PRCTICAS DE MICROBIOLOGA

OBJETIVOS:
1. Iniciacin en las tcnicas del estudio de
microorganismos: cultivo, tincin y morfologa.
Material necesario:
Cultivo de bacterias, levaduras, Antibiticos.
Cristal violeta (1 g de cristal violeta en 100 cc de agua destilada).
Lugol (1 g de iodo en 2 g de ioduro potsico en 100 cc de agua
destilada). Fucsina bsica (1 g de fucsina bsica en 100 cc de agua
destilada).
Aceite de inmersin.
Microscopio
Portaobjetos, asas de cultivo, mechero, cpsulas de Petri, tubos de
ensayo. Papel secante.
1.- INTRODUCCIN
El tamao de la mayora de las clulas
bacterianas es tal que resultan difciles
de ver con el microscopio ptico. La
principal dificultad es la falta de
contraste entre la clula y el medio que
la rodea. El modo ms simple de
aumentar el contraste es la utilizacin
de colorantes.
Si se desea simplemente aumentar el
contraste de las clulas para la
microscopa, son suficientes los
procedimientos que usan un solo colorante llamados de tincin
simple. Sin embargo, a menudo se utilizan mtodos que no tien
de igual modo todas las clulas, es el proceso denominado
tincin diferencial. Uno muy usado en microbiologa es la
tincin Gram. Basndose en su reaccin a la tincin Gram, las
bacteras pueden dividirse en dos grupos: grampositivas y
gramnegativas. Esta tincin tiene gran importancia en
taxonoma bacteriana ya que indica diferencias fundamentales
de la pared celular de las distintas bacterias.

Mientras que las bacterias gramnegativas son constantes en su

reaccin, los microorganismos grampositivos pueden presentar
respuestas variables en ciertas condiciones (son gramlbiles).
Por ejemplo, los cultivos viejos de algunas bacterias
grampositivas pierden la propiedad de retener el cristal
violeta, y en consecuencia, se tien por la safranina
apareciendo como gramnegativas. Anlogo efecto se produce
en ocasiones por cambio en el medio del organismo, o por
ligeras modificaciones en la ejecucin de la tcnica. Por este
motivo, es preciso atenerse, en la prctica, al procedimiento
establecido.
Para explicar el mecanismo de la tincin de gram se han
propuesto varias hiptesis fundadas en la naturaleza qumica
de las paredes celulares de los microorganismos.
Aqu puedes ver las diferencias estructurales y qumicas de los
dos tipos de pared bacteriana:
Pared Gram +
capa densa y uniforme de 200 a 800
A)
cidos teicoicos
polisacridos
protenas (pocas veces)
glicopptido (50% del peso seco)

Pared Gram capa interna delgada de 20 a 30 A

cubierta por capas externas de
densidad menor)
lipopolisacridos
lipoprotenas
protenas
glicopptido (10% del peso seco)

El mecanismo de la tincin Gram es la reseado en el siguiente

esquema:

Productos
que se
utilizan

1) Cristal
violeta
2) Lugol
solucin
iodada
3) Alcohol

Reaccin y coloracin de las bacterias

GRAM +
Clulas color violeta

Se forma el complejo CV-I.

Las clulas continan
teidas de color violeta.
Se deshidratan las paredes
celulares. Se contraen los
poros. Disminuye la
permeabilidad. El complejo
CV-I no sale de las clulas
que continan teidas de
color violeta.
4) Safranina Clulas no decoloradas;
quedan teidas de color
violeta.

GRAM Clulas color violeta

Se forma el complejo CV-I.
Las clulas continan
teidas de color violeta.
Eliminacin por extraccin
de grasas de las paredes
celulares. Aumenta la
porosidad. El complejo CV-I
se separa de la clula.

Clulas decoloradas; se
tien de color rosado.

2. TINCIN DE GRAM
2.1 Mtodo
2.1.1 Extensin: En un porta bien limpio (con alcohol, papel de
filtro y flameado) se coloca una gota de agua destilada a la que.
con el asa de siembra, previamente esterilizada a la llama, se
lleva una pequea cantidad de suspensin de bacterias o, en su
caso, de una colonia.
Con el asa se extiende la gota y las bacterias sobre el porta y
se fija la extensin por el calor, calentando suavemente a la
llama del mechero hasta que se seque.

2.1.2 Coloracin:
a) 1 minuto en cristal violeta de Hucker (colorante inicial)
b) se lava con agua destilada
c) 1 minuto en lugol (mordiente)
d) se decolora con alcohol de 95 (decolorante)
e) se lava con agua destilada
f) 1 minuto en fucsina bsica (colorante de contraste)
g) se lava con agua corriente
h) se seca suavemente y sin frotar con papel de filtro
Una vez que la preparacin est totalmente seca, poner una
gota muy pequea de aceite de cedro y observar al microscopio
con el objetivo de inmersin.

2.2. Observacin
Debe utilizarse el
objetivo de
inmersin.
Se coloca una
gota de aceite de
cedro sobre la
preparacin. Se
enfoca,
preferentemente,
con el
micromtrico.
Despus de
utilizar el
objetivo de inmersin debe limpiarse con xilol

Observaciones realizadas: antalas en tu cuaderno Qu forma

tienen las bacterias observadas? Las bacterias aparecen
aisladas o agrupadas? En caso de que aparezcan agrupadas
indicar el tipo de asociacin. Indica tipo de Gram.