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Crdoba,
comprometida
con el desarrollo
regional.
UNIVERSIDAD DE CORDOBA
FACULTAD DE CIENCIAS BSICAS
PROGRAMA BIOLOGIA
MONTERA CORDOBA
2015
DNA Recombinante:
Esta tecnologa nos permite obtener fragmentos de ADN en cantidades ilimitadas, que
llevar adems el gen o los genes que se desee. Este ADN puede incorporarse a las
clulas de otros organismos (vegetales, animales, bacterias...) en los que se podr
"expresar" la informacin de dichos genes. (De una manera muy simple podemos decir
que "cortamos" un gen humano y se lo "pegamos" al ADN de una bacteria; si por
ejemplo es el gen que regula la fabricacin de insulina, lo que haramos al ponrselo a
una bacteria es "obligar" a sta a que fabrique la insulina.
En la naturaleza, la recombinacin gentica normalmente tiene lugar entre dos
molculas de DNA derivadas de organismos de la misma especie. En animales y
plantas, por ejemplo, los dos padres de un individuo son las fuentes originales del DNA
que se recombina durante la meiosis. Una molcula de DNA recombinante que surge
de forma natural difiere de las molculas de DNA parental slo en la combinacin de
alelos que contiene; la identidad fundamental y la secuencia de sus genes se
mantienen igual.
Una caracterstica clave de la tecnologa del DNA recombinante es la capacidad de
replicar o clonar fragmentos especficos de DNA con el propsito de preparar
grandes cantidades para investigacin y para otros usos. El clonaje va acompaado del
corte y empalme del DNA de inters y el empalme al DNA del elemento gentico,
llamado vector de clonaje, que se puede replicar de forma autnoma cuando se
introduce en una clula que crece en cultivo en la mayora de los casos, una bacteria
como E. Coli. El vector de clonaje puede ser un plsmido o el DNA de un virus,
normalmente un bacterifago. En cualquier caso, el DNA pasajero del vector se copia
cada vez que se replica ste. De esta forma, es posible generar grandes cantidades de
genes especficos u otros segmentos de DNA y tambin sus productos proteicos, si
los genes pasajeros se transcriben y se traducen en clulas en proliferacin que portan
el vector.
La mayora de lo que denominamos tecnologa del DNA recombinante ha sido posible
por el descubrimiento de las enzimas de restriccin. La capacidad de las enzimas de
restriccin para cortar molculas de DNA en secuencias especficas, denominadas
sitios de restriccin las convierte en poderosas herramientas para cortar grandes
enzimas de restriccin se pueden utilizar para la cartografa del ADN. Por su trabajo en
el descubrimiento y caracterizacin de enzimas de restriccin, el Premio Nobel 1978 de
Fisiologa o Medicina fue otorgado a Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton O. Smith.
Su descubrimiento condujo al desarrollo de la tecnologa de ADN recombinante que
permite, por ejemplo, la produccin a gran escala de la insulina humana para los
diabticos utilizando bacterias E. coli.
alto nmero de copias, por lo tanto, la clonacin de fragmentos grandes pueden requerir
vector de clonacin ms especializado.
Plsmido
Los plsmidos son los vectores de clonacin estndar y los ms comnmente
utilizados. Plsmidos ms generales se pueden utilizar para clonar inserto de ADN de
hasta 15 kb de tamao. Uno de los primeros vectores de clonacin utilizados es el
plsmido pBR322. Otros vectores de clonacin incluyen la serie de plsmidos pUC, y
un gran nmero de diferentes vectores plasmdicos de clonacin estn disponibles.
Muchos plsmidos tienen alto nmero de copias, por ejemplo, pUC19, que tiene un
nmero de copias de 500-700 copias por clula, y alto nmero de copias es til, ya que
produce un mayor rendimiento de plsmido recombinante para su posterior
manipulacin. Sin embargo plsmidos de nmero de copia bajo pueden ser utilizados
preferentemente en ciertas circunstancias, por ejemplo, cuando la protena a partir del
gen clonado es txico para las clulas.
Algunos plsmidos contienen un bacterifago M13 origen de la replicacin y pueden ser
utilizados para generar ADN de una sola hebra. Estos se llaman fagmido, y ejemplos
son la serie de vectores de clonacin pBluescript.
Bacterifago
Los bacterifagos son utilizados para la clonacin del fago? y el fago M13. Hay un lmite
superior en la cantidad de ADN que puede ser empaquetado en un fago, por lo tanto,
para permitir ADN extrao que se inserta en el ADN de fago, los vectores de clonacin
de fago necesita tener algunos genes no esenciales eliminan, por ejemplo, los genes
para la lisogenia en fago? Hay dos tipos de? vectores de fago - vector de insercin y
vector de reemplazamiento. Vectores de insercin contienen un sitio de escisin nico
mediante el cual se puede insertar ADN extrao con el tamao de 5-11 kb. En vectores
de reemplazo, los sitios de escisin flanquean una regin que contiene los genes no
esenciales para el ciclo ltico, y de esta regin puede ser suprimido y reemplazado por
el inserto de ADN en el proceso de clonacin, y un ADN de mayor tamao de 8-24 kb
puede ser insertado.
Tambin hay un lmite de tamao inferior de ADN que puede ser empaquetado en un
fago, y vectores que son demasiado pequeos no puede ser empaquetado
correctamente en el fago. Esta propiedad se puede utilizar para la seleccin - vector sin
inserto puede ser demasiado pequea, por lo tanto, slo con vectores de inserto
pueden ser seleccionados para la propagacin.
Csmido
Los csmidos son plsmidos que incorporan un segmento de bacterifago? ADN que
tiene el sitio de extremo cohesivo que contiene los elementos necesarios para envases
de ADN en? partculas. Normalmente se utiliza para clonar grandes fragmentos de ADN
entre 28-45 Kb.
Cromosoma artificial bacteriano
Inserte tamao de hasta 350 kb puede clonarse en el cromosoma artificial bacteriano.
BAC se mantienen en E. coli con un nmero de copias de slo 1 por clula. BACS se
basan en el plsmido F, otro cromosoma artificial llamado el PAC se basa en el fago P1.
Cromosoma artificial de levadura
Inserte de hasta 3,000 kb se puede llevar por el cromosoma artificial de levadura.
Cromosoma artificial humano
Cromosoma artificial humano puede ser potencialmente til como vectores de
transferencia gnica para la entrega de genes en las clulas humanas, y una
herramienta para estudios de expresin y la determinacin de la funcin cromosoma
humano. Se puede llevar fragmento de ADN muy grande, por lo tanto, no tiene el
problema de la capacidad de clonacin limitado de otros vectores, y tambin evita la
posible mutagnesis de insercin causado por la integracin en los cromosomas de
acogida por el vector viral.
4. Qu es la transformacin molecular?
TIPOS DE GENOTECA:
Genoteca Genmica.
Es un tipo til de genoteca que contiene fragmentos del ADN genmicos generados
mediante la digestin parcial con cantidades limitantes de una enzima de restriccin la
cual efecta cortes en determinados sitios con una frecuencia elevada en el genoma.
Como consecuencia se produce una digestin parcial del ADN, de modo que solo tiene
lugar la fragmentacin de unos cuantos sitios de restriccin, quedando el resto intacto.
Se genera as una coleccin de fragmentos superpuestos con una longitud idnea para
la clonacin en un vector de clonacin tras ligar el vector y el fragmento de ADN, se
introduce en una clula husped.
La cantidad de clones que se necesitan para generar una genoteca que cubra el
genoma entero depender del tamao de dicho genoma y del tamao de los trozos de
ADN obtenidos. Por tanto para saber el nmero de clones. Por lo tanto para saber el
nmero de clones que necesitamos usamos dos parmetros.
N clones= tamao genoma/ tamao medio del fragmento x N de clones con el mismo
inserto
en un vector apropiado para crear una genoteca de ADNc representativa de todos los
transcritos originales de ARNm que se encuentran en una clula o tejido original.
Algunos vectores hbilmente construidos, llamados vectores de expresin, contienen
seales de transcripcin y de traduccin adyacentes al lugar de insercin del ADNc,
haciendo posible la transcripcin y traduccin en bacterias, hongos o clulas en cultivo,
de una molcula de ADNc de longitud completa para poder as producir la protena que
codifica.
10. Cules son los tipos de marcadores moleculares que hay en la actualidad.
Explique cada uno.
Los marcadores moleculares son una herramienta necesaria en muchos campos de la
biologa como evolucin, ecologa, bio-medicina, ciencias forenses y estudios de
diversidad. Adems se utilizan para localizar y aislar genes de inters. En la actualidad
existen varias tcnicas moleculares que nos permiten conocer cmo se encuentran las
proporciones de genes en las poblaciones naturales de manera indirecta, como con los
anlisis de protenas, o de manera directa con estudios de ADN.Los diferentes tipos de
marcadores se distinguen por su capacidad de detectar polimorfismos en loci nicos o
mltiples y son de tipo dominante o co-dominante (Simpson, 1997).
RAPDs
Los RAPDs (polimorfismos de ADN amplificados al azar) son marcadores que
amplifican aleatoriamente segmentos de ADN en una gran variedad de especies. Los
RAPDs se basan en la probabilidad estadstica de que se presenten sitios
complementarios al oligonucletido de 10 pares de bases (pb) a lo largo del genoma. El
polimorfismo de las bandas entre los individuos se debe a cambios en la secuencia de
los nucletidos en los sitios de acoplamiento del oligonucletido y por insercin o
delecin de los fragmentos en estos sitios.
Los RAPDs son tiles en la elaboracin de mapas genticos, en el estudio de
parentesco y en el anlisis de la estructura poblacional, ya que ayudan a estimar
tamao efectivo, aislamiento reproductivo y niveles de fecundacin cruzada (Otero et
al., 1997; Parker et al., 1998; vanse tambin los captulos 2, 3 y 6 de este libro).
Microsatlites
Los microssatlites o secuencias simples repetidas (SSRs; Litt y Luty, 1989) son
secuencias de ADN formadas de 1 a 4 pares de bases, por ejemplo mononucletidos
(TT)n, dinucletidos (AT)n, o tetra nucletidos (AAGG)n. Estos loci se encuentran en
regiones codificantes y no codificantes del ADN y es probable que se formen por
eventos de rompimiento que generan polimorfismos con valores superiores al 90%.
Los microsatlites han tomado ventaja sobre otros marcadores genticos como los
AFLPs, RAPDs, RFLPs, debido a que: i) tienen el ms alto grado de polimorfismo; ii)
segregan de manera mendeliana y son codominantes; iii) la presencia de un solo locus
gentico por microsatlite hace que la lectura de las bandas sea clara y fcil de
interpretar y iv) son selectivamente neutros (Golstein y Pollock, 1994; Vendraminet al.,
1996). Adems, para trabajar con SRR es necesario conocer la secuencia de la regin
a analizar para contar con primers especficos que amplifiquen la regin repetitiva (el
microsatlite) responsable de la variacin observada, que adems es homloga para
diferentes especies o incluso gneros (Golsteinet al., 1996). Esto es, los microsatlites
son especficos para ciertos grupos de especies y homlogos entre s (Vendraminet al.,
1996), lo que permite hacer estudios comparativos entre especies o gneros de un
mismo grupo. Por otra parte, se han realizado estimaciones de las tasas de mutacin
de estas regiones y se ha llegado a la conclusin de que los microsatlite del ADN
nuclear tienen tasas de mutacin de 1x 10 -3 a 1x 10 -6 (Wiessenbachet al., 1992;
Weber y Wong, 1993), ms altas que las que se presentan en el ADN de cloroplasto las
cuales segn Provanet al. (1999) son de 3.2-7.9 x 10-5. Conocer las tasas de mutacin
nos brinda una base importante para realizar anlisis robustos de la genealoga de las
poblaciones que nos hablen acerca de la historia evolutiva de las especies, ventaja muy
importante sobre otros marcadores genticos.
ISSRs
Es un marcador molecular conocido como secuencias repetidas intersimples.
Esta es una tcnica relativamente nueva y es similar a los RAPDs, excepto que en los
ISSRs el primer es un di trinucleotido repetido (Culler y Wolfe, 2001 vase el captulo
19 de este libro).
Los dos mtodos que se utilizan en la electroforesis de ISSRs son: a) gel de agarosa
visualizado con bromuro de etidio, y b) geles de acrilamida teidos con nitrato de plata.
Las bandas que se obtienen con este marcador van de 100 a 2000 pb. La variacin
allica en los ISSRs consiste de la presencia o ausencia de los productos amplificados.
Comparada con los primers de los RAPDs las secuencias de los ISSRs es usualmente
larga lo que resulta en una mayor reproductibilidad de las bandas.
RFLPs
interacciones entre sus productos es una meta a largo plazo todava. Hay, pues, mucho
ms que conocer para entender el proceso mismo de la vida.
Determinar la secuencia de ADN es til en el estudio de la investigacin bsica de los
procesos biolgicos fundamentales, as como en campos aplicados, como la
investigacin forense. El desarrollo de la secuenciacin del ADN ha acelerado
significativamente la investigacin y los descubrimientos en biologa.
BIBLIOGRAFA.
The Internet and The new biology. Tools for genomic and molecular
approach. Peruski, L. F. Jr. Y Peruski, A. H. 1997. American Society for
Microbiology, Washington.