M,g,f-l 4,cer--REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR

ET DE LA RECI{ERCHE SCIENTIFIQUE

CENTRE I'NI\ZERSITAIRE DE OUARGT,A

]NSTITUT DE CHIM]E ]NDUSTR]ELLE

Mmoire de fin d'tude

Prsent en vue d'obtention du titre

INGENIEUR D'ETAT
Spcialit : Chimie industrielle
OPTION GENIE CHIMIQUE
Prsent par

Zoubeidi Chahinaz

%ncalrorr,

'm/%rdire.3.
'm/rA6auaaaua.%t

* Promotion 2000 a

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR

ET DE LA RECHERC}IE SCIENTIFIQI]E

CENTRE TINI\IERSTfATRE DE OUARGI,A

]NSTITUT DE CH]MIE ]NDUSTRIELLE

Mmoire de fin d'tude

Prsent en rrue d'obtention du titre

INGENIET]R I}'ETAT
Spcialit : Chimie industrielle
OPTION GENIE CHIMIQUE
Prsent par :
Zoubeidi Chahnaz

La mise au point d'une mthode

D'identification et de dosage d'un
Stimulant Pseudophedrine, HCI
Dans un milieu biologique urines

%nnadr,e,un:

Tn**.di.},.3.
'm/a%rw"rti"rr*.Kr.

c Prsmstion 2000

F
I
I

l
I
I
L

DEDICACES
I

L-

,I

i
I

ta ddie ce trqvail

L
l-

- A nrcs chresparents (Mekki, F'elta) qui ontveille oecttne grande atrcntionpour-raliser

c'ette russite dsns mes tudes.

I

\l

A toutes personnes participes de m'aider pour faire se bon travail

:_

L-

proches( Ahmed, Samira )

sans oublie mes

LI

- A mes frres : Amar, Saci, Lamin, Lzhar, Bralm, Idriss, Yassine, Mouhamed.

- A mes surs : Hayat, Linda, Anissa, Fetna, Zovlua, Nawel, Ghozlane, Samira, Ahlame.

i
I

tI

- A tous la section de 5*" anne.

t

L
. A Kadm, Touhami.
i
I

t-.

l
l

I
I

I
I

t
I

I
I

t_

Z. Chahinaz"

F
I
I

I
I

Remerciements

l-

Ce traveil a t ralis au niveau des laborutoir,es de chimie analytique l'CRl )

\a\dal

,Vozr^r

cncodreur Mr R.Segni de leur conseils prcieta qu'il nous a olf'ert ainsi pour la

tenons en celte occasion exprimer nofre pra/bnde reconnaissonce notre

t'ottJiance

qu'il nous o accord.

()rte notre promoteur

Mr K.Bouarioua assistant tla recherche.

Nos remerciements ntotre examinateur

Mr Bencrghzer.Mourad, ingnieur

spcialistc

L'

t'himie industrielle, poutr son aide.

L
I

I
,

\--'t

\-

4cs remerciements sont galement Mme. Hamdi.N,

;un lqboratoi.re de chimie analytique.

t:nfin taut le personnel de l'CllD Saidol surtout ceux des laboratoires de chimie
analytique, pharmaco-toxicologie

eT

galnique, qui nous ont t d'une grande aide

iI

I
I

pour m'avoir acateilli dans

(ndanl lo dure de ralisation de ce travail.

!.'t

toLts

qui m'ont aid dans mon trovail.

TABLE DES MATIERS

piigc

TABLE DES MATIERES

LISTE DES TABLEAUX.

LISS DES FIGURES

ABREVIATIONS
INTRODUCTION

P*RTIE THEORIQUE

mdicaments.
9
1- Dfinition. ..
9
2- Rappel de pharmacologie gnrale... .
9
ll- Le pseudoephedrine, HCl.
tt
1- lntroduction.
I
2- Caractres et effets thrapeutiques.
I
lll- Les mthodes d'analyses utilises..
... ... .
13
j
1-Spectrophotomtrie UV- visible... .
1-1 Principe de la mthode ..
.. lJ
1-2 Loi de Ber et Lambert ... .
tl
2-1 Principe de la mthode
i
3-Notions de chromatographie
l{)
3-1 Dfinition.
t,
3-1 Classification des mthode chromatographiques. I i,
l- Les

3-2-2 Selon la nature des phnomnes mise en jeu dans

la sparation
3-2-2.a. La chromatographie
3-2-2.b. La chromatographie de
3-2-2.c. La chromatograplrie par d'change
3-2-2.d. La chromatographie exclusion diffusion ..
3-2-3. Selon le procd
3-2-3-a. La chromatographie sur
- La chromatographie srur papier (C
- La chromatographie sur couche mince (C.C.M.)..
3-2-3.b. La chromatographie sur
4-La Chromatographie en phase Liquide Haute Performance
(c. L. H.
4-14-2- Principe de

P.).
lntroduction.
base.

lr;
t,ri

lo
d'adsorption
partage..... 1i
d'ions l-t
. t'i
utilis.
t'
\t
surface.
P.).
17
18
8
colonne.

..

19

I9

4-3- L'appareillage d'un systme C.L.H.p

4-4 les diffrents grandeurs caracttiristiques correspondants
4-4-1 Grandeurs de rtentions.
4-4-2. Efficacit d'une colonne.
4-4-3. Slectivit

l9
20
20

2l
1r
/I

2l
5- Validation d'une mthode d'analyse
5-1- lntroduction
5-2- Dfinitions.....
5-2-1. Spcificit......
5-2-2. Slectivit
5-2-3 linarit...
5-2-4. Fidtit
5-2-4-a- Rptabi lit..
5-2-4-b- Reprod u cti b i it
5-2-5. Seuil de dtection
5-2-6. Seuil de quantification
5-3 Critres statistiques pour valuer une mthode d'analyse
I

PARTIE EXPERIMENTALE
l- Contrle de qualit du

ll- Mise au
llCl

23

/)

.r1

23
23
23
2/+
1.1

:-+

24
24
24
.,'
L1

,t

25

Pseudoephedrine, HCI >) ..............

point d'une mthode de dosage de < Pseudoephedrine,
<<

26
,)a
LU

1-2- Mthodes
1 -2-1. Optim isation des conditions opratoires

:....................

1.2.1-1.Choixdelaphasestationnaire.............
1-2-1-2. Choix de la phase mobile
1-2-1-3. Choix de longueur d'onde....
1-2-1-4, lnfluence de polarit de Ia phase mobile.....
1-2-1-5. lnfluence de pH de la phase mobile
2- Validation de la mthode
2-1. Spcificit...

28
28
29
29
29
2q

3t

3i

a1
)J
a)/

37

2-2. Slectivit......

38

2-3. Li narit.............

Ji)

.)(l

2-3-1. Linarit de l'talon...

2-3-2. Linarit de l'chantillon

a{\

39
44

2-4-2.Re p rod u cti b i it...........................

2-5. Limite de dtection......
2-6. Limite de quantification........
Application de la mthode de dosage du pseudoephedrine, HCI
I

lll

4.t
45
4t)
tlt s

L
i
I

L
I

i
I

L_

l)

L
t

L
I

I
I
I

I
I

I
I

I
I

i
I
I
I

\*

LITE DE TAtsI,IiATiX
"l'ab.n''l: Inilication tlu valeurs de tcteurs de capacit
'l'ulr n 2 :l cs

rstrltats

,, llserr,,lucplrd.lrine, I-lCl

cles

essais

de contrle de qualit du

'l'ah.n'''3 :,Choix do la phasc mobile

'[+b.no4 : Inlluonce de polarit d* la phase

nrohile
'fab.n''S : Intluence de pH de phase
la
rnohile

I'ab.n.'6 : [itude de la linarit du de l'talon

'l'alt"n'7 : lrtutle de la
linarit du I'chanrillon

,'l'lrb rr t(: ll,ludr: tte lrl rplrtivit

clu

<,.

Ilscudocpherlrinc. Il(-ll

'l'ntr rl"9 , Iittttlc tL: lu

r'pr()ductitrilitc ciu I)suutLrcphdrilr:"

llUl

'['ltr n lU . Modc
d"administratiorr

;-

'l

*lr n I I

. !.c.s rsultats obterrus aprs l'application ile la mthuile rJe

r'ilrsos
<<

pseudoephririns. HCI dans les urines

-4-

I,IS'I"Ii DN]S FIGURI

i : Shnra de principc cl'appareillagcs

t;ru rr

tJc

I "(l.l.lI.l).

liig. rr 2: l'rscntation dos caractristiques chromatographiqucs.

I'rg. rr

.J .

Clruix cl$ la phasc stal.it-rnriarre

Iiig. rrnS : Choix de lc-rngueur d'onde.

Fig. rr"6 : Influence de la polarit de la phase nrobile.

i:ig rr'7
f

-..

: Influ,enc* de ptr-I ale la phase rnohile.

ig n''8 : Variation de Tr en fonction

!;ig

du;o/o

*"i : vnriar'ir:,n r"ri: Tr en fonction du

du lampon KF{2pOa

pI{ dc la phase nrobilc.

Fig. n''10 : Etuetre de la speificit.

I : Etrrde de la slectivit.

1;1o.

n'll

Fig.

u"l2

Fig rr'13

: F,tude de la linarit de l'Etalon

: l,.tude de la linarit de l'Echantillon.

I;ig.-n l.l : Courhc d'l,,talonrragc du l'litalon.

liig. n"l 5 : Llourbe <J'Etalonnege du l'Hchantilkrn.
l--ig" nl'l

6 : Etuds.de la,rpetitivit

Fig. nol7 : Etude de la reproducribilir.

Fig. nol S : Etude da la. lir,nite de dtection.

Fig. no}g : Ai:plication de dosage du

<<

Pseudoophedrine. HCI clans les

urins.

Itj;. -o10 : p,rctft'ri'id*n#fi+ntion par spectrophotomtrie

dans'l'ultraviolet

d'absorption

Fi6. no2l : spectrophotomtrie d'ahsorption dans l'infra-rouge

Fig. n"22: Prparation de la gamrne d'talonnage de l,talon.
i

Fig. n"23 : Prparation dc ln gamme d'talonnage de l'chaltillon.

ABREVIATIONS
etrn : Atmosphre.
B.P.C.: bonded Phase Chromatographie (Chromatographie sur phase greffe).
C' : vitesse de lumire.
C : concentration. d'unq solution.
"C.: Degr elsius,
oC/ mn
'
: Degr Par
C.C.M. : Chromatographio sur couche minco.
Ch :Chromatographie.
CFiCl3 : Chk::ofonne.
CH2CI : Dichlarofrme.
CzHsOH : Ethanol.
C}"I.'COOH : Acidc ;,'cetique glacial.
C[]r[tri : Mthanol.
Cl- : Chlorures.
cl HP : chr*r,akrgraphie liquicle haute perlirrrnance
(. i .C. . Chronratographie liquid; ,gol.
L L . Chrornatographic liquidc,l;quidc
r'nr . Ucntilnolrr:.
t'tit : L'hrtrmatographie sur papier. corrcr.:ntruti'rr tlu solut dans la phase

Minute.

Illcrtrilc.
oltlp : Clornprirn"

Cl)

1'

(1.P.. ; Chromatographie en phase gazeuse.

C.l).1.. : Chronlar()graphie en phase liquilc.
Cs : c,rrcentration du,solut dans la phase statir''aire. I).c.1.
IXj : Densit oprique
Ir : Iitalon
qr,',: lectnru voll

gl'i.ltltH't(:

lr

rruiri'e

I'

. hr.h'ogcrre
rtiil* chlorhr.dr.rrlrr,;
.

lt'l

lttt filr.r .
ll,St), . acide rultirrique

ii

IIrl)().j : acide phosphorique.

L I'irrterrsit Ia sortie d'une solution.
I I'itrtcrrsit l'errtre d'utre solutirn.

il

lil*

,ugc.
F,, r-rrlllicient d'.: partage.
i

ir

-6-

K': facteur de capacit.

K* : ion de Potassium .
KBr : Bromure de Potassium..
KzCOg: Carbonates de potassium.
KHzPO+ :tampon phosphates de potassium.
L.D. : limite de dtection.
Log : logarithme doimal
M : molaire.
Mg*: magnsium.

_
-

mg : milligremme.
mdl : milligramme par litre.
mml : milligramnn par millilitre.
mllmin : millilitre par minute,
Na*: ion de Sodium.
NaCl : chlorure de sodium.
NaCIH : hydroxyde de sodium.
NHr : ammoniaque.
NFfo : ion d'ammonium.
NI{4COOCHT : actates d'ammonium.
p.a : principe actif.
pH : potentiel en hydrogne.
ppm : particule par million.
Rf : rference
Rs : rsolution.
T :tolrance
Tj:.temps mort.
Tr: temps de rtention.
To : temprature.
UV: ultra-violet.
V/ : la largeur de I a base de pios.
7o : pourcentage.
qm : nanomtre.
u : la slectivit
: slectivit.
longueurd'onde.
pr : micro
FS/ml : micro gramme par millilitre.
pl : micro litre.

l:

lN'l'RoDt iC'l'toN

[.a 'Pseudoephedrine, HCI'est un principe actit'qui tit partie la

classe des alcalcTdr,s,

il est trs utilis en temps qu'agent dopant et dans

pa.s rnal de prparations pharmaceutiques comme ingrdient

importanoe thrapeutique, CRD SAIDAL

recherche

r:fin de

et vu son

entamer Tout un axe de

dvelopper des mthodes

de

sparations et

d'identifications de ces principes actifs.

C"est dars ^,:i ^xe nue rn'a t propos le prsent sujet qui porte
pour thme 'Mise au point d'un mthode d'identitication et de dosage de
la Pseudoephedrine, HCI dans le milieu biologique (urine)'.

comme mthode de sparation on a opt pour la cLHp qui permet

dc sparer des mlanges complexes en un ternps trs court aves un
s1'stme cle dtection trs scnsible el tablc.

Lc plarr

,.1()

uolrc travail cst conrllosi d'une partie tlrorique qui

,,'l':iLrhr: lrrult:s

r.:,s

inlirunrtions nossaires rcenles sur notre sujet et une

il:ri-li* Pratiqtrc daus lacluelle on a rsunr l'ensenrbls des rsultats trouvs

;rinsi cpre les interprtations adc1uates.

I:ln

liti

lrtto cotrclusion gnralc rsuruc l.: trarail clsrrrald.

ll

:t '- -.

-t

- ll-

I-I,ES MEDICAMBNTS
I-Dfinifion

un mdicament d'une faon trs large, otnnle toute substance qui

atlbct les processus de la vie.

_ L'Organisation Montliale rlc lu Sunt(O.N'I.S.) clonne une

dfinitit-xr plus stricte le tenne nrdicanr;nt s'entend toute substance
ou glrtdttit ulilis r'uc clr: rntditit:r ou rl'tudier urr systrne physiokrgie, ou

i:lilil

()lt

1:rirtltukrgiu cl:rris l"intrt dc sujet arr rlrrol

il adrnirristre[21.

2- ITAPPIIL DE PHARMACOLOCIE GINERA[,8

OIT

IGIN Ii DE N,TI.]DICAN,IENT'S

- bl{iljclLJ :.}"1lrtd::rir . A;riptrle .

:.

llroduit ulTciqrtur-:

\.'l'L:(;()ltl li

r/egtale Artiliciolles-.

sr rrtlrse

IrS Nl li D l ( :.,\NI Ii N' l'Si

l)i'()Bus (ol"iS,ine llltrtrr.ulle t [61

ilrrxJrri(s clrirrri,-1tres llur

s.

lirpat'ittiottr ltahinitltte s(i partir tl* lrlrt:ie rtts

tlnrgucs)

- llrtparitlion rnagistt'alc : pcrsonnaliscs l)()ur un nrulatlic

- l"lltriirlitri rllrlrmaceutiquc_: <lnorninatiorr scicrrlrlicluc (Norrrralisatiorr

.li'

L "IIJPAC)

I)crt,rrttittalion r)tllrnunc
't:'..,i

.l,If

,i

tit iiri

ruii

,r!l

wt)ti

,': l'
l r rr

-,

( nrur sinrple utilisal:lc n tour l)uvs )

e

-r r..iIill

-9-

VOIE D'ADMINISTRATION
()1t,,\l,Es
Solides
Cachets
Comprims
Drages

1,,\R

divers
enrobages

Pilulss

liquidos
sirop
potions
gouttes

soluts aqueux

CCpsules

lifi't'tiR,\Lti

- .,r()us culatt
- intranrusculaire
- intraveineuse
- intra artrielle

Alcooliqu

- intracardiaque
- intrachidien4e - sous

arachiGlules

dienne

Granuls
pidurale
achets

LOCALES

TRANSMBQUEUSE

Application sur la peau

Reotale

anntfation sur

Bucco-lingatilo
oculaires

'l'rachio bronchique

lcs muqueuscs gnito-

ulinaires
Injection

- lntra pleurale
- lrrtra arliculaircs

lr,

Pseudeohedrine

II. PSEUDOEPHEDRINE
':1..

.t,,:t-i,,..

1- INTRODUCTION :[1U

'j'ir'
:"i";
,

leurs espces renferment des

Les phdras sont des sous arbrisseaux dioique,
plupart asiatiques'
quantits notableg d'alcalodes, sont pour la

'

Si l'on a identifi dqn

1a

oe
drogue des flavonoldes et des pranthooyanidols'

s,rhsrnn

,r*nrrf les
tas substanoes azote ce
sont surtout

o:nt

des drivs de types phnthylarrine.

Le co-astituant majoritaire est presque toujours la G) phdrine

totaux, et compagnie de
(configuration lR,2S) qui prsente 40 go%des alcaloides
nor et N'bI
(+) p,?f,,1$oephedrin: d: configuration(lS' 2S)ainsi que des driv
dimthYl corres.

2.CARACTERES ET EFFETS THERAPEUTIQUES:

'Iraitement symptomatique de
ai

la congestion nasale au cours des affections

gues rhino-PharYngs'

et 'node d'administration:Il5l

,Fosologie
-Par voie orale.

-Comprimcontient:60mgdePseudoephdrine,HCl.

Contrr indication:[151
-Risqtre dc glatlcome par femrcttrrc de l'angle'

-R.isqr,:

de rtention tlrinaire lie

notamtnent

des

troubles

urtrr:Prostal iqucs.

-lls sont viter chez les femmes enceinte ou qui allaite'

Prcautions d'emPlois:It5l

L{Cl doit tre

Comme tous les sympathomimtiques, la Pseudoephedrine,
diabtiques' gs ou cas des
utilise avec prudence, chez les sujets hypertendus
psycltose.
'1.

ll

Purtie thorique

'Pseudcohedtine

Sportifs:

Substance interdite (Journal officiel du

7 mars 2000.).- Une Concentrations

strprieure l0pg/ml d'urine est considre comme un rsultat positif

l2

III. LE METHODES D'ANALYSES UTITISEE:

1. SPECTROPHOTOMETRIE ULTRAT VIOLET ET YISIBLE:
1-1. Principe de Ia mthode :

Une analyse UV- Visible revient dterminer les possibilits

d'adsorption lectriques d'une molcule et tracer de bonde
correspondantO

Les transitions lectroniques JV-Visible sont dues l'absorption de

quantum d'nergie lumineuse pr un lectron qui passe d,une orbitale
liante une orbitale antiliante. t10l

es nergios mise en jeu varient en fonction de la longueur d'onde,

et est donnes par la reration dvelopp par planck

E=H*c/1,
E : nergie d'un quantum lumineuse ( E en k cal

mol, ou

C : vitesse de lumire

l": longueur d'onde (qm)

Les groupements chimiques susceptibles de conduire

absorption de la lumire dans l'UV-Visible (200
4m<<B00qm
appeles les chromophormes

il

(C=C; C=C ). Ces derniers

un

) sont

se dfinissent

existe d'autre groupement incapables eux seuls de provoquer

I'absorption.

l-2.Loi de Ber - Lambert: [Tl

13-

t-

Supposant qu'un faisceau de lumire monochromatique

traverser

une solution d'un corps absorbanl soit Jo l'intensit du

lumineuse l'entre de la solution et

faisceau

son intensit la sortie, soit c la

concentration du srps absorbant.

I7t
la loi de Ber et celle de Lambert peuvent exprimer en une relation
unique: [71

Log Io/ I = L. r.C

Io: l'intensit lumineuse l,entre de la solution

I : l'intensit

L:

lumineuse la sortie de la solution

paisseur dc flacon d'analyse de l'chantillon (en

cm)
e : coefficient d'adsorption molaire

c:

la concentration de la solution de substance

analyser

La transition

<<

T est dfinit somme le rapport des deux intensits

lumineuse:

[71

T: f / fo

( on l'exprime souvent en 7o )

La densit optique Do r, ( ou absorbance) est le logarithme

inverse du rapport inverse : [?l

Do=IogIo/I:Ab

- 14-

2.

SPECTROPHOTOMETRE DANS L'INFRAROUGE:

2-1. Principe:
La spectrophotomtrie IR a pour base l,absorption
de l,nergie de
photons (hv) donnant naissance des vibrations
molculaires. [g]
Les photons d'une lumire monochromatique peuvent
galement
entrer en collision lastique avsc certains domaines
moloulaires. [gl
ce procd d'identification c'est trs rargement dveropp
au ours
des dernires annes, cmme dans le cas prcdent
c,est la proprit des
molcules d'absorber certaines radiations lumineuses
qui va tre mise

profit [Il
Toute fois, l'absorption aura lieu

ici des longueurs

d,ondes

utilises en pratique de 200 4000 cm-r.

Les frquences des bondes d'absorption seront

en fonction

des

masses atomiques du vibrateur, de la force

de riaisons, et de la symtrie
de la molcule. [lJ

Le

spectre

IR d'une molcule organique est infiniment

complexe que le spectre

prus

uv-visibre, II comporte un trs grand nombre de

bandes exprimes en qm on parle plutt des frquences
de vibrations
celles-ci sont exprimes en cm-,.
1l1

15-

3. NOTIONS DE LACHROMATOGRAPHIE

3-l.Dfinition:
C'est une mthode d'analyse immdiate par percolation d'un
liquide, ou d'un gaz sur une matire poreuse, ou divise,

Il

se produit

alors des changes rpts entre une phase fixe, qui est appele phase
stationnaire, et les constituant de la phase mobile. Se spare, p&r suite de
la diffrences de leurs vitesse de migration. .[11

3-2.Classi{ication

On peut classer les mthodes chromatographies de trois manires

diffirentes:
2-2-1. elon Ia nature des phases:

La phase fixo (ou phase stationnaire ) peut tre, soit un liquide

solide ayant des proprits adsorbants, soit un liquide qui imprgne un
solide, un liquide qui solvate un solids, et on fait intgrante(on parle,
alors, de gel ), soit, en fin, un solide la surface du quel on a greffe
des molcules appropris. La phase mobile soit un liquide, Ou un gaz
vecteur on distingue[I 7l

Ainsi:

1. chromatographie liquide

solide

2. chromatographie liquide - liquide

3. chromatographie g-

4.

chromatographie

3-2,-2. elon

la

solide

gu liquide

nature des phncmnes mise en jen dans

Ia

sparation:
On distingue

i.

16-

3-2a-r. La chromatographie

d' adsorption

Lorsquo la phase stationnaire est un solide dou de proprits

adsorbantes.[81

Pour obtenir des sparations reproductibles il faut donc maintenir

oonstante la teneur en oau de l'adsorbant. [171

3-2a-A. La chromatographie de partage:

La sparation repose sur la diffirence de solubilit de la molcule
dans les deux phases (liquides) pratiquement, non miscibles.

ou

des

diffirences interactions des soluts avec les motifs organiques. [161

Actuellement,

on utilise,

pratiquement, plus que les phases

greffies, et nous nous limitons. A cette forme de la chromatographie de

partage qui est nomm:

chromatographie de parage

sur phase stationnaire

greffe Bonded

Phase Chromatograph B.P.C, On distingue deux types : [91

La chromatographie de partage de phase normal, Ou la

phase

stationnaire est polaire, et les phases mobiles sont peu polaires.

Ou, la chromatographie polarit de phase inverse ou la phase

stationnaire tant apolaire (plus souven! les motifs greffis sont des
chanes carbonyles), la phase mobile est polaire.

3-2a-*. La chromatographie par change d'ions:

La phase stationnaire est forme de macromolculaires (rsines)

portant des groupements fonctionnels acides ou basiques qui permettent
l'change de certains de leurs ions avec des ions de mme signe du
mlange chromatographie. [8]

3 -lA-A. La chromatographie d' exclusion dilfusion:

On dsigne un prosessus au cours drquul, par

passage des

molcules travers un gel de structure poreuse et en raison d'un effet de

- 71-

tamis. Sous le tentro de pernrulatiorr sur.gcl.lgl

3-2-s.ffassification d'aprs le pnx:rl urilisi.

( )n <lcsturrc

lrn:,i

J-2--t-,r. Lir chromr:rtogruJllrir sur' .,ul l';rct.

-1,;r ( lltroluatogrllllrir,,slu' l)itllicl'

( { l' i ' i;i g,irS:,tirlit,nnilne eSt-rtn

litpritle ntantlclrrr :iut ul) ;ul)lrur I rlu cellulose

II

r,l

-l,;t chrolttatogra;lhie sut' crrrclr* nrirrcc (t .( . \l) : l .r l,lr.r,c

statronuaire datrs cr; cas esl rolctruc sur urrc 6rrrFace plirnc r"i'r" rllilltcre
plrrslit;ttc. otr l'ctrillc d'altrlrrirritutr. tlui

c:t turrrrl\tt'tt.tl rinr.r(,ltr.ll

(tl'e;raisseur :0.5 mm) dc gcl tJe sifice. orr irlurrrinc.

Elle est base sttr l'eflt crapillunc dc

rrrirrec

ltll

lr lrlursu'rrrt,lrrle

ri tlrrrers

lrr

phase slalionnaire. [91

S-Z-Z,lt. La chrolnatographio sur. cokxurt:

I.u phase stutionnaire est une ccllonnc cvlirrtJr"irluc cn v$rrc ou cn nrital.

serlon les modalits de

niigration de la phasc nrobilc orr visagc ;l8l

-[.a chromat*a.raphie par dveloppenrent

-La chromatographie pr lution.

.,,.,

!:) ..,

18t

4- TItROMATOGRAP$ItE
PE:RF'ORNEANCE C.L.H.P

4-1. Introduction

LtQI

rt

DIi A

HAI rTE

La lenteur des sparations de la chronratogmphie en phase liquide

(sirr colonnc ) tait lie aux tibles vitesses cl'lution ncessaire en raison
de l'olTicacit mdiocro des colonnes utilises (0^01 ().00lcm.s-r

). ItTl

Actuellement, on opre avec des vitesses linaires de la piiase

rulrbile cio l'orurc ".c 0.1

cnr.s-l,vitesse corrrparablo

celle dc

la

chromatographie en phase gazeuse . dont elle est conrplmentaire[31. On

parle ici de la chromatographie liquide grande vitcsse
pttltisiott ));

: (( s()trs haute

.le ltattte perli:rmanr,o ((, ou de pcl'lbrrnanco ltautc

lcsolrrtrouu . Il.7l

4-2. Prineipe de nurl,

On opre pratiquement exclusivement par lution, une

tible

quantit de

l'chantilloa analyser est introduite au sommt de la colonne l'aide

d'injecteur ! ,sous l'action de la phase mobile (luant) qui ost presse par
une pompe haute performance (sous haute pression). On observe la
sortie du dtecteur des pics symtriques, plus au moins spares sur le
chromatogramme.

19-

4*. Ltappamflhge dtrm tyrtme de

C.L.fLp.

Un nppardlago C.L.H.P. [Sfcomprend quatre parries principales

'

Une pomp

IJno oolonne

'

[In systme d'injection

Un dtecteur,avcc un systme d'analyse.

Sarnple injector

Colurrrrr

)A'I'A
)rocesso

F'ig. nCIl : chma d'appareillage rle C.L.H.P

di

"-

- 20-

4-4.

caractristiques correspondants Les diffrents

grandeurs

4-4-1. Grandeurs de rtentions:

Temps de rtention tR (min) : C'est le temps d'lution au maximum du
pic mesur partir de I'injection. d'autre par! on pout dfinir le temps de
rtention relatif tp', qui est la diffirence entre le temps de rtention ts et
tno . [81

tps :est

le temps qui mise la

phase mobile pour parcourir la

colonne.

tR'=tn-tno

On utilise, pour caractriser la rtention d'un compos le facteur de

capacit

k' qui est dfini par la relation :[8]

Kt = Cs.Ys / Cy.Yna = I(. Ys I Yru

cs

: Gon'entration de solut

l'quilibre dans la phase mobile.

C11 : coilcentration de solut

Cs/Cu: K : coefficient

l'quilibre dans la phase stationnaire

de partage

Ys : le volume de la phaso stationnaire.

Ys

K'

:le volume de la phase luente contenu dans la colonne.

peut tre dterminer exprimentalement au mo_yen des relations

suivantes:

K'= (V* -

[I7l

Yoo I Ypr =(

ts -

tnr ) / tno

Tab nol": Les valeurs de K, indique que : [l7l

Kt
Compos

<l

Non

Peu

Retenu

l0
Trop

Retenu
Retenu

- 211

retenu

i"

,.1'
',.i

4-4-2.Emcacit de tn colonne

',,-i'

Le nombre de plateaux thorique constitu une mesure de la

capacit d'une colonne de sparation, On peut le calcul par les relaons
,i

sulvantes : [91

N = 16(tr I w)2 = $.Log 2.(trl6)2

w : largeur de pic la base

: largeur de pic mi -hauteur

Pour pottvoir oonrparor crttr<.: dcux r;olonrrcs tl: dillr-entes

longueurs,

rr dtnit la l{auteur

"l'horique(II.[.P.T.

H.,,

tr,

, ou

Equivalente

un

plateau

ff). llTl

-l -{-J, t,a slectiyit:

Pour caractriser la dista:rce sparant les sornrnets de deux pics

cottscutif I et 2, On utilise la slectivit (ou rtentiou relative) 6tinie

par

les relations:

tx = (tp2

[l7l

: K'r / K,,

tnr) /(tru-tpo)

4-1-1. La rs;hution: La rsolution R5 crrtre deur pics cst dtinit par la

rcl.llirrrr: lI71, l9l
Fls

= z(t*:-tRr)/ (u;-r-u,r

)-)

tu

5-

tA

YALIDATIOIY D'UNE METHODE D'ANALYE

5-1. Introduction:

La validation d'une

mthode est une opration destine

dterminer que toute procdure utilise pour
l,analyse d,un produit
conduisant ffictivement au bon rsultat.

[l3l

En bioanalyse, la validation pour objectif de

dmontrer et les
performances de la procdure de dosage
et de prouver que les rsultats
[Slobtenus sont dans les limites bien dfinies.
Ces critres sont les suivants

-Critres fonctionnels

Slectivit

[SJ

:[l3f

Spcificit;
Sensibilit.

-Critres statistiques

Iinarit

Fidlir ( rptabilit, reproducribilir).

Paramtres garantissent I'aptitude de la

mthode donner des rsultats
exacts et constants dans les conditions opratoires
fixs par le laboratoire
de mise au point:
[IJ

5-2. Dfinitions:
5-2-t.spcificir

Est une mthode d'anaryse lorsqu'elle permet

de vrifier le non_
interference le signal de la substance
analyser avec les constifuants
prvenus la formation ou des produits
de dgradation[sJ

'LJ-

5-2-2. lectivit:
La sleotivit d'une procdure analytique est sa capacit tablir de
manire univoque l'existence de

la

substance

d'autres omposnts potentiellement prsents.

5-2-3. Linarit

analyser en prsence

[51

La linarit d'une procdure d'analyse est sa capacit I'intrieur

d'un certain intervalle de dosage, la relation oxistante entre [a rponse
(signal, oxemple: Surthce) et la concentration (quantit) en substance
examiner dans l'chantillon. [131

5-2-*. Fidtir

Est exprime l'troitesse de I'accord entre une srie de mesures

provenant de multiples d'un mme chantillon homogne dans des
conditions prescrites la fidlit peut tre value deux niveaux : [131

-Rptabilit.
-Reproductibilit.
5 -2

-t- a,. Rprabilit

Est une expression quantitative de la prcision, lorsque le mme

oprateur applique la mme mthode sur le mme chantillon, dans le
mme laboratoire, vec les mmes appareils et les mme ractifs au cours
de la mme srie d'analyse. [4]

5-2-4-b. Reproductibitit : Les variations typiques tudier sont

les effets jour, oprateurs, quipements,... etc.

L'utilisation ne doit pas tre tudier individuellement, l'utilisation

d'un plan d'expriences est encourage.
-24-

[51

S-2-S.Seuit de dtection

Le seuil de dtection d'une procdure est la plus petite quantit

examiner dans un chantillon, pouvant tre dtecte mais non quantifie

romme une valeur oxacte.

[41

S-2-e.Seuit de quantifrcation

Le seuil de quantification est dfinie comme la plus petite quantit de

produit qu'il ost possible de quantifier dans les conditions satisfaisantes
de prcision, c'est dire aves une justesse et une fidlit acceptable.

[U

5-3. Critres statistiques pour valuer rme mthode:

Quand on rpte

n fois une mesure exprimentale sur un mme

chantillon (en sens chimique) pour estimer [e bon rsultat, la pratique

consiste d'valuer les critres suivants: [10]

1- La valeur centrale (valeur moyenne arithmtique des valeurs

individuelles):

x = (xr

-t- x2

* ,.. * x j/

2-.L'carttype d'un ensemble des rsultats

: l/ X(xi - x;2t1n-t1
l-

3- Coefficient de variation( l'cart- pe relatif )

Cv= (/x'). 100

(oxprimen%)

-25-

()\Ilt()l'l'l)rr,(J{r^\r,rrr't)rr ,,r'sr.rrr.t.;rrrtrrr.irrt.,il(,r:

l.c ,IrsirLf,, dc lrr.tnotlrc ae lil.usl e {rty11)lL ln!.trt;rrre

lr I rtlcrrtilicalron ct
fir v'errlicalion de sa puret (lu!: rcllctc

lir tlrlli.rcrreu

llrrrrrlt.rc er

r;lr ll

c lir vrr lcrtr

la ',',lcrrr expt'irrrcrrt,ru rrt: I g11.,rrrrrrt: trrt lllll)llt(:ls

s()tl

d'originc rrrirrr.alc ou or.garrit;rrc.

Los ta;rcs suives Jxrur t.alisur
l)l

fi

tr

rir r rr

r,rc t;orrlr

olt: :\onl

(l(.t

llcs iliurs

raeo;rc ortrr,priert rtc.

)c:tr"rililrrrlltril urrlllpgrrrttc irrrc,r;rlr,,ilrrrt.

l'rcrt, l, rclrhctl

t-r r

rrr,rr rrr rrLrrt.

ru

)rrrorrrirt;tl

l,

rn t, lrilr ri, 1rrr":

I
I

i_

I ot11111;" hc'ltlc

l)-I'l lli.t ().Ntt tttYt;\iMtN( )-l

l,lll,.N\'l I l,l{()l,AN()l
L'llt rltiil\ t)ti^il
CrollrrN( l.

;11'1

slrrre trrre: clruni(luo

NH-cH3
",H

HU

cHr

I
-.

,tri..:,

iir':::

:i,,,,:l:i:i,i
.,

..

ti

;+i-l
:\.,
:l_s,t;jt, l

t_.::.i).t.'
,1,.

:,

'

Puids rnol{culaire:

211,

. r-'
I

llr

['es es;ais des rsultg,* repreentes

dans re rabrcau

'26-t

.7ll g ruol

t 1,,'

I
**_

I
l

I,

l"L

L.
LL
I

i-

LL'

Li.
I
LL
LL
;1

ill
:L'i

:.1
!-

-L
I

L
I

-j

L-

L-

Partie

pratiuue

contLlgle quulit e Pseudaeohedrine, HCI

'f,ab no2:rsultats des essais tle contrle de qualit du

pse

udoephedrine , IICI

Paramtres tests

l{ormes

Rsultats

Aspects

Poudre cristalline blanche

ou serrsiblement btranche

Conforrne

Solubilit:
Trs soluble
Trs soluble
Trs soluble
Peu soluble

Eau (HzO)
Alcool (EthOH, 96%)
Actonitrile (cH3cN)
Chloroforme (CHCh)
Point de ftision
Spectrophotomtrie IR

Specffophotomtrie UV-

sible

Spectre chantillon
identique au spectre de
rfrence
Prsente tror.s
rnaximurn :
0.696 Ab
251.4
0.876 Ab
257.1
0.708 At)
262.8

qm
qrn
rm

Corbrme

Confonne

Conforme

Raction chimique
Pcr"te de dessiccation(%
Cendres sulfuriques

D'aprs les rsultats obtenus,

<<

le Pseudoephedrine, HCI

spcification de la (8P.1993, USP.1995, Clark's)..

21

est conforme aLx

Partie

pratioue

mise au ooint de la mthode

II- MISE AU T}IONT D'UNE ME,THODE DE DOSAGE

PSEUE{.JEPHE,DRII\I8, HCI PAR C.L.H.F:

tr-Mthode et matriels:
1-l-.nnatriels et ractifs
*R.actifs

Pseudoephedrine ,HCl (Etalon)

Eau ultra pure (pour H.P.L.C.)

Actonitrile MERC pour H.P.L.C..

Tampon actate d'ammonium pour H.P.L.C.
Tampon drhydrogno phosphate de potassium FLUKA (T--90%)

Mthanol CHROMANORM pour H.P.L.C. (T:999%)

*Appareillagesl

Etuve MEMERT.
Balance analytique de prcision SARTORIUS

Millpore pour filtration HV- 0.45pm

Ultra-son ANNE MASSE S.A.
Chromatographie liquide de type SCHIvIADZU:

- Une pompe L.C.-I0 AD SCI{IMADZU

- - Un dtecteur SPD - Ml0 AV.DAD( Diode .Array .Dtecter.)
- [SIL - 10 AD] Auto injecteuu.
- Colorure de pe . Symrntry Shield. RP C-rs,5 pm,3.9 x 150 rnm
(WATERS); Pr colonne C-rr.

28

Partie

pratioue

mise au point de lamthode

1,{

I-2. Mthodes:

l-2-t

Optimisation tles conditions opratoiresl

La recherche des conditions optimales de Pseudoephedrine ,HCl dans

ut

milieux biologique est ralise en mesurant les paramtres classiques de rtention

pour augmenter la sensibilit et la spcificit du la mthode chromatographie.

l-2-t-t.

Choix de la phase stationnaire

Nos travaux ont t effectu sur un seul types de colonne C-ra sous les
^
mmes
conditions de phase mobile, de longueur d'onde (voir ITg. no3).

Fig. no3: Choix de Ia phase stationnaire

rH

-r

ffi

l-2-t-2.
.-

Choix de la phase mobile

Nous avons procd aux choix de la phase mobile, trois systmes proposs
par la bibliographie. Les rsultats obtenus sont rsums dans le tableau no3 ,vu les
rsultats obtenus, nous avons opt pour le systme n"3 soit Actonitrile
KHzPOq

29

tampon

Tab no3 : choix de la phase mobile

tn de
proportion

Phase mobile

pseudoephedrine,

HCI

Remarque
tn court.
Pic large avec

Methanol /Tampon
70-30

3.185

KHzPO+

un traner
Pic faible avec un tn

MethanoVTampon
CH3COONH4

89-1

4 s03

court
La phase mobile
Un pics symtrie

Acetonitrile/tampon

8.192
Avec un tp suffisant.

92-8

KHzPO+

Fig. no4 :Choix de Ia phase mobile

Phase mobile

n"l

MthanoUeau

Phase mobile no2:

Phasemobile n"3

MethanoUtrrmp on ac tar e

actonitrileV tampon

d'ammonium

KHzPO+

30

Purtie

pratiuue

mise au noint de lu m"thode

1-2-t-S.Choix tte la longueur d'onde

Le

balayage d'une solution de pseudoephedrine, HCI dans

la

phase

mobile entre 21A-270 qm, prsente un maximum d'adsorption 210 r1m. (voir
Fig no s)

Fig. n 5: Choix de Ia longueur d'onde

v
!

l-2-t-q.lnlluence

cle

la polarit de la phase mobile

A fin d'amliorer la rsolution du Pseudoephedrine,

HCI , Nous avons

fait varier la proportion du tampon KHzO+ 80% - 96Yo .Les rsultats obtenus sont

\v

rsums dans le tableau no4:

3l

Partie

prutique

miseJru point de la ffithode

Tab no4 : influenccs de tra polarit de Ia phase mobile.

"/" Tampon KH2P01

'2, Acetonitrile

80

20

ts d'talon (min)

8s
1

08

06
12 1A0

96

tp est en relation avec la polarit de la phase rnobile. Nous avons remarqu, d'aprs

la courbe de la fig. n I que le ternps de rtention augmente avec la polarit

croissante de la phase rnobile donc avec un pourcentage du tampon de KH2POa

Pour ture polarit de 92o/o on otrtient

un

temps de rtention optimale qui

permet:

- Une analyse spcifique pour le pseudoephedrine, HCI

que celles de

composs d'urine.

- Une analyse corrte et sufllsante pour le dosage de Pseudoephedrine

HCI .

1-2-t-S.tnfluence du pH de la phase mobile:

Nous prparons six soltrtions contenants 60 pdml

Pseudoephedrine,HCll , le pH de ces solutiorts varie entre 3 et

Tab n"5, trnfluence

cle

de

B.

pH de Ia phase rnobile sur tp

ts ( min)

11.43s

On observe que le t1i augrnonte quand on augmente le pH,

plus adquat pour donnor rm tp su{Tsant pour notre analyse.

32

pH:

5 c'est

le

oo

sFl
)

!-

rd

NJ

o
Hoo

(Jt

l
I

\o
o\
Fl

t_

g)
l
I

rd

ioq

E
I

o\
I

l-

l.

i.J

lo

l
t(D
l

L-

ll
iT

t\)

ru

\o
O
\o
o\
Fl

L=

ffi

:r

ijij
&s

rd

n
)

FT

(Dr

lo
r--

\o

10
\

lE
IP
ia

Fl

)
tD

l!

lo
lE
(D

7!
Fn
.J

I
I

t_

o
\o
o\
o\
Fl

ffi

&r

u
U

rd

o
P

h
.)

JJ

I
I
I

:
I

FU

ro

:-I
I
I

t-r)

I
I

s.

I
l
I

t-

f!,

r-liP

-.

Oq

FU

L_O

i-

aa

il

O
(J.)
UT

II

iF,

il

-rD

ilr

IJ
t
tD

i(D
il-

'(J
H

t{

lIrD
l-

Fl
p

rv
t-

IP

FU

rO

-l

(t)
tD

iJ

IP

to
L_or
1(D

la

ll-I

t7
I

-.
Ft

(+
il

O
o\

FL<

il
o
oo

I
l

t_

34

"{

I
I

t_
i
I

(I

I
I

i
I

12
I

t_

e
l ro

c)
.E!

0)

"d

U)

(u

I
l

l
I

L-

7o tampon

KH2PO4

I
I

i._

Fig no8:Variation de

tR

en fonction de polarit de la phase mobile

I
I

L-

I
I

l_
I
I

11

E
E

olo
I
I
I

i
i

o
o
Le
o

E
o

Er
o

F
L

i
I

pll
I

Fig no9:Variation de

tR

en fonction de pH de la phase mobile

t_

35

Les rsultats retenus les conditions cluomatographies optimales suivantes

L
C

L
l-

ONDITI ONS CHROMATOGRAPHIQUES

COLONNE :

SYMETRY SHILD RP-1s DI 15pm, 3.9x150mm

PHASE MOBILE

I-TAMPON KH2PO4 92%

t_

2.ACETOMTRILE 8%

2- LONGUETIR

DEBIT

t
l

L*

D'ONDE

SOLUTION

21Oqrn

lmVmin

INJECTEE

L,ETALON INTERNE
DANS LA PHASE MOBILE

INIECTE
pH AJUSTE
VOLLIME

20pl
4.9

L
I

L
I

L
lt_

L
l-

L
36
I

Panie

t_

.]

oratioue

I
i

vgljd.ation de la mthodc

2.VALIDATION DE LA MBTHODE

I
I

Les conditions chromatograplques optimales tant retenues, nous nous

sommes attels tudier les critres de fiabilit de la mthode.

2-1. Spcificit
l
I

Nous avons procd l'injection d'wre solution contenant les urines

sans

Pseudoephedrine ,HCl .

La fig n"tO monke l'absence de tout pic au temps

rtention coffespond au Pseudoephedrine, HCI .

Fig n'10: Etude de la spcificit.

I

t_

t_
3:r

de

L
l

Parti.e

prdsue

vali.ddon de lam&hode

Z-z.lectivit :
I
I

Nous avons procd l'injection d'une solution contenant les urines et le

i

L-

Pseudoephedrine ,HCl ,

la fig noll

monffe

Ia slectivit de pic de

Pseudoephedrine,Ircl que celle des composs de l'urine."

L
I

Iig. n'11: Etude de la sIectivit

t*

L
l

t_

L
I

i
I

t
L

L
t_

l
l

t_

oix

t*
l

l-s.Linarnt:

la

lfuarit

de la

variation

du

surfaces des

pics

du

Pseudohedrine ,Ircl en fonction de la conce,nation de Pseudoephedrine

t_
i

t*

,HCl

>>

a t tudier.

2-3-1.Linarit de l'talon

Dans cs cls, cinq solutions de concenffations differentes de Pszudoryhedrine,

HCI ont t prepares suivant le schma dcrit par ld fr9n"22.
Les rsultats exprimentaux nous ont permis d'tblir le tableau no6 monffe les
chromatogrammes correspondants obtenus.

*i
\\1

Partie

oratique

ilidution de lu mthoile

L'quation de la droite de la forme y

Ax + B est calcule partir

des valerus du

tableau no6.

Tab no6 :Etude de linarit de l,talon

Concentration de
<<

Pseudoephedrine,

20

40

60

80

100

753988

1529333

2308293

3179245

391s346

HCI (pml)
Surfaces des pics de

I'talon

Les valeurs exprimentales portant en abscisse les concentations dg

Pseudoephedrine,HCl et en ordome les surfhces sont portes sur la fig n"12.

L'quation de

la droite cle rgression est y:

39803.14.

coefficient de corrlation de A.99974nontre la trs bonne linarit

-3-Z.l-narit de I, clatntillon

-54547.4. et le
cle

la mthode.

Cinq solutions d'chantillon de Pseudoeptrredrine,HCl de concenhations

varient de 20 100 plrr (derns l'tirine). ont t prpares suivant le schrna dcrit
par la fig no23.

Les rstrltats obtenus partir dcs chrornatogrammes prscnts dans la {lg

no13, sont apports dans le tableau no7, et partir desquels on a pu calculer
l'quation de Ia droite.

Tatr noTt Etude de L'chantillon:

Concentration de
pseudoephed rine(pml )

Surface de pic de

I'talon

698487

5678s9

39

2345327

31 13408

3853453

I
I

*,---"-

t_

:la:'=-

'------.

rili,

.*-,--

- ,t*l: '

..

.*------,,:=- t

Fi-..,',,,',,,,. .,:: r:ri:l:.,-

r::.:r&

N)

qt

L-

';

t_

,f;f

I
I

i0

I*
LP

qg_
I

,o

i t\)
I"
t [r,
I

.L

F}

l
ItD

i#-

l-

ir-

lp
!-

lo

ts

o\
O
a_

)
a

ie

tt

Lts.
lil\

?Dr

'l(.l

tD

:.:

;;

(D'.

lp
|-o:,

tu-=-==..--

,.:

'

l:

n4

::l
llj:lill
i;*i

l.

oo

qt

L
l
I

l_
:

.-';

O
O

qt

'
l

t_

Ir"

g.-;,1,::'

40

?ti-. lij-

i*i?

/,
I

L
I

f,J

ql

(_
I

L
I

I
I

L-

lr.

to0
L-.

frl
a

.lr

I(.)

L
I

IE

lo"
r-CD
rfD

lLP
lJ

t(D
t
L-T

ls
L-

ql

..
tr,
-l.

g
xts.
:

-.
|
(Dr

::t

o\

at

lcx
t
ly

l-l.

ll.
lIg^

tD

-{
)

vI
t

q-i;

s,
I

*ir
:.lri

qt

L
I

L
L-

L-

O
O

ql

L41
l

{}(f
Y=39803.14.X -54547.4

3trdf

R2:0.99974
3(}dr

?*

tql*
tlk
{II(|F

50d
Concentration (Ug/ml)

Fig nol4:courbe d'talonnage de Ia linarit de I'talon.

*2

l_

Y=38124 X

- 813769

R2: 0.9994

Concentration (pg/m)

Fig. no15 : courbe d'talonnage du chantillon

43

Les valeurs exprirnentales portes str la fig no 13 nous en permis de tracer

corrlation 0.9994.

2-4. n'iOlit : Ce pararntre comprend la rptabilit et la reproductibilit de la

mthode.

2-4-t- Rptabilit .une solution contenant l'talon 60pg de << Pseudoephednne,FIC|

a t injecte dix fois

dans

le

cluomatographe, les chromatogrammes

obtenus sont rappofies sttr la fig no16.

Les surfaces des pics sont rsumes dans le tableau n"8, Nous avons calctrl

Tab no8: Etude de la rptabilit du

Nx(i)

Surface de pic de l'talon

2345679

2336748

2349159

2337383

2346211

2329907

2343753

2336672

2336483

10

2340685

X= 2337028.8.

15683.873

Cv = A.49'/"

44

<<

Pseudoephedrine,Hcl

2 - 4 -Z.Wep ro tl

ctibilit

Pour valuer la reproductibilit nous prparons pendant cinq jours

solution contenant 60 pg de Pseudoephedrine, HCI

rme

>> .

Les rsultats obtenus partir des chromatogrammes reports sur la fig no:17
Sont prsents dans le tableau no9.

Tableau n"9: Btude de la reproductibilit du Pseudoephetlrine, HCI

I

2378029

2308293

> .

Surfaces

du pics

2314561 I 2326463

2362s08

X:2337970.8
= 30691.8

Cv =

l.3t"l'

Les coefficients de variation qui restent trs faibles aussi bien dans l'tude

de la rptabilit que dans celle de la reproductibilit montrent une excellente

prcision de notre rntlrode.

45

b.)

o
B
ID

f!r,

oa

(-..

o\

aa

J*

l;:

tl
F}

Y.

t!

r!

t,

r!

T
rr

15

(r}
e

C'
Fl.
\

B
(t

EI

t*e

J46

li:

L
L
3!e

'F

o\(!

t!
J
a:.

L
L

-I(!

L
a,
ts.

(!
I

oe

zo

Fr

-L=*

o\

FJ

I
I

L-

-l

-3

(D

tD

P
t?

-tr

r,ll,

L
t-

-l.

5
ts.
E

-.
-|
(Dr

\oo
o

L
I

L_

li

o
o
I

L
I

t_
:

L--

47

(!
ff

\Jo

o
I

lal

Ft

oq

zo
li

-.I
FI

(r)

o
o

-l

3
t?
g

o
I

(D

SD

Ft

t?

:t

Lr

FF
{-+

-l

o
L

fDr

(
tD

o
L

48

Partie

pratique

validation de tu mthode

Z-S.Limite de dtection

La dtennination de la limite de dtection permet d'valuer la sensibilit

de la mthode, nous l'avons estim en effectuant des dilutions successives d'une

solution de 10-r rng de Pseudoephedrine, I{Cl , nous avons dtermins la

concenfration de plus petite pic dtectable correspondant au rapport de surface

(bruit de fond suprieur ou gale deux).

(voir chromatogramme fig. no18).
La plus petite concentration est gale : 0.01 pg / ml.

fig. n"18 : Etude de Ia timite de dtection.

i
I

Ii'
d'En

t'
I

i.r,, ,... - j
-,:
/?

I'

ir

:.rt.

.I

;i

,.f tr'1!i
:]i
r\ r"
,

r,'
"

,,i,1'

:1. -r'uu|'rj''-t1
.,J11r

,...,&-_._...
i

2-6.La Iimite tle quantification

De mme rnanire, nous l'avons estim, en effectuant, aussi, des dilutions

successives d'ture solirtion de concentration 10-2mg /ml de Pseudoephedrine,
HCI .

Nous avorls dtennin la concentration rninimale ou la mthode est non

linaire(est gale 8pm1).

J9

Psrtie orutiuue
- .---

apolication de lo mthgde

III.L'application de Ia mthode de dosage pseudoephedrine, HCI

>>

dans

l.Administration

l'Urine :
:

Notts avons tudie la molcule de Pseudoephedrine, HCI , aprs 24

hemes de son acLninistration chez rm sujet ( hunain).

Tab n'10: mode d'administration.

Heure

Heure de

Volume Iimin

d'administration

rcupration

aprs 24 heure

age

fminin

23 ans

0.00 heure

24 heure

1025 rnl

Z.Prparatlons des solutions injeater dans Ia c.L.H.p

Etalon

Echantillon:

Solulion rnre
200mg de l'E / l00rnl d'eau

Solution mre

l'llchantillon

1ml i lOml
dans Ia phase
rnobile

lml /

10rr
clans la phase

mobile

4ml I l0m1
dans la phase
mobile

Volume final

Volune final

De concentration

10ml

De concentration : 80 pglml

50

10ml

Purtie

pratiuue

apolication de la 4nth,o*e

Tab nol1: L,cs rsultats obtenus aprs I'application de la mthode

du dosage (( pseudor:phtlrinc , IlCt > clans les urines.
Quantit absorbe de
la pseudoephedrine,

Concentration

Surrface

IICI aprs'une
comprim de 180 mg

Etalon

200t100 .4t10 .

1/10:

80mg (100%)

3294227

80pml

x:299356513294227x

Echantillon

200/100x1/10x4/10

10

299356s

x 100

Calcul

X:2993565/3294227 x2001100 x

X:

72.690/o

3.Interprtation & Conclusion

D'aprs la phannacologique

l/L}x4ll0 x 10 x 100

clinique,

les nonnes de la quantit

limine de Pseudoephedrine, HCI inchange dans les urines varie de 70%

90o par appq la quantit absorbe.

Les rsultats obtenus permettent (Fig n"19 ) de constater chez les sujet que

la quantit lirnine du rndicament dans les urines aprs 24h d'administration

est dans la nomle

5l

t-

i_

Par consquence notre mthode est valide, car elle repond tous les critres de

validation.
I

L
L
I

I
L
L
t_

chantillon

t
L

,!

rtu,li$tqsm

'tri

rft
:iI

,.i

1c

L
I

L
.t
:il

t*

';

t_

I
L
I

min

Etalons
Fig.nol.9 application de dosage du

<<

52

Pseudoepheine, HCI dans les urines

Conclusion

C O F{ C

I,

USIOI GENE,R.ALE

La clrrotnatographie apporte une contribution particulirement irnportante

Pour rpondre aux problmes d'identifications et de dosages dans le cadre du
1'tude de la bioequivalance de notre substance, la

,<

Pseudoephedrine, HCI .

On a procd ture recherche analytique trs pousse afin de mettre au

point ture mthode de dosage de Pseudoephedrine, HCl .par CLHP.

La validation de cette mthode obtenue aprs exploitation statisque des

rsultats dmontre sa fiabilit.

Elle donne de bonne rsultats du faite qu'elle prsente ture limite

de

dtection assez basse (10nml) et confirm par la trs borure linarit avec un
coefficient de corrlation ' 'O.gggl et des coefficients de variations

faibles(O.49a pour la rpetabilit, et

l.3l% pour la reproductibilit).

Ainsi la trs linarit de la mthode stu l'chantillon , ou le coefficient

de

corrlation est perfectionn (coefficient de corrlation est gale a0.9994).

Elle pennet d'appliqu cette mthode pour doser, et identifier

Pseudoephed.rine, HCI .dans le milieu biologique urine .

53

la

Bibliosraphie

(I

BIBLIOGRAPHIE

)
1

1- ALBI:RT LESPACNOL

CHIM]E DES MEDICAMENTS

Tome

I,

1978, France

2- ANONYME : the United States Pharmacopieia

I
I

USP, the notion fonnuly

3-

I
I

Blaque- Belair: Diitionnaire Medical Phannacologique et Thrapeutique

3*'dition, 3*" tirage, 19g5, France

I

L
r

4.

C.H.JEFFERY, J. BASSE, J.MENDI{AM, R.C.DENNEY

L-

VOLGEL'S Quantitative

L-

l-

Chimecal Analysis

""'" dition,1994, Canada

5-E.CHAPIJZET,N.MERCIER : Methodes chromatographiques de dosage dans

les milieux biolo giques

iL)

Stratgie de validation

Rapport de commission SESTP (3),1997

P:169-194,france

t"
t-

6-Georges

PAIIL

MEDIANA EURESCO

Analyse sequencielle du mdicament

l9l4,France.

\
I

L-

-.
i

L
iL-

7-G

cHARLor
Chimie Analytique Gnrale
Tome : II , 1989, Frane.

\-

8.G MAHZIER ; M

HAMOUN

Abrg de Chirnie Analytique

II-rntlrocle de sparatiorl

2u^" dition :

MASSON, 19g6, France.

9-Georg Schewedt

Mthode d'Analyse

ATLAS DE POCI_IE
Edition : CAMOUN, 1994, France.

L.

11-Jean BRUETON Pharmacognoise Phochirnie

PLANTES MEDICINALE

3 "'n"

\*

dition, 1999, France

12. J.P.GIROUD, G.MATFM, G.MEYNTEL

Pharmacolo gie clinique

'-

base de la thrapeutique.Il

1978 France.

:
ta

^ ^m T
tr- IL A.Q

leguide d'Assurance de qualit et de traabilit

\'
,

1"'" dition-1996, France

14- Morter

Matria,. Clark's-Isolation

and Identification of the Drugs-.

Vol: 2, 2"*" dition, pp:944 -945, 1986, Grant Britten

.1S-VIDAL

75mcdition,lggg,France.

6-Journal of pharmacologie etbiornedical Analyse, volume, 1 2,No 12

pp l60t-1606 .1994- Grant Britten

Bibliosrunhie

l7- Mantrel pratique cles mthodes d'analyses-Cpl18- symmetry shield ]'MApplicarions

-Note Book-wATERS

-1ggg-usA

r
\
'J-_

\
I

{.*

I
I

i"_
l
I
I

'l

I
I

i_
T
I

.t_
I

'l
I

I
I

,l

I
'\--

\
:,

'

,i
I

-t
l

fii o :i t,*

\l
j..:JJr."JLr)
.-:;1.:.()C)()

,* -..3

qr :l l r

-{

(s

CT

i)

i,

>=q')nZZ';{TZ
rC=G)(t:Ct:(/1:.
9e:Elf(D9U
ex.n-i=iD
:r<o=:l/(u[Do*
P o,-q, -::

=Y:aU()h.1n
J r5'-Y=
C -

(/)

I
I

(;J

\\
t
L.

=i o

.gi slfl:d
b=^irji5+

r 5' -'
a.A p-"^I rc'RE

(JJ
C C, t-T

C,)

i:-,
a-t

"

aq;0
- !r8

r;)

'
)

G)

O)

l\)

(o

(,)

cn

F-)

o
l.J

}.}
)ra
.i..

f\)

r.

T'

ra
:
J
o
!t'

N)
*t

-.1

IT
(f

(n

l:
L-

oc

(o

Ft

a.t.

,a

J\-

r3
(.1

(,

l
tr
)t)

(r)

E
l-{

(,
!

(,)

'

(-)

+' Ei
l

\*

\,1

F'ig.

No20 : spectre d tidentification par spectrophotomtfle

'

absorptin
:l

dans l'U.V-visible

r::r
r-.{

r:r1
rl;j
ir{

rsf

i1.,1 |

'ii

r,:;r r:,1

. ,

i-r '.1) a-{

,-t lr-r,

r-1.1

,;.it.f.

jj,.r"

i.l

.
r:.:r
..1-'
t'l:l
:,..,
r:1.r
Ll-'
':::)
1,..,

':J-.. tlt..r"..t

rT r {i.J-Jrljl il:l :::

.,-.r rl.rr-4 rJr t,...'Ll

.::.-

:. rl.t '1., i-- r.r

rl.r.,-r tl-::r.rll
rll
r:.r'j l.-t:r j r'jl Lt.1 i:t._.
L-

r.l.r

l,.j
:i...

r.lr r].r
:-, r-.1
,.i.j t.i..
"tr.l.r t:i.:
llj
,'.i\
r::! :.

"r:l'

,
-:ii
Il:1."*r
t:i.t

,-r

r_r.:r

"

i'.... r:'

,.

.r

.l t:J:t

,- { 1 .... r.:r:.,

-- ":lr

tj":l Ll.:t'..t:ii'...r;.il r.J.]

r:a .l r'r.l

l:j...,:!.1 i:1.i r'11 !'a.l

,.1.j

,..)'.r

lr'J r:1'

"-{

l',...

14...

l.f'J

--t

r:.: 1

!::::i

r:I\ !l'..1.;l- i::t::r::|\ r:r.l

r.:r'r r.:l rr.:Ir r"l r

.1 r' ,.1 r: r.l r:1.1

!'

r.:;: r:i;i r:i:;:,I:::ir

"..i

l!:r fij frj ir:r ir)

ri;l

t.i:r

'

,-,t

-t
!......._........... _.....-.i.,._..._ . .-.

. __

........

.r- .

.. .

r::ir

,l

...,... . ,., ..-1.............-..- .....,....r....-

i
!

f,l

t::r''

la'i ra:', -"''

lr"r l|::l
tr
r'j i :r

!-.{ rj;:r

F"ir:i;r"

"'-'

fr:r

L-

:,

r:::;r {:l

r:!'
trl

frit tlir ,i-,

1,';r

risl

t_

h*.r r:r',

,.J',:ir

ti5lt ,

**

lr';r{:iJ. . , .

t'

,,r:jii" -"'
...r

r:51

r:11

I
I

L_

: t:;j
('

::

f..l

I
I

t-

I
|

I
t_

,:ir
,.Li'
i=..r

I
I
!

!=

rlsr

-- .il"

-:

.:'\l

''

h-

iI " l.'{
tlil
r
L_

*"r*-'-".-*
':,'

:: {li,t

['I.'

'

r:iil

1--l
,:j:r i::1 r,..t rii:. rt:.l

lr
t_

...1

r-r :::: r:;l l-J

,l

:'-r--*--**'1rSl
r5r

Fig no22: Prsentation de Ia gamme d'talonnage de l'talon

Pseudoephdrine,HCl
20Omg

Diluer dans 100m1

de la phase mobile

Pipetter 5rnl

Diluer dans 50 ml
De la phase mobile

r r
I

tq [q
I

uster avec la

[q E E E @
+

20p,rnl

a0pml

60p$nl

)o

80pml

phase mobile

100pml

i:

\_:

fig. 23 : Prparation de gamme d'talonnage de l'chantillon

Pseudoephdrine,HCl.
200mg

)'

t
Diluer dans 100m1
de la phase mobile

I
I

Pipetter 5ml

Diluer dans 50 ml
de l'urine

L
L
L

Ajuster avec la
phase mobile

It

L-

L
L

@ @
20pml

a0pn

60pg/n

t
L
T

L-.

l\57

l-l

80pmI

100prnl

u
i

srRo-rsoMRrE DU 2-(MTHyr-A,MrNo)-1 -pHNyLpRopAN-l -oL

I
I

I
I

OH

OI I

I
NI'I.CIi

Hy'yNn'crl3

ll,C IIN-r,-J-a-ll

(-(
1; '\'-'l-'ti
-5 (r
1,',
)

II
6.5

I
I

C[I
65

H,CJH
cI'13

L-

i'

(II

lt

il

t
t

|
5lll3
--l-NIl-clr.r,,,,-,,r,=J__,,
r

--l-orr
|
cll
O

ilo--J--il
I

cl-l

lt.
I

l.,C-l

IN--l-.11
Hi-ol'l

,, -_l-I,,-",,
rro--]- rr

CII

(l) : lvogyrc:-42"

(lr) : rlcxtlogyrc:-r 42"

ct{
(rj

c6I'15

(c) : lvogyrc

(d) : dcxtrogyrc

t/{

r.s ,

, 2.
L

l---

l':rt'tltrt,

2/l

_1

Iiphrlrinc

t'

ls,2s

Ut,2R

++
t--

'lhro

l'}scudophd ripe

l
I

L
t'i

Les stro-isomres (a) et (tl) ainsi que (c) et (d) sont nantiomrss.
Les stro-isomres () et (c) ainsi que (a) et (d) sont diastro-isomres.
Les stro-isomres (b) et (c) ainsi que (b) et (d) sont diastro-isomres.

L'appellation thro dfinit une configuration relative des deux carbones chiraux
voisins (ou norr) telle que des groupes analogues ne puissent pas, par rotation,
tre superposables (mis en coihcidence).

11:XEIIT I'II

I
I

II

1LI

Les stro-isornres clr 2-(mthylamino)- 1 -phnylpropan-1 -ol

(a) et (b)ou 1, 25 et 15, 2R sont considrs comme rhro
(c) et (d) ou 1, 2 et 15, 25 sont considrs cornme thro.

Paramtre maietrr
Rptabilit sur
solution tmoin
Coeffrcient de
corrlation sur
chantillon de
rfrence

Coefficient de
corrlation sur
chantillon
reconstitue
Ecart type de
rptabilit sur
chantillon
manufactur
Limite de dtection
(enYo de la
concentration
normale dose)

Constituant mineur

<

lo/o

Constituant en haces

<

Constituant

<

lo/o

lo/o

> 0.999

>0980

>4.970

> 0.998

> 0.960

> 0.950

<

I.5o/o

<

30

<5Yo

<

0.5o/o

<

Io/o

<5o/o

< lo

<

30

<1}Yo

< 2.50

<

5o/o

<l}Yo

Limite de

quantification ( e,
o/o
dela
concentration
nonnale dose)
Ecart pe de
reproductibilit sur
chantillon
manufachr
Ecart type de
fid1it
Ecart de iustesse

<

4Yo

<

80

<

<

20

4o/o

< lao

TabL2: Types d'chantillons et critres d'acceptation

75o/o