bioelisa

bioelisa anti-HBc
3000-1102
96 tests
Test de ELISA para la deteccin de anticuerpos totales contra el antgeno core de la hepatitis B (anti-HBc)
en suero o plasma humano.
Sumario
La hepatitis B es una enfermedad causada por una infeccin vrica. A lo largo de la infeccin aparecen varios
marcadores serolgicos entre los cuales est el anti-HBc. El antgeno "core" de la hepatitis B (HBcAg) es un
componente interno del virus de la hepatitis B antignicamente distinto al antgeno de superficie (HBsAg). Este
sistema antgeno-anticuerpo HBcAg/anti-HBc fue descrito por Almeida y col. en 1971.1 El anti-HBc es el primer
anticuerpo detectable en el curso de una hepatitis B aguda y puede persistir durante toda la vida. El anti-HBc suele
detectarse en sangre inmediatamente despus de la deteccin de HBsAg y justo antes de la aparicin de las
manifestaciones clnicas de la enfermedad. En casos de hepatitis B aguda con recuperacin, el anti-HBc es el
nico marcador de la infeccin detectable en el perodo entre la desaparicin de HBsAg y la aparicin de anti-HBs.
La sangre extrada de un individuo durante este perodo puede ser infectiva y se ha sugerido que el cribado para
anti-HBc adems del cribado para HBsAg en donantes, permitira reducir la incidencia de hepatitis B
postransfusionales.4 Por otra parte, la deteccin de anti-HBc es til en exmenes prevacunales ya que slo es
necesario que se vacunen contra la hepatitis B aquellos individuos negativos para anti-HBc. Varios estudios han
demostrado una correlacin entre la presencia de anti-HBc en donaciones sanguneas con la aparicin de
hepatitis no A no B (NANBH o hepatitis C) postransfusional.7,8,9 La implementacin del cribado para anti-HBc en
donantes de sangre podra prevenir muchos de estos casos.
Principio
bioelisa anti-HBc es un mtodo inmunoenzimtico competitivo para la determinacin de anticuerpos contra el
HBcAg en suero humano. El ensayo est basado en la competencia entre anticuerpos humanos presentes en la
muestra y anticuerpos IgG de conejo anti-HBc conjugados con peroxidasa cuando se incuban simultneamente en
los pocillos de una microplaca recubierta con HBcAg recombinante. Despus de la incubacin se efecta un
lavado para eliminar el material no fijado y a continuacin se aade una solucin de sustrato enzimtico y
cromgeno. Esta solucin desarrollar un color azul cuando la muestra sea negativa. El color azul cambia a
amarillo despus de parar la reaccin con cido sulfrico La presencia de anti-HBc en la muestra reduce el
desarrollo de color de forma proporcional a su concentracin.
Componentes
1. MCPL MICROPLACA:
12 x 8 pocillos recubiertos con antgeno recombinante HBcAg (E. coli). Pocillos separables individualmente.
2.

CONJ CONJUGADO:
1 x 6 ml de anticuerpos IgG de conejo anti-HBc conjugados con peroxidasa. Contiene colorante rojo,
protenas estabilizadoras, mertiolato sdico al 0,02% y sulfato de gentamicina al 0,001%. Listo para usar.

3.

WASH SOLN 10x SOLUCIN DE LAVADO:

2 x 50 ml de tampn fosfato concentrado (10x) que contiene Tween 20 al 1% y mertiolato sdico al 0,01%. A
diluir 1/10 con agua destilada o desionizada antes de utilizarse.

4.

SUBS BUF TAMPN SUSTRATO:

1 x 14 ml de tampn citrato-acetato que contiene perxido de hidrgeno.

5.

SOLN TMB CROMGENO:

1 x 1,5 ml de 3,3', 5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB) disuelta en dimetilsulfxido (DMSO).

6.

CONTROL + CONTROL POSITIVO:

1 x 2 ml de anticuerpos IgG de conejo anti-HBc diluidos en tampn fosfato. Contiene protenas estabilizadoras
y sulfato de gentamicina al 0,001%. Listo para usar.

7.

CONTROL CONTROL NEGATIVO:

1 x 3,5 ml de suero humano negativo para todos los marcadores de la hepatitis B. Contiene sulfato de
gentamicina al 0,001%. Listo para usar.

8.

H2SO4 1N SOLUCIN DE PARADA:

1 x 12 ml de cido sulfrico 1N. Listo para usar.
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9.

SEALS LMINAS ADHESIVAS:

Para cubrir la microplaca durante las incubaciones.

10. BAG BOLSA DE PLSTICO:

Para guardar las tiras sin usar.
Precauciones
bioelisa anti-HBc es slo para el diagnstico IN VITRO.
Para uso exclusivo por profesionales.
ATENCIN: MATERIAL DE RIESGO BIOLGICO.
Todo el material de origen humano utilizado en la preparacin de este producto ha sido encontrado negativo a la
presencia de anticuerpos de los virus HIV-1/HIV-2 y HCV, as como a la del antgeno de superficie de la
hepatitis B, utilizando un mtodo comercial autorizado. Sin embargo, dado que ningn mtodo puede ofrecer la
total seguridad de la ausencia de agentes infecciosos, este producto debe manejarse con precaucin:
-

No permitir que los reactivos entren en contacto con la piel o los ojos; si esto ocurre, lavar con abundante
cantidad de agua.
Usar guantes.
No pipetear ningn reactivo con la boca.
No fumar.
Depositar todos los materiales usados en recipientes adecuados para material biocontaminante. Los restos
de muestras, controles, reactivos aspirados y puntas desechables deben recogerse en un recipiente
destinado al efecto y autoclavarse una hora a 121C, o tratarse con hipoclorito sdico a una concentracin
final del 10%, durante 30 minutos. (Los restos que contengan cido deben ser neutralizados antes de aadir
el hipoclorito sdico).
Algunos reactivos de este kit contienen azida sdica como conservante. La azida sdica puede reaccionar
con tuberas y desages de plomo o cobre dando lugar a azidas metlicas altamente explosivas. Al desechar
los restos de reactivos, deje correr agua abundante.

Precauciones de manejo:
-

Ajustar el lavador al tipo de placa utilizado (fondo plano), para realizar un buen lavado.
No mezclar reactivos procedentes de diferentes lotes.
No usar los reactivos una vez hayan caducado.
Deben extremarse las precauciones para evitar contaminaciones microbianas y contaminacin cruzada entre
los reactivos.
Utilizar una nueva punta desechable para pipetear cada muestra o reactivo.
Es muy importante preparar la solucin de sustrato-TMB justo 5-10 minutos antes de ser empleada.
Mantenerla en un recipiente bien tapado y al abrigo de la luz.
Restos de jabones y/o agentes oxidantes en los recipientes utilizados para la preparacin de la solucin
sustrato-TMB, pueden interferir en la reaccin. En caso de que se utilicen recipientes de vidrio, es
conveniente lavarlos con cido sulfrico o clorhdrico 1N, enjuagarlos bien con agua destilada y secarlos
antes de usarlos. Usar preferiblemente material plstico desechable.

Conservacin y estabilidad
Los componentes permanecern inalterados hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, si se conservan
entre 2-8C. La bolsa que contiene la microplaca debe llevarse a temperatura ambiente antes de abrirla para evitar
condensacin en los pocillos. Una vez abierta la bolsa, la microplaca es estable por 3 meses guardada a 2-8C en
la bolsa de plstico bien cerrada, con la bolsita de silicagel. La solucin de lavado, una vez diluida, es estable
durante dos semanas si se conserva entre 2-8C. Guardar el cromgeno al abrigo de la luz. La solucin sustratoTMB una vez preparada no es estable, por lo que se deben seguir estrictamente las indicaciones para su
utilizacin.
Material necesario no incluido
Agua destilada o desionizada.
Pipetas multicanal y micropipetas (50 l, 100 l) y puntas desechables.
Incubador a 37C 1C.
Cronmetro.
Lector de microplacas con filtro de 450 nm. Recomendable filtro de referencia de 620 o 630 nm.
Sistema de lavado manual o automtico.

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Recoleccin de la muestra
Usar suero fresco o plasma (citrato/EDTA). Otros anticoagulantes deben ser comprobados antes de utilizarse. Las
muestras pueden ser conservadas durante 3 das entre 2-8C. Si es por un perodo de tiempo ms largo las
muestras deben ser congeladas (-20C). Debe evitarse congelar y descongelar las muestras repetidamente.
Partculas en suspensin deben eliminarse por centrifugacin. Los sueros o plasmas no deben ser inactivados por
calor, ya que puede conducir a resultados incorrectos. No utilizar muestras que contengan azida sdica.
Procesamiento automtico
Esta prueba permite su uso de modo automtico o semi-automtico en diferentes instrumentos. Es muy importante
validar cualquier sistema automtico para demostrar que los resultados obtenidos para las muestras son
equivalentes a los obtenidos emplendose el ensayo manual. Se recomienda que el usuario valide peridicamente
el instrumento. Si encuentra cualquier dificultad en la programacin y ajuste de los procesadores automticos de
Biokit, por favor contacte con su distribuidor.
PROCEDIMIENTO (Ver esquema del procedimiento)
Operaciones previas
Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente (20-25C) antes de empezar el ensayo.
Los reactivos lquidos deben homogeneizarse suavemente antes de usarlos.
Diluir la solucin de lavado concentrada 1/10 con agua destilada o desionizada. Para una placa mezclar 50 ml de
solucin de lavado concentrada con 450 ml de agua. En caso de no utilizar una placa completa preparar el
volumen proporcional de solucin.
Realizacin de la prueba
1. Utilizar solamente el nmero de tiras necesario para el test. Reservar 7 pocillos para blanco y controles.
Transferir 50 l de control negativo a 4 pocillos y 50 l de control positivo a 2 pocillos. Dejar vaco un pocillo
para el blanco de sustrato.
2.

Transferir 50 l de cada una de las muestras a analizar a los pocillos correspondientes.

3.

Aadir 50 l de conjugado a cada pocillo, a excepcin del pocillo para el blanco de sustrato.

4.

Cubrir la placa con una lmina adhesiva, agitarla suavemente e incubar durante 1 hora a 37C.

5.

Durante los ltimos 5-10 minutos de esta incubacin, preparar la solucin de sustrato-cromgeno. Para una
placa aadir 280 l de la solucin de cromgeno (TMB) a un vial de tampn sustrato (14 ml) y mezclar bien.
Si no se utiliza toda la placa, preparar la cantidad necesaria segn indica la tabla 1. La solucin final debe ser
incolora, descartar en caso de que se vuelva azul.
TABLA 1
Tiras requeridas
Tampn sustrato ml
Cromgeno (TMB) l

1
1,0
20

2
2,0
40

4
4,0
80

6
6,0
120

8
8,0
160

10
10,0
200

12
12,0
240

NOTA: El TMB est disuelto en DMSO. Dado que la temperatura de fusin del DMSO es de 18C, el cromgeno
debe alcanzar una temperatura de 20-25C y agitarse bien antes de usarlo. Es normal que el cromgeno
presente un color amarillento.
6.

Desechar la lmina adhesiva. Aspirar el contenido de los pocillos y llenarlos completamente

(aproximadamente 350 l) con solucin de lavado diluida. Repetir el proceso de aspiracin lavado 3 veces
ms. Asegurarse de que cada columna de pocillos est en remojo al menos 15 segundos antes del nuevo
ciclo de aspiracin. Despus del ltimo lavado golpear la placa invertida sobre un papel absorbente para
eliminar cualquier exceso de lquido en los pocillos.

7.

Aadir 100 l de sustrato-TMB a todos los pocillos, incluso el blanco.

8.

Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente (20-25C).

9.

Aadir 100 l de solucin de parada a cada pocillo, guardando la misma secuencia y con los mismos
intervalos observados en la adicin del sustrato-TMB.

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10. Ajustar el cero del lector con el pocillo del blanco a 450 nm y leer la absorbancia de cada uno de los pocillos
en el plazo mximo de 30 minutos. Se recomienda hacer lectura bicromtica utilizando filtro de referencia de
620 - 630 nm.
Control de calidad
Los resultados de un ensayo son vlidos si se cumplen los siguientes criterios:
1.

Blanco del sustrato: el valor de absorbancia debe ser inferior o igual a 0,100.

2.

Control negativo: cada uno de los valores individuales de absorbancia no debe variar ms del 20% de la
media de los cuatro valores. La media de las absorbancias deber ser igual o mayor que 0,600 despus de
restar el blanco.

3.

Control positivo: la media de las absorbancias debe ser igual o menor que 0,100 despus de restar el blanco.

Resultados
1. Calcular el valor umbral sumando el valor promedio de absorbancias del control negativo y el del control
positivo y multiplicando el resultado de esta suma por 0,4.
Valor umbral = (CNx + CPx) x 0,4
2.

Dividir la absorbancia de la muestra por el valor umbral.

Positivo:
Negativo:
Dudoso:

ratio absorbancia/valor umbral 1,0

ratio absorbancia/valor umbral > 1,1
ratio absorbancia/valor umbral > 1,0 1,1

Interpretacin de los resultados

Un resultado positivo para anti-HBc significa que el paciente ha contrado la hepatitis B alguna vez previamente.
No es un marcador de inmunidad. Un resultado negativo significa que la muestra analizada no contiene anti-HBc o
lo contiene por debajo del lmite de deteccin del kit. Para evaluar la situacin de un paciente respecto a la
hepatitis B deben practicarse los tests para los dems marcadores serolgicos de la hepatitis B.
Limitaciones del procedimiento
Como ocurre con otras pruebas serolgicas, los resultados obtenidos con el bioelisa anti-HBc sirven solamente
como ayuda al diagnstico y deben interpretarse teniendo en cuenta la historia clnica del paciente.
Para el correcto funcionamiento del kit debe seguirse estrictamente las instrucciones descritas. Cualquier
desviacin puede dar origen a resultados aberrantes.
Muestras con una concentracin de anticuerpos anti-HBc inferior a 1,5 U/ml (PEI) pueden no detectarse.
Todas las muestras positivas o dudosas se deberan repetir y probarse para otros marcadores serolgicos del
HBV.
Resultados esperados
El anticuerpo anti-HBc es el marcador ms frecuente de infeccin por el virus de la hepatitis B y se detecta tanto
en la infeccin aguda como en la crnica y en la infeccin pasada con recuperacin. La prevalencia de anti-HBc y
de otros marcadores de la hepatitis B vara ampliamente en el mundo, de alta (70-90%, ej., frica, Asia y Pacfico
Oeste) a intermediaria (20-55%, ej., sur y este Europeo) y baja (4-6%, ej., Europa occidental, Amrica del Norte y
partes de Amrica del Sur). Diferentes estudios han descrito una prevalencia del 0,53 al 2,16% en donantes de
sangre del Reino Unido.2,5,6
Caractersticas funcionales
Sensibilidad analtica
El lmite de deteccin del bioelisa anti-HBc es 1,5 unidad/ml utilizando el suero de referencia anti-HBc del Paul
Ehrlich Institute (PEI), Alemania.

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Evaluaciones
El funcionamiento del bioelisa anti-HBc se evalu en estudios comparativos con otros ensayos comerciales.
-

En una evaluacin interna se probaron 233 muestras que eran positivas de anti-HBc con otro ensayo comercial
(76 de ellas eran tambin positivas de HBsAg). 227 presentaron resultado positivo (incluso las 76 positivas de
HBsAg) y 6 presentaron resultado negativo. Las 6 muestras discrepantes se probaron con un tercero ensayo
comercial y los resultados fueron tambin negativos.

En una evaluacin externa en comparacin con otro ensayo comercial, se probaron 175 muestras. 31 fueron
positivas y 141 fueron negativas con ambos ensayos. Se obtuvo una concordancia global del 98,3% (172/175).
Eliminndose 2 muestras dudosas de los clculos, la sensibilidad relativa fue del 100% (31/31) y la
especificidad relativa fue del 99,2%.

En otra evaluacin externa, se probaron 251 muestras positivas de HBsAg. 247 (98,4%) fueron reactivas con el
bioelisa anti-HBc, de las cuales 245 fueron reactivas tambin con el mtodo alternativo utilizado en rutina para
anti-HBc. 4 muestras fueron anti-HBc negativas con el bioelisa y con el mtodo en rutina y 2 fueron positivas
solamente con el bioelisa. Por tanto, la sensibilidad relativa del bioelisa fue del 100% (245/245) y la
concordancia global entre ambos mtodos fue del 99,2% (249/251).

En una otra evaluacin externa, 5058 muestras consecutivas de donantes de sangre habituales se probaron en
paralelo con el bioelisa y con el mtodo en rutina. De estas muestras, 6 fueron reactivas tanto con el bioelisa
como con el mtodo en rutina, 5 de las cuales se confirmaron 5 como de infeccin pasada despus de
realizarse tests adicionales para otros marcadores de HBV. mientras que 1 era positiva solamente para
anti-HBc. Otras 3 muestras fueron repetidamente positivas con el bioelisa y negativas con el test en rutina
siendo 2 de ellas consideradas como falsamente positivas y 1 de resultado inconclusivo despus de realizar
tests adicionales. Considerando como positivas verdaderas solamente las muestras confirmadas como de
infeccin pasada, la especificidad encontrada fue del 99,92% (5049/5053).

Otra evaluacin externa de sensibilidad a punto final y funcionamiento comparando con otros ensayos
comerciales se encuentra en la bibliografa.3

Precisin
Reproducibilidad intra-ensayo:
Los coeficientes de variacin obtenidos para los valores de absorbancia de 48 replicados de una muestra negativa
fueron del 4,34%, 4,19% e 3,66% en tres lotes estudiados.
Reproducibilidad inter-ensayo:
Tres muestras negativas se probaron en 3 ensayos diferentes. Los coeficientes de variacin obtenidos para los
ratios absorbancia/valor umbral de las 3 muestras fueron del 4,9%, 7,0% y 8,2% respectivamente.
Interferencias
Para estudiar posibles interferencias, se probaron muestras con un riesgo potencial de producir reacciones
cruzadas, tales como sueros positivos de factor reumatoide (RF), anticuerpos anti-nucleares (ANA), anticuerpos
heterfilos, IgM anti-HAV, anti-E. coli y de mujeres embarazadas. No se observaron evidencias de interferencia.

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bioelisa: Gua de problemas
Problema

Posibles causas

Solucin

1. Controles fuera de
validacin.

1a. Temperatura, incubacin

o pipeteo incorrecto.
1b. Preparacin incorrecta de
reactivos, error en las
diluciones. Reactivos no
mezclados
correctamente.
1c. Contaminacin cruzada
entre controles.

Comprobar procedimiento.
Repetir el ensayo.
Comprobar procedimiento.
Repetir el ensayo.

1d.

1e.

1f.

1g.

2. Sin color o poco color al

final del ensayo.

2a.

2b.

2c.

2d.

Pipetear cuidadosamente. No
intercambiar los tapones de
los viales. Repetir el ensayo.
Filtro de lectura
Comprobar que el filtro de
incorrecto.
lectura sea de 450 nm. Si no
se usa filtro de referencia de
620 o 630 nm, las
absorbancias aumentan
aproximadamente
50 miliunidades.
Interferencia en el camino Comprobar el lector. Limpiar o
ptico.
secar el fondo de los pocillos.
Comprobar que no haya
burbujas de aire. Repetir la
lectura.
Se han utilizado
No utilizar componentes de
componentes de lotes
lotes diferentes puesto que
diferentes.
estn ajustados para cada
lote en particular.
Reactivos caducados.
Comprobar la caducidad del
kit. No utilizar un kit
caducado.
Uno o ms reactivos no
Comprobar el procedimiento.
aadidos o aadidos en
Repetir el ensayo.
secuencia equivocada.
Conjugado inactivo:
Comprobar si ha habido
conservacin incorrecta. contaminacin, comprobar el
procedimiento. Repetir el
ensayo.
Microplaca inactiva:
Mantener siempre las tiras no
conservacin incorrecta. utilizadas en la bolsa minigrip,
bien cerrada, con el
desecante dentro. Repetir el
ensayo.
Sustrato inactivo:
Utilizar siempre una dilucin
conservacin o dilucin
fresca de TMB en tampn
incorrecta, el contenedor sustrato. Usar contenedores
utilizado afecta la
desechables o lavados con
estabilidad del sustrato,
cido o etanol y enjuagados
contaminacin cruzada
con agua desionizada.
con la solucin de
Comprobar el procedimiento.
parada.
Repetir el ensayo.

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bioelisa: Gua de problemas
Problema

Posibles causas

Solucin

3. Demasiado color en
todos los pocillos de la
microplaca.

3a. Sustrato contaminado,

oxidado o preparado
incorrectamente.

Comprobar que el sustrato

preparado sea incoloro,
descrtelo si est azul.
Asegrese que el TMB est
completamente lquido antes
de utilizarlo. Asegurar la
correcta mezcla del TMB en
el tampn sustrato. Utilizar
viales o contenedores
desechables o lavados con
solucin cida o etanol.
Repetir el ensayo.
Comprobar contaminacin
(aspecto turbio). Comprobar
diluciones. Repetir el ensayo.
Comprobar la calidad del
agua destilada/desionizada
utilizada para preparar la
dilucin. Repetir el ensayo.
Comprobar el lavador. Llenar
los pocillos hasta el tope y
aspirar completamente.
Incrementar el nmero de
ciclos de lavado. Golpear la
placa invertida contra papel
absorbente. Repetir el
ensayo.
Utilizar slo la solucin de
lavado de biokit.

3b. Reactivos contaminados

o preparados
incorrectamente.
3c. Solucin de lavado (1x)
contaminada.

3d. Lavado insuficiente o no

consistente: llenado o
aspiracin insuficiente o
no uniforme, nmero de
ciclos de lavado
insuficiente. Lavador
contaminado.
3e. Se ha utilizado solucin
de lavado de otro
fabricante.
4. Reproducibilidad pobre o 4a. Problemas de lavado.
elevado nmero de
4b. Pipetas mal calibradas o
muestras reactivas que
puntas mal encajadas.
no se repiten.
Tcnica de pipeteo
incorrecta.
4c.

4d.

4e.

4f.

Ver apartados 3c, 3d, 3e.

Utilizar pipetas calibradas con
puntas bien ajustadas.
Pipetear cuidadosamente sin
burbujas ni salpicaduras.
Repetir el ensayo.
Reactivos y muestra no a Atemperar muestras y
temperatura ambiente o
reactivos y mezclarlos bien
no correctamente
antes de utilizarlos.
mezclados antes de usar.
Corrientes de aire sobre
Mantener la microplaca
la microplaca durante las protegida de las corrientes de
incubaciones.
aire.
Demasiado tiempo en la Desarrollar una tcnica
adicin de muestras y/o
uniforme y consistente.
reactivos. Inconsistencia
en los intervalos de
tiempo, burbujas de aire.
Interferencia en el camino Ver 1e.
ptico.

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