MICROSATELITES

Universidad del Valle, Facultad de Ciencias Naturales y Exactas

Departamento de Biologa
Cali- Colombia.

Anlisis y discusin de resultados.

La amplificacin con PCR del ADN extrado de los estudiantes del curso
de biologa molecular se muestra en la figura 1 y la tabla 1 (anexos). La
amplificacin se realiz con el sistema THSO1 y D13S317 en donde se
los primeros 12 individuos se sometieron al primer sistema y el resto al
segundo. En la electroforesis se observan distintos patrones de bandas
para cada individuo. Los individuos sometidos al sistema D13S317: los 3
primeros individuos presentan una sola banda de aproximadamente 200
bp, en los siguientes 4, 5 y 6 no hubo ninguna amplificacin y en el resto
de individuos (hasta el 12) se observan mltiples bandas o alelos. Los
individuos restantes (sistema TH01) presentan mltiples bandas, en
donde la amplificacin de ambos sistemas presentan un patrn similar
de bandas en el rango de 150 a 175 bp y de 250 bp hasta 400 bp los
cuales sern explicados en detalle ms adelante.

Figura. 1 Electroforesis en gel de las muestras de ADN amplificadas con

los sistemas THSO1 y D13S317. La lectura de los resultados debe ser de
izquierda a derecha, iniciando con el individuo 1 y terminando con el
individuo 18.

Segn la literatura el sistema TH01 (AATG) y D13S317 (TATC) amplifican

por PCR fragmentos de 146 a 190 bp Gene et al. (1996) y de 157 hasta
201 bp Jin et al. (1997), respectivamente. Estas dos ltimas citas fueron
sacadas de la gua de laboratorio de biologa molecular, Barreto (2015).
Los resultados son consistentes con la longitud de algunos de los
fragmentos amplificados, ya que como se observa en la figura 1 todas
las muestras de los individuos en donde hubo amplificacin presentan
un patrn de bandas correspondiente a dicho rango, puntualmente en el
rango de 150 a 200 bp en donde se observan pequeas variaciones en
la longitud de los fragmentos y en algunos casos (individuos 9, 10 y 11)
se observa la presencia de dos bandas contiguas muy cercanas en
distancia. Todas las muestras amplificadas presentan un patrn de
bandas dentro del rango de 150 bp a 200 bp, que segn la tabla
propuesta en la gua de laboratorio de biologa molecular de la
Universidad del Valle (2005) se esperara un numero secuencias
repetidas en tandem STRs o alelos diferentes para el sistema D13S317
en un rango de entre 5 STRs de TATC o (TATC) 5 y 10 STRs (TATC)10. Esta
primera clasificacin basada en la longitud de los fragmentos nos
permite evidenciar un rasgo comn o semejante entre los individuos
analizados (12 primeros), en donde se observa un patrn similar de
longitud de fragmentos el cual presenta pequeas variaciones
longitudinales que determinan el nmero de alelos (polimorfismos)
presentes en una poblacin, en este caso la poblacin son los individuos
del curso de biologa de molecular y se observan 6 formas allicas
correspondientes al alelo esperado (de entre 157 a 201 bp).
A dems de presentar diferencias en cuanto a la longitud de los
fragmentos algunos individuos (9, 10 y 11) presentan dos bandas
contiguas dentro de este rango, esta caracterstica indica que son
heterocigotos (cada progenitor aporto un alelo de diferente tamao)
para dicho alelo ya que los microsatelites son marcadores codominantes
(herencia mendeliana) en donde pueden distinguirse alelos con distintos
tamaos en un grupo de individuos o poblacin Fortes (2009). Al
observar el gel se observa que el individuo 11 presenta dos alelos de
tamaos muy similares pero no iguales mientras que en el resto se
observa una separacin clara de ambas bandas. No se encontraron
estudios en donde se le adjudique una funcin o lugar dentro de un gen
a este sistema de expresin, el cual solo se estudia o utiliza como un
marcador de referencia para comparar las frecuencias allicas de
individuos en una poblacin. Sin embargo debera determinarse o
adjudicarle, si es que existe, una determinada correlacin de la variacin
allica de este marcador con un determinado fenotipo.

El sistema TH01, utilizado en los individuos del 13 al 18 presentan un

patrn de bandas similar que se sita en el rango de 150 a 175 bp en
donde la variacin en cuanto a longitud es mnima ya que todas las
franjas se sitan en un rango que difiere solo por 25 bp en donde se
estima la presencia de entre 4 a 10 formas allicas con STRs desde
(AATG)4 hasta (AATG)10. A diferencia del sistema anterior, TH01 segn
Lare et al (1993) se encuentra asociado al intron 1 del gen de la
tiroxina hidroxilasa en humanos, enzima implicada en la conversin de
tirosina a dihidroxifenilalanina DOPA (precursor de la dopamina). Esta
similitud en el patrn de bandas evidencia que el intron 1 del gen que
codifica para DOPA presenta una estructura estable o poco polimrfica
dentro de los individuos analizados, quizs esta sea una caracterstica
muy tpica de la poblacin vallecaucana o colombiana.
En los prrafos anteriores se discutieron los resultados consistentes con
las franjas esperadas para la amplificacin, pero en ambos sistemas de
amplificacin se observan bandas que se salen por mucho del rango
esperado de longitud para cada amplificacin. En el sistema D13S317 se
observan fragmentos en el rango de 250 bp hasta 450 bp que es muy
posible que correspondan a la amplificacin de fragmentos exgenos al
DNA alvo porque la diferencia de longitudes es muy grande con relacin
a la mxima esperada (190 bp), por tanto el origen de estas bandas
inesperadas puede ser explicado por la amplificacin de otra regin del
ADN, distinta a la regin alvo de amplificacin ya que los STRs son muy
abundantes en el genoma humano y es posible que los primers hayan
flanqueado una regin distinta a la esperada. La otra posibilidad es que
se est realizando la amplificacin de ADN exgeno al utilizado porque
algunas muestras, como por ejemplo el individuo 7, se extrajo el ADN a
partir de la cavidad bucal, la cual constituye un entorno para diversos
microorganismos cuyo material gentico puede ser el origen de estas
bandas. Si estas diferencias corresponden a amplificaciones propias del
ADN alvo se considera que los individuos 1, 2, 3 y 10 carecen de estas
regiones porque no se observa ninguna banda dentro de este rango y
solo los individuos 7, 8, 9, 11 y 12 presentan alelos con una longitud
dentro de dicho rango, en donde estos individuos mencionados presenta
particularidades en cuanto a la longitud de la secuencia dentro de este
rango ver figura 1.
En los individuos sometidos al sistema TH01 tambin se observa un
patrn de bandas no esperado que se sita en el rango de 250 bp a 350
bp, en donde el individuo 16 es el nico que presenta una banda de 250
bp muy tenue, los individuos 13, 14 y 18 presentan una banda en el
rango de 275 a 300 bp y solo los individuos 13 y 14 presentan una
banda de 325 bp. Estas similitudes y discrepancias representan un

marco gentico de comparacin en donde se pueden establecer

diferencias y similitudes en cuanto a los haplotipos de los individuos
estudiados en donde se concluye que los individuos 13, 14 y 18
presentan alelos similares que no se encuentran presentes en los
individuos 15, 16 y 17.
Otro patrn de bandas atpico o no esperado de bandas se observa en el
rango de 10 a 40 bp en los individuos 7, 8, 9, 13, 14 y 15, como se
observa estos individuos fueron sometidos a los dos sistemas de
amplificacin por lo cual no se pueden hacer comparaciones entre los
individuos 7,8 y 9 con 13, 14 y 15 porque ambos corresponden a STRs
distintos. Al igual que en el anlisis anterior, estas similitudes y
discrepancias entre los individuos tratados con el mismo sistema de
amplificacin pueden representar variaciones haplotipicas entre los
individuos en el caso de que las bandas no sean producto de impurezas
durante la amplificacin.
Preguntas
1. Son secuencias de ADN con tamao va desde dos hasta seis pares
de bases, en las que un fragmento se repite de manera
consecutiva Generalmente se encuentran en zonas no codificantes
del ADN. Son neutros y poseen una alta tasa de mutacin, lo que
los hace muy polimrficos (Armour et al 1994). Su naturaleza es
codominante, es decir, que en cada locus un individuo podra
presentar uno o ms alelos, dependiendo del nmero de juegos de
cromosomas que
posea.
Por
ejemplo,
los
mamiferos
somos diploides, por ende, poseemos dos juegos completos de
cromosomas y por lo tanto para un locus de un microsatlite,
podemos presentar un alelo (si ambos progenitores nos
transmitieron alelos de la misma secuencia y tamao) o dos alelos
(si cada progenitor nos hered un alelo de tamao diferente)
(Aranguren et al. 2005).
2. Al realizar microsatlites, es posible determinar cuando un
individuo tiene condicin de homocigosis si se observa una banda,
presentando condiciones monoallicas, es decir una sola hebra,
teniendo tambin en cuenta la cantidad de pares de bases, de la
misma manera para observar heterocigosis, deben haber
condiciones biallicas. (De Jess et al, 2011)
3. Adems de la gentica forense, a nivel poblacional encontramos
que los microsatelites tiene una aparente variabilidad entre
especies que han migrado y pueden verse la variabilidad gentica
de las poblaciones. Se han realizado estudios en decpodos de
inters econmico con el fin de revisar el nivel de diversidad

gentico entre poblaciones salvajes y cultivadas (Benzie, 2000).

De la misma manera, estudios realizados en lepidptera con el fin
de determinar la variabilidad gentica entre poblaciones de varias
zonas de un cultivo en Chile (Espinoza, 2007). Tambin su uso se
extiende a la asignacin parental. En un estudio en hormigas se
analizaron un total de ocho colonias de Leptothorax acervorum y
encontraron que la progenie proceda de ms de una reina
reproductora (Burke, 1997)
4. Los STRs se emplean en investigacin forense, ya que con muy
poca cantidad de ADN se puede obtener un perfil gentico
adecuado. Esto permite la identificacin de muestras que se
encuentren en escenas de crimen, adems de la generacin de
una base de datos con los perfiles genticos de los sospechosos. A
la hora de comparar dos perfiles genticos, se tiene en cuenta la
probabilidad de que el perfil gentico encontrado en la escena del
crimen provenga de una persona aleatoria de la poblacin y es
especialmente importante en el caso de que cuentes con perfiles
genticos parciales, es decir, que no contengan el mnimo legal de
16 STRs para los seres humanos. Si existe un sospechoso que
queremos comparar con el ADN de la escena del crimen, debemos
estar seguros que las muestras coinciden. La probabilidad de que
los 16 STRs de una muestra coincidan con las de otra es de
1x10^-18,lo cual hace confiable este mtodo de identificacin
(Wagner & Geldermann, 1994).
5. Los microsatelites son repeticiones que se dan a lo largo de todo el
genoma donde se dan cambio de pares de bases en
combinaciones de nucletidos no iguales. La variabilidad de estas
secuencias est dada por la polimerasa que aumenta o disminuye
el nmero de nucletidos. Igualmente se considera que por evento
de recombinacin entre cromosomas homlogos o cromtidas
hermanas (Ruiz, 2014).
6. Vamos a suponer que tenemos un locus polimrfico, el cual ser
caracterizado mediante PCR, tipo microsatlite, prximo a un
locus de una patologa, y estn ntimamente ligado (asumiendo
una frecuencia de recombinacin igual a 0). Si identificamos los
alelos de dicho polimorfismo en cada uno de los miembros de la
familia podremos inferir el alelo del locus de la enfermedad que
porta cada individuo.
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