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DE
SANTIAGO
DE
CHILE
FACULTAD
DE
QUIMICA
Y
BIOLOGIA
DEPARTAMENTO
DE
BIOLOGIA
BIOQUIMICA
VEGETAL
LICENCIATURA
EN
BIOQUIMICA
Facultad
de
Qumica
y
Biologa
Departamento
de
Biologa
Actividades
prcticas.
Obejtivo.
Identificar
estructuras
de
la
clula
vegetal
mediante
el
uso
de
microscopa
ptica
y
tinciones
histolgicas.
1. Observacin
de
catafilo
de
Allium
cepa.
Separe
un
catafilo
de
un
bulbo
de
cebolla
y
mantngalo
en
una
placa
con
agua
destilada,
corte
en
dos
el
catafilo.
El
primer
catafilo
transfiralo
directamente
a
un
portaobjetos,
observe
la
organizacin
celular
a
10x
y
40x;
dibuje
lo
observado
a
escala,
reconociendo
el
mayor
nmero
de
estructuras
posibles.
El
segundo
trozo
somtalo
a
tincin
con
Facultad
de
Qumica
y
Biologa
Departamento
de
Biologa
El
potencial
hdrico
()
mide
la
tendencia
del
agua
para
moverse
a
travs
de
un
sistema,
tal
como
el
suelo,
atmsfera
y
clulas.
Mide
la
tendencia
del
agua
para
moverse
desde
un
sistema
hacia
el
exterior,
o
viceversa.
Si
existe
un
equilibrio
osmtico,
la
variacin
el
potencia
hdrico
es
cero
(d
=
0),
y
por
ende,
no
hay
presin
de
turgencia
en
el
tejido
(p
=
0),
por
lo
que
el
potencial
osmtico
del
lquido
intracelular
puede
ser
igual
a
la
presin
osmtica
de
la
solucin
en
que
est
contenida.
Pese
a
que
la
definicin
termodinmica
puede
ser
bastante
obvia,
es
difcil
determinar
el
potencial
pues
los
mtodos
se
basan
en
poner
tejidos
en
diferentes
soluciones
para
obtener
la
que
est
en
equilibrio,
tal
como
se
realiza
en
el
mtodo
de
Chardakov.
Objetivo:
Evaluar
las
propiedades
hdricas
de
las
plantas,
comprender
los
conceptos
de
osmosis,
plasmlisis
y
presin
de
turgencia.
Evaluar
teora
tensin-adhesin-cohesin.
1.-
Mtodo
de
Chardakov
en
tubrculos
de
papa.
1. Medicin
del
potencial
osmtico
mediante
el
mtodo
de
Chardakov.
Solucin
de
Sacarosa
0
(agua)
0.2
M
0.4
M
0.6
M
0.8
M
1.0
M
Solucin
de
NaCl
0
(agua)
0.1
M
0.5
M
1.0
M
2.5
M
5.0
M
Ponga
trozos
de
catafilo
de
cebolla
en
las
diferentes
soluciones
durante
15
minutos
con
azul
de
metileno,
enjuague
el
exceso
de
tincin
(tenga
cuidado
de
hacerlo
con
una
solucin
de
la
misma
concentracin
de
sacarosa
o
NaCl
en
donde
estaba
contenido
el
catafilo).
Mire
al
microscopio
y
dibuje
sus
observaciones.
Indique
el
fenmeno
observado.
3.-
Teora
tensin-adhesin-cohesin.
Ponga
un
trozo
de
apio
cortado
bajo
agua
en
una
solucin
al
5%
de
rojo
neutro
en
diferentes
soluciones
de
sacarosa
(0,
0.2,
0.4,
0.6,
0.8
y
1.0
M).
Cada
2
minutos,
durante
20
minutos
realice
una
medicin
de
cuanto
ha
subido
el
colorante
por
los
haces
vasculares.
Grafique
el
movimiento
por
capilaridad
en
funcin
del
tiempo.
Calcule
la
ecuacin
que
describe
la
curva
y
explquela.
Metodologa.
Se
le
entregar
tres
sets
de
trigo
etiolado,
no
etiloado
y
tratado
con
paraquat
(0.5%).
1) En
primer
lugar
medir
la
eficiencia
fotosinttica
(relacin
Fv/Fm)
con
el
aparato
de
medicin
de
eficiencia
fotosinttica
(PEA,
Hansatech).
Coloque
los
clamps
cerrados
sobre
hojas
al
azar,
mantnga
por
15
minutos
y
luego
con
la
supervisin
del
profesor
y/o
ayudante
coloque
la
fuente
de
iluminacin
e
irradie.
Registre
los
datos
entregados
por
el
equipo.
2) Luego
tome
muestras
de
100
mg
y
macerelas
en
mortero
fro
con
acetona
80%,
centrifugue
y
recupere
el
sobrenadante.
Diluyala
25
veces
en
acetona
80%
(en
una
cubeta)
y
mida
la
absorbancia
a
665
y
649
nm.
Clorofila
a
(g/ml)=
13.96
x
A
(665)-
6.88
x
A
(649)
Clorofila
b
(g/ml)=
24.96
x
A
(649)-
7.32
x
A
(665)
Grafique
la
relacin
Chl-a/Chl-b
3) Tome
muestras
de
1
g
y
extrigalas
en
1
mL
de
etanol
80%
mediante
maceracin
en
mortero
fro.
Luego
centrifugue
y
mida
del
sobrenadante
lo
siguiente:
Contenido
de
azcares
totales:
utilice
el
reactivo
de
antrona
sulfurica,
para
ello
mezcle
3
mL
de
reactivo
de
antrona
sulfrica
(150
mg
de
antrona
en
100
mL
de
Facultad
de
Qumica
y
Biologa
Departamento
de
Biologa
cido
sulfrico
70%
v/v)
y
100
L
de
extracto
etanlico,
deje
reaccionar
por
15
minutos
y
mida
la
absorbancia
a
620
nm.
4) Tome
muestras
de
1
g
y
extraigalas
en
1
mL
de
agua
desionizada
mediante
maceracin
en
mortero
fro.
Luego
centrifugue
y
mida
del
sobrenadante
lo
siguiente:
Contenido
de
almidn:
tome
50
L
de
extracto
acuoso
y
mezcle
con
950
L
de
solucin
de
lugol
(0.1X)
,
deje
reaccionar
1
min
y
mida
la
abosrbancia
a
583
nm.
Facultad
de
Qumica
y
Biologa
Departamento
de
Biologa
Actividades
prcticas.
Objetivo.
Evaluar
el
efecto
de
hormonas
en
el
crecimiento,
germinacin
y
maduracin.
Sesin
1.
1. Participacin
de
giberelinas
en
la
salida
de
la
dormancia.
a. Desinfecte
y
active
las
semillas
de
acuerdo
al
siguiente
protocolo:
- Tome
10
semillas
de
cebada
(Hordeum
vulgare)
y
crtelas
transversalmente.
La
mitad
que
contiene
el
embrin
deschela
y
la
otra
mitad
que
contiene
el
endosperma
esterilcela
incubando
por
10
min
en
1%
de
NaClO.
Lave
con
agua
(x
5).
- Tome
otro
grupo
de
10
semillas
y
esterilcelas
de
igual
forma.
- Luego
ambos
grupos
de
semillas
se
embeben
en
H2O
por
1
hora.
Compare
la
actividad
-amilasa
de
ambos
lotes
de
semillas,
siguiendo
el
protocolo
que
se
indica
a
continuacin:
- Se
utilizarn
placas
petri
que
contienen
agar
al
1%
y
almidn
al
1%.
Las
semillas
con
y
sin
embrin
se
colocan
en
las
placas
en
forma
vertical
y
se
dejan
por
48
hrs.
Al
trmino
de
la
incubacin,
las
placas
se
revelan
con
lugol
y
se
mide
el
halo
de
actividad
en
torno
a
los
grupos
de
semillas.
Se
correlaciona
el
dimetro
del
halo
con
la
presencia
o
ausencia
de
embrin.
Qu
otros
mtodos
podran
entregar
informacin
cuantitativa
de
la
actividad
-amilasa?
Cmo
podra
actuar
el
GA3
estimulando
la
actividad
-amilasa?
Proponga
un
modelo
y
disctalo.
Qu
otro
mecanismo
de
regulacin
de
la
actividad
-amilasa
conoce?
2. Participacin
de
ABA
en
la
germinacin.
Desinfecte
un
grupo
de
semillas
de
trigo
de
acuerdo
al
protocolo
anterior.
Luego
un
grupo
actvelo
con
200
mL
de
agua
destilada
durante
1
hora
y
otro
grupo
actvelo
en
200
mL
de
agua
destilada
y
agregue
200
L
de
solucin
de
ABA
5
mg/mL.
Tome
registro
cada
48
horas
del
porcentaje
de
germinacin
durante
una
semana.
Facultad
de
Qumica
y
Biologa
Departamento
de
Biologa
Trabajo
prctico.
Se
le
entregar
un
set
de
plantas
de
tabaco,
una
control
y
sometida
a
estrs
salino
(300
mM
de
NaCl)
ii.
iii.
iv.
v.
Peroxidasas
totales
(guaiacol
peroxidasa,
POD)
i.
ii.
iii.
iv.
v.
Extraccin
de
metabolitos
antioxidantes.
1. Tome
100
mg
de
tejido.
2. Homogenice
en
mortero
utilizando
1
mL
de
etanol
85%.
3. Traspase
a
un
tubo
eppendorf.
4. Centrifugue
a
10000
rpm
y
traspase
el
sobrenadante
a
un
tubo
nuevo.
Medicin
de
la
capacidad
de
atrapamiento
del
radical
libre
1,1-difenil-2-picrilhidrazil
(DPPH):
i. Preparar
solucin
de
DPPH
de
absorbancia
0.75
aproximadamente.
ii. Tomar
un
volumen
de
0.98
mL
de
DPPH
iii. Agregar
20
L
volumen
de
extracto
iv. Medir
una
cintica
de
4
min
a
517
nm
v. Calcular
el
%
de
DPPH
consumido
Medicin
de
dao
en
membranas
(lipoperoxidacin
de
membranas)
por
el
mtodo
de
las
sustancias
reactivas
al
cido
tiobarbitrico
(TBARS):
1. Tome
100
mg
de
tejido.
2. Homogenice
en
mortero
utilizando
2
mL
de
TCA
(1%).
Facultad
de
Qumica
y
Biologa
Departamento
de
Biologa
7. Medir
la
absorbancia
a
532
y
600
nm
8. Realizar
los
clculos
con
el
coeficiente
de
extincin
molar
155
mM-1cm-1
usando
A532-A600
Parte
2.
Zimografa
de
la
actividad
POD
Prepare
un
gel
de
poliacrilamida
(acrilamida:bis-acrilamida)
al
10%
segn
el
siguiente
protocolo,
para
6
mL
de
solucin
utilice:
3.8
mL
de
agua
miliQ
3.4
mL
de
solucin
acrilamida:bis-acrilamida
30%
2.6
mL
de
buffer
tris-HCl
1.5
M
(pH=
8.8)
0.1
mL
de
SDS
10%
0.1
mL
de
persulfato
de
amonio
10%
Homogenice
por
inversin
y
agregue
20
L
de
TEMED
Rpidamente
deposite
en
los
vidrios
para
formar
el
gel,
utilice
una
peineta
de
12
pocillos
Una
vez
gelificado,
cargue
utilizando
un
tampn
de
carga
SIN
SDS
y
SIN
b-
MERCAPTOETANOL
Coloque
los
vidrios
en
el
sistema
de
electrolisis
(cmara
electrofortica)
y
corra
2
horas
a
100
V,
utilizando
tampn
tris-glicina
1X
(3.0285
g
tris,
14.4
g
de
glicina,
pH=
8.3).
Luego
saque
el
gel
de
los
vidrios
y
colque
el
gel
en
100
mL
en
tampn
tris-HCl
(50
mM,
pH=
8.0)
Incube
1
minuto
con
100
L
de
H2O2
12.5
L
de
SensiMix
2
L
de
mezcla
de
primers
5
L
de
agua
DEPC
5
L
de
solucin
de
RNA
0.5
L
de
solucin
de
inhibidor
de
RNasa
Centrifuge
1
min
a
mxima
velocidad
y
programe
el
equipo:
RT
tradicional
(30
min
a
72
C)
y
50
ciclos
de
PCR,
utilizando
58
C
de
annealing
Los
sets
de
primers
sern:
rna18S
dhn
CTTAGCAGAACGACCAGCGA
TCTTCATCGATGCGAGAGCC
GCCAGAGATTAAGGAGCGGG
ATCGGTGGAGTTTGTCGAGG