alcool 95% (0,5-1 min), splnd dup aceasta resturile de alcool cu ap.
4)Frotiul se acoper cu fucsin Pfaiffer i peste 1-2 min colorantul se vars, preparatul se spal cu ap, se
usuc cu hrtie de filtru i se examineaz la microscopul imersic.
Prin aceast metod de coloraie microorganismele gram-pozitive se coloreaz n violet, iar cele gramnegative - n rou-roz, ceea ce este determinat de particularitile de structur i compoziia chimic a
celulei microbiene.

7) De demonstrat tehnica pregtirii frotiurilor din culturi pure de bacterii i colorarea prin metoda
Ziehl-Neelsen
nceputul de la ex . 6 +
Coloraia Ziehl-Neelsen se folosete pentru evidenierea mico bacteriilor acidorezistente ale tuberculozei,
leprei i unor actinomicete. Acidorezistena microorganismelor este condiionat de prezena lipidelor,
cerii, oxiacizilor n celulele lor. Astfel de microorganisme se coloreaz greu cu soluiile diluate de
colorani pentru a uura ptrunderea colorantului n celula microorganismului fucsina fenicat Ziehl,
aplicat pe frotiu, se nclzete la flacr.
Microorganismele colorate nu se decoloreaz cu soluii slabe de acizi minerali i alcool.
Coloraia Ziehl-Neelsen include urmtoarele etape:
1.Frotiul fixat se acofer cu hrtie de filtru. Pe ea se toarn fucsin fenicat Ziehl (se poate utiliza hrtie
de filtru, preventiv mbibat cu colorant i uscat .)Frotiul se nclzete la flacr pn la apariia vaporilor, apoi se rcete i se adaug o poriune nou de colorant. nclzirea se repet de 2-3 ori. Dup
rcire hrtia de filtru se nltur i frotiul se spal cu ap.
2.Frotiul se decoloreaz cu soluie de 5% de acid sulfuric i se spal de cteva ori cu ap.
3.Frotiul se recoloreaz cu albatru de metilen - soluie hidroalcoolic - 3-5 min, se spal cu ap i se
usuc
Bacteriile acido-rezistente colorate prin metoda Ziehl-Neelsen capy un ro u aprins ,iar restul
microflorei se coloreaz n albastru deschis.
8) De demonstrat tehnica pregtirii frotiurilor din culturi pure de bacterii i colorarea prin metoda
Burri-Hinss
nceputul de la ex. 6 +
Coloraia Hinss. Frotiul pregtit dup Burri i uscat la aer se fixeaz, aplicnd 2-3 picturi de alcool, care
se arde pe lam. Pe lama rcit se aplic fucsina Pfaiffer - 3-5 min, se spal cu ap i se usuc. In acest
caz bacteriile se coloreaz n rou, iar capsulele incolore evident contrasteaz pe fondul ntunecat al
frotiului. Uneori n jurul bacteriilor colorate acapsulate se observ zone mici incolore - pseudocap sulate,
care apar n urma uscrii i fixrii incorecte a frotiului.
9) De demonstrat tehnica pregtirii frotiurilor din culturi pure de bacterii i colorarea prin metoda
Aujeszky
nceputul de la ex. 6 +
Coloraia Aujeszky. Se prepar un frotiu des din cultur, se usuc la aer, se mordeaz cu soluie de 0,5%
acid clorhidric i se nclzete pn la apariia vaporilor. Pe urm frotiul se spal cu ap, se usuc, se
fixeaz n flacr i se coloreaz prin metoda Ziehl-Neelsen. Sporii se coloreaz n rou-roz, iar celula - n
albastru.
10) De demonstrat tehnica pregtirii frotiurilor din culturi pure de bacterii i colorarea prin
metoda Neisser.
ncepnd de la ex.6+
Metoda Neisser. Coloraia granulaiilor de volutin prin aceast metod include urmtoarele etape.
1.Frotiul fixat se coloreaz cu albastru de metilen acetat - 1 min, colorantul se nltur i se spal cu ap.
2.Se acoper cu soluia Lugol - 20-30 s.
3.Fr a fi splat, frotiul se coloreaz cu vezuvin - 1-3 min, apoi se spal cu ap i se usuc.
Albastru de metilen acetat Neisser
Albastru de metilen - 0,1 g Alcool 95% - 2 ml Acid acetic glacial - 5 mi Ap distilat - 100 ml
Vezuvin
Vezuvin - 12 g Alcool 95% - 60 ml Ap distilat - 40 ml
Amestecul se fierbe i dup rcire se filtreaz.

11.Noiune de sterilizare. Obiectul i regimul sterilizrii


prin cldur umed. Controlul eficienii sterilizrii.
Sterilizarea este distrugerea sau indepartare tuturor microorganismelor,inclusiv a sporilor.
Sterilizarea prin caldura umeda,se face cu ajutorul autoclavului prin vapori sub presiune,care
realizeaza 115C,la 0,5atmosfere,121C la o

atmosfera si 134c la 2 atmosfere.


Autoclavul este un cazan cu pereti rezistenti in care dupa inchiderea cu un capac
masiv,presat cu buloane sau sistem cabestan,vaporii de apa se
comprima la presiunea necesara sterilizarii.
Autoclavele cu peretele simplu pot fi verticale si orizontale.Se sterilizeaza sticlaria pentru
culturi de celule si aparatele de filtrare.
Procedura:
Se toarne apa in cazan,pina la 2-3 cm,prin incinta de sterilizare
Se aseaza pe suport obiectele de sterilizat in ambalajul lor.(flacoane,eprubete,cosuri din
sirma,cutii,casolete...)cu capacele semideschise
Se inchide etans capacul autoclavului
Se conecteaza sursa de caldura
Se deschide robinetul pentru evacuarea aerului.dupa ce aerul este complet evacuat din
incinta de sterilizare...
Se inchide robinetul de evacuare a aerului
Cind presiunea ajunge la valoarea aleasa se regleaza sursa de caldura,pentru a mentine o
presiune constanta,pe toata durata timpului de
sterilizare.
Se intrerupe sursa de caldura,pentru a se raci aparatul,se deschid lent robinetul de
vapori,apoi capacul.
Se lasa materialele pentru uscare in autoclava deschisa

Pentru controlul functionarii sterilizatorului cu vapori intre obiectele ce se


sterilizeaza se pune un tub de sticla sudat,care contine o substanta cu punctul de
topire cunoscut (benzonaftol-110C,acid benzoic-120C) si o cantitate mica de
colorant anilinic praf.La topirea acestor substante are loc colorarea lor uniforma.
Tyndalizarea-este sterilizarea fractionara pentru substantele care se degradeaza si
denatureaza usor la temperatura de 60C(serurile,vitaminele).Incalzirea se repeta
timp de 5-6 zile in aparate speciale cu termoreglatoare sau in baile de apa obisnuita
la temperatura de 56-58C cite o ora.
Pasteurizarea-se foloseste pentru distrugerea formelor asporulate ale
microorganismelor in special a speciilor patogene.Prin pasteurizare are loc
asanarea diverselor produse printr-o singura incalzire la 50-65C timp de 60 min sau
la 70-80C 5-10 min.Laptele se pasteurizeaza cu scopul inactivarii bacteriilor
acidolactice si patogene(tifo-paratifoidice,streptococilor,stafilococilor).

12.Noiune de sterilizare. Obiectul i regimul sterilizrii


prin cldur uscat. Controlul eficienii sterilizrii
Sterilitate este distrugerea sau indepartarea tuturor microorganismelor, inclusiv al sporilor.
Sterilizarea cu aer fierbinte(cald):
Indicatii: Obiecte din sticla (eprubete, flacoane, pipete) sau din portelan (mojare, pistile),
seringi Luer din sticla, instrument chirurgical, substante grase, pulberi termostabile.
Se realizeaza in etuva la temperature de 160-180 grade Celsius timp de o ora. Suplimentar
inca o ora in cazul ambalajelor voluminoase sau obiectelor care se incalzesc greu. Etuva e o
incinta cilindrica cu pereti dubli din table termoizolati.Un thermostat care mentine
temperature. Un
sistem de ventilare care uniformizeaza temperature.
Procedura: Obiectele sterilizarii se pun pe rafturi cu spatii intre ele pentru libera circulatie al
aerului cald. Se inchide etuva. Se deschid orificiile de ventilare si se conecteaza la retea. Se
marcheaza timpul de sterilizare. Obiectele se scot numai dupa racirea aparatului.
Controlul eficientei sterilizarii: 3 tipuri de indicatori; fizici (manometru, termometru),
chimici (floare de sulf (autoclave) se topeste la 115 grade C, acid benzoic(autoclava) se
topeste la 121-122 grade C, tiouree (etuva) se topeste la 180 grade) si biologici: tuburi cu
fire de bumbac cu spori, dupa sterilizare se insemanteaza.

13. Noiune de sterilizare. Sterilizarea chimic. Obiectele


i regimul sterilizrii. Controlul eficienii sterilizrii
Pentru sterilizarea chimica se folosesc gaze.Mai cunoscut este oxidul de etilen,un
gaz incolor,usor solubil in apa si imflamabil.Toxicitatea e moderata.
Indicatii: Sterilizarea echipamentului de plastic termosensibil se efectueaza in
laboratoarele de microbiologie.Mai larg este folosit in serviciile de

endoscopie(sterilizarea cateterelor si componentelor termosensibile ale


endoscoapelor),de chirurgie sau stomatologie.
Se utilizeaza in amestec cu 15% CO2(pentru a preveni explozii).In incinte etanse,la
55-60C si 40% umiditatea relativa,in concentratie de 450-800 mg /l oxidul de etilen
asigura sterilizarea in interval de 2,5-3h.
Controlul eficientei sterilizarii: 3 tipuri de indicatori; fizici (manometru, termometru),
chimici (floare de sulf (autoclave) se topeste la 115 grade C, acid benzoic(autoclava) se
topeste la 121-122 grade C, tiouree (etuva) se topeste la 180 grade) si biologici: tuburi cu
fire de bumbac cu spori, dupa sterilizare se insemanteaza.

14. Mediile de cultur. Cerinele fa de medii.


Clasificarea. Mediile uzuale, elective, diferenialdiagnostice, de mbogire. Aplicarea practic
Mediile de cultura =sunt soluii care asigura nutrientii si conditiile fizico-chimice necesare
cresterii si multiplicarii bacteriilor.
Cerinele fa de Mediile de cultura:
a. necesitile nutritive i energetice bct
b. umiditate optimal
c. pH optimal (7,2-7,4) i constant (caracter de tampon)
d. potenial de oxido-reducere optimal (anaerobi - rH2<5, aerobi rH2>10)
e. izotonic (0,5% NaCl)
f. steril i transparent
Clasificarea Mediilor de cultura:
--Dup provenienta nutrientilor
Empirice, naturale. Au la baz produse de origine animal sau vegetal (snge, ser, lapte,
ou, cartof, extracte din carne, cord, creier,ficat, pete, levuri, etc). Compoziia chimic
precis nu poate fi controlat.
Sintetice includ ingrediente chimice pure, compoziia chimic este cunoscut cu
exactitate
-- Dup consistenta
Lichide (bulion) utilizate pentru obinerea biomasei bacteriene i a produselor lor
(bulionul peptonat,glucozat,cu singe si biliat,apa peptonata si laptele)
Solide conin 10-15% gelatin sau 2-3% agar-agar (polizaharid extras din alge roii, t
topire 80-100C, solidificare 42C). Placa de geloz n cutii Petri si izolarea culturilor pure;
geloza nclinat (n pant) si acumularea culturilor pure.
Semilichide 0,2 0,5 % agar-agar. Se utilizeaz pentru studierea activitii biochimice
sau a mobilitii bacteriilor.
-- Dup compozitia chimic:
Medii uzuale (universale, simple):
- Ap peptonat (ap+1% pepton+0,5% NaCl)
- Bulion peptonat BP (extract apos din carne + 1% pepton+0,5% NaCl)
- Geloza nutritiv (BP + 2-3% agar-agar)
- Gelatina nutritiv (BP + 10-15% gelatin)
Sunt utilizate pentru creterea bacteriilor nepretenioase la cultivare
Sterilizarea prin autoclavare: 120C, 20 min
Medii complexe:
elective
selective:
- pe mediu solid
-pe mediu lichid = mediu de imbogatire
diferential-diagnostice (DD):
- izolare cultura pura
- multitest, pt acumulare cultura pura si identificare preliminara
- identificare finala
speciale
de transport
Medii elective formate din medii simple cu adaos de componente care permit creterea
mi/o exigente nutritiv (bulion-ser, bulion glucozat,geloz-snge streptococi, neisserii; ser
coagulat corinebacterii, etc)

Mediile de mbogire reprezint medii selective lichide, utilizate pentru mbogirea florei
patogene i inhibarea florei de asociaie dintr-un prelevat plurimicrobian (ex: materii fecale)
a. Mediul Muller (BP+Lugol+CaCO3+hiposulfit)
b. Mediul Kauffmann (mediul Muller+bil+verde de briliant) Salmonella
c. Bulion cu selenit Shigella, Salmonella
d. Ap peptonat alcalin (pH=8) Vibrio cholerae
e. Kitt-Tarrozzi (BP+0,5% glucoz+buci de ficat) pentru anaerobi
Medii diferenial-diagnostice ) permit diferenierea speciilor bacteriene n baza
activitii lor biochimice (zaharolitice, proteolitice,lipolitice, de oxido-reducere)
Sunt construite dup urmtoarea schem: Baz nutritiv+substrat+indicator (la necesitate)

15.Mediile de cultur. Cerinele fa de ele. Mediile


selective
i
diferenial-diagnostice.
Componena,
aplicarea practic.
Mediile de cultura =sunt soluii care asigura nutrientii si conditiile fizico-chimice necesare
cresterii si multiplicarii bacteriilor.
Cerinele fa de Mediile de cultura:
a. necesitile nutritive i energetice bct
b. umiditate optimal
c. pH optimal (7,2-7,4) i constant (caracter de tampon)
d. potenial de oxido-reducere optimal (anaerobi - rH2<5, aerobi rH2>10)
e. izotonic (0,5% NaCl)
f. steril i transparent
Medii selective medii solide cu adaos de componente sau cu condiii fizico-chimice
particulare care stimuleaz creterea unor specii i inhib creterea altor specii (geloza
salin - stafilococi, geloza alcalin - vibrioni, mediul Ploskirev - Salmonella, Shigella, etc)
Medii diferenial-diagnostice (DD) permit diferenierea speciilor bacteriene n baza
activitii lor biochimice (zaharolitice, proteolitice,
lipolitice, de oxido-reducere)
Sunt construite dup urmtoarea schem: Baz nutritiv+substrat+indicator (la necesitate)
-Medii DD pentru izolarea culturii pure
Studierea proprietilor zaharolitice:
Endo (geloz+lactoz+fucsin+hiposulfit de Na)
Levin (geloz+lactoz+eozin+albastru metilen)
Ploskirev (geloz+lactoz+rou neutru+sruri de acizi biliari+verde de briliant)
Coloniile lactozo-pozitive vor fi colorate (roii pe Endo, Ploskirev, albastru-violete pe Levin)
Studierea proprietilor de oxido-reducere:
Mediul cu sulfit de Bi pentru Salmonella (colonii negre reducerea sulfitului n sulfura de
Bi)
Mediul Klauberg (geloz-snge cu telurit de K) pentru Corynebacterium diphtheriae
Studierea proprietilor lipolitice:
Geloza cu glbenu de ou bacteriile cu lecitinaz formeaz un halou opac n jurul coloniei
Studierea proprietilor hemolitice:
Geloza-snge (geloza+5-15% snge defibrinat) in cazul hemolizei n jurul coloniilor apare o
zon clar
-Medii DD multitest pentru acumularea culturii pure i identificare preliminar
Kligler identic Russel+sulfat de Fe (detectarea H2S)
Olkeniki identic Kligler+1% zaharoz+uree
Indicatorul Andrede fucsin+NaOH
Scindarea glucidelor (acid - A, acid i gaz - AG) duce la modificarea pH i virajul culorii
mediului din rou n galben. n pant se apreciaz lactoza/zaharoza (oxidare), n coloanglucoza (fermentare).
-Medii DD pentru identificarea final
irul pestri Hiss (lichid sau semisolid): tuburi ce conin soluii 0,5% de diferite glucide i
indicator. Aprecierea dup modificarea culorii (acid -A) i apariia bulelor de gaz (acid i gaz
- AG)

16.De selectat mediile de cultur i de descris proprietile


biochimice ale microorganismelor.
Activitatea zaharolitic (irul Hiss, coagularea laptelui, etc)
Activitatea proteolitic
Degradarea proteinelor native (lichefierea gelatinei sau a serului coagulat, peptonizarea
laptelui, etc)
Evidenierea enzimelor specifice (ureaz, decarboxilaze, dezaminaze, etc) prin detectarea
produsele finale ale reaciilor: H2S, NH3, indol
o Depistarea producerii H2S: formarea sulfurii de fer de culoare neagr n mediile multitest
Kligler, Olkeniki, etc; plasarea unei benzi de hrtie de filtru mbibat cu acetat de Pb
deasupra n care crete cultura studiat (formarea sulfurii de Pb nnegrete hrtia)
o Depistarea indolului (produs al metabolizrii triptofanului) benzi de hrtie mbibate cu
acid oxalic. n prezena indolului indicatorul vireazn roz.
o Depistarea amoniacului (ureaza) hrtia de turnesol se coloreaz n albastru.
o Depistarea catalazei (H2O2 .... H2O + O2): cultura se amestec cu o pictur de ap
oxigenat apariia bulelor de gaz
o Depistarea oxidazei (detectarea prezenei citocromoxidazei din lanul respirator)
Reactiv di (tetra)metil-parafenilen-diamin (benzi sau rondele de hrtie mbibate cu
reactiv, creioane, etc)
Oxidarea reactivului culoare violet-neagr
Oxidazo+ : Neisseria, Vibrio, Pseudomonas
Oxidazo- : Enterobacteriaceae
o Depistarea lecitinazei mediu cu glbenu de ou 10% - formarea unui halou opac n jurul
coloniilor
o Depistarea lipazei mediu cu Twin 80 1% halou opac n jurul coloniilor (precipitarea
acizilor grai)
o Depistarea hemolizinei geloz-snge 5-10% - zon clar n jurul coloniei
o Depistarea ADNazei, fosfatazei, etc
Probele sunt incubate la 37 C, 18-24 h

17.De demonstrat tehnica de nsmnare pe geloz-snge,


geloz salin cu ou, mediul Hiss i Kligler. De descris
caracterele de cultur. Aplicarea practic.
Geloza singe. La geloza sterila lichefiata si racita pina la 45C,repartizata in
eprubete si flacoane se adauga de la 5 pina la 10% singe defibrinat,20-25% ser
sanguin.Geloza in eprubete se amesteca minutios si se inclina,iar continutul
flacoanelor se toarna in cutiile Petri.La bulionul steril se adauga in aceeasi
cantitati(ca si in geloza) singe sau ser sanguin.In aceste medii dupa controlul
sterilitatii se cultiva cocii patogeni( streptococii,meningococii,gonococii).(pentru
mediile de cultura speciale)
Geloza cu glbenu de ou bacteriile cu lecitinaz formeaz un halou opac n jurul coloniei

Mediul Hiss-servesc pentru evidentierea enzimelor care scindeaza


glucidele.Actualmente mediile uscate cu glucide se pregatesc la fabrici.Ele constau
din geloza,glucid si indicatorul Andrade.Din praf uscat se prepara medii
semilichide:2g praf se dizolva in 100ml de apa distilata,incalzindo pina la fierbere,se
repartizeaza in eprubete sterile,se sterilizeaza 10min la 110C sau cu vapori
fluenti.Indicatorul Andrade in mediul acid capata o culoare rosie,in cel alcalin este
incolor,in neutru-roz.(pentru mediile de cultura diferential-diagnostice)
Mediul Kligler - mediu utilizat pentru diferentierea enterobacteriilor pe baza
fermentarii zaharurilor (glucoza, lactoza) si a producerii de hidrogen sulfurat

18.De demonstrat tehnica de insmnare n bulion


peptonat, geloz n pant, pe placa cu geloz, geloz
semilichid. De descris caracterele de cultur. Aplicarea
practic
Prepararea mediilor de cultura speciale:

1.Bulionul peptonat si geloza cu glucoza si cu alte glucide-Pentru prepararea


bulionului si gelozei glucozate la bulionul peptonat sau geloza lichefiata se adauga
de la 0,5 pina la 1% glucoza.Mediile ,,glucozate se sterilizeaza cu vapori fluenti 3
zile la rind cite 30 min sau sub presiunea de 0,4 atm(110C)-10-15min.Pentru
cultivarea streptococilor la bulionul peptonat sau geloza sterila se adauga solutie de
glucoza 10% in apa distilata,proaspat pregatita si fiarta.La 5ml de mediu se adauga
0,5 ml solutie glucoza.Pentru controlul sterilitatii bulionul se introduce in termostat
pe 24 ore la 37C.
Bulionul cu 2-5% glicerina se prepara analog cu bulionul glucozat,in el se cultiva
agentul tuberculozei si alte bacterii.

19. De selectat mediile de cultur i de descris etapele de


izolare a culturilor pure de bacterii aerobe.
Prelevatul este supus examenului macroscopic (modificarea aspectului, a mirosului, etc) orientare n diagnostic
Dup necesitate, probele sunt supuse pregtirii pentru investigaie (diluare, omogenizare,
centrifugare, etc)
Examinarea microscopic (preparate native, Gram, Ziehl-Neelsen, Burri-Hinss...) prezena
mi/o, forma, cantitatea, G+/-.
I etap IZOLAREA CULTURILOR PURE
Scopul izolrii - de a obine o cultur pur dintr-un melanj de celule bacteriene sau dintr-un
produs patologic.
Tehnici utilizate:
o Prin epuizarea inoculului pe suprafaa gelozei din cutia Petri (nsmnare n striuri
paralele, nsmnare n cadrane, etalarea consecutiv pe trei cutii).
o Metoda diluiilor logaritmice a inoculului n geloz topit i rcit la 50 C apoi turnate n
cutii Petri sau eprubete.
Incubare n termostat la 37 C, 18-24 h .
Metode speciale de izolare n culturi pure: bct sporulate: nclzirea prealabil a prelevatului
80 C 20 min; bct acido-rezistente: tratarea prealabil cu acid a prelevatului i
neutralizarea ulterioar cu o baz; bct din asociaii cu numr minim de mi/o patogene:
mbogirea prealabil
a florei patogene utiliznd medii de mbogire; bct cu virulen nalt i pretenioase la
cultivare: inocularea la animalele de laborator sensibile
II etap ACUMULAREA CULTURII PURE
Examinarea macroscopic a coloniilor crescute (form, culoare, dimensiuni, etc)
Examinarea microscopic (frotiu Gram) a coloniilor suspecte si confirmarea puritii culturii
Repicarea coloniilor suspecte pe geloz n pant si acumularea culturii pure
Termostat, 37 C, 18-24 ore
III etap IDENTIFICAREA CULTURII PURE
Verificarea puritii culturii (frotiu Gram)
Identificarea culturii pure const n evidenierea unor caractere specifice ale acestei culturi
pentru a o include ntr-o familie, gen, specie, variant
Se studiaz caracterele: Morfologice; Tinctoriale; De cultur; Biochimice; Antigenice
(seroidentificarea); De patogenitate; Sensibilitatea la bacteriofagi (fago-identificarea);
Sensibilitatea la AB
IV etap EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA SI ELIBERAREA RSPUNSULUI
Compararea rezultatelor obinute cu caracterele speciilor bacteriene cunoscute pentru a gsi
asemnri.

20.De demonstrat metodele de creare a condiiilor de


anaerobioz pentru cultivarea bacteriilor anaerobe.
EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU CULTURI ANAEROBE (clostridiene, neclostridiene)
Condiia principal cultivare n absena oxigenului
Utilizarea mediilor anaerobe (Kitt-Tarrozzi regenerat - 100 C, 20 min, rcit, acoperit cu
vazelin; nsmnarea n geloz n coloan)
Crearea condiiilor de anaerobioz
Metoda fizic utilizarea anaerostatului

Metoda chimic n exicator se ntroduc substane ce fixeaz oxigenul (pirogalol+baz);


utilizarea gas-pachetelor
Metoda biologic Fortner cultivarea concomitent a aerobilor i anaerobilor
Recoltarea cu precauie, evitnd contactul cu aerul (n seringi, utiliznd medii speciale)
I etap MBOGIREA ANAEROBILOR
nsmnarea prelevatului n 2 eprubete cu mediul Kitt-Tarrozzi regenerat
nclzirea unui tub la 80 C, 20 min distrugerea florei nesporogene
Incubarea la 37 C, 24-48 h (va avea loc nmulirea anaerobilor)
II etap - IZOLAREA CULTURII PURE DE ANAEROBI
Studierea caracterelor de cultur tulburarea mediului, descompunerea bucilor de ficat,
etc
Izolarea culturii pure de anaerobi prin metoda Zeissler (nsmnarea a 0,1 ml din mediul K-T
pe 3 cutii cu geloz-snge glucozat
consecutiv). Incubarea n anaerostat/exicator/gas-pack, 24-48 h
Metoda Weinberg diluii succesive a culturii n geloz glucozat lichefiat i aspirarea n
tuburi lungi i nguste, nchise ermetic. Incubarea n
termostat, 24 h
III etap - ACUMULAREA CULTURII PURE
Studierea macroscopic a coloniilor
Examinarea microscopic (frotiu Gram) a coloniilor suspecte
Repicarea n mediul K-T regenerat pentru acumularea culturii pure
Incubarea n termostat, 24 h
IV etap - IDENTIFICAREA CULTURII PURE DE ANAEROBI
Verificarea puritii culturii pure (frotiu Gram)
Studierea caracterelor culturii pure izolate (cu respectarea condiiilor de anaerobioz)
V etap - EVALUAREA REZULTATELOR, FORMULAREA I ELIBERAREA RSPUNSULUI

21.De selectat mediile de cultur i de descris etapele de izolare a culturilor pure de bacterii
anaerobe.
MC = soluii/substrate solide, asigur nutrienii i condiiile fizico-chimice pt cultivarea bct.
Pot fi utilizate pt: cultivarea (izolarea) bacteriilor; testarea sensibilitii la AB; stocarea sau transportul culturilor
bacreiene.
Cerinele fa de MC:
a. necesitile nutritive i energetice bct
b. umiditate optimal
c. pH optimal (7,2-7,4) i constant (caracter de tampon)
d. potenial de oxido-reducere optimal (anaerobi - rH2<5, aerobi rH2>10)
e. izotonic (0,5% NaCl)
f. steril i transparent
Clasificarea MC:
Dup provenien
Empirice, naturale. Au la baz produse de origine animal sau vegetal (snge, ser, lapte, ou, cartof,
extracte din carne, cord, creier, ficat, pete, levuri, etc). Compoziia chimic precis nu poate fi
controlat.
Sintetice includ ingrediente chimice pure, compoziia chimic este cunoscut cu exactitate
Semisintetice
Dup consisten
Lichide (bulion) utilizate pentru obinerea biomasei bacteriene i a produselor lor (AB, E, toxine)
Solide conin 10-15% gelatin sau 2-3% agar-agar (polizaharid extras din alge roii, t topire 80100C, solidificare 42C). Placa de geloz n cutii Petri izolarea culturilor pure; geloza nclinat (n
pant) acumularea culturilor pure.
Semisolide 0,2 0,5 % agar-agar. Se utilizeaz pentru studierea activitii biochimice sau a mobilitii
bacteriilor.
Dup compoziia chimic (complexitate) i destinaie
Medii uzuale (universale, simple)
Ap peptonat (ap+1% pepton+0,5% NaCl)

Bulion peptonat BP (extract apos din carne + 1% pepton+0,5% NaCl)


Geloza nutritiv (BP + 2-3% agar-agar)
Gelatina nutritiv (BP + 10-15% gelatin)
Sunt utilizate pentru creterea bacteriilor nepretenioase la cultivare
Sterilizarea prin autoclavare: 120C, 20 min
Medii complexe:
elective
selective:
pe mediu solid
pe mediu lichid = mediu de imbogatire
diferential-diagnostice (DD)
izolare cultura pura
multitest, pt acumulare cultura pura si identificare preliminara
identificare finala
speciale
de transport
Medii elective formate din medii simple cu adaos de componente care permit creterea mi/o exigente nutritiv
(bulion-ser, bulion glucozat, geloz-snge streptococi, neisserii; ser coagulat corinebacterii, etc)
Medii selective medii solide cu adaos de componente sau cu condiii fizico-chimice particulare care stimuleaz
creterea unor specii i inhib creterea altor specii (geloza salin - stafilococi, geloza alcalin - vibrioni, mediul
Ploskirev - Salmonella, Shigella, etc)
Mediile de mbogire reprezint medii selective lichide, utilizate pentru mbogirea florei patogene i inhibarea
florei de asociaie dintr-un prelevat plurimicrobian (ex: materii fecale)
a. Mediul Muller (BP+Lugol+CaCO3+hiposulfit)
b. Mediul Kauffmann (mediul Muller+bil+verde de briliant) Salmonella
c. Bulion cu selenit Shigella, Salmonella
d. Ap peptonat alcalin (pH=8) Vibrio cholerae
e. Kitt-Tarrozzi (BP+0,5% glucoz+buci de ficat) pentru anaerobi
Medii diferenial-diagnostice (DD) permit diferenierea speciilor bacteriene n baza activitii lor biochimice
(zaharolitice, proteolitice, lipolitice, de oxido-reducere)
Sunt construite dup urmtoarea schem: Baz nutritiv+substrat+indicator (la necesitate)
Medii DD pentru izolarea culturii pure
Studierea proprietilor zaharolitice
Endo (geloz+lactoz+fucsin+hiposulfit de Na)
Levin (geloz+lactoz+eozin+albastru metilen)
Ploskirev (geloz+lactoz+rou neutru+sruri de acizi biliari+verde de briliant)
Coloniile lactozo-pozitive vor fi colorate (roii pe Endo, Ploskirev, albastru-violete pe Levin)
Studierea proprietilor de oxido-reducere
Mediul cu sulfit de Bi pentru Salmonella (colonii negre reducerea sulfitului n sulfura de Bi)
Mediul Klauberg (geloz-snge cu telurit de K) pentru Corynebacterium diphtheriae
Studierea proprietilor lipolitice
Geloza cu glbenu de ou bacteriile cu lecitinaz formeaz un halou opac n jurul coloniei
Studierea proprietilor hemolitice
Geloza-snge (geloza+5-15% snge defibrinat) in cazul hemolizei n jurul coloniilor apare o zon clar
Medii DD multitest pentru acumularea culturii pure i identificare preliminar
Russel geloz+1% lactoz, 0,1% glucoz, indicator
Kligler identic Russel+sulfat de Fe (detectarea H2S)
Olkeniki identic Kligler+1% zaharoz+uree
Indicatorul Andrede fucsin+NaOH
Scindarea glucidelor (acid - A, acid i gaz - AG) duce la modificarea pH i virajul culorii mediului din
rou n galben. n pant se apreciaz lactoza/zaharoza (oxidare), n coloan-glucoza (fermentare).
Producerea H2S nnegrirea mediului
Medii DD pentru identificarea final
irul pestri Hiss (lichid sau semisolid): tuburi ce conin soluii 0,5% de diferite glucide i indicator. Aprecierea
dup modificarea culorii (acid - A) i apariia bulelor de gaz (acid i gaz - AG)
Medii cu AA (lizin, arginin, ornitin) i indicatori
Medii speciale pentru izolarea unor anumite bacterii (Finn, Popescu, Lowenstein-Jensen pentru agenii
tuberculozei, Sabouraud fungi)
Medii de transport transportare/stocare material (prelevat). Menine n via bacteriile, fr a favoriza
multiplicarea lor. Mediul cu glicerin 30%; Soluie tampon-fosfat; Soluie NaCl 3%; Mediul Cary-Blair; Mediul
Stuart (NaCl, 0,5% agar, tioglicolat de Na, albastru de metilen) pentru anaerobi, neisserii, etc

Pentru cultivarea bacteriilor o cantitate mic de material ce conine bacterii (inoculum) se ntroduce ntr-un mediu de
cultur (nsmnare, inoculare), care ulterior va fi incubat n termostat (pentru asigurarea temperaturii optime).
n timpul incubrii (18-24-48 ore..) bacteriile cresc i se divid, formnd o cultur bacterian (totalitatea
bacteriilor acumulate prin multiplicare intr-un mediu).
M.tuberculosis 3-5 sptmni
V.cholerae 6-12 ore
Cultur pur format din bacterii de aceeai specie (indispensabil identificrii)
Cultur mixt compus din bacterii de specii diferite
Tulpin populaie microbian constituit din descendenii unei singure izolri n cultur pur, care va fi studiat
ulterior.
Clon populaie care rezult din multiplicarea unei singure celule
Manifestarea creterii i multiplicrii bacteriilor
n mediu lichid
Turbiditate uniform
Formarea unei pelicule la suprafaa mediului (vibrioni, yersinia - agentul pestei)
Formarea unui sediment la fundul tubului sau pe perei (streptococi, Bacillus anthracis)
n mediu solid formarea coloniilor
Colonie o aglomerare de bacterii care se dezvolt dintr-o singur celul sau un grup de celule (UFC - unitate
formatoare de colonii) pe suprafaa unui mediu solid. Fiecare specie bacterian formeaz colonii specifice (caracter
util n identificare).
Caracteristica coloniilor
a. Dimensiuni colonii mici (0,1-1mm), medii (1-2mm), mari (2-3mm)
b. Contur (margini) neted, ondulat, zimat, lobat, etc
c. Suprafa plat, bombat, convex, ombilicat, etc
d. Form punctiform, circular, filamentoas, neregulat
e. Culoare (pigmentaie) alb, galben, aurie, etc
f. Densitate opac, transparent, etc
g. Consisten cremoas, untoas, uscat, mucoid
Tipurile de colonii: Colonii S (smouth) rotunde, netede, umede, lucioase; Colonii R (rough) margini neregulate,
suprafaa uscat, rugoas
Caracterele de cultur ale bacteriilor = exigenele nutritive (medii, temperatur, pH, aerare, etc), viteza i
manifestarea creterii pe medii lichide i solide
Dinamica multiplicrii bacteriilor n culturi
n funcie de modul de dezvoltare a culturilor bacteriene se disting:
Culturi discontinue
Culturi continue
Culturi sincrone
Culturile discontinue se obin la cultivarea bacteriilor n volum limitat de mediu. Astfel de culturi sunt obinute i
utilizate n laboratorul microbiologic
Fazele dezvoltrii unei culturi discontinue
I. Faza de lag faza de adaptare la condiiile mediului, bacteriile sunt active metabolic, cresc n dimensiuni, dar nu
se divid. Durata este variabil (2-4 ore); depinde de starea bacteriei, condiiile mediului, etc
II. Faza logaritmic bacteriile cresc i se divid cu vitez maximal constant, curba evolueaz exponenial.
Bacteriile sunt foarte sensibile la ageni antimicrobieni (culturi utile pentru testarea sensibilitii la antibiotice).
Durata 8-10 ore.
III. Faza staionar rata celulelor care se multiplic scade treptat, numrul celulelor vii rmne constant mai multe
ore. Cauza consumarea nutrienilor, acumularea metaboliilor toxici. Morfologia bacteriilor este tipic speciei, apar
incluziuni, spori (culturi utile pentru identificare). Sensibilitatea la agenii antimicrobieni scade. Durata 10-12 ore.
IV. Faza de declin (letalitate) bacteriile mor progresiv.
Cultura continu se realizeaz cnd mediul de cultur este continuu rennoit i mbogit cu oxigen cu evacuarea
unei cantiti de cultur. Se realizeaz n chemostate sau turbidostate, cultura aflndu-se permanent n faza
exponenial. Se utilizeaz n microbiologia industrial. n intestin culturi continue.
Culturi sincrone culturi n care bacteriile se divid n acelai timp. ???

22.De descris tehnica de infectare, izolare, indicare a virusurilor n culturi celulare i oul
embrionat de gin.

Oul embrionat de gin (5-13 zile) reprezint un mediu de celule nedifereniate, cu multiplicare activ, steril i
lipsit de mijloace de aprare antiinfecioas. Se utilizeaz n prepararea unor vaccinuri virale (ex.: gripal)
- Iniial se verific viabilitatea embrionului la ovoscop n camera obscur.
- Prelevatul se inoculeaz steril cu seringa n cavitatea amniotic sau alantoidean, sau pe membrana
chorioalantoidean (utiliznd metoda deschis sau nchis).
- Orificiul se parafineaz i se incubeaz la 35-37C timp de 48-72 ore
Indicarea virusului n oul embrionat de gin
Oule se rcesc 18 ore la +4 grade C pentru o vazoconstricie maxim, apoi aseptic se taie coaja, se recolteaz
lichidul alantoic sau amniotic, iar MCA i embrionul se ntroduc n cutii Petri sterile. Se observ:
1. Moartea embrionului
2. Apariia modificrilor (hemoragii, pustule) pe MCA
3. Acumularea de HA n lichide
Virusurile sunt cultivate pentru: Stabilirea diagnosticului etiologic; Testarea infeciozitii virusurilor; Testarea
preparatelor antivirale; Producerea vaccinurilor
SISTEME DE CULTIVARE: Culturi de celule; Ou embrionat de gin; Animale de laborator
Animalele de laborator se utilizeaz limitat (receptivitate selectiv, preexistena infeciilor, cost avansat). Se recurge
numai cnd nu exist alte posibiliti (VHB, HIV, Coxsackie, etc). Constituie modele de cercetare sau de control al
vaccinurilor. Animalele utilizate curent oriceii albi nou-nscui, dar pot fi utilizai obolani, cobai, maimue, etc.
Regulile de lucru cu animalele de laborator (selectare, inoculare, examinare) sunt identice cu cele din infeciile
bacteriene.
Oul embrionat de gin (5-13 zile) reprezint un mediu de celule nedifereniate, cu multiplicare activ, steril i lipsit
de mijloace de aprare antiinfecioas. Se utilizeaz n prepararea unor vaccinuri virale (ex.: gripal)
Iniial se verific viabilitatea embrionului la ovoscop n camera obscur.
Prelevatul se inoculeaz steril cu seringa n cavitatea amniotic sau alantoidean, sau pe membrana
chorioalantoidean (utiliznd metoda deschis sau nchis). Orificiul se parafineaz i se incubeaz la 35-37 C timp
de 48-72 ore
Culturile de celule. Celulele provenite din esuturi adulte sau embrionare, normale sau tumorale, plasate ntr-un
mediu adecvat (nutrieni, pH, t) rmn viabile i se multiplic. Pentru cultivarea virusurilor se utilizeaz culturile n
monostrat celular.
Tipurile de culturi de celule:
Culturi primare (primar tripsinizate). Sunt obinute din esuturi adulte sau embrionare de origine animal sau uman.
Suport 4-6 pasaje (subcultivri)
Culturi diploide. Obinute din esut embrionar (MRS5, fibroblaste umane). Pot fi subcultivate 40-50 generaii
Linii continui de celule. Obinute din esut tumoral. Pot fi subcultivate nelimitat.
Obinera culturilor de celule primar tripsinizate:
Prelevarea esutului (ex.: rinichi de maimu)
Fragmentarea i splarea cu sol fiziologic
Dezagregarea tisular cu enzime proteolitice
Separarea celulelor prin centrifugare
Dozarea suspensiei 105 106 celule/ml
ntroducerea celulelor n mediu nutritiv i repartizarea n recipiente sterile
Incubarea pn la formarea monostratului celular (inhibiie de contact)
Monostratul poate fi infectat cu virus sau servete drept surs de celule pentru o nou cultivare (pasaj)
Mediile de cultur pentru culturi de celule conin AA, Vit, factori de cretere, sruri minerale (Eagle, Hanks, 199,
hidrolizat de lactalbumin, etc), rou fenol pentru monitorizarea pH (vireaz n galben n mediu acid)
Mediile de cretere sunt mbogite cu ser sangvin (uman, animal) pentru cultivarea CC
Mediile de ntreinere se utilizeaz pentru meninerea monostratului n procesul reproducerii virale. Nu conin ser.
CC reprezint sistemul virus-gazd predilect n virologia clinic i cercetare.
Inocularea CC; Se aleg tuburi cu monostrat bine format; Se nltur mediul de cretere, se spal cu sol. Hanks
Se inoculeaz 0,1 0,2 ml de prelevat; Peste 30-60 min n tuburi se toarn cte ; 1 ml mediu de ntreinere
Se ntroduc n termostat la t adecvat 3-4 zile

23.Componentele i tehnica determinrii CMI a antibioticelor prin metoda diluiilor


succesive. De interpretat rezultatele.
Metoda diluiilor
ntr-un ir de tuburi cu 1 ml BP se efectueaz diluia AB (256 UA, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5, etc). Se adaug n
fiecare tub (cu excepia celui martor) 0,1 ml de suspensie bacterian 105/ml. Termostat - 24h.
Lectura cea mai mic doz de AB care inhib creterea culturii dup 24h de incubare (mediu clar) constituie
Concentraia Minim de Inhibiie (CMI) a AB pentru tulpina testat. CMI msoar efectul bacteriostatic.

Concentraia Minim Bactericid (CMB) cantitatea minim de AB care omoar 99,9% din inoculum dup 18h de
incubare. Determinarea CMB din ultimele tuburi fr cretere se repic 0,1 ml de mediu pe placa cu geloz. Dup
24h se compar numrul celulelor ce au supravieuit cu nr iniial de bacterii (105/ml).
Corelaia dintre studii in vitro i rezultate in vivo
n studii in vitro parametrii (densitatea suspensiei bacteriene, concentraia AB, etc) nu se modific n timp. In vivo,
la pacieni, concentraia AB variaz n timp i n funcie de esut.
Pentru a stabili dac tulpina izolat este sensibil sau rezistent la un AB se cere cunoaterea Concentraiei
Terapeutice (CT) (cantitatea de AB prezent n focarul infecios n cursul tratamentului cu doze terapeutice) a fiecrui
AB testat.
Tulpini Sensibile CMI/CT <1, ex.: 2/8, 2/16 - efect terapeutic posibil cu doze uzuale
Tulpini Rezistente CMI/CT>1, ex.: 8/2, efect terapeutic imposibil
Tulpini Intermediare CMI/CT=1, efect terapeutic imprevizibil. Pot fi utilizate doze maxime de AB sau
administrarea lor local
Testarea CMI / CMB este indicat n tratamentul infeciilor grave : meningite, septicemii, endocardite, infecii
cronice sau la persoane cu imunosupresie.

24.Componentele i tehnica determinrii sensibilitii bacteriilor la antibiotice prin metoda


difuzimetric. Interpretarea rezultatelor.
Metoda difuzimetric (rondelelor).
Utilizat uzual n infecii banale.
Condiii: mediu standard, concentraie standard de mi/o (105/ml), rondele/discuri (comprimate) cu % standarde de
AB, condiii standarde.
Mediul este inoculat cu suspensia bacterian. Dup uscare n termostat se aplic rondelele 24h, 37C.
Lectura diametrul zonei de inhibiie a creterii culturii bacteriene este comparat cu diametrele standarde pentru
fiecare AB. Valori sub acest diametru tulpina este R, dac este depit S.

25.Componentele i tehnica determinrii rapide a sensibilitii bacteriilor la antibiotice


prin metoda diluiilor succesive. Interpretarea rezultatelor.
Metoda diluiilor
ntr-un ir de tuburi cu 1 ml BP se efectueaz diluia AB (256 UA, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5, etc). Se adaug n
fiecare tub (cu excepia celui martor) 0,1 ml de suspensie bacterian 105/ml. Termostat - 24h.
Lectura cea mai mic doz de AB care inhib creterea culturii dup 24h de incubare (mediu clar) constituie
Concentraia Minim de Inhibiie (CMI) a AB pentru tulpina testat. CMI msoar efectul bacteriostatic.
Concentraia Minim Bactericid (CMB) cantitatea minim de AB care omoar 99,9% din inoculum dup 18h de
incubare. Determinarea CMB din ultimele tuburi fr cretere se repic 0,1 ml de mediu pe placa cu geloz. Dup
24h se compar numrul celulelor ce au supravieuit cu nr iniial de bacterii (105/ml).
Corelaia dintre studii in vitro i rezultate in vivo
n studii in vitro parametrii (densitatea suspensiei bacteriene, concentraia AB, etc) nu se modific n timp. In vivo,
la pacieni, concentraia AB variaz n timp i n funcie de esut.
Pentru a stabili dac tulpina izolat este sensibil sau rezistent la un AB se cere cunoaterea Concentraiei
Terapeutice (CT) (cantitatea de AB prezent n focarul infecios n cursul tratamentului cu doze terapeutice) a fiecrui
AB testat.
Tulpini Sensibile CMI/CT <1, ex.: 2/8, 2/16 - efect terapeutic posibil cu doze uzuale
Tulpini Rezistente CMI/CT>1, ex.: 8/2, efect terapeutic imposibil
Tulpini Intermediare CMI/CT=1, efect terapeutic imprevizibil. Pot fi utilizate doze maxime de AB sau
administrarea lor local
Testarea CMI / CMB este indicat n tratamentul infeciilor grave : meningite, septicemii, endocardite, infecii
cronice sau la persoane cu imunosupresie.

26.Determinarea concentraiei antibioticelor n umorile organismului (snge, urin etc.).


Importana practic.
Indicaii:
- Utilizarea unui AB toxic
-

n caz cnd bolnavul sufer de deficiene metabolice sau excretoare (renale, hepatice)

Se compar concentraiile obinute cu CMI a antibioticului testat (sau cu CT).


. Studiul activitii inhibitorii a lichidelor biologice (NEI)
Indicaii: infecii grave care nu rspund rapid la tratament.

Efectuarea: la diluii duble (1/2, ...) ale lichidului examinat (ser, LCR, urin) se adaug suspensia bacterian (din
tulpina izolat de la bolnav).
Lectura: dup 24h de incubaie la 37 C se apreciaz diluia maxim cu efect bacteriostatic/cid.
NEI 1:8 reflect eficiena antibioticoterapiei .
Importanta practica : se foloseste pentru monitorizarea tratamentului cu AB si pentru verificarea eficientei
antibioterapiei.

27.Bacteriofagul. Titrarea bacteriofagului prin metoda Appelman. Importana practic.


Aplicarea bacteriofagului n scopuri terapeutice i profilactice.
Bacteriofagi = virusuri ce infecteaz bacteriile. Parazii intracelulari obligatorii ai bct.
Toate bacteriile pot fi infectate de ctre bacteriofagi.
In majoritatea cazurilor, un fag anume infecteaz doar celulele unui singur gen, unei anumite specii sau a unei
tulpini - specificitatea fagului prezena R pt acest fag la suprafaa bct-gazd.
Structura bacteriofagului
Structura fagilor corespunde regulilor generale ce se refer la structura virusurilor.
1. Acid nucleic (ADN sau ARN, mai frecvent dublucatenar).
2. Inveli proteic = capsid protecie a materialului genetic. Poseda R la suprafa infecia gazdei.
Capsida este constituit din subuniti proteice, capsomere, aranjate simetric ntr-o ordine distinct,
conferind forma fagului.
3. Unii fagi pot conine i enzime (ex.: lizozim, neuraminidaza).
Exist 3 forme morfologice principale de fagi:
Fag icosaedric: form sferic, 20 fee triungiulare, 30 muchii i 12 vrfuri (simetrie cubic a capsidei).
Fag cilindric: bastonae proteice formate din capsomere, asamblate ntr-o structur tubular (simetrie
helicoidal a capsidei).
Fag complex: constituit din cap icosaedric ataat la o coad helicoidal. Coada este format din doua tuburi
concentrice, un tub intern rigid - canalul axial, care este inconjurat de teaca cozii, un manon contractil.
Gulerul cozii (colul) se afl la jonciunea capului cu coada. La partea distal a cozii se afl o plac
hexagonal, placa bazal, la fiecare apex fiind ancorate cte un croet i o fibr. Ele reprezent sistemul de
fixare a fagului pe bacteria receptoare i contribuie la injecia materialului genetic n celul.
Nu toi fagii au o astfel de morfologie. Unii au coad lunga i non-contractila, alii - coada scurt, sau far
coad. Exist i fagi filamentoi.
TITRAREA BACTERIOFAGILOR
Este utilizat pentru determinarea numrului de fagi viruleni n prelevat sau cultur.
Metodele de titrare a bacteriofagului
Titrarea bacteriofagului n mediu lichid (metoda Appelman)
Titrarea bacteriofagului n mediu solid (metoda Gratia)
APPELMAN la diluii logaritmice a culturii de fag (10-1.....10-10) n bulion peptonat se adaug suspensie bacterian
omolog fagului examinat. Dup 24 ore de incubare la 37 C se apreciaz titrul fagului: diluia maxim a fagului
care nc mai provoac liza bacteriilor (mediu clar).
GRATIA. Dup diluia logaritmic a fagului i adugarea culturii bacteriene, coninutul fiecrui tub se amestec cu
geloz topit i amestecul se toarn n cutii Petri. Dup 24 ore de incubare la 37C se numr plajele formate
(coloniile negative de fagi). Numrul plajelor corespunde cu nr de fagi viruleni din materialul de examinat.
APLICAREA PRACTIC A FAGILOR
n domeniul terapeutic
Tratamentul i profilaxia maladiilor infecioase
n domeniul diagnostic
Fago-identificarea identificarea tulpinilor bacteriene necunoscute cu ajutorul fagilor omologi (metoda Otto, Furt,
etc)
Lizotipizarea (fagotipajul). Permite diferenierea unor tulpini din cadrul aceleeai specii (subdivizarea speciei n
lizotipuri/fagovaruri). Este utilizat pentru tulpini de Staphylococcus aureus, Salmonella Typhi, .a.
Lizotipul reprezint un marker epidemiologic.
Fagii reprezint un model de studiu pentru geneticieni, fagii temperai se utilizeaz n ingineria genetic (ei
pot asigura transferul de material genetic prin transducie).

28.Bacteriofagul. Metodele de evidenietre a bacteriofagului: Otto, Furt i Fisher. Aplicarea


practic a bacteriofagului
Bacteriofagi = virusuri ce infecteaz bacteriile. Parazii intracelulari obligatorii ai bct.

Toate bacteriile pot fi infectate de ctre bacteriofagi.


In majoritatea cazurilor, un fag anume infecteaz doar celulele unui singur gen, unei anumite specii sau a unei
tulpini - specificitatea fagului prezena R pt acest fag la suprafaa bct-gazd.
Structura bacteriofagului
Structura fagilor corespunde regulilor generale ce se refer la structura virusurilor.
4. Acid nucleic (ADN sau ARN, mai frecvent dublucatenar).
5. Inveli proteic = capsid protecie a materialului genetic. Poseda R la suprafa infecia gazdei.
Capsida este constituit din subuniti proteice, capsomere, aranjate simetric ntr-o ordine distinct,
conferind forma fagului.
6. Unii fagi pot conine i enzime (ex.: lizozim, neuraminidaza).
Exist 3 forme morfologice principale de fagi:
Fag icosaedric: form sferic, 20 fee triungiulare, 30 muchii i 12 vrfuri (simetrie cubic a capsidei).
Fag cilindric: bastonae proteice formate din capsomere, asamblate ntr-o structur tubular (simetrie
helicoidal a capsidei).
Fag complex: constituit din cap icosaedric ataat la o coad helicoidal. Coada este format din doua tuburi
concentrice, un tub intern rigid - canalul axial, care este inconjurat de teaca cozii, un manon contractil.
Gulerul cozii (colul) se afl la jonciunea capului cu coada. La partea distal a cozii se afl o plac
hexagonal, placa bazal, la fiecare apex fiind ancorate cte un croet i o fibr. Ele reprezent sistemul de
fixare a fagului pe bacteria receptoare i contribuie la injecia materialului genetic n celul.
Nu toi fagii au o astfel de morfologie. Unii au coad lunga i non-contractila, alii - coada scurt, sau far
coad. Exist i fagi filamentoi.
INDICAREA BACTERIOFAGILOR
Metoda OTTO. Pe placa de geloz din cutia Petri se nsmneaz n gazon suspensia de bacterii omologe fagului.
n continuare se aplic o pictur de filtrat care conine fag (cutia poate fi nclinat ca pictura s se preling). Cutia
se incubeaz la 37 C timp de 24 ore.
Aprecierea: dac n filtrat se aflau fagi omologi culturii bacteriene, n locul aplicrii filtratului se observ o zon de
liz (colonie negativ de fag).
Metoda FURT. Filtratul ce conine fagi se amestec cu geloz topit i se toarn n cutia Petri. Suprafaa cutiei se
mparte n 4 sectoare. n fiecare sector se nsmneaz n striuri culturi cunoscute de diferite bacterii. Incubare la
37C 24 ore.
Aprecierea: lipsa creterii bacteriilor ntr-un sector indic prezena fagului omolog.
Metoda FISHER
Similar cu metoda Furt, doar c suprafaa cutiei se mparte n 10 cadrane, astfel pot fi nsmnate 10 culturi
bacteriene i pot fi indicai concomitent mai muli fagi.
APLICAREA PRACTIC A FAGILOR
n domeniul terapeutic
Tratamentul i profilaxia maladiilor infecioase
n domeniul diagnostic
Fago-identificarea identificarea tulpinilor bacteriene necunoscute cu ajutorul fagilor omologi (metoda Otto, Furt,
etc)
Lizotipizarea (fagotipajul). Permite diferenierea unor tulpini din cadrul aceleeai specii (subdivizarea speciei n
lizotipuri/fagovaruri). Este utilizat pentru tulpini de Staphylococcus aureus, Salmonella Typhi, .a.
Lizotipul reprezint un marker epidemiologic.
Fagii reprezint un model de studiu pentru geneticieni, fagii temperai se utilizeaz n ingineria genetic (ei
pot asigura transferul de material genetic prin transducie).

29.Bacteriofagul. Fagotipajul i fagoidentificarea culturilor bacteriene. Importana


practic. Aplicarea practic a bacteriofagului.
Bacteriofagi = virusuri ce infecteaz bacteriile. Parazii intracelulari obligatorii ai bct.
Toate bacteriile pot fi infectate de ctre bacteriofagi.
In majoritatea cazurilor, un fag anume infecteaz doar celulele unui singur gen, unei anumite specii sau a unei
tulpini - specificitatea fagului prezena R pt acest fag la suprafaa bct-gazd.
Structura bacteriofagului
Structura fagilor corespunde regulilor generale ce se refer la structura virusurilor.
7. Acid nucleic (ADN sau ARN, mai frecvent dublucatenar).
8. Inveli proteic = capsid protecie a materialului genetic. Poseda R la suprafa infecia gazdei.
Capsida este constituit din subuniti proteice, capsomere, aranjate simetric ntr-o ordine distinct,
conferind forma fagului.

9. Unii fagi pot conine i enzime (ex.: lizozim, neuraminidaza).


Exist 3 forme morfologice principale de fagi:
Fag icosaedric: form sferic, 20 fee triungiulare, 30 muchii i 12 vrfuri (simetrie cubic a capsidei).
Fag cilindric: bastonae proteice formate din capsomere, asamblate ntr-o structur tubular (simetrie
helicoidal a capsidei).
Fag complex: constituit din cap icosaedric ataat la o coad helicoidal. Coada este format din doua tuburi
concentrice, un tub intern rigid - canalul axial, care este inconjurat de teaca cozii, un manon contractil.
Gulerul cozii (colul) se afl la jonciunea capului cu coada. La partea distal a cozii se afl o plac
hexagonal, placa bazal, la fiecare apex fiind ancorate cte un croet i o fibr. Ele reprezent sistemul de
fixare a fagului pe bacteria receptoare i contribuie la injecia materialului genetic n celul.
Nu toi fagii au o astfel de morfologie. Unii au coad lunga i non-contractila, alii - coada scurt, sau far
coad. Exist i fagi filamentoi.
APLICAREA PRACTIC A FAGILOR
n domeniul terapeutic
Tratamentul i profilaxia maladiilor infecioase
n domeniul diagnostic
Fago-identificarea identificarea tulpinilor bacteriene necunoscute cu ajutorul fagilor omologi (metoda Otto, Furt,
etc)
Lizotipizarea (fagotipajul). Permite diferenierea unor tulpini din cadrul aceleeai specii (subdivizarea speciei n
lizotipuri/fagovaruri). Este utilizat pentru tulpini de Staphylococcus aureus, Salmonella Typhi, .a.
Lizotipul reprezint un marker epidemiologic.
Fagii reprezint un model de studiu pentru geneticieni, fagii temperai se utilizeaz n ingineria genetic (ei
pot asigura transferul de material genetic prin transducie).

30.De descris etapele metodei biologice de diagnostic i de demonstrat tehnica necropsiei


animalelor de laborator experimental infectate.
biologic (experimental) inoculare produs patologic la animale de laborator, provocare maladie
tipica
Metoda biologica de examinare consta in infectarea animalelor pentru obtinerea
(izolarea)culturilor de microorganism ,agenti cauzali ai bolilor cu studierea uterioara a
patogenitatii si virulentei lor.
Etapele:
1.Alegerea animalelor.experietele se fac doar pe animale sanatoare cu blana neteda si
lucioase,active mobile si cu alimentatie buna .Se recomanda de a folosi animale de aceeasi
virsta ,sex,greutate.
2.Marcarea.Consta in colorarea diverselor sectoare ale blanii cu solutii de coloranti anilinici ,acid
picric sau prin aplicarea semnelor de marcare la urechi.Numarul si marcarea fiecarui animal se
indica in protocol .
3.Fixarea animalelor.Impobilizare animalelor in timpul experientei se face cu dispozititve special
,masa de fixare,cutii sau ,manoperi ,prin care asistentul fixeaza animalul in pozitia necesara.
4.Inocularea.se face cu seringi si ace de marimi adecvate ,sterile ,dupa prealabila antiseptizare a
tegumetului cu alcool.
La infectarea experimentala a animalelor materialul de studiat se inoculeaza pe diferite cai
cutanata,subcutanata,intadermica,intramusculara,intravenoasa,per os si in diferite organe si
tesuturi-in encefal,membrane mucoasa,prin caile respiratorii.
5.Necropsia.Animalele trebuie necropsiate in maxim o ora dupa moarte sau sacrificate ,pentru a
Evita invadarea tesuturilor cu flora de putrefactive.
Necesar:
Tava de tabla cu margini perforate ,pentru fixarea cobaielor sau iepurilor ;mica planseta de lemn
pentru fixarea soarecilor;
Instrumente sterile ;3bisturie,4foarfece,4pense anatomice ,cleste mic pentru oasele craniului,daca
se impune accesul la creer;
Pipete Pasteur;cutii Petri,ieprubete sterile ,lame de microscop;
Placi si tubii cu medii de cultura adecvate.

Procedura :
1.se fixeaza animalul cu fata ventral in sus ,iar pu accesul la creer cu fata vetrala in jos
2.se badijoniaza insistent toata fata ventral a animalului cu o solutie 3 % de dezinfectanta
fenolic .animalele mici ,pot fi cunfundate complet in solutie dezinfectanta
3.cu un rind de instrumente sterile se face o incizie tegumantara sub mentopubiana prelungita
spre radacina fiecarui membru,si se decoleaza pielea pina la flancuri.
4.se inspecteaza tesutul cellular subcutanat ,masele musculare si ganglionii limfatici in regiunea
de inoculare.
5.cu un nou rind de instrumente sterile se deschide cavitatea ,periotoniala si se reflecta lateral
planul,musculoaponevrotic.
Cu foarfece sterile adecvate se sectioniaza prin 2 incizii laterale cartilajele costale,apoi
diafragmul si se indeparteaza plastronul sternal.
6.pentru hemocultura se punctioniaza cordul cu o pipeta Pasteur prevazuta cu tetina de
cauciuc .Daca necropsia este ingrijita nu este necesara cauterizarea suprafetei punctionale .se
insaminteaza single extras in medii de cultura adecvate .
7.cu un nou rind de intrumente sterile se preleva si se depune in cutii Petri sterile ,pu
examinarea ,splina ,ficatul,rinichii si pulmonii ,atentie la prelevare pu a nu deschide tubul
digestive.
8.Se examineaza macroscopic,se sectioneaza cu instrumente sterile organelle prelevate,se
inseminteaza in medii adecvate mici fragmente de tesut si se efectueaza amprente pu microscop.
9.Se acopera carcasa animalului cu o bucata de hirtie igienica imbibata cu solutie
dezinfectanta.Se autoclaviaza carcasa impreuna cu tava apoi se incinereaza carcasa animalului.
10.Se dezinfecteaza prin fierbere sau chimic instrumentarul in vederea splarii.Cadavrele
animalelor pierite de infectii extreme de contagioase se supun autopsiei in incaperi special cu
respectarea regulilor de Securitate.

31 Reacia de aglutinare pe lam i n tuburi cu scop de seroidentificare.


Ingredientele necesare, tehnica efecturii, citirea i interpretarea
rezultatelor.
REACIA DE AGLUTINARE
Din latin agglutinatio - ncleiere
Reacia Ag-Ac se poate manifesta prin aglutinare atunci cnd determinantele antigenice sunt
purtate de particule figurate (Ag insolubile, corpusculare), iar Ac specifici sunt complei (cel
puin bivaleni).
Aglutinarea este determinat de formarea unei reele ntre Ag i Ac, ce permite apropierea unui numr
suficient de particule figurate pentru a constitui aglutinate vizibile cu ochiul liber. Ac IgM cu 10
epitopi poteniali aglutineaz mai activ dect Ac IgG.
Clasificarea reaciilor de aglutinare
Aglutinare activ
sau direct
, n care particula figurat (Ag corpuscular) este el nsui
activ
direct,
purttor de determinante antigenice specifice (hematii, leucocite, trombocite, spermatozoizi,
bacterii)
Aglutinare pasiv
sau indirect
, n care particula servete doar de suport pentru un
pasiv
indirect,
determinant antigenic solubil fixat artificial pe suprafaa sa. Frecvent sunt utilizate ca suport
hematii formolate, particule de latex sau microcristale de colesterol.
Reactii
Reactii de
de aglutinare
aglutinare activa
activa (directa
(directa)
Aspect calitativ.
alitativ. Reactia
eactia poate
poate fi efectuata
efectuata pe lama
lama de sticla sau in
in tuburi
tuburi..
Reacia de aglutinare pe lamel: pe lamela degresat se aplic cu pipeta Pasteur cteva
picturi de ser n diluii mici (1:10 1:20) i o pic de sol izotonic de clorid de natriu pentru control.
n fiecare pictur de ser, nclusiv n cea de control se introduce o ans de cultur vie de
microorganisme de 24 ore de pe suprafaa mediului solid sau se adaug cu pipeta Pasteur cte o
pic de suspensie de microorganisme omorte (diagnosticum). Cultura aplicat se amestec
minuios pentru a obine o suspensie tulbure omogen. Reacia decurge la temperatura camerei.
Rezultatul ei se citete cu ochiul liber peste 5-10 min, uneori este folosit lupa. Dac lamele se
introduc n camera umed nchis, pentru a evita uscarea picturilor rezultatul reaciei se citete i
peste 30-40 min.
La reacia pozitiv n pictura de ser apar flocoane (mari sau mici), uor vizibile la cltinarea
lamei. La reacia negativ lichidul rmne tulbure omogen. Dac cantitatea de microorganisme

este mic i citirea rezultatului reaciei este dificil, pictura de ser cu amestecul de cultur se
usuc, preparatul se fixeazse coloreaz cu fuxin Pfaiffer si se examineaz la microscop. La
reacia pozitiv toate cmpurile de vedere sunt libere. Aceasta este reacia de microaglutinare.
Reacia de aglutinare n tuburi se folosete pentru determinarea serogrupului i serovarului
microorganismelor. Toate ingredientele se repartizeaz succesiv n eprubete. Serul este diluat n
proporiile 1:100, 1:200, 1:400 etc. n fiecare tub cu serul diluat se adaug 1-2 picturi de antigen
(suspensie de 1-2mlrd de microorganisme la 1ml), se agit energic i se incubeaz n termostat la
37C-2 ore, apoi se citesc rezultatele prealabile ale reaciei, ncepnd cu cele de control(al serului i
antigenului). Absena aglutinrii n tuburile de control i prezena de flocoane suspendate n
tuburile de experien se apreciaz ca reacie pozitiv. Tuburile se menin la temperatura camerei
18-20 de ore i dup aceea se constat rezultatul definitiv al reaciei. Intensitatea reaciei se
exprim prin semne de plus. La aglutinarea complet (++++) lichidul este absolut transparent, iar
la fundul tubului se depune sediment din flocoane de microorganisme aglutinate. Cu ct mai puine
microorganisme snt aglutinate, cu att este mai tulbure lichidul i cu att mai puin sediment
floconos se nregistreaz la fundul eprubetei (+++, ++, +). La reacia negativ (-) sedimentul
lipsete, suspensia rmne uniform tulbure i dup aspect nu difer de coninutul de control al
antigenului. RA se utilizeaz pentru diagnosticul serologic al bolilor infecioase febrelor tifoparatifoide (reacia Widal), brucelozei (reacia Wright, Huddleson), tularemiei i altor boli.
Aprecierea:
Aprecierea: cea mai mare dilutie a serului in care se manifesta aglutinare de cel putin 3 + (++
+) se numeste titrul anticorpilor aglutinanti (titrul serului aglutinant).
aglutinant).
Aglutinarea
glutinarea directa
directa este
este utilizata
utilizata pent
pentrru determina
determinarea grupelor
grupelor sangv
sangvine
ine sau
sau in diagnosticul
diagnosticul unor
maladii
se (seroidentificarea Ag sau depistarea i titrarea Ac din serul bolnavilor) .
maladii infectioa
infectioase
Reactile
Reactile de
de aglutinare
aglutinare pasiva
pasiva (indirecta
(indirecta)
Aglutinarea
u al unui Ac) pe un suport corpuscular inert,
glutinarea pasiva
pasiva consta
consta in fixa
fixarea unui
unui Ag solubi
solubil (sa
(sau
inert,
care nu intervi
intervine in reactia
reactia Ag-Ac. In calitate de suport inert pot servi hematiile, particule de latex,
cristale
ristale de colesterol. Suspensia
uspensia de particule sensibilizate cu Ag sau Ac este
este pusa in contact cu
serul
serul imun (respectiv
(respectiv cu Ag), ca si in cazul aglutinarii directe.
Avantajele reactiilor
ea lecturii
ea inalta.
reactiilor indirecte:
indirecte: facilitat
facilitate
lecturii si sensibilitat
sensibilitate
inalta.

32 Reacia de aglutinare pe lam i n tuburi cu scop de serodiagnostic.


Ingredientele necesare, tehnica efecturii, citirea i interpretarea
rezultatelor.
REACIA DE AGLUTINARE
Din latin agglutinatio - ncleiere
Reacia Ag-Ac se poate manifesta prin aglutinare atunci cnd determinantele antigenice sunt
purtate de particule figurate (Ag insolubile, corpusculare), iar Ac specifici sunt complei (cel
puin bivaleni).
Aglutinarea este determinat de formarea unei reele ntre Ag i Ac, ce permite apropierea unui numr
suficient de particule figurate pentru a constitui aglutinate vizibile cu ochiul liber. Ac IgM cu 10
epitopi poteniali aglutineaz mai activ dect Ac IgG.
Clasificarea reaciilor de aglutinare
Aglutinare activ
sau direct
, n care particula figurat (Ag corpuscular) este el nsui
activ
direct,
purttor de determinante antigenice specifice (hematii, leucocite, trombocite, spermatozoizi,
bacterii)
Aglutinare pasiv
sau indirect
, n care particula servete doar de suport pentru un
pasiv
indirect,
determinant antigenic solubil fixat artificial pe suprafaa sa. Frecvent sunt utilizate ca suport
hematii formolate, particule de latex sau microcristale de colesterol.
Reactii
Reactii de
de aglutinare
aglutinare activa
activa (directa
(directa)
Aspect calitativ.
alitativ. Reactia
eactia poate
poate fi efectuata
efectuata pe lama
lama de sticla sau in
in tuburi
tuburi..
Reacia de aglutinare pe lamel: pe lamela degresat se aplic cu pipeta Pasteur cteva
picturi de ser n diluii mici (1:10 1:20) i o pic de sol izotonic de clorid de natriu pentru control.
n fiecare pictur de ser, nclusiv n cea de control se introduce o ans de cultur vie de
microorganisme de 24 ore de pe suprafaa mediului solid sau se adaug cu pipeta Pasteur cte o
pic de suspensie de microorganisme omorte (diagnosticum). Cultura aplicat se amestec
minuios pentru a obine o suspensie tulbure omogen. Reacia decurge la temperatura camerei.
Rezultatul ei se citete cu ochiul liber peste 5-10 min, uneori este folosit lupa. Dac lamele se
introduc n camera umed nchis, pentru a evita uscarea picturilor rezultatul reaciei se citete i
peste 30-40 min.
La reacia pozitiv n pictura de ser apar flocoane (mari sau mici), uor vizibile la cltinarea
lamei. La reacia negativ lichidul rmne tulbure omogen. Dac cantitatea de microorganisme
este mic i citirea rezultatului reaciei este dificil, pictura de ser cu amestecul de cultur se
usuc, preparatul se fixeazse coloreaz cu fuxin Pfaiffer si se examineaz la microscop. La
reacia pozitiv toate cmpurile de vedere sunt libere. Aceasta este reacia de microaglutinare.
Reacia de aglutinare n tuburi se folosete pentru determinarea serogrupului i serovarului
microorganismelor. Toate ingredientele se repartizeaz succesiv n eprubete. Serul este diluat n
proporiile 1:100, 1:200, 1:400 etc. n fiecare tub cu serul diluat se adaug 1-2 picturi de antigen
(suspensie de 1-2mlrd de microorganisme la 1ml), se agit energic i se incubeaz n termostat la

37C-2 ore, apoi se citesc rezultatele prealabile ale reaciei, ncepnd cu cele de control(al serului i
antigenului). Absena aglutinrii n tuburile de control i prezena de flocoane suspendate n
tuburile de experien se apreciaz ca reacie pozitiv. Tuburile se menin la temperatura camerei
18-20 de ore i dup aceea se constat rezultatul definitiv al reaciei. Intensitatea reaciei se
exprim prin semne de plus. La aglutinarea complet (++++) lichidul este absolut transparent, iar
la fundul tubului se depune sediment din flocoane de microorganisme aglutinate. Cu ct mai puine
microorganisme snt aglutinate, cu att este mai tulbure lichidul i cu att mai puin sediment
floconos se nregistreaz la fundul eprubetei (+++, ++, +). La reacia negativ (-) sedimentul
lipsete, suspensia rmne uniform tulbure i dup aspect nu difer de coninutul de control al
antigenului. RA se utilizeaz pentru diagnosticul serologic al bolilor infecioase febrelor tifoparatifoide (reacia Widal), brucelozei (reacia Wright, Huddleson), tularemiei i altor boli.
Aprecierea:
Aprecierea: cea mai mare dilutie a serului in care se manifesta aglutinare de cel putin 3 + (++
+) se numeste titrul anticorpilor aglutinanti (titrul serului aglutinant).
aglutinant).
Aglutinarea
glutinarea directa
directa este
este utilizata
utilizata pent
pentrru determina
determinarea grupelor
grupelor sangv
sangvine
ine sau
sau in diagnosticul
diagnosticul unor
maladii
se (seroidentificarea Ag sau depistarea i titrarea Ac din serul bolnavilor) .
maladii infectioa
infectioase
Reactile
Reactile de
de aglutinare
aglutinare pasiva
pasiva (indirecta
(indirecta)
Aglutinarea
u al unui Ac) pe un suport corpuscular inert,
glutinarea pasiva
pasiva consta
consta in fixa
fixarea unui
unui Ag solubi
solubil (sa
(sau
inert,
care nu intervi
intervine in reactia
reactia Ag-Ac. In calitate de suport inert pot servi hematiile, particule de latex,
cristale
ristale de colesterol. Suspensia
uspensia de particule sensibilizate cu Ag sau Ac este
este pusa in contact cu
serul
serul imun (respectiv
(respectiv cu Ag), ca si in cazul aglutinarii directe.
Avantajele reactiilor
ea lecturii
ea inalta.
reactiilor indirecte:
indirecte: facilitat
facilitate
lecturii si sensibilitat
sensibilitate
inalta.

33 Reacia de hemagluinare indirect. Ingredientele necesare, tehnica


efecturii, citirea i interpretarea rezultatelor.
Uneori Ag folosite n reacia de aglutinare sunt att de microdispersate c complexul aglutinogenaglutinin nu se observ cu ochiul liber. Pentru ca aceast reacie s poat fi vzut s-au propus
diferite ci de absorbire a acestor Ag pe particule mai mari cu aglutinarea lor ulterioar cu Ac specifici.
Ca adsorbani se folosesc diferite specii de bacterii, corpuscule de talc, dermatol, colodii, coalin,
carmin, latex .a. Aceast reacie a cptat denumirea de reacie de aglutinare indirect sau pozitiv.
O capacitate mai pronunat de adsorbie au eritrocitele. Reacia n care se folosesc eritrocitele se
numete hemaglutinare indirect sau pasiv (RHAI sau RHAP). Pentru efectuarea RHAI se folosesc
eritrocite de berbec, cal, iepure, gin, oarece, om .a. care n prealabil sunt prelucrate cu formalin
sau glutaraldehid. Capacitatea de adsorbie a eritrocitelor crete la prelucrarea lor cu soluie de
tanin sau clorid de crom.
n RHAI ca antigene pot servi Ag polizaharidice, extractele vaccinurilor bacteriene, Ag virusurilor i
rickettsiilor i alte substane de natur proteic.
Eritrocitele sensibilizate cu antigene se numesc diagnosticumuri eritrocitare. Pentru prepararea
diagnosticumurilor eritrocitare se folosesc frecvent eritrocite de berbec, care au o capacitate mare de
adsorbie.
RHAI se efectueaz mai uor n micropanourile aparatului Tacaci, folosind pentru diluia materialului
microtitratorul. Serurile de examinat se nclzesc 30min la temperatura de 56C, pentru a nltura
hemaglutininele nespecifice, se prepar diluii duble n serie n soluie stabilizant i cte o pictur de
suspensie de 1% de eritrocite sensibilizate, n rndul 2 aceeai cantitate de eritrocite de control.
Plcile se agit minuios i se introduc n termostat pentru 30-40 min la temperatura 37C.
Rezultatele reaciei se citesc dup prezena hemaglutinrii. Ea este pozitiv (umbrel inversat de
culoare brun la fundul godeurilor) n cazul, c titrul de hemaglutinare cu eritrocite de experien
predomin cel puin de 4 ori fa de titrul cu eritrocitele de control. E obligatoriu controlul cu
eritrocitele sensibilizate pentru excluderea aglutinrii spontane.(conform compendiului)
Conform la cartea mic neagr(Cerkes):
Metodica: serul cercetat se nclzete 30 min la t 56C, se dilueaz consecutiv n coraport de 1:10
1:1280 i se toarn cte 0,25ml n eprubete sau alveole, unde apoi se adaug cte 2 picturi de
diagnosticum eritrocitar. n calitate de control servesc: suspensia de diagnosticum eritrocitar cu ser
imun; suspensia de diagnosticum cu ser normal; suspensia de eritrocite normale cu serul cercetat. n
primul control urmeaz s aib loc aglutinarea, iar n controalele doi i trei aglutinarea va lipsi.
Cu ajutorul la RHAI poate fi determinat Ag necunoscut, dac pe suprafaa eritrocitelor vom adsorbi
anticorpii deja cunoscui.
Reacia de hemaglutinare poate fi efectuat i n volume mai mici 0.025ml (micrometoda),
folosind microtitratorul Tcaci.

34 Reacia de hemagluinare indirect inversat. Ingredientele necesare,


tehnica efecturii, citirea i interpretarea rezultatelor.
Uneori Ag folosite n reacia de aglutinare sunt att de microdispersate c complexul aglutinogenaglutinin nu se observ cu ochiul liber. Pentru ca aceast reacie s poat fi vzut s-au propus
diferite ci de absorbire a acestor Ag pe particule mai mari cu aglutinarea lor ulterioar cu Ac specifici.

Ca adsorbani se folosesc diferite specii de bacterii, corpuscule de talc, dermatol, colodii, coalin,
carmin, latex .a. Aceast reacie a cptat denumirea de reacie de aglutinare indirect sau pozitiv.
O capacitate mai pronunat de adsorbie au eritrocitele. Reacia n care se folosesc eritrocitele se
numete hemaglutinare indirect sau pasiv (RHAI sau RHAP). Pentru efectuarea RHAI se folosesc
eritrocite de berbec, cal, iepure, gin, oarece, om .a. care n prealabil sunt prelucrate cu formalin
sau glutaraldehid. Capacitatea de adsorbie a eritrocitelor crete la prelucrarea lor cu soluie de
tanin sau clorid de crom.
n RHAI ca antigene pot servi Ag polizaharidice, extractele vaccinurilor bacteriene, Ag virusurilor i
rickettsiilor i alte substane de natur proteic.
Eritrocitele sensibilizate cu antigene se numesc diagnosticumuri eritrocitare. Pentru prepararea
diagnosticumurilor eritrocitare se folosesc frecvent eritrocite de berbec, care au o capacitate mare de
adsorbie.
RHAI se efectueaz mai uor n micropanourile aparatului Tacaci, folosind pentru diluia materialului
microtitratorul. Serurile de examinat se nclzesc 30min la temperatura de 56C, pentru a nltura
hemaglutininele nespecifice, se prepar diluii duble n serie n soluie stabilizant i cte o pictur de
suspensie de 1% de eritrocite sensibilizate, n rndul 2 aceeai cantitate de eritrocite de control.
Plcile se agit minuios i se introduc n termostat pentru 30-40 min la temperatura 37C.
Rezultatele reaciei se citesc dup prezena hemaglutinrii. Ea este pozitiv (umbrel inversat de
culoare brun la fundul godeurilor) n cazul, c titrul de hemaglutinare cu eritrocite de experien
predomin cel puin de 4 ori fa de titrul cu eritrocitele de control. E obligatoriu controlul cu
eritrocitele sensibilizate pentru excluderea aglutinrii spontane.(conform compendiului)
Conform la cartea mic neagr(Cerkes):
Metodica: serul cercetat se nclzete 30 min la t 56C, se dilueaz consecutiv n coraport de 1:10
1:1280 i se toarn cte 0,25ml n eprubete sau alveole, unde apoi se adaug cte 2 picturi de
diagnosticum eritrocitar. n calitate de control servesc: suspensia de diagnosticum eritrocitar cu ser
imun; suspensia de diagnosticum cu ser normal; suspensia de eritrocite normale cu serul cercetat. n
primul control urmeaz s aib loc aglutinarea, iar n controalele doi i trei aglutinarea va lipsi.
Cu ajutorul la RHAI determin Ac necunoscut, iar pe suprafaa eritrocitelor se adsorb Ag deja
cunoscui.
Reacia de hemaglutinare poate fi efectuat i n volume mai mici 0.025ml (micrometoda),
folosind microtitratorul Tcaci.

35 Reaciile de co-aglutinare, latex aglutinare. Ingredientele necesare, tehnica


efecturii, citirea i interpretarea rezultatelor.
Reacia n care se folosesc eritrocitele se numete hemaglutinare indirect sau pasiv (RHAI sau
RHAP).
Reacia de latex-aglutinare este utilizata in identificarea factorului reumatoid la bolnavi suspecti de
poliartrita reumatoida, in bacteriologie pentru identificarea rapid a mi/o sau Ag lor n prelevate, sau
identificarea tulpinilor izolate, de asemenea pentru serodiagnosticul unor infecii.

reacia de latex-aglutinare reacia de latex-aglutinare Ac sau AgAsunt fixai pe particule de latex. Reacia
se efectueaz pe lama de sticl.
Reacia de Co-aglutinare. La baza acestei reacii se afl proprietatea unei bacterii Staphylococcus
aureus (tulpina Cowan) - ce are n componena peretelui celular proteina A - s fixeze Ig G prin
intermediul fragmentului Fc. Astfel se formeaz diagnosticuri cu Ac, cu ajutorul carora pot fi
identificare Ag respective necunoscute. Reacia se efectueaz pe lam.

36 Reacia antiglobulinic Coombs. Principiul. Componentele. Tehnica


efecturii. Citirea i interpretarea rezultatelor.
Unii Ac (monovaleni) nu sunt aglutinai n condiii normale, fiind monovaleni (ex. Ac anti-Rh,
responsabili de incompatibilitatea materno+fetal n sistemul Rh). Ei pot fi depistai graie testelor
Coombs. sunt posibile 2 tehnici, n funcie de prelevat: snge de la nou-nscut sau de la femeia
gravid.
Tehnica Coombs direct: la un nou-nscut se caut prezena Ac materni anti-Rh fixai pe hematii,
dac mama este Rh- . La aceste hematii suspecte se adaug un ser anti-Ig uman. Acest ser nu
aglutineaz hematiile normale, din contra, el provoac aglutinarea hematiilor pe care sunt fixai Ac
anti-Rh.
Tehnica Coombs indirect: la o femeie gravid Rh- Ac anti-Rh sunt prezeni n ser. Iniial la acest
ser se adaug hematii Rh+ (ptr formarea complexului Ag-Ac), apoi se aplic serul anti-Ig.
Demonstrarea prezentei de imunoglobuline sau a complementului pe suprafata hematiilor sustine
diagnosticul de distructie eritrocitara mediata imun.
Exista doua clase majore de anticorpi care reactioneaza cu eritrocitele. Anticorpii completi sau salini
aglutineaza eritrocitele suspendate in solutie salina; acestia sunt de obicei de tip IgM (cel mai bun
exemplu de aglutinare salina la temperatura camerei este cea utilizata in grupajul ABO). In
vivo anticorpii IgM fixeaza complementul si produc hemoliza imediata intravasculara. Anticorpii care

nu reactioneaza vizibil in mediu salin si produc reactii de aglutinare numai prin utilizarea de tehnici
speciale sunt numiti aglutinine incomplete si sunt de obicei de tip IgG (cel mai bun exemplu sunt
anticorpii anti-Rh, care, daca sunt prezenti in serul primitorului de sange incompatibil, produc o reactie
hemolitica transfuzionala intarziata, extravasculara).
Pentru a certifica faptul ca hematiile unui pacient sunt invelite (sensibilizate) cu imunoglobuline,
complement sau ambele, se adauga la o suspensie de eritrocite provenite de la pacient antiser cu
reactivitate fata de moleculele de Ig si/sau complement umane, care va determina aglutinarea
acestora. Initial testarea se face cu antiseruri polispecifice, care contin anti-IgG, anti-C3d si ocazional si
activitate anti-lant usor. Reactivii monospecifici diferentiaza in continuare intre IgG, C3d, existand si
seruri monospecifice pentru C3b, C4b, C4d si lantul greu al IgG. Antiseruri specifice pentru IgM sau IgA
sunt rar utilizate, deoarece IgM nu mai sunt gasite de obicei inca atasate pe suprafata celulara, iar IgA
sunt foarte rar intalnite pe suprafata eritrocitelor.
Utilizand sange recoltat pe EDTA sau pe citrat activarea in vitro a complementului de catre
autoanticorpii la rece benigni este inhibata. Spalarea eritrocitelor indeparteaza globulinele solubile sau
atasate nespecific, ceea ce permite detectia imunoglobulinelor si factorilor complementului specific
legate de eritrocite in vivo. Se foloseste metoda de hemaglutinare pe lama. Specimen

recoltat - sange venos. Stabilitate proba - testul se efectueaza imediat, daca acest lucru
nu este posibil, proba se pastreaza 48 ore la 2-8o C. Prelucrare necesara dupa
recoltare - o parte din eritrocite se spala de trei-patru ori cu solutie salina normala, urmata
de prepararea unei suspensii eritrocitare in ser fiziologic steril 5 %.

37 Reaciile de inhibare a hemadsorbiei (RIHAds) i hemaglutinrii (RIHA).


Componentele. Evaluarea i interpretarea rezultatelor.
In practica de laborator se ntrebuineaz dou tipuri de reacii de hemaglutinare (RHA), care se
deosebesc dup mecanismul de aciune.
Prima RHA face parte din reaciile serologice. In aceast reacie eritrocitele se aglutineaz la
interaciunea cu anticorpi corespunztori (hemaglutinine). Aceast reacie se aplic pe larg pentru
determinarea grupelor de snge.
A doua RHA nu este serologic. In aceast reacie aglutinarea eritrocitelor e condiionat nu de
anticorpi, ci de substane deosebite, formate n cazul infeciei virotice. De exemplu, virusul gripei
aglutineaz eritrocitele de gin i cobai, iar virusul poliomielitei eritrocitele de berbec. Aceast
reacie permite de a constata prezena unui sau altui virus n materialul de cercetat.
Metodica. Reacia se efectueaz n eprubete sau pe plci speciale cu adncituri. Materialul de cercetat
se dilueaz n soluie izotonic de la 1:10 pn la 1:1280; 0,5 ml din fiecare diluie se amestec cu
volum egal de suspensie de l2% de eritrocite. In control, 0,5 ml suspensie de eritrocite se amestec
cu 0,5 ml de soluie izotonic Eprubetele se amplaseaz n termostat pe 30 min, iar plcile se in la
temperatura camerei timp de 45 min.
Evidena rezultatelor. In cazul rezultatului pozitiv al reaciei, pe fundul eprubetei sau al adnciturii din
plac se formeaz sediment de eritrocite n form de umbrel, care astup tot fundul. In cazul
rezultatului negativ, eritrocitele formeaz un sediment compact cu margini netede, care se aseamn
cu un nasture. Sediment asemntor se formeaz i n control. Intensitatea reaciei se indic cu
ajutorul semnului plus. Titrul virusului indic diluia maxim a materialului, n care mai are loc
aglutinarea.
Reacia de inhibare a hemaglutinrii. Aceasta reprezint o reacie serologic, n care anticorpii
antivirotici specifici, interacionnd cu virusul (antigenul), asigur neutralizarea acestuia i exclud
capacitatea de a aglutina eritrocite, adic inhib reacia de hemaglutinare. Specificitatea nalt a
reaciei de inhibare a hem aglutinrii (RIHA) permite de a determina, cu ajutorul ei specia i chiar tipul
de virusuri nregistrate n timpul RHA
Metodica. 0,25 ml de ser antiviral se dilueaz consecutiv de h; 1:10 pn la 1:2560 i se amestec cu
volume egale de material ci conine virus i este diluat de 4 ori n comparaie cu titrul determina prin
RHA. Amestecul se agit i se termostateaz 30 min, dup cars se adaug cile 0,5 ml suspensie de l
2% de eritrocite. Reacia e nsoit de 3 controale. Evidena rezultatelor se efectueaz dup incubarea
repetata i termostat, n decurs de 30 min, sau meninerea timp de 45 min 1; temperatura camerei. La
pregtirea corect a experienei, n controlu serului i eritrocitelor trebuie s se formeze nasturele,
deci lipseti factorul ce condiioneaz aglutinarea eritrocitelor, iar n controlul anti genului se formeaz
umbrela, deci virusul a dus la aglutinare; eritrocitelor. In experien, dac serul este omolog cu
virusul cercetat. s< formeaz nasturele, deci serul a neutralizat virusul, n acest caz titrul serului
reprezint diluia maxim, n care se mai nregistreaz inhibarea hemaglutinrii.
.

38 Tehnica efecturii, citirea i interpretarea rezultatelor reaciilor de


precipitare inelar, n gel cu scop de seroidentificare.
Reacie de precipitare (R.P.) se numete sedimentarea antigenului (pretipitinogenului) din soluie la
aciunea serului imun (precipitinei) i a electrolitului asupra lui. Cu ajutorul reaciei de precipitare
antigenul poate fi evideniat n aa cantiti minime, care nu se determin pe cale chimic.

In reacia de precipitare se folosesc antigene lichide i transparente, care prezint corpuscule


ultramicroscopice ale soluiei coloidale de protein, polizaharide etc.n calitate de antigene se folosesc
extracte din celulele microbiene, organe i esuturi, produsele dezintegrrii celulelor rnicrobiene lizate, filtrate . a. Rezistena precipitinogenelor la temperaturi nalte se folosete la obinerea
antigenelor din agenii cauzali ai antraxului, pestei . a. (metoda de fierbere). Serurile precipitante se
pregtesc centralizat prin hiperimunizarea animalelor (iepurilor) cu suspensie de bacterii, filtrat al
culturilor bulionice, autolizate, extracte saline ale microorganismelor, proteine serice etc.
Titrul serului precipitant, spre deosebire de titrul altor seruri diagnostice, se determin prin diluia
maxim a antigenului care se precipit cu serul dat. Aceasta se explic prin faptul, c antigenul care
particip n R.P. are dimensiune ultramicroscopic i se conine ntr-o unitate de volum n cantiti mai
mari dect anticorpi n acelai volum de ser. Serurile precipitante se elaboreaz cu titru nu mai mic de
1:100000.
Reacia de precipitare inelar. In eprubeta de precipitare, cu ajutorul pipetei Pasteur, se toarn 0,2
0,3 ml (5 6 picturi) de ser (serul nu trebuie s nimereasc pe peretele eprubetei). Pe peretele
eprubetei, n ser, foarte atent, cu ajutorul pipetei subiri Pasteur, se adaug acelai volum de antigen.
In acest timp eprubeta se ine n poziie nclinat. La stratificarea corect ntre ser i antigen se
distinge o limit clar. Atent, pentru a evita amestecarea straturilor, eprubeta se trece n stativ, n caz
de reacie pozitiv, la hotarul dintre antigen i anticorp se formeaz un inel tulbure, care reprezint
precipitatul Reacia este nsoit de un ir de controale.Un rol deosebit de important aparine
consecutivitii introducerii ingredienilor reaciei n eprubeta. Nu se admite stratificarea serului pe
suprafaa antigenului (n control pe soluia izotonic), deoarece densitatea serului este mai mare
dect cea a antigenului i el se va aeza la fundul eprubetei, iar hotarul dintre antigen i anticorp nu se
for-eaz.
Evidena rezultatelor se efectueaz peste 530 min, iar n unele cazuri peste o or, ntotdeauna
ncepnd cu controlul. Inelul din eprubeta a doua inidic capacitatea serului imun de a intra n
reacia specific cu antigenul corespunztor, n eprubetele nr. 35 nu trebuie s apar inele
de precipitare, deoarece lipsesc anticorpii i antigenii omologi. Prezena inelului n eprubeta nr. l
indic rezultatul pozitiv al reaciei i faptul c antigenul cercetat corespunde serului imun folosit n
reacie. Lipsa inelului (inelul e prezent doar n eprubeta nr. 2) indic necorespunderea
antigenului cu anticorpul, deci a fost obinut rezultatul negativ al reaciei.
Reacia de precipitate se folosete pe larg n practica de laborator pentru diagnosticul bolilor
infecioase bacteriene (antrax, pest, tularmie . a.) i de natur virotic (variol, infecia respiratorie
acut . a.),
In medicina judiciar R.P. se folosete pentru determinarea apartenenei de specie a proteinei (pete de
snge, sperm etc.).
Cu ajutorul R.P. se va determina att specificitatea de specie, ct i de grup a proteinei. Prin intermediul
ei s-a determinat, de exemplu, gradul de nrudire a diverselor specii de animale i plante.

39 RIF direct i indirect. Ingredientele necesare, tehnica efecturii, citirea i


interpretarea rezultatelor.
Marcanii utilizai uzual: fluorocromi(rodamina, fluoresceina), care emit respectiv o lumin rou-oranj
sau verde-galben la tratarea lor cu raze UV.
Reacia de imunofluorescenta direct este folosit numai n scop de seroidentificare. Din
materialul ce conine Ag (material nativ, cultura pur, biopsie tisular) se prepar un frotiu, peste care
se aplic serul imun specific cu Ac marcai cu fluorocrom. Peste 20 min de incubare ntr-o camer
umed, preparatul este studiat la microscopul luminescent. n caz de reacie pozitiv se observ
luminiscen local. Inconvinient:necesitatea de a avea seruri imune marcate specifice ptr fiecare Ag.
Are la baz folosirea fluorocromilor, chimic conjugai cu anticorpii. Anticorpii marcai i pstreaz
specificitatea imunologic si reacioneaz strict cu anumite antigene. Complexele antigenelor cu
anticorpii marcai se evideniaz uor dup intensitatea de luminiscen galben-verzuie la studierea
frotiului n microscopul luminiscent.
R.I.F. direct prevede folosirea serurilor imunofluorescente fa de fiecare antigen examinat.
R.I.F. poate fi aplicat pentru examinarea diferitor antigene: culturi de bacterii, ciuperci, protozoare;
frotiuri din materialul bolnavului; celulelor infectate, seciuni de esut . a. Materialul de examinat se
aplic pe lam i se fixeaz (deseori n aceton (10 min) la temperatura camerei), apoi ss usuc 20
min la temperatura de 37C. Prelucrarea preparatelor n continuare depinde de varianta R.I.F. folosite.
Preparatul n R.i.F. direct se coloreaz cu antiser specific marcat n camer umed 30 min la
temperatura 25C, apoi se spal cu soluie tampon (pH 7,2) 10 min a temperatura de 25C.
Pentru a evita rezultate fals-pozitive reacia este nsoit de un ir de controluri, printre care un rol
deosebit i revine controlului cu antigen eterogen
RIF indirect poate fi utilizat ptr seroidentificare i serodiagnostic. pe frotiul ce conine Ag se aplic
Ac corespunztori nemarcai. Peste 20 min se spal minuios preparatul, apoi se adaug anti- Ig
fluorescent, care se va combina cu Ac din complex. Acest reactiv poate fi utilizat n numeroase reacii.
Anti-Ig se obine prin imunizarea iepurilor(sau altor animale) cu Ig umoane.
R.I.F. indirect are la baz folosirea a dou antiseruri diferite. La nceput se aplic anticorpii
nemarcai fa de antigenul studiat, iar n etapa a doua a reaciei complexul format antigen-anticorp
este prelucrat cu antiser marcat cu F.I.T.C (fluresceinizotiocianat., ce conine anticorpi contra gama-

globulinelor acelui animal, de la care s-au obinut antiserurile folosite n prima etap a reaciei (ser
antigen de specie).

40 Reacia de fixare a complementului cu scop de seroidentificare.


Ingredientele necesare, tehnica efecturii, citirea i interpretarea
rezultatelor.
RFC se bazeaz pe fenomenul , conform cruia complexul specific dintre Ag i Ac ntotdeauna leag
complementul.
RFC cu scop de serodiagnostic prevede identificarea Ac cu ajutorul Ag.
componentele: ptr sistemul de baz: antigen (de regul lizat), extract, hapten, mai rar suspensia de
microorganisme, anticorp: serul bolnavului, complement: serul cobaiului. ptr sistemul hemolitic:
antigen: eritrocite de berbec; anticorp: hemolizina fa de eritrocitele berbecului; soluie izotonic.
REACIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI (RFC). Este o reacie complex, constituit din 2
sisteme Ag-Ac i cu participarea C. n RFC particip Ig capabile s fixeze C IgM i IgG. RFC se
utilizeaz n diagnosticul virozelor, infeciilor bacteriene, etc Toate componentele RFC sunt utilizate n
acelai volum fiind titrate n prealabil pentru aprecierea dozelor de lucru. Reacia este nsoit de
martori ai tuturor componenilor
Reacia se efectueaz n 2 etape utiliznd 2 sisteme.
I etap Sistemul de baz este constituit din Ag1 (diagnosticuri sau Ag necunoscute), Ac1 (serul
bolnavului sau serul imun) i complement n doza de lucru. Amestecul este incubat 1h la 37
37 C sau
meninut 16-18 ore la 4
4 C. Dac Ac se combin cu Ag omolog va avea loc i fixarea C (efect
frecvent invizibil).
II etap la sistemul de baz se adaog sistemul indicator (hemolitic), constituit din hematii de
berbec (Ag2) combinate cu Ac specifici (Ac2). Peste 1h incubare la 37
37 C reacia este terminat.
Evaluarea rezultatelor dac complementul a fost fixat de primul sistem Ag-Ac hemoliza nu se
observ (rezultat pozitiv). Dac Ag1 nu corespunde cu Ac1, complementul rmne disponibil
pentru fixare pe sistemul indicator Ag2-Ac2, provocnd hemoliza (rezultat negativ)

41. Reacia de bacterioliz. Componentele. Tehnica efecturii reaciei in vivo. Citirea i


interpretarea rzultatelor.
L i z i n e numim nite anticorpi specifici care provoac dizolvarea bacteriilor, celulelor de plante i
animale. Citoliza bacteriilor se produce prin concursul a dou ingrediente: anticorpului specific, coninut
n serul imun, i substanei nespecifice, coninute n orice ser normal sau imun, numite complement.
Uzinele au capacitate^ de a dizolva bacteriile : treponemele, lep- tospirele (bacteriolizine), precum i de a
produce leziuni brutale n structura hematiilor (hemolizine), leucocitelor i altor celule (citolizine). Ele
posed toate proprietile principale ale anticorpilor, cu unica diferen c acioneaz asupra antigenului
exclusiv n prezena complementului.
Reacia de liz este polisistemic, indirect, tricomponenial. Dat fiind c complementul este labil, n
reaciile de liz se folosete un complement conservat obinut de obicei din serul de cobai. Conservarea
complementului se face prin adiie de clorur de sodiu n concentraii de 10%, sau acid boric 4%, su
sulfat de sodiu 5%, precum i prin uscare la temperatur joas n vid (liofilizare).
n caz de imunizare a iepurilor cu suspensie de hematii de berbec n sngele lor se acumuleaz anticorpi
capabili s modifice hematiile, de pe urma crui fapt legtura de adsorbie dintre hemoglobin i stroma
lor se rupe, hemoglobina ptrunde lesne din hematii n lichidul nconjurtor i el se coloreaz n roz.
nclzirea serului imun la temperatura de 56C timp de 30 min. este nsoit de pierderea proprietilor
hemolitice de pe urma inactivrii complementului, n adiia de ser proaspt de ja un nimal chiar
neimunizat restaureaz caracterele hemolitice ale serului imun. Dac n eprubet introducem n anumite
proporii ser hemolitic (anticorpi), hematii de berbec (antigen) i complement, peste cteva minute se va
produce modificarea amestecului: din rou opalescent el va deveni roz (cu aspect de lac).
42. Reacia de bacterioliz. Componentele. Tehnica efecturii reaciei in vitro. Citirea i
interpretarea rezultatelor.
Reaciile de liz Snt cele de dizolvare a antigenului unit cu anti-corpi n prezena complementului. In
dependen de antigenele care particip l reacia de liz; ea poart denumirea de vibrioliz, bacterioliz,

hemoliz . a. m. d. Anticorpii ce particip sint numii respectiv spirochetolizie, vibriolizie, hemolizine .


a. Lizinele i manifest aciunea numai n prezena complementului.
Majoritatea microorganismelor, excluznd vibrionul boierie si treponemele, snt rezistente la aciunea
litic a anticorpilor. De aceea reacia de liz nu este larg rspndit n practica de laborator...
| La efectuarea reaciei de liz (tab. 2) serul imun se nclzete timpB de 30 min la temperatura de 56C
pentru inactivarea complementului Suspensia de microorganisme se prepar din cultura de 24 ore (1 ml)
diluat suspensie de microorganisme i 0,1 ml de complement nediluat. In alt tub - martor al
complementului, inactivat n serul imun, complement nu se adaug. In al treilea tub martor al
complementului la' lipsa Uzinelor n el, serul imun se nlocuiete cu soluie izotonic de dorid de natriu.
Tuburile se menin n termostat 2 ore la temperatura de 37C. Apoi se facnsmnri cu ansa din fiecare
tub pe mediu nutritiv soUd n cutii Petri.
H nsmnrile snt ncubate 24 ore la temperatura de 37C i se numr coloniile. In caz c serul
examinat conine lizine, numrul de co- I Ionii pe mediul nutritiv, nsmnat cu material din tubul de
experien, va fi de multe ori mai mic dedt n cutiile nsmnate cu materialul din ; tuburile de control.
Reacia de hemoliz este folosit n calitate de sistem indicator n I reacia de fixare a complementului.
43. Reacia de neutralizare a exotoxinelor in vivo. Principiul. Componentele. Tehnica efecturii.
Citirea i interpretarea rezultatelor.
La baza acestei reacii se afl capacitatea serului antitoxic specific de a neutraliza exotoxina. Pentru
efectuarea reaciei materialul de examinat n care se presupune prezena exotoxinei se amestec cu ser
antitoxic, se pstreaz n termostat i se inoculeaz animalelor (cobai, oarece). Animalelor de control li
se injecteaz filtratul materialului de examinat neprelucrat cu ser. In caz c are loc neutralizarea
exotoxinei de ctre serul antitoxic, animalele din grupul de experien supravieuiesc. Animalele de
control pier n urma aciunii exotoxinei. O variant a reaciei de neutralizare este testul de* seroprotecie,
in care se urmrete capacitatea unei antitoxine, inoculate n prealabil la un animal receptiv, de a preveni
efectele specifice ale unei toxine.
Frecvent folosit n laboratorul clinic este dozarea antistreptolizinei O bazat pe neutralizarea efectului
hemolitic al streptolizinei O, o citotoxin produs de. streptococii grup A, C i G.
Prin teste intradermice poate fi urmrit neutralizarea toxinelor difterice, cu efect dermonecrotic (testul
Schick) sau a eritrotoxinei streptococice (testul Dick).

44. Reacia de imobilizare a bacteriilor. Componentele. Tehnica reaciei. Citirea i interpretarea.


Reacia de imobilizare este monosistemic, indirect, tricomponenial. n afeciunile provocate de
treponemele patogene n sngele oamenilor bolnavi se formeaz anticorpi care mpiedic micarea
treponemelor i produc dezintegrarea lor.'Efectul imobilizant al anticorpilor se realizeaz n prezena
complementului, dei nu are loc fixarea lui sauifenomenul se produce n grad minim. Apariia reaciei de
imobilizare a fost constatat nu numai fa de treponeme, ci i fa de alte microorganisme (agentul
amibiazei, unele bacterii mobile etc.a.
45. Testul ELISA metoda direct. Principiul. Componentele. Tehnica efecturii. Citirea i
interpretarea rezultatelor.
ELISA una dintre cele mai folosite metode de indentificare si apreciere cantitativa pentru anticorpi,
antigene, hormone, cytokine si o paleta larga de molecule, inclusiv peptide sintetice.
Principul :
Se bazeaza pe antigen-anticorp. Antigenul sau anticorpul de captura este fixat pe un support solid dupa
care este pus in contact cu o immunoglobulina sau un antigen. O enzima cuplata fie direct de
imunoglobulina sau de un alt anticorp antiimunoglobulina degradeaza un substrat cromogen inccolor
producind un compus colorat ce poate fi detectat spectrofotometric la o lungime de unda
corespunzatoare.
- RIE direct (metoda sandwich). Utilizat doar n seroidentificarea Ag. n godeurile din placa de
polistiren n care sunt fixai Ac cunoscui se toarn soluia de Ag necunoscut. Se incubeaz 1h. Dup

o splare minuioas a godeurilor se adaug Ac marcai cu enzime, care se fixeaz pe epitopii liberi ai
Ag polivalent. Dup incubare de 30 min-1h se spal iari godeurile. Prezena complexului Ac-AgAc-marcat se depisteaz cu ajutorul substratului cromogen (substan iniial incolor, dar care se
coloreaz sub aciunea enzimei, ex. apa oxigenata si orthofenilendiamina).
Interpretarea rezultatelor:
Consta in aprecierea culorii probei. Intensitatea culorii se apreciaza mai intii visual, pentru determinarea
virarii de culoare dupa adaugarea substratului si stabilirea timpului de mentinere a lui pina la stoparea
reactiei. Densitatea se apreciaza la stecrofotometru.
46.Testul ELISA metoda indirect. Principiul. Componentele. Tehnica efecturii. Citirea i
interpretarea rezultatelor.
Utilizat n serodiagnostic.
ELISA una dintre cele mai folosite metode de indentificare si apreciere cantitativa pentru anticorpi,
antigene, hormone, cytokine si o paleta larga de molecule, inclusiv peptide sintetice.
Principul :
Se bazeaza pe antigen-anticorp. Antigenul sau anticorpul de captura este fixat pe un support solid dupa
care este pus in contact cu o immunoglobulina sau un antigen. O enzima cuplata fie direct de
imunoglobulina sau de un alt anticorp antiimunoglobulina degradeaza un substrat cromogen inccolor
producind un compus colorat ce poate fi detectat spectrofotometric la o lungime de unda
corespunzatoare.
Ag cunoscut este fixat la fundul godeurilor. Ac (serul testat) se ntroduce n godeu, dup 1h se spal totul
i se adaug ligandul marcat cu enzim (anti-Ig sau proteina A cuplate cu enzim). Acest ligand se fixeaz
pe Ac testai. Se adaug apoi substratul cromogen. Cantitatea de Ac se msoar dup densitatea optic a
lichidului din godeuri.
Interpretarea rezultatelor:
Consta in aprecierea culorii probei. Intensitatea culorii se apreciaza mai intii visual, pentru determinarea
virarii de culoare dupa adaugarea substratului si stabilirea timpului de mentinere a lui pina la stoparea
reactiei. Densitatea se apreciaza la stecrofotometru.
47.Testul imunoblot. Principiul. Componentele. Tehnica efecturii. Citirea i interpretarea
rezultatelor.
Acest test este util pentru a confirma prezenta anticorpilor IgG specifici fata de virusul hepatitei C in
probele de ser care au dat rezultate reactive. Testul utilizeaz 6 antigene HCV recombinate purificate,
relevante serologic, care sunt separate pe baza greutii moleculare prin electroforez n gel de
poliacrilamid n prezen de sodium dodecil sulfat (SDS-PAGE) i transferate ulterior electroforetic pe o
membran de nitroceluloz (Western blotting). Situsurile de legare libere de pe membran sunt saturate cu
o soluie de proteine, dup care matricea este splat i tiat n fii (strip-uri). Antigenele sunt
reprezentate, n ordinea fixrii pe strip, de:

Core 1 i Core 2: proteine structurale provenite din regiunea core care formeaz cea mai mare
parte a nucleocapsidei virale;

Helicaz: protein nonstructural/parte din NS3 cu activitate de helicaz viral;

NS-3: protein nonstructural cu activitate de helicaz viral i proteaz;

NS-4: protein nonstructural;

NS-5: protein nonstructural.


ntr-o prim etap strip-ul ncrcat cu antigenele HCV este incubat mpreun cu serul diluat al pacientului.
Dac n ser sunt prezeni anticorpi specifici acetia se vor lega de antigenele corespunztoare de pe strip.
Dup o etap de splare, strip-ul este incubat cu un conjugat anti-IgG uman marcat cu peroxidaz.
Conjugatul se va ataa la poriunea IgG a complexului antigen-anticorp. Dup ndeprtarea prin splare a
conjugatului nelegat se adaug soluia de colorare un sistem de detecie enzimatic colorimetric care
conine peroxid de hidrogen i 4-cloro-1-naftol. Dac este prezent conjugatul legat reacia enzimatic va
genera un produs colorat albastru-nchis la nivelul benzilor ocupate de anticorpi specifici. Astfel, benzile
vizualizate la nivelul stripului sunt rezultatul legrii anticorpilor specifici de antigenele individuale
recombinate de la nivelul strip-ului.
Prin acest test sunt detectai anticorpii specifici fa de cele 6 genotipuri HCV 4.

Valori de referin i interpretarea rezultatelor


Intensitatea benzilor probelor este comparat cu cea a benzii controlului cut-off prezent pe fiecare strip.
Sunt posibile urmtoarele exprimri semicantitative:
Nici un antigen --------- negativ
Core 1 izolat, Helicaza izolata sau alte 2 antigene ------------- echivoc
Core 1 si Core 2; Core 2 si un alt antigen; 3 antigene --------------- pozitiv.
48. Reacia opsono-fagocitar. Componentele. Tehnica reaciei. Citirea i interpretarea.
Determinarea indicelui opsono-fagocitar.
O p s o n i n e (din gr. opson - hran) se numesc 1 anticorpii serurilor normale i imune, care modific
microorganismele i le 1 prepar n vederea unei fagocitri mai intense. Sub influena opsoninelor se .
produce modificarea suprafeei microorganismelor, mai ales a potenialului lor electric, de pe urma crui
fapt ele se preteaz mai lesne la fagocitoz. Opso- ninele condiioneaz sensibilizarea specific i sporirea
sensibilitii bacteriilor I fa de fagocitoz.
Opsoninele snt alctuite din substane termolabile ale serului sangvin i ^includ trei fracii ale
complementului (C3b) i termostabile, ce conin IgG.
La nceput, n prima faz se produce opsonizarea particulelor,. n a doua | fixarea lor pe suprafaa
celulelor fagocitate.
4Gradul de activitate a opsoninelor se obinuiete a-1 exprima prin i n d i ce o p son i c, cre reprezint
raportul indicelui fagocitar al serului imun la indicele fagocitar al serului de om sntos. Indice fagocitar
se numete rezub tatul de la mprirea numrului de bacterii fagocitate de 100 de fagocite la numrul de
fagocite. Indicele opsonic trebuie s fie mai mare dect 1,0.
49.Diagnosticul microbiologic al infeciei stafilococice (medii pentru izolare i unele teste mai
importante pentru identificare).
1. Prelevate patologice (puroi, singe, probe alimentare, urina, mase fecale)
2. Microscopia direct
Se efectueaz i se coloreaz Gram frotiuri, care sunt examinate prin obiectivul cu imersie
3. Izolarea i identificarea
Etapa I. Se epuizeaz o ans din prelevatul patologic sau tamponul de prelevare pe mediul de izolare:
geloz-snge: prelevate necontaminate sau cu contaminare redus ca puroi, lichid cefalorahidian,
tampon riazal etc.;
--- hiperclorurat cu lapte i ou, hiperclorurat cu manitol (Chapman): prelevate hiper- contaminate ca
materii fecale, alimente, sput.
Etapa II . Dup incubare aerob peste noapte la 37C, stafilococii formeaz colonii S, cu diametrul de 1
2 mm, bombate, opace, pigmentate auriu, alb sau galben, cu sau fr hemoliz complet pe geloz-snge
i cu halou opac determinat de lecitinaz pe geloza cu lapte i ou.
Pe mediul Chapman coloniile de S. aureus sunt manitopozitive (galbene prin fermentarea manitei). Ali
stafilococi sunt manitonegativi.
Etapa III . Cultura pur, verificat microscopic, este supus testelor de identificare.
6.
Depistarea coagulazei legate (dumping factor). Pe o lam de microscop, ntr-o pictur de ap, se
omogenizeaz o ans din cultura pur pentru a obine o suspensie lptoas. Se nmoaie un fir drept n
plasm de iepure i se agit, prin micare circular continu, timp de 5 secunde, n suspensie bacterian.
Aglutinarea stafilococilor din pictur n interval de 10 secunde semnific un test pozitiv. Testul negativ,
absena aglutinrii, trebuie confirmat prin testul coagulazei libere, n tub.
7.
Testul coagulazei libere. ntr-un tub 10/100 mm cu 0,5 ml plasm citratat de iepure diluat 1/4 se
suspensioneaz o ans plin din cultura pur. Se incubeaz n baie de ap la 37C i se verific, prin
nclinarea tubului, dup 30 minute i 4 ore apariia cheagului. n caz de rezultat negativ n acest interval,
se las tubul pn a doua zi la temperatura camerei i se urmrete din nou apariia cheagului.
8.
Se epuizeaz cultura pe geloz cu 0,01% fosfat de fenolftalein i se incubeaz peste noapte la
37C. Se expune cultura vaporilor de amoniac (o bucat de hrtie de filtru mbibat cu amoniac i fixat

pe capacul plcii Petri). n interval de 12 minute coloniile stafilococilor productori de fosfataz devin
roz-roii.
9.
Fermentarea sau oxidarea zaharurilor sunt urmrite prin testul O/F.
10.
Rezistena la novobiocin poate fi testat o dat cu antibiograma tulpinii semnificativ clinic
supus identificrii.

50.Diagnosticul microbiologic al infeciei streptococice (medii pentru izolare i unele teste mai
importante pentru identificare).
1. Prelevate patologice
Exsudat oro- sau nazofaringian, puroi, lichid cefalorahidian, raclat uterin, sput in |feciile localizate,
recoltate, dup caz, pe tampon, cu seringa sau pipeta.
2. Microscopia direct
colorare Gram i cu albastru de metilen, depisteaz coci grampozitivi dispui in perechi sau lanuri n
context inflamator cu polimorfonucleare.
3. Izolarea i identificarea
Hemoculturile.
Etapa I. Sngele n cantitate de 510 ml, recoltat aseptic din vena cubitl, este nsmnat n proporie
de 1:10 n bulion glucozat i n bulion Kitt-Tarrozzi cu incubare de 721 zile la 37C aerob i, respectiv,
anaerob in atmosfer cu 1020% 02.
Etapa II. Hemoculturile se examineaz n zilele 1; 2; 3; 5; 7; 10; 15; 21 microscopic i prin repicare pe
plac cu geloz-snge.
Etapa III. Identificarea izolatelor n cultur pur se face prin:
Streptococii sunt pretenioi nutritiv, facultativ pe medii Imbogatite. Pc geloz-snge formeaz colonii
hemolitice sau nehemolitice in funcie de specia implicata.
Testul catafaza difereniaz aceste bacterii fiind negativ pentru i pozitiv pentru mkfocori.
Pe o lam de microscop, se amestec* o pictur din cutunMii Pam Qt o pic tur din soluia 10% de
H2O2. Se urmrete efectul timp de 13 rest negativ: absenta bulelor de gaz; test pozitiv: apariia
bulelor de gaz.
Testul de sensibilitate la bacitracin. Pe un sector al unei plci cu geloz-snge confluent cu tulpina
testat se depune un microcompriraat cu 0,5 UI bacitracin peste noapte la 37C.
| Identificarea streptococilor nongrup A se face prin criteriile Sherman
I I Pentru Identificarea S. agalactiae (grup B) este util testul CMP, bazat pe capacitatea acestei specii de
a stimula activitatea hemolitic a streptococului auriu. Pe o plac cuigeloz-snge nsmnm tulpinile
de streptococ testate n striuri perpendiculare pn la 1 cm distan de un striu prensmnat cu
Staphylococcus aureus i incubm pn p doua zi la 37C. Zona de hemoliz a stafilococului se lrgete
n dreptul striului de Bpeptococ grup B.
I Etapa IV. Comunicm rezultatul: specia sau grupul serblogic al streptococului izolat.
S. ipyogenes este printre puinele specii care i-au pstrat marea sensibilitate natural la penicilin. Pentru
toi ceilali streptococi se efectueaz i se comuni antibiograma. n cazul pacienilor sensibilizai la
penicilin, la fel se procedeaz i cu S. pyogenes, care a dobndit rezisten la alte antibiotice, inclusiv la
eritromicin.
51. Diagnosticul microbiologic al infeciei meningococice (medii pt izolare i unele teste m.import pt
identificare).
Prelevate: exsudatul nasofaringean, hemocultur, exsudat prelevat aseptic prin scarificarea pete iilor,
lichid cefalorahidan.
Graie fragilitii meningococilor, examinarea probelor (cel mult 1-2h) evitarea refrigerrii.
Examenul bacteriologic
Sedimentul din LCR se nsemneaz pe medii de cultur mbogite, cum sunt geloza-snge,
geloza-ciocolat, mediul Mueller-Hinton prenclzite la 37 C.
Exsudatul nazofaringean se nsemneaz imediat dup recoltare pe medii cu adaos de antibiotice
(lincomicin, vancomicin, ristomicin) pentru inhibarea cre terii bacteriilor G+

Hemoculturile se nsemneaz n bulion glucozat 2% (un volum sange pentru 10 volume mcdiu).
Examinrile se fac zilnic timp de 5-7 zile prin subculturi.
Identificarea
Studiul earacterelor morfotinctoriale: diplococi gramnegativi in boabc de cafea; in culturile vechi
apar forme atipice variate.
Studiul curacterelor de cultur prin repicare pe geloza nutritiva i geloza-ser cu incubare la 37C i la
22C. Mcningococul crete numai pc geloza-ser la 37C.
Studiul caracterelor biochimice. Meningococii produc oxidaza i catalaza, iar pc mcdiul Hiss formeaza
acid din glucoz i maltoza, dar nu scindeaza zaharoza, lactoza i fructoza
52. Diagnosticul de laborator al gonoreei: produsele patologice i recoltarea lor; metodele de
diagnostic.
Prelevate: secreiile uretrale,exsudat endocervical, vulvovaginal, din endocol, anorectal, conjunctival,
nazofaringian, articular.
Recoltare - tampon de alginat de Ca (sau ansa bacteriologic), care este apoi trimis imediat n laborator
pentru testare (dupa necesitate se foloseste mediul de transport Stuart cu tioglicolat i crbune activat).
Daca eliminrile sunt srace, se apeleaz la stimularea secreiei sau inflamaiei din focare : Alimentar (cu
bauturi alcoolice bere); Chimic (instilaii cu nitrat de Ag sol. 1% in uretr, 10% n colul uterin);
Biologic (inocularea gonovaccinului, recoltarea secreiilor imediat dupa menstre la femei); Mecanic
(masaj al prostatei); Termic (diatermie sau inductotermie edine 30min-3zile)
Examenul microscopic (elocvent doar n cazul uretritelor acute la brbai).
In frotiuri din puroiul uretral colorate Gram sau cu albastru de metilen se observ diplococi gram negativi
n boabe de cafea situai intra- sau extracelular. RIF
Examenul bacteriologic (este obligator n forme asimptomatice sau cronice)
Etapa I. Prelevatele patologice sunt epuizate pe medii special imbogtite (Thayer-Martin).
Pentru izolare in mediul de cultur se include i un amestec selectiv format din colimicina sau polimixin
B 10-20 U/ml (inhib bacilii gramnegativi) i ristomicin sau vancomicin (inhib flora grampozitiv).
Culturile trebuie incubate 24-48 ore la 37C in atmosfer cu 5-10% CO2 i umiditate crescut asigurat
de hrtie de filtru umectat.
Etapa II. Coloniile suspecte (mici, transparente, S, oxidazopozitive) sunt repicate, pentru a obtine cultura
pur necesar identificrii.
Etapa III. Se procedeaz la identificarea culturii pe baza urmtoarelor caractere:
diplococi caracteristici gramnegativi; oxidazopozitivi; care cultiv numai la 37C pe medii special
imbogtitc cu ser; formeaz acid numai din glucoz i sunt inactivi asupra maltozei, lactozei i
zaharozei Identificarea antigenic poatc fi facuta cu seruri antigonococice prin agiutinarc, coaglutinare
sau rcactie imunofluorescenta.
Antibiograma este necesara pentru ca exista tulpini producatoarc de b-lactamaz i multirezistente la
antibiotice.
Etapa IV. Interpretarea rezultatelor i completarea bulctinului de analiz..
Diagnosticul serologic - RFC. Titrurile mai mari de 1:10 sunt sugestive, dar specificitatea i sensibilitatea
reactiei sunt nesati-sfctoare.

1. Diagnosticul de laborator al antraxului: produsele patologice i recoltarea lor; metodele de


diagnostic.
Prelevate (n funcie de forma clinic): exsudat din leziunea cutanat, sput, snge, LCR, materii fecale,
bioptate din ganglioni limfatici, probe necroptice, probe de la animalul suspect i elemente din mediul
extern
Examenul microscopic: direct, RIF. Pe frotiuri sau amprente de organe coIorate cu albastru de metiten
policrom i Gram se observ bacili mari cu morfologia caracteristic, capete retezate, izolai sau n lanuri
scurte. Sporii sunt rareori prezeni.
Prin coloraia cu albastru de metilen policrom capsula se observ mai bine, colorat metacromatic in roz,
ca un inveli continuu in jurul baciIilor

Examenul bacteriologic Prelevatele monomicrobiene se nsmneaz pe geloz i geloz-snge, iar cele


polimicrobiene se nclzesc n prealabil 10 min la 75 grade C. Incubarea la 37 C timp de 24h.
Sngele n bulion glucozat, repicri zilnice timp de 7 zile pe geloz-snge.
Examinarea coloniilor crescute, selecia celor suspecte i acumularea lor : Coloniile de B. Anthracis sunt
mari, rugoase, cu aspect de sticl pisat, nehemolitice, cu circumferinj neregulat, inconjurat cu
prelungiri laterale ondulate in coama de leu
Identificarea culturii pure acumulate i diferenierea de antracoizi.
Examenul biologic - Se inoculeaz prelevatele la cobai sau oareci, care sunt foarte sensibili la infecie.
Dup moartea lor (36-48h) bacilii sunt depistai n frotiuri din snge i organe. Depistarea Ag
polizaharidice termostabile n prelevate (reacia de precipitare inelar Ascoli)
Diagnosticul serologic. Ac anti-antrax pot fi depistai la convalesceni n RP sau RFC
Diagnosticul imunologic (proba cutanat alergic). Se pune n eviden starea de hipersensibilizare prin
inocularea intradermic a 0,1 ml de antraxin (extract din tulpina vaccinant de B.anthracis). Reacie
pozitiv edem i hiperemie cu diametrul de peste 8 mm.
2. Diagnosticul microbiologic al pestei (medii pentru izolare i unele teste mai importante pentru
identificare).
Examenul direct
Examenul microscopic frotiuri din exsudat, aspirat ganglionar, puroi, snge, sput colorate Giemsa, cu
albatstru de metilen sau albastru toluidin depisteaz Y. pestis sub form de cocobacili colorati bipolar,
dispui izolat sau in perechi printre celuiele inflamatorii.
Examenul bacteriologic
Se insmnteaz prelevate necontaminate (aspirat ganglionar, probe bioptice) pc geloz-snge hemolizat
i hiposulfit de sodiu (1:4000) ca stimulatori de cretere.
Prelevatcle contaminatc (sput, probe de la cadavre, probe de sol) sc epuizeaz pc mcdii selective prin
adaos de violet de gentian (1:100000-1:200000).
Hemoculturile sunt indicatc in fiecare form clinic a bolii cu insmntarea sngelui in bulion glucozat.
Se incubeaz culturile minimum 30 ore la 28C.
-Se urmrete pe mediile solide apariia de colonii mici (0,1-1 mm diametru) cu centrul opac, perifcria
transparenta i marginile ondulate. In bulion Y. pestis determin turbiditate minim, creterea fiind sub
aspect de pelicula superficial cu ex-tindere de filamente in profunzimea mediului i depuneri la fundul
recipientului.
- Examenul ulterior al caracterelor de cultur (creterea progresiv a coloniilor, for marea in bulion a unui
val cu prelungiri sub form de stalactite in profunzimea mediului, care rmnc relativ clar), biochimice i
patogenitatea pentru oarece, obolan sau cobai diferentiaza izolatele de alte yersinii i le confirm ca Y.
pestis.
3. Diagnosticul de laborator al botulismului: produsele patologice i recoltarea lor; metodele de
diagnostic.
Prelevate: ser sangvin, extract din alimente, mase vomitive,splturi stomacale, mase fecale, urin.
Diagnostic microbiologic
Pn la nsmnare materialulde examinat n prealabil se frmi eaz n mojar.
Se Insmineaz 10-12 ml material in rnediul Kitt-Tarrozzi, in mediul cazeinic acid sau cazein-micetic.
Una din probe se insminteaz in 4flacoane, 2din care se nclzesc unul la temperatura de 60C,15min pt
seelctarea Cl.botulinum de tipul E), altul - la temperatura de 80C, 20 min
mbogirea cuIturiIor clostridiene de tipul E i F are loc in termostat la 28C, iar pentru creterea
clostridiilor de tipul A, B, C insmintrile se cultiv la temperatura de 37C, 48 ore.
Pentru activarea toxinei E din protoxin, n mediul nutritiv se adauge tripsin, pin la concentraia final
(0,1%).
Resturile din probele materialului de cercetat sInt pstrate in frigider pin la sfiritul analizei.
Peste 24-48 ore de pstrare a insminrilor in termostat se fixeaz turbiditatea mediului de imbogire i
gaz. Din mediul unde se depisteaz cresterea se pregtesc frotiuri, care se coloreaz dup metoda Gram.
Dac sint evideniate clostridii tipice cu spori (In form de palet), se efectueaz reinsminarea pe medii
nutritive solide pentru cptarea coloniilor separate. Izolarea culturii pure prezint greuti din cauz, c
clostridiile botulinice deseori se gsesc n asociaii cu unele bacterii aerobe. Uneori numai Insminrile
repetate de mai multe ori permit obinerea culturii pure.

Pe geloza singe glucozat Cl.botulinum formeaz colonii neregulate cu o suprafa neted sau rugoas,
inconjurate de o zon de hemoliz. In profunzimea coloanei de geloz glucozat aceste colonii amintesc
fulgi de vat sau boabe de linte.
Pentru identificare cultura pur obinut se insminteaz in rre diile irului "pestri" Cl.botulinum posed
caractere proteolitice: lichifiaz gelatina, serulcoahulat, descompune ovalbumina, segmente de carne.
Majoritatea tulpinilor fermenteaz glucoza, manita, maltoza i alte glucide cu formare de acid i gaz.
4. Diagnosticul de laborator al gangrenei gazoase. Prelevatele. Metodele de diagnostic
Prelevate : serozitate din profunzimea plgii, probe bioptice din leziune, snge, probe necroptice din
leziune i organe.
Microscopia direct : Pe sectiunile histopatologice, pe amprentele tisulare sau pe frotiurile serozitii din
plag, C.perfringens apare ca bacili grampozitivi, uneori capsulati, sporulai sau nesporulati.
Diagnostic microbilogic
-Sc epuizeaza cte o ansa din proba pe o placa cu geloza-sange glucozata i una cu geloza-galbenus de ou
lactozata. Daca frotiul direct a atestat prezenta bacteriilor sporulate i numeroase alte bacterii nesporulate,
se procedeaza la imbogatirea clostridiilor dupa cum urmeaza: se insamanteaza restul probei in mai multe
tuburi cu bulion Kitt-Tarrozzi regenerat.
Se incalzeste cate un tub in baie de apa la fierberc timp de 5,10, 20 min(termorezistenta sporilor
clostridiali este diferit).
Se incubeaza anaerob la 37C si se urmarete zilnic mediile insamantate. C. perfringens, specie care
sporuleaza rar e mbogit prin incubarea anaeroba a tuburilor cu bulion la 45-46C sau prin incubare in
bulion cu 100 g neomicina/ml.
-Se urmrete aspectul coloniilor dczvoltate, caracterele hemolizei i, pe placa cu geloza-galbenus de ou
lactozata, producerea de lecitinaza sau lipaza i fermentarea lactozei.
Sc repic colonii sugestive pe gcloza-sange, pentru acumularc de cultur pura.
-Se identifica izolatele pc baza caracterelor:
Microscopice: prezenta, forma i pozitia sporului.
Aspectul coloniilor: colonii S sau R hemolitice. C. perfringens produce hemoliza de tip caldrece: o
prima zona de hemoliza completa aparuta la 37C se inconjoara cu a doua zon, mai putin clar, dupa
mentinerea culturii la frigider.
Coloniile unor specii mobile tind s invadeze suprafala mediului (C. septicum, C. sporogenes, dar mai
ales C. novyi). In coloan de geloz moale specia imobil, C. perfringens, formeaz colonii compacte
biconvexe (lenticulare), iar speciile mobile colonii arborescente sau pufoase (cu aspectul pufului de
ppdie).
Biochimice. Pe geloz-glbenu de ou se urmrete producerea de lecitinaz i lipaz (opacifiere i,
respectiv, strat perlat in jurul coloniilor). Proteoliza se evidentiaz prin digerarea plasmei, a serului
coagulat sau lizarea fragmentelor de organe (ficat, carne tocat), din bulionul Kitt-Tarrozzi. Insmntarea
in lapte degresat i turnesolat permite urmrirea coagulrii i digestiei cheagului. Activitatea zaharolitic
se studiaz prin insmntare in baterie de mediu Hiss regenerat i incubat sub ulei de parafin steril.
Metoda rapida de depistare a C. perfringens
Se insmnteaz proba de examinat n cte dou tuburi cu urmtoarele trei medii de cultur: bution KittTarrozzi, lapte degresat turnesolat, bulion VF cu sulfit. Se inclzeste cte un tub cu fiecare mediu la 80C
timp de 20 minute pentru omorrea formelor vegetative, apoi sc incubeaz toatc tuburile anaerob la 37C.
La intervale de 3-6 Ore urmresc rezultatele sugestive:
crestere de bacili grampozitivi;
innegrire in bulionul cu sulfit;
producere de chcag alveolar in laptele turnesolat.
5. Diagnosticul de laborator al tetanosului: produsele patologice i recoltarea lor; metodele de
diagnostic.
Prelevate: puroi, secreii din plag,pansamente, medicamente.
Microscopia direct : bastonae lungi i subiri cu spori terminali sferici gram pozitivi Cl.tetani
Diagnostic bacteriologic Prelevatele sunt incalzite 30 minute la 80C pentru omorrea florei nesporulate
dc asociaie, apoi sunt mbogtite prin incubare n bulion Kitt-Tarrozzi.

Se epuizcaz proba imbogtit pe dou plci cu geloz-snge Zeissler (agarizat 5% pentru a preveni
creterea invaziv a bacilului tetanic) dintre care una cu ser antitetanic.
Dup incubare anacrob se urmarete apariia coloniilor transparente, cu tendint invaziv, uzual
hemolitice.
Pe placa cu ser antitetanic hemoliza este inhibat.
Sc repic cteva colonii tipice in bulion Kitt-Tarrozzi pentru acumulare de cultur pur necesar
identificrii.
ldentificarea rapid include studiul:
Caracterelor microscopice: bacili gramvariabiti cu spor sfcric terminal (aspect de bolduri sau bele de
tob).
Caracterelor de cultivare: organism anaerob cu cretere invaziv3 pc inediile cu concentratie normal
(2%) de agar.
Palogenittii. Se injectcaz, intramuscular, in membrul posterior, cultura plus 5 mg Cl2Ca la 2 oareci
dintre care unul protejat cu ser antitetanic. Dup cca 4 zile oarecele neprotejat moare cu semne de
tetanos.
6. Diagnosticul de laborator al difteriei: produsele patologice i recoltarea lor; metodele de
diagnostic.
Material de examinat: peliculele difterice sau secreia membranelor mucoase afectate ale faringelui,
nasului, uneori ale organelor sexuale externe i conjunctivei ochiului, de la purttori - secretul faringian i
nazal.
Secretul faringian se recolt pe nemncate sau peste 2 ore dup mas. Nu se recomand folosirea
substanelor dezinfectante i a anti-bioticelor pn la recoltarea materialului. Materialul din faringe i nas
este recoltat cu 2 tampoane sterile, care apoi se introduc n eprubete i se transmit de urgen n laborator.
Dac transportarea dureaz mai mult de 3-4 ore, se folosesc tampoane mbibate cu soluie de glicerin de
5% n soluie izotonic de natriu clorid.
Examen bacterioscopic: secretul membranei mucoase se recolteaz cu 2tampoane: unul se foloseste
pentru insminare, altul -prepararea frotiurilor. Frotiu-rile pot fi colorate prin metoda Gram cu metil
violet, acetat albastru de metilen Loeffler, albastru toluidin dup Neisser. In frotiuri preparate din pelicul
corinobacteriile au form de bastonase separate, situate sub un unghi asemntor V, mai rar formeaz
aglomeraii gram + care amintesc o grmad de bolduri imprstiate.
La colorarea cu metil violet acetat i albastru Loeffler se evideniaz granule de volutin intensiv colorate.
Bacteriile pseudodifterice i difteroizii se aranjeaz paralel "in form de palisad", i, de regul, snt
lipsite de granulaii de volutin.
Examenul bacteriologic. Insminarea materialului se efectueaz pe unul din mediile elective: n
eprubete cu ser coagulat i in cutii Petri cu geloz-singe si telurit, geloz-ser cu cistin i telurit (TinsdaleSadkova), mediul cu hinozol Bucin.
Insmnarea materialului este efectuat cu un tampon prin friciune la suprafaa mediului.
Pe serul coagulat corinebacteriile difterice cresc naintea altor mi/o, formind colonii mici separate
(cretere agrenat). Peste 8-12 ore de incubare se pregtesc frotiuri, n caz de rezultat negativ examenul
microscopic se repet peste 18-24 ore. Dac corinebacteriile difterice nu sint depistate, insminrile se
menin in termostat 48 ore, dup ce se poate formula un rspuns negativ.
La depistarea corinebacteriilor tipice se izoleaz cultura pur, care se identific dup caracterele
fermentative si toxigene.
Dup 24-48 ore se studiaz coloniile n cutii. Pe mediile cu telurit de kaliu corinebacteriile difterice de
tipul gravis formeaz colonii mari de culoare neagr-surie, plate, rugoase, cu striaii radiale si margini
festonate, cu aspect de margarete; coloniile de tip mitis - mici, bomba-te, lucioase, negre, cu suprafaa
neted i margini regulate. Difteroizii cresc formnd colonii netede, bombate de culoare surie sau cafenie.
Bacteriile pseudodifterice formeaz colonii mici, uscate, mucoase, de o culoare surie.
Pe mediul Tinsdale-Sadkova coloniile din corinebacteriile difterice sint inconjurate de o aureol cafenie
nchis, pe mediul Bucin sint de culoare albastr, difteroizii pe acest mediu formeaz colonii incolore, iar
bacteriile pseudodifterice - colonii de o culoare albastr-deschis.
Pentru cptarea culturii pure i determinarea toxigenezei coloniile suspecte se microscopeaz i se
rensmneaz pe mediul cu ser cutii cu geloz-peptonat-fosfat. Culturile pure se nsmneaz n
mediile irului "pestri" - (glucoz, zaharoz, amidon), mediul cu cis-tein - proba la cistinaz (Pizu),
mediul cu uree (proba la ureaz).

Examenul biologic se efectueaz pentru determinarea toxigenezei culturilor izolate in vito


Metoda intradermic Se pregtete o suspensie din cultura cercetat de 100-200 mln i se administreaz
intradermic cte 0,2 ml de fiecare sus-pensie la doi cobai pregtii
Dup. 4 ore cobaiului de control infectat i se administreaz intraperitoneal 100 UJ ser antitoxic difteric.
Dac cultura este toxigen, la cobaiul experimentat n locul inoculrii materialului apare hiperemie, edem,
apoi necroz. Rezultatele finale se nregistreaz dup 72 ore.
7. Diagnosticul de laborator al tusei convulsive: produsele patologice i recoltarea lor; metodele de
diagnostic.
Prelevate ct timp pacienii sunt contagioi (primele 3-4 saptmni de boat) se prelev mucozit ile
nazofaringiene cu un tampon pernazal. Sputa, picaturile Flugge prelevate pe placa tuita, sunt mai puin
satisfacatoare.
Dat fiind marca sensibilitate a B.pertussis la desicare, exsudatul nazofaringian il prelevam pe tampon
imbibat cu mediul de transport Kuzneov (soluie de tampon fosfat, cu pH 7,0, cu 0,5% agar-agar i 0,2%
carbune de lemn activat). Pentru transport, tamponul imersat in mediul Kuzneov permite supravieuirea
bordetelelor pana la 5-6 ore.
Microscopia directa pe frotiuri din mucozitile nazofaringiene sau sputa colorate cu ser imun
fluorescent anti-pertussis i anti-parapertussis permite depistarea i identificarea rapid a speciilor
respective.
Examen bacteriologic
-Se cpuizeaza tamponul cu exsudat nazofaringian sau sputa pe mediul Bordet-Gengou sau gelozacazeina-snge-carbune activat, care contin 4-6 Ul penicilina pcntru inhibilia bactcriilor gram pozitive de
contaminare, cu incubare la 37C, in atmosfera umeda, timp dc 7 zile.
-Se urmarestc zilnic aparitia coloniilor caracteristice. Coloniile de Bordetella sunt bombate, perlate cu
aspectul picturi r de mcrcur, cu hemoliza fr linnte, precise.
B. pertussis crete cel mai lent, abia du 3z ile, cu colonii mici.
B. parapertussis creste in 1-2 zile i formeaza colonii mai mari.
Coloniile dc B. broncluseptica apar a doua sunt cele mai mari.
Se repic 3-15 colonii tipice sau suspecte, pentru a se obine cultura stock pc pant n vederea
identificarii.
-Se identifica izolatele pe baza caracterelor:
a) Microscopice: cocobacili gramnegativi cu sau fra capsul.
B. pertussis B parapertussis sunt imobile. B. bronchiseptica este mobil.
b) Caractere de cultur: La izolarea din organism. B. pertussis nu crete pe mediu cu pepton; celelalte
specii cresc, inclusiv pe mediul Mac Conkey, care conine i srur biliare.
c) Teste biochimice. Caractere de gen: ineria fermentativ.
Caractere diferenialc intre specii: scindarea tirozinei, utilizarea citratului, producerca de ureaza,
reducerea nitrailor n nitrii, producere de catalaz, oxidaza.

8. Diagnosticul de laborator al tuberculozei: produsele patologice i recoltarea lor; metodele de


diagnostic.
Prelevate patologice: sputa, aspirat sau spltur bronica, spltur gastric, exsudate aspirate prin
punctia cavitilor seroase afectate (Pleura, meninge, articulaii), puroi din abcese reci, probe biopsice,
urina, secreie menstrual, materii fecale. Probele care nu sunt examinate imediat, pot fi conservate la
+4C pana a doua zi. Detectarca bacililor tuberculozei este ameliorata daca se procedeaz la concentrarea
lor prin centrifugare timp de 30 minute la 3000-5000 rpm (urina, lichid cefalorahidian) sau prin
ultrafiltrare (lichid cefalorahidian). Pentru centrifugare prelevatele vscoase (ca sputa) sunt in prealabil
omogenizate. Metodele de omogenizare realizeaz i decontaminarea probelor.
Mai frecvent se recurge la omogenizare i decontaminare prin tratarea probelor cu soluie 4% de NaOH la
37C, cu agitare repetata timp de 30 minute, urmat de neutralizare cu solutie 10% de HCI.

Aceasta tehnica omoar bacteriile neacidorezistente de contaminare care au cretere rapid i ar invada
mediul, facand imposibil izolarea micobacteriilor cu cretere lent sau foarte lent.
Examenul bacterioscopic.
Sputa se toarn n cutia Petri, care se pune pe suprafaa ntunecat a mesei, se aleg globule compacte de
puroi, care se fricioneaz. ntr-un strat subire Intre dou lame. Lichidul cefalorahidian se pstreaz la
rece. Peste 18-24 ore n el se formeaz o pelicul fin de fibrin, care conine micobacterii tuberculoase i
elemente celulare. Aceast pelicul se aplic pe lam.
Urina se centrifugheaz atent i din sediment se pregtesc frotiuri.
Frotiurile se coloreaz prin metoda Ziehl -Neelsen. Micobacteriile tuberculoase colorate n rou-aprins
(rubiniu) prezint nite bastonae alungite, subiri, puin Incovoiate sau scurte i drepte; uneori n ele se
observ granulaii.
Examenul bacteriologic La materialul de cercetat se adaug un,volum dublu de acid sulfuric de 6%, care
inactiveaz mi/o acidosensibile, i se agit 10 min. Amestecul materialului cu acid sulfuric se
centrifugheaz eprubet steril, lichidul se vars, sedimentul se neutralizeaz adugnd 1-2 picturi NaOH
de 3% sau se spal de cteva ori cu soluie izotonic de natriu clorid i se insmineaz. Materiile fecale
sint prelucrate cu soluie NaOH 4%, amestecul se introduce n termostat pentru 3 ore, se centrifugheaz,
sedimentul se neutralizeaz cu acid clorhidric i dup aceea se insmineaz pe medii speciale.
-Probele decontaminate le nsmntm pe panta mediilor solide cum sunt: Lowenstein-Jensen, Popescu,
Finn, care,prin compoziia lor complex asigur cre terea micobacteriilor i inhib flora de asociaie
eventual rmasa dup decontaminare.
Culturile, in tuburi ermetic Inchise, sunt incubate difereniat la temperaturi Intre 22 i 42C cu urmrire
sptmnal timp de dou luni.
-Citirea culturilor : Coloniile de M. tuberculosts apar dupa 2-3 saptamni de incubare la 37C, sunt
rugoase, mamelonate, alb-bej i cresc progresiv in volum -(cretere eugonic) pna iau aspect
conopidiform. Sunt greu emulsionabile. M. bovis crete mai lent (dup 4 saptamni) i formeaza colonii
mici (cretere disgonic) albe, S, uor emulsionabile.
-Identificarea speciilor dup caractere
a> Aspectul coloniilor Si pigmentogeneza
b> Temperatura de incubare Si viteza creterit. la
c) Activitatea biochtmic: testul catalazei: bacilii tuberculozei produc o catalaz termosensibil
(inactivat in 30 de minutc la 68C), micobacteriile atipice produc o catalaz termorezistent; sinteza de
niacin (pozitiv la M. tuberculosis); testele ureazei, arilsulfatazei
d) Patogenitalea experimentala pentru diferite gazdw: cobai, iepure, oarece, psri. tt
e) Spectrul de sensibilitate la antibiotice Si chimioterapice antituberculoase.
Intradermoreacia la tuberculin (reacia Mantoux). Se cerceteaz starea de hipersensibilitate cutanat la
tuberculin. Tuberculina reprezint un filtrat dintr-o cultur bulionic autoclavat de M.tuberculosis.
Pe faa anterioar a antebraului se injecteaz i/dermic 2, 5 sau 10 UI de tuberculin n volum de 0,1 ml.
Lectura peste 72 ore. Reacia pozitiv se manifest printr-o induraie i congestie cu diametrul superior
sau egal cu 5 mm. Interpretarea se efectueaz n funcie de contextul clinic
Reacia + indic c subiectul a fost infectat cu micobacterii (primoinfecie), a fost vaccinat cu BCG sau
este bolnav de tuberculoz (n acest caz diametrul depete 10 mm).
Reacia negativ exclude diagnosticul de tuberculoz.

61.
Diagnosticul de laborator al spirochetozelor: produsele patologice i recoltarea lor;
metodele de diagnostic.
CLASIFICAREA SPIROCHETELOR
Spirochetele Familii : Spirochaetaceae(gen Treponema:pallidum,endemicum,carateum), Leptospiraceae (gen
Leptospira:interrogans,biflexa,parva.) gen.Borrelia

Diagnosticul spirochaetaceae(sifilis):

Prelevate: serozitatea din leziunile primare sau secundare, puncii din


ganglioni limfatici, serul sangvin, LCR .
Recoltarea:Ulceratia formata in locul inocularii spirochetelor se trateaza cu
tampon imbibat in sol izotonica de clorura de natriu.Lichidul colectat se
aplica pe lama pt examinare.
Singele se recolteaza din vena cubitala cu seringa sterila 4-7ml.
Metode de diagnostic
1.Examenul microscopic
-Microscopia pe fond negru.2-3 picaturi e lichid colectat se aplica pe lama
portobiect,ce se acopera cu lamela de acoperire.Se examineaza pe fundal
negru.Agentul patogen are aspect de spirala.
O alta metoda- frotiul se coloreaza dupa R-Giemsa si se examineaza la
microscop.In preparat se observa spirochete roz-pal.
2)RIF este putin accesibila dar evita riscul confundarii T.pallidum cu
treponeme genitale comensale.Se trateaza frotiuri cu conjugat fluorescent al
anticorpilor specifici anti T.pallidum.

3) Diagnostic serologic:- reactia Wassermann se efectueaza pe principiu reactiei de fixare a


complementului. ca antigeni se folosesc :cardiolipina,antigen proteic de grup/specific biotipurilor
de t.palidum.Lipsa hemolizei indica reactia pozitiva-o confirmare serologica a sifilisului.
-Reactia de precipitare :serul bolnavului se inactiveaza la 56 C timp 30 min.la antigen se adauga
0,6 % de colesterol pt marirea sensibilitatii reactiei.

4)reactia de imobilizare a treponemelor:este cea mai specifica.In eprubeta se


toarna 1,7 ml de suspensie de treponema tisulara ,se adauga 0,2 ml de ser cercetat
si 0,1 ml de complement proaspat.Se trece in aerostat eprubeta si se umple cu
amestec de gaze si se termostateaza la 37 C.Apoi materialul se examineaza.
Leptospiraceae:
Prelevate: snge, LCR (prima sptmn), urin (din sptmna II de boal), probe necroptice (seciuni histologice
renale, hepatice)
Metode de colectarea amterialului:singe-5 ml se recolteaza din vena cubitala cu seringa sterila.Urina-se colecteaza
cu ajutorul cateterului steril in vas steril.LCR- se obtine cu ajutorul unui ac special steril in eprubeta.
Metode de diagnostic
- Examenul microscopic singe- 1-2 ml se amesteca cu 2 ml de citrat de natriu si se exponeaza in decurs de 1 h.Cu
pipeta pasteur se aplica pe lama portobiect ,se acopera cu lamela,si se examineaza la microscop cu fundar negru.
Urina/LCR- se centrifugheaza si sedimentul obtinut se examineaza la microscop .
-Examenul bacteriologic
Probele sunt nsmnate n cte 3-5 tuburi cu mediu de cultur, incubate n aerobioz la 28 grade pn la 1-3 luni.
Creasterea se controleaza la fiecare 5-6 zile.Identificarea se va face n baza caracterelor: -Microscopice -De cultur
-De patogenitate -Serologice (RFC, RAL)
Examenul biologic- inocularea de singe intraperitoneal la cobai. Peste 6-10 zile animalul se
imbolnaveste.observatiile se duc timp de o luna.
-Diagnocticul serologic se efectueaza reactia de microaglutinare (RMA).Serul se dilueaza de la 1;50- 1;1600.In
calitate de antigen se foloseste cultura vie de leptospira crescuta pe mediu lichid .Evidenta rezultatelor se face pe fon
intunecat.

62.
Diagnosticul microbiologic al escherichiozelor (medii pentru izolare i unele teste
mai importante pentru identificare).

Pt diagn se examineaza:mase fecale,voma,urina,exsudate purulente,sputa,biopsii,LCR.


Metoda de colectare:mase fecale/ varsatura se aduna in vas steril si se amesteca cu sol izotonica de clorura de natriu.
Medii pt izolare:Endo ,Levin,medii selective- Leifson,Ploskirev;Olkenitkii,
-Microscopia directa:pe frotiu colorat giemsa,
-Izolarea si indentificarea: Etapa 1; se pune prelevatul pathologic pe o placa cu un mediu Endo/Levin.Se incubeaza
placile peste noapte la 37 C.
Et 2: se urmaresc coloniile Et 3:se confirma identitatea izolatelor suspecte si a serovarurilor. Et 4:se analizeaza si
se interpreteaza rezultatele.
-Diagnosticul serologic:exceptional se recurge la autoserodiagnostic prin reactia de aglutinre in tuburi,folosind ca
antigen tulpina izolata de la bolnav.
-Hemocultura este un test calitativ pentru detectarea microorganismelor prezente in sange. Sangele, prelevat in
conditii de stricta asepsie, este insamantat in flaconul de hemocultura a carui compozitie favorizeaza dezvoltarea
germenilor aerobi, anaerobi si microaerofili

63.
Diagnosticul de laborator al dizenteriei: produsele patologice i recoltarea lor;
metodele de diagnostic.
Prelevate: mase fecale fara contaminare cu urina,se selecteaza fragmente mucopurulentsangvinolente din scaun.
Material necropic,produse alimenatre.
Recoltarea:mase fecale-se recolteaza din 1 zi a imbolnavirii,se ia 3-5 g de mase se spala bine ,dezinfecteaza ,se trec
in amestec glicerinic .colecatarea masei se face cu o ansa dubla de aluminiu ce se introduce in rect.
Material necropic-2-3 fragmente de intestin gros se macereaza cu piulita,se adauga sol izotonica de clorura de
natriu.suspensia obtinuta se insaminteaza .
Metode de diagnostic:
1 Microscopia directa- pe preparat umed intre lama si lamela sau pe frotiu Gram depisteaza reactia
inflamatorie.Microscopia pe preparate colorate imunofluorescent cu seruri antidizenterice permite rapid in 1-2 h
diagn.etiologic al dizenteriei bacteriene.
2 izolarea si identificarea:- se epuizeaza probele de scaun pe mediile selective-diferentiale Endo ,ploskirev,Levin,Se
insaminteaza in mediul de imbogatire cu selenit acid de sodium.Se incubeaza mediile peste noapte la 37C.Se
urmaresc pe placi coloniile suspecte de shigella.Identificam cultura pura .Se analizeaza si se interpreteaza
rezultatele .
3 Diagnostic serologic-se folosesc reactia de aglutinare,reactia de hemaglutinare indirecta,Elisa. Identificarea se
face cu ser adsorbit.
4 In calitate de metode express se foloseste Microscopia luminiscenta si proba biologica asupra cobailor.

64.
Diagnosticul microbiologic al infeciei cu Salmonella spp. (medii pentru izolare i
unele teste mai importante pentru identificare).
Prelevate:se examineaza singe,mase fecale, urina, continut al duodenului.Medii pt izolare:Olkenitkii din geloza
uscata,Rassel,Ploskirev,geloza bismut-sulfit.
-Microscopia directa
-Izolarea si identificarea- se insaminteaza single prelevat in bullion biliat/peptonat glucozat.Se incubeaza culturile
aerob la 37 C si se examineaza microscopic pe medii Endo,Kliger,Olkenitki.Identificam cultura pura studiind
caractrerele microscopice / biochimice.Se analizeaza ,se interpreteaza rezultatele,se apreciaza agentul etiologic .
-Diagnostic serologic: prin reactia Widel se depisteaza anticorpii anti-O si anti-H,iar prin reactia RHAI anticorpii
anti-O.Pentru depistarea antigenului patogen se cerceteaza serul bolnavului in reactia de aglutinare.ca antigen se
folosesc culturi moarte de salmonela.Singele 2-3 ml se recolteaza din pulpa degetului/vena cubitala in eprubeta
sterila si se transporta in laborator si se termostateaza 20-30 min la rece.
-Bacteriologica- 1 zi se colecteaza si se pregateste materialul.Se insaminteaza pe mediile de diferentiere si de
acumulare. 2 zi dupa 18-24 h de incubare ,cutiile insemintate se scot din termostat si se examineaza cu ochiul
liber/lupa.Citeva colonii se inseminteaza pe mediul olkenitkii sau Rassel. 3 zi eprubetele insamintate se scot din
termostat si se analizeaaza particularitatile. 4 zi s determina proprietatile morfologice ,culturale si fermentative ale
culturii izolate.

65.
Diagnosticul de laborator al holerei: produsele patologice i recoltarea lor, metodele
de diagnostic.
Prelevate:mase fecale,voma, material necroptic. Pt depistare este indicata prelevarea din scaunul obtinut dupa
administrarea unui purgativ salin saau a aspiratului duodenal. Prelevare,ambalarea si transportul se va face cu
maxima atentie pt a nu raspindi infectia.
Recoltarea:mase fecale- 10-20 mg se aduna cu lungurita de metal/lemn/carton si se trec in borcanase de sticla.Sub
dop se pune hirtie de pergament. Sau pot fi colectate masele fecale cu ansa dubla din sirma.
Voma- 10-15 g se aduna cu lingurita metalica sterila si se trec o in borcan cu git larg
Material necroptic- cu o pensa se apuca citeva regiuni ale intestinului si cu foarfece se sectioneaza fragmente.Se
introduc in borcan.
-Metoda rapida de diagn:se bazeaza pe microscopie.ce permite depistarea vibrionilor holerici in scaunul
apos.Include urmatoarele tehnici de examinare a prelevatelor:
1 frotiul colorat gram
2 preparatul intre lama si lamella
3 coloratia imunofluorescenta directa
4 reactia de microaglutinare si imobilizare- pe lama portobiect se aplica 2 picaturi de mase fecale .la prima picatura
se adauga ser O ,la a 2 picatura se adauga sol izotonica de clorura de natriu.Se amesteca cu pipeta,se acopera cu
lamela de acoperire si se examineaza la microscop.
-izolarea si identificarea:se efect.cu utilizarea mediilor elective de imbogatire si a mediilor selective-diferentiale .Et
1:se insaminteaza proba de examinat pe apa peptonata alcalina 1:10 si totodata se epuizeaza pe o placa cu mediu
diferential-selectiv.Dupa 6 h de incubare apare opalescenta.Apoi se urmareste si se identifica vibrionii .Se citesc
rezultatele.
-diagnosticul serologic:are importanta orientativa pt investigarea starii de purtator sanatos.sunr indicate reactia de
aglutinare si reactia anticorpilor vibriocizi

66.

Diagnosticul de laborator al gripei. Prelevatele. Metodele de diagnostic.

Prelevate:exsudat nazofaringian,in caz de deces-fragmente de tesut pulmonary,raclat de pe


mucoasa traheobronsica, singe.
-Diagnosticul rapid:se bazeaza pe depistarea antigenului viral,mai efficient prin
imunofluorescenta.Se utilizeaza Ig fluorescente comerciale.Frotiul amprenta se prelucreaza cu
anti-serul imunofluorescent specific.Prezenta virusului conditioneaza fluorescenta galbenverzuie.
-Rinocitodiagnostic:se preleva amprente de pe mucoasa cornetelor nazale pe lame inguste.Se
coloreaza cu romanovskii si se examineaza la microscop.Se observa epiteliul cilindric schimbat
in gripa.
-Elisa: pune in evidenta antigenii specifici de tip.
-Izolarea virusului:se bazeaza pe infectarea embrionului de gaina.Se injecteaza prelevate 0,2 ml
n cavitatea amniotica si alantoidiana la 5 embrioni,care se incubeaza la 37C timp te 3-4
zile.Dupa incubare se racesc 2-4 h in frigider,apoi se aspira lichidul amniotic cu seringa sau
pipeta .Acumularea virusului se testeaza prin RIHA,RN,RFC.
-Diagnostic serologic:este o metoda retrospective.Se examineaza seruri pereche,primul in faza
acuta,alta dupa 10 zile de boala.Se efect.RFC,RIHA,Elisa.In calitate de antigen serveste
antigenul gripei.

67.
Diagnosticul de laborator al hepatitei virale B, C, D. Prelevatele. Metodele de
diagnostic. Markerii i semnificaia lor diagnostic.
Diagnosticul virusologic: HBV- 1) la etapa acuta diagnosticul se efectuaeaza pe calea depistarii
antigenului HBs in serul sangvin al bolnavului. 2) determinarea anti-HBs cu ajutorul metodei
RFS.Anti- HBs apare in singe doar dupa 2-4 saptamini de la inceputul bolii. 3) Diagnosticul
retrospectiv al hepatitei B se eefctueaza pe calea determinarii anti HBs in seruri pereche ale
singelui bolnavilor in reactie de precipitare in gel.

68.

Diagnosticul de laborator al HIV infeciei. Prelevatele. Metodele de diagnostic.

Prelevate:se examineaza in functie de manifestarea clinica- singe,sperma,LCR,material biopatic.


-Diagnostic serologic:este cel mai accesibil care permite depistarea anticorpilor specifici .Se utilizeaza testul Elisa.se
separa proteinele virale prin electroforeza cu gel,apoi transferarea acestora pe membrane de nitroceluloza,care se
trateaza cu serul de examinat.Complexul anticorp-antigen se developeaza cu ser antiglobulinic marcat cu
peroxidaza. Aceasta reactie inlude 2 faze:specifica (formarea complexului antigen-anticorp) si nespecifica ( in
aceasta faza complexul specific dintre antigen si anticorp interactioneaza cu factorii nespecifici ai mediului,in care
are loc reactia.)
-Detectarea virusului se face prin RIF,Elisa,ARI
-Reactia de aglutinare reprezinta alipirea si sedimentarea in precipitat a microorganismelor sau a altor celule sub
actiunea anticorpilor in prezenta electrolitului.Pt efectuarea reactie este necesar;anticorp,antigen si solutie
izotonica .Poate fi efectuata pe lamele sau tubmiuri.
-Reactia de imunofluorescenta RIF-in reactie se aplica microscopia fluorescenta .Reactie este bazata pe faptul ca
serurile umane la interactiunea cu antigenii corespunzatri formeaza complex specific fluorescent,care devine vizibil
in microscop.metoda nu necesita izolarea culturii.Rezultatul poate fi obtinut dupa 30 min de la aplicarea pe
preparata serului luminiscent.
-Pt izolarea HIV se utilizeaza culture de limfocite T activate cu interleuchina-2 pe culture de cellule Thelperi.Urmarim formarea de sincitii si moartea rapida a celulelor

69.
Microbiologia i diagnosticul de laboratora al infeciei herpetice. Prelevatele.
Metodele de diagnostic.
Prelevate:se examineaza cotinutul veziculelor,cruste,saliva,LCR,frotiuri din exsudatul veziculelor de pe mucoasa
cavitatii bucale sau organe genital.,singe,probe de creie si maduva spinarii in cazuri letale.
-Diagnostic rapid: frotiuri sau amprente din vezicule se coloreaza Giemsa si se examineaza la microscopia
optica.Prezenta celulelor gigante polinucleate cu incluziuni indica infectia herpetica.Virionii pot fi detectati prin
RIF,ELISA.
-Izolarea virusului: cu material de examinat pathologic se infecteaza embrionii de gaina si se incubeaza la 37 C.Se
urmareste dupa 48 h .Herpes simplex poate fi izolat si in organismal soriceilor sugari infectati intracerebral sau
intraperitoneal.Identificarea virusului izolat se efectueaza prin RN pe soricei,culture de cellule sau embrioni de gaina
cu seruri specific standartizate.
Examenul virusologic : *Izolarea virusului pe animale sensibile, ou embrionat de gin sau culturi celulare *
Indicarea virusului: manifestri clinice la animal, apariia veziculelor pe membrana chorio-alantoica a oului
embrionat, ECP specific pe culturile de celule (celule gigante sincitiale cu incluzii intranucleare) *Identificarea
virusului cu ajutorul serurilor imune specifice (RN, RIF, ELISA)
-Diagnosticul serologic:Se urmareste cresterea cel putin 4 ori a titrului de anticorpi prin axaminarea serurilor
pereche in RN si RFC..
-Tehnicile citologice sunt deosebit de rapide pt stabilirea diagnosticului etiologic ,utilizind material biologic din
leziunile ulcerative .Astfel cu ajutorul coloratiilor speciale,pot fi evidentiate celulele gigante precum si incluziunile
intranucleare.

70.
Microbiologia i diagnosticul de laboratora al infeciilor provocate de
enterovirusuri. Prelevatele. Metodele de diagnostic.
Enterovirusurile: virusuri acid-rezistente ce ptrund pe cale digestiv, replicndu-se cel mai bine n condiii de pH
sczut i la 37. Clasificare: de interes pentru patologia umana sunt:
Enterovirusurile Rhinovirusurile Heparnavirus: gen separat pentru virusul hepatitei A (VHA).
Diagnosticul infeciilor determinate de enterovirusuri.
Cultivarea este cea mai util metod de diagnostic
Produse patologice:
LCR pentru diagnosticul meningitei (dar nu i pentru diagnosticul poliomielitei);

materii fecale sau tampon rectal ;


exsudat faringian;
-deoarece eliminarea de virus este intermitent se prefer recoltarea a cel puin 2 probe, 2 zile consecutiv,
ct mai precoce n timpul bolii (de preferat n primele 5 zile de boal);
-post-mortem se recolteaz probe ct mai precoce.

-Teste serologice: nu au valoare foarte mare n diagnosticul infeciilor cu enterovirusuri.Se examineaza seruri
perechi:primul obtinut la debutul bolii si al 2 peste 3-4 saptamini.
Se pot utiliza
RFC pentru antigene specifice de grup

Reacia de neutralizare
RIH
-Izolarea virusului :se face in culturi de cellule din rinichi de maimute,embrion uman,pe cellule Hela.Prezenta
virusului de urmareste dupa proba culorii si efectul citopatic .Identificarea se face prin RN pe culturi de cellule
,utilizind seruri standart specific de serovar.

71. Tehnica recoltrii probelor de ap din robinet. Determinarea NTG,


indecelui coli i titrului coli. Normativele.

Probele de ap se recolteaz n flacoane sterile cu dop.

Apa de robinet se recolteaz n volum de 500 ml. n prealabil orificiul robinetului se flambeaz cu un
tampon de vat mbibat cu alcool, apoi se deschide complet i se las s curg apa timp de 10 min. Se
deschide flaconul, se fixeaz sub jetul de ap i se umple pn la aproximativ 1 cm sub dop. Flaconul se
astup cu dopul, peste care se pune un capac de hrtie. n fia de nsoire se indic locul recoltrii, data (ora,
ziua, luna, anul), scopul analizei i numele persoanei care a prelevat proba

Transportarea apei se efectueaz n frigidere portative la temperatura de 1-2 grade C. Analiza probelor
trebuie efectuat n cel mult 2 ore de la prelevare (sau 6 ore cu pstrarea probei n frigider).

In raport cu prevederile standardelor de stat, apa de robinet urmeaza sa contina cel mult 100
microorganisme\ml, indecele coli sa fie de cel mult 3 si titrul coli mai mare de 333.

Determinarea bacteriilor din grupul coli(bacteriilor coliforme)


Acest grup include reprezentani ai familiei Enterobacteriaceae din genurile Escherichia, Klebsiella,
Citrobacter, Enterobacter, etc.

Reprezint bastonae G-, asporogene, care fermenteaz glucoza i lactoza pn la acid i gaz (la 37 C timp
de 24 ore). Aceste mi/o ptrund n mediul ambiant, inclusiv n ap, cu masele fecale ale omului i
animalelor, de aceea depistarea lor indic o poluare fecal a mediului i pericolul unor infecii intestinale.

Determinarea bacteriilor coliforme se realizeaz prin 2 metode:

Metoda membranelor filtrante

Metoda titrrii (fermentrii)

Metoda membranelor filtrante


Se bazeaz pe capacitatea membranelor filtrante de a reine bacteriile din apa de examinat cu izolarea lor pe
medii de cultur i identificarea lor.

Se utilizeaz membrane filtrante din nitroceluloz nr 2 i 3. Ele se fierb n prealabil timp de 10 min n ap
distilat. Filtrarea se efectueaz n filtrul Seitz cu utilizarea a 2-3 membrane. Apa din apeduct se filtreaz n
volum de 333 ml, iar din fntni, izvoare 100 ml. Membranele se scot cu pensa steril i se aplic pe
mediul Endo cu suprafaa pe care se afl bacteriile n sus. Cutiile se ncubeaz la 37 C timp de 24 ore.

Bacteriile din grupul coli vor forma colonii tipice roii cu luciu metallic. Pentru confirmare se pregtesc
frotiuri, colorate Gram i se monteaz testul oxidazei (Gram-, oxidaza-)

Aceast metod permite determinarea indicelui coli cantitatea de bacterii din grupul coli care se conine
n 1 l de ap. Pentru determinarea indicelui coli numrul de colonii tipice se nmulete cu 1000 i se
mparte la volumul de ap filtrat (ex.: 6x1000:333 =18).

Titrul coli reprezint volumul minim de ap n care se conine o singur bacterie coliform
Metoda titrrii

Prin aceast metod are loc iniial mbogirea coliformilor m medii cu glucoz, izolarea lor pe mediul
Endo i identificarea culturilor pure izolate. Apa potabil se nsmneaz n volum de 333 ml: 3 volume
cte 100 ml, 3 cte 10 ml i 3 cte 1 ml. Se incubeaz la 37 C timp de 24 ore. Din tuburile cu cretere
(turbiditate, acid i gaz) se repic pe cutii cu mediul Endo. La etapa urmtoare creterea coloniilor lactoza+,
constituite din bastonae G-, oxidaza-, permite formularea unui rspuns pozitiv. Pentru determinarea coliindicelui i coli-titrului se consult tabele speciale.

Din grupul coliformilor se difereniaz coliformii fecali (bacterii coli-fecale), capabili s fermenteze lactoza
cu producere de acid i gaz la temperatura de 44,5 C n 24 ore. Prezena lor indic o poluare fecal
recent.

Indice coli cantitatea de bacterii din grupul coli care se conine n 1 l de ap. Pentru determinarea indicelui coli
numrul de colonii tipice se nmulete cu 1000 i se mparte la volumul de ap filtrat (ex.: 6x1000:333 =18).
Titrul coli reprezint volumul minim de ap n care se conine o singur bacterie coliform
Numrul total de germeni mezofili, NTG (care se dezvolt la 37 0C si respectiv 220C) este un indicator
global care permite aprecierea ncrcrii apei cu flor de diverse origini care sunt responsabile de
transmiterea infeciilor pe calea apei.

Analiza de determinarea a NTG-ului (numar total de germeni se efectueaza la 2


temeperaturi la 37 0C si respectiv 220C) la apa potabila se executa in cadrul
laboratoului propriu conform standardului national SR EN ISO 6222/2004.

Principiul metodei:
Determinarea NTG-ului la apa potabila se efectueaza cu ajutorul sistemului de
filtrare prin membrana folosind drept mediu de cultura agar nutritiv in mediu aerob.

72. Tehnica recoltrii probelor de aer. Determinarea NTG, streptococilor


i stafilococilor. Normativele.

Analiza bactereologica sanitara a aerului permite aprecierea igienica si epidimiologica a mediului aerian, pe baza
careia putem stabili un complex de masuri pentru profilaxia infectiilor aaerogene.
Probele de aer pentru investigaie din ncperi nchise se recolteaz din 5 puncte (n coluri i n centru), la o distan
de 0,5 m de la perei i la o nlime de 1,6-1,8 m (n ncperi de locuit) sau la nivelul patului (n saloane de spital).
Recoltarea se efectueaz prin metoda de sedimentare sau de aspiraie
Analiza microbiologica a aerului presupune studierea diversitatii speciilor microbiene precum si cuantificarea
indicatorilor microbiologici.
Aprecierea starii sanitarie a aerului din incaperile inchise se efectueaza pe baza concentratiei indicatorilor
microbiologici ca stafilococii si streptococii alfa si beta hemolitici, precum si nr total de microorganism per m3 de
aer. In clinicele chirurgicale se determina flora potential patogena care cauzeaza deseori infectii nazocomiale
(Pseudomonas, Klebsiella, Protesu)
Normative:
In sala de operatii in saloanele postoperatorii in sectiile de reanimare, in Sali de pansament in sala de nastere
concentratia admisa la 1 m3 de aer de streptococci si stafilococi este 0 . In saloane de spital: stafilococi iarna<52 ;
vara <24,
streptococi iarna <36, vara <16

73. Infecia ncruciat n cabinetul de stomatologie i consecinele ei. Sursele


i cile de transmitere a infeciei spre gazda receptiv. Msuri de combatere.
Conceptul de infecie ncruciat n cabinetul de stomatologie presupune vehicularea microorganismelor de la
personalul medical(medic,asistent) spre pacient sau invers dar i vehicularea microbilor de la un pacient la altul
prin instrumente sau obiecte,aer,instalaii sanitare din cabinetul stomatologic i anexele sale:sala de a teptare,grup
sanitar.
Eventualele mocroorganisme patogene putnd fi vehiculate.
- Pe cale aerogen-(virusurile gripale i alte virusuri respiratorii)

Prin snge(virusul hepatitei B,virusul imunodeficienei umane


Prin saliv-(virusul hepatitei B,virusurile herpetice)
Prin contact direct ntre minile personalului i leziunea mucoasei bucale(treponema pallidum,candida
albicans)

Se pot transmite: varicela, gripa, sida,sifilisul, tuberculoza,hepatita,herpesul,rubeola,rujeola etc.


Pentru prevenirea vehicularii microorganismelor e necesar de respectat regulile de asepsie si antisepsie. (Medicul
trbuie sa fie echipat cu costum chirurgical, manusi, masca, boneta, ecran sau ochelari, Instrumentele -sterilizate si
suprafetele -dezinfectate dupa fiecare pacient.)
Msuri de combatere a infeciei ncruciate n cabinetul stomatologic. (mai detaliat)
-Minile pot fi neutralizate ca surs ,cale de transmitere sau poart de intrare a infeciei , prin:
Unghii tiate scurt,bijuterii ndeprtate n timpul lucrului,splarea cu ap i pun lichid nainte i dup fiecare
pacient(cu peria 10 secunde),uscarea minilor dup splare cu aer cald sau prosoape de unic
folosin,antiseptizarea minilor,portul mnuilor e necesar, sunt observate leziuni ale mucoasei
orale,asistentele trebuie s poarte mnui atunci cnd colecteaz instrumentarul sau materialul dispozabil
contaminat cu snge,saliv,puroi, mnuile se schimb dup fiecare pacient
-protecia feei i cilor respiratorii prin masc de tifon sau cea dispozabil,care trebuie s acopere mentonul
i piramida nazal, trebuie schimbat la 1-2 ore sau odat ce s-a umezit sau murdrit de snge,saliv...
-protejarea ochilor contra leziunilor mecanice i infeciei poate fi realizat prin portul ochelarilor de protecie
sau cnd e cazul a ochelarilor de vedere, acetia trebuie de decontaminat ct mai des
-protecia prului i a hainelor prin echipament specific compus din halat lung, ncheiat i bonet ce acoper
fruntea i cea mai mare parte din pr. Halatul i boneta pot fi de unic folosin,dar cel mai des sunt
confecionate din bubac i sunt reutilizate, trebuie schimbate la maxim 2 zile, trebuie splate cu ap i
detergent , iar apoi trebuie dezinfectate cu compui de clor
-vaccinarea personalului mpotriva virusului hepatitei B a redus sectaculos prevalena infeciei n rndul
acestei grupe ocupaionale cu risc
-profilaxirea inoculrii acute vizeaz 2 infecii grave, transmise prin snge-infecia cu virusul hepatitei B i
infecia cu virusul imunodificienei umane
Pacienii care sufer de vreo maladie contagioas-sunt programai spre sfritul zilei de lucru , se face
curarea, splarea i sterilizarea corect a instrumentelor, dezinfecia riguroas a piesei de la unit, dezinfec ia
suprafeelor din cabinetul stomatologic, dezinfecia aeruluii igienizarea aerului.

74.Dezinfecia i sterilizarea n practica stomatologic. Metodele de sterilizare


utilizate n practica stomatologic.
Dezinfectia- proces fizic sau chimic prin care agentii patogeni sau microorganismele producatoare a diferitor
maladii pot fi distruse.
Sterilizarea- proces prin care toate formele de viata sunt distruse prin actiunea agentilor fizici si chimici.
Dezinfecia i sterilizarea n cabinetul stomatologic trebuie strict respectate, dup fiecare pacient instrumentele cu
care s-a lucrat la el trebuie nlocuite cu altele sterile,toate suprafetele care au fost in contact cu pacientul si medicul
se dezinfecteaza , iar cele dispozabile sunt colectate n pungi din plastic speciale ce vor fi autoclavate.
Dezinfecia unitului se face dupa fiecare pacientcu dezinfectante sub form de spray i prosoape de hrtie, sau
se folosesc dezinfectantele n soluie i burei din voal cu dimensiunile 10*10cm.este preferat hipocloridul de
sodiu i formal contraindicai iodoforii.
Mobilierul cabinetului trebuie dezinfectate zilnic , obligatoriu la sfritul zilei, se folosesc: iodoforii,deriva ii
fenolici,hipocloridul de sodiu
Duumeaua trebuie splat zilnic cu ap cald i detergent, iar n apa de cltire se adaug un dezinfectant.
Pereii acoperii cu vopsea sau var lavabil sunt decontaminai lunar prin splare cu ap i detergeni.
Echipamentul de curenie (glei,burete,lavete) este separat pentru fiecare funcie de destinaie
Dezinfecia aerului se realizeaz cu lmpi germicide, generatoare de radiaii ultraviolete, sau dezinfec ia
chimic a aerului cu sprayuri ce conin hexilresorcinol,acid lactic sau propilenglicol.
Metodele de sterilizare:
Autoclavarea( prin caldura umeda) - pentru instrumentar metalic ,obiecte din bumbac sau cauciuc
termorezistent, instrumentele sunt grupate dup destinaie i mpachetate n cmpuri de bumbac,hrtie,nylon sau
folie de aluminiu i plasate n casolete. Presiunea in autoclav- 1-2 atmosfere, timp de 30 min

Sterilizarea n pupinel (prin caldura uscata)- se folosete pentru sterilizarea instrumentelor metalice n special
a celo confecionate din metale oxidabile. 170grade-60min,160grade-120min,150grade-150min.Instrumentele
sunt ambalate n cutii metalice sau folie de aluminiu.
Sterilizarea prin vapori chimici nesaturai- amestecul de formaldehid,alcool,keton,ap,aceton, nclzite sub
presiune degaj vapori ce acioneaz ca agent de sterilizare. Dispozitivul chemiclav 132 grade 1,5-2 atm,timp
20 min. Se mai practic sterilizarea cu oxid de etilen i cu glutaraldehid.

75. Factorii care controleaz condiia microbiologic a gurii. Succesiunea


microbiotei orale umane. Succesiuni normale i succesiuni disbiotice ale
microbiotei orale.
Factorii ce controleaz condiia microbiologic a gurii.
1. Ptrunderea mi/o n gur
2. Retenia mi/o
-aderena (fimbrii, capsula, polizaharide extracelulare)
-situs-urile protectoare (fosete/fisuri ocluzale, spaii interdentare, s.papilar a limbii, proteze)
3.Eliminarea microorganismelor
- descuamarea continua e epiteliului
- splarea continu prin fluxul salivar,
- masticaia, deglutiia,
- micrile limbii i a prilor moi orale,
- aciunea abraziv a alimentelor.
4. Multiplicarea bacteriilor orale
pH meninut ~ neutralitate (6,7 7,3) prin secretia salivara.
Placa bacterien supragingival - scade pn sub 5,0 - supravieuiesc S. mutans i L.acidophilus,
specii adaptate la oc acid.
Sulcusul gingival - 7,5 8,5 ;
*direct influeneaz sistemele enzimatice
*indirect genereaz molecule n mediu
Potenial de oxido-reducere (Eh) - proporia compuilor oxidai sau redui in cursul reaciilor
enzimatice.
E influenat de prezena O2 molecular - cel mai comun acceptor de electroni.
Bacteriile anaerobe necesit pt cretere un mediu reductor (Eh negativ) n timp ce bacteriile
aerobe au nevoie de un mediu oxidativ(Eh pozitiv).
Nivelul Eh - variaz n funcie de biotop,de la +150 _+540 mV n saliv, pn la 300 mV n
sulcusul gingival
Temperatur: ~ constanta 34 -36C
Creterea t-39C la nivelul pungilor paradontale inflamate poate modifica expresia genelor
bacteriene i eventual, competitivitatea unei anumite specii.
Nutrieni provin din
-sursa exogena: alimentele ingerate
-sursa endogena: saliva, fluid cervicular, celule descuamate, bacteria
Succesiunea microbiotei orale umane. Succesiuni normale i disbiotice.

Succesiuni normale:
Sugarul edentat
Prezint numai suprafee epiteliale i primele specii de colonizare aparin genurilor
Streptococcus, Lactobacillus, Neisseria, Stapyilococcus, Veillonella, Actinomyces,
Fusobacterium;
Streptococii - bacterii dominante numeric n primul an de via.
Speciile pionier de streptococ care predomin n prima lun de via sunt: S. Mitis biovar I,
S.oralis, S.salivarius, S.anginosus, S.mitis biovar II i S.sanguinis;
Dupa erupie, pe smal ader i se multiplic bacterii productoare de matrice adeziv.
S.sanguinis, S.mutans i A.viscosus sunt specii de colonizare definitiv din momentul erupiei.
La adolesceni se constat creterea n placa bacterian subgingival a bacililor gram-negativi
anaerobi pigmentogeni i a treponemelor orale.
Succesiuni disbiotice:
Pe msura naintrii n vrst, se acumu-leaz diferii factori care destabilizeaz comunitatea
climax oral i determin apariia unor comuniti microbiene anormale, disbiotice.
Disbiozele legate de diet i obiceiuri alimentare:
Consumul crescut de zaharuri rafinate favorizeaz selecia bacteriilor acidogene i acidurice,
S.mutans i lactobacili, implicate n iniierea bolii carioase
Disbioze ale plcii bacteriene subgingivale :
Bacilii gram-negativi strict anaerobi, bacilii microaerofili din grupul HACEK i treponemele
orale care domin n placa bacterian subgingival in boala paradontal, invadeaz esutul
conjunctiv i determin leziuni att prin mecanism direct(constitueni celulari, toxine, enzime,
produi de metabolism bacterian) ct i indirect.
Disbioze legate de edentaie i protezare:
edentaia se nsoete de scderea numrului de specii anaerobe capabile s antagonizeze
levurile;
scderea aprrii antiinfecioase, n special a imunitii celulare duce la apariia candidozelor
orale
proteza total perturb mecanismele fiziologice de curire a mucoasei orale i de ndeprtare a
bacteriilor.

76. Placa dentar. Formarea. Colonizarea precoce i succesiuni bacteriene.

Placa Dentara este un depozit format din agregate bacteriene ce adera la suprafetele dentare sau alte suprafete solide
din cavitatea bucala prin intermediul unei matrice .Apare ca un depozit mat,acumulat in special in zona marginii
gingivale,intre spatiile interdentare,fostele ocluzale.Pentru determinarea prezentei placii bacteriene se folosesc
revelatori de placa .Placa veche acumulata pe suprafetele dintilor se calcifica si formeaza tartrul in special pe
suprafetele dentae din zona canalelor salivare majore.Deosebim placa supragingivala si subgingivala..
Formarea PD prevede citeva etape:

-formarea peliculei,
-colonizarea bacteriana precoce,
-succesiunile bacteriene pina la maturizarea placii.
Formarea peliculei: Microorganismele orale ca provatella melaninogenica ,P.oralis,fusobacterium produc
neuroamidaze sub actiunea careia glicoproteinele salivare pierd acidul sialic si precipita.Glicoproteinele
insolubilizate se adsorb prin intermediul ionilor de Ca pe suprafetele dentare ,in urma caror se adsorb si
fosfoproteine,sulfoglicopeptide,incit grosimea peliculei creste de la 100nm pina la 500-1000 nm dupa 48h.
Colonizarea si succesiunile: Bacteriile din saliva se adsorb pe pelicula glicoproteica in formare.Primii adera la
pelicula streptococii orali, si cocii gram negative ca Neisseria si Moraxella.Apoi in interval de 24 h la ele mai adera
corinebacterii ,bacterii anaerobe Veillonella,Lactobacillus apoi si actinomicete anaerobe.Astfel Are loc sinteza de
matrice polizaharidica , scade potentialul de oxido-reducere ,se modifica Ph si se acumuleaza cataboliti si alti
produsi bacterieni care pregatesc urmatoarea succesiune bacteriana cu maturarea placii ulterior.
Placa matura: Odat formata, placa bacterian, continu s se populeze cu bacterii secundare, s se
maturizeze, astfel nct n final, se concentreaz n structura sa o cantitate foarte mare de germeni. n
30 de zile de la colonizarea peliculei primare cu microorganisme, apare placa bacterian matur. Ali
constitueni ai plcii bacteriene mature ,pe lng microorganisme sunt: celule epiteliale, leucocite,
eritrocite, particule alimentare i protozoare. Placa matur are capacitatea de a metaboliza foarte
rapid zaharoza din aportul alimentar prin lanul glicolitic, producnd acizi organici care asigur o
scdere profund i prelungit a pH-ului plcii, smalul ncepe s sufere procesul de
demineralizare. De aceea, este necesar ndeprtarea constant a plcii bacteriene de pe structurile
orale prin respectarea unor reguli de igien i alimentaie care ne vor pstra dinii sntoi

77.Tartrul dentar. Consideraii generale.


Tartrul dentar este un depozit organo-mineral aparut in urma calcifierii placii dentare cu
ioni de calciu , ntlnit la dinii, lucrrile dentare fixe i mobile, la implanturile i aparatele
ortodontice intilnite in cavitatea bucala.
Viteza de formare a tartrului dentar reprezinta o caracteristica individulala si este
influentata de o serie de factori favorizanti:
-retentivitati anatomice
-cantitatea si compozitia salivei secreate
-fumatul
-igiena cavitatii orale
Compozitia tartrului dentar:
-substante anorganice- 75-85% (ioni de calciu, fosfat si carbonat, ioni de sodium,
magneziu)
-substante organice 15% ( resturi de microorganisme moarte, cellule epiteliale
descuamate, leucocite)
-apa 8%

Exist dou tipuri de tartru: supragingival i subgingival.

78. Caria dentar. Etiologia i patogenia cariei dentare.Determinarea


activitii cariogenice a salivei.
Caria dentara:este o distructie a tesutului dentar dur cu formarea de cavitati,care poate
progresa spre inflmatie si devitalizarea tesutului pulpar.Rol in declansarea proceselor
carioase il au bacteriile,insa progresarea leziunilor carioase este influentat si de
interactiunea factorului microbian cu factorii care tin de gazda ,de regimul alimentar cu
factorul timp.Bacteriile implicate in initierea cariei sunt acidogene.Etiologic,rol essential in
cariogeneza il are streptococii din grupul mutans,sobrinus.Implicarea altor specii ca
Actinomices ,Eubacterum ,Nocardia nu este sufficient argumentata.Dupa patogeneza,caria
este initiate prin demineralizarea acida a smaltului cauzata de activitatile metabolice ale
bacteriilor din placa ce creaza conditii favorabile pentru dezvoltarea altor bacteria
.Teoria clasica placa-gazda substrat demonstreaza ca dupa o alimentatie bogata in
hidrocarbonati,Ph scade su 5,5 pntru perioade lungi de timp si acizii organic actioneaza
asupra fosfatului de calciu din dinte,demineralizind smaltul.

Cariile dentare de obicei sunt detectate prin sondarea zonelor suspecte.Deseori


leziunile incipiente de pe suprafetele meziale si distal a dintilor laterali sunt evidentiate
prin examen radiografic.Examenul microbiologic al leziunilor carioase nu este efectuat
de rutina.astfel de examene pot fi practicate pentru evaluarea riscului cariogen la un
individ sau intr-o anumita colectivitae sau in cadrul studiilor de cercetare a cariogenezei.
Cunoasterea etiopatogeniei cariei dentare a facut posibila conceperea unor teste de
masurare a receptivitatii individuale la aparitia cariei.Unul din teste este bazat pe
determinarea indicelui de corelatie dintre factorul microbian si incidenta cariei cum ar fi
Determinarea cantitativa a lactobacililor din saliva.
O metoda mai simpla este Cuantificarea nefelometrica a lactobacililor sau Depistarea
cantitativa a S .Mutans in placa dentara. Testul Snyder apreciaza cantitatea de acid
produsa de bacteriile din placa dentara intr-o perioada de 3 zile.

79. Boala parodontal. Etiopatogenia bolilor parodontale. Microorganismele


asociate bolilor parodontale. Diagnosticul de laborator al bolilor parodontale
Bolile parodontale reprezinta cea mai frecventa conditie inflamatorie cu caracter
distructiv din patologia umana.Sunt initiate de microorganismele din placa dentara
dezvoltata pe suprafata dura a dintelui din vecinatatea tesururilor moi
parodontale.Pot fi limitate la gingie(gingivite) sau se extind si la structurile profunde
de suport al dintelui ,cu distrugerea ligamentelor parodontale si a osului
alveolar(parodontite).Pierderea tesuturilor de sustinere a dintilor duce in cele din
urma la mobilitatea si pierderea lor.

Rolul primordial in producerea afectiunilor parodontale apartine bacteriilor din placa


dentara.Acumularea si componenta placii variaza insa de la un individ la altul.De
aceea cind placa creste sau apar specii microbiene noi ori cele deja existente isi pot
manifesta virulenta,homeostazia placii e tulburata si apare infectia.
Microorganisme asociate bolilor parodontale
-Gingivita ulcero-necrotica acuta prevotella intermedia,spirochete
-Gingivita din sarcinaprevotela intermedia
-Parodontita juvenila localizata Actinobacillus actinomycetemcomitans
-Parodontita juvenila generalizata Porphyromonas gingivalis,Prevotella
intermedia,Actinobacillus actinomycetemcomitans.
-Parodontita prepubertara Frecvent : specii ale genurilor
Fusobacterium,Selenomonas,Wolinella
-Parodontita cronica marginala-Prevotella intermedia,Porphyromonas
gingivalis,Bacteroides forsythus,Prevotella melaninogenica,Fusobacterium
nucleatum.
Colonizarea spatiului subgingival presupune aderarea bacteriilor la placa
supragingivala si apoi migrarea in profunzime,e favorizata de traumatisme minore
ale gingiei.
Invazia esuturiloe e asigurata prin actiunea unor constituienti
celulari,toxine,enzime,produsi ai metabolismului bacterian .Principalele bacterii
asociate bolilor parodontale sunt bacterii capsulate,fiind astfel la adapost de
actiunea fagocitelor.Atit bacteriile gram-pozitive cit si cele gram-negative anaerobe
produc o serie de metaboliti cu actiune nociva asupra tesutului gazda.
Majoritatea bacteriilor din spatiul subgingival produc hialuronidaza ce are ca efect
cresterea permeabilitatii epiteliului gingival prin largirea spatiilor intercelulare.Specii
de Prevotella si Porphyromonas,Actinobacillus actinomycetemcomitans produc
colagenaze,aminopeptidaze,fosfolipaza A,fosfata acida si alcalina fiind responsabile
de resorbtia osoasa.

Diagnosticul de laborator al bolilor parodontale


Diagnosticul de laborator este necesar:
1.Pentru precizarea etiologiei parodontitelor,in special in formelor intricate de
boala:parodontita prepubertara,parodontita rapid progresiva,a caror manifestare
clinica este apropiata de cea din parodontita juvenila.
2.Pentru precizarea sensibilitatii la antibiotice a principalilor patogeni parodontali
Exista numeroase teste utile pentru precizarea etiologiei unei boli parodontale :
1.Tehnici bazate pe examenul microbiologic al produsului prelevat din punga
parodontala:
-examenul microscopic direct
-cultivarea,izolarea si identificarea bacteriilor din leziune
-identificarea unor enzime specifice in prelevatul subgingival
-teste imunofluorescente
-PCR
2.Tehnici serologice
-ELISA
-Tehnici imunofluorescente

Insa cea mai sigura desi nu cea mai rapida si mai eftina ramine examenul bacteriologice direct al
prelevatului din leziunea parodontala.Pentru examenul direct este prelevat exsudatul din
crevasele gingivale sau punga parodontala.Cind punga parodontala lipseste si exista doar
detasarea gingiei marginale prelevarea se face cu ajutorul conurilor din hirtie. Cnd punga

parodontal lipsete i exist doar detaarea gingiei marginale, prelevarea se face cu ajutorul conurilor din hrtie de
filtru sterile, care sunt introduse cu blndee in sulcusul gingival i sunt meninute cca. 1 minut. Apoi, sunt retrase cu
grij din cavitatea oral i introduse n tubun cu mediu de transport reductor fluid pentru a asigura viabilitatea
bacteriilor anaerobe i microaerofile.
Cnd este prezent punga parodontal, este prelevat coninutul acesteia cu ajutorul unei chiurete sterile. Punga
chiuretat este introdus intr-un tub cu mediu de transport reductor.
Pentru examenul bacteriologic, tuburile coninnd probele de la pacieni sunt centrifugate, supernatantul ndeprtat,
iar din sediment sunt efectuate:
11.
Preparat umed ntre lam i lamel, ce va fi examinat la microscopul cu fond ntunecat pentru evidenierea
treponemelor orale asociate.
12.
Frotiu colorat Gram, pentru examenul cito-bacterioscopic (prezena i intensitatea reaciei inflamatorii,
categorii microscopice prezente n prob).

nsmnarea pe medii de cultur selective pentru bacilii gram-negativi anaerobi

80. Infeciile pulpare. Etiopatogenie. Microorganismele asociate infeciilor


endodontice. Diagnosticul microbiologic al infeciilor pulpare
Infecia pulpei dentare, pulpita, i cea a esuturilor periapicale, abcesul dento-alveolar sau parodontita apical acut,
sunt deseori reunite sub denumirea de infecii endodontice deoarece apariia i evoluia uneia dintre entiti
influeneaz hotrtor dezvoltarea celeilalte afeciuni.
Rolul principal in producerea pulpitelor l au bacteriile anaerobe, dar bacterii facultative au fost, de asemenea, izolate din infecii
ale canalelor radiculare
Microorganismele pot invada pulpa dentar pe 3 ci principale:
13.
14.
15.

acces direct;
calea pulpo-parodontal;
calea sanguin.

-Accesul direct al microbilor n camera pulpar deschis, cel mai frecvent


ca urmare a unei leziuni carioase profunde. Alte condiii care expun pulpa
direct aciunii microorganismelor orale sunt: eroziuni, fisuri ale structurilor
dentare i fracturi ale dintelui, consecutive unui traumatism important.
Supravieuirea pulpei n aceste cazuri este o eventualitate rar.
-Calea pulpo-parodontal de acces al microbilor spre pulpa dentar are dou
vanante: prin
canale laterale i prin foramenul apical. Canalele laterale pot aprea aproape
oriunde pe suprafaa rdcinilor dentare sau in ariile de bifurcare. Colonizarea
microbian a acestor structuri poate fi consecina unei boli parodontale,
tratamentului parodontal sau traumatismelor parodoniului.
Microorganisme din pungi parodontale profunde, din procese inflamatorii de
vecintate sau de pe mucoasa gingival pot migra prin foramenul apical spre
esutul pulpar.
-Pe cale sanguin, microorganisme variate ajung la nivelul pulpei ca urmare a
bacteriemiilor. Descrcri tranzitorii ale bacteriilor din diverse esuturi i organe
sunt frecvente dup intervenii chirurgicale, dar i dup periajul dentar brutal,
chiuretarea pungilor parodontale, extracii dentare i chiar dup un prnz bogat n
alimente solide, dure
Diagnosticul:e bazat pe examenul clinic si radiologic precum si pe testarea
vitalitatii pulpei dentare prin aplicarea de stimuli termici,electrici.

81 Abcesele periapicale. Etiopatogenie. Diagnosticul microbiologic al


abceselor periapicale
Abcesele periapicale-manifestri frecvente ale infeciilor orale acute si trebuie considerate urgene
stomatologice.
Aspectele clinice variaz in funcie de severitatea inflamaiei si poziia dintelui afectat, dar
durerea i tumefacia regiunii periapicale sunt semne constante.

Etiopatogenie-Bacteriile izolate din abcesele dento-alveolare fac parte, din microbiota indigen a
cavitii orale. Ele provin fie din pulpa dentar necrozat, prin foramenul apical, fie din pungi
parodontale profunde, prin obturare sau traumatizare accidental.
Rolul major n producerea infeciei u au bacilii gram-negativi deoarece:
-au endotoxin;
-sunt bacterii capsulate ce pot determina fagocitoza;
-elibereaz n mediu enzime precum colagenaze, hialuronidaz, fibrinolizin, cu ajutorul crora
distrug esutul conjunctiv;
-poseda, antigene capabile s induc rspuns imun umoral i celular.
Studii recente au artat c formele severe ale abceselor periapicale sunt determinate mai
frecvent de Porphyromonas endodontalis i Porphyromonas gingivalis, n timp ce din formele
benigne au fost izolate preponderent Prevotella oralis i Prevotella intermedia.
Bacterii anaerobe
Bacterii
aerobe/facultative
Prevotella intermedia
Streptococi
alfa_hemolitici
Prevotella denticola
Streptococi
beta_hemolitici
Prevotella melaninogenica
Enterococi
Porphyromonas endodontalis
Staphylococcus
epidermidis
Porphyromonas gingivalis
Staphylococcus
aureus
Porphyromonas asaccharolytica Neisserii
nepretenioase
Fusobacterium nucleatum
Bacili difteroizi
Fusobacterium mortiferum
Capnocytophaga
spp.
Propionibacterium. spp.
Eikenella coirodens
Actinomyces spp.
Enterobacteriaceae
Bifidobacterium spp.
Eubactenum spp.
Villonella
Peptostreptococcus
Spirochete
Diagnosticul abceselor periapicale
Prelevarea puroiului este fcut prin aspiraie cu ac i sering sterile, dup antiseptizarea
regiunii cu alcool etilic sau alcool izopropilic 50%.
Deoarece principalele bacterii implicate sunt anaerobe, este recomandat sistemul "sering
anaerob Alternativ, produsul poate fi descrcat imediat dup prelevare intr-un mediu de
transport reductor.
In laborator, prelevatul este omogenizat i nsmnat pe trei tipuri de medii agarizate: medii
mbogite pentru incubare aerob, medii mbogite pentru bacterii anaerobe i medii selective
pentru barilii gram-negativi anaerobi. Plcile incubate aerob sunt citite dup 2-3 zile, dar cele
incubate anaerob sunt urmrite zilnic timp de 7 zile. Din coloniile izolate sunt practicate teste
biochimice de identificare i antibiograma.
Dei accesibil, diagnosticul microbiologic al infeciilor periapicale nu este efectuat curent
deoarece:

mediile de cultur i sistemele de identificare a anaerobilor sunt scumpe, conducnd la o


relaie cost-beneficiu negativ;
17.
principalii ageni etiologici - Prevotella i Porphyromonas, cultiv lent, astfel c
rezultatele sunt obinute dup 2-3 sptmni, cnd nu mai pot fi utile pacientului investigat.
Din aceste motive, astfel de teste sunt fcute periodic, n cadrul studiilor de supraveghere
epidenmiologic a rezistenei la antibiotice a bacteriilor implicate in infecii periapicale.
16.

82 Prelevatele i principiile diagnosticului microbiologic a stomatitei


gonococice.
Agentul cauzal Specii patogene Neisseria gonorrhoeae (gonococul)
Principala investigatie este reprezentata de efectuarea culturilor microbiologice pentru gonococ. Se recolteaza probe
de pe mucoasa orala care vor fi apoi insamantate pe medii speciale, unde se asteapta dezvoltarea coloniilor de
gonococ. Culturile sunt apoi incubate in mediu bogat in dioxid de carbon si se urmareste placa de cultura. Se
analizeaza apoi la microscop si se stabileste daca au crescut sau nu gonococi pe ea(coc Gram-negativ,
reniform, nesporulat,Asezati in diplo, de regula, se gasesc intracelular si extracelular.)
Manifestari orale.
Mucoasa bucala prezinta o rezistenta specifica fata de infectia gonococica. Stomatita gonococica s-a
observat frecvent la persoane, in particular la homosexuali, cu practici aberante (orogenitale).
Periooada de incubatie in cavitatea bucala variaza de la 1 2 zile pana la o saptamana. Pot apare
variate tipuri de leziuni locale si generale. Se descrie o membrana aderenta rugoasa. Aceasta
membrana prezinta puncte de eroziune. Infectia intereseaza gingia, limba si palatul moale si se
asociaza cu o halena fetida. Bolnavii cu infectii prezinta febra de peste 40sC. Se descriu cazuri de
faringite gonococice asimptomatice cu toate ca s-au izolat gonococi din secretiile faringo-amigdaliene.
Manifestarile clinice ale leziunilor locale in stomatita gonococica pot stimula angina Vincent.
Diagnosticul poate fi dificil si se realizeaza prin datele anamnestice. Diferentierea de neisseriile, ce
compun flora normala a cailor respiratorii superioare si cavitatii bucale, se face prin tehnicile de izolare
bacteriana

83 Particularitile diagnosticului de laborator a sifilisului cu localizare


primar a agentului n diverse regiuni a cavitii bucale.
Imposibilitatea cultivrii
T. pallidum in vitro, precum i natura tranzitorie a leziunilor, fac ca i diagnosticul
sfi e i m p o s i b i l d e r e a l i z a t p r i n m e t o d e b a c t e r i o l o g i c e d e r u t i n . D e
i s p i r o c h e t e l e s u n t d e t e c t a b i l e p r i n microscopie, n stadiile primare i
secundare, diagnosticul se bazeaz pe simptomatologia clinic i pe
testeleserologice.

Examen microscopic:
Sifilisul primar i secundar pot fi diagnosticate rapid prin examinare la microscopul cufond
ntunecat a produselor proaspete recoltate din leziuni cutanate sau mucoase. Testul este
concludent, numaidac produsul patologic conine spirochete mobile, iar preparatul
este examinat de ctre un microbiolog cuexperien, deoarece spirochetele nu
supravieuiesc transportului la laborator, iar debriurile tisulare pot fi confundate cu
spirochetele. Identificarea specific a T. Pallidum poate fi facut utiliznd anticorpi marcai cu
fluorescein. Bacteriile mai pot fi observate i prin impregnarea argentic a preparatelor
histologice efectuate din leziunile cutanate.
Diagnostic serologic:

Reprezint metoda de elecie n diagnosticul sifilisului. Exist 2 tipuri de teste


(specificei nespecifice), ambele cu o sensibilitate mai mic n sifilisul primar,
dar avnd o sensibilitate de 100% n celsecundar.

Testele nespecifice (netreponemice)


Msoar anticorpii Ig G i Ig M (numii i reagine) formai mpotriva lipidelor
eliberate din celulele lezate ncursul primului stadiu al bolii i prezente pe
suprafaa treponemelor. Antigenul utilizat pentru aceste teste
estecardiolipinul, obinut din cordul de bou. Cele mai utilizate teste
sunt VDRL (Venereal Disease
ResearchL a b o r a t o r y ) i R P R ( Ra p i d P l a s m a Re a g i n ) . A m b e l e m
s o a r fl o c u l a re a c a rd i o l i p i n u l u i d e c t re s e r u l pacientului,
sunt rapide i se pozitiveaz precoce. Sunt mai puin specifice i se utilizeaz
ca teste screening, pentru depistarea n mas a cazurilor de sifilis.
Numai VDRL poate fi utilizat pentru testarea LCR la pacieniisuspectai
de neurosifilis.Reacii fals pozitive pot apare n: boli acute febrile, vaccinare
recent, sarcin, boli autoimune sau de colagen,infecii hepatice cu distrucie
tisular, pacieni n vrst.

Testele specifice (treponemice)


Detecteaz anticorpi specifi ci fa de antigenele treponemice. Sunt
utilizate pentru confi rmarea rezultatelor pozitive ale VDRL sau RPR.
Testele specifice pot fi pozitive naintea celor nespecifice, sau pot rmne
pozitivela pacienii cu sifilis teriar, la care testele nespecifice s-au negativat.
Antigenele utilizate n cadrul acestor teste, provin de la spirochetele izolate
din leziuni testiculare ale iepurelui. Cele mai utilizate teste specifice sunt:
-FTA-ABS( Fluorescent treponemal antibody absorbtion) i
-THPA(Treponema pallidum hemagglutination). Este mai simpl din punct de vedere tehnic i
mai uor de interpretat dect FTA-ABS

84 Tehnica de recoltare a prelevatelor n stomatitele bacteriene. Diagnosticul


microbiologic a stomatitelor stafilo-streptococice.
se caracterizeaza prin vezicule mici, care se rup imediat lasand o mica pierdere de substanta superficiala inconjurata
de un guleras. Acestea sunt localizate in diferite zone ale cavitatii bucale, produc usturimi si chiar dureri ale
mucoasei bucale, impiedica alimentatia, sunt insotite de salivatie abundenta, marirea ganglionilor
submandibulari si uneori si de febra.

DIAGNOSTIC SI INVESTIGATII NECESARE

Teste ale sangelui;

Examen de cultura a leziunilor;

Biopsia ulceratiilor: se ia o mica parte de tesut din leziune si se examineaza la microscop

85 Prelevatele i principiile examenului microbiologic n descifrarea etiologic


a stomatitei ulcero-necrotice (fusospirochetozei).
Stomatita ulcero-necrotica este forma cea mai grava produsa de flora bacteriana, pe fondul scaderii puterii de
aparare antiinfectioasa. Apare sub form unor ulceratii (leziuni prin distrugeri si pierderi de substanta) de intindere
variabila, avand fundul murder cenusiu prin necroza produsa la acest nivel, vizibila in diferite zone ale mucoasei

bucale, extreme de dureroase, urat mirositoare, impiedicand complet alimetatia, sunt insotite de salivatie
abundenta, marirea ganglionilor submandibulari, febra ridicata si stare toxico-septica.

DIAGNOSTIC SI INVESTIGATII NECESARE

86

Teste ale sangelui;

Examen de cultura a leziunilor;

Biopsia ulceratiilor: se ia o mica parte de tesut din leziune si se examineaza la microscop

Diagnosticul de
(mrgritrelului).

laborator

al

candidozei

pseudomembranoase

Stomatita albicans (muguet, margaritarel) este produsa de Candida Albicans. Apare la nou-nascuti , la sugari cu
rezistenta antinfectioasa scazuta, dar si la varste mai mari in cazuri tratate vreme indelungata cu antibiotice sau la
persoanele cu imunitate scazuta, cum ar fi cei cu SIDA. Aspectul stomatitei candidozice este al unor depozite albe,
de intindere diferita, care se observa pe mucoasa interna a obrajilor, limba si uneori pe amigdale. Incomodeaza pe
sugar la supt.

Tratamentul local consta

in administrarea, in cavitatea bucala a Glicerinei boraxate 10% la care se adauga

pulbere
de
In cazurile cu extindere mai mare si rezistente la tratament, se administreaza Nistatin pe cale orala.

Nistatina.

DIAGNOSTIC SI INVESTIGATII NECESARE

Teste ale sangelui;

Examen de cultura a leziunilor;

Biopsia ulceratiilor: se ia o mica parte de tesut din leziune si se examineaza la microscop

87 Diagnosticul de laborator al infeciilor cauzate de germeni anaerobi


endogeni.

Bacili gram negativi anaeorbi


Bacilii gram negativi strict anaerobi sunt cuprini n f
amilia
Bacteroidaceae
. E i f a c p a r t e d i n f l o r a c o m e n s a l a m u c o a s e i res
piratorii, a tractului digestiv i a tractului genital. Din cele 20
deg e n u r i , i m p o r t a n t e n p a t o l o g i a u m a n s u n t g e n u r i l e
Bacteroides
,
Prevotella
,
Prophyromonas
i
Fusobacterium
. S p e c i i l e a c e s t o r g e n u r i sunt implicate n etologia bolii periodontale.

Diagnosticul
infeciilor produse d e b a c i l i i g r a m n e g a t i v i a n a e r o b i const n izolarea i
identificarea lor din produsele patologice. ntructfac parte din flora normal a organismului,
produsele contaminate cuaceast flor nu pot fi prelucrate. Diagnosticul este foarte
laborios,dureaz mult (4 sptmni) i implicaia lor etiologic trebuie
corelatc u r e a l i t i l e c l i n i c e . I z o l a r e a l o r d i n p r o d u s e n o r m a l s t e r i l e
a r e ntotdeauna semnificaie patologic.S e n s i b i l i t a t e a l a a n t i b i o t i c e a b a c i l i l o r
g r a m n e g a t i v i a n a e r o b i e s t e diferit constituind un criteriu de identificare

88 Stabilirea numrului total de lactobacterii din lichidul bucal: metoda


clasic i metodele rapide.
Lactobacilii sunt frecvent izolai din cavitatea bucal, n special din placa dentar i de pe limb.
L. casei, L. rhamnosus, L. fermentam, L acidophilus, L. salivarius, L. plantarum, L. paracasei,
L.gasseri, L oris
18.
Reprezint mai puin de 1 % din flora cultivabil a cavitii bucale
19.
Prevalena lor crete n cazul pacienilor cu carii
20.
Fermenteaz glucoza cu producere de lactat sau lactat i acetat
21.
Se folosesc medii selective pentru estimarea numrului de lactobacili din saliv
22.
Test pentru aprecierea activitii cariogene a microflorei bucale
o Cu toate ca aceste teste nu sunt foarte relevante, ele ofer informaii n legtur cu dieta
pacientului
Nivelul de lactobacili se coreleaz cu aportul de carbohidrai din dieta persoanei
Metoda clasic
Recoltarea lichidului bucal
23.
n seara anterioar recoltrii pacientul efectueaz o igien riguroas a cavitii bucale,
apoi nu mai consum alimente, lichide,.
24.
Dimineaa, nainte de a mnca, se cltete cavitatea bucal cu ser fiziologic steril
25.
Dup un repaus de 30 minute, se cltete din nou gura cu 20 ml ser fiziologic steril timp
de 2 min.
o Serul va fi colectat n recipient steril
Tehnica de lucru
Se efectueaz diluii succesive 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000
Din fiecare diluie se nsmneaz 1 ml prin nglobare n 10 ml mediu fluidificat
Se numr coloniile de lactobacili
- Colonii R, cu margini neregulate
- Se numr plcile n care s-au dezvoltat cel puin 20-30 colonii i cel mult 300 colonii
- Se corecteaz cu factorul de diluie i se apreciaz numrul de lactobacili/ml. lichid bucal
Metode rapide
CRT bacteria
26.
Se folosete pt determinarea numrului de streptococi mutans i de lactobacili din saliv
27.
Utilizeaz medii selective
28.
Contraindicaii :
*Tratament antibiotic
Testul se poate utiliza doar dup 2 sptmni de la ncetarea tratamentelor antibiotice
*Utilizarea apei de gur cu efect antibacterian
Testul se poate utiliza dup 12 ore
Metoda de lucru

Stimularea secreiei salivare prin mestecarea unor granule de parafin


30.
Se recolteaz saliva n recipient steril
31.
Se umezesc ambele pri ale mediului cu saliv
* Saliva se va picura cu pipeta pentru a evita zgrierea mediului
32.
Se scurge excesul de saliv
33.
estul se plaseaz n recipient, se nchide ermetic
34.
Se incubeaz la 37 C, 48 ore, n poziie vertical
35.
Citirea se face n comparaie cu etalonul
29.

89 Metoda de determinare a efectului antimicrobian al pastelor dentare.


S. mutans, S. sanguis, S. sobrinus i S. mitis - principalii agentii patogeni in timp ce S.
salivarius e un iniiator al infeciei dentare. Aceti streptococi oral prezint riscuri
semnificative pentru sntate n cazul n care intr n fluxul sanguin, prin intermediul
rnilor, infectiilor orale, putnd cauza endocardita.n urma invadatorilor primari, cavitatea
oral e vulnerabil ctre invadatori secundari : C.albicans i Actinomyces, Spirochete i
Lactobacillus.
Agentii patogeni bacterieni au fost identificai i izolai.
Efectul antimicrobian din 11 paste de dini disponibile la nivel local au fost evaluate n
raport cu izolate de agar.
Rezultat:
Infecii Monomicrobial au fost observate n toate cazurile.
Agentii patogeni bacterieni s-au dovedit a fi S.mutans S. salivarius S. Sanguis S. sobrinus
S. mitis.
Colgate Total, Colgate, Anchor White coninnd triclosan au demonstrat efectul
antimicrobian. Fiind sigure pentru esuturile orale moi i dini, prin faptul c nu
influeneaz microflora, nici prin dezvoltarea unor tulpini rezistente i nici prin virarea
florei ctre specii oportuniste
Triclosanul este un agent antibacterian cu spectru larg, activ mpotriva bacteriilor grampozitiv i gram-negativ..
La concentraii bacteriostatice, triclosanul mpiedic aportul de aminoacizi eseniali;
La concentraii bactericide, provoac dezorganizare a membranei citoplasmatice
bacteriene, i pierderea coninutului celular

90 Metoda de determinare a efectului antimicrobian al substanelor


antiseptice utilizate n igiena cavitii orale.
Evaluarea intensitii aciunii antisepticelor i dezinfectantelorse face prin determinarea :
-concentraiei minime inhibitoare (CMI), care determin indicele fenolic.Substanele
dezinfectante prezint o CMI pentru bacteriile sub form planctonic,dar CMI crete foarte mult cnd
bacteriile se afl ncorporate ntr-un biofilm.
-concentraiei minime bactericide (CMB) cantitatea cea mai mic desubstan care asigur un efect
bactericid, stabilit n condiii sandard.
- spectrului de aciune a unei substane antiseptice sau dezinfectante: lista speciilori variantelor bacteriene sensibile
la substana respectiv cu precizarea CMIstabilite n condiii standard. Sunt cuprinse i speciile
insensibile (cu rezistennatural).
Modul de aciune al antisepticelor i dezinfectantelor este:
germicid = oprirea ireversibil a multiplicrii germenilor
patogeni.
Omorrea (inactivarea) acestora este dovedit de absena creterii germenilordup nlturarea substanei
germicide i introducerea germenilor n mediifavorabile multiplicrii lor.

n funcie de tipul microorganismului asupra cruia se acioneaz, aciunea este:


- bactericid - se intervine letal asupra bacteriilor;
- sporicid - se intervine letal asupra sporilor
- virucid - se intervine letal asupra virusurilor;
- fungicid - se intervine letal asupra fungilor;
- amoebicid - se intervine letal asupra amoebelor