Colgio Bartolomeu Dias, 2014/2015

Colorao
diferencial de
Gram
E posterior observao microscpica

Ana Margarida, Francisco Alves, Miguel Cruz

08-05-2015
Prof. Joana Alves
Biologia

CONTEDO TERICO:
O objectivo central deste trabalho laboratorial refere-se ao procedimento da
colorao diferencial de Gram e posterior observao de espcies bacterianas, a
nvel microscpico, presentes num iogurte, analisando assim as suas paredes
celulares que tm diferentes estruturas e composies qumicas.
As bactrias so clulas procariticas pertencentes ao reino monera. As bactrias
podem ser encontradas de forma isolada ou em colnias. Podem viver na presena
de oxignio (aerbias), na ausncia de oxignio (anaerbias) ou podem ser
anaerbias facultativas.
As bactrias apresentam vrios tipos morfolgicos, sendo os mais vulgares os cocos
(forma esfrica), os bacilos (forma de bastonete), os espirilos (forma espiralada) e
os vibries (forma de vrgula).

As bactrias so constitudas pelos seguintes constituintes estruturais: pili,

nucleide, citoplasma, ribossomas, membrana plasmtica, parede celular, cpsula e
flagelo.
As pili ou fimbrias numerosos apndices filamentosos, de natureza proteica, muito
mais curtos e finos do que os flagelos; facilitam a aderncia da bactria a substratos
slidos ou aos tecidos dos organismos parasitados.
O nucleide consiste numa nica molcula circular de DNA que determina as
caractersticas da clula e comanda as suas actividades.
O citoplasma a soluo aquosa na qual esto suspensos todos os componentes
internos; pode conter substncias teis para a clula como enzimas e substncias de
reserva.

Os ribossomas so pequenos corpos

granulares, com os quais ocorre a sntese
de protenas; movem-se livremente no
citoplasma.
A membrana plasmtica envolve a clula
bacteriana controlando as trocas de
substncias com o exterior; pode formar
invaginaes para o interior em cuja
superfcie se realizam processos como a
respirao ou a fotossntese.
A parede celular o invlucro semi-rgido
que d forma s bactrias e as protege
contra vrus e substncias txicas.
formada
por
polissacardeos
e
polipeptdeos.
A cpsula tem um aspeto gelatinoso, protege a bactria da dessecao, dos vrus
bacterifagos, clulas fagocitrias e anticorpos. Alguns antibiticos, como a
penicilina, actuam inibindo a produo de cpsulas.
As bactrias podem apresentar um nmero varivel de flagelos, os quais, rodando
sobre a sua base, permitem que a clula se movimente.
A reproduo mais comum nas bactrias assexuada por bipartio. Ocorre a
duplicao do DNA bacteriano com enzimas da prpria bactria, que depois migra
para os polos. De seguida, a bactria divide o seu citoplasma e a sua parede celular,
para formar duas clulas. As bactrias multiplicam-se por este processo muito
rapidamente quando dispem de condies favorveis.
A tcnica de Gram um processo de colorao de bactrias descoberto pelo mdico
dinamarqus Hans Christian Joachim Gram em 1884. Este processo permite a
microscpio diferenciar bactrias com diferentes estruturas de parede celular a
partir das coloraes que estas apresentam aps sofrerem o processo de colorao.
A colorao de Gram um dos mais importantes mtodos de colorao utilizados
em laboratrios de microbiologia e de anlises clnicas.
As bactrias do tipo Gram-negativas possuem uma parede com uma bicamada
fosfolipdica exterior, relativamente a uma fina camada de peptidoglicano, e que
envolvem a membrana plasmtica. Na tcnica de colorao de Gram, os lpidos
externos destas clulas so dissolvidos pelo lcool, formando poros na parede, o
que permite a sada do corante Violeta de Cristal para o exterior celular. Estas
clulas so posteriormente coradas com soluo de Safranina de modo a

adquirirem uma cor rosa avermelhado. Alguns exemplos so: Salmonela;

Pseudomonas; Yersinia; Shigella; Legionella; Escherichia coli; Sphingomonas.
As bactrias do tipo Gram-positivas no possuem uma bicamada fosfolipdica
exterior na parede celular mas sim uma camada espessa de peptidoglicano sendo o
seu teor lipdico muito menor que nas bactrias Gram-negativas. A camada espessa
de peptidoglicano atua como uma barreira que impedir a sada do corante Violeta
de Cristal, o que levar a aquisio de uma cor violeta escuro. Alguns exemplos so:
Clostridium; Streptococcus; Staphilococcus; Bacillus; Lactobacillus.
O estudo das bactrias tem favorecido largamente vrios ramos profissionais do
quotidiano. Entre eles, houve um que se tornou um sucesso em ascenso: a
biotecnologia. A biotecnologia uso de mltiplos e diversificados organismos vivos
para produo de bens ou servios. A alimentao, a agricultura e a medicina em
muito beneficiaram deste ramo que combina a gentica, biologia molecular,
bioqumica, biologia celular, engenharia qumica, biotica, etc. Nestas combinaes
podemos ver enquadrados atividades milenares como o fabrico de alimentos
fermentados (po, vinho, entre outros).
Na atualidade, cerca de 20% da populao mundial no tem acesso a certos bens
essenciais, e entre eles, a alimentao. Com o propsito de erradicar a fome
mundial, vrias empresas e laboratrios tem vindo a desenvolver transformaes
biotecnolgicas que resultam em novos alimentos ou a sua sntese mais rentvel,
sendo que, por vezes, so exponenciadas as taxas nutritivas dos alimentos mais
comuns.
Na transformao biotecnolgica de alimentos, existem trs processos muito
bsicos: catlise microbiana, com a interveno de microrganismos; a catlise
enzimtica, onde intervm enzimas produzidas por microrganismos; manipulao
gentica, resultando em transformaes do patrimnio gentico.
A catlise microbiana o uso de componentes, por exemplo, das bactrias para
aumentar a velocidade em que produzida uma determinada substncia desejada.
Isto , a bactria exponenciada para produo de uma substncia mas com uma
velocidade superior. Este processo utilizado quando a catlise enzimtica no
possvel. Aqui as enzimas catalisam as reaes. Porm, neste processo, a enzima
pode auxiliar a produo de nutrientes consumveis, como as protenas, os
carbohidratos, e as gorduras. Como conhecido, so as enzimas que permitem a
converso rpida de algumas substncias em outras que podemos absorver.
Obviamente, nem sempre, as bactrias podem produzir as substncias que so
desejadas e por isso so manipuladas geneticamente para que possam oferecer o
pretendido. So atingidas estas manipulaes atravs, por exemplo, do uso da
tcnica do ADN recombinante ou da cultura de tecidos.

Eis alguns produtos obtidos atravs de bactrias:

Microrganismos
Bactrias lcticas

Leveduras

Bactrias lcticas e
leveduras
Bactrias lcticas e
bolores

Matria-prima
Couve-branca
Legumes
Leite
Soro lcteo
Carnes
Fruta
Malte
Cereais
Cana-de-acar
Vegetais
Cereais
Gengibre
Vegetais
Leite

Produtos
Couve fermentada
Pickles
Iogurte, queijo
Requeijo
Chourio, salsicha
Vinho, vermute
Cerveja, whisky
Po
Rum
Pickles
Po cido
Cerveja
Molho de soja
Queijo

Outro ramo que tem favorecido do estudo das bactrias a engenharia gentica. As
bactrias so clulas procariticas que apresentam todas as estruturas moleculares
necessrias biossntese e transformaes energticas, logo podem fabricar
protenas da leitura que fazem ao seu prprio material gentico. Acrescentando a
biossntese bacteriana, a bactria possui uma vantagem para a engenharia
gentica: como o material gentico das bactrias apresenta plasmdeos, genes
acessrios em forma de anel que no esto ligados a molcula principal do ADN,
ento a engenharia gentica pode fazer a biossntese dos produtos que desejar
atravs da adio de novos plasmdeos. A esta insero, e os anteriores processos
que permitem a insero chamamos tcnica do ADN recombinante, como j foi
referido. Nesta tcnica insere-se um gene de outro organismo produtor de uma
protena no plasmdeo.
Entre os vrios exemplos de produtos que podem ser obtidos da engenharia
gentica com bactrias temos os anticorpos monoclonais, a hormona do
crescimento e a insulina. Os anticorpos monoclonais combatem alguns tipos de
cancro, a hormona de crescimento trata subdesenvolvimentos de certos rgos e a
insulina combate a doena diabetes.

CONCEITOS-CHAVE:
Bactrias (microrganismos)
Gram positiva
Gram negativa
Parede celular
Corante
Solvente orgnico
Peptidoglicano

MATERIAL:
Microscpio
Lminas
Ansa de inoculao
Tina de colorao
Lamparina de lcool
Fsforos
Papel de limpeza
Soluo de violeta-de-genciana
Soluo de lugol
lcool a 95%
Soluo de fucsina
Iogurte natural
Cronmetro
Garrafa de esguicho
leo de imerso

PROCEDIMENTO:
Preparao e fixao do esfregao:
1.Colocou-se uma gota de gua numa lmina
2.Com a ansa de inoculao, retirou-se uma gota de iogurte. Colocou-se a gota na
lmina, sobre a gota de gua, espalhando, para formar o esfregao.
3.Secou-se o esfregao na lamparina de lcool durante alguns minutos.
4.Fixou-se o esfregao, inundando a lmina com lcool durante 5 minutos.
5.Secou-se a preparao ao ar, antes de efetuar a colorao de Gram.

Colorao de Gram:
6.Colocou-se a lmina na tina de colorao e inunde o esfregao com a soluo de
violeta-de-genciana, deixando atuar durante 1 minuto.
7.Escorreu-se o corante removendo-o do esfregao, colocando-se a lmina
paralelamente ao fio de gua de uma garrafa de esguicho.
8.Lavou-se com lugol e escorreu-se o corante.
9.Cubriu-se o esfregao com soluo de lugol e deixou-se atuar durante 1 minuto.
10.Escorreu-se o lugol e descorou-se com lcool, deixando cair gota a gota sobre a
preparao, at que no sasse mais corante. Deixou-se atuar durante 30 segundos.
11.Lavou-se cuidadosamente o esfregao, tal como se fez no passo 7.
12.Corou-se o esfregao com a soluo de fucsina durante 2 minutos.
13.Lavou-se cuidadosamente o esfregao tal como se fez nos passos 7 e 11.
14.Secou-se a preparao junto corrente de ar ascendente da chama de uma
lamparina.
15.Observou-se a preparao ao microscpio e registou-se as observaes.
16.Colocou-se uma gota de leo de imerso sobre a preparao e observou-se com
a objectiva de 100x.
RESULTADOS:

Ampliao:

Ampliao:
LEGENDA:

Cor da parede
Cor violeta escura

Forma da bactria
Lactobacillus bulgaricus
Streptococcus thermophilus

Gram
Gram-positiva

DISCUSSO:
Nos resultados que obtivemos podemos observar dois tipos de bactrias que
apenas diferem na morfologia e correspondem acertadamente ao conhecimento
que possumos sobre as bactrias no iogurte. Foi ento passvel de observao dois
tipos de bactrias: uma mais esfrica, com a colorao violeta e de tamanho menor;
e outra com forma de bastonete, longa e de colorao igualmente violeta. Elas so,
respectivamente, streptococcus thermophilus e lactobacillus bulgaricus, porque
ambas so consideradas Gram positivas devido a sua colorao e apresentam
ambas as estruturas dessas bactrias.
A colorao violenta provm do corante violeta-de-genciana que ficou retido na
espessa camada de peptidoglicanos, originando o tom violeta na sua parede.
No caso de se tratarem de bactrias do tipo Gram negativo, estas apresentariam
uma colorao rosada ou avermelhada, proveniente da colorao criada pela
fucsina e da sada que os poros da camada fosfolipdica estimulados pelo lcool
criam ao corante violeta-de-genciana.
Estas bactrias so usadas ambas pela fermentao que realizam ao leite,
originando o iogurte. Bem, a fermentao a base para a produo de muitos
alimentos que consumimos. A fermentao feita por microrganismos anaerbios
facultativos, isto , apenas na ausncia de oxignio que realizam a fermentao.
Nesta podem-se destacar duas fases: a fase da ativao e a fase do rendimento. Na
primeira fase, acontece um processo chamado gliclise. Aqui a molcula de glicose
oxidada e transforma-se em duas molculas de cido pirvico. Aqui uma molcula
de NAD+ reduzido e duas molculas de energia, o ATP, so igualmente reduzidas.
Na segunda fase, a fase de rendimento, quando o cido pirvico descarboxilado,
funcionando com um acetor de eletres, gerando a oxidao do NADH para NAD+.
Os produtos finais podem diferir dependendo do substrato e das bactrias e
gerando por isso diferentes tipos de fermentao.
Vamos agora aplicar os conhecimentos que temos dos diferentes tipos de
fermentao com as bactrias encontradas.
PRODUTOS DA FERMENTAO LTICA
Na fermentao ltica intervm muitas lactobactrias, entre elas ento os
lactobacillus e streptcoccus. Primeiro, o leite sofre uma pasteurizao para eliminar
vrios microrganismos endgenos. Depois estas bactrias usam vrios substratos
como os acares no leite para realizar reaes de fermentao ltica. Este tipo de
fermentao utiliza-se para a produo de iogurtes.
Na fermentao ltica, o piruvato reduzido em cido ltico. A presena de cido
ltico altera o pH do meio, provocando a coagulao do leite.

BIBLIOGRAFIA:
DIAS DA SILVA, Amparo; SANTOS, Maria Terra, Universo da Vida (Biologia,
12 ano).
REIS, Jorge; LEMOS, Paula Preparao para o Exame Nacional 2013
(Biologia e Geologia).
www.en.wikipedia.org/wiki/Gram, visitado no dia 20 de maio.
https://pt.scribd.com/doc/47269425/Observacao-de-bacterias-usando-acoloracao-de-Gram#download, visitado no dia 20 de maio.
http://www.ebah.pt/content/ABAAAAY8sAF/relatorio-coloracao-gram,
visitado no dia 20 de maio.
www.pt.wikipedia.org/wiki/Bactria, visitado no dia 20 de maio.