Matymet

Buffer de Sacarosa (0.38M sacarosa, 0.07M K2HPO4, 0.01M KCl, pH 7.5)

Espinaca
Tijeras
Balanza
Mortero
vasos
precipitados
Tubos falcon 15ml/50ml
Micropipeta
Acetona

Espectrofotometro
Acetona 80%

Cubeta de plstico
Gasa
Aluminio
Micropipetas
Alcega
Centrifuga
Lampara
Planta de
tabaco
parafilm

Procedimiento:
Identificacin de fase clara de la fotosntesis en hojas de plantas de tabaco:
En dos vasos se agreg una hoja de tabaco, luego se llen con agua hasta el
tope y cubri con parafilm. Un vaso se coloc a la luz de una lmpara y el otro
vaso se cubri con papel aluminio. Se esper una hora a temperatura y se
observaron las hojas.
Extraccin de cloroplasto de acelga:
Se lav y se sec una hoja hoja de acelga, luego se pes 5g de tejido verde,
procurando no tomar la vena principal. El tejido se llev a un mortero
preenfriado con 15ml de buffer de sacarosa, se moli. El lquido resultante, se
filtr con gasa y se puso en dos tubos falcon de 15ml. Se centrifug los tubos a
3000rpm por tres minutos. Se elimin el sobrenadante y se re suspendi el
pellet con 1 ml de buffer sacarosa. Se dej el pellet resuspendido en un tubo en
hielo.
Extraccin de clorofila del extracto de cloroplastos:
Se tom desde el tubo 50 uL de extracto, se traspas a otro tubo falcon y se
enras a los 5ml con acetona al 80%. Luego, se centrifug a 3000rpm por dos
minutos, y el sobrenadante se llev a otro a tubo falcon. Entonces, se tom 1ml
y se midi la absorbancia a 652nm. Luego, se ajust la concentracin del
extracto a 0.5mg/mL. Se sac 1ml del extracto y se enras a 3.9ml.
Absorbancia de clorofila extrada:
-In vivo: Se tom 10uL del extracto de clorofila, se agreg 1ml de buffer de
sacarosa, y se midi la absorbancia en un rango de 400 a 700nm con intervalos
de 30 nm.
- En puro: Se tom 10ul del extracto de clorofila, se agreg 1ml de acetona al
80%, y se midi la absorbancia en un rango de 400 a 700nm con intervalos de
30 nm.

Tome una hoja de

espinaca, procurando
dejarla lo ms seca
posible. Usando tijeras,
rompa el tejido y colecte
unos 5 gramos de tejido
(use la balanza), evitando
la vena
principal, la cual no
contiene muchos
cloroplastos. Poner el
tejido en un mortero
preenfriado
y agregar 15 mL de buffer
de sacarosa pre-enfriado
(0.38 M sacarosa, 0.07 M
K2HPO4 , 0.01 M KCl ,
pH 7.5) homogenizar bien
el tejido y luego mediante
gasa, filtrar el
homogenizado en un vaso
precipitado de 100 mL.
Dividir la suspensin en 2
tubos Falcon
de 15 mL con igual
volumen en cada uno.
Centrifugar a 3000 rpm, 3
min, para peletear los
cloroplastos. Desechar el
sobrenadante, y agregar
300 l de buffer de
sacarosa al pellet.
Resuspender el pellet con
agitacin suave (para no
romper los cloroplastos)NO usar la
micropipeta para
resuspender. Una vez
resuspendido, agregar
buffer hasta un volumen
total
de 1 mL.
Para estandarizar las
mediciones, hay que saber

cunto material
prepararon. La
forma ms comn de
expresar resultados
utilizando cloroplastos es
en trminos de la
cantidad de clorofila que
existe en la muestra.
A. Estimacin de
clorofila
-Tomar 50 l de la
preparacin
-Completar volumen de 5
mL con acetona al 80% en
un Falcon de 15 mL
-Mezclar, y centrifugar a
3000 rpm, 2 minutos para
peletear protenas
precipitadas
-Hacer cero el
espectrofotmetro con 1
mL de acetona 80%,
medir absorbancia a 652
nm
-Medir la absorbancia
652nm de 1 mL de la
preparacin de
cloroplastos en acetona
-Hacer la siguiente
conversin:
mg clorofila /mL = 2.9 x
A652
-Anote la concentracin
de clorofila obtenida.
Ajuste la preparacin de 1
mL de cloroplastos en
buffer de sacarosa, a una
concentracin
final de 0.5 mg/ mL,
usando buffer de sacarosa.
Probablemente, van a
tener unos 2-5 mL de
preparacin en total.
Para cada uno de los
ensayos siguiente, se

utilizar una alicuot5a de

la preparacin anterior.
Se sugiere fuertemente
que para los ensayos a
continuacin, se divida el
grupo de trabajo y
que empiecen con los
ensayos simultneamente.
B. Espectro de absorcin
de la clorofila
Primero se medir dos
espectros de absorcin de
clorofila, uno de clorofila
unido a
la protena (estado in
vivo), y el segundo de
clorofila pura- extrado en
acetona.
1. Estado in vivo.
Tome 1ul de cloroplasto y
dilyalo a 1 mL con buffer
de sacarosa en una cubeta
de
plstico.
Poner una cubeta con 1
mL buffer de sacarosa
solo (blanco) en el
espectrofotmetro, medir
la absorbancia a 400 nm, y
ajustar los nmeros a cero.
Luego
poner la cubeta con los
cloroplastos en el
espectrofotmetro , anote
el valor de absorbancia
obtenido. Repetir el
proceso, cambiando la
longitud en pasos de 20
nm, desde 400 nm hasta
700 nm. No olvidar de que
en cada paso, tiene que
ajustar la mquina a cero,
antes de medir
la muestra de clorofila.
Pueden usar la misma

muestra para todos los

ensayos, pero
mantenindola en
oscuridad y fro lo
mximo posible.
2. Estado puro
Diluir 10 ul de
cloroplastos en 1 mL de

acetona 80% en una

cubeta plstica. Usando
un blanco de 1 mL de
acetona 80%, y la muestra
de clorofila en acetona
80%, medir la
absorbancia desde 400 nm
a 700nm en pasos de 20

nm como esta descrito

anteriormente.
Hacer un grfico con
ambos datos e interpretar
los resultados.