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Dissertao apresentada
Universidade Federal de Viosa,
como parte das exigncias do
Programa de Ps-Graduao em
Biologia Celular e Estrutural, para
obteno do ttulo de Magister
Scientiae.
VIOSA
MINAS GERAIS BRASIL
2011
iii
Dissertao apresentada
Universidade Federal de Viosa,
como parte das exigncias do
Programa de Ps-Graduao em
Biologia Celular e Estrutural, para
obteno do ttulo de Magister
Scientiae.
______________________________
Maria do Carmo Gouveia Peluzio
______________________________
Sirlene Souza Rodrigues Sartori
___________________________________
Izabel Regina dos Santos Costa Maldonado
(Orientadora)
ii
iii
AGRADECIMENTOS
Dai graas ao Senhor porque ele bom, eterna sua misericrdia (Sal 117, 29).
Aos meus pais, Aldejair e Creuza, e ao meu irmo, Willian, por fazerem tudo possvel.
Pelo apoio incondicional e pela torcida sem fim. Amo vocs!
A minha famlia que, mesmo com a distncia estiveram sempre torcendo. Grata pelas
oraes e pelo incentivo.
A Universidade Federal de Viosa pela oportunidade.
A CAPES pela concesso da bolsa de estudos do Programa REUNI.
A Prof Izabel Regina dos Santos Costa Maldonado pelo exemplo de profissionalismo,
pela orientao e confiana depositada em mim.
A Prof Maria do Carmo Gouveia Peluzio (DNS/UFV) pelo profissionalismo,
contribuio e por ceder gentilmente os animais utilizados neste estudo e o laboratrio
para as anlises.
Ao Prof Eduardo Euclydes de Lima e Borges (DEF/UFV) pela colaborao e por
disponibilizar toda a estrutura para a extrao do leo.
A Prof Luzimar Campos da Silva (DBV/UFV) por disponibilizar o uso do
fotomicroscpio.
A Prof Ana Vldia Bandeira Moreira (DNS/UFV) por disponibilizar o uso do
cromatgrafo gasoso e pela valiosa ajuda nas anlises.
Ao Prof. Clvis Andrade Neves, chefe do Departamento de Biologia Geral, que me deu
grande apoio no incio da realizao deste trabalho, e que agora na etapa final aceitou o
convite para ser membro suplente na banca examinadora deste trabalho. Grata pela
disponibilidade e ajuda em todo momento em que foi procurado.
As professoras Maria do Carmo Gouveia Peluzio e Sirlene Souza Rodrigues Sartori por
aceitarem fazer parte da banca examinadora deste trabalho.
Ao professor Srgio Luis Pinto da Matta (Super Srgio!) por aceitar fazer parte da banca
examinadora deste trabalho como professor suplente. Grata ainda pelo incentivo,
recepo e ajuda ao longo de todos estes anos.
Aos professores do curso de Ps-Graduao em Biologia Celular e Estrutural pelo
exemplo de profissionalismo, pela disponibilidade em ajudar e pelo aprendizado ao
longo do curso.
Aos Departamentos de Biologia Geral, Engenharia Florestal, Nutrio e Sade por
cederem o espao e materiais necessrios para o desenvolvimento do trabalho.
Aos camundongos.
iv
Aos amigos Cynthia, Eduardo, Kyvia, Marli, Suellen e Vitor, e as professoras Izabel e
Maria do Carmo pela ajuda no dia do sacrifcio.
Ao Alex de Freitas Bhering Cardoso, tcnico do Laboratrio de Biologia Estrutural e
Histofisiologia Reprodutiva e Digestiva. Grata por toda a ajuda e pela pacincia!
A Elizabeth Alves Pena, a Beth, secretria do curso de Ps-Graduao em Biologia
Celular e Estrutural. Grata por toda a ajuda e pacincia e por no nos deixar ficar
perdidos em meio a tantas datas importantes e prazos.
Ao Eduardo Frana Castro pela parceria e companhia. Pelas caronas e pela ajuda ao
longo dos ltimos 12 meses.
Ao Jos Mauro Ferreira (DEF/UFV), tcnico do Laboratrio de Sementes, pelas
sugestes e auxlio na extrao do leo.
Ao Sr. Toninho, tcnico do Laboratrio de Bioqumica Nutricional por toda a ajuda e
disponibilidade.
Ao aluno de iniciao cientfica Vtor Maurcio pela ajuda na manuteno dos animais.
A aluna de iniciao cientfica Camila pela ajuda com as anlises no cromatgrafo
gasoso.
As mestres Cynthia e Natlia pela ajuda na extrao dos lipdeos e a Damiana, sempre
disponvel para esclarecer as dvidas.
A Suellen pela ajuda nas anlises histomorfomtricas.
A Daiane pelos inmeros momentos em que me socorreu no laboratrio!
Aos amigos do Laboratrio de Biologia Estrutural e Histofisiologia Reprodutiva e
Digestiva, pelos momentos de distrao, trabalho, sufoco e ajuda!
Aos amigos do curso de Ps-Graduao em Biologia Celular e Estrutural, grata pela
companhia e pelos bons momentos.
As amigas Daiane, Marli e Suellen! Obrigada por tudo!
As companheiras de repblica, Carla, Nathalia e Renata, por contribuir para que Viosa
se tornasse um segundo lar.
Aos Biodesagradveis! Por todos os momentos maravilhosos e divertidos ao longo
destes anos em Viosa.
Aos amigos que Viosa me permitiu conhecer.
As amigas Izabela e Renata pelo incentivo, pelas risadas, pela companhia, torcida e
presena.
A todos que direta ou indiretamente participaram para que tudo fosse possvel. O meu
sincero... Muito Obrigada!
v
BIOGRAFIA
vi
SUMRIO
LISTA DE ABREVIATURAS____________________________________________x
LISTA DE FIGURAS__________________________________________________xi
LISTA DE TABELAS _________________________________________________xii
RESUMO___________________________________________________________xiii
ABSTRACT_________________________________________________________xiv
Introduo ___________________________________________________________ 1
Referencial terico ____________________________________________________ 3
1.
2.
1.2.
2.2.
Hidrodestilao _________________________________________________ 6
2.3.
2.4.
3.
As lipoprotenas ____________________________________________________ 7
4.
5.
6.
7.
6.1.
6.2.
Objetivos ___________________________________________________________ 20
1.
2.
Metodologia _________________________________________________________ 21
1.
2.
Sementes _____________________________________________________ 21
1.2.
1.3.
3.
4.
4.2.
4.3.
4.4.
Eutansia ____________________________________________________ 25
5.
5.2.
5.3.
5.4.
6.
8.
Resultados __________________________________________________________ 30
Extrao e avaliao do leo das sementes de sacha kiruma ____________________ 30
1.
2.
3.
2.
3.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
2.
3.
4.
4.
Concluses __________________________________________________________ 54
Anexos _____________________________________________________________ 55
Preparo de Solues __________________________________________________ 58
Referncias __________________________________________________________ 61
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
AB+-Clula caliciforme marcada apenas pelo Azul de Alcian ph2,5, produtoras de
mucina cida no sulfatada ou sialomucina, caracterizada pela colorao azulada
AB+PAS+-Clula caliciforme marcada simultaneamente pelo Azul de Alcian e Reativo
de Schiff, produz e secreta ambos tipos de mucina, neutra e cida, caracterizada por
uma colorao que varia do prpura ao violeta
ACF- Grupo com 5 animais Apo-E -/-; dieta controle, fmeas
ACM- Grupo com 5 animais Apo-E -/-; dieta controle, machos
Apo-E- Apoprotena E
Apo-E -/-- Camundondo da linhagem BlackC57/6 knockout para o gene da
apolipoprotena E
ATF- Grupo com 5 animais Apo-E -/-; dieta tratada com o leo de sacha kiruma, fmeas
ATM- Grupo com 5 animais Apo-E -/-; dieta tratada com o leo de sacha kiruma,
machos
BCF- Grupo com 5 animais BlackC57/6 selvagem; dieta controle, fmeas
BCM- Grupo com 5 animais BlackC57/6 selvagem; dieta controle, machos
BlackC57/6- Camundongo da linhagem BlackC57/6 normal
BTF- Grupo com 5 animais BlackC57/6 selvagem; dieta tratada com o leo de sacha
kiruma, fmeas
BTM- Grupo com 5 animais BlackC57/6 selvagem; dieta tratada com o leo de sacha
kiruma,, machos
HDL- Lipoprotenas de densidade alta
IDL- Lipoprotenas de densidade intermediria
LDL- Lipoprotenas de densidade baixa
PAS+-Clula caliciforme marcada apenas pelo Reativo de Schiff, produtoras de mucina
neutra, caracterizada pela colorao azulada
QM- Quilomcrons
VLDL- Lipoprotenas de densidade muito baixa
-3- mega trs, famlia de cidos graxos essenciais
-6- mega seis, famlia de cidos graxos essenciais
-9- mega nove, famlia de cidos graxos
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Planta de sacha kiruma com frutos imaturos e maduros - (Janeiro de 2010). ... 4
Figura 2: Semente de sacha kiruma - (Setembro de 2011). .............................................. 4
Figura 3: Atuao da Apo-E. Adaptado de Pendse et al. (2009). ..................................... 8
Figura 4: Estrutura qumica dos principais cidos graxos da famlia -3 (MOREIRA,
2006). ................................................................................................................................ 9
Figura 5: Metabolismo dos cidos graxos das famlias -3 (n-3) e -6 (n-6) (Adaptado
de PERINI et al., 2010). .................................................................................................. 10
Figura 6: Desenho esquemtico da organizao da parede do tudo digestivo (Adaptado
de GARTNER & HIATT, 2002). .................................................................................... 12
Figura 7: Diagrama esquemtico da mucosa, vilos, criptas de Lieberkhn, e
componentes celulares do intestino delgado de humanos (Adaptado de GARTNER &
HIATT, 2002). ................................................................................................................ 15
Figura 8: Diagrama esquemtico da cripta de Lieberkhn (a), do pice do vilo (b) e dos
componentes celulares do intestino delgado de humanos (Adaptado de JUNQUEIRA &
CARNEIRO, 2008). ........................................................................................................ 15
Figura 9: Absoro de lipdeos no intestino delgado (Adaptado de GARTNER &
HIATT, 2002). ................................................................................................................ 17
Figura 10: Desenho esquemtico do fgado.(Adaptado de GARTNER & HIATT, 2002).
......................................................................................................................................... 18
Figura 11: Consumo alimentar dos grupos tratados, controles e consumo geral ao longo
do tratamento. .................................................................................................................. 33
Figura 12: Evoluo ponderal dos camundongos ao longo das quinzenas (Q). ............. 34
Figura 13: Seco transversal do duodeno com destaque para o vilo, cripta, mucosa e
tnica muscular Azul de Toluidina Borato de Sdio 1%.. ............................................. 40
Figura 14: Seco transversal do duodeno. Tcnica combinada de Azul de Alcian e
PAS. ................................................................................................................................ 41
Figura 15: Seces transversais do duodeno representando os oito tratamentos. Azul de
Toluidina Borato de Sdio 1%. Barra: 100m. .............................................................. 42
Figura 16: Seces transversais do duodeno representando os oito tratamentos. Tcnica
combinada de Azul de Alcian e PAS. Barra: 50m. ....................................................... 43
Figura 17: Seco transversal do fgado. Hematoxilina- Eosina. Barra: 50m. ............. 46
Figura 18: Seces do fgado representando os oito tratamentos. Hematoxilina- Eosina.
Barra: 50m. ................................................................................................................... 47
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Composio em cidos graxos do leo de sacha kiruma extrado com hexano,
segundo Hamaker et al. (1992) ......................................................................................... 5
Tabela 2: Caracterizao dos grupos experimentais. ...................................................... 24
Tabela 3: Formulao das dietas controle e experimental. Em acordo com
determinaes AIN-93G formulada para roedores em fase de crescimento, gestao e
lactao. ........................................................................................................................... 25
Tabela 4: Combinao de grupos utilizada para a interpretao dos resultados. ............ 29
Tabela 5: Rendimento das seis baterias de extrao do leo de sacha kiruma. .............. 30
Tabela 6: cidos graxos (% de rea) do leo extrado das sementes de sacha kiruma. . 31
Tabela 7: Principais cidos graxos encontrados no leo de sacha kiruma e a relao
poliinsaturados/saturados. ............................................................................................... 32
Tabela 8: Dados de massa corporal, consumo alimentar e ndice hepatossomtico. ...... 35
Tabela 9: Dados da morfometria dos vilos do duodeno. ................................................. 36
Tabela 10: Morfometria da superfcie de absoro do duodeno. .................................... 37
Tabela 11: Morfometria da mucosa do duodeno............................................................. 37
Tabela 12: Morfometria das camadas musculares do duodeno. ..................................... 38
Tabela 13: Morfometria da cripta de Lieberkhn no duodeno. ...................................... 38
Tabela 14: Frequncia de entercitos e linfcitos intraepiteliais no duodeno. ............... 39
Tabela 15: Tipos celulares secretores e clula de Paneth por mm de mucosa no
duodeno. .......................................................................................................................... 39
Tabela 16: Quantificao dos componentes celulares no fgado. ................................... 44
Tabela 17: Freqncia dos componentes intercelulares no fgado.................................. 45
Tabela 18: Dimetros nuclear e celular dos hepatcitos. ................................................ 45
xii
RESUMO
THOMAZINI, Bruna Fontana, M.Sc., Universidade Federal de Viosa, Setembro de
2011. Avaliao do leo de sacha kiruma (Plukenetia volubilis L.) no duodeno e
fgado de camundongos C57BL/6 e APO E-/-. Orientadora: Izabel Regina dos Santos
Costa Maldonado.
Sacha kiruma (Plukenetia volubilis L.) uma planta oleaginosa nativa da Amaznia
Peruana. O leo extrado de suas sementes muito rico em cidos graxos
poliinsaturados, diretamente relacionados preveno de doenas cardiovasculares,
dentre elas, a aterosclerose. Para seu transporte, os lipdeos formam complexos com
protenas, as apoprotenas. A apoprotena E (Apo-E) sintetizada principalmente no
fgado e no intestino e se relaciona com a absoro celular de quilomcrons ricos em
triglicerdeos remanescentes e VLDL. A produo de animais knockout para o gene da
apoprotena E apresenta como principal caracterstica o rpido e espontneo
aparecimento de leses aterosclerticas nas artrias, similares quelas encontradas em
humanos. O intestino delgado o stio de absoro de componentes da dieta, dentre eles
os lipdeos, enquanto o fgado apresenta-se como o stio de modificao e/ou
armazenamento de compostos. Os objetivos foram extrair o leo de sementes de sacha
kiruma por meio de mtodo qumico (hexano), determinar o perfil de cidos graxos e
avaliar os efeitos desse leo na estrutura do duodeno e fgado de camundongos Apo-E /- e selvagens BlackC56/7. Os resultados da avaliao do leo extrado para este estudo
indica percentual de cidos graxos similar ao citado na literatura. Entre os tratamentos
no foram encontradas alteraes no duodeno com relao superfcie de absoro,
morfometria de cripta e espessura das camadas musculares e da mucosa. Com relao
altura do epitlio absortivo, os animais knockout do grupo controle apresentaram maior
mdia se comparados com os grupos knockout tratados com o leo. A freqncia de
entercitos, linfcitos, clulas caliciformes e clulas de Paneth no sofreram alteraes
devido ao tratamento proposto. Em relao s clulas caliciformes AB+PAS+, foi
observada maior freqncia nos grupos selvagens tratados com leo de sacha kiruma em
relao aos controles. No fgado tambm no foram encontradas diferenas devido ao
tratamento na frequncia dos componentes hepticos, nem na relao de dimetro do
citoplasma/ dimetro do ncleo dos hepatcitos. Com isso, concluiu-se que o mtodo de
extrao com hexano mostrou ser eficiente na extrao de leo das sementes de sacha
kiruma. Este leo apresentou composio lipdica similar daquela descrita na literatura,
mantendo suas propriedades teraputicas. O ensaio no mostrou indcios de que a dieta
com o leo de sacha kiruma possa ter alterado a estrutura histolgica no duodeno ou
fgado dos camundongos.
xiii
ABSTRACT
THOMAZINI, Bruna Fontana, M.Sc., Universidade Federal de Viosa. September,
2011. Evaluation of the effects of sacha kiruma oil (Plukenetia volubilis L.) in the
duodenum and liver in C57BL/6 and APO E -/- mice. Advisor: Izabel Regina dos
Santos Costa Maldonado.
Sacha kiruma (Plukenetia volubilis L.) is an oleaginous native plant of the Peruvian
Amazon. The oil extracted from its seeds is very rich in polyunsaturated fatty acids,
directly related to the prevention of cardiovascular diseases, among them, the
atherosclerosis. For transportation, lipids form complexes with proteins, the
apoproteins. The apoprotein E (Apo E) is mainly synthesized in the liver and intestine
and is related to the cellular uptake of triglyceride-rich chylomicrons and VLDL
remmants. The production of knockout animals for the apoprotein E gene presents as
main characteristic the rapid and spontaneous development of atherosclerosis lesions in
the arteries, similar to those found in humans. The small intestine is the site of
absorption of dietary components, including lipids, whiles the liver is the site of
modification and/or storage of compounds. The objectives were extract sacha kiruma
seedss oil by chemical method (hexane) and determine the acid profile. Also evaluate
the histological structure of the duodenum and the liver of Apo E-/- mice and wild
BlackC57/6 after the treatment with this oil. The evaluation of the oil extracted in this
study indicates the percentage of polyunsaturated fatty acids similar to that found in the
literature. There were no histological changes due the treatment in the duodenum, with
regard to the surface absorption, morphology of the crypt and the thickness of muscle
layers and mucosa. With respect to the height of the absorptive epithelium, the control
animals have high average compared with animals treated with the oil. The frequency of
enterocytes, lymphocytes, goblet cells and Paneth cells did not change due to the
proposal treatment. In relation to the goblet cell AB+PAS+ was observed more
frequently in the groups of BlackC57/6 mice treated with the sacha kirumas oil
compared to control groups. In the liver were not found differences due to the treatment
in the frequency of liver components or the ratio cytoplasm/ nucleus of the liver cells.
The solvent extraction method was efficient in extracting oil from sacha kirumas seeds.
The oil showed similar lipid composition from the described in the literature. The test
showed no evidence that the diet with sacha kiruma oil may have altered the histological
structure of the duodenum and liver of mice Apo E -/- or wild BlackC57/6.
xiv
Introduo
Sacha kiruma (Plukenetia volubilis Linneo), uma planta nativa do Peru, que foi
descrita em 1753 pelo naturalista Linneo. A espcie tambm ocorre no norte do Brasil e
em outros pases que formam o complexo amaznico, sendo conhecida por vrias
denominaes, dentre elas, sacha inchi, mani do inca, amendoim selvagem, amndoalopo, amendoim inca, amendoim da montanha e amui (CIED, 2007; GUILLN et al.,
2003; HUAMAN & FLORES, 2009). De acordo com Huaman & Flores (2009) o leo
extrado das sementes de sacha kiruma tem elevada concentrao de cidos graxos
poliinsaturados: 48,60% de cido -linolnico (-3, mega 3); 36,80% de cido linolico (-6, mega 6) e 8,28% de cido olico (-9, mega 9). O leo tambm
contm cidos graxos saturados, dentre eles cido palmtico (3,85%) e cido esterico
(3,85%) (HUAMAN & FLORES, 2009).
Os cidos graxos da famlia -3 so conhecidos por vrios benefcios sade,
dentre eles a reduo de triglicerdeo e colesterol srico, efeitos antiinflamatrios e
retardo do crescimento de tumores (TSUKUI et al., 2009; ZHANG et al., 2010). Em
estudo realizado com humanos verificou-se que o consumo do leo de sacha kiruma
reduz a trigliceridemia posprandial (HUAMN et al., 2008). Os mecanismos de ao
dos cidos graxos poliinsaturados para diminuir a quantidade de lipdeos plasmticos
so mltiplos: reduo da sntese de triglicerdeos e da secreo de VLDL, aumento da
-oxidao dos cidos graxos no fgado, aumento da depurao dos quilomcrons e
triglicerdeos por incremento da atividade da lipase lipoprotica (HUAMN et al.,
2008). Por outro lado, os cidos graxos -6, principalmente os cidos graxos linolico e
araquidnico, possuem efeitos proinflamatrios. A concentrao equilibrada destes
cidos graxos possui efeito crucial no processo inflamatrio (ZHANG, 2010). A relao
desejada desses cidos graxos na dieta de 4:1 de -6 em relao a -3 (PEREIRA,
2009; SOUZA & VISENTAINER, 2006). Os cidos graxos so constitudos por cadeias
hidrocarbonadas cidas de comprimento entre quatro e 36 carbonos (C4 a C36), sendo
que os mais frequentes na natureza contm nmeros pares de tomos de carbono, de 12
a 24, em cadeias no ramificadas. (GAZZINELLI et al., 2010).
Por serem insolveis em meio aquoso, os lipdeos formam complexos com
protenas, as apoprotenas, as quais possibilitam seu transporte. A apoprotena E (ApoE) foi inicialmente identificada como um componente das partculas de lipoprotena rica
em triglicerdeos. Apo-E conhecida por facilitar a remoo de partculas
remanescentes hepticas de quilomcrons ricos em colesterol, e tambm agindo como
ligante de algumas partculas de lipoprotenas para o receptor de LDL. Embora o fgado
apresenta-se como o maior local de sntese de Apo-E, uma grande variedade de tecidos
perifricos tambm expressam essa protena. Tecidos esteroidognicos, em particular,
expressam altos nveis de Apo-E. A glndula adrenal de humanos e macacos, por
exemplo, sintetizam Apo-E numa taxa similar ou mesmo maior do que o fgado
(PRACK, 1991).
O camundongo knockout para o gene da apoprotena E (Apo-E -/-) um dos
modelos mais utilizados na pesquisa para o estudo do desenvolvimento espontneo de
leses aterosclerticas (ZADELAAR et al., 2007). A aterosclerose uma doena
multifatorial que pode ser modulada com a dieta e com a condio de
1
Referencial terico
1.
Plukenetia volubilis Linneo
Sacha kiruma (Plukenetia volubilis Linneo) originria da Amaznia peruana,
sendo conhecida no complexo regional Amaznico do Brasil pelo nome de amndoalopo. Segundo estudos arqueolgicos, h indcios de que as civilizaes pr-inca e inca
utilizavam as sementes de sacha kiruma na alimentao (CIED, 2007). um arbusto
perene, hermafrodita, e pertencente famlia Euphorbiaceae (CIED, 2007), que rene
aproximadamente 7.500 espcies, distribudas em todo o mundo principalmente nas
regies tropicais, em altitudes entre 200 e 1500m (GUILLN et al., 2003).
Os nativos da Amaznia obtm farinha e leo das sementes de sacha kiruma,
subprodutos que so utilizados na preparao de diferentes alimentos e bebidas. No
entanto, esta planta tem sido pouco estudada, e sua importncia do ponto de vista
nutricional e funcional ainda assunto de pesquisa. Hamaker et al. (1992), em trabalho
pioneiro, determinaram a composio de suas sementes, encontrando 35-60% de
lipdeos e 27% de protenas ricas em cistena, tirosina, treonina e triptofano.
1.1. Caractersticas Botnicas
Na famlia Euphorbiaceae esto espcies importantes sob o aspecto econmico,
destacando-se a seringueira, a mamona e a mandioca (JOLY, 1976). O gnero
Plukenetia L. possui 16 espcies conhecidas (GILLESPIE, 1994), 11 de ocorrncia na
regio neotropical, quatro na frica e em Madagascar, e uma na sia (BUSSMANN et
al, 2009). Todas as espcies neotropicais do gnero so cips ou lianas, e a maioria
ocorre em floresta tropical mida. Sacha kiruma encontrada principalmente a partir
do nvel do mar at cerca de 1000 a 1500m de altitude (BUSSMANN et al., 2009).
Exemplares de sacha kiruma atingem altura mdia de dois metros e necessitam
do apoio de estacas para se desenvolver adequadamente (CIED, 2007). Os frutos so em
forma de cpsulas de 30-50 mm de dimetro, de cor verde intensa (Figura 1a), porm
quando amadurecem apresentam colorao marrom escura (Figura 1b). Os frutos
geralmente tm quatro lbulos, mas existem aqueles com cinco a sete. As sementes
(Figura 2) so de forma lenticular e se encontram dentro dos lbulos das cpsulas,
medindo de 15 a 20 mm de largura por 7 a 8 mm de espessura. O peso de cada semente
varia de 0,8 a 1,4g com 33 a 35% de casca e 65 a 67% da amndoa (CAI, 2011,
FOLLEGATTI ROMERO, 2007).
Os frutos ficam maduros quando a planta atinge a idade de sete a oito meses de
estabelecimento no campo. Aps a primeira colheita, a planta no deixa de produzir e o
intervalo entre colheitas em torno de 20 a 25 dias, por at 10 anos (CSPEDES,
2006).
Figura 1: Planta de sacha kiruma com frutos imaturos (a) e maduros (b) - (Janeiro de 2010).
1.2.
O perfil de aminocidos e cidos graxos das sementes de sacha kiruma foi determinado
por Hamaker et al. (1992). O contedo protico das sementes foi aproximadamente o mesmo
encontrado em outras oleaginosas da regio dos Andes e o contedo protico da farinha livre de
lipdeos foi aproximadamente 53%. O perfil de aminocidos foi comparado com o de outras
oleaginosas. Os autores encontraram nveis de leucina e lisina menores em relao protena de
soja, enquanto foi igual ou superior aos nveis de sementes de amendoim, algodo e girassol.
91,6%, dos quais o cido linolnico representa 45,2% seguido do cido linolico com 36,80%
(Tabela 1).
Tabela 1: Composio em cidos graxos do leo de sacha kiruma extrado com hexano,
segundo Hamaker et al. (1992)
cidos graxos
Saturados
Palmtico (C16:0)
Esterico (C18:0)
Insaturados
Olico (C18:1)
Linolico (C18:2)
Linolnico (C18:3)
Resumo
Saturados
Monoinsaturados
Poliinsaturados
Porcentagem (%)
4,5
3,2
9,6
36,8
45,2
7,7
9,6
82,0
Hamaker et al. (1992) comparando sacha kiruma com soja, amendoim, algodo
e girassol, mostraram que as sementes de sacha kiruma possuem maior teor lipdico na
semente (HAMAKER et al., 1992). Guilln et al. (2003) compararam o leo de sacha
kiruma com o de linhaa e verificaram que o leo de linhaa possui mais olico
(monoinsaturado) enquanto o leo de sacha kiruma
possui mais linolico
(diinsaturado).
O leo de sacha kiruma, por apresentar alta concentrao de poliinsaturados,
poderia ser bastante instvel oxidao, produzindo sabores e odores desagradveis.
Entretanto, estudos preliminares no Peru mostraram que o leo de sacha kiruma no
refinado parece ser relativamente estvel (HAMAKER et al., 1992). Os resultados
obtidos por Follegatti Romero (2007) mostraram um elevado teor de tocoferis, o que
possibilita a estabilizao deste leo.
2.
Mtodos de extrao de leos vegetais
Os mtodos de extrao empregados no passado eram bem simplificados e os
produtos obtidos a partir destes nem sempre eram leos 100% puros. As caractersticas
de um leo podem mudar conforme o mtodo empregado, tendo em vista que as suas
propriedades qumicas podero ser totalmente alteradas a depender das condies a qual
ele submetido quando determinada tcnica utilizada (PEREIRA, 2009).
2.1. Extrao por prensagem a frio
A prensagem um mtodo comumente empregado para obteno dos leos
vegetais. So prensas de alta presso e bastantes flexveis para operar com diferentes
tipos de oleaginosas. Um aspecto negativo deste processo que pode restar um residual
de leo na torta. Existe tambm o processo denominado misto que se refere
combinao do sistema de prensagem com o sistema de extrao por solvente. Esse
5
processo pode ser utilizado em larga escala e tambm ser adaptado para vrios tipos de
oleaginosas (PEREIRA, 2009).
2.2. Hidrodestilao
A destilao um processo de separao de misturas lquidas baseado na
diferena de composies dos constituintes na fase lquida e vapor em equilbrio, devido
diferena de volatilidade entre os componentes do lquido. Existem trs formas de se
expressar a hidrodestilao: destilao com gua, destilao a vapor e destilao com
vapor direto (PEREIRA, 2009).
Neste mtodo, o material vegetal imerso em gua sob aquecimento at a
fervura, resultando na formao de vapores que arrastam os compostos volteis, os
quais, aps condensao, separam-se da fase aquosa por decantao. A composio dos
leos essenciais pode ser influenciada pelo contato com a gua, tempo de extrao e
velocidade de aquecimento do equipamento (PRINS et al., 2006).
2.3. Extrao supercrtica
A extrao com fluido supercrtico uma tcnica que explora o poder de
solvncia de fluidos geralmente a temperaturas e presses prximas ao seu ponto
crtico. particularmente efetiva no isolamento de substncias de massa molar mdia e
polaridade relativamente baixa (FOLLEGATTI ROMERO, 2007).
Neste processo so empregados solventes acima de seus pontos crticos para
extrarem componentes solveis de uma mistura. Pode ser definida como a
solubilizao de determinados compostos de uma matriz slida ou lquida em um
solvente em condies supercrticas. Uma vantagem da extrao com fluido supercrtico
a possibilidade de fcil recuperao do solvente supercrtico aps o processo de
extrao, apenas pelo ajuste da presso e/ou temperatura, podendo o mesmo ser
continuamente reciclado. Isto elimina uma das etapas mais dispendiosas dos processos
de extrao convencionais que a separao do produto extrado do solvente orgnico
(PEREIRA, 2009).
2.4. Extrao com solvente orgnico
A extrao por solvente orgnico uma operao unitria simples e foi aplicada
pela primeira vez em 1835 por Robiquet para extrao de compostos de flores (HUI &
JOHN, 2007; PEREIRA, 2009). Os componentes contidos em uma matriz slida so
extrados dissolvendo-os em um solvente lquido. Este processo conhecido como
lixiviao ou ainda extrao slido-lquido. A soluo obtida, chamada micela (leo +
solvente), removida do extrator e encaminhada para um evaporador para a remoo do
solvente. Depois que o solvente removido completamente, obtm-se um extrato
concentrado. O solvente influencia na composio do extrato (parmetros diferentes de
solubilidade), na sua qualidade sensorial e no rendimento da extrao (PEREIRA,
2009).
O solvente orgnico mais utilizado o hexano, por ser o mais seletivo, possuir
estreita faixa de ebulio (entre 69 e 70C) e ser imiscvel em gua, o que evita misturas
azeotrpicas. Nestas, o ponto de ebulio constante, e a mistura se comporta como
uma substncia pura, dificultando a separao dos componentes pela destilao comum.
6
H desvantagens em seu uso, podendo-se destacar seu custo, toxidez e o fato de ser
extremamente inflamvel (FOLLEGATTI ROMERO, 2007; PEREIRA, 2009).
3.
As lipoprotenas
As lipoprotenas so compostas por lipdeos e protenas, denominadas, por sua
vez, apoprotenas (OJOPI et al., 2004). As lipoprotenas so caracterizadas por suas
propriedades fsico-qumicas (LOPES et al., 1996), sendo, porm, a densidade a
propriedade fsica na qual se baseia a atual classificao (GARCIA & OLIVEIRA,
1992; VALENTE, 1998). Pelo mtodo da ultracentrifugao preparativa, classes
distintas de lipoprotenas podem ser isoladas do plasma ps-prandial, e se diferenciam
pelo tamanho, pela densidade e pela composio tanto lipdica como apoprotica:
quilomcrons (QM), lipoprotenas de densidade muito baixa (VLDL), lipoprotenas de
densidade intermediria (IDL), lipoprotenas de densidade baixa (LDL) e lipoprotenas
de densidade alta (HDL), subdivididas em HDL2 e HDL3. A densidade das lipoprotenas
aumenta proporcionalmente ao aumento do teor protico e reduo do contedo
lipdico (FORTI & DIAMENT, 2006; VALENTE, 1998; THOMPSON, 1989).
As interaes entre as apoprotenas e os lipdeos das lipoprotenas podem
ocorrer por duas maneiras: (1) por meio de regies apolares hidrofbicas das
apoprotenas com o colesterol esterificado, triglicerdeos e com as cadeias de
hidrocarbonetos dos fosfolipdeos; (2) por meio de ligaes inicas entre aminocidos
da regio -hlice das apoprotenas e a cabea polar dos fosfolipdeos (GARCIA &
OLIVEIRA, 1992; VALENTE, 1998). As apoprotenas desempenham papel importante
no metabolismo lipdico. Alm da funo estrutural, permitindo a solubilizao das
lipoprotenas, contribuem para a regulao do metabolismo das lipoprotenas,
modulando a atividade de enzimas como a lecitina-colesterol aciltransferase e
lipoprotena-lipase, ligando-se tambm aos receptores da superfcie celular
(THOMPSON, 1989).
As lipoprotenas so sintetizadas no fgado e no intestino, ou formadas no
plasma, pela modificao de outras lipoprotenas (CHAPMAN, 1982; VALENTE,
1998). As apoprotenas so sintetizadas como pr-apoprotenas e, aps processamento,
modificam-se em apoprotenas. Algumas permanecem fixas nas lipoprotenas, enquanto
outras podem ser trocadas entre as diferentes lipoprotenas (MARINETTI, 1990;
VALENTE, 1998).
4.
A Apoprotena-E
A apoprotena-E (Apo-E) uma glicoprotena plasmtica de 36-kD que
representa um papel crucial no metabolismo de lipoprotenas no plasma. Esta protena
facilita a absoro celular de quilomcrons remanescentes ricos em triglicerdeos e
VLDL por meio do receptor de LDL e protenas relacionadas (CALLEJA et al., 1999;
KASHYAP et al., 1995; MAEDA et al., 2007; OSUGA, 1998). A apo-E componente
estrutural da superfcie de quilomcrons, quilomcrons remanescentes, VLDL, IDL e
HDL, sendo o principal componente de VLDL e HDL (CALLEJA et al., 1999; OJOPI
et al., 2004). Esta apoprotena primariamente sintetizada no fgado, podendo ser
produzida no crebro, intestino e em outras clulas e tecidos perifricos, incluindo
macrfagos (FAZIO et al., 1997; OSUGA, 1998).
7
Figura 3: Atuao da Apo-E. Adaptado de Pendse et al. (2009). As setas representam mudanas
no acmulo dos lipdeos nos diferentes tecidos na presena ou ausncia da Apo-E.
4.
Os cidos graxos poliinsaturados: metabolismo e importncia
O nosso organismo consegue sintetizar a maioria dos cidos graxos saturados e
insaturados, exceto os chamados essenciais. Estes esto divididos em dois grupos
principais: os da famlia -3 (cido linolnico) e -6 (cido linolico) (ANJO, 2004).
Estas famlias abrangem cidos graxos que apresentam insaturaes separadas apenas
por um carbono metilnico, com a primeira insaturao (dupla ligao) no terceiro e
sexto carbono, respectivamente, enumerado a partir do grupo metil terminal
(extremidade identificada pela letra mega- ) (MARTIN et al., 2006; MOREIRA,
2006). Os cidos graxos -3 so encontrados abundantemente em certas plantas e em
leo de peixe e os -6 so encontrados em leos vegetais (ANJO, 2004).
Os cidos graxos destas famlias so obtidos por meio da dieta ou produzidos
pelo organismo a partir dos cidos graxos -linolnico e linolico, pela ao de enzimas
elongase e dessaturase. O processo ocorre no retculo endoplasmtico, especialmente no
fgado. As elongases atuam adicionando dois tomos de carbono parte inicial da
cadeia, e as dessaturases agem oxidando dois carbonos da cadeia, originando uma dupla
8
ligao com a configurao cis (MARTIN et al., 2006; PERINI et al., 2010). Se a ao
dessas enzimas for bloqueada no corpo, esses cidos graxos tero de ser obtidos em
outras fontes. Isso significa que os cidos graxos -linolnico e linolico so cidos
graxos essenciais. O mesmo grupo de enzimas na via principal afeta o metabolismo
tanto da srie de cidos graxos essenciais -3 quanto da srie -6. Com isso concluiu-se
que, os fatores que bloqueiam a produo de molculas biologicamente ativas a partir
do cido linolico, tambm sejam responsveis pelo bloqueio da via metablica a partir
do cido -linolnico (EWIN, 1997). Os cidos graxos destas duas famlias competem
pelas mesmas enzimas envolvidas nas reaes de dessaturao e elongao, sendo que
essas enzimas tm maior afinidade pelos cidos graxos da famlia -3 (PERINI et al.,
2010).
Os principais cidos graxos poliinsaturados da famlia -3 so: cidos linolnico (-LNA, 18:3-3), cido eisosapentaenico (EPA, 20:5-3) e o cido
docosahexaenico (DHA, 22:6-3) (Figura 4). O organismo humano no consegue
sintetizar o cido -linolnico e o cido linolico (18:2-6) devido ausncia das
enzimas -15 e -12 dessaturases que so capazes de inserir duplas ligaes no terceiro
e sexto carbono, respectivamente, contados a partir do terminal metil. Por isso,
necessrio obt-los por meio da dieta para manter um pool adequado no organismo
(MOREIRA, 2006). O cido eisosapentaenico muito importante na preveno de
doenas cardiovasculares e hipertenso. O cido docosahexaenico apresenta
capacidade de prevenir doena cardaca, reduzir a taxa de triglicerdeos, alm de ser
importante no desenvolvimento da funo visual e cerebral (ANJO, 2004).
Figura 4: Estrutura qumica dos principais cidos graxos da famlia -3 (MOREIRA, 2006).
Na srie de cidos graxos -6, existem outros compostos nos quais os cidos
graxos essenciais so importantes: cido -linolnico (GLA, 18:3-6), o primeiro
produto metablico formado a partir do cido linolico, e dois metablitos do cido linolnico, a prostaglandina E1 (PGE1) e o cido dihomo- - linolnico (DGLA, 20:3 6), que pode ser convertido em prostaglandina E1 (Figura 5). O cido linolico
precursor ainda do cido araquidnico (AA, 20:4-6) (EWIN, 1997; MOREIRA, 2006).
Outros derivados importantes so os eicosanides. Os eicosanides so mediadores
9
Figura 5: Metabolismo dos cidos graxos das famlias -3 (n-3) e -6 (n-6) (Adaptado de
PERINI et al., 2010).
As pregas circulares, denominadas plicae circularis, em forma
semilunar, circular ou espiral, consistem em dobras da mucosa e submucosa. Estas
pregas so estruturas permanentes e so mais desenvolvidas no jejuno e, embora
estejam frequentemente presentes no duodeno e leo, no so caractersticas destes
rgos;
epitlio de agressores qumicos, fsicos e biolgicos, que podem estar presentes na luz
intestinal. Dependendo da composio de seus monossacardeos, as mucinas so
classificadas em neutras e subtipos cidos: no-sulfatadas (sialomucinas) e sulfatadas
(sulfomucinas). As mucinas neutras contm monossacardeos de manose, galactose e
galactosamina. As sialomucinas compem um grupo que contm diversos
monossacardeos, compostos de nove carbonos, e na posio C1 h um grupo
carboxilato, que est sempre ionizado a um pH fisiolgico (SHIRAISHI et al, 2009).
As criptas de Lieberkhn so glndulas tubulosas simples (ou tubulosas
ramificadas) que abrem espaos entre as vilosidades. Estas glndulas tubulosas so
compostas por entercitos, clulas caliciformes, clulas-tronco, clulas enteroendcrinas
e clulas de Paneth (GARTNER & HIATT, 2003). Os entercitos e as clulas
caliciformes ocupam a metade superior da glndula. A metade basal da glndula no
tem entercitos e somente algumas clulas caliciformes; ao invs disso, a maioria das
clulas so clulas-tronco, clulas enteroendcrinas e as clulas de Paneth (GARTNER
& HIATT, 2003).
O percentual de renovao celular determinado pela atividade das clulastronco/ progenitoras multipotentes, localizadas perto da base da cripta de Lieberkhn,
prximas as clulas de Paneth (GARCIA & MIRANDA, 2010; JUNQUEIRA &
CARNEIRO, 2008). A taxa de reproduo das clulas na cripta e a proporo de
migrao desses entercitos so alteradas em vrios estados fisiolgicos ou patolgicos.
Essas mudanas na dinmica celular determinam nos entercitos do vilo, por exemplo,
alterao na atividade transportadora relacionada ao tempo de vida (CARUSO &
DEMONTE, 2005).
Esta proliferao para na juno cripta-vilosidade. As novas clulas podem
mover-se para baixo e situar-se na base das criptas como clulas diferenciadas, as
clulas de Paneth, ou podem migrar para cima ao longo dos vilos enquanto se
diferenciam em entercitos, clulas enteroendcrinas ou clulas caliciformes. Quando
as clulas alcanam o pice do vilo, eventualmente elas passam pelo processo de
apoptose e so eliminadas para o lmen intestinal (CARUSO & DEMONTE, 2005;
GARCIA-MIRANDA, 2010).
As clulas de Paneth esto localizadas na poro basal das glndulas intestinais e
produzem o agente antomicrobiano lisozima. Devido sua atividade antibacteriana, a
lisozima tambm exerce controle sobre a microbiota intestinal. Ao contrrio das outras
clulas, as clulas de Paneth tm o tempo de vida comparativamente longo, cerca de 20
dias nas microvilosidades (GARTNER & HIATT, 2003; JUNQUEIRA & CARNEIRO,
2008).
Os linfcitos intra-epiteliais esto localizados acima da lmina prpria,
principalmente no duodeno e no jejuno proximal, e participam de modo decisivo na
regulao das interaes que ocorrem entre o meio ambiente e o sistema imunolgico,
tanto local quanto sistmico. Estes linfcitos so predominantemente (98%) linfcitos
T CD8+ CD45RO+ (clulas de memria) (MAYER, 2005).
14
Figura 8: Diagrama esquemtico da cripta de Lieberkhn (a), do pice do vilo (b) e dos
componentes celulares do intestino delgado de humanos (Adaptado de JUNQUEIRA &
CARNEIRO, 2008).
mais largas, mais altas e mais numerosas por unidade de rea. Ele possui menos clulas
caliciformes por unidade de rea do que os outros segmentos e possui as glndulas de
Brnner em sua submucosa (GARTNER & HIATT, 2003).
O intestino tem um papel importante na homeostase do colesterol. o rgo
responsvel pela regulao da quantidade de colesterol que ser absorvido, seja ele
oriundo da dieta ou produzido no organismo. Nesta regio ocorre a montagem
intracelular e liberao de quilomcrons, HDL nascentes e uma forma intestinal de
lipoprotena de baixa densidade (NGUYEN et al., 2001).
Em mamferos, os triglicerdeos so parcialmente hidrolisados no lmen
intestinal a cidos graxos livres e monoacilgliceris. Os produtos ento se difundem em
micelas para a mucosa intestinal onde so absorvidos como monmeros (OLSEN &
RINGO, 1997). Os cidos graxos so reesterificados em triglicerdeos no retculo
endoplasmtico antes de serem incorporados em lipoprotenas e serem exocitados ao
espao intersticial (THOMSON et al., 1993; TSO & FUJIMOTO, 1991).
Os cidos graxos de cadeia longa e os monoglicerdeos entram no retculo
endoplasmtico liso dos entercitos, onde so reesterificados formando triglicerdeos.
Estes triglicerdeos so transferidos para o aparelho de Golgi, onde so combinados com
uma capa de -lipoprotena, produzida no retculo endoplasmtico rugoso, formando
quilomcrons. Estas grandes gotculas lipoproticas, empacotadas e liberadas pelo
aparelho de Golgi, so transportadas para a membrana basolateral das clulas e
liberadas na lmina prpria. Os quilomcrons seguem para os vasos quilferos,
preenchendo-os com uma substncia rica em lipdeos, denominada quilo (GARTNER &
HIATT, 2003).
cidos graxos de cadeia curta no entram no retculo endoplasmtico liso para
serem reesterificados. Estes cidos graxos livres, que so suficientemente curtos para
serem hidrossolveis, dirigem-se para a membrana basolateral do entercito, se
difundem para a lmina prpria e penetram nas alas capilares e vo para o fgado onde
so processados (Figura 9) (GARTNER & HIATT, 2003).
Os cidos biliares so sintetizados a partir do colesterol no fgado e so
secretados com a bile no intestino delgado. Uma pequena frao dos conjugados
lipoflicos de cidos biliares so absorvidos passivamente no pH cido do duodeno.
cidos biliares conjugados so absorvidos no jejuno por troca aninica e por um
mecanismo de transporte antiporte. No leo, um transportador de cido biliar Na+
dependente participa do processo de absoro dos cidos biliares conjugados
(THOMSON et al., 2001).
16
7.
19
Objetivos
1.
Objetivos gerais
O objetivo geral deste trabalho foi extrair o leo de sementes de sacha kiruma,
determinar o perfil de cidos graxos e avaliar os efeitos desse leo na estrutura do
duodeno e fgado de camundongos.
2.
Objetivos especficos
a)
Obter o leo das sementes de sacha kiruma utilizando o mtodo de
extrao por solvente (hexano);
b)
Determinar o rendimento do processo de extrao de leo;
c)
Determinar a composio de cidos graxos nas amostras do leo
extrado;
d)
Acompanhar o consumo alimentar e a evoluo ponderal de
camundongos selvagens e knockout Apo-E tratados com dieta controle e dieta com o
leo de sacha kiruma;
e)
Avaliar os efeitos do leo de sacha kiruma na estrutura histolgica do
duodeno e fgado de camundongos selvagens e knockout Apo-E, machos e fmeas.
20
Metodologia
1.
Obteno do leo
1.1. Sementes
Foram utilizados trs espcimes de sacha kiruma, estabelecidos em Viosa, a
partir da germinao de sementes provenientes da Estao Experimental Agraria "El
Polvenir", Tarapoto (Peru). A cidade de Viosa est localizada na Zona da Mata mineira
(20 45' 14" S, 42 52' 53" O, 648,74 m), com clima caracterizado como tropical de
altitude, com veres chuvosos, invernos frios e secos, temperatura mdia de 19C e solo
argissolo vermelho-amarelo (ABREU et al., 2008; MARAGON et al., 2003). Quando os
frutos atingiram a maturidade, procedeu-se a coleta das sementes. Foram feitas trs
coletas ao longo de dois meses.
Aps a colheita, as sementes foram secas em temperatura ambiente por 15 dias.
Em seguida, foram acondicionadas em estufa com Circulao e Renovao de ar TE394/2, Tecnal a 45C por 24 horas, a fim de desumidific-las. Esta estufa foi
gentilmente cedida pelo Laboratrio de Micorriza, do Departamento de Engenharia
Florestal da Universidade Federal de Viosa. Aps o processo foram obtidos 2,127kg de
sementes desumidificadas.
1.2. Moagem das sementes
As sementes foram modas em Moinho de Rotor Vertical com facas mveis e
fixas, cedido pelo Laboratrio de Painis e Energia da Madeira, Departamento de
Engenharia Florestal da Universidade Federal de Viosa. Aps a moagem foram
obtidos 2,042kg de amostra.
1.3. Extrao do leo de sacha kiruma
Foi utilizado o mtodo de extrao por solvente com Soxhlet, utilizando hexano.
Este mtodo pode ser aplicado devido s caractersticas das sementes de sacha kiruma
que apresentam alto teor de lipdeos. Toda a metodologia de extrao foi realizada no
Laboratrio de Sementes, Departamento de Engenharia Florestal da Universidade
Federal de Viosa. O mtodo foi adaptado para a amostra de acordo com descrio no
Anexo I.
A primeira etapa do processo de extrao foi a padronizao da massa de
sementes modas a ser utilizada no cartucho de extrao. De acordo com a aparelhagem
disponvel para o processo, foi possvel utilizar cartuchos com 50g ou com 100g de
amostra. O uso de cartuchos com 100g de amostra, apesar de representar a princpio
uma vantagem pela reduo do tempo total para a extrao, mostrou-se pouco vantajoso
devido ao menor rendimento em relao aos cartuchos de 50g. Optou-se pelos cartuchos
com a menor massa a fim de se obter o maior rendimento possvel e minimizar o
desperdcio de amostra.
Para remoo de partculas que tenham permanecido durante a extrao, a
amostra contendo solvente e leo foi recolhida e filtrada a vcuo, utilizando uma bomba
de 1,5 HP e papel de filtro com porosidade 11. Em seguida, a amostra passou por uma
destilao.
21
3.
Obteno dos steres de cidos graxos do leo de sacha kiruma
Para traar o perfil lipdico do leo de sacha kiruma no tocante ao teor de cidos
graxos livres, foi preciso realizar a saponificao e esterificao da amostra. Este
mtodo foi realizado no Laboratrio de Bioqumica Nutricional, do Departamento de
Nutrio e Sade da Universidade Federal de Viosa.
A extrao dos lipdeos seguiu o mtodo proposto por Folch et al. (1957)
utilizando 30mg de leo e, em seguida, as amostras foram esterificadas pela tcnica de
Hartman & Lago (1973). As metodologias foram adaptadas para a amostra seguindo
modificaes apresentadas no Anexo IV.
3.1. Avaliao do perfil lipdico do leo de sacha kiruma utilizando a
cromatografia gasosa
A determinao do perfil de cidos graxos do leo de sacha kiruma foi feita por
meio da cromatografia gasosa. O aparelho utilizado foi cedido pelo Laboratrio de
Nutrio Experimental, do Departamento de Nutrio e Sade da Universidade Federal
de Viosa. Foi utilizado um cromatgrafo a gs Shimadzu, com detector por ionizao
em chama (FID - Flame Ionization Detector) equipado com uma coluna capilar de slica
fundida (100m x 0,25mm id).
As condies de anlise foram: programao da temperatura: 80C com rampa
de aquecimento de 10C/min at alcanar 150C e 4C/min at alcanar a temperatura
22
23
24
Tabela 3: Formulao das dietas controle e experimental. Em acordo com determinaes AIN93G formulada para roedores em fase de crescimento, gestao e lactao.
Ingredientes
Dieta controle (%) Dieta experimental (%)
Casena
20
20
Amido dextrinizado
13,2
13,2
Sacarose
10
10
leo de soja
7
leo de sacha kiruma 7
Fibras
5
5
Mistura de minerais
3,5
3,5
Mistura de vitaminas 1
1
L-cistina
0,3
0,3
Bitartarato de colina
0,25
0,25
Amido de milho
39,75
39,75
O consumo alimentar foi verificado duas vezes por semana em cada grupo. O
clculo se baseou na rao restante no comedouro, em relao quantidade de rao
inicial. Inicialmente foi considerado um consumo de 10g/ animal por dia. Ao longo das
semanas essa oferta foi ajustada de acordo com o consumo dos grupos, numa mdia de
4g/animal por dia.
4.3. Desenvolvimento dos animais
Ao longo do tratamento, os animais tiveram livre acesso a gua e alimento. O
peso corporal individual foi obtido quinzenalmente. Para a avaliao do crescimento dos
animais, foi utilizado tambm o ndice hepatossomtico (IH):
4.4. Eutansia
Ao final do experimento, todos os animais foram submetidos eutansia para a
coleta dos rgos, utilizando-se a inalao com gs carbnico. Este procedimento foi
realizado no Laboratrio de Nutrio Experimental, do Departamento de Nutrio e
Sade da Universidade Federal de Viosa. A massa final de cada camundongo foi
obtida minutos antes do procedimento.
5.
Avaliao dos efeitos do tratamento no duodeno
5.1. Obteno dos fragmentos do duodeno
O intestino delgado foi identificado em sua poro inicial e cuidadosamente
distendido para que os contedos permanecessem em posio (MARQUES, 2006). Para
a localizao do duodeno, foi utilizado como referncia o esfncter pilrico e a
interseo duodeno/jejuno. Incluindo o esfncter pilrico, extraiu-se um fragmento com
aproximadamente dois centmetros de comprimento. As amostras foram colhidas e
25
27
6.
Avaliaes dos efeitos do tratamento no fgado
6.1. Obteno dos fragmentos de fgado
O fgado foi extrado, lavado imediatamente com soluo salina e pesado. Na
sequncia, parte da amostra foi fixada em soluo de paraformaldedo-glutaraldedo
(KARNOVSKY, 1965). O material permaneceu por 24 horas no fixador e foi
posteriormente transferido para soluo de lcool 70% at a incluso em glicolmetacrilato (Historesin, LEICA).
6.2. Microtomia e Colorao
Os procedimentos de microtomia e colorao foram realizados no Laboratrio
de Biologia Estrutural e Histofisiologia Reprodutiva e Digestiva, Departamento de
Biologia Geral da Universidade Federal de Viosa. O fragmento de fgado foi
seccionado em micrtomo rotativo (Reichert-Jung 2045 Multicut, Germany) para a
obteno de cortes transversais semi-seriados. O material foi seccionado na espessura de
2m e intervalo entre cortes de 20m e corado com Hematoxilina-Eosina para melhor
interpretao da morfologia do parnquima e estroma heptico.
No mtodo de colorao, as preparaes foram mergulhadas na soluo de
Hematoxilina por trs minutos. Na sequncia foram lavadas com gua corrente e
mergulhadas em soluo de Eosina por 30 segundos. Novamente, banho em gua
corrente. As preparaes foram secas em temperatura ambiente, sendo a montagem
realizada com o meio Entellan (Merck).
6.3. Captura de imagens
As imagens das seces histolgicas foram capturadas a partir do microscpio
de luz (Olympus AX 70) por meio de uma cmera de captura acoplada a um sistema
28
Considerando o
tratamento
proposto
ATM X ACM
ATF X ACF
BTM X BCM
BTF X BCF
Considerando a
linhagem
ATM X BTM
ATF X BTF
ACM X BCM
ACF X BCF
Considerando o
sexo
ATM X ATF
BTM X BTF
ACM X ACF
BCM X BCF
29
Resultados
Extrao e avaliao do leo das sementes de sacha kiruma
1.
2.
Perfil de cidos graxos do leo de sacha kiruma
Os resultados preliminares da cromatografia gasosa indicaram steres de cidos
graxos de cadeia longa (Tabela 6). Os resultados mostraram presena de intermedirios
da cadeia de biossntese dos cidos graxos linolico e linolnico, indicando a presena
inicial destes cidos graxos. O cido graxo com maior porcentagem na amostra
(50,61%) foi o eicosadienico (C20:2n6), produto direto da elongao do cido graxo
linolico (C18:2n6), da famlia -6, muito encontrado em leos vegetais.
Foi encontrada neste leo alta concentrao de poliinsaturados, 95,48% e baixa
concentrao de cidos graxos saturados (4,42%). Outros cidos graxos encontrados
foram da famlia -9, o cido olico (C18:1n9) (6,37%), o cido eladico (C18:1n9t)
(2,42%) e o cido ercico (C22:1n9) (0,02%).
30
Tabela 6: cidos graxos (% de rea) do leo extrado das sementes de sacha kiruma.
% de rea
0,0252
4,2853
0,0700
0,0273
0,0094
0,0273
0,0066
0,0092
0,0109
34,9018
0,0643
50,6126
0,0090
0,0169
1,0473
0,0672
2,4156
6,3744
0,0196
4,4172
95,5827
0,1011
95,4816
31
3.
cidos graxos
Concentrao (%)
Linolico (C18:2n6)
34,9018
Linolnico (C18:3n3)
0,0092
Araquidnico (C20:4n6)
0,0090
Poliinsaturados
34,92
Mirstico (C14:0)
0,0252
Palmtico (C16:0)
4,2853
Saturados
4,3105
Relao poliinsaturados/ saturados
8,10
32
Ensaio Biolgico
1.
Consumo alimentar
Nas duas primeiras semanas do experimento, que corresponderam ao perodo de
adaptao dos animais quanto dieta e acomodao, no se observou reduo no
consumo alimentar. Durante o experimento o consumo se manteve com pouca
oscilao, com mdia de 3,5g/animal/dia (Figura 11).
Figura 11: Consumo alimentar dos grupos tratados, controles e consumo geral ao longo do
tratamento.
33
2.
Evoluo ponderal
A massa corporal inicial dos animais variou entre 16 e 25g e, ao longo das
quinzenas (Q) oscilou entre 18 e 25g (Figura 12).
Figura 12: Evoluo ponderal dos camundongos ao longo das quinzenas (Q).
3.
Variao da massa corporal, consumo alimentar e ndice
hepatossomtico
Foram encontradas diferenas relacionadas a linhagem e ao sexo dos
camundongos para as mdias de massa corporal inicial, em que foram encontrados
machos e indivduos da linhagem BlackC57/6 com maiores valores em relao as
fmeas, ou a linhagem knockout. A mdia do grupo BTM foi maior em relao a BTF;
ACM maior em relao a ACF; BCM maior em relao a BCF; BCM maior em relao
a ACM e BTM maior em relao a ATM. Considerando as mdias de massa corporal
final, foram encontradas diferenas relacionadas ao sexo dos camundongos. A mdia
dos grupos com camundongos machos foram maiores em relao aos grupos com
camundongos fmeas, similar ao que foi obtido para a massa corporal inicial. Assim,
ATM maior em relao a ATF; ACM maior em relao a ACF; BTM maior em relao
a BTF e BCM em relao a BCF. Observando a variao de massa nestes grupos, foram
encontradas diferenas relacionadas a linhagem e ao sexo dos camundongos. A mdia
encontrada para o grupo ATM foi maior em relao a ATF, como tambm com relao
a BTM (Tabela 8).
Outra informao que foi utilizada para evidenciar o crescimento e
desenvolvimento dos camundongos foi o ndice hepatossomtico. Apenas a mdia do
34
grupo ATF apresentou diferena estatstica em relao aos demais. A mdia de ATF foi
maior em relao a ACF, em relao a ATM e em relao a BTF (Tabela 8).
Tabela 8: Dados de massa corporal, consumo alimentar e ndice hepatossomtico.
Grupo
Massa
Massa
Variao da
Consumo
ndice
corporal
corporal
massa
alimentar
hepatossomtico
inicial (g)
final (g)
corporal (g)
(g/dia/animal)
25,562,65b 5,0422,289c
3,896
0,0470,001a
ATM 20,522,14a
23,421,60b 2,6302,778ac
3,560
0,0430,005a
ACM 20,792,33a
18,751,35ab 19,710,81a 0,9571,590ab
3,641
0,0530,003b
ATF
b
a
ac
16,811,84
19,150,86
2,3341,225
3,538
0,0470,013a
ACF
25,591,09c
23,550,64b -2,0360,596b 3,278
0,0410,002a
BTM
24,852,22b -1,0323,928ab 3,590
0,0420,003a
BCM 25,893,08c
18,930,80ab 18,910,45a -0,0201,147ab 3,182
0,0430,002a
BTF
ab
a
ab
19,561,15
18,591,16
-0,9751,422
3,177
0,0470,002a
BCF
Mdias desvio padro. Mdias na coluna seguidas por mesma letra no diferem entre si ao
nvel de significncia de 5% pelo Teste de Newman-Keuls.
35
3.
Superfcie de absoro
No foram encontradas diferenas entre as mdias de superfcie de absoro no
duodeno entre os grupos considerando o tratamento, o sexo e as linhagens. Na relao
altura do vilo/altura da cripta, a mdia do grupo BCF foi maior em relao a BCM
assim como em relao a ACF, diferenas estas relacionadas a linhagem e ao sexo dos
camundongos.
Quanto ao epitlio absortivo foram encontradas diferenas relacionadas ao
tratamento, em que a mdia para o grupo ACM foi maior em relao a ATM, e ACF
maior em relao a ATF. Outras diferenas encontradas foi com relao a linhagem dos
camundongos. A mdia de BTM, maior em relao a ATM; BTF maior em relao a
ATF (Tabela 10; Figuras 13 e 15).
36
4.
Morfometria da mucosa
A morfometria da mucosa do duodeno no revelou diferenas entre os grupos,
considerando o tratamento proposto, a linhagem ou o sexo dos camundongos (Tabela
11; Figuras 13 e 15).
Tabela 11: Morfometria da mucosa do duodeno.
Grupo Espessura da mucosa basal (m) Espessura da mucosa total (m)
449,13139,80a
ATM 122,6245,16a
458,2743,24a
ACM 113,379,57a
a
132,1311,40
526,6423,96ab
ATF
124,6819,02a
506,8447,33ab
ACF
119,249,59a
495,9093,54ab
BTM
482,4843,41ab
BCM 113,7318,85a
113,8111,17a
505,6854,20ab
BTF
a
121,5815,35
604,4369,52b
BCF
Mdias desvio padro. Mdias na coluna seguidas por mesma letra no diferem entre si ao
nvel de significncia de 5% pelo Teste de Newman-Keuls.
5.
Morfometria da tnica muscular
A morfometria da tnica muscular e das subcamadas musculares no revelou
diferenas entre os grupos, considerando o tratamento proposto, a linhagem ou o sexo
dos camundongos (Tabela 12; Figuras 13 e 15).
37
6.
Morfometria da cripta de Lieberkhn
A morfometria da cripta no mostrou alterao entre os grupos para as mdias de
comprimento, dimetro da base e largura das criptas. Foi observada diferena
estatisticamente significante nas mdias do dimetro do pice das criptas. A mdia foi
maior nos grupos ACM em relao ATM, ACF em relao ATF e BCM em relao
BTM (Tabela 13; Figuras 13 e 15).
Tabela 13: Morfometria da cripta de Lieberkhn no duodeno.
Comprimento da
Dimetro da base
Largura da
Dimetro do pice
cripta (m)
da cripta (m)
cripta (m)
da cripta (m)
a
a
a
38,441,65
40,782,74
38,402,44a
ATM 125,2525,27
37,303,39a
42,313,40a
44,122,81b
ACM 114,378,04a
124,1010,68a
35,731,48a
39,322,23a
38,741,25a
ATF
127,0915,34a
37,502,46a
41,422,41a
44,974,23b
ACF
a
a
a
130,0121,93
34,551,87
38,372,59
37,081,25a
BTM
37,183,13a
39,204,81a
44,374,35b
BCM 123,6715,03a
112,688,34a
35,431,71a
39,411,78a
41,391,95ab
BTF
117,3810,34a
36,450,71a
39,150,75a
41,821,35ab
BCF
Mdias desvio padro. Mdias na coluna seguidas por mesma letra no diferem entre si ao
nvel de significncia de 5% pelo Teste de Newman-Keuls.
Grupo
7.
Linfcitos intraepiteliais e entercitos
Na freqncia de entercitos no vilo, foram encontradas diferenas relacionadas
ao sexo e a linhagem dos camundongos. A mdia do grupo BCF foi maior em relao a
BCM e tambm em relao a ACF. No foram observadas diferenas entre as mdias
para a freqncia de linfcitos intraepiteliais ou na relao entre estas frequncias
(Tabela 14, Figuras 13 e 15).
38
8.
Quantificao das clulas caliciformes e clulas de Paneth por mm2
de mucosa
No foram encontradas clulas secretoras apenas de mucinas cidas (AB+) nas
preparaes histolgicas analisadas. A quantificao no mostrou diferena nas mdias
de clulas secretoras de mucinas neutras (PAS+) entre os grupos (Tabela 15; Figuras 14
e 16).
Em relao s clulas cuja secreo uma mistura de mucinas neutras e cidas
+
(AB PAS+), foram encontradas diferenas relacionadas ao tratamento proposto, em que
a mdia de BTM foi maior em relao a BCM, e BTF maior em relao a BCF.
Tambm foram encontradas diferenas relacionadas a linhagem e ao sexo dos
camundongos. A mdia de BTM encontrada foi maior em relao a BTF; BTM foi
maior em relao a ATM; e BTF foi maior em relao a ATF (Tabela 15; Figuras 14 e
16).
A freqncia de clulas de Paneth foi maior no grupo BCM em relao ao grupo
BCF; em ACF foi maior em relao a BCF; e em BTF foi maior em relao a BCF
(Tabela 15; Figuras 14 e 16).
Tabela 15: Tipos celulares secretores e clula de Paneth por mm de mucosa no duodeno.
Grupo
PAS+
AB+PAS+
Clula de Paneth
a
a
14,7615,72
172,9032,38
28,3516,39b
ATM
220,3214,24a 48,2313,31b
ACM 3,401,77a
6,772,48a
207,5728,13a 53,7714,75b
ATF
7,581,90a
216,7325,10a 31,1015,05b
ACF
a
10,056,56
267,8654,99c 33,2913,23b
BTM
BCM 11,7313,83a 226,6427,16a 27,705,80b
11,468,18a 265,2211,31b 32,166,34b
BTF
6,673,09a
192,1230,56a 15,942,72a
BCF
Mdias desvio padro. Mdias na coluna seguidas por mesma letra no diferem entre si ao
nvel de significncia de 5% pelo Teste de Newman-Keuls.
39
Figura 13: Seco transversal do duodeno com destaque para o vilo, cripta, mucosa e tnica
muscular (camada muscular externa (E) mais camada muscular interna (I). Azul de Toluidina
Borato de Sdio 1%. Barra: 100m.
40
Figura 14: Seco transversal do duodeno com destaque para as clulas caliciformes localizadas
ao longo das criptas e vilos, com o muco evidenciado pela tcnica (a), e clula de Paneth,
localizadas na base das criptas e cujos grnulos so evidenciados pela tcnica (b). O quadro
delimitando a base da cripta apresenta-se em destaque mostrando as clulas de Paneth, com
maior visualizao de seus grnulos, localizao basal e morfologia (b). Tcnica combinada de
Azul de Alcian e PAS. Barra: 50m
41
42
43
3.
Morfometria de outros componentes do fgado
Na freqncia de reas com sinusides, foram observadas maiores mdias no
grupo BCF em relao a BCM; BCF em relao a ACF; e BCF em relao a BTF. Na
freqncia de macrfagos, as mdias encontradas em BCM foram maiores em relao a
BCF; ACF em relao a BCF; em BTM tambm foram maiores em relao a ATM e
tambm maiores em BTF em relao a BCF (Tabela 17; Figuras 17 e 18).
Nas reas com necrose e na freqncia de vasos sanguneos no foram
observadas diferenas entre os grupos (Tabela 17; Figuras 17 e 18).
44
4.
Dimetro celular e nuclear de hepatcitos
Na morfometria dos hepatcitos, no foram encontradas diferenas entre os
grupos para os dimetros nuclear e celular, e nem na relao entre estes valores (Tabela
18; Figuras 17 e 18).
Tabela 18: Dimetros nuclear e celular dos hepatcitos.
Grupo
Dimetro nuclear de
Dimetro celular de
hepatcitos (m)
hepatcitos (m)
97,9511,84
ATM 43,982,82
44,811,63
98,967,19
ACM
45,372,21
97,884,76
ATF
46,463,83
91,927,25
ACF
42,312,84
89,965,02
BTM
91,161,88
BCM 45,913,41
45,492,26
93,886,03
BTF
45,502,68
94,762,40
BCF
Mdias desvio padro. Mdias na coluna seguidas por mesma
nvel de significncia de 5% pelo Teste de Newman-Keuls.
45
Figura 17: Seco transversal do fgado com destaque para o cordo de hepatcitos delimitado
(a), hepatcito mononucleado (b), hepatcito binucleado (c) e poro de citoplasma de
hepatcito rica em gotculas lipdicas (d). Hematoxilina- Eosina. Barra: 50m.
46
Figura 18: Seces do fgado representando os oito tratamentos. Hematoxilina- Eosina. Barra:
50m.
47
igual a 8,10 (Tabela 7). Este dado indica que este leo manteria os benefcios em
relao a preveno de doenas cardiovasculares j descritos na literatura consultada.
2.
Evoluo do consumo alimentar e massa corporal dos camundongos
durante o ensaio biolgico
Nas primeiras duas semanas aceitvel uma alterao do padro de alimentao
devido adaptao dos animais as novas acomodaes. Os camundongos neste estudo
no apresentaram problemas com adaptao dieta, mantendo mdias semelhantes de
consumo dirio de dieta ao longo das semanas de ensaio, desde o incio da oferta da
mesma (Figura 11). A dieta foi armazenada seguindo recomendaes, o que foi
importante para evitar a oxidao dos cidos graxos. Os animais apresentaram um
desenvolvimento e comportamento semelhante ao longo das semanas.
O ndice hepatossomtico foi utilizado para avaliar o crescimento dos animais,
uma vez que o fgado o principal rgo do metabolismo lipdico, de formao das
lipoprotenas e de armazenamento de vitaminas (BRITO, 2008; GUYTON, 1992). O
seu aumento sugere um comprometimento no desenvolvimento normal desses animais,
bem como ndice de hepatotoxicidade (BRITO, 2008). A alterao encontrada neste
valor para um dos grupos no pode ser atribuda ao tratamento proposto. Os resultados
para o ndice hepassomtico entre os grupos tratados e controles est de acordo e
complementa os dados expostos (Tabela 8).
Em trabalho com leo de aroeira vermelha (Schinus terebinthifolius Raddi)
realizado por Silva et al. (2010), frangos de corte foram tratados com o leo essencial
extrado dos frutos, acrescido de antibiticos e tambm no encontraram diferenas no
consumo alimentar entre os grupos. Estes dados esto de acordo com os dados do
desenvolvimento ponderal ao longo do ensaio. A proporo se manteve ao longo das
semanas, em acordo com o consumo da rao (Tabela 8). No mesmo experimento,
Silva et al. (2010) encontraram ganho de massa e massa final superiores nos grupos
tratados com o leo de aroeira vermelha em relao aos controles. Segundo os autores,
a maximizao nesses ndices zootcnicos parece indicar uma melhoria nos processos
de digesto e absoro de nutrientes, tornando-os mais eficientes.
Alguns estudos sobre o consumo de nozes e amendoim em humanos, fontes de
cidos graxos poliinsaturados e monoinsaturados, respectivamente, verificaram que,
embora esses alimentos sejam altamente energticos, os voluntrios estudados no
aumentaram a massa tanto quanto o consumo energtico (ALMARIO et al., 2001; HU
et al., 1998; KRIS-ETHERTON et al., 1999; OBYRNE et al., 1997; ZAMBN et al.,
2000). Em outro estudo, Cintra (2003) tambm encontrou resultado semelhante em ratos
(SALES et al., 2005).
3.
Avaliao dos efeitos do tratamento no duodeno
A mucosa intestinal deve apresentar caractersticas morfofuncionais adequadas,
pois os processos de absoro so dependentes da integridade do epitlio. Inmeros
agentes infecciosos ou no infecciosos podem lesar a mucosa intestinal, alm de
comprometer os processos digestrios (SILVA et al., 2010). De acordo com Macari et
al. (2002), a capacidade absortiva do intestino proporcional ao nmero de vilosidades
ali presentes. A manuteno do tamanho dos vilos garante a manuteno da capacidade
49
e 12; Figuras 13 e 15). Silva et al. (2010) com o trabalho com leo de aroeira vermelha
tambm no encontraram diferena significativa entre os tratamentos para a espessura
da tnica muscular do jejuno.
4.
Avaliao dos efeitos do tratamento no fgado
O fgado o principal rgo responsvel pela manuteno da homeostase
metablica, participa da biotransformao de metablitos circulantes e na
desintoxicao e excreo de resduos metablicos e de contaminantes externos. um
rgo muito susceptvel a potenciais leses por substncias farmacuticas e qumicas,
que podem provocar hepatotoxicidade (ALVARADO-RICO & CASTRO, 2010).
Diante de possveis leses a que o fgado submetido, os hepatcitos contam
com mecanismos eficientes para enfrentar as modificaes ao seu entorno. Para manter
a homeostase, o fgado responde, seja aumentando seu tamanho (hipertrofia) ou
incrementando o nmero de clulas, por meio da diviso celular (hiperplasia), como
resposta adaptativa ao estresse (ALVARADO-RICO & CASTRO, 2010).
Os hepatcitos tm como caracterstica a presena de dois ou mais ncleos, e
geralmente apresentam tamanho uniforme. A hipertrofia acontece quando estas clulas
aumentam consideravelmente de tamanho, podendo ocorrer tambm o aumento do
ncleo. A hipertrofia, tumefao ou aumento de clulas so achados morfolgicos
comuns em vrias doenas inflamatrias do fgado, resultando de alteraes funcionais
na bomba de sdio com reteno citoplasmtica deste e de gua (LORA, 2007). A
hiperplasia celular pode ser identificada com a maior frequncia de hepatcitos
binucleados, um indicativo da etapa final da diviso. Aumento na frequncia de
hepatcitos binucleados tambm pode indicar maior atividade metablica do tecido.
Neste ensaio no foram observadas diferenas entre a frequncia de hepatcitos
mononucleado e binucleado, entre os grupos que receberam o tratamento e seus grupos
controles (Tabela 16; Figuras 17 e 18). No foram encontradas, ainda, diferena nos
dimetros celular e nuclear ou na relao entre os dimetros citoplasma/ ncleo,
indicando que o tratamento no provoca alterao no volume celular ou nuclear dos
hepatcitos (Tabela 17; Figuras 17 e 18).
Segundo Lora (2007), tanto o aumento do volume de hepatcitos e de seus
ncleos quanto a necrose j foram verificados em quadros de intoxicao por
Arrabidaea bilabiata L. (Bignoniaceae) (chibata) em coelhos; com frutos de Melia
azedarach L. (Meliaceae) (cinamomo) em sunos e intoxicao por Mascagnia sp.
(Malpighiaceae) (timb). No presente trabalho, no foram observados indcios
morfolgicos de que o leo extrado de sacha kiruma, oferecido na dose de lipdios
diria recomendada para estes camundongos, possa causar dano na morfologia do
fgado. Lora (2007) afirma ainda que, segundo Sherlock (1978), a hepatotoxicidade
relacionada com dose-dependncia. Lora (2007) trabalhou com extrato hidroalcolico
de Eugenia uniflora L. (Myrtaceae) (pitanga) em camundongos de ambos sexos e
encontrou sinais de hepatotoxicidade dose-dependente. Encontrou alteraes em
hepatcitos e necrose nos grupos tratados em relao aos controles.
Batista et al., (2006) trabalharam com infuso de razes de Cayaponia tayuya
(Cucurbitaceae) (abbora-danta) em camundongos swiss machos e encontraram vasos
sanguneos e sinusides volumosos e congestos e reas com necrose. No ensaio com
52
53
Concluses
1.
O mtodo de extrao utilizando o hexano como solvente orgnico foi
considerado eficiente para a extrao de leo das sementes de sacha kiruma; sendo que
o rendimento de extrao foi maior utilizando cartuchos com menor massa de amostra;
2.
A composio de cidos graxos do leo extrado das sementes cultivadas
em Viosa (MG) foi similar quela encontrada na literatura;
3.
O consumo das dietas e a evoluo ponderal dos grupos de camundongos
controle e tratado com o leo de sacha kiruma foi similar durante o ensaio biolgico;
4.
A estrutura histolgica do duodeno e do fgado no mostrou alteraes
devido ao tratamento com o leo.
Neste ensaio no encontramos sinais de toxidez do leo extrado de sacha
kiruma que pudesse inviabilizar seu consumo. Estudos futuros relacionando seu uso
com a estrutura do sistema cardiovascular de animais deficientes em apoprotena E
sero necessrios para agregar novas informaes. Alm disso, seria interessante o
desenvolvimento de estudo com dose-dependncia, a fim de determinar uma faixa
segura de consumo do leo de sacha kiruma.
54
Anexos
Anexo I
Mtodo de extrao do leo das sementes de sacha kiruma por Soxhlet
utilizando o hexano como solvente
Foi utilizado um Extrator de gordura Soxhlet de 500ml. Inicialmente a amostra
foi dividida em cartuchos de extrao com 50g ou 100g cada, a fim de verificarmos se
haveria diferena de rendimento no processo de extrao. Cada bateria comportava seis
cartuchos e foram necessrias seis baterias de 24 horas. Os cartuchos foram
confeccionados com papel de Germinao de Sementes (28x38 cm com 65 g) e seu
tamanho foi padronizado de acordo com o tamanho do Soxhlet. Os cartuchos foram
acomodados no Soxhlet e o volume completado com Hexano. A temperatura da chapa
aquecedora foi controlada durante todo o processo mantendo-se prximo a 69C, dentro
da faixa para a ebulio do hexano, que varia entre 68C e 70C. A temperatura da
gua do condensador tambm foi controlada durante todo o processo mantendo-se
prximo a 16C 1C.
O volume de solvente utilizado foi o suficiente para completar o volume do
Soxhlet e permitir duas sifonagens, quando o solvente passa por toda a amostra e se
deposita no balo de fundo chato acoplado, em torno de 400ml de hexano.
Principio do mtodo de extrao: O hexano presente no balo de fundo chato,
em contato com a placa aquecedora evapora, passando ao longo do Soxlet. Em contato
com a gua mais fria este vapor condensa e retorna ao balo de fundo chato. Neste
percurso, o solvente lava a amostra contida no cartucho levando parte do leo. Assim,
ao final das 24 horas temos uma mistura do hexano com o leo de Sacha kiruma no
balo, e uma amostra livre de leo nos cartuchos. Estes cartuchos foram recolhidos e
armazenados em estufa a 45C por 12 horas para posterior pesagem.
Anexo II
Descrio da destilao com Rotavapor a vcuo da amostra aps o processo de
extrao por Soxhlet utilizando o hexano como solvente
Inicialmente, foi preciso padronizar todo o sistema com um balo de fundo
redondo contendo apenas hexano. O sistema funcionou desta forma por cerca de 30
minutos e, posteriormente o balo foi trocado por um contendo nossa amostra. Como
trabalhamos em um ambiente com vcuo, a evaporao do solvente ocorreu em uma
temperatura abaixo de seu ponto de ebulio. Vale ressaltar que para o hexano, o ponto
de ebulio 69C.
Iniciamos a etapa com uma temperatura de 30C e, vagarosamente, foi
aumentada para 40C, 50C e, finalmente, 55C, mantendo-se at o final do processo. O
balo de fundo redondo com a amostra ficava girando constantemente o que facilitou a
evaporao do solvente.
O hexano evaporava da amostra, passava pelo condensador e, em contato com a
gua resfriada, condensava e caa no balo de fundo redondo para este fim. Tal solvente
considerado puro podendo ser novamente utilizado. Para a nossa extrao foi utilizado
apenas hexano novo.
55
Anexo III
Descrio da etapa de borbulhar nitrognio na amostra obtida do processo de
destilao com Rotavapor a vcuo
Aps a destilao, a amostra de leo foi retirada do balo de fundo redondo e
armazenada em um kitasato. Este foi colocado em um banho-maria com temperatura
controlada em 55C por 10 minutos. Um cateter com uma seringa, adaptado a partir de
um balo de nitrognio foi introduzido nesse kitasato e, em constante e delicado
movimento, borbulhou-se nitrognio na amostra.
Anexo IV
Extrao de lipdeos do leo de sacha kiruma e obteno dos steres dos cidos
graxos.
Mtodo de Folch (1957) modificado:
1)
Pesar a amostra em tubo de ensaio fresco e identificado. Para o leo, utilizou-se
30mg,
2)
Adicionar 1,0ml de clorofrmio: metanol e macerar com basto de vidro,
acrescentar 0,9ml de clorofrmio:metanol, lavando o basto de vidro e retirando-o do
tubo de ensaio,
3)
Homogeinizar em vrtex por 3min,
4)
Adicionar 0,4ml de metanol puro,
5)
Centrigufar por 3min a 3000 RPM. Foi utilizada a centrfuga para 16 tubos de
ensaio da Quimis,
6)
Passar o sobrenadante para um tubo de ensaio rosquevel seco, pesado e
identificado,
7)
Acrescentar 0,8ml de clorofrmio puro,
8)
Adicionar 0,64ml de soluo de NaCl a 0,73%,
9)
Homogeneizar em vrtex por 30seg,
10)
Centrifugar por 10 min a 3000 RPM,
11)
Desprezar a fase superior com pipeta de Pasteur,
12)
Lavar trs vezes a parede interna do tubo de ensaio com 0,3ml de soluo de
Folch de cada vez sem afetar a parte superior,
13)
Desprezar a fase superior,
14)
Secar em estufa semi- aberta a 40C, sugesto overnight, mas verificar se o
solvente evaporou por completo antes de prosseguir.
As etapas envolvendo os solventes foram realizadas em capela de exausto.
56
57
Preparo de Solues
1.
Soluo de Folch
- 3% de clorofrmio,
- 48% de metanol,
- 47% de gua destilada,
- 2% de NaCl 29%
Misturar os componentes. Agitar no agitador magntico por 10min e reservar em frasco
mbar.
2.
Reagente de esterificao
3.
Reagente de saponificao
- 2g de NaOH,
- 100Ml de metanol
Adicionar o hidrxido de sdio no balo volumtrico de 100mL, completar o volume
com metabol, dissolver o NaOH. Reservar em recipiente de plstico.
Soluo fixadora
4.
Fixador Karnovsky
Soluo A:
-Paraformaldedo 4%
100 ml de paraformaldedo 40%
900 ml de tampo fosfato de sdio 0,1M pH 7,3 (450ml de gua destilada + 450ml de
tampo fostato 0,2M)
58
Soluo B:
-Glutaraldedo
160ml de glutaraldedo 25%
420ml de tampo fosfato de sdio 0,2M pH 7,3
420ml de gua destilada
Manter as duas solues na geladeira e misturar na hora do uso.
Corantes
5.
Eosina
6.
Hematoxilina de Harris
59
8.
Reativo de Schiff
Fucsina bsica-------- 1g
gua destilada------- 200ml
cido clordrico 1N------ 20ml
Bissulfito de anidro------ 1g
Ferver a gua destilada e adicionar a fucsina bsica. Esfriar at 50C e filtrar. Adicionar
o cido clordrico 1N, esfriar at 25C e acrescentar o bissulfito de sdio. Guardar a
soluo em ambiente escuro durante pelo menos 12 horas ( a recomendao de 48
horas). Em seguida, adicionar 2g de carvo ativado, misturar e filtrar.
Obs: Soluo HCL 1N:
HCl concentrado------- 8,5ml
gua destilada------- 91,5ml
9.
Azul de Alcian pH 2,5
gua destilada----------------------------97ml
cido actico glacial--------------------3ml
Alcian Blue 8 GX--------------------------1g
Dissolver o Alcian Blue na gua destilada e cido actico. Agitar por 15 min no agitador
magntico e filtrar em papel filtro. Conservar em frasco mbar.
60
Referncias
ABREU, F.B.; SILVA, D.J.H da; CRUZ, C.D.; MIZUBUTI, E.S.G. Inheritance
of resistance to Phytophthora infestans (Peronosporales, Pythiaceae) in a new source of
resistance in tomato (Solanum sp. (formerly Lycopersicon sp.), Solanales, Solanaceae)
Genetics and Molecular Biology. 31 (2): 493-497, 2008.
AGUIAR, A.S. de. Toxicidade do consumo crnico de baixas doses de etanol
e predisposio ao alcoolismo em animais desnutridos. Tese de doutorado,
Universidade Federal Fluminense. 170p., 2008.
ALMARIO, R.U.; VONGHAVARAVAT, V.; WONG, R.; KASIMKARAKAS, S.E. Effects of walnut consumption on plasma fatty acids and lipoprotein
in combined hyperlipidemia. The American Journal of Clinical Nutrition. 74(1):7279, 2001.
ALVARADO-RICO, S. & CASTRO, L. Histologa del Hgado de Ratas
Tratadas con una Infusin de Hojas de Higuera (Ficus carica). Reporte de Caso. Revista
de la Facultad de Ciencias Veterinarias. 51(2): 99-103, 2010.
ANJO, D.F.C. Alimentos funcionais em angiologia e cirurgia vascular. Jornal
Vascular Brasileiro. 3(2):145-54, 2004.
AUGUSTO, R.M.N. Maltodextrina em raes de leites desmamados com
diferentes pesos. Dissertao de mestrado. Faculdade de Veterinria e Zootecnia da
Universidade Estadual Paulista. 86p., 2009.
ANTUNES, D.M.F. Avaliao da absoro intestinal de D-xilose no modelo
experimental de inflamao intestinal crnica antgeno-especfica em ratos.
Dissertao de mestrado. Universidade Federal Fluminense. 115p., 2007.
ANTUNES, M.T. Fornecimento de dieta mida para frangos de corte e
poedeiras comerciais. Dissertao de mestrado. Faculdade de Zootecnia e Engenharia
de Alimentos da Universidade de So Paulo. 72p., 2008.
AXTELL, B.L. & FAIRMAN, R.M. Food and agriculture organization of the
united nations. FAO Agricultural Services Bulletin. 94, 1992. Disponvel em:
http://www.fao.org/docrep/x5043e/x5043e00.htm. Acesso em 28 de julho de 2011.
BANCROFT, J.D. & STEVENS, A. Theory and practice of histological
techniques. 4 ed. Churchill Livingstone. 1996.
BATISTA, A.G.U; LOPES, R.A.; SOUZA, M.A. DE; KASAI, A.; LOPES,
P.E.V. DE P.; SALA, M.A.; REGALO, S.C.H.; PETENUSCI, S.O. Hepatotoxicidade
de plantas medicinais. XLIX. Ao da infuso de Cayaponia tayuya (Vell.) Cogn. no
camundongo. Revista Cientfica da Universidade de Franca. 6 (1), 2006.
61
CALLEJA, L.; PARS, M.A.; PAUL, A.; VILELLA, E.; JOVEN, J.; JIMNEZ,
A.; BELTRN, G.; UCEDA, M.; MAEDA, N.; OSADA, J. Low-Cholesterol and HighFat Diets Reduce Atherosclerotic Lesion Development in ApoE-Knockout Mice.
Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19:2368-2375, 1999.
CAMPBELL, M.K. & FARRELL, S.O. Bioqumica. Volume 1- Bioqumica
Bsica. Ed. Thomson, 2007.
CARLOS, J. Estudo morfolgico e morfomtrico do intestino delgado de
camundongos imunodeprimidos submetidos dieta enteral contendo prebiticos e
contaminada por Klebsiella pneumoniae. Dissertao de mestrado, Universidade
Federal de Viosa. 77p., 2006.
CARUSO, M. & DEMONTE, A. Histomorfometria do intestino delgado de
ratos submetidos a diferentes fontes proticas. Alimentos e Nutrio, 16 (2): 131-136,
2005.
62
and Fatty Acid Profiles of the Inca Peanut (Plukenetia volubilis L.). Cereal Chemistry.
69:461-463, 1992.
HARDIN, J. A.; CHUNG, B.; LOUGHLIN, E. V. O.; GALL, D. G. The effect
of epidermal growth factor on brush border surface area and function in the distal
remnant following resection in the rabbit. Gut. 44 (1): 26-32, 1999.
HARTMAN L. & LAGO, R.C. Rapid preparation of fatty acid methyl esters
from lipids. Laboratory Practice. 22 (6):475-6, 1973.
HU, F.B.; STAMPFER, M.J.; MANSON, J.E.; RIMM, E.B.; COLDITZ, G.A.;
ROSNER B.A. Frequent nut consumption and risk of coronary heart disease in women:
prospective cohort study. British Medical Journal. 317 (7169):1341-1345, 1998.
HUAMN, J.; CHVEZ, K.; CASTAEDA, E.; CARRANZA, S.; CHVEZ,
T.; BELTRN, Y.; CAFFO, C.; CADILLO, R.; CADENILLAS, J. Efecto de la
Plukenetia volubilis Linneo (sacha inchi) en la trigliceridemia posprandial. Anales de la
Facultad de Medicina. 69(4):263-266, 2008.
HUAMAN, P.L.T. & FLORES, E.B. Estrategias de comercializacin del Sacha
Inchi. Revista de Investigacin de la Faculda. de Ciencias Administrativas.12 (03):
37-49, 2009.
HUI, Y.H.; JOHN W. Handbook of food products manufacturing. Sons
Publication, USA, 2007.
INSTITUTE OF MEDICINE. Dietary Reference Intakes (DRIs) for energy,
carbohydrate, fiber, fat, fatty acids, cholesterol, protein, and amino acids. Part 1.
National Academy Press. 2002.
JOINT FAO/WHO/UNU Expert Consultation 1985.
JOLY, A. B. Botnica Introduo taxonomia vegetal. Ed Nacional, So
Paulo. 3ed, 1976.
JUNQUEIRA, L.C. & CARNEIRO, J. Histologia Bsica. 11 ed, Rio de
Janeiro, Guanabara Koogan. 2008.
KARNOVSKY, M.J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high
osmolality for use in eletron microscopy. Journal of Cellular Biology. 27:137-138,
1965.
KASHYAP,V.S.; SANTAMARINA-FOJO,S.; BROWN,D.R.; PARROTT,C.L.;
APPLEBAUM-BOWDEN,D.; MEYN,S.; TALLEY,G.; PAIGEN,B.; MAEDA,N. E
BREWER JR.,H.B.B. Apolipoprotein E Deficiency in Mice: Gene Replacement and
Prevention of Atherosclerosis Using Adenovirus Vectors. The Journal of Clinical
Investigation. 96:1612-1620, 1995.
65
66
68
70
ZAMBN, D.; SABAT, J.; MUOZ, S.; CAMPERO, B.; CASALS, E.;
MERLOS, M. Substituting walnuts for monounsaturated fat improves the serum lipid
profile of hypercholesterolemic men and women: a randomized crossover trial. Annals
of Internal Medicine. 132(7): 538-46, 2000.
ZHANG, S.H.; REDDICK, R.L.; PIEDRAHITA, J.A.; MAEDA, N.
Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E.
Science. 258:468471, 1992.
ZHANG, L.; GENG, Y.; YIN, M.; MAO, L.; ZHANG, S.; PAN, J. Low u-6/u-3
polyunsaturated fatty acid ratios reduce hepatic C-reactive protein expression in
apolipoprotein Enull mice. Nutrition. 26: 829834, 2010.
71