Inm unologa e

Inm unoqum ica

Fundamentos

1. ^

Inmunologa e
Inmunoqumica
Fundamentos
Quinta edicin

ZZZPHGLOLEURVFRP
Ricardo Anbal Margni
P rofesor Em rito de la U niversidad de Buenos Aires. P rofesor H onorario de la U niversidad del Salvador. Ex-Profesor
Titular Plenario de Inm unologa e Inm unoqum ica de la F acultad de F arm acia y B ioqum ica de la U niversidad de
Buenos A ires. M iem bro de la C arrera del Investigador Cientfico (Investigador clase Superior) del C onsejo N acional
de Investigaciones C ientficas y Tecnolgicas (CO N ICET). D irector del ID EH U -Instituto de Estudios d e ia
Inm unidad H um oral (CONICET--UBA)

: !

V B

UaiCACON

ll\A '

______ e d i t o r i a l m e d ic a ----------_

C^paaamericana^
M A R C E L O T. DE ALV EAR 2145 - BUENOS A IRES
B O G O T - C A R A C A S - M A D R ID - M X IC O - S A O P A U L O

BOiS

P rim era edicin, octubre de 1972

S egunda edicin, setiem bre de 1977
T ercera edicin, enero de 1982
C uarta edicin, ju lio de 1989
Q uinta edicin, setiem bre de 1996

ISBN 950-06-1495-2
84-7903-317-7

IM PR E SO EN LA A R G EN TIN A

Q ueda hecho el depsito que dispone la ley 11.723.

Todos los derechos reservados.
E ste libro o cualquiera de sus partes
no po d ra ser reproducidos ni archivados en sistem as recuperables,
ni transm itidos en ninguna form a o por ningn m edio,
ya sean m ecnicos o electrnicos, fotocopiadoras, grabaciones
o cualquier otro, sin el perm iso previo
de Editorial M dica P anam ericana S.A.

1996 ED ITO R IA L M D ICA P A N A M E R IC A N A S.A.

M arcelo T. de A lvear 2145 - Buenos A ires, A rgentina

E sta edicin se term in de im prim ir

en'e.' .mes de setiem bre de 1996
en los talleres de Editorial M dica P anam ericana S.A.
A v. A m an d o A lcorta 1695, Buenos A ires

Colaboradores

Leopoldo F. Abdon

Leonardo Fainboim

D ocente de la C tedra de Inm unologa de la Facultad de

Farm acia y B ioqum ica de la U niversidad de B uenos A ires
M iem bro del IDEHU

Profesor Titular del D epartam ento de M icrobiologa, Parasitologa e Inm unologa, ren Inm unologa, de a Facultad
de M edicina de la U niversidad de B uenos Aires, M iem b ro
de la C arrera del Investigador C ientfico del C O N C E T

lida lvarez
Profesora A djunta de Inm unologa, Facultad de Farm acia y
B ioqum ica ce la U niversidad de B uenos Aires. M iem bro
de la C arrera de Investigador Cientfico del CO N ICET.
M iem bro del ID EH U

Angel Basualdo
Profesor Titulu- de M icrobiologa de la Facultad de M ed i
cina de la U niversidad N acional de La Plata

Guillermo Blanco
M iem bro de ia Carrera deJ Investigador Cientfico del
C O N IC E T, M iem bro del ID EH U

Marta Braun
Profesora T itular de Inm unologa de la Facultad de
V eterinaria de la U niversidad de B uenos Aires, M iem bro
de la C arrera del Investigador Cientfico del C O N IC E T

Gloria E. Cerrone
B ecaria Posdoctoral del CONICFH, Laboratorio de B io lo
ga M olecular, Hospital de C lnicas Jos de San M artn ,
Facultad de M edicina, D ocente de la Ctedra de G entica y
B iologa M olecular de la Facultad de Farm acia y B io q u
mica de la U nivei'sidad de Buenos A ires

Alberto Fossati
P rofesor A djunto de Inm unologa de la Facultad d e C ie n
cias E xactas de la U niversidad N acional de La Plata,
M iem bro de la C arrera del Investigador C ientfico del
C O N IC E T , M iem bro del IDEHU

Mirta Franco
P rofesora A djunta de M icrobiologa de la Iacultad d e F ar
m acia y B ioqum ica de la U niversidad de B uenos A ires

Mirta Giordano
Instituto de Investigaciones H em atolgicas de la A cadem ia
N acional de M edicina, M iem bro de la Carrera del In v e sti
gador Cientfico del CO N IC E T

Fernando Goldbaum
D ocente de la C tedra de Inm unologa de la F acu ltad de
F arm acia y Bioqum ica d e la U niversidad de B u en o s Aires
M iem bro del ID EH U

Stella M. Gonzlez Cappa

P rofesora Titular del D epartam ento de M icrobiologa, P a
rasitologa e Inm unologa de la Facultad de M ed ic in a de la
U niversidad de Buenos A ires, M iem bro de la C a rrera del
Investigador C ientfico del C O N IC E T

Mnica G. Charamonte
B ecaria Posdoctoral del CO N IC E T. D ocente de la
C tedra de Inm unologa de la Facultad de Farm acia y
B ioqum ica de la U niversidad de Buenos Aires.
M iem bro del ID EH U

Ramn A. de Torres
P rofesor T itular de M icrobiologa de la Facultad de F arm a
cia y B ioqum ica de la U niversidad de Buenos A ires,
M iem bro de la C arrera de! Investigador Cientfico del
CO N IC E T

Elvira L. Durante de Isola

P rofesora A djunta de) D epartam ento de M icrobiologa, Iarasitologa e inm unologa de la Facultad de M edicina de la
U niversidad de Buenos A ires

Silvia E. Hajos
P rofesora Titular de Inm unologa de la Facultad d e I:<'armacia y B ioqum ica de la U niversidad de Buenos A ires,
M iem bro de la C arrera del Investigador Cientfico del
C O N IC E T . M iem bro del IDEHU

Nora Halperin
L aboratorio de Inm unogentica. H ospital de C ln icas Jos
de S an M artn

Ileaiia Malan Borel

D ocente de la Ctedra d e Inm unologa de la F acu ltad de
F arm acia y B ioqum ica de la U niversidad de B u en o s Aires
M iem bro de la C arrera del Investigador C ientfico del
C O N IC E T . M iem bro del ID EH U

VI

Colaboradores

Emilio L. Malchiodi

Clelia M. Riera

Profesor A djunto de Inm unologa de la Facultad de Farm acia y B ioqum ica de la U niversidad de Buenos Aires.
M iem bro de la C arrera del Investigador Cientfico del
CO N IC ET. M iem bro del IDEHU

Profesora T itular de Inm unologa y Serologa de la F acu l

tad de C iencias Q um icas de la U niversidad N acional de
Crdoba, M iem bro de la C arrera del Investigador C ientfi
co del CO N IC E T

Marcela A. Manghi

Mara Rivas

Profesora A djunta de Inm unologa de la Facultad de F ar

m acia y B ioqum ica de la U niversidad de Buenos Aires.
M iem bro de la C arrera del Investigador C ientfico del
CO N IC ET. M iem bro del IDEHU

Servicio de Inm unologa del H ospital N acional de Pediatra

Dr. Juan P. G arrahan

Irina Mathov
D ocente de la C tedra de Inm unologa de la Facultad de
Farm acia y B ioqum ica de la U niversidad de Buenos A ires
M iem bro del IDEHU

Estela Roux
D epartam ento de B rom atologa y Nutricin de la Facultad
de Farm acia y Bioqum ica de la U niversidad de Buenos
Aires. M iem bro de la C arrera del Investigador C ientfico
del CO N IC E T

M. Leonardo Satz
Gerardo Mirkin
D ocente del D epartam ento de M icrobiologa, P arasitologa
e Inm unologa de la Facultad de M edicina de la U niversi
dad de Buenos Aires

Marta Minvielle
Profesora A djunta de M icrobiologa de la F acultad de
M edicina de la U niversidad N acional de L a P lata

Claudia Mongini
B ecaria Posdoctoral de C O N IC E T. D ocente de la Ctedra
de Inm unologa de la Facultad de Farm acia y Biociumica
de la U niversidad de Buenos A ires. M iem bro del ID EH U

Laura Morelli
D ocente de la Ctedra de Inm unologa de la Facultad de
Farm acia y B ioqum ica de la U niversidad de Buenos Aires
M iem bro de la C arrera del Investigador Cientfico del
CO N IC ET. M iem bro del ID EH U

Profesor A djunto del D epartam ento de M icrobiologa,

Parasitologa e Inm unologa, rea Inm unologa de la
Facultad de M edicina de la U niversidad de Buenos
Aires, M iem bro de la C arrera del Investigador C ientfico
del CO N IC E T

Norma S. de Speziale
Profesora A djunta de Q um ica B iolgica P atolgica de la
Facultad de Farm acia y B ioqum ica de la U niversidad de
Buenos A ires, M iem bro de la C arrera del Investigador
Cientfico del C O N IC E T

Liliana G. Vauthay
D ocente del D epartam ento de B iologa C elular, H istologa,
Em briologa y G entica de la Facultad de M edicina de la
U niversidad de Buenos A ires, P rofesional Investigador,
D epartam ento B ioterio y C ncer E xperim ental, Instituto de
O ncologa A ngel R offo ,

Claudia Waldner
Ricardo Negroni
C entro de M icologa de la F acultad de M edicina de la U ni
versidad de B uenos A ires

M. Rosa Padrs Vindrola

Laboratorio de Inm unogentica. C entro de Investigaciones
M dicas A lberto Einstein. Profesora de la Facultad de M e
dicina de la U niversidad del Salvador

Marco Pizzolato
Profesor A djunto del D epartam ento de A nlisis Clnicos,
O rientacin Q um ica de P rotenas de la Facultad de F ar
m acia y B ioqum ica de la U niversidad de Buenos A ires

Edgardo Poskus
Profesor T itular de Inm unologa de la F acultad de F arm a
cia y B ioqum ica de la LIniversidad de Buenos Aires,
M iem bro de la C arrera del Investigador Cientfico del
CO N IC ET. M iem bro del ID EH U

Becaria Posdoctoral del C O N IC ET, D ocente de la

C tedra de Inm unologa de la Facultad de Farm acia y
B ioqum ica de la U niversidad de Buenos A ires, M iem bro
del ID EH U

Nora Yranzo-Volont
D ocente de la C tedra de Inm unologa y Serologa de la
Facultad de Ciencias Q um icas de la U niversidad N acional
de Crdoba, M iem bro de la Carrera del Investigador C ien
tfico del C O N IC E T

Marta Zelazko
Jefe del Servicio de Inm unologa del H ospital N acional de
Pediatra Dr. Juan P. G arrahan

Norberto W. Zwirner
Becario Posdoctoral del C O N IC E T. D ocente de la C tedra
de Inm unologa de la Facultad de Ciencias Exactas de la
U niversidad N acional de La Plata, M iem bro del ID EH U

Indice

Prlogos

IX

13. El reconocimiento antignico y

activacin de los linfocitos B y T

257

R icardo A. M argni

I. A SPEC TO S BSICO S D E LA
INM UNIDAD

1. Mecanismos de defensa contra

la agresin

14. Evolucin del sistema inmune

15. Respuesta inmune humoral

R icardo A. M argni

2. La respuesta inmune

14

R icardo A. M argni

3. Bases celulares de la respuesta

inmune. rganos linfoides primarios
y secundarios

47
75

R icardo A. M argni

6. El origen de la diversidad de los

anticuerpos

131

144

M. L eonardo Satz

8. Reaccin antgeno-anticuerpo
in vitro. Interaccin primaria

154

176

201

M. L eonardo Satz.

II . Molculas de adhesin

Elida Alvarez

317

18. Regulacin de la respuesta inmune

327

M arta Braun

19. Anticuerpos no precipitantes,

anticuerpos asimtricos de las
clases IgG. Su relacin con los
precipitantes

345

20. Inmunizacin activa y pasiva

362

II. M EC A N ISM O S E F EC T O R E S
D E L A RESPU ESTA INM UNE

373

21. Mecanismos citotxicos mediados

por clulas

375

M artn Isturiz y M irta G iordano

219

M arcela A. M anghi

12. Citoquinas

S E G U N D A PA R T E

Regulacin neuroendocrina de la
inmunidad de mucosas: un sistema
interactivo-adaptativo

R icardo A. M argni

Ricardo A. M argni

10. El complejo mayor de histocom

patibilidad y su relacin con la
respuesta inmune

M ara E.nela R oux

R icardo A. M argni

Ricardo A. M argni

9. Reaccin antgeno-anticuerpo
in vitro. Interaccin secundaria

306

PR IM E R A PA R TE

M ara Estela R oux y Liliana G raciela Vauthay

M. L eonardo Satz y Ricardo /l. M argni

7. Estructura y organizacin gentica

del receptor T

16. Hipersensibilidad tarda y otras

reacciones de inmunidad mediada
por la activacin de macrfagos
296
17. El sistema inmune de mucosas

33

R icardo A. M argni

5. Anticuerpos

278

R icardo A. M argni

Marta. Braun

M arta Braun

4. Antgenos

267

Guillerm.o Blanco

22. Complemento

386

R icardo A. M argni

231

23. Inflamacin
N orm a S. de Spezicile

435

VIII

ndice

III. INMUNOPATOLOGA

473

39. Inmunoanlisis radiomtrcos

821

Edgardo Poskus

24. Inmunologa de las infecciones

microbianas

475

M irta Franco

25. Inmunologa de las micosis

496

521

V. MTODOS INMUNOQUMICOS

867

531

41. Mtodos cromatogrficos de fase

lquido-slido (LSC) aplicados a
la purificacin de protenas

869

Stelia M. G onzlez Cappa, Elvira L D urante

de J.^olay Gerardo A. M irkin

27. Inmunologa de las infecciones

virales
Ram n A. de Torre.y, Juan A n g e l Ba,gualdo
y M arta C. M invielle

28. Autoinmunidad

559

Clelia Riera, Juliana L eoni y Nora

Yranzo-Volont

29. Estructura y funcin del complejo

mayor de histocompatibilidad

593

M. Leonardo Satz y L eonarch F ainboim

30. Inmunodeficiencias

609

M arta Zelazkj) y M ara Rivas

31. Gammopatas monoclonales

627

Marco Pizzolato

32. Manifestaciones de hipersensibilidad.

Alergia
639
Ricardo A. M argni

33. Inmunologa tumoral

664

Silvia E. Hajos

34. Inmunologa de la reproduccin

852

G loria E. C errone y Laura MorelU

Ricardo N egroni

26. Inmunologa de las infecciones

parasitarias

40. Metodologas bsicas en biologa

molecular. Tcnicas de hibridizaein
y reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR)

Juliana Leone, Irina M atov y Leopoldo

E. A bdon

42. Electroforesis en gel de

poliacrilamida; isoeleetroenfocado;
inmunotransferencia
(immunoblotting)

906

Ricardo A. M argni, Em ilio L. M alchiodi

y M nica G. C hiaram onte

43. Antgenos bacterianos

923

Ricardo A. M argni

44. Antgenos proteicos

932

Ricardo A. M argni

45. Preparacin de sueros inmunes y

purificacin de anticuerpos

937

Ricardo A. M argni

46. Fraccionamiento de
inmunoglobulinas

945

Ricardo A. M argni

681

Ricardo A. M argni e Ileana M alan B orel

VI. APNDICES
IV. M E T O D O L O G IA S
35. Mtodos utilizados para la
identificacin y cuantificacin
de antgenos y anticuerpos

695

697

729

Claudia M ongini y Claudia W akiner

37. Hibridomas y anticuerpos

monoclonales

781

Fernando A lberto G oldbaum

y Carlos A lberto Fossati

38. ELISA
N orberto W. Z w irner

953

R icardo A. M argni

II. Soluciones buffer ms comunes

usadas en inmunologa

Ricardo A. M argni

36. Metodologas para la evaluacin de

las clulas inmunocompetentes

I. Preparacin de adyuvantes

951

957

R icardo A. M argni

III. Coeficientes de extincin molar

(E^,) de sustancias de bajo pe'So
molecular usadas en inmunologa
y Coeficientes de extincin porcentual
(E|'*n,) de protenas usadas en
inmunologa
960
Ricardo A. M argni

IV. Nomenclatura de los aminocidos

962

R icardo A. M argni

798
ndice analtico

963

Prlogo de la quinta edicin

El avance acelerado de los conocim ientos

en e] cam po de la inm unologa, sustentados
en hiptesis planteadas y en el desarrollo de
una m etodologa de avanzada, ha hecho que
los textos sobre tem as relacionados con esta
ram a de las ciencias biolgicas deban ser re
novados perm anentem ente, y muy esp ecial
mente si ellos pretenden dar una visin gene
ralizada de los fen m en o s inm unolgicos.
H asta no hace m ucho tiem po, un libro con
cinco aos de antigedad, salvo raras ex cep
ciones tena plena vigencia. En la actualidad,
ese tiem po m arca la necesidad de elab o rar
una n ueva edicin con la in corporacin de
todos los conocim ientos surgidos durante ese
perodo.
se es el m otivo de la 5"' edicin de In m u
nologa e Inm unoqum ica y es nuestro deseo
que sta llegue a tener la acogida de las cua
tro ediciones anteriores. Para que ello pueda
concretarse se ha hecho una revisin p o rm e
norizada de los diferentes captulos que co m
ponen el libro, incorporando nuevos concep
tos e hiptesis as com o la m etodologa m s
adecuada para poder encarar, desde el punto
de vista experim ental, los diferentes estudios
que puedan llevar a la clarificacin de h e
chos an no dilucidados. Se ha procurado,
adems, que la m ayor cantidad posible de las
figuras sean en colores para que sus interpre
taciones se vean facilitadas.
D ada la im portancia de las m olculas de
adhesin en el desarrollo del proceso in m u
nolgico, al igual que las citoquinas en l in

volucradas, se han incorporado sendos ca p

tulos sobre estos tem as y el captulo sobre in
flam acin ha sido actualizado sobre la base
de esos conocim ientos. Del mismo m od o se
incluye" el anlisis de los eventos b io q u m i
cos que ocurren durante la tran sd u cci n de
seales que llevan a la activacin de lo s lin
focitos T y B y a la desgranulacin y lib e ra
cin de m ediadores qum icos por las clulas
b a s fila s e sp ec fic am e n te e stim u la d a s. El
avance en el conocim iento de la estructura y
funcin de los anticuerpos IgG asim tricos
nos h a llevado a la am pliacin del captu lo
correspondiente y a la incorporacin d e un
captulo sobre Inm unologa de la R eproduc
cin, proceso en el que estos anticuerpos de
sem pean un papel im portante.
D esde el punto de vista m etodolgico los
captulos correspondientes han sido a c tu a li
zados, incorporando nuevas tcnicas d e uso
corriente en el laboratorio inm unolgico co
mo son las tcnicas bsicas de biologa m o le
cular, hibridaciones, PCR, crom atografa l
quida de alta eficiencia (HPLC, FPLC), tc
nicas p ara estudios de la inm unidad celular,
etc., y todas aquellas que resultan in d isp en
sables para un buen estudio inm unolgico e
inm unoqum ieo.
L a base del desarrollo de nuestros conocim entos es el ID EH U -Instituto de E studios de
Inm unidad H um oral (C O N IC ET-U B A ) y la
c te d ra de In m u n o lo g a de la F a c u ltad de
F arm acia y Bioqum ica de la U niversidad de
Buenos Aires. Jvenes que con el co rrer del

Prlogo de la quinta edicin

tiem po se han ido incorporando a nuestro lugar de trabajo, se han transform ado hoy en
expertos en diferentes aspectos de la inm unologa. Es por este m otivo que a los inm unlogos de prestigio que colaboraron en la
edicin anterior, se sum an en esta 5"* edicin
nuevos autores, que aportan todos sus conocim ientos adquiridos en el desarrollo de sus
tem as de trabajo. Como en ediciones anterio
res, los diferentes autores han respetado los

lincam ientos generales del libro, pero han le

nido plena libertad para expresar sus conocmientos.
Finalm ente, quiero expresar mi agradecm iento a Editorial M dica Panam ericana por
todo lo hecho p ara que esta nueva edicin
del libro pudiera concretarse,

R ic a rd o

A.

M arg n i

Prlogo de la primera edicin

En la ltim a dcada se han pubhcado nu

m erosos y muy buenos textos sobre Inm uno
loga e Inm unoqum ica, escritos p rin c ip a l
m ente en ingls y fran cs, algunos d e los
cuales fueron traducidos al espaol. L am en
tablemente, dado el tiem po transcurrido entre
su escritura en el idiom a original y la apari
cin de las traducciones, y la constante evo
lucin de los diferentes aspectos de la In m u
nologa, algunos de los captulos incluidos
en aqullos han perdido actualidad.
Cuando se decidi la publicacin de este
libro, en ningn m om ento se pens en trm i
nos de com peticin. Sim plem ente, se procu
r escribir en espaol un texto que pudiera
ser til y accesible no slo a nuestros alum
nos de la carrera de B ioqum ica que deben
cursar Inm unologa e Inm unoqum ica, sino
tam bin a todos aquellos que deseen iniciar
se en estas disciplinas y no dominen lenguas
extranjeras, en especial el ingls.
El libro ha sido dividido en tres partes, y se
han incluido adem s tres apndices. En la
parte prim era se han expuesto los conceptos
tericos bsicos de la Inm unologa. A dem s
de hacerse el estudio de los antgenos, anti
cuerpos y complemento y sus mecanism os de
interaccin in vitro e in vivo, se han incluido
un captulo sobre enfermedades autoinmunes,
en especial las de tipo experimental, y otro so
bre las bases inm unolgicas de) rechazo al in
jerto homlogo por considerarlo de sum a im
portancia en el m om ento actual. Los funda
mentos tericos sobre el concepto de afinidad
de los anticuerpos y los mtodos para medir

su Ko (constante de asociacin intrnseca pro

m edio), n (valencia) y a (factor de hom oge
neidad), han sido desarrollados en detalle.
L a p a rte segunda in cluy e la d escripcin
detallada de los m todos serolgicos m s im
portantes para la identificacin y cuantifica
cin de antgenos y anticuerpos.
U na serie de tcnicas de uso frecuente en
In m u n o q u m ic a han sido a g ru p a d as en la
p a rte tercera.
M todos para la activacin de resin as de
intercam bio inico, preparacin de colum nas
para crom atografa y filtracin por g eles, dis
tintos buffer de uso en Inm unologa e Inm u
noqum ica y una hsta de los
y
de
num erosas sustancias, en especial haptenos
de com posicin qum ica definida y protenas
antignicas o con actividad anticuerpo, for
m an parte de los tres apndices.
Se ha incluido un buen nm ero de grficos
y fotografas, de modo que faciliten la inter
pretaci n de los hechos. Han sido elab o ra
dos, en su mayora, con datos experim entales
provenientes de nuestro laboratorios.
En el captulo 4, para la identificacin dei
Complemento, de los com plejos in term edio s.
resultantes y de los productos de degradacin
enzim tica de algunos de sus com ponentes,
se ha em pleado la nom enclatura antigua. Ello
ha sido realizado con el objeto de facilitar a
los que recin se inician, el acceso y com
prensin de la bibliografa no m uy reciente
sobre e) tema. N o obstante en la p a rte final
del captulo se transcribe ia nom enclatura ac
tual, recom endada por la O rganizacin iVIun-

XII

Prlogo de la primera edicin

dial de la Salud, as com o sus relaciones con

la utilizada.
Puesto que es ste un lib ro p ara p rin c i
p ian tes, la b ib lio g rafa no fo rm a p arte del
texto. Al final de cada captulo se acom paa
una Bibliografa en la que se indican los li
bros, actualizaciones y trabajos m s im por
tantes, que el lector podr consultar pira p o
der am pliar sus conocim ientos.
En los casos particu lares de d escripcin
d e m todos o tcn icas, las re fe re n cia s b i

bliogrficas estn indicadas en el pie de p

gina.
Al finalizar este breve prlogo se deja e x
presado el reconocim iento del autor a todos
aquellos que de una u otra m anera han co n
tribuido a que sus deseos de escribir un l i
bro en espaol sobre fundam entos de la In
m unologa y la Inm unoqum ica se co n creta
ran.
R ic a rd o

A.

M a rg n i

Prlogo de la segunda edicin

La circunstancia de que la prim era edicin

de Inm unologa e Inm unoqum ica se agotara
antes de lo previsto plante la necesidad in
m ediata de su segunda edicin.
Com o en los ltim os cinco aos gran parte
de los conocim ientos en los diferentes cam
pos de la Inm unologa experim entaron cam
bios de im portancia, la m ayora de los cap
tulos del libro original fueron m odificados,
reescritos ntegram ente, subdivididos y am
pliados para su adaptacin.
D e las consultas y sugerencias recib id as
surgi la necesidad de incorporar nuevos ca
ptulos, en especial sobre rganos linfoides y
clulas que intervienen en la respuesta inm u
ne; la respuesta inm une mediada por clulas;
algunos aspectos de inm unopatologa com o
las inm uno deficiencias y las enferm edades
por autoagresin desarrolladas en el hom bre;
los anticuerpos no precipitantes; problem as
particulares en el campo de la inm unoqum i
ca, y otros. Ello hizo que para el desarrollo de
algunos de esos temas, que no eran de nuestra
esp ecialid ad , so licitara la co lab o raci n de
destacados inm unlogos de nuestro m edio. A
quienes lean la segunda edicin de Inm unolo
ga e Inm unoqum ica no les quedarn dudas
de que todos lo han hecho con el m xim o de
eficacia y que la experiencia por ellos vertida
habr de resultarles muy til.
El objetivo inicial de la redaccin de este
libro fue el de presentar una obra o rig in al

m en te esc rita en espaol, con los c o n o c i

m ie n to s in m u n o l g ico s bsico s a c tu a liz a
dos, y en la que adem s fuera posible hallar
la m etodologa necesaria para poder llev ar a
cab o los ex p erim en to s q u e p u d ieran p la n
tearse aquellos que se inician en la inv esti
g a c i n in m u n o l g ica . P o r tal m o tiv o , esa
m e to d o lo g a h a sido am pliada, in clu y en d o
las tcnicas indispensables para los estudios
de in m un id ad a nivel celu lar, los m todos
in m u n o q u m ic o s m s tiles para p u rific a
cin de diferentes tipos de antgenos y anti
cuerpos y toda la m etodologa acceso ria ne
cesaria para estos fines.
Es nuestro m ayor deseo que este libro, en
el que figura una m etodologa am pliam ente
e x p erim en tad a, pueda e sta r en la m e s a de
trab ajo de aquellos que estn h a c ie n d o sus
prim eras armas en el cam po de la Inm unolo
ga y la Inm unoqum ica.
N o podra cerrar este breve prlogo sin an
tes agradecer profundam ente a todos los que
han colaborado en su redaccin, a quienes
con sus com entarios hicieron apreciar la ne
cesidad de una am pliacin en su contenido y
a E ditorial M dica Panam ericana, responsa
ble de esta segunda edicin, por to d o el em
p e o p u e sto p a ra q u e p u e d a n c u m p lirs e
nuestros deseos.

R ic a rd o

A.

M a rg n i

Prlogo de la tercera edicin

Dos aos y medio fueron suficientes para

que la segunda edicin de Inmunologa e Inm u
noqumica se agotara. Pero en este lapso tam
bin se clarificaron algunos conocimientos en
el campo de la inmunologa y surgieron hechos
y metodologas que hicieron que optramos por
elaborar una nueva edicin del libro en lugar
de su reimpresin.
Para que este manual pueda prestar utilidad
al mayor nmero de personas interesadas en la
inm unologa se incluyeron nuevos captulos,
entre ellos: Inmunogentica, Inmunidad en las
infecciones bacterianas. Inm unidad en las in
fecciones virales. Inmunidad en las infecciones
parasitarias. Inmunidad en las infecciones mi-

cticas e Inmunidad tumoral, los que han sido

escritos por especialistas en los respectivos te
mas. Los restantes captulos han sido corregi
dos y actualizados para que el libro mantenga
vigencia permanente.
A los colaboradores iniciales y a los que se
han incorporado en esta edicin, mi sincero
agradecimiento por su contribucin, la que in
dudablem ente habr de ser apreciada por los
lectores. A E ditorial M dica Panam ericana,
responsable de la edicin, mi reconocimiento
por todo lo hecho.

R ic a r d o

A.

M arg n i

Prlogo de la cuarta edicin

Los avances logrados en el cam po de la

biologa m olecular, los aportes de la ingenie
ra gentica, el uso de anticuerpos m onoclo
nales, de cepas seleccionadas de anim ales de
experim entacin y el desarrollo de sofistica
das m etodologas, entre otros, han hecho que
num erosos conocim ientos inm unolgicos h a
yan sido clarificados en lo que va de la dca
da de 1980. A ello se debe que tengam os hoy
un concepto claro sobre el origen de la di v er
sificacin de las cadenas L y H de las inm u
noglobulinas, la que en gran parte es conse
cuencia de recom binaciones de exones cuya
ubicacin en el genom a se conoce. Lo m is
m o cabe decir para el receptor antignico de
los linfocitos T y para algunas interleuqui
nas, as com o para los antgenos H L A . En
este caso no slo se ha avanzado en lo que a
H L A y re s p u e s ta in m u n e se re fie re , sin o
tam bin a posibles relaciones entre H L A y
enfermedad.
Los estudios de difraccin de rayos X de
com plejos form ados por el fragm ento F ab de
inm unoglobulinas m onoclonales y m olculas
an tig n icas p e q u e as han p e rm itid o te n e r
una idea mucho ms precisa sobre el sitio de
com binacin de los anticuerpos y la topogra
fa de algunos determ inantes antignicos.
En el cam po del diagnstico, el em pleo de
reacciones inm unolgicas de tipo inm unoenzim ticas ha d em ostrad o su e x trao rd in aria
sensibilidad y la posibihdad de su desarrollo
sin necesidad de tener que recurrir a reacti
vos radiom arcados o al em pleo de m icrosco
pia ptica no convencional.
A nivel celular, en especial en lo referente
a la participacin que tienen las clulas acce

sorias y las diferentes poblaciones de lin fo c i

tos en los m ecanism os de reconocim iento de
los epitopes antignicos y en la regulacin de
la respuesta inm une, los avances tam bin han
sido notables.
T odos estos hechos son los que han d eter
m inado la reedicin de nuestro libro d e In
m unologa e Inm unoqum ica escrito en esp a
ol -c u y a liltim a edicin data de 1 9 8 2 - para
p o d er incorporar los grandes avances d e la
inm unologa que tuvieron lugar durante estos
ltim os seis a siete aos.
En esta o p o rtu n id ad p articip aro n v e in ti
cuatro colaboradores, aportando cada u n o su
experiencia en determ inados temas. E llo ha
h echo que algunos captulos fueran m o d ifi
cados sustancialm ente o reescritos y q u e fue
ra necesario incorporar otros nuevos com o:
El origen de la diversidad de los anticuerpos
y ontogenia linfocitaria B; Estructura y orga
nizacin gentica del receptor T; R espuesta
inm une humoral; Inm unologa de las m u co
sas; A nticuerpos no precipitantes de la clase
IgG y su relacin con los precipitantes; M e
canism os citotxicos m ediados por clulas;
R egulacin de la respuesta inmune; In flam a
cin; El com plejo m ayor de histocom patibili
dad humano: HLA.
Puesto que nuevas m etodologas sero l g i
cas y de uso inm unoqum ico han surgido l
tim am ente, captulos sobre R adioinm unoen
sayo (RIA), Enzim oinm unoensayo (ELISA );
H ib rid o m a s y a n tic u e rp o s m o n o c lo n a le s;
Electroforesis en gel de poliacrilam ida; isoe
lectro en fo cad o ; in m u n o tran sferen cia (im
m u n o b lo ttin g ), han sido in co rp o rad o s. El
captu lo sobre m todos cro m ato g rfico s ha

XVI

Prlogo de la cuarta edicin

sido am pliado, habindose incluido adem s

el crom atoenfocado. En el captulo Fraccio
nam iento de Inm unoglo b u lin as, se h a d e s
cripto la m etodologa para la degradacin en
zim tica de las diferentes clases de inm unog lo b u lin as de ratn, dado que no to d as se
com portan de m anera sim ilar a las de otros
vertebrados y al uso frecuente que se hace de
ellas por m edio de los anticuerpos m onoclo
nales obtenidos por hibridizacin.
La cuarta edicin de Inm unologa e Inm u
noqum ica, que en su versin original fuera
concebida para nuestros alum nos de la carre
ra de B ioqum ica, podr, en su versin ac
tual, ser til para todos aquellos que cursen
diferentes carreras con orientacin biolgica
com o medicina, veterinaria, biologa, ya que
no slo estn desarrollados los aspectos bsi
cos de la inm unologa, sino que tam bin es
tn d escrip tas d istin tas in m u n o p ato lo g as.
A dem s, dada la am plia m etodologa que el
libro contiene, sera nuestro deseo que pudie

ra encontrarse en la m esa de trabajo de aque

llos que desarrollen su actividad en los cam
pos de la inm unologa bsica y la aphcada.
El libro contina siendo una obra integra
da. N o obstante, se ha dejado en libertad a
los d istin to s c o la b o ra d o re s p ara que cad a
uno, sig u ien d o los lin cam ien to s gen erales
trazados, p u ed a expresar su punto de vista
sobre el tem a que relata y, en especial, sobre
aquellos tpicos que todava constituyen m o
tivo de discusin.
N o q u isiera cerrar este prlogo sin antes
agradecer profundam ente a los diferentes au
tores, especialistas en sus tem as, por el e x
traordinario aporte que ha significado cada
una de sus contribuciones.
A Editorial M dica Panam ericana, al igual
q u e en ed icio n e s an terio re s, m i a g ra d e c i
miento por el esftierzo realizado para que e s
ta cuarta edicin haya podido concretarse.
R

ic a r d o

A. M

argni

ASPECTOS BASICOS
DE LA INMUNIDAD

Mecanismos de defensa
contra la agresin

RICARDO MARGNI

El hombre y los animales normalmente no

sufren el impacto de los agentes patgenos y
de todos aquellos agresores reales o potencia
les que los rodean. Ello se debe a que poseen
m ecanism os defensivos protectores que les
aseguran cierta integridad, y slo por fallas de
esos m ecanism os se producen infecciones o
agresiones.
MECANISMOS DE LA INFECCIN
La mayor parte de las bacterias deben inva
dir los tejidos del husped parasitado y multi
plicarse en ellos para poder ejercer su accin
nociva, lo cual presupone que se encontrarn
con condiciones biolgicas y bioqumicas par
ticulares que harn posible esa invasin y m ul
tiplicacin.
Cuando un m icroorganism o penetra en el
husped por cualquier va, se instala en l, se
multiplica y, ya sea por efecto mismo de su ac
ceso a los tejidos o por accin de ciertos pro
ductos de su m etabolism o conocidos con el
nombre de toxinas, produce lesiones locales o a
distancia. Esto es, origina una infeccin.
Esta infeccin puede ser generalizada o loca
lizada. En el primer caso hay una invasin que
alcanza a diversos tejidos y se producen bacteriemias, septicemias, localizaciones en diferen
tes visceras. En el segundo se destaca la agre
sin que sufren los tejidos que circundan el lu
gar donde se ha producido la m ultiplicacin
bacteriana la cual est, en cierto modo, deter
minada por propiedades inherentes a la bacteria
misma en la mayora de los casos.
Existen qtros microorganismos que ejercen
su accin nociva de manera distinta. Si bien se
multiplican tambin en el tejido que han invadi

1
do o infectado, no alcanzan por s mismos otros
tejidos o visceras, sino que lo hacen por inter
medio de sustancias que, elaboradas por ellos
en el lugar donde se han localizado, son volca
das al medio interno y, vehiculizadas por la san
gre o la linfa, llegan a los diferentes rganos y
tejidos, donde producen lesiones caractersticas.
A los m icroorganism os que actan p o r el
primer mecanismo se los conoce con el nom bre
de infectantes, en tanto que a los segundos se
los denomina microorganistnos txicos. Estos,
a su vez, pueden ser toxiinfectantes o exclusi
vamente txicos. El inicroorganismo es toxiinfectante cuando penetra en el husped, prolifera en el tejido invadido, infecta, y elabora en
ese lugar las toxinas que por difusin van a
producir la sintomatologa clsica de 1a enfer
medad. Actan de este modo los bacilos dei t
tanos, de la difteria, de la gangrena gaseosa.
Hay tambin otro tipo de microorganismos
que no necesitan invadir para elaborar sus toxi
nas; por el contrario, no se multiplican en los
tejidos del hombre, pero son capaces de elabo
rar en el medio externo exotoxinas potentes, las
que, al ser ingeridas por aqul, pueden produ
cirle alteraciones sumamente graves, capaces
de llevarlo a la muerte. El caso tpico de m i
croorganismo que acta de esta manera, y que
es por ello considerado txico, es el C lo stri
dium botulinum.
Las bacterias txicas y toxiinfectantes son
las que ejercen su accin patgena por interm e
dio de sustancias de elevada toxicidad, difusi
bles, a las que se deben las lesiones y sntomas
caractersticos de la enfermedad. Las toxinas
bacterianas son de dos tipos: las exotoxinas,
que son eliminadas al medio externo, y las en
dotoxinas, que quedan unidas al protoplasm a
bacteriano.

Aspectos bsicos de la inmunidad

Por procesos de filtracin a travs de mem

branas filtrantes adecuadas es posible separar
las exotoxinas del medio de cuUivo donde ha
proliferado el germen productor. Son marcada
mente activas y sumamente antignicas; esto
significa que, inoculadas a un animal sensible,
estimulan la produccin de antitoxinas que las
neutralizan especficamente, reaccin para la
que unas y otras guardan proporcionalidad di
recta.
Las endotoxinas no pueden ser separadas por
simple filtracin; es necesario recurrir a otros
tratamientos fsicos, tales como congelacin y
descongelacin, empleo de solventes, ultraso
nidos, accin citoltica de detergentes, desinte
gracin mecnica, etctera. Su ndice txico es
inferior al de las exotoxinas y son, adems, ter
moestables y no precipitables por el sulfato de
am onio, propiedades que no com parten las
exotoxinas. Tienen muy escaso poder inmuno
gnico y en algunos casos resulta prcticamen
te imposible preparar sueros antitxicos.
Las exotoxinas son protenas, en tanto que
las endotoxinas son en su mayora complejos
glucidolipidoproteieos.
Inm unizando animales con endotoxinas se
consiguen antisueros que neutralizan pocas do
sis letales mnimas de ehas, pero nunca se con
sigue la relacin lineal entre las cantidades de
antitoxina y toxina en una mezcla exactamente
neutralizada que, en cambio, se logra en las
exotoxinas.
Es necesario recordar que, adem s de las
exotoxinas y endotoxinas, las bacterias pueden
producir otros metabolitos que a su vez son ca
paces de incidir de diferente manera en el curso
de las infecciones. Algunos microorganismos,
como los estafilococos por ejemplo, son activos
productores de coagulasa, que tiene la particula
ridad de coagular el plasma humano y de otros
vertebrados; los estreptococos producen fibrinolisinas, capaces de digerir los cogulos de fibri
na; varios microorganismos son productores de
hialuronidasa, factor de difusin que facilita la
penetracin, y muchos de ellos elaboran enzi
mas de diferentes tipos que pueden tener cierta
influencia en la infeccin al producir alteracio
nes en el metabolismo normal celular.
Adems de las bacterias, otros agentes agre
sores reales (virus, parsitos) o potenciales
pueden producir daos hsticos u orgnicos y
provocar como consecuencia de ello la reac
cin del husped.

MECANISMOS QUE IMPIDEN

LA INFECCIN
Los vertebrados poseen diferentes mecanis
mos para defenderse de la agresin originada

por agentes patgenos. Esos mecanismos pue

den ser inespecficos y especficos, siendo los
primeros de carcter general, capaces de defen
derlo contra cualquier agresor, en tanto que los
especficos slo actan contra entidades bien
definidas.
Mecanismos inespecfcos
Son de dos tipos: a) los constituidos por las
barreras naturales, y b) los de la inmunidad in
nata o inespecfica.
Las barreras naturales
Los microorganismos patgenos se caracteri
zan por su capacidad de penetrar y multiplicarse
en los tejidos que invaden. Para defenderse de
esa posible agresin, existen en los vertebrados
barreras naturales que, impidiendo la penetra
cin de los agentes patgenos reales o potencia
les, les permiten mantener su integridad.
Debemos considerar en primer lugar la piel,
la cual, intacta, acta como una efectiva barrera
que impide el paso de las bacterias, no slo co
mo mero hecho fsico, mecnico, sino tambin
por la presencia de cidos grasos que dificultan
e impiden la proliferacin bacteriana y actan
como verdaderos elem entos inespecficos de
defensa.
La boca, el estmago y el intestino tambin
lo son. Las bacterias que llegan a la boca son
retenidas en parte por fijacin a la secrecin
que recubre el epitelio bucal. A quellas que
pueden llegar al estmago sufren la accin bac
tericida del jugo cido de este rgano, el cual
las destruye en su mayora, y por ello los ex
menes bacteriolgicos del lquido duodenal y
de la porcin alta del intestino delgado denotan
frecuentemente ausencia de bacterias.
La nariz, la nasofaringe y las vas respirato
rias, por su estructura anatmica y su capa de
clulas vibrtiles, actan como elementos de
fensivos barriendo la capa mucosa que las re
cubre. En las fosas nasales, la cantidad de m i
croorganismos es indudablemente superior a la
que hay en trquea y bronquios; a nivel de es
tos ltimos, el nmero es escaso y puede a ve
ces ser nulo.
La conjuntiva ocular est ntimamente rela
cionada con las vas respiratorias superiores por
intermedio de los conductos lagrimales. El par
padeo y las lgrimas barren la superficie ocular
y eliminan por los lagrimales en las vas respi
ratorias altas las bacterias que pudieran hallarse
en ella; por otra parte, no hay que olvidar que la
secrecin lagrimal es muy rica en una sustancia
bacterioltica natural denominada lisozima, que
a alta dilucin tiene la particularidad de produ
cir la lisis de muchos microorganismos. Esta

Mecanismos de defensa contra la agresin

sustancia bacterioltica no slo se encuentra en
la secrecin lagrimal sino tambin en muchas
secreciones mucosas, y su presencia ha podido
ser demostrada hasta en la misma piel.
Las vas genitales estn totalmente recubier
tas por una capa drmica. En el hombre, la m a
yor parte de los microorganismos son barridos
por la orina. La vagina, por su parte, debido a
que normalmente posee una flora rica en lactobacilos, origina un medio con un pH bajo que
impide la proliferacin de otros microorganis
mos. Junto a estos mecanismos de barrido en el
caso del hombre y de produccin de cido lc
tico por los bacilos acidricos en la mujer, la
mucosa genital en ambos casos posee un mar
cado poder bactericida y ello se debe a su con
tenido en lisozima e inhibina.
Adems de la necesidad de vencer los meca
nismos anteriormente citados, para que un m i
croorganismo pueda penetrar e infectar, deben
darse ciertas condiciones, tales como tempera
tura adecuada para su supervivencia y multipli
cacin. Esto servira para explicar ciertos casos
de inmunidad natural hacia determinados m i
croorganismos ya que, experimentalmente, se
ha podido comprobar que algunos de los ani
males inmunes a la infeccin pueden contraera
cuando se los expone a variaciones trmicas; se
recuerda como ejemplo el clsico experimento
de Pasteur de la infeccin de la gallina por car
bunco al someterla a enfriamiento.
La tensin de oxgeno en los tejidos puede
crear condiciones favorables o por el contrario
desfavorables para la multiplicacin microbia
na; el caso de los clostridios, cuya proliferacin
en el torrente sanguneo re su lta dificu lto sa
cuando hay una oxigenacin acentuada de l,
es un ejemplo de ello.
La presencia de metabolitos, o su ausencia,
puede desem pear un papel importante en la
proliferacin de microorganismos que, habien
do franqueado las barreras anteriormente des
critas, llegan a los tejidos. La ausencia de algu
nas sustancias indispensables impide su m ulti
plicacin y ha podido demostrarse con mutan
tes particulares, en infecciones experimentales
efectuadas en animales, que el aadido de esos
metabolitos esenciales -en la dieta o mediante
inoculaciones- allana la dificultad y favorece
la infeccin.
Adems de la lisozima, ya referida, existen
en los tejidos del hom bre y de los anim ales
otras sustancias que tienen accin bactericida o
bacteriosttica, como la espermina y la esperrnidina, capaces de actuar sobre los bacilos tu
berculosos; la fagocitina, obtenida de los poli
morfonucleares; (3-lisinas; los pptidos antim i
crobianos sintetizados por clulas de mamfe
ros conocidos con el nombre de defensinas ;
etctera.

Si las barreras naturales han sido vencidas y

hay penetracin de los microorganismos pat
genos, se ponen en marcha otros mecanismos
de resistencia naturales, involucrados dentro
de lo que se conoce como inmunidad innata .
Inmunidad innata
Sus mecanismos comienzan a actuar in m e
diatamente despus de la penetracin del agente
agresor, a diferencia de lo que ocurre con la in
m unidad esp ecfica que requiere de c ierto
tiempo para que se haga efectiva. Lo que se
procura en primera instancia es la eliminacin
del agente infectivo y la reparacin del dao ti
sular originado, jugando un papel muy im por
tante en ello el denominado proceso inflam ato
rio. En este evento participan clulas (m onoci
tos, polimorfonucleares, neutrfilos, clulas NK
[natural killer, asesinas], clulas endoteliales),
molculas (citoquinas, componentes del sistema
complemento resultantes de la activacin por la
va alterna, metabolitos del cido araquidnico),
m o l c u la s de a d h esi n (L F A -1 , IC A M -1 ,
ICAM-2, ELAM-1, entre otras) y receptores de
componentes del sistema complemento (C R I,
CR2, CR3 y CR4) (vanse caps. 11 y 12).
Las clulas que actan en primera instancia
son los m acrfagos locales, que ligan a su
mem brana al agente agresor. Este mecanismo
tiene lugar a travs de la unin de un receptor,
frecuentemente CRI y CR2, con los productos
del sistema complemento C3b y C3bi unidos al
microorganism o y provenientes de su activ a
cin por la va altema, inducida por componen
tes de la pared celular de las bacterias. Esas
uniones tambin ocurren entre pares de m olcu
las de adhesin (vase cap. 11). Como conse
cuencia de esa interaccin los macrfagos sinte
tizan y liberan interleuquina 1 (IL-1), factor ne
crosante de tumores (TNF) y factor quimiotcti
co de neutrfilos (NCF). Estos factores inducen
la rpida emigracin de los pohmorfonucleares
neutrfilos circulantes a los sitios extravasculares donde se encuentra el agente patgeno, esta
migracin es mediada por la interaccin de m o
lculas que se expresan en la membrana de los
neutrfilos (L FA -l) y las molculas de ad h e
sin ELAM-1 (molculas endoteliales de adhe
sin de leucocitos), ICAM -l e ICAM-2 (m ol
culas de adhesin intercelular) que se expresan
en el endotelio de los vasos, inducidas p o r la
IL-1 y TNF de origen macrofgico. Estas citoquinas inducen, a su vez, alteraciones en el en
dotelio vascular a travs del cual se produce la
emigracin de los neutrfilos.
Las interacciones entre las molculas de la
membrana de los neutrfdos y las del epitelio
vascular transducen seales, en las que partici
pan protenas G, fosfolipasa C, proteinquinasa

Aspectos bsicos de la inmunidad

C, entre otras, y llevan a la activacin del neutrfilo. La injuria tisular inducida por ste es d e
bido a la liberacin de productos intermediarios
del oxgeno (H^Oj, anin superxido, radicales
hidroxilo) y a la exocitosis de los contenidos de
los grnulos citoplasm ticos, especialm ente
elastasa. Los oxidantes desnaturalizan a las pro
tenas y facilitan su degradacin por las enzimas
proteolticas. En este proceso de injuria partici
pan tambin los metabolitos del cido araquid
nico (tromboxanos, leueotrienos) y los fragmen
tos C3a y C5a del sistema complemento, resul
tantes de su activacin por la va alterna.
Todo este proceso hace que los polimorfonu
cleares neutrfilos sean Jas clulas defensivas
que acuden en primer trmino al lugar de la in
feccin, observndose acumulo de ellas en las
primeras 24 horas, y posterior destruccin, por
fagocitosis, de los neutrfilos que participaron
activamente en el proceso. A partir de ese m o
mento las clulas predominantes son los macr
fagos los que, dada su distribucin, tardan ms
tiempo en llegar y son las que al fagocitar las
bacterias habrn de provocar su destruccin.
La muerte de las bacterias tiene lugar por me
canismos endocelulares que ocurren en los ma
crfagos y por mecanismos exocelulares media
dos por el sistema complemento. La accin fa
goctica se ejerce no slo cuando un microorga
nismo llega al tejido celular subcutneo, sino
tambin cuando hay una invasin del torrente
circulatorio. Intervienen en este complejo pro
ceso, adems de los polimorfonucleares neutr
filos sanguneos, las clulas histioides libres y
aun las fijas, localizadas en hgado, bazo, sinu
soides venosos, etc. (Para mayor informacin
sobre inflamacin, vase cap. 23.)
Los m icroorganism os fagocitados son, en
gran parte, destruidos por accin enzimtica y
metabolizados como material extrao. El pasa
je de las partculas al citoplasma de los fagoci
tos no es simple y ello ocurre previa invagina
cin de la membrana citoplasmtica que engol
fa a la partcula en su fase inicial y la rodea fi
nalm ente, originando un fagosoma. Seguida
mente, los grnulos lisosomales se unen al fa
gosoma y forman un fagolisosoma; durante es
te proceso las enzimas de los grnulos lisoso
males pasan al interior del fagolisosoma y se
inician los procesos de digestin del material
fagocitado, que es consecuencia de la activa
cin que ha experimentado el macrfago. D u
rante este proceso hay un aumento de los re
ceptores para Fe y C3b que esta clula expresa
en su membrana. Entre las hidrolasas lisosoma
les que son liberadas durante la fagocitosis se
encuentran fosfatasas, ribonucleasas, desoxiribonucleasas, proteasas, lipasas, glucosidasas y
esterasas. Ocurren aqu cambios en el metabo
lismo celular caracterizados por mayor consu

mo de oxgeno y glucosa, con acumulacin de

cido lctico y disminucin del pH por aumen
to de la gluclisis, hiperproduccin de agua
oxigenada y de los llamados radicales de ox
geno (anin superxido, oxgeno singlete, radi
cal hidroxilo). Estos productos son marcada
mente txicos para las bacterias y las matan en
pocos segundos. (Para otros aspectos de la fa
gocitosis, vanse caps. 3 y 21.)
En casos particulares como las infecciones
virales, procesos citotxicos mediados por c
lulas NK pueden constituir efectivos mecanis
mos inespecficos de defensa (vase cap. 3).
Las clulas NK, cuyo origen no est bien defi
nido, presentan semejanzas con los linfocitos
T, de los que se diferencian por carecer de re
ceptores para el antgeno. Su unin a las clu
las blanco se hace por molculas de adhe
sin; de esa unin surge la formacin de poros
en la m em brana de la clula im pactada y su
consecuente destruccin. Este dao celular est
mediado por molculas de la familia de las porinas o perforinas que funcionan de manera si
milar al componente C9 del sistema com ple
mento (vase cap. 22).
En la defensa inespecfica del husped pue
den participar tambin las llamadas protenas
de la fase aguda, entre las que se encuentran la
protena C reactiva, la cx2-macroglobulina y la
al-a n titrip sin a . En determinadas circunstan
cias, estos componentes sricos normales pue
den incrementarse grandemente y, a travs de
diferentes mecanismos, amplificar las defensas
naturales contra la agresin exgena.
La inmunidad innata constituye, en realidad,
la etapa previa de la respuesta inmune especfi
ca, pues para que sta se lleve a cabo se necesi
ta la captacin de los agresores por los macr
fagos, su degradacin y procesamiento en pe
queos pptidos para su presentacin adecuada
en la membrana celular, requisito indispensable
para su reconocim iento por los linfocitos T,
elem entos de la respuesta inm une adquirida
(vase cap. 2).
Otros productos inespecficos de defensa son
los interferones (lEN). Son pptidos con activi
dad antiviral que desempean un papel impor
tante en la resistencia inespecfica a la infec
cin; en un comienzo se supuso que era una
sustancia tnica elaborada espontneamente co
mo respuesta a una infeccin viral. En estos
momentos se sabe que a! menos hay tres enti
dades distintas denominadas a , p y y, las que
no slo funcionan como antivirales, sino que
tambin han demostrado un efecto antiproliferativo y una participacin activa en los meca
nismos regulatorios de la respuesta inmune.
Si bien el interfern no es especfico para el
virus inductor, presenta ciertas caractersticas
de especificidad con relacin a las clulas res

Mecanismos de defensa contra la agresin

ponsables de su elaboracin. As, el interfern
logrado por induccin de un determinado virus
es eficaz contra cualquier otro tipo de infeccin
viral, pero nicamente protege a las clulas de
la especie animal de donde proviene. Ello se
debera a que su elaboracin es patrimonio de
la informacin gentica de la clula y no del vi
rus; de ah su especificidad para aqulla.
En condiciones normales, todas las clulas
somticas son potenciahnente capaces de pro
ducir interfern, pero slo lo elaboran por esti
mulaciones preferentemente virales. No es ste
el nico mecanism o para inducir su produc
cin; la inoculacin de virus atenuados ARN,
polirribonucletidos sintticos de doble cadena
como poli Lpoli C y algunos extractos bacteria
nos -entre otros- pueden resultar eficaces.
Hasta el momento se han identificado los in
terferones a , P y y, que presentan diferencias
antignicas y son sintetizados por poblaciones
celulares distintas. El IFN -a es producido por
leucocitos estimulados por virus y polirribonu
cletidos. Los mismos inductores, al actuar so
bre fibroblastos, dan origen al INF-p. El IFNy
es producido por leucocitos estimulados por vi
rus y polirribonucletidos. Los linfocitos esti
mulados con antgenos o mitgenos, producen
IFNy, de all que se lo conozca tambin como
interfern inmune, que funciona como una lin
foquina. Los tres interferones tienen pesos mo
leculares prximos (18, 20, 21-24 kD) y estn
constituidos por 189, 187 y 143aa, respectiva
mente. Presentan diferencias antignicas entre
ellos. (Para ms informacin vase captulo 12.)
Los genes que codifican para los tres interfe
rones han sido clonados. Se han identificado 14
genes para el IFN -a, 2 a 5 para el IFN-p y 1
para el IFN-y. Este ltimo no presenta homolo
ga con los otros genes de IFN, pese a que co
difica una protena de tamao similar en la que
ciertos aminocidos ocupan las mismas p o si
ciones en los IFN a y p. Los interferones a y P
son estables a pH 2 a 4C y se mantienen acti
vos en presencia de dodeciisulfato de sodio. El
IFN-y, en cambio, es sensible a ambos trata
mientos. Los IFN P y y son glucoprotenas, no
as el IFN -a.
Se han aislado IFN de pesos moleculares su
periores al indicado, lo cual podra deberse, en
parte, al hidrato de carbono acom paante, a
que el IFN formara dmeros o a que se asociase
con otras protenas no liberadas durante la puri
ficacin.
De todos los interferones, el a y el P son los
que han demostrado un efecto viral ms mani
fiesto, en tanto que el IFN-y, si bien conserva
esa actividad, funciona mejor como una linfo
quina.
El IFN no acta como un anticuerpo neutra
lizando al virus; en una mezcla de virus e inter

fern, el primero conserva su poder infectivo.

El cido nucleico viral al penetrar en una clula
com ienza a replicarse y es durante esta fase
cuando la clula, por algn tipo de informacin
recibida, reactiva el material gentico conteni
do en el ADN nuclear transcribiendo un m en
saje en un ARNm, que se pone en contacto con
los ribosomas del citoplasma. La traduccin de
ese mensaje significa la sntesis de la protena
interfern. Cada especie animal elabora su
propio IFN, que abandona la clula productora,
destinada a morir por la infeccin viral. Por s
solo es incapaz de salvar a una clula agredida,
pero resulta efectivo para la proteccin de clu
las no invadidas.
En relacin con la actividad antiviral, los
IFN interfieren en la formacin de nuevos vi
riones. No son protenas que inhiben a replica
cin viral, sino que inducen a las clulas a sin
tetizar las protenas responsables del efecto an
tiviral. Los interferones no penetran en las c
lulas; muy posiblemente interaccionen con un
receptor de la superficie de la clula y se expre
sen va un segundo mensajero. En apoyo de
ello est el hecho de cjue la inyeccin intracelu
lar de INF no induce efecto antiviral.
El mecanismo bsico de accin del IFN pa
recera que est relacionado con la interferencia
a que molculas de ARNm traduzcan m olcu
las tempranas o progenitoras de la sntesis vi
ral. Se ha demostrado que el IFN induce la sn
tesis de protenas celulares, algunas con activi
dad enzimtica. Una de ellas tiene capacidad
para convertir, en presencia de ARN de doble
cadena, al ATP en un oligo A particular, que a
su vez activara una endorribonucleasa que hidrolizara los ARNm virales, inhibiendo de este
modo la sntesis de protenas estructurales del
virus. El IFN tambin inhibira la sntesis pro
teica en forma indirecta al inducir una protein
quinasa que, en presencia de ARN de doble
cadena, fosforila el factor de elongacin, inter
firiendo de esta forma en el proceso de traduc
cin. Ei IFN puede, adems, potenciar la inhi
bicin de la sntesis proteica al in d u cir una
fosfodiesterasa, la que escinde las secuencias
term inales 3 CCA del ARNt, im pidiendo la
unin del aminocido. Si bien los mecanismos
descritos podran explicar la interferencia de
los IFN en la sntesis de las protenas v irales,,
existen todava interrogantes que no han recibi
do respuesta adecuada.
Elementos especficos de defensa
Si bien las barreras naturales y los m ecanis
mos de la inmunidad innata son de valor ex
traordinario para la defensa del husped, sabe
mos que, si se produjesen soluciones de conti
nuidad u otras alteraciones, pueden d e ja r de

Aspectos bsicos de la inmunidad

cumplir eficazmente su cometido. En esos ca

sos, los agentes agresores, al penetrar y ejercer
su accin nociva sobre tejidos y rganos, pro
ducen enfermedad. Significa ello que cuando
los mecanismos naturales inespecficos dejan
de actuar se han agotado nuestros medios de
lucha contra la agresin? En estos casos dispo
nemos de quim ioterpicos y antibiticos que
pueden ser eficaces en algunas oportunidades;
pero podemos adems crear mecanismos de
fensivos especficos, los de la inmunidad, cuyo
estudio habremos de encarar.
Cuando un agente agresor real o potencial
(antgeno) penetra en un vertebrado adulto (pri
mer estmulo), ste experim enta una serie de
modificaciones que determinan que su compor
tamiento ulterior frente a nuevas penetraciones
del mismo antgeno pueda ser de naturaleza di
ferente. Ello depende de las dosis antignicas
empleadas en cada caso, del tiempo transcurri
do entre el primer estmulo y los siguientes, de
la calidad de los anticuerpos especficos forma
dos, de ciertos factores genticos propios del
individuo, etc., todo lo cual configura modifi
caciones de la sensibilidad. Si las reestim ula
ciones antignicas provocan en el husped va
riaciones cuantitativas de la sensibilidad (normosensibilidad o hiposensibilidad) con respec
to a la accin directa que ejerce el antgeno, se
dice que hay inmunidad. El ejemplo clsico es
el de la inoculacin de una toxina microbiana a
dosis subletales en un animal de experimenta
cin. T ranscurrido cierto tiem po, el anim al
puede recibir dosis superiores sin sufrir trastor
nos, lo que significa, desde el punto de vista
cuantitativo, que ha modificado su sensibilidad
para la toxina. El animal es inmune a la accin
txica.
Cuando las inoculaciones de antgenos pro
ducen en el husped modificaciones tales que
hacen que reaccione con cambios cualitativos
de la sensibihdad frente a la reinoculacin del
mismo antgeno, se dice que hay alergia. As
ocurre, por ejemplo, al inocular un cobayo con
100 mg de ovoalbmina y reinocularlo tres se
manas despus, por va endovenosa, con canti
dades inferiores de antgeno. El animal reaccio
na frente al segundo estmulo con una sensibili
dad exagerada que puede llevarlo a la muerte
(choque anafilctico). Es indudable que esa hi
persensibilidad no es causada por el antgeno
en s, ya que se le inocularon dosis menores
que las del primer estmulo. Ello se debe a la li
beracin de mediadores qumicos como conse
cuencia de la interaccin del antgeno con sus
anticuerpos especficos fijados a clulas (mas
tocitos). Esos mediadores modifican la sensibi
lidad y sta es de una calidad distinta a la pro
vocada directam ente por el antgeno (vase
cuadro 1-1).

inmunidad. Conceptos generales;

mecanismos
El trmino inmunidad proviene del voca
blo latino inmun (in privativo; munus, carga; o
sea privado de carga, privilegiado). Este voca
blo se utilizaba en la poca del hiiperio Roma
no pai-a identificar a las personas eximidas del
pago de impuestos, beneficio que poda obte
nerse por herencia o adquirirse mediante algu
na accin particular que era prem iada por el
Estado. Pero desde el punto de vista mdico, y
para no incurrir en confusiones, es necesario
determ inar exactam ente qu se entiende por
inmunidad . Se la considera como sinnimo
de resistencia y sirve para expresar la resultante
de dos sistemas opuestos, el agente invasor y
las reacciones del husped invadido, resultante
que puede tener todos los valores, desde cero a
infinito. La inm unidad se caracteriza porque
como respuesta al estm ulo antignico no se
desencadenan manifestaciones colaterales per
judiciales para el husped, cosa que en cambio
ocurre en la alergia. En un sentido ms amplio,
y sobre la base de los conocimientos que ac
tualmente se tienen sobre los fenmenos inm u
nolgicos, debe considerrsela como la re s
puesta de un husped a un agente agresor real o
potencial y las consecuencias de ella derivadas.
Un vertebrado inmune posee ciertos elemen
tos especficos que actan sobre el antgeno o
agente agresor que les ha dado origen, neutrali
zndolo o impidiendo un dao real o potencial
en el organismo. Pero cmo y dnde se for
man esos elem entos? Por qu en un animal
sus componentes normales no expresan esa ac
tividad? En qu casos particulares y cm o
pueden formarse productos que acten contra
los propios componentes orgnicos dando lugar
a las llam adas enferm edades por autinm unidad? Cul es la causa del rechazo de los injer
tos homlogos y heterlogos? Si bien hasta no
hace mucho tiempo nuestra ignorancia al res
pecto era grande, num erosos hechos experi
mentales han facilitado su interpretacin.
Tipos de inmunidad
Dijimos ya que los inmunes eran privilegia
dos y que este privilegio podan tenerlo desde
el nacimiento -posean por lo tanto una inmu
nidad natural-, o conseguirlo ulteriormente -la
inmunidcid era en este caso adquirida- Desde
el punto de vista mdico existen tambin esos
dos tipos de inmunidad.
Inmunidad natural
Si bien es poco lo que se sabe de ella, es un
hecho cierto que diferentes especies animales

Mecanismos de defensa contra la agresin

Cuadro 1-1. Respuesta del husped a su agente agresor

Husped

R eaccin

F enm eno
Espontnea

A ctiva
Prim er estm ulo

M odificacin de
la capacidad
reactiva norm al

M odificaciones
cuantitativas de la_
sensibilidad (norraosensibilidad o
hiposensibilidad)

Experim ental
- Inm unidad

Espontnea
Pasiva
E xperim ental
A doptiva

Experim ental
A c tiv a

Estm ulos
poste-
riores

A nafilaxia

IVIodificaciones
cualitativas de la
sensibilidad
(hipersensibilidad)

Inm ediata

A nticuerpos
sricos fijos
a clulas

P a s iv a
A c tiv a

A topia

P a siv a

A lergia
A nticuerpos
sricos circu
lantes

Fenm eno
de A rthus

/Votivo
P asiv o

, [c lu la s esp ecfica m en - Alergia tipo tuberculnico

K ctaiaaa 4
sensibilizadas
1 ,
,.
,
,
[
Rechazo al nomoinjerto, etc.

presentan resistencia variada a la accin de los

distintos microorganismos o de sus toxinas. La
razn de ello puede residir en diferentes causas:
1) Factores genticos y raciales. Existen nu
merosos ejemplos que demuesti'an influencias
de ese tipo. Los animales carnvoros y las aves
son resistentes al carbunco; no ocurre as con
los hervboros, que son sensibles aunque dentro
de ciertas limitaciones. Entre las ovejas, las de
raza europea son sensibles, mientras que las ar
gelinas son resistentes a dicha infeccin.
Otro hecho curioso lo presenta el gonococo,
que, si bien enferma al hombre producindole
blenorragia, no tiene capacidad para infectar a
ninguno de os anim ales de experim entacin
normalmente utilizados.
Dentro del gnero humano hay factores ra
ciales que confieren a los individuos distinta
resistencia. La raza negra, por ejemplo, es m u
cho ms sensible que a blanca a la tuberculo
sis y algunas enfermedades tropicales, e inclu
so dentro de la ltima, hay individuos ms o
menos resistentes a diferentes m icroorganis
mos.
2) Edad. Es otro factor que debe tenerse en
cuenta. El virus del sarampin, cuando infecta
al hombre, por regla general no deja secuelas,
pero si la infectada es una embarazada con me
nos de tres meses de gestacin el embrin pue
de sufrir lesiones cardacas graves, cataratas,
sordera. Fetos de mayor edad son resistentes.
Otro ejem plo lo tenemos en el Trypanosoma

cruzi que, si bien no infecta a la rata adulta, tie

ne marcado poder infectivo sobre las cras lac
tantes de menos de una semana de vida.
3) Influencias hormonales. Variaciones hor
monales pueden producir modificaciones en la
resistencia a la infeccin por diferentes agentes
agresores. Los diabticos son susceptibles a las
infecciones de piel, en especial la furunculosis;
tanto los hipotiroideos como los hipertiroideos
-y se suman quienes padecen de hipoadrenalism o - poseen mayor susceptibilidad a la infec
cin que los individuos normales.
4) Anticuerpos naturales. En algunos anim a
les con marcada resistencia a distintos agentes
agresores se ha demostrado la existencia de an
ticuerpos especficos similares a los formados
en el proceso inmunitario adquirido. Se obser
va a veces que individuos que exhiben alta re
sistencia a ciertas exotoxinas bacterianas tienen
en su sangre circulante antitoxinas similares a
las que aparecen en infectados o vacunados
contra ellas. Esto podra deberse a infecciones
subagudas que pasaron inadvertidas, pero que
han servido para dejar algn grado de resisten
cia. Lo que resulta muy difcil de explicar es
que en determ inadas personas o anim ales se
encuentran anticuerpos contra numerosos m i
croorganismos, lo que significara, de acuerdo
con la concepcin anterior, que han sufrido in
fecciones m ltiples, cosa un tanto difcil de
aceptar, sobre todo teniendo en cuenta que esos
anticuerpos han sido observados a veces en
anim ales refractarios a la accin de lo s m i

1o

Aspectos bsicos de la inmunidad

croorganism os cuyos correspondientes an ti

cuerpos contienen. Cuando se iiaga referencia a
la incidencia de las mutaciones somticas en la
creacin de diversificacin en las inm unoglo
bulinas (cap. 6) se podr apreciar la posibilidad
de aparicin de estos anticuerpos como conse
cuencia de ese hecho.
Por hibridacin de clulas de bazo de ratones
embrionarios con clulas de plasmocitom a se
han conseguido hbridos que sintetizan an ti
cuerpos especficos de la clase IgM, de baja
afinidad. Dado que los embriones no fueron es
timulados ni expuestos a antgenos extraos,
ello significa que en sus clulas de bazo ya
exista informacin para la sntesis de ciertos
tipos de anticuerpos, los que, dadas las circuns
tancias expuestas, deben ser considerados co
mo naturales.
Sea cual fuere el mecanismo que confiere la
inmunidad natural, es innegable que hay una
resistencia particular, natural o gentica, que
hace que la resultante de la interaccin de ese
sistema opuesto agente invasor-husped infec
tado se desplace totalmente hacia este tiltimo
lado y ese privilegio natural o inmunidad natu
ral sea un hecho concreto.
Inm unidad adquirida
Es la que en realidad nos interesa, ya que se
trata de una lucha especfica entre el agente in
vasor y los anticuerpos y clulas sensibihzadas
por l originados. Puede ser de tres tipos: acti
va, pasiva y adoptiva.
1) La inmunidad activa se divide a su vez en:
a) Adquirida espontneamente
b) Provocada artificialmente
En la inmunidad activa adquirida espont
neam ente, las defensas especficas se co n si
guen como consecuencia de la penetracin en
el individuo de un agente invasor que lo enfer
ma. No obstante, el husped invadido consigue
activar las clulas del sistema inmune y elabo
rar anticuerpos especficos, los que perm ane
cen en el organismo aun mucho despus de ha
ber desaparecido el agente infectante.
La inm unidad activa provocada artificial
mente se consigue mediante la inoculacin de
antgenos, que pueden ser protenas com ple
jas, m icroorganism os vivos atenuados, m i
croorganism os m uertos, o bien las toxinas
m ism as, pero m odificadas de modo tal que
conserven su capacidad antignica aunque en
el proceso de modificacin hayan perdido su
accin txica (toxoides). El husped, ante es
tos estmulos, responde como en el caso ante
rior. La inmunidad es activa porque el infecta
do o vacunado elabora sus propios elementos

defensivos y adems es de larga duracin por

que - a pesar de que los anticuerpos elabora
dos, como protenas que son, se metabolizan y
eliminan por los emuntorios en un perodo no
superior al m e s- el aparato encargado de su
fo rm a ci n sig u e tra b a jan d o y re p o n ie n d o
constantemente, por un tiempo bastante largo,
los anticuerpos que van desapareciendo del
torrente circulatorio.
2) La inm unidad adquirida pasiva puede ser
tambin:
a) Espontnea (congnita)
b) Conferida artificialmente
La inmunidad adquirida en forma pasiva y
espontnea es la que tiene el recin nacido co
mo consecuencia de su transferencia por la ma
dre a travs de la placenta o el calostro; en
cambio, la pasiva conferida artificialmente es
la que se consigue por inoculacin de suero
proveniente de otros individuos o animales in
munizados con anterioridad y en los cuales hay
un alto contenido de anticuerpos especficos.
Este tipo de inmunidad es de corta duracin,
pues los anticuerpos son metabolizados como
todas las protenas y eliminados por los emun
torios a breve plazo, de modo que el estado in
munitario termina con la desaparicin de di
chos anticuerpos por no estar estim ulado su
propio aparato formador.
La inmunizacin activa artificial provocada
por vacunacin persigue el logro de una protec
cin de larga duracin para que acte preventi
vamente. Como las defensas en este caso tardan
un tiempo en aparecer, algo ms de una semana,
la vacunacin no puede ser utilizada como cura
tiva. Se apelar entonces a la inmunizacin pa
siva, mediante seroterapia o la administracin
de inmunoglobulinas hiperinmunes, ya que esos
anticuerpos introducidos actuarn de inmediato,
neutralizando el agente mrbido o sus toxinas y
favoreciendo el restablecimiento.
3) Inmunidad adoptiva:
Es la que se consigue cuando se transfieren
clulas inm unolgieam ente com petentes. Su
duracin ser distinta segn que las clulas
transferidas sean islogas, homlogas o heter
logas.
Mecanismo de la inmunidad antiinfecciosa
Cuando las bacterias se introducen directa
mente en la sangre, gran parte de ellas son en
globadas por los macrfagos e histiocitos fijos
del hgado, bazo, sinusoides venosos y en parte
son fagocitadas por los polim orfonucleares e
histiocitos de los pulm ones, donde floculan

Mecanismos de defensa contra la agresin

parcialmente. Si las bacterias que han penetra
do son avirulentas, este mecanismo las elimina
rpidamente, En el caso de bacterias de marca
do poder patgeno, a esa primera eliminacin
parcial le sigue una multiplicacin exagerada
en el sitio donde se han localizado y sobreviene
como consecuencia una invasin al torrente
sanguneo; del triunfo de la multiplicacin so
bre el mecanismo de la eliminacin, o vicever
sa, depende la infeccin.
La muerte del animal por septicemia aguda
se produce cuando esos mecanismos resultan
insuficientes.
Las bacterias que penetran por otras vas su
fren un mecanismo de eliminacin sim ilar al
anterior -n o tan intenso-, que depende funda
mentalmente de la naturaleza del tejido donde
se han localizado. Si la inoculacin es intrape
ritoneal, la invasin al torrente sanguneo es r
pida; lo es menos si la inoculacin ha sido he
cha por va intram uscular y menos aun si se
inocula por va subcutnea.
El pasaje de las bacterias desde el punto de
inoculacin a la sangre se realiza siempre por
los linfticos, y en la eliminacin de los m i
croorganismos invasores los macrfagos de los
ganglios linfticos regionales desempean un
papel preponderante. Si las bacterias son avirulantas o de virulencia relativa y penetran en al

11

gn tejido o zona donde el pasaje sanguneo es

muy lento, la infeccin puede no llegar a la san
gre y quedar en los ganglios, donde puede per
manecer por mucho tiempo aunque el animal no
experimente reacciones que indiquen enferm e
dad, En la eliminacin de algunas bacterias par
ticipan tambin, como ya se ha visto, sustancias
bactericidas elaboradas por el husped, que ac
tan por s solas o formando parte de sistemas.
Hemos considerado hasta ahora el m ecanis
mo por el cual son eliminadas hasta cierto pun
to las bacterias que han penetrado en un animal
normal, pero ese mecanismo puede increm en
tarse m ediante la inm unizacin esp ecfica a
partir de un cultivo muerto de dichos m icroor
ganismos.
Un animal inmunizado activamente reaccio
na frente a las bacterias como si stas fueran
avirulentas o de virulencia muy escasa y logra
entonces que el equilibrio se desplace de modo
que los mecanismos de fagocitosis y de elim i
nacin predominen sobre los de penetracin de
las bacterias e impidan la infeccin. Para con
seguir este desplazamiento en el equilibrio pue
de hacerse una inmunizacin activa, com o ya
hemos dicho, o en cambio inmunizarse pasiva
m ente mediante la inoculacin, en la m ayor
parte de los casos, de suero proveniente de ani
m ales in m u n izad o s activ am en te. A d em s,

Eliminacin

sanguneo

Fig. 1-1. Esquem atizacin de los diferentes fenm enos que pueden ocurrir cuando una bacteria penetra en un v erteb rad o
adulto. A, B acteriem ia, elim inacin por fagocitosis. B, Infeccin aguda, septicem ia y m uerte. C, Infeccin m oderada, fo r
m acin de anticuerpos, inm unidad.

12

Aspectos bsicos de la inmunidad

cuando ha habido infeccin en un individuo no

inmunizado, en los perodos finales de la infec
cin, y como consecuencia de la elaboracin de
anticuerpos especficos contra el microorganis
mo infectante, se crea un estado inm unitario
que hace que el proceso infeccioso pueda ser
vencido si no se debe a microorganismos m ar
cadamente virulentos (fig. 1-1). Este es el me
canismo ms comn de respuesta inmune a una
infeccin bacteriana; no obstante, en algunos
casos particulares, la inmunidad mediada por
clulas tiene participacin activa.
El suero de los animales inoculados con do
sis repetidas de toxina diftrica, tetnica u otras
exotoxinas, adquiere la propiedad de^ neutrali
zarlas por formacin de antitoxinas. stas, que
constituyen la base de la inmunidad antitxica
considerada como el tipo ms simple y sencillo
de inmunidad y que ejercen una accin neutra
lizante especfica sobre las exotoxinas, pueden
encontrarse en el suero del hom bre o de los
animales como consecuencia de procesos in
fecciosos por bacilos toxignicos, o por la ino
culacin experimental de toxinas o toxoides.
Adems de estas antitoxinas originadas por un
proceso inmunitario activo, puede conseguirse
cierto ttulo de las mismas en la sangre circu
lante del hombre o animales de experim enta
cin m ediante su inoculacin bajo form a de
suero antitxico. La inm unidad antitxica es
simple, ya que se produce mediante la neutrali
zacin directa de la toxina por su respectiva an
titoxina existente en el medio circulante, sin
que haya necesidad de que intervengan los ma
crfagos y otros fagocitos indispensables para
la inmunidad antibacteriana.
Su mecanismo en nada depende del comple
jo sistema de clulas que, en cambio, es funda
mental en el caso de que la infeccin sea pro
ducida exclusivamente por microorganismos y
no por sus toxinas. Un hecho muy caractersti
co de la inmunidad antxica es que la concen
tracin de la antitoxina microbiana presente en
el torrente circulatorio es relativam ente baja;
as, en el caso de la difteria hay inm unidad
cuando la concentracin de antitoxina circulan
te, conseguida como consecuencia de una in
munizacin activa, es alrededor de 0,01 U.A.
Esta pequea cantidad de antitoxina sera sufi
ciente para neutralizar la toxina originada en
una infeccin primaria. Si las cantidades de to
xina rebasan la capacidad neutralizante de la
antitoxina la infeccin puede producirse, pero
es necesario hacer notar que en los individuos
inm unizados activam ente, a diferencia de lo
que pasa con los no inmunes, pequeos estm u
los, conseguidos como consecuencia del nuevo
ingreso de toxina a los tejidos, hacen que rpi
damente y con suma facilidad elaboren gran
cantidad de antitoxina y de este modo aumen

ten enormemente las defensas especficas (va

se cap. 24).
Nuestros conocimientos sobre la inmunidad
antiviral no son tan claros como desearamos;
no obstante sabemos que en la defensa contra
los virus los principales elementos de defensa
son los linfocitos citotxicos. Es necesario te
ner en cuenta una serie de factores que pueden
incidir en dicha inmunidad, factores que estn
relacionados con la especie animal, la edad del
sujeto en experimentacin, el tejido donde se
im planta el virus, la va de inoculacin. Un
ejemplo lo tenemos en el virus de la influenza,
que inoculado por va subcutnea no infecta al
ratn pero, si en cambio es inoculado por va
intranasal, s le produce la tpica neumona vi
ral al cabo de una semana.
El mecanismo de invasin viral y las opera
ciones de limpieza llevadas a cabo por el macroorganismo infectado son muy similares a lo
que ocurre en las infecciones bacterianas pero
no debemos olvidar cul es la estructura y me
tabolismo de los virus y su exclusiva prolifera
cin en las clulas del husped.
Lo que s es evidente es que, cuando se ino
culan por las vas que corresponden suspensio
nes de virus atenuados, o en los casos de infec
ciones virales por enfermedad, se consigue una
inmunizacin activa de largo plazo, muchas ve
ces de por vida, mucho ms eficaz que la inmu
nidad bacteriana. Es tambin evidente que me
diante la inoculacin de esos virus atenuados a
animales adecuados puede conseguirse la pre
paracin de sueros antivirus para ser emplea
dos eficazm ente en la inm unizacin pasiva
(vase cap. 27).
In m u n id ad local
Desde hace mucho tiempo se sospechaba la
existencia de un estado inmunitario local, en
cierto modo independiente de la inm unidad
general, pero slo en los ltimos tiempos, con
el descubrimiento de los anticuerpos citoflicos
y la inm unoglobulina IgA secretoria (vase
cap. 5) se ha logrado una explicacin convin
cente.
Sabemos que en el hombre y ios animales
existen diferentes clases de inmunoglobulinas
que pueden tener especificidad para un mismo
determinante antignico; tenemos conocimien
to tambin de que los anticuerpos, como con
secuencia de modificaciones en sus estructu
ras, pueden variar en su comportamiento bio
lgico. Algunos de ellos tienen capacidad para
fijarse a clulas, en especial a macrfagos: son
los anticuerpos citoflicos y se caracterizan
porque al fijarse a receptores celulares del ma
crfago lo arm an con anticuerpos especfi
cos capaces de fijar al antgeno. El armado de

Mecanismos de defensa contra la agresin

los macrfagos con anticuerpos citoflicos, va
receptor para Fe, puede ocurrir en el curso de
una infeccin, en la zona inflamada donde se
ha originado el proceso o en los ndulos linf
ticos, por contacto de los macrfagos con clu
las form adoras de anticuerpos o anticuerpos
circulantes. Los macrfagos armados pueden,
regionalmente o a distancia de la infeccin ini
cial, posibilitar la fagocitosis del antgeno por
fijacin previa a su membrana, lo que favorece
su endocitosis, o facilitar su destruccin por un
mecanismo no fagoctico. No caben dudas de
que los m acrfagos que tienen fijados an ti
cuerpos citoflicos deben desempear un papel
im portante en la inm unidad local contra los
agentes agresores externos.
Bl hecho que ha contribuido a una m ejor
comprensin de la inmunidad local ha sido el
d escubrim iento de que la inm unoglobulina
IgA, que se encuentra en el torrente sanguneo
en pequeas cantidades, est presente en con
centraciones relativamente altas en el calostro,
sahva, lgrimas, secrecin bronquial e intesti
nal. En todas estas secreciones, la IgA no res
ponde a su estructura normal, sino que adquie
re una estructura dimrica asociada a un com
ponente S o secretorio, diferente de los pp
tidos constitutivos de las inm unoglobulinas,
elaborados por las clulas epiteliales glandula
res y que le confiere al anticuerpo resistencia a
la accin de las enzim as proteolticas. Esta
IgA es de origen local y est elaborada por las
clulas formadoras de anticuerpos ubicadas subepitelialm ente en las glndulas m ucosas y
membranas. Es de singular importancia en la

13

regulacin de la inmunidad local, por su parti

cipacin en la defensa de las membranas y ca
vidades abiertas contra los agentes de la agre
sin (vanse caps. 5 y 17).
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La respuesta inmune

RICARDO MARGNI

En el captulo 1, al discutir los mecanismos

de la defensa contra la agresin de patgenos
reales o potenciales, se enfatizaba que en todos
los vertebrados adultos poda activarse un sis
tema de reconocimiento especfico del agente
agresor, conocido como sistema inmune. A fi
nes del siglo pasado y en los comienzos de esta
centuria, se discuti vivamente si ese mecanis
mo era mediado por molculas o por clulas,
siendo activos defensores de estas postulacio
nes Ehrlich y Metchnicoff. Este ltimo sostena
que la defensa inmune era ejercida por los m a
crfagos, los que al fagocitar las bacterias por
un proceso similar al que ocurre con las part
culas inertes, aseguraban su destruccin. Ehr
lich, en cambio, consideraba que las clulas
elaboraban receptores especficos en sus mem
branas los que, luego eran liberados al plasma
circulante, y que esas molculas eran las que
neutralizaban al antgeno o agente agresor.
Entre los aos 1930 y 1960, especialmente
en lo que a respuesta humoral se refiere, dos ti
pos de teoras fueron expuestas. Las instructi
vas postulaban que el antgeno inoculado, ac
tuando como molde o matriz, interfera en la
conformacin de la gamma globulina que nor
malmente se sintetizaba, haciendo que su es
tructura fuese complementaria de la del antge
no. Las otras teoras, denominadas selectivas,
consideraban que el antgeno no influa sobre
el tipo de anticuerpo que habra de formarse,
sino que aqul seleccionaba y estim ulaba las
clulas que elaboran el anticuerpo especfico,
para lo que estaban programadas desde el naci
miento.
Con el correr del tiempo los conceptos han
ido cambiando, en gran parte se han integrado
y actualmente sabemos que el sistema inmune
est formado por dos grupos fundamentales de

2
clulas. Por un lado macrfagos y clulas simi
lares que actuando en forma inespecfica parti
cipan, de la captacin del antgeno, su procesa
miento y presentacin para el reconocimiento
por los linfocitos, clulas con actividad espec
fica. Algunas estirpes de estas clulas slo son
capaces de reconocer al antgeno por contacto
directo, cuando les es presentado por el macr
fago en forma adecuada; otras secretan molcu
las denominadas anticuerpos, poseedoras de es
tructuras especiales, que pueden unirse al ant
geno especficam ente y neutralizar su efecto
agresor. A las clulas capaces de interaccionar
especficamente con el antgeno o de secretar
molculas que puedan hacerlo se las denomina
inmunocompetentes, y a las que participan en
otras etapas de la respuesta inmune clulas ac
cesorias.
En el hombre y dems vertebrados normal
mente existen estas clulas, de modo que ten
gan asegurada la posibilidad de poner en mar
chados mecanismos de defensa especfica con
tra los agentes patgenos, agresores reales o
potenciales. De dnde provienen esas clulas?
Cmo se originan y adquieren capacidad para
el reconocimiento especfico? Cmo es ese re
conocim iento y cules son los m ecanism os
efectores? Las clulas inm unocom petentes
constituyen una nica estirpe celular o hay va
rios tipos de ellas con funciones distintas?
Clulas indiferenciadas multipotentes
Las clulas del sistema inmune se originan
durante la hematopoyesis, proceso por el cual a
partir de elulas indiferenciadas multipotentes
o stem cells y en funcin del microambiente
que las rodea, estas clulas pueden diferenciar
se en distintas lneas celulares: mieloide, linfoi-

La respuesta inmune
de, eritroblastoide, monocitoide, megacariocitoide. Aquellas clulas de la serie linfoide ori
ginadas durante este proceso constituyen el
componente celular especfico del sistema in
mune (fig. 2-1).
Al comienzo del desarrollo embrionario las
primitivas clulas indiferenciadas desarrollan a
partir del m esnquim a; a m edida que el em
brin evoluciona se las encuentra en el saco vitelino, hgado fetal, bazo y mdula sea, lugar
ste donde perduran durante la vida extrauteri
na. Durante el desaiTollo seo las clulas mesenqui males se localizan en el rea subendostal, surgiendo por un lado los osteoblastos y os
teoclastos y por el otro las clulas indiferenciadas o stem cells pluripotentes. Estas clulas
se dividen dando clulas hijas, algunas de las
cuales retienen sus caractersticas subsistiendo
com o clulas in diferen ciad as, en tanto que
otras se diferencian en las distintas lneas celu
lares del sistema hematopoytico. Se han en
contrado stem cells con capacidad de desa
rrollo ms limitado dentro del linaje de las c
lulas sanguneas. As, algunas de ellas slo son

15

capaces de diferenciarse en clulas mieloides, o

clulas linfoides, o clulas eritroides.
Segtin el microambiente que las rodee, y su
posibilidad de interaccionar con matrices celu
lares como hialuronato, otras molculas pro tei
cas de membranas celulares y molculas libres
del tipo de las interleuquinas, especialm ente
IL-7, una clula indiferenciada podr derivar
en una determ inada lnea celular del sistem a
hematopoytico. Todo ello tiene lugar por in
teracciones protena-protena, jugando un p a
pel muy importante en este mecanismo la m o
lcula CD44, uno de los constituyentes de los
elu ster o grupos de diferenciacin (v ase
cap. 11) y el cido hialurnico. CD44 es una
protena trasm em brnica, cuyo gen tene 20
exones IO de los cuales pueden ser ensam bla
dos en forma alternativa, originando isoformas
cuyo dom ino extracelular expresa diferentes
aminocidos insertados en la forma estandard
de la protena, lo que hace que se pueda un ir a
diferentes ligandos, hecho regulado por el m i
croambiente en el que prolifera. En embriones
de ratn la molcula CD44 es deteetable cu an

Antiouerpos

Y A
AA

Progenitor eritroide

F ig. 2-1. G eneracin de clulas hem atopoyticas a partir de una clula indiferenciada o stem ceU" pluripotente. C 'FU:
unidad form adora de colonias; G M -CSF: factor estim ulante de colonias d e monocitos; G -CSF: factor estim ulante d e ca o lo - .
nias de granulocitos; 11.-1, lL -3, lL-7: interleuquinas ), 3 y 7.

16

Aspectos bsicos de la inmunidad

do se desarrolla el mesodermo y endodermo y

cuando ocurren las migraciones celulares, per
mitiendo de este modo, segn el sitio de reca
lada, las diferenciaciones de las stem cells .
Mediante el uso de anticuerpos monoclonales
especficos esta molcula ha sido detectada en
las clulas indiferenciadas, en progenitores de
la serie linfoide y en las clulas que penetran
al timo y son inducidas a diferenciarse en ti
mocitos.
Otras molculas que juegan un rol importan
te en la fijacin y migracin de estas clulas en
su entorno son los componentes de la familia
de las integrinas (vase cap. 12), glucoprote
nas constituyentes de los receptores de adhe
sin. Isoform as de una de ellas, la protena
VLA, pueden actuar como receptores para laminina, fibronectina y colgeno. Las integri
nas, de las que se han identificado 20 formas
distintas, son heterodmeros formados por las
cadenas peptdicas a y (3 no covalentem ente
unidas; de stas se conocen 14 y 8 cadenas di
ferentes, respectivam ente. V arias isoform as
son originadas por empalmes alternativos de
exones ocurridos a nivel gnico y algunas mo
dificaciones postraduccionales. Estas integrinas
parecen desempear un papel importante, fun
cionando como verdaderas seales durante la
migracin celular a distintos rganos y tejidos.
Linfocitos
A partir de estas clulas indiferenciadas deri
van las distintas estirpes de linfocitos o clulas
inmunolgieamente competentes. En los mam
feros, entre el 0,5% y 10% de las clulas pro
ducidas diariamente son linfocitos, muchos de
los cuales mueren en pocos das, mientras que
algunos se mantienen como clulas de larga vi
da (clulas con memoria).
Existen poblaciones de linfocitos funcionalmente distintas, hecho relacionado con el rga
no linfoide primario en el que han adquirido
competencia inmunolgica. Entre estas clulas,
los linfocitos B (LB) son los productores de an
ticuerpos o inmunoglobiilinas; los linfocitos T
(LT), en cambio, carecen de esa propiedad. Los
LT pueden ser efectores como los LT citot
xicos (Te) o citolticos (CTL) que matan y des
truyen aquellas clulas blanco que expresan
epitopes extraos en su superficie, o regulado
res como los linfocitos T cooperadores o helper (Th) que ayudan a los LB y Te a cumplir
su funcin eficientemente. Si bien con frecuen
cia se hace mencin de una poblacin de linfo
citos T reguladores, capaces de expresar una
funcin supresora (Ts), contraria a la desarro
llada por los Th, hasta el momento no se ha po
dido aislar ningn clon de clulas linfoides que
expresen exclusivamente tal funcin. Los me

canismos de supresin existen en una respuesta

inmune, y es muy probable que los mismos es
tn regulados a nivel molecular por interaccio
nes mediadas por molculas sintetizadas por
las otras estirpes linfoides conocidas.
Los linfocitos T y B no son diferenciables
morfolgica ni tintorialmente; no obstante ello
puede hacerse a travs de la deteccin, median
te el uso de anticuerpos monoclonales especfi
cos, de los marcadores de membrana propios
que cada uno de ellos expresa. A las clulas
linfoides que no poseen los marcadores clsi
cos de membrana se las denomina linfocitos T
nulos o TO.
Si una clula indiferenciada, inmunolgicamente incompetente, adquiere competencia in
munolgica en el ambiente de la bursa de Fabricius (aves) u otros rganos linfoides prima
rios de otros vertebrados (mdula sea, placas
de Peyer, amgdalas, apndice cecal), la clula
resultante ser un linfocito B. Si lo hace en el
ambiente del timo, el producto de diferencia
cin ser un linfocito T. El contacto de estas
clulas con clulas epiteliales de los rganos
linfoides primarios, bursa o bursa smilis y del
timo, inducen programas de expresin de genes
que sern especficos para los linfocitos B o los
linfocitos T, respectivamente. Dicha expresin
tiene lugar a lo largo de la diferenciacin que
experimentan estas clulas hasta lograr la com
petencia inmunolgica y su funcionalidad, por
lo que la identificacin de determinados marca
dores de membrana permitir, en cada una de
estas lneas celulares, establecer el grado de
madurez adquirido.
Linfocitos B: caractersticas y ontogenia
Durante el proceso de diferenciacin los lin
focitos B evolucionan, a partir de una stem
cell, en clula Pro-B o precursor B inmadu
ro, clula Pre-B , linfocito B inmaduro y lin
focito B maduro, el que a su vez puede diferen
ciarse en clula plasmtica. En los diferentes
estadios aparecen en la membrana celular pro
tenas especficas o marcadores, algunos de los
cuales perduran durante la mayor parte de la
evolucin y otros son propios de distintos esta
dios celulares.
La clula Pro-B se caracteriza por expresar
en su superficie marcadores tpicos del linaje
B, pero no sintetiza ninguna de las cadenas
constitutivas de inmunoglobulinas. En este es
tadio de diferenciacin slo se produce el rea
rreglo de los genes D^,, Jj_, y V,_, (vase cap. 6).
La enzima deoxinucleotidil transferasa termi
nal (TdT) est presente en el ncleo de los pri
meros progenitores de los linfocitos B y T y
tiene un papel importante en la creacin de di
versificacin, ya que su funcin es catalizar la

La respuesta inmune
incorporacin al azar de nucletidos en extre
mos expuestos de ADN. Ello lleva a la inser
cin de residuos de origen no germinal durante
ei rearreglo de los genes D,.,,
y Vj^, aumen
tando la diversificacin del sitio de combina
cin de la molcula anticuerpo, especialmente
a nivel de CDR3 (tercera zona de hipervariabi
lidad de las cadenas H). Esta enzima constituye
un excelente marcador del estadio inicial de di
ferenciacin de los linfocitos B y T, ya que en
el estadio siguiente esta enzima no se expresa.
Los antgenos del Complejo Mayor de H is
tocompatibilidad llamados HLA-DR son mol
culas que se expresan en los linfocitos B desde
los comienzos de su diferenciacin y perduran
durante todo el linaje de las clulas B, dejando
de hacerlo en los plasmocitos. Estos antgenos
son fundamentales para la expresin en mem
brana de los pptidos antignicos que habr de
reconocer el linfocito Th para ejercer su efecto
cooperativo (vase ms adelante).
Las molculas CDl 9 y CD24 son marcado
res que se expresan en las elulas Pro-B. El pri
mero de ellos se conserva hasta en el linfocito
B activado, mientras que CD24 se pierde du
rante la activacin.
Las clulas Pre-B expresan CDIO, una endopeptidasa neutra, y C D l9, glucoprotena trans
membrnica que puede asociarse no covalente
mente con los componentes del complejo que
constituye el receptor antignico del linfocito
B. CD20 y CD22 comienzan a expresarse tam
bin en este estadio, perdurando el primero en
los linfocitos B activados, lo que no ocurre con
CD22. E stu d io s estru ctu rales sugieren que
CD20 podra ser un canal inico que funciona
ra durante la activacin celular. Otra protena
detectada en los progenitores iniciales de la di
ferenciacin es CD34, con una estructura pare
cida a la mucina y que funcionara como m ol
cula de adhesin por un mecanismo similar al
de las leetinas.
Una molcula del linaje B maduro es CD21,
que muestra baja afinidad por el componente
del complemento C3d y constituye el receptor
del virus Epstein-Barr, productor de la mononucleosis infecciosa y el linfoma de Burkitt. La
molcula CD21 se pierde durante la activacin
linfocitaria.
El marcador tpico del linfocito B es su re
ceptor antignico, el que est constituido por
una molcula monomrica de inmunoglobulina
de la clase IgM (|0.k)2 o (jAA-jj], idntica al anti
cuerpo que habr de secretar luego la corresponcente clula plasmtica (vase cap. 5). El
reordenamiento de los genes que dirigen la sn
tesis de las cadenas pesadas (fj.) constitutivas de
la IgM tiene lugar en el estadio Pro-B. El pri
mer hecho suele ser la aproximacin de un seg
mento Dy (diversity) del gen de cadena pesa

17

da a un segmento J_, (joining), producindose

un rearreglo Dj^/Jj_,, el que a su vez se une a uno
de los varios segmentos VH (variable), origi
nando VjyDj.,Jj.j. En el hombre esto ocurre en
uno de los cromosomas 14. Si se logra ensam
blar un gen activo que codificar para el seg
mento variable de la cadena, el otro haplotipo
de cadena pesada presente en el otro crom oso
ma 14 permanece sin cambios o reordenamien
tos (en configuracin germinal). Si en el prim er
intento no se logra ensam blar un gen activo
(recombinacin abortiva), se procede a reordenar los genes de cadena pesada del otro crom o
soma. No se conocen las seales que regulan
estos hechos, pero ellos explican el fenmeno
de exclusin allica.
Las clulas Pre-B tienen reordenados su ge
nes para la sntesis de cadenas |Li, las cadenas H
o pesadas de IgM, pero no han adquirido an la
capacidad de expresar las cadenas livianas K o
X. Simultneamente aparecen cadenas |Li en el
citoplasma. En este estado se expresan dos ge
nes adicionales, X5 y VpreB, y sus productos ca
dena (X) (omega, 18 kDa) y cadena t (iota, 14
kD a), constituyen la denom inada cad en a L
su stitu a o pseudo cadena L que p u ed e
combinarse con una cadena naciente y expre
sarse en la membrana celular. Se ha demostrado
que la cadena se une covalentemente al produc
to del gen X5 (cadena (o) y se asocia no cova
lentemente al producto del gen VpB (cadena i).
Los genes X5 y VpreB tienen secuencias hom olo
gas con las cadenas ^ y no han experimentado
rearreglos antes de su expresin. Parecera que
la funcin que cumple esta asociacin, que no
tiene actividad de receptor de antgeno, es la de
facilitar interacciones del linfocito Pre-B con
clulas estromales y otros componentes del m i
croam biente de la mdula sea. No obstante,
estudios recientes parecen demostrar que la ex
presin de cadenas ja en la superficie celular es
condicin indispensable para que tenga lugar la
expresin de cadenas livianas.
En este estado de diferenciacin se expresan
tambin otros dos genes relacionados con el re
ceptor B. Son los identificados en el ratn como
mb-1 y B29, cuyos productos de expresin, las
protenas Ig a e gP, asociadas a la IgMm cons
tituyen el complejo que funciona como receptor
antignico del hnfocito B (vase cap. 11).
Las clulas proceden luego a reordenar los
genes de cadenas livianas (V^^ y Jj^). A parente
mente el orden de los sucesos no ocurre al azar,
sino que se observa un orden jerrquico. Se co
mienza con la familia k (kappa) en un crom o
soma 2; si el suceso es exitoso, el otro haploti
po k y ambos cromosomas 22 que llevan 1a fa
milia X (lambda) se conservan en configuracin
germinal. Si el primer intento X resulta aborti
vo, se procede a reordenar el segundo haplotipo

18

Aspectos bsicos de la Inmunidad

manteniendo X en configuracin germinal. Si

este intento tambin falla, recin se procede a
utilizar la familia X, intentando primero uno de
los dos alelos. La preferencia en la utilizacin
de cadena liviana K puede tener que ver con la
mayor posibilidad de diversidad que ofrece este
sistema respecto del X y se refleja en las inmu
noglobulinas circulantes: en el ratn el 95% de
los anticuerpos poseen cadenas liv ian as K,
mientras que en humano el 60% utiliza k . Ello
es consecuencia de que en el ratn existen apro
ximadamente 250 genes Vk, en tanto que hay
solo dos genes YX, mientras que en el hombre
esos valores son 50 y 30, respectivamente.
Finalmente, una vez que la cadena liviana se
transcribe y se traduce, en el citoplasma se une
a la cadena pesada para ensamlslar una IgM
monomrica que se expresar en la membrana
celular (IgMm). A continuacin por empalme
(splicing) alternativo del pre-ARNm, las c
lulas sintetizan en form a sim ultnea cadenas
pesadas p. y 5 y expresan en la superficie IgM e
IgD. Todos los hechos descritos en el proceso
de diferenciacin de los linfocitos B ocurren en
alrededor de tres das.
A partir de aqu la clula est madura y mi
gra hacia los rganos linfoides secundarios.
Luego de la activacin antignica las clulas
dejan de expresar IgM e IgD de superficie y
pasan a secretar IgM. El CD23, un receptor de
K,

baja afinidad para IgE, es un marcador exclusi

vo de este estadio de activacin del linfocito B.
La caracterstica fundamental del receptor de
los hnfocitos B es su capacidad para reconocer
antgenos en solucin, sin necesidad de inter
mediarios. En la membrana celular se encuen
tran asociadas a la IgM las cadenas peptdicas
Ig a e IgP, las que tienen una activa participa
cin en los mecanismos de transduccin de se
ales al interior de la clula cuando el receptor
antignico del LB interacciona con el antgeno.
Los linfocitos B experim entan durante su
evolucin un proceso que los lleva a la no reac
tividad contra los antgenos propios. Ello ocu
rre en los primeros estadios de la diferencia
cin, donde los contactos prematuros con esos
antgenos pueden inducir anergia, delecin clo
nal y muerte celular.
Los linfocitos B maduros se localizan en di
ferentes rganos linfoides secundarios, pasando
a formar parte de la poblacin de linfocitos B
recirculantes, los que estn en condiciones de
responder a un estmulo antignico. El 20% de
estas clulas se encuentran en sangre perifrica;
el 70%, repartido aproximadamente en partes
iguales, en el bazo, zona fohcular de los gan
glios linfticos y conducto torcico; el resto en
mdula sea y amgdalas.
La figura 2-2 esquematiza los distintos esta
dios de diferenciacin y los marcadores celula

Clula B
con memoria

Anticuerpos

Clula
indiferenciada

Clula Pro-B
Clula Pre-B
(Precursor inmaduro)
TdT (-h-H-t)
HLA-DR (+)
CD10 (-I-)
CD19 {+++)
CD24 (-I--H-)
CD72 {++)
Genes H reor
denados (-H-h)

HLA-DR {++++)
CD10 (+-H-H-)
CD19 (-t-t-i-H-)
CD20 {++++)
GD24 (-i-f++)
CD22 (+++)
CD72 (-t-h+-t)
CD78 {++)
|i en citoplas
ma (-)-i-++)
Genes H reor
denados (-H--H-)
Genes L, inicia
cin reordena
miento (-t-t)

Clula
plasmtica
HLA-DR (++++)
CD10 (-H-+H-)
GD19 (-I--I-+-!-)
GD20 (++++)
GD24 ^++-1-)
GD22 (+++)
GD72 (-H--H-)
GD78 {+++)
IgM sup (-r-H-t)
IgD sup (-(-+-M-)
Genes H reorde
nados (-t-t++)
Genes L reorde
nados {++++)

HLA-DR (++++)
CD19 (-t-t-H-)
GD20 {+++)
CD23 (+-H--F)
GD72 (++++)
GD78 (+++)
IgM sup (+-I-+H-)
Genes H reor
denados (-H--H-)
Genes L reor
denados (-H--H-)

CD38 (-t-t)
CD78 {+++)
(i en citoplas
ma (-H--H-)
Genes H reor
denados (-H--I-I-)
Genes L reor
denados (-H--H-)

Fig. 2-2. Evolucin y expresin de m arcadores durante el proceso de diferenciacin por los com ponentes celulares de la
lnea de linfocitos B.

La respuesta inmune
res que identifican a las clulas de linaje B. Por
inm unofluorescencia indirecta y usando anti
cuerpos m onoclonales especficos para cada
marcador, se los puede poner en evidencia. Por
el mismo procedim iento, usando suero an ti
gamma globulina, puede detectarse en los lin
focitos B su receptor antignico (vase cap. 3).
Linfocitos T: caractersticas y ontogenia
Las clulas indiferenciadas que migran al ti
mo encuentran el microambiente para su dife
renciacin en linfocitos T. Estas clulas pueden
participar en ciertos mecanismos inm unolgi
cos como el rechazo de injertos, reacciones de
hipersensibilidad retardada, reacciones de in

19

jerto contra husped, defensa contra virus y c

lulas tumorales, o en procesos de regulacin de
la respuesta inmune. Las clulas que entran al
timo provienen de la mdula sea y son TdT" y
HLA-DR+. Este ltimo marcador se pierde in
mediatamente. En el microambiente del timo,
como consecuencia del entorno y la influencia
de productos de naturaleza peptdica (timosina,
etc), la clula indiferenciada comienza a dife
renciarse. Los primeros cambios ocurren en la
zona cortical del timo; estos timocitos inm adu
ros (protim ocitos) expresan los m arcadores
CD2 y CD7, y posteriormente CD5 (tim ocito
inmaduro). En esta etapa los timocitos com ien
zan a reordenar los genes que codifican para el
receptor antignico, un heterodmero form ado
TIMO

dula
T dT

SANGRE
CIRCULANTE

F ig. 2-3. D iferenciacin de los linfocitos T. La p rim era etapa ocurre en la corteza del tim o, continuando luego en la zona
m edular. D urante este pasaje los linfocitos experim entan estadios de diferenciacin caracterizados por la ap a rici n en
m em brana de diferentes m arcadores antignicos. F inalm ente se separan en dos grupos, los que expresan los m arcadores
CD4 y C D 8, respectivam ente. A lcanzado ese grado de diferenciacin los tim ocitos se vuelcan al torrente linftico y san
guneo y constituyen las poblaciones de linfocito T que expresan CD 4 (T H I y TFI2) y CDS (Te).

20

Aspectos bsicos de la inmunidad

por dos cadenas peptdicas, a/|3 o X/b, unidas

covalentemente (vase cap. 7). Los genes que
se reordenan primero son los T[3 y Ty. Reorde
nados los genes, com ienza a expresarse en
ARNm. La etapa siguiente de maduracin tiene
lugar en la zona m edular del tim o (tim ocito
comn), y en su inicio incorporan nuevos an
tgenos y marcadores de membrana: C D l, CD4
y CD8. La denominacin de timocito comn
proviene de que estas clulas expresan ambos
marcadores CD4 y CD8. Dentro de la zona me
dular, en una etapa posterior de diferenciacin,
los LT pierden C Dl e incorporan el antgeno
CD3, asociado al receptor antignico, pero las
clulas ya se diferencian en dos grupos: el que
expresa CD4 y el que expresa CD8, marcado
res de los linfocitos Th y Te respectivamente.
Adems se reordenan y expresan los genes T a
(vase cap. 7). Teniendo en cuenta varias simi
litudes en el desarrollo entre los linfocitos B y
T, es de esperar que una cadena a sustituta
juegue en el linfocito T un papel similar al ejer
cido por la cadena L sustituta en el linfocito
B. En ratones CD3+CD4"CD8" deficientes en
cadenas a , se han encontrado timocitos grandes
que expresan cadenas |3 asociados, va puente
d isulfuro, a una glucopro ten a denom inada
gp33, cuyo gen ha sido clonado. ste codifica
una protena con un dominio extracelular, una
porcin transmembrnica que contiene dos re
siduos polares idnticos a los de la cadena a , y
una porcin citoplasmtica. En las cadenas a
normales estos dos residuos son necesarios pa
ra el ensam blado y transporte del com plejo
C D 3.TcR ap. Por este motivo a la gp33 se la
denomina cadena a sustituta del pre-receptor
T (pTa), la que tendra un papel similar al de la
cadena L sustituta codificada por los genes
A.5 y VpjeB. El receptor del linfocito T slo reco
noce pptidos antignicos provenientes del pro
cesado, por las clulas presentadoras: a) de an
tgenos endgenamente sintetizados (protenas
virales, antgenos tum orales), expresados en
membranas celulares y asociados a antgenos
del Complejo M ayor de H istocom patibilidad
(CMH) clase I (linfocitos Te), o b) de antge
nos extraos y asociados al CMH clase II (lin
focito Th). Esto constituye una restriccin del
reconocimiento antignico por los componen
tes del CM H clase I, para los linfocitos Te,
efectores y del CMH clase II, para los linfoci
tos Th, reguladores (vase cap. 7).
Cuando los timocitos completan su madura
cin se vuelcan al torrente sanguneo como lin
focitos T maduros, que expresan en membrana
como m arcadores ms representativos CD2,
CD3, CD4, CD5, CD7 (Th) y CD2, CD3, CD5,
CD7, CD8 (Te) (fg. 2-3).
CD2 es el responsable de la formacin de ro
setas que tiene lugar cuando se mezclan linfo

citos T y glbulos rojos de carnero, reaccin

que durante cierto tiempo fue considerada co
mo una de las ms efectivas en la identifica
cin de esta estirpe de Hnfocitos. El adveni
miento de los anticuerpos monoclonales y la
identificacin de diferentes molculas CD, le
han quitado primaca a las llamadas rosetas E.
Los linfocitos Th que expresan CD4 se dife
rencian en dos grupos, TH l y TE12. El primero
de ellos sintetiza IL-2 e lEN-y y normalmente
son los responsables de las reacciones de hiper
sensibilidad tarda (vase cap. 16). Los TH2,
que sintetizan IL-4, IL-5 e IL-10, son los que
ejercen el efecto cooperativo. A aquellos linfo
citos que sintetizan las interleuquinas produci
das por am bos grupos (T H l + TH2) se los
identifica como THO.
Los linfocitos CD8+, citotxicos, secretan IL10 e lEN-y, y ejercen un efecto supresor sobre
los T H l y la sntesis de inmunoglobulina IgE.
Un efecto similar, a travs de la IL-10 que se
cretan, ejercen los TH2 sobre la poblacin T H l.
La IL-10 secretada regula a su vez la actividad
de las clulas CD8+, lo que demuestra que estas
clulas pueden ejercer un efecto supresorio a
travs de molculas que ellas elaboran, y que la
IL-10, por otra parte, tiene un efecto regulatorio
en la proliferacin de clulas T. Estos datos
confirmaran la suposicin de la inexistencia de
una estirpe nica de linfocitos T (Ts) responsa
ble de los fenmenos de supresin que ocurren
durante una respuesta inmune.
En los linfocitos maduros ya est predeter
minado cul va a ser el elemento restrictivo pa
ra el reconocimiento antignico (CMH clase I o
II). Esta cualidad no es heredada, se la adquiere
durante la maduracin linfocitaria. Los linfoci
tos T han aprendido este reconocimiento parti
cular durante su evolucin en el timo, habiendo
experimentado en primer lugar una seleccin
positiva y luego una seleccin negativa. Duran
te la primera slo han sobrevivido aquellos ti
mocitos inmaduros que reconocen a los antge
nos del CMH de clase I o de clase II propios
expresados en el epitelio tmico, y durante el
proceso de seleccin negativa mueren aquellos
timocitos que reconocen a sus antgenos pro
pios asociados a sus antgenos del CMH de cla
se I o de clase II. Los que sobreviven son aque
llos que poseen receptores capaces de interac
cionar con antgenos extraos adecuadamente
procesados por las clulas presentadoras de an
tgenos y asociados a antgenos del CMH pro
pios. Este proceso selectivo evita que proliferen aquellos linfocitos capaces de reconocer
antgenos propios e inducir una respuesta in
mune de autoagresin, y hace que slo perdu
ren los que reconocen a los agentes agresores
extraos, contra los que ponen en marcha los
mecanismos de la inmunidad.

La respuesta inmune
Los linfocitos que mueren durante este pro
ceso de seleccin lo hacen por apoptosis o
muerte programada, la que es inducida por se
ales especficas. La muerte no es por necrosis;
hay fragmentacin del ncleo y destruccin ce
lular. De la poblacin total de clulas que se di
ferencian en el timo, slo el 5% sobrevive y
pasa a circulacin como linfocitos T maduros.
A aquellos linfocitos que han madurado pero
que no han sido impactados por el antgeno se
los identifica como clulas nve (cndidas,
inocentes, vrgenes). Cuando un antgeno inte
racciona con un linfocito no estimulado (naVve) ste se diferencia a clulas efectoras/reguladoras, parte de las cuales perdurarn como
clulas con memoria.
Estudios realizados por Prince y col. por ci
tometra de flujo bicolor y tricolor, han demos
trado que las clulas nave son CD45RO%
C D 45R A ""'" y las clu las con m em o ria
C D 45R O *'", C D 4 5 R A \ L as c lu la s
C D 4 5 R O ' '", C D 4 5 R A - y C D 4 5 R O '>^ ,
CD45RA*son exclusivam ente hnfocitos T,
en tanto que las CD45RO, CD45RA' pue
den ser clulas T, clulas B y clulas killer .
En la conversin nve a memoria se in
crementa la proporcin de CD25 y disminuye
ladeC D 38:
CD45RO-, CD45RA>"'......CD 25 (5% ); CD 38 (76%)
CD451, C D 45R A ' >......C D 25 (24% ); CD 38 (53%)
CD45RO'"", C D 45RA -......CD 25 (42% ); CD38 (27%)

Las molculas C D l la, CD2 y CD4 aumen

tan en las clulas con memoria . Ello ocurrira
despus de la prdida de CD45RA y aparicin
de CD45RO y no durante los estadios interme
dios como ocurre con CD25 y CD38.
Los linfocitos B y T que han adquirido com
petencia inmunolgica pasan a poblar los rga
nos hnfoides secundarios, en la proporcin y
distribucin ya indicada para cada uno de ellos.
En ese conjunto de linfocitos recirculantes estn
expresados los receptores capaces de reconocer
a los diferentes antgenos, cuyo nmero se esti
ma en 5 X 10*^ hasta 1 x 10, pudiendo cada uno
de ellos expresar entre 5 y 10 epitopes diferen
tes, en promedio. Dado que cada linfocito B o T
expresa un receptor capaz de reconocer sola
mente un epitope antignico, la poblacin nor
mal de linfocitos, calculada para el ratn en 10,
es suficiente para cubrir el panorama de especi
ficidades necesario para que la labor defensiva
contra los agentes agresores sea efectiva.
Clulas accesorias
Las clulas con funciones accesorias que
pueden presentar epitopes a los LT para su re
conocimiento dual (CPA) son los macrfagos.

21

monocitos, clulas dendrticas, astrocitos, clu

las de Langerhans, pudiendo tambin cum plir
esa funcin los linfocitos B activados y las c
lulas B de origen tum oral. La caracterstica
fundamental de estas clulas es expresar en sus
membranas antgenos codificados por el CM H
de clase II y adems, especialmente en los m a
crfagos, de sintetizar y excretar factores cono
cidos con el nombre de monoquinas, siendo el
principal de ellos la interleuquina 1 (IL-1), fac
tor estim ulativo de fundam ental im portancia
para que los linfocitos en estado de rep o so
(GO) puedan excitarse, pasar a la fase G1 e in
gresar al ciclo celular. Las clulas accesorias
son generalmente fagocticas y por ese m eca
nismo captan al antgeno, lo procesan y se acti
van, incrementando la produccin de lL-1.
A las CPA se las designa profesio n ales
cuando en condiciones normales expresan an t
genos del CMH en su superficie, as co m o
otras molculas de adhesin. Las CPA son no
profesionales, no clsicas, si slo bajo deter
minadas circunstancias expresan en su superfi
cie antgenos del CMH.
El contacto de los antgenos con las clulas
fagocticas se hace a travs de receptores, en
especial por intermedio de CRl y CRII, los que
tienen como ligandos a C3b y C3bi, co m p o
nentes del complemento resultantes de su acti
vacin por la va alterna. Estos componentes, al
estar unidos a los antgenos e interaccionar con
los receptores CRl y CRII actan como puentes
entre el antgeno y el macrfago facilitando su
en d o cito sis. La adhesin del antgeno a la
m em brana del macrfago puede ocurrir ta m
bin por interacciones protena-protena o por
la unin de ciertas protenas con funciones de
lectinas que se fijan a los hidratos de carbono
de algunas glucoprotenas aisladas o co m o
componentes de membranas celulares,
Los antgenos del CMH de clase I, que se ex
presan en la membrana de todas las clulas hu
manas, excepto los eritrocitos y espermatozoi
des, estn constituidos por una cadena a inserta
da en la membrana celular, asociada no covalen
tem ente a una cadena del p2 microglobulina.
Los antgenos del CMH clase II estn formados
por dos cadenas peptdicas, a y P y asociadas no
covalentemente, y ambas insertadas en la m em
brana celular. Dentro del citoplasma celular y
antes de su expresin en membrana, los antge
nos de clase II tienen una tercera cadena peptdi
ca llamada y o invariante, que no presenta iso
formas y cumple un rol importante en el trans
porte del pptido antignico (vase cap. 10).
Los pptidos resultantes de la degradacin de
los antgenos fagocitados constituyen los epito
pes que finalmente reaparecern en la superficie
de las clulas accesorias, asociados a los antge
nos del CMH mediante uniones hidrofbicas, y

22

Aspectos bsicos de la Inmunidad

Cambio
conformacional
CMH-clase I

TAP1

TAP2

Pptido
CITOPLASMA
Proteasoma

Complejo
proteasoma-pptido

F ig. 2-4. Procesado por la CPA y expresin en la m em brana celular de pptidos provenientes de antgenos de sntesis en
dgena asociados a CM H-L Parte de la figura por debajo de la lnea quebrada: visin am plificada del proceso de fragm en
tacin del antgeno (Ag) por interm edio de los proteasom as (PTS) y transporte al lum en del RE a travs de los transporta
dores de pptidos insertados en la m em brana del RE, a efectos de su interaccin con los antgenos del CM H -clase L Com o
consecuencia del proceso stos sufren cam bios conform acionales, los que aseguran una m ejor unin y transporte al Golgi.
P arte superior: pasaje del com plejo pptido-C M H -I a travs del aparato vesicular del Golgi y trans-G olgi h asta la m em bra
na celular para su presentacin al receptor antignico (R C T) de LT.

en ese contexto son presentados a los linfocitos

T. La nica excepcin a la restriccin para el re
conocimiento dual por los LT son los antgenos
del CMH extraos (alotpicos), ya que en ese
caso particular no es necesaria la participacin
de los antgenos del CMH propios.
Procesado y presentacin del antgeno
Qu acontece cuando un antgeno penetra
por primera vez en el hombre u otro vertebrado
que ya ha desarrollado su sistema inmune? Las
clulas que actan en primer lugar son los m a
crfagos y otras clulas presentadoras de ant
genos. El procesamiento de ese antgeno ser
distinto segn se trate: a) de un antgeno end
genamente sintetizado, como lo son las prote
nas virales correspondientes a virus que infec
tan las clulas, los neoantgenos producto de
clulas que han sufrido transformacin malig
na, etc, o b) que el agente agresor sea un coinponente antignico externo del tipo de las bac
terias, parsitos o protenas extraas.

En el primer caso, la protena viral u otra si

milar de origen citoplasmtico es degradada en
el citosol por un grupo de proteosomas (PRT),
-unidad que contiene sitios catalticos m lti
ples-, y se originan simultneamente y a partir
del mismo sustrato diferentes pptidos. Estos
sitios proteolticos mltiples facilitan la p ro
duccin preferencial de los pequeos pptidos
que habrn de constituir los epitopes antigni
cos secuenciales a reconocer por los linfocitos
T. Estos pptidos son transferidos a las unida
des transportadoras (TAP) que residen en la
m em brana del retculo endoplsm ico (RE) y
que transfieren a su vez los pptidos al lumen
del RE, los que en el Golgi se unen a las nue
vas inolculas del CMH de clase 1. Esta unin
induce cambios conformacionales en las mol
culas CMH, que habrn de llevar a su estabihzacin y facilitar el transporte del com plejo
pptido-CMH clase 1 a la superficie celular pa
ra su reconocimiento por el receptor antignico
del linfocito T (fig. 2-4).
Los antgenos extraos adheridos a la super

La respuesta inmune
ficie de la clula que habr de participar en su
presentacin sern endocitados por pinocitosis,
proceso que consiste en la ingestin de partcu
las solubles o fluidos, o por fagocitosis cuando
se trate de restos celulares, bacterias o produc
tos de agregacin. En ambos casos se forman
vesculas o vacuolas que se vierten en los en
dosomas tempranos, primer compartimento do
tado de proteasas eficientes a pH cidos, nece
sarias para iniciar la degradacin del antgeno.
Entre stas, las dos ms importantes son la catepsina B y D. El proceso contina luego en los
endosomas tardos y concluye con la participa
cin de las vesculas lisosomales, caracteriza
das por contener un elevado ntmero de enzi
mas proteolticas.
Las molculas de antgenos procesadas por
la va endoctica no tienen posibilidades de
unirse a los antgenos del CMH clase L Slo lo
hacen a molculas de clase IL El ensamblado
de tas cadenas a y P de los antgenos del CMH
clase II para formar el heterodmero tiene lugar
en el RE. Durante la biosntesis de estas mol
culas una tercera cadena denominada y o inva
riante (Ii) se une al heterodmero en forma tran

23

sitoria, impidiendo su unin a pptidos endge

nos en el RE y asegurndole de este modo su
participacin en la va endoctica. Si bien el en
samblado de la cadena no es un requerimiento
absoluto para la expresin del heterodm ero
aP , incrementa la eficiencia del proceso. Las
inolculas de clase II transportadas a partir del
RE lo hacen bajo la forma de un armazn com
plejo constituido por 3 cadenas y en el que se
insertan 3 hetrodmeros ap.
C u an d o las m o lcu las lleg an al re tc u lo
trans-G olgi (RTG) y como consecuencia de
una seal determinada, el complejo aP y se diri
ge, por alguno de los mecanismos de la v a en
doctica cuya localizacin no ha sido determ i
nada hasta el presente, a los endosom as que
contienen los antgenos procesados. D urante
este trnsito la cadena y es degradada y el h ete
rodmero a p puede entonces unirse a los p p ti
dos antignicos exgenos (fig. 2-5). El tiempo
que las molculas del CMH clase II tardan en
atravesar la ruta endoctica y aparecer en la su
perficie celular es de 1-3 horas. El pH cido
predominante en los endosomas/lisosomas con
tribuye a una mejor degradacin de las m olcu
Ag exgeno
Pptido exgeno
CMH-clase ['

Pptido e n d g e n o L iJ
CMH-clase II

F ig. 2-5. P rocesado p or la C PA y expresin en la m em brana celular de pptidos provenientes de antgenos de sn tesis ex
gena y endgena, asociados al CM H-II,

24

Aspectos bsicos de a inmunidad

LINFOCITO Th

CMH-clase II
CELULA PRESENTADORA DE ANTIGENO
Aminocidos componentes del epitope

Aminocidos componentes dei agretope

Fig. 2-6. E pitope y agretope. El conjunto de am inocidos identificados con
que contactan con el RCT, constituyen
el epitope-, los identificados con (), que contactan con el CM FI-clase II constituyen el agretope.

las de antgeno endocitadas y a un aumento de

la eficiencia de la unin de los pptidos a las
molculas del CMH clase II.
Si bien los antgenos del CMH clase II nor
malmente presentan pptidos provenientes de
antgenos exgenos, pueden tambin, en deter
m inadas circunstancias, presentar antgenos
endgenamente sintetizados. Ello ocurre en las
respuestas con formacin de anticuerpos de la

clase IgG contra antgenos procedentes de una

infeccin viral, las que slo tienen lugar si el
linfocito B es ayudado por un linfocito T
helper que ha aprendido a reconocer ppti
dos andgnicos asociados al CMH clase II. Su
mecanismo no est bien determinado; podra
ocurrir que antgenos endgenos expresados
en la membrana celular asociados a CMH cla
se I para su reconocim iento por las clulas
LINFOCITO Th

Ag procesado

Fig. 2-7. Procesam iento del an t

g eno por el m acrfago y p resen
ta c i n d e l c o m p le jo p p tid o C M H -II a las cadenas a y |3 del
R C T de un Th. Se in d ican a d e
m s las cadenas peptdicas cons
titutivas de CDS y la fam iha zeta,
C D 4 y la interaccin entre CD28
y B7 y de un par de m olculas de
adhesin (C D 2/LFA -3) com o re
presentativas de estos procesos.

La respuesta inmune
CD8+ fueran luego endocitados. En este caso
el proceso seguira la va endoctica que lleva
a la asociacin con antgenos clase II y su ex
presin en la superficie celular para su recono
cimiento por los receptores antignieos de las
clulas CD4+. Otra posibilidad es que se for
men autofagosomas que incorporen protenas
citoplasmticas y que despus de la fusin con
estructuras lisosomales esas protenas antig
nicas sean procesadas por la va de los antge
nos del CMH clase II.
La va endgena de procesamiento del ant
geno, utilizada cuando los pptidos resultantes
se van a unir a antgenos del CMH clase 1, es
distinta de la que tiene lugar cuando los antge
nos van a ser presentados por molculas de cla
se 11. En el primer caso el proceso puede ser
bloqueado con inhibidores de sntesis de pro
tenas o mediante brefeldina A, un inhibidor
especfico del transporte entre el RE y el Golgi,
y no es alterado por cloroquina. Esta droga en
cambio, al igual que el NH4C1, impide la acidi
ficacin de los endosomas y produce el conse
cuente bloqueo del procesamiento del antgeno
a ser presentado por molculas de clase II.
Un antgeno extrao, endgeno o exgeno,
ser procesado por los macrfagos y otras clu
las presentadoras del husped, y en el contexto
de los antgenos del CMH clase 1 y clase II, pe
queos pptidos de 8-15 aminocidos sern ex
presados en sus membranas. Los complejos es
tarn en condiciones de ser reconocidos por
aquellos linfocitos T maduros que se encuen
tran en los rganos linfoides secundarios for
mando parte del conjunto de clulas T recircu
lantes, dentro de las limitaciones de su restric
cin y especificidad.
Los pequeos pptidos antignieos se unen
en forma lineal, por uniones no covalentes, a la
parte variable de los antgenos del CMH clase I
y clase II, que en esa zona presentan una es
tructura en forma de celdilla que, por estudios
de cristalografa de rayos X, se ha demostrado
que est form ada por protena con estructura
secundaria de dos a-hlices cruzadas por es
tructuras en lmina p plegadas (vase cap. 10).
Los aminocidos del pptido que se unen al an
tgeno del CMH constituyen el agretope y no
son necesariamente los mismos que se exponen
para ser reconocidos por el RCT (epitope) (fig.
2-6). Experimentalmente se ha demostrado que
en el pptido obtenido de mielina de rata y pos
teriorm ente acetilado, compuesto de 11 am i
nocidos (A c.A la-Ser-G ln-L ys-A rg-Pro-SerGly-Arg-His-Gly), la Gln que ocupa el lugar 3
y la Pro hacen contacto con el RCT; la Ala y la
Lys lo hacen con los antgenos del CMH.
Pai'a que la unin CPA-LT se efectivice ade
cuadamente, adems de la unin RCT-pptido
otras interacciones entre molculas de adhesin

25

de las membranas de ambas clulas tienen lu

gar (vase cap. 11).
Sim ultneam ente las clulas m acrofgicas
sintetizan y secretan lL-1 y TNF, m olculas
que activan a los linfocitos que reconocieron al
antgeno por ellas presentado y se encuentran
en fase de reposo o GO e inducen su pasaje a
las fases G1 y S, o de sntesis, del ciclo de vida
celular (fig. 2-7). Si el linfocito T era del serotipo CD8+ y su RCT tena restriccin para ant
genos CMH clase I, el linfocito excitado habr
adquirido capacidad para reconocer y destruir,
como clula citotxica o linfoltica efectora, a
cualquier otra clula que exprese en su m em
brana ese producto CMH clase Lpptido. Si la
clula T era CD4+, su RCT posea restriccin
para CMH clase II y sintetizaba IL-2, el linfo
cito T estimulado adquirir capacidad para in
ducir respuestas de hipersensibilidad tard a
cuando encuentre al pptido antignico espec
fico presentado en el contexto del CMH clase
11. Estos linfocitos, como ya se indicara, son
identificados como T H l. Algunas de estas es
tirpes eelulai'es pueden ejercer efecto coopera
tivo o helper. Si la clula T CD4* que reco
noce al CMH clase 11-pptido es productora de
IL-4, IL-5 e IL-10, identificada como TH2,
ejercer un efecto cooperativo sobre los linfoci
tos B, asegurando una respuesta efectiva de es
tas clulas (fig. 2-8).
Un linfocito B reconoce al antgeno en fase
fluida, sin necesidad de degradacin p revia y
sin requerimiento de clula presentadora de an
tgeno o restriccin de antgenos del CM H,
Cuando el receptor B (IgM de membrana) cap
ta al antgeno, el LB se activa, se diferencia en
clula plasmtica y secreta inm unoglobulinas
de la misma especificidad que la de su recep
tor. Si el antgeno que indujo la respuesta es Tindependiente, ella ser con produccin de an
ticuerpos IgM ya que los antgenos de ese gru
po, por poseer efecto mitognico o determinan
tes antignieos prximos y repetidos, producen
agregacin de los receptores y transducen las
seales que llevan a la activacin y diferencia
cin celular, aparentemente sin la necesidad de
otros intermediarios. Hay estudios que parece
ran indicar que en algunos casos se necesitara
el estmulo de IL-1. Los antgenos T-independientes no inducen cambio o switch de clase
de inmunoglobulina por lo que la respuesta es
siempre de tipo IgM. El cambio de IgM a IgG
u otros isotipos de inmunoglobulinas es depen
diente del antgeno y de las diferentes interleu
quinas sintetizadas principalmente por los lin
focitos Th.
Si el inmungeno es un antgeno T-dependiente, el antgeno por s solo no es suficiente
para que la respuesta inmune sea efectiva. Para
que ello ocurra necesita de la cooperacin de

26

Aspectos bsicos de la inmunidad

los linfocitos Th. D urante mucho tiem po se

consider que el Th, para ejercer su efecto coo
perativo reconoca, del antgeno fijado por el
LB a travs del epitope, a la parte soporte o
carrier la que actuaba como puente entre am
bas clulas.
E.ste concepto dej de ser vlido cuando se
demostr que el LT slo reconoca pequeos
pptidos resultantes de la degradacin del ant
geno, asociados a antgenos del CMH. El LT
haba aprendido a reconocer al antgeno pre
sentado por el macrfago de una manera dife
rente a la efectuada por el LB, ya que ste lo fi
jaba por su epitope a travs de la IgM de mem
brana (IgMm). Actualmente esto ha sido clari
ficado, pues se ha demostrado que el linfocito
B cuando fija al antgeno por su receptor espe
cfico lo internaliza, procesa y expone en su
mem brana los diferentes pptidos resultantes
asociados a molculas de antgenos CMH clase
II, de modo anlogo al que hacen las clulas
presentadoras de antgeno. Este producto es el
que reconoce el linfocito Th. Esto implica que
el LT no reconoce el mismo epitope cjue el LB,
y que el efecto cooperativo lo pueden ejercer
los distintos Th capaces de identificar a cada
uno de los diferentes pptidos, resultantes de la
degradacin antignica, expuestos en membra
na del LB asociados a antgenos del CMH cla

se II. Al mismo tiempo el LB expresa recepto

res para IL-2 e IL-4, los que interaccionan con
la IL-2 o IL-4 secretada por el Th. Estas inte
racciones son las que estimulan al LB y lo lle
van a diferenciarse en piasmocito y a sintetizar
anticuerpos con la misma especificidad que su
receptor especfico (IgMm) (fig. 2-8).
Cuando un antgeno es inoculado por prime
ra vez en un animal virgen, los eventos que se
ponen en marcha son los indicados; la respues
ta primaria es iniciada por unos pocos linfoci
tos (clulas nai've) que poseen receptores es
pecficos para el antgeno (fig. 2-9). Adems,
linfocitos T y B que no se transforrnan en clu
las efectoras, perduran en el husped por pero
dos prolongados como clulas con memoria
inm unolgica. Nuevos estm ulos antignicos
contactarn rpidamente las clulas con mem o
ria las que, por el hecho de tener especificidad
definida y formar parte de una poblacin celu
lar ms numerosa que las que pudieron recono
cer al antgeno durante el primer estmulo, in
ducen una respuesta ms acelerada y de mayor
magnitud. El clon celular correspondiente a los
linfocitos T se habr incrementado y la produc
cin de anticuerpos por las clulas de la lnea B
ser de un nivel superior. En este caso la res
puesta inmune inducida se denomina secunda
ria, la que resulta mucho ms efectiva que la

Ag T-indOTendiente

Diferenciacin

Y Y Y
IgM

Proliferacin y
diferenciacin
IgM; IgG; IgA
IgD; IgE
Y

C lu la

'

' plasmtica

Epitope
Pptidos
CMH-I
C M H -ll

, < Receptor B
V ^R e ce p to rT (C M H -I)
S r'R s c e p to rT (CM H-ll)

Mastocito
oliferacln)

Fig, 2-8. Interacciones entre clulas presentadoras de antgenos (CPA ), linfocitos B, linfocitos T (Th, Te) y los productos
solubles por ellas sintetizados (interleuquinas), ante una estim ulacin con antgenos T-independientes (A) y T -dependien
tes (B)

La respuesta inmune

27

MDULA SEA

L1
Clulas
indiferenciadas
BURSAI

LB

TIMO

j J I d O I I ICtLIV

'^ m e m o r i a (

LTCD4+ (Th1)\
(hipersensibi
lidad tarda)

(efectores)

K qmM
Respuesta primaria

LT CD8", Te
Respuesta primaria

F ig. 2-9. R espuesta inm une prim aria y secundaria. L as clulas indiferenciadas de la m dula sea pueden adquirir c o m p e
tencia inm unolgica a travs del tim o o de rganos b u rsa sm ilis, diferencindose en linfocitos T y B, respectivam ente, los
que pasan a integrar la poblacin de linfocitos recirculantes que no ha sido im pactada p o r antgenos. C uando esto ocurre
los linfocitos B se replican y diferencian en clulas plasm ticas sintetizadoras de anticuerpos (IgM ); los linfocitos T o rig i
nan clones de clulas efectoras (CD4+ T H l y Te) y reguladoras (CD4+ TH 2). Parte de las clulas perd u ra por largos p e ro
dos com o clulas de m em oria, las que ante nuevos estm ulos antignicos se m ultiplican y diferencian rpidam ente, con
una respuesta secundaria m agnificada respecto de la respuesta prim aria.

respuesta primaria . Durante este proceso hay

maduracin de la respuesta inmune, caracteri
zada por el cambio de clase de inmunoglobuli
na, generalmente IgG y una mayor afinidad o
capacidad de unin del antgeno a los anticuer
pos que se sintetizan. En la induccin de este
fenmeno participan aspectos propios del ant
geno inductor usado y distintos tipos de linfo
quinas sin tetizad as por los lin fo cito s (fig.
2-10). El efecto resultante de las estim ulacio
nes repetidas es el que se busca cuando se quie
ren obtener inmunizaciones activas (vacunacio
nes) exitosas y cuando se intenta lograr inm u
nosueros de alto ttulo de anticuerpos y buena
afinidad.

B IB L IO G R A F A
1. A da GL, N ossal, G. The clonal selection th e o ry . S ci
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28

Aspectos bsicos de la inmunidad

Proliferacin de
linfocitos i

Sntesis de
anticuerpos

Fig. 2-10. D iferentes interleuquinas que participan en la activacin del linfocito B y en el cam bio o sw ich de clase de
inm unoglobulina.

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La respuesta inmune

29

Compilado por: L. Fainboim

Anexo I: Listado de clusters de diferenciacin (CD) leucocitarios basado en los resultados del
V Taller Internacional realizado en Boston, en noviembre 1993. Referencia sobre los m ism os
pueden encontrarse en: Leuiiocyte Typing V.- wlrite cell differentiation antigens. Eds. S. Schlossman y col. Oxford University Press, 1994.
CD

O tras denom inaciones P M (kD)

CDl a
C D lb
D ]c
CD2
CD2R
CD3

T6
W M 25
M241

T3

49
45
43
50
50
5 cadenas

CD4

T4

55

CD5
CD6
CD7
CDS

TI
TI 2

67
100
40
34

^ ,| 1

TS (hom odm eros y

heterodm eros)

CD9
CDIO

CA LLA

24
100

C D l la

L FA ^

170

C D llb

CR3,M A C-1*

165

C D llc

p l5 0

150

C D I2
CD13

90-120
150

CD14

55 (mo)
64 (B)
trisacrido

CD15

Lew is X*

CD15S

sLex,*

CD16

FcR IIIA /
FcRIllB
FcR lIIB

C D l 6b
C D w l7

? Ligando para cl. T y8

Igual que C D l a
Igual que CD 1a
L igando para CD58
V a alternativa de activacin T
A sociado al TCR. T ransduccin
de seales T
Interacta con M HC clase II
T ransduccin de seales
Ligando para CD72
7
7
Interacta con M H C clase I
T ransduccin de seales
A ctivacin plaquetaria?
Idntica a la endopeptidasa neural (enkefalinasa)
CD 11 a/C D 18 ligando
IC A M -I e lC A M -2
C D l lb /C D 1 8 interacta con pro
tenas de la m atriz y es el re
ceptor para iC3b
C D l Ic/C D l 8 ligando de fibringeno
7
A m inopeptidasa

R eceptor del com plejo de LPS y

la protena que une LPS
El A cM inhibe fagocitosis y
efecto m icrobicida en N E
form a siali- Ligando para CD 62E
tada
R eceptor baja afinidad para IgG
50-65
agregada
Unin a m em brana po r G PI. No
48
enva seales
LacC er de los N e involucrado en
LacC er
exocitosis 0 em paquetam iento
granular
95
V ase C D l l

CD 19
CD20

cadena |32 de las inte

grinas
B4
Bl

CD2I

CR2

145

CD22

BL-CA M

130/I40

CD23
CD24

F ceRII, Blast-2

45
35-45

CD25

IL-2R

55

CD18

95
33-37

R egulacin proliferacin B
R egulacin activacin y prolife
racin B
R eceptor para C3d y EBV activa
cin B
C adena (3 ligando para C 45R 0 y
C D 72
R eceptor baja afinidad IgE
?
Induce activacin y proliferacin
cel. T ,B ,tim ., N K, M a.
P roteasa de superficie celular

CD26

110

CD27

55 hom od L igando de CD70, seal coestim uladora cl. T vrgenes

mero
44 hom od L igando de CD 80 (seal coesti
m ulatoria)
m ero
H eterodm eros C D 29/C D 49 me
130
dian adhesin clula-clula y a
m atriz

CD28
CD29

subunidad p i integri
nas

D Lnribucin celular

P apel biolgico

Tim ocito, CL
Igual que C D l a
Igual que C D l a, Subpob. B
T, N K
T activados
T
T que reconocen M H C clase II
T, subpob. B (B la )
A lgunos T y algunos B
T
T que reconocen M H C clase I
Pre-B, B inm aduros, M o, Pl
Pro, algunos Pre-B, algunos B m ad u ro s,
Gr
L
Cl. M i y NK

Cl. M i, altos niveles en Ma, m a rcad o r

de LCV
M o, G r, Pl
Prec. m ielom onocticos, Mo, Eo, N e,
CEp, intestino delgado, tbulos ren .,
m em b. sinpticas, F i, Oc
M o, M a, algunos Gr, B
N e, Eo
Igual a C D l5
N K, M a
Ne
Ne, M o, Pl

V ase C D l 1
Pro- B hasta B activadas, CFD
Pre-B hasta B activadas
B m aduras, CFD, subpoblacin tim m ica, epitelio farngeo
B m aduras (60-80% ), I.CV citop. d e
pro-B , pre-B, B
F cella: B. Fcellb: M o
Pro-B , pre-B y B, Gr, Ti (2%), n eu ro blastom a, T act.
Cl. activadas T, B y Mo
T y B en reposo y activadas. C E p ren al
e intest., canal, biliar
T, Ti m edulares, B activ,, Pl
T C D 4 (95% ), T CDS (50%)
L e en reposo y activados

C o n tin a

30

Aspectos bsicos de la inmunidad

Anexo I. (Continuacin)
CD

Otras denom inaciones

C D 30

Ki^ 1

105

CD31
C D 32

PECA M FcyRIIA

130-140
40

CRl

67
105-120
250

CD33
C D 34
CD 35

88

CD 36
CD 37
CD 38
C D 39
C D 40

TIO

P apel l)iolgico

P M (I D)

40-45
43
78
50

R eceptor baja afinidad IgG

M ediador de fagocitosis por su

unin a C 3b y C4b
? R eceptor eritrocitario para
Plasm odium falciparum

C ooperacin T-B a travs de

unin a gp39 en T activados
C adena a del heterodm ero con
C D 6 I, involucrado en adhesin
y agregacin plaquetaria. Une
fibringeno, fibronect, vitronect.
P arte del com plejo CD 42
U nin a factor de von W illebrand. R eceptor a trom bina
Parte del com plejo CD42
Parte del com plejo CD42
Ligando de CD 54

C D 41#

G PIlb

125/22

C D 42a
C D 42b

G PIX
G P IB ,a

23
135,23

C D 42c
C D 42d
CD43

G PIB ,p
GPV
Sialoforina

C D 44

Pgp-1

22
85
95 (T)
115-135 (Ne)
R eceptor para cido hialurnico.
80-95
por el cual une Li a HEV

210

C D 45

LCA ,B 220

V ariante de CD 44 con condroitn

sulfato
A ctividad fosfo-tirosino-fosfata180-240
sa. C D 45R O ligando de CD 22
240 (cl B) a
180 (Ti)

C D 46

M CP,TLX

51-58 y 59-

C D 44R

68
C D 47

C o 'facto r proteico de m em brana

(M CP) que al unir C3b o C4b
perm ite que el factor I degrade
C3b o C4b

47-52

C D 48

Blast-I

40-47

C D 49a

VLA-1 (cadena a l )

210

C D 49b

V LA -2 (cadena a 2 )

160

C D 49e
C D 49d

V LA -3 (cadena a 3 )
V LA -4 (cadena a 4 )

125
150

C D 49e
CD 49f
C D 50
CD51

V LA -5 (cadena a 5 )
V LA -6 (cadena a 6 )
ICA M -3

135,25
120,25
124
140
cadena a v

C D 52
CD 53

Cam path-1

21-28
32-40

H eterodm eros C D 49/C D 29 ad

hesin a m atriz extrace-m ediada por la secuencia Arg-GlyA sp (RG D ). C olgeno
(CD 49a,b), Lam i-(C D 49a,b,c),
fibronectina (CD 49c,d,e), HEV
de placas P eyer (CD 49d)
A diferencia de otras integrinas
C D 49/C D 29 m edia adhesin
clula a clula por su unin al
ligando VCAM -1
Ligando LFA-1
R eceptor para vitronectina,
(C D 51/C D 61). R econoce RGD
en m atriz extracelular, (von
W illcbrand, fibringeno, vitro
nectina)

D istribucin celular
T y B activ. Cl. R eed-Stem berg, linfo
mas a cl. grandes anaplsticas, Pl,
M o, Gr, CE
M o, Pl, Gr, Ce y sus uniones
Todas las form as en Mo, C E y trofo
blasto. FcyRIIA y C en Ne. FC^RIIB
en B
Prec. M i (luego de CD 34), M o
Cl. hem atopoyticas inm aduras y CE
Ne, Eo, subp T, B, M o, podocitos glom erulares
G licoprotena m ayor de Pl, M o, CE, v e
na um bilical
B. B aja expresin cls. M i
Prec. T y B tem pranos, T y B activ, P
B activ, N K activ, Subp. T, Ma, CD, C L
CD, B, algunas CEp
Pl, m egacariocitos

Pl, m egacariocitos
Pl, megacariocito.s
Pl, m egacariocitos
Pl, m egacariocitos
Ti, T, Gr, M o, Ma, NK, Pl, B activ, P,
stem cells de M O y timo
T, B, M o, Gr, Ti m edulares, Er, CEp,
cl m em oria
Sustancia b lan ca de SNC, miisculo esqueltico, tum ores
Li
Excepto Er, todas las clulas hem atopo
yticas. Las isoform as C D 45RA,
CD 45RB , CD 45RC y C D 45R O se ex
presan diferencialm ente en distintas
clulas (vase texto)
Ti, T, B, M o, Gr, NK, Pl, CE, C Ep, F,
placenta, esperm a

Todas las cl. hem atopoyticas, CEp,

CE, F, esperm a
T, B, Ti, M O (30% ), Eo, CEp bronquial
y salival
T reposo (CD49d)
T m em oria aum enta C D 49e,f
Ti (CD 49d,f), B (CD 49b,c,d)
M o (CD 49b,e,f), Pl (C D 49b,e,t)
C Ep (C D 49f a.sociado a cadena (34)

Ti, T, B, M o, Gr
Pl, m egacariocitos

T i , T , B , G r ( l 5 % ) , E o (30% )
Ti, T, B, M o, Pl, Gr, Oc, Ob

La respuesta inmune

31

Anexo I. (Continuacin)
CD
CD 54

IC A M -I

80-114

CD55

DAF

70

CD56

N^CAM
M ol. de adhesin
neural
HNK-1
LFA -3
M IR L

17.5-185

CD57
CD58
CD59

CD w 60* U M 4D 4
CD61
G P Illa
CD 62E

ELAM 4

CD 62L
C D 62P

LAM-1
PAD G EM

CD63
CD64

FcyRI

CDw65'' V lM -2
C D 66a BG P
CD66b CD 67
CD66c N CA
CD66d C G M l
C D 66e CEA
CD67
actual C D 66b
CD68
CD69

MLR^3

CD70
CD71

CD72
CD73
CD74
CDw75
C D w76 antes CD76
CD77*

BLA

CDw78 A ntgeno Ba
CD79a

lg a ,ra b -l

CD79b
CD80
CD8)

Igp,B 29
B7,BB1
T A PA -I

CD82
CD83

R 2 JA 4
HB15

CD w84 267,152-1D5
V M P-55
CD85
B 7.2, FUN ^l
CD86

P apel biolgico

P M (kD)

Otras denom inaciones

lio

7
L igando para CD2
R egula la accin del C por su
unin a C8 y C9
7
Trisacrido
Es la cadena (3 que se asocia a
110
CD41
Ligando del epitope sLe*
115
R eceptor para N e y T
Unen linfocitos a HEV
75-80
M edia la interaccin de plaq. ac
150
tiv. con neu. y mo. U ne sLex
7
53
R eceptor de alta afinidad IgG
75
U nico que une m onm eros
oligosacrido A ctivacin de neutrfilos
Los C D 66 pertenecen a la fila, de
180-200
A gs carcino-em brionarios de
95-100
m olculas de adhesin involu
90-95
crada en adhesin hom otpica
30
180-200
55-70
18-20

no

D istribucin celular

A m plia. Cl. hem atopoyticas y n o h e

L igando para L F A -1
m atopoyticas
(C D I I a /C D 1 8 ) y M a c - l. R e
ceptor para R inovirus
P rotege a los tejidos del dao por A m plia. Cl. hem atopoyticas y n o h e
m atopoyticas
el C autiogo, im pide el arm a
do de la C3 convertasa
N K, alg. tejidos neurales
A dhesin hom otpica

NK, 25% T y B, algunos Mo

A m plia en cl. hem atopoyticas, C E
Le, C E, CEp, Pl
T (25-45% ), Pl, M o
Pl, M eg, IVla, cl. no hem atopoyticas
C E activadas
L vrgenes
Pl activadas, IVIeg, CE
Pl activ., Mo, M a, dbil en Gr, B, T
Mo y Ma
G r y algunos M o
Ne, precursores m ieloides, ribete en ce
pillo de epitelio colnico

G rnulos citoplsm icos y su p erficie de

M o, M a, N e, Ba, L grandes
C onstitutiva en Pl, Ti CD4-^/CD8-^- T
activadas
B y T activ.

Es la m olcula que se expresa

28,32
m s tem prano en la activ. cel.
hom odm ero
55,75,95,110, L igando de CD27
120
T y B activ., Ma
R eceptor para transferrina
95
M etabolism o del hierro y creci
m iento y proliferacin celular
Pro-B a B activada, M a
42
L igando para CD5
hom odm ero
Ti, CD4-^ (10% ). C D 8+ (50%), B
Ecto. 5 nucleotidasa
69
(70% ), CEp, CE
C adena invariante (Ii) H L A clase B, M o, Ma, subp T act., CEp
43/41/35/53
II. P resentacin Ag.
(4 form as)
9
T (20% ), B (aum enta con activ.) C E p ,
53
precurs. eritroides
7
7
Subp. T , B. M elanocitos, CE, C E p , (he
patocitos, tub. renales)
7
B de centro germ inal. M arcador
epitope
Lin fo m a de B urkitt
carbohidrato
7
Pre-B a B (aum enta con activacin),
M a, CEp
Pre-B hasta B
Parte del com plejo recep to r de
33,40
antgeno B . Form a un heterod
m ero con CD79b
Pre-B hasta B
V ase C D 79a
33,40
Cd, subp. B y todas las B activ.
Ligando para CD28 y C T L A -4
60
A cM o anti-T A P A -l tien e efecto L, lneas de neuroblastom a y m e la n o
22
mas
anti-proliferativo
43

73
120
80

7
7
Seal coestim ulatoria en CPA

Alta: CID , CD, C L

Baja: L i activados
M a, Pl, B y T activados
B, M o, LCV , m ielom as
CD, B y M o activados
C ontina

32

Aspectos bsicos de la inmunidad

Anexo I. (Continuacin)
CD

Otras
denotninaciones

P M (kD)

P apel biolgico

CD 87

U PA -R

50-65

CD 88
C D 89
C D w 90
CD91

C5aR
F caR
Thy-1
a2 m R (heterod
m ero)

C D w 92
CD93
C D 94
CD95

p70
V1MD25
KP43
A P O -l,F a s

42
55-75
25-35
600
515
85
70
120
43
42

C D 96

T A C TIL E

160

CD 97
CD 98

VIM3
4F2

74,80,89
80,40

Receptor para el activador del

plasm ingeno tipo-urokinasa
que prom ueve actividad fibrinoltica
R eceptor de la anafilotoxina C 5a
U ne IgA srica y secretoria
?
Receptor a2-m acroglobulina.
M edia endocitosis del receptor
unido a proteinasa
7
7
A dhesin de NK con integrinas
A sociado con la induccin de
apoptosis
A dhesin de T y N K en fase tar
da de respuesta inm une
7
7

CD 99
C D 99R
C D l 00

E2, M IC2
B B I8,A 8

32
32
150

? (form acin de rosetas con Er)

7
7

C D w lO l
C D 102

BB27, BA27
IC A M -2

140
60

C D l 03

HML-1

150,25

7
Ligando para L F A -1 (no para
M ac-1)
? C adena a E de integrinas
Se asocia con integrina p7
? C adena (34 de integrinas
A sociada con a (CD 49f) une
lam inina y epiligrina
7
Ligando para V LA -4
Posible rol en adhesin

C D l 04

205

C D l 05
C D l 06
C D l 07a

Endoglin
VCAM -1
LAMP-1

95

C D l 07b
C D w l0 8
C D w l0 9
C D l 15

L A M P-2
8A 3,7D 1
C S F -IR ; M -CSFR

120
80
170-150
150

C D w ll6

G M -C SFR

150

C D l 17

c-K it

145

CD w 119
C D I 20a

IFNyR
T N FR; 55kd

90
55

C D l 20b
C D w l2 1 a
C D w l2 1 b
C D l 22
C D w l2 4
C D l 26
C D l 27
C D w l2 8

T N FR; 75kD
IL -IR tipo 1
IL - 1R tipo 2
1L-2RP
1L-4R
IL-6R
IL-7R
IL8R

75
80
68
75
140
80
75
58,67

C D w l3 0

g p l3 0 ,S IG

130

100, l i o
lio

D istribucin celular
Ne, M o, M a, Eo, CE, Fi, T acvadas, ti
mo fetal

Gr, M a, M astocitos, m. liso

Mo, Gr, Ma, subp. B y T
Pro-Ti, cerebro y otros tejidos no linfoides
M o, M a, Fi, m. liso, hepatocitos, sinciciotrofoblasto, neuronas
Gr, M o, CE, U -9 3 7 ,T H P -I
Gr, M o, CE, U -9 3 7 ,T H P -I
N K, subpob. T. Aum. con activ.
Linaje T y m ieloide
T y N K activadas
T y B act., M o, NK, Gr, Pl
Baja en T, B, N K, Gr. A lta en: M o, T y
N K act,, m. cardaco, queratinocitos b a
sales
Ti, Li perifricos
Form a ms restringida de CD99
A mplia. Subpob. CD4 y CD8 que se acti
van por CD28
Gr, M o
L, M o, C E (alta expresin no m odulada
por la inflam acin)
Li intraepit. de intestino
H em idesm osom as epitehales, cl,
Schw an, CE, neuro, trofoblasto

CE, M a activados
CE
A m plia en citop, sup, de Pl activadas, T
^ citotxicos
? 60% hom ologa con LA M Pl
dem
7
Li, leucem ias agudas
7
Pl, M eg, C E capilar y venular, T activ.
La unin de M -C SF induce la di M o, M a y sus precursores
m erizacin del receptor
C adena a del receptor une GM - M o, M a y sus precursores, Pl
CSF. Junto a la cadena |3 gene
ra receptor alta afinidad
R eceptor para factor de creci
,Stem cells, m astocitos
m iento de stetn cells
U ne IFN y con alta afinidad
M ac, M o, B, fibro., epit., endo.
C D l 20a y b unen T N F a y TN Fp La m ayora de las cl, expresan uno o am
con relativa alta afinidad. Cobos TN FR s
m odulan con el antgeno Fas
V ase C D I2 0 a
V ase C D l2 0 a
R eceptor IL -1
A m plia
R eceptor IL -1
A m plia
C adena P del 1L-2R
T ,B
R eceptor IL-4
A m plia
R ec ep to rIL -6
A m plia
R ec ep to rIL -7
Precur, hem atopoyticas
R eceptor de IL-8
Ne, M o, queratinocitos, basfilos, sub
pob, T
S ubunidad p del receptor de IL6, transduce seal

(*): ep ito p e h id ro ca rb o n a d o , ($): U n id as a la m em b ra n a p o r un io n es fo sfatid il inositol. (#): C D 41 = gpMb es un h e te ro d m e ro 120/63, q u e

fo rm a un c o m p lejo c o n g p llla (C D 61). E x p re si n en tejidos: B, T , N K : lin fo cito s B, T y N K ; P: p lasm o cito s; Pl: plaq u e ta s; L: leucocitos;
Li: linfocitos; M o: m o n o cito s; G r: g ra n u lo c ito s; M a: m ac r fa g o s; E o: eo sin filo s; N e: n eu tr filo s; Er: eritro cito s; M O : m d u la sea; M eg;
m eg a cario c ito s; C E p: clulas ep iteliales; C E; c lu la s e n d o te lia le s; F i: fib ro b la sto s; T i: tim o cito s; C D ; c lu la s d endrticas; C L; c lu la s de
L an g e rh a n s; Oc; osteo cla sto s; Ob: osteo b iaslo s; C ID : c lu la s in terd ig itad as; M i: c lu la s m ielo id es; LCV:. leucem ia de c lu la s vellosas.

Bases celulares de la respuesta

inmune. rganos linfoides primarios
y secundarios

MARTA BRAUN

CONCEPTOS PRELIMINARES
El ingreso de un antgeno no propio dentro
de un organismo induce una respuesta inmune
especfica dirigida contra ese mismo antgeno
que, por la adaptabilidad del sistema inmune,
puede tomar distintas modalidades: produccin
de inmunoglobulinas de diferentes clases, res
puesta celular con activacin de macrfagos,
efectos citotxicos, etc. Es el antgeno quien
elige los clones de linfocitos especficos, precomprometidos para reconocerlo, a los que va
a activar y que van a producir alguna de esas
respuestas. Pero, para que sucedan todos esos
mecanismos efectores especficos, no slo de
ben preexistir linfocitos que reconozcan al ant
geno, sino que deben interactuar varias pobla
ciones celulares, que colaboran entre ellas, an
tes de que sea patente uno o ms de esos meca
nismos efectores.
De estas poblaciones, la nica que reconoce
especficamente a los antgenos es la de los lin
focitos. Pero aunque stos aparezcan morfol
gicam ente idnticos entre s, son funcional
mente muy diferentes, no slo por su especifi
cidad, para la cual ya estn com prom etidos
desde su maduracin, sino tambin por sus fun
ciones.
Existen dos grandes poblaciones de linfoci
tos: los linfocitos B y los linfocitos T. Los pri
meros son los encargados, casi exclusivamente,
de la sntesis de inmunoglobulinas. Los linfoci
tos T tienen, por el contrario, una serie de fun
ciones, algunas de ellas efectoras y otras de co
laboracin y regulacin, que ejercen sobre los
linfocitos B y sobre otras subpoblaciones de T.
Adems, para que se inicie una respuesta inm u
ne deben colaborar otras clulas'no linfoides.

3
muy especialm ente las de la serie m onocitomacrfago.
As, para que se produzca una respuesta hu
moral, por ejemplo, si bien los linfocitos B pue
den reconocer por s mismos el antgeno para el
cual estn comprometidos, pero para que se es
timulen, se diferencien a plasmocitos y secreten
anticuerpos, deben recibir la colaboracin de
una subpoblacin de linfocitos T, los linfocitos
T colaboradores o helper (Th). Para que los
Th reconozcan al antgeno para el cual estn
' pre-comprometidos, ste debe haber sido proce
sado y presentado, junto con un antgeno de
histocompatibilidad (CMH) propio, por otra c
lula, ya sea un m acrfago u otro linfocito B
(vase cap. 10). A su vez, la respuesta inmune
efectora casi siempre se ejerce con la colabora
cin de clulas o factores inespecficos: por
ejemplo, para que las Igs secretadas tengan un
efecto de proteccin contra el antgeno extrao,
salvo contadas excepciones, como puede ser la
neutralizacin de virus o toxinas, deben interve
nir otras clulas, como fagocitos o clulas ki
ller, o factores, como el complemento.
Por todo esto, se comprende que la respuesta
inmune provocada por un antgeno extrao es
un proceso complicado en el cual intervienen,
en forma de cascada exquisitamente regulada,
una serie de clulas y factores de los que no to
dos pertenecen al sistem a especfico p ro p ia
mente dicho, constituido por los linfocitos.
Las clulas, tanto especficas como inespec
ficas, que intervienen en la respuesta inm une
tienen un origen comn, las clulas troncales
(stem cells) de la mdula sea, pero luego
tienen diferentes vas de diferenciacin, lo que
da por resultado poblaciones celulares con di
ferentes funciones. Esta diferenciacin se inicia

32

Aspectos bsicos de la inmunidad

Anexo I. (Continuacin)
CD

Otras
denominaciones

P M (IcD)

P apel biolgico

CD 87

U PA -R

50-65

CD 88
C D 89
C D w 90
CD91

C5aR
F caR
Thy-1
a2 m R (heterod
m ero)

C D w 92
CD93
C D 94
CD95

p70
V1MD25
KP43
A P O -l,F a s

42
55-75
25-35
600
515
85
70
120
43
42

C D 96

T A C TIL E

160

CD 97
CD 98

VIM3
4F2

74,80,89
80,40

Receptor para el activador del

plasraingerro tipo-urokinasa
que prom ueve actividad fibrinoltica
R eceptor de la anafilotoxina C 5a
U ne IgA srica y secretoria
?
Receptor a2-m acroglobulina.
M edia endocitosis del receptor
unido a proteinasa
7
7
A dhesin de NK con integrinas
A sociado con la induccin de
apoptosis
A dhesin de T y N K en fase tar
da de respuesta inm une
7
?

CD 99
C D 99R
C D l 00

E2, M IC2
B B I8,A 8

32
32
150

? (form acin de rosetas con Er)

7
7

C D w lO l
C D 102

BB27, BA27
IC A M -2

140
60

C D l 03

HML-1

150,25

7
Ligando para L F A -1 (no para
M ac-1)
? C adena a E de integrinas
Se asocia con integrina p7
? C adena (34 de integrinas
A sociada con a (CD 49f) une
lam inina y epiligrina
7
Ligando pitra V LA -4
Posible rol en adhesin

C D l 04

205

C D l 05
C D 106
C D l 07a

Endoglin
VCAM -1
L A M P -1

95

C D l 07b
C D w l0 8
C D w l0 9
C D l 15

LAMP~2
8A 3,7D 1
C S F -IR ; M -CSFR

120
80
170-150
150

C D w ll

G M -C SFR

150

C D l 17

c-K it

145

CD w 119
C D l 20a

IFNyR
T N FR; 55kd

90
55

C D l 20b
C D w l2 1 a
C D w l2 1 b
C D l 22
C D w l2 4
C D l 26
C D l 27
C D w l2 8

T N FR; 75kD
IL -IR tipo 1
IL - 1R tipo 2
1L-2RP
IL-4R
IL-5R
IL-7R
IL8R

75
80
68
75
140
80
75
58,67

C D w l3 0

g p l3 0 ,S IG

130

100, l i o
110

D istribucin celular
Ne, M o, M a, Eo, CE, Fi, T acvadas, ti
mo fetal

Gr, M a, M astocitos, m. liso

Mo, Gr, Ma, subp. B y T
Pro-Ti, cerebro y otros tejidos no linfoides
M o, M a, Fi, m. liso, hepatocitos, sinciciotrofoblasto, neuronas
Gr, M o, CE, U -9 3 7 ,T H P -I
Gr, M o, CE, U -937,T H P-1
N K, subpob. T. Aum. con activ.
Linaje T y m ieloide
T y N K activadas
T y B act., M o, NK, Gr, Pl
Baja en T, B, N K, Gr. A lta en; M o, T y
N K aet,, m. cardaco, queratinocitos basales
Ti, Li perifricos
Form a ms restringida de CD99
A mplia. Subpob. CD4 y CD8 que se acti
van por CD28
Gr, M o
L, M o, C E (alta expresin no m odulada
por la inflam acin)
Li intraepit. de intestino
H em idesm osom as epiteliales, cl,
Schw an, CE, neuro, trofoblasto

CE, M a activados
CE
A m plia en citop, sup, de Pl activadas, T
^ citotxicos
? 60% hom ologa con LA M Pl
dem
7
Li, leucem ias agudas
7
Pl, M eg, C E capilar y venular, T activ.
La unin de M -C SF induce la di- M o, M a y sus precursores
m erizacin del receptor
C adena a del receptor une GM - M o, M a y sus precursores, Pl
CSF. Junto a la cadena |3 gene
ra receptor alta afinidad
R eceptor para factor de creci
,Stem cells, m astocitos
m iento de stem cells
U ne IFN y con alta afinidad
M ac, M o, B, fibro., epit., endo.
C D l 20a y b unen T N F a y TN Fp La m ayora de las cl. expresan uno o am
eon relativa alta afinidad. Cobos TN FR s
inodulan con el antgeno Fas
V ase C D l2 0 a
V ase C D l2 0 a
R eceptor IL -1
A m plia
R eceptor IL -1
A m plia
C adena P del IL-2R
T ,B
R eceptor IL-4
A m plia
R ec ep to rIL -6
A m plia
R ec ep to rIL -7
Precur, hem atopoyticas
R eceptor de IL-8
Ne, M o, queratinocitos, basfilos, sub
pob, T
S ubunidad p del receptor de IL6, transduce seal

(*): ep ilo p e h id ro ca rb o n a d o , (::): U n id as a la m em b ra n a p o r un io n es fo sfatid il inositol. (#): C D 41 = gpMb es un h e te ro d m e ro 120/63, q u e

fo rm a un c o m p lejo c o n g p llla (C D 61). E x p re si n en tejidos: B, T , N K : lin fo cito s B, T y N K ; P: p lasm o cito s; Pl: plaq u e ta s; L: leucocitos;
Li: linfocitos; M o: m o n o cito s; G r: g ra n u lo c ito s; M a: m ac r fa g o s; E o: eo sin filo s; N e; n eu tr filo s; Er: eritro cito s; M O : m d u la sea; M eg;
m eg a cario c ito s; C E p: clulas ep iteliales; C E; c lu la s e n d o te lia le s; F i: fib ro b la sto s; T i; tim o cito s; C D ; c lu la s d endrticas; C L: c lu la s de
L an g e rh a n s; Oc; osteo cla sto s; Ob: osteo b lasto s; C ID : c lu la s in terd ig itad as; M i; c lu la s m ielo id es; LCV:. leucem ia de c lu la s vellosas.

Bases celulares de la respuesta

inmune. rganos linfoides primarios
y secundarios

MARTA BRAUN

CONCEPTOS PRELIMINARES
El ingreso de un antgeno no propio dentro
de un organismo induce una respuesta inmune
especfica dirigida contra ese mismo antgeno
que, por la adaptabilidad del sistema inmune,
puede tomar distintas modalidades: produccin
de inmunoglobulinas de diferentes clases, res
puesta celular con activacin de macrfagos,
efectos citotxicos, etc. Es el antgeno quien
elige los clones de linfocitos especficos, pre
comprometidos para reconocerlo, a los que va
a activar y que van a producir alguna de esas
respuestas, Pero, para que sucedan todos esos
mecanismos efectores especficos, no slo de
ben preexistir linfocitos que reconozcan al ant
geno, sino que deben interactuar varias pobla
ciones celulares, que colaboran entre ellas, an
tes de que sea patente uno o ms de esos meca
nismos efectores.
De estas poblaciones, la nica que reconoce
especficamente a los antgenos es la de los lin
focitos. Pero aunque stos aparezcan morfol
gicam ente idnticos entre s, son funcional
mente muy diferentes, no slo por su especifi
cidad, para la cual ya estn com prom etidos
desde su maduracin, sino tambin por sus fun
ciones.
Existen dos grandes poblaciones de linfoci
tos: los linfocitos B y los linfocitos T, Los pri
meros son los encargados, casi exclusivamente,
de la sntesis de inmunoglobulinas. Los linfoci
tos T tienen, por el contrario, una serie de fun
ciones, algunas de ellas efectoras y otras de co
laboracin y regulacin, que ejercen sobre los
linfocitos B y sobre otras subpoblaciones de T.
Adems, para que se inicie una respuesta inm u
ne deben colaborar otras clulas'no linfoides.

3
muy especialm ente las de la serie m onocitomacrfago.
As, para que se produzca una respuesta hu
moral, por ejemplo, si bien los linfocitos B pue
den reconocer por s mismos el antgeno para el
cual estn comprometidos, pero para que se es
timulen, se diferencien a plasmocitos y secreten
anticuerpos, deben recibir la colaboracin de
una subpoblacin de linfocitos T, los linfocitos
T colaboradores o helper (Th). Para que los
Th reconozcan al antgeno para el cual estn
' pre-comprometidos, ste debe haber sido proce
sado y presentado, junto con un antgeno de
histocompatibilidad (CMH) propio, por otra c
lula, ya sea un m acrfago u otro linfocito B
(vase cap. 10). A su vez, la respuesta inmune
efectora casi siempre se ejerce con la colabora
cin de clulas o factores inespecficos: por
ejemplo, para que las Igs secretadas tengan un
efecto de proteccin contra el antgeno extrao,
salvo contadas excepciones, como puede ser la
neutralizacin de virus o toxinas, deben interve
nir otras clulas, como fagocitos o clulas ki
ller, o factores, como el complemento.
Por todo esto, se comprende que la respuesta
inmune provocada por un antgeno extrao es
un proceso complicado en el cual intervienen,
en forma de cascada exquisitamente regulada,
una serie de clulas y factores de los que no to
dos pertenecen al sistem a especfico p ro p ia
mente dicho, constituido por los linfocitos.
Las clulas, tanto especficas como inespec
ficas, que intervienen en la respuesta inm une
tienen un origen comn, las clulas troncales
(stem cells) de la mdula sea, pero luego
tienen diferentes vas de diferenciacin, lo que
da por resultado poblaciones celulares con di
ferentes funciones. Esta diferenciacin se inicia

34

Aspectos bsicos de la inmunidad

en los rganos primarios del sistema inmune,

en ausencia de antgenos externos, y luego se
contina en los rganos secundarios, a conse
cuencia de la entrada de esos antgenos.
RGANOS LINFOIDES PRIMARIOS
Y SECUNDARIOS
Concepto
Se entiende por rganos primarios (tambin
llamados centrales) del sistema inmune a aque
llos que proveen un microambiente en el cual
los linfocitos maduran y adquieren inm unocompetencia. Los linfocitos inmaduros provie
nen de clulas troncales (stem cells) de la
m dula sea (vase ontogenia) y, al salir de
ella, ya estn precom prom etidos para la fun
cin T o B, o sea, son linfocitos pro-T y pro-B,
respectivamente. El microambiente de los r
ganos primarios se caracteriza no slo por la
presencia de clulas y factores que estimulan la
maduracin de los linfocitos, sino tambin por
la ausencia de antgenos provenientes del me
dio externo. El rgano primario para la madu
racin de los linfocitos T es el timo en todos
los vertebrados superiores. Para los linfocitos
B, en las aves es la bursa de Fabricius y en los
m am feros, sus equivalentes (vase cap. 2,
fig. 2-1).
A estos rganos llegan lin fo cito s p ro v e
nientes de la mdula que, pese a ser m orfol
gicam ente iguales a los maduros, no son in
munocompetentes, es decir, son incapaces de
reconocer antgenos. Los linfocitos, en gene
ral, no salen de los vasos, pero llevan en su
superficie molculas de adhesin (vase cap.
11) que les perm iten adosarse a las vnulas
p o scap ilares del rgano p ara el cual estn
comprometidos y as penetrar en la intimidad
de su tejido.
Los rganos secundarios o perifricos del
sistema inmune son aquellos que proveen un
microam biente donde los linfocitos maduros,
tanto B como T f provenientes de los rganos
primarios, pueden interactuar tanto con los an
tgenos externos como entre ellos y con otras
clulas accesorias, muy especialmente con las
clulas presentadoras de antgenos de las lnea
monocito-macrfago. Esta interaccin o cola
boracin intercelular es la que permite el com
plicado proceso de la respuesta inmune espec
fica.
Los principales rganos secundarios son los
ganghos linfticos, el bazo y el tejido linftico
asociado a las mucosas: amgdalas, placas de
Peyer, tejido linftico asociado al intestino
grueso y delgado, etc. y clulas linfoides libres
de la submucosa.

TIMO
Origen y desarrollo
El timo es un rgano bilobulado y es el pri
mer rgano linfoide en aparecer durante el de
sarrollo fetal. Deriva del endodermo de la ter
cera y cuarta bolsas branquiales: el endodermo
de dichas bolsas, con parte del ectodermo, pe
netra en el mesodermo que lo rodea para iniciar
la formacin del timo y las glndulas paratiroides; ms tarde, el rudimento tmico se separa y
penetra dentro de la cavidad torcica.
La poblacin celular tmica es variada, pues
est compuesto por clulas provenientes de los
procesos branquiales, sobre todo de origen epi
telial, y clulas que penetran en oleadas sucesi
vas de migraciones a partir de la sangre: son las
de la serie monocito-macrfago y los linfoci
tos, que aqu son llamados timocitos. En la m a
durez de un individuo, el 99% de las clulas t
micas son timocitos.
Luego de migrar al trax, el rudimento tmi
co recibe una primera oleada de hnfocitos, que
es seguida rpidamente de otra oleada de pre
cursores de linfocitos T. A partir de ese m o
mento, en condiciones fisiolgicas, ya no pene
trarn al timo nuevas oleadas de clulas inma
duras provenientes de la mdula sea, pero su
funcin se conserva y podra actuar como re
servorio para una regeneracin masiva del ti
mo, si fuera necesaria en etapas posteriores de
la vida.
Durante el desarrollo fetal y las etapas tem
pranas de la vida extrauterina, el timo aumenta
de tamao absoluto y llega a su mximo en la
pubertad, cundo comienza su involucin hasta
llegar a una marcada atrofia. Pero debe remar
carse que, en la mayora de las especies inclui
da la humana, antes del nacimiento, desde el
segundo tercio del desarrollo fetal, comienzan
a salir del timo hnfocitos T maduros inmunocompetentes, que migrarn hacia los rganos
secundarios y los poblarn. Adems, la vida
media de los linfocitos T es muy larga y sus
clones podran durar incluso ms que la vida
del individuo; de hecho, el establecimiento in
vitro de lneas celulares T es muy fcil y mu
chas han perdurado durante tiempos muy pro
longados. Estos dos hechos hacen que, en el
momento del nacimiento, en la mayora de las
especies (salvo en la especie experimental por
antonom asia de la inm unologa - e l ra t n - y
otras pocas excepciones), la funcin del timo
ya est cumplida y pueda ser extirpado sin in
convenientes. De hecho, en los albores de la ci
ruga cardaca correctora de m alform aciones
fetales, cuando an el timo era un rgano en
docrino de funcin desconocida, los cirujanos
extirpaban el timo de los recin nacidos some

Bases celulares de la respuesta Inmune

tidos a operaciones cardacas, pues les impeda
un acceso fcil al trax; esos nios no padecie
ron despus deficiencias notables de su sistema
inmune.
Organizacin
El timo presenta una corteza perifrica, una
corteza profunda y una regin medular. Es de
hacer notar que en la corteza, tanto profunda
como superficial, existe ima barrera hemato-tmica que impide, o por lo menos disminuye en
gran medida, el paso de protenas sanguneas
hacia la intim idad del tejido; esta barrera no
existe en la mdula (vase cap. 2, fig. 2-3),
En la corteza superficial, el endotelio de las
vnulas poscapilares presenta una zona ms
densa con estructura particular. Los linfocitos
pro-T reconocen estas estructuras por sus m o
lculas superficiales, se adosan a ellas y de esa
forma llegan a la corteza, donde forman una
delgada capa de pocas clulas de espesor. All
se dividen activamente y dan origen a todos los
otros timocitos. En esta regin, los timocitos
son grandes, de aspecto inmaduro y presentan
un alto ndice de mitosis. En condiciones nor
males, esta capa representa menos del 5% del
total de timocitos.
Los timocitos de la corteza superficial migran hacia la corteza profunda, que contiene un
85% de los timocitos. Esta regin se caracteri
za por la presencia de clulas de tipo dendrtico, de origen epitelial y de aspecto estrellado,
que contactan con otras clulas similares por
medio de pequeos desmosomas. Hay adems
clulas originadas en precursores hematolinfoides, de la serie monocito-macrfago, como c
lulas dendrticas y macrfagos, stos ms abun
dantes en la mdula tmica. En esta regin, los
timocitos tienen menor tamao y estn en nti
mo contacto entre s y, especialmente, con las
clulas de tipo dendrtico, que han sido deno
minadas clulas nodrizas, en cuyos repliegues
se alojan en forma tal cjue hasta parecen pene
trar en ellas. En esta regin los linfocitos inm a
duros sufren una nueva etapa de maduracin y
de .seleccin, para pasar luego a la mdula.
En la regin m edular, los tim ocitos estn
raenos compactados que en la cortical; algunos
son ya linfocitos T maduros, listos para pasar a
la sangre. Aqu tambin se encuentran clulas
epiteliales, organizadas a veces en corpsculos
de Hassall, y un nmero importante de macr
fagos. Los vasos de esta zona son altam ente
permeables a las protenas plasmticas; los lin
focitos en su ltima etapa de maduracin en
tran en ntimo contacto con las protenas pro
pias y sufren aqu el ltimo proceso de selec
cin, que hace a la poblacin migrante alta
mente tolerante hacia las protenas propias.

35

Los tim ocitos inm aduros de la co rteza no

sintetizan la enzima 20-hidroxil-esteroide dehi
drogenasa y son muy sensibles a las hormonas
esteroides. Durante la pubertad, a consecuencia
de la secrecin aumentada de estas hormonas,
disminuyen en forma notable, lo cual origina la
involucin tmica tpica de esa edad. En la m
dula, los timocitos ms maduros ya expresan
esa hormona y son corticoide resistentes.
Como veremos ms adelante, en el tim o no
slo se producen y maduran los linfocitos T, si
no que tambin sufren una rigurosa seleccin,
por la cual los linfocitos no aptos son elim ina
dos. Esta seleccin hace que menos del 1% del
total de los linfocitos producidos emigren del
tim o: el 99% restan te m uere por ap o p to sis
(m uerte programada) en el mismo timo. Este
gasto aparentemente enorme tiene una im por
tancia biolgica tambin enorme: por una par
te, slo emigran los linfocitos capaces de reco
nocer los antgenos de histocompatibilidad pro
pios (seleccin positiva) y los que no reaccio
nan ni contra stos ni contra los otros antgenos
propios (seleccin negativa), lo que hace que la
produccin del timo no slo sea funcionalmen
te apta, pues reconoce los antgenos de histo
com patibilidad propios (base de la respuesta
inmune T, vase cap 10), sino tambin autotolerante, pues no agrede a los tejidos propios.
ORGANOS PRIMARIOS
DEL SISTEMA B
Como se dijo antes, existe en la aves un r
gano primario de maduracin de los linfocitos
B, que es la bursa de Fabricius: si se extirpa
qumica o quirrgicamente la bursa durante el
desarrollo fetal, su sistema B no se desaiTolla.
Sin embargo, la ablacin quirrgica de este r
gano en un animal adulto no impide la produc
cin constante de linfocitos B maduros, lo que
indica cjue esta funcin cambia de sitio en eta
pas posteriores al nacimiento.
En los m am feros, el rgano prim ario del
sistema B puede variar segn la especie. E n los
ovinos, la maduracin de los linfocitos B suce
de en el tejido linfoide asociado al intestino
delgado; en el ratn y en el hombre no se ha
encontrado un rgano similar, y se admite que
la produccin y maduracin de los linfocitos B
se realiza ntegramente en la mdula sea. Las
placas de Peyer han sido propuestas com o r
ganos primarios B en otras especies y, en algu
nos casos, la m aduracin de los linfocitos B
podra lograrse en rganos, como el bazo, en
los que los linfocitos pro-B estn en contacto
estrecho entre s. Sea cual fuere el rgano de
m aduracin de los linfocitos B, stos tienen
una vida media corta y, a diferencia de lo que

36

Aspectos bsicos de la inmunidad

sucede con los linfocitos T, su produccin y

maduracin contina durante toda la vida del
individuo.
RGANOS SECUNDARIOS
Organizacin de los ganglios linfticos
Los ganglios linfticos son pequeos rga
nos redondeados u ovoides, que se encuentran
generalmente en grupos, en el tejido adiposo
que rodea a los grandes vasos sanguneos del
abdomen y el trax, el de la nuca, el cuello, las
axilas, las ingles y el hueco poplteo. Dentro de
una cpsula que rodea al rgano y se prolonga
en trabculas en un estrom a reticular, se en
cuentra un gran nmero de linfocitos y clulas
de las serie monocito-macrfago, no slo m a
crfagos sino tambin clulas propias de los
ganglios, las clulas dendrticas.
La circulacin de los ganglios linfticos pro
viene tanto de la sangre como de los vasos lin
fticos y tiene una gran importancia en la mi
gracin de los linfocitos y en la provisin de un
microambiente adecuado para la interaccin de
los antgenos con las distintas clulas inmunocompetentes y con los anticuerpos (vase fig.
3-1), importante no slo en la induccin de res
puestas inmunes sino tambin en su regulacin.
La sangre penetra por el hilio por una arteria
cuyas ramas llegan hasta la corteza superficial.
En esa zona se incurvan y se forman las vnulas
que luego se juntan para formar una vena que
sale por el hilio. En la zona de la curvatura, su
endotelio presenta un aspecto ensanchado parti
cular y es la regin que permite el paso de los
linfocitos de la sangre al interior del gangho.
Los vasos linfticos tienen su origen en los
diferentes tejidos del organismo y forman una
red de canales, paralelos a la circulacin san

gunea, que recogen el fluido extravasado de

los capilares que, en los vasos linfticos, recibe
el nombre de linfa. La linfa contiene tambin
clulas provenientes de la sangre o los tejidos,
muy especialmente linfocitos y clulas veladas.
Estas ltimas se originan de las clulas de Lan
gerhans de la piel y son las encargadas, junto
con los macrfagos, de llevar los antgenos a
los ganglios locales: en stos se convertiran en
clulas dendrticas residentes, capaces de cap
tar antgenos y de mantenerlos in situ por tiem
pos prolongados.
La linfa llega al ganglio local por los vasos
aferentes que desembocan en un seno que ro
dea a la corteza, en la periferia del ganglio. De
all filtra por el interior del ganglio, en un ca
mino paralelo al de la sangre, y luego sale por
el hilio, por un linftico eferente. Los linfticos
eferentes de varios ganglios se juntan entre
ellos y, eventualmente, desembocan en la san
gre, a travs del conducto torcico u otros co
lectores linfticos. De esta forma se establece
una recirculacin constante entre la sangre y la
hnfa, que permite el pasaje no slo de los flui
dos sino tambin de las clulas, a travs de los
ganglios linfticos. Esta recirculacin permite
la migracin permanente de los linfocitos entre
la sangre y los rganos linfoides secundarios y,
eventualmente, los tejidos.
Los ganglios linfticos estn divididos en
tres reas principales; la corteza superficial, la
corteza profunda y la regin medular (fig. 3-1).
En las dos primeras predominan los linfocitos,
y entre ellos corre esa red de canales linfticos
que van de la corteza a la mdula.
En la corteza superficial, los linfocitos estn
en ntimo contacto, muchos de ellos organiza
dos en ndulos o folculos, compuestos en gran
proporcin por linfocitos B; entre los folculos
hay linfocitos repartidos sin organizacin parti
cular; la mayora de ellos son T. Si, a partir de
Vnulas

F ig . 3 -1 . E s q u e m a de
un ganglio linftico. N
te n se las d ife re n te s r e
giones tim odependientes
y tim o in d e p e n d ie n t e s
(vase el texto) y la cir
c u la c i n d e lin fa y d e
lin fo c ito s p ro v e n ie n te s
de la sangre.

Bases celulares de la respuesta inmune

la zona que drena ese ganglio penetra un ant
geno y se estimula la respuesta, los folculos se
agrandan y dan lugar a los llamados folculos
secundarios; en ellos aparece un rea central
con clulas grandes y en mitosis: son los llama
dos centros germinativos.
Los linfocitos T predominan entre los folcu
los y en la zona medular: es la llamada zona ti
mo-dependiente pues no se desarrolla en ani
males timoprivos o en pacientes con deficien
cias tmicas, en los que slo se aprecian los fo
lculos primarios bien desarrollados.
En la zona que rodea a los folculos, adems
de los linfocitos T y entre las clulas del estro
ma, se encuentran numerosas clulas dendrti
cas, cuya importante funcin es retener y pre
sentar los antgenos a los linfocitos: se han en
contrado determinantes antignieos sobre clu
las dendrticas mucho tiempo despus que el
antgeno fuera inyectado.
Es interesante tener en cuenta que, pese a
que en el caso de una estimulacin antignica
se producen mitosis en los ganglios regionales,
la gran mayora de los linfocitos que estn en
un momento dado en los ganglios no son de
produccin local, sino que provienen de la
sangre. Los vasos sanguneos son normalmen
te impermeables a los linfocitos, pero en la re
gin subcapsular de los ganglios, las vnulas
poscapilares ya m encionadas expresan m ol
culas de adhesin que son reconocidas por glu
coprotenas superficiales de los linfocitos, tan
to los T como los B de memoria. stos se ado
san a la pared del vaso, lo atraviesan y pene
tran en el tejido linftico, pero slo permane
cen unos pocos das en el ganglio, pues van
migrando hacia la mdula, para salir luego por
la linfa y comenzar un nuevo ciclo de recircu
lacin.
Es de hacer notar que existe una importante
selectividad en la recirculacin de los linfoci
tos: si se marcan e inyectan linfocitos prove
nientes del conducto torcico o de ganglios su
perficiales, la gran mayora se encontrar luego
en los ganglios superficiales mientras que, si se
inyectan linfocitos de bazo, se hallarn en el
bazo en grandes proporciones. Los hnfocitos
de los rganos linfoides asociados a las m uco
sas tienen tambin sus rutas propias de recircu
lacin (vase cap. 17). Todas estas rutas estn
dirigidas por una serie de molculas superficia
les, muchas de ellas ya conocidas (vase cap.
11), que permiten el pasaje de los linfocitos de
la sangre al tejido.
Organizacin del bazo
El bazo es un rgano abdominal cuya fun
cin inmune en el adulto es filtrar partculas de
la sangre y concentrar antgenos circulantes; en

37

efecto, la respuesta inmune frente a antgenos

circulantes se hace principalmente en el bazo.
Tiene adems funcin de reservorio sanguneo,
poco importante en el hombre pero muy im por
tante en algunas especies, es el encargado de la
hemocatresis (destruccin de eritrocitos enve
jecidos) y en ciertas patologas puede retom ar
funciones de hemopoyesis propias del feto. Es
tas ltimas funciones se cumplen en la pulpa
roja, rica en capilares sinusoides y con alto
contenido en eritrocitos, que forma la m ayor
parte del bazo.
La pulpa blanca, donde se cumplen las fun
ciones inmunes del bazo, forma pequeos hu
sos alrededor de las pequeas arterias y las ar
teriolas. Cada huso rodea a una arteriola, que
termina en una vnula, que nace al final de la
arteriola y se vuelve hacia atrs, formando el
seno marginal, que separa la pulpa blanca de la
roja. Por este seno los linfocitos penetran direc
tamente de la sangre al tejido linfoide y luego,
a semejanza de lo que sucede en los ganglios,
migran lentamente a travs del tejido del m an
guito. Pasan despus a la pulpa roja y abando
nan el bazo por su vena y por sus vasos linfti
cos. En los husos, al igual que los ganglios, hay
regiones timodependientes y timo independien
tes: la primera, rica en linfocitos T y en clulas
dendrticas y macrofgicas, es un manguito arteriolar de tejido linfoide difuso que rodea in
mediatam ente a la arteriola; la segunda com
prende folculos y ndulos que rodean a ese
manguito.
Tejido linfoide asociado a las mucosas
Todas las mucosas presentan acmulos subepiteliales de tejido hnfoide, que en estas regio
nes tiene la particularidad de no estar rodeado
por una cpsula de tejido conectivo. Este tejido
linfoide puede presentarse como colecciones
difusas de linfocitos, plasmocitos y macrfagos
dispersos en la lmina propia de los rganos, o
bien como acmulos ms organizados con fol
culos semejantes a los de otros rganos secun
darios: en el hombre stos incluyen las am gda
las, las placas de Peyer y el apndice cecal. En
su superficie mucosa, estos acmulos presentan
clulas epiteliales especializadas capaces de
captar antgenos. Los hnfocitos que fueron esti
mulados en los acmulos pasan a la linfa y de
all a los ganghos mesentricos y a la sangre.
Del torrente sanguneo migran a la lmina p ro
pia de las mucosas, donde aparecen dispersos y
se transforman en clulas productoras de IgA o
IgE.
La importancia de este sistema, la migracin
especializada de los linfocitos que lo com po
nen y su papel en la proteccin del individuo se
vern con ms detalle en el captulo 17.

38

Aspectos bsicos de la Inmunidad

La mdula sea como rgano secundario

Si bien en el ratn y en el hombre la mdula
sea acta como rgano primario del sistema
inmune, tambin tiene funcin de rgano se
cundario; los linfocitos B estim ulados en los
ganglios perifricos migran a la mdula donde
se diferencian a plasm ocitos. La m dula se
convierte as en un importante sitio de sntesis
de Igs, sobre todo en los perodos tardos de la
respuesta inmune primaria y en las respuestas
secundarias.
Captacin de los antgenos
en los rganos secundarios
Los antgenos que penetran del exterior se
rn tomados por los distintos rganos secunda
rios segn sea su va de entrada y su estructura
fsico-qumica. En general, los antgenos solu
bles, salvo que sean captados por alguna clu
la, no van a quedarse en un rgano secundario:
por esta razn, es raro que induzcan respuestas
inmunes positivas y tendrn tendencia a indu
cir tolerancia (vase cap. 18). Generalmente,
las sustancias extraas, muy especialmente si
son particuladas, y ms an si estn opsonizadas, son captadas por las clulas fagocticas.
Estas los van a digerir y procesar, para luego
presentar sus determinantes antignicos en la
superficie unidos a los antgenos de histocom
patibilidad de clase II. Si penetran a los espa
cios intercelulares de cualquier tejido y son
captados por macrfagos, stos migran a los
ganglios drenantes. En la piel, pueden ser to
mados por clulas de Langerhans, que luego
migran hacia el ganglio en form a de clulas
veladas. En el caso de antgenos que no hayan
sido englobados por un fagocito, pueden toda
va ser captados en los rganos secundarios,
siempre que exista por lo menos una pequea
cantidad de anticuerpos contra ese antgeno y
se formen complejos; en este caso, las clulas
dendrticas, que tienen receptores para el Ec de
las inmunoglobulinas, pueden fijar el complejo
sobre su superficie. En algunos tejidos existen
macrfagos fijos (clulas de Kupffer del hga
do, macrfagos alveolares). A qu el antgeno
queda en el lugar y no interviene en la estim u
lacin del sistema inmune, pero podra actuar
como reservorio y estimularlo ms tarde, pues
to que se ha comprobado que el antgeno del
interior de estas clulas est en equilibrio con
el antgeno circulante.
Los antgenos que penetran en los ganglios
junto con un macrfago, por la particular circu
lacin en los ganghos pueden llegar hasta las
zonas tim odependiente y tim oindependiente.
Dado que los linfocitos estn migrando perma
nentemente por estas zonas, la posibilidad de

que cada determinante se encuentre con un lin

focito que lo reconozca aumenta notablemente.
En el caso de que penetre un antgeno libre
por la zona cortical, puede interactuar con clu
las dendrticas, siempre que exista suficiente
proporcin de anticuerpos. La concentracin
del antgeno va disminuyendo de la corteza a la
mdula y la de los anticuerpos va aumentando
paralelamente, en razn de la particular circula
cin del ganglio; en esta forma aumentar las
posibilidades de que sea fijado por clulas den
drticas. Estas diferencias en las concentracio
nes de los antgenos y los anticuerpos en la di
ferentes zonas de los ganglios tiene tambin
importancia en la regulacin de la respuesta in
mune.
En el bazo sucede un fenmeno parecido a
partir de la sangre, pues all tambin los antge
nos penetran a contracorriente de la migracin
de los linfocitos, lo que favorece la interaccin
entre ambos.
M ADURACIN DEL SISTEMA INMUNE
Las clulas que intervienen en las respuestas
inmunes provienen de los rganos hematopo
yticos, donde clulas troncales darn origen a
los distintos elem entos formes de la sangre.
Provengan de una misma clula troncal o de
clulas diferenciadas para precursores de linfo
citos T o B, los linfocitos que migran de la m
dula sea ya son pro-B o pro-T pero, para con
vertirse en clulas inmuno-competentes, nece
sitan (sobre todo los T) del microambiente pro
picio que les ofrece el rgano primario. Como
ya se mencion, ste es elegido por el linfocito
inmaduro circulante mediante sus molculas de
adhesin superficiales. En estos rganos, los
linfocitos inmaduros comenzarn a sintetizar y
expresar en su superficie una serie de molcu
las que les permitirn, por una parte, reconocer
a un determinante antignico particular y, por
la otra, interactuar con las otras clulas involu
cradas en la respuesta inmune (vase cap. 2,
figs. 2-2 y 2-3).
De todas las molculas superficiales, la ms
indispensable es el receptor para el antgeno.
Este se adquiere durante la maduracin, m e
diante un reacomodamiento del material gen
tico en clulas somticas, que implica prdida
de su ADN. Este proceso, que se describe en
detalle en los captulos 6 y 7, se realiza en au
sencia de antgenos extraos e implica que ca
da linfocito que madur y sus descendientes
tengan una secuencia particular y nica en la
zona que codifica para su receptor antignico,
que le da una especificidad fija. En los linfoci
tos T, esta secuencia no vara para nada durante
toda la vida de la clula, que es larga, ni vara

Bases celulares de la respuesta inmune

tampoco durante sus mitosis, de modo que ca
da linfocito maduro formar un clon, capaz de
reconocer un nico determ inante antignico.
Debe tenerse muy en cuenta que estos clones
existen independientem ente de la entrada del
antgeno que sern capaces de reconocer. Si
uno o ms de los linfocitos de ese clon interac
ciona con el antgeno para el cual estn com
prometidos, sucedern nuevas mitosis, sin cam
bios nuevos para los linfocitos T pero con la
posibilidad de mutaciones puntuales para los
linfocitos B (vanse caps. 6 y 7).
Es de hacer notar que, en la mayora de las
especies, en el momento del nacimiento el pro
ceso de maduracin de los linfocitos y su m i
gracin a los rganos secundarios ya se ha rea
lizado, es decir, que el individuo es inmunolgicamente maduro.
Maduracin de los linfocitos B
La maduracin y activacin de los linfocitos
B se cumple en una serie de etapas; comienza
durante la vida fetal y se contina durante toda
la existencia del individuo, pues los linfocitos
B tienen vida corta y son renovados constante
mente. En el rgano primario, los linfocitos B
adquieren esa molcula importantsima que, no
slo los distingue de otros linfocitos no B, sino
que es fundamental para su funcionalidad, que
es la inmunoglobulina (Ig) de superficie y que
acta como receptor para el antgeno (vase
cap. 2, fig. 2-2).
La existencia de Ig sobre la superficie de los
linfocitos B y slo de los B, se conoce desde
hace tiempo, y se la considera, como el princi
pal marcador de la serie B, Luego se demostr
que esta Ig es sintetizada por el propio linfocito
y que, si bien puede cambiar en la regin cons
tante, es prcticam ente idntica en su regin
variable a la Ig que secretar ese linfocito y sus
descendientes luego de su estimulacin por el
antgeno. A este respecto, cabe remarcar que la
Ig de superficie es algo ms larga que la circu
lante, puesto que en el extremo C terminal tie
ne dos dominios ms, uno hidrofbico, que es
el que atraviesa la membrana y un ltimo h i
droflico, que permanece en el citoplasma. La
capacidad del sistem a inm une para producir
tantos clones con tantas especificidades distin
tas se debe al reacomodamiento del ADN que
codifica para la regin variable de esta Ig.
Dado que la membrana celular es fluida, las
molculas superficiales pueden moverse. La in
teraccin de las Igs superficiales con ligandos
polivalentes, ya sean antgenos o anticuerpos
,dirigidos contra ellas, que puedan form ar un
enrejado sobre su superficie, lleva a la form a
cin de casquetes (capping) o sea, a la acu
mulacin de todas las molculas sobre un polo

39

de la clula. Estas m olculas y sus ligandos

pueden ser luego interiorizados por pinocitosis,
lo cual tiene gran importancia en la capacidad
del linfocito B de presentar antgenos a los lin
focitos T, o para eliminarlos.
N um erosos experim entos han dem ostrado
que la Ig superficial es la que acta com o re
ceptor antignico del linfocito B y que la unin
de una ligando a esta Ig inicia una serie de
eventos que culmina con el envo de una seal
activadora del linfocito. Si bien la Ig es la en
cargada de reconocer especficamente al ant
geno, para su funcin receptora no est sola si
no t]ue forma un complejo multimolecular su
perficial, pues est acompaada por otras mollulas que no slo la fijan sobre la membrana si
no que contribuyen al envo de la seal al inte
rior de la clula.
En una primera etapa, el linfocito en m adu
racin reacomoda el ADN que codifica para la
cadena pesada y comienza a sintetizar cadenas
de clase p,. Estas no se expresan en la m em bra
na, pero pueden ser detectadas en el citoplas
ma; es la etapa de linfocito pre-B. Luego reaco
moda la cadena liviana y, ahora s, esta m ol
cula puede expresarse en la membrana.
A partir de este momento, el linfocito B pue
de reconocer al antgeno, pero es un linfocito B
inmaduro, que tiene la particularidad de que el
encuentro con el antgeno especfico lo lleva a
la tolerancia. Si bien se discute an cules son
los m ecanism os que llevan a la tolerizacin
de los linfocitos B inmaduros, su efecto fisiol
gico es la eliminacin funcional de los linfoci
tos autorreactivos, pues los Ags propios entran
en contacto con ellos durante esta etapa.
En un paso siguiente, por empalmado (sphcing) alternativo del ARN de la cadena pesa
da, el linfocito com ienza a sintetizar Ig D e
IgM. Se trata ahora de un linfocito maduro, al
cual el encuentro con su Ag especfico llevar
a la activacin. Estos linfocitos maduros, que
sintetizan simultneamente IgM e IgD y expre
san ambas en la membrana, salen de los rga
nos primarios y migran a los rganos secunda
rios donde formarn los folculos prim arios.
Algunos linfocitos expresan tambin IgA en la
superficie desde esta etapa y se encuentran en
el tejido linfoide asociado a las mucosas (vase
cap. 17). De no mediar un estmulo antignico,
este linfocito maduro virgen tiene vida corta,
no recircula y muere en menos de 30 das en la
m ayora de las especies. Si hay un contacto con
el Ag y con factores de los linfocitos T (vanse
caps. 2 y 13), suceden una serie de nuevas eta
pas de mitosis y diferenciacin, que converti
rn al linfocito B maduro en plasmocitos, p ro
ductores de Igs, tambin de vida corta, o bien
en linfocitos B de memoria, de vida ms larga
y recirculantes. Esta diferenciacin est gene-

40

Aspectos bsicos de la inmunidad

ramente acompaada de otros dos fenmenos:

por una parte, puede haber una nueva prdida
de ADN, y el linfocito ya no podr sintetizar
IgM e IgD y slo sintetizar otras clases de Igs:
es el llamado sw itch o cambio de Igs; por
otra parte, por empalme o splicing alternati
vo del ARN, se pueden perder los dominios intramembrana e intracitoplasmtico de la Ig, de
modo que sta no queda fijada a la membrana
sino que se secreta; las clulas que sufren este
proceso son las que se diferencian a plasmoci
tos (vase cap. 2, fig. 2-2).
Plasmocitos
En el caso de diferenciacin a plasmocito, la
clula sufre varios procesos, entre los que se
incluye una diferenciacin morfolgica, pues
adopta el tpico aspecto de clula ovoide, de
abundante citoplasma y ncleo excntrico y en
rueda de carro. La iniciacin de la diferencia
cin a plasmocito se hace en las regiones timoindependientes de los rganos secundarios,
y muchos de los plasmocitos se encuentran en
folculos de bazo, ganglios o tejido linfoide
asociado a las mucosas. Una proporcin impor
tante de ellos migra y puede establecerse en
otras regiones del ganglio o bazo, en la mdula
sea o como clulas linfoides no organizadas
en las submucosas.
El plasmocito es una clula terminal, que vi
ve pocos das y cuya nica funcin es la secre
cin de Igs. Toda la Ig que produce es de tipo
circulante, sin regin intram em brana ni cito
plasmtica. Esta clula ha perdido la Ig de su
perficie, as como otros receptores funcionales
de linfocitos B. Por lo tanto, ya no podr ser
activada ni ser pasible de regulacin negativa.
Maduracin de los linfocitos T
Las primeras observaciones que permitieron
comprobar que el sistem a inm une posee dos
grandes tipos de respuestas, humoral y celular,
adjudicaron slo la funcin de inmunidad m e
diada por clulas al sistema T y a sta, casi ex
clusivamente la de vigilancia inmunolgica antitumoral. Poco despus, se comprob que la
funcin de las clulas derivadas del timo era
muchsimo mayor, pues se vio que su colabora
cin es indispensable para prcticamente todas
las respuestas humorales. Al adjudicrsele tam
bin una importante funcin de regulacin, por
medio de los linfocitos T supresores, el timo
pas a ser considerado como el director de la
orquesta inmunolgica. Ninguno de estos con
ceptos ha perdido vigencia hoy, pero debe te
nerse en cuenta que no es el timo, p er se, el que
dirige la orquesta, sino las clulas que en l
maduraron, que poblaron los rganos secunda

rios y que permanecern recirculando durante

la vida del individuo. A este respecto, en vista
de la dispensabihdad del timo desde el naci
miento en la mayora de las especies incluida
la humana, muchos autores han postulado que
existiran rganos extra-tm icos que cum pli
ran la funcin de maduracin de los linfocitos
T durante la vida extrauterina. Sin embargo, en
vista de la larga vida de los linfocitos, cuyos
clones pueden perdurar in vitro indefinidamen
te, muchos autores aceptan hoy que tales rga
nos no son necesarios y que los clones m adu
rados en el timo durante la poca fetal pueden
acompaar al individuo durante toda su vida.
Otra consideracin que conviene hacer al res
pecto, es que existen mecanismos, an no co
nocidos, que mantienen ms o menos estable
la poblacin total de hnfocitos T de un indivi
duo. Despus de cada estimulacin antignica
se produce una im portante expansin de los
clones que reconocen al inmungeno y, a dife
rencia de lo que pasa con los plasmocitos, un
gran nmero de los hnfocitos T no mueren lue
go de cumplir su funcin, sino que se diferen
cian a clulas T de memoria. Ello no significa
que la poblacin total de linfocitos T aumente
indefinidamente durante toda la vida a conse
cuencia de los estmulos antignieos repetidos
que recibe cualquier individuo normal. Si bien
existen mecanismos homeostticos que inter
vienen para mantener constante la poblacin T
total, muchos de esos mecanismos no son co
nocidos an.
As como el conocimiento sobre la im por
tancia del timo se logr mediante estudios en
el ratn, una de las pocas especies en que la ti
mectoma neonatal lleva a la desaparicin de la
funcin T, la maduracin de los linfocitos T se
estudi tambin en el ratn y luego en el hom
bre. Si bien no se ha estudiado en todas las es
pecies, los datos obtenidos hasta ahora en es
pecies dom sticas de vertebrados superiores
sugieren que seguiran pasos similares en to
dos stos.
Durante su maduracin, los hnfocitos T ad
quieren la molcula principal para su funcin,
el receptor antignico o TCR, en una forma si
milar a la adquisicin de la Igs por parte de los
linfocitos B, es decir, por reacomodacin con
prdida del ADN que codifica para el receptor.
Pero tambin adquieren y pierden otra serie de
molculas, con importantes funciones, cuya lis
ta y modo de deteccin se detallan en el captu
lo 2 (fig. 2-3).
Como ya se mencion, los linfocitos pro-T
provenientes de la mdula, se alojan en la cor
teza superficial del timo y comienzan a sufrir
varios ciclos de mitosis. Durante estos ciclos,
se hace el reacomodamiento del ADN que co
difica para las diferentes cadenas del TCR.

Bases celulares de la respuesta nmune

En los primeros estadios de maduracin, las ca
denas que se reacomodan son las j y 5, que dan
origen a linfocitos j/5 positivos. Estos, por lo
menos en el hombre, tienden a disminuir en pe
rodos posteriores de la vida, y se los encuentra
especialmente en los tejidos linfticos asocia
dos a las mucosas. Luego comienza la reaco
modacin del ADN de las cadenas (3 y a , segn
se datalla en el captulo 7. El TCR se expresa
en la membrana en un complejo polimolecular,
unido al CD3, cuya funcin ser, no slo la de
anclar el TCR a la membrana, sino tambin la
de contribuir para el envo de la seal de acti
vacin del linfocito T. Tambin comienzan a
sintetizarse y expresarse otras dos molculas
importantes en la activacin del linfocito T: el
CD4 y el CD8.
Estos linfocitos CD4+-CD8^ positivos se en
cuentran en gran cantidad en la corteza profun
da del timo. En estos momentos el linfocito en
maduracin es capaz de reconocer antgenos,
pero conviene tener en cuenta desde ya que lo
nico que puede reconocer un linfocito T ma
duro son los antgenos de histocompatibilidad
propios, de clase I o IL unidos a un pptido
propio o extrao. Comienza ahora el proceso
que en una poca se llam aprendizaje tmico,
pero se trata ms bien de una seleccin tmica,
pues los linfocitos no seleccionados mueren.
Esta seleccin tiene dos etapas: una selec
cin positiva y una negativa. La primera, es la
que permite vivir a aquellos linfocitos inmadu
ros que s reconocen antgenos propios de Cla
se I o II. En efecto, el reordenamiento de las
cadenas a y P del TCR se hace al azar, por lo
que slo una proporcin relativamente pequea
de los linfocitos que reacomodaron su TCR re
conocer los alelos propios, ya sean de Clase I
o II. Las clulas de origen epitelial del timo ex
presan ambas clases de antgenos de histocom
patibilidad. En esta etapa, el timocito en madu
racin ha activado su sistema de muerte pro
gramada o apoptosis: si en este momento no es
capaz de reconocer algunas de las protenas de
clase I o II que las clulas le muestran, muere
por apoptosis. Si en cambio reconoce alguna de
esas molculas de histocompatibilidad, recibe
una seal que anula la muerte program ada y
contina su ciclo.
Este linfocito as rescatado pasa entonces a
alojarse entre los repliegues de la membrana de
las clulas nodrizas, dnde puede continuar su
maduracin. La clase del antgeno que ha reco
nocido tambin es importante; si reconoci una
molcula de Clase I, se reprime el gen que co
difica para CD4 y el linfocito contina sinteti
zando slo CD8, Por el contrario, si reconoci
Clase II, se reprime el gen para el CD8 y el lin
focito slo sintetizar CD4, La consecuencia fi
siolgica de esta seleccin positiva es que slo

41

saldrn del timo linfocitos funcionales, es de

cir, linfocitos capaces de reconocer los antge
nos de histocompatibilidad propios (vase cap.
2, fig. 2-3).
D ado que el reacom odam iento se hace al
azar, pueden surgir linfocitos capaces no slo
de reconocer sino tambin de reaccionar contra
antgenos de histocompatibilidad propios uni
dos a pptidos propios, es decir, capaces de ini
ciar reacciones autoagresivas. Este hecho ha
llevado a que evolucione una segunda form a de
seleccin, una seleccin negativa, que se lleva
a cabo mayoritariamente en la mdula del timo.
No est demostrada cul es la diferencia entre
reconocim iento simple y reconocim iento con
reaccin, pero muchos autores la atribuyen a
una diferencia en la afinidad de unin del TCR
con su antgeno especfico. Sea por interaccin
de alta afinidad o por otra causa, un reconoci
miento de antgenos propios seguido de reac
ci n , lleva al lin fo c ito en m ad u raci n a la
muerte, en este caso a cargo de los macrfagos
medulares.
Debe tenerse en cuenta que, en la mdula, la
barrera hematotmica ya no existe, y las prote
nas plasmticas pueden penetrar all. P o r otra
parte, las clulas propias del timo sintetizan un
gran nmero de molculas tpicas de otros r
ganos. Esto perm ite que, para casi to d o s las
protenas propias del organismo, cuyos ppti
dos sean presentados junto con antgenos tanto
de clase I como II, exista tolerancia, pues los
clones capaces de reaccionar contra ellos han
sido eliminados por esta seleccin negativa.
Los linfocitos que han terminado su madura
cin y han sido as seleccionados estn en con
diciones de abandonar el timo y dirigirse a los
rganos secundarios, a travs de los cuales, co
mo ya se explic, recirculan en forma de linfo
citos maduros vrgenes, hasta tanto encuentren
al antgeno para el cual estn precomprometi
dos para reconocer y reaccionar.
Subpoblaciones funcionales
de los linfocitos T
De lo expresado antes, se d esp ren d e que
ex isten dos grandes clases de lin fo cito s T:
aquellos que reconocen antgenos de C lase I y
expresan CD8 y los que reconocen los de Cla
se II y expresan CD4, La distribucin y fun
ciones de estas dos molculas se detallan en el
captulo 10, pero conviene tener desde ya en
cuenta que los de Clase I se expresan en casi
todas las clulas del organismo y salen a la su
perficie unidos a pptidos de protenas sinteti
zadas en la mism a clula; en cambio, los de
Clase II, se expresan casi exclusivam ente en
los linfocitos B y las clulas de la lnea mono
cito-macrfago, que son clulas especializadas

42

Aspectos bsicos de la Inmunidad

para la presentacin de antgenos a los linfoci

tos T, y salen a la superficie unidos a ppfidos
de protenas que han sido fagocitadas o pinocitadas por la clula.
Es de comprender entonces que los linfoci
tos T CDS positivos pueden interactuar con ca
si cualquier clula del organismo y pueden re
conocer y reaccionar con cualquiera de ellas
que est sintetizando protenas no propias, co
mo pueden ser las protenas de un virus. La
funcin de estos linfocitos es principalm ente
citotxica, pero tambin producen factores de
colaboracin y regulacin. T am bin en esta
subpoblacin se ha determinado la presencia de
funcin supresora, muy discutida en este mo
mento.
Por el contrario, los linfocitos CD4-I- slo
pueden interactuar con clulas presentadoras de
antgeno y reconocen y reaccionan contra ant
genos que hayan sido internalizados y procesa
dos previamente por una de ellas. Esta pobla
cin CD4-H no tiene en general funcin efectora
directa sino que produce factores solubles de
colaboracin y constituyen la poblacin de Th.
No se han encontrado diferencias entre los
linfocitos CD4+ vrgenes, es decir entre los que
atin no han encontrado a su antgeno. Pero en
tre los Th previamente sensibilizados o de me
moria, pueden reconocerse dos subpoblaciones:
los Thl y los Th2, que se diferencian por la
concentracin en que expresan un biotipo de la
molcula CD45. No hay acuerdo en si los lin
focitos Th estn precomprometidos para dife
renciarse a una de estas dos subpoblaciones an
tes de la estimulacin por el antgeno, pero evi
dencias recientes apuntan a que el m icroam
biente y las seales que reciben al ser estimula
dos por el antgeno son esenciales para que se
conviertan en una u otra subpoblacin luego de
su primer contacto con el mismo (vase cap.
18). Sea cual fuere el origen de estas dos sub
poblaciones, sus funciones son diferentes.
Los Thl son efectores y capaces de llevar a
la agresin: al ser estimulados por el antgeno
producen y secretan al medio una serie de lin
foquinas, cuyo efecto es activar a los macrfa
gos y aumentar su capacidad citoltica, lo que
da por resultado una reaccin inflamatoria cr
nica, cuyo exponente ms tpico es la hipersensiblidad tarda. Por el contrario, los Th2, al ser
estimulados, producen y secretan al medio una
serie de interleuquinas, cuya funcin es colabo
rar con los linfocitos B, lo que da por resultado
una respuesta humoral. Adems, ambas supoblaciones pueden ser tambin regulatorias e in
cluso citotxicas.
Como se ver en detalle en otros captulos,
los linfocitos T ejercen realmente un nmero
grande de funciones muy diferentes y son, ver
daderamente, directores de la orquesta inmuno-

lgica. Lo que no es real es dividirlos, como se

hace muy a menudo, en subpoblaciones funcio
nalmente rgidas, y atribuir a los CD8-H las fun
ciones citotxicas y supresoras y a los CD4, las
de colaboracin e hipersensibilidad tarda, pues
todas estas funciones son influenciables por las
seales que va recibiendo cada linfocito T du
rante su larga vida.
Linfocitos no-T no-B
Adems de las dos grandes poblaciones de
linfocitos T y B, existe otra poblacin de linfo
citos que no presenta molculas superficiales
propias de los linfocitos T ni de los B. Estos
linfocitos nulos no pertenecen al sistema in
mune especfico, pues no tienen receptores pa
ra el antgeno, por lo que no se los puede consi
derar funcionalmente como linfocitos propia
mente dichos, sino que son clulas pertenecien
tes a los sistemas inespecficos de proteccin.
Estas clulas son adems distinguibles morfo
lgicamente de los linfocitos especficos, pues
son ms grandes que ellos y presentan granula
ciones en su citoplasma, por lo que se los ha
llamado linfocitos grandes granulares (LGL).
Su funcin es principalm ente citotxica: son
las encargadas de la citotoxicidad espontnea,
es decir, son las clulas citotxicas naturales o
NK y tambin ejercen funcin de citotoxicidad
celular anticuerpo dependiente (vase cap. 21).
Clulas de la lnea monocito-macrfago
Los linfocitos T y B son las nicas clulas
capaces de reconocer y distinguir entre s a los
diferentes antgenos y de reaccionar contra
ellos, es decir, son las nicas clulas especfi
cas. Pero para ejercer su funcin inmune nece
sitan de la colaboracin de otras clulas, tanto
en la fase aferente de la respuesta como en su
fase eferente o efectora. Las principales clulas
que colaboran con ellos son las de la lnea monocito-m acrfago, pertenecientes al llam ado
sistema reticuloendotelial.
Estas clulas tambin se originan en la m
dula, a partir de clulas troncales, que por dife
renciacin producen monocitos que salen a la
circulacin sangunea (vase cap. 2, fig. 2-1).
Estos abandonan la sangre y, en los diferentes
tejidos, se diferencian tomando formas distin
tas pero manteniendo, en general, funciones si
milares. Una gran proporcin se diferencia a
macrfagos residentes (por ej., macrfagos al
veolares en el pulmn, clulas de Kupffer en el
hgado), de vida larga, con funcin macrofgi
ca pero que, como ya se dijo, no intervienen
activamente en la presentacin de antgenos y
no expresan normalmente antgenos de histo
compatibilidad de clase II.

Bases celulares de la respuesta inmune

Los macrfagos propiamente dichos son c
lulas migratorias que se encuentran en todo el
tejido conectivo, en especial rodeando la m em
brana basal de los pequeos vasos sanguneos;
como ya se mencion, se encuentran tambin
en los rganos linfoides primarios y secunda
rios. Estas clulas tienen vida larga y presentan
un retculo endoplsmico bien desarrollado y
m itocondrias. Una proporcin im portante de
estas clulas expresa antgenos de histocompa
tibilidad de clase II y son capaces de presentar
antgenos a los linfocitos Th. Tambin ejercen
funciones efectoras, pues son fagocticos y
pueden lisar la m ayora de las partculas que
han ingerido. Como veremos en otro captulo,
son activados por las linfoquinas de los hnfoci
tos T hl, lo que los hace mucho ms activos en
su funcin ltica.
En otros tejidos, los monocitos se diferen
cian en otros tipos celulares: clulas de Langer
hans en la piel, clulas veladas en la linfa y c
lulas dendrticas de los ganghos, que ya fueron
mencionadas. En los glomrulos renales, cons
tituyen las clulas mesangiales, en el sistema
nervioso central, la m icroglia y en el tejido
seo, los osteoclastos.
Todas estas clulas tienen caractersticas su
perficiales propias, reconocibles por anticuer
pos monoclonales dirigidos contra sus molcu
las de superficie y, adems de los antgenos de
histocompatibilidad de clase I y II, expresan re
ceptores comunes, funcionalmente muy im por
tantes, como son los receptores para el Ec de
las Igs y para el C3b del complemento. Estos
receptores, que actan sinergsticamente, p er
miten la fijacin de partculas opzonizadas so
bre su superficie, lo cual produce un importan
te aumento de su capacidad fagoctica.
Fagocitosis y lisis
La fagocitosis es un mecanismo inespecfico
de defensa, pero es a menudo el primer paso
que llevar a la iniciacin de una respuesta in
mune. Es una funcin ejercida por los macrfa
gos y tambin por los leucocitos polimorfonu
cleares o neutrfilos. Estos ltimos son clulas
tambin provenientes de la mdula, pero son de
vida corta y no expresan antgenos de h isto
compatibilidad de clase II, por lo cual no ejer
cen funcin de presentacin antignica. Tienen
abundante cantidad de glucgeno y poseen tres
tipos de grnulos: los primarios o azurfilos,
que contienen m ielopero x id asa, liso zim a y
otras protenas catinicas; los secundarios, que
poseen lactoferrina y lisozima, y los terciarios,
parecidos a los hsosomas convencionales, que
contienen hidrolasas cidas.
Tanto los macrfagos como los neutrfilos
ingieren partculas no solubles, no por recono

43

cerlas como antgenos extraos, sino en forma

mecnica, al envolverlas con sus seudopodios.
La fagocitosis es ms eficiente si, por alguna ra
zn, la adherencia entre la membrana del fago
cito y la partcula se ve aumentada. Esto puede
suceder por cargas elctricas diferentes y com
plementarias y, muy especialmente, cuando la
partcula est recubierta por Igs y/o C3b; los fa
gocitos, que tienen receptores que ligan ambas
sustancias, se pegan en ellas, con lo cual la ad
herencia de la partcula est asegurada.
La partcula adherida a la membrana celular
es rodeada por los seudopodios de la clula,
que la abrazan y terminan unindose entre s,
dejando englobada la partcula en un fagosoma,
dentro del citoplasma. La fagocitosis de part
culas viables, como las bacterias, es seguida
muy a menudo (pero no siempre) de lisis. Esta
se lleva a cabo por dos mecanismos. Por una
parte, los grnulos se unen al fagosoma, que
pasa a convertirse en un fagolisosoma, en el
cual vuelcan sus enzim as preformadas. Estas
enzimas tienen accin bactericida o hacteriosttica, sobre todo a pH cido, y tienen tam bin
accin proteoltica, por lo que se digieren los
microorganismos muertos. Este mecanismo no
es oxgeno dependiente.
Por otra parte, la ingestin de una partcula
aumenta la actividad de la va de las hexosas
monofosfato, lo que genera NADPH, el cual,
en ltima instancia, reduce el citocromo b245
propio de la membrana plasmtica, con un au
mento explosivo del consumo de oxgeno, co
nocido como estallido metablico. Este oxge
no se convierte en anin superxido, perxido
de hidrgeno, o libre o naciente y radicales hi
droxilo, todos ellos de potente accin m icrobi
cida. Adems, la mieloperoxidasa acta sobre
el perxido y sobre iones haluro, dando como
resultado un sistem a halogenante de p otente
accin bactericida. Finalmente, el consumo de
iones hidrgeno eleva el pH de manera que se
permite la funcin ptima de las protenas canicas de los grnulos (vase cap. 21).
Ambos mecanismos, oxgeno dependiente e
independiente, dan por resultado la lisis de las
bacterias fagocitadas, constituyendo as un im
portante mecanismo de defensa inespecfico.
Interaccin con el sistema inmune especfico
Si bien el sistema inmune especfico es filogenticamente ms avanzado que todos los sis
temas inespecficos de defensa, al igual que en
otros casos de la evolucin, por ejemplo el sis
tem a nervioso central, el sistem a n u ev o no
reemplaz al ms antiguo sino que pas a ac
tuar en ntimo acuerdo con l.
En la rama aferente de la respuesta inmune,
las clulas fagocticas tienen un importante pa-

44

Aspectos bsicos de la Inmunidad

pe, no slo en la eliminacin del exceso de ant

geno y su digestin, sino tambin en la produc
cin de factores quimiotcticos e inflamatorios,
que acumulan clulas especficas en el sio de
entrada del agente extrao. Adems, la funcin
de presentacin antignica de los macrfagos a
los linfocitos T es esencial para la iniciacin de
una respuesta inmune T, sin la cual la respuesta
humoral tampoco puede existir.
En la rama efectora de la respuesta inmune
tambin juegan los fagocitos un papel esencial
y son muchas veces los encargados de eliminar
al invasor que ha sido marcado como blanco
por los anticuerpos. Einalmente, la acum ula
cin y la activacin de los macrfagos, con au
mento de su poder ltico, es el resultado de una
reaccin de inmunidad mediada por los linfoci
tos T hl.
Todo esto ejemplifica una vez ms la com
pleja relacin intercelular que implica una res
puesta inmune, pues abarca no slo las clulas
especficas sino tambin los sistemas inespec
ficos.
DETECCIN E INDIVIDUALIZACIN
DE LAS CLULAS QUE COMPONEN
EL SISTEMA INMUNE
La inmunologa, sobre todo en sus aspectos
celulares, es una ciencia muy joven y en cons
tante expansin, que ha estado durante muchos
aos muy atrasada con respecto a otras ramas
de la fisiologa y la biologa. Este atraso se de
bi, en gran parte, a las dificultades para identi
ficar diferentes poblaciones de linfocitos que,
pese a parecer todos iguales, cumplen funcio
nes distintas. Adems, el sistem a inm une no
cuenta con un rgano fijo, como casi todos los
otros sistemas de un individuo, sino que est
repartido por diferentes regiones del vertebra
do. Para terminar de hacer difciles las cosas,
las clulas que componen el sistem a inmune
muestran una tendencia a la migracin no com
parable con la de ninguna otra clula, pues pa
san de los rganos primarios a la sangre, al r
gano secundario que les corresponde, a la linfa,
a la sangre, a un tejido o nuevamente al rgano
secundario, etc., en una sucesin constante y
mediante vas y sistemas regulatorios no todos
completamente conocidos. Por otra parte, son
capaces de cam biar su m igracin fisiolgica
habitual obedeciendo a factores quimiotcticos
que se producen en zonas de inflamacin. Nin
guna de estas migraciones es al azar, sino que
van siendo reguladas y dirigidas por las mol
culas superficiales de cada linfocito y por las
m olculas presentes en cada uno de los microambientes para los que est comprometido
el linfocito.

Desde hace muchos aos se conoce la exis

tencia de factores protectores en el suero, los
anticuerpos, y de otras reaccioties inmunes no
transferibles por el suero. Pero para conocer la
base de la dualidad del sistema inmune, debi
recurrirse a la ablacin de rganos primarios de
animales inmunolgicamente inmaduros: el ti
mo en ratones recin nacidos y la bursa de em
briones de pollos. Esto dio lugar a un gran
avance, pues permiti el estudio de animales T
o B privos, pero tambin indujo a confusiones,
porque ni todos los vertebrados parecen tener
rganos equivalentes a la bursa de Eabricius, ni
todos nacen con su sistema T inmaduro.
Otro avance muy importante fue la deteccin
de un aloantgeno, presente en el cerebro y en
los linfocitos T de los ratones, que fuera deno
m inado 0 (theta) y actualm ente es llam ado
Thy. 1, que permiti identificar los linfocitos T
murinos mediante inmunofluorescencia. Ade
ms, con anticuerpos anti-Thy.l ms comple
mento, pudieron prepararse poblaciones despro
vistas de linfocitos T, lo que permiti trabajar in
vitro o inyectar ratones previamente irradiados
con poblaciones desprovistas de linfocitos T ; de
esta manera pudo descubrirse la necesidad de
colaboracin entre los linfocitos T y B.
Pero tambin la necesidad de trabajar in vi
tro para establecer la mayora de los conoci
mientos sobre la respuesta inmune ha trado
otros inconvenientes a la inmunologa. En la
mayora de los casos no se tiene en cuenta el
resto del organismo y la interrelacin del siste
ma inmune con los otros sistemas del indivi
duo, muy especialmente con el sistema nervio
so central y con el endocrino. Estas interaccio
nes tien en gran im p o rtan c ia en la fu n ci n
homeosttica del sistema inmune y recin en
estos ltimos aos se estn empezando a cono
cer (vase cap. 17, 2da. parte).
La identificacin de las subpoblaciones lin
foides es til, no slo para el m ejor conoci
miento de la maduracin, diferenciacin, fun
ciones y otras caractersticas fisiolgicas del
sistema inmune, sino tambin desde un punto
de vista aplicado o clnico, para el diagnstico
y pronstico de enfermedades linfoproliferativas o con compromiso inmunolgico.
En una primera instancia, se utilizaron sue
ros inmunes, generalmente producidos en co
nejos o cabras, dirigidos contra molculas ais
ladas de la superficie de los linfocitos o, en el
caso de las Igs, del suero sanguneo. Luego se
pas a la produccin de anticuerpos monoclo
nales, generalmente a partir de esplenocitos de
ratones inyectados con clulas enteras de esa u
otra especie. Los diferentes grupos que produ
jeron estos anticuerpos intercam biaron infor
macin, y esto permiti la identificacin de una
serie de grupos o acmulos (clusters) de mono-

Bases celulares de la respuesta inmune

clnales dirigidos contra una misma estructura
de diferenciacin, lo que defini las diferentes
molculas superficiales, que llevan ahora, en el
hombre y otras especies pero no en el ratn, el
nombre de CD (cluster of differentiation) se
guido de un ntimero. A ctualm ente se cuenta
con una batera de anticuerpos monoclonales
contra los CD humanos. En el Apndice del
cap. 2, se da la lista de los CD conocidos hasta
hoy y sus funciones.
Para individualizar cada clula se las puede
incubar con el anticuerpo marcado con sustan
cias fluorescentes y luego observarlas en m i
croscopio con luz ultravioleta. Tambin se pue
de usar este mismo tipo de reactivo para apre
ciar las proporciones de cada subpoblacin en
una suspensin dada mediante el uso del cito
fluormetro. Este mtodo permite tambin te
ir una clula con dos o ms sustancias dife
rentes y medir simultneamente otras caracte
rsticas de cada una de las clulas de la pobla
cin, como tamao, cantidad de ADN, etc., lo
que puede aportar mucha informacin sobre la
poblacin celular estudiada. Adems, permite
separar subpoblaciones por diferencias en bri
llo, equivalente a la concentracin de la mol
cula marcada en la superficie celular, u otra ca
racterstica.
Tambin se puede aislar una poblacin m e
diante el uso de estos anticuerpos absorbidos
sobre superficies, ya sea fondos de recipientes
o grnulos, sobre las que se pegarn las clulas
con la molcula en cuestin, y pueden ser res
catadas en pureza. Por fin, se puede eliminar
una poblacin con esos mism os anticuerpos
ms complemento.
La identificacin y aislamiento de los linfo
citos B se hace, principalmente, por la Ig de la
membrana; dado que los otros linfocitos no sin
tetizan ni expresan Ig superficial, su presencia
es el mejor marcador para reconocer los linfo
citos B. Para identificarlos, los mejores m to
dos estn basados en la incubacin de pobla
ciones mixtas, viables o fijadas, con anticuer
pos anti-Ig marcados con sustancias flu o res
centes, que luego pueden ser detectadas por
microscopia de fluorescencia o citofluorome
tra. Como se comprende, para visualizar los
linfocitos B se deben incubar con anti-Ig de
modo que no se formen casquetes, ya sea im pi
diendo el metabolismo celular con temperatura
baja o antimetabolitos, o fijando el sistema de
microtbulos y microfilamentos celulares.
Mediante estas tcnicas no slo se pueden
identificar los hnfocitos B, sino que se pueden
determinar las clases de Igs que sintetizan y ex
presan, utilizando anticuerpos, monoclonales o
polielonales, especficos para una clase de Ig de
la especie. As se pudo determinar la secuencia
de expresin de diferentes clases de g durante

45

la maduracin de los linfocitos B y su diferen

ciacin a plasmocitos o linfocitos B de m em o
ria. M s an, utilizando anticuerpos dirigidos
contra dos o ms clases de Igs, marcados con
diferentes sustancias, se pudo demostrar la exis
tencia de clulas doble y triplemente positivas,
lo cual llev a la demostracin del fenmeno de
splicing alternativo en los linfocitos.
La identificacin de los linfocitos T en los
ratones se hizo mediante el uso de sueros antiT hy.l, como se dijo antes. En el hombre no se
encontr un antisuero similar y durante mucho
tiempo se utihz la particular tendencia a la ad
hesin a otras clulas que tienen los linfocitos
T, que forman rosetas con los eritrocitos de
carnero; estas rosetas permitieron tam bin la
purificacin de poblaciones T hum anas m e
diante centrifugacin en gradientes. Hoy se sa
be que estas rosetas se hacen a travs del C D 2.
Actualmente, para identificar, aislar o eliminar
poblaciones de linfocitos T humanos, se utili
zan anticuerpos dirigidos contra molculas co
munes a todos los hnfocitos T (anti-pan T), co
mo CD2 o CDS. La identificacin de la subpo
blacin Th se hace, generalm ente, con anti
CD4 y de la poblacin citotxica/supresora,
con anti CDS.
Aqu tambin, la medicin de las proporcio
nes relativas de las subpoblaciones T puede te
ner gran importancia clnica. Por ejemplo, un
d e sc e n s o en la re la c i n de lin fo c ito s
CD4+/CD8+ es ndice de avance de la enferm e
dad en el SIDA.
Otras molculas superficiales
Todos los hnfocitos expresan molculas de
histocompatibilidad de Clase I en alta concen
tracin y otras molculas sumamente im portan
tes para su funcin inmune. Los linfocitos B
expresan tambin antgenos de histocom patibi
lidad de clase 11; estos ltimos, que aumentan
con la estimulacin antignica, permiten al lin
focito B presentar antgenos al linfocito T, co
mo se indica en el captulo 10. Los linfocitos T
no expresan, en reposo, antgenos de clase II,
pero pueden hacerlo cuando estn activados.
La m ayor parte de los linfocitos B tien en
tambin en su superficie receptores capaces de
ligar la regin Ec de las Igs modificadas por
unin con el antgeno. Su funcin est relacio
nada principalm ente con la regulacin d e la
respuesta inmune. Los linfocitos T activados
tam bin expresan a veces receptores para Fe.
Aproximadamente un 50 a 75% de los linfoci
tos B expresan receptores para la fraccin C3b
del com plem ento, de tipo CRI y CR2, cuya
funcin est relacionada con la regulacin.
La identificacin de estas molculas, que se
realizaba mediante la formacin de rosetas con

46

Aspectos bsicos de la inmunidad

eritrocitos recubiertos con anticuerpo (rosetas

EA) o con anticuerpo y las primeras fracciones
del complemento (rosetas EAC), hoy se hace
con anticuerpos monoclonales dirigidos contra
estos receptores.
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m echanism s o f lym phocyte hom ing. A nnual R eview o f
Im m unology, 10, 561, 1992.
Ik u ta , K ., U c h id a , N ., F rie d m a n , J., W e is sm a n j, I. L.
L ym phocyte developm ent from Stem Cells, A nnual R e
view o f Im m unology, 1 0 ,7 5 9 , 1992.
Jorggensen, I. L. y col. M o lecu lar com ponents o f T-C ell
reco g n itio n . A n n u al R eview o f im m u n o lo g y , 10, 835,
1992.
Janew ay, Ch. A. T he T. Cell receptor as a m ulticom ponent
signalling m achine: CD 4/C D 8 coreceptors and CD45 in
T cell activatio n . A nnual R eview o f Im m unology, 10,
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M acL ennan, I. C. M . G erm inal Centers. A nnual R eview o f
Im m unology, 12, 117, 1994.
Pfeffer, K., M ak, T. W . Lym phocyte ontogeny and activ a
tion in gene targeted mice. A nnual Review o f Im m unology, 12, 367, 1994.
Robey, E., Fow lkes, B. J. S elective events in T cell developmenL A nnual R eview o f Im m unology, 12, 635, 1994.

Antgenos

RICARDO MARGNI

GENERALIDADES
Son antgenos las sustancias que introducidas
en el organismo de un vertebrado adulto indu
cen una respuesta inmune, dando lugar a la pro
duccin de otras sustancias denominadas anti
cuerpos o a la proliferacin de clulas sensibili
zadas con las que especficamente reaccionan.
La palabra antgeno, que significa formador
de anticuerpos, es una contraccin de an/somatgeno, vocablo propuesto por Deutsch en 1899.
Por definicin, antgeno significa capacidad
para inducir la produccin de anticuerpos y es
pecificidad para reaccionar con ellos. En la na
turaleza existen ~o pueden obtenerse a partir de
ciertas sustancias- fracciones capaces de reac
cionar con los anticuerpos (especificidad), pero
no de engendrarlos (poder inm unognico) y
que Landsteiner,^ para identificarlas, las deno
min haptenos. Estos a su vez pueden ser hap
tenos complejos cuando la reaccin haptenoanticuerpo efectuada in vitro es visible, o hap
tenos simples cuando ella no origina un fen
meno deteetable a simple vista.
A la zona restringida de la molcula antig
nica que determina la especificidad se la deno
mina determinante antignico. Dado que pue
den existir varios determinantes antignieos di
ferentes en una molcula, la inoculacin de s
ta originar en el receptor anticuerpos con dis
tinta especificidad (fig. 4-1).
Un hapteno o grupo haptnico definido, tal
como:
O^N

C1

0
NH,

d)

puede conjugarse covalentemente a una m ol

cula proteica que, al ser inoculada a un Verte
brado, induce la formacin de anticuerpos con
especificidad para aqul. Un hapteno sim ple,
dentro de la molcula antignica, constituye un
determinante antignico estructural (vase
fig. 4-2).
En protenas complejas resulta difcil diluci
dar cul es la estructura del determinante anti
gnico. No obstante, estucos llevados a cabo
con protenas de las que se conoce su estructu
ra primaria y terciaria, como la mioglobina, li
sozim a, insulina, nucleasa e sta filo c cic a y
otras, han demostrado que en algunos casos el
determinante antignico est ntimamente rela
cionado con uno o pocos aminocidos c o n ti
guos presentes en la secuencia primaria (deter
m inante continuo), m ientras que en otros es
responsable de la conformacin de una restrin
gida zona de la molcula (determinante confor
macional) (fig. 4-3 1),
Actualmente se sabe que en muchas m acro
m olculas, entre ellas lisozim a de huevo, la
parte del antgeno que interacciona con el sitio
de combinacin del anticuerpo est constituida
por residuos aminoacdicos localizados distan
tes dentro de la secuencia de su estructura p ri
maria pero prximos uno a otros como conse
cuencia de la estructura terciaria o cuaternaria.
Estos determinantes antignieos topogrficos
slo funcionan mientras la molcula conserve
su estructura nativa (fig. 4-3 11). Se los identifi
ca tam bin con la denom inacin de determ incmtes antignieos discontinuos (para m ayor
informacin, vase cap. 5).
Jem e ha propuesto para el sitio, grupo o rea
del determinante antignico el nombre de epitope, y el de epitipo para el conjunto o fam ilia

46

Aspectos bsicos de la inmunidad

eritrocitos recubiertos con anticuerpo (rosetas

EA) o con anticuerpo y las primeras fracciones
del complemento (rosetas EAC), hoy se hace
con anticuerpos monoclonales dirigidos contra
estos receptores.
B IB L IO G R A FA
G eneral
C entner, J., de W eck, A. L. A tlas o f Imm uno-AU ergology.
H ogrefe & H uber Publishers, Bern, 1995. (H ay versin
en castellano.)
Fainboin, L., Satz, M . L.: Introduccin a la Inm unologa
H um ana. 3 edicin. E dicin del autor, B uenos A ires,
1995.
A bbas, A. K., Lichtm an, A. H., Pober, I. S. C ellular and
M olecular Im m unology, 2 edicin. W .B. Saunders Co.,
U .S.A ., 1994.

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T cell activatio n . A nnual R eview o f Im m unology, 10,
561, 1992.
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Im m unology, 12, 117, 1994.
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tion in gene targeted mice. A nnual Review o f Im m uno
logy, 12, 367, 1994.
Robey, E., Fow lkes, B. I. S elective events in T cell d ev e
lopm ent. A nnual R eview o f Im m unology, 12, 635, 1994.

Antgenos

RICARDO MARGNI

GENERALIDADES
Son antgenos las sustancias que introducidas
en el organismo de un vertebrado adulto indu
cen una respuesta inmune, dando lugar a la pro
duccin de otras sustancias denominadas anti
cuerpos o a la proliferacin de clulas sensibili
zadas con las que especficamente reaccionan.
La palabra antgeno, que significa formador
de anticuerpos, es una contraccin de an/somatgeno, vocablo propuesto por Deutsch en 1899.
Por definicin, antgeno significa capacidad
para inducir la produccin de anticuerpos y es
pecificidad para reaccionar con ellos. En la na
turaleza existen ~o pueden obtenerse a partir de
ciertas sustancias- fracciones capaces de reac
cionar con los anticuerpos (especificidad), pero
no de engendrarlos (poder inm unognico) y
que Landsteiner,^ para identificarlas, las deno
min haptenos. Estos a su vez pueden ser hap
tenos complejos cuando la reaccin haptenoanticuerpo efectuada in vitro es visible, o hap
tenos simples cuando ella no origina un fen
meno detectable a simple vista.
A la zona restringida de la molcula antig
nica que determina la especificidad se la deno
mina determinante antignico. Dado que pue
den existir varios determinantes antignicos di
ferentes en una molcula, la inoculacin de s
ta originar en el receptor anticuerpos con dis
tinta especificidad (fig. 4-1).
Un hapteno o grupo haptnico definido, tal
como:
O^N

C1

0
NH,

d)

puede conjugarse covalentemente a una m ol

cula proteica que, al ser inoculada a un Verte
brado, induce la formacin de anticuerpos con
especificidad para aqul. Un hapteno sim ple,
dentro de la molcula antignica, constituye un
determinante antignico estructural (vase
fig. 4-2).
En protenas complejas resulta difcil diluci
dar cul es la estructura del determinante anti
gnico. No obstante, estudios llevados a cabo
con protenas de las que se conoce su estructu
ra primaria y terciaria, como la mioglobina, li
sozim a, insulina, nucleasa e sta filo c cic a y
otras, han demostrado que en algunos casos el
determinante antignico est ntimamente rela
cionado con uno o pocos aminocidos c o n ti
guos presentes en la secuencia primaria (deter
m inante continuo), m ientras que en otros es
responsable de la conformacin de una restrin
gida zona de la molcula (determinante confor
macional) (fig. 4-3 1).
Actualmente se sabe que en muchas m acro
m olculas, entre ellas lisozim a de huevo, la
parte del antgeno que interacciona con el sitio
de combinacin del anticuerpo est constituida
por residuos aminoacdicos localizados distan
tes dentro de la secuencia de su estructura p ri
maria pero prximos uno a otros como conse
cuencia de la estructura terciaria o cuaternaria.
Estos determinantes antignicos topogrficos
slo funcionan mientras la molcula conserve
su estructura nativa (fig. 4-3 II). Se los identifi
ca tam bin con la denom inacin de determ incmtes antignicos discontinuos (para m ayor
informacin, vase cap. 5).
Jem e ha propuesto para el sitio, grupo o rea
del determinante antignico el nombre de epitope, y el de epitipo para el conjunto o fam ilia

48

Aspectos bsicos de la inm unidad

''
3

inoculacin a
vertebrado
adulto

B = antgeno
poliespecfico
1, 2, y 3 = determinantes
antignicos

Reaccin Ag - Ac

R eaccin Hp - Ac

entre un antgeno monoespecfico y su corres

pondiente anticuerpo

entre el determinan
te antignico y el
anticuerpo originado
por el antgeno monoespectico

a, b, c = anticuerpos
con especificidad para
los determinantes
antignicos 1, 2 y 3
respectivamente

Reaccin Ag - Ac
entre un antgeno poliespecfico y los diferentes
anticuerpos formados

Fig. 4-1. R eacciones antgeno-anticuerpo y iiapteno-anticuerpo.

0,N
.(CH,),

NO,
Hapteno

Determinante antignico

Antgeno

de epitopes relacionados. Al sitio conaplementario de la estructura del determinante antigni

co ubicado en el anticuerpo lo llama paratope.
Esta denominacin resulta litil en algunos ca
sos, como ocurre con los antgenos somticos
de las salmonelas, o con los constituyentes an
tignicos de los hemates correspondientes al
sistema ABO, en que todos poseen un polisido
comiin y slo difieren por la naturaleza del
azijcar no reductor terminal.
Esta nomenclatura ha tenido gran aceptacin
y en estos momentos la mayora de los inm u
nlogos la ha adoptado, identificando el deter
m inante antignico como epitope, cualquiera
que sea su naturaleza.
Los determinantes antignicos o epitopes por
unidad de antgeno, sea sta una tnolcula o
una partcula, varan grandemente, y la periodi
cidad de su repeticin es funcin del nmero
de determinantes antignicos diferentes presen-

Fig. 4-2. R epresentacin esquem tica de una m olcula de

antgeno, su determ inante antignico estructura! y e! grupo
haptm ico.

Antgenos

49

F ig . 4 -3. Estructura hipottica de un fragm ento proteico. Las zonas A y B, deUmitadas por h'neas de puntos, se alan
reas que podran constituir determ inantes antignieos conform acionales, de los que form an parte m uy pocos re sid u o s y
que afectan a una o a las dos cadenas peptdicas. La reduccin del puente S-S de la zona A o el desplegam iento de la B p o
dran hacer perder la especificidad de los determ inantes antignieos all locahzados. La zona C podra corresponder a un
determ inante antignico estructural.

tes en la misma. Se ha comprobado que una

m olcula de ovoalbtim ina posee 30 epitopes
efectivos y 62 epitopes potenciales sobre su su
perficie, cifras que contrastan con las halladas
en una partcula enormemente mayor, un bacilo
tfico, en el que se han calculado 5,6 x 10* epi

F ig . 4 -3 II. L os residuos id e n tifi

cados con crculos rojos dentro de
la zo n a d elim itad a por lneas de
p u n to s, co n stitu y en un d e te rm i
nante anignico topogrfico h ipo
ttico.

topes, los cuales, segtin diferentes iiavestigadores, no se encuentran aislados sobre la superfi
cie bacilar, sino dispuestos en placas. La valen
cia total del antgeno est dada por el nmero
de determ inantes antignieos presentes en la
molcula, expuestos y ocultos. La valencia fu n

50

Aspectos bsicos de la inmunidad

cional corresponde a los determinantes antig

nicos expuestos, capaces de reaccionar directa
mente con los anticuerpos.
Existen ciertos hechos relacionados con la
definicin de antgenos que conviene dejar
aclarados. Sustancias de peso m olecular no
muy elevado pueden ser excretadas rpidamen
te y por esta circunstancia estimular deficiente
m ente la produccin de anticuerpos; pero, si
aqullas son inoculadas junto con adyuvantes,
los resultados pueden m odificarse favorable
mente. Por otra parte, macromolculas que re
nan todas las condiciones para la antigenicidad
pueden ser buenos agentes inmunizantes para
algunos anim ales y m alos para otros, como
ocurre con los polisacridos neum occicos,
que inducen buena respuesta inmunolgica en
el hombre y el ratn, no as en el conejo. He
chos similares suelen ocurrir en animales ino
culados con antgenos para cuyas especificida
des pueden tener cierta tolerancia inmunolgi
ca como consecuencia de poseer antgenos em
parentados, lo que hace que su reactividad sea
escasa o nula.
Por este motivo se prefiere reservar el nom
bre de inmungeno para las sustancias capaces
de inducir respuesta inmune y el de antgeno
para aquellas que interaccionan con los produc
tos de dicha respuesta. No obstante, son trmi
nos que frecuentemente se emplean como sin
nimos.
CARACTERSTICAS DE LAS QUE
DEPENDE LA ANTIGENICIDAD
O CAPACIDAD PARA INDUCIR
RESPUESTA
A qu se debe que ciertas macromolculas
al ser introducidas en el organismo induzcan
respuesta inmune y otras en cambio no tengan
capacidad inmunognica? Para que una sustan
cia pueda actuar como antgeno, aun cuando
ella rena todas las condiciones para la antige
nicidad, es indispensable que su concentracin
sea la ptima cuando se la inocula al husped,
pues pequeas dosis podran ser inefectivas y
un exceso podra actuar como inhibidor.
Tamao molecular
Los antgenos completos son protenas o hi
dratos de carbono, pero para que puedan en
gendrar anticuerpos deben tener un peso mole
cular exageradamente grande, como la albmi
na; 70 kD, globulinas; 150 a 900 kD, polisac
ridos de los neumococos: 150 kD. Se admite
que para que una sustancia pueda actuar como
antgeno, su peso molecular debe ser superior a
10 kD. No obstante ello, hay algunas de peso

m olecular bajo, como el glucagn (P.M. 3,8

kD), y las insulinas (P.M. 6 kO), que inocula
das junto con adyuvantes originan anticuerpos.
Por copulacin de cuplena con isocianato de
fenilo se obtiene un complejo de peso molecu
lar no superior a 4,5 kO, que inoculado a cone
jos da lugar a la formacin de anticuerpos pre
cipitantes.
Los polipptidos de sntesis han sido muy
tiles para los estudios de antigenicidad. Han
sido empleados con tal fin homopolmeros (po
lmeros de un solo aminocido); pequeos pp
tidos de secuencia conocida unidos a bloques
de copolmeros; copolmeros obtenidos al azar,
en los que se conoce su composicin, pero no
su secuencia; copolmeros con multicadenas,
con un pptido funcionando com o colum na
vertebral con sitios de recepcin mltiples a los
que pueden unirse cadenas peptdicas. Han sido
elaborados exclusivamente con D-aminocidos
o L-aminocidos o con mezcla de ambos. Esta
variedad de productos ha servido para tener
una informacin ms acabada de las exigencias
que rigen en la induccin de la respuesta inm u
ne. Se ha comprobado que los polmeros de Daminocidos generalmente no inducen form a
cin de anticuerpos, cosa que hace la mayora
de las preparados con L-aminocidos.
Sela, Maurer, Benacerraf y otros han puesto
en evidencia que polipptidos de sntesis de pe
so molecular aproximado de 4 kD, y aun me
nos, pueden form ar anticuerpos cuando son
inoculados a vertebrados adultos, pero ese peso
molecular debe ir asociado a una estructura es
pacial determinada, ya que algunos polippti
dos hneales de bajo peso molecular no forman
anticuerpos, en tanto que lo hacen los ramifica
dos. Por otra parte, existen protenas de peso
molecular elevado, como la histona, las protaminas, la gelatina, etctera, que normalmente
no inducen la produccin de anticuerpos.
Grupos qumicos activos
No slo el tam ao m olecular es un factor
preponderante en la capacidad inmunitaria de
las molculas antignicas, sino que muchas de
ellas, fundamentalmente las protenas, necesi
tan de la preponderancia de ciertos radicales,
sobre todo los cidos, para que ella se cumpla.
La no antigenicidad de la gelatina, cuando se
la inyecta en solucin sin adyuvantes, se debe
ra a la ausencia de aminocidos tales como la
tirosina y la fenilalanina, que seran factores
preponderantes. Protenas copuladas con los
diazoderivados de los cidos p-am inobencenoarsnico (cido arsalnico) y p-aminobencenosulfnico (cido sulfanlico), cuando son
inoculadas, originan anticuerpos especficos
para dichos radicales, lo que nos habla de la

Antgenos
importancia de stos en la estructura de la m o
lcula. Un hecho anlogo ocurre con protenas
a las que se les han fijado grupos dinitrobence
no o trinitrobenceno.
Grupos bsicos fuertes dentro de la molcula
proteica tienen una accin efectiva, al igual que
los grupos cidos, en la direccin de la especi
ficidad. Otro prerrequisito para la antigenicidad
es la rigidez en la estructura para los grupos de
terminantes; la alta especificidad de los grupos
aromticos en los antgenos de sntesis obteni
dos por diazotacin y copulacin es debida pre
cisamente a la rigidez del benceno. En cambio,
la inactividad com o grupo antignico de las
grandes molculas de los cidos grasos se debe
a que las largas cadenas de los hidrocarburos
son fcilmente distorsionadas y sufren altera
ciones constantes.
Con respecto a la de los determinantes anti
gnicos de los polisacridos, generalmente es
consecuencia de combinaciones de dos o ms
unidades de hexosas. Ha podido establecerse
que en el dextrano los grupos determ inantes
consisten en unidades de, por lo menos, tres
aD-glucopiranosa, las que se repiten. Para es
tos antgenos, el determ inante antignico d e
pender de la secuencia de los azcares que lo
componen y su modo de unin, ms que de su
conformacin.
Posicin de los radicales
en el ncleo aromtico
Cuando el determinante de un antgeno es un
grupo aromtico sin radicales cidos, la especi
ficidad es menos precisa que en estos ltimos
casos y depende en gran parte de la posicin
que los diferentes radicales ocupan en dicho
ncleo. Si se inoculan conejos con un antgeno
obtenido por diazotacin de la p-cloroanilina y
copulacin con albmina bovina, se obtienen
anticuerpos especficos para la p-cloroanilina,
pero que tambin reaccionan con la p-nitrosoanilina y la p-metilanilina. Esta especificidad, en
cambio, est enormemente reducida o anulada
cuando se vara la posicin del radical determi
nante, como ocurre al hacer reaccionar estos

anticuerpos con la o-cloroanilina, m-cloroanilina o cualquiera de los otros derivados m encio

nados en posicin orto y meta. En estos casos
las reacciones cruzadas son menos m arcadas
que las o b servadas cuando los an ticu erp o s
reaccionan con los otros derivados, con radica
les diferentes, pero ubicados en la misma posi
cin del ncleo aromtico (cuadro 4-1).
Influencia de la estructura espacial
del determinante antignico
Ya hemos visto en el caso anterior la im por
tancia que tiene la posicin de un determinado
radical o grupo aromtico con respecto a la es
pecificidad, lo que nos est indicando que la
posicin de stos en el espacio es significativa
para aqulla. Landsteiner pudo diferenciar serolgicam ente los cidos D- y L-paminobenzoilfenilaminoactico.
Del mismo modo, copulando con protenas
los cidos levo, dextro y meso-p-aminotartranlico e inoculndolos a conejos, se obtienen anti
cuerpos capaces de reaccionar especficamente
con los respectivos cidos tu-tricos, ya sea uni
dos a la protena a la cual fueron copulados para
transformarlos en antgenos y emplearlos en la
inm unizacin de los conejos, ya sea unidos a
otras seroprotenas de diferente origen animal.
El cuadro 4-2 esquematiza lo expuesto ante
riormente.
Sela y col. demostraron en materia de anti
genicidad la im portancia de los am inocidos
que contienen grupos aromticos y de su posi
cin en las cadenas proteicas. Estos autores,
trabajando con polipptidos de sntesis, p(Tyr,G lu)-pA la-pL ys, pA la-p(T yr-G lu)- -p (L y sAla), han llegado a la conclusin de que, para
los polipptidos lineales y ramificados de peso
molecular 4 kDa, la posicin que el am inoci
do aromtico ocupa en la cadena polipeptdica
es factor preponderante en la antigenicidad. Por
otra parte, han llegado a establecer que p o li
pptidos lineales de ese peso molecular, p o r re
gla general, no son antignicos, en tanto que
los m ism os, como polipptidos ram ificados,
adquieren poder inmunognico. Ello indica que

Cuadro 4-1. Posicin de los radicales en el ncleo aromtico.

cc

ra

'(D
2
N=N ( o

Cl
)
NH2

51

52

Aspectos bsicos de la inmunidad

C u ad ro 4-2. Especificidad inmunolgica de diferentes cidos tartricos

A N T G E N O S
C O O H ^ (R)

H C O H
COOH
A cido ]-tartrico

cido 1-tartrico
cido d-tartrico
cido m -tartrico

ho - - c ^ h

CO O H
A cido d-tartrico

CO O H - (R)
H C OH

H C OH

C O OH
A cido m -tartrico

+++
+

los ncleos aromticos y la posicin espacial

de las cadenas constitutivas de las protenas o
de los determinantes antignieos son factores

------ p (Glu, Tyr)

< ------ p-DL-Ala
= - < - p-Lys

-p-DL-Ala
p (Glu, Tyr)
^ p -L y s

Fig. 4-4. Polipptido.? A y C antignieos. P olipptido B:

no antignico.

(R)

H-^C^OH

-O C H
Suero inm une
contra

CO O H

de suma importancia en lo relativo a la antige

nicidad de la sustancia. Resultados similares
con otros tipos de experiencias han sido obteni
dos por otros investigadores, entre ellos Maurer
y Benacerraf.
Mediante el empleo de copolmeros con multicadenas se ha podido comprobar que es indis
pensable que la regin antignicamente impor
tante de la molcula sea accesible al mecanis
mo que induce la formacin de los anticuerpos,
pero ello no significa que dicha regin antigni
ca deba encontrarse al final de las cadenas pep
tdicas, segn se deduce del siguiente hecho ex
perim ental. Se prepararon copolm eros con
m ulticadenas de la mism a composicin y un
pptido de polilisina como columna vertebral.
En un caso las cadenas laterales unidas a la lisina fueron polialanina, con sustituciones termi
nales de poliglutamiltirosina. En el otro fue in
vertido el orden de unin. Slo el primero de
los polmeros fue antignico en el conejo. Se
pudo comprobar adems que, cuando el pptido
que funcionaba como columna vertebral era un
copolmero de lisina y alanina, la unin de la
cadena peptdica p (Glu, Tyr)-pAla le confera
antigenicidad, cosa que no ocurra en el caso
anterior. Ello probablemente se deba al mayor
espacio existente entre los e-aminogrupos de la
lisina a los que se unen las cadenas peptdicas,
lo que permite una mejor exposicin de la re
gin antignicamente importante; esto demues
tra que no necesita ser terminal en todos los ca
sos. La figura 4-4 esquematiza lo expuesto.
Es de hacer notar que lo anteriormente dicho
es vlido cuando se inmuniza con un solo ant
geno o determinante antignico ya que, si se
utilizan varios a la vez, por fenmenos de com
peticin puede estar inhibida la actividad de al
guno de ellos. Esto significa que, al inmunizar
con varios antgenos simultneamente, debe re
gularse su concentracin para conseguir buena
respuesta inmune para todos.

Antgenos
Hidrofliddad y prediccin de epitopes
El desconocim iento de la estructura trid i
mensional de muchas protenas ha hecho que
se buscaran otros parm etros que perm iten
predecir si las superficies expuestas de estas
m olculas hacen que sean antignicas o no.
Dado que los sitios hidroflicos son general
mente hallados en la superficie de la protena
expuesta al agua, se considera que los mismos
podran ser blanco de los anticuerpos. Los
anlisis de numerosas protenas han dem ostra
do que estos sitios son componentes de deter
minantes antignicos. Sin embargo, una gran
parte de los sitios de la superficie son no pola
res, y en varios casos se ha demostrado que re
siduos aromticos e hidrofbicos forman parte
del epitope.
Prediccin de epitopes
El inters de predecir y definir sitios antig
nicos de una protena comenz en parte con la
produccin de vacunas sintticas.
Los mayores avances sobre los conocimien
tos del sitio antignico fueron realizados con
siderando la carga y polaridad de los am ino
cidos involucrados. Esto no descarta que inte
racciones hidrofbicas puedan estabilizar la
unin antgeno-anticuerpo (Ag-Ac). Sin em
bargo, es probable que la naturaleza direccional carga-carga y otras interacciones polares
(p. ej., uniones hidrgeno) contribuyan como

F ig. 4-5. P erfil de hidrofilicidad de

la m ioglobina. A daptada de V an Reg e n m o rte l M . H . V. I m m u n o lo g y
Today, 10:266, 1989.

53

elemento crtico de la especificidad geomtrica

de los sitios de unin. Los residuos polares son
necesarios en las interacciones proteicas; los
grupos no polares ayudan, pero no son absolu
tamente necesarios.
La reciente literatura indica que muchos la
boratorios, para localizar sitios antignicos so
bre una protena, se basan en la prediccin de
sitios hidroflicos como probables regiones de
alta antigenicidad, lo que puede incluir, ade
ms, consideraciones sobre la estructura se
cundaria (p. ej., a-hlice, hoja plegada en p,
curvaturas en (3).
Mtodos para determinar hidrofilicidad
y estructura secundaria
Es apropiado determinar simultneamente la
prediccin de la estructura secundaria e hidrofi
licidad, ya que la estructura secundaria depen
de de la hidrofbica e hidroflica de los seg
mentos de aminocidos considerados.
La representacin del perfil hidroflico de
una protena se ha estandarizado con una escala
en la que se indican las secuencias hidroflicas
hacia arriba y las hidrofbicas hacia abajo (fig.
4-5). Si se superponen las secuencias secunda
rias con la hidrofilicidad/hidrofobicidad se ob
serva una significativa correlacin entre ambas.
Los valles profundos generalmente ocurren en
las zonas a-hlices ms largas o cerca de las
zonas de hojas plegadas en |3, las que constitu
yen el fino paquete hidrofgico del centro de la

100

50

Aminocidos

54

Aspectos bsicos de la Inmunidad

molcula. Las a-hlices ms cortas son las zo

nas ms expuestas de la molcula y, por lo tan
to, estn relacionadas con los sitios antignicos
de la misma. Para los estudios de prediccin de
epitopes en base a estructuras secundarias, se
han elaborado mtodos com putacionales que
usan la informacin proveniente de unas pocas
protenas bien definidas y en las que se encuen
tran determinadas las escalas de giro o torsin.
Un giro es la secuencia de la columna vertebral
de un polipptido involucrada en el cambio de
direccin de la cadena principal.
Papel de la movilidad atmica en la
antigenicidad e inmunogenicidad
de protenas
El mecanismo de la especificidad depende
de la complementariedad entre el epitope anti
gnico y el sitio de combinacin o paratope del
anticuerpo, estando comprometidos en ello los
puentes de hidrgeno, uniones polares, fuerzas
de Van der Walls, etc., que puedan originarse
entre ambos (vase cap. 5). Su eficiencia de
pende de un buen acomodamiento entre ambas
estructuras.
Para determinantes antignicos conformacio
nales o discontinuos (topogrficos) es difcil
determinar si la movilidad estructural que invo
lucra residuos distantes, ubicados en la secuen
cia aminoacdica, y que pueden diferir signifi
cativamente en la movilidad relativa, juega un
papel im portante en la determ inacin de la
complementariedad de la interaccin antgenoanticuerpo. Incluso, en este caso, el desplaza
miento de alguno/s de los residuos comprome
tidos puede dar lugar a cambios en la superficie
de contacto originada por los residuos vecinos.
En el caso de los determ inantes antignicos
contiguos (secuencia continuada de un niimero
determinado de residuos), la interpretacin de
la movilizacin local en el mencionado fen
meno es menos ambigua.
La informacin sobre movilidad relativa de
diferentes tomos en protenas, llamado factor
de temperatura atmica, proviene de estructu
ras moleculares refinadas, y es sumamente til
para entender aspectos dinmicos de estructu
ras proteicas, en especial acerca de la flexibili
dad de residuos aminoacdicos individuales y
elementos estructurales. Han sido muy tiles en
este sentido estudios de difraccin de rayos X
desarrollados con protenas cristalizadas.
Esos factores de temperatura atmica indivi
duales no representan diferencias trmicas lo
cales dentro de la molcula, sino que son lla
mados as por la temperatura dependiente de la
velocidad del movimiento atmico y la corres
pondiente energa trmica disponible para su
perar esas barreras de energa potencial confor

macional. Generalmente, cuando se hace refe

rencia a pptidos localizados en regiones de
una protena, se emplea el trmino caliente
para identificar una zona muy mvil (factores
de temperatura altos) y fro para las regiones
bien ordenadas (factores de temperatura bajos).
Los datos provenientes de anticuerpos antipptidos y del mapeo de epitopes proteicos
sugieren que el reconocimiento antignico en
general involucra la interaccin de anticuerpos
con zonas de la protena que puede adoptar for
mas mltiples, distintas de la estructura prome
dio observada por cristalografa de rayos X.
Todo perm ite suponer que la interaccin del
paratope del anticuerpo con el epitope antigni
co es suficiente en primera instancia para el re
conocimiento, pero que luego, debido a la m o
vilidad atmica, hay una induccin a la estruc
tura del epitope que mejor se adapte. En el caso
de las interacciones entre pptidos de protenas
y sus correspondientes anticuerpos, el pptido
se une al paratope cuando su conformacin se
asemeja a la que le corresponde en la protena
nativa, acomodndose luego, como consecuen
cia de movilizacin atmica, a la estructura que
reaccione m ejor con el sitio de combinacin
del anticuerpo.
En este sentido resulta muy interesante que
en diferentes protenas relativamente pequeas,
como la neurotoxina alfa de escorpin, mioglobina, lisozima nativa, citocromo c, etc., las zo
nas de antigenicidad de la molcula (epitopes)
estn relacionados, en su mayora, con regiones
de alta movihdad o cahentes, con factores de
tem peratura atmica altos. En el citocromo c
los residuos 44, 60/62 y 89/92, integrantes de
los tres epitopes detectados en esa molcula,
estn asociados con reas identificadas como
mviles en los factores de temperatura cristalo
grficos. Lo mismo ocurre con los tres epitopes
de la ribonucleasa, en cuya estructura partici
pan los residuos 1/10, 63/75 y 98/104.
No obstante lo expuesto, esa relacin no de
be ser considerada como un hecho general, ya
que en algunos casos no se ha podido demos
trar que dicha relacin exista.
A LT E R A C I N D E LOS A NTG EN OS
Desnaturalizacin
Los antgenos, en su gran mayora protenas,
pueden sufrir alteraciones derivadas de la ac
cin que algunos agentes fsicos o qum icos
pueden ejercer sobre ellos. El proceso por regla
general es progresivo, se cumple en dos o tres
etapas, y determina que esa protena desnatura
lizada, cuando es inoculada a un animal, esti
mule la produccin de anticuerpos, que en al

Antgenos
gunos casos pueden reaccionar con la protena
primitiva, no as en otros. Ello se debe a las
profundas modificaciones que pueden sufrir los
determinantes antignieos originales a causa de
la desnaturalizacin de la protena. La desnatu
ralizacin suele producirse ya sea por trata
miento con cidos y bases fuertes, por calenta
miento a altas temperaturas o por otros proce
dimientos.
Oxidacin
M ediante el empleo de perxidos como el
permanganato de potasio, pueden modificarse
las protenas antignicas, las que una vez ino
culadas al animal dan lugar a la formacin de
anticuerpos, que presentan la particularidad de
no precipitar con otras protenas modificadas,
ni aun con la protena primitiva no oxidada.
Reduccin
Por este mecanismo pueden alterarse algunasprotenas, pero generalmente las modificaciones
son nfimas y los anticuerpos que se originan al
inocular animales exhiben reactividades cruza
das para la protena primitiva y la reducida.
Digestin
Las enzimas, actuando en medio cido o en
medio alcahno, segn sus condiciones ptimas,
pueden producir escisiones profundas en las
molculas proteicas antignicas haciendo que
las mismas se desdoblen en varios polippti
dos, algunos de los cuales, si bien no reaccio
nan aparentemente con el anticuerpo respecti
vo, pueden llegar a neutralizarlo, lo cual indica
que esta digestin muchas veces libera deter
minantes antignieos con capacidad reactiva.
A cidificacin y alcalinizacin
Los cidos y los lcalis pueden reaccionar
con las protenas formando metaprotenas ci
das o alcalinas. La actividad antignica de stas
disminuye menos en las metaprotenas alcahnas que en las cidas, y estas ltimas presentan
frecuente reactividad cruzada con otras prote
nas como consecuencia de las modificaciones
experimentadas.
Desaminacin
La remocin de los grupos aminos libres en
las protenas no produce modificaciones gran
des en la antigenicidad y caractersticas de s
tas. La remocin de ms o menos un tercio de
los aminogrupos de la casena y la albmina de
huevo no provoca alteraciones manifiesta.s.

55

Esterifcacin
La esterifcacin de protenas origina altera
ciones que hacen que pierdan su capacidad pa
ra reaccionar con los anticuerpos producidos
por la protena no modificada.
Por su parte, la acilacin, halogenacin, diazotacin, tratam iento con gas de m o staza y
otros agentes qumicos dan lugar a m odifica
ciones de resultados anlogos. Algunos proce
dimientos fsicos, como los ultrasonidos, pue
den tambin provocar modificaciones y liberar
a veces grupos antignieos de la m olcula no
evidenciados anteriormente.
C O M P O S IC I N Q U M IC A
DE LOS ANTGENOS
La mayor parte de los antgenos son prote
nas de alto peso molecular que contienen algu
nos aminocidos particulares, sobre todo po
seedores de ncleos aromticos, y una estructu
ra espacial definida. Carbohidratos de alto peso
molecular pueden tambin actuar como antge
nos y habitualmente la antigenicidad est dada
por la condensacin de grupos hexosas.
Estas distintas estructuras moleculares hacen
que los antgenos puedan inducir respuesta in
mune directa sobre los linfocitos B (antgenos
T-independientes: polisidos, lipopolisacri
dos, flagelina polim erizada), sin la participa
cin de los linfocitos T, o que necesiten de di
cha cooperacin (antgenos T-dependientes:
antgenos proteicos, haptenos fijados a soportes
proteicos).
Los ratones nude -q u e por padecer de una
aplasia tmica carecen de linfocitos T -, cuando
son inoculados con el antgeno T-dependiente
T N P-protena (protena trinitrofenolada), no
dan respuesta anti-TNP, pero lo hacen si el in
culo es T N P-dextrano (antgeno T -independiente).
Los antgenos T -independientes h a n sido
agrupados en dos categoras; los de tipo I y los
de tipo II.
Los de tipo I son mitognicos de los linfoci
tos B e inducen respuesta policlonal de anti
cuerpos. Forman parte de este grupo los lipo
polisacridos (LPS) componentes de la pared
celular de las bacterias. Estos antgenos son
tam bin activadores de macrfagos e inducen
produccin de interleuquinas (IL -1, IL-6, IL8), factor necrosante de tumores (T N F -a), in
terfern a (IFNa), prostaglandinas, etctera.
Los antgenos de tipo II son polm eros de
polisacridos; poseen secuencias repetidas que
actuando como epitopes favorecen la polimeri
zacin de los receptores antignieos de los lin
focitos B (Ig de membrana), iniciando la trans-

56

Aspectos bsicos de la inmunidad

duccin de seales que llevan a la activacin

de la clula.
Las clulas B purificadas no responden in
vitro a los antgenos tipo IL lo que sugiere la
necesidad de algin requerimiento, aunque mo
desto, de alguna citoquina. Las clulas B en
reposo (resting cells) estim uladas con ant
genos T-independientes de tipo II no secretan
anticuerpos hapteno-especficos o policlonales, pero lo hacen si al medio se le aade IL-2
o IL-5, respectivamente.
Los polisacridos antignicos ms simples
son dextrano y levano, los cuales se obdenen
por accin enzimtica bacteriana sobre sacaro
sa. La dextransucrasa origina el dextrano, y la
levansucrasa, el levano. El primero resulta de
la condensacin de molculas de glucosa y el
segundo, de molculas de fructosa. La unin
glucosdica es principalmente a (1 > 6) en el
dextrano y a (2 ^ 6) en el levano. Hay cepas
microbianas que pueden originar otros tpos de
uniones, tales como a ( l - 3 ) o a ( l
A).
En algunas oportunidades, sustancias sim
ples de bajo peso molecular al ser inoculadas
pueden originar anticuerpos, pero ello no sig
nifica que por s solas tengan antigenicidad si
no que, por combinacin con las protenas pro
pias del husped, se trasform an en antgenos
complejos capaces de dar lugar a la formacin
de anticuerpos. Se ha dado el caso de que el
plasma extrado de una persona y conservado
por el aadido de M erthiolate, cuando le fue
reinoculado produjo un choque anafilctico
despus de la tercera inoculacin. Ello se de
bi a que la sal mercurial orgnica se combin
con las protenas sricas originando un antge
no que sensibiliz en las primeras inoculacio
nes, desencadenando finalm ente la reaccin
alrgica.
Algunas enzimas pueden formar anticuerpos
cuando son inoculadas a vertebrados adultos.
No todas ellas tienen capacidad inmunognica
e incluso, cuando forman anticuerpos, stos
pueden tener especificidad para la funcin en
zimtica, neutralizndola, o para otros deter
minantes antignicos presentes en la molcula,
sin que la actividad enzim tica especfica de
sta se vea modificada.
Los cidos nucleicos (ADN y ARN) pue
den, en determinadas condiciones, inducir la
formacin de anticuerpos, pero generalmente
con reactividad cruzada para algunas de las ba
ses o azcares relacionados.
En general, los cidos nucleicos desnaturali
zados por calentamiento y enfriamiento rpido
con el objeto de romper la doble hlice, fun
cionan m ejor com o inm ungenos, esp ecial
mente cuando se los inocula mezclados con se
roalbm ina bovina metilada, la que funciona
como adyuvante. Al esterificarse los grupos

carboxilos de la albmina, los grupos aminos

rem anentes, positivam ente cargados, forman
complejos con los grupos fosfato cargados ne
gativamente, existentes en los cidos nucleicos
desnaturalizados, los que, por esta circunstan
cia, resultan accesibles a la complejacin.
Los cidos grasos no son antignicos, pero
s lo son algunos lpidos complejos, sobre todo
cuando se encuentran asociados a glcidos y
protenas, como ocurre con algunos constitu
yentes m icrobianos y componentes de m em
branas celulares. La cardiolipina y la citolipina
H son ejemplos al respecto.
A ntgenos m odificados qumicamente
Por diferentes procedimientos es posible in
troducir grupos qumicos en protenas. Muchas
veces los compuestos fijados inducen respues
ta especfica y tienen capacidad para neutrali
zar a los anticuerpos form ados. Son grupos
haptnicos entre los que figuran anillos arom
ticos esteroides, pequeos pptidos, drogas,
etc. Otras veces, el objeto de la modificacin
del antgeno es el de introducir marcas capaces
de ser detectadas, como lo son las sustancias
fluorescentes del tipo de la rodamina y la fluo
rescena, materiales densos al flujo de electro
nes como la ferritina, o tomos radiactivos.
Los fundamentos de los mtodos ms usa
dos para la introduccin de grupos qumicos
en protenas son los siguientes:
Diazotacin y copulacin
Se utiliza para haptenos con grupos -NH li
bres, como los cidos sulfanlico, arsanlico,
paminobenzoico, etc. El producto de diazota
cin se copula a la tirosina, en posicin orto,
pudindolo hacer tambin, en menor grado, a
la lisina e histidina. Vase esquema pg. 57,
parte A.
Dinitrofenil derivados
Se obtienen por reaccin entre el fluordinitrobenceno y los grupos amino libres de las
protenas, en especial los residuos de lisina.
Vase esquema pg. 57, parte B.
Reaccin con carbodiimidas
Su frmula general es RN = C = NR y son
muy usadas para la fijacin, a temperatura am
biente, de grupos carboxilos a aminos libres de
protenas, form ando uniones p eptdicas. El
grupo a fijar debe tener un carboxilo libre o lo
grrselo por oxidacin, como ocurre con el hi
droxilo prim ario de los nuclesidos. V ase
esquema pg. 57, parte C.

Antgenos

CO-NHR;,
Residuo tirosina

Residuo histidina

Residuo lisina
pH 9,5

4 C

OI

OH

\ /

N<^

( h ,),
CHNH-COR,

HNH-COR,

NH,

NO,

A '

CO-NHR,

C O -N H R ,

CO-N H R ,

Na,GO,

P
J
V NO,

4C

NO,

/ \

2)4

P NO,

i; .h n h - c o r ,

Fl

+ NaPi

NH

to^NHR,
ic

(CH

i HNH-COR,
i 0 -N H R ,

Residuo lisina

/
R ,- COOH + R ,- N = C = N - R,-------------

,0 n
\
^ /
N^R,
R 1 -C -0
J-H

NH,
R -C -N -C H ,-P ro te n a + R ^-N -C -N -R g ^
H

H O H

CH,
Protena

57

58

Aspectos bsicos de a inmunidad

Reaccin mixta con anhdridos

Reaccin con isocianatos (R -N =C =0)

y tiocianatos (R-N=C=S)
La fijacin se produce por interaccin con
grupos amino libres de la protena
Fluorescena - N = C = S +
+ H jN - CHj - Protena
Fluorescena - N - C - N - CH, - Protena

I SI I HI

Se la usa para fijar compuestos con grupos

carboxilos a grupos amino libres de protenas.
Aqullos pueden formar parte de la molcula
original o puede introducrselos, por conve
niencia, para la fijacin. Es un mtodo muy
empleado para la unin a protenas de esteroi
des y azcares cidos.

CH,

H aC ^ ^C H 3
CH

GH

COOH
CH,

Tributilamina

CHj

----------
R

0=G C I

0 = C -0 -C = O

+
H jN -C H j-P rotena
OH-

HgC^

;C H - CHj,OH + CO 2+ R - C - N - CH^- Protena

H ,C O

DIFERENTES TIPOS DE A N TG EN O S
Antgenos bacterianos
Cuando una bacteria es inoculada a un ani
mal se forma ms de un anticuerpo y ello se
debe a que un microorganismo debe ser consi
derado com o un verdadero saco antignico
dentro del cual podemos encontrar antgenos
diferentes, cada uno de ellos con capacidad in
munognica y en condiciones, por lo tanto, de
originar anticuerpos. Estos antgenos microbia
nos pueden ser protenas, que frecuentemente
estn situadas en la membrana celular y el es
pacio periplasmtico; hidratos de carbono, que
constituyen sobre todo los antgenos de super
ficie; y en algunos casos particulares, como el
de las enterobacterias, complejos glcido-fosfolipdicos que son verdaderas endotoxinas y
forman parte de la pared celular. No todos los
constituyentes antignieos de una bacteria tie
nen la misma capacidad inmunognica; algu
nos originan anticuerpos con suma facilidad
mientras que otros necesitan concentraciones
altas para conseguirlo y, casi siempre, a un t
tulo o nivel exageradamente bajo.
A los antgenos bacterianos ubicados en el so
ma se los denomina antgenos O, a los de envol
tura o capsulares, antgenos y a los ciliares, H.

Algunos microorganismos producen sustan

cias que son volcadas al medio externo, de ca
rcter proteico y con marcado poder toxignico
para los animales y el hombre. Esas sustancias,
conocidas con el nombre de exotoxinas, inmu
nizan bien, son antgenos eficaces en pequeas
dosis y pueden ser neutralizados totalm ente
por los anticuerpos que ellos originan. Como
muchas bacterias son productoras de enzimas,
la inoculacin de un caldo de cultivo a un ani
mal puede originar anticuerpos para todos los
antgenos mencionados e incluso para las enzi
mas de referencia. El hecho de que un m i
croorganismo sea un complejo antignico ca
paz de originar anticuerpos para cada uno de
ellos hace que muchas veces no se interpreten
correctamente las reacciones serolgicas, sobre
todo las reacciones cruzadas que ocurren cuan
do se enfrentan sueros inmunes logrados por la
inoculacin de un animal con un microorganis
mo diferente al empleado como antgeno de
reaccin. Estas reacciones pueden ocurrir con
microorganismos que poseen cierto grado de
parentesco y se las observa a veces en especies
de ubicacin totalmente diferente.
No todos los m icroorganism os tienen una
estructura similar. En algunos hay predominio
de componentes protenicos, en tanto que en
otros los hidratos de carbono constituyen los

Antgenos
antgenos que permiten la diferenciacin en ti
pos dentro de una especie, tal el caso de los
neum ococos. D istin to s in v estig ad o res han
abordado el estudio de la estructura qumica de
estos polisacridos, preferentemente por m to
dos que utilizan la metilacin. El polisacrido
del neumococo tipo II contiene 7 partes de 2:4
di-o-m etilram nosa, 2:3 di-o-m etilglucosa, 1
parte de cido 2:3:4 tri-o-metilglucurnico y 2
partes de cido 2:3 di-o-m etilglucurnico, lo
que ha hecho que la estructura del mismo sea
considerada como muy ramificada, con una ca
dena principal de molculas de ramnosa y ca
denas laterales de cido glucurnico y glucosa.
Del neumococo tipo VI se ha aislado un oligo
sacrido cristalino que responde a la estructura
galactosil-(l
3)-glucosil-(l - 3)-ramnosil(1 -> 3)-ribitol.
Sobre la base de ensayos de metilacin y ais
lamiento de oligosacridos, se ha propuesto pa
ra el neumococo tipo VIII una unidad estructu
ral que se repite y que responde al siguiente es
quema:
[-4-|3-D -cido g lu c u r n ic o 1 > 4-3-Dglucosa 1 ^ 4-a-D-glucosa 1 -h >4-a-D-galactosa 1 ^ ] .
En otros microorganismos, como los estrep
tococos, los constituyentes poliosdicos no son
superficiales y perm iten la diferenciacin en
grupos. En los estreptococos del grupo A este
polisacrido es de peso molecular 8 kD y est
compuesto por ramnosa y glucosa en la propor
cin 5 a 2, sin capacidad inmunognica y con
caractersticas de hapteno. De estos microorga
nismos, por extracciones cidas, se han obteni
do antgenos protenicos, tipo especficos, ubi
cados superficialmente, conocidos como M y
T. El primero es una protena soluble en alco
hol, termoestable y rpidamente digerible por
enzimas proteolticas, en tanto que el antgeno
T es insoluble en alcohol, resistente a la diges
tin, termolbil en medio cido, pero muy re
sistente al calentamiento en medio alcalino.
De los estafilococos patgenos y no patge
nos se han aislado polisacridos diferenciales.
Ambos tienen aproximadamente un 4% de ni
trgeno, pero se distinguen por su rotacin p
tica especfica y los tipos de azcares obtenidos
por hidrlisis.
Un constituyente muy particular forma parte
de la cpsula del Bacilus anthracis. Se trata de
un polipptido del D-cido glutmico, form a
no natural del aminocido, hecho que podra
estar relacionado con la virulencia del microor
ganismo.
Un grupo importante de bacterias lo consti
tuyen las salmonelas, de las que se conocen va
rios cientos de especies. La mayora son m vi

59

les y poseen antgenos som ticos y ciliares.

Los antgenos O forman parte del cuerpo celu
lar y se los identifica con nmeros arbigos.
Como las diferentes salmonelas pueden conte
ner uno o ms de esos antgenos, compartidos
por varias especies, han sido subdivididas en
grupos. Los antgenos ciliares pueden ser de
dos tipos, especficos e inespecficos. U na mis
ma salmonela puede presentar las dos varieda
des de antgenos ciliares aunque no sean com
partidos concomitantemente por la especie mi
crobiana. Los antgenos ciliares especficos se
identifican con letras minsculas que van de a
a z, designndose con z y subndices a los des
cubiertos posteriormente. Los inespecficos se
encuentran en menor cantidad.
En la Salm onella typhi se ha identificado
adems un antgeno superficial termolbil, de
nominado Vi. No es un componente exclusivo
de este microorganismo, sino que puede hallar
se en otras salmonelas como la S- paratyphi C,
e incluso en otras enterobacterias no pertene
cientes al gnero Salmonela.
La estructura antignica somtica y ciliar ha
servido para la elaboracin del esquem a de
Kauffmann-White de identificacin de las sal
monelas.
Los estudios qumicos han demostrado que
el antgeno H es una protena fibrosa, del tipo
de la miosina y la queratina. La protena flage
lar purificada, llamada flagelina, de peso m ole
cular 41 kD, no contiene fsforo y s slo tra
zas de lpidos e hidratos de carbono. No contie
ne histidina, triptfano ni hidroxiprolina y slo
pequeas cantidades de cistena. El antgeno O
es un complejo polimolecular formado p o r un
polisacrido especfico, una protena y un fosfolpido. Los anlisis qumicos indican que en
la fraccin hidrocarbonada de las salmonelas y
otras enterobacterias existe un ncleo central
formado por cinco componentes: 2keto-3 deoxi-octonate (KDO), heptosa fosfato, D -gluco
samina, D-galactosa y D-glucosa. Las diferen
tes especies se caracterizan por tener azcares
adicionales que forman cadenas de oligosacri
dos unidos al ncleo central. La Salmonella p a
ratyphi A, que forma parte del grupo A, posee
los antgenos 0: 1, 2 y 12, y el polisacrido
contiene glucosa, galactosa, maosa, ram nosa
y paratosa (3,6-dideoxi-D-glucosa); el antgeno
2 es el caracterstico de este grupo. El polisac
rido de la Salmonella typhi murium, del grupo
B, eon los antgenos 1, 4, 5 y 12, contiene glu
cosa, galactosa, m aosa, ram nosa y abecosa
(3,6-dideoxi-D-galactosa), el que provee las ca
ractersticas al antgeno 4, especfico de este
grupo. En el caso de la Salmonella typhi, perte
neciente al grupo D, la especificidad c o rres
ponde al antgeno 9, que contiene tivelosa (3,6dideoxi-D -m anosa). En otras enterobacterias

60

Aspectos bsicos de ia inmunidad

tambin han sido hallados azicares particula

res, como la colitosa (3,6-dideoxi-Lgalactosa)
en la Escherichia coli.
El antgeno Vi es de naturaleza glucolipdica
y difiere qumicamente del antgeno somtico 0.
Existe un grupo particular de microorganis
mos, denom inados bacilos acidorresistentes,
entre los que se encuentra el M ycobacterium
tuberculosi.'s, ricos en componentes lipdicos.
Por diversos mecanismos se han podido sepa
rar de la bacteria citada tres fracciones, consti
tuidas por glicridos, fosftidos y ceras. Los
fosfolpidos pueden extraerse de los microorga
nismos por tratamiento con alcohol y separar
los por su insolubilidad en acetona. Se ha en
contrado que la parte ms activa de aqullos es
una sustancia fosforada, sin nitrgeno, consti
tuida por cidos grasos, cido ghcerofosfrico
y trazas de inositol. Entre los cidos grasos se
parados del fosfolpido, el principal componen
te es el palmtico, y el oleico entre los no satu
rados. Del bacilo tuberculoso tipo humano se
ha aislado un cido ismero del certico, deno
minado cido phthioico, y de las ceras prove
nientes del mismo bacilo, un cido graso satu
rado denominado cido miclico, que es acidorresistente. Las ceras purificadas de los bacilos
tuberculosos humano y bovino contienen un al
cohol, el phthiocerol, y polisacridos que por
hidrhsis dan diferentes azcares, entre los que
se encuentran la maosa, d-arabinosa y galac
tosa. Ha sido identificado tambin un cido le
vgiro llamado cido mycocertico.
De los bacilos tuberculosos se ha extrado
una cera soluble en cloroformo, la cera D. En
la variedad humana, la misma se encuentra uni

da a una cadena peptdica ausente en los otros

bacilos tuberculosos y los acidorresistentes sa
profticos. Esta cera ha sido fraccionada en un
pptido-glucolipoide, de extraordinaria impor
tancia en la potenciacin de los vehculos oleo
sos con bacilos tuberculosos constitutivos del
llamado adyuvante de Freund completo, activa
dor de la antigenicidad (fig. 4-6).
Adems de los lipoides, se han extrado po
lisidos capaces de interaccionar con sueros
provenientes de enfermos tuberculosos. Consti
tuyen verdaderos haptenos adsorbibles a la su
perficie de hemates, transformndose de esta
m anera en antgenos aglutinables muy tiles
para estudios inmunoserolgicos.
Uno de esos polisacridos, que posee carac
tersticas de hapteno, tiene un peso molecular 9
kD, y est constituido principalmente por ma
osa y arabinosa. Otro polisacrido aislado de
bacilos tuberculosos aviarios tiene un peso mo
lecular prximo a 100 kD y por s solo se com
porta como antgeno. Est constituido por un
poliglucosn que por hidrlisis da nicamente
molculas de D-glucosa.
Como constitutivos de los bacilos tuberculo
sos, se han encontrado tambin protenas, co
nocidas con el nombre de tubereulinas, que son
liberadas en los medios de cultivo por autlisis.
A partir de cultivos en medios sintticos se ha
obtenido un derivado protenico purificado que
se conoce con el nombre de P.P.D. {Protein
Purified Derivative). Por migracin electrofo
rtica, se ha com probado que existen por lo
menos tres protenas diferentes denominadas
A, B y C, de las cuales parecera que A es la
ms efectiva. Estas protenas inducen poca sen-

Mycoloil

[Arabinosa
:Galactosa

:Ac. N-glicolil murmico

O

Lactil
:N-acetilglucosamina o
:N-acetilgalactosamina

o Lactil
:Pptido

F ig. 4-6. Estructura esquem tica de a cera D.

Antgenos
sibilidad tuberculnica, pero puede increm en
tarse si se las inocula mezcladas con ceras pro
venientes de extractos de bacilos tuberculosos,
en especial la cera D. (Para ms detalles sobre
antgenos bacterianos, vase cap. 24.)
Antgenos de rickettsias y virus
Los estudios sobre estructura antignica de
rickettsias slo han adquirido alguna claridad
despus de la obtencin de suspensiones de
aquellas libres de protenas de tejido. Varias de
las rickettsias conocidas dan reacciones cruza
das, como la R. prowazeckii con la R. mooseri.
Se han identificado dos antgenos, uno termol
bil, capaz de ser destruido por calentamiento
durante una hora a 60C, altamente especfico,
y otro termoestable, no especfico, relacionado
con una parcela del constituyente antignico
som tico del P roteus 19, responsable de la
aglutinacin de dichos bacilos por el suero de
enfermos de tifus exantem tico (reaccin de
Weil-Flix).
Si Jos conocimientos sobre estructura antig
nica de rickettsias son poco claros, menos cla
ros aun son los que poseemos sobre los antge
nos virales, y ello est relacionado con su ta
mao, su simplicidad constitucional y su capa
cidad para multiplicarse nicamente en presen
cia de clulas vivas.
En cuanto a su antigenicidad, los virus se pa
recen a las bacterias y en algunos de ellos ha
sido posible demostrar varios antgenos; la es
tructura antignica est frecuentemente sujeta a
variaciones.
E ntre los virus anim ales del grupo ADN,
uno de los que mejor se ha estudiado ha sido el
virus de la vacuna. Inicialmente se describi la
presencia de dos antgenos solubles, uno llama
do L, que se destruye por calentamiento a 56C
durante una hora, y el otro S, que resiste una
hora a 65C. Se crey que ambos antgenos es
taban separados y que el componente S era un
poiisacrido con caractersticas de hapteno.
Actualmente se sabe que son constituyentes de
una misma molcula proteica. En los corpscu
los elementales de la vacuna se han identifica
do adems otros dos antgenos llamados N P o
antgeno nucleoproteico y el antgeno X, que es
un aglutingeno. Un suero inmune animal ad
sorbido con los antgenos SL, N P y X conserva
todava poder aglutinante sobre los corpsculos
elementales y poder neutralizante sobre el vi
rus, lo que est indicando que adems de los
descritos deben existir otros antgenos con las
propiedades indicadas.
Por exmenes serolgicos se han demostrado
relaciones antignicas entre los virus ECHO,
Coxsackie y de la pohomielitis, todos ellos per
tenecientes al grupo ARN. Las cepas del virus

61

de la poliomielitis conocidas hasta el momento

corresponden a tres tipos antignieos diferen
tes, I, II y III, y cualquiera de eUos puede ser
responsable de epidemias.
Los estudios serolgicos acerca del virus de
la influenza, principalmente mediante virus ad
sorbidos sobre hem ates, han dem ostrado la
existencia de dos variedades fundamentales, la
A y la B. En la primera de ellas han sido identi
ficados varios subtipos que difieren e n tre s
respecto de la especificidad dominante.
Ultimamente ha sido muy estudiado el virus
de la hepatitis B (HBV), Es un virus de tipo
ADN, de 42 nm de dimetro, de doble envoltu
ra, inicialm ente conocido com o partcu la de
Dae. Posee un compuesto antignico que for
ma un ncleo o core, de 27 nm de dimetro, y
antgenos de envoltura. Los antgenos del HBV
identificados hasta el momento son:
HBsAg = antgeno de superficie
HBcAg = antgeno del core
HBeAg = antgeno e ntimamente relaciona
do con la infeccin por HBV
El HBsAg posee un componente a, com n a
los diferentes subtipos, y componentes desig
nados como d, y, w, r, que son codificados por
el genoma viral y no por el husped. Los subti
pos principales que resultan de la combinacin
de a con ellos, se comportan como si constitu
yeran dos tipos allicos: d e y por un lado, y
wJ, w2, w3, w4, y r por el otro. Las 10 catego
ras de antgenos de superficie del virus HBV
son las siguientes: ayw l, ayw2, ayw3, ayw4,
ayr, adw2, adw4, adr, adyw y adyr. Tambin
han sido identificados otros antgenos de super
ficie denominados q, x, f t, j, n y g. Hasta estos
mom entos no se conoce claramente qu rela
ciones pueden existir entre stos y los ya co
rrectamente identificados.
Del antgeno e (HBeAg) se conocen dos va
riedades denominadas HBeAg/1 y HBeAg/2.
Los antgenos mencionados son inm unog
nicos y tienen capacidad para engendrar anti
cuerpos especficos (vase cap. 27).
La estructura antignica del HIV o virus del
sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SI
DA) ha sido ampliamente estudiado en los lti
mos aos. Es un retrovirus de la subfamilia de
los lentivirus constituido por ARN, transcripta
sa inversa, protenas estructurales y glucopro
tenas de envoltura. Entre las protenas estruc
turales internas o del core se han identificado
las p24, p25, p l7 y p l5 ; enzimas con actividad
polimerasa como las p66, p51 y p33, y las glu
coprotenas de envoltura g p l2 0 y gp41, entre
otras (vase cap. 27). La g p l20 es la que se une
a la molcula de superficie CD4, presente prin
cipalm ente en los linfocitos T cooperadores.

62

Aspectos bsicos de la inmunidad

cuya infeccin y destruccin inhiben su partici

pacin en los mecanismos inmunolgicos, ori
ginndose como consecuencia una inmunodefi
ciencia.
Los virus productores de enfermedades en
plantas han sido en conjunto los menos estudia
dos, no obstante haber sido uno de ellos, el del
mosaico del tabaco, el primero en ser obtenido
en estado cristalino. Estudios serolgicos efec
tuados con estos virus han demostrado la pre
sencia de componentes comunes responsables
de reacciones cruzadas. Lo mismo puede decir
se sobre los bacterifagos o virus de bacterias,
acerca de los cuales ltimamente se han inten
sificado estudios de este tipo.
Toxinas microbianas
Numerosos microorganismos elaboran sus
tancias difusibles o no en el medio externo y
capaces de provocar, en animales susceptibles,
lesiones o sntomas caractersticos. A las que
difunden en los medios nutricios donde esos
microorganismos son cultivados, se las designa
exotoxinas, mientras que a aquellas que forman
parte del soma microbiano y que slo son libe
radas por autlisis se las denomina endotoxi
nas. Ambas son antignicas, sobre todo las pri
meras, dado su carcter eminentemente protei
co, mientras que las segundas son polimoleculares y forman complejos glcido-lpidoproteicos. Los anticuerpos respectivos las neutralizan
especficam ente y esta caracterstica precisa
mente es la que permite diferenciarlas de otros
venenos qumicos, de los alcaloides, etctera.
Los microorganismos exotxicos ejercen su
accin a distancia por difusin de sus venenos
por va hemtica y linftica. Muchos producen
ms de una toxina, pero por regla general una
es la que posee accin preponderante. Elay co
cos que elaboran exotoxinas, entre ellos los es
tafilococos dorados y los estreptococos hemol
ticos, pero los grmenes toxignicos ms acti
vos son bacilos pertenecientes principalmente
al gnero anaerobio Clostridium.
Algunas exotoxinas, como la tetnica y la
diftrica, han sido altamente purificadas y cris
talizadas. De esta ltima se sabe que su peso
molecular oscila entre 62 y 63 kDa y que tien
de a formar dmeros y agregados de alto peso
m olecular sin prdidas apreciables del efecto
txico. Se conoce tambin parte de su secuen
cia primaria. Posee dos puentes disulfuro que
al ser reducidos con mercaptoetanol y alquila
dos hacen que la molcula pierda algo de su to
xicidad. Si a continuacin la molcula es some
tida a digestin trptica se originan dos ppti
dos, uno correspondiente al fragmento N-terminal (pptido A), de P.M. 23 kD, que se man
tiene soluble en agua, y otro constituido por el

fragmento C-terminal (pptido B), de P.M. 38

kD, que se agrega con mucha facilidad y resul
ta muy difcil recuperarlo en su estado nativo,
lo que dificulta su estudio biolgico. El pptido
A no es txico (fig. 4-7).
Las caractersticas de las endotoxinas extra
das de los distintos microorganismos son muy
parecidas, y en los animales de experim enta
cin producen sintomatologa anloga, caracte
rizada por elevacin trmica, postracin y fe
nmenos hem orragparos viscerales. La pro
duccin de anticuerpos en el hombre y anima
les es escasa o nula. El poder txico es varia
ble, y algunos investigadores han aislado de
salmonelas, especialm ente Salm onella typhi,
glucidolpidos con distintos grados de pureza,
capaces de provocar reacciones febriles en el
ratn blanco con dosis que van de 0,1 ig a
0,005 |ig.
Desde el punto de vista de la antigenicidad,
las ms importantes son las exotoxinas, mien
tras que las endotoxinas no son muy activas y
su poder txico, de muy difcil valoracin bio
lgica, se expresa en miligramos por gramo de
peso animal. Las exotoxinas pueden ser medi
das sin inconvenientes por procedimiento bio
lgico, y se ha establecido al respecto una serie
de unidades.
Dosis mortal mnima (DMM o DLM)
Es la menor cantidad de toxina que inocula
da a un animal sensible le produce la muerte en
un determinado perodo. Esta definicin, para
el caso de la toxina diftrica, tal como lo hizo
Ehrlich, es la siguiente: la menor cantidad de
toxina que inoculada a un cobayo de 250 g de
peso, por va subcutnea, le produce la muerte
a las 96 horas de la inoculacin. Para otras to
xinas vara el animal a inocular y la va de in
troduccin del antgeno. Es preciso respetar es
tas condiciones para que los resultados puedan
ser comparables.
Dosis letal 50 (DL 50)
Es la menor cantidad de toxina que, inocula
da a cada uno de los animales de un lote o gru
po, produce la muerte del 50% de stos en un
perodo determinado. Para el caso de la toxina
diftrica, los animales a emplear son cobayos
de 250 g de peso, la va de inoculacin la sub
cutnea y el tiempo de lectura 96 horas.
Lmite nulo (Lo)
Es la mayor cantidad de toxina que, unida a
una unidad antitxica e inoculada al animal re
ceptivo, no produce sntomas de intoxicacin
en un perodo preestablecido.

Antgenos

63

Lmite muerte ( L+)

Dosis lmite floculante (Lf)

Es la menor cantidad de toxina que, unida a

una unidad antitxica e inoculada por va subcu
tnea, a un cobayo de 250 g de peso, le produce
la muerte a las 96 horas. Esta definicin as ex
presada corresponde a toxina diftrica ya que, si
valoramos toxina tetnica (tetanoespasmina), los
animales a utilizar sern cobayos de 350 g de
peso y la cantidad de antitoxina 0,1 U.A. Para
otras toxinas la cantidades de antitoxinas a em
plear varan; estn especificadas en cada caso y
dependen de la actividad de la toxina. Esta uni
dad es una de las ms utilizadas en la medicin
de actividad de toxinas y antitoxinas.
Como la cantidad de unidades de antitoxina
a utilizar para los diferentes toxinas microbia
nas es U.A./n, los valores de n establecidos son:

Fue establecida inicialmente por Ramn para

la toxina diftrica, y actualmente se la emplea
tambin para la valoracin de otras toxinas. La
unidad de floculacin o Lf es la cantidad de to
xina que, mezclada con una unidad antitxica,
flocula en el menor tiempo, cuando se ha utili
zado para la medicin una serie de mezclas que
co n tien en cantidades variab les de to x in a y
constantes de antitoxina. Al tiempo de flocula
cin se lo denomina Kf y sirve para expresar la
avidez de los sueros o antitoxinas en estudio,
ya que dos antitoxinas diferentes con el mismo
valor de unidades antitxicas pueden provocar
la floculacin y consiguiente neutralizacin de
la toxina en diferentes tiempos. Esto expresa
distinta rapidez en la neutralizacin, fenmeno
que es tenido en cuenta en teraputica.
En el cuadro 4-3 figura una serie com parati
va de las propiedades de las endo y exotoxinas
bacterianas.

U.A.

Antitoxina
D iftrica
Tetnica
Cl. welchii
Cl. septicum
Cl. histolicum
Cl. sordelli
Cl. aedem atiens

10
5
2
1
5
50

0,1
0,2
0,5
1
0,2
0,02

Dosis lmite reaccional (LR)

Esta unidad ha sido definida para la toxina
d ift ric a despus de las o b se rv a c io n e s de
Roemmers sobre el eritema que produca sta
cuando se la inoculaba por va intradrmica y
la inhibicin de este fenmeno por la corres
pondiente antitoxina.
Se la define como la mnima cantidad de to
xina que mezclada con 1/300 de unidad antit
xica e inoculada por va intradrmica en el co
bayo, en un volumen de 0,2 ml, le produce una
lesin cutnea mnima. Inicialmente se us co
mo dosis de antitoxina una unidad antitxica;
actualmente se emplea tal como ha sido defini
da e incluso hay autores que establecen la ca
pacidad reaccional de la toxina frente a 1/250
U.A. o 1/500 U.A.

V enenos de vegetales superiores

De distintos vegetales han sido aisladas sus
tancias txicas con carcter antignico, desta
c n d o se entre ellas la ab rin a, e x tra d a del
A brus precatorius; la crotina, del C roton gliun; la ricina, del Ricinus comunis; la curcina,
del Jatropha curcas, y la robina, de la Robinia
pseudoaccacia. Todas estas sustancias txicas
son de carcter proteico, poseen actividad anti
gnica y son capaces, cuando se las trata por el
formol, de transformarse en toxoides, o sea to
xinas que han perdido su efecto txico, pero
que conservan su funcin antignica.
Algunas de estas fitotoxinas han sido purifi
cadas por cristalizaciones y estudiadas desde el
punto de vista fisicoqumico y biolgico.
De otros vegetales se han aislado algunas he
maglutininas y hemotoxinas, pero por regla ge
nera] no son txicas para el hombre cuando son
ingeridas. Slo las cuatro nombradas en primer
trmino poseen aquella caracterstica.

C uadro 4-3. Caracteres diferencales de las toxinas microbianas

N autraleza qum ica

S olubilidad en cido tricloroactico
Excrecin al m edio de cultivo
Toxicidad
Estabilidad a 80C
Estabilidad a tem peratura am biente
Estabilidad a las radiaciones ultravioleta
A ntigenicidad
C om portam iento frente al aldehido frm ico

Exotoxina.'i

Endctoxincks

Protenas
Insolubles
Son excretadas
M uy txicas (DEM = 0,001 mg)
Inestables
M uy po co estables
Poco estables
M uy antignicas
F orm an toxoides (antignicos y no txicos)

G lucolipoides
Solubles
No son excretadas
Poco txicas (DEM s 0,1 mg)
Estables
Estables
Estables
Poco antignicas
No se convierten en to x o id es

64

Aspectos bsicos de a inmunidad

-Gly-NH3

-OOC - ArgSH
SH

SH

H,N-

SH

i- c o o Pptido B (PM: 38 kD)

-o o c Toxina (PM: 62 kD)

F ig . 4-7. E structura esquem tica de la toxina diftrica y de los pptidos resultantes de la hidrlisis triplica. (Segn A. M.
Pappenheim er, Jr. y D. M ichael Gil. Sciece 182: 353, 1973.)

Venenos de origen animal

Numerosos animales producen secreciones
txicas para el hombre; figuran entre ellos es
pecies de serpientes, escorpiones, araas, sala
mandras e incluso abejas. Los mejor estudiados
han sido los ofidios. Estos venenos son prote
nas antignicas transformables en anavenenos
por accin del formol. Del veneno de la vbora
cobra (Naja flava) se ha aislado una potente
neurotoxina, con un niimero de DMM para el
ratn superior a las 100.000 por gramo de ve
neno. Esta es de bajo peso molecular, entre 2,5
kD y 4 kD, y dializa a travs de membranas de
celofn. Los venenos de estos tipos de vboras
son neurotxicos y hemolticos, pero muy poco
o nada hemorragparos y citolticos. De otros
tip.os de serpientes, entre ellos la cascabel
(Crotalus terrificus), se han aislado protenas
txicas de peso molecular de aproximadamente
30 kD. Del gnero Bothrops, especialmente de
la Bothrops alternata o vbora yarar, se han
obtenido sustancias sum am ente txicas cuya
principal caracterstica, al igual que en el caso
del Crotalus terrificus, es su alto contenido en
azufre. Por habero hallado tambin en el vene
no de escorpiones y de abejas, algunos autores
consideran que todos los venenos o toxinas de
origen animal son ricos en ese elemento.
Los venenos crotlicos, a diferencia de los
de cobra, son poco neurotxicos, pero son he
molticos, coagulantes, muy hemorragparos y
citolticos. Los venenos de escorpiones y algu
nos arcnidos ejercen sobre el hombre una ac
cin muy parecida a la que se ha descrito para
los venenos de serpientes.
La m ayor parte de los venenos anim ales,
tanto los provenientes de serpientes como los
de insectos, deben su accin txica a neurotoxinas, enzimas proteolticas y fosfatidasas, an
tignicas en su mayora.
Antgenos de zooparsitos
H abida cuenta de que en los zooparsitos

existen constituyentes de naturaleza proteica y

glucdica con propiedades antignicas, es lgi
co suponer que en los casos en que aqullos
lleguen a la intimidad de los tejidos, estimula
rn al sistema reticuloendotelial y originarn
anticuerpos.
En algunas parasitosis tales como el paludis
mo y la amebiasis, en los perodos de cronicidad
hay una marcada resistencia a la reinfeccin. En
estos casos no siempre es posible demostrar la
presencia de anticuerpos, pero todo hace supo
ner que esa resistencia es consecuencia de una
refractariedad especfica por inmunidad.
En los parsitos unicelulares, por sus condi
ciones particulares de vida, resulta difcil el
aislamiento de sustancias qumicas especficas,
en tanto que en los pluricelulares, dada su es
tructura compleja, los estudios no son del todo
satisfactorios. Las reacciones inmunoserolgicas ms utilizadas para el diagnstico de estas
parasitosis son las de fijacin del complemen
to, de precipitacin, inm unofluorescencia y
ELISA, principalmente para la identificacin
de protozoarios, no as de vermes. Ello no se
debe a que los primeros tengan antgenos con
mayor poder inmunizante que los segundos, si
no que est relacionado con el hbitat normal
del parsito. Las tenias, scaris, oxiuros, anquilostomas, viven en el intestino y dan pocas m a
nifestaciones serolgicas, a diferencia de lo que
ocurre con las triquinas, leishmanias, tripano
somas, plasmodios, que indudablemente provo
can la formacin de anticuerpos.
Estudios efectuados in vitro con anquilostomas y triquinas demuestran que cuando estos
parsitos vivos se ponen en contacto con sus
respectivos anticuerpos aparecen precipitados
m icroscpicos en form a de burbujas o capu
chones que recubren electivamente los orificios
bucales de las larvas.
Con respecto a la composicin qumica de
los antgenos parasitarios, se han aislado poli
sacridos que dan reacciones especficas con
los sueros de conejos inmunizados con los pa
rsitos de los que provienen. El poiisacrido

Antgenos
del Ascaris lumbricoides y de la mayor parte
de los parsitos es glucgeno, formado por ca
denas de glucosa y muy similar al glucgeno
de los mamferos, aunque de peso m olecular
ms bajo.
Las protenas presentes en los zooparsitos
son poco conocidas porque su estudio no ha si
do encarado a fondo.
En cuanto a los lpidos, son los comunes ha
llados en otras especies animales.
Dado el carcter crnico de las infecciones
parasitarias, el desarrollo de alergia es muy fre
cuente, y puede ser utilizada con fines diagns
ticos si se emplean extractos parasitarios como
antgenos desencadenantes.
Es conveniente recordar que sobre todo en
los cestodes y nematodes, como consecuencia
de la presencia de antgenos de grupo, son co
munes las reacciones cruzadas (vase cap. 26).
De algunos hemoflagelados como el Tripanosoma cruzi, en especial de la forma epimastigote del parsito, obtenida por cultivo en m e
dios bifsicos y rota por compresin y descom
presin, se ha conseguido separar por centrifu
gacin diferencia] distintos componentes rela
cionados con las fracciones nuclear, flagelar,
ribosomal, mitocondrial, etc., que han sido ana
lizadas desde el punto de vista antignico. La
fraccin separable a 1.000 g es rica en ncleos,
flagelos y membranas, las que a su vez pueden
separarse por centrifugacin en gradientes de
densidad de sacarosa; las correspondientes a
11.500 g y 30.000 g estn muy enriquecidas en
membranas mitocondriales, y el sobrenadante
de 105.000 g tiene un alto contenido en prote
nas citoplasmticas. Algunos de esos antgenos
son muy tiles para reacciones serolgicas, co
mo lo es la fraccin soluble de 105.000 g, la
que, por otra parte, ha demostrado carecer de
poder protector en la infeccin experim ental
del ratn. La fraccin flagelar, en cambio, es la
que mejor protege.
En nuestros laboratorios, por tcnicas com
binadas de inm unoqum ica y el uso de an ti
cuerpos monoclonales, ha sido posible separar
componentes antignicos de T. cruzi. Uno de
ellos, el A gl63B 6, constitutivo de la mem bra
na del parsito ha resultado ser muy til para la
elaboracin de reacciones serolgicas de diag
nstico de la enfermedad de Chagas. Presenta
la caracterstica de no dar reacciones de cruce
con componentes de Leishmanias, otro parsito
que pulula en zonas endmicas de tripanoso
miasis americana y que muchas veces puede
confundir el diagnstico (vase cap. 26).
Antgenos especficos de especies y rganos
Cuando un antgeno es propio de una espe
cie y se encuentra en todos sus miembros se

65

dice que es especfico de especie. Inyectados a

especies homlogas no producen anticuerpos,
cosa que ocurre si se inoculan a especies hete
rlogas. En los animales de una misma especie
es p osible encontrar protenas que cum plen
distintas funciones en el organismo, presum i
blem ente con estructuras diferentes, las que
pueden ser diferenciadas serolgicamente. As,
por ejemplo, la hemoglobina del hombre pue
de ser serolgicamente diferenciada de las pro
tenas renales e, incluso, los distintos com po
nentes del plasma sanguneo pueden ser dife
renciados fcilmente por los mtodos inmunoserolgicos. Por otra parte, protenas q u e en
diferentes especies animales cumplen una m is
ma funcin, tenen, por regla general, una es
tructura parecida y por lo comn dan reaccio
nes cruzadas.
Cuando los antgenos son particulares de un
rgano de una especie animal se llaman espe
cficos de rgano, los que a su vez pueden ser
especficos de rgano y de especie, si la espe
cificidad es propia y particular para ambos. El
ejemplo clsico de este tipo de antgenos es la
tiroglobulina. Otras veces la especificidad slo
es de rgano, ya que el mismo antgeno puede
encontrarse en diferentes especies; en estos ca
sos los antgenos son especficos de rganos,
pero heterogenticos. El ejem plo ms re p re
sentativo es la protena del cristalino del ojo,
la que puede hallarse en especies tan diferentes
como el hombre y los peces, con la m ism a es
pecificidad.
E x isten antgenos, en esp ecial p ro ten as,
que cumplen la m ism a funcin en diferentes
especies animales y que poseen gran similitud
en sus estructuras, siendo capaces de dar reac
ciones cruzadas. Un ejem plo de ello son las
insulinas, las que, si bien en un principio se
crey que eran idnticas, difieren entre s por
modificaciones en la secuencia de sus am ino
cidos, de los cuales aproximadamente tres son
los que estn comprometidos. Este tipo de es
pecificidad se conoce con el nombre de fu n cional.
No todas las protenas y clulas de los dis
tin to s anim ales de una m ism a esp ecie son
idnticas, ya que hay posibilidades de diferen
ciaciones serolgicas, las que llevan a la esp e
cificidad individual o alotpiea, a diferencia de
la especificidad de especie o isotpica. Son
ejem plos de estos tipos de especificidad los
antgenos de los diferentes sistemas de los gru
pos sanguneos, ya sean los mucopolisacridos
del sistema ABO, o los constituyentes proteicos
de otros grupos, como los MN. Existen en los
distintos individuos de la misma especie otros
antgenos que se heredan, cuya presencia que
da dem ostrada por la im posibilidad de tra s
plante de tejidos homlogos.

66

Aspectos bsicos de la inmunidad

Antgenos heterfilos
Forssman fue el primero en demostrar la pre
sencia del mismo tipo de antgeno o antgenos
muy similares distribuidos en forma variada en
la naturaleza, los cuales pueden ser com parti
dos por bacterias, hongos, vegetales superiores,
vertebrados, etc. El ms conocido y estudiado
de estos antgenos ha sido el de Forssman. Se
encuentra muy repartido y es posible hallarlo
en distintas bacterias, como las shigelas en su
form a rugosa, los neum ococos, el B a cilu s
anthracis\ se lo encuentra tambin en algunos
parsitos animales, como las triquinas, en algu
nos moluscos y crustceos, en reptiles, en el
caballo, la cabra, el carnero, el cobayo, el ra
tn, el perro, el gato y otros felinos e incluso en
el homljre del grupo sanguneo A.
Forssm an lo describi por prim era vez al
comprobar que conejos inyectados con riones
triturados de cobayo producan anticuerpos lti
cos a alta concentracin para los hemates de
carnero. Si bien a este antgeno se lo ha encon
trado muy distribuido en la naturaleza, el con
cepto primitivo de unidad antignica ha cam
biado, ya que actualmente se considera como
tales a aquellos antgenos que, inoculados a co
nejos, producen lisina para los hemates de car
nero. Estos antgenos son solubles en alcohol,
resisten a la ebullicin y, desde el punto de vis
ta qumico, han sido estudiados por Landstei
ner y Levine, quienes han encontrado un alto
contenido en hidratos de carbono, aproximada
mente 55 a 58%, y un 2 a 3% de nitrgeno. En
tre los azcares obtenidos por hid r lisis se
identificaron hexosaminas.
El concepto de antgeno de Forssman ha sido
sustituido por el de hapteno y se lo concibe,
desde el punto de vista serolgico, como un
conjunto de sustancias similares cuya caracte
rstica particular sera la de producir en el cone
jo hemolisinas para los glbulos rojos de carne
ro. Ese hapteno es de naturaleza glucidolipdica, y la especificidad, atribuible al hidrato de
carbono.
En el curso de algunas enfermedades, como
la mononucleosis infecciosa, es posible encon
trar anticuerpos heterfilos capaces de agluti
nar los hemates de carnero. En un comienzo se
los consider como anticuerpos contra el ant
geno de Forssman, pero trabajos posteriores
han permitido comprobar que actan no slo
sobre constituyentes existentes en el estroma
de los hemates de carnero, sino tambin en los
del ganado vacuno, especie que por otra parte
no posee antgenos de Forssman, lo que est in
dicando diferencias en estos tipos de antgenos.
La identificacin de stos puede hacerse por la
aglutinabilidad de los hemates de carnero y de
vacuno por los anticuerpos de este tipo. Los an-

Cuadro 4-4. Antgenos heterfilos

A glutinacin de hem ates de carnero

Anticuerpos
Forssm an
M ononucleosis
infecciosa
Enferm edad
del suero

Suero
sin
adsorber

Suero
adsorbido
con rin
de cobayo
hervido

+
+

+
-

0+

0 +

Suero
adsorbido
con hem ates
bovinos
h ervidos

ticuerpos anti-Forssman slo aglutinan los he

mates de oveja, no as los de vacuno.
Aquellos pacientes a los que se les han ino
culado dosis repetidas de suero de caballo, pue
den formar anticuerpos capaces de aglutinar a
los hemates de oveja, pero no reaccionan con
los antgenos de Forssman, ni con los hemates
de bovinos. El determinante de la formacin de
estos anticuerpos constituira, pues, otro tipo de
antgeno heterfilo.
Teniendo en cuenta que los anticuerpos antiForssman son adsorbidos por suspensiones de
rin de cobayo, pero no por los hemates bo
vinos; que los anticuerpos de la mononucleosis
infecciosa no son adsorbidos por las suspensio
nes de rin de cobayo, pero s por los hema
tes de bovinos, y que los anticuerpos de la en
fermedad del suero son dbilmente adsorbidos
por las dos suspensiones mencionadas, es posi
ble, por ensayos de aglutinacin frente a hema
tes de carnero, del suero del paciente no adsor
bido y previa adsorcin con rin de cobayo y
hemates bovinos, establecer la identidad del
anticuerpo en estudio (cuadro 4-4).
Otros antgenos compartidos
Existen microorganismos que, sin tener pa
rentesco inmediato de gnero o especie, com
parten determinantes antignicos, lo que hace
que en muchas circunstancias ocurran reaccio
nes cruzadas entre algunos de ellos con los sue
ros de pacientes o animales inmunizados con
los otros microorganismos.
Un caso es el del Proteus OX, cuya variedad
OX 19 posee un antgeno comn con la Pickettsa prowazeckii y \'d Rickettsia ricketsli, y la
variedad OXK posee un antgeno compartido
con la Rickettsia tsutsugamushi. For este m oti
vo, en la reaccin de W eil-Flix se emplean
suspensiones de esos microorganism os como
antgenos para la investigacin de anticuerpos
contra Jas rickettsias nombradas, productoras
del tifus exantemtico, la fiebre manchada de
las Montaas Rocosas y fiebre tsutsugamushi.

Antgenos
El diagnstico preciso de sfilis puede lograr
se cuando se emplea como antgeno el Trepone
ma pallidum, microorganismo no cultivable en
los medios artificiales y slo mantenido viable
por pasajes sucesivos en conejos inoculados por
va testicular. Pero este microorganismo tiene
una protena muy similar a otra protena aislada
de un treponem a cultivable, el treponem a de
Reiter, con la que comparte determinantes anti
gnicos. Con esta protena aislada puede efec
tuarse una serorreaccin de fijacin del comple
mento para el diagnstico de certeza de la sfilis.
Compartir antgenos por algunos microorga
nismos y antgenos constitutivos de clulas o te
jidos en el hombre no siempre es beneficioso;
tal el caso de los dextranos y polisacridos de
algunos neumococos, como los del tipo II, XII y
XX. Personas que como consecuencia de infec
ciones por estos microorganismos han formado
anticuerpos contra sus polisidos, pueden sufrir
accidentes graves (choque anafilctico) al ser
trasfundidos con soluciones de dextranos.
Tambin se ha observado que el neumococo
tipo XIV posee un polisacrido cuya estructura
antignica es compartida al menos por dos hi
dratos de carbono de los isoantgenos sangu
neos hum anos A, B y 0. Existen num erosos
ejemplos similares a los anteriores, lo que nos
muestra la caprichosa distribucin en la natura
leza de ciertos constituyentes,que, por el hecho
de compartir determinantes antignicos, al inmunizai' sensibilizan para ambos antgenos, cu
yo resultado puede ser til en algunos casos o
francamente desfavorable como acabamos de
ver.
C onstituyentes antignicos de los glbulos
rojos hum anos
Las comprobaciones efectuadas inicialmente
por Landsteiner y completadas luego por nu
merosos investigadores, con respecto a la pre
sencia en h em ates hum an o s de d ife re n te s
constituyentes antignicos, han permitido subdividir a aqullos en distintos sistemas, llam a
dos ABO, MN, S, P, Rh, etc., los que a su vez,
de acuerdo con subgrupos y frecuencia, han
llevado al encasillamiento del hombre en dife
rentes grupos sanguneos. Como todos estos
factores son hereditarios y cumplen las leyes
mendelianas, la im portancia de su estudio en
medicina legal, antropologa, etc., es de valor
significativo.
De todos estos constituyentes antignicos,
los mejor estudiados en lo relativo a su compo
sicin qumica son los del sistema ABO.
Desde el punto de vista gentico se ha pro
puesto la existencia de tres genes allicos. A, B
y O, siendo A y B dominantes respecto de 0.
Los genes A y B rigen la formacin de las sus

67

tancias A y B, en tanto que el O no dirige la sn

tesis de ningn isoantgeno.
No obstante, las clulas O tienen un antgeno
que ha sido reconocido por sueros normales de
algunos animales -e n especial los provenientes
de terneras y anguilas-, sueros de cabra antishigela y algunas protenas de origen vegetal.
Como el antgeno de las clulas O no slo est
presente en el hombre sino tambin en algunos
anim ales, es heterogentico; de ah que se lo
llame sustancia H. Esta no puede ser conside
rada como producto del gene O, ya que es posi
ble, con sueros anti-H, obtener aglutinaciones
positivas de glbulos A (homocigotas) y AB.
Siendo el hombre diploide, homocigota o he
terocigota, los dos alelos por individuo pueden
dar lugar a seis genotipos y cuatro fenotipos.
Las sustancias de los grupos sanguneos A, B
y O no han podido obtenerse puras o serolgicamente muy activas a partir de los hemates hu
manos; pero de tejidos y secreciones animales e
incluso de secreciones humanas ha sido posible
su extraccin en estado de relativa pureza.
Sustancias del grupo A se obtuvieron de peptonas comerciales, mucosa de estmago de cer
do, del cuarto estmago de la vaca, de la saliva
hum ana y otros materiales. De estm agos de
cerdos se han aislado sustancias A, B y sustan
cia con especificidad para el grupo O (H ), al
igual que de estmagos de bovinos y de algunas
plantas. Cabe sealar que no siempre los pro
ductos extrados como sustancia A de diferentes
materiales eran activos, no obstante la similitud,
en algunos casos, de su contenido en hexosamias, azcares reductores, acetilo, nitrgeno, vis
cosidad relativa, etc. Las denominadas sustan
cia A aisladas de materiales de origen humano
por diferentes autores, si bien son semejantes en
cuanto a su peso molecular y ciertas propieda
des fsicas y qumicas, algunas son dextrgiras
y otras tienen poder levorrotatorio.
La sustancia A aislada de diferentes anim a
les tiene mucha similitud con la de origen hu
mano; no obstante, en algunos casos, sobre to
do cuando se efectan estudios m ediante las
tcnicas del bloqueo o inhibicin de la hem oa
glutinacin, se observan diferencias.
Las sustancias de los grupos sanguneos A,
B y O (H) reaccionan con suero antineumoccico tipo XIV, debido muy prob ab lem en te al
contenido de glucosa en todas ellas. La distinta
especificidad de aqullas indudablem ente es
debida a otras diferencias estructurales. Todas
son polisacridos que, inyectados en estado de
pureza a conejos, no producen anticuerpos y
slo lo hacen si previamente son trasformados
en antgenos completos por complejacin con
protenas, preferentemente las de Shigella dy~
senteriae. Inoculadas al hombre en estado de
pureza, tal como se obtienen, por extraccin fe-

Aspectos bsicos de la inmunidad

68

C u ad ro 4-5. Los antgenos ms importantes

de los diferentes sistemas de los glbulos rojos
humanos

C u ad ro 4-5. (Continuacin)
SISTEM A Rh
A glutingenos

Sistem a ABO
Progenitores

G enotipo

Fenotipo

A A x AA
A A x AB

AA
AA
AB
AA
AO
AB
AB
AO
AO
AA
BB
AB
AA
AO
AB
BO
BB
AB
BB
BO
AB
AO
AO
BO
AA
00
AO
AB
BO
00
AO
BO
AB
00
AO
BB
BB
BO
BO
BB
00
BO
00
BO
00

A
A
AB
A
A*
AB
AB
A*
A*
A
B
AB
A
A*
AB
B*
B
AB
B
B*
AB
A*
A*
B*
A
0
A*
AB
B*
0
A*
B*
AB
0
A*
B
B
B*
B*
B
0
B*
0
B*
0

AA

AO

A A xBB
AA X BO
AA X 00
A B xA B

A BxA O

A BxBB
AB x B O

A B xO O
A O x AO

AO X BB
A O xB O

AO

00

BBxB B
BB x B O
BB X 00
BOX BO

BOX 00
00x00

L os g rupos san g u n eo s A y B m arc ad o s con * son h ete ro cig o lo s.

E n cl c u a d ro slo se in d ica el gru p o A y n o sus su b tip o s A , y A j

nlico-alcohlica a partir de estmagos de cer

do, producen aumento de los anticuerpos co
rrespondientes, lo que dem uestra el distinto
comportamiento en uno y otro caso. Hay auto
res que sostienen que ello se debe a que, como
en el hombre ya existen anticuerpos contra las
mismas, al penetrar y combinarse con dichos
anticuerpos, dado su carcter proteico, haran
que los productos de combinacin fueran verda
deros antgenos y actuaran como estimulantes.
A aquellos individuos en cuyos fluidos exis
tan las sustancias A, B o O (H) se los denomina

Nom enclatura
de Fisher-Race

N om enclatura
de W iener

(lee
dCe
dCe
dcE
dCE
Dce
DCe
DCe
D cE
D CE
D"ce
D Ce
D cE
IDCE

rh
rh'
rh'
rh "
rhv
Rh
Rh,
R h ,
Rhj
Rhj
Rh
Rh,
RH,
RH,

O tros sistem as
MN

Ss

P
Lutheran
Kell
Lewis
D uffy
Kidd

Fenotipo
M
N
MN
S
s
Ss
P,
P,
P
Lu
L u
K+
KLe>
Le"
Fyo
Fy"
Jk
Jk"

secretores, dndose el nombre de no secretores

a quienes carecen de ellas. Esta propiedad no
es exclusiva de las sustancias A, B y O (H), si
no que tam bin parece estar relacionada con
otros constituyentes de los glbulos rojos, co
mo el Lewis Le'*,
Las sustancias de los grupos sanguneos que
se encuentran en gran cantidad, principalmente
en los fluidos de los quistes de ovario, estn
constituidas aproximadamente por un 25% de
aminocidos y 75% de polisacridos. Tanto las
de origen humano como animal contienen ga
lactosa, fucosa, n-acetil galactosamina y nacetil
glucosamina.
Los aminocidos presentes parecen no tener
mucha significacin en cuanto a la especifici
dad del producto. Ella se modifica por hidrli
sis ligeras que no remueven los aminocidos

Antgenos

Sustancia H

Sustancia A

69

Sustancia B

N-acetilgalactosamina

N-acetilglucosamina

D-galactosa

L-fucosa

Fig. 4-8. R epresentacin esquem tica de las estructuras qum icas de las sustancias H , A y B y sus relaciones.

presentes, pero s producen alteraciones del hi

drato de carbono.
Trabajando con extractos de Triciomonas
foetus, ricos en enzimas contra las sustancias
A, B y O (H), se demostr que algunos glcidos
simples pueden actuar como inhibidores. La fucosa actiia como inhibidora de la sustancia O
(H), la n-acetil D-galactosamina inhibe la des
truccin de la sustancia A, y la D-galactosa la
de la sustancia B.
Los monosacridos indicados son en reali
dad los azcares terminales no reductores cons
tituyentes de los polisidos responsables de la
especificidad. Con respecto a la sustancia B se
cree que no es exactamente la D-galactosa, si
no la 6-acetil glucosamina. Por la potencia de
la respuesta en los ensayos de inhibicin, se es
tima que la parte activa son los polisacridos y
que los aminocidos hallados son secundarios.
Todo hace suponer que la sustancia H es ela
borada por un gene H distinto de los genes al
licos ABO. A qulla constituira un precursor
m acrom olecular sobre el que se fijaran los

grupos determinantes de la especificidad de las

sustancias A y B. En los casos de grupo O, al
no actuar como soporte de grupos activos, que
dara expuesta y podra expresarse como recep
tor especfico (fig. 4-8 y cuadro 4-5).
Existen otras sustancias de grupos san g u
neos relacionadas con el sistema ABO: los fac
tores Lewis Le.j y Le,^. El primero de ellos se
encuentra en la saliva de la mayora de los no
secretores A, B y O (H). Son glucolpidos no
sintetizados in situ sino adquiridos del plasma,
donde son transportados por lipoproteinas. El
mecanismo de fijacin a la superficie de los he
mates es desconocido, se ignora si existen re
ceptores especficos o slo se encuentran ad
sorbidos.
Con respecto a otros constituyentes antigni
cos de los hemates, como los M y N, poco es
lo que se conoce sobre su naturaleza qum ica y
parecen localizarse exclusivamente en los he
mates. Se sabe que son glucoprotenas y que la
especificidad estara relacionada con la existen
cia de pequeos oligosacridos; la galactosa es

70

Aspectos bsicos de la Inmunidad

el carbohidrato predominante. Desde el punto

de vista fsico, difieren de los A, B, O (H) en su
solubilidad y extractibilidad.
Sobre los antgenos S, P, Rh y otros menos
significativos, se conoce bastante sobre su po
der inm unognico, herencia, im portancia en
medicina legal y antropolgica, pero se conoce
poco de su estructura qumica. De los antge
nos Rh se sabe que su sntesis est dirigida por
tres pares de alelos, Cc, Dd y Ee. Segn las ca
ractersticas de homocigotas o heterocigotas de
los progenitores, surgen los genotipos y fenoti
pos de los distintos individuos (cuadro 4-5).
El nmero de determinantes o receptores an
tignicos en la superficie de los hemates no es
el mismo para los diferentes sistemas. Para el
ABO se estim a en 800.000 y para el Rh en
30.000. Para otros sistemas su nmero es aun

Lo.s antgenos de
histocompatibilidad
La identidad o no identidad entre los antge
nos de histocom patibilidad del husped y los
de un tejido u rgano trasplantado es lo que de
termina su aceptacin o rechazo. Son antgenos
de superficie y en el hombre han sido detecta
dos en los diferentes tipos de clulas, incluidos
los linfocitos. Su presencia no ha sido demos
trada en eritrocitos y espermatozoides.
Estos antgenos, insertados en la bicapa lip
dica de la membrana celular, son de diferentes
tipos. Los del hombre son codificados por ge
nes ubicados en el cromosoma 6 y forman par
te del complejo mayor de histocompatibilidad
(antgenos HLA). Los de clase I estn consti
tuidos por dos cadenas peptdicas, de P.M. 12
kD y 43 kD, respectivamente. La ltima contie
ne hidratos de carbono, no as la de P.M. bajo
que ha sido identificada como la p2 microglo
bulina, protena cuya presencia en la orina de
pacientes con tubulopatas ha sido establecida
hace tiempo.
Los antgenos de clase II estn constituidos
por dos cadenas peptdicas de P.M. 28 kD y 33
kD.
En los captulos 12 y 20 se encontrar infor
macin detallada sobre las principales caracte
rsticas de esos antgenos.
M itgenos y superantgenos
A diferencia de lo que ocurre con los ant
genos, que activan a los linfocitos interaccionando a travs de receptores especficos, los
mitgenos son capaces de inducir divisin de
linfocitos T y B en forma no especfica. Algu
nos de ellos son efectivos sobre clulas B,
otros sobre clulas T o ambas. Son activado

res policlonales pues inducen al mismo tiem

po la proliferacin de clulas provenientes de
diferentes clones. Entre los mitgenos se en
cuentran las leetinas, como la concanavalina
A (Con A) y la fitohemaglutinina (PHA), pro
tenas con actividad mitognica sobre los lin
focitos T, con capacidad para unirse a grupos
de carbohidratos distintos. Ello les permite in
teraccionar con glucoprotens de membranas
iniciando la transduccin de seales y activa
cin celular.
La Con A es un tetrmero que fija hidratos
de carbono que contienen grupos a-D maosa
o a-D glucosa terminales o grupos relaciona
dos. Otras leetinas tienen capacidad para unirse
a otros azcares.
Los lipopolisacridos bacterianos (LPS) ob
tenidos de la pared celular de bacterias Gram
negativas son activos mitgenos de linfocitos B
y su efecto se ejerce por interaccin del lpido
A, uno de sus constituyentes, con componentes
de la membrana plasmtica.
Hay mitgenos capaces de activar los hnfo
citos T y B; uno de ellos es el extrado de la
hierba carmn o pokeweed (PWM).
En los ltimos aos se han descrito antge
nos exgenos de origen bacteriano, en especial
la enterotoxina de Staphylococcus aureus, y de
otros m icroorganism os como Streptococcus,
Micoplasma, que para inducir una respuesta in
m une especfica no necesitan procesam iento
previo y su degradacin a pptidos para su pre
sentacin por los antgenos del CMH-II al re
ceptor de los linfocitos T (RCT) (vase cap. 2).
Tienen capacidad para activar clulas T que ex
presan secuencias comunes en sus RCT, inde
pendientemente de la efectividad por el com
plejo pptido-CMH. Dada esta peculiaridad se
los denom ina superantgenos. En el ratn se
han demostrado que los antgenos endgenos
M is, al igual que algunos antgenos virales,
presentan tambin esta caracterstica.
Los superantgenos son activos mitgenos;
la mayor parte son protenas bsicas pequeas
de 20-30 kD y para inducir una respuesta se
unen a la parte lateral de los antgenos del
CMH-II, que no es la convencional. Su unin
al RCT no se efecta a travs del complejo po
lim o rfo c o d ific a d o p o r lo s g e n es V a JaVpD(3jp, o sitio de unin al antgeno, sino
que se une lateralmente a determinadas secuen
cias codificadas por genes V|3 (fig, 4-9), Este
puente de unin que se crea entre el CMH-II y
el RCT es el que provoca la agregacin del re
ceptor y la activacin celular,
A diferencia de lo que ocurre con los antge
nos convencionales donde el reconocim iento
por el linfocit T est restringido a pptidos del
antgeno procesado asociados a antgenos el
CM H-II propios, para los superantgenos no

Antgenos
existe tal restriccin; pueden ser presentados
por antgenos CMH-II alogeneicos y sin nece
sidad de procesado previo por las clalas pre
sentadoras del antgeno.
Aproximadamente 1/10-^ a 1/10 de la pobla
cin total de linfocitos responden al estmulo
de un antgeno dado. Teniendo en cuenta que
en el ratn el nmero de genes V[3 identifica
dos es 20 y en el hombre 50, y asumiendo que
todos los genes se expresaran con igual fre
cuencia, sera lgico esperar que 1/20 a 1/50 de
la poblacin de linfocitos T interaccionen con
un determ inado superantgeno. Sin embargo
ese nmero es 4-5 veces menor porque los superantgenos no a reconocen los productos co
dificados por todos los genes V(3, sino a algu
nos de ellos. Este elevado nmero de clulas
que se activan producen una exagerada sntesis
de citoquinas las que son responsables, en gran
parte, del shock txico que se produce en es
tos casos.
A NLISIS ANTIGNICO
Su empleo en bacteriologa, micologa, viro
loga, hematologa y aun en gentica es muy
til y frecuente, ya que mediante l se puede
llegar a demostrar diferencias entre microorga
nismos, clulas o protenas que por otros m
todos hubiese sido imposible. Consiste en esta
blecer, utilizando antisueros especficos m ono
valentes, cules son los constituyentes antignicos del agente en estudio. Claro est que en
cada caso ser necesario disponer de reactivos
obtenidos con el mximo de garanta, pues ad
sorciones insuficientes o inadecuadas, o inm u
nizaciones incorrectas de los animales de ex
perim entacin, pueden llevar a confusiones.
En la actualidad el uso de anticuerpos mono
clonales ha resuelto muchos de esos inconve
nientes.
Gran parte del adelanto de la microbiologa,
de la inm unologa aplicada, de la serologa
diagnstica y del esclarecim iento de nuestra
ignorancia sobre problemas transfusionales y
de incom patibihdad maternofetal, se deben a
que, mediante correctos anlisis antignieos,
han podido establecerse relaciones entre entes
que no se supona em parentados. El conoci
miento de la composicin antignica correcta
y completa de muchos microorganismos, como
el complejo grupo de la familia de las Enterobacteriaceae, ha p erm itid o seleccio n ar los
reactivos adecuados para un diagnstico de
certeza y muchas veces una correcta teraputi
ca, as como, en stos y otros casos, establecer
las caractersticas de una bacteria que permiten
utilizarla en la preparacin de una vacuna.

71

DEM OSTRACION
DE LA A N TIG EN IC ID A D
Cuando un vertebrado adulto es inoculado
con una sustancia extraa, si sta posee cap a
cidad inmunognica pondr en marcha los m e
c an ism o s que e n g e n d ra rn la re s p u e sta al
agente agresor real o potencial.
Cmo puede ponerse en evidencia esa trasformacin? Ello puede lograrse por la investi
gacin en la sangre circulante de los agentes
inmunolgicos, los anticuerpos; o mediante la
inoculacin de una nueva dosis de antgeno y
la investigacin de la modificacin de la cap a
cidad reactiva normal de los tejidos, si es que
el mismo rene las condiciones necesarias.
En el primer caso el nivel de los anticuerpos
form ados puede establecerse por d iferentes
mecanismos, ya sea por precipitacin especfi
ca en medios lquidos o gelosados; por dosaje
del complemento consumido, en especial con
lecturas del 50%de hemlisis; por hem oagluti
nacin pasiva; por radioinmunoanlisis (RIA);
inm unofluorescencia (IF); enzim oinm unoan
lisis (ELISA), o bien por cuak]uier otro m eca
nism o inm unolgico que perm ita evidenciar
anticuerpos en sangre.
La investigacin de la capacidad reactiva al
terada de los tejidos puede efectuarse ex p eri
mentalm ente por anafilaxia activa, anafilaxia
pasiva o anafilaxia cutnea pasiva. Todos estos
mecanism os se describen en los captulos 11
y 13.
Como algunos antgenos tienen capacidad
para estim ular una respuesta inmune m ediada
por clulas, ms que por anticuerpos, en casos
particulares la inmunogenicidad de una sustan
cia debe ser investigada mediante el empleo de
mtodos inmunolgicos destinados a detectar
la inmunidad celular (vanse caps. 13 y 36).

D IN M IC A DE LO S A NTG EN OS
La accin de los antgenos, su dinm ica,
puede demostrarse de diferentes maneras. La
anafilaxia activa y pasiva ha aportado datos de
valor sobre el particular. Estando dicha dinm i
ca establecida por la intensidad de la pro d u c
cin de anticuerpos, slo las dos primeras eta
pas de la anafilaxia, la sensibilizacin y la fase
de incubacin, sirven para ponerla de m anifies
to, ya que en el desencadenamiento de la reac
cin alrgica intervienen otros factores ajenos a
la interaccin antgeno-anticuerpo que no son
especficos y ponderables en la determinacin
de la antigenicidad. Cuando un animal es in o
culado con un antgeno y se sensibiliza, indica
que ha elaborado anticuerpos, y el tiempo de

72

Aspectos bsicos de la inmunidad

Linfocito Th

CDS

RCT

Fiia

F ig . 4 -9 . M ecan ism o de in te ra c
ci n d e un s u p e ra n tg e n o co n el
C M H y el RCT. H ay una unin la
teral con el CM H y con estructuras
codificadas por V p en el RCT, am
bas por fuera de las zonas a las que
.se unen los antgenos convenciona
les. C o m p rese eo n la fig u ra 2-7,
captulo 2.

Ciuia presentadora de Ag

latencia mnimo mide el lapso necesario para

desencadenar el choque anafilctico, cuando se
inocule la segunda dosis.
Si la determinacin de la actividad la haceinos en la priinera etapa, la evaluacin se hace
por la dosis de antgeno capaz de sensibilizar,
en tanto que en la segunda se mide por el tiem
po m nim o necesario para d esen cad en ar la
reaccin. Indudablem ente que esto es vlido
para aquellas respuestas inm unes que cursan
con formacin de anticuerpos homocitotpicos,
pero no para los que carecen de esa propiedad.
Si bien este mtodo fue muy usado en un co
mienzo para estudiar la inmunogenicidad, en la
actualidad, el desarrollo de una m etodologa
muy sensible para el dosaje de anticuerpos, co
mo lo son la hemoaglutinacin pasiva de Boyden, la inmunofluorescencia, la inmunoenzimo
loga, el empleo de radioistopos, y muy espe
cialmente la determinacin del ntimero de clu
las linfoides formadoras de placas de hemlisis,
etc., permiten evaluar la actividad de los antge
nos sin recurrir al estudio de la anafilaxia; esto
es muy iinportante sobre todo para los antge
nos o conjuntos antignicos de gran tamao, co
mo las bacterias, los hemates y las clulas.
A dyuvantes y exaltacin de la antigenicidad
Si bien mediante estmulos a repeticin pue
de mejorarse la respuesta inmune como conse
cuencia de la capacidad adyuvante intrnseca
que tienen algunos antgenos, en otros casos se
consigue una exaltacin de su inm unogenici
dad aadindoles productos con capacidad ad
yuvante extrnseca, los que pueden convertir
en inmunognicas a sustancias que no lo son, o

hacer que antgenos dbiles induzcan una ade

cuada respuesta inmune. Estos productos se co
nocen con el nombre genrico de adyuvantes,
los que pueden ser antignicos o no. Entre los
primeros se encuentran los bacilos acidorresistentes, bacterias gramnegativas y sus endotoxi
nas, la Bordetella pertussis, los anticuerpos, la
fitoheinaglutinina, etc. Los no antignicos pue
den tener distinto origen, como el hidrxido de
aluminio, el alumbre, el fosfato de calcio, la
protamina-cinc, la tapioca, la lanolina, aceites
minerales, agentes tensioactivos, etctera.
No todos los adyuvantes acttian de la misma
manera, ya que algunos exaltan la respuesta in
mune humoral y otros la mediada por clulas.
Se considera que los macrfagos, los linfoci
tos B y los hnfocitos T son las clulas que par
ticipan en la exaltacin de la antigenicidad. Los
antgenos particulados o solubles transform a
dos en particulados por accin de un adyuvante
seran procesados por los macrfagos, los que
im pediran su fuga y facilitaran su presenta
cin a las clulas inm unocompetentes, m ejo
rando de este modo la respuesta. Para algunos
de los adyuvantes parecera necesitarse la parti
cipacin de los linfocitos T y B en la exaltacin
de la respuesta inmune humoral. Experimental
mente se ha comprobado que hay adyuvantes
que no aumentan la produccin de anticuerpos
en animales depletados en clulas T; otros en
cambio parecen actuar directamente sobre las
clulas B, ejerciendo sobre las tnismas un efec
to mitognico. La dosis de antgeno influye en
estos casos, ya que se ha observado una menor
dependencia T cuando la cantidad de inmun
geno inoculada es grande. El requerimiento de
clulas T o B ha sido estimado experimental

Antgenos
mente sobre la base de la influencia del adyu
vante en la produccin, por parte del husped,
de anticuerpos de tipo IgM o IgG. Como se sa
be, los primeros no son T dependientes, y s lo
son los segundos.
Varios son los mecanismos por los cuales los
adyuvantes pueden ejercer su efecto. Este pue
de deberse a una liberacin lenta y gradual del
antgeno cuando se encuentra adsorbido a geles
coloidales como el hidrxido de aluminio, fos
fato de calcio, etctera, o emulsionado en veh
culos oleosos. La vida media del antgeno au
menta, con prolongacin de su capacidad estim ulativa, lo que asegura una m ayor y m s
efectiva produccin de anticuerpos.
Otro hecho que asegura una mejor respuesta
inmune es la acumulacin de clulas inmunocompetentes en los rganos linfoides estimula
dos por el antgeno, el que se produce a expen
sas de las clulas circulantes. La mayor parte
de los adyuvantes inducen este fenmeno y al
gunos de ellos -especialm ente el adyuvante de
Freund completo constituido por un vehculo
oleoso adicionado de b acilo s tu b ercu lo so s
m uertos- producen un granuloma en el punto
de inoculacin, donde se observa acumulacin
de macrfagos y linfocitos, los que de este m o
do estn ms expuestos a la accin del inm un
geno. Este fenmeno es ms evidente para los
antgenos particulados, con adyuvancia intrn
seca, y para los de alto peso molecular adsorbi
dos o emulsionados. El secuestro de clulas de
la circulacin y su reclutam iento en rganos
linfoides se logra con adyuvantes no inmunognicos, y este efecto es ms duradero que el
producido directamente por los antgenos. A de
ms, el sitio de acumulacin de clulas linfoi
des depende de la va de inoculacin del ant
geno; el bazo es el destinatario si la inyeccin
se hizo por va venosa o intraperitoneal, y el
ndulo linftico drenante si se us la va subcu
tnea. Parecera que este reclutamiento de clu
las inmunocompetentes sera indispensable pa
ra iniciar la respuesta inmune, y que la funcin
de los adyuvantes sera la de exaltarla.
Hay adyuvantes que actuaran activando a
los macrfagos, los que por intermedio de la
interleuquina 1 (IL-1) sintetizada estimularan
a los linfocitos y facilitaran su respuesta. Otros
en cambio estimularan directamente la prolife
racin y diferenciacin celular. Algunos, como
los lipopolisacridos, son mitgenos selectivos
de los linfocitos B, mientras que otros, como la
vitamina A, lo hacen directamente sobre las c
lulas T. Podran actuar tambin modificando la
permeabilidad de la membrana citoplasmtica
de los linfocitos facilitando la captacin del an
tgeno.
Se considera que ciertos adyuvantes pueden
ejercer su accin variando la cintica de la

73

reaccin inmune humoral y celular, interfirien

do en la regulacin de la sntesis de los anti
cuerpos de tipo IgM, estimulando la adenilci
clasa con aumento de AMP cclico, el que par
ticipa en la regulacin de la sntesis de cidos
nucleicos y proliferacin celular, etctera.
M ediante la participacin de uno o varios de
los mecanism os m encionados los adyuvantes
exaltan la inmunogenicidad, haciendo que ant
genos dbiles se transformen en buenos induc
tores de la respuesta inmune.
En los ltimos aos se ha aislado un pptido
de la pared celular de las bacterias que forman
parte del adyuvante de Freund completo, que
luego fue sintetizado. Es el A^-acetilmuramil-Lalanil-D-isoglutamina, al que se lo designa muramil dipptido (MDP), y constituye la copia
de un fragmento del peptidoglicano bacteriano.
Este producto y otros derivados han dem ostra
do poseer un notable poder adyuvante y ser
moduladores activos de la respuesta inmune.
O tra manera de conseguir inmunopotenciacin es incorporando los antgenos proteicos en
vesculas lipdicas o liposomas y en los llam a
dos complejos lipoflicos inmunomoduladores
(ISCOMs), usando como intermediarios deter
gentes o saponina, los que luego son. elim ina
dos. Los liposomas se preparan mezclando, en
determinadas condiciones, la protena antigni
ca con fosfolpidos. Se forman vesculas rodea
das por una bicapa en la que se incorporan las
protenas, las que orientan sus residuos hidroflicos hacia la fase acuosa y los hidrofbicos ha
cia el centro de la vescula. Los ISCOMs resul
tan de la interaccin entre colesterol, Quil A y
residuos hidrofbicos de las protenas a incor
porar como inmungenos. Dado que el Q uil A
es una m ezcla de varias saponinas, distintas
partidas de Quil A pueden incidir en la obten
cin de ISCOMs inmunognicos.
Los ISCOMs tienen capacidad para inducir
la formacin de anticuerpos y de activar linfo
citos Te especficos, as como de Th.
Para la formacin de los ISCOMs las prote
nas a incorporar deben tener restos hidrofbi
cos. Es por ello que las protenas liberadas de
membrana, que contienen un fragmento trans
membrnico de naturaleza hidrofbica, form an
buenos ISCOMs. Tambin han resultado efec
tivas protenas modificadas por tratamiento con
cido palmtico, el que es fijado covalentemen
te. Por este procedimiento protenas no hid ro
fbicas como ovoalbmina y seroalbmina bo
vina, pueden originar ISCOMs inmunognicos.
Los ISCOMs pueden ser usados como inm u
ngenos por va parenteral y oral, con buenos
resultados. En el ltim o caso inducen buena
respuesta de IgA.
En los liposomas e ISCOMS las protenas
incorporadas se expresan como inm ungenos

74

Aspectos bsicos de la inmunidad

multivalentes. Estos adyuvantes han comenza

do a usarse en la inmunizacin humana, sobre
todo en la formulacin de vacunas que usan
pptidos como inmungenos, los que por s so
los, en su mayora, son poco efectivos.
Tiem po de perm anencia de los antgenos
La mayora de los investigadores adm iten
que los antgenos permanecen un tiempo relati
vamente corto en el organismo y se metabolizaran de la mism a m anera que lo hacen las
restantes protenas que llegan al organism o.
Otros han podido dem ostrar, trabajando con
azoprotenas y protenas unidas a haptenos
marcados con '^'I, ^C, ^S o
su permanen
cia por tiempo prolongado en el organismo ino
culado. Es de hacer notar que en estas investi
gaciones se ha demostrado, en clulas obteni
das de bazo, radiactividad correspondiente a
1.000 molculas de antgeno por clula, cinco
meses despus de la inoculacin, y que se redu
ca a 100 a los ocho o nueve meses. Estas expe
riencias m uestran la perm anencia por cierto
tiempo de materiales antignieos marcados, no
as la totalidad del antgeno. Es probable que el
material proteico, que acta como transporta
dor no especfico, experimente la degradacin
que normalmente ocurre en esas sustancias. La
posibilidad de que la radiactividad detectada
sea consecuencia de productos de radilisis no
puede ser descartada.
Investigaciones recientes han dem ostrado
que las clulas dendrticas localizadas en el ba
zo retienen antgeno sin procesar, fijado a su
mem brana, por largos perodos. E ste hecho
cumplira un papel muy importante en el man
tenimiento de la memoria inmunolgica; esos
antgenos seran los que estimularan en forma
repetida a los linfocitos que cumplen esa fun
cin, asegurando la presencia de clulas capa
ces de reaccionar con sus antgenos especficos
por largos perodos.
Cabe sealar que lo expuesto corresponde a
antgenos proteicos, ya que los de naturaleza
poliosdica, que se degradan con dificultad,
permanecen en el organismo del husped por
largos perodos. Esta eliminacin lenta puede
producir acumulacin, la que a su vez puede
dar lugar a una parlisis inmunolgica con au
sencia de respuesta inmune (vase cap. 15).
B IB L IO G R A FA
A lien, P. M.; A ntigen processing at the m olecular level .
Im m unology Today <S: 210-213, 1987.

B en jam in y col.: T h e an tig en ic stru ctu re o f p ro tein s: a

reappraisal. En: A n n Rev Im m unol (W E Paul, C G arrison
Fathm an, H M etzger, Eds), 67-102, 1984.
Berzofsky, J. A. & Berkow er, I. J.: Im m unogenicity and
an tig en s tru c tu re . En F u n d a m en ta l Im m u n o lo g y (W .
Paul, Ed.) Cap. 8, 1993, 3" ed. R aven Press.
C iba F oundation Sym posium : Im m unopotentiation. E lse
vier Publ. N. Y ork, 1973.
C ohn S, Sadun EH: Im m unology o f Parasitic Infections.
Blackw ell Sci Publ O xford, 1976.
C hase M W , K uhns W J (Ed): S p ecificity o f S ero lo g ical
Reactions: L andsteiner C entenial. N Y A c a d Sci 169: I293, 1970. N Y ork A cad Sci Publ N York.
G lynn LE , Stew ard M W ; Im m unochem istry: A n A d va n ced
Textbook. J W iley and Sons. N Y ork y Londres, 1978.
In te rn a tio n a l A ss o c ia tio n o f B io lo g ic a l S ta n d a riz a tio n
(Eds): Use a n d Standarization o f C hem ical D efin ed A n
tigens. S. K arger, 1986.
K ab at EA : B lo o d G roup S u sta n ces. A cad em ic P ress N
Y ork, 19.56.
K abat EA: Stru ctu ra l C oncepts in Im m unology an d Im m unochem istry. H olt, R inehart y W inston. N Y ork, 1976.
Ludevitz O, S taub AM , W estphal O: Im m unochem istry of
O and R antigens o f S alm onella and related Enterobacteriaceae. B act R ev 30:192, 1966.
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P ap p en h e im er A M , G il D M : D ip h te ria. R ec en t stu d ies
h av e cla rifie d the m o le c u la r m e ch an ism s in v o lv ed in
this pathogenesis. S cience 182:353, 1973.
R ace R R; S anger R: B lo o d G roups in M an, 6th ed, B lack
w ell Sci Publ O xford, 1975.
Rini, J. M ., S chultze-G ahm en V. & W ilson, 1. A.: S tru c
tu r a l e v id e n c e fo r in d u c e d it as a m e e h a n is m fo r
a n tib o d y -a n ig e n r e c o g n itio n . S cien ce 2 55: 9 6 9 -9 6 5 ,
1992.
R u d b ac h JA , B ak e r PJ (E d s); Im m u n o lo g y o f B a c teria l
P o ly s a c c h a r id e s . E ls e v ie r N o rth H o lla n d P u b lis h in g
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S altn M JR: The B a cteria l C ell Wall. E lsevier. N Y ork,
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Sela M; Im m unological studies with synthetic p o ly p ep ti
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Sela M (Ed): The antigens: a com prehensive treatise, vols.
1-V A cadem ic Press. N Y ork, 1973-85.
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p ro te in an tig en . M o le c u la r Im m u n o lo g y 2J.-8 O 7 -8 I0 ,
1986.
Sercavz, E. (ed.). A ntigenic determ inants and im m une re
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S inger SJ: S tru ctu re and F u n ctio n o f A n tig en and A n ti
body Protein, En The Proteins, vol III. H N eurath (Ed),
A cadem ic Press, N Y ork, 1965,
S tew art-T u ll D E S , D av ies M (Eds): Im m u n o lo g y o f the
b acterial cell envelope. John W iley and Sons Ltd,, 1985,
T aim er E y col: T he atom ic m obility com ponent o f protein
antigenicity. En A n n R ev Im m unol (W E Paul, C G arrison
F athm an, H M etzger, Eds), pp 501-536, 1985,
S zentivanyi A, F ried m an H (Eds); Y irus, Im m u n ity an d
Im m unodeficiency. P lenum Publ, 1986,
In te rn a tio n a l A ss o c ia tio n o f B io lo g ic a l S ta n d a riz a tio n
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W eir DM (Ed): H a n d b o o k o f E xp erim en ta l Im m unology,
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W illiam s CA, C hase M W (Ed): M ethods in Im m u n o lo g y
cmd Im m u n o c h em istry, vols I y II, A cad em ic P ress. N
Y ork, 1967-68.

Anticuerpos

RICARDO MARGNI

GENERALIDADES
Son protenas que elaboran los vertebrados
al ser estimulados con un antgeno y que tienen
capacidad para reaccionar especficamente con
el inductor.
Esto permite excluir de la definicin a otras
sustancias que se encuentran en los humores de
los animales, que reaccionan de manera ms o
menos especfica con ciertos agentes, pero que
no son anticuerpos; nos referimos a algunos in
hibidores de enzimas proteolticas presentes en
el organismo que, si bien tienen accin espec
fica sobre ellas, sus concentraciones no aumen
tan ni sufren modificaciones por la inoculacin
de dichas enzimas.
La mayor parte de los anticuerpos se halla en
el plasma circulante como constituyentes pro
teicos de aqul. Antes de analizar y tratar de
establecer su ubicacin entre las protenas, es
conveniente aclarar conceptos que nos van a
permitir comprender mejor algunos resultados.
Los anticuerpos reaccionan especficamente
con los antgenos que les han dado origen y co
mo consecuencia de esa reaccin se produce la
neutralizacin. Cuando esto ocurre en el tubo
de ensayo generalmente sigue un fenmeno vi
sible que puede ser precipitacin, aglutinacin,
bacterilisis, citlisis, etctera, segn las carac
tersticas del antgeno y la presencia o no de
sustancias complementarias. En un comienzo
se dio nombre particular al anticuerpo capaz de
producir uno u otro tipo de reaccin, y se lo lla
m precipitina, aglutinina, anticuerpo fijador
del complemento, bacteriolisina, citolisina, et
ctera, pero estudios posteriores perm itieron
comprobar que un mismo antisuero poda dar
todas o casi todas las reacciones serolgicas in
dicadas, lo que llev a la postulacin de la teo

5
ra unitaria del anticuerpo. Esto ha simplificado
los hechos, pero debemos aclarar que no es ab
soluto ya que, como se ver ms adelante, un
antgeno puede originar ms de un tipo de anti
cuerpo con caractersticas fisicoqumicas dife
rentes, de ah su distinta manera de reaccionar
frente al antgeno y su particular co m p o rta
miento biolgico. Debemos admitir que un an
ticuerpo puede dar una o ms de las reacciones
seiialadas, pero no necesariamente todas. Son
pluripotentes, pero sin alcanzar la totalidad.
Por anlisis electroforticos de sueros de
animales normales e inmunizados, se com pro
b que estos ltimos diferan de los prim eros
en un aumento de la fraccin gammaglobulnica (fig. 5-1), y que haba un gradiente progresi
vo de aumento de dicha fraccin si esos sueros
provenan de un mismo animal en el transcurso
de una inm unizacin. Esto hizo suponer que
los anticuerpos estaban localizados en la frac
cin gammaglobulina, y la demostracin feha
ciente de que as era se tuvo cuando se hicieron
electroforesis simultneas de un suero p ro ce
dente de un animal inmunizado y del m ism o
suero previamente adsorbido con el respectivo
antgeno a efectos de eliminar el anticuerpo.
Como puede verse en la figura 5-2, la depre
sin del pico de las gammaglobulinas es m ani
fiesta en el segundo caso. Esto a su vez indica
que no toda la gammaglobuhna plasmtica tie
ne actividad anticuerpo para el antgeno en es
tudio, sino parte de ella, a la que ha dado en
llamrsela gammaglobulina inmune.
La introduccin de otros mtodos analticos
como la ultracentrifugacin, la electroforesis
en geles en la inmunoelectroforesis sirvi para
com probar que la gammaglobulina no es una
fraccin homognea, sino que puede ser subdividida en diferentes componentes. Ya los in-

74

Aspectos bsicos de la inmunidad

multivalentes. Estos adyuvantes han comenza

do a usarse en la inmunizacin humana, sobre
todo en la formulacin de vacunas que usan
pptidos como inmungenos, los que por s so
los, en su mayora, son poco efectivos.
Tiem po de perm anencia de los antgenos
La mayora de los investigadores adm iten
que los antgenos permanecen un tiempo relati
vamente corto en el organismo y se metabolizaran de la mism a m anera que lo hacen las
restantes protenas que llegan al organism o.
Otros han podido dem ostrar, trabajando con
azoprotenas y protenas unidas a haptenos
marcados con '^'I, *C, ^S o ^H, su permanen
cia por tiempo prolongado en el organismo ino
culado. Es de hacer notar que en estas investi
gaciones se ha demostrado, en clulas obteni
das de bazo, radiactividad correspondiente a
1.000 molculas de antgeno por clula, cinco
meses despus de la inoculacin, y que se redu
ca a 100 a los ocho o nueve meses. Estas expe
riencias m uestran la perm anencia por cierto
tiempo de materiales antignicos marcados, no
as la totalidad del antgeno. Es probable que el
material proteico, que acta como transporta
dor no especfico, experimente la degradacin
que normalmente ocurre en esas sustancias. La
posibilidad de que la radiactividad detectada
sea consecuencia de productos de radilisis no
puede ser descartada.
Investigaciones recientes han dem ostrado
que las clulas dendrticas localizadas en el ba
zo retienen antgeno sin procesar, fijado a su
mem brana, por largos perodos. E ste hecho
cumplira un papel muy importante en el man
tenimiento de la memoria inmunolgica; esos
antgenos seran los que estimularan en forma
repetida a los linfocitos que cumplen esa fun
cin, asegurando la presencia de clulas capa
ces de reaccionar con sus antgenos especficos
por largos perodos.
Cabe sealar que lo expuesto corresponde a
antgenos proteicos, ya que los de naturaleza
poliosdica, que se degradan con dificultad,
permanecen en el organismo del husped por
largos perodos. Esta eliminacin lenta puede
producir acumulacin, la que a su vez puede
dar lugar a una parlisis inmunolgica con au
sencia de respuesta inmune (vase cap. 15).
B IB L IO G R A FA
A lien, P. M.; A ntigen processing at the m olecular level .
Im m unology Today <S: 210-213, 1987.

B en jam n y col.: T h e an tig en ic stru ctu re o f p ro tein s: a

reappraisal. En: A n n Rev Im m unol (W E Paul, C G arrison
Fathm an, H M etzger, Eds), 67-102, 1984.
Berzofsky, J. A. & Berkow er, 1. J.: Im m unogenicity and
an tig en s tru c tu re . En F u n d a m en a l Im m u n o lo g y (W .
Paul, Ed.) Cap. 8, 1993, 3" ed. R aven Press.
C iba F oundation Sym posium : Im m unopotenliation. E lse
vier Publ. N. Y ork, 1973.
C ohn S, Sadun EH: Im m unology o f Parasitic Infections.
Blackw ell Sci Publ O xford, 1976.
C hase M W , K uhns W J (Ed): S p ecificity o f S ero lo g ical
Reactions: L andsteiner C entenial. N Y A c a d Sci 169: 1293, 1970. N Y ork A cad Sci Publ N York.
G lynn LE , Stew ard M W ; Im m unochem istry: A n A d va n ced
Texlbook. J W iley and Sons. N Y ork y Londres, 1978.
In te rn a tio n a l A ss o c ia tio n o f B io lo g ic a l S ta n d a riz a tio n
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h av e ela rifie d the m o le c u la r m e ch an ism s in v o lv ed in
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R ace R R; S anger R: B lo o d G roups in M an, 6th ed, B lack
w ell Sci Publ O xford, 1975.
Rini, J. M ., S ehultze-G ahm en V. & W ilson, 1. A.: S tru c
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a n tib o d y -a n ig e n r e c o g n itio n . S cien ce 2 55: 9 6 9 -9 6 5 ,
1992.
R u d b ac h JA , B ak e r PJ (E d s): Im m u n o lo g y o f B a c teria l
P o ly s a c c h a r id e s . E ls e v ie r N o rth H o lla n d P u b lis h in g
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p ro te in an tig en . M o le c u la r Im m u n o lo g y 2 J.-8 0 7 -8 1 0 ,
1986.
Sercavz, E. (ed.). A ntigenic determ inants and im m une re
gulation C hem ical Im m unology, vol. 46, 1989.
S inger SJ: S tru ctu re and F u n ctio n o f A n tig en and A n ti
body Protein. En The Proteins, vol 111. H N eurath (Ed).
A cadem ic Press. N Y ork, 1965.
S tew art-T u ll D E S , D av ies M (Eds): Im m u n o lo g y o f the
b acterial cell envelope. John W iley and Sons Ltd., 1985.
T aim er E y col: T he atom ie m obility com ponent o f protein
antigenicity. En A m R ev Im m unol (W E Paul, C G arrison
Fathm an, H M etzger, Eds), pp 501-536, 1985.
S zentivanyi A, F ried m an H (Eds): Virus, Im m u n ity an d
Im m unodeficiency. P lenum Publ, 1986.
In te rn a tio n a l A ss o c ia tio n o f B io lo g ic a l S ta n d a riz a tio n
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tigens. S K arger, 1986.
W eir DM (Ed): H a n d b o o k o f E xp erim en ta l Im m unology,
vol. I. Im m u n o ch em istry . B lack w ell S ci P ubl O xford,
1986.
W illiam s CA, C hase M W (Ed): M ethods in Im m u n o lo g y
cmd Im m u n o c h em istry, vols I y II. A cad em ic P ress. N
Y ork, 1967-68.

Anticuerpos

RICARDO MARGNI

GENERALIDADES
Son protenas que elaboran los vertebrados
al ser estimulados con un antgeno y que tienen
capacidad para reaccionar especficamente con
el inductor.
Esto permite excluir de la definicin a otras
sustancias que se encuentran en los humores de
los animales, que reaccionan de manera ms o
menos especfica con ciertos agentes, pero que
no son anticuerpos; nos referimos a algunos in
hibidores de enzimas proteolticas presentes en
el organismo que, si bien tienen accin espec
fica sobre ellas, sus concentraciones no aumen
tan ni sufren modificaciones por la inoculacin
de dichas enzimas.
La mayor parte de los anticuerpos se halla en
el plasma circulante como constituyentes pro
teicos de aqul. Antes de analizar y tratar de
establecer su ubicacin entre las protenas, es
conveniente aclarar conceptos que nos van a
permitir comprender mejor algunos resultados.
Los anticuerpos reaccionan especficamente
con los antgenos que les han dado origen y co
mo consecuencia de esa reaccin se produce la
neutralizacin. Cuando esto ocurre en el tubo
de ensayo generalmente sigue un fenmeno vi
sible que puede ser precipitacin, aglutinacin,
bacterilisis, citolisis, etctera, segn las carac
tersticas del antgeno y la presencia o no de
sustancias complementarias. En un comienzo
se dio nombre particular al anticuerpo capaz de
producir uno u otro tipo de reaccin, y se lo lla
m precipitina, aglutinina, anticuerpo fijador
del complemento, bacteriolisina, citolisina, et
ctera, pero estudios posteriores perm itieron
comprobar que un mismo antisuero poda dar
todas o casi todas las reacciones serolgicas in
dicadas, lo que llev a la postulacin de la teo

5
ra unitaria del anticuerpo. Esto ha simplificado
los hechos, pero debemos aclarar que no es ab
soluto ya que, como se ver ms adelante, un
antgeno puede originar ms de un tipo de anti
cuerpo con caractersticas fisicoqumicas dife
rentes, de ah su distinta manera de reaccionar
frente al antgeno y su particular co m p o rta
miento biolgico. Debemos admitir que un an
ticuerpo puede dar una o ms de las reacciones
seiialadas, pero no necesariamente todas. Son
pluripotentes, pero sin alcanzar la totalidad.
Por anlisis electroforticos de sueros de
animales normales e inmunizados, se com pro
b que estos ltimos diferan de los prim eros
en un aumento de la fraccin gammaglobulnica (fig. 5-1), y que haba un gradiente progresi
vo de aumento de dicha fraccin si esos sueros
provenan de un mismo animal en el transcurso
de una inm unizacin. Esto hizo suponer que
los anticuerpos estaban localizados en la frac
cin gammaglobulina, y la demostracin feha
ciente de que as era se tuvo cuando se hicieron
electroforesis simultneas de un suero p ro ce
dente de un animal inmunizado y del m ism o
suero previamente adsorbido con el respectivo
antgeno a efectos de eliminar el anticuerpo.
Como puede verse en la figura 5-2, la depre
sin del pico de las gammaglobulinas es m ani
fiesta en el segundo caso. Esto a su vez indica
que no toda la gammaglobuhna plasmtica tie
ne actividad anticuerpo para el antgeno en es
tudio, sino parte de ella, a la que ha dado en
llamrsela gammaglobulina inmune.
La introduccin de otros mtodos analticos
como la ultracentrifugacin, la electroforesis
en geles en la inmunoelectroforesis sirvi para
com probar que la gammaglobulina no es una
fraccin homognea, sino que puede ser subdi
vidida en diferentes componentes. Ya los in-

76

Aspectos bsicos de a inmunidad

Fig. 5-1. Eleetroforesis en acetato de eelulosa de suero de

conejo norm al (a) y sueros del m ism o anim al despus de la
inoculacin de ovoalbm ina (b, c). A m edida que el ttulo
de anticuerpos aum enta se observa increm ento de la frac
cin gam m aglobulina,

munlogos haban observado que algunos anti

cuerpos con igual especificidad para un mismo
antgeno, pero provenientes de animales de dis
tinta especie, tenan caractersticas fisicoqumi
cas diferentes. Igual fenmeno se haba obser
vado en los anticuerpos que aparecan en los
perodos iniciales de una inmunizacin y en los
tardos. Los anticuerpos contra el soma bacilar
y contra las cilias obtenidos por inmunizacin
con Salmonella typhi tenan pesos moleculares
muy distintos.
Todos estos hechos y el desarrollo a un alto
nivel de metodologas analticas fisicoqumicas
aplicadas a la biologa permitieron abordar el
estudio de los anticuerpos y de clulas compro

metidas en su biosntesis en un sentido mucho

ms amplio. Se ha llegado a la conclusin de
que la gammaglobulina inmune no es un tipo
tnico de protena, sino que es una familia a la
que se denomina inmunoglobulinas y en la que,
segtin Heremans, se incluyen todas las globuli
nas con actividad anticuerpo. En el hombre se
han identificado las IgG, IgM, IgA, IgD, IgE
gammaglobulinas, y relacionadas con ellas es
tn las protenas de Bence-Jones halladas en la
orina de enfermos de mieloma (fig. 5-3).
Se las considera como una familia porque en
todas ha sido posible demostrar la funcin de
anticuerpo; son elaboradas por un mismo tipo
de clula, las plasmticas; y adems, actuando
como antgenos, cada una de ellas da reaccio
nes cruzadas con los anticuerpos elaborados
por las restantes. El anlisis qumico ha servido
para reafirmar este agrupamiento. Se ha com
probado que todas tienen una estructura tetrapeptdica bsica, con pptidos compartidos y
diferenciales. Estos pptidos, llamados L y H,
estn unidos entre s covalentemente y se en
cuentran repetidos en la molcula (fig. 5-4).
Estas estructuras tetrapeptdicas pueden en
contrarse bajo form a de m onm eros, com o
ocurre con la IgG, IgD e IgE; de pentmeros,
como en el caso de la IgM; o de monmero, d
mero y trmero, como en la IgA.
Las inmunoglobulinas son glucoprotenas y
el contenido en hidratos de carbono vara para
cada una de las clases.
Las diferentes clases de inm unoglobulinas
normales constituyen una poblacin heterog
nea de molculas y son de origen policlonal.
Esa heterogeneidad es consecuencia de la va
riabilidad de los aminocidos constitutivos, la
que puede deberse a variaciones isotpicas, que

F ig. 5-2. G raficacin de la corrida inm unoelectrofortica de un suero inm une antes y despus de la adsorcin con el an t
g eno especfico. I, eleetroforesis en acetato de celulosa de suero de conejo inm unizado con ovoalbm ina. II, eleetroforesis
d el m ism o suero previa adsorcin con ovoalbiim ina en zona de equivalencia (m uestra concentrada al volum en original
d espus de la adsorcin).

Anticuerpos
son comunes a todos los individuos de la m is
ma especie y que afectan a las distintas clases y
tipos de inmunoglobulinas; a variaciones alot
picas, que diferencian formas polimorfas de in
munoglobulinas, las que no se encuentran pre
sentes en toda la poblacin molecular de una
determinada clase de inmunoglobulina de una
especie animal, y a variaciones idiotpicas, pro
pias y particulares de cada molcula (fig. 5-5),
Las inmunoglobulinas que poseen especifici
dad para un antgeno (anticuerpos) son ms ho
mogneas que las inmunoglobulinas normales,
pues su sntesis depende de un ntmero restrin
gido de clones celulares. Las protenas de m ie
lomas son inmunoglobulinas homogneas por
ser de origen monoclonal (fig. 5-6). Estas han
resultado de extraordinario valor para estudios
secuenciales, ya que, en cambio, por su hetero
geneidad, no se prestan para ello las inmunoglobulinas normales y la mayor parte de los an
ticuerpos.
En los ltimos aos se ha desarrollado una
metodologa que permite obtener por fusin de
clulas tumorales y clulas productoras de anti
cuerpos, hibridomas, con capacidad para pro
liferar in vitro y sintetizar anticuerpos homog
neos. Estas poblaciones moleculares se estn
usando en diferentes laboratorios y en distintas
lneas de investigacin, ya que por clonado y
seleccin se pueden conseguir hbridos que sin
tetizan anticuerpos de la clase y la especifici
dad deseadas.
La diferencia ms apreciable entre las inm u
noglobulinas normales y los anticuerpos es la
capacidad de estos ltimos para reconocer sus
correspondientes antgenos, es decir, su especi
ficidad. En realidad, las inmunoglobulinas nor
males del suero en nada difieren de los anti-

77

F ig. 5-3. Inm unoelectroforesi de su ero hum ano. C o m o

inm unosueros precipitantes se usaron: 1, suero de co n e jo
andhum ano total, i , suero de conejo anti-lgG , 3, su ero de
conejo anti-IgA . 4, suero d e conejo anti-IgM .

cuerpos. Aquellas estn constituidas por una

poblacin molecular infinitamente grande, te
niendo cada una de esas molculas una especi-

Pepsina

Pepsina

Fig. 5-4. Esquem atizacin de una m olcula de IgG (Ig G l). Los nm eros indican las posiciones de los residuos d o nde tiene lugar el clivaje enzim tico. CH O significa hidratos de carbono. Las porciones trazadas con lneas de puntos co rresp o n
den a los fragm entos variables d e las cadenas L y H.

78

Aspectos bsicos de ia inmunidad

F ig . 5-5. a, variaciones isotpicas. A fectan a todos los com ponentes de la clase o subclase de inm unoglobulina y estn lo
calizadas en la parte constante de la cadena H, preferentem ente en el fragm ento Fe; b, variaciones alotpicas. N o estn presentes en todos lo.s com ponentes de una m ism a clase o subclase y perm iten diferenciar poblaciones m oleculares dentro de
ellas. C orresponden a determ inantes antignieos codificados por form as allicas de un m ism o locus. N orm alm ente estn
localizadas en los fragm entos constantes de las cadenas L y H; y c, variaciones idiotpicas. Son propias de cada m olcula y
afectan a los fragm entos variables de las cadenas L y H.

IV

VI

VII

Clones celulares

IgG elaborada -

> a
o
1 ^ 2

Inmunoelectroforesis

4 . ^ / ! \ /\

*\ *\ / t \ / ! \

r T - T T
Suero anti-IgG

F ig. 5-6. Esquem atizacin de una IgG policlonal y monoclonal.

Anticuerpos
ficidad definida. La enorme dilucin de cada
molcula en la poblacin total y el hecho de no
conocer sus especificidades hace que genrica
mente se consideren como no reactivas, cuando
en realidad lo que no tienen es capacidad para
reaccionar con un determinado antgeno en en
sayo.
Para un mejor anlisis nos ocuparemos del
estudio de las caractersticas generales de los
componentes de esta fam iha y sus relaciones
con la actividad anticuerpo, as como de los di
ferentes factores que regulan su produccin y
condicionan la especificidad.
De todas las inmunoglobulinas, la mejor es
tudiada ha sido la IgG ; las investigaciones
efectuadas en las restantes estn en su mayora
relacionadas con esos estudios. Es por ese m o
tivo que habr de ser analizada en forma ms
pormenorizada.
La nomenclatura con que se identifican es la
recomendada por la Organizacin Mundial de
la Salud.
IN M U N O G L O B U L IN A G (IgG )

Sinonimia. 1 S y globulina; globulina.

Por electroforesis aparece como una banda
algo difusa, en la zona catdica. El ancho de la
banda depende del soporte de corrida usado.
Cuando se usan geles la misma es estrecha, a
diferencia de lo que ocurra en los prim eros
anlisis efectuados, en los que se empleaba pa
pel como soporte. Por inmunoelectroforesis, la
IgG da una banda de precipitacin que se ex
tiende desde la zona de menor movilidad hasta
las a 2 globulinas, con zonas de precipitacin
de mayor intensidad para las molculas menos
mviles, que son las evidenciables por electro
foresis en soportes inertes.
La IgG tiene una constante de sedimentacin
de aproxim adam ente 7 u n id ad es S vedberg
(6,56 0,32) y ste es el motivo por el que se
la conoce comnmente como 7 S gammaglobu
lina. Su peso molecular, calculado por diferen
tes mtodos, oscila entre 140 y 160 kD. Es la
inmunoglobulina de menor contenido en hidra
tos de carbono, un 2,6%, de los cuales 1,2%
corresponden a hexosa y 1,14% a hexosamina;
la relacin hexosamina/hexosa es de 0,94.
Frente al antgeno especfico se com porta
como anticuerpo bivalente y tiene capacidad
para fijar el complemento, fijarse a piel heter
loga y atravesar la placenta. Porter estudi la
degradacin sufrida por la gammaglobulina de
conejo cuando era tratada con papana cristali
zada activada con cistena y posteriorm ente
cromatografiada en columna de resinas celul
sicas de intercambio inico. Estudios similares
se han efectuado con gamm-aglobulina humana.

79

Por este procedim iento se obtienen dos fra g

mentos, uno de movilidad electrofortica lenta
(Fab) y el otro de desplazamiento rpido (Ec).
En ei primero de ellos se encuentran locali
zados la actividad anticuerpo, los factores ge
nticos Km (anteriormente designados Inv) y
los determinantes antignicos comunes a otras
inmunoglobuhnas, en tanto que el Ec, fragm en
to cristalizable, si bien carece de actividad anti
cuerpo, est relacionado con otras propiedades
inherentes a la molcula entera y posee los d e
terminantes antignicos propios y los factores
genticos Gm exclusivos de la IgG. Este frag
mento es el que contiene la mayor proporcin
de los hidratos de carbono, calculada en apro
ximadamente un 75%. Es el responsable de la
fijacin de los anticuerpos a piel heterloga; el
que fija el complemento cuando forma parte
del complejo antgeno-anticuerpo; el que d eter
mina la capacidad de esta inmunoglobulina p a
ra atravesar la placenta; el que contribuye al
control del ritmo catablieo, y el que se fija a la
protena A del Staphylococcm aureus.
El fragmento Fab, si bien rtiene la actividad
anticuerpo, se comporta como univalente. Los
pptidos Fab y Fe tienen la misma constante de
sedimentacin, 3,5 S y un peso molecular apro
ximado de 55 kD. Esto ocurre cuando el tiem
po de digestin vara entre 1 y 4 horas; en cam
bio, si se lo prolonga a 16 horas, aparece un
pptido F e antignicamente deficiente con re s
pecto a Fe (figs. 5-7 y 5-8).
P or digestin trp tic a parcial se o b tien en
p p tid o s sim ilares, a los que se d en o m in a
Fab(t) y Fc(t).
Si la IgG es clivada con pepsina durante 18
horas, se obtienen fragmentos con una constan
te de sedimentacin de 5,5 S y peso molecular
90 kD. Siguen comportndose como anticuer
pos bivalentes precipitantes y se denom inan
F(cb)2. Los fragmentos Fe obtenidos por d i
gestin papanica son destruidos durante el tra
tam iento ppsico, por desdoblamiento en p e
queos pptidos dializables. Si el tiempo de di
gestin es menor, se obtiene un pptido deriva
do del Fe, el pF c, muy similar al fragm ento
F e resu ltan te de la digestin papanica. El
fragmento F (ab)2 tratado con mereaptoetanol
u otro reductor se transforma en un pptido que
tiene una constante de sedimentacin de 3,5 S e
inm unolgieam ente se com porta como a n ti
cuerpo univalente. Esto fue lo que llev a co n
siderar que los anticuerpos bivalentes estn
constituidos por dos subunidades Fab unidas
por un puente disulfuro y un fragmento Fe que
aparece en el digesto papanico y es degradado
por la pepsina, ello deducido de su comporta
miento frente a los agentes hidrolizan tes. Si la
digestin papanica se lleva a cabo con papana
insoluble en agua (papana unida a un copol-

80

Aspectos bsicos de a inmunidad

F ig. 5 -7. 1, IgG h u m an a d ig erid a c o n .
p a p a n a -c is te n a , d u ra n te 4 h o ra s , a,
Protena no digerida; b, m ezcla de Fab y
Fe; c, pptidos pequeos (F e ). 2, IgG
h u m a n a d ig e rid a con p apana-ci.stena
durante 16 horas. En am bos casos la se
paracin se hizo por filtracin a travs
de S ep h ad ex G-IOO, y la elu ci n con
buffer de fosfatos 0,01 M, NaCl 0,15 M.
pH 7,6. 3, separacin de los fragm entos
Fab y Fe, provenientes del pico b, por
c ro m a to g ra fa en D E A E -c e lu lo sa . La
elucin se hizo con gradiente de fo sfa
tos 0,005 M /0 ,1 M, pH 7,6.

10

20 30 40 50

60

70

90 100 110 120 130 140

O*'*

Tubos

mero de p-aminofenilalanina y leucina), solubilizando luego los productos con detergentes

(dodecil sulfato de sodio), se obtiene un frag
mento F (ab)2 similar al anterior, pero de P.M.
84 kD, que se desdobla con cistena en dos
fragmentos Fab. En la figura 5-4 se encuentran
sealados los residuos donde las enzimas m en
cionadas producen las escisiones.

En condiciones especiales de clivaje, el frag

mento constituido por las porciones variables
de las cadenas L y H puede ser escindido del
resto de la molcula de inmunoglobulina. Se
designa fragmento Fv.
Cuando la IgG se reduce con m ercaptoeta
nol, se alquila con iodoacetamida para evitar la
reoxidacin y se trata con cido actico o pro-

F ig. 5-8. Inm unoelectroforesis de IgG hum ana y sus fragm entos obtenidos por digc^iiiMi paj)aiiis'a. i. a la^ - loras; I I , a
las 16 horas.

Anticuerpos

81

mi de eluido
Fig. 5-9. Separacin de cadenas H y L por filtracin a travs de Sephadex G-lOO estabilizado con cido propinico 1 M,
El producto filtrado proveniente de una IgG hum ana tratada con m ereaptoetanol, alquilada con iodoacetam ida y d ia liz ad a
contra cido propinico 1 M. C om o eluyente se utiliz cido propinico 1 M.

pinico, se desdobla en cadenas peptdicas de

dos tipos; las livianas L {ligltt), de peso mole
cular aproximadamente 23 kD, portadoras de
factores Km y determinantes antignieos com
partidos con las restantes inmunoglobulinas, y
las pesadas, H {heavy), de peso molecular 52
kD, con especificidad propia y factores genti
cos Gm. Su separaciSn se consigue filtrando
por Sephadex G-lOO y empleando como elu
yente la misma solucin cida (fig. 5-9).
Las cadenas L, comunes a todas las inmunoglobulinas, son de dos tipos, llamadas kappa
( k ) y lambda {X), que se encuentran presentes
en la poblacin de cada inmunoglobulina. No
obstante, las molculas son simtricas y cada
una posee dos cadenas K o dos cadenas X, las
cuales difieren en su antigenicidad y aminoci
dos constitutivos. En una poblacin normal de
molculas de IgG, aproxim adam ente un 6065% de ellas posee cadenas L tipo k , y un 3035%, cadenas L tipo % (relacin k!X = 1,5). El
aminocido C terminal de las cadenas k es cis
tena, y el de las cadenas X, serina, precedido
de cistena, aminocido ste de suma importan
cia que contribuye a la formacin de los puen
tes S-S entre las cadenas L y H.
Distintos investigadores han efectuado anli
sis secuenciales de cadenas L tipo K y X y han
dem ostrado que estn constituidas por 214
(213-218) aminocidos. Para estos estudios se
han empleado los mtodos generales usados en

el anhsis proteico. Se han efectuado hidrlisis

previas con bromuro de ciangeno (BrCN), que
rompe las uniones del grupo -COOH de la metionina con el grupo -NH^ del aminocido si
guiente, transformando la metionina en hom oserina u homoserina lactona; y estos pptidos,
o sus productos de digestin por accin de la
tripsina, quimotripsina u otros degradantes, han
sido analizados para tratar de establecer, con
todos esos datos, la estructura de la protena
inicial. Para la determinacin del aminocido
C-terminal generalmente se us el mtodo de la
carboxipeptidasa y para el N -term inal el de
dansyl o el de Edman, sobre todo para las de
gradaciones seriadas.
Todas estas investigaciones han perm itido
com probar que las cadenas L estn form adas
por dos fragmentos de 107 aminocidos cada
una. La porcin N-terminal es variable, con un
total de 75-77 residuos sustituibles (-70% de
variabilidad), en tanto que la C-terminal es esta
ble para cada tipo de cadena. Cuatro residuos
cistena, dos en la zona variable y dos en la es
table, originan puentes -S-S-, los que form an
dos anillos o bucles, de aproximadamente 60
aminocidos cada uno, denominados Vj y C,
que le confieren cierta estabihdad a la molcula.
La fraccin variable presenta zonas estables
(fig. 5-10). Dicha variabilidad, sobre todo la
correspondiente a algunos residuos, com o se
ver m s adelante, desem pea un papel m uy

82

Aspectos bsicos de la Inmunidad

C uadro 5-1. Relaciones entre el fenotipo Km

y estructura primaria de la regin constante de
las cadenas K
Fenotipo
Km

()

( 1. 2)
(3)

R esiduo de am inocidos
153
V al
A la
A la

191
Leu
Leu
Val

importante en la actividad anticuerpo de la mo

lcula. Cuando se habla de secuencia variable
se quiere significar que existen muchos lugares
ocupados por aminocidos diferentes, en otras
cadenas del mismo tipo estudiadas.
En la regin constante de las cadenas k se
han observado variaciones, que estn relacio
nadas con tipos serolgicos hereditarios {aloti
pos). Los marcadores genticos Km se heredan
por una serie de tres alelos; K m , Km''^ y K m l
Los anlisis secuenciales han perm itido esta
blecer las relaciones entre -la estructura prima
ria de estas cadenas y los antgenos Km (1),
Km (1,2) y Km (3) (cuadro 5-1).
Variaciones similares ocurren en las cadenas
X, pero aqu no se trata de marcadores genti
cos, ya que estn distribuidos entre las diferen
tes cadenas X de todos los individuos. Se deno
minan isotipos y a esas variedades serolgicamente identificables se las conoce como marca
dores Oz, Kern, Mz y Mcg, que pueden ser po-

C u a d ro 5-2. V ariaciones iso tp ica s en la

estructura prim aria del fragm ento constante
de las cadenas X
Isotipo

Posicin

Oz

193

Kern

156

fvlz

147/174

M cg

116/118/167

Residuo

Variante

Lys
Arg
Gly
Ser
V al/A sn
Ala/Lys
A sp/Thr/l^ys
A la/Se/Thr

+
+
_

~
+
-

sitivos o negativos segn que den reacciones es

pecficas o no con los correspondientes antisue
ros. Las relaciones entre ellos y la estructura
primaria del fragmento constante de las cadenas
\ comprometido figuran en el cuadro 5-2.
Si bien los primeros 20-25 residuos de las
cadenas L de tipo K y pueden presentar varia
ciones consideradas cada una de ellas en con
junto, actualmente y sobre la base de un mayor
conocimiento de secuencias, el anlisis detalla
do de esos residuos ha permitido subdividir a
las cadenas K en los subgrupos Kj, k , . k y
y a las cadenas A. en los subgrupos
>.j,
Xjy,
y
cada uno de ellos con los prime
ros 22 residuos constantes. Estos residuos son
los ubicados antes de la primera cistena N-ter
minal.

I Cadena H
F ig . S-10. Representacin esquem tica de una cadena L de tipo K. (Elaborada con datos publicados por Puttnam y M ils
tein.)

Anticuerpos

83

C uadro 5-3. Secuencia amino-terminal de los subgrupos de cadenas L humanas de los tipos K y X
S e c u e n c ia
Sub^
grupo 1

Vk, A.sp
Vk,i Asp
VKhi Glu
V k,v A sp

lie
lie
lie
le

la,

S er
Ser
Tyr
S er
S er
Phe

PCA
i a PCA
KX.||j Ser
(-)
PCA
KX^^ Asp

11

12

M el
M et
Leu
M et

Thr
Thr
Thr
Thr

Gln
Gln
Gln
G ln

S er
S er
S er
Ser

P ro
P ro
P ro
P ro

S er
L eu
Gly
Asn

Ser
Ser
Thr
Ser

Leu
L eu
L eu
L eu

S er
Pro
S er
A la

Ata
Ser Val
V al T hr Pro
Leu
S e r P ro
V al
S e r Leu

Val
Val
Val
V al
A la
Val

S er
S er
S er
Ser
S er
S er

G ly
Gly
V al
Val
G ly
Glu

Val
Ala
Glu
Glu
A la
M et

L eu
L eu
L eu
L eu
L eu
I.e u

T h r Gln P ro P ro S er
Thr G ln P ro Ala S er
Thr Gln P ro P ro S er
Thr G ln Asp Pro Ala
T h r G ln P ro P ro S er
Thr Gln P ro His S er

(-)
(- )
(- )
(- )
(- )
(-)

13

14

3
Gln
Val
V al
V al

16
G ly
G ly
G ly
G ly

A la P ro G ly
S e r P ro G ly
Ser P ro G ly
A la Leu G ly
S e r Pro G ly
S e r P ro G ly

17
A sp
G lu
G lu
G lu

18
Arg
Pro
Arg
Arg

79
V al
A la
A la
A la

20

21

Thr lie
Ser lie
Thr L eu
T h r He

Glu Agr Val T hr lie

G ln Ser
lie
iT. h r lie
Gln Thr A la Arg lie
Gln Thr Val Arg lie
G ln S er
V al T h r le
Lys Thr Val Thr Phe

22
Thr
Ser

23

S er
A sn

Cys
Cys
Cys
Cys

S er
er
oSc.
Thr
Thr
S er
S er

Cys
Cys
Cys
Cys
Cys
Cys

P C A es el s m b o lo para el re sid u o d erivado del cido p irro lid -2 -o n a-5 ca rb o x lic o

L os am in o c id o s d estac ad o s co rresp o n d e n a residuos in v aria b le s en todas las c a d e n a s secuenciadas.

El cuadro 5-3 muestra los prototipos de los

diferentes subtipos de cadenas L, y el cuadro
5-4 los productos de combinacin de los frag
mentos VL y CL para cada tipo de cadena.
Las cadenas K y X que se diferencian entre s
por la secuencia de los aminocidos de la mitad
C-terminal, poseen tambin ciertas fracciones
comunes (cuadro 5-5). Las fracciones N-termi~
nal en ambos tipos de cadenas presentan varia
ciones individuales, razn por la cual no pue
den tenerse en cuenta para la diferenciacin.
Como consecuencia de su distinta estructura
secuencial, las cadenas k y difieren antigni
camente. Teniendo en cuenta que se encuentran
presentes en todas las inmunoglobulinas, stas
han sido subdivididas en dos grupos, las llama
das tipo L (I) que se caracterizan por tener ca
denas L de tipo K y las llamadas tipo L (II), que
contienen cadenas L tipo X (fig. 5-11).

C uadro 5-4. Recombinacin de los fragm en

tos variables de las cadenas K y X con sus
respectivos fragmentos constantes para form ar
los diferentes subtipos de cadenas L

Las cadenas H tienen diferente denom ina

cin segn la inmunoglobulina de que p ro ce
den. Se las designa y para la IgG, \i p a ra la
IgM, a para la IgA, 8 para la IgD y e para la
IgE. De todas ellas la mejor conocida es la y,
de la cual han sido hallados en el hombre cua
tro tipos diferentes: y,, y^, yj y y^ (cuadro 5-6).
Se conocen estudios secuenciales completos
de cadenas H (y) (cuadro 5-7) y exmenes par
ciales de algunas cadenas y de p rotenas de
mielomas y de enfermedad de Franklin o de
las cadenas pesadas .
Se ha podido comprobar que la fraccin Nterminal de cadenas y, obtenidas por pronasa,
es Glu-Val-Thr, pero el NH^ grupo del am ino
cido terminal est bloqueado, formando un ani
llo derivado del cido pirrolidn carboxlico; de
ah que su secuencia sea PC A -V al-Thr. Los
primeros 107 a 132 residuos N-terminales de la
cadena H presentan gran variabilidad. Se ha
observado en cambio gran identidad entre pp
tidos correspondientes a la zona C-terminal, de
las protenas de mieloma pertenecientes al m is
mo tipo antignico y gentico.
El octadecapptido C-terminal, separable por
BrCN, ha sido estudiado en diferentes cadenas
H, presentando gran estabilidad. Se han obser
vado mnimas variaciones para las cadenas y, y
y^ de origen humano y para las cadenas y de co
nejo y caballo (cuadro 5-8).
Sobre la base de estos estudios, las cadenas
H pueden ser divididas en dos porciones, la Fd,
que posee el aminocido N-terminal y se co
rresponde con la cadena L, y la Fe, poseedora
del aminocido C-terminal. Esta fraccin nor
malmente es constante en el mismo tipo de ca
dena, no as la Fd. En el fragmento Fe se en
cuentran ubicados los determinantes antignicos especficos de la IgG y la mayor parte de
los factores genticos Gm. La porcin Fd pue
de ser dividida tambin en mitades. La N-ter-

84

Aspectos bsicos de la inmunidad

Tipo K

Tipo L

ic
)T
-jy

IgA

X
XI

|K

X,
X|
X

X
XI

IgE
|K

|K
B.Jones

__JK

X mmmrnmmium

Fig. 5-11. E s t r u c t u r a t e t r a p e p t d i c a d e l a s c i n c o c l a s e s d e i n m u n o g l o b u l i n a s d e o r i g e n h u m a n o c o n s u s d o s t i p o s ( k a p p a y
la m b d a ) d e c a d e n a s liv ia n a s .

C u ad ro 5-5. Cadenas L de tipo Ky X. Comparacin de los fragmentos C-terminales

lio

115

120

125

C ad en a K A R G -T H R -V A L -A L A -A L A -P R O -S E R -V A L -P H E -IL E -P H E -P R O -P R O -S E R -A S X -G L U -G I.N 4 .E U -L Y S -S E R
C ad en a X G I.N ^ P R O -L Y S ~ A L A -A L A -P R O -S E R -V A L -T H R -L E U 4 > H E -P R O -P R O -S E R -S E R -G L U -G L U -E E U -G L N -A L A

'TyCT

130

140

145

GLY-THR-ALA-SER-VAL^VAL-CYS-LEU-LEU-ASN-ASN-PHE-PRO-TYR-ARG-GLU-ALA-LYS-VAL-GLN-TRP-I.YS
A S N iY S ^ A L A -T H R -L E U ^ V A L -C Y S -JJU -IL E ^ S E R ^ A S P -P H E -T Y R ^ P R O -G L Y -A L A -V A L -T H R ^ V A L -A I.A -T R P -L Y S
150

155

160

165

170

VAL-ASP-ASN-ALA-I,EU-GLN-SER-GLY-ASN-SER-GLN-GLU-SER-VAL^THR-GLU-GI.N^ASP-SER-LYS-ASP-SER
ALA-ASP-SER-SER-PRO-VAL-LYS-AEA~GLY-VAL-GLU^THR-THR-THR-PRC>SERT.YS^GLN-SER-ASN-ASN-I.YS
175

180

185

190

THR-TYR-SER^LEU-SER-SER-THR-LEU-THR-LEU-SER-LYS-ALA-ASP-TYR-GLU-LYS-HlS-I.YS^j''g'^TYR-ALATYR-ALA-ALA-SER-SER-TYR-LEU-SER-LEU-THR-PRO-GLU-GLN^TRP^LYS-SER-HIS-ARG^SER-TYR-SER

195

200

205

210

C Y S -G L U -V A L -T H R -H IS -G L N -G L Y -L E U -S E R -S E R -P R O -V A L -T H R -L Y S -S E R J> H E -A S N -A R G -G L Y -G L U -C Y S
C Y S -G L N -V A L -T H R -H IS -G L U -G L Y -

'E E l

S E R -T H R -V A L -G L U -L Y S -T H R ^ V A L -A L A -F R O ^ T H R -G E U -C Y S -S E R

Anticuerpos
Fragmento
variable

F ig . 5 -1 2 . E s
q u e m a d e la e s
tr u c tu r a d e u n a
c a d e n a H (y).

Fragmento constante

minal, constitutiva del fraginento Fv, es muy

variable y participa en la formacin del sitio de
combinacin, en tanto que la otra mitad consti
tutiva del fragmento Fb, es estable. El fragmen
to Fd presenta hom ologa con la cadena L.
Anlisis estructurales han permitido comprobar
que en las cadenas H existen cuatro bucles o
anillos similares a los observados en las cade
nas L, denominados Vj_j, C l, C,_,2 y C,_,3, los
dos primeros ubicados en el fragmento Fd y los
dos restantes en el Fe (fig. 5-12).
El cuadro 5-9 define los diferentes fragmen
tos constitutivos de una molcula de inmunoglobulina, los que se encuentran representados
en las figuras 5 -13a y 5 -13b.
La secuencia de aminocidos de las regiones
variables de las cadenas pesadas (Vj.,) de las in
m unoglobulinas hum anas, p ro v en ien tes de
mieloinas, fueron clasificadas originalm ente
por Kabat en tres grupos, de acuerdo con la ho
mologa en la secuencia aminoacdica. E stu
dios posteriores han hecho posible el reordena
miento de stos, sobre la base del 80% por lo
menos de homologa a nivel de secuencia de
nucletidos, en 6 fam ilias ( V h I , V h2, V h 3 ,
Vh4, V h5 y V h6), de manera similar a lo que
ocurre con las cadenas L. Las seis secuencias
prototipos de dichos subgrupos figuran en el
cuadro 5-lOa. Recientemente la familia V h I ha
C uadro 5-6. Cadenas H (humanas)
inm uno- D enom inacin
globulinas de la cadena H Subtipos

IgG

Yl
Y2

y.
y.

Ig M
IgA

IgD
IgE

8
e

1
2
-

85

D enom inacin
del subtipo de
inm unoglobulinas
Ig G l
lg G 2
Ig G 3
Ig G 4
Ig A l
Ig A 2
-

sido reclasificada en V H I y V H 7, quedando

estas familias conformadas por 11 y 1 genes
V h funcionales, respectivamente. Por otro lado,
estas fam ilias, sobre la base de su filogenia,
han sido agrupadas en 3 clanes. El clan I con
tiene las famihas V h I , V h5 y V h7; el clan 2
contiene las familias V h2, V h4 y V h6; el clan
III contiene la fatnilia Vh3.
De los aproximadamente 95 genes VH cono
cidos (vase cap. 6), slo 51 tienen reordenado
el marco de lectura (open reading frame) por
lo que son funcionales y participan en la crea
cin de la variabilidad de las cadenas H; los res
tantes no tienen abierto el marco de lectura, son
seudogenes o no han sido secuenciados (cuadro
5 -10b). Estos fragmentos variables de cadenas
H son comunes a las diferentes inmunoglobuli
nas, de lo que se deduce que las distintas cade
nas H resultan de la recombinacin de un frag
mento H variable (V^,) comn y un fragmento H
constante (Cj^) propio para cada inmunoglobuli
na, aspecto que se discutir ms adelante.
Protenas de mielomas, completas, han sido
analizadas con el objeto de obtener pptidos
constituidos nicamente por fragmentos de ca
denas L, de cadenas H y mezcla de ambas uni
das por puentes S-S. Despus de la reduccin
de dichos puentes con mercaptoetanol se hicie
ron los anhsis de los pptidos, algunos de los
cuales coincidieron con los ya conocidos en los
estudios efectuados separadamente en las cade
nas L y H de dichas protenas. Esto ha perm iti
do determinar la ubicacin de los puentes S-S
dentro de las cadenas FI y las uniones L-H, as
como del hidrato de carbono ligado a las inm u
noglobulinas.
Del anlisis de inmunoglobulinas de mielomas, que son homogneas, se ha concluido que
hay cuatro subclases de IgG. En la Ig G l, la
unin H-L se produce entre la cistena C-terminal o preterminal de las cadenas L y la cistena
de la cadena H ubicada en el residuo 220. Po
see adems dos puentes disulfuro intercadenas
H-H. En las Ig02, IgG3 e IgG4 la unin H-L

86

Aspectos bsicos de la inmunidad

C u ad ro 5-7. Secuencia de los aminocidos constitutivos de una cadena H (y) de Ig G l humana

1

10

20

PC A -V al-G In-L eu-V al-G ln-Ser-G ly-A la-G lu-V al-L ys-Lys-Pro-G ly-Ser-Ser-V al-Lis-V al30

40

Ser-C ys-L ys-A Ia-Ser-G ly-G ly-T hr-Phe-Ser-A rg-Ser-A la-Ile-Ile-Trp~V al-A rg-G ln-A la50

60

Pro-G ly-G ln-G ly-Leu-G lu-Trp-M et-G ly-G ly-Ile-V al-Pi'o-M et-Phe-G ly-Pro-Pro-A sn-Tyr70

80

A la-G ln-Lys-Phe-G ln-G ly-A rg-V al-Thr-IIe-T hr-A la-A sp-G lu-Ser-Thr-A sn-T hr-A la-Tyr90

100

M et-G lu-L eu-Ser-Ser-L eu-A rg-Ser-G lu-A sp-T hr-A la-Phe-T yr-Phe-C ys-A la-G ly-G ly-T yr110

120

G ly-Ile-Tyr-Ser-Pro-G lu-G lii-Tyr-A sivG ly-G ly-Leu-V al-T hr^V al-Ser-Ser-A la-Ser-T hr130

140

L ys-G ly-P ro-Ser-V al-Phe-Pro-L eu-A la-P ro-Ser-Ser-L ys-Ser-T hr-Ser-G ly-G ly-T hr-A la150

160

A la-L eu-G ly-C ys-L eu-V al-L ys-A sp-T yr-Phe-Pro-G lu-P ro-V al-T hr-V al-Ser-T rp-A sn-S er170

180

G ly-A la-lxu-T hr-Ser-G ly-V al-H is-T hr-Phe-Pro-A la-V al-L eu-G ln-S er-S er-G ly-L eu-T yr190

200

Ser-Leu-S er-S er-V al-V aL T hr-V al-P ro-S er-S er-Ser-L eu-G ly-T hr-G ln-T hr-T yr-Ile-C ys210

220

A sn-V al-A sii-H iS'Lys-Pro-Ser-A sn-Thr-Lys-V al-A sp-L ys-A rg-V al-G lu-Pro-Lys-Ser-C ys230

240

A sp-L ys-T hr-H is-T hr-C ys-Pro-Pro-C ys-Pro-A la-Pro-G lu-L eu-L eU 'G ly-G ly-Pro-Ser-V al250

260

Phe-Leu-Phe-Pro-Pro-Lys-Pro-L ys-A sp-Tlir-Leu-M et~ lle-Ser-A rg-T hr-Pro-G lu-V al-T hr270

280

C ys-V al-V al-V al-A sp-V al-Ser-H is-G lu-A sp-Pro-G ln-V al-Lys^^Phe-A sn-Trp-Tyr-V al-A sp290

300

G ly-V al-G ln-V al-H is-A sn-A la-L ys-T hr-L ys-Pro-A rg-G lu-G ln-G ln-T yr-A sx-S er-T hr-T yr310

320

A rg-V al-V al-S er-V al-L eu-T hr-V al-L eu-H is-G ln-A sn-T rp-L eu-A sp-G ly-L ys-G lu-T yr-L ys330

340

C ys-L ys-V al-S er-A sn-L ys-A ia-L eu-P ro-A la-Pro-Ile-G lu-L ys-T hr-Ile-Ser-L ys-A la-L ys350

360

G ly-G ln-P ro-A rg-G lu-P ro-G ln-V al-T yr-T hr-L eu-P ro-Pro-S er-A rg-G lu-G ln-M et-T hr-L ys370

380

A sn-G ln-V al-Ser-L eu-T hr-C ys-L eu-V al-L ys-G ly-Phe-T yr-Pro-S er-A sp-lle-A la-V al-G lu390

400

Trp-G Iu-S er-A sn-A sp-G ly-G lu-P ro-G lu-A sn-T yr-L ys-T hr-T hr-P ro-Pro-V al-L eu-A sp-S er410

420

A sp-G ly-S er-P he-P he-L eu-T yr-S er-L ys-L eu-T hr-V ai-A sp-L ys-S er-A rg-T rp'G ln-G lu-G ly430

440

A sn-V al-Phe-Ser-C ys-S er-V ai-M et-H is-G lu-A la-L eu-H is-A sn-H is-T yr-T hr-G ln-L ys-S erLeu-Ser-L eu-Ser-Pro-G ly

Anticuerpos

87

C uadro 5-8. Secuencia del octadecapptido carboxiterminal de cadena,s pesadas de diferentes

inmunoglobulinas IgG
/ i , (Humina):
^G^ (H um ana):
(Conejo):
(Caballo):

(M et) - HLS - G L U - A LA ^ LE U ^ HiS ^ ASN - HLS ~ T Y R - TH R - G L N ^ LY S ^ SER - LE U - SER - LEU - SER - PRO - GLY - (C O O H )
(M et) - HLS - G LU - ALA - LE U - HIS - ASN - A R G -

PHE - T H R - G L N - LYS - SER - LE U - SER - LEU - SER - PRO - GLY - (C O O H )

(M et) - H IS - G LU - ALA - LEU - HiS - ASN - HLS - TY R - T H R - G L N - LYS - SER -

ILE - SE R - A R G - SER - PRO - GLY - (C O O H )

(M et) - HLS ^ GLU ^ A LA ^ LE U - HS ^ ASN - H IS - TY R - T H R - G L N - LYS - SER - V A L - SE R - LYS - SER - PRO - GLY - (C O O H

C u a d ro 5-9. D efinicin y caractersticas de los diferentes fra g m en to s constitutivos d e las

inmunoglobulinas
Fragm ento
H

Cadena peptdica pesada, con caracteres propios para cada clase de inm unoglobulina. Existen dos cad en as
H idnticas po r m olcula de inm unoglobulina.

C adena peptdica liviana, com partida p or las diferentes clases de inm unoglobulinas. Existen dos ca d en as L
idnticas po r m olcula de inm unoglobulina.

Fab

C onstituido po r una cadena L y el fragm ento H y-C ^l de u n a cadena pesada. Se lo obtiene por d ig e sti n papanica. Se com porta fi'ente al antgeno com o ligando univalente.

Fe

D m ero constituido por dos fragm entos

de ca d en a pesada unidos por los puentes disulfuro c o rres
pondientes a la zona de la bisagra. Se obtiene por digestin papanica. N o expresa actividad anticuerpo.

F(ab)2

C onstituido p or dos fragm entos F ab unidos por puentes disulfuro. Se lo obtiene por digestin p p sic a d u
rante 18 hs. Se com porta frente al antgeno com o ligando bivalente. T iene capacidad p ara p recip itarlo p e
ro no expresa otras propiedades del anticuerpo com o fijacin del com plem ento, pasaje placentario, etc.

F ab

Se obtiene por reduccin del fragm ento (F (ab)2 con m ereaptoetanol y bloqueo de los grupos-SH co n io
doacetam ida. Est constituido por el fragm ento Fab y restos de la regin bisagra.

F e

Es un dm ero del fragm ento Cj_j3 de ca d en a H. Se obtiene por digestin p rolongada con papana.

Fd

E st form ado por el fragm ento V jj-C^l de cadena H. Se lo obtiene por reduccin y desnaturalizacin del
fragm ento Fab,

Fv

Constituye la parte variable del fragm ento Fab. Es un dm ero de V h-V, .

p F c

Es sim ilar al F e , R esulta de digestiones cortas con pepsina,

Fb

Constituye la parte constante del fragm ento Fab, Es un dm ero de Cj^,l-C,,

C uadro 5-lOa. Secuencia de los primeros 30 aminocidos N-terminales (F R l) correspondientes

al fragmento variable de las 6 familias de cadenas H humanas
V H l ( / I g G l )
P ca-V a l-G ln -L e v i-V a l-G to -S e r-G ly -A la ~ G lu -V a l-L y s-L y s-P ro -G iy -S e i-S e i-V a l-L y s-V a l-S e r-C y s-L y s-A la -S e r-G ly -G ly -T h r-P h e -S e r(;)
V H 2 (COR I g G l )
P ca-V al-T Iir-L e u -A rg -G lu -S er-G ly -P ro -A Ia-L e u -V a l-L y s-P ro -T h r-G ln -T h r-L eu -T h r-L eu -T h r-C y s-T lir-P h e-S er-G ly -P h e-S e r-L e u -S er('2 )
V H 3 ( I g G A l)
G lu -V a l-G ln -L e u -L e u -G lu -S er-G ly -G ly -G y -L e u -V a l-G ln -P ro -G ly -G ly -S e r-L e u -A rg ~ L eu -S er-C y ,s-A la-A la-S er-G ly -P h e-T lir-P h e -S er (3)
V H 4 (X A C /lg M )
P ca-V al-G ln -L eu -G ln -G ln -T rp -G iy -A la-G ly -L eu -L eu -L y s-P ro -S er-G lu -T h i-L eu -S er-L eu -T h r-C y ,s-A la-V al-T y r-G ly -G ly -S e r-P h e-S e r (4)
V H 5 (gen 5 J R f)
G lu -V a l-G ln -L e u -V a l-G ln -S e r-G ly -A la -G lu -V a l-L y s-L y s-P ro -G ly -G lu -S e r-L e u -L y s-V a l'S e r-C y s-L y s-G ly -S e r-G Iy -T h r-S e r-P h e -T h r (5)

V m ig e n lG l)
G ln-V al-G Jn -L eu -G ]n ~ G ln -S er-G ly -P ro -G ly -L eu -V al-L y s-P ro -S e r-0 1 n -T h r-L e u -S e r-L eu -T h r-C y s-A la-l)e-S er-G ly -A ,sp -S e r-V a l-S er6 )

(I), (2), (3): S eq u en c es o f p ro te in s o f im m u n o lo g ica l in tere st, F o u rth E dil,, 1987 (K a b a t E, y col,)
(4): J. Biol. Chem., 2 6 6 :2 8 3 6 -2 8 4 2 , 1991
(5): EM BO J., 7:727-738, 1988
(6: Eur. J. Immun., 20:351-3,56, 1990
P C A es el s m b o lo p a ra cl re s id u o deriv a d o del cido p irro ld -2 -o n e-5 -ca rb o x lic o

88

Aspectos bsicos de la Inmunidad

C u ad ro 5-lOb. Contenido en genes Vh del locus funcional en cromosomas 14

Vh I

Con m arco de lectura reordenado

C on m arco de lectura no reordenado
Pseudogenes
N o secuenciados
Total

II
1
4
1
17

Vh 2

V h3

Vh 4

Vh 5

Vh 6

3
0
1

22
6
21
2
51

11
0
)
1
13

2
1
O

0
4

0
3

0
O
0
1

Vh 7

Total
51
9
30
5
95

E lab o rad o con datos to m ad o s d e G. P, C o o k e l.M .T o n iliso n . Immunology Today, 16: 237, 1995.

se produce entre los residuos cistena de las ca

denas L en las posiciones indicadas y los de las
cadenas H ubicados al comienzo de la porcin
constante del fragmento Fd (aproxiinadamente
residuo 140). Adems, el nmero de puentes
disulfuro intercadenas FI-H es cuatro, once y
dos, respectivamente. La zona de la bisagra de
la IgG3 es de mayor tamao que en las restan
tes subclases, a causa de que un fragmento del
ADN del gen que codifica para Cy (vase cap.
6) se ha cuadruplicado. Tiene 62 residuos re
sultantes de la unin de un segmento de 17 re
siduos seguidos en posicin C-terminal de tres
F (a b )2

fragmentos idnticos de 15 residuos cada uno.

Ello hace que su peso m olecular sea de 170
kD. La IgG4 no fija el complemento, la IgG2
no se fija a piel heterloga, y slo las IgGl e
igG3 tienen capacidad opsonizante y son sensi
bles a la accin proteoltica de la papana en
ausencia de cistena (fig. 5-14). La subclase
con mayor actividad fijadora del complemento
es la IgG3, que a su vez es la de menor vida
media (8 das).
La relacin cadenas k/X para las diferentes
subclases de IgG es la siguiente: IgG l = 2,4;
IgG 2= l,l;Ig G 3 = l,12;IgG 4 = 5.

Anticuerpos

89

F ig . 5 - 1 3 b . D ib u jo s d el
esqueleto de los earbonos
a co rresp o n d ie n tes a una
m olcula de IgG com pleta,
su fragm ento Fv, la regin
de la bisagra y el fragm en
to Fe. (C o m p o sic i n e la
borada con partes de las fi
guras publicadas p or P ad
lan E A , A n a to m y o f lite
antibody m olecule. M o le
cular Im m unology, 31: 169,

1994.)

Bisagra

CH2

Fe

Todas estas investigaciones efectuadas sobre

estructuras primai'ias de inmunoglobulinas han
llevado a la formulacin de la hiptesis de una
evolucin estructural de las cadenas L tipo K o
X, a partir de un gen ancestral comn. La ho

mologa estructural observada entre las cadenas

L y H sostiene la hiptesis de una evolucin
comn y una diferenciacin primaria de los ge
nes que gobiernan esta sntesis (fig. 5-15).
Es posible que el ancestro slo tuviera 300

90

Aspectos bsicos de la inmunidad

IgG,

IgG,

C/3
i L

lgG4

F ig . 5-14. E squem a estructural de las diferentes subclases

de IgC hum ana.

ERA

AOS
(millones)

nucletidos y que codificara para un pptido de

100 aminocidos (un bucle); por duplicacin
gnica y plegadura intragnica se originaron los
genes que gobiernan la sntesis de las distintas
cadenas L y H. Ello habra surgido con la evo
lucin. De las cadenas H, las primeras en dife
renciarse fueron las jj. y luego lo habran hecho
las restantes. En la figura 5-15 puede verse esa
evolucin en el curso del tiempo y las especies.
Cada m olcula de IgG es bivalente, o sea
que tiene dos sitios de combinacin para el de
terminante antignico especfico, que est si
tuado en el dominio formado por las regiones
variables de las cadenas L y H, y ambas contri
buyen a la formacin del sitio de combinacin.
En la naturaleza slo han sido hallados anti
cuerpos bivalentes para un solo determinante
antignico. No se conocen anticuerpos heteroligados naturales.
Todos estos estudios sobre productos de de
gradacin de IgG y su reactividad han llevado
a la esquematizacin de su molcula. Una de
las ms aceptadas ha sido la propuesta por Por
ter (fig. 5-4).
Se han analizado con el microscopio electr
nico los productos de interaccin de la IgG an
ticuerpo antidinitrofenol con el dihapteno co
rrespondiente unido por cadenas de -C H ^ -.
Igualmente han sido examinados los productos
de reaccin del anticuerpo completo y los obte
nidos por digestin ppsica (Eab^) y papanica
(Eab). Se pudo comprobar que, cuando el que
reacciona es el anticuerpo completo, se forman

A, X

|J,,

Ii^a,

ttj Y, Yj, Y3 Y4 8

ESPECIES
Primates

Kenozoica

-6 0

Aves

-200

IVIesozoica

Reptiles
Anfibios
Peces
Paleozoica

-5 0 0

plegadura intragnica
duplicacin gnica

F ig . 5-15. E volucin de las cadenas L y H de las inm unoglobulinas a partir de un gene ancestral comiin. (Tom ado de E.
V an Loghem . A nn. N . Y ork A cad. Sci. 190: 137, 1971.)

Anticuerpos

91

Fig. 5-16. Microscopa clcclriiiica. A: l"Ci de concjo ainidiiiilriilv-iuil al nlcr.iccoiiar cdu IXNI- M l - i ( '!Ij;, N(I l)X I'. H:
La misma imnunoglobulina previamente tratada con pepsina. (Tomado de Valentine, R.A. y Green, N. iVI. J. M ol. Biol.,
27:615, 1967.)

predom inantem ente figuras triangulares con

mamelones en los extremos, los cjue desapare
cen si el anticuerpo ha sido sometido previa
mente a digestin ppsica (fig. 5-16). Si el trata
miento fue papamico no se forman figuras geo
mtricas. De ello se dedujo que la IgG se ase
meja a una Y con los dos sitios reactivos en los
extremos superiores (fig^. 5-17). Su tamao ha
sido calculado en 200 de ancho. La figura
5-18 representa los tringulos formados por la
interaccin de tres molculas de IgG con tres
molculas del dihapteno, que corresponden a
las figuras observadas al microscopio electrni
co. Los trabajos mencionados han servido, ade
ms, para poner en evidencia que la formacin
de figuras geomtricas triangulares slo tiene
lugar cuando el puente que une los dos radicales
difenilo tiene un mnimo de seis -CH^-. Si bien
la estructura en Y es la que se observa cuando
la IgG ha reaccionado con el ligando, no se tie
ne seguridad sobre su conformacin cuando se
encuentra libre en solucin. Hay quienes sostie
nen que la indicada en la figura 5-4 podra ser la
correcta, en tanto que otros, basados en estudios
de diferentes tipos, consideran que la estructura
de la IgG libre es una T, la que dada su flexibi
lidad adquirira la forma de Y al reaccionar con
un ligando, exponiendo de este modo ciertos re
ceptores ocultos como seran los que facilitan la
fijacin del componente C lq del sistema com
plemento (fig. 5-19). Estudios de difraccin de
rayos X efectuados con inmunoglobuhnas mo
noclonales cristalizadas parecieran confirmar la
estructura en forma de Y.
Todas las inmunoglobulinas contienen hidra
tos de carbono, pero ellos no molestan en el es

tudio de sus estructuras-, pues se encuentran uni

dos a sus molculas a travs de restos de aspa
ragina y son fcilmente separables por hidrli
sis.
Las frmulas representativas de la IgG se
ran Y2K2 y 72^2IN M U N O G L O B U L IN A M (Ig M )

Sinonimias: yM globulina: 19 S inm unoglo

bulina; macroglobulina. Representa la m s pe
sada de las globulinas del sistema gamma.
Desde hace tiempo se conoca la existencia
de anticuerpos de alto peso molecular, pero sus
caractersticas fisicoqumicas y relaciones in
munolgicas y genticas con las otras globuli
nas inmunes han sido determinadas con poste
rioridad a los estudios reahzados con IgG.
Su concentracin en el suero normal es esca
sa, pero en los ltimos tiempos se ha logrado
conocerla m ejor com o consecuencia d e una
profundizacin en los estudios sobre algunas
p ato lo g as, com o la m a cro g lo b u lin em ia de
Waldenstrom y el hallazgo del factor reum atoi
deo. Este y la globulina aislada de la enferm e
dad citada son 19Sy globulinas y se encuentran
en altas concentraciones. La designacin de
19Sy globuhna se hace con el objeto de recor
dar su velocidad de sedimentacin equivalente
a 19 unidades Svedberg. Su peso molecular es
970 kD y ha sido calculado por ultracentrifuga
cin. Exmenes de este tipo evidencian hetero
geneidad de a IgM y ello se debe a que, si bien
el componente ms importante tiene una cons
tante de sedimentacin de 19 unidades Sved-

92

Aspectos bsicos de la inmunidad

Fig. 5-19. Representacin esquem tica de la m olcula de

IgG segn Edelm an. ; hidratos de carbono.

F ig . 5-17. Estructura propuesta para la IgG por V alentine

y O reen de acuerdo con observaciones hechas a nivel de
m icroscopia electrnica.

berg, existen siempre fracciones adicionales

que se encuentran en menor proporcin y po-

seen velocidades de sedimentacin de 29 S y

35-40 S, que constituyen polmeros de la 19 S
gammaglobulina.
Esta protena tiene una movilidad electrofo
rtica que va desde la zona media de las gam
ma hasta las betaglobulinas.
Su contenido en hidratos de carbono es apro
ximadamente del 12% con un 5,2% de hexosa

NOg
F ig . 5-18. Esquem atizacin de las figuras triangulares con m am elones en los extrem os observadas al m icroscopio electr
nico cuando interaccionan anticuerpos (IgG ) de conejo anti-D N P y el dihapteno correspondiente. Si la reaccin se realiza
con los productos de digestin ppsica y el dihapteno, se form an figuras triangulares carentes de m am elones, de lo que se
deduce que los m ism os corresponden al fragm ento Fe de la IgG. Para que la reaccin se produzca, el nm ero de - d i z
que unen los dos grupos dinitrofenol (D NP) debe ser superior a seis.

Anticuerpos

T ~T

t/5

- 88-

SS

-88h b h h h b b

93

-S 9 ~

88-

Ii b i

aCOOI

O co

-S S

coo-

nK

SS

/
00

\ i

F ig. 5-20. Estructura esquem tica de IgM m onm era (A) e IgM polim rica (B).

y 2,9% de hexosamina, lo que determina una

relacin hexosamina/hexosa de 0,55. Por ultracentrifugacin preparativa, crom atografa en
columnas de D EA E-celulosa o filtracin por
geles se la puede obtener pura. C antidades
apreciables se pueden conseguir a partir de sue
ros de pacientes con m acroglobulinem ia de
Waldenstrm.

Cuando su peso molecular es el indicado, se

ha determinado que su valencia es predom inan
temente pentavalente, aun cuando posee otras
cinco valencias de menor afinidad. Su frm ula
sera (iJ-jKj), y (M-25^2)5- Recientemente se h a de
mostrado en el plasma humano la presencia de
IgM constituida por la polimerizacin de 6 uni
dades monomricas, lo que estara relacionado

94

Aspectos bsicos de ia inmunidad

F ig . 5-2 1 . M icro sco p ia e lectr n ica de u n a m o lcu la de

IgM en la que se puede apreciar su estructura en form a de
estrella. (T om ado de F einstein, A. y col.: A nn. N. York
A cad. Sci., 190: 104, 1971.)

con la cantidad de cadenas J que sintetiza el

plasmocito (vase ms adelante). Aquellas c
lulas con bajos contenidos de cadenas J secre
tan IgM-exmero (igM)6, secretando IgM-pentmero (IgM)5 las clulas plasmticas que tie
nen alto contenido de cadenas J. Los mitgenos
y polisacridos de la pared celular de bacterias,
con subunidades de carbohidratos repetidas, in
ducen en los linfocitos B produccin de IgM en
ausencia de linfocitos Th cooperadores y sin la
participacin de IL-2. En estos casos la sntesis
de IgM-exmero se ve favorecida. Fija el com
plem ento y su capacidad de com binacin es
mayor con antgenos particulados que con los
solubles (fig. 5-20). Observada al microscopio
electrnico por el mtodo de la tincin negati
va, tiene aspecto estrellado, con un centro en
forma de pentgono y cinco prolongaciones la
terales (fig. 5-21).
Cuando la IgM es tratada por mercaptoetanol, se disocia en subunidades 7 S, que conser
van las caractersticas de antigenicidad de la
molcula total, no as la actividad de anticuer
po plurivalente, si es que la molcula la posea.
La recom binacin de las 7 S subunidades se
consigue si el mereaptoetanol es eliminado por
dilisis. Estas 7 S subunidades son estables si
despus del tratamiento con mereaptoetanol se
impide la reoxidacin con iodoacetamida. Se
comportan como anticuerpos univalentes aun
cuando estn constituidas por dos cadenas L y
dos cadenas H (P.M. 65 kD). Ello se debe a
que al combinarse con el antgeno no originan
complejos suficientemente grandes como para
precipitar o aglutinar, como consecuencia de
algn im pedim ento estrico. Que se trata de
anticuerpos bivalentes, no obstante su aparente
com portam iento de univalentes, ha sido de
mostrado mediante la preparacin de hbridos y
por estudios de interaccin primaria.

La IgM da reactividad cruzada con la IgG,

siendo responsable de ello el pptido L. La trip
sina d iv a la molcula de IgM por encima del
puente disulfuro in tercadena H, originando
Fab|i monomrico y Fc|0.5 (pentamrico). Si la
IgM es reducida por mereaptoetanol en presen
cia de urea, se obtienen cadenas L similares a
las que se encuentran en las IgG, siendo esta
fraccin de la molcula, al igual que en el caso
anterior, el lugar donde se encuentran locahza
dos los determinantes antignieos comunes y
los factores genticos Km. Las cadenas H tie
nen caractersticas propias y particulares. Se co
noce el anlisis secuencial de cadenas jj, com
pletas. Fi logenti camente se considera que stas
son las cadenas H ms antiguas, de las que se
diferenciaron las cadenas y hace 200 millones
de aos y las a hace 300 millones de aos.
Los factores genticos Gm, especficos de la
inmunoglobulina, no se encuentran en la IgM.
Algunos anticuerpos, que se forman por in
m unizacin con antgenos T -independientes
(polisidos, antgenos somticos de Salmonella
typl%i) y algunas isohemoaglutininas, son IgM
globuhnas. En algunos animales de experimen
tacin e incluso en el hombre, en el curso ini
cial de una inmunizacin con antgenos T-dependientes, se forman anticuerpos IgM, pero
nuevas estimulaciones con los mismos antge
nos dan lugar a IgG inmunes. Las caractersti
cas de estas variaciones en el curso de la res
puesta inmune se exponen en el captulo 8.
Hasta el momento no se ha podido demostrar
fehacientem ente que la IgM atraviese la p la
centa. Algunas pocas comunicaciones sobre el
hallazgo de esta protena en la sangre del cor
dn umbilical deben ser tomadas con cuidado,
hasta tanto no se conozca bien la capacidad de
sntesis de aqulla por parte del feto, ya que el
aporte de datos acerca de la sntesis temprana
de esta globulina es cada vez mayor.
La cadena polipeptdica designada cadena J
(joining) se encuentra asociada con las formas
polimricas de IgA y con el pentmero de IgM
(19S). Es un producto de sntesis de las clulas
p lasm ticas, tiene un peso m olecular de 15
kDa, es rica en restos -S H y se une a las men
cionadas inmunoglobulinas mediante uniones
disulfuro. Cuando la cadena J no es detectada
en los polmeros no tratados, puede ser eviden
ciada por la adicin, previa al anlisis inmunoelectrofortico o a la inm unodifusin, de
agentes reductores.
Es interesante destacar que en los diferentes
polmeros de IgA y en IgM 19S slo se ha de
tectado una cadena J por polmero.
La cadena J desempea un papel muy impor
tante en el proceso de polimerizacin. Hay for
macin de uniones covalentes de una cadena J
a dos unidades monomricas vecinas, indepen-

Anticuerpos
dientemente de los monmeros que compongan
el polmero. El hallazgo de pptidos a - J - a es
un argumento de valor en ese sentido. Estos es
tudios han servido tambin para demostrar que
la cistena preterminal de la regin C-terminal
de las cadenas a y probablemente de las ja. se
une a las cadenas J. La figura 5-22 muestra la
estructura esquemtica de la cadena J.
En clulas plasmticas elaboradoras de IgG
no polimriea se ha demostrado la presencia de
cadenas J, lo que indica que su hallazgo no
siempre significa polimerizacin. En los pol
meros su presencia es constante.
La IgMs (subunidad monomrica) intracelu
lar aislada no polimeriza espontneamente, si
no con previa reduccin; esto hace suponer que
los residuos de cistena responsables de las interuniones de las subunidades estn bloqueados
dentro de la clula.
Inmediatamente antes de la secrecin se in
corporan la cadena J y los hidratos de carbono
terminales.
Si bien la cadena J participa en la polimeriza
cin, no se tiene una idea clara de cmo ocurre
ello, ya que la IgM es siempre un pentmero, en
tanto que las clulas que sintetizan IgA, dispo
niendo de toda la maquinaria para la polimeri
zacin, dan productos constituidos por m on
meros, dmeros, trmeros y aun tetrmeros.
INMUNOGLOBULINA A (IgA)
Sinonimia: 7-13 S y globulina; p^A globuli
na; Y, A globulina.

95

SH
Met

"r

-----.A s p COOH

J _ _ _ ------- L _ pca

SH

F ig . 5-22. C adena J, estructura esquem tica.

Durante mucho tiempo ha sido inexplorada y

la mayor parte de la informacin que se tiene
proviene del estudio de mielomas de tipo IgA.
Se ha demostrado su actividad anticuerpo y
com probado que se encuentran ubicados en
ella algunos autoanticuerpos, tales como el an
tincleo, antitiroglobulina y antiinsulina. N o es
fijadora del componente Clq del sistema com
plem ento y el monm ero no es precipitante.
Fue considerada en un comienzo como porta
dora de la reagina alrgica, sensibilizante de la
piel, pero hoy sabemos que ello es patrimonio
de la IgE.
Una caracterstica muy particular de la IgA es
su marcada heterogeneidad, la que se debe a un
conjunto de componentes con constantes de sedi
mentacin que van de 7 S a 13 S, que se forman
por polimerizacin y son disociables por mercaptoetanol y urea en medio cido (fig. 5-23).
Su contenido en hidratos de carbono ocupa
un lugar interm edio entre la IgG e IgM . Los
valores son algo superiores al 7% y la relacin
hexosamina/hexosa es de 0,8. La IgA, al igual
que la IgM, no atraviesa la placenta.

Dmero (IgA)j

Fig. 5-23. Inm unoglobulina A (IgA).

96

Aspectos bsicos de ia inmunidad

F ig. 5-24. Estructura pro-,
puestci para la IgA.

La degradacin enzimtica con papana pro

duce subunidades 3,5 S constituidas por ppti
dos Fab y pequeos pptidos resultantes de la
degradacin enzimtica del fragmento Fe. Por
reduccin y alquilaein se obtienen pptidos L
y H. Las cadenas L son similares a las de otras
inmunoglobulinas: contienen los factores gen
ticos Km y los determinantes antignicos co
munes. Las cadenas H, en cambio, tienen ca
ractersticas propias. En cadenas
(IgA^) se
ha demostrado la presencia de factores genti
cos, a los que se denomina Am.
Dada la dificultad en la obtencin de frag
mentos proteolticos de esta inmunoglobulina,
similares a los logrados con IgG, las investiga
ciones inmunoqumicas se han hecho ms dif
ciles, en especial las relacionadas con su estu
dio secuencial. Se admite que su estructura es
la indicada en la figura 5-24.
La separacin y purificacin de una enzima
p roteoltica elaborada por el Streptococcus
sanguis, una bacteria aislada de heces hum a
nas, ha significado un aporte im portante al es
tudio de la IgA. Esa proteasa d iv a a la inm u
noglobulina en la zona de la bisagra, por enci
ma de los puentes S-S intercadenas H-H, dan
do origen a los pptidos F a b a y F ea, similar
este ltimo a los pptidos Fe de las otras inm u

Fig. 5-25.

noglobulinas. La separacin de ambos se con

sigue por filtracin a travs de Bio-gel P-200.
El F e a obtenido por este procedimiento puede
aislarse como monmero, con una constante
de sedimentacin 3,0 S y P.M. de 41,5 kDa, o
como dmero con un coeficiente de sedimenta
cin de 5,3 S. Por reduccin con ditiotreitol, el
dmero se transforma en monmero. La men
cionada enzima ha resultado efectiva en el elivado de IgA srica e IgA secretoria, perm itien
do en ambos casos obtener F ea. Segn algu
nos autores es efectiva sobre la Ig A l, no as
sobre la IgA2.
Se conocen dos subclases de IgA (IgA l e
IgA2), que difieren antignicamente y por su
contenido en galactosamina, aminoazcar que
slo est presente en la primera. Los pesos mo
leculares de las cadenas a , y
son de 58 kDa
y 52 kDa, respectivamente. En una forma alotpica de lgA2 (AmJ) se ha observado la ausencia
de puentes disulfuro intercadenas L-H, lo que
hace presumir que la integridad de la molcula
se debe a fuertes uniones no covalentes. La otra
forma alotpiea (Am^O tiene una estructura si
m ilar a la IgA l y en ambas las uniones L-H
son por puentes disulfuro (fig. 5-25).
En todos los casos su estructura normal es
Kj o

Subtipos de IgA.

Anticuerpos
Resulta interesante conocer que, si bien el
contenido de IgA es bajo en el suero sanguneo
normal (1,5-2,0 mg/ml), es relativamente alto
en otros fluidos tales como la saliva, lgrimas,
secrecin intestinal, fluido prosttico y calos
tro, especialmente en este tiltimo. Puede sepa
rarse de stos por filtracin a travs de Sepha
dex G-200 o por cromatografa en DEAE-celu
losa. A esta inmunoglobulina se la conoce co
mo IgA secretoria y difiere en ciertos aspectos
de la srica. Es predominantemente 11 S y est
asociada a un fragmento antignicamente dis
tinto de las cadenas L y H, llamado componen
te secretorio (S). El peso molecular de la IgA
secretoria es de 385 kD y consiste en dos subu
nidades monomricas de IgA (7 S) y el compo
nente secretorio de P.M de 70 kD, el que pare
ce estar unido covalentemente a slo una de las
unidades m onom ricas (fig. 5-26). La unin
entre las unidades 7 S es por puentes disulfuro
y en ella participa la cadena J de manera simi
lar a lo que ocurre en la formacin de los pol
meros 19 S de la IgM. La fijacin al com po
nente S es por uniones covalentes de puentes
disulfuro y uniones no covalentes.
La IgA secretoria, cuya frmula genrica es
(a^ k ^)2 S o ( a ^ ^ 2)2 S, es sintetizada por las c
lulas plasmticas ubicadas en el subepitelio, de
donde una pequea parte puede pasar a la cir
culacin general, mientras que el resto durante
el transporte a travs del epitelio glandular o de
la superficie intestinal fija el componente se
cretorio, previo a la secrecin. Este componen
te, que es elaborado por las clulas epiteliales,
le confiere a la inm unoglobulina propiedades
particulares, entre eUas una marcada resistencia
a la accin de las enzim as proteolticas (fig.
5-27). Actualmente se sabe que el componente
S est constituido por los cinco dominios extracelulares del RPolylg (receptor de IgM e IgA
polimricas, que normalmente transporta estas
formas de IgM e IgA a travs del epitelio intes
tinal y heptico) liberados por protelisis. Para
mayor informacin vase ms adelante Super
familia de las inmunoglobulinas y cap. 17.
La re s iste n c ia c o n fe rid a p ro b ab lem en te
constituya una necesidad biolgica, ya que se
considera que la IgA de las secreciones desem
pea un papel importantsimo en los m ecanis
mos de defensa de las m ucosas frente a los
agresores, especialmente bacterias y virus (in
munidad local). Para mayor informacin, van
se caps. 24 y 27.

97

el suero normal es de 0,03 m g.m f. M igra en la

zona de las beta lentas o gamma rpidas. Su
constante de sedimentacin es 7S.
Por digestin con papana y cistena da Ec y
Fab. Por reduccin y alquilacin con mercaptoetanol y iodoacetam ida libera cadenas L y
H(5) (P.M. 69,7 kD). Las cadenas L son comu
nes a las de las otras inmunoglobulinas y perte
necen a los tipos K y
(fig. 5-28). La relacin
cadenas k/X es 0,25.
No posee determinantes especficos de las
IgG, IgM, IgA e IgE, pero en cambio posee de
terminantes especficos propios correspondien
tes a sus cadenas H. Responde a la frmula
y
y ha sido identificada en otras especies
animales. En la superficie de linfocitos B del ra
tn se ha identificado una IgD similar a la hu
mana, con la que presenta reactividad cruzada.
Actividad especfica relacionada con esta in
munoglobulina ha sido demostrada en anticuer
pos antipenicilina, antiinsulina y antitoxina dif
trica. De su importancia fisiolgica se conoce
muy poco. Ha sido hallada como inmunoglobu
lina de membrana en linfocitos B, donde fun
ciona como unidad de reconocimiento de ant
geno en la respuesta inmune.

IN M U N O G LO BU LIN A D (IgD)
En el hombre, inicialmente fue hallada en un
caso de mieloma. Constituye el 1% de las in
munoglobuhnas totales y su concentracin en

IN M U N O G LO BU LIN A E (IgE)
Investigaciones efectuadas en la dcada de
los 60, han demostrado que el hasta entonces

98

Aspectos bsicos de a inmunidad

F ig . 5-2 7 . B io sn tesis de
IgA secretoria.

a circulacin
general

%
i
(igA),S

Epitelio glandular

Clula plasmtica

denominado anticuerpo reagnico humano, res

ponsable de la alergia atpiea, estaba localiza
do en una nueva inmunoglobulina, a la que se
denomin IgE o gamma E la que migra en la
zona de la IgA.
Su velocidad de sedimentacin en gradiente
de sacarosa es 7,8 S y su P.M. 185 kD. Por re
duccin y alquilaein se liberan cadenas H(e)
especficas (P.M. 72,5 kD) y cadenas L de tipo
K y A, de caractersticas similares a las otras ca
denas L ya conocidas. Su estructura es
y
y predominan las que contienen cadenas
K (fig. 5-29). Se fija a piel homloga, no as a
piel heterloga, y es la responsable de la anafi
laxia activa y pasiva homloga en el hombre.
Se fija a tejidos de primates, hecho que ha sido
aprovechado para numerosos estudios experi
mentales.

ss-

M ielom as identificados como de tipo IgE

han provisto material adecuado para completar
estos estudios.
Anticuerpos similares han sido reconocidos
en otras especies animales pero debido a su pe
quea cantidad no han podido ser estudiados
inmunoqumicamente.
Una inm unoglobulina del cobayo que re s
ponde a esas caractersticas ha sido aislada y
purificada por nosotros.
La IgE reducida con mercaptoetanol pierde su
propiedad de inducir reaccin anafilctica, no
porque haya modificado su capacidad para unirse
al antgeno, sino porque la reduccin de los
puentes S-S intercadenas H-H altera la capacidad
del fragmento Ec pai'a fijarse al receptor presente
en el mastocito o basfilo sanguneo. La IgE ca
lentada a 56C se comporta de manera similar.

0
1

o
X

o
X
o

H(5).
SS

-S S

OHC

-SS .

-SS

o
X
o

Fig. 5-28. P robable estructura de IgD.

o
X
o

Anticuerpos
Mayor informacin sobre el comportamiento
de la IgE podr hallarse en el captulo 32.
Protena de Bence-Jones
Sinonimia: gam m aglobulina microm olecular, yL globulina; 1,0-3,5 S y globulinas.
En la orina de mielomatosos se encuentra la
protena de B ence-Jones, de peso m olecular
aproximadamente 40 kD y constante de sedi
mentacin 3,5 S, que da reacciones inmunoserolgicas cruzadas con las inmunoglobulinas.
Se ha encontrado tambin que la orina normal
contiene vestigios de IgG y de gammaglobuli
na de bajo peso molecular, de aproximadamen
te 1,6 unidades de sedimentacin, que antigni
camente y por sus propiedades fisicoqumicas,
aun para el ensayo del calor, se comportan co
mo la protena de Bence-Jones. Fueron halla
das tambin en sueros humanos normales y se
las denomina y^ globulinas o microglobulinas.
Se han identificado dos tipos diferentes de
protenas de Bence-Jones, con cuyos antisueros
pudo clasificarse a las inm unoglobulinas en
dos grupos. La profundizacin de estas investi
gaciones ha permitido establecer que las prote
nas de Bence-Jones estn constituidas por ca
denas L y que contienen factores genticos Km
y los determinantes antignieos comunes pre
sentes en las inm unoglobulinas. Se conocen
formas monomricas de P.M. 23 kD, dmeros
de P.M. 45 kD y aun tetrm eros de P.M. 85
kD.
Experiencias efectuadas con radioistopos
indican que el aum ento de las protenas de
Bence-Jones en la orina, en los casos de mielomas, no es una consecuencia de la exagerada
metabolizacin de la IgG mielomatosa srica;
seran productos secundarios, colaterales, de la
sntesis globulnica. Su aumento en la orina en
estos casos se explicara como una consecuen
cia de la exagerada sntesis de la globulina
m ielom atosa por parte de clones de clulas
plasm ticas que han sufrido degeneraciones

t l 's s ^

o
X
O

H (e ).

L s s I
co

malignas y han adquirido la capacidad de pro li

ferar sin tasa, sin haber perdido el poder de sin
tetizar la globulina normal. Las protenas de
Bence-Jones son cadenas L libres que pueden
escapar como producto colateral y, como con
secuencia de su bajo peso molecular, ser excre
tadas por la orina, donde las formas dimricas
son las halladas con ms frecuencia. D ada su
homogeneidad, estas protenas han sido m uy
utilizadas para los anlisis secuenciales de las
cadenas L (fig. 5-30).
ltimamente se ha demostrado que el amiloide de las amiloidosis est constituido por el
dominio V ,, mezclas de V, y C; y cadenas L
enteras. Esto aclara una serie de hechos, en es
pecial los relacionados con la aparicin de am i
loidosis en los mielomas, ya que el amiloide no
sera ms que producto de la degradacin enzi
mtica de cadenas L.
En el cuadro 5-11 se encuentran resumidas
las propiedades ms significativas de las inm u
noglobulinas del hombre.
LOS HIDRATOS DE CARBONO
DE LAS MOLCULAS DE
INMUNOGLOBULINAS
Las inmunoglobulinas contienen hidratos de
carbono (heteropolisacridos), que norm alm en
te estn localizados en las cadenas H. Las cade
nas J, participantes de la polimerizacin de la
IgM e IgA, y el componente secretorio (CS) de
la (IgA)^S estn glucosilados; no lo estn, en
cambio, las cadenas L.
El contenido en hidratos de carbono v ara
para las diferentes clases de inmunoglobulinas,
o scilando esos valores entre 2% y 3% p ara
IgG, 7% y 11% para la IgA, 12% para la IgM ,
9% y 14% para la IgD y 12% para la IgE.
La unin de los hidratos de carbono puede
tener lugar por iV-glucosilacin u 0-glucosilacin, siendo sta muy poco frecuente en las in
munoglobuhnas. En el primer caso ocurre por

O O

0 o
1 1

L s s J 1' ls's 1

-SS

1ss -J

co co w
co co co

o
X

I
m

99

X
o

Fig. 5-29. Inm unoglobulina E (IgE).

r T

0
1
o

o
o

L s s 1

100

Aspectos bsicos de a inmunidad

cd
>

o
O
'O

hir
O

o
Fluidos en los que est p resente

3
o
(U

oUt
O
1
i

.2 1
g '&
o 'c^3
00

Fijacin a protena G

+ + , +
+ + + +

+ +

Fijacin a protena A

+ + 1+
+ + ' +

+ +

F ijacin a polim orfonucleares neutrfilos

+ 1+ +

+ +

4-

Reaccin con protena A del S. aureus

+ + 1+

Fijacin a m acrfagos

+ +

1 1

Fijacin a m astocitos heterlogos

+ 1+ +

1 1

1 1

Fijacin 0 m astocitos hom logos

P asaje placentario

+ +

Fijacin del com plem ento (va alterna)

l i l i

Fijacin del com plem ento (va clsica)

C antidad sintetizada (m g/kg/da)

Vida m edia fdas)
% de intravascular cataboUzada p o r da
D istribucin intravascular (%)
C oncentracin srica (m g %)

D om inios de la cadena Fl

Peso m olecular de la cadena H (kD)

+ +

1 1

m
co

CN
'O

r- r- r-- r-

-o

1 1

^ O r-- -H
CN r j
(N

CN

o o o o
(N On0^
00 (N

O O
r- ^

<DJS'O
2

^ '|O O O O
o o o o
p q q q
vn VT) 'vO'T'i

3 P
^

<N

lO

Tipo de cadena H

Flidratos de carbono %

1
i

q q
vn VT)

S o C
\D C
\jT> Ij

1 . 3

b a
ro ro co ro
(N CN CN r-1

3 *=: z3

Peso m olecular (kD)

T<3u o
^^g

\0 'O "O ''O

^ ^ ^ ^

Coefic. sedim entacin

00 00 00 00
!> i> i>

00 00
r- r--

Subclase

(N ro ^
OOO
OJ) bi) OX) b)

es
s
U

Clase

co
00

I ^
3si
~..o P

r-i fSj
< <

6
<OJj H
o

Anticuerpos

101

C u ad ro 5-12. Estructura de los oligosacri

dos obtenidos de una mezcla de inmunoglobu
linas de origen humano. /, ll, l l l y IV: estructu
ra de diferentes core hallados en conejo
Oligo.sacrido.s unido.'i a la.'i inm uno globulina.'^ po r N -g lu
cosilacin
A) Tipo com plejo
N euA ca2^6G al(3 1 -4 G lc N ac P | -2 M a n a I
^4M aii|3~4G lcN acf3|
-4G lcN ac-A sn

G lc N a c P i-

NeuAca2-6GaiPi-4GlcNacP|~2Mana )
B) R ico en m a osa
M a n a l- 2 M a n a K

'6
|-S-SR

M ana 1

M a n a l- 2 M a n a 1 '

Monmero

Dmero

M an P I -4 G lc N ac P | '4G lcN aC A sn
3

Fig. 5-30. P rotena de Bence-Jones,

M a n a 1-2 M a n a l-2 M ana 1 '

C) D iferentes C ore
M ana 1
M anP I-4 G lcN a cP (-4 G lc N ac -A sn
- 3

M ana 1 ^
Fuca 1

M ana U
6

' o

M an p |-4 G lc N a c P )-4 G lc N a c -A s n
3

III

G lcN ac p I -4 M a n |3 1 -4G lcN ac(3 ] -4G lcN ac-A sn

M ana 1

M ana 1
V

Pu= 1.

'b

G lc N a c P , -4 M a n P , -4 G lc N a c P , -4 G lc N ac -A sn

^^3

M an a 1

unin de un residuo de iV-acetilglucosamina al

amido grupo de una asparagina, el que debe es
tar formando parte del triplete Asn-X-Ser/ Thr,
mientras que en el segundo la unin se produce
por interaccin entre un residuo de N-acetilgalactosamina o galactosa con el grupo oxidrilo
de una serina o treonina.
Los azcares identificados en los polisacri
dos existentes en las diferentes inmunoglobuli
nas han sido A-acetil-D-glucosamina, A^-acetilD-galactosamina, cido A-acetil-neuramnico,
L-fucosa, D-galactosa y D-manosa. No todos es-

tn presentes en los polisidos ni guardan las

mismas relaciones inoleculares, aunque g en e
ralmente lo hacen en una combinacin p refe
rencial, constituida por un oligosacrido neutro
o core y el resto del polisido conform ado
por los restantes azcares. Este polisacrido de
tipo complejo se encuentra en todas las cla
ses de inmunoglobulinas. En algunas de ellas
se han identificado unidades de hidratos de car
bono ricas en maosa, carentes de cido si
lico y galactosa, las que son olivadas de la m o
lcula de inmunoglobulina por tratamiento con
la enzima endo-(3-glueosidasa H (cuadro 5-12).
La glucosilacin de las cadenas H y de las L
que tienen el aceptor Asn-X-Ser/Thr, norm al
mente ocurre por transferencia a una cadena
naciente del core de oligosacrido, a partir de
un lpido transportador, el dolicoldifosfato. La
transferencia del core a una cadena H nacien
te retrasa la elongacin del polipptido, dism i
nuyendo su velocidad de sntesis, hecho que
contribuye a corregir el desequilibrio entre la
sntesis de cadenas H y cadenas L. Durante el
perodo de glucosilacin, el core fijado es
procesado y elongado por adicin de azcares
terminales.
Las unidades de hidratos de carbono estn
localizadas principalmente en el fragmento Fe,
y en algunos casos (IgM, IgE) han sido detecta
das tambin en el Fd. En condiciones normales,
la IgG tiene una unidad por cada cadena H, y la
unin ocurre en el dominio Cj2. La IgM tiene
un promedio de cinco oligosacridos por cade
na ji,, cuatro en el Fe: (Cu^2:l; 0^3:2; C ^4 :l) y
uno en el Fd (C|^l); la IgE tiene seis unidades

102

Aspectos bsicos de la inmunidad

hidrocarbonadas, de las cuales tres estn en el

do m in io C e l (Fd) y las re sta n te s en el Fe
(C g2:l; Ce3:2). En la IgA l se han detectado
unidades de oligosacridos; cinco estn en el
dominio C a l, una en el C qc2, una en el C(x3 y
una unidad ha sido localizada en la zona FRl
del dominio variable (V a). En la (IgAj^S, ade
ms de las unidades sealadas deben aadirse
otras dos, una correspondiente a la cadena J,
presente tambin en la IgM, y otra en el com
ponente secretorio (CS). La IgD posee cuatro
unidades hidrocarbonadas en el dominio C51,
una en el C2 y dos en el CgS.
Un residuo de A^-acetilglucosamina unido a
una treonina, ha sido identificado en la zona de
la bisagra de slo una cadena y del 80% de las
molculas de IgG de conejo. Parecera que en
esta glucosilacin asimtrica el azcar protege
ra a la molcula de degradaciones biolgicas,
impidiendo el acceso de las enzimas proteolti
cas a dicha zona. Sobre el particular resulta su
gestivo el hallazgo en IgA e IgD de un residuo
azucarado similar, en la misma regin.
Los anlisis de protenas de mielomas han
demostrado que cadenas H y L de diferentes
inm unog lobulinas que poseen la secuencia
A snX-Ser/Thr pueden presentar glucosilaciones anmalas, que llegan a afectar diferentes
dominios, incluido el Fd.
Recientemente hemos podido demostrar que
los anticuerpos IgG no precipitantes (coprecipi
tantes) de diferentes especies anim ales estn
constituidos por molculas funcionalmente asi
mtricas (cap. 19), debido a que un oligosacri
do predominantemente rico en maosa se halla
insertado en slo uno de los Fab de la molcu
la. Ese oligosacrido, que se encuentra unido al
fragmento Fd, es el que altera el sitio de com
binacin y hace que el anticuerpo tenga un
comportamiento biolgico particular. La con
canavalina A -lectina que interacciona con po
lisacridos con grupos m anosilo o glucosilo
terminales-, covalentemente unida a Sepharosa
(Con A-Sepharosa), fija esos anticuerpos.
Ms curioso aun resulta el hecho de que
aproximadamente el 10% de las molculas de
IgG normales del hombre y del conejo se fijan
a Con A-Sepharosa, y que el ohgosacrido interactuante est localizado en el fragmento Fd
de slo uno de los Fab. Al igual que en el caso
de los anticuerpos coprecipitantes, la unidad hidrocarbonada predom inantem ente es del tipo
rica en maosa, y es clivada de la molcula
por tratamiento con endo-p-glucosidasa H.
Todava no est claro cul es la funcin que
cumplen los hidratos de carbono en la molcula
de los distintos isotipos de inmunoglobulinas.
En algunos casos parecera que juegan un papel
protector de la molcula al chvaje por enzimas
proteolticas, dificultando la exposicin de los

sitios de ataque. Hay datos experimentales que

hacen suponer que estos ohgosacridos partici
paran activamente en la secrecin de las mol
culas de anticuerpos. Si bien durante el pasaje
de la inmunoglobulina a travs de los elemen
tos membranosos de la clula hay incorpora
cin de carbohidratos, ello no es prueba sufi
ciente de la importancia de la glucosilacin en
la secrecin, ya que hay clulas plasm ticas
que slo secretan cadenas L que carecen de hi
dratos de carbono.
INMUNOGLOBULINAS DE
DIFERENTES CLASES DE
VERTEBRADOS
En distintas especies de vertebrados se han
descrito diferentes clases y subclases de inmu
noglobulinas a las que se ha tratado de relacio
nar con las identificadas en mamferos, espe
cialmente el hombre, dado que todas ellas tie
nen un ancestro comn (cuadro 5-13). El crite
rio seguido ha sido el de comparar propiedades
fisicoqumicas y biolgicas, tales como peso
molecular, movihdad electrofortica, coeficien
te de sedimentacin, contenido en hidratos de
carbono, capacidad para fijar el complemento,
pasaje placentario, sensibilizacin de piel ho
mloga y heterloga, reactividad frente a sue
ros especficos, etc. Pero esto no puede ser to
mado como definitorio ya que en algunas espe
cies de peces, reptiles y aves la ubicacin de
las inm unoglobulinas aisladas resulta difcil.
En variedades de ranas se han descrito anti
cuerpos de alto peso molecular, similares a la
IgM de mamferos, que resultan de la conden
sacin de seis subunidades. En algunos peces,
como las carpas, estos anticuerpos son tetramricos. Si bien son similares, no puede decirse
con certeza que sean realmente IgM.
Una mayor definicin se consigue a veces
comparando anlisis secuenciales. Como ejem
plo podra citarse el caso de la IgG (T) del ca
ballo, considerada por mucho tiempo relacio
nada con la IgA. Cuando se comparan los lti
mos nueve residuos C-terminales de la cadena
H de esta inm unoglobulina y los correspon
dientes a las cadenas y, a y )J, de IgG, IgA e
IgM humanas, no caben dudas de que su es
tructura presenta similitud con la IgG (cuadro
5-14). Si bien la comparacin de secuencias li
mitadas en algunos casos es suficiente para la
diferenciacin, en otros no lo es. En el cuadro
5-14 puede verse que los cuatro ltimos resi
duos C-terminales de IgA e IgM son idnticos
(Gly-Thr-Cys-Tyr).
Con respecto a la distribucin de las cadenas
K y
en las inm unoglobulinas de diferentes
animales, se ha observado que ms del 95% de

Anticuerpos

103

C uadro 5-13. Inmunoglobulinas de algunas especies de vertebrados

Inm unoglobulinas

Especie
7S
IgG
7S
5 ,7 S ,7 S

14S, I9S
IgM
I9S
19S

IgG l
IgG 2
IgG3
IgG 4

IgM

IgA

IgD

IgE

ratn

Ig G l
IgG 2,
IgC 2,
Ig 0 3

IgM

IgA

IgD

IgE

rata

Ig G l
IgG 2
IgG2,
lgG 2,

IgM

IgA

IgE

cobayo

Ig G l
IgG 2

IgM

IgA

IgE

conejo

IgG

IgM

IgA

IgE

perro

IgG

IgM

IgA

IgE

vaca

Ig G l
IgG 2

IgM

IgA

IgE

caballo

IgG ,
IgG ,
IgG ,
IgG (T)
IgB

IgM

IgA

IgE

oveja

IgG l
IgG 2

IgM

IgA

IgE

cabra

IgG l
IgG2

IgM

IgA

IgE

P eces
A nfibios
Reptiles
Aves
M am feros
hom bre

E n los casos en q u e slo fig u ra n los c o e ficien te s d e sed im entacin las in m u n o g lo b u lin as aisladas no estn relacionadavS c o n las clases d e i n
m u n o g lo b u lin a s co n o c id as o n o se co n o c en dato s estructurales p a ra estab le cer re la cio n es.

las inmunoglobulinas sricas del caballo con

tienen cadenas X, en tanto que no menos del
95% de las inmunoglobulinas del ratn contie
nen cadenas K. Es posible que ello sea conse
cuencia de las diferentes clases de inmunoglo

bulinas involucradas en las distintas etapas de

la respuesta inmune, sobre todo si se tiene en
cuenta que ambos animales poseen varias sub
clases de IgG y la distribucin kJX no es la m is
ma para todas ellas.

C uadro 5-14. Anlisis secuencial comparativo del nonapptido C-terminal

humanas y de IgG (T) equina
Secuencia
Inm unogtoblinas
1
IgG hum ana
IgG (T) equina
IgA hum ana
IgM hum ana

-G lu
- Glu
-M et
- M et

- Lys
- Lys
.- A la

- Ser

- Ser
- A sn
- G lu
- A sx

L eu
Val
V al
Thr

Ser
- Ser
- A sp
- A sp

6
-

Leu
H is
G ly
G ly

7
-

Ser
Ser
Thr
Thr

- Pro - G ly
- Pro - Gly
- Cys - Tyr
- Cys - Tyr

-C O O H
.-C O O H
- COOH
- C O O H

IgG, IgA e Ig M

104

Aspectos bsicos de la inmunidad

HOMOGENEIDAD
Y HETEROGENEIDAD
DE LAS INMUNOGLOBULINAS
Como ya indicramos al comienzo del cap
tulo, las inmunoglobulinas normales y los anti
cuerpos no son homogneos. A causa de ello,
en los anlisis electroforticos en acetato de ce
lulosa a pE[ 8,2 se observa en la zona de corrida
correspondiente una banda ancha, ms intensa
mente teida en el centro y difusa hacia los ex
tremos. Esto se comprende fcilmente si recor
damos que la carga neta de una protena, que es
la que determ ina su m ovilidad en un campo
elctrico, resulta de la suma de las cargas par
ciales de cada uno de sus aminocidos constitu
tivos. Siendo estas cargas, como consecuencia
de la heterogeneidad, distintas para cada una de
las molculas que componen las inmunoglobu
linas norm ales, el cam ino a recorrer por las
mismas ser diferente.
Si se hace una corrida electrofortica en ge
les de una IgG normal purificada y se separan
las zonas de mayor y menor movilidad, al co
rrerlas nuevamente se observar que ambas se
desplazan de una manera diferente. Las cade
nas L y H obtenidas de esas inmunoglobulinas
habrn de mostrar tambin distinta movilidad
electrofortica, evidenciable en forma de ban
das en gel de pohacrilamida.
Las protenas de mielomas y sus respectivas
cadenas L y H generalmente muestran por co
rrida electrofortica una banda neta que corres
ponde a la de una de las tantas molculas cons
titutivas de las inm unoglobulinas norm ales.
Las protenas de Bence-Jones y cadenas L de
inmunoglobulinas de mielomas dan, por elec
troforesis en gel de poliacrilamida, una o dos
bandas, las que corresponden a monmeros y
dmeros a diferencia de las 8 a 1 0 bandas que
se observan en las cadenas L de inmunoglobu
linas normales y que obedecen a fenmenos de
carga.
En algunas protenas de mielomas, no obs
tante su homogeneidad constitutiva se ha ob
servado ms de una banda electrofortica. La
causa de ello no es bien conocida. Experiencias
realizadas in vitro con cultivos de linfocitos
provenientes de ratones portadores de mielomas permitieron comprobar que la inmunoglo
bulina recientem ente sintetizada, que era ho
mognea, si se la marcaba con un tomo ra
diactivo y se la inoculaba a otro ratn de la
m ism a endocra, se volva heterognea en el
suero, dando por electroforesis en geles hasta
cinco bandas. Ello ha hecho que la heteroge
neidad electrofortica observada en protenas
de mieloma sea atribuida a variaciones de car
ga elctrica, causadas por la accin sobre aqu
llas de enzimas sricas, que provocaran prdi

das de grupos lbiles que no produciran dife

rencias en la estructura secuencial primaria, co
mo cido silico, grupos amido, etctera.
La heterogeneidad puede deberse tambin a
distintas glucoformas del pptido que contie
nen diferentes restos hidrocarbonados, como
consecuencia de la accin de distintas glucotransferasas.
LOS SITIOS ACTIVOS DE
LAS MOLCULAS DE
INMUNOGLOBULINAS
Edelm an, al considerar la hom ologa exis
tente entre los fragmentos constitutivos de las
cadenas L y H como consecuencia de la forma
cin de puentes disulfuro que originan bucles
de aproxim adam ente 60 residuos cada uno,
propuso la divisin de la molcula de inmunoglobuhna en dominios, identificados como V,
y V (variables) y C ,, Cj_, 1 ,
y C^,3 corres
pondientes a las zonas constantes, pivoteando
la molcula en la zona denominada gozne o de
la bisagra, ubicada en las proximidades de los
puentes disulfuro intercadenas H-H, la que no
muestra homologa con ninguna otra parte de la
cadena peptdica H. Esta zona es rica en resi
duos de prolina, aminocido incapaz de formar
una hlice a porque su tomo de nitrgeno for
ma parte de un anillo rgido y no es posible la
rotacin del enlace N-C. Esta interrupcin de la
hlice a origina un rizo o curvatura en la cade
na peptdica, que condicionara la flexibilidad
de los fragmentos Fab (fig. 5-31). Los dom i
nios de las inmunoglobulinas estn separados
entre s por cadenas peptdicas de 60-70 resi
duos, siendo la correspondiente a la zona de la
bisagra de mayor tamao. Se considera que ca
da dominio tiene una estructura tridimensional
similar y que origina un sitio activo relaciona
do con diferentes funciones de la molcula. El
dominio variable participa en la formacin del
sitio de combinacin o paratope del anticuerpo,
responsable de la especificidad, mientras que
los dominios ubicados en las zonas constantes
son efectores de funciones, algunas de las cua
les slo se expresan despus de la interaccin
antgeno-anticuerpo.
Los estudios sobre estructura tridimensional
de las inmunoglobulinas efectuados por difrac
cin de rayos X han demostrado que son pro
tenas multimricas con subunidades globula
res (dominios), formadas cada una de ellas por
aproxim adam ente 1 1 0 am inocidos, los que
despliegan un perfil comn de plegamiento tri
dimensional (folding). La estructura secun
daria predominante de estas subunidades es la
de hoja antiparalela plegada en |3 (p pleated
sheef). Cada subunidad contiene dos hojas pa

Anticuerpos

105

Inmunoglobulina
IgG
Fig. 5-31. D om inios de la IgG .

ralelas formando un sandwich o emparedado,

constituida cada hoja por 3 o 4 fibras antipara
lelas de aminocidos. El volumen interno est
formado por un empaquetamiento de sitios hi
drofbicos. Alrededor del 50% de los aminoci
dos de las inm unoglobulinas estn formando
parte de esta estructura. Las dos hojas plegadas
en P se hallan covalentemente unidas por un
puente S-S intracatenario, en una direccin
aproximadamente perpendicular al plano de las
hojas. Las diferentes fibras estn unidas entre s
por segmentos en P turn o codos (fig. 5-32).
Varias de las protenas presentes en superfi
cies celulares que participan en el reconoci
miento del antgeno, como el receptor de los
linfocitos T (RCT), el complejo CD3, las mol
culas Ig a e Igp asociadas al receptor de los lin
focitos B, incluidas dentro de la denominada
superfamilia de las inm unoglobulinas, p re
sentan esta estructura.
En las IgM e IgE existe un dominio Cj^4, co
mo consecuencia de que las cadenas H de estas

inmunoglobulinas, a causa de su mayor tam a

o, poseen cinco bucles por cadena. El nuevo
dominio en estas cadenas no est insertado d es
pus del Cj,3, sino que est ubicado entre los
dominios C^l y C,.,2 correspondientes a las ca
denas H de las otras inmunoglobulinas.
Estudios recientes de difraccin de rayos X,
realizados con inm unoglobulinas IgG m o n o
clonales cristahzadas, muestran que los dom i
nios V-Vj^ presentan una estructura tridim en
sional estable que se adapta a su funcin de si
tio de combinacin con el antgeno. Los dom i
nios Cj^ 1 y C,.,3 de una cadena H se encuentran
apareados con los de la cadena opuesta, en fo r
ma entrecruzada, dando lugar a una estructura
rgida. Los dominios C,.,2, en cambio, no se e n
trecruzan y se encuentran separados por dos ca
denas ramificadas de hidratos de carbono una
en cada dom inio- de aproximadamente 2 0 uni
dades, unidas por A^-glucosilacin. La estractura particular de esas cadenas es la que hace que
los dos dominios Cj^2 de la molcula se m an

106

Aspectos bsicos de la inmunidad

Cadena L

F ig . 5-32. Estructura de lm ina plegada en p de los dom inios variable (V L) y constante (CL) de una cadena L. (A daptado
d e M . Schiffer y col., Biochem istry, 12:4620, 1973.)

tengan separados, con la suficiente flexibilidad

com o para perm itirle cum plir determ inadas
funciones (fig. 5-33).

F ig , 5 -3 3 . E s tru c tu ra esq u e m tic a de u n a m o lcu la de

IgG , con sus dom inios, elaborada sobre la base de los da
tos conocidos, especialm ente los provenientes de estudios
cristalogrficos (C^HO hidratos de carbono).

Sitio de combinacin de los anticuerpos

En las inmunoglobulinas los fragmentos Fab
son los portadores de la actividad anticuerpo,
en tanto que el Fe es el responsable de las otras
propiedades biolgicas inherentes a la molcu
la entera.
En lo referente a la actividad anticuerpo, el
problema que se plante era saber; a) si ello era
consecuencia del plegamiento proteico o de la
secuencia de sus aminocidos constitutivos; b)
si estaba localizada en las cadenas L o FI, si
ambas participaban de esa actividad y cules
eran los fragmentos comprometidos; c) si el si
tio de combinacin era uniespecfico o pluriespecfico y d) cul era el tamao aproximado de
dicho sitio.
Diferentes hiptesis se plantearon
a)
La hiptesis sostenida inicialm ente por
Haurowitz de que la actividad anticuerpo era
consecuencia de una adaptacin de la inmunoglobulina al determinante antignico producida
durante su plegamiento dej de tener vigor des
de el momento en que se demostr, en un m is
mo animal, la heterogeneidad de los anticuer
pos para distintos determinantes antignieos.
Lo mismo ha ocurrido con la sustentacin de
Karush de que ella sera consecuencia del reor
denamiento de los puentes S-S que forman par
te de la molcula, ello sobre la base de que su
nmero es de 20-25 y posibilitara, estadstica
mente, la elaboracin de ms de 1 0 * molculas
diferentes. El hecho de que el fragmento Fab
tenga actividad anticuerpo y los S-S que con
tiene sean mnimos con respecto al total, res

Anticuerpos

107

tringe enormemente el ntimero de anticuerpos trar que la capacidad de unir ligando se encon
diferentes que podran lograrse. Adems, ac traba principalmente en las cadenas H. El expe
tualmente se sabe que una molcula de inm u rimento desarrollado en este sentido por M etz
noglobulina reducida y alquilada, que no posee ger y Singer consisti en reducir con mercapuniones covalentes de S, sigue manteniendo su toetanol y alquilar con iodoacetamida la IgG
actividad anticuerpo.
anticuerpo, que luego fue dializada en cido
Todo esto hizo suponer, teniendo en cuenta propinico 1 M, mezclada con e DNP-lisina y
las diferencias estructurales observadas entre filtrada por una colum na de Sephadex G -75
los anticuerpos, que su especificidad estaba re equilibrada con cido propinico 1 M que co n
lacionada con su estructura secuencial, la que a tiene 8 DNP-hsina 6 x 10 '^ M. La absorbancia
su vez determinara qu fuerzas termodinmicas de los productos de elucin fue medida a 280
obligarn a la molcula a adquirir una configu nm y 360 nm. Como control se efectu una e x
racin energticamente estable, que le permiti periencia anloga sustituyendo el anticuerpo
ra a sta cumplir con su funcin especfica.
antiDNP por IgG normal de conejo. Las lectu
b)
Los exmenes electroforticos en gel de ras espectrofotomtricas a 280 nm de los elu i
almidn de inmunoglobulinas normales de co dos permitieron ubicar los picos proteicos c o
bayo y anticuerpos con diferente especificidad, rrespondientes a las cadenas H (el que eluye en
previamente reducidas y alquiladas, mostraron primer trmino) y las cadenas L. Las lecturas a
diferencias que hicieron suponer en un comien 360 nm hicieron posible la ubicacin de la E
zo que las cadenas L fuesen responsables de la DNP-lisina por ser mxima su absorcin a esta
actividad especfica.
longitud de onda. Como puede verse en la fig u
A partir de IgG (T) de caballo, neutralizante ra 5-34, la cantidad mxima de ligando est fi
de la toxina diftrica y de anticuerpos antitet jada en las cadenas H, mientras que es insigni
nicos y antilecitinasa del mismo tipo, se pudo ficante en las L. Las cadenas H y L de IgG n o r
demostrar que la ruptura de los puentes S-S de mal no muestran fijacin de ligando.
la molcula por reduccin y alquilacin no m o
Por estudios de recombinacin de cadenas L
d ificab a su activ id ad anticu erp o . A dem s, y H se ha podido demostrar que hay complecuando se separaron las respectivas cadenas L mentacin entre ellas, que es ms m anifiesta
y H, se comprob que gran parte de dicha acti cuando derivan de una m ism a m olcula de
vidad estaba localizada en las cadenas H, la IgG, segin se deduce de los ensayos competiti
que era potenciada por cadenas L provenientes vos y no competitivos que a continuacin se
de la mism a molcula, no as por cadenas L transcriben. A partir de dos IgG homogneas,
procedentes de otra inmunoglobulina de la m is IgG() e IgG*'^ se obtuvieron sus respectivas ca
ma clase, pero eon diferente especificidad. Las denas L y H (HW,
H'W y U '>) y con esos
cadenas L, por su paite, prcticamente carecan productos se efectuaron ensayos de recom bina
de actividad anticuerpo. Todo esto hizo supo cin con los siguientes resultados:
ner que la especificidad estaba localizada en
una determinada secuencia de las cadenas H,
C adenas
Tipo
% de Ig G
que sera com plem entada por las cadenas L,
de ensayo
recoinhinadas gG fo rm a d a ob ten id o
asegurando de ese modo estabilidad al sitio de
H () + L <
H (>L <)
80
combinacin.
Que en la fijacin del determinante antigni N o com petitivo
H <) + L <>
HwL
80
co intervienen principalmente las cadenas H, se
deducira de los estudios de equilibrio de dili
H <"> L I
65
H () + L + LW
sis de cadenas L y H aisladas de IgG anti-p-azoH
w
L
<
>
)
20
fenil-p-lactsido y hapteno monovalente desa
C om petitivo
rrollados por Karush en los que se demostr una
H < L <">
20
mayor afinidad de las cadenas H por el ligando.
H w + L <) + L<w
H <) L <1
65
En este caso, el aislamiento de las cadenas H,
despus de la reduccin y alquilacin, fue he
cho por filtracin a travs de Sephadex G-200
usando buffer Tris IM pH 8 , adicionado de doTrabajando con anticuerpos IgG obtenidos
decil sulfato de sodio 0,03 M, lo cual evita el del mismo conejo, con igual especificidad pero
agregado de cadenas H que generalm ente se de distinta afinidad, se comprob que, al reproduce a pH cido, base de algunas de las crti combinar cadenas H y L, las molculas form a
cas a los resultados obtenidos por otros autores das de mayor afinidad para el antgeno eran las
que no haban tenido en cuenta este hecho.
obtenidas con cadenas H y L procedentes de
Aprovechando que anticuerpos de conejo an anticuerpos de alta afinidad, y que ella era infe
ti-DNP de alta afinidad pueden fijar hapteno rior cuando la IgG de recombinacin provena
(e DNP-lisina) a pH cido, fue posible demos de cadenas H obtenidas de anticuerpo de alta

108

Aspectos bsicos de la inmunidad

100

15 0

200

250

F ig . 5-34. G raficacin de los picos de elucin correspondientes a protenas (DO 280 nm ) y D PN -lisina (D O 360 nm ) de
Ig G de conejo norm al (-----) y anti D PN ( ) reducidas y alquiladas y filtradas por Sephadex G-75 equilibrado con cido
propinico 1 M y D N P-lisina 6 x IO'*M.

afinidad y cadenas L de baja afinidad. Ello es

una prueba evidente de la com plem entacin
entre las cadenas El y L en la elaboracin del
sitio da combinacin con el antgeno, y que esa
complementacin es ms efectiva entre las ca
denas H y L de una misma molcula.
Que la complementacin entre dos cadenas
es fundamental para la elaboracin de la estruc
tura tridimensional que cumple las funciones
de sitio de combinacin lo da el hecho de que
dmeros de cadenas L pueden fijar ligandos. En
la molcula de anticuerpo, esa complementa
cin tiene lugar entre los fragmentos V, y Vj,.
El interrogante que surgi es si hay residuos
particulares del sitio de combinacin compro
metidos en la determinacin de la especificidad
y en la conformacin de esa estructura comple
mentaria a la del ligando, que asegure la pro
duccin de una unin firme con ste mediante
la creacin de diferentes tipos de fuerzas no co
valentes estables.
Respecto de los posibles residuos compro
metidos en la elaboracin del sitio de combina
cin, se ha podido determinar, analizando anti
cuerpos de conejo antiovoalbmina, antseroalbmina bovina y antifenilarzonato que, al m e
nos en estos casos, un aminocido capaz de fi
jar iodo radiactivo, identificado luego como un
residuo de tirosina, form a parte del sitio de
combinacin. Ello ha sido posible por iodacin
mediante la tcnica diferencial, que consiste en
marcar el anticuerpo purificado con
y con
'^' al mismo anticuerpo previamente mezclado
con el hapteno, el que ha sido modificado de
modo que pueda dar con algn residuo del sitio
de combinacin una unin covalente estable.
Se mezclan luego los dos productos marcados
y se procede a la separacin de las cadenas L y
El, las cuales son sometidas a digestin trptica.
Los pptidos obtenidos son separados por cro
matografa en placa y electroforesis de alto vol
taje combinadas (mapas peptdicos), determi
nando en cada uno de ellos el contenido en '^^1

y '^'I y estableciendo la relacin

Para
aquellos que demuestren radiactividad y no es
tn comprometidos en la elaboracin del sitio
de combinacin, esa relacin ser prxima a la
unidad, siendo superior en el caso contrario.
Ello se debe a que, como consecuencia de su
interaccin con el hapteno, el pptido que for
ma parte del sitio de combinacin es inaccesi
ble al '^'I durante la iodacin. El anlisis se
cuencial posterior de ese pptido ha permitido
tener conocimiento de algunos de los residuos
de las cadenas L y H que participan en la unin
del anticuerpo al antgeno.
No obstante esos resultados, hasta el presen
te no existen argumentos vlidos que muestren
que uno o ms residuos particulares tengan par
ticipacin activa en la elaboracin del sitio de
combinacin de todos los anticuerpos.
Los estudios comparativos sobre variabili
dad de cadenas L y H de inm unoglobulinas
monoclonales de diferentes clases y especies
animales, y de las provenientes de anticuerpos
homogneos logrados en conejos por inocula
cin de algunos polisidos, entre ellos los de
neumococo tipo III (S-III) y tipo VIII (S-VIII),
son los que han suministrado la mayor infor
macin sobre posibles relaciones entre residuos
y especificidad. En los fragm entos V^ y V,_,
pueden observarse variaciones ocasionales, al
ternativas y mltiples. Las primeras responden
a variabilidad originada por mutaciones som
ticas, la segunda a alotipos y la tercera muy
probablemente a la relacin de dicho residuo
con la elaboracin de la especificidad del sitio
de combinacin del anticuerpo. Como puede
verse en la figura 5-35, el grado de variabilidad
(nmero de aminocidos diferentes en una de
terminada posicin/frecuencia del aminocido
ms comn en esa posicin) de las cadenas L
es mximo en las zonas de los residuos 24-34,
50-56 y 89-97. Analizando cadenas L de anti
cuerpos anti-DNP y de protenas de mieloma

Anticuerpos
Cadenas H

Cadenas L

100

100

90

90

80

80

70

70

60

60

50

50

40

40

30

30

20

20

ii

l .1-

si

10

10

109

o 10 20 30 40 50

m i

60 70

80 90 100 110 120

Posicin de ios am inocidos

O
O 10

20

1
30 40 50

60

70 80 90 100 110 120

Posicin de ios am inocidos

F ig . 5-35. Z onas de hipervariabilidad de cadenas L y H de origen hum ano. Las flechas verticales indican residuos s itu a
dos en las zonas de hipervariabilidad o prxim os a ella, y en los que m ediante estudios de afinidad se h a dem ostrado la
unin a haptenos. (Tom ado de C apra, J. D. y Edm unson, A. B. Scientific Am erican, 1977.)

de ratn con actividad anti-DNP, se encontr

que en el primer caso el residuo 87 fijaba hap
teno y en el segundo el residuo 32, situado este
liltimo en la primera regin hipervariable y el
primero muy prximo a los residuos que cons
tituyen la tercera regin de hipervariabilidad.
En las cadenas H, regiones de mayor variabili
dad estn com prendidas entre los residuos
31-35, 50-65 y 95-102, similares en su ubica
cin a las de las cadenas L.
Las zonas de hipervariabilidad determinan
tes de complementariedad se identifican como
C D R l, CDR2 y CDR3 (complementarity determining regin) y F R l, FR2, FR3 y FR4 (jramewori) a las zonas invariables interpuestas
entre ellas, que sirven para su organizacin.
- Estudios de estructuras prim aria y trid i
mensional de anticuerpos revelan que los ami
nocidos Tyr, His y Asn tienen cierta prepon
derancia a formar parte de los CDR.
Es evidente que en las cadena L y H dos de
las zonas de marcada hipervariabilidad se en
cuentran ubicadas posteriormente y prximas a
los residuos de cistena (23 y 8 8 para las cade
nas L y 22 y 92 para las cadenas H), que son
los que originan el puente disulfuro que da lu
gar al bucle de la regin variable de ambas ca
denas. Esta simetra en la localizacin de las
zonas de hipervariabilidad de las cadenas L y
H provee la estructura tridimensional del sitio
de combinacin, el que contiene los residuos
complementarios para su unin al determinante
antignico.
- Si bien la unin al antgeno involucra a los
fragmentos CDR del Fab, en ocasiones resi
duos de los fragmentos FR pueden estar com

prom etidos en estas interacciones. Se ha d e

mostrado, entre otros, que los residuos Trp 47H (HyHEL-5) y Thr 30-H (HyHEL-10) co m
ponentes de los FR de los respectivos anticuer
pos, interaccionan con la hsozima.
Como quedara especificado al referirnos a la
estructura de cadenas L, existen residuos fijos
de ghcina. En la posicin 99-101 la secuencia
ms comn es Gly-Gln-Gly o Gly-Gly-Gly. En
las cadenas H hay dos glicinas situadas en la
misma posicin y las secuencias ms comunes
son Gly-Gln-Gly, Gly-Arg-Gly o GlyGly. Se
considera que, dada su posicin, podran fu n
cionar como pivote para permitirle a esa zona
de la m olcula el mximo de flexibilidad de
modo de asegurar un buen contacto del antge
no con el sitio de combinacin del anticuerpo.
La figura 5-36 esquematiza la zona variable del
fragmento Fab (Fy) donde puede verse la u b i
cacin de las regiones de hipervariabilidad.
Los aminocidos con cadenas laterales aro
mticas constitutivas de los CDR pueden co n
tribuir significativamente en la unin al ligando
como consecuencia de su mayor tamao - l a
que im plica un mayor efecto hidrofbico--, su
mayor polarizacin -co n una mayor contribu
cin a la interaccin por fuerzas de Van d er
W aals-, y su habilidad para formar puentes de
hidrgeno - a travs de sus anillos aromticos o
de tomos polares en las cadenas laterales y,
adems, por su relativa rigidez ya que tienen
pocos grados de libertad y, como consecuencia
una menor prdida de entropa conformacional,
luego de la complejacin con el ligando.
Las cadenas alifticas apolares laterales de
Val, le y Leu son incapaces de participar en

110

Aspectos bsicos de la inmunidad

H,N

NH,

F ig . 5-36. Sitio de com binacin. E structura del fragm ento

v ariable de las cadenas L y H; ubicacin de las respectivas
zonas de hip e rv ariab ilid a d y de los resid u o s de cistena
(vase texto).

interacciones inicas y slo pueden hacerlo en

la unin al ligando a travs de interacciones de
Van der W aals y de efecto hidrofbico. T e
niendo en cuenta su grado de libertad rotado-

F ig . 5-37. D iagram a del esqueleto de los carbonos a del

com plejo lisozim a-Fab (anticuerpo m onoclonal anti-lisozima). En el fragm ento Fab (parte superior derecha), la cade
na H est indicada con trazo grueso, y con trazo delgado la
correspondiente a la cadena L, E n la parte inferior izquier
da, adosada al sitio de com binacin, est ubicada la lisozi
ma. (C orresponde al estudio tridim ensional de un com plejo
antgeno-Fab, analizado por difraccin de rayos X. R. Polja k y col., 1986. G entilm ente cedida por .su autor.)

nal, que puede ser congelado despus de la for

macin del complejo Fab-ligando, estos am i
nocidos tienen una contribucin negativa en
esta unin.
Las Asp estn involucradas en la formacin
de puentes de hidrgeno y resultan ms efecti
vas cuando estn localizadas en los CDR que
en los FR. Se supone que podran participar en
la estabilizacin de los bucles o loops.
La alta incidencia de residuos aromticos ex
puestos, as como el carcter apolar de las ca
denas alifticas laterales en parte de la superfi
cie del Fv, daran lugar a una estructura com
pacta que le conferira a la molcula su capaci
dad para unir diversos ligandos. La especifici
dad para un determinado antgeno provendra
de la precisa complementariedad de las superfi
cies interaccionan tes y de la correcta posicin
de los posibles grupos reactivos.
La variabilidad de las cadenas L, y conse
cuente creacin de diversificacin, resulta de la
asociacin de genes VI y JL (vase cap. 6). D i
cha asociacin genera diversidad en la tercera
zona de complementariedad (CDR3). Investi
gaciones recientes realizadas por Kimberly y
Capra con transcriptos de cadenas L de tipo k
generados con hgado fetal humano y linfocitos
de sangre perifrica, han demostrado que apro
ximadamente un tercio exhiba una variacin
de la longitud de CDR3, independiente del seg
mento gnico J k usado. El anlisis de la se
cuencia de nucletidos, revel que algunos de
los nuclotidos resultantes de la unin V k -J k y
que presentaban variaciones de CDRS, eran co
dificados por los genes V k y J k usados en estos
transcriptos. No obstante, cerca del 20% de los
transcriptos contenan adiciones de segmentos
N-terminales, resultados coincidentes con una
actividad sim ilar a la TdT (deoxinucleotidil
transferasa terminal). Esas observaciones su
gieren que TdT o una enzima anloga podra
ser activada en un porcentaje significativo de
linfocitos B humanos durante el rearreglo de
las cadenas L (vase cap. 2). Las variaciones en
la longitud de CDR3 en las cadenas L aumenta
el repertorio potencial y constituye una posibi
lidad adicional de generar diversificacin en la
molcula de anticuerpo.
De acuerdo con estudios de Padlan, del total
de la superficie de los CDR del Fv, slo el
26,5% y 28,4% es usado en la unin con el an
tgeno por los anticuerpos anti-lisozim a HyHEL-5 y HyHEL~10, respectivamente. Los re
siduos de los CDR que contactan con el ligan
do representan slo el 37,0% y 35,8% del n
mero total de residuos de los CDR.
Con respecto a los CDR3-L y CDR3-H se
presume que deben jugar un rol prominente, no
slo en la unin al ligando, sino tambin en la
unin con el dominio opuesto y en el contacto

Anticuerpos

111

con otros CDR. Probablemente no sea coinci llo, sino que es una superficie que presenta p ro
dencia que los dos CDR3 presentan el mximo tuberancias y depresiones con posibilidades de
de variabilidad y que CDR3-H sea quien presu interaccin con diferentes ligandos. La mayor o
me la mayor variabilidad en tamao y confor menor posibilidad de cpe el sitio de combina
macin, como lo han demostrado recientemen cin se una a ligandos diferentes depender del
te Wu y colab.
balance entre las fuerzas de unin y de repul
c)
Otro hecho que se debe considerar es la sin que se originen en esas interacciones, d on
uniespecificidad del sitio de combinacin del de muchas veces un nico residuo aminoaedianticuerpo. La pregunta que se formula es si las co del ligando o del sitio de combinacin del
zonas de hipervariabilidad de una determinada anticuerpo puede jugar un papel importante.
molcula configuran especificidad para un solo
Por ello, la especificidad de un suero inmune
ligando, o si en el sitio de combinacin existen debe ser considerada como un fenmeno de la
subsitios para ms de uno de ellos. Estas dudas poblacin total de molculas de anticuerpos y
surgen despus de haberse demostrado, en pro no necesariamente la propiedad de cada m ol
tenas monoclonales provenientes de mielomas cula de inmunoglobulina.
humanos y de ratn, la capacidad de algunas de
Estudios desarrollados por Poljak y col. so
ellas para fijar ms de un ligando. La IgM (K) bre estructura tridimensional de un com plejo
EH, aislada de un paciente con macroglobuli Ag-Ac cristalizado (lisozima de huevo de conemia de Waldenstrom, por ejemplo, fija gru dorniz-antilisozima) y del mismo antgeno con
pos dinitrofenol, grupos nitronaftil, ADN des el correspondiente fragmento Fab, hechos por
naturalizado, ARN, heparina, sulfato de dextra difraccin de rayos X a una resolucin de 2,8
no, cido poliestirensulfnico, cido ribitol tei A, muestran aspectos muy interesantes. La es
choico y polmero ribosa-fosfato de origen bac tructura terciaria del antgeno lisozima, d e s
teriano. La IgAj 460 de ratn fija DNP-lisina y pus de reaccionar con el Fab no presenta cam
menadiona (vitamina Kj), haptenos no relacio bios conformacionales respecto de la lisozim a
nados. En este caso se ha demostrado que, por nativa, y se comporta como un determ inante
modificaciones qumicas introducidas en el si antignico topogrfico en el que participan re
tio de combinacin, es posible conseguir que la siduos ubicados en diferentes partes de la m o
capacidad ligante sea para el grupo DNP o vi lcula, algunos bien distantes entre s. Estos e s
ceversa. Si bien esto sugerira en forma indi tudios muestran adems que la estructura cua
recta la existencia de subsitios no continuos pa ternaria del sitio de combinacin del anticuer
ra estructuras de determinantes antignicos no po, no constituye un simple bolsillo en el que
relacionados, en inmunoglobulinas monoclona se insertara el epitope y en cuya formacin in
les provenientes de mielom as, estos estudios tervendran las regiones determinantes de com
deben ser extendidos a poblaciones de an ti plem entariedad de los fragm entos v ariables
cuerpos para obtener respuesta definitiva. En
(CDR), sino que se extendera a lo largo de
un comienzo se hipotetiz (Richards y Konigs- ellos como una superficie plana con protube
berg) que podran existir diferentes clulas for rancias y depresiones originadas por las cade
madoras de anticuerpos que originaran inm u nas laterales. Un rea extensa del antgeno se
noglobulinas con sitios de combinacin m lti pone en co ntacto con el Fab, y lo hace de
ples, no iguales, en los que la especificidad pa acuerdo con la topografa de ambos. Las protu
ra un ligando podra estar repetida en varias de berancias y depresiones del ligando y del anti
ellas. Por estim ulacin antignica se origina cuerpo facilitan el contacto y las interacciones
ran inmunoglobulinas diversas con especifici entre los residuos para formar las uniones no
dad para ligandos distintos (no esencialmente covalentes, de una manera similar a lo que o cu
los mismos en cada molcula), pero todos eon rre en las interacciones protena-protena. En el
especificidad para el antgeno inductor. Ello sistema estudiado, 16 residuos de la lisozima y
hara que en una poblacin de molculas de an 17 residuos del Fab hacen contacto, correspon
ticuerpos para un ligando todas tuvieran espe diendo 10 de ellos a la cadena H. La m ayor
cificidad para ste, y que la relacionada con los parte de esos 17 residuos estn ubicados en la
restantes se viera diluida como consecuencia tercera zona de hipervariabilidad (CDR3).
de la participacin de clones mltiples.
En algunos casos la simple sustitucin de un
Estas especulaciones fueron hechas conside aminocido en el antgeno vara enormemente
rando el sitio de combinacin como un bolsillo, la especificidad, como se ha observado en lisocon varios subsitios, y que cada ligando para zimas de huevo de distintas especies animales
interaccionar tendra que insertarse en l. In cuando reaccionan con el fragmento Fab del
vestigaciones recientes que se describen ms anticuerpo monoclonal especfico para la liso
adelante, desarrolladas con anticuerpos mono zima de huevo de codorniz. Este hecho y otros,
clonales, muestran que el sitio de combinacin como la diferente afinidad de anticuerpos espe
del anticuerpo con el antgeno no es un bolsi cficos para un m ism o ligando, las bases e s

112

Aspectos bsicos de la inmunidad

tructurales de las reacciones cruzadas de un an

ticuerpo con antgenos heterlogos, los anti
cuerpos heteroclticos y las reacciones idiotipoantiidiotipo, son fcilmente entendibles con el
modelo de sitio de combinacin del anticuerpo
descrito por estos autores. Estudios hechos por
Padlan y col. con diferentes anticuerpos mono
clonales especficos para hsozima de clara de
huevo, permitieron demostrar que, para el mis
mo ligando (lisozima), los aminocidos de los
Fab que interaccionan con el antgeno no son
los mismos para los distintos anticuerpos (cua
dros 5-15A y 5-15B).
La figura 5-37 corresponde a un diagram a
del esqueleto de los carbonos a del complejo
lisozima-Fab antilisozima, y la figura 5-38 a
esa misma interaccin con indicacin de los re
siduos del ligando y hgante que interaccionan.
A diferencia de lo que se supona, se ha
comprobado que los paratopes o sitios de com
binacin con el antgeno no adoptan mltiples
conformaciones surgidas al azar como conse

cuencia de sus aminocidos constitutivos. Tra

bajando con varias inmunoglobulinas monoclo
nales se demostr que usaran para cada regin
variable CDR slo unas pocas conformaciones
a las que se denomina estructuras cannicas,
las que estaran determinadas por un reducido
nmero de aminocidos ubicados en sitios es
pecficos de las zonas hipervariables. Esas es
tructuras bsicas son las que se indican en la fi
gura 5-39.
d)
Una apreciacin sobre el tamao del sitio
de combinacin de un anticuerpo fue inicial
mente lograda por ensayos de inhibicin, ha
biendo resultado tiles en este sentido los anti
cuerpos antidextrano (poli-D-glucosa), antipolialanina y DNP-polilisina.
La inhibicin de la interaccin especfica an
tgeno-anticuerpo por oligosacridos y oligopptidos, medida al 50% de efectividad, permi
ti comprobar que aqulla se consigue con oligmeros de 5 a 6 residuos. En el caso del DNP
(lisina)n se ha observado que el mximo de in-

F ig . 5 -3 8 . E n el m o d e lo q u e se
m u e s tra lo s to m o s d e l a n tg e
n o ( li s o z i m a ) y d e l F a b a n t i
c u e rp o e s t n r e p r e s e n ta d o s en
su t o ta l id a d c o m o e s f e r a s d e
1,7 d e r a d io . A-. e s tr u c tu r a
d e l c o m p le jo a n tg e n o F a b ( a n
t ic u e r p o ) , L a s c a d e n a s H d e l
f r a g m e n to F a b e s t n c o l o r e a
d o s en a z u l, y e n a m a r illo las
c a d e n a s L, L a lis o z im a e s t c o
l o re a d a en v e rd e y su r e s id u o
G ln 1 2 1 , q u e j u e g a u n p a p e l
m u y im p o rta n te e n la e s p e c ifi
c id a d , e n ro jo , B : lo s m o d e lo s
c o rr e s p o n d ie n te s a l is o z im a y
al F a b h a n s id o s e p a ra d o s p a ra
m o s t r a r la s p r o t u b e r a n c i a s y
d e p re s io n e s en las s u p e rf ic ie s
c o m p le m e n ta ria s.

Anticuerpos

113

F ig . 5-38 (cont.) C: s u p e rfic ie d e c o n ta c to del F ab y d e l a n tg e n o . L o s r e s id u o s in te ra c tu a n te s e st n n u m e ra d o s y c o lo r e a

d o s en ro jo , a e x c e p c i n d e la G ln 121 d e l a n tg e n o , q u e lo e s t en v io le ta . L o s re s id u o s d e la c a d e n a L q u e c o n ta c ta n c o n
e l a n tg e n o s o n ; 1 (H is 3 0 ), 2 (T y r 3 2 ), 3 (T y r 4 9 ), 4 ( T y r 5 0 ), 5 (P h e 9 1 ), 6 (T rp 9 2 ) y 7 (S e r 9 3 ). L o s d e la c a d e n a H : 8
(T h r 30), 9 (G ly 31), 10 (T y r 3 2 ), I I (T rp 5 2 ), 12 (G ly 5 3 ), 13 (A sp 5 4 ), 14 (A rg 99), 15 ( A s p 100), 16 (T y r 101) 17 ( A r g
102). L os re s id u o s d e la lis o z im a q u e c o n ta c ta n co n el a n tic u e rp o son: 1 (A s p 18), 2 (A sn 19), 3 (A rg 2 1 ), 4 (G ly 2 2 ) , 5
(T y r 23), 6 (S e r 2 4 ), 7 (L e u 2 5 ), 8 (A sn 2 7 ), 9 (L ys 1 16), 10 (G ly 117), 11 (T h r 118), 12 (A s p I 19), 13 (V a l 120), 14 ( G ln
121), 15 (lie 124), 16 (L e u 129). (L o s n m e ro s e n tre p a r n te s is in d ic a n el o r d e n d e s e c u e n c ia .) (C o rre s p o n d e al m is in o e s
tu d io in d ic a d o e n la fig u ra 5 -3 6 . F o to g ra fa s g e n tilm e n te c e d id a s p o r el D r. R . P o ja k .)

hibicin se consigue con DPN (lisina), y que

igual potencia inhibitoria tienen DNP (hsina)g y
DNP (lisina),. Resultados similares se han obte
nido con anticuerpos antidextrano (fig, 5-40).
Ello indica que el tamao del sito de combina
cin debe ser tan grande como para rodear a
aqullos, lo que significa el compromiso de
aproximadamente 15-30 residuos de los 1.300
que constituyen una molcula de anticuerpo.
Eos estudios cristalogrficos han permitido
calcular que el rea del anticuerpo que interacciona con un epitope tiene un tamao aproxi
mado de 700 A^.
Otros sitios efectores de
las inmunoglobulinas

Localizacin de los sitios. Como ya se indi

cara, adems de los dominios V^j y Vj^ que par
ticipan en la formacin del sitio de combina
cin de la molcula de anticuerpo, o paratope
segn la propuesta de Jem e (vase cap. 4),
existen en los fragmentos constantes de las ca
denas H otros dominios, que son efectores de
funciones, algunas de las cuales se ejercen di
rectamente, en cambio otras slo tienen lugar
despus de la unin antgeno-anticuerpo. Entre
esas propiedades figuran la capacidad de acti
var el sistema complemento a travs de la va
clsica (fijacin de Clq) o de la va alterna, de

fijarse a mastocitos homlogos o heterlogos,

de unirse a linfocitos B, de atravesar mem bra
nas biolgicamente activas (placenta, pared in
testinal del recin nacido), de fijarse a la prote
na A del Staphylococcus aureus, de regular el
ciclo catablico de la molcula proteica de la
que form a parte, de fijarse a macrfagos,, de
reaccionar con factor reumatoideo, etc, La m a
yor parte de esas funciones estn localizadas en
el fragm ento Fe, en los dominios
y C^S
para la IgG e IgA, y en los C,_,2, Cj^3 y Cj^4 p a
ra la IgM e IgE.
Si bien el fragmento Ec completo separable
por tratam iento papanico conserva prctica
mente intacta la actividad de la molcula com
pleta, los dominios aislados se muestran m uy
poco efectivos no obstante existir pruebas indi
rectas de que algunos de ellos son los responsa
bles de determinadas funciones. Se ha observa
do que los fragmentos Ec y pEc de IgG, cons
tituidos casi exclusivam ente por el dom inio
Cjj3, si bien conservan algunos determinantes
antignicos de la molcula entera y la capaci
dad de reaccionar con algunos factores reumatoideos, carecen de la mayor parte de las pro
piedades del fragmento Fe, lo que hace suponer
que gran parte de la actividad de este fragmen
to est localizada en el dominio Cj^2. Un frag
mento de IgG2a de ratn, obtenido por trata
miento enzimtico, que responde a las caracte-

114

Aspectos bsicos de la inmunidad

Fig. 5-39. A . E l s itio d e c o m b in a c i n d e lo s
a n tic u e rp o s e s t f o rm a d o p o r se is b u c le s o c o
d o s, tre s c o rre s p o n d ie n te s al d o m in io V. ( L l ,
L 2 y L 3 ) y tre s al d o m in io V ( H l , H 2 y H 3 ).
B . E s tru c tu ra s c a n n ic a s p ro p u e s ta s p a ra la s r e
g io n e s h i p e r v a r i a b le s d e lo s d o m in io s V k y
V H . L a s u p e rf ic ie a c c e s ib le al a n tg e n o es la
u b ic a d a e n la p a rte s u p e rio r d e las fig u ra s y en
la p a rte in fe rio r la c o rre s p o n d ie n te a la e s tr u c
tu ra rg id a . S e m u e s tra n la c o n fo rm a c i n d e la
c a d e n a p r in c ip a l y a lg u n a s c a d e n a s la te ra le s
d e te r m i n a n te s d e la s e s tr u c tu r a s c a n n ic a s .
(A d a p ta d o d e C h o th ia C ., L e s k A . M ., T r a m o n
ta n o A . y c o l., N ature 3 4 2 :8 7 7 , 1989).

al a n tg en o

Vk

Ll
26

26

||g

L2

L3

VH

26
Phe 2 9 ^

Anticuerpos
rsticas de ese dom inio, ha dem ostrado fijar
Clq, pero su capacidad para activar el sistema
complemento es menor que la del Fe entero.
Se ha demostrado que en la fijacin de C lq a
la IgG l (Ejj.) humana, tienen activa participa
cin los residuos Glu (318), Lys (320) y Lys
(322), ubicados en la parte externa del dominio
CH2, disposicin que facilitara un contacto di
recto con C lq . La unin de protema A (frag
mento B) a IgG l tiene lugar en las proximida
des de la unin de CH2 y CH3.
En la IgG l de cobayo, el dominio responsa
ble de la activacin del complemento por la va
alterna (vase cap. 22) pareciera que es el C H l,
contenido en el fragmento Fd.
El fragmento Fe de la IgA humana es el que
fija el componente secretorio y las cadenas J, y
en el caso de la IgE, slo el Fe entero (P.M. 94
kDa) conserva la capacidad de fijacin a m as
tocitos hom logos, no as el F e de P.M. 57
kDa.
Resulta difcil establecer con seguridad la lo
calizacin de los sitios activos de la porcin
constante de las cadenas H, ya que la inefecti
vidad de dom inios aislados puede deberse a
modificaciones conformacionales derivadas de
los tratamientos enzimticos usados para su ob
tencin. Parecera que los puentes S-S intercatenarios ubicados en la regin de la bisagra y
que form an parte del fragm ento Fe tuvieran
cierta significacin en el mantenimiento de la
actividad de este fragmento. La reduccin de
esos puentes eon mereaptoetanol determina que
la capacidad de la IgG de unirse a Clq y de fi
jarse a m acrfagos dism inuya considerable
mente. La IgE sometida al mismo tratamiento
pierde su capacidad para fijarse a mastocitos
homlogos.
Si bien inmunoglobulinas diferentes pueden
tener propiedades biolgicas similares, ello no
significa que los sitios implicados sean los m is
mos. Dos inmunoglobulinas pueden fijarse a un
mismo receptor pero con distinta afinidad, por
no ser iguales sus estructuras, lo cual puede de
mostrarse por competicin. Pueden unirse tam
bin a receptores muy prximos y la fijacin de
una de ellas crear un impedimento estrico para
la unin de la otra, o ejercer la misma funcin
por unin a receptores distintos no prximos.
En consecuencia, es difcil establecer correla
ciones entre dominios de diferentes inmunoglo
bulinas con respecto a una funcin biolgica
compartida por ambas.
Las inmunoglobulinas IgG e IgM fijan Clq
con distinta afinidad, siendo la ltima la ms
efectiva. De las subclases de IgG humana, la
IgG3 es la que fija ms firmemente Clq, h a
cindolo en orden decreciente la IgG l e IgG2.
La IgC4 no fija el complemento. Los dominios
responsables de ello no son los mismos y esa

115

actividad corresponde al CH2 (P.M. 17 kDa)

de la IgG y al C4 (P.M. 6 ,8 kDa) de la IgM.
En el caso del ratn, la fijacin a macrfagos
de los anticuerpos de tipo IgM e IgG n o es
competitiva; la primera es Ca^+ dependiente.
En el cuadro 5-15 figuran algunas de las pro
piedades atribuidas a los diferentes dom inios
de la IgG.
Cmo fu n cio n a n los sitios efectores. Hay
funciones que son puestas en marcha p o r la
molcula de inmunoglobulina, sin necesidad de
interaccin previa con el antgeno. Entre ellas
est la capacidad para atravesar la placenta, la
unin a la protena A del Staphyococcus a u
reus y el control del ritmo catablieo. Se h a de
mostrado que esas funciones son inherentes al
fragmento Fe sin la participacin del fragmento
Fab. La estructura del fragmento Fe, segn la
clase o subclase de inmunoglobulina de la que
provenga, determ ina que su funcionam iento
pueda ser distinto. En el caso de la regulacin
del ritmo catablieo, la degradacin de IgG es
t en relacin directa con su concentracin sri
ca, no as para la IgM e IgA. El catabolismo de
la IgD est en relacin inversa a su concentra
cin.
La IgG humana intravascular catabolizada
por da vara segn la subclase, siendo del 17%
para la IgG3 y del 7% para cada una de las res
tantes, lo que determina que la vida m edia de
estas ltimas sea de 21 das y slo de 7 das la
de la IgG3.
En la puesta en m archa de otros procesos
biolgicos mediados por anticuerpos es in d is
pensable la interaccin previa con el antgeno
para que aqullos se efectivicen. Numerosas in
vestigaciones han sido desarrolladas con el ob
jeto de conocer el m ecanism o de esa activ a
cin, y todas ellas apuntan a dos posibilidades.
Una es la que considera que la interaccin del
antgeno eon el anticuerpo induce en ste cam
bios conform acionales, y que esa estru ctu ra
adaptada sera la que tendra mayor afinidad
por el receptor, dando una unin firme y esta
ble capaz de poner en marcha un proceso. Si
bien por estudios de dicrosmo circulai' se han
podido detectar cambios de esa naturaleza, y en
algunos casos considerrselos como responsa
bles, la m ayor parte de los autores p arecen
coincidir en que no constituyen una regla gene
ral. La otra posibilidad estima que lo que debe
jugar un papel muy importante es la formacin
de un retculo estable que, consecuentemente,
aumentara la afinidad por el receptor y, si esto
ocurre sobre una membrana celular, el retculo
formado inducira modificaciones que podran
llevar a una redistribucin de los receptores de
superficie. Esta modificacin sera la que indu
cira a la clula a cumplir una funcin determ i
nada. Entre los argumentos en favor de esta in-

116

Aspectos bsicos de la inmunidad

II

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Anticuerpos

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117

118

Aspectos bsicos de ia inmunidad

F ig . 5-40. 50% de in
hibicin por o ligosac
ridos de isom altosa a la
p r e c ip ita c i n d e 1 m i
de suero anti-d ex tran o
por dextrano.

Inmoles de oligosacrido aadido

terpretacin est el hecho de que la IgE entera

fijada a mastocito slo puede desencadenar una
reaccin de hipersensibilidad inmediata cuando
reacciona con un antgeno bivalente o poliva-

C u a d ro 5-16. A lgunas de las pro p ied a d es

atribuidas a los dominios constantes de la IgG
Fragm ento

Fe

F c

pF c

D om inios constitutivos

C 2 C 3

C3

C3

Especificidad de cla.se

-1-

E specificidad de subcla
se

Especificidad alotpica

C apacidad de com bina

cin con el Ag
U nin al factor reum a
toideo

Fijacin del com plem en

to (va clsica)

-1 -0 -*

0- *

lente. Los haptenos simples y antgenos monovalentes carecen de esa propiedad, al igual que
los fragmentos Fab del anticuerpo reagnico.
E sta ltim a interpretacin estara ms de
acuerdo con los hechos, ya que la IgE sola se
fija firmemente al receptor de los mastocitos,
pero la liberacin de histamina recin ocurre
cuando se produce la interaccin con un ligan
do bivalente.
La fijacin de Clq a la molcula de IgG e
IgM libre es un hecho conocido, pero esta fija
cin no lleva a la activacin del sistema com
plemento si la inmunoglobulina no ha formado
un complejo Ag-Ac o ha sido agregada por m
todos fsicos o qumicos. Se presume que ello
puede deberse a que la agregacin expone un
nmero mayor de receptores por Clq -m olcu
la con seis sitios reactivos sim ilares- y que, co
mo consecuencia, se originara un aumento en
la afinidad de la unin. Esta unin firme y esta
ble, con cambios en la conformacin de Clq o
sin ellos, sera la que asegurara su capacidad
para iniciar la activacin de los restantes com
ponentes del sistema complemento (fig. 5-41).

F ijacin a m astocitos he
terlogos

-t-

VARIACIONES ALOTPICAS

C om binacin con la pro

tena A del S. aureus

-1-

H-

En las cadenas L y H de las inmunoglobuli

nas del hombre y de otros vertebrados se han
sealado variaciones alotpicas, correspondien
tes a la presencia de ciertos pptidos que fun
cionan como epitopes o determinantes antignicos y que son heredados de acuerdo con las
leyes de Mendel. Algunos de los alotipos son
conform acionales, por lo que necesitan estar
asociados a otras cadenas polipeptdicas para
que puedan expresarse, de modo que su estruc
tura tridimensional se mantenga. Se los deno
mina tambin factores genticos, son recono
cidos por los receptores antignieos de las clu-

C apacidad para atravesar

m em branas biolgica
m ente activas:
placenta
intestino
C ontrol del ritm o catablico

S lo algunos factores gen tic o s h an sido d e te ctad o s en el d o m i

n io C,.,3
** C o rre s p o n d e a en sa y o s efe c tu a d o s en ra to n e s re c i n n a c id o s,
c o n frag m en to s de IgG de co n e jo (M o rris, T, G. Proc. R. Soc. B.
160: 276, 1964.)

Anticuerpos

119

F ig . 5-41. Posibles m ecanism os de iniciacin de funciones biolgicas reguladas por los sitios activos ubicados en el frag^
m ent Fe de las inm unoglobulinas. A. U nin de inm unoglobulina libre a un receptor (pasaje placentario, regulacin d e rit
m o catablieo; fijacin a la protena A del Staphyococcus aureus). B. F orm acin de un retculo A g-A c-receptor q ue o rig i
na m odificaciones en la m em brana celular (hipersensibilidad m ediada po r anticuerpos citotrpicos). C. 1) Form acin d e un
com plejo de baja afinidad (fijacin de C lq a la IgG libre, sin activacin de los restantes com ponentes de com plem ento). II)
Form acin de un com plejo de alta afinidad (fijacin de C lq a un com plejo A g-A c con subsecuente activacin de los otro s
com ponentes del com plem ento.

las B y T y pueden ser simples o complejos. El

origen de los primeros puede explicarse fcil
m ente por m utaciones som ticas, las cuales
pueden haber originado formas allicas de un
mismo locus. El origen de los alotipos comple
jos es ms difcil de concebir y sobre el parti
cular se han formulado diferentes hiptesis.

Los distintos alotipos estn bajo el respecti

vo control gentico de locus segregados in d e
pendientem ente. Son autosmicos y codom inantes, lo cual significa que se expresan en heterocigotas y son independientes del sexo.
En las cadenas L de tipo k humanas han sido
identificados los alotipos Km, y los Gm y Am

C uadro 5-17. Nomenclatura y localizacin de los alotipos ms frecuentes del hoi.ibre y conejo
Especie

L ocus

Localizacin

A lotipos

G lm

C yl (C I)

G lm (4 )
G lm (1 7 )
G lm ( I)
G lm (-I)
G2m (23)
G 2m (-23)
G 3m(5)
G 3m(-5)
G3m (15)
G3ni(16)
G3m (21)
G 3m (-2I)
G 3m(6)
G 3 m (ll)
G 3 m (-ll)
G 3m (13)
G 3m (I4)
G 4m (4a)
G 4m (4b)
A 2 m (l)
A 2m (2)
K m (l)
K m (l,2 )
Km(3)

Aminocido.^ com prom etidos*

H om bre

Cyl (C3)
G 2m

Cy2 (C2)

G3m

Cy3 (C,.,2)

Cy3 (C3)

Cy4 (G2)
C a 2 (C3)
G 4m

C[-

A 2m
Km

A rg (214)
Lys (214)
A sp(356)-G lu-L eu(358)-T hr-L ys
G lu(356)-G lu-M et(358)-T hr-L ys

Tyr(296)
P he(296)
P he(436)
Tyr(436)

P h e(4 1 1 )-A sp(428)-V al(458)-V aI(467)

T h r(4 1 1)-G lu(428)-Ile(458)-A la(467)
V al(I5 3 ), Leu(191)
A la(I5 3 ), L eu(19I)
A la(I5 3 ), V al(191)

Conejo

V
c,
c.
Ms

c.

A l, A2, A3
B4, B5, B6, B 9
C l, C21
d ll
d l2
e l4
e l5
M sl6 , M sl7

' E n m ero e n tre p arn tesis c o rresp o n d e a la ubicacin en la s e c u e n c ia am in o ac d ic a.

S ustituciones mltiples
Sustituciones miiltiples
M et(225)
Thr(225)
Thr(309)
A la(309)

120

Aspectos bsicos de la inmunidad

en las cadenas y y a de las inmunoglobulinas

IgG e IgA, respectivamente. Los alotipos de las
cadenas H (Gm y Am) estn asociados con las
diferentes subclases de inmunoglobulinas y go
bernados por loci relacionados, algunos de los
cuales son multiallieos.
Si bien en un comienzo existi cierta anar
qua en la nomenclatura de los alotipos, actual
mente se identifican con las letras que se co
rresponden con la clase y subclase de cadenas
H, seguido de m y de inmediato y entre parn
tesis el nmero del alelo. Ejemplos: G lm (l) y
G lm ( 1 7 ); G 3 m (6 ), G 3 m (1 3 ), G 3 m (1 4 );
A 2m (l) y A2m(2). En las cadenas L de tipo k
han sido identificados tres alotipos, K m (l),
K m (l,2 )y Km(3).
Cada alotipo Gm est localizado en slo una
subclase de cadena y. Los alotpos Gm y Am
estn ubicados en el fragmento constante, espe
cialm ente en los dom inios C2 y Cj,3 (Ec),
aunque algunos de ellos estn en el dominio
Cj^l (Ed). Los alotipos Km se encuentran en el
fragmento constante C, de las cadenas K (cua
dro 5-17). Los alotpos Km estn presentes en
todas las clases de inmunoglobulinas, mientras
que los Gm y Am lo estn exclusivamente en
las IgG e IgA.
En subclases de IgG se ha dem ostrado la
presencia de marcadores genticos (Gm) que
pueden existir como isoantgenos en otras sub
clases de cadenas y. Se los designa no marca
dores o isoalotpos, y es posible que sean se
cuencias bsicas comunes a genes de las dife
rentes subclases de IgG. Las variantes 4a y 4b
son alelos presentes en las cadenas y^ y se los
denomina G4m(4a) y G4m(4b). Este ltimo ha
sido hallado en la cadena y^, pero expresado en
ambos genes parentales, lo cual no constituye
un marcador diferencial. Es posible que la re
gin del ADN que codifica para estos antge
nos en uno de los genes haya podido ser altera
da por mutaciones, generando polimorfismo en
una de las subclases. El alotipo G lm (l), por
ejemplo, se ha encontrado en las cadenas yj, y
cuando est presente el fragmento responsable
es el pentapptido Asp-Glu-Leu-Thr-Lys en la
posicin 355-360, Cuando en esta cadena se
halla ausente [G lm (-l)], la secuencia del ppti
do es Glu-Glu-Met-Thr-Lys, difiriendo del an
terior en dos aminocidos. La secuencia corres
pondiente al alotipo G lm (l) se encuentra tam
bin en la IgG2 y en la IgG3, pero no en la
IgG4. Puede originar anticuerpos especficos,
est siempre presente por lo que no es un aloti,po, y por tanto en estas subclases de inmunoglobulina IgG slo es un no marcador (cua
dro 5-18).
Los alotipos Km estn relacionados con va
riaciones aminoacdicas en las posiciones 153
y 191 [K m (l): Val(153), Leu(191); K m (l,2):

Fig. 5-18. Factores genticos no m arcado

res o isoalotipos en el hombre
'No m a rca d o res
Subclase
de cadena

N om enclatura
original

N om enclatura
actual

no-Uj

n G m l(l)
n G m 3 (5 )
m G m 3 (l 1)
n O m 3 (2 1 )
n G m 4 (4 b )

n o -b
llO-b

no-g
y.,

4b

A la (1 5 3 ), L e u (1 9 1 ); K m (3) : A la (1 5 3 ),
Val(191)].
En el conejo el conjunto de alotipos es muy
extenso, y marcadores que corresponden a esta
categora han sido identificados en las cadenas
y (IgG), a (IgA), |i (IgM), k (L) y A (L). Al
igual ciue en los alotipos humanos, son multiallicos, codominantes y segregados indepen
dientemente.
El locus a tiene tres alelos (al, a2 y a3) y los
alotipos se expresan en la parte variable de to
das las cadenas H. Son alotipos complejos, ya
que cada uno difiere del otro en no menos de
seis aminocidos. Siendo el fragmento variable
de las cadenas H la expresin de un producto
de recombinacin de genes, que aparentemente
ocurre al azar, este alehsmo es difcil de expli
car. Algunos suponen que podra estar localiza
do en un fragmento regulatorio adyacente a di
chos genes.
El locus b, con nueve alelos, cuatro de los
cuales (b4, b5, b 6 y b9) son predominantes, de
terminan caractersticas antignicas localizadas
en el fragmento constante de las cadenas L de
tipo K. Son alotipos com plejos, y cuando se
compu-an las secuencias de aminocidos entre
ellos, muestran diferencias prximas al 30%,
El locus c codifica para cadenas L de tipo k .
Se conocen los alelos c l y c21, y hay conejos
homocigotas que no expresan ninguno de ellos.
Estos animales se identifican como c-negativos.
Los alotipos d l l , d l2 , e l4 y e l5 , correspon
dientes a los locus d y e, estn localizados en
las cadenas y de la IgG de conejo. Los alotipos
d i 1 y d i 2 estn ubicados en la zona de la bisa
gra. El di 1 est asociado con la presencia de
un residuo de metionina en posicin 225 (adya
cente y aminoterminal de la cistena que parti
cipa en la formacin del puente disulfuro inter
cadenas H), mientras que el d i 2 est asociado a
una treonina en esa posicin. Los alelos e l4 y
e l 5 estn ubicados en la porcin terminal del
fragmento Fe (residuo 309). En el alotipo e l4
en esa posicin hay treonina, la cual es sustitui
da por alanina en el e l 5.

Anticuerpos
En las cadenas (i ha sido identificado el lo
cus del alotipo Mn, del que se conocen ocho
alotipos.
En ratas, ratones y otros mamferos tambin
se han identificado alotipos de inmunoglobuli
nas. l^a rata presenta alotipos en el fragmento
constante de las cadenas L k , mientras que en el
ratn no existen alotipos para ninguno de los
subtipos de cadenas k y X,. Ambos anim ales
presentan alotipos en los fragmentos constantes
de las cadenas H (y). Para su identificacin se
han usado diferentes nomenclaturas.
Es posible obtener anti sueros contra los dife
rentes alotipos de las inm unoglobulinas del
hombre, conejo y otros animales; ello ha per
mitido la tipificacin serolgica y determina
cin del tipo gentico a que pertenecen, en es
pecial las inm unoglobulinas hom ogneas de
mielomas. La tipificacin de la IgG provenien
te de un suero humano normal, constituida por
una mezcla de IgG l, IgG2, IgG3 e IgG4, slo
perm ite conocer los alotipos presentes en la
mezcla, pero no los individuales. En el conejo,
el fenotipo hallado depende del carcter homocigoto o heteroeigoto del animal en estudio.
Los mtodos serolgicos empleados para es
tos ensayos se basan en la inhibicin de la
aglutinacin que la inmunoglobulina en estudio
puede producir, al actuar sobre un sistem a
aglutinante constituido por hemates que tienen
fijada IgG de genotipo conocido, y su corres
pondiente anticuerpo. Su determinacin puede
efectuarse tambin por ELISA.
VARIACIONES IDIOTPICAS
Kunkel pudo dem ostrar que al inocular un
conejo con una determinada IgG de mieloma se
obtena un antisuero y que, al ser absorbido con
otra IgG de mieloma distinta a la anterior pero
perteneciente a la misma subclase, quedaba un
remanente de anticuerpos que slo reacciona
ban con la IgG usada como inmungeno. C on
cluy que la especificidad estaba dirigida con
tra determinantes antignieos presentes en la
parte variable de las cadenas L y H de la m ol
cula, los que se identificaron con el nombre de
idiotipos.
Un determinante simple del fragmento varia
ble (Fv) se denom ina idiotopo y se llam a
idiotipo a la suma de todos aquellos que se
encuentran presentes en un dominio variable.
Los anticuerpos capaces de reconocerlos se lla
man antiidiotpicos. Se han identificado idio
tipos localizados en las cadenas L, H y algunos
que involucran a am bas. T am bin se los ha
identificado en los fragmentos variables de las
cadenas L y H que no estn relacionados con la
zonas de hipervariabilidad. Teniendo en cuenta

121

el mecanismo por el cual se genera diversificacin en las inmunoglobuhnas, que es el resulta

do de recombinacin de mltiples genes V^,
V|^, D|,, y
que aparentemente ocurre al azar,
es comprensible que un mismo idiotipo pueda
estar localizado en sitios de combinacin o p a
ratopes correspondientes a anticuerpos con dis
tinta especificidad, y que en algunos casos ha
ya sido posible agruparlos en familias, en las
que pueden estar incluidos anticuerpos con es
pecificidad no relacionada. A estos idiotipos se
los llam a pblicos , y privados si slo se
hallan presentes en una determinada molcula.
El hecho de que un epitope antignico pueda
ser reconocido por paratopes que no comparten
el m ism o idiotipo y que un m ism o id io tip o
pueda estar en paratopes diferentes constituy
la base de la hiptesis de Jeme sobre la regula
cin del sistema inmune a travs de la red idiotipo-antiidiotipo.
A GLUTIN IN AS PR O C E D E N TE S
DE PLAN TAS E IN VERTEBRAD OS
A partir de diferentes variedades de h a b i
chuelas (Phaseolus limensis, Vicia craca, Vicia
gramnea, Vicia fava. Vicia ervlia), de sem i
llas de ricino {Ricnus comunis), Bauhina p u r
purea, etc., se han preparado extractos en los
que se han encontrado sustancias con capaci
dad para interaccionar con componentes antignicos de los glbulos rojos y prc lucir agluti
nacin. Estas sustancias, cuya especificidad es
para componentes hidrocarbonados, son cono
cidas con el nombre de lectinas; pueden fijar
m onosacridos y oligosacridos y precip itar
glucoprotenas. La actividad ms comn es anti-A, anti-H, anti-N y a veces anti-B y anti-M.
No se han encontrado lectinas contra antgenos
del sistema Rh. Ello podra deberse a que estos
antgenos son lipoprotenas y en las lectinas s
lo ha podido dem ostrarse especificidad para
azcares (cuadro 5-19).
Estas sustancias han sido empleadas en for
ma rutinaria en la agrupacin sangunea, en es
pecial en la determinacin de subgrupos A y
AB y en la investigacin de secretores.
Los estudios fisicoqumicos han demostrado
que, si bien interaccionan con antgenos hem
ticos, no son inmunoglobulinas. Se fijan a re
ceptores hemticos expuestos en la membrana
de la clula y en algunos casos se ha consegui
do, con monosacridos y oligosacridos, inhi
bir su accin aglutinante. Se han intentado es
tudios de interaccin primaria con el objeto de
determinar la valencia de las lectinas, pero en
su mayora se han visto dificultados por no ha
berse podido determ inar con certeza el peso
molecular de las sustancias ensayadas.

122

Aspectos bsicos de la inm unidad

C u ad ro 5-19. Especificidad de diferentes leetinas para eritrocitos humanos

Especificidad

mentos constantes en las cadenas L y H (fig.

4-29) y de subtipos para ambos tipos de cade
nas, propuso la siguiente nomenclatura:

O rigen

Anti-A

P haseolus limensis
Phaseolus lunatus
C rotolaria aegyptica
C rotolaria fa lca ta
Vicia peregrina
Vicia vilosa
D olichos biflorus
H elix pom atia
CUtocyba nebularis
O tala lactea
H yptos siiayeolens

Anti-B

M arasm ius oreales

B andeiraea sim plicifolia
Polysporus fom entarius
Sophora ja p n ica

A nli-H

U lex europaeus
L otus tetragonolohus
Cytisus sessifolis
Laburnurn alpinum
O nonis spinosa
Xylaria polym orpha
Tetragonolobus purpureas

A nti-M

Iberis am ara

Anti-N

Vicia gram nea

Bauhinia purpurea

En la hemolinfa de crustceos, moluscos y

otros invertebrados se han encontrado tambin
aglutininas similares a las anteriores, capaces
de aglutinar bacterias y glbulos rojos de verte
brados. Son sustancias proteicas de alto peso
molecular, muy resistentes a las enzimas pro
teolticas. En el fluido celnico de loinbrices de
tierra portadoras de injertos heterlogos se han
encontrado sustancias no presentes en lombri
ces portadoras de injertos autlogos, las que re
presentaran aglutininas contra los antgenos
extraos.
Algunas de las leetinas conocidas son mito
gnicas de determinados tipos de clulas linfoi
des; de ah que ltimamente se las haya utiliza
do con xito en la diferenciacin de linfocitos
T y B. Tambin, dada su capacidad para inte
raccionar con hidratos de carbono, algunas de
ellas, como la concanavalina A, ha sido utiliza
da para aislar y purificar glucoprotenas, inclui
das inmunoglobulinas.
N O M EN CLA TU RA
DE LAS INMUNOGLOBULINAS
Un comit de expertos de la Organizacin
M undial de la Salud, teniendo en cuenta la
existencia de segm entos variables y de seg

C adenas L
C k y Cy para los segmentos constantes de
ambas cadenas.
VKp V k , Vk,jj, V k ,.^, para los subtipos de
cadenas K con variabilidad localizada en el seg
mento variable.
V^,, VI,j, V l|, VX,y, VA,av^, VXy,, para los
subtipos de cadenas A, con variabilidad locali
zada en el segmento variable.
C adenasH
Cy, Cft, C a , C5, Ce, para los segm entos
constantes de las cadenas H de IgG, IgM, IgA,
IgD e IgE, respectivamente.
Vy, Vji, V a, V 8 , Ve, para los segmentos va
riables de las mismas cadenas.
Para la IgG que tiene cuatro subtipos de ca
denas H, con diferenciacin en el segm ento
constante, Cy se ampla a Cy,, Cyj, Cy, y Cy_^.
De igual modo C|J, C a l, Ca2.
C om o cada segm ento H constante puede
subdividirse en tres dominios, uno correspon
diente al segmento Fd y los restantes al frag
mento Fe, cada fragmento H constante estar
constituido por CH,, CH^ y CH,,.
Sobre la base de lo expuesto, las frmulas de
las inmunoglobulinas pueden expresarse de una
manera ms compleja, pero a su vez ms expl
cita.
La IgG del tipo 1, es decir la IgG l, con ca
denas K del tipo II, tiene la frmula
1(Vk . C k) (V y . Cyl)]^
Si se quiere hacer referencia a los com po
nentes de las fracciones constantes de las cade
nas H, la frmula se ampla:
[ ( V K . C K ) ( V y . C y , ' . Cy, 2. Cy,3)

La frmula general de la IgM ser:

I [ (V k . C k ) (V ^ . C[i) ], 1,
El mismo esquema se utiliza para las restan
tes inmunoglobulinas.
Estas frm ulas son tiles para expresar la
composicin de algunas inmunoglobulinas, en
especial un tipo de IgA en que las dos cadenas
L estn unidas entre s al igual que las cadenas
H, y las uniones L-H no son de tipo covalente
por puentes S-S. Para ellas la frmula sera:
(V k . C k) (V a . C a),

Anticuerpos
Para el caso de las IgA halladas en secrecio
nes, la frmula resultante es la siguiente:
[ [ (V k . C k) (V a . C a)

J^S

Siendo S el componente secretorio.

O T R A S M O L C U L A S R E L A C IO N A D A S
CO N L A S INMUNOGLOBULINAS
L a superfam ilia
de las inm unoglobulinas

Bajo este rubro se incluyen molculas pro

teicas cuya principal caracterstica es la de pre
sentar en su estructura bucles o loops simila
res a los que se observan en los fragmentos va
riables (V) y constantes (C) de las cadenas L y
H de las inmunoglobulinas. El nmero de bu
cles no es constante y -vara segn el origen de
la molcula. Estos bucles como en las inmunoglobulinas, estn constituidos por dos hojas an
tiparalelas plegadas en p, formando un sand
wich o emparedado, presentando cada una de
las hojas 3 o 4 fibras. En la mayora de los ca
sos ambas hojas estn unidas por un puente disulfuro perpendicular a las mismas, estando los
residuos hidrofbicos orientados hacia el cen
tro del ncleo.
A los dom inios que presentan hom ologa
con el dominio variable de las cadenas L o H,
constituidos por 65-75 residuos, se los designa
V, y con C a los que presentan homologa con
los dominios constantes, los que estn consti
tuidos por 55-60 residuos. En este caso se los
designa C l , y con C 2 a aquellos que poseen es
tructuras intermedias con los dominios V y C.
Por regla general la secuencia de aminocidos
es menor que la correspondiente al C l, origi
nando un bucle ms pequeo.
Cabe hacer notar que a aquellos dominios de
las molculas de la Superfamilia que presentan
hom ologa con los dominios variables de las
inmunoglobulinas se los denomina V, por su
similitud con estos dominios, sin que ello sig
nifique variabilidad tal como ocurre con los do
minios V de las cadenas L y H (fig. 5-42).
Los estudios estructurales de estas protenas
llevan a suponer un origen comn a partir de
un gen ancestral correspondiente a un receptor
primordial de superficie, que codificara para
1 0 0 residuos, con dos restos de cistena que al
unirse y originar un puente disulfuro daran lu
gar a un bucle. Los genes que codifican para
los diferentes miembros de la Superfamilia ha
bran surgido por duplicacin gnica y diver
gencia a partir de ese dominio primordial. Los
genes que codifican para estas protenas estn
distribuidos en distintos cromosomas.

123

Las protenas que forman parte de la Super

familia de la inmunoglobulina pueden incluir
se en diferentes grupos segn la funcin que
cumplen y el tejido con el que estn relaciona
das. Los grupos ms importantes son: a) inm u
noglobulinas: cadenas H, cadenas k y cadenas
A; b) complejo RCT-CD3: cadenas a ,p o yS del
RCT y cadenas y,5,e de CD3; c) complejo m a
y o r de h isto c o m p a tib ilid a d : cadenas oc de
CMH-I y pj-microglobulina, cadenas a y i de
CMEl-II; d) antgenos asociados a (i^-microglobulina: cadenas a de los antgenos TL, Qa
y C D l a; e) molculas de adhesin: CD2, LFA3; f) a ntgenos de su p erficie de lin fo cito s:
CD4, cadenas T y II de CD 8 y CTLA-4; g) an
tgenos localizados en cerebro y linfocitos:
Thy-1, MRC OH-2; h) receptores de inmunoglobulinas: RPolylg, RPcy2b/yl; i) m olculas
re la c io n a d a s con tejid o n ervio so : N C A M
(m o lcu la de adhesin de tejido n erv io so ),
MAG (glucoprotena asociada a m ielina), Po
(protena de mielina); j) antgenos tumorales:
CEA (antgeno carcinoembrionario; k) recep
tores de factores de crecimiento: RPDGF (re
ceptor del factor de crecim iento derivado de
plaquetas), RCSE-1 (receptor del factor esti
m ulante de colonias- 1 ); 1) molculas que no
form an parte de la superficie celular: a ,B g p
(glucoprotena a,B ), LINK (protena de unin
a membrana basal).
En el cuadro 5-20 figuran algunas de las ca
ractersticas ms importantes de estas p ro te
nas.
Casi todas las protenas de la Superfamilia
asociadas a clulas tienen una parte citoplas
mtica, la C-term inal, seguida de una tra n s
membrnica de carcter hidrofbico y una por
cin extracelular donde se encuentran localiza
dos los dominios V y/o C. Algunas de estas
protenas no estn insertadas en la mem brana
celular, sino que estn unidas a sta por un an
claje de tipo glucofoslipdico (fig. 5-42: prote
nas THy-1, LEA-3, CEA).
En los receptores antignicos de los linfoci
tos B y T la unin al ligando (antgeno o CM Hpptido) tiene lugar a travs de la superficie
que en la parte superior de la molcula forman
los fragmentos V, y C, de la Ig y las cadenas a
y p del RCT. Las otras interacciones de los do
minios de las inm unoglobulinas tienen lugar
por contacto entre las caras de las hojas plega
das en p como ocurre con C, y C,., (fragmento
Fb, unin heteroflica) y Cj,3...C^3 (fragmento
Fe, unin homoflica). Ello hace suponer que
las interacciones entre molculas de la Superfa
milia tienen lugar por un mecanismo sim ilar,
que los dominios V, C l o C2 pueden interac
cionar con otras molculas a travs de alguna
parte accesible de sus superficies, y que las
uniones son no covalentes y de distinta afini-

124

Aspectos bsicos de la inmunidad

C uadro 5-20. Principales componentes de la Superfamilia de las inmunoglobulinas, la mayora

de las cuales se expresan en la superficie de diferentes clulas
M olcula

Tejido en el que se expresan

Ig (inm unoglobulinas)

Slo en linfocitos B

R C T (receptor del LT)

En linfocitos T y tim ocitos

CD3 (cadenas y, 5, e)
C M H (antgenos del com plejo m ayor
de de histocom patibilidad)
P,-m globulina
C b 2 y LFA-3

En linfocitos T y tim ocitos

D iferentes tipos celulares; inducidos
po r interfern
D iferentes grupos de clulas linfoides
Linfocitos y tim ocitos

C D 4 y CD8
C TLA -4

CD 4 y CD8 en tim ocitos y poblaciones

de linfocitos T
CD 4 en m acrfagos
CD 8 en clulas N K
C TL A -4 en clulas T activadas
C lulas linfoides y cerebro. Se locali
zan en neuronas, fibroblastos y dife
rentes clulas linfoides

Thy-1

Funcin
R eceptor antignico del LB, A nticuer
pos
R eceptor antignico del LT, N o se co
nocen form as solubles del R C T
Form an parte del com plejo RCT-CD 3
Presentan pptidos de antgenos ex tra
os al RC T
Se desconoce su funcin
C D 2 de clula T interacciona con
LFA -3 presente en otras clulas m e
diante reacciones de adhesin. F un
ciones sim ilares cum plen las m olcu
las CA M (molculas de adhesin ce
lular)
C D 4 y CD8 controlan la interaccin de
los L T con los antgenos CM H clase

lyll,
C TLA-4: funcin desconocida
A nticuerpos anti-Thy-I inducen divi
sin de los linfocitos T, No se cono
cen sus receptores en el sistem a ner
vioso
Se desconoce su funcin

M R C OX-2

Se localiza en neuronas, endotelio y d i

ferentes linfocitos

R P o ly lg (receptor de IgM e IgA poli

mricas)

E pitelio intestinal y heptico

RFC-ylb/yl (receptor de IgG)

N C A M (m olcula de adhesin del sis
tem a nervioso)

P o (protena de m ielina)

M acrfagos
Form a parte del grupo de molculas
asociadas al sistem a nervioso. Se la
encuentra en las neuronas y gla
C orresponde al m ism o grupo de m ol
culas que N CA M , Se localiza en
m ielina central y perifrica y algunas
neuronas
M ielina perifrica

CEA (antgeno carcinocm brionario)

Clulas epiteliales y sus tum ores

R P D G F (receptor del factor de creci

m iento derivado de plaquetas)

C lulas m esenquim al es

R C S F l (receptor del factor estim ulante

de co lo n ias-1)
L IN K (protena de unin a m em brana
b asal)
a l B-gp (glucoprotena a IB)

M onocitos

Constituye el 50% de la protena de

m ielina perifrica
M arcador tum oral. F uncin desconoci
da
Interacciona con factores de creci
m iento para iniciar divisin celular y
otras actividades
Sim ilar a R PD G F

M em brana basal (no es una m olcula

de superficie celular)
G lucoprotena hallada en suero

Actiia com o m olcula de unin entre

proteoglicano y hialuronatos
Se desconoce su funcin y ligandos

M A G (glucoprotena asociada a m ieli

na)

dad segn la funcin que esas interaceiones po

nen en marcha.
Considerando el supuesto origen comn de
estas diferentes molculas de la Superfamilia de
las inmunoglobuhnas, se ha sugerido que el rol
primitivo de estas molculas ha sido el de reco
nocim iento celular, y que una diferenciacin
posterior las ha llevado a cumplir distintas fun
ciones como la adhesin celular, la captacin de
ligandos actuando coino receptores, etc. Estas

T ransporta form as m nltim ricas de

IgM e IgA a travs del epitelio. El
p rim er dom inio fija IgA, Los dom i
nios extracelulares liberados de
m em brana por protelisis constitu
yen el Com ponente Secretorio (S)
Fija IgA agregada
M edia la adhesin de clulas nerviosas

Podra funcionar en m ielinizacin

funciones las cumplen no slo a travs de las

clulas y tejidos comprometidos con la respues
ta ininune, sino tambin con otros tejidos, entre
ellos los componentes del sistema nervioso.
Si bien las m olculas descritas han sido
identificadas en vertebrados, sera muy impor
tante tener conocimiento sobre su posible exis
tencia en invertebrados; ello sera de gran utili
dad para establecer su evolucin estructural y
funcional.

Anticuerpos
Inmunoglobulina
(IgM)

125

Complejo RCT-CD3

F ig . 5-42. Superfam ilia de las imrrunoglobulinas. Las siglas con las que se identifican las diferentes protenas com i^onentes de esta fam ilia son las indicadas en el cuadro 5-18. Los dom inios sealados con V y Cl presentan sim ilitud con lo s d o
m inios V y C de las cadenas H de las inm unoglobulinas. Los identificados con C2 corresponden a estructuras interm edias
com partidas con V y C y son de m enor tam ao por estar constituidos po r un nm ero de residuos inferior al co rresp o n d ien
te a los dom inios constantes de las inm unoglobulinas. L as m olculas en las que se representan dom inios distintos a lo s b u
cles, corresponden a estructuras no sim ilares a los dom inios V o C de las inm unoglobulinas. El signo () indica h id ra to de
carbono. El anclado a m em brana por unin gluco-fosfatidilinositol de algunas de las protenas est indicado por una flech a
( i ) . (A daptado de W illiam s, A. F., Barclay, A. N. Ann. Rev. Inim unol, 6:381, 1988).

126

Aspectos bsicos de ia inmunidad

Cuadro 5-21. Receptores para Fe (humanos)

A fin id a d para

Am inocidos
N om enclatura

Cadenas PM (kD ) Citopl. Transm.. E xtracel.

huR IFcy
huR IlF cy
huR IIIFcy
huR lF ce

S im ple 72
S im ple 40
a-y2aC 2 50-80
a|3Y2

45-65

63
76
25
31

21

28
21
21

273
186
191
180

Receptores para Fe
Por regla general los fragmentos Fe de las
inmunoglobulinas pueden ser fijados a la su
perficie celular por molculas del grupo de las
glucosiltransferasas que reconocen la parte hidrocarbonada de la molcula, por molculas si
milares a leetinas y por los receptores para Fe.
Desde com ienzo de siglo se tena conoci
miento de la existencia en el suero de factores
termoestables y termosensibles conocidos co
mo opsoninas, con capacidad para unirse a bac
terias y facilitar su captacin y fagocitosis por
los macrfagos. Actualmente se sabe que esos
factores son anticuerpos y componentes del sis
tema complemento, los que se unen a los fago
citos por intermedio de receptores para esos li
gandos. A los que tienen capacidad para-fijar
inmunoglobulinas se los designa receptores Fe
(RFC).
Los RFc fueron identificados en el hombre y
otros vertebrados a partir de 1972, cuando se
hicieron los primeros estudios sobre los meca
nismos de la fijacin de complejos Ag-Ac so
bre linfocitos B y T . Esos estudios estuvieron
dificultados por la metodologa disponible en
esos momentos. El advenimiento de los anti
cuerpos monoclonales, el clonado de lneas ce
lulares, la citometra de flujo y los estudios a
nivel de genes han permitido tener un concepto
claro sobre estructura, funcin y relaciones en
tre los receptores para Fe de las distintas clases
y/o subclases de inmunoglobulinas. Estos re
ceptores juegan un rol fundamental en aquellos
mecanismos celulares de defensa iniciados por
la fijacin del Fe de molculas de anticuerpos o
complejos inmunes sobre diferentes clulas del
sistema hematopoytico, entre los que cabe ci
tar la fagocitosis, la citotoxicidad dependiente
de anticuerpo (ADCC), la citotoxicidad por c
lulas NK (natural killer), la captura y presen
tacin de antgenos, procesos en los que se ha
demostrado que el evento inicial para los RFc
es la agregacin.
Adems de participar en funciones efectoras
de la respuesta inmune, los RFc, al interaccio
nar con los Fe de las molculas de anticuerpos,

CD

IgG (Ka)

Ig E (K a )

CD 64
I0**-109
C D w 32 <10
CD 16
<10
10'

E specificidad
I g G l> Ig G 3 > Ig G 4 Ig G 2
I g G l= Ig G 3 Ig G 2 ,Ig G 4
I g G I= lg G 3 Ig G 2 ,Ig G 4
IgE

pueden regular otras funciones como la expre

sin de linfoquinas, otros receptores celulares e
iniciar procesos de diferenciacin celular.
Para identificar la inmunoglobulina que son
capaces de fijar, los RFc llevan adicionada la
letra griega de la correspondiente cadena Bl:
RFcy, RFc|i., R F ca, RF ce, RF c5. En aquellos
casos que exista ms de un receptor por clase
de inmunoglobulina, la letra R va seguida del
n m ero ro m a n o c o rre s p o n d ie n te : R IF cy,
RIIFcy, RIIIFcy, RIFce, RIIFce.
Los receptores para Fe han sido estudiados
en el hombre y otras especies animales como
ratn y rata. Se los identifica anteponiendo a la
letra R las siglas hu(humano), mu(murino),
rt(rata): huRIFcy, muRFcy2b, rtRIFce, etc.
Los receptores para Fe estn formados por
un nmero variable de unidades segn el recep
tor; tien en p o rcio n es in trac ito p la sm tic as,
transmembrnicas y extracelulares, y presentan
dominios similares a los C2 de la Superfamilia
de las inmunoglobulinas, en la que han sido in
cluidos. Hace excepcin a esta regla el RIFce,
que fija molculas de IgE con uniones de baja
afinidad.
Se han descrito receptores para todos los iso
tipos de inmunoglobulinas, no obstante, son los
RFcy y los RFce los que han sido mejor estu
diados y sobre los que se han volcado la mayo
ra de los anlisis estructurales correspondien
tes a estas molculas.
Receptores para Fe de IgG en humanos
(huRFcy)
Los receptores para Fe de origen hum ano
con esp ecificid ad para IgG (huRFcy) estn
agrupados en tres categoras de acuerdo con su
e stru c tu ra y re a c tiv id a d : R IFcy, R IIF cy y
RIIIFcy. En la figura 5-43 se encuentran esque
m atizadas dichas estructuras y en el cuadro
5-21 resumidas sus propiedades.
El R IF cy es de alta afinidad, capaz de fijar
IgG monomrica con una constante de afinidad
(Ka) del orden 10-10 M*. Este receptor est
presente en monocitos y macrfagos, y en poli
morfonucleares neutrfilos humanos puede ser

Anticuerpos

127

inducido por interfern gamma (INF-y). En al nas estirpes de linfocitos T perifricos. La prin
gunas lneas de monocitos el INF-y puede in cipal caracterstica de este receptor es que en
crem en tar h asta 2 0 veces la expresin del macrfagos y clulas NK se expresa como una
RIFcy, cuyo nmero normal por clula oscila protena transmembrnica, en tanto que en neu
entre 1 x IO'* a 5 x lO"*. La Reunin de Expertos trfilos lo hace como una protena fijada por
en Antgenos de Diferenciacin ha designado a una unin glucano-fosfatidilnositol (fig. 5-43).
huRIFc y como CD64. A diferencia de los otros O tra caracterstica de este receptor es que la
receptores de baja afinidad, que poseen dos do protena posee cido asprtico, aminocido car
minios extracelulares del tipo C2, el huRIFcy gado, en la porcin correspondiente al sector
tiene tres. Los dos primeros dominios extrace- transmembrnico. La expresin transmembrni
luiares son homlogos a los dominios corres ca del RIIIFcy es dependiente de la coexpresin
pondientes a los receptores RIIFcy y RIIIFcy. de la subunidad y del RIFce o de la subunidad ^
Todo hace presumir que el tercer dominio del del complejo RCT-CD3, ambas con residuos
RIFcy debe desem pear un rol importante en cargados en el dominio transmembrnico.
Aproximadamente 10^ copias de R IIIFcy se
las uniones de alta afinidad del receptor a li
gandos. El RIFcy tiene una masa relativa de 72 expresan en la superficie de los neutrfilos hu
kD y la capacidad para fijar los diferentes sub manos. Estos receptores estn altamente gluco
clases de IgG humanas vara en el siguiente or silados y en geles migran como protenas de 50den: IgG l> IgG 3> IgG 4IgG 2.
80 kDa, en tanto que los expresados en m acr
Todos los ensayos sealados parecen indicar fagos lo hacen como protenas de 53 kD. El fac
que el RIFcy es univalente. La principal fun tor de transformacin de crecimiento-p (TGFcin efectora en la que el receptor participa es p) aumenta la expresin del RIIIFcy en las su
perficies celulares. Se identifica al RIIIFcy con
la ADCC.
El segundo receptor para IgG humano {hu- el antgeno de diferenciacin C D l 6 .
En los macrfagos, en los que el receptor es
RIlFcy) es una protena de 40-50 kD, presente
en una variedad de tipos celulares entre los que de tipo transmembrnico, activa la fagocitosis.
se incluyen monocitos, macrfagos, plaquetas, En los neutrfilos, en los que el anclado del re
eosinfilos y linfocitos B; no se lo encuentra en ceptor a membrana es por unin glucano-fosfatidilinositol, se discute que funcin cum ple.
clulas T.
Siguiendo las recomendaciones del Comit Ello porque el entrecruzamiento de este recep
de Expertos en Antgenos de Diferenciacin se tor mediado por un anticuerpo anti-receptor es
lo designa CDw32. A nivel genmico se han pecfico induce en los neutrfilos aumento de
identificado tres genes denominados IIA, IIB y calcio libre en el citosol y de actina F, lo que
IIC los que codifican seis transcriptos. Todos estara indicando que es capaz de mediar algu
ellos se expresan en monocitos; IIA y IIC se na seal transm em brnica aunque no se en
expresan en polimorfonucleares neutrfilos y cuentre insertado en ella.
En cuanto a la especificidad por las inmunoalgunas clulas pluripotenciales, y no lo hacen
en linfocitos y clulas NK. HuRIIBFcy se ex g lo b u lin as es sim ila r a la in dicada p a ra el
presa preferencialm ente en linfocitos. Su n RIIFcy.
mero por clulas es variable, siendo del orden
de 10- en plaquetas, 3 x 10 en neutrfilos y 2,6 Receptores para Fe de IgE en humanos
X lO"en macrfagos alveolares.
(RFce)
A diferencia del RIFcy, el receptor RIIFcy es
Se conocen dos receptores capaces de inte
de baja afinidad para IgG monomrica; los va
lores de Ka son inferiores a 10 M . No obstan raccionar con el fragmento Fe de IgE; el RIFce
te, la funcin de receptor ha sido demostrada lo hace con una unin de alta afinidad y el
por la capacidad para fijar inmunocomplejos y RIIFce con baja afinidad. Solo el RIFce est re
se considera que podra participar en fagocito lacionado con la Superfamilia de las inm unosis mediada por clulas mononucleares y poli globulinas.
morfonucleares neutrfilos. Se estima tambin
El RIFce es el componente de la superficie
que RIIFcy puede mediar ADCC y la liberacin celular que inicia las reacciones alrgicas (va
de anin superxido y factor necrosante de tu- se cap. 32) y a diferencia de los receptores Fcy
y slo est presente en mastocitos y clulas bamores-(x (TNF-a).
La especificidad de huRIIFcy para las sub .sfilas. Su activacin induce en estas clulas
clases de IgG humanas es similar para IgG l e degranulacin y liberacin de contenidos gra
IgG3, la que a su vez es mayor que la corres nulares como histamina, la sntesis y secrecin
de cido araquidnico y sus metabolitos como
pondiente a IgG2 e IgG4.
El huR IIlF cjes un receptor que no se expre ias prostaglandinas y los leucotrienos. Adems,
sa en monocitos, pero que lo hace en macrfa esta activacin celular induce la sntesis y se
gos, neutrfilos, eosinfilos, clulas NK y algu crecin del factor estim ulante de colonias de

128

Aspectos bsicos de a inmunidad

CD64
RIFcy
CDw32

CD16

RIIFCy

RIIIFCy

C D 16TM
RIIIFOy

Extracelular

(T/Q2
GPI

Membrana
celular

Citoplasma

Extracelular

(y/02
Membrana
celular

RIFCe

RFC,

Citoplasma

F ig. 5-43. Estructura esquem tica de los receptores para el fragm ento Fe de inm unoglobulinas.

granulocitos y macrfagos (GM-CSF) e inter

leuquinas (IL -la, lL-3, IL-4, IL-5, IL- 6 , INF-y)
entre otras. Para que la activacin celular tenga
lugar se necesita, en primer trmino, que la IgE
sintetizada por linfocitos B se fije al RIFce, y
luego que la IgE fijada, a travs de su paratope
interaccione con su antgeno especfico multi
valente. El receptor es univalente y fija IgE mo
nomrica y la interaccin con el antgeno multi
valente determina agregacin del receptor, he
cho fundamental para que el fenmeno se haga
efectivo. La interaccin previa de la IgE con el
antgeno y su posterior unin al RIFce no es su
ficiente para la acvacin celular.
El RIFce est constituido por 3 cadenas pep
tdicas denominadas a , |3 y y. Su unin al Fe de
IgE es con alta afinidad (Ka = 10" M"' y al
igual que el RIIIFcy, la cadena a , necesita de la
coexpresin de las cadenas p y y para un co
rrecto ensam blado y transporte a membrana.

Esta cadena y es la misma que usa el RIIIFcy;

en cuanto a la cadena p, relacionada con CD20,
no se conoce qu funcin cumple.
Se ha demostrado que en el RIFce, la cadena
a est asociada con una cadena p y dos cade
nas y unidas entre s por un puente di sulfuro. El
sitio de unin en el receptor consiste en tres re
giones localizadas en el segundo dominio ex
tracelular de la cadena a . Este receptor se ex
presa muy temprano durante la diferenciacin
celular de los mastocitos y clulas basfilas;
clulas en los primeros estadios de diferencia
cin ya lo expresan en sus membranas.
De los tres dominios que integran el frag
mento Fce (Ce2, Ce3, Ce4), una porcin ubica
da entre Ce2 y Ce3 es la que se une al RIFce.
La unin de IgE a RIFce es relativamente es
pecfica. Otros isotipos no coinpiten con IgE,
pero IgE de otras especies como las de rata y
ratn se unen al huRIFce.

Anticuerpos
El huRIlFce, identificado como la protena
de membrana CD23, es una protena glucosila
da de 45 kD la que ha sido clonada y secuenciada. Est constituido por un segmento cito
plasmtico de 23 aminocidos, uno transmem
brnico que contiene 2 1 residuos hidrofbicos
y un resto extracelular de 277 residuos. El
CD23 tiene una orientacin inusual, con el re
siduo N-terminal en el citoplasma y el C-termi
nal extracelular.
Se han identificado dos formas allicas de
nominadas RlIaEce y RIlbFce.
Se expresa en la m em brana de monocitos,
macrfagos, eosinfilos, plaquetas y linfocitos.
Es un receptor que une IgE con baja afinidad y
no est comprometido en el desencadenamien
to de reacciones alrgicas.
Se desconoce cul es su funcin; no obstante
se ha descrito que la isoforma RIIbEcs expresa
da en monocitos y eosinfilos, y no la RIIaEce
expresada en linfocitos B, es capaz de mediar
fagocitosis de complejos formados por anticuer
pos de la clase IgE. Otras funciones atribuidas
como liberacin de cido araquidnico y sus
metabolitos cuando linfocitos interaccionan con
inm unocom plejos de IgE son dubitativas, ya
que en esos experimentos no puede descartarse
que los resultados obtenidos estn mediados por
otros receptores diferentes al RIIFce o CD23.
Conviene recordar sobre el particular que re
cientem ente se ha dem ostrado que RIIEcy y
RIIIFcy fijan inmunocomplejos de IgE.
La presencia de un factor soluble de unin a
IgE o CD23 soluble, resultante del clivaje pro
teoltico de RIIFce, ha sido demostrada y se es
pecula que el mismo podra jugar un papel im
portante en la regulacin de la sntesis de IgE.
Receptor para Fe de IgM
Hace tiempo fu descrito un receptor espec
fico para IgM, el RFc|ii, presente en linfocitos
B humanos y murinos. Es inhibido por IgM
pentamrica, en tanto que resultan inefectivas
protenas monoclonales de las clases IgG, IgA
e IgE, ensayadas a concentraciones 200 veces
superiores a las usadas para IgM. La unin del
Fc|j, al receptor se hace a travs del dominio
Cj.,3, sin la participacin de C,_,l, Cj^2 o Cj^4. Se
ha demostrado que el receptor fija nicamente
IgM pentamrica, por lo que se estima que es
de baja afinidad.
No se conoce su estructura. No se tiene in
formacin sobre clonado o secuenciacin de
este receptor, ni cul es la funcin que real
mente cumple.
Receptor para Fe de IgA
En granulocitos neutrfilos, m onocitos y

129

macrfagos humanos se ha descrito la presen

cia de un receptor para IgA de masa relativa de
60 kD, cuyo ADNc codifica una protena de
287 aminocidos que presenta homologa con
receptores para Fcy y con el receptor para IgE
de alta afinidad (RIFce). Presenta una arginina
en la regin transmembrnica, hecho anmalo
que recuerda lo ya descrito para RIIIFcy.
Este receptor, que es distinto al RPolylg que
transporta IgA polimriea a travs de epitelios,
media por parte de neutrfilos y monocitos fa
gocitosis de partculas recubiertas con IgA y
secrecin de anin superxido.
Receptor para Fe de IgD
E stu d io s prelim in ares parecen in d ic a r la
existencia de un receptor para IgD, denomina
do RFc 6 , presente en clulas B normales y neo
plsicas. Esos datos reflejan la posible existen
cia de un receptor para Fe de IgD, pero la m is
ma deber ser confirmada.
Receptores similares a los descritos para los
fragmentos Fe de los diferentes isotipos de in
munoglobulinas humanas se han encontrado en
otras especies animales, como ratn y rata, en
los que se ha demostrado, especialmente para
los REcy, la especificidad de subclase que p o
seen, las funciones que cumplen y sus relacio
nes con ios receptores para Fe de origen h um a
no.

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130

Aspectos bsicos de la inmunidad

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'
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teins, Bence-.lones proteins and m acroglobulins into tw o
groups on the basis o f com m on antigenic characters. .!
E xp M ed 6.-859, 1962.

M argni RA , C strelo s O D , Paz CB: T h e sheep im m une

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C D R H 3 in an tib o d ies . Proteins: Struct. Funct. Genet.
16:1, 1993.

El origen de la diversidad
de los anticuerpos

M. LEONARDO SATZ
RICARDO MARGNI

T eoras sobre el origen de la diversificacin

de los anticuerpos
A principios de siglo, Ehrlich postul la teo
ra de los receptores celulares especficos, se
gn la cual el antgeno (Ag) interacta con re
ceptores especficos en la superficie de las c
lulas productoras de anticuerpos (Ac) y activa
las mismas para producir ms Acs. Esta idea es
bastante aproximada a la concepcin actual de
la seleccin clonal. En la dcada del 30, Haurovitz y luego Pauling postularon las llamadas
teoras instructivas, que intentaron explicar el
am plio repertorio de reconocim iento de los
Acs, aun contra molculas sintticas. Se postu
l que exista una nica molcula de Ac, de es
tructura flexible, a la cual el Ag, al actuar como
molde, instrua de forma de determinar su es
tructura tridimensional nica y especfica con
tra l. Hacia la dcada del 60, los avances en
la determinacin de las secuencias aminoacdi
cas de los primeros Acs mostraron su diversi
dad en molculas dirigidas contra Ags distintos
e hicieron insostenibles estas teoras.
Predominaron luego las llamadas teoras se
lectivas y, en especial, la nocin de la seleccin
o expansin clonal sugerida por Burnett y Jerne. Se postul que cada linfocito B es capaz de
producir Acs de una especificidad nica y que
el Ag selecciona, activa y expande el clon es
pecfico. Para explicar el origen de la diversi
dad de los Acs en cada clon, se postularon dos
ideas alternativas esenciales; la existencia de
miles de genes para cadenas pesadas (H) y li
vianas (L) en la lnea germinal, o la existencia
de un solo gen sobre el cual se acumulan muta
ciones especficas para cada clon (ya sea du
rante la vida embrionaria o durante la diferen

6
ciacin linfocitaria B). Teniendo en cuenta la
longitud de las cadenas L y H, se ha estimado
que se requerira un 15% del genoma de un
mamfero para codificar los Acs diferentes. Los
entusiastas de estas nociones justificaban que
los anim ales superiores destinasen una gran
fraccin de su genoma para un mecanismo in
mune de gran valor para su supervivencia.
Hacia principios de la dcada del 60 se d e
terminaron las secuencias aminoacdicas de va
rias cadenas L diferentes. Se observ que todas
las cadenas difieren entre s y que todas las di
ferencias estn localizadas en los primeros 106
aminocidos del extremo aminoterminal (lo que
llamamos regin variable de la cadena liviana o
VL). En 1965, Dreyer y Bennet razonaron que,
si es que existen cientos de miles de genes, de
ba existir un mecanismo especial por el cual
luego de millones de aos de evolucin se haya
preservado sin cambios la regin constante (C)
y s se hayan acumulado variaciones o m utacio
nes sobre la regin V. Postularon como explica
cin alternativa que, en el genoma, la informa
cin para una cadena L no se halla en una se
cuencia nucleotdica continua, sino fragmenta
da, con la presencia de uno o muy pocos genes
que codifican para la regin C y cientos o miles
de genes para la regin V. Estos postulados p re
decan que, si existe un solo gen para la regin
C, una mutacin que altere sus secuencias en un
gameto o cigota, el cambio se ver reflejado en
todas las cadenas. Postulaban adems que, n e
cesariam ente, la informacin presente en los
bloques separados deba generar un gen o un
ARNm continuo para garantizar la sntesis de
una cadena proteica. Estas nociones, sumamen
te radicales en su momento, resultaron ser esen
cialmente correctas, como lo han dem ostrado

130

Aspectos bsicos de la Inmunidad

D ay, E. D. A dvanced Im m unochem estry, 2 ed. W ileyLiss Publ. N ew Y ork, 1990.

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294:9 \, 1976.
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16:1, 1993.

El origen de la diversidad
de los anticuerpos

M. LEONARDO SATZ
RICARDO MARGNI

T eoras sobre el origen de la diversificacin

de los anticuerpos
A principios de siglo, Ehrlich postul la teo
ra de los receptores celulares especficos, se
gn la cual el antgeno (Ag) interacta con re
ceptores especficos en la superficie de las c
lulas productoras de anticuerpos (Ac) y activa
las mismas para producir ms Acs. Esta idea es
bastante aproximada a la concepcin actual de
la seleccin clonal. En la dcada del 30, Hau
rovitz y luego Pauling postularon las llamadas
teoras instructivas, que intentaron explicar el
am plio repertorio de reconocim iento de los
Acs, aun contra molculas sintticas. Se postu
l que exista una nica molcula de Ac, de es
tructura flexible, a la cual el Ag, al actuar como
molde, instrua de forma de determinar su es
tructura tridimensional nica y e.specfica con
tra l. Hacia la dcada del 60, los avances en
la determinacin de las secuencias aminoacdicas de los primeros Acs mostraron su diversi
dad en molculas dirigidas contra Ags distintos
e hicieron insostenibles estas teoras.
Predominaron luego las llamadas teoras se
lectivas y, en especial, la nocin de la seleccin
o expansin clonal sugerida por Burnett y Jerne. Se postul que cada linfocito B es capaz de
producir Acs de una especificidad nica y que
el Ag selecciona, activa y expande el clon es
pecfico. Para explicar el origen de la diversi
dad de los Acs en cada clon, se postularon dos
ideas alternativas esenciales; la existencia de
miles de genes para cadenas pesadas (H) y li
vianas (L) en la lnea germinal, o la existencia
de un solo gen sobre el cual se acumulan muta
ciones especficas para cada clon (ya sea du
rante la vida embrionaria o durante la diferen

ciacin linfocitaria B). Teniendo en cuenta la

longitud de las cadenas L y H, se ha estimado
que se requerira un 15% del genoma de un
mamfero para codificar los Acs diferentes. Los
entusiastas de estas nociones justificaban que
los anim ales superiores destinasen una gran
fraccin de su genoma para un mecanismo in
mune de gran valor para su supervivencia.
Hacia principios de la dcada del 60 se d e
terminaron las secuencias aminoacdicas de va
rias cadenas L diferentes. Se observ que todas
las cadenas difieren entre s y que todas las di
ferencias estn localizadas en los primeros 106
aminocidos del extremo aminoterminal (lo que
llamamos regin variable de la cadena liviana o
VE). En 1965, Dreyer y Bennet razonaron que,
si es que existen cientos de miles de genes, de
ba existir un mecanismo especial por el cual
luego de millones de aos de evolucin se haya
preservado sin cambios la regin constante (C)
y s se hayan acumulado variaciones o m utacio
nes sobre la regin V. Postularon como explica
cin alternativa que, en el genoma, la informa
cin para una cadena L no se halla en una se
cuencia nucleotdica continua, sino fragmenta
da, con la presencia de uno o muy pocos genes
que codifican para la regin C y cientos o miles
de genes para la regin V. Estos po.stulados pre
decan que, si existe un solo gen para la regin
C, una mutacin que altere sus secuencias en un
gameto o cigota, el cambio se ver reflejado en
todas las cadenas. Postulaban adems que, n e
cesariam ente, la informacin presente en los
bloques separados deba generar un gen o un
ARNm continuo para garantizar la sntesis de
una cadena proteica. Estas nociones, sumamen
te radicales en su momento, resultaron ser esen
cialmente correctas, como lo han dem ostrado

132

Aspectos bsicos de la inmunidad

independientemente Tonegawa y Leder una d

cada ms tarde, mediante el uso de tcnicas de
ADN recombinante.
Los genes de inmunoglobulinas
se reordenan durante la ontogenia:
su hallazgo experimental
Los primeros experimentos que analizaron la
complejidad de los genes de Igs fueron realiza
dos por P. Leder y col. en los Institutos Nacio
nales de la Salud (NIH, E E.U U .) en el ao
1974. E stos in v estig ad o re s p u rifica ro n un
ARNm para cadena liviana kappa y sintetiza
ron un ADN complementario (ADNc) para la
porcin constante del mismo, al cual marcaron
con ^H. Usaron esta sonda para evaluar su ci
ntica de hibridacin a ADN de distintos tipos
celulares, en forma comparativa con la cintica
de un gen de beta globina, para el cual haban

demostrado previamente la existencia de dos

copias por clula. Sus resultados sugirieron la
existencia tambin de slo dos genes por clula
para la regin constante de la cadena Lj^.
En 1976, Hozum i y T onegaw a usaron un
ARNm purificado de un mieloma (tumor plasmocitario) productor de cadenas livianas lamb
da, para analizar la organizacin de los respec
tivos genes en el ADN nuclear. Para ello, puri
ficaron ADN embrionario y ADN del mieloma
de ratn (que representan tejidos indiferenciado
y diferenciado en produccin de anticuerpos,
respectivamente) y los fragmentaron con una
endonucleasa de restriccin. Luego fracciona
ron por eleetroforesis el ADN, purificaron nu
merosas fracciones segn su tamao molecular
e hibridaron cada una de las mism as con el
ARNm antes mencionado (fig. 6-1). El ARNm
hibrid con dos fragm entos distin to s en el
ADN em brionario pero hibrid con un solo
ADN DE MIELOMA

ADN EMBRIONARIO

Fragmentacin con
endonucleasas de
restriccin

Separacin de los
fragmentos segn
tamao por electroforesis

/ - V jI

i
Dos bandas de hibridacin
una posee el gen V y otra el C

Hibridacin con
ARNm radioactivo

Una sola banda de hibridacin

conteniendo los genes V y C en
el mismo fragmento de ADN

F ig . 6 -L Experim entos que m ostraron la diferente organizacin de los genes de inm unoglobulinas en el ADN em brionario
y en el ADN de clulas productoras de anticuerpos.

El origen de la diversidad de ios anticuerpos

fragmento (diferente de los anteriores) en el
ADN del mieloma. Los datos sugirieron que
las secuencias que codifican para las regiones
C y V se hallan separadas en el ADN e m
brionario y que se han rearreglado en un solo
fragmento en el ADN de hnfocitos B maduros.
Los mismos resultados fueron confirmados m e
diante la tcnica de Southern b lo f, mediante
la cual el ADN fragmentado, luego de su frac
cionamiento por eleetroforesis, es desnaturali
zado y transferido a una m em brana para su
posterior hibridacin.
Familia de genes de cadena liviana
k ap p a ( k )
En humanos, est localizada en el cromoso
ma 2 banda p l l y en el ratn en el cromosoma
6 . La regin constante de la cadena liviana ka
ppa est codificada por un nico gen constante
denominado C k , cuya secuencia nucleotdica
mostr la presencia de informacin para los re
siduos 109 hasta el 214 de la cadena polipeptdica.

133

La inform acin p ara regin variable est

segmentada en dos familias de genes, denom i
nadas V K y Jk, locahzadas en el mismo crom o
soma, aunque a decenas de miles de nucleti
dos de C k (fig. 6-2). Hay aproximadamente 50
genes V k distintos, cada uno precedido p o r un
pequeo exn (bloque codificante de ADN) pa
ra el pptido seal (leader peptide), del cual es
t separado por un pequeo intrn (bloque no
codificante de ADN). Este pptido seal le per
mite a la cadena su traslocacin a travs de las
m em branas del retculo endoplasm tico (du
rante el cual es chvado) para su expresin su
perficial o secrecin. La secuencia de A D N de
cada gen V k revela la informacin para los l
timos tres residuos del pptido seal y los pri
meros 95 aminocidos de la regin variable. En
el hom bre hay cinco genes J k , muy cercanos
entre s, cada uno de los cuales puede codificar
para los residuos 96 a 108 de la cadena liviana.
Esta fam ilia est localizada entre los genes V k
y el gen C k , a unas 3 kb (3.000 bases) de este
ltimo (fig. 6-2). Esta organizacin de la fam i
lia kappa es la hallada en todas las clulas del

CADENA K
Vk,

ADN"
germinal

V k,

Vk

k -i

Ck

Jk

-it1 2 3 4 5 Reordenamiento del ADN

L Vk

ADN
reordenado

Ck

4 5

Transcripcin y empalme del pre ARNm

ARNm

L Vk J
I

Ck

Traduccin y transporte de la protena

Protena madura
presente en el
anticuerpo

Sk

QX.

Sk CA.3

J?. QX,

JA,

c:

40kb
F ig. 6-2. A . O rganizacin genm ica en las familias de cadena liviana kappa. Se indican los residuos codificados p o r los
bloques L, V, J y C. Se m uestra un reordenam iento hipottico de un gen Vj^ hacia un gen
B. O rganizacin gen m ica
en la fam ilia de cadena liviana lambda. El tramo de A I)N que contiene a los genes CA.2 y C a3 posee una longitud v ariab le
en los distintos individuos, con la presencia de 2, 3, 4 o 5 genes constantes (polim orfism o poblacional); esto d eterm in a
que el nm ero total de genes C a oscile entre 6 y 9, segtin el individuo. Los tres p rim eros genes constantes se c o rre sp o n
den con los m arcadores isotpicos M cg, Ke-Oz- y K e-O z+,

134

Aspectos bsicos de la inmunidad

organismo, excepto las del linaje B, y se deno

mina organizacin germinal. El ratn posee 4
J k funcionales. Durante la diferenciacin linfocitaria B, cada linfocito elige uno de los genes
V k (acompaado de su propio exn lder) y lo
reacomoda delante de alguno de los genes J,^.
A parentem ente la seleccin del gen V k y Jk
por cada clula es al azar. Luego de este reor
denamiento gentico, los genes V k y Jk previa
mente localizados entre el V k y Jk elegidos, se
pierden. Ntese en la figura 6-2 que ahora se
ha ensamblado un bloque variable kappa conti
nuo (la suma de V -i- J), a continuacin del cual
todava pueden hallarse otros genes Jk. Esta
nueva disposicin de los genes se denom ina
configuracin reordenada y es la que ser
transcripta por la clula B en un precursor del
ARNm. Este precursor com ienza con la se
cuencia del exn lder, contina con el intrn
que lo separa del gen Vk, el gen V k contiguo a
un gen Jk, los restantes Jk presentes a conti
nuacin del usado (separados por pequeos in
trones), y un intrn hasta el gen C k , Durante su
m igracin del ncleo al citoplasma, este preARNm madura, adquiere las modificaciones en
los extremos 5 y 3 (cap y poli A) y empal
m a el exn seal con el V k-Jk y el C k , elimi
nando los intrones y los Jk presentes a conti
nuacin del usado (splicing o empalmado del
pre ARNm). Ya en el citoplasm a, el ARNm
maduro se traduce en polirribosomas de retcu
lo rugoso.
Complejidad de la fam ilia Vk: Los genes
V k humanos se agrupan en siete familias dis
tintas, segn el grado de hom ologa que po
seen entre s. Existen a! menos 76 genes V, de
los cuales 40 estn localizados en un tramo de
600 kb de AND proximales al locus Ck; 38 de
estos 40 genes Vk, poseen la mism a orienta
cin de transcripcin que el locus Jk-C k y se
reordenan por mecanismos de acercamiento y
delecin (vase ms adelante Mecanismos de
reordenamiento gentico). H acia 5 de esta re
gin de genes Vk, hay un segmento de ADN
de 800 kb que aparentemente carece de genes
V y a continuacin hay un segmento de 440
kb que posee los otros 36 genes V k ; los genes
V de este segmento distal tienen orientacin
de transcripcin inversa al locus J k - C k y se
re o rd e n a n p o r m e c a n ism o s de in v e rs i n
(vase ms adelante). De los 76 genes identi
ficados, 26 no seran funcionales (seudogeoes) y de los otros 50, slo la mitad (los ms
proximales al locus C k ) se reordenan frecuen
temente. Un estudio reciente de W inter y col.
mostr que en ms de 200 ADNc de cadenas
livianas k , los V k ms distales al locus C k es
taban representados en m enos del 5%; esto
podra deberse a las distancias relativas de las
regiones proximales y distales respecto de Jk-

Ck, o al mecanismo diferente de recom bina

cin que se requiere para producir un rearre
glo productivo. Es interesante notar que en la
poblacin existe un haplotipo frecuente (deno
minado haplotipo 11) que carece de un seg
mento de aproximadamente un milln de nu
cletidos (1 Mb) de la regin distal y por lo
tanto le faltan los 36 genes V k de esta regin;
los portadores homocigotas de este haplotipo
son tan inmunocompetentes como los que po
seen la dotacin gentica completa.
Familia de genes de cadena liviana
lambda (X)
Aproximadamente un tercio de los anticuer
pos humanos poseen cadenas hvianas lambda;
en el ratn constituyen menos del 10%. Los ge
nes para esta fam ilia estn en el crom osom a
22ql 1 humano y cromosoma 16 murino. A di
ferencia de la familia kappa, existen varios ge
nes que codifican para la porcin constante,
Ck, cuyo nmero vara entre 6 y 9 segn el in
dividuo. Cada uno de estos genes constantes
est precedido por un gen iX propio (fig. 6 -2 ).
La secuencia nucleotdica de los prim eros
tres genes constantes revel que se correspon
den con los marcadores isotpicos Mcg, Ke-Ozy Ke-Oz+ presentes en el suero humano (fig.
6-2). Estas tres cadenas son muy parecidas en
tre s, difieren en 1-4 aminocidos, lo que hace
sospechar de una duplicacin reciente de estos
genes.
Por otro lado, existen numerosos genes VX,
cada uno de los cuales codifica para los prime
ros 95 aminocidos de la protena, y cada uno
acompaado de su propio exn seal. Para el
ensamblado de una configuracin reordenada,
uno de los genes V k se reacomoda prximo a
uno de los genes J?i, donde ya queda definido
cul de los genes CA, se usar. Ntese que aun
cuando el gen C k no contribuye con diversidad
de reconocimiento, s lo hace cada uno de los
JA. que lo acompaan.

Complejidad de lafamilia VX. Se han identificado

en el humano al menos 67 genes VA en un segmento
de 850 kb de DNA, aunque un 40% de los mismos
parecen ser seudogenes. Se los agrupa en diez fami
lias, con ms de 75% de homologa entre miembros
de una misma familia y 55-69% de homologa nterfamilia. En esta regin tambin se localiza el gen pa
ra la cadena VpreB cuyo producto forma parte del
receptor pre B (vase ms adelante).
En el ratn se han identificado cuatro genes cons
tantes (aunque uno no es funcional), cada uno tam
bin acompaado de un gen J. Como se observa en
la figura 6-2, se los halla en unidades agrupadas de a
dos, cada uno precedido de un solo gen VA. El ratn
posee entonces, slo dos genes YA.

El origen de la diversidad de los anticuerpos

Familia de genes de cadena pesada
Estn localizados en el cromosoma 14q32.3
humano, estimndose la longitud total del lo
cus en 1500 kb. Esta familia posee una organizacin algo ms compleja: existen varios ge
nes constantes, uno por cada isotipo de cadena
pesada conocido; cada gen constante est a su
vez organizado en intrones y exones que co
rresponden a los diversos dominios constantes
CHI, CH2, etc.; finalmente la informacin pa
ra regin variable de la cadena pesada est
subdividida en tres familias de genes (en lugar
de dos), denominados V,.,,
y
(vase fg.
6-3).
Cada gen
posee informacin para los pri
meros 99 am inocidos de la regin variable.
Hacia 5, luego de un intrn de unas 80-100 bp,
cada gen
est precedido de un exn que co
difica los primeros 15 residuos del pptido se
al (los cuatro aminocidos restantes estn co
dificados al comienzo del exn V^,),

Complejidad de la familia
En el ser humano,
esta regin se extiende por una lO Kb, que co
mienzan a unas l Kb 5 de la regin D|_|. Los estu
dios ms recientes de mapeo han identificado 87 ge
nes V,_|, de los cuales 29 son seudogenes y al menos
46 han sido hallados en inmunoglobulinas (esto es,
son funcionales). Al igual que en los loci de cadenas
livianas, aqu tambin hay algunos segmentos (con
teniendo 1 a 4 genes V^,) duplicados o deleccionados, segn el individuo estudiado. De acuerdo a su
homologa se los agrupa en siete familias, con ms
de 80% de homologa entre los miembros de una
misma familia; las familias V3, V,j4 y V^^l son las
que ms miembros poseen.
La familia de genes D est compuesta por
un nmero aproxim ado de 20 miembros. En
general estn agrupados en un tramo de 1 0 0 kb,
aunque otros estn intercalados con genes
y
uno solo est junto a la familia J,_|. l^a secuencia
nucleotdica de estos genes indica que cada
segmento D codifica para 3-4 aminocidos.
La familia de genes
en humanos posee 9
miembros de los cuales 3 no son funcionales
(seudogenes); el ratn posee cuatro J^. Cada
uno codifica para un tramo de 1 0 - 1 2 aminoci
dos. Todos los genes
y C,_, poseen la
misma orientacin de transcripcin, lo que tie
ne implicancias con los mecanismos de reorde
namiento (vase ms adelante).
Hacia la derecha de la familia
(hacia 3), y
a una distancia de 8 kb de la misma, comienza
la familia de genes Ch, esparcidos a lo largo de
unas 150 kb (fig. 6-3). El orden de los mismos
es el siguiente: C|a., C 8 , Cy 3, C yl, Ce2 (un
seudogn). C a l, Cy2, Cy4, C el y C a2. Esta
organizacin sugiere que estos genes se han

135

originado de la duplicacin de un bloque an

cestral y-y--a.
Durante la diferenciacin de los linfocitos B,
uno de los prim eros eventos m adurativos lo
constituye el reordenamiento de los genes de
cadena pesada. wSe produce primero la eleccin
de un gen D,_j que ser reacomodado prxim o a
uno de los genes J^,, con la prdida de los genes
comprendidos entre ellos. En una segunda eta
pa, se produce el reordenamiento de uno de los
genes Vj_j prximo al bloque Djj/J|,. Esta orga
nizacin reordenada V/D/J-C|J, es la que ser
transcripta y los intrones y genes Jj, adicionales
sern eliminados durante el splicing del preRNAm.
En el ratn el locus H se halla en el crom o
soma 1 2 . Todos los genes C_, son funcionales,
para la generacin de cadenas pesadas mu,
delta, gamma 3, gamma 1, gamma 2b, gam m a
2a, epsilon y alfa. Por lo tanto el ratn ha du
plicado sus genes gamma sin afectar los psilon y alfa.
Cambio de isotipo de cadena
pesada
Durante la activacin de los linfocitos B en
la respuesta primaria, la mayora de las clulas
producen activam ente IgM. Algunas clulas
del clon en expansin dejan de sintetizar cade
na pesada mu y comienzan a sintetizar algn
otro isotipo: gamma, psilon o alfa. Para ello,
la clula padece un nuevo evento de reordena
m iento gentico, por el cual todo el b loque
VDJ se reacom oda prxim o a un nuevo gen
constante; se elim inan los genes constantes
presentes entre Ci (incluido l) y el nuevo gen
C,_| elegido (fig, 6-3). Ntese que todo el con
junto VDJ contina codificando a la porcin
variable de la cadena pesada, por lo que la es
pecificidad de reconocimiento antignico no se
modifica luego del switch isotpico.
Se han id en tificad o las secuencias en el
ADN que intervienen en estos procesos de re
combinacin: se denominan sitios S y estn lo
calizadas previo a cada gen C^, excepto a C5
que no la posee. Se trata de secuencias repetiti
vas de ADN que interactan entre s, diferentes
a las que operan en los reordenamientos antes
descritos. Hay evidencias de que un m ism o
clon celular puede realizar cambios sucesivos
de isotipo de cadena pesada, hacia genes Cj^
ms distales.
El cambio de isotipo es un fenmeno que de
pende de la cooperacin de las clulas T (vase
cap. 2). Las clulas T proveen seales a travs
de molculas de membrana (como CD40) y a
travs de citoquinas; por ejemplo IL-4 prom ue
ve el cambio a isotipos IgE e IgG4, T G F p e
IL -6 a IgA, IIv-10 a IgG, e IgG^,

136

Aspectos bsicos de la inmunidad

ADN GERMINAL

LVH, LVH,D

LVH

Dh

Cfx

C5

Cy.

C'/i

xj/Eg Ccx.,

100

1500

Cy|

C e^

CXg

51

58

Reordenamiento durante la diferenciacin

CYj Cy, \|/ej Ca,
Cy^
Cy^ Ce, Ca^

Ii cC|j,
u C5

L V DJJ

Cy,

ADN
REORDENADO
Cambio (switch) isotpico
durante la expansin clonal
L V DJ J

Ca,

H O lK t

pre-RNAm

ADN

Transcripcin y
ensamblado (splicing)

L V DJ Ca^
Produccin
simultnea de
cadenas n y y

L V DJ CS

Produccin de
cadena pesada

lOIII

F ig . 6-3. O rganizacin genm ica en la fam ilia de cadena pesada. El crculo negro que precede a cada gen constante (ex
cepto C8) indica los sitios S. El pequeo cuadrado que sigue a la fam ilia de genes J representa al enhancer de cadena p e
sada. Los genes pesados estn esquem atizados sin la subdivisin en exones e intrones. V ase texto para seguir los proce
sos de reordenam iento y expresin.

9
7
9
23
M r , A r , A G T G | ------- ------- [ a CATAAAC c !-------- / / -------(g GTTTTTG t ]

7
12

CACTGTG

CADENA K

IJ k

23

CADENA PESADA

23

A ......

12

12

23

F ig . 6-4. A. H eptm eros, nonm eros y espaciadores que acom paan a los genes de las tres lam ilias de cadenas de inm u
noglobulinas.

El origen de la diversidad de los anticuerpos

137

L Vk,3

F ig. 6-4 (coni.). B. A proxim acin espacial de los genes V y J que recom binan. La estructura secundaria estara esta b iliza
d a por el apaream iento de las bases com plem entarias de heptm eros y nonm eros.

Mecanismos de reordenamiento gentico

El anlisis de las secuencias de ADN flan
queantes a los genes V, D y J de cadena pesada
y V y J de cadena liviana, mostr un patrn
muy conservado de nucletidos, que se denomi
nan secuencias de reconocimiento o RS, y que
tienen un papel muy importante en los mecanis
mos de reordenamiento. Los genes de inmunoglobulinas con RS mutados (por ej. en ciertos
seudogenes o por mutaciones realizadas delibe
radamente in vitro) no pueden reordenarse.
En posicin 3 a cada gen V existe un tramo
de siete nucletidos, heptmero (idntico en to
dos los genes); a continuacin se halla un tra
mo de 12 o 23 nucletidos (segtn la familia)
conservados en longitud pero no en secuencia
(denominado espaciador o spacer). F inal
mente, sigue un nonmero (9 nucletidos) con

servados en longitud y secuencia (fig. 6-4A).

Un ordenamiento similar de heptmeros, espa
ciadores y nonmeros est presente tambin al
comienzo y fin de cada gen D y precediendo a
cada gen J,
Una inspeccin cuidadosa de las secuencias
de los heptmeros y nonmeros que siguen al
final de los genes V y D revela que es com ple
mentaria a la presente en los heptmeros y no
nmeros que preceden a los genes D y J (vase
fig. 6-4A). Esto hace pensar que estas secuen
cias podran facilitar el acercamiento de los ge
nes que interactan, prom oviendo el ap area
miento de los tramos complementarios en una
de las hebras del ADN (fig. 6-4B). Estas hor
quillas poseen en su base a los genes acerca
dos, con los tramos de ADN entre ambos hacia
arriba. Esta estructura secundaria se generara
por el apareamiento de las bases complementa

138

Aspectos bsicos de la inmunidad

rias antes m encionada, y sera la reconocida

por un sistema enzimtico especializado en su
eliminacin.
En cada familia de genes, la organizacin de
los espaciadores hace que siempre el reordena
miento ocurra entre un gen con espaciador de
12 y otro de 23. Los espaciadores de 12 y 23
bases equivalen, respectivamente, a una y dos
vueltas de la doble hlice del ADN. Estas ca
ractersticas peculiares de la regla 12/23 sugie
ren que esta organizacin aportara seales im
portantes para la recombinacin.
M a q u in a r ia e n z im tic a in v o lu c r a d a e n la r e c o m
b in a c i n . Al conjunto de enzimas y protenas res

ponsables de los reordenamientos genticos recin

descritos, se denomina r e c o m b in a s a . Hay tres evi
dencias indirectas que sugieren que una misma re
combinasa V(D)J opera en el naje B y el T (vase
cap. 7): (a) los loci que reordenan estn flanqueados
por RS (heptmeros, espaciadores, nonmeros) con
servados; (b) ocurren reordenamientos D-J en los lo
ci beta del receptor T y de la cadena pesada mu en
linfocitos B y T respectivamente; (c) los mismos dos
genes R A G (vase ms adelante) que pueden inducir
recombinaein V(D)J en clulas de linaje no-linfoide, se expresan coordinadamente en linfocitos B y T
en los estadios de diferenciacin donde ocurre activa
recombinacin.
R A G -1 y R A G -2 (gen activante de la recombina
cin): son dos genes estrechamente ligados en el
cromosoma 11 humano (slo distantes 8 kb entre s),
extremadamente conservados entre los vertebrados,
aunque no poseen homologa entre s. Los mismos
fueron aislados por Baltimore y col. mediante expe
rimentos en los que se transfectaron fibroblastos en
cultivo con ADN genmico total y donde un 0,1%
de los transfectantes dio origen a clulas eon activi
dad de recombinasa estable (evaluada por su capa
cidad de reordenar genes V/D/J contenidos en un
plsmido); luego de sucesivos ciclos de transfeccin,
se identificaron estos loci por mtodos clsicos de
clonado molecular, con una estrategia similar a la
usada para aislar los primeros oncogenes. Por lo tan
to, aunque la actvidad de recombinasa se expresa
reguladamente slo en lneas linfoides inmaduras, la
expresin constitutiva de estos dos genes en otras
clulas es suficiente para activar la recombinasa.
Adems, estos dos genes son esenciales para esta ac
tividad; ratones mulantes en uno u otro gen RAG
son inmunodeficientes ya que carecen de linfocitos
B y T. Se desconoce ain el mecanismo de accin de
los genes RAG. Se han propuesto dos modelos: (a)
los productos de RAG tendran actividad enzimtica
y participaran directamente en la reaccin de recOmbinacin o (b) tendran actividad regulatoria y
activaran la maquinaria de recombinacin. El anli
sis estructura! de los genes favorece la idea de un rol
directo de los RAG en la reeombinacin: el extremo
C-terminal de RAG-1, que posee un dominio con

homologa a topoisomerasas (enzimas asociadas a

recombinaciones de ADN en una gran variedad de
sistemas), es esencial para su funcin; sin embargo,
la eliminacin de otros segmentos gnicos homlo
gos a dominios con funcin regulatoria (tales como
el extremo N-terminal de RAG-1 que incluye un do
minio tipo dedo de Zn, o un dominio acdico de
RAG-2) no anula la actividad recombinasa.
Otras enzimas: hay numerosas evidencias que
involucran a otros productos adems de los RAG.
Por ejemplo, los ratones mutantes s c id son inmunodeficientes severos, carecen de linfocitos T y B, y
tienen recombinaciones V(D)J defectuosas. La mu
tacin mapea en un locus distinto al de los genes
RAG y adems, las clulas no linfoides exhiben de
fectos en la reparacin del ADN daado por radia
ciones X. Recientemente fue identificada una de las
protenas involucradas en estos procesos de repara
cin enzimtica del ADN y que tambin es necesaria
para la actividad de recombinasa V(D)J: se trata del
llamado autoantgeno Ku, una protena capaz de
unirse a extremos libres de hebras de ADN. Final
mente, se sabe que la enzima deoxinucleotidil trans
ferasa terminal es la responsable del agregado de nu
cletidos al azar en los sitios de yuxtaposicin
V(D)J (vase ms adelante).
Diversidad originada
por recombnacin somtica
Teniendo en cuenta el niimero de genes en
cada familia, se puede estimar el potencial de
diversificacin que tiene este sistem a. Si la
eleccin de genes se produce al azar, es vlido
aphcar combinatoria para el clculo:
Familia kappa: 50 genes
x 5 genes Jj^ =
250 cadenas livianas kappa
Familia H: 50 genes
x 20 genes Dj^ x 6
genes
= 6 . 0 0 0 cadenas pesadas
Recurdese que el ensamblado entre cadenas
pesadas y livianas para generar un anticuerpo
involucra uniones covalentes entre residuos de
cistenas. Vale decir que a priori no hay cons
tricciones estructurales que impidan la combi
nacin de cualquier cadena pesada con cual
quiera liviana. Por lo tanto, parece vlido vol
ver a aplicar combinatoria para estimar el total
de anticuerpos distintos posibles, segn el po
tencial de genes existentes:
250 c a d e n a s L x 6 .0 0 0 c a d e n a s H =
1.500.000 anticuerpos diferentes
Un nm ero para nada despreciable, si se
considera que se requiere de menos de 300 ge
nes en el genoma para su generacin y que no
se incluy en este clculo a las cadenas livianas
lambda, que en humanos poseen un repertorio

El origen de la diversidad de los anticuerpos

similar al de kappa. Cabe mencionar que aun
cuando casi todos los genes eucariotas estn
fragm entados en exones e intrones, inform a
cin que se empalma durante el splicing de
los pre-ARNm, los reordenamientos que ocu
rren en los genes de inmunoglobulinas acercan
la informacin a nivel del ADN, algo no des
crito para ninguna otra familia de genes euca
riotas.
Mecanismos adicionales de diversificacin
a) Imprecisiones en la recombinacin: Habi
tualmente el codn 95 en las cadenas livianas
es aportado por el gen
y el 96 por el gen
Sin embargo no existe un lmite preciso de fin
y comienzo de estos genes. Por esta flexib ili
dad en el sitio de yuxtaposicin se generan co
dones alternativos para el residuo 96, segn
cul sea el ltimo nucletido contribuido por el
gen
(vase fig. 6-5). En el primer ejemplo
de la figura, el codn 95 y el 96 son contribui
dos por V y J respectivamente. En el segundo
ejemplo, el gen V contribuye con un nucletido
adicional, por lo que el gen J comienza con el
segundo nucletido del codn 96; esto genera
un nuevo triplete que reemplaza triptfano por
arginina en el residuo 96. En el tercer ejemplo
el gen V aporta dos bases extras y J slo una
del codn 96; ahora el triplete codifica para
prolina en lugar de arginina o triptfano. Hay
situaciones en donde el gen V contribuye con
un triplete entero adicional y esa cadena ser
un aminocido ms largo (cuarto ejemplo), o
con un codn de menos, lo que producir una
cadena ms corta. Esta flexibilidad en el enlace
de los genes que recombinan se extiende hacia
el codn 95 y 97 de la cadena liviana y por otro
lado, el fenmeno tambin se observa en la re
combinacin V/D y D/J de la cadena pesada.
Hay ejemplos bien documentados en donde el
cambio de un solo residuo en esta tercera re
gin hipervariable afecta dram ticam ente la
afinidad de un anticuerpo por un epitope.
b) D iversificacin N-terminal: Al analizar
las secuencias de nucletidos de los ARNm o
de los genes reordenados, se observa frecuente
mente en el sitio de recombinacin la presencia
de 1 a 6 nucletidos adicionales no codificados
por los respectivos genes de la lnea germinal.
Asimismo, la longitud de las secuencias Dj_, y
Jj_, es frecuentemente menor que la codificada
en lnea germinal. Este fenmeno aporta obvia
mente diversidad adicional al repertorio de es
pecificidades y ha sido denominado diversifi
cacin N-terminal. La enzima deoxinucleotidil
transferasa terminal estara involucrada en este
agregado de nucletidos libre de templado.
Para resumir, dos anticuerpos cuyas cadenas
han utilizado idnticos genes V ,,
V,^, Dj^ y

139

Jjj, pueden poseer especificidades de reconoci

miento diferentes debido a estos fenmenos de
flexibilidad en el sitio de enlace y diversifica
cin N-terminal. Como consecuencia de estos
dos fenmenos, es frecuente que en la configu
racin reordenada de los bloques no se respete
el marco de lectura de los codones (por ej., en
la fig. 6-5, si el tercer nucletido del codn 95
se enlazara con el segundo nucletido del co
dn 96 en el gen J). La consecuencia del cam
bio del marco de lectura es la aparicin de co
dones de terminacin de sntesis proteica en las
secuencias D o J y ese reordenamiento no ser
viable (abortivo). De este ejemplo se desprende
que los dos m ecanism os recin descritos, si
bien contribuyen para generar diversidad, pue
den por otro lado conducir a reordenamientos
abortivos.
La flexibihdad en el sitio de recombinacin
y la diversificacin N-terminal, se estim a que
aumentan el repertorio de especificidades por
un factor de 1 0 en las cadenas livianas y p o r un
factor de 100 en las cadenas pesadas. P o r lo
tanto, el nm ero total de p osibilidades que
ofrece el sistema es superior a 1 0 ^ (6 . 0 0 0 x fO^
x 2 5 0 x 10= 1,5 X 109).
El lector no debe pensar que un individuo
debe expresar simultneamente el total de este
repertorio en sus linfocitos perifricos. Las c
lulas B maduras que salen a periferia recirculan
con una vida m edia relativam ente co rta, de
unas pocas semanas y, si no se produce el en
cuentro con un antgeno apropiado, m ueren.
Diariamente la mdula sea produce y exporta
al menos 5 x 1 0 linfocitos B, que irn reno
vando el pool de especificidades. Si se re
cuerda que los microorganism os enfrentan al
sistema inmune no con uno, sino con un m osai
co de epitopes diferentes, lo ms probable es
que exista alguna clula B capaz de reconocer
alguno de los epitopes extraos. Aun si la afini
dad de ese anticuerpo es modesta, podr iniciar
la respuesta inmune, a la que contribuirn otros
clones dirigidos contra otros epitopes en los
das sucesivos.
Mutacin somtica
Durante la expansin clonal de los Hnfocitos
B en la respuesta primaria, las primeras clulas
sufren una diferenciacin terminal hacia plas
mocitos productores de IgM. Otras clulas pro
ducen el cambio de isotipo (switch) que perm i
tir la secrecin de anticuerpos con otras cade
nas pesadas. Una porcin de las clulas activa
das es la que se expande para generar el pool
de clulas B de memoria. Este proceso ocurre
en los linfocitos B activados (centroblastos)
presentes en los centros germinales de los gan
glios linfticos. A continuacin, las clulas pa-

140

Aspectos bsicos de la inmunidad

^ H
RESIDUO:

94

95

4)

H
97

CCC :
' Pro :

2)

g e n j

CGC :
Pro

C
Arg

CGC :
Pro :

CC

CCC :
Pro ;

CCA
: Pro

TGG
Trp

A ce
Thr

Gt3 ^

ACG
Thr

Pro

TGG
Trp

ACG
Thr

ACG
Thr

F ig . 6-5. Flexibilidad en la recom binacin V-J. Se m uestran las secuencias finales de un gen V k y las iniciales de un gen
J k que recom binan (vase descripcin en el texto).

saran a recircular a la espera del segundo con

tacto.
Durante este proceso de expansin clonal, al
cabo de 7-10 das de iniciada la respuesta, los
genes reordenados de cadena liviana y pesada
comienzan a acumular una serie de mutaciones
puntuales, a un ritmo de 10 '^ por nucletido por
generacin. Estas mutaciones se evidencian al
determinar la secuencia nucleotdica de los ge
nes reordenados o del ARNm en hibridom as
secretantes de anticuerpos especficos. Si se
compara esta secuencia con aquella de los ge
nes de lnea germinal se observan los cambios
puntuales mencionados. Las mismas mutacio
nes, al estar presentes tambin en las clulas de
memoria, se evidenciarn en la respuesta se
cundaria, durante la cual se agregarn cambios
adicionales.
Todas las mutaciones se esparcen en una re
gin de 1 .0 0 0 nucletidos que incluyen a los
genes VJ y VDJ y los intrones que los flan
quean; no afectan al gen constante, ni a los ge
nes no reordenados, aunque s a los reordena
dos abortivamente en el otro cromosoma (si los
hubiere). I^a afinidad de los anticuerpos secre
tados por los clones mutados es usualm ente
5-100 veces mayor que aquella de los anticuer
pos de la respuesta primaria; se detectan tam
bin unos pocos clones cuya afinidad es igual o
menor, Muchos de los cambios afectan a resi
duos crticos en las regiones CDRl y CDR2 de
las cadenas. Durante la generacin de las elula.s de memoria, el antgeno seleccionara y fa

vorecera la expansin de los clones cuya in

munoglobulina superficial posee mayor afini
dad. En la respuesta secundaria sern predomi
nantes estos clones, as como otros que utilicen
otros genes variables.
Expresin de los genes: promotores
y enhancers
En un linfocito B, la transcripcin de los ge
nes de inmunoglobulinas (comenzando desde
el exn seal que precede a los genes V) no
ocurre en los genes en configuracin germinal
pero s en los genes reordenados. Ello se debe
fundam entalmente a la presencia de unas se
cuencias aumentadoras ce la transcripcin o
"enhancers, localizadas en el intrn que sepa
ra al ltimo gen J y el gen constante, tanto en
cadenas livianas como en pesadas. Los enhan
cers se definen como secuencias regulatorias
que aumentan la transcripcin de promotores
vecinos. El promotor (regin en el ADN donde
la ARN polimerasa inicia la transcripcin) de
los genes de inmunoglobulinas se localiza pre
vio a cada exn seal de cada gen V. Este pro
motor est normalmente alejado del enhancer,
excepto cuando ocurre el reordenamiento, que
lo lleva contiguo a un gen J y prximo a la r
bita de accin del enhancer. El enhancer de es
tos genes tiene una longitud de menos de 300
bases y despus del cambio de clase (en los ge
nes de cadena pesada) acom paa al bloque
V/D/J hacia su nueva localizacin.

El origen de la diversidad de los anticuerpos

A unos pocos nucletidos previos al sitio de
iniciacin de transcripcin de todos los genes
V, se halla un octanucletido conservado, cu
ya secuencia complementaria se encuentra en
un sitio anlogo en los genes de cadenas livia
nas y en el enhancer de las cadenas pesadas.
El enhancer de las cadenas vianas tambin
posee una secuencia conservada. Estas secuen
cias son esenciales para la expresin de estos
genes, a los que les conferira la especificidad
de expresin en tejido linfoide. Se han identifi
cado las protenas nucleares que se unen a estas
secuencias regulatorias; las llamadas oct J y
oct 2 se unen al octanuclotido y NF-kB se une
al enhancer.
Reordenaraientos y expresin durante
la maduracin Iinfocitaria
Uno de los primeros eventos en la diferen
ciacin del linaje B lo constituye el reordena
miento de los genes de cadena pesada de inm u
noglobulinas. La clula procede primero con la
recom binacin D/J (habitualm ente en ambos
cromosomas 14) y luego con la V > D/J en
uno slo de los crom osomas 14: si logra en
samblar correctamente los genes, se transcribe
y traduce la cadena pesada (X. Si el reordena
miento no es productivo (abortivo) debido a
deleciones, mutaciones o cambios en el marco
de lectura de los codones, la clula procede a
reordenar el otro cromosoma 14 del par alco.
Si ambos intentos son aborvos, la clula m ue
re por apoptosis. Luego de un reordenamiento

141

exitoso, la cadena pesada p, se asocia tem pora

riamente en el retculo endoplasmtico con una
protena chaperona de 78 kD denominada BiP,
y una pequea proporcin de las molculas se
asocian covalentemente a la llamada cadena li
viana sustitua ( surrogate light chain) con la
cual migra a superficie.
Esta c a d e n a liv ia n a s u s titu a es un dmero no co
valente de dos pptidos llamados (X^ (26 kD) y
(16 kD), que adopta una conformacin espacial si
milar a una cadena liviana. A travs de la porcin
se une por enlace disulfuro a la cadena pesada ju y
todo el complejo se expresa en superficie junto a las
m.olculas accesorias Ig e Igfi. Este complejo mole
cular, denominado r e c e p t o r p r e - B , sera importante
en el envo de seales de diferenciacin por parte de
clulas del estroma de la mdula sea y/o sus citoquinas.
y X5 estn codificados por genes loca
lizados en el cromosoma 22, dentro de la familia de
genes de cadena liviana lambda; son genes muy
conservados en distintas especies y n o se r e o r d e n a n
previo a su expresin. Esta c a d e n a liv ia n a s u s t itu a
es crtica para e! desarrollo linfocitario B, ya que en
ratones mutantes donde se ha alterado deliberada
mente su estructura para evitar su expresin, la on
togenia B se afecta profundamente, con una dismi
nucin en 40-veces del nmero total de linfocitos
pre-B.
La presencia de una cadena |a, funcional en
este estadio parece constituir una seal para
dos eventos: 1 ) que la clula no proceda a reo r
denar los genes del otro cromosoma 14 (si el

ARNm p ara
c a d e n a 5 de
su p e rfic ie

F ig. 6-6. Sntesis sim ultnea de dos A R N m maduros p ara cadena pesada |i. y cadena p esada delta en linfocitos B m ad u ro s
vrgenes. U n pre A RN m que incluye a todos los exones de C p y C8 se procesa en form a diferencial {splicing alternativo)
para generar dos A RNm m aduros, uno para cadena p y otro para delta, q u e incluyen en am bos casos los ltimos ex o n es h i
drofbicos M p y M 5 . Los linfocitos B activados transcriben un pre A R N m ms corto q u e excluye los exones de C ; al
m adurar, se elim inan los exones hidrofbicos M p y la cadena term ina en un tram o hidroflico (S), q ue evitar su an c lad o a
ia m em brana. Las flechas indican los sitios de poli-adenilacin.

142

Aspectos bsicos de la Inmunidad

primer intento fue productivo); 2) que comien

cen los reordenamientos de los genes de cadena
liviana. Para las mismas hay una jerarqua en la
eleccin de los cuatro loci disponibles; primero
siempre se intenta con la familia kappa, en uno
de los cromosomas 2. Si el evento es producti
vo, el otro locus kappa y la familia lambda per
manecen en configuracin germinal. Si el pri
mer intento falla, se reordenan los loci kappa
en el otro cromosohia 2 y, si ste tambin falla,
recin entonces se reordenan los genes lambda
(tambin un cromosoma por intento). En otras
palabras, un clon que expresa cadenas lambda,
posee ambos loci kappa abortivamente reorde
nados, Estos fenm enos explican m olecular
mente la llamada exclusin allica, por la cual
una clula B slo expresa uno de los dos alelos
posibles (materno o paterno) de cadena liviana
y pesada, y slo una de las dos cadenas livianas
posibles.
Una vez que la clula produce una cadena li
viana funcional, su ensamble con la cadena pe
sada ocurre dentro del retculo endoplasmtico,
ya sea a travs de un intermediario de hemimocula H-L o de un dmero H-H al cual se unen
luego ias cadenas vianas; estas vas dependen
del isotipo de cadena pesada involucrada. En el
retculo tambin comienza la glucosilacin de
la protena, que contina durante su trnsito ha
cia la membrana a travs del Golgi.
En el estadio ms avanzado de diferencia
cin, la clula expresa simultneamente IgM e
IgD en la superficie, marcadores con los que
migra a la periferia. La clula puede producir
las dos cadenas pesadas, ya que transcribe un
pre-ARNm muy largo que incluye el bloque
variable VDJ, el gen constante C |i y el gen
constante C5. Por empalme o splicing alterna
tivo del pre-ARNm, se producen dos mensaje
ros m aduros, uno para cada cadena p esad a
(vase fig. 6-6). Ellos incluyen a los dos lti
mos exones de cada gen pesado, que poseen
aminocidos hidrfobos, y que le permiten a la
cadena pesada expresarse como una protena
integral de superficie celular.
Cuando comienza la activacin y expansin
clonal inducida por el antgeno, slo se sinteti
za IgM; el pre-ARNm no incluye ai gen C5, En
las clulas plasmticas, el anticuerpo no se ex
presa en superficie sino que se secreta. Para
ello, se produce un ARNm para C |l algo ms
corto, que excluye a los ltimos exones hidr
fobos y termina al final del dominio CH4 con
20 codones hidrofiicos. Los niveles acumula
dos de ARNm son 20-100 veces mayores a los
presentes en un linfocito B en reposo y es con
secuencia, en partes iguales, de un aumento en
el ritmo de transcripcin y un aumento en la es
tabilidad de los ARNm. Cuando las cadenas
pesadas carecen de los dominios de transmem

brana, se transportan como molculas solubles

dentro de vesculas que liberan su contenido al
exterior por exocitosis. Un plasmocito maduro
puede secretar hasta 10 molculas de anticuer
po por minuto.
Existe un nmero muy pequeo de linfocitos
B maduros que exhiben simultneamente anti
cuerpos con dos isotipos distintos de cadena
pesada, por ejemplo IgG -i- IgE, etc. El anlisis
molecular de este tipo de poblacin fue realiza
do en muy pocos casos, en los que se demostr
la presencia de pre-ARNm largos que incluyen
a ms de un gen constante. El procesamiento
diferencial del mismo (similar al que ocurre pa
ra la expresin simultnea de IgM e IgD) gene
rara ARNm maduros para dos cadenas pesadas
diferentes. Se desconoce si estas clulas perte
necen a una subpoblacin con relevancia fun
cional.

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Estructura y organizacin
gentica del receptor T

M. LEONARDO SATZ

Antecedentes histricos
Desde el descubrimiento de los fenmenos
de restriccin en el reconocimiento antignico
por los linfocitos T a principios de la dcada
del 70, y durante ms de una dcada, la natu
raleza del receptor T (TCR) ha sido tem a de
gran controversia en inmunologa. La existen
cia de Jgs como elemento de reconocimiento y
la existencia de uno o dos receptores para ex
plicar la restriccin por los linfocitos T fueron
quiz las reas ms debatidas durante se tiem
po.
A lo largo de muchos aos, numerosos estu
dios contribuyeron a la nocin de que el reco
nocimiento antignico por parte de los linfoci
tos T es diferente del de los linfocitos B. En lo
que se refiere al repertorio o espectro de reco
nocimiento, queda claro que aun cuando puede
haber epitopes reconocidos por clulas de am
bos linajes, los linfocitos B reconocen determi
nantes nativos en el Ag (sean lineales o con
formacionales), mientras que el TCR slo reco
noce pptidos antignicos generados por las
maquinarias de procesamiento (vase cap. 1 0 )
y presentados en la superficie de las clulas
presentadoras de Ag (CPA) por molculas de
histocompatibilidad (MHC).
Hubo dos estrategias de estudio que, inde
pendientemente, han permitido la dilucidacin
de la estructura del TCR. La primera de ellas
analiz el efecto de Acs monoclonales sobre el
reconocimiento de Ag por clulas T y, even
tualmente, llev a la caracterizacin bioqumi
ca del TCR. La segunda encar directamente el
aislamiento de los genes que codifican para el
TCR.

Efectos de ACs monoclonales sobre

el reconocimiento T
La herram ienta esencial en estos estudios
constituy la disponibilidad de clones de linfo
citos T, tanto humanos como murinos. Ellos se
obtienen estimulando repetidas veces in vitro
linfocitos T inmunes con el Ag especfico (y
CPA) y en presencia de IL-2 en el medio de
cultivo. Luego de un tiempo, las clulas son ca
paces de crecer y dividirse, teniendo como tni
co requisito la provisin de IL-2 exgena. Las
clulas pueden ser clonadas por dilucin y el
clon resultante manifestar un reconocimiento
antignico especfico, de naturaleza monoclo
nal. Se han generado clones T con actividad
helper que, ante la presentacin de Ag por
CPA singeneicos, aceleran su proliferacin y
secretan IL-2 y citoquinas. Tambin se han ge
nerado clones T con actividad citotxica espe
cfica.
La caracterizacin fenotpica de los clones T
citotxicos mostr que la mayora de ellos son
CD 8 -I- y estn dirigidos contra epitopes presen
tados en el contexto de MHC de clase 1. Sin
embargo, un pequeo porcentaje de ellos son
de fenotipo CD4-h y reconocen epitopes p re
sentados por MHC de clase II. La asociacin
entre el fenotipo superficial y la clase de mol
culas reconocidas sugiri que quiz las mol
culas CD4 y CDS facilitan el reconocimiento
y/o la lisis de las clulas blanco. Si se preincuban los clones T citotxicos con Acs monoclo
nales anti-CD4 y anti-CD 8 , previo al ensayo de
su actividad biolgica, los primeros inhiben la
citotoxicidad de los clones CD4+ y los segun
dos la de los clones CD 8 -1-. Este efecto se ob

Estructura y organizacin gentica del receptor T

serva sobre clones dirigidos contra blancos dis
tintos y el grado de inhibicin de la citotoxici
dad vara.
Las molculas CD4 y CD8 (vanse cap. 2 y
cap. 13), presentes en la superficie de las dos
poblaciones T predominantes en periferia, es
tn codificadas por genes no polim rficos e
idnticos en las distintas clulas. Por lo tanto,
se especul como poco probable que ellas sean
parte del TCR. Sabemos hoy que estas molcu
las, reconocen estructuras conservadoras (monomrficas) sobre las MHC de clase I y clase II
(de all la asociacin CD4-clase II y CD8-clase
1). No slo ayudaran a la estabilizacin de la
interaccin de la clula T con la CPA, sino que
adems transducen seales de activacin celu
lar (vase cap. 13).
El complejo molecular CD3 est presente en
la superficie celular del 95% de los hnfocitos T
maduros. Est compuesto por un complejo de 5
cadenas polipeptdicas cuyos PM oscilan entre
16 y 26 kD. Se ha observado que durante la ac
tivacin antignica la cadena CD3-zeta es fosforilada en residuos de serina. Cuando se preincuban clones de linfocitos T con Acs monoclo
nales contra CD3, segn las circunstancias ex
perimentales, s'e bloquea la activacin antigni
ca o se induce la activacin de las clulas, aun
en ausencia del Ag especfico. Estos efectos
tambin se manifiestan sobre diversos clones
T, independientemente de la especificidad anti
gnica. El complejo molecular CD3 no exhibe
variaciones en las distintas clulas o in d iv i
duos, y por ello no constituye la estructura pri
maria del reconocimiento.
Los experim entos clave con estos mism os
clones T se hicieron cuando se los us para in
munizar ratones y preparar Acs monoclonales
contra ellos. Los Acs fueron caracterizados, se
gn su capacidad para bloquear o inhibir el re
conocimiento antignico o la activacin de los
clones. Algunos de los Acs obtenidos reaccio
naron e inhibieron especficamente el reconoci
miento antignico por el clon utilizado en la in
munizacin y se los denomin Acs clonotpi
cos. Estos Acs clonotpicos fueron utilizados
para caracterizar bioqumicamente las molcu
las contra las cuales estaban dirigidos en la su
perficie celular T.
En los diversos clones T, independientemen
te de su fenotipo superficial (CD4 o CD8) su
funcin (helper o citotxica), o su especificidad
antignica, estos Acs reconocen glucoprotenas
de alrededor de 90 kD. En estos experimentos
de inmunoprecipitacin, con frecuencia se copurifican tambin los componentes del comple
jo CD3. Por otra parte, si previamente se entre
lazan las protenas con Acs contra CD3, se copurifican las molculas de 90 kD arriba mencio
nadas; estos experim entos sugieren que los

145

componentes del CD3 estn locahzados fsica

mente muy cercanos a las molculas de 90 kD.
Los Acs clonotpicos tambin fueron utiliza
dos para purificar estas molculas. Cuando se
analizaron digestiones trpticas de las m olcu
las aisladas de diversos clones, la crom atogra
fa revel pptidos comunes y otros especficos
de cada clon. Esta caracterstica sera la que
puede esperarse de una molcula con funcin
de TCR, con regiones C y V, como en las Igs.
Una de las cadenas se llam T a y la otra Tp.
Luego se obtuvo informacin parcial de las se
cuencias aminoacdicas de las cadenas purifica
das con estos Acs y se demostraron pequeos
tramos de homologa con las cadenas pesadas y
livianas de las Igs.
Todas estas evidencias experimentales fue
ron obtenidas durante los aos 1983-1984 y su
girieron, obviamente, que las estructuras reco
nocidas formaban parte del TCR. La confirm a
cin provino de los estudios moleculares de ca
racterizacin de los genes de la cadena p del
TCR, lograda en form a independiente en el
transcurso de los mismos aos (vase ms ade
lante). La segunda fam ilia de genes de TCR
identificada se crey que era la correspondiente
a la cadena T a; se trataba en realidad de los ge
nes Ty, que codifican para un TCR diferente.
Pronto qued claro que existen dos estructuras
diferentes de TCR, presentes en distintas po
blaciones de linfocitos T, que se denom inan
a /p y y/8 y cuyo origen, distribucin y funcin
parecen ser diferentes. Ambos tipos de recepto
res estn estrechamente asociados en la mem
brana al complejo molecular CD3 que, como
vim os antes, se requiere para el correcto en
samblado y transporte del TCR a la superficie
y tambin para la transduccin de seales al in
terior de la clula. El cuadro 7-1 resume las ca
ractersticas de ambos tipos de clulas T.
Estrategias de aislamiento
de los genes de! T C R
Durante 1983 M ark Davis y col. establecie
ron una estrategia para el aislamiento de los ge
nes del TCR, basada en las siguientes presun
ciones: a) los genes deben expresarse en clu
las T y no en clulas B, b) los ARNm para el
TCR deben hallarse en polisem as adosados a.
membranas del retculo endoplasmtico rugo
so, con la protena naciente unida al retculo
por el pptido seal, c) los genes que codifican
el TCR deben sufrir reordenamientos genticos
de hnfocitos T para generar diversidad con es
trategias similares a las usadas por las Igs, y d)
al igual que en los genes de Igs, debe haber re
giones V y regiones C.
Sobre la base de estas suposiciones se desa
rroll una estrategia de clonado, teniendo en

146

Aspectos bsicos de la inmunidad

C u ad ro 7-1. Descripcin comparativa de los linfocitos con receptores a jiy yS

R eceptor yS

R eceptor aj3
Estructura:
D iversidad;
D istribucin:
Fenotipo:

Ontogenia:
F uncin:

H eterodm ero unido S-S

a : - 6 0 V, -6 0 J, 1 C
P: - 7 0 V, 2D , 13 J, 2 C
Sangre perifrica 60-70%
G anglios, bazo
60% CD 4 + CDS 35% CD 4 - CDS +
<1% C D 4 - C D S 100% CD 2+ CD34-, > 95% CD5 -F
T m ica (tarda)
Extratm ica im probable
Reconoce pptidos presentados sobre m ol
culas de histocom patibilidad de clase I y II
clsicas

cuenta que los linfocitos B y T difieren sola

mente en la expresin de unos 200-300 genes y
que slo un 3% de los ARNm se hallan unidos
a polisomas de retculo rugoso. Se prepar una
coleccin de ADNc a partir de ARNm purifica
do de polisomas de retculo de clulas T, usan
do uno de los precursores de la sntesis de
TCRP

H eterodm ero unido S-S o no covalente

8: 5 - I 0 V , 3 D , 4 J , 1 C
y: 9 V, 5 J, 2 C
Sangre perifrica < 10%. Epitelio intestinal, genital, piel.
lquido sinovial
< 1% CD 4 + CDS 20-50% C D 4 - CDS dbil
50-80% CD 4 - CDS 100% CD 2+ CD 3+, C D 5- o dbil
Tm ica (tem prana)
Extratm ica probable
Posibles: prim era lnea de defensa contra antgenos m icro
bianos conservados. R econocim iento de pptidos sobre
m olculas de histocom patibilidad clsicas o no clsicas
(C D l en hum anos,
TL /Q a m urinos)

ADN m arcado por

Se hibridizaron con
ARNm proveniente de linfocitos B para elimi
nar las secuencias comunes a ambos linajes ce
lulares y los ADNc especficos T restantes se
utilizaron como una sonda para identificar clo
nes con secuencias de ADN homlogas, en otra
coleccin de ADNc especficos de clulas T
TCRa

F ig . 7 -1 . E s q u e m a d e l
c o m p le jo C D 3 /r e c e p to r
T a.p en la su p erficie c e lu
lar. Los signos (+) y (-) en
las porciones transm em br
nicas representan am inoci
dos cargados en las cadenas
del receptor y de las m o l
culas CD3. H ay evidencias
a h o ra d e la p r e s e n c ia d e
dos cadenas e en C D 3, u na
aso ciad a a C D 3-8 y o tra a
CD3~y.

Estructura y organizacin gentica del receptor T

construidos como antes. Se aislaron clones po
sitivos, y con cada uno de ellos se evalu su
expresin exclusiva en linfocitos T y si sus se
cuencias se hallaban reordenadas en linfocitos
T y no en B (patrones e hibridizaein diferen
tes al cortar el ADN de linfocitos B y T con nu
cleasas de restriccin). Uno de los clones aisla
dos cumpli con todos estos requisitos. Se tra
t, en efecto, de la cadena T(3 murina, cuya se
cuencia nucleotdica revel tramos de homolo
ga con las Igs. Este primer clon fue usado a su
vez como sonda para identificar secuencias ho
mlogas en una coleccin de ADNc preparada
a partir de ARNm tmico. Se identificaron nue
vos clones, cuya secuencia nucleotdica era va
riable en los primeros 100 codones, pero cons
tante en los ltimos 200.
Con estrategias sim ilares se identificaron
otros genes de los TCR murino y humano. Los
primeros clones de ADNc perm itieron aislar
luego clones genmieos y conocer la organiza
cin de las familias de estos genes.
Heterodmero a p
La cadena a posee unos 260 aminocidos y
la P unos 300, de los cuales los primeros 100120 (del extrem o N -term in a l de cada una)
constituyen la regin variable. La yuxtaposi
cin espacial de la regin V a y v p determina
el sitio de reconocim iento del receptor (fig.
7-1). El dominio ms prximo a la membrana
es conservado y se lo llama regin constante,
C a y C3. Los dominios V y C en ambas cade
nas poseen puentes di sulfuro intraeatenarios, t
picos de la estructura general que poseen las
inmunoglobulinas y MHC. Ambas cadenas es
tn unidas covalentemente por cistenas locali
zadas prxim as a la m em brana plasm tica.
Luego de un segmento hidrfobo transmembr
nico (19-22 aminocidos), las cadenas term i
nan con 5-12 residuos intracitoplsmicos. A m
bas cadenas estn glucosiladas, y poseen una
masa relativa de 45-60 kD y 40-50 kD para la
a y p respectivamente.
La estructura tridimensional de los dominios
variables de las cadenas a y p del receptor T
(RCT), determinada por cristolografa de rayos
X se observa en la figura 7-2.
Gentica del receptor ap
U ICR est codificado por genes que, en lnep generales, siguen la misma estrategia que
k' genes de inmunoglobulinas para generar di
versidad. Esto es, durante la diferenciacin los
linfocitos T reacom odan blo q u es de genes
V(D)J para ensam blar una regin variable y
traerla prxima a la regin constante.

147

Familia de genes a. En humanos, est locali

zada en el cromosoma 14, en el sitio alejado del
locus de cadena pesada de inmunoglobulinas;
en ratn, se hallan en el cromosoma 14. E st
compuesta por un nico gen constante, denom i
nado Ca, dividido en cuatro exones. La infor
macin para la porcin variable de la cadena al
fa est fragmentada en dos familias, una deno
minada V a y otra Ja. Esta ltima est com pues
ta por al menos 61 miembros, esparcidos en un
tramo de unas 70 kb vecinas a C a (fig. 7-3); al
menos cinco J a son seudogenes. Cada J a posee
una longitud de unos 55-65 bp y por lo tanto
codifica para unos 18-21 residuos. A continua
cin del locus Ja , se halla el locus de genes 5
(vase ms adelante) y luego el conjunto de g e
nes V a , cada uno de ellos est precedido por un
exn seal. Existen como mnimo 60 genes V a
clasificados en 29 subfamilias. Esta regin del
genom a est extrem adam ente conservada en
murinos, donde tambin hay unos 60 segmentos
J a y unos 100 genes V a.
Para generar diversidad en esta cadena, du
rante la diferenciacin intratmica, cada clula
elige un gen del pool V a y lo reacomoda v e
cino a alguno de los genes Ja. Al cabo de este
proceso se eliminan todos los genes localizados
entre ambos V a -Ja que reordenan, incluyendo
a todo el locus delta (fig. 7-3). Por el gran espaciam iento de la fam ilia Ja , los pre-ARNm
que se generan por transcripcin del locus re o r
denado son notablemente largos. La transcrip
cin de este locus est regulada por un enhan
cer, localizado a 4,5 kb hacia 3 del gen C a ,
que afecta al promotor de cada gen V a luego
de la reeombinacin V a /Ja . Por la gran exten
sin de la regin Ja , se presume que este e n
hancer debe ser lo suficientemente activo para
afectar la transcripcin de genes V a que han
reordenado a J a muy distales.
F a m ilia de genes 3. Est localizada en el
cromosoma 7 humano y 6 murino (alejado de
la familia de genes de cadena liviana k). Tanto
en el humano como en el ratn, existen dos g e
nes constantes denominados C/37 y C}2. A m
bos son genes funcionales, subdivididos en
cuatro exones, con muy alta homologa (>95% )
entre s. Poseen cierta homologa ancestral (3237%) con los genes Ce y el dominio CHI de la
cadena pesada gamma de inmunoglobulinas.
C p l est precedido en un tramo de -4-5 kb
por un grupo de seis genes 7/3 y un gen D5,
mientras que CB2 est precedido por siete j p y
un D p (fig. 7-3). Cada gen Dp codifica p ara
3-5 aminocidos y cada Jp para 15-17 residuos.
Existen adems no raenos de 70 genes V3
humanos, cada uno precedido de un exn seal.
Esta fam ilia est localizada previo a D p i, e x
cepto para un gen v p ubicado unos 10 kb a
continuacin de CP2, con una orientacin de

148

Aspectos bsicos de la Inmunidad

F ig . 7-2. A. E structura tridim ensional
determ inada por cristalografa de rayos
X de los dom inios variables (V) de las
cadenas a (am arillo) y p (celeste) del
receptor para antgenos de las clulas T
(RCT). Las regiones de com plem enta
riedad hipervariables que interaccionan
eo n el co m p lejo p p tid o -m o lcu la de
clase II del C M H estn in d icad as en
a z u l ( C D R I ) , b la n c o (C D R 2 ), ro jo
(C D R 3) y en m agenta /a regin de iipervariabiU dad 4 (HVA). B. La mism a
estru c tu ra m o stran d o la su p erficie d e
contacto eon el com plejo pptido-m ol
cula clase II del CM H con el mism o c
digo de colores. Fotografas gentilm en
te cedidas por los Dres. B. A. Fields, E.
L. M alchiodi y R. A. M ariuzza.

transcripcin inversa a la del gen constante. Es

te ltimo gen Vp es funcional. La diversidad
v p murina es menor, con aproximadamente 25
miembros.
Para generar diversidad en la familia p, du
rante la diferenciacin intratm ica una clula
procede a reacomodar estos genes. En primer
trmino se produce la recom binacin D p-Jp:
D p i tiene 13 opciones Jp para elegir (seis del
prim er grupo y siete del segundo), m ientras
que Dp2 slo tiene siete (fig. 7-3). En una se
gunda etapa, uno de los genes VP es elegido y
reacomodado vecino al bloque Dp/Jp. Los ge
nes C pi y CP2 son utilizados indistintamente
en los linfocitos T, independientemente del fe
notipo de superficie o funcin de los mismos.
Funcin del receptor aP
L as clulas T p o rtad o res el rec e p to r a p
constituyen el 60-70% de los linfocitos de san
gre perifrica y son tambin los predominantes
en ganglios y bazo. Esta molcula est presen
te en la superficie tanto de las clulas CD4-{-

como las CD8+, secm colaboradoras o citotxicas/supresoras. Su funcin es la de reconocer

MHC de clase I o clase II que acarrean ppti
dos antignicos en su sitio de presentacin.
Correlacin en tre la estructura del recep
tor T y la especificidad antignica. La des
cripcin de los genes a y p como responsables
de la codificacin de las cadenas del receptor
antignico presente en la mayor parte de los
linfocitos T permiti luego encarar estrategias
experimentales para conocer cul es la contri
bucin de ambas cadenas en la especificidad fi
na del reconocimiento. Numerosos experimen
tos demuestran que ambas cadenas son necesa
rias para el reconocimiento T. Por ejemplo, Yague y col. aislaron tres clones T murinos espe
cficos contra ovalbmina de pollo junto a la
MHC de clase II, I-A'. Los tres clones utilizan
los mismos genes a y P; lneas mutantes que
dejan de expresar una u otra cadena, pierden su
capacidad de reconocer Ag, lo que se restaura
al fusionar dos mutantes (una a y otra P). En
otros modelos de mutantes similares, la intro
duccin exgena del gen, cuya expresin end

Estructura y organizacin gentica dei receptor T

gena se ha perdido en ei mutante, tambin res
taura ia expresin dei receptor T. Recurdese
que ias m utantes que no expresan ei dm ero
T a, P, tampoco expresan CD3 y que ia reex
presin dei RCT tambin restaura CD3.
Con ei objeto de saber si ia cadena a o ia p
participan independientem ente dei reconoci
miento dei epitope antignico y de ia MHC, se
hicieron ios siguientes experimentos: a partir
de un clon T citotxico se aislaron ios genes
reordenados T a y Tp y se introdujeron para su
expresin en otro cion citotxico, de especifici
dad distinta. Luego de ia transferencia, ias nue
vas ciuias conservaron su especificidad originai, adquirieron ia especificidad de ias ciuias
donantes de ios genes, pero no adquirieron
nuevas especificidades combinadas para reco
nocer cada uno de los pptidos antignieos en
ei contexto de ia MHC del otro cion. Estos re
sultados sugieren una vez ms que ambas cade
nas son ias responsables dei reconocim iento
dei complejo pptido-MHC.
Por otra parte, no hay una utilizacin preferenciai de determinados genes variables ( a o p)
por una u otra subpoblacin CD4 o CD8 de lin
focitos T. Estas observaciones coinciden con ia
nocin de que ia MHC de ciase I y de clase II
posee una estructura tridimensional similar.

149

Heterodmero jd
Se expresa en ia superficie asociado ai com
plejo m olecular CD3, en linfocitos T que no
expresan el dimero a p . Las cadenas y tienen
una m asa relativa de 45-55 kD (algo m s de
300 aminocidos) y las 8 de 40-50 kDa (~ 275
aminocidos). Ambas estn glucosiladas.
En humanos hay dos tipos de cadenas g a
mma que difieren en su posicin constante, de
nominadas T y l y Ty2 segn utilicen genes Cyl
o Cy2 (vase ms adelante). Tyl forma un d
mero unido por puentes disulfuro con ia cadena
5, m ientras que Ty2 se enlaza no co valente
mente con 5 ya que carece de cistenas por fue
ra del dom inio transm em brana. En el rat n
aparentemente todos los TCR y8 poseen enla
ces covalentes.
Gentica del receptor y
Est codificado por segmentos gnicos que
tambin se reordenan durante la ontogenia para
generar diversidad.
F a m ilia de genes y. Est localizada en ei
cromosoma 7 humano, en un locus alejado del
que codifica para los genes beta; en el ratn se
halla en el cromosoma 13. Existen dos genes

CADENA p

2 5 kb

CADENA a
L Va

Ja

Ja Ja Ja J a Ja

Ja Ja Ja

Ca

80 Kb
CADENA.8
'L V a

LV5

D5,_3

LVa

J5,_,

C5

lf

V8 L

15 Kb

CADENA Y
L Vy

L Vy

Jy

Cy,

Jy

Cy,

F ig. 7-3. O rganizacin genm ica en las cuatro fam ilias de cadenas del TCR. El locus delta est entre los genes V a y J a .
V ase el texto para ms detalles. Un C om it de N om enclatura de la O N U acord recientem ente designar a los resp ectiv o s
genes con letras m aysculas, por ej.: T C R A C , es el gen constante C a , T C R A J se refiere a los genes J a , etctera.

150

Aspectos bsicos de la inmunidad

constantes funcionales denom inados C yl y

Cy2, separados entre s por unas 16 kb (fig.
7-3). Cyl es precedido por tres genes J y y
por dos Jy adicionales. Se han identificado 14
genes Vy, agrupados en 4 familias. La primera
incluye 5 genes funcionales y cuatro seudoge
nes, las otras tres poseen un miembro cada una
aunque slo un gen (V9) es funcional. Al igual
que en las otras cadenas, el apropiado reorde
namiento Vy-Jy permite la transcripcin de un
gen funcional. La organizacin murina es simi
lar, aunque hay cuatro clusters Jy-Cy, uno de
ellos no funcional. Hay al menos siete Vy mu
rinos funcionales.
Familia de genes 5. Este locus se halla en
tre los genes V a y J a (fig. 7-3). Existe un ni
co gen constante CS, organizado en cuatro exo
nes. Est precedido de cuatro segmentos J5 y
tres genes D5. Se han identificado hasta el pre
sente por lo menos cuatro genes VS, uno locali
zado a continuacin de C5 en orientacin de
transcripcin invertida y los otros parecen estar
esparcidos entre los genes de la familia V a. A
unas 2 kb hacia 5 del segmento C5 (entre C5 y
J5), se halla el enhancer que regula la trans
cripcin de los genes. La familia est extrema
damente conservada entre humanos y murinos.
Funcin del receptor y
En humanos, las clulas T con receptores y5
constituyen una fraccin minoritaria de los lin
focitos T de sangre perifrica (<10% ), gan
glios, bazo y timo (<1%), esto es, en rganos
donde predominan las clulas T a p . Sin embar
go en rumiantes, la sangre perifrica posee pre
dominio de Ty5. Estas clulas se hallan en di
versos epitelios y se acumulan en lesiones in
flamatorias causadas por numerosos patgenos.
La mayora no expresa en superficie las mol
culas accesorias CD4 y CDS; las presentes en
epitelio intestinal expresan un hom odm ero
C D Saa. Se desconoce la funcin precisa de es
tos linfocitos, aunque las evidencias sugieren
que pueden ejercer diversas funciones efectoras
y regulatorias (vase ms adelante).
Hay evidencias que sugieren que los linajes
que se diferencian hacia clulas a[3 y y6 en el
timo, son independientes. Se ha postulado la
existencia de una clula precursora que inten
ta reordenar productivam ente el locus gamma:
de lograrlo, contina su m aduracin reorde
nando el locus delta. Si falla el reordenam ien
to de gamma, la clula reordenara genes -beta
y finalmente genes alfa. Durante la diferencia
cin, las clulas Ty6 realizan seleccin positi
va y seleccin negativa y hay evidencias de
que tanto las molculas de histocom paribilidad clsicas como las no clsicas estn invo
lucradas en este proceso. A lgunas subpobla

ciones Ty5 parecen ser seleccionadas en en

tornos extratmicos, presumiblemente por an
tgenos ambientales.
En humanos existen fundamentalmente dos
subpoblaciones de linfocitos Ty6. La subpobla
cin V8l usa preferentemente una combinacin
V81/D51 y D82, y se une en forma no covalen
te a cadenas gamma que usan Cy2 y el Jy ms
vecino que lo precede, pero no tienen preferen
cia por un dado Vy. Esta poblacin aparece en
timo 4-6 meses despus del nacimiento, posee
gran diversidad en el sitio de yuxtaposicin
V/(D)J, son minoritarias en sangre, donde exhi
ben un fenotipo CD45 RA. La subpoblacin
V52 es de ontogenia ms temprana, aparecen
en timos fetales de 10 semanas y con el desa
rrollo pasan a sangre perifrica, donde son ms
abundantes que las V 8 l y poseen fenotipo
CD45RO. Estn form adas por cadenas delta
V82/D83 unidas covalentemente a cadenas ga
mma con uso preferencial Vyl o Vy9/Jyl/Cyl.
Es como si ambas subpoblaciones balancearan
el uso recproco de genes.
La poblacin V82 de sangre perifrica hu
mana exhibe una citotoxicidad inespecfica, ti
po NK, contra determinadas clulas tumorales,
luego de su activacin in vitro con mitgenos
(PHA) e IL-2. Tambin expresan receptores Ec
y algunos clones Ty8 pueden ejercer ADCC.
La poblacin V81, tiene menor potencial citotxico. Algunos clones T con estas caractersti
cas responden con intensa proliferacin ante
ciertos HLA-DR alogeneieos respecto de las
clulas T; esta estimulacin se bloquea con an
ticuerpos anti HLA-DR, demostrando el reco
nocimiento por el receptor y5 de una molcula
de histocom patibilidad. Algunos clones TyS
murinos tam bin m ostraron esta reactividad.
Tanto clones humanos como murinos secretan
algunas citoquinas in vitro.
En el ratn, los linfocitos Ty8 son los prime
ros en colonizar el timo en el da 14 de la gesta
cin, donde reordenan y expresan predominan
temente el gen Vy3. En el da 17 se produce otra
onda de expansin de timocitos y8, que expre
san predominantemente el gen Vy3. En el da 17
se produce otra onda de expansin de timocitos
y8, que expresan predom inantem ente el gen
Vy4. Estos linfocitos fetales migran para coloni
zar la piel y epitelios genitales, respectivamente,
donde exhiben muy limitada diversidad de reco
nocimiento (vase ms adelante. Diversidad).
En ratones adultos se halla una poblacin Ty8
con mucha diversificacin, que coloniza epitelio
intestinal y parece desarrollarse (o al menos ex
pandirse) en entornos extratmicos.
Papel de las clulas T yS en infecciones. Se
ha comprobado recientemente que en determi
nadas patologas infecciosas, se acumulan lin
focitos Ty8 en sitios inflamatorios. En reaccio

Estructura y organizacin gentica del receptor T

nes granulomatosas cutneas en pacientes con
lep ra tu b e rc u lo id e , hay ap ro x im a d a m e n te
25-35% de linfocitos Ty5, comparado con un
-5% presente en piel normal. Se pudieron ge
nerar algunas lneas celulares de estos pacien
tes, que proliferaron intensamente ante lepromina y PPD, aunque no se estableci claramen
te la necesidad o no de reconocimiento del an
tgeno junto a m olculas HLA. En pacientes
con Leishmaniasis cutnea tambin se observ
un incremento de 7 veces en el nmero de lin
focitos TyS en las lesiones granulomatosas. Por
otro lado, en el lquido sinovial de pacientes
con a r tr itis re u m a to id e a , se a cu m u la un
10-20% de linfocitos TyS. Cuando se incuba in
vitro esta poblacin con extractos antignicos
de Mycobacterium tuberculosis y protenas de
estrs trmico (HSP-60) purificadas, se induce
la activacin celular. Una estimulacin similar
se observa con clulas Ty5 de sangre perifrica
de individuos positivos al PPD. Clones TyS
(Vy9-i-) de sangre de individuos normales ejer
cen citotoxicidad contra clulas preincubadas
con enterotoxinas de estafilococos. Durante la
fase aguda de infeccin con el virus de Epstein
BaiT, aumentan en sangre perifrica los nm e
ros de linfocitos Ty5 Vy9/Vy2. Las Ty5 tam
bin aumentan en humanos infectados con Sal
monella o Brucella.
Los modelos experimentales murinos aporta
ron en los ltimos ao numerosos ejemplos del
papel de las clulas Ty8. Los ratones donde se
eliminaron las clulas T y5 (por tratamientos in
vivo con anticuerpos monoclonales anti-Ty5, o
con animales donde se mutaron deliberadamen
te los genes y5 de forma tal que no se permite
la m aduracin de estas clulas), son m ucho
menos eficientes en la depuracin de bacterias
o parsitos tales como Listeria, Salmonella o
Leishmania. En experimentos muy recientes se
ha docum entado que las clulas TyS pueden
constituir parte de la inmunidad innata produ
ciendo diferencialm ente citoquinas que indu
cen respuestas T hl y Th2. As, ratones infecta
dos por va intraperitoneal con Listeria, acum u
lan en esta cavidad durante 10 das clulas TyS
que secretan INFy; por otra parte, ratones in
fectados con un parsito extracelular {Nipostrongylus), acumulan linfocitos TyS que secre
tan IL-4. Evidentemente las clulas TyS pueden
discrim inar am bos patgenos en las etapas
tempranas de la infeccin y producir citoquinas
asociadas de respuestas Thl o Th2.
El rol de ias clulas TyS no se hmita a este
papel regulador de las respuestas inmunes: ra
tones que carecen de clulas T ap , pero que po
seen nm eros norm ales de clulas TyS, son
mucho ms eficientes en la eliminacin de L is
teria comparados con animales en donde am
bas poblaciones T estn ausentes; esto indica

151

que las clulas TyS pueden jugar un papel ms

directo en la eliminacin de patgenos.
En los casos donde se la analiz, la partici
pacin de las molculas de histocompatibilidad
(M HC) clsicas en el reconocim iento p o r la
TyS constituye una excepcin; en algunas si
tuaciones, se requiere una MHC aunque no se
observa restriccin gentica. Por otro lado, nu
merosos clones TyS reconocen clulas que ex
presan determ inadas MHC no-clsicas, tales
como TL/Qa murinas o C D l y CD48 humanas.
M ecanismos de reordenamiento gentico
Los miembros de las cuatro familias de ge
nes del TCR poseen seales de recombinacin
con heptmeros, nonmeros y espaciadores de
12 y 23, muy similares a los presentes en los
genes de inmunoglobulinas (cap. 6). Su organi
zacin muestra que tambin se cumplira la re
gla 12/23 para los genes que interactan (fig. 74). Por la disposicin de las seales en el locus
Tp, ntese que podra ocurrir una recom bina
cin V[3-Jp directa, o una recombinacin D p iDp2, sin violar esta regla (fig. 7-4). Sin em bar
go, estos fenmenos no parecen ser habituales.
Otro mecanismo de recombinacin sera el utihzado por los genes Vp y VS hallados en posi
cin in v ertid a a co n tin u aci n de los genes
constantes CP2 y CS respectivamente.
Diversidad de los receptores T
La diversidad exhibida por los receptores aP
es de una magnitud similar a la de las inmunoglobulinas. En todas las familias de genes del
TCR existe flexibilidad en el sitio de yuxtapo
sicin de los genes que recombinan y tambin
ocurre el agregado de 1-12 nucletidos libre de
tem plado en dichos sitios (diversificacin Nterm inal). Esta di versificacin en el sitio de
yuxtaposicin vara en las diferentes etapas de
ios ontogenia TyS murina, desconocindose los
factores que la regulan.
Por otro lado, en la familia de genes TP, am
bos elementos Dp pueden ser usados en los tres
marcos de lectura sin la aparicin de codones
de terminacin. Esto permite eodificai' distintos
residuos, lo que aumenta notablemente la di
versificacin. Lo mismo sucede con los genes
DS, donde adems se han identificado num ero
sas cadenas que utilizan simultneamente dos
regiones DS. Estos mecanismos proveen al sis
tem a yS de un enorme potencial pese a que es
tas familias disponen de un aparente reducido
nmero de genes variables.
En el ratn, los linfocitos TyS de la piel y
epitelio genital expresan predom inantem ente
un par de cadenas yS, donde sus genes poseen
muy reducida variabilidad en los sitios de re-

152

Aspectos bsicos de la inmunidad

CADENA a
7
Va

23

12

Ja

CADENA p

vp

I_____-/ /_

Dp

12

Jp

CADENA y
23

12

Jy

CADENAS
,

D5
23

V8.

//-

12

23

-//

12

J8

F ig. 7-4. H eptm eros, nonm eros y espaciadores que anciuean a los genes de las cuatro cadenas de los receptores T. O b
srvese que, por la disposicin de los espaciadores vecinos a D p y D6, se perm ite la recom binacin entre dos genes D.

combinacin. Por lo tanto, el repertorio de re

conocimiento de estas clulas es muy limitado.
A diferencia de lo que sucede con los genes
de inm unoglobulinas, no hay evidencias que
sugieran la existencia de mutacin somtica en
lo genes de receptor T.
Molculas accesorias
E l complejo molecular CD3. Ambos heterodmeros de reconocim iento T estn estrecha
mente unidos en la superficie celular con un
grupo de molculas que colectivamente se de
signan complejo CD3 (fig. 7-1). Como se ha
mencionado antes, se trata de cinco cadenas
polipep tdicas de 150-180 residuos, dos de
ellas glucosiladas llam adas CD3y y CD3s, y
dos no glucosiladas, denominadas CDSsipsilon) y CD3( (zeta), habiendo dos m.olculas de
esta ltima por complejo molecular. No se dehe confundir a estas cadenas con las molculas
del receptor Tpropiam ente dicho.
Son protenas integrales de membrana, uni
das no covalentemente entre s, excepto las dos
molculas
que estn unidas por enlaces di
sulfuro. Excepto CD3i;, el resto de las molcu
las poseen los dos tercios de la protena e x
puestos al exterior, seguidos a continuacin de

una regin transmembrana de unos 26 residuos.

Este tramo posee un aminocido con carga ne
gativa, que puede constituir uno de los m eca
nismos que estabilizan su interaccin con las
cadenas del heterodmero receptor, que poseen
en esta porcin uno o dos residuos con carga
positiva.
Las porciones intracitoplasm ticas de los
componentes son significativamente ms largas
que las de los receptores, por lo que se cree que
pueden interactuar con otros componentes del
citoplasm a en la transduccin de seales. Su
secuencia no es homloga a dominios de act
vidad quinasa o protenas que ligan GTP. Co
mo se describir en el captulo 13, los compo
nentes de CD3 participan en la transduccin de
seales durante la activacin celular.
El complejo molecular CD3 es esencial, ade
ms, en el ensamblado y transporte del TCR a
la superficie. La unin de las molculas ocurre
en el retculo endoplasmtico, donde participa
una cadena adicional denominada CD3co(omega). Clulas mutantes para la expresin de al
guna de las cadenas de CD3 no exportan el re
ceptor T hacia la superficie.
Las cadenas CD3 y, 5 y e se sintetizan desde
estadios muy tempranos de maduracin tmica,
pero permanecen en el interior celular. Recin

Estructura y organizacin gentica del receptor T

en los estadios ms avanzados de maduracin,
ei reordenamiento y la expresin de los genes
del TER permiten el ensamblado del conjunto
para su exposicin superficial.
Los genes que codifican CD3 7 , 8 y e estn
estrechamente ligados en un tramo de 60 kd del
cromosoma 1 lq23 humano y 9 murino.
Otras molculas accesorias. En las clulas
portadoras del receptor a p , las molculas CD4
y CD 8 juegan un papel importante en el mconoeimiento de porciones no polimrficas de las
MHC de clase II y I respectivamente. Tambin
participaran en la transduccin de seales al
interior, ya que estn asociadas a una tirosina
quinasa que puede fosforilar a cadena CD3 ^
(vase cap. 13).
B IB L IO G R A F A
S.M. H edrick y col. Isolation o f cD N A clones encoding T
cell specific m em brane-associated proteins. N ature 308:
14t>L53, 1984.
S.M. H edrick y col. Sequence relationship betw een putative T -cell rece p to r poly p e p tid e s and im m unoglobulins.
N ature 308: 153-158, 1984.
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Reaccin antgeno-anticuerpo in vitro

interaccin primaria

RICARDO MARGNI

GENERALIDADES
L a reaccin inm unolgica depende de la
complementariedad que pueda existir entre un
antgeno y un anticuerpo y constituye una inte
raccin tpica entre macromolculas. En el de
terminante antignico y en el sitio de combina
cin del anticuerpo especfico hay estructuras
que se corresponden y la regulan. No solamen
te las estructuras primarias son las responsables
sino que, tal como ocurre con algunas enzimas,
las estructuras secundarias y terciarias tambin
participan facilitando el acoplamiento, como la
llave a la cerradura segn la expresin clsica.
Las fuerzas que facilitan esta unin no son
de tipo covalente, son ms lbiles, lo que per
mite en ciertas condiciones la disociacin de
complejos Ag-Ac ya formados.
Cuando antgeno y anticuerpo se encuentran
en fase acuosa, la interaccin de las molculas
de agua con ambos reactivos juega un papel
muy im portante en la combinacin ligante-ligando. Las fuerzas responsables de esa unin
se producen en prim er trm ino como conse
cuencia de una disminucin de la entalpia que
lleva a la sustitucin de las interacciones de fi
jacin entre el agua y el antgeno o el anticuer
po, por interacciones ms estables entre el ant
geno y el anticuerpo y, en segundo lugar, por
un aumento de la entropa originariamente de
pendiente de la liberacin de agua por ambos
reactivos. La energa libre de fijacin es la que
tiene que vencer la disminucin de la entropa
originada a consecuencia de la com binacin
del antgeno con el anticuerpo para formar un
complejo Ag-Ac ms estable.
D iferentes formas de unin no covalentes
contribuyen a la formacin de la unin Ag-Ac,
las que estn determ inadas por la naturaleza

8
qumica del solvente. Entre ellas figuran unio
nes electrostticas (atraccin entre tomos car
gados positivam ente y negativamente), unio
nes o puentes de hidrgeno (atraccin entre
tomos polarizados opuestos de hidrgeno y
oxgeno), fuerzas de Van der Waals (atraccin
entre electrones y ncleos atmicos), fuerzas
de dispersin de London (dependen de la pola
ridad electrnica de los grupos interactivos),
etc. Una caracterstica de todas esas fuerzas de
atraccin es que son inversamente proporcio
nales a la distancia entre los grupos interaccionantes. As, las uniones inicas son inversa
mente proporcionales al cuadrado de la distan
cia que los separa, en tanto que las fuerzas de
Van der Waals son inversamente proporciona
les a la sexta potencia de la distancia entre los
grupos. Adems, en estas interacciones partici
pa la llamada repulsin estrica, que es inver
samente proporcional a la dcima potencia de
la distancia entre los grupos reaccionantes. Es
tas fuerzas se deben a la interpenetracin de
las nubes electrnicas de los tomos no uni
dos.. C uando hay co m p lem en taried ad entre
ellos, estas fuerzas se minimizan, ocurriendo
lo contrario cuando el ligando no es especfico
para los grupos reactivos del sitio de combina
cin del anticuerpo. La contribucin de esas
fuerzas a la energa libre de unin es del orden
de -1 a -2 Kcal/mol para las interacciones i
nicas; de -1 Kcal/mol para los puentes de hi
drgeno, y m enos de -1 K cal/ mol p ara las
fuerzas de London, La mayor contribucin a la
energa libre de unin no proviene de las unio
nes dbiles entre superficies apolares, sino del
aumento de la entropa como consecuencia de
la liberacin de molculas de agua alrededor
de grupos apolares de los reactivos interaccionantes, que es de aproximadamente -4,1 Kcal-

Reaccin antgeno-anticuerpo in vitro

/mol. Cuando residuos hidrofbicos de un de
terminante antignico interaccionan con resi
duos hidrofbicos del sitio de combinacin del
anticuerpo, las molculas de agua que estaban
en contacto con cada uno de ellos se excluyen,
lo cual facilita la estabilizacin de la interac
cin. Ocurre algo similar a lo que acontece con
molculas proteicas ricas en residuos hidrof
bicos superficiales, las que en solucin acuosa
no pueden permanecer como monmeros pues
dimerizan con facilidad. La contribucin de los
puentes de hidrgeno a la energa lib re de
unin del complejo Ag-Ac, que podra ser sig
nificativa, -4,5 Kcal/mol, se ve muy disminui
da como consecuencia de que las molculas de
agua compiten eficazmente con el antgeno y el
anticuerpo en esas interacciones. La energa li
bre de fijacin total de la unin del antgeno
con el anticuerpo, que es aditiva, oscila entre
-8 y -1 5 Kcal/mol.
Una de las mayores dificultades para el estu
dio de las interacciones antgenos-anticuerpos
sricos es la gran heterogeneidad de stos. El
advenimiento de los anticuerpos monoclonales
homogneos, obtenidos de hibridomas habr de
facilitar los hechos. No obstante, esos resulta
dos sern vlidos para estudios experimentales,
ya que la homogeneidad no es la caracterstica
de la poblacin total de anticuerpos sricos de
una respuesta inmune, donde la poblacin mo
lecular, de origen policlonal, est formada por
anticuerpos de diferente afinidad, que a su vez
pueden reconocer diferencias en los epitopes
para los cuales tienen especificidad.
En el laboratorio es factible realizar el estu
dio fisicoqumico de esa interaccin y la medi
cin de las fuerzas que la regulan en cada caso.
Para ello, partculas antignicas tales como
bacterias, hem ates, clulas, etc., no resultan
tiles pues son muchos los componentes anti
gnicos que las forman. Tampoco son eficaces
la m ayor parte de las protenas sim ples por
contener varios determinantes antignicos dife
rentes por molcula, lo que llevara a la medi
cin de la interaccin simultnea de distintos
sistemas ligando-anticuerpo. Los mejores siste
mas son los constituidos por anticuerpos con
especificidad para grupos qumicos definidos
(anticido arsanlico, antidinitrofenol, antilactsido, etc.) y sus correspondientes haptenos.
Puede recurrirse tambin al empleo de inmunosueros obtenidos por inmunizacin con deter
minadas bacterias capsuladas, las que por con
tener en sus polisidos constitutivos algunos
residuos simples, tales como el cido cellobiurnico en el neumococo tipo ll, originan anti
cuerpos con especificidad para ellos.
Si se inmuniza un animal y se lo sangra pe
ridicam ente, los anticuerpos formados reac
cionan con el agente inmunizante a velocidades

155

diferentes y originan precipitados o aglutinados

que se disocian de distinta m anera segn la
sangra de la que fueron obtenidos. Ello es con
secuencia de su distinta afinidad, que depende
del tipo de fuerzas que gobiernan esas uniones.
Cmo puede medirse esa afinidad?
Si consideramos un hapteno con un solo gru
po reactivo por molcula (Hp), cuando reaccio
ne con su anticuerpo especfico lo har de la si
guiente manera;
Ac + Hp ^ A c H p
k i
AcHp + Hp

AcHp^
k .

AcHp_, + H p ^ AcHp
k
n representa el nmero mximo de molculas
de ligando m onovalente capaces de unirse a
una molcula de anticuerpo, o sea el nmero de
sitios de com binacin o valencia de ste; en
tanto que k y k son las constantes de las velo
cidades de asociacin y disociacin (constantes
cinticas) para las distintas etapas de la reac
cin, y su relacin k /k = K la constante de
asociacin. El valor de K puede calcularse de
terminando la concentracin de cada uno de los
reactivos cuando el sistema se haya equilibra
do. El valor de K determinado en esas condi
ciones se denomina constante de asociacin in
trnseca, y la ecuacin que expresa ese estado
de equilibrio es la siguiente;
(AcHp)
(Ac) (Hp)

= K

(1)

Es necesario, para poder comparar los resul

tados obtenidos con diferentes sistemas, deter
minar las condiciones de equilibrio para el cl
culo de K. Se ha establecido que ste corres
ponde al caso en que ia mitad o el 50% de os
sitios de combinacin del anticuerpo estn ocu
pados por ligando monovalente. Este valor de
K se denomina constante de asociacin intrn
seca mediana, se identifica como
y es sin
nimo de afinidad. Suele representarse tambin
con
(constante de afinidad).
De la ecuacin (1) deriva la siguiente;
K (Ac) (Hp) = (AcHp)

(2)

La concentracin total de anticuerpo (Act) es

igual a la suma de sus molculas unidas al hap-

156

Aspectos bsicos de la inmunidad

teo (AcHp) y las que se encuentran libres en

el medio (Ac):
(Act) = (Ac) + (AcHp)

(3)

Ello considerando al anticuerpo como univa

lente, pero dado que ste posee ms de un sitio
de combinacin por m olcula (n), este valor
debe ser tenido en cuenta, como se ver ms
adelante.
La ecuacin (3) puede reescribirse:
(Ac) = (Act) - (AcHp)

cul debe ser la concentracin aproximada de

ligando (Hp) que se debe aadir para poder lo
grar la saturacin de aqul.
La ecuacin (7) es una expresin de la ley de
accin de las masas, similar a la derivada por
Langmuir para la adsorcin de gases sobre sli
dos.
De la ecuacin (7) puede derivarse otra, que
permite calcular K q determinando las concen
traciones de hapteno libre y combinado para
los diferentes sistem as en equilibrio. Si esa
ecuacin es invertida:

(4)

Sustituyendo el valor (Ac) en la ecuacin (2)

por el de la ecuacin (4) resulta:

(Act)

1 -I- K (Hp)

(AcHp)

K (Hp)

(8)

Si se pasa (Act) al lado derecho de la ecuacin:

K (Hp) l(Act)-(AcHp)] - (AcHp)

(5)

Resolviendo el lado izquierdo de la ecuacin

y reordenando

1 + K (Hp)

(AcHp)

(Act) K (Hp)

(9)

Desarrollando el lado derecho de la ecuacin:

K (Hp) (Act) - K (Hp) (Ac Hp) = (Ac Hp)
K (Hp) (Act) = (AcHp) 4- K (Hp) (AcHp)
K (Hp) (Act) = (AcHp) [ 1 K (Hp)]
(6)
Transfiriendo (Act) del lado izquierdo de la
ecuacin hacia el derecho y [1 4- K (Hp)] en
sentido inverso, resulta;
(AcHp)
(Act)
(AcHp)

(7)

constituye la relacin entre el nmero

de molculas de hapteno combinado por mol

cula de anticuerpo y equivale a la fraccin de la
molcula de anticuerpo unida al hapteno.
Si en la ecuacin (7) (Act) se lo transfiere al
lado derecho, se transforma en
K (Hp) (Act)
(AcHp) = ---------------1 -f K (Hp)

(AcHp)

(Act) K (Hp)

(Act)

(7 )

Siendo K q expresado en M y (Hp) en M, el

producto K (Hp) no tiene unidades. Este valor,
relativo de 1 determina el grado de saturacin
del anticuerpo (Act) por el ligando (Hp). As, si
K; es 10*' M ' y la concentracin del ligando
(rfp) es 10 '' M, Ko (Hp) = 0,1, por lo tanto, de
acuerdo con la ecuacin (7^), el total de anti
cuerpo ocupado sr
0,1
0,1
--------- = ------ = 9 %
1-1-0,1
1,1
Esta observacin es muy interesante ya que
permite saber, para una determinada concentra
cin de anticuerpo (Act) y conociendo su Kq,

(10)

Si sustituimos (AcHp) = hapteno combinado,

por b y (Hp) = hapteno hbre, por c, la ecuacin
anterior puede escribirse:
1

K( Hp)
1 -HK (Hp)

---------- =

---------------

+ --------

( 11)

Act

Act K c

Graficando por el mtodo de Scatchard 1/fo ver

sus 1/c (fig. 8-1) se obtiene una curva que per
mite calcular, adems de Kq, los sitios de com
binacin o paratopes existentes en la muestra
por extrapolacin de la curva a Mb, ya que en
ese punto c y 1/c = O y, de acuerdo con la
ecuacin (11), la ordenada al origen es MAct.
Si se trabaja con anticuerpo purificado, puede
determinarse su valencia dividiendo la concen
tracin de sitios de combinacin por la concen
tracin de anticuerpo total.
La ecuacin (7) est referida a un anticuerpo
o ligante que posee un solo sitio de combina
cin pero, teniendo en cuenta que en los anti
cuerpos existen n sitios, ella debe escribirse
(AcHp)

n K (Hp)

(Act)

1 -)- K (Hp)

( 12)

(AcHp)
--------- y c a la
( Act)
concentracin de hapteno libre (Hp), la ecua
cin anterior puede escribirse:
Si llamamos r a la relacin

nK C
1 - hKc

(13)

Reaccin antgeno-anticuerpo in vitro

157

obtener una lnea cuya pendiente es - K (vase

fig. 8-2A). sta no es una recta, ndice de la he
terogeneidad de los anticuerpos.
Cuando la concentracin de hapteno libre c
es enormemente grande, r se aproxima a n, y
para r/c = O, el punto en que la curva intercepta
a r ser la valencia del anticuerpo o nmero
mximo de molculas de ligando monovalente
capaces de fijarse a una molcula de anticuer
po. Esta graficacin, como se ver ms adelan
te, sirve para determinar el valor de Kq.
Pasando 1 -i- Kc al lado izquierdo de la ecua
cin y reordenando se obtiene;
r -(- r K c = nKc
r = n K c - r K c = c (nK - r)
= nK-rK
1/cxlo^M '
F ig . 8-1. E laborada con los datos del cuadro 8-2. La curva
experim ental fue linealizada por el mtodo del anlisis re
gresivo. In te rcep ci n d e la ln ea a )/b = 8,4 x 10 M -'.
C oncentracin de sitios de com binacin = 0,119 x 1 0 M.
C o n c e n tra c i n de in m u n o g lo b u lin a a n tic u e rp o = 0,95
m g .m l-';K o = 0 ,9 x 1 0 M -'.

Esta expresin resulta muy til ya que si me

diante la aplicacin de alguna de las metodolo
gas conocidas es posible lograr diferentes esta
dos de equilibrio para una misma concentra
cin de anticuerpo y concentraciones variables
de hapteno monovalente, pueden obtenerse di
ferentes valores de r y de c. Esto permite grafi
car por el mtodo de Scatchard r/c versus r y

(14)

Al igual que la ecuacin (11), la (14) no es

una recta, razn por la que no son las expresio
nes ms recomendadas para los clculos de Kq.
En este sentido es m uy til la ecuacin deriva
da por Sips de la de Langmuir (9) para la ad
sorcin de un gas en un slido y que, para el
equilibrio de protenas e iones en solucin, uti
lizando la nomenclatura ya indicada, resulta:
n (K c)
I -t (K c)

(J5)

en la que a es el ndice de heterogeneidad de

los anticuerpos o grado de disp ersi n de la
constante de equilibrio en torno a Ko-

F ig . 8-2. E laborada con los datos del cuadro 9-1. A. graficacin por el m todo de Scatchard. B, g raficacin por el mto
do de Sips.

158

Aspectos bsicos de la Inmunidad

Pasando 1 + (Kc) al lado izquierdo de la

ecuacin (15) y resolviendo se obtiene:
r + r(Kc) = n(Kc)^'
r = n(Kc)>- r(Kc^'
r = (n - r) (Kc)=>
(16)

= (K c )

Su representacin grfica se muestra en la figu

ra 8-2C. Por esta va es posible estudiar la ho
mogeneidad funcional de un anticuerpo mono
clonal directam ente de los sobrenadantes de
cultivos de los hibridomas o de las ascitis que
se prepararon para su expansin.

Act-b

la que mediante la aplicacin de logaritmos se

transforma en:
= a log K - a log c

log

(17)

Cuando se grafican los valores de log

versus log c se obtiene una recta (fig. 8-2B),
siendo a el valor de la pendiente. Tericamente
el valor de a (o a , como tambin se lo designa)
oscila entre 1 y 0. El valor 1 correspondera al
de un anticuerpo en el que todas sus molculas
tuviesen el mismo valor de K, cosa que a ex
cepcin de los anticuerpos monoclonales, en la
prctica difcilm ente ocurre. Valores de a =
0,5-0,7 se obtienen con mucha frecuencia. Para
valores de c = 0,5, el 75% de los sitios de com
binacin dei anticuerpo analizado tienen valo
res de K que oscilan entre 0,025 Kq y 40 Kq.
Esta dispersin es menor cuando el valor de a
se aproxima a la unidad. Para a = 0,8, ella osci
la entre 0,27 y 3,7 de K^.
La ecuacin de Sips puede expresarse de dos
maneras; una de ellas es la (17).
En esta forma, para su clculo es necesario
aislar y purificar el Ac especfico involucrado,
ya que es requisito para la determinacin de r.
Ai igual que con la ecuacin de Scatchard,
donde existen dos formas de expresin, una en
trminos de r (ecuacin 14) y otra independien
te de r y que, por ende, no requiere conocer
concentracin de inmunoglobulina Ac por una
va independiente (vase cap. 39, ecuacin 16),
la equacin de Sips puede expresarse indepen
dientemente de r. Partiendo de una equacin
que veremos ms adelante (ecuacin 27).
1

Act K c"

1
Act

donde Act corresponde a la concentracin total

de sitios, tal como se lo defini para la ecua
cin (11) y cuya determinacin puede hacerse
por un experimento de desplazamiento, se de
duce que
log

Act-r

= a log K -I-a log c

(17)

Afinidad y avidez
La ecuacin (14) puede escribirse as:
= K (n-r)

(18)

= K

(19)

de la que deriva
(n-r) c

Esta ecuacin permite establecer el valor de

K q, cualquiera que haya sido el mtodo de gra
ficacin empleado. Si se trata de un anticuerpo
b ivalente, cuando la m itad de sus sitios de
combinacin estn ocupados, r = 1 y n-r = 1, de
donde
r
1
-------- = K =
(n-r) c
c

(20)

o sea, que K q ser igual a la inversa de la con

centracin de hapteno libre.
Cuando se determina Kq usando como ligan
do un hapteno simple se habla de afinidad y, si
para ello se utiliza un antgeno, se considera
que el valor obtenido expresa la avidez, ya que
las fuerzas de unin en este caso estn aumen
tadas. Lo que se determina es una constante de
asociacin aparente, m agnificada respecto de
K(), pues otras fuerzas, que no son las corres
pondientes a la unin entre el sitio de combina
cin y un epitope aislado, pueden participar.

Reaccin antgeno-anticuerpo in vitro

Cuando lo que interacciona con un anticuerpo
es un antgeno que posee un solo epitope y un
paratope de la molcula de anticuerpo, puedan
ocurrir otras uniones protena-protena entre la
estructura soporte del antgeno y del anticuerpo
no involucradas en el sitio de com binacin.
Puede ocurrir tambin que su interaccin con
un sitio de com binacin del anticuerpo -p o r
creacin de mecanismos alostricos- haga que
el otro sitio de combinacin pueda reaccionar
con el ligando de una manera ms efectiva. Si
el antgeno posee repetido un mismo epitope, y
siempre que no haya im pedim entos estricos
que le permitan interaccionar con ms de un si
tio de combinacin de la molcula de anticuer
po (interaccin m onogm ica), originar una
fuerza de unin mayor que cuando interacciona
un ligando simple. Termodinmicamente signi
fica que para su disociacin, no obstante tratar
se de una molcula de antgeno y una molcula
de anticuerpo las que interaccionan, se necesi
tar mayor energa que si estuviera unido slo
un sitio de combinacin.
En sntesis, toda transgresin a la unin sim
ple entre un sitio de combinacin y un ligando
univalente pequeo como lo es un hapteno (afi
nidad, K q), dar lugar a una constante de aso
ciacin aparente magnificada respecto de Kq.
El valor de esa constante de asociacin mlti
ple o
se llama avidez. Singer y Campbell
analizaron la interaccin entre un anticuerpo y
un antgeno con un epitope repetido varias ve
ces. Llegaron a la conclusin de que la posibili
dad de interaccin mltiple sitios de combinacin-antgeno dependa del nm ero de esos
epitopes por unidad de antgeno. Ello les per
miti, para estos casos, expresar la ecuacin
= E Ko/n como representativa de la avi
dez, siendo F la valencia del antgeno y n el
nmero de sitios de combinacin de la molcu
la de anticuerpo interviniente.
Por este motivo puede ocurrir que anticuer
pos con valores de K q bajos determinados con
un hapteno tengan valores mayores cuando el
ligando es un antgeno. En algunos casos, esas
diferencias han llegado a ser 10.000 veces ms
efectivas.
Todo lo expresado est relacionado con el
estudio de las fuerzas que regulan la unin de
los complejos Ag-Ac o afinidad^ que no debe
confundirse con especificidad. Esta es mayor
para aquellos determinantes antignicos idnti
cos a los utilizados en la inmunizacin y dismi
nuye a medida que se diferencian. Determinan
tes antignicos con grupos compartidos pueden
dar reacciones cruzadas con los anticuerpos
o rig in ad o s p o r uno de ellos. In ic ia lm e n te
Landsteiner y posteriormente otros investiga
dores han efectuado experiencias bien demos
trativas sobre el particular (cap. 4).

159

Fig. 8-3.
A = inm ungeno.
B = ligando que d a reactividad cruzada d e tip o I.
C = ligando que da reactividad cruzada d e tip o II.
R = relacin B /F del ligando radioinarcado.
R o = lm ite de R, cuando la concentracin d e todo el ligan
do, incluido el trazador, se aproxim a a O (cero ).

Recientemente Berzofsky y Schetchter, utili

zando el radioinm unoanlisis de competicin
como mtodo analtico (vase cap. 38), han de
finido dos tipos de reacciones cruzadas. La del
tipo I es la originada por un ligando distinto del
usado en la inmunizacin, que reconoce al anti
cuerpo originado por ste, pero con menor afi
nidad. En este caso, las curvas de competicin
muestran que el segundo ligando puede llegar a
desplazar totalmente al trazador, pero con ma
yor consumo de antgeno que el correspondien
te al inductor de la respuesta inm une. Ello es
consecuencia de su menor afinidad (fig. 8-3).
La reactividad cruzada de tipo II tiene lugar
cuando en el suero en anlisis hay una mezcla
de anticuerpos originados por el antgeno in
ductor. En este caso, el segundo ligando slo
reconoce algunos de ellos y puede hacerlo con
una afinidad similar a la de! ligando original,
pero aunque se aumente su concentracin no
interacciona con los otros anticuerpos presentes
-q u e s reconocen al prim ero-, de all que el
desplazamiento del trazador no sea total.
La afinidad de un anticuerpo para dos deter
m inantes antignicos relacionados es mayor
para el homlogo, esto es, para el inductor de
ia respuesta inmune. Existen anticuerpos deno
minados heteroclticos, que tienen mayor afi
nidad de fijacin por antgenos relacionados
con el inmungeno que por ste.
Cuando un suero contiene anticuerpos de al
ta afinidad, stos pueden reaccionar con deter
minantes antignicos relacionados, cosa que
generalmente no ocurre con los de baja afini
dad. En efecto, un anticuerpo de este tpo, ca-

160

Aspectos bsicos de la inmunidad.

paz de dar una dbil reaccin visualizable con

su determ inante antignico especfico, no da
reacciones visibles con antgenos relacionados,
cosa que puede hacer uno de alta afinidad. Ello
significa que los sueros con anticuerpos de alta
afinidad pueden tener una especificidad menor
que los de baja afinidad, usados a la mism a
concentracin. El problema por lo general se
resuelve diluyendo convenientemente el anti
suero.

Al formarse los complejos antcuerpo-hapteno producen cambios de la energa libre estn

dar A F, que puede medirse a partir de K q de
acuerdo con la siguiente ecuacin:
(21 )

en la que R es la constante universal de los ga

ses (1,9871 cal/grado/mol) y T la temperatura
absoluta, que se obtiene sumando la temperatu
ra en "C a 273,15; In K q es el logaritmo natural
de Ko, que es igual a 2,303 log Kq. Se emplea
el signo menos (-) porque, por convencin, un
cambio negativo en la energa libre correspon
de a uniones positivas. De todo ello resulta
A F = 4,576 T = log K q

(I) A F" = -4,576 X 293,15 X 5 = ^6,7 Kcal/mol

(II) A F = -4,576 X 293,15 x 6 = -8,0 Kcal/mol
(III) A F" = -4,576 X 293,15 x 7 = -9,4 Kcal/mol
Ello indica que una diferencia de 100 veces
en la afinidad (anticuerpos I y III) significa una
variacin de AF en -2 ,7 Kcal/mol, prctica
mente la energa de algo ms de medio puente
de hidrgeno (4,5 Kcal/mol) o de dos interac
ciones inicas (1 a 2 Kcal/mol).
La entalpia A H puede calcularse haciendo
dos determinaciones de Kq a diferentes tempe
raturas, de acuerdo con la siguiente ecuacin:
Kn,

AH
(23)
2,303 R

2,303 R
log Ko2 - log Ko,
1

( t i)

A H>

A H

2,303 R

4,576

4,576 (log K 02 - log Kq,)

AH ------------------------------- ^----1

T,

T^

(24)

La entropa A S se calcula a partir de:

A F = A H - A S

(25)

de donde:
A S T = A H - A F
A H - A F
AS" = ---------------

(26)

(22 )

La ecuacin (22) es muy interesante, ya que

muestra que grandes variaciones de la afinidad
pueden significar muchas veces pequeos cam
bios de la energa libre estndar A F.
Si consideramos tres anticuerpos (I, II y III)
con valores de 10^ M *, 10' M ' y 10^ M ', res
pectivam ente, y la reaccin tu v iera lugar a
20C, los valores de A F seran:

log

AH / 1
log K ()2 - log Ko, =

TERMODINMICA
D E LA INTERACCIN
H A PT E N O -A N T IC U E R PO

A F = -R T In K,-o

en la que K q y
son las constantes de asocia
cin determinadas a las temperaturas absolutas
T, y T^ respectivamente.
Resolviendo la ecuacin (23) se obtiene:

D ET E R M IN A C I N DE
(CONSTANTE DE ASOCIACIN
INTRNSECA PROMEDIO)
Puede hacerse por equilibrio de dilisis, ex
tincin iquenching) de fluorescencia, polariza
cin de fluorescencia, por precipitacin con
sulfato de amonio de los complejos Ag-Ac for
mados, por ultracentrifugacin o filtracin por
geles, etc. La mayora de estos mtodos no ne
cesitan que el anticuerpo en estudio est purifi
cado, y usan para su anlisis suero entero o su
fraccin gam m aglobulnica. O tros, como el
quenching de fluorescencia slo pueden llevar
se a cabo con el anticuerpo aislado.
Equilibro de dilisis
Se funda en los siguientes hechos: si separa
dos por una membrana hemipermeable coloca
mos en un compartimiento de la cmara una
solucin de hapteno dializahle y en la otra el
anticuerpo no dializahle, despus de cierto
tiempo parte del hapteno que ha atravesado la
membrana se combinar con el anticuerpo, lle
gndose finalm ente a un estado de equilibrio
estable entre las concentraciones de hapteno li

Reaccin antgeno-anticuerpo in vitro

161

Anticuerpo

H apteno

Inicial

Final

F ig. 8-4. R epresentacin esquem tica de un equilibrio de dilisis.

bre de ambos com partim ientos (fig. 8-4). La

cantidad de hapteno com binado, de acuerdo
con la ley de accin de las masas que regula es
te equilibrio, depender de la concentracin de
hapteno colocado inicialmente en su correspon
diente celda. Es posible, mediante el empleo de
varios juegos de cmaras en las que se coloca
la misma cantidad de anticuefpo y cantidades
variables de hapteno en cada una de ellas, con
seguir diferentes estados de equilibrio en los
que el anticuerpo estar bloqueado por el hap
teno a distintos grados de saturacin. Si obteni
dos los estados de equilibrio se miden las con
centraciones de hapteno libre y combinado, se
podrn calcular los diferentes valores necesa
rios para la graficacin de los resultados y de
terminar K q = 1/c. La concentracin de hapteno
en la celda donde originariamente se la coloc
dar el valor de hapteno libre, mientras que la
concentracin de hapteno en la celda donde se
coloc el anticuerpo corresponder a hapteno
libre ms hapteno combinado. La concentra
cin de este ltimo se determina por diferencia
entre.los valores obtenidos.
P arte

e) Pequeas lm inas de papel celofn. Se

utilizan para separar los compartimientos de la
cmara y permitir el equilibrio. Antes de su uso
conviene lavarlas con agua destilada para eli
minar el apresto que pudieran contener.
f) Pipetas de 1, 2 y 10 mi.
g) Agitador adecuado.
h) Espectrofotmetro.
Mtodo
Armar las cmaras de dilisis. Para ello co
locar entre dos compartimientos una lam inilla
de papel celofn y unirlos mantenindolos fijos
mediante el ajuste de los correspondientes tor
nillos. Numerar las cmaras de modo que pue
dan ser identificados los diferentes com parti
mientos. En un compartimiento de cada una de
ellas colocar 2 mi de la solucin de anticuerpo
y en los restantes las diferentes soluciones de
hapteno, procurando que quede una burbuja de
aire para facilitar la agitacin. Cerrar las aber
turas de carga.

e x p e r im e n t a l

Material necesario
a) Anticuerpo antidinitrofenol purificado. Se
obtiene a partir de suero de ovejas inmunizadas
con gamm aglobulina humana dinitrofenoiada
(GGH-DNP). El mtodo de preparacin y las
indicaciones para la purificacin del anticuerpo
son los especificados en el captulo 44, Para el
ensayo se prepara una solucin 2,5 x 10"^ M
(3,75 mg mi *) en solucin salina fosfatada.
b) Hapteno. Se utiliza dinitrofenol disuelto
en solucin salina fosfatada. Para el ensayo se
preparan soluciones 1 x 10"^ M; 5 x 10 '* M; 2,5
X lO-'* M; 1 X lO-"* M; 5 x 10-^ M y 1,5 x 10- M,
c) Solucin salina fosfatada. NaCl 0,15 M,
fosfatos 0,01 M, pH 7,6.
d) Cmaras para equilibrio de dilisis. Pue
den usarse distintos modelos. Son muy tiles
las de acrlico que se muestran en la figura 8-5.

F ig. 8-5. Pequeas cm aras de acrlico, para eq uilibrio de

dilisis.

162

Aspectos bsicos de la inmunidad

C uadro 8-1. Resultados obtenidos p o r equilibrio de dilisis en la determinacin de la capacidad

de combinacin del anticuerpo con su hapteno especfico

H apteno libre

(c)

H apteno
com binado

H apteno
com binado

(h)

Cm ara

Anticuerpo

xia^M

X 10-^ M

X 70-5 M

2.5
2.5
2.5
2.5
2.5
2.5

0,18
0,50
1.65
4.66
8,50
31,60

1.95
2,80
3,50
3.95
4,75

anticuerpo
(r)

1,02

r/c

10* M-'
22,8

0,41
0,78

15,6
7,2
3
1,9

1,12

1,40
1,58
1,90

0,6

A n ticu e rp o an a liz ad o : Ig G l a n ti-D N P d e oveja; P .M .: 160.000; IO/e S

H a p te n o : D in itro fe n o l (D N P -O H ); P .M .: 184;
14.900.

lo g c

log r/n-r

-5 ,7 4 4 7
-5 ,3 0 3 6
-^ ,7 8 2 5
-4 ,3 3 1 6
-4 ,0 7 0 6
-3,5 0 0 3

-0 .5 8 5 0
-0 ,1 9 3 8
0.1038
0,3674
0,5712
1,2788

: 0,68.

D O (280 nm ) 0,68
C lcu lo d e la.s m olaridade.s: A n ticu e rp o

=
160.000

D O (3 6 0 nm )
14.900

Es necesario colocar como controles cma

ras que contengan solucin salina fosfatada y
hapteno (dosis media) y otra con anticuerpo de
especificidad diferente y hapteno. La primera
de ellas permite determinar si se ha logrado el
equilibrio (igual concentracin final de hapteno
en ambos compartimientos), y la segunda, si el
hapteno se ha fijado inespecficamente.
Todas las cmaras son colocadas en el agita
dor, que es puesto en funcionamiento. La agita
cin se mantiene durante 18 horas a temperatu
ra ambiente, tiempo suficiente para lograr los
equilibrios. Transcurrido el lapso, desobturar
ios compartimientos de las cmaras, retirar los
contenidos y determ inar la concentracin de
hapteno por lectura espectrofotomtrica de las
DO a 360 nm. Las lecturas de los contenidos
de los compartimientos en que inicialmente se
coloc el hapteno permitirn calcular el hapte
no libre, y las correspondientes a los comparti
mientos en que se ubic el anticuerpo, el hapte
no libre ms el hapteno combinado. Este lti
mo se calcular por diferencia entre ambas de
terminaciones.
Para transformar las DO (360 nm) en molari
dades, dividir las lecturas espectrofotomtricas
por 14.900 (E rom del dinitrofenol).
Conociendo las concentraciones de anticuer
po, hapteno libre y hapteno combinado calcular
las relaciones necesarias para graficar segn las
ecuaciones (11), (14) o (17) (cuadros 8-1, 8-2 y
8-3; figs. 8-],8-2A y8-2B ),
Si se dispone de hapteno marcado con -H y
espectrmetro de centelleo lquido para las lec
turas, el ensayo puede hacerse con cantidades
menores de anticuerpo (10 ^ M), ya que en este
caso las concentraciones de hapteno, que son
muy bajas y no pueden determinarse por espec-

trofotomctra, se calculan sobre la base del n

mero de c.p.m. de la solucin.
El equilibrio de dilisis no excluye la posibi
lidad de que el ensayo se efecte con suero to
tal o la fraccin globulnica precipitada con
sulfato de amonio al 50% de saturacin. En es
tos casos es necesario colocar controles para
establecer la fijacin inespecfica del hapteno,
que debe ser descontada para los clculos. Es
preferible usar las globulinas precipitadas por
el sulfato de amonio, dada la gran captacin de
dinitrofenol por la albmina, o en su defecto
usar otros haptenos, como la e-dinitrofenil lisi
na o el cido dinitrofenil e-aminocaproico, de
fijacin inespecfica mniina.

C u ad ro 8-2. Determinacin de la concentra

cin de anticuerpo en un suero mediante inte
raccin primaria anticuerpo-hapteno

N"

H apteno
libre
(c)
JO-I M

H apteno
com binado
(b)
10-'''M

]/c
W M -'

]/b
l(P M -i

1
2
3
4
5
6
7

1,14
1,64
2,38
2.94
5,26
7,14
10,12

1,10
1,60
1,99
2,40
4,31
4,75
5,81

0,87
0,61
0,42
0,34
0,19
0,14
0,10

90,90
62,50
50,24
41,55
23,15
21,03
17,20

M to d o d e m edicin de la in tera cci n prim aria; P rec ip itac i n c o n

s u lfato d e am onio al 50% d e satu ra ci n d e los c o m p lejo s an tic u e r
p o -h a p te n o form ados.
D iiuvenle; Ig G l d e o veja (20 m g m l') aislad a d e un suero norm a]
d e oveja, djlu id a 1:5 para .su uso.
H apteno; A cido d in itro fen il y-a m in o b u trico (D N P -G A B A ).
A ntisuero; A n ti-D N P d e o veja (ttulo ap ro x im a d o 4 m g ml'*)'
P M IgG ^ ONq-a = 1 6 0 k D .

Reaccin antgeno-anticuerpo in vitro

163

C uadro 8-3. Resultados obtenidos por extincin (quenching) de fluorescencia en la determina

cin de la capacidad de combinacin del anticuerpo con. su hapteno especfico

Hapteno
----------------------

nm ol

Lectura

Hapteno
Quench Quench comh.
Corree- Lectura
%
%
l(A e )x 2 x
cin p o r corre(Qmx (Qm x Quench.
volumen
gida
=100% ) = 7 8 % )
nm ol

100

100
0,01

0,02
0.03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,10
0,12
0,14
0,16

0,20

0,25
0,50
0,75
1

1.25
1.50
1,75

2.25
2.50
3
3.50
4
5

91,7
84
77
59
63

5<

5!
46,5
46
44
40
38
37
35

0,5
0,8
1,2
1,4

1,6
1.7
1.8
1,9

2,5
2,9
3,2
3,7

92,2
85
78
70.5
64.5
57.7
52.8
48.5
48
46
42.5

41
40
39

O
7,8
15
22
29.5
35.5
42,3
47,2
51.5
52
54
57.5
59
60
61

O
10
19
28
38
46
54
60
66
67
69
75
76
77
78

0,23
0,44
0,65
0,87
1,05
1,24
1,38
1,51
1,54
1,59
1,72
1,75
1.77
1.78

Hapteno
Ubre
Hapteno
(c)
comh./Ac
nm ol
(r)

0,02

0,20

0,06

0,38
0,56
0,76
0.91
1,07

0,10
0,13

0,20
0,26
0,37
0,49
0,71
0,91
1,28
1,75
2,23
3,22

1,20
1,31
1,34
1,38
1,50
1,-52
1.54
1.55

r/n-r

0,11
0,23
0,38
0,61
0,83
1.15
1,50
1,89
2,03

2,22
3,0
3.16
3,34
3,44

r/c*
n m oles''

10,0
6,3
5,6
5.8
4.5
4.1
3.2
2.6

1.8
1,5
1,17

0,86
0,64
0,48

log
r/n-r

^0,959
-0,638
-0,420
-0,215
-0,081
0,60
0,176
0,276
0.307
0,346
0.477
0,499
0,524
0.536

log c

-1,699
- 1,222
-0,999
- 0,886
-0,699
-0,585
-0,432
-0,310
-0,149
-0,041
0,107
0,243
0,348
0,508

A n ticu e rp o Ig G l a n ti-D N P d e o v eja , 0,575 [xM (2 m i = 1 ,1 5 m |0,m ol); Q tnx = 7 8 % ,

H apteno: D in itro fe n o l (D N P -O H ), 25 |jM (25 m nm ol/nil).
P ara e x p re s a r K q en L /M , al v alo r de 1/c en n m oles- ' o b te n id o (en este ca so p re v ia m u ltip licac i n p o r 2 ya q u e se trabaj c o n 2 m i de
solucin d e a n ticu e rp o ) m u ltip licarlo p o r 10^

Extincin (quenching) de fluorescencia

Una protena irradiada con luz ultravioleta a
una longitud de onda correspondiente a su m
xima absorcin (280 nm) adquirir fluorescen
cia porque la energa absorbida es emitida co
mo luz de una m ayor longitud de onda (350
nm). El principal crom foro que acta como
absorbente es el triptfano. Si un hapteno se
une al sitio de combinacin del anticuerpo, par
te de la energa que debe ser em itida com o
fluorescencia por el triptfano puede ser trans
ferida al hapteno. Ello traer como consecuen
cia una dism inucin de la fluorescencia que
normalmente debe emitir la protena anticuer
po, que estar en relacin directa con la con
centracin de hapteno fijado. La mxima efec
tividad se obtiene cuando el hapteno absorbe
en la regin de la emisin de fluorescencia. El
mtodo resulta muy til para los anticuerpos
antidinitrofenol, pues sus haptenos (dinitrofe
nol, cido dinitrofenil e-aminocaproico, e-dinitrofenil lisina, cido dinitrofenil y-aminobutrico) tienen su mxima absorcin a 360 nm.
Para el empleo de este mtodo en los estu
dios sobre capacidad de combinacin del anti
cuerpo, es necesario saber cul es la extincin
(quenching) mxim a de fluorescencia que un
hapteno puede provocar sobre su anticuerpo es
pecfico. Este valor debe ser determinado expe
rim entalm ente para cada anticuerpo y su co
rrespondiente hapteno, aadiendo a una canti
dad conocida de anticuerpo exceso de hapteno,
de manera que su concentracin final sea no
menos de cien veces superior a la concentra

cin de anticuerpo, lo que asegura que en esas

condiciones prcticam ente todos los sitios de
combinacin del anticuerpo estn ocupados por
el hapteno. La mxima extincin de fluorescen
cia conseguida en esas condiciones constituye
el quenching mximo (Qmx) (fig. 8-6).
A diferencia del equilibrio de dilisis, slo
puede hacerse con anticuerpo purificado. Ade
ms no se puede determinar valencia, dato que
ha de conocerse previamente para poder efec
tuar los clculos.
P a rte

e x p e rim e n ta l

M aterial necesario

a)

Anticuerpo purificado. Solucin ap ro x i

madamente 1 |xM de anticuerpo bivalente
antidinitrofenol de oveja (IgGl).
Hapteno. Solucin de dinitrofenol aproxi
madamente 25 |iM.
Pipetas de 10 a.1,1 mi, 2 mi y 10 rnl.
Espectrofluormetro.

Mtodo
C olocar 2 mi de la solucin de anticuerpo en
la cuba del espectrofluorm etro, previam ente
calibrado y ajustar a 100% de fluorescencia.
Aadir 10 |il de hapteno, mezclar por rotacin
con una pequea varilla de vidrio con su extre
midad doblada en ngulo y leer. Continuar con
adiciones sucesivas de 10 )t1 de hapteno hasta
com pletar 150-200 xl, anotando el porcentaje
de fluorescencia de la mezcla despus de cada

164

Aspectos bsicos de la inmunidad

mi de DNP-OH 50 xM
F ig . 8-6. D eterm inacin dei Q m x para Ig G l de oveja anti-D N P. Cuando el anticuerpo est saturado por el hapteno slo
se consigue reducir la fluorescencia en un 78% (Qmx).

adicin. Con los resultados obtenidos, efectuar

los clculos, tenietido en cuenta para ello las
variaciones de volumen que ocurren despus
de cada adicin y el valor de la extincin mxi
ma de la fluorescencia o quenching mximo
(Qmx) para el anticuerpo y hapteno en estu
dio. El hapteno combinado se calcula multipli
cando el valor del quenching por 2 (anticuerpo
bivalente) y por la molaridad del anticuerpo de
ensayo, ello sobre la base de que el quenching
logrado est en relacin directa con la cantidad
de hapteno que se uni al anticuerpo. El hapte
no libre se determina por diferencia entre el to
tal de hapteno aadido y el combinado (vase
cuadro 8-3).
Precipitacin c o n s u lf a t o de amonio de los
complejos anticuerpo-hapteno formados
Si una mezcla de anticuerpo y hapteno des
pus que ha alcanzado el estado de equilibrio
es precipitada con sulfato de amonio al 50% de
saturacin, el hapteno libre quedar en el so
brenadante y el combinado en el precipitado.
Conociendo la concentracin de anticuerpo, la
cantidad total de hapteno aadida y la del so
brenadante, es fcil calcular hapteno libre y
combinado y las relaciones de ellos derivadas.
Si el ensayo se hace en una serie de tubos, para
una misma concentracin de anticuerpo y con
centraciones variables de hapteno, los resulta
dos obtenidos pueden graficarse.
Este mtodo puede utilizarse para anticuer
pos puros o antisueros sin purificar. En este l

timo caso es conveniente separar previamente

la albmina por precipitacin salina pues para
algunos haptenos, dinitrofenol en especial, tie
ne un marcado poder de fijacin inespecfico.
Puede usarse para ligandos de mayor tamao
siempre que no precipiten con sulfato de amo
nio al 50% de saturacin.
Para la descripcin del mtodo se usar sue
ro de conejo antidinitrofenol como fuente de
anticuerpo, y cido dinitrofenil e-aminocaproi
co como hapteno.
P a r te e x p e rim e n ta l

Material necesario
a) Suero de conejo normal (diluyente). El
suero de conejo no inm unizado es m ezclado
con un volumen igual de solucin saturada de
sulfato de amonio (760 g de sulfato de amonio
disueltos en 1.000 mi de agua destilada y ajus
tados a pH 7 con NaOH IN). Se deja a tempe
ratura am biente una hora y se cen trifu g a a
5.000 r.p.m. durante 30 minutos. Se elimina el
sobrenadante y se disuelve el precipitado en
NaCl 0,15 M en un volumen cinco veces supe
rior al inicial. Esta dilucin 1:5 de globulinas
normales es lo que se usa como diluyente.
En los casos en que el hapteno no se fije a
albmina, se emplea directam ente suero nor
mal de conejo diluido 1:5 en NaCl 0,15 M.
b) Suero para valorar o anticuerpo purificado
(antidinitrofenol). Si se tratara de anticuerpo
purificado, se prepara con l una solucin de 2

Reaccin antgeno-anticuerpo in vitro

mg/ml, usando como diluyente el indicado en
a). En el caso de sueros totales es conveniente
separar la fraccin globulnica y preparar con
ella una solucin diluyente 1:5, que contenga 2
mg-ml' de anticuerpo, determinados por curva
de precipitacin de acuerdo con las especifica
ciones del captulo 34.
c) Hapteno (cido dinitrofenil e-aminocaproi
co). Se preparan soluciones de distintas concen
traciones. Para la experiencia, usar las siguien
tes; l X lO^' M; 7 x 1 0 -5 M; 5 x 10 ^ M; 2,5
x 10-5 M; l x 10-5 M; 8 x 10-<> M y 5 x 10-^ M.
Las diluciones de hapteno se hacen en NaCl
0,15 M, fosfatos 0,01 M, pH 7,6.
d) Tubos de hemlisis.
e) Pipetas de 0,1, 1 y 5 mi.
f) Centrfuga; espectrofotmetro.
^
Mtodo
Numerar dos series de tubos del l al 7 (A) y
del r al 7 (B). A todos los tubos de la serie A
aadirles 0,5 mi de la solucin de anticuerpo, y
a los de la serie B, 0,5 ral de diluyente (suero
normal o fraccin globulnica normal 1;5). A
los tubos 1 y r agregar ) mi de la primera di
lucin de hapteno; a los tubos 2 y 2 1 ral de la
segunda y, de m anera similar, a los tubos si
guientes las restantes soluciones de hapteno.
Dejar en contacto a temperatura ambiente (o a
la deseada) por 30 minutos. Aadir a todos los
tubos 1,5 mi de solucin saturada de sulfato de
amonio y dejar a la misma temperatura durante
una hora. Centrifugar a 5.000 r.p.m. por 30 m i
nutos, separar los sobrenadantes y en ellos cal
cular las concentraciones de hapteno por lectu
ra de las DO a 360 nm. Las concentraciones
molares resultan de dividir las DO (360 nm)
por 17.800 (Efcm del cido dinitrofenil e-aminocaproico).

165

Los valores obtenidos con los tubos de la se

rie A corresponden a concentraciones de hapte
no libre y los de la serie B a hapteno total. El
hapteno combinado se determina por diferen
cia. Con los valores hallados se calculan las re
laciones (cuadro 8-4) y se grafica.
Al igual que para equilibrio de dilisis, el
empleo de haptenos marcados con tom os ra
d iactivos perm ite desarrollar el m todo con
concentraciones de anticuerpo diez veces infe
riores a las indicadas.
CLCULO DE K(), n, a, Ac
Ko puede calcularse a partir de cualquiera de
los valores graficados utilizando las ecuaciones
(11), (14) y (17). La eleccin depende de los
datos experimentales disponibles.
Si no se conoce la valencia ni la concentra
cin en anticuerpo de la muestra en estudio, el
clculo de Kq puede hacerse graficando l/b
versus 1/c (ecuacin 11) (fig, 8-1). En el punto
en que la curva intercepta a l/b , el valor sea
lado corresponde a la inversa de la concentra
cin de ligando monovalente que satura to tal
mente al anticuerpo. El doble de dicho valor es
la inversa de la concentracin de ligando cjue
slo satura el 50% de los sitios de com bina
cin. Buscando ese valor en el eje de las orde
nadas y trazando una perpendicular a l, sta
cortar la curva experimental en un punto. El
valor correspondiente de la inversa de la con
centracin de ligando libre (eje de las abscisas)
ser 1/c = Kq.
La graficacin de la figura 8-1 puede servir
tambin para establecer la concentracin total
de anticuerpo (Act) de la m uestra analizada,
sobre todo cuando se trata de anticuerpos de
muy baja afinidad que no dan uniones firm es
con el antgeno y resultan difciles de valorar

C uadro 8-4. Precipitacin con sulfato de amonio de los complejos form ados en la determinacin
de la capacidad de combinacin del anticuerpo con su hapteno especfico

N"
I
2
3
4
.5
6
7
8

Anticuerpo
xlO '> M
2 ,2 2
2 ,2 2
2^22
2 ,2 2
2^2
2 ,2 2
2,2 2

222

H apteno
total
X 10 ' M

H apteno
libre
(c)
X /0- M

1,63
2 ,5 2
3 ,9 3
4 ,9 2
5 ,4 7
6 .2 9
8,2 5
11,69

0,1 3
0,41
1,01
1,70
1,59
2 ,5 5
4 ,3 7
7 ,5 2

H apteno
H apteno com binado
com binado
anticuerpo
X 10-''
M
(r)
1,50
2,11
2 92

X22
3 ,8 8
3 ,7 4
3 ,8 8
4 ,1 7

0 ,6 7
0 ,9 5
1,31
1,45
1,74
1,68
1,74
1,87

r/c
xW
M'i
51
23
13
12
11
6 ,2
3,9
2.4

r/n-r
0 ,5 0
0 ,9 0
1,89
2 ,6 3
6 ,6 9
5 ,2 5
6 ,6 9
14,3

log r/n-r

log c

^ 0 ,3 0 1
- 0 ,0 4 6
0 ,2 7 6
0 ,4 2 0
0 ,8 2 5
0 ,7 2 0
0 ,8 2 5
1,155

- 0 ,8 8 6
- 0 ,3 8 7
0 ,0 0 4
0 ,0 7 9
0 ,2 0 1
0 ,4 0 6
0 ,6 4 0
0 ,8 7 6

A nticuerpo an a liz ad o : IgG 2 a n ti-D N P p re cip ita n te d e oveja.

H apteno: ^H D N P^G A B A
= 17.500).
L as m olaridades d e h ap te n o en los tubo,; de re acc i n fueron c a lc u la d o s por co n v e rsi n d e c.p.m . en JM, co n o c ien d o la re la ci n M /c.p .m . d el
h ap te n o aadido.

1 (56

Aspectos bsicos de la inmunidad

por otros procedimientos especficos. Cuando

la curva experimental intercepta a I/b, el valor
de la ordenada al origen corresponde a la inver
sa de la concentracin de anticuerpo total [1/
Act, ecuacin (11)]. Para determinar esa con
centracin hay que tener en cuenta que los va
lores de la grfica para 1/b corresponden a li
gando monovalente (moles.litro '), y que por lo
tanto debe considerarse la concentracin de an
ticuerpo expresada en sitios de combinacin,
cuyo PM es de 75 kD (si el anticuerpo es IgG).
Para el caso de la figura 8-1, la curva intercepta
a 1/b en el valor 8,4 x 10'' M ', cuya inversa
equivale a la concentracin de sitios de combi
nacin del anticuerpo, igual a 0,19 x 10 ' M. Si
se considera para cada sitio de combinacin un
PM de 80 kD (IgGl de oveja, PM = 160 kD),
la concentracin de anticuerpo en la m ezcla
analizada ser de 0,95 mg.mk'.
Cuando la concentracin de anticuerpo es
conocida, no as su valencia, K q puede ser de
terminado graficando r/c versus r (fig. 8-2A),
recordando que para el valor r = 1 (mitad de los
sitios de combinacin de un anticuerpo biva
lente ocupados por el hapteno), r/c = 7/c, que
por definicin es igual a K q. Levantando una
perpendicular a r en el punto equivalente a la
mitad de la saturacin (en este caso r/2 = 1), el
valor de r/c correspondiente a la interseccin
de dicha recta con la curva graficada con los
valores experimentales ser i/c == Kq.
Cuando el valor de r/2 es diferente de 1, para
obtener el valor de K q el resultado experimen
tal hay que dividirlo por r/2. Si la curva hubie
se interceptado a r = 2,4, el valor de r/2 sera
1,2. Si para ese valor el resultado experimental
fuera r/c = 8 x 10'' M ', para transformarlo en
]/c es necesario dividirlo por 1,2. En este caso,
Ko = 1/c - 8/1,2 X 105
= 6,6 x 10= M >.
Por este procedimiento es posible, adems,
calculu' (valencia o nmero mximo de mo
lculas de ligando monovalente que se fijan por
molcula de anticuerpo), ya que en el punto en
que la proyeccin de la curva experimental in
tercepta a r corresponde al valor r/c - O y r oo, o sea aquel en que el anticuerpo est total
mente saturado por el ligando. Que r = n s t de
duce de la ecuacin:

cuando

luego r K = n K y por lo tanto r

Esta graficacin perm ite tam bin calcular

Kav o constante de afinidad media pesada o
ponderada, que corresponde al promedio de

las afinidades pesada o ponderada por la. con

centracin de los anticuerpos con cada afini
dad. La pendiente de la recta que une los pun
tos en que la curva intercepta a r/c y r constitu
ye Kav, y experimentalmente se calcula deter
minando el cociente entre esos dos valores de
r/c y r.
Si Kq se calcula graficando log r/n-r versus
log c (fig. 8-2B), para lo cual es necesario co
nocer previamente la valencia y concentracin
del anticuerpo en anlisis, cuando r/2 = 1 (mi
tad de los sitios de combinacin saturados), log
r/n-r = 0. Trazando una perpendicular a log r/
n-r en el valor O, dicha recta cortar a la traza
da con los valores experimentales, lo que per
mitir determinar el log c en ese punto. Con
ese dato se calcula c, y 1/c = K(>.
La graficacin de Sips (fig. 8-2B) permite
adems calcular a o ndice de heterogeneidad
de los anticuerpos. Dado que ste no es ms
que el valor de la pendiente de la recta grafica
da, puede hallarse determinando
A y

----- = a
AX
El valor a puede tambin calcularse a partir
de la ecuacin (16) o de la siguiente:
(27)
Act Kc

Act

deducida a partir de la (7), pero adaptada para

un sistema policlonal, elevando K y c a la po
tencia a, y con la nomenclatura utilizada en la
ecuacin (11)
Los estudios de interaccin primaria liganteligando pueden servir tambin para determinar
el nmero de receptores y determinantes anti
gnicos existentes en una membrana celular,
as como su constante de afinidad. En estos ca
sos, la graficacin que mejor resulta es l/b ver
sus 1/c (fig. 8-1), derivada de la ecuacin de
Langmuir adaptada (11).
1

L.K.c.

donde L es el ligante, b y c las concentraciones

de ligando combinado y libre, respectivamente.
Si se quiere determinar, por ejemplo, el n
mero de receptores para Fe en la superficie de
un eritrocito, es necesario hacer interaccionar
cantidades iguales de una suspensin de un n
mero conocido de clulas mh* con el ligando
especfico (en este caso gM monomrica mar
cada con
= ^^'LIgM.7S) a concentracio
nes variables. Transcurrido el tiempo suficiente
para que la reaccin se equilibre se centrifugan
los tubos y se determina la radiactividad del so

Reaccin antgeno-anticuerpo in vitro

brenadante (ligando libre = c) y del sedimento
(ligando combinado = b), las que se transfor
man en molaridades conociendo previamente la
relacin c.p.m./concentracin molar del ligan
do usado. Con los resultados obtenidos se gra
fica 1/b versus 1/c y la curva obtenida, linearizada por anlisis regresivo o por el mtodo de
los cuadrados mnimos, es extrapolada hasta
interceptar 1/b. Este valor corresponde a la in
versa de ligando combinado ('^'I.gM.7S, PM =
180 kD ), que satu ra to talm en te al lig an te
(FcR), y con los datos obtenidos se calcula la
concentracin molar del ligando y el nmero
de moles en el volumen usado. Asumiendo que
a cada FcR se une una molcula de ^LIgM.7S,
multiplicando los moles fijados por 6,02 x 10^^
(nmero de Avogadro) se obtiene el nmero de
molculas fijadas por la totalidad de las clulas
reaccionantes cuando el ligante est saturado,
valor que equivale al nmero total de FcR exis
tentes. Dividiendo ese valor por el nmero de
eritrocitos usados en el ensayo se obtiene el n
mero de FcR por clula.
Por este procedim iento hemos podido de
mostrar que la densidad de receptores hemti
cos para Fe por clula es 1,2 x 10^ en los eritro
citos de carnero y 1,2 x 10^ en los de pollo.
Los valores de la constante de afinidad entre
ligante y ligando se calculan en la forma ya in
dicada (fig. 8-1).

-t- B
F Ka
La capacidad fijadora de antgeno ,

(28)
[H] [S]
Si sustituimos [HS] por B (ligando unido o
bound y [H] por F (ligando libre o fre e ), la
ecuacin (28) puede escribirse
Ka

So - B

(31)

ABC puede expresarse tambin en trminos

de sitios de fijacin:
So (no diluido)
ABC = -------- ------------- B
So

(32)

donde So (no diluido) es la concentracin total

de sitios de combinacin en el suero sin diluir y
So la concentracin total de sitios de combina
cin en la dilucin del suero en la que B sitios
estn combinados; es decir.
So (no diluido)
So

1
dil. suero

Se ha observado que la ABC de u n suero,

medida a diferentes concentraciones de ligando
total, est relacionada con la avidez de los anti
cuerpos contenidos en ese suero. Para deducir
una expresin que describa esa relacin, se ha
definido un nuevo trmino;
ABCx
(33)

en la que ABCi es la capacidad de fijacin de

antgeno con una concentracin total de ligan
do referida com o concentracin n d ice (i) y
ABCx es la capacidad de fijacin de antgeno
con una concentracin de ligando diferente, ge
neralmente menor, llamada concentracin en
anlisis o experimental (x).
Sustituyendo en la ecuacin (33) los equiva
lentes de la (32), resulta;
So (no diluido)
-----^-------------- B (x)
So (x)
So(i) B(x)
R = .---------------------------- = --------------- (34)
So (no diluido)
Sox) B(i)

Usando ia expresin (30), la ecuacin (34) pue

de escribirse;
[(B/F)i (1/Ka) 4- Bi] Bx
R =
^--------- ^------------- (35)
[B/F)x (1/Ka) + Bx] Bi

(29)

La concentracin de [SJ libres es igual a la

concentracin total de So menos la concentra
cin de sitios combinados B, luego [S] = So - B.
La ecuacin (29) puede reordenarse para re
solver So

(30)

1
ABC = ------------ B
dil. suero

R =

jHS]

So =

Capacidad fija d o ra de antgeno

En 1975, W. E. Paul y G. J, Elfenbein des

cribieron un mtodo que permite calcular afini
dades relativas, utilizando la tcnica de Farr de
precipitacin con sulfato de amonio. En los en
sayos tipo Farr, los resultados generalm ente
son expresados en trminos de capacidad fija
dora de antgeno o ABC {antigen binding ca~
pacity).
Cuando un hapteno H interacciona con un
anticuerpo que tiene S sitios de combinacin
con el ligando y el sistema se equilibra.

167

de donde
(B/F) X Bi - (B/F)i Bx
Ka =
--------- ^ ^ ------(36)
(l-R )B i Bx

168

Aspectos bsicos de la inmunidad

La expresin (36) permite calcular Ka sin re

querir el valor de la concentracin de los sitios
totales (So).
Para estas determinaciones de afinidades re
lativas, es conveniente comparar slo ABC ob
tenidos cuando el 33% del ligando est unido
(ABC33), en cuyo caso B/F 0,5. En estas con
diciones, la ecuacin (36) se simplifica:
Ka =

R B i-B x
2(1 -R ) Bi Bx

(37)

Es conveniente sealar que Ka (37) corres

ponde a la afinidad relativa Kr o Ka 33%, lo
que no significa Ko o constante de asociacin
intrnseca mediana.
Parte experimental:
10 jj,l de ligando especfico radioisotpieamente marcado, a concentraciones 10 M (con
centracin ndice) y 10 M o 10 M (concen
tracin experimental) se mezclan con 10 |u,l de
diluciones seriadas del antisuero. Las mezclas
se dejan 30-60 minutos a 4C y se les aade a
cada una de ellas 20 [xl de solucin saturada de
sulfato de amonio. Se incuba 30 minutos a 4C,
se centrifuga a 2.500 r.p.m. por 30 minutos a la
misma temperatura. En 20 jul de los sobrena
dantes (si el radioistopo em ite radiaciones
gamm a) o en las m ism as cantidades p revia
mente mezcladas con 6 ml de Aquasol (si el ra
dioistopo emite radiaciones beta) se mide la
radiactividad, utilizando en cada caso el conta
dor de radiaciones correspondiente.
Se incluye una serie testigo en la que el anti
suero es sustituido por suero normal de la mis
ma especie.
El porcentaje de ligando unido se define co
mo:

100- 100

APENDICE
Cuando para estudios de interaccin prima
ria se grafican resultados, en especial ///? ver
sus 7/ t', muchas veces resulta difcil trazar la
lnea que une esos puntos experimentales. Co
mo la ecuacin matemtica que representa a di
cha curva es y = a + bx, puede lograrse el traza
do de una lnea corregida mediante la aplica
cin de anlisis regresivo, o bien, por el mto
do de los cuadrados mnimos.
Tomemos como ejemplo el cuadro 8-2 y la
curva resultante de la graficacin de dichos da
tos experimentales (fig. 8-2). En ella x = 1/c, y
= I/b, siendo N = nmero de determinaciones.
Para dichos datos experimentales
S X = 2,67
E x2 = 1,4867
x = 0,38
(Ex)2 = 7,13
Exy =159
N=7
Conociendo las varianeias (S^) de x e y, y la co
variancia, esos datos pueden ser computados y
usados luego para la elaboracin de la recta.
/
(2 x)2 \
S2(x) =
(z x = - - - ) = 0 .0 *
N -l
1

La dilucin de anticuerpo requerida para tal

unin (ABC33) se determina experimental mente
graficando porcentaje de ligando fijado con
tra logaritmo de la dilucin del suero . Ello
permite determinar

dil.

y con los resultados obtenidos calcular R de

acuerdo con la ecuacin (33) y Ka mediante la
ecuacin (37).

(Z y f \
\ = 705

S 2 ( y ) = ------ / X y 2 ---- ^

N-l
Covariancia (xy) =

N -l
g

< radiactividad del sobrenadante '

en presencia de antisuero
radiactividad del sobrenadante
\ en presencia de suero norm al ,

Zy = 304
Sy^ = 17.384
y = 43,39
(Ey)2 = 92,416

X )( y)

N
El coeficiente de correlacin r =
covariancia (xy)
~ 1 s (X )

Siendo S (x) =

S (yT

(x) y S (y) =

= 0,97

(y )

El resultado obtenido es un buen valor para

una correlacin ya que r est matemticamente
restringido a estar situado dentro del rango -1 a
-1-1. La ecuacin de la lnea regresiva de la figu
ra 8-1 es
y = a + bx

Reaccin antgeno-anticuerpo in vitro

covariancia (xy)
b = ---------------- ^
=91,3
(X )

siendo:
a = y - bx = 8,7
por lo tanto, la ecuacin que m ejor une los
.puntos experimentales de la figura 8 -1 es
y

= 8,7 + 91,3

Para dos diferentes valores de ;c, dentro de la

escala de la grfica, se obtienen otros tantos va
lores de y, con los que puede trazarse la recta
deseada. Ello puede lograrse tambin calculan
do un solo valor de 3; para determinado valor de
X ya que el otro punto de la recta sera a pues
sta es la ordenada al origen. La recta que une
los puntos experimentales de la figura 8 - 1 lia
sido trazada con los valores antes indicados.
Otro mtodo que puede usarse para hallar los
valores de a y > en la ecuacin (28) es el de los
cuadrados mnimos. En este caso se determinan
de la siguiente manera:
Z x^ Ey ^ Lx i: xy
N x 2 ^ (X x y
b =

N 2 : xy - E X E y
N E x2 - (E

X) 2

ALGUNAS R EA C C IO N ES
DE INTERACCIN PRIMARIA
USADAS PARA LA D ET E C C I N DE
ANTGENOS Y ANTICUERPOS
En los ltimos 25 aos se han descrito una
serie de mtodos de interaccin primaria para
la deteccin de antgenos y anticuerpos, de
gran sensibilidad y marcada especificidad, en
tre los que merecen destacarse el radioinm u
noanlisis, el enzimoinmunoanlisis, la inm u
nofluorescencia y, muy recientemente, el inm u
noanlisis por quimioluminiscencia. Por regla
general se designan con siglas: RIA (radioinmunoanlis; IRMA (anlisis radioinm unom
trico); ELISA (anlisis con reactivo inm une
marcado con enzima); IF (inmunofluorescencia
directa); IFI (inm unofluorescencia indirecta).
Algunas de estas tcnicas han sido modificadas
y no obstante constituir simples variantes de
ellas, se han usado siglas para su identificacin,
las que muchas veces se prestan a confusiones.
Todas ellas se caracterizan porque la identi
ficacin del antgeno o del anticuerpo tiene lu
gar por una interaccin simple, sin la participa
cin de fenmenos asociados, como ocurre en
las reacciones de interaccin secundaria.

169

INMUNOFLUORESCENCIA (IF)
Los mtodos serolgicos comunes resultan
inapropiados para investigar la presencia de an
tgenos en la superficie de clulas, bacterias y
parsitos, as como su distribucin, o cules
son las clulas comprometidas en la biosntesis
de los anticuerpos.
Para estas investigaciones, as como para la
identificacin de microorganismos en m ateria
les infectados y algunas reacciones antgenoanticuerpo desarrolladas con cantidades m ni
mas de reactivos, ha sido descrito un m todo
de alta sensibilidad y que ha permitido resolver
problem as insolubles hasta el momento. L la
mado inmunofluorescencia, se basa en el em
pleo de anticuerpos marcados con sustancias
fluorescentes como el isotioeianato de fluores
cena o lisamina-rodamina. Estas sustancias, al
ser excitadas eon longitudes de onda del rango
ultravioleta, emiten luz de mayor longitud, la
que se demuestra por fluorescencia am arilloverdosa o anaranjadorrojiza, respectivamente.
La inmunofluorescencia puede ser directa o
indirecta. En el primer caso lo que se m arca es
el anticuerpo que habr de interaccionar direc
tamente con el antgeno. En la forma indirecta
se emplea como reactivo marcado un suero angam m aglobulina (contra la gam m aglobulina
de la especie animal de la que proviene el anti
cuerpo). Se lo hace actuar sobre el com plejo
antgeno-anticuerpo no marcado que ha reac
cionado en una primera etapa.
La metodologa consiste en colocar sobre un
portaobjetos el material que contiene el antge
no para analizar. En la tcnica directa, ste se
cubre con el antisuero marcado con fluorescena y, despus de lavado para eliminar el m ate
rial fluorescente no fijado especficamente, se
hace la observacin microscpica, utilizando
una fuente de luz ultravioleta y los filtros ade
cuados. Cuando se emplea la tcnica indirecta,
lo que se aade al portaobjetos que contiene el
m aterial antignico es el antisuero especfico
sin marca. Luego de cierto tiempo de contacto
el preparado se lava, se cubre con suero anti
gammaglobulina marcada, se deja reaccionar y
se lava nuevamente. Se observa con el m icros
copio en la forma ya descrita. En el prim er ca
so, si el antgeno ha fijado el anticuerpo con
marca, el complejo emite fluorescencia. En el
segundo caso, el antgeno fija el anticuerpo sin
marcar, pero sobre ste se acopla la antigam
maglobulina marcada, que es la que emite fluo
rescencia (figs. 8-7 y 8 - 8 ).
C om o en toda reaccin inm unolgica, son
necesarios controles adecuados. El tratamiento
previo del material antignico con antisuero es
pecfico sin marcar debe inhibir la fijacin del
mismo anticuerpo con marca y, por otra parte.

170

Aspectos bsicos de la inm unidad

Fig. 8-7. In m u n o flu o re s c e n c ia
d irecta e i,udicecta.

Anticuerpo
marcado

Antgeno
sin marca

Complejo
Ag-Ac marcado

I: Esquema de reaccin de inmunofluorescencia directa

Primera etapa

Anticuerpo
sin marca

Antgeno
sin marca

Complejo Ag-Ac
sin marca

Segunda etapa

^\U/, si/-4;
~Vs'*
Complejo Ag-Ac
sin marca

'/ a''
Complejo Ag-Ac
marcado

Anticuerpo marcado
(antigammaglobulina)

II; Esquema de reaccin de inmunofluorescencia indirecta

la adicin de antgeno soluble en exceso al an

ticuerpo marcado debe inhibir su fijacin pos
terior al antgeno fijado al portaobjetos.
Se obtiene un buen reactivo cuando el anti
cuerpo ha fijado dos o tres grupos fluorescentes
por molcula. Si est muy marcado puede teir
inespecficamente tejidos. Para reducir al mni
mo este inconveniente, y con el objeto de eli
minar la mayor parte de la protena muy mar
cada, es necesario filtrar por Sephadex G-25,
resinas intercam biadoras o adsorber el suero
con polvo de tejidos, en especial hgado de ra
tn desecado con acetona. Si el suero tiene un
alto ttulo de anticuerpos (3-5 mg/ml), la dilu
cin para su uso minimiza las tinciones inespe
cficas.
La inmunofluorescencia ha sido muy utiliza
da, sobre todo para la investigacin rpida y es
pecfica de agentes infectivos en m ateriales
sospechosos. Empleando anticuerpos con mar
cas diferentes, ha sido posible investigar ms
de un antgeno en un mismo preparado micros

cpico. E sta m etodologa es la que provey

una de las evidencias de que las clulas plas
mticas son las principales elaboradoras de los
anticuerpos, y que en los linfocitos B existen
inmunoglobulinas de superficie.
De las tcnicas descritas, la directa tiene el
inconveniente de que debe disponerse de anti
cuerpo m arcado con especificidad para cada
antgeno. La indirecta, en cambio, solamente
utiliza antigammaglobulina marcada con fluo
rocromo.
Para detalles metodolgicos vase el captu
lo 34.
RADIOINMUNOANLISIS (RIA)
Y A N LISIS RADIOINMUNOMETRICO
(IRMA)
La cuantificacin de pequeas cantidades de
antgenos, no detectables por los mtodos con
vencionales, puede lograrse sin inconvenientes

Reaccin antgeno-anticuerpo in vitro

171

Big. 8-8. Epim astigotes de T ripanosom a cruzi,

visualizados por inm unofluorescencia indirecta.

si estn marcados con tomos radiactivos. M e

diante su em pleo ha sido desarrollado el ra
dioinmunoanlisis, mtodo sensible y especfi
co, muy utilizado sobre todo en endocrinologa
para Ja cuantificacin de hormonas peptdicas.
Se ha usado tambin con xito en estudios de
interaccin hapteno-anticuerpo y en el anlisis
de hormonas esteroides.
El hecho ms significativo del radioinm u
noanlisis es el de que utiliza una marcacin
radioisotpica para discriminar entre antgeno
unido al anticuerpo y antgeno libre. El radioi
stopo es un tomo inestable que se va desinte
grando y em ite partcu la s subatm icas y/o
energa en la forma de radiacin, que pueden
ser medidas en aparatos apropiados. Cada is
topo radiactivo tiene una vida media (t 1/2) es
pecfica, factor limitante para su uso en algu
nos casos. Los tomos radiactivos ms utiliza
dos con 3H (t 1 /2 = 1 2 aos), '^'C (t 1/2 = 5.730
aos), 57Co (t 1/2 = 270 das),
(t 1/2 = 60
das),
(t 1/2 = 8 das); la energa emitida es
t constituida por radiaciones P en los dos pri
meros y Y en los restantes.
El marcado de los antgenos con radioisto
pos puede hacerse por diferentes mtodos.

Para la separacin del antgeno libre y com

binado, valores que se usarn para las graficaciones, pueden emplearse mtodos fisicoqumi
cos como la electroforesis, adsorciones cromatogrficas, resinas intercarabiadoras, filtracin
por geles, precipitacin salina o con polietilen
glicol, etc., o mtodos inmunolgicos mediante
el em pleo de un anticuerpo con especificidad
para la especie animal del anticuerpo q u e en
prim era instancia reaccion con el antgeno
(mtodo del doble anticuerpo).
Uno de los radioinmunoanlisis ms utiliza
dos es el de competicin que se basa en el si
guiente principio; si a una serie de tubos que
contienen una mezcla de anticuerpo y antgeno
radiactivo en cantidad suficiente para saturar el
50% de los sitios de combinacin, se le aade
cantidades crecientes de antgeno sin m arca,
habr competicin por la ocupacin de esos si
tios. Se producir una cada secuencial del ant
geno marcado combinado a lo largo de la serie.
Con los datos obtenidos puede graficarse ant
geno marcado combinado (escala lineal) versus
antgeno sin marcado aadido (escala lo gart
mica). Dentro de cierto rango, la curva regresi
va es lineal, lo que permite por interpolacin de

172

Aspectos bsicos de la Inmunidad

los resultados obtenidos en un ensayo similar

con un antgeno sin marca, de concentracin
desconocida, hacer su cuantificacin.
El anlisis radioinm unomtrico (IRMA), o
inmunoanlisis utihzando anticuerpo marcado
con un tomo radiactivo, es cada vez ms utili
zado y con frecuencia es ms sensible y espec
fico que el RIA. El fundamento es similar al
del RIA, pero invariablemente usa una tcnica
. de separacin en fase shda del anticuerpo li
bre, para discriminar entre ste y el anticuerpo
unido al ligando. En este ensayo, la cantidad de
antgeno es medida en funcin de la cantidad
de anticuerpo marcado que se ha unido. Para
ms detalles sobre el tema vase el captulo 38.
ENZIMOINMUNOANLISIS
(ELISA)
La histoqum ica ha provisto los principios
que han servido de base para el desarrollo de
una nueva metodologa inmunolgica, la inmu
noenzimologa, que en forma directa o indirec
ta permite identificar antgenos. Los fundamen
tos son similares a los de la inmunofluorescen
cia, de la que se diferencia en que emplea anti
cuerpos (mtodo directo) o antigammaglobuli
na (mtodo indirecto) marcados con una enzi
ma capaz de desarrollar una reaccin colorea
da. La enzima usada con ms frecuencia para el
marcado es la peroxidasa y el sustrato la o-fenilendiamina y H , 0 2 .
A provechando la propiedad que tienen las
protenas de adsorberse a pH 9-10 a tubos, es
feras, discos o concavidades en placas de pls
tico (poiiestireno y polipropileno), se han desa
rrollado mtodos de ELISA que perm iten la
cuantificacin de pequeas cantidades de ant
genos, con una sensibilidad prxim a a la del
RIA, y tiene la ventaja de no tener que usar
m aterial radiactivo ni aparatos especiales de
medicin de radiactividad.
El m todo puede desarro llarse fijando al
plstico cantidades limitantes de anticuerpo, el
cual se hace interaccionar con diferentes con
centraciones del antgeno que se ha de valorar
y la cantidad adecuada del m ism o antgeno
marcado con la enzima. La fijacin de sta es
tar en proporcin inversa a la del antgeno no
marcado. Existiendo una fase slida que retiene
al antgeno combinado, la discriminacin entre
ste y el antgeno libre, ser fcil, datos funda
mentales para la graficacin y cuantificacin.
El ELISA puede hacerse tambin con anti
cuerpo al que se ha fijado la enzim a o anti
gammaglobulina (segundo anticuerpo) marca
da. En el primer caso, a cantidades variables
de antgeno fijadas al plstico se le aaden
concentraciones constantes de anticuerpo enzi

ma marcado. Por lavado se elimina el anticuer

po que no se fij, y el anticuerpo fijado se de
tecta aadiendo el sustrato correspondiente,
que desarrollar color en forma proporcional a
la de anticuerpo presente. Como en la inmunofluorescencia indirecta, el ELISA puede desa
rrollarse usando antigammaglobulina contra la
especie animal a la que pertenece el anticuerpo
usado en la primera etapa, hecho que lo hace
ms general y evita el uso del antisuero espec
fico marcado para cada una de las oportunida
des. En este caso se fijan al plstico diferentes
c o n cen tracio n es de antgeno que se hacen
reaccionar con anticuerpo especfico sin m ar
ca. D espus de lavar se aade la correspon
diente antigammaglobulina marcada con la en
zima, y transcurrido el tiempo conveniente y
luego de lavar se adiciona el sustrato adecuado
para el desarrollo de color y lectura de los re
sultados.
Para detalles tcnicos vase el captulo 37.
INMUNOANLISIS CON REACTIVOS
M ARCADOS CON SUSTANCIAS
LUMINISCENTES
La luminiscencia es un fenmeno similar al
de la fluorescencia. La diferencia radica en que
en la fluorescencia la energa excitante es luz
ultravioleta, mientras que en la luminiscencia
es provista por una reaccin qumica.
Existen dos tipos de luminiscencia. La bioluminiscencia es una reaccin en la que parti
cipa un organismo viviente, tanto del reino ani
mal como vegetal. Lo hacen a travs de un sis
tema enzimtico, el de la luciferasa. Algunas
luciferasas son especficas para el ATP, casi
siempre con produccin de un fotn por cada
molcula de TP que reacciona. Otras lucifera
sas, especialmente las de origen bacteriano, son
menos eficientes y tienen especificidad para
NADH o NADPH. La reaccin de quimioluminiscencia produce luz a partir de reacciones
qumicas simples, que involucran la accin del
oxgeno o de perxidos en la oxidacin de sus
tratos orgnicos. Como consecuencia de la ex
citacin, algunas molculas del sustrato lumi
n iscente em iten fotones m ientras que otras
emiten calor. Los sistemas ms eficientes son
aquellos en los que la emisin de fotones es
mxima. En los sistemas bioluminiscentes, esa
eficiencia puede variar entre un 10% y un 90%,
m ientras que en los quim iolum iniscentes los
valores oscilan en alrededor del 1%.
Recientemente se han desarrollado mtodos
de inmunoanhsis que utilizan este principio,
especialmente la quimioluminisceneia por ser
de menor costo, no obstante la mayor eficien
cia de los sistemas bioluminiscentes.

Reaccin antgeno-anticuerpo in vitro

173

Biotina
Ac

F ig . 8-9. Inm unoanlisis po r form acin de com plejos avidina-biotina.

Una de las reacciones de quimioluminiscencia ms estudiada es la produccin de luz por el

lum inol en presencia de perxidos, reaccin
que requiere pH alcalino y algunos metales o

heminas como catalizadores. La reaccin pue

de ser catalizada tambin por peroxidasa a pH
neutro.
La luz producida puede ser medida y su in

174

Aspectos bsicos de la inmunidad

tensidad depende de la cantidad de sustancia

lum iniscente presente. Si el lum inol u otras
sustancias quimioluminiscentes como el isoluminol, pirogalol, derivados del luminol y steres ele acridinio, entre otras, son unidas cova

lentem ente a antgenos o anticuerpos, estos

productos pueden ser usados para inmunoanli
sis de quimioluminiscencia.
La reaccin de quimioluminiscencia del lu
minol es la siguiente;
O
II
C O-

NH
- Luz

+ 2 H ,0 , + OH---------

ilH

^ ^

catalizador

X mx. 430 nm)

C O'
NH.,

NH,

O
Luminol

FORMACION DE COMPLEJOS
AVID IN A-BIOTIN A
La avidina es una glucoprotena que fija la
biotina con una unin de muy alta afinidad (K^
= 10^-^ M). Ambos reactivos pueden ser fijados
en forma covalente a anticuerpos, antgenos,
enzimas, sustancias fluorescentes, clulas, etc.,
productos que pueden obtenerse en el com er
cio. Esto ha hecho que la formacin del com
plejo avidina-biotina sea usado con buenos re
sultados en estudios de interacciones anticuer
po-ligando, facilitando el desarrollo de enzi
moinmunoanlisis, radioinm unoanlisis, estu
dio de interacciones antgeno-anticuerpo a n i
vel celular, etctera.
La biotina es un factor soluble del complejo
vitamnico B y acta como coenzima de enzi
mas involucradas en mecanismos de carboxilacin. Se puede copular fcilmente a anticuer
pos o enzimas sin prdida de su actvidad. Esta
unin, de tipo covalente, se produce entre el
grupo carboxilo de la biotina -p rev ia activa
cin- y los grupos amino libres de las prote
nas.
La avidina, compuesto proteico de la clara
de huevo, es muy estable y presenta varios si
tios de unin por lo que puede actuar como
puente entre dos molculas biotiniladas o unir
se covalentemente a enzimas formando un con
jugado capaz de reaccionar con anticuerpos o
antgenos biotinilados.
Los enzimoinmunoanlisis que aprovechan
la formacin del complejo avidina-biotina ge
neralmente se desarrollan fijando el anticuerpo
especfico sin marca a una fase slida. Despus
de interaccionar con su correspondiente antge
no el complejo se lava y se le aade el mismo
anticuerpo al que previamente se le ha fijado

a-aminoftaiato
+ N ,+ 3H ,0

biotina covalentemente. Despus de producida

la reaccin se lava y se aade avidina marcada
con peroxidasa, y luego se contina la reaccin
aadiendo el sustrato correspondiente, como se
indic en enzim oinm unoanlisis (fig. 8-9A).
Tambin ha dado muy buenos resultados para
la identificacin de anticuerpos monoclonales
(de origen murino). En este caso, al antgeno
fijado a una fase slida se le aade el material
que contiene los anticuerpos monoclonales que
se han de valorar. Los complejos formdos se
hacen interaccionar luego con suero antiinmunoglobulina de ratn, obtenido de otra especie
animal, al que previamente se le fij biotina.
Despus de lavar se aade avidina marcada con
peroxidasa y luego se desarrolla la reaccin co
loreada mediante el aadido del sustrato co
rrespondiente (O-fenilendiamina y H^O,) (fig.
8-9B),
Han sido descritas diferentes variantes de los
dos mecanismos generales sealados.
B IB L IO G R A F A
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Reaccin antgeno-anticuerpo in vitro

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Reac^in antgeno-anticuerpo in vitro

Interaccin secundaria

RICAF^DO MARGNI

Dada Ja especificidad de la reaccin antgeno-anticuerpo, sta ha sido utihzada con m ag

nficos resultados en "a diferenciacin e identi
ficacin de microor mismos, hemates, antge
nos solubles, as como en la investigacin y
cuantificacin de anticuerpos sricos, sobre to
do con fines de diagnstico. En este sentido
han sido muy tiles las diferentes metodologas
aportadas por la serologa.
En un principio se crey que los diferentes
fenmenos visuaiizables de las reacciones antgeno-anticuerpo, como ya se seal al comien
zo del captulo 5, dependan exclusivamente de
las caractersticas propias y particulares de s
tos. Hoy se sabe que en ello participan distintos
factores.
En la interaccin in vitro de un antgeno
con su correspondiente anticuerpo se distin
guen dos etapas, la reaccin prim ara no visualizable y la reaccin secundaria, que sigue
a !a anterior y se caracteriza por la aparicin
de un fenmeno visible como la aglutinacin,
la precipitacin, etc. Cuando la reaccin ocu
rre in vivo, como consecuencia de esta inte
raccin pueden aparecer fenm enos b iolgi
cos colaterales como la necrosis en la reaccin
de Arthus; los fenmenos vasgenos y de conractura de la musculatura lisa en la anafilaxia
como resultado de la liberacin de histam ina y
otros mediadores qum icos, etc. Estas m ani
festaciones se consideran com o reacciones
terciarias.
Los mecanismos que regulan la reaccin pri
maria ya han sido expuestos en el captulo 8.
Los complejos iniciales que se forman rpi
damente y sobre los que, dentro de ciertos lmi
tes, las variaciones de temperatura y concentra
cin salina tienen poca influencia, se agregan
luego para dar diferentes fenm enos visibles

cuyas caractersticas dependen en gran parte

del estado fsico del antgeno. Esta etapa se
acelera con la tem peratura, la agitacin y es
electrlito-dependiente.
Es importante separar las etapas de la reac
cin antgeno-anticuerpo. Puede ocurrir que se
demuestre la presencia de anticuerpo por inte
raccin primaria, pero que ste no sea detectable por interaccin secundaria o terciaria. Esto
puede ser consecuencia de variaciones cuanti
tativas, ya que para conseguir fenmenos visi
bles son indispensables deternrinadas concen
traciones de anticuerpo, y cualitativas inheren
tes a las propiedades de la clase de inmunoglo
bulina comprometida en la respuesta inmune,
as como de las caractersticas del ligando. Si
bien es posible detectar un anticuerpo mediante
estudios de interaccin primaria, como ya se ha
visto, ello no significa cjue siempre deban ocu
rrir reacciones secundarias o tei'ciarias.
Las diferentes m anifestaciones de tipo se
eundario sern estudiadas en sus pormenores,
en tanto que las terciarias podrn ser halladas
en los distintos captulos, en especial en el refe
rente a m anifestaciones de hipersensibilidad.
Las metodologas utilizadas para el desarrollo
de las diferentes reacciones secundarias figuran
en el captulo 35.
P K E C IP IT A C I N
Cuando un anticuerpo, excepcin hecha de
los bloqueantes y no precipitantes, es puesto en
contacto con una solucin de la macromolcula
que lo origin, se form an com plejos Ac-Ag
que se insolubilizan luego en su mayor part:
dando una reaccin de precipitacin, que p u e
de ser total o zonal (fig. 9-1).

Reaccin antgeno-anticuerpo in vitro

Como expresramos al comienzo del libro,
sta es una propiedad de la mayor parte de los
anticuerpos y no una caracterstica particular de
un determinado tipo al que originalmente se lo
llam anticuerpo precipitante.
Precipitacin en medios lquidos
Precipitacin cualitativa
E^sta reaccin se produce en dos etapas. En la
inicial, que se desarrolla rpidamente y es in
fluida muy poco por la temperatura y los elec
trlitos, se forman los complejos Ac-Ag prima
rios. A medida que el tiempo transcurre, .esos
complejos iniciales se agregan, originando micelas de diferentes tamaos, las que finalmente
precipitan. Algunos complejos no alcanzan a
hacerlo y quedan en solucin. La velocidad de
sedimentacin es proporcional a V-((p-(po) g,
siendo V el volumen de la partcula, (p y cpo las
densidades de las partculas y el solvente, res
pectivamente, y g, el campo gravitacional.
La'tem peratura acelera esta segunda etapa,
siendo adems electrlito-dependiente. Cloruro
. sdico al 0,85% (0,15 M) es la concentracin
ptima en la mayor parte de los casos, excep
cin hecha de los anticuerpos de origen aviario,
en que se eleva al 8%. Es rnucho ms lenta que
la inicial, puede durar minutos, e incluso horas,
para que se complete.
La form acin de agregados es una co n se
cuencia de la bivalencia de los anticuerpos y
multivalencia de los antgenos. Con haptenos
monovalentes o antgenos que poseen un solo
determinante antignico por molcula, la preci
pitacin no se produce. Experiencias muy inte
resantes sobre el particular se han realizado con
ribonucleasa pancretica marcada con dinitro
fenol (D NP-RNAsa) en la que las relaciones
molares eran 1:1. Los sueros de animales in
munizados por DNP-BSA no precipitan con ri
bonucleasa monodinitrofenilada, pero s lo ha
cen los de animales inm unizados con ribonu
cleasa.; Ello es consecuencia de la presencia de
u solo grupo DNP y de varios determinantes
atigjcos especficos para ribonucleasa por
molcula de DNP-ARNsa.
Un hecho muy particular lo constituyen los
anticuerpos m onoclonales, que en su m ayor
parte no muestran actividad precipitante. Ello se
debe a que en muchos de los casos, especial
mente cuando estn dirigidos contra macromo
lculas en solucin, reconocen a un nico epito
pe no repetido, lo que les impide formar agrega
dos. Con los sueros inmunes obtenidos de ani
males inoculados con macromolculas, a preci
pitacin tiene lugar, pues en esos sueros hay
una mezcla de anticuerpos capaces de interac
cionar con diferentes epitopes del mism.o ant

177

geno, lo que posibilita la formacin de com ple

jos mixtos Ac-Ag, insolubles (fig. 9 -Ib).
Si se utiliza un antgeno marcado fcil de d e
mostrar en el precipitado, es posible conocer la
composicin de los complejos Ac-Ag que p re
cipitan, y si se analizan los precipitados que se
forman en una serie de tubos en los que se han
colocado cantidades iguales de anticuerpo y
variables de antgeno, se ver que las relacio
nes molares Ac/Ag son aproximadamente 1 en
la zona de exceso de antgeno, 4 en la zona de
equivalencia o proporciones ptimas y 7 en la
de exceso de anticuerpo. El peso molecular del
antgeno ejerce marcada influencia en esa rela
cin. Siendo el peso molecular y la valencia del
anticuerpo constantes, mayor nmero-de m o l
culas de ste podrn interaccionar con molctllas de antgeno grandes que con pequeas. En
la zona de exceso de anticuerpo la relacin es
40 para el sistema tiroglobulina-antitiroglobulina (tiroglobulina PM, 700 kD) y 5 para ovoal
bmina-antiovoalbmina (ovoalbmina PM , 43
!cD). Con otras protenas de diferentes pesos
m oleculares esas relacio n es varan. P a ra la
gammaglobulina humana (PM, 150 kD) es 7,
para la ribonucleasa pancretica bovina (PM ,
13,6 kD) es 3 y para si virus del mosaico del
tabaco (PM, 40.000 kD) es 650. Estos valores
estn influidos por la especie animal de donde
proviene el anticuerpo y su grado de inm uniza
cin, ello como consecuencia de la calidad de
los anticuerpos elaborados. Es conveniente re
cordar que, en el curso de una inm unizacin,
los anticuerpos que aparecen primero son IgM
y luego IgG, si el inmungeno es T-dependien
te y no debe olvidarse adems la existencia de
anticuerpos no precipitantes capaces de origi
nar uniones Ac-Ag, pero no de precipitar, por
ser funcionalmente univalentes.
La formacin de estos diferentes complejos
ha sido exphcada mediante la llamada teora
dl enrejado, que considera que la composicin
del precipitado formado es una consecuencia
del modo en que anticuerpo y antgeno se han
unido. Dada la bivalencia del anticuerpo y m ul
tivalencia del antgeno, las posibilidades de
com binacin varan segn que en la m ezcla
exista exceso de antgeno, exceso de anticuerpo
o equivalencia de ambos (fig. 9-2). Las frm u
las de dichos complejos son; Ac^Ag, Ac^Ag pa
ra la zona de exceso de anticuerpo; ACjAg,
Ac^Ag para la zona de equivalencia; y AcAgj,
Ac^Agj para la zona de exceso de antgeno,
constituyendo complejos solubles, que se for
man en la zona de marcado exceso de Ag.
Precipitacin cuantitativa
Si
bien la precipitacin en medios lquidos
es muy til para ia identificacin de antgenos

178

Aspectos bsicos de la inmunidad

F ig. 9 - la . P recipitacin en m edio lquido. T ubos a y d,
precipitacin zonal con form acin de un precipitado anu
lar. Tubo b, precipitacin total con enturbiatniento. Tubo
c, testigo.

A n tgen o

A nticuerpo m on oclon al

S u e ro inm une

V Y VV V
anti-a

anti-a

anti-b

anti-c

V
y
C om plejo A g-A c
n o precipitable

C om plejo insoluble

Fig. 9 - lb . Interaccin de un antgeno que presenta m ltiples epitopes (a, b, c) no repetidos, con un anticuerpo m onoclo
nal (anti-a) y con un suero inm une que contiene anticuerpos anti-a, anti-b y anti-c. Slo el suero inm une puede originar
com plejos A c-A g insolubles.

Reaccin antgeno-anticuerpo in vitro

Fig. 9-2. F orm acin de precipita
dos o com plejos solubles segin las
concentraciones de antgeno y an
ticuerpo presentes en la mezcla.

179

Precipitados

Ac/Ag = 3

Ac/Ag = 2

Complejos solubles formados en exceso de antgeno

O O aAc/Ag = 0,5
= 0 ,6 7

Complejos formados en exceso de anticuerpo

Antgeno
( )

Anticuerpo
Ac/Ag = 5

Ac/Ag = 6

y anticuerpos, teniendo en cuenta lo expuesto

anteriormente, en lo relativo a la formacin de
los precipitados, ella puede usarse con fines
cuantitativos y constituye un buen mtodo, para
la medida de la concentracin de los anticuer
pos presentes en un suero. Puede usarse tam
bin para medir niveles de antgeno.
Si
suponemos que se desea valorar un suero
antineumoccico tipo III y disponemos del polisacrido antignico suficientemente purifica
do, el mtodo que se ha de seguir es el siguien
te: en una serie de tubos se colocan voliimenes
iguales del suero para valorar y cantidades cre
cientes del poiisacrido. Despus de la incuba
cin, y producida la precipitacin, todos los tu
bos son centrifugados y los precipitados lava
dos con solucin salina tamponada (NaCl 0,15
M, fosfato 0,01 M, pH 7,6) para elim inar las
protenas sricas no especficas contaminantes.
Si por cualquier procedim iento sensible (microKjeldahl, Folin-Ciocalteau, espectrofotometra) valoramos la protena de los precipitados,
ella corresponder al anticuerpo, ya que el ant
geno no tiene carcter proteico (cuadro 9-1 y
fig. 9-3), Cuando se hacen estas valoraciones
es necesario aadir EDTA al suero para evitar
la copreeipitacin del complemento.

Un hecho que llama la atencin, y que pare

cera que est en desacuerdo con lo expresado
respecto de la formacin de. los precipitados, es
que la cantidad de anticuerpo no aum enta con
el incremento de antgeno, sino que existe una
zona ptima, llamada zona o punto de equiva
lencia, ubicada entre las zonas de exceso de an
ticuerpo y exceso de antgeno, donde la preci
pitacin es mxima. Si se analiza el sobrena
dante de ese tubo, recurriendo a mtodos sufi-

C u a d ro 9-1. Valoracin de anticuerpos antipolisacridos neumoccico tipo III

Suero
mi
1
1
1
1
1
1
1
1

Poiisacrido
neum occico Protena
tipo III
del ppdo^
Hg/0,5 rnl
(Ac) mg
25
50
75
100
150
200
300
400

1,61
3,32
4,15
4,75
4,96
4,07
3,19
2.53

A n lisis
del sobi'en a d a n te
Exceso
E xceso
de Ag
d e Ac

....

+
+

-1-

-h
+
+

180

Aspectos bsicos de la inm unidad

Sobrenadante
E

|j,g de Ag aadido
Fig. 9-3. Curva de precipitacin correspondiente al sistem a polisacrido neum occico tipo Ill-antipolisacrido, elaborada
con los datos del cuadro 9-1.

cientemente sensibles, se observa que en l no

hay exceso de anticuerpo ni de antgeno. Ello
significa que el anticuerpo contenido en ese
precipitado corresponde a la totalidad de l,
existente en el suero para valorar.
Este hecho se explica si se tiene en cuenta
que la reaccin de precipitacin es reversible y
que tiene lugar bajo rigurosas condiciones de
equilibrio:

DNP-SAB (dinitrofenil seroalbmina bovina),

por lectura espectrofotom trica a 360 nm se
puede determinar la concentracin de antge
no y a 280 nm su contenido proteico. C ono
ciendo este hecho de antemano es posible, por
simple sustraccin, calcular la protena anti
cuerpo del precipitado (vanse cuadro 9-2 y
fig. 9-4).
En caso de que el antgeno no tuviese marca,
ovoalbmina por ejemplo, es necesario por el
Ag . Ac
anlisis de los sobrenadantes frente a antgeno
: + Ac
y frente a anticuerpo, por separado, determinar
(precipitado)
la zona de equivalencia. Como en ese punto la
En exceso de Ag el equilibrio se desplaza, precipitacin del antgeno es total, restando del
formndose complejos solubles, y disminuye precipitado la cantidad de l aadida conocere
por lo tanto la cantidad de anticuerpos en el mos la cantidad de protena anticuerpo (vase
precipitado:
cuadro 9-3).
Cuando en la valoracin de anticuerpos por
Ag Ac + Ag
Agj Ac
precipitacin el punto de equivalencia se deter
(precipitado)
(soluble)
mina mediante la investigacin de exceso de Ac
El mismo efecto anterior puede lograrse aa o de Ag en el sobrenadante, es indispensable
diendo exceso de hapteno al precipitado. En es que el antgeno empleado en este examen sea de
tas condiciones pueden form arse com plejos la mxima pureza. Si no fuese as, la mayor pre
Hp^ Ac solubles, hecho ste que se emplea con cipitacin podra corresponder a mezcla de anti
suma frecuencia cuando quieren disociarse pre cuerpos y adems podra ocurrir que anticuer
cipitados para la purificacin de anticuerpos. pos contra la im pureza, que se encuentran a
La mayor o menor cantidad de Hp^ Ac formado concentraciones distintas de las del anticuerpo
depender de la afinidad de aqul por el antge para valorar, tengan zonas de equivalencia dife
no y el hapteno.
rentes y dificulten el anlisis (fig. 9-5).
Si
el anticuerpo para valorar fuera especfi Si
el antgeno empleado en la inmunizacin
co contra un antgeno proteico, el mtodo de y en la valoracin es una protena con varios
valoracin para emplear sera el mismo, pero determ inantes antignicos, ovoalbm ina por
en este caso la protena del precipitado no se ejemplo, el ttulo obtenido corresponder a ms
ra exclusivaiiente anticuerpo. Si el antgeno de un anticuerpo que han precipitado simult
tuviera una m arca identficable, por ejem plo neamente. El problema se complica aun ms si

Reaccin antgeno-anticuerpo in vitro

181

ng de Ag aadido

F ig . 9-4. C urva de precipitacin correspondiente al sistem a D N P -an-D N P, elaborada con los datos del cu a d ro 5-3.

se tiene en cuenta que cada uno de los determi

nantes puede tener una heterogeneidad distinta
con respecto a la afinidad.
Inhibicin de la precipitacin
po r haptenos
Siendo el hapteno la parte de la molcula an
tignica que le confiere la especificidad, es l
gico que el anticuerpo originado reaccione con
ambos. Si bien la interaccin directa anticuerpo-hapteno (A c-H p) no puede v isualizarse,
puede ponerse de manifiesto mediante la inhi
bicin de la precipitacin cuando es aadido el
antgeno. Durante la primera etapa, los sitios de

com binacin del anticuerpo son bloqueados

por el hapteno, imposibilitando la interaccin
posterior del antgeno.
Mediante este mtodo ha sido posible tener
m ejor informacin sobre la especificidad del
anticuerpo que cuando se emplea la precipita
cin cualitativa.
El mtodo tambin puede hacerse cuantitati
vo y generalmente se elige como punto final de
la reaccin el 50% de inhibicin.
Tiene la ventaja de permitir la medicin de
la capacidad inhibitoria de haptenos relaciona
dos y establecer comparaciones entre ambos,
en especial sus afinidades con relacin al ant
geno inmunizante (fig. 9-6).

C u ad ro 9-2. Valoracin de anticuerpos antidinitrofenol (anti-DPN)

DO
Suero
mi

A ntgeno
lg/0,2 m i

0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5

40
75
100
125
150
175
200

360

280 (a)

0,290
0,385
0,502
0,611
0,740
0,796
0,737

1.060
1,221
1.305
1.542
1,634
1.609
1,530

D O (360)
x 0 ,6 2
(b)

DO (280)
corregido
(a-b)

0,180
0,238
0,311
0,379
0,458
0,493
0,457

0,880
0,983
0,994
1,163
1,176
1,116
1,073

A c en
ppdo.
- mg
1,10
1,22
1,25
1,45
1,47
1,39
1,34

A g en
ppdo.
fg

Relacin
Ac/Ag

53
70
92
112
136
145
135

20,7
17,4
13,4
12,9
10,8'
9.5
9,9

S u ero valorado: su ero de co n e jo in m u n iz ad o con g am m a g lo b u lin a h u m a n a d in itro fen o la d a (D N P -H G G ).

A n tg en o em p lea d o : alb m in a b o v in a din itro fen o la d a (D N P -B S A ). P ara D O (3 6 0 nm ) = 1 c o rresp o n d e n 93 }Xg d e antgeno (fig . 35-1).
Inc u b aci n : 1 h o ra a 37"C y 24 h o ra s a 4 'C.
.ec tu ras: esp e ctro fo to m tric as (v o lu m en final d e lo s tu b o s 2 m i).
10/E^^i^, p ara la Ig G d e conejo: 0,625.
C lculos:
A n ticu e rp o en el p p d o .: D O (280 n m ) (a-b) x 2 x 0 ,6 2 5 : m g/ppdo.
A n tg en o en el p p d o .: D O (360 nm ) x 2 x 93: )ig/ppdo.
R elacin A c/A g: [ig A c en p p d o /|ig A g en ppdo.
T tu lo d e an ticu e rp o s anti-D P : m x im a cantidad d e A c en ppdo. x 2.
P ara el ca so de an alizado: ] ,5 x 2 = 3 m g - mi"' de suero.

182

Aspectos bsicos de la inmunidad

Fig. 9-S. C urva de precipT
tacin efectu ad a con suero
d e o v e ja in m u n iz a d a con
H G G -D N P. En los solwenad a n te s se o b s e rv a n tu b o s
c o n e x c e s o d e A g y A c.
Ello es debido a que se trata
de un sistem a m ultiespeefico, constituido por anticuer
pos anti-H G G (-------) y an
ti-DN P

|ig de Ag aadido
-Precipitacin con HGG - DNP
-Precipitacin con HGG
-Precipitacin con BSA - DNP

Reaccin de floculacin
Un hecho no bien entendido es la llam ada
reaccin de floculacin. sta se caracteriza por
no formar precipitados hasta que la cantidad de
antgeno aadido no exceda de ciertos lmites,
cosa que no ocurre con la precipitacin. Aqu
hay formacin de agregados que sedimentan con
el aadido de cantidades mnimas de antgeno.
En la floculacin, los complejos formados se
agregan y sedimentan en un rango nruy estre
cho de la relacin Ac/Ag; en la zona de exceso
de antgeno y exceso de anticuerpos slo se
forman complejos solubles. En la precipitacin
esto es bien manifiesto en la zona de exceso de
antgeno (fig. 9-7).

Parecera que es una propiedad dependiente

ms de los anticuerpos que de los antgenos.
Los sueros que dan floculacin son los que se
obtienen por inmunizacin de caballos con al
gunos tipos de protenas, en especial toxinas
m icrobianas, como la diftrica y la tetnica.
Los sueros de los mismos animales inoculados
con polisacridos se comportan como precipi
tantes y no como floculantes. Los conejos, ca
bras y ovejas dan sueros precipitantes, cual
quiera que sea el tipo de antgeno empleado.
En el hombre se ha observado que algunos
sueros provenientes de enfermos con tiroiditis
de fashimoto, enfermedad en la que aparecen
autoanticuerpos antitiroglobulina, se com por
tan como floculantes.

C u ad ro 9-3. Valoracin de anticuerpos antio

voalbmina

|iM de hapteno aadido

F ig. 9-6. G raficacin de los resultados obtenidos en la in

hibicin de la precipitacin por un hapteno. Sistem a reacti
vo: D N P-anti-D N P. A nticuerpo: 0,5 m l de suero de oveja
anti-D N P (inm unizada con D N P-H G G ). A ntgeno: 150 lig
D N P-BSA (dosis ptim a). H apteno: dinitrofenol (D NP).

Suero
ml

O voal
bm ina
llg/0,2
ml

DO
(280
nm,}

Protena
del
ppdo.
mg

0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5

50
75
100
125
150
175
200
225

0,820
1,150
1,350
1,550
1,795
1,725
1,610
1,525

1,03
1,44
1,69
1,94
2,24
2,16
2,01
1,90

Anli'sis
d el sobrenadante
Exceso
Exceso
deA g
cleA c
_
_

+
+
+
+
_

+
+
+

C lculos;
D O (280) X 0 ,625 x 2: P ro ten a del pre cip ita d o .
(P rotena del ppdo. en zo n a d e eq u iv a le n cia) - (A g a a d id o en zona
de eq u iv a le n cia) = A n ticu e rp o en ppdo. en zo n a de eq u iv a le n cia.
P ara el caso analizado: 2 ,2 4 - 0,15() = 2 ,09 m g/0,5 m l d e suero.

Reaccin antgeno-anticuerpo in vitro

183

Fig. 9-7. Curvas de

p recip itaci n y floculacin. En la p re
cip ita c i n slo hay
fo rm a c i n de c o m
p le jo s s o lu b le s en
exceso de antgeno,
en ta n to q u e en la
f lo c u la c i n
e llo
ocurre en exceso de
an tg en o y de a n ti
cuerpo.

P R E C IP IT A C I N

Los sueros con anticuerpos que dan precipi

tacin se identifican como de tipo R, y como de
tipo H los que producen floculacin.
Esta denominacin se ha adoptado teniendo
en cuenta que los sueros de conejo (rabbit) y
los de caballo (horse) son los que tienen esas
caractersticas.
Precipitacin en medios con geles
Las macromolculas pueden difundir libre
mente a travs de geles; esta difusin est limi
tada por la concentracin del gel. Empleando
soportes adecuados, en especial aquellos que
como base tienen agar disuelto en electrlitos,
es posible hacer migrar antgenos y anticuerpos
de modo que al encontrarse interaccionen. Pue
den utilizarse tambin geles con base de pectina, alginatos, poliacrilamida y aun tiras de ace
tato de celulosa gelatinizado.
Los precipitados que se originan se visuali
zan como ntidas bandas de precipitacin, que
permanecern estables mientras un mayor aflu
jo de molculas de los reactivos no provoquen
redisolucin.
Se han descrito numerosas tcnicas cualitati
vas y cuantitativas basadas en este principio,
entre las que pueden citarse la difusin simple
monodimensional, doble difusin monodimensional, doble difusin bidimensional, difusin
radial, inmunoelectroforesis.

trando, creando un gradiente de concentracin.

En la interfase gel-lquido no se form an preci
pitados, dada la alta concentracin antignica,
y aparecen con la forma de bandas cuando la
concentracin del antgeno que ha difundido es
la ptima.
Si
en el suero haba ms de un anticuerpo y
en la solucin aadida ms de un antgeno que
se correspondan, se formarn tantas bandas de
precipitacin como sistemas hayan interaccio
nado.
Esto no es exacto, pues si se tiene en cuenta
que estas separaciones dependen de las veloci
dades de difusin de las diferentes molculas
antignicas, slo ser cierto si aqullas son dis
tintas. El nmero de bandas de precipitacin
nos indica la cantidad mnima de sistem as reac
cionantes presentes. Esto tambin es relativo,
ya que es indispensable que los reactivos no es
tn a concentraciones inferiores a las necesarias
para que la reaccin ocurra.
Teniendo en cuenta que la velocidad de mi
gracin depende del coeficiente de difusin del
antgeno y de su concentracin, Oudin trat de
aplicar las leyes de la difusin con el objeto de
transform ar el m todo en cuantitativo, estu
diando los factores que influyen en la forma
cin de los precipitados. Las frmulas para la
cuantificaci n p ropuestas por l son las si
guientes:

1)
Difusin simple monodimensional
M todo conocido tambin como tcnica de
Oudin simple, por ser ste el autor que lo des
cribi; consiste en colocar en un tubo de ensa
yo pequeo agar fundido (solucin al 1% en
NaCl 0,15 M) mezclado con un volumen igual
del antisuero para analizar. Producida la solidi
ficacin, se aade la solucin de antgeno. Por
difusin a travs del gel el antgeno va pene

2)

VF
,

h =K
VT
=

y lo g

Ago

h
Ag
= a log

VF

Ago

184

Aspectos bsicos de la inmunidad

h es la distancia desde el borde del gel a la ban

da de precipitacin en un tiempo t; y y a son
constantes y Ag y Ac las concentraciones ini
ciales de antgeno y de anticuerpo. Agg y ACg
son los correspondientes valores extrapolados
para
h
= O
VT
La frmula 2 se aplica cuando el anticuerpo
es constante y el antgeno variable, y la 3, en el
caso contrario.
Posteriormente, el mismo autor pudo com
probar que hay una relacin lineal entre K y lo
garitmo de la concentracin antignica (log C)
para valores bajos de ~

y entre

Solucin
de Ag
en S.F.

Ag + agar
ai 1%

r 0,5%

Solucin
de Ac
en agar

Ac + agar
ai 1%

Difusin simple

Difusin dobie

y el mis-

h
mo logaritmo para valores altos de . En conVF
secuencia, para bajas concentraciones antignih
se aproxima a log C, mientras que a al
VT
tas concentraciones lo hace a
VT
Han sido propuestos otros mtodos de cuan
tificacin incluso el empleo de densitmetros
especialmente diseados, pero a pesar de ello
actualmente slo se utilizan como metodologa
cualitativa, ya que para la cuantificacin de Ag
y Ac existen otros mtodos ms eficientes.
Difusin simple bidimensional
En este caso, la reaccin se efecta colocan
do en la parte inferior del tubo un volumen de
agar al 1% fundido, mezclado con partes igua
les del antisuero. Producida la gelificacin, se
agrega agar al 0,5% en solucin salina, en un
volumen igual a la mitad del anterior. Despus
de la solidificacin se cubre todo con un volu
men de agar al 1% fundido, mezclado con igual
volumen de la solucin antignica.
Antgenos y anticuerpos migrarn hacia la
zona media y, cuando los que son equivalentes
se encuentren, interaccionarn desencadenn
dose la precipitacin cuando las concentracio
nes sean las ptimas. Si las cantidades de Ag y
Ac aadidas son las que corresponden a la zona
de equivalencia, la precipitacin se producir
en la parte central de la zona de reaccin y las
bandas formadas sern ntidas y estables, en
tanto que estarn desplazadas hacia los extre
mos cuando estas condiciones no se cumplan, y
en parte se redisolvern. Estando la difusin en
relacin directa con la concentracin de la sus
tancia que difunde, la banda de precipitacin
estar m s prxim a a la zona del antgeno

Ag

Ag

Ac

Ac

Precipitacin en
exceso de Ac

Precipitacin en
zona de equivalencia

Ac

Precipitacin en
exceso de Ag

F ig. 9-8. A . Esquem atizacin de la inm unodifusin sim

ple y doble. B . Los tubos indican las caractersticas de la
banda de precipitacin en la inm unodifusin doble, la que
es ntida y est ubicada en el centro cuando se form a en la
zona de equivalencia, y d ifusa y desplazada cuando io h a
ce en p resen cia d e exceso de an tgeno o an ticu erp o . La
banda se desplaza hacia la zona del antgeno, y la red iso lu
cin del precipitado (zona difusa) se produce del lado don
de est ubicad o el an ticu erp o cu ando h ay exceso d e l;
ocurre lo contrario cuando el antgeno es el que se encuen
tra en m ayor concentracin.

cuando hay exceso de anticuerpo, y ocurrir lo

inverso en caso contrario.
ste es un buen mtodo cualitativo que per
mite demostrar varios sistemas reactivos simul
tneos, cosa que no ocurre en la precipitacin
en medios lquidos (figs. 9-8 y 9-9). Pueden
detectarse hasta 10 |J,g por mi de anticuerpo.
Doble difusin bidimensional
Un mtodo interesante de doble difusin en
placas fue descrito por Ouchterlony, que luego
fue transformado en micromtodo al emplear
portaobjetos cubiertos con agar al 1,5% en so
lucin salina como base de la reaccin. Consis
te en enfrentar en pequeas perforaciones efec
tuadas en el agar, y a distancias convenientes,
las soluciones de antgeno y anticuerpo.

Reaccin antgeno-anticuerpo in vitro

185

F ig . 9 -9 . In m u n o d ifu si n d o b le en
exceso de antgeno (1), zona de equi-v alen cia (2) y ex c eso de an ticuerpo
(3). L as ban d as de p re c ip ita c i n de
los tubos 4 y 5 corresponden a ia inte^
racci n de distintos sistem as a n tg e
no--anticuerpo.

Al difundir ambos y ponerse en contacto,

producirn una banda de precipitacin cuando
estn en la relacin ptima. Si la concentracin
de Ag y Ac colocados en los reservorios es la
que corresponde a la zona de equivalencia, la
banda de precipitacin estar situada aproxima
damente en la distancia media que separa esos
reservorios. Cuando hay exceso de Ag o de Ac,
la banda de precipitacin formada estar prxi
ma al reservorio del anticuerpo o del antgeno,
respectivamente.
Con esta tcnica puede tenerse una idea de
las relaciones entre los pesos moleculares de
los antgenos y anticuerpos reaccionantes. Tra
bajando con concentraciones ptimas de Ag y
Ac, si la banda de precipitacin formada es rec
ta, indica que los pesos moleculares de ambos
son muy prximos. Si la banda es cncava con
respecto al reservorio del antgeno, seala que
el peso molecular de ste es superior al del an
ticuerpo, siendo m enor en el caso en que la
banda presente convexidad.
Todo esto es una consecuencia de las leyes
generales de la difusin, que establecen que la
distancia a la que una sustancia difunde est en
relacin directa con su concentracin y en rela
cin inversa con su peso molecular. Mediante
esta metodologa es posible identificar varios
sistemas reaccionantes simultneamente, pues
cada uno de ellos dar una banda de precipita
cin especfica y, adems, investigar reaccio
nes cruzadas, pues en estos casos habr fusin
de bandas. Teniendo en cuenta ello se han idea
do distintos modelos de matrices con las que
pueden elaborarse diferentes esquemas reacti
vos (fig. 9-10).
Este mtodo resulta muy interesante porque
permite identificar las bandas de precipitacin

m ediante el empleo simultneo, en el mismo

esquema de reaccin, de antgenos y anticuer
pos conocidos. O riginariam ente O uchterlony
describi, de acuerdo con este hecho, tres tipos
de reacciones y el esquema correspondiente a
ellas puede verse en la figura 9-11. Fueron de
nom inadas como reacciones de identidad, no
identidad e identidad parcial.
En el primer caso, los dos sistemas reactivos
se funden en una nica banda de precipitacin.
Si los sistemas no son iguales (reacciones de
no identidad), cada uno reacciona independien
tem ente originando bandas de precipitacin
que se cruzan. Cuando uno de los antgenos
analizados tiene algn com ponente capaz de
dar una reaccin cruzada con el anticuerpo ela
borado por el otro (identidad parcial), las ban-

F ig . 9-10. D istin to s esquem as para inm unoprecipitacin

en p lacas de agar (tcnica de O uchterlony).

186

Aspectos bsicos de la Inmunidad

F ig . 9-11. E squem as de rea c c iO '

das de precipitacin de ambos sistemas se unen

y funden parcialm ente en una banda, apare
ciendo una prolongacin o espoln en la co
rrespondiente al antgeno que se emple para la
obtencin del antisuero. Esto indica que en este
antgeno hay componentes antignicos no com
partidos con el restante.
Las reacciones descritas son las que respon
den a los lincamientos generales de los esque
mas expuestos y muy especialm ente cuando
Ag y Ac estn en relaciones ptimas. Variacio
nes en sus concentraciones pueden influir en
los resultados, hechos stos que deben tenerse
muy en cuenta para su interpretacin correcta.
La figura 9-12 muestra algunos de ellos.
La difusin doble en placa es un excelente
mtodo cualitativo para el estudio de la homo-

10

F ig . 9 -1 2 . In m u n o p re c ip ita c i n en p la c a (m to d o de
O uchterlony). Pueden apreciarse sistem as sim ples y m lti
ples, bandas de identidad, y de no identidad.

geneidad de antgenos y anticuerpos purifica

dos. Resulta muy til tambin para la bsqueda
de impurezas, lo cual est limitado por la con
centracin en que ellas se encuentren presentes,
ya que la precipitacin se hace visible cuando
los reactivos exceden valores mnimos. Para
obviar este inconveniente, en la prctica se em
plean generalm ente altas concentraciones de
Ag y Ac que, si bien no resultan tiles para el
sistema principal, pues deja de estar en las con
diciones ptimas, perm iten aumentar la con
centracin de la impureza y asegurar su preci
pitacin.
Difusin simple en placa o difusin radial
Es un mtodo que resulta poco til desde el
punto de vista cualitativo, ya que la doble difu
sin descrita por Ouchterlony provee mayor in
formacin. En lneas generales, consiste en la
preparacin de una placa con agar al 3% en so
lucin salina, al que previa fusin se le aade
un volumen igual del suero inmune que contie
ne los anticuerpos. Producida la soUdificacin,
se practican orificios en la placa y en cada uno
de ellos se colocan los antgenos para analizar.
Si los sistemas son equivalentes rodear al ori
ficio un crculo de precipitacin, pero pueden
aparecer varios si se encuentra presente ms de
un sistema reaccionante.
Este mtodo ha dado magnficos resultados
para la cuantificacin de antgenos; permite de
tectar en mezclas cantidades mnimas, proble
ma que no haba sido resuelto hasta ese m o
mento. Cuando un antgeno es colocado en el
orificio circular practicado en la placa de agar
adicionado de anticuerpo m onoespecfico di
funde en form a radial y, de acuerdo con los
principios bsicos de la difusin, el dimetro
del halo de precipitacin est en relacin direc
ta con su concentracin. Si esta operacin se
efecta colocando en varios orificios de la pla
ca cantidades variables conocidas del antgeno
especfico para el antisuero m ezclado con e!
agar y se deja a tem peratura am biente hasta
que el halo de precipitacin no se modifique.

Reaccin antgeno-anticuerpo in vitro

187

F ig . 9 - 1 3 . C u rv a p a r a la
cuantificacin de antgenos
por in m u n o d ifu si n radial.
El s is te m a u s a d o p a ra su
elaboracin ha sido seroal
bm ina hiim ana-antiseroalbm ina hum ana. P arte infe
rior: fo to g ra fa de los d i
m etros de los halos de p re
cipitacin.

Antgeno (mg/ml)

con los resultados obtenidos se puede confec

cionar una curva relacionando la superficie de
los crculos de precipitacin o sus r^ con las co
rrespondientes concentracio n es an tignicas
(fig. 9-13). Esta curva permite calcular la con
centracin de ese mismo antgeno en cualquier
inuestra desconocida, ya que estableciendo
cul es el dim etro del halo de precipitacin
para un volumen aadido se puede determinar
r^ y, con el auxilio de la curva de precipitacin,
establecer la concentracin antignica en l.
Por simple clculo podr determinarse luego su
concentracin por ml. La confeccin de la cur
va y la valoracin del desconocido conviene
h acerlas sim ultneam en te con el o b jeto de
igualar las condiciones de la reaccin.
La difusin radial se utiliza con muy buenos
resultados en la valoracin de protenas que se
encuentran presentes en mezclas complejas co
mo lo son los componentes del suero humano.
Es indispensable disponer para ello de antisue
ros monoespecficos destinados a los antgenos
que se quieren valorar.

Reoforesis
Es un mtodo de inmunodifusin que se basa
en los siguientes hechos: si en una p la c a de
agarosa o agar purificado que contiene anti
cuerpo en un orificio central y antgeno en los
circundantes, o viceversa, se confecciona sobre
el gel una canaleta perifrica en la que se colo
ca buffer y se perfora centralmente la tapa de la
placa, como consecuencia de la evaporacin a
travs de este orificio se originan corrientes del
lquido que obligan al material contenido en los
orificios perifricos a desplazarse hacia el cen
tro, con lo que se logra una interaccin antge
no-anticuerpo ms efectiva y por lo tanto mejo
res arcos de precipitacin. La figura 9-14 es
quematiza lo expuesto.
Inmunoelectroforesis
Grabar y Williams tuvieron la feliz id ea de
concebir un mtodo analtico de protenas aJ
que llamaron anlisis inmunoelectrofortico y

188

Aspectos bsicos de la inmunidad

Base

Tapa

conteniendo buffer
F ig . 9-14. E squem a de re o fo re s is ,------- ^ indican el senti
do de la corriente lquida originada por la evaporacin a
travs del orificio central de la tapa.

que resulta de extraordinario valor para los

exmenes inmunoserolgicos e inm unoqumi
cos. Si se efecta la separacin electrofortica
de los constituyentes de una mezcla de antge
nos, en gel de agar como soporte, y aprove
chando la tcnica de Ouchterlony se hace di
fundir lateralmente un inmunosuero especfico
para los constituyentes de la mezcla en estudio,
en las zonas correspondientes a la interaccin
de cada antgeno con su anticuerpo aparecer
una banda de precipitacin. Su ubicacin de
pender de la movilidad electrofortica y velo
cidad de difusin del antgeno, lo que permite
hacer las diferenciaciones (figs, 9-15 y 9-16).
Algunos antgenos, incluso, pueden ser identi
ficados mediante reacciones particulares sobre
las bandas de precipitacin, aprovechando la
presencia en el antgeno de algn grupo reacti
vo especial que pueda ser demostrado por una
reaccin qumica o enzimtica.
Para su puesta en marcha no son necesarios
dispositivos complicados. Solamente hace falta
una fuente de poder capaz de proveer el voltaje
y miliamperaje indispensables, agar purificado,
cubas de material plstico, soluciones regula
doras, inmunosueros y algunos reactivos colo
rantes.
El agar que se utilizar debe ser de muy bue
na calidad, libre de impurezas, ya que si stas
son de carcter antignico pueden incidir en los
resultados. El gel se prepara disolviendo el agar
al 1,25% en el buffer adecuado; el ms usado es
el de veronal sdico de fuerza inica 0,05, ajus
tado a pH 8,4 con cido clorhdrico IN.
Las placas inicialm ente usadas por Grabar
para las corridas elec tro fo rticas eran muy
grandes, lo que significaba largos tiempos de
corrida e inm unoprecipitacin y consum o de
apreciables cantidades de antisuero. Scheidegger propuso luego el empleo de portaobjetos

como placas de corrida y desarroll un mtodo

llamado microinmunoelectroforesis, que es el
que se emplea actualmente.
En el comercio existen diferentes modelos
de aparatos con sus correspondientes fuentes
de poder, cubas y matrices para la confeccin
de las placas, lo que facihta las tareas.
Como el agar no es una sustancia absoluta
mente neutra, un fenmeno secundario, la elec
troendsm osis, acompaa a la eleetroforesis,
que consiste en un movimiento de la totalidad
del lquido que em bebe el gel en el sentido
opuesto al de la corriente elctrica. En efecto,
los diferentes soportes (agar, agarosa, acetato
de celulosa) cuando se impregnan en el buffer
alcalino, dada su naturaleza, exhiben cargas ne
gativas. Ello hace que el agua se cargue positi
vamente dando una unin muy dbil con aqu
llos. Como los soportes no pueden m overse
cuando se aplica la corriente elctrica, las mo
lculas de agua se disocian y se dirigen al polo
negativo (ctodo). El efecto ser ms o menos
intenso segn la naturaleza del soporte; en el
caso de los medios gelosados, el efecto es m
ximo para el agar y mnimo para la agarosa. In
fluyen tam bin en este fenm eno el pH , la
fuerza inica y el potencial aplicado. Este mo
vimiento es regular y no interfiere en los des
plazam ientos por eleetroforesis. Si estas dos
migraciones son iguales tendremos la im pre
sin de que la sustancia no se ha movido; en
cambio su movilidad ser la del sentido de la
corriente, aunque ms reducida, si sus molcu
las estn fuertemente cargadas. Las molculas
poco cargadas son desplazadas por electroen
dsmosis en sentido contrario al de su migra
cin electrofortica real. Las sustancias neutras
slo son movilizadas por la corriente endosmtica y ocuparn, despus de la corrida electro
fortica, una posicin que correspondera al
punto cero de migracin. Este hecho obliga a
depositar la sustancia para analizar, si es desco
nocida, en un reservorio confeccionado en el
centro de la placa para evitar que algunos cons
tituyentes se desplacen fuera de ella. Para sus
tancias conocidas, la siembra podr efectuarse
en el punto ms conveniente, de acuerdo con su
comportamiento.
Cuando se trabaja con el material indicado,
una corriente de 6 volts/cm permite una buena
separacin en 75 minutos. La inmunoprecipita
cin tiene lugar en las 24 horas siguientes. El
examen de las bandas obtenidas puede hacerse
directamente o por coloracin con negro am i
do, nigrosina, fucsina cida, azocarmn u otro
colorante, previa desecacin del ge! de agar.
Pueden emplearse otros soportes diferentes
del agar, y merecen destacarse las tiras de ace
tato de celulosa gelatinizado, por su gran poder
de resolucin (fig. 9-17).

Reaccin antgeno-anticuerpo in vitro

189

A = esquema para inmunoelectroforesis con un antgeno (a) y dos inmunosueros (1 y 2)

B = esquema para inmunoelectroforesis con dos antgenos (a y b) y un inmunosuero (1)

A = electroforesis en agar
B = esquema de la inmunodifusin posterior a la electroforesis
C = inmunoprecipitacin

F ig . 9-15. Inm unoelectroforesis.

Crossing-over electroforesis
o contrainmunoelectroforesis
Durante la electroforesis en medios gelosados a pH 8, las gammaglobulinas y por lo tanto
los anticuerpos, no obstante estar cargados ne
gativamente, se desplazan hacia el ctodo co
mo consecuencia del flujo endosmtico origi
nado en el proceso. Otras protenas antignicas
en esas condiciones migrarn en direccin an-

dica. Haciendo un estudio de las distancias a

las que pueden sembrarse los antgenos y los
anticuerpos, puede lograrse que el desplaza
miento sea convergente y, como consecuencia,
que en la zona de interaccin se produzca una
banda de precipitacin (fig. 9-18). Este mtodo
se desarrolla en corto tiempo, 20-30 minutos, y
perm ite identificar antgenos y anticuerpos en
m uestras de sueros desconocidos. H a tenido
gran aplicacin, especialmente en la investiga

190

Aspectos bsicos de la inmunidad

I^ig. 9-l. Inm unoelectroforesis en agar de suero hum ano.

cin del agente causal de la hepatitis viral (an

tgeno Au).
Electroinmunodifusin o rocket
electroforesis
Es un mtodo que sirve para cuantificar pro
tenas. Cuando una partcula antignica se des
plaza bajo la accin de un campo elctrico, en
un medio soporte que contiene el correspon
diente antisuero, durante la migracin electro
fortica el antgeno y su correspondiente anti
cuerpo van formando lneas de precipitacin en
el sentido de la corrida; el frente de ella experi
menta sucesivas precipitaciones y redisolucio
nes, y concluye en un pico delimitado por un
precipitado estable formado cuando la concen
tracin del antgeno remanente es mnima. Es
tos arcos de precipitacin, dada su forma pun
tiaguda (fig. 9-19), han sido denominados rockets y su altura depende de la concentracin
del antgeno en cuestin. Como soporte de co
rrida puede usarse agarosa o acetato de celulo
sa gelatinizado.
El mtodo, descrito por Laurell, tiene ciertas
limitaciones. Protenas antignicas como las in
m unoglobulinas no puede ser cu antificadas
adecuadamente ya que por su movilidad elec
trofortica similar a los correspondientes anti-

Fig. 9 -8 . C ontrainm unoelectroforesis. Sistem a analizado

alb m in a h u m an a (d erecha); a n tialb m in a h u m a n a (iz
quierda). Soporte: agar.

cuerpos, el efecto de electroforesis cruzada no

se cumple en condiciones ptimas.
Cuando se hacen estas determinaciones es ne
cesario correr simultneamente una muestra del
mismo antgeno de concentracin conocida, ya
que la cuantificacin se har relacionando las al
turas de los picos de precipitacin obtenidos.
Electroforesis cruzada
Laurell describi una modificacin de la in
munoelectroforesis, que puede ser utilizada con
fines cualitativos y cuantitativos. Resulta su-

Big. 9-17. Electroforesis (parte sup erior) e inm unoelectro

foresis (parte in ferior) en acetato de celulosa de suero hu
mano.

Fig. 9-19. R ocket electroforesis desarrollada en acetato

de celulosa gelatinizado.

Reaccin antgeno-anticuerpo in vitro

mmente til para estudios de protenas sricas
y puede desarrollarse sobre agarosa u otros ge
les, incluso acetato de celulosa.
Cuando se utiliza agarosa como soporte, so
bre una placa de 1,5 mm de espesor preparada
con ella y usando buffer de veronal pH 8,6, se
hace una corrida electrofortica de 3 horas, em
pleando un potencial de 10 V/cm. Terminada
sta, se corta una tira longitudinal del gel de
corrida y se deposita en otra placa, en la que a
la agarosa se le ha aadido una dilucin conve
niente de antisuero que contiene anticuerpos
para los antgenos en estudio. Haciendo girar la
placa 90 sobre la creccin de la corrida ini
cial, se le aplica un potencial similar al ante
rior. El tiempo de corrida vara entre 30 y 90
minutos, de acuerdo con las proporciones rela
tivas de antgeno y anticuerpo. En esta segunda
corrida, los antgenos de la tira de agarosa as
como los anticuerpos incorporados al gel migran segn su movilidad electrofortica. Para
cada sistema antgeno-anticuerpo se forman zo
nas de precipitacin, las que m igran rpida
mente influidas por el exceso de antgeno, y as
se originan arcos de precipitacin que se esta
bilizan cuando este exceso no ocurre. Los arcos
formados difieren de los logrados por inm u
noelectroforesis clsica y los resultados obteni
dos pueden ser utilizados con fines cualitativos
y cuantitativos, ya que las reas de precipita
cin formadas pueden ser cuantificadas (fig. 920 ).
La intensidad de las bandas de precipitacin
puede magnificarse si se recurre al siguiente ar
tificio: despus de la corrida en segunda dimen
sin, la placa es lavada por 24 horas con buffer
de fosfatos 0,01 M. Sobre la zona correspon
diente a las bandas de precipitacin se coloca
un trozo de papel de filtro seco y se deja en
contacto, a temperatura ambiente, por 2-3 ho
ras. Su finalidad es la deshidratacin parcial de
la zona para que se forme una concavidad te
nue, sobre Ja que se esparcirn 200 fxl de anti
suero con especificidad para la especie animal
de la que provienen las inmunoglobulinas espe
cficas usadas en la inmunoprecipitacin inicial.
Dejar 24 horas a temperatura ambiente y lavar.
El mtodo puede simplificarse. Una vez ter
minada la corrida en la segunda dimensin y
efectuado el lavado de las placas por 24 horas,
stas se cubren con papel de filtro impregnado
en la dilucin conveniente del inmunosuero es
pecfico para las inmunoglobulinas, ya seala
do. Despus de 2-3 horas de contacto, a tempe
ratura ambiente, se retira el papel de filtro y las
placas se incuban a la misma temperatura, en
cmara hmeda, por 24 horas. Lavar las placas
convenientemente, finahzada la incubacin. Si
se desea, las bandas pueden ser coloreadas si
guiendo para ello el mtodo ya descrito.

191

F ig . 9-20. Inm unoelectroforesis cruzada o bidim ensional.

M edio de soporte: acetato de celulosa.

Cuando la tcnica se desarrolla sobre acetato

de celulosa, la prim era corrida electrofortica
se hace sobre un extremo de la p laca y la se
gunda sobre la misma placa girada en ngulo
de 90, pero antes se ha recubierto el resto de
su superficie con una dilucin conveniente de
antisuero.
Radioinmunoelectroforesis
La inmunoelectroforesis puede ser desarro
llada usando antgenos o haptenos marcados
con radioistopos, especialm ente
[q que
permite por autorradiografa visualizar una in
teraccin ligando-anticuerpo que por sus carac
tersticas no puede ser detectada directamente.
Es lo que ocurre con las uniones anticuerpohapteno, pequeas cantidades de antisuero y li
gando de gran tamao o las originadas por anti
cuerpos no precipitantes y sus correspondientes
antgenos.
Para la investigacin de anticuerpos, el sue
ro en ensayo es corrido en una p laca de gel co
mo se hace norm alm ente. Cuando la separa
cin de las protenas se ha completado, en la
canaleta longitudinal se coloca u n a mezcla de
antgeno radiactivo y antisuero contra la frac
cin globulnica del suero en ensayo. El ant
geno se combina con el anticuerpo especfico
formando complejos, que luego son precipita
dos por el suero antigammaglobulina. Despus
de lavar para eliminar las protenas no precipi
tadas, el preparado es secado y previa colora-

192

Aspectos bsicos de la inmunidad

INMUNOFIJACIN
Es una tcnica que ha sido introducida con
xito para estudios diferenciales de protenas
hom ogneas, en especial inm unoglobulinas
monoclonales, tanto para la identificacin de la
clase de inmunoglobulina comprometida, como
para establecer el tipo de cadena L.
Consiste en efectuar varias corridas electro
forticas paralelas, usando acetato de celulosa
como soporte, preferentemente no gelatinizado
pues ste consume mayor cantidad de inmunosuero especfico. Terminada la corrida, una de
las tiras es coloreada con el objeto de ubicar la
banda m onoclonal. Inm ediatam ente despus,
en esa zona, se cubre cada una de las corridas
restantes con los diferentes sueros monoespec
ficos para determinar la clase de inmunoglobu
lina y el tipo de cadena L. Se dejan actuar los
inmunosueros durante 5-10 minutos, se lavan
las tiras con solucin salina para eliminar las
protenas que no han formado complejos AgAc
insolubles, y se procede al teido.
La protena monoclonal slo se fijar al so
porte de corrida cuando al interaccionar con los
anticuerpos especficos forme complejos inso
lubles. Conociendo la especificidad de los in
munosueros puede establecerse la identidad de
la protena analizada.
Este mtodo resulta muy til para identificar
y establecer la movilidad electrofortica de un
antgeno presente en una mezcla compleja, en
especial cuando se analizan productos de ex
traccin de m em branas celulares. El mtodo
adquiere m ayor sensibilidad si se usan anti
cuerpos marcados con tomos radiactivos, es
pecialm ente '^I, y la revelacin se hace por
mtodos autorradiogrficos.
Actualmente otras variantes y nuevos mto
dos se usan para la investigacin de antgenos
y anticuerpos por inmunoprecipitacin (vanse
caps. 35 y 42).

F ig . 9-21. Esquem atizacin de la radioinm unoelectroforesis. 1, electroforesis. 2, inm unodifusin con una m ezcla de
hapteno (*) y anticuerpos antigam m aglobulina (o). 3, inm unoelectrof'oresis. 4, autorradiografa.

cin o sin ella las placas son puestas en con

tacto con Una pelcula sensible a los rayos X
como la NS-54T de Kodak u otra similar. D es
pus de una exposicin conveniente la pelcula
es revelada. La coloracin previa de las placas
permite comparar los resultados obtenidos por
inm unoelectroforesis y radioinmunoelectroforesis. La figura 9-21 esquematiza esta metodoloea.

AGLUTINACIN
Cuando un anticuerpo es puesto en contacto
con su antgeno especfico, si ste se encuentra
al estado particulado (hemates, bacterias, clu
las), las partculas se agruman y aglutinan. Los
principios que regulan esta reaccin son los
mismos que para la precipitacin. La ocurrencia
de uno u otro fenmeno depende de si el antge
no es particulado (suspensin) o est en solu
cin. En un comienzo se crey que el hecho es
taba regido por el anticuerpo al que se denomi
naba aglutinina. Hoy sabemos que un mismo
anticuerpo puede dar aglutinacin con una sus
pensin bacteriana y precipitacin con un lisado
obtenido a partir del mismo microorganismo.

Reaccin antgeno-anticuerpo in vitro

La aglutinacin se lleva a cabo en medio sa
lino. La concentracin ptima de electrlitos es
0,15 M. Concentraciones mayores pueden neu
tralizar las cargas superficiales negativas que
las bacterias y otros antgenos particulados po
seen a pH neutro y provocar aglutinacin es
pontnea no especfica. C oncentraciones de
NaCl inferiores a 0,001 M son inefectivas.
El mecanismo de la aglutinacin ha sido ex
plicado de diferentes maneras. Bordet y Eagle
consideraron que inespecficamente el electr
lito era el responsable de la aglutinacin, sobre
la base del siguiente mecanism o: durante la
reaccin el antgeno se rodeara de una capa
monomolecular de globulina anticuerpo; si en
el medio no hay electrlitos, la ionizacin de la
protena sera suficiente como para mantener la
dispersin, pero la presencia de electrlitos im
pedira esa ionizacin, y al disminuir las cargas
por debajo de ciertos lmites se originara el fe
nmeno de aglutinacin. Esta interpretacin es
criticable, ya que si dos antgenos particulados
bien diferenciables a la observacin e incapa
ces de dar reacciones cruzadas, son puestos en
contacto con una mezcla de sus respectivos an
ticuerpos, en presencia de electrlito se produ
ce la aglutinacin y al microscopio se observan
grumos originados por cada uno de los antge

193

nos y no mezcla de ambos (fig. 9-22). Este he

cho est en total acuerdo con la teora del enre
jado expuesta antes. Lo que probablemente de
be ocurrir es que los iones opuestos del electr
lito neutralizan en parte las cargas superficiales
de las partculas antignicas evitando el recha
zo entre ellas y asegurando la aproximacin in
dispensable para que una molcula de anticuer
po, al reaccionar con dos de ellas, pueda iniciar
la form acin de los grum os que llev an a la
aglutinacin especfica. Si la interpretacin de
Eagle fuera la correcta, los grumos microscpi
cos de la experiencia anteriormente expuesta
deberan ser mixtos.
Reacciones de aglutinacin
M todos cualitativos
Son muy utilizados en serologa diagnstica
con el objeto de identificar bacterias, en las de
term inaciones de grupos sanguneos, etc. En
estos casos, es indispensable disponer de sue
ros monoespecficos obtenidos mediante adsor
ciones cruzadas. Estas reacciones se efectan
en portaobjetos mezclando suspensiones de las
bacterias o hemates para identificar con anti
sueros diferentes. La formacin de grum os in

Fig. 9-22. Izquierda: O bservacin m icroscpica de la reaccin de aglutinacin efectuada m ezclando glbulos rojos de
carnero dinitrofenolados y Salm onella typhi, con suero de conejo antidinitrofenol y am i-Salnionella typhi. S e observan
grum os de eritrocitos y grum os de bacterias aislados y no grum os m ixtos. D erecha: T estigo constituido por u na m ezcla de
am bos antgenos en ausencia de anticuerpos. (V anse explicaciones en el texto.)

194

Aspectos bsicos de la inmunidad

F ig. 9-23. A y B, aglutinacin m acroscpica de una suspensin de Salm onella lyphi por diferentes diluciones de su anti
suero especfico. C, control negativo.

dicar la especificidad del sistema reaccionante

(fig. 9-23). No obstante que las bacterias o clu
las en el husped (inyeccin, infeccin) se de
gradan y originan anticuerpos contra los antge
nos superficiales y citoplasmticos, en las reac
ciones de aglutinacin slo interaccionan los
primeros, dada la imposibilidad de penetracin
de los anticuerpos al interior de las clulas.
Valoracin de antisueros
Los mtodos son semicuantitativos y consis
ten en determinar cul es la mxima dilucin
del suero para analizar capaz de aglutinar al an
tgeno especfico. Las diluciones generalmente
se hacen en razcin 2 y el ttulo se expresa por la
inversa de la mxima dilucin aglutinante. Si la
dilucin 1/1024 aglutina y no lo hace la dilu
cin 1/2048, el ttulo ser 1024. Los valores
obtenidos son groseros y pueden aproximarse
efectuando diluciones intermedias. No obstante
ello, es una metodologa de singular importan
cia diagnstica, ya que, efectuada en forma se
riada, la variacin del ttulo de anticuerpos
puede ser muy til para seguir la evolucin de
una infeccin bacteriana o de una isosensibilizacin por antgenos hemticos.
El dosaje de anticuerpos por aglutinacin
puede hacerse mediante reacciones de lectura
lenta o rpida. En el prim er caso se emplean
suspensiones diluidas de antgeno, que se mez
clan con voMmenes iguales de las diferentes
diluciones del suero para valorar, empleando
como diluente cloruro de sodio 0,15 M. Los tu
bos son incubados en bao de agua a 37C du
rante dos horas y dejados luego en la refrigera
dora hasta el da siguiente para que la reaccin
se complete. El ttulo se determina buscando
cul es el lltimo tubo de la serie que presenta
aglutinacin.
La aglutinacin rpida es muy usada en sero
loga diagnstica (reaccin de Huddleson para
brucelosis, reaccin de Widal para las salmonelosis, etc.). En este caso, la reaccin se efecta

en placas, el antgeno que se emplea es veinte

veces ms concentrado que el usado en la aglu
tinacin lenta y la lectura de los resultados se
hace a los 3-5 minutos. Los fundamentos del
mtodo y determinacin del ttulo son similares
a los indicados anteriormente.
Fenmeno de prozona. Cuando se valora un
antisuero, la dism inucin de los anticuerpos
por dilucin hace que decrezca la aglutinacin
hasta hacerse nula. No obstante ello, en algu
nos sueros se observa un comportamiento par
ticular, caracterizado por ausencia de aglutina
cin en los primeros tubos de la serie, en los
que la concentracin de anticuerpos es m xi
ma, con aglutinacin positiva a diluciones ma
yores. A este fenmeno se lo llama prozona.
Mediante el empleo de anticuerpos marcados y
otras metodologas, se ha podido demostrar que
en esos tubos, aun en ausencia de aglutinacin,
el anticuerpo est unido al antgeno. Existiendo
un marcado exceso de anticuerpo con respecto
a los determinantes antignicos de la superficie
celular, estadsticamente es muy poco probable
que los dos sitios activos del anticuerpo puedan
unirse a grupos receptivos especficos ubicados
en clulas diferentes. Teniendo el anticuerpo
suficiente flexibilidad, las molculas pueden
bloquear pares de determinantes de la misma
clula, inhibindose de este modo la formacin
de grumos.
No hay que olvidar tampoco que se han des
crito anticuerpos incompletos o bloqueantes,
similares a los anticuerpos coprecipitantes y no
precipitantes (cap. 19), y que su presencia en el
suero, sim ultneam ente con los anticuerpos
normales, puede incidir en ef fenmeno de pro
zona.
Valoracin de anticuerpos incompletos
o bloqueantes
Estos anticuerpos, adems de no aglutinar, al
ser puestos en presencia de las correspondien
tes partculas antignicas las bloquean e impi

Reaccin antgeno-anticuerpo in vitro

den su aglutinacin por el anticuerpo especfi
co bivalente. En un comienzo se supuso que
eran univalentes pero algunas experiencias he
chas con hbridos y estudios sobre equilibrio de
dilisis, hacen que deban considerarse como bi
valentes. Impedimentos estricos o fenmenos
de carga deben determinar el comportamiento
particular de estos anticuerpos.
Su investigacin y valoracin son muy co
rrientes en clnica hematolgica, en especial en
isosensibilizaciones maternofetales por antge
nos del sistema Rh. Su presencia ha sido de
mostrada tambin en algunas infecciones bac
terianas, en especial brucelosis y salmonelosis.
La valoracin puede hacerse por bloqueo,
c o n g lu tin a c i n o m e d ia n te el m to d o de
Coombs o test de la antiglobulina.
a) Bloqueo. Para ello, en una batera de tu
bos se colocan volmenes iguales de la suspen
sin antignica con especificidad para el anti
cuerpo que se analiza. A todos los tubos se
aade un volumen igual de cada una de las di
luciones en razn 2 del suero a valorar. Se in
cuban a 37C durante una hora y luego se cen
trifugan; se lava el sedimento tres veces con
solucin salina tam ponada. Se resuspende el
antgeno en la misma solucin hasta igualar el
volumen original y luego se aade a todos los
tubos, en un mismo volumen, anticuerpo biva
lente especfico en concentracin suficiente co
mo para aglutinar el antgeno presente. Se in
cuba a 37C durante una hora y se determina
cul es la dilucin mxima del suero capaz de
inhibir la aglutinacin. La inversa de ella cons
tituye el ttulo del anticuerpo bloqueante en la
muestra examinada.
b) Mtodo de Coombs o de la antiglobulina.
Para esta determinacin es necesario disponer
de un antisuero especfico contra la gamm aglobulina de la especie animal de la que pro
vienen los anticuerpos que se han de investi

Glbulos rojos

195

gar. Si los anticuerpos bloqueantes fuesen hu

m a n o s , la a n tig a m m a g lo b u lin a (s u e ro de
Coombs) ser especfica para la gammaglobu
lina humana. El mtodo consiste en m ezclar el
antgeno con diluciones del suero que contiene
los anticuerpos incom pletos e in cu b ar las
mezclas a 37C durante una hora. Si bien no
hay aglutinacin, hay fijacin dei anticuerpo al
antgeno, lo que significa que ste se cubre de
molculas de gammaglobulina. Si despus de
lavar tres veces con solucin salina tamponada
se aade a todos los tubos suero de Coombs,
como ste es especfico para los determinantes
antignieos de la gam m aglobulina, en todos
aquellos tubos en que exista anticuerpo in
com pleto fijado al antgeno habr aglutina
cin. El ttulo corresponder a la inversa de la
mxim a dilucin del suero en examen que d
aglutinacin (fig. 9-24).
c)
Conglutinacin. Si la suspensin antigni
ca se prepara en albmina bovina al 20% y las
diluciones del suero para valorar se hacen en el
m ism o diluyente, los anticuerpos incom ple
tos pueden aglutinar al antgeno despus de
una hora de incubacin a 37C correspondien
do el ttulo a la inversa de la mxima dilucin
aglutinante. Ello se debera a que, como conse
cuencia de la interaccin antgeno-anticuerpos
incompletos , el complejo formado fija algu
nos de los componentes del complemento, en
especial C3. En la albmina bovina existe una
sustancia llamada conglutinina, capaz de fijarse
a los hidratos de carbono presentes en las mo
lcu las de dicha fraccin, originando como
consecuencia de ello la aglutinacin.
La neutralizacin de cargas por parte de la al
bmina, lo que facilitara la aproximacin de las
partculas y por consiguiente su aglutinacin, es
un mecanismo que no puede descartarse, as co
mo posibles interacciones entre la albm ina y el
fragmento Fe de la inmunoglobulina.

Anticuerpos
incompletos

Anticuerpos
anti-gamma globulina
(Suero de Coombs)
Complejos Ag-Ac
no aglutinables

Complejos Ag-Ac
aglutinables

F ig. 9-24. E squem atizacin de la reaccin de Coom bs para la identificacin d e anticuerpos incom pletos.

196

Aspectos bsicos de la Inmunidad

Aglutinacin cuantitativa
Es un mtodo que no se emplea rutinaria
mente, no obstante lo cual puede servir para
determinar los mg de anticuerpo especfico pa
ra un antgeno particulado existentes en un sue
ro inmune. Para ello se determina por microKjeldahl el nitrgeno correspondiente a un vo
lumen de antgeno puesto en contacto con el
suero inmune y el de un volumen igual del an
tgeno puesto en contacto con suero normal de
la misma especie animal que contenan los an
ticuerpos.
Las determ inaciones de N deben hacerse
previo lavado de los sedimentos con solucin
salina para eliminar toda protena no fijada es
pecficam ente, y la reaccin de aglutinacin
debe efectuarse en presencia de EDTA para in
hibir la fijacin del C. La cantidad de protena
anticuerpo se calcula multiplicando el N halla
do por diferencia entre los dos ensayos, por el
factor de conversin 6,25.
Aglutinacin pasiva
Cantidades de anticuerpos contra un antge
no soluble no pueden detectarse por precipita
cin si su concentracin no excede los 20 )J,g
m i '. Teniendo en cuenta que la aglutinacin es
ms sensible (cuadro 9-4), se ha procurado fijar
antgenos solubles a partculas, de m odo de
transform ar la precipitacin en aglutinacin.
Ello se ha logrado, y con magnficos resulta
dos, mediante su fijacin a hemates y partcu
las inertes como el poliestireno, la bentonita y
el colodin. A la reaccin que resulta del em
pleo de glbulos rojos como soporte se la llama
hemoaglutinacin pasiva, y simplemente aglu
tinacin pasiva cuando se utilizan otros. Gene
ralmente las uniones de los antgenos a los so
portes son no covalentes y la fijacin se obtie
ne por mezcla directa o previo acondiciona
miento de la superficie de las partculas. En el
caso de los hemates, la fijacin de hidratos de
carbono no necesita intermediarios; en cambio
para las protenas es necesario el taado previo
o tratam iento con aldehidos simples como el
frmico, pirivico o glutrico. Mediante el em
pleo de ciertos reactivos, tales como la bencidi
na bis-diazotizada o el toluene-2-4-isocianato,
con dos grupos funcionales por molcula, se
consiguen uniones covalentes de protenas a la
superficie de los hemates. Es posible tambin,
teniendo en cuenta que en la membrana celular
hay restos de lisina, fijar grupos DNP utilizan
do como reactivo FDNB (fluordinitrobenceno)
(fig. 9-25). Los hemates frescos marcados se
conservan poco tiempo, pero ste puede pro
longarse mediante la formalizacin de los eri
trocitos.

C u ad ro 9-4. Valores aproximados de la con

centracin mnima de anticuerpos detectables
por los diferentes mtodos inmuno serolgic os
M todo
Precipitacin (m edio gelosado)
Precipitacin (m edio lquido)
F ijacin del com plem ento
(100% de lisis)
Fijacin del com plem ento
(50% de lisis)
A glutinacin
H em aglutinacin pasiva
IFI
E LISA
R IA

Anticuerpo
ng m f
20
10
5
0,2
0,4
0,15
0,05
0,01
0,001

Sensibilidad
relativa
1
n
4
100
50 '
133
400
2.000
20.000

P ara los clculos d e sensibilidad re la tiv a se asig n el v a lo r 1 a la

c o rresp o n d ien te a p re cip ita ci n en m ed io g eosado.

La aglutinacin pasiva es un mtodo semicuantitativo que, al igual que la aglutinacin,

perm ite determ inar concentraciones relativas
de anticuerpos sobre la base de la mxima di
lucin aglutinante. Es cuatro veces ms sensi
ble que la aglutinacin y mucho ms aun que
la precipitacin.
Ello es consecuencia del tamao de las par
tculas antignicas que intervienen en la reac
cin. En la precipitacin, el antgeno es mole
cular y se necesitan muchos complejos Ag-Ac
agregados para que la reaccin se visualice, en
tanto que en la aglutinacin pasiva se lo ha
transformado en una partcula de gran tamao,
capaz de dar aglutinados con pocas de ellas. El
nmero de molculas de anticuerpo que inter
vienen en uno y otro caso difiere muchsimo,
de ah la distinta sensibilidad.
La reaccin se efecta colocando en tubos
0,5 mi de las diluciones del suero para valorar y
0,05 mi del antgeno fijado al soporte, que se
agitan para mezclar. Se dejan a temperatura am
biente 18-24 horas y se observan los tubos sin
centrifugar por la parte inferior, para determinar
si ha habido aglutinacin (fig. 9-26). Existen
dispositivos que mediante el empleo de espejos
e iluminacin indirecta permiten ver reflejados
sobre aqullos los fondos de los tubos.
Esta tcnica es muy utilizada en serologa
diagnstica, ya sea bajo la forma de aglutina
cin pasiva directa o midiendo su inhibicin.
Esto sirve para investigar hormonas y antge
nos solubles diversos en sangre, orina y otros
fluidos y especialm ente para el diagnstico
tem prano del embarazo, puesto que en estos
casos hay marcado aumento de gonadotrofina
urinaria: si se mezcla un antgeno constituido
por partculas inertes a las que se les ha fijado
la gonadotrofina y suero antigonadotrofina bi
valente, habr aglutinacin. M ezclando dicho

Reaccin antgeno-anticuerpo in vitro

suero con la orina a analizar, en caso de que s
ta contenga gonadotrofina, el anticuerpo ser
neutralizado, y si luego se aade el antgeno fi
jado al soporte inerte, no habr aglutinacin.
Ello significa que el anticuerpo fue totalmente
neutralizado en la primera etapa y que por lo
tanto la concentracin de gonadotrofina urina
ria es alta, lo que perm ite hacer diagnstico
temprano de embarazo. La aglutinacin hubie
se hecho descartar esa posibilidad. Actualmen
te la aglutinacin pasiva en tubo ha sido susti
tuida por la aglutinacin en policubetas de poliestireno u otros tipos de plsticos.
FIJACIN DEL COMPLEMENTO
En el captulo 22 se ha indicado la cintica
de la inmunohemlisis por accin del comple
mento (C) y el efecto que l ejerce sobre las
m em branas si los antg en o s son c elu lares.
Cuando el sistema Ag-Ac sobre el que acta
son hem ates-hem olisina, produce hem lisis,
originando citlisis o bacterilisis cuando lo
hace sobre sistemas en que los antgenos son
clulas o bacterias. El C se inactiva tam bin
con complejos originados por antgenos solu
bles, pero aqu el fenmeno no es demostrable
en forma directa o por microscopia como ocu
rre en cambio en los casos anteriores.
Teniendo en cuenta la hemlisis que produce
cuando se fija a hemates sensibilizados, en es
pecial glbulos rojos de carnero, se ha ideado
una reaccin serolgica denominada/yacfw del
complemento, la que mediante un sistema indi
cador permite determinar la fijacin de C a cual
quier complejo Ag-Ac, est el antgeno en solu
cin o en suspensin. El reactivo indicador es el
sistema hemoltico -hem ates de carnero y he
molisina-, el que aadido en segunda instancia
al tubo que contiene la cupla que se analiza y C
dar hemlisis o no segn que exista C libre. De
haber C libre, significa cjue no hay correlacin
entre el antgeno y anticuerpo analizado, en tan
to que la ausencia estara indicando que el C ha
sido fijado por el primer sistema y que en este
caso Ag y Ac se relacionan (fig. 9-27).
Para que una reaccin de fijacin del com
plemento funcione correctamente, es indispen
sable que la cantidad de C aadida al primer
sistema reactivo sea igual a la necesaria para
producir el 100% o 50% de lisis del sistema he
moltico, segn se utihcen como punto final de
la reaccin lecturas del 100% o 50% de hem
lisis. De aadirse un exceso de C, la fijacin de
parte de l en la primera etapa de la reaccin
podra no ser detectada por los glbulos rojos
sensibilizados.
Las reacciones de fijacin del complemento
pueden ser cualitativas o cuantitativas. En este

197

ltimo caso slo se valoran cantidades relativas

de anticuerpo, pues al igual que en la aglutina
cin, el ttulo del suero estar dado por la in
versa de la m xim a dilucin que, puesta en
contacto con el antgeno, tenga capacidad para
fijar el complemento. Adems, su em pleo est
limitado por la calidad del anticuerpo, ya que,
como se indic en el captulo 5, hay algunos
que no fijan el C.
Algunas muestras para analizar presentan la
particularidad de fijar el complemento en au
sencia de antgeno. Estos sueros se denominan
anticomplementarios, y ello se debe a que con
tienen gammaglobulina desnaturalizada y agre
gada, que tiene capacidad fijadora del C (vase
cap. 22). Para evitar estos inconvenientes es
n ecesario que los sueros para an a liz a r sean
frescos y mantenidos en refrigeradora por no
ms de 48 horas. En caso de que deban conser
varse por ms tiempo, para evitar los agregados
de gammaglobulina por desnaturaUzacin fsi
ca o contaminaciones, es conveniente aadirles
0,1% de cistena o glicina y 0,01% de Merthio
late. Estas sustancias, a las concentraciones in
dicadas, no interfieren en la reaccin.
Para las reacciones de fijacin del comple
mento es necesario disponer de glbulos rojos
de carnero, hem olisina antiglbulos rojos de
carnero, complemento (suero fresco de cobayo)
y soluciones salinas tamponadas.
Todos estos reactivos deben estar estabihzados y valorados, ya que para cada sistem a hay
una dosis ptima.
Las reacciones cualitativas de fijacin del
complemento con lecturas del 100% de hemo
lisis se efectan colocando en pequeos tubos
cantidades adecuadas de antgeno y suero para
valorar y la dosis de C que es capaz de produ
cir el 100% de lisis del sistem a hem oltico.
Despus de una hora de incubacin a 37C se
agrega la cantidad correspondiente de glbulos
rojos sensibihzados y se vuelve a incubar por
30 minutos. La ausencia de hemlisis indicar
especificidad entre el sistem a A g-A c que se
analiza. Esta mism a reaccin puede transfor
marse en cuantitativa si se hace en varios tubos
con distintas diluciones del suero para valorar.
Teniendo en cuenta que la curva sigmoidal
obtenida cuando se relaciona porcentaje de lisis
con cantidades de complemento demuestra que
la sensibilidad es m xim a para lectu ras del
50% de hemlisis, actualmente las reacciones
de fijacin del complemento se hacen utilizan
do la dosis de ste capaz de producir este efec
to. En estos casos, como se trabaja entre lmites
muy estrechos, es indispensable determ inar,
para las condiciones en que se realiza la prueba
(fijaciones a 37C o 4C, tiempo de incuba
cin), cuntas unidades de com plem ento se
consum en inespecficamente, de m odo que la

198

Aspectos bsicos de la inmunidad

F ig. 9-25. Representacin esquem tica de la hem aglutinacin pasiva. A, lo,s hem ates son sensibilizados por tratam iento
previo con solucin de cido tnico. B, la bencidina bis-diazotizada acta com o ligante del antgeno al hem ate. C, la fija
cin de hapteno al hem ate se consigue directam ente com o consecuencia de la reaccin que se produce entre el FD N B y
los restos de lisina de la m em brana de los eritrocitos.

cantidad para aadir en la reaccin no sea insu

ficiente. Los diferentes sistemas fijan inespec
ficam ente entre 2 y 4 unidades CRj,,; de ah
que las dosis que se han de emplear en las reac
ciones varan entre 3 y 5 unidades.
Para las reacciones cualitativas, las lecturas
se hacen directamente o por simple compara
cin con testigos correspondientes a diferentes
grados de hemlisis del sistema hemoltico. En

F ig . 9-26. H em aglutinacin pasiva. E! tubo de la izquier

da corresponde a una reaccin negativa; en los restantes
tubos pueden observarse distintos grados de positividad.

las cuantitativas, la determinacin de la dilu

cin que da 50% de hemlisis y su inversa, se
hace de manera similar a la indicada en valora
cin de compilemento, ya sea graficando los re
sultados obtenidos -dilucin del suero versus

y
1 - y

, o mediante el empleo de tablas con-

feccionadas sobre la base de x =

que
1 - y.
dependern del valor de 1/n. ste est influido
por la concentracin de hemates del sistem a
hem oltico y volumen de la reaccin; de ah
que cuando se utilicen estas tablas debern res
petarse las condiciones de la reaccin para la
que fueron calculadas.
Para establecer si un anticuerpo activa el .sis
tema complemento por la va alterna, se hace
interaccionar el com plejo A g-Ac con suero
fresco de cobayo (fuente de complemento de t
tulo conocido) en presencia de etilenglicol diam in o tetraactico (EGTA) 10 mM y Mg^+ 2
mM, establecindose despus de 1 hora de in
cubacin a 37C y previa recalcificacin con
Ca^+ hasta 4 mM, el ttulo del complemento re
sidual. Como el EGTA bloquea Ca^+ pero no

Reaccin antgeno-anticuerpo in vitro

199

A gl

KC1

NO LISIS

SH

Reaccin Ag-Ac especfica

Fig. 9-27. R epresentacin esquem tica de una reaccin de fijacin del com plem ento. A g l y A g2 antgenos.- A c l , anti
cuerpo. C , com plem ento, S H , sistem a hem oltico.

Mg^+, si hubo consumo de complemento signi

fica que su activacin tuvo lugar por la va al
terna, ya que el Ca^' es indispensable para que
la va clsica fimcione.
OTROS TIPOS DE REACCIONES
USADAS
Inmunoadherencia
Hace algo ms de medio siglo se describi la
reaccin de la trombocitobarina, que resultaba
de la fijacin de bacterias a plaquetas. Hoy co
nocemos algo ms sobre ese fenmeno, deno
minado inmunoadherencia, que consiste en una
aglutinacin basada en la capacidad que tienen
com plejos antgeno-anticuerpo-com plem ento
de adherirse a la superficie de partculas no
sensibilizadas, tales como glbulos rojos, leu
cocitos, plaquetas y grnulos de almidn. Este
mecanismo fue utilizado para la investigacin
de anticuerpos especficos contra el Treponema
pallidum.
Ha sido observado in vivo y se lo relacion
con la fagocitosis. Se considera que microorga

nismos sensibilizados por sus correspondientes

anticuerpos pueden fijarse a hemates en e! to
rrente circulatorio y ser fagocitados m s fcil
mente. Hoy se sabe que en este proceso inter
vienen receptores celulares para componentes
del complemento, en especial para C3b.
Opsonizacin
Cuando un elemento particulado, ya sea una
bacteria, hemate, etc., penetra en un vertebra
do adulto, es fagocitado por las clulas fagoc
ticas. Las bacterias patgenas tienen en su su
perficie estructuras que hacen que se vuelvan
resistentes a dicha accin. Los neumococos pa
tgenos como consecuencia de la cpsula de
naturaleza poliosdica que los recubre, son dif
cilmente fagocitados, a menos que previamente
hayan estado en contacto con su anticuerpo es
pecfico, Esta accin previa del anticuerpo se
denomina opsonizacin, estando su accin fa
cilitada por C3b, componente del complemento
derivado de C3.
Existen evidencias de que sueros de muchos
anim ales presentan anticuerpos opsonizantes
para numeross bacterias. Probablemente ello

200

Aspectos bsicos de la inmunidad

se deba a contactos previos con esos agentes

infectivos. La sugerencia de que una opsonina
especfica es indispensable para la fagocitosis
de cualquier elemento particulado es objetable,
ya que, si bien su presencia es comprensible en
el caso de las bacterias, resulta difcil de expli
car para partculas inertes. En los captulos 3 y
5 se ha indicado la im portancia que los recep
tores para Fe y C3b expresados en la membra
na de los macrfagos, tienen en los m ecanis
mos de opsonizacin.
Se ha descrito la existencia de protenas sri
cas no especficas opsonizantes. Una de ellas,
sensibilizante de bacterias, no es una gammaglobulina, no acta a 0C, no es
dependien
te ni Mg^+ dependiente, no fija el complemento
y es inactivada por amonaco o hidrazina.
La cantidad de opsonina presente en un sue
ro determ ina su capacidad opsnica o ndice
opsonocitofgico, que se establece estudiando
comparativamente la fagocitosis inducida por
dicho suero y uno normal.
Los anticuerpos citoflicos, con capacidad
para fijarse a receptores particulares de los ma
crfagos, son opsonizantes. For este m ecanis
mo logran que los antgenos retenidos a nivel
de la membrana de estas clulas sean incorpo
rados al citoplasma.
NEUTRALIZACIN O INHIBICIN
DE EFECTO
Cuando un antgeno tiene una actvidad de
fcil medicin, puede ser identificado y cuantificado mediante su neutralizacin por el anti
cuerpo especfico.
Las exotoxinas bacterianas de alto poder toxignico en los animales receptivos no ejercen
su efecto si previam ente han sido mezcladas
con su correspondiente antisuero. Lo mismo
ocurre con los antgenos virales, capaces de
aglutinar eritrocitos de diferentes especies ani
males o de ejercer citopatogenia sobre cultivos
celulares. Ambos efectos pueden ser inhibidos
por el anticuerpo especfico, lo que permite la
identificacin y cuantificacin del nmero de
partculas virales por unidad de volum en del
material analizado.
Uno de los mtodos ms sensibles para la
deteccin de anticuerpos es el de la neutraliza
cin de bacterifagos por sus correspondientes
anticuerpos. Al inhibirse su capacidad infecti
va, no form an placas de lisis cuando se los
siembra en placas de agar juntam ente con la
bacteria sensitiva. Usando diferentes diluciones

de antisuero puede establecerse cul es la que

produce una disminucin del 50% de las placas
de lisis. La inversa de esa dilucin expresar el
ttulo de anticuerpos en el suero.
Otro ejemplo de cuantificacin de anticuer
pos por este mtodo es el dosaje de antiestrep
tolisina O por la inhibicin de la actvidad lti
ca que la estreptolisina tiene sobre los glbulos
rojos de conejo.
BIB L IO G R A FA
1. A xelsen, N. H. "H igh resolution electrophoresis and
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El complejo mayor de histocompatibilidad

y su relacin con la respuesta inmune

i n
M. LEONARDO SATZ

CONCEPTOS GENERALES
El complejo mayor de histocom patibilidad
(CMH) es un locus gentico muy polimrfico
que codifica la expresin de una serie de gluco
protenas que presentan pptidos antignicos
para su reconocimiento por los linfocitos T. El
CMH, llamado HLA en el humano y H-2 en el
ratn, est presente en todos los vertebrados su
periores estudiados hasta el presente. El CMH
fue identificado originalmente por el papel que
juega en el rechazo de los trasplantes. Cuando
se injertan tejidos de un individuo a otro de la
misma especie, la presencia de alelos idnticos
o distintos en los productos codificados por el
CMH, determina la sobrevida del injerto. Hoy
se sabe que las molculas de histocompatbilidad (MHC) presentes en la superficie celular
participan directamente del reconocimiento de
un Ag por parte de los linfocitos T colaborado
res y citotxicos. En este captulo se describe la
estructura y organizacin del sistema H-2 y los
fenm enos inm unolgicos asociados con el
CMH. En el captulo 29 se describe el sistema
HLA, su importancia en los trasplantes y las en
fermedades asociadas con l.
La historia del CMH com ienza en 1903,
cuando Jensen logr propagar 19 veces un car
cinoma murino en su laboratorio, pero fracas
cuando intent trasplantar el mismo tum or a
ratones de otro laboratorio. En 1914 se propu
so la existencia de genes dom inantes como
responsables de la susceptibilidad al trasplante
tumoral y que su rechazo era consecuencia de
mecanismos activos de defensa del husped.
H acia 1933 Landsteiner y Haldane propusie
ron que la inm unidad estaba dirigida contra
aloantgenos presentes en los tejidos, similares

a los de grupos sanguneos, ms q u e contra

Ags tumorales. Estas ideas llevaron a Gorer en
1936 a investigar los Ags presentes en los eri
trocitos de ratn. Mostr la presencia de cuatro
grupos sanguneos, uno de los cuales, el Ag 2,
correlacion su presencia en tumores con cier
tas cepas de ratones que posean el m ism o Ag
2. Asimismo, los ratones que rechazaban el tu
mor tenan altos ttulos de Acs hemaglutinantes contra el Ag 2. En la dcada del 40, Medawar y col. demostraron las bases inmunolgi
cas del rechazo de trasplantes, comparando in
jertos de piel entre animales alogeneieos. Un
ratn de raza A rechaza un injerto de piel de
raza B en aproximadamente 12 das. Si luego
del rechazo se lo desafa nuevamente con piel
B, se produce un rechazo acelerado (7 das).
Esta memoria inmunolgica es especfica: un
desafo con piel C se rechaza a los 12 das y
adems es sistmica: el injerto se rechaza ace
leradam ente con independencia d el sitio de
implante. M edawar demostr tam bin que se
produce el rechazo acelerado si se inyecta pre
viamente al animal con clulas de otros tejidos
(por ej., bazo) del mismo donante. Mitchison
(1957) mostr que la respuesta inm une respon
sable del rechazo acelerado puede ser transfe
rida de ratones vrgenes de tratam iento me
diante clulas linfoides de animales que pre
viamente han rechazado un injerto. H oy se sa
be que el rechazo se produce por una reaccin
inflam atoria mediada por linfocitos T CD4 y
p o r linfocitos T citotxicos CDS. P o r esos
aos, Snell propuso designar como genes y an
tgenos de histocompatibilidad a los responsa
bles del rechazo de tejidos y llam H -2 al lo
cus que codifica para el Ag 2. Emprendi, ade
ms, la tarea de generar cepas de ratones sin-

200

Aspectos bsicos de la inmunidad

se deba a contactos previos con esos agentes

infectivos. La sugerencia de que una opsonina
especfica es indispensable para la fagocitosis
de cualquier elemento particulado es objetable,
ya que, si bien su presencia es comprensible en
el caso de las bacterias, resulta difi'cil de expli
car para partculas inertes. En los captulos 3 y
5 se fia indicado la im portancia que los recep
tores para Fe y C3b expresados en la membra
na de los macrfagos, tienen en los m ecanis
mos de opsonizacin.
Se ha descrito la existencia de protenas sri
cas no especficas opsonizantes. Una de ellas,
sensibilizante de bacterias, no es una gammaglobulina, no acta a 0C, no es
dependien
te ni Mg^+ dependiente, no fija el complemento
y es inactivada por amonaco o hidrazina.
La cantidad de opsonina presente en un sue
ro determ ina su capacidad opsnica o ndice
opsonocitofgico, que se establece estudiando
comparativamente la fagocitosis inducida por
dicho suero y uno normal.
Los anticuerpos citoflicos, con capacidad
para fijarse a receptores particulares de los ma
crfagos, son opsonizantes. Por este m ecanis
mo logran que los antgenos retenidos a nivel
de la membrana de estas clulas sean incorpo
rados al citoplasma.
NEUTRALIZACIN O INHIBICIN
DE EFECTO
Cuando un antgeno tiene una actividad de
fcil medicin, puede ser identificado y cuanti
ficado mediante su neutralizacin por el anti
cuerpo especfico.
Las exotoxinas bacterianas de alto poder toxignico en los animales receptivos no ejercen
su efecto si previam ente han sido mezcladas
con su correspondiente antisuero. I_^o mismo
ocurre con los antgenos virales, capaces de
aglutinar eritrocitos de diferentes especies ani
males o de ejercer citopatogenia sobre cultivos
celulares. Ambos efectos pueden ser inhibidos
por el anticuerpo especfico, lo que permite la
identificacin y cuantificacin del nmero de
partculas virales por unidad de volum en del
material analizado.
Uno de los mtodos ms sensibles para la
deteccin de anticuerpos es el de la neutraliza
cin de bacterifagos por sus correspondientes
anticuerpos. Al inhibirse su capacidad infecti
va, no form an placas de lisis cuando se los
siembra en placas de agar juntam ente con la
bacteria sensitiva. Usando diferentes diluciones

de antisuero puede establecerse cul es la que

produce una disminucin del 50% de las placas
de lisis. La inversa de esa dilucin expresar el
ttulo de anticuerpos en el suero.
Otro ejemplo de cuantificacin de anticuer
pos por este mtodo es el dosaje de antiestreptolisina O por la inhibicin de la actividad lti
ca que la estreptolisina tiene sobre los glbulos
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22. W illiam s, C A y Chase, M W (Ed): M ethods in Im mun o lo g y a n d m m u n o ch e m istry . V o ls l - l l - l l l , IV , V.
A cadem ic Press. N Y ork, 1967, 1968, 1970.

El complejo mayor de histocompatibilidad

y su relacin con la respuesta inmune

i n
M. LEONARDO SATZ

CONCEPTOS GENERALES
El complejo mayor de histocom patibilidad
(CMH) es un locus gentico muy polimrfico
que codifica la expresin de una serie de gluco
protenas que presentan pptidos antignicos
para su reconocimiento por los linfocitos T. El
CMH, llamado HLA en el humano y H-2 en el
ratn, est presente en todos los vertebrados su
periores estudiados hasta el presente. El CMH
fue identificado originalmente por el papel que
juega en el rechazo de los trasplantes. Cuando
se injertan tejidos de un individuo a otro de la
misma especie, la presencia de alelos idnticos
o distintos en los productos codificados por el
CMH, determina la sobrevida del injerto. Hoy
se sabe que las molculas de histocompatbilidad (MHC) presentes en la superficie celular
participan directamente del reconocimiento de
un Ag por parte de los linfocitos T colaborado
res y citotxicos. En este captulo se describe la
estructura y organizacin del sistema H-2 y los
fenm enos inm unolgicos asociados con el
CMH. En el captulo 29 se describe el sistema
HLA, su importancia en los trasplantes y las en
fermedades asociadas con l.
La historia del CMH com ienza en 1903,
cuando Jensen logr propagar 19 veces un car
cinoma murino en su laboratorio, pero fracas
cuando intent trasplantar el mismo tum or a
ratones de otro laboratorio. En 1914 se propu
so la existencia de genes dom inantes como
responsables de la susceptibilidad al trasplante
tumoral y que su rechazo era consecuencia de
mecanismos activos de defensa del husped.
H acia 1933 Landsteiner y Haldane propusie
ron que la inm unidad estaba dirigida contra
aloantgenos presentes en los tejidos, similares

a los de grupos sanguneos, ms q u e contra

Ags tumorales. Estas ideas llevaron a Gorer en
1936 a investigar los Ags presentes en los eri
trocitos de ratn. Mostr la presencia de cuatro
grupos sanguneos, uno de los cuales, el Ag 2,
correlacion su presencia en tumores con cier
tas cepas de ratones que posean el m ism o Ag
2. Asimismo, los ratones que rechazaban el tu
mor tenan altos ttulos de Acs hemaglutinantes contra el Ag 2. En la dcada del 40, Meda
war y col. demostraron las bases inmunolgi
cas del rechazo de trasplantes, comparando in
jertos de piel entre animales alogeneieos. Un
ratn de raza A rechaza un injerto de piel de
raza B en aproximadamente 12 das. Si luego
del rechazo se lo desafa nuevamente con piel
B, se produce un rechazo acelerado (7 das).
Esta memoria inmunolgica es especfica: un
desafo con piel C se rechaza a los 12 das y
adems es sistmica: el injerto se rechaza ace
leradam ente con independencia d el sitio de
implante. M edawar demostr tam bin que se
produce el rechazo acelerado si se inyecta pre
viamente al animal con clulas de otros tejidos
(por ej., bazo) del mismo donante. Mitchison
(1957) mostr que la respuesta inm une respon
sable del rechazo acelerado puede ser transfe
rida de ratones vrgenes de tratam iento me
diante clulas linfoides de animales que pre
viamente han rechazado un injerto. H oy se sa
be que el rechazo se produce por una reaccin
inflam atoria mediada por linfocitos T CD4 y
p o r linfocitos T citotxicos CDS. P o r esos
aos, Snell propuso designar como genes y an
tgenos de histocompatibilidad a los responsa
bles del rechazo de tejidos y llam H -2 al lo
cus que codifica para el Ag 2. Emprendi, ade
ms, la tarea de generar cepas de ratones sin-

202

Aspectos bsicos de ia inmunidad

geneicos o consanguneos, m ediante aparea

mientos repetidos entre hermanos en genera
ciones sucesivas. Utilizando este mtodo de endocra por ms de 20 generaciones, los anima
les terminan siendo idnticos para todos sus
cromosomas. Tambin se produjeron cepas de
ratones congnicos, es decir cepas que slo di
fieren en su H-2 y poseen idntico el resto de
su genoma. La disponibilidad de cepas congnicas y singeneicas permiti, en las dcadas si
guientes, mapear el sistema H-2, identificar sus
genes, sus productos y sus funciones. Permiti
tam bin describir la presencia de genes que
mapean fuera del H-2, cuya disparidad tambin
conduce al rechazo de injertos, aunque en ge
neral el rechazo es ms lento; se los denomina
loci menores de histocompatibilidad.
En la dcada del 70 (ms de 50 aos luego
de su descripcin original como antgenos de
trasplante) surgieron las prim eras evidencias
experimentales que mostraron que los linfoci
tos T requieren para su activacin, del recono
cimiento simultneo del antgeno junto a MHC
presente en la superficie de clulas presentado
ras. Este fenmeno se denomin restriccin en
el reconocimiento T p o r el CMH. En la dcada
del 80 se demostr que, a diferencia de los
Acs, el receptor T (vase cap. 7) interacta con
epitopes secuenciales del antgeno (pptidos
cortos -d e 8 a 20 am inocidos- generados por
procesamiento intracelular) acarreados por las
MHC. Existen dos tipos de MHC que cumplen
esta funcin de presentacin antignica, llama
das M HC de clase 1 y de clase II, que presentan
pptidos antignieos a los linfocitos T CD8 y a
los T CD4, respectivamente.

O RG A N IZA C I N G EN TICA
DEL SISTEMA H-2
El sistema H-2 est ubicado en el cromoso
ma 17, a unos 15 centimorgans (cM) del centrmetro (fig. 10-1). Al principio se crey que
el H-2 codificaba para un solo producto. Los
estudios posteriores mostraron la presencia de
recombinaciones dentro del sistema H-2 y hoy
se conocen varios productos y un gran nmero
de genes presentes en l. Se divide en cuatro
regiones, designadas con las letras maysculas
K, 1, S y D. M ediante inmunizaciones aloge
neicas, se obtuvieron Acs capaces de reconocer
los productos codificados por las diferentes re
giones del PL2 {aloanticuerpos). Estos Acs
fueron utilizados para identificar la expresin
de las MHC en la superficie celular por inm u
nofluorescencia y citotoxicidad m ediada por
complemento, y para su caracterizacin bioqu
mica y funcional. Las regiones K y D codifican
para MHC de clase I y las regiones LA e LE
codifican para MHC de clase IL La regin S
codifica para algunos de los componentes del
sistema complemento y aun cuando sus funcio
nes inmunolgicas no tienen nada que ver con
la de las MHC, algunos autores las denominan
molculas de clase III. Los extremos del H-2,
definidos por las regiones K y D, estn separa
dos por aproximadamente 0,5 cM, que corres
ponderan a unas 1.500 kilobases (kb) de ADN.
A causa del estrecho ligamiento que poseen en
tre s, los alelos presentes en cada locus se here
dan en bloque durante la segregacin de los cro
mosomas homlogos. Es as como la descen
dencia hereda lo que se denomina un haplotipo;

I
Productos

A|3AaE[3

Ecx

C4
SIp

Qa^

TL
Q a,

C.
Bf
Clase

II II II

Fig. 10-1. Productos de los genes de las regiones Q, T y M (vase inform acin en el texto).

Hmt

El complejo mayor de histocompatibilidad

203

C uadro 10-1. Designacin de los productos de clase / y clase II en diversas cepas endocriadas
de ratones
Cepa
Balb/c
AKR
BIO
B 10.D 2
BIO .BR
B IO .HTG
B IO .AQ R

H aplotipo

H -2'

H -2

H -2K
H-2K'-'
H-2K'>
H -2K"

B-2'

H-2K^

H~2*

H -2K
H -2K

H-2

H-2y'

Regiones H -2
I

]-A'
I-A"
I-A^'

1-E"

I-A '
1-A

I-&'

EE'-

H-2Dk

I-A^'

I-E"*

H -2 D '
H -2 D '

I-A

1-Ek
EE

I-Ek

H -2 D '
EI-2D''
H -2D
H -2 D '

En las ce p as re cornbinantes, la letra m inscula que d e s ig n a el ale lo p re sen te en ca d a p ro d u c to es la co rresp o n d ien te de a c u erd o c o n su ori
gen, au n q u e la d esig n ac i n d el hap lo tip o hl-2 de d icha c e p a llev a una letra o d e n o m in ac i n p ro p ia diferente.

0 sea, un conjunto de especificidades que se he

redan juntas. Por otra parte, cabe destacar que la
expresin de estos genes es codominante.
El haplotipo H-2 de una cepa endocriada de
ratones se designa con una letra minscula superscripta al trmino H-2. Por ejemplo, las ce
pas Balb/c y DBA/2 son H-2^ las cepas AKR y
C3H son H-2', la cepa BIO es H-2^ etc. Hay
muchas cepas congnicas construidas sobre el
b a c k g ro u n d B IO . P or eje m p lo , la cep a
B10.D2 es H -2^ la BIO.BR es H-2^ etc. Los
alelos de los productos codificados por las dife
rentes regiones del H-2 tambin se denominan
con una letra m inscula superscripta (vase
cuadro lO-l). Existen cepas recombinan tes que
poseen alelos de un aplotipo en algunos de sus
productos y alelos de otro en los productos res
tantes. Por ejemplo, la cepa BIO.HTG, congnica del BIO, posee alelos d en las regiones K,
1 y S y alelo b en la regin D. Hay cepas que
poseen ms de un suceso de recom binacin
(vanse ejemplos en el cuadro 10-1). Existen
en el cromosoma 17, en posicin telomrica a
la regin D, otros loci que codifican para mol
culas estructuralmente similares a las de clase I
[en las regiones Q, T y M (vase fig. 10-1)].
A lgunos de los productos de estas regiones
pueden presentar pptidos antignicos (vase
ms adelante).
ESTR U CTU RA Y EX PR ESI N
DE LAS M O L C U LA S D E CLASE I
Dentro del H-2, la regin K codifica para la
expresin de una molcula de clase 1 llamada
H-2K. La regin D tambin codifica para la ex
presin de molculas de clase I, aunque su n
mero vara de acuerdo con la cepa de ratn: to
das poseen al m enos una p rotena llam ada
H-2D, mientras que slo algunas cepas expre
san adems protenas llamadas H-2L. La distri
bucin de las MHC de clase I en el organismo
es muy amplia y estn presentes en prctica
mente todos los tejidos incluidos los eritrocitos

y las plaquetas. La densidad de expresin no es

homognea: es ms alta en clulas de tejidos
linfoides y muy baja, por ejemplo, en el hga
do. Estn ausentes en los espermatozoides, en
los primeros estadios embrionarios y en el tro
foblasto, En el hombre no se expresan en los
eritrocitos.
Las MHC de clase I estn constituidas por
dos p o lip p tid o s: una caden a p esad a a , de
aproxim adam ente 340 aminocidos d e longi
tud, glucosilada, de alrededor de 44 kD de ta
mao molecular, asociada no covalentemente a
una cadena liviana llamada p2-microglobulina,
no glucosilada, de aproxim adam ente 12 kD
(fig. 10-2). La cadena a est codificada por ge
nes dentro del CMH, mientras que el gen para
la P2-microglobulina est ubicado en un cro
m osoma distinto (2 en el ratn). La cadena pe
sada posee tres dominios proteicos globulares,
llamados a l , a 2 y a3, que se exponen en la su
p erficie externa de la mem brana plasm tica
(fig. 10-2). Cada dominio posee aproxim ada
m ente 90 aminocidos de longitud, siendo el
dominio a l el que contiene el extremo aminoterminal y el dominio a3 el ms cercano a la
m em brana plasm tica. La molcula contina
con un segmento transmembrnico hidrofbico
de alrededor de 30 a 40 aminocidos de longi
tud y finalmente termina en el interior de la c
lula eon un segmento hidroflico de unos 20 a
30 aminocidos, que contiene el carboxilo ter
minal. Los dominios globulares a 2 y a 3 po
seen su estructura estabilizada por la presencia
de puentes disulfuro de cistenas separadas en
tre s por aproxim adam ente 60 aminocidos.
Las molculas de clase I murinas tienen dos re
siduos de hidratos de carbono, uno en la aspa
ragina de posicin 86 (dominio a l ) y el otro en
la asparagina de posicin 176 (domino a2 ). S
lo el primero est presente en las molculas hu
manas. La [32-microglobulina es un polipptido
globular, estabilizado por puentes disulfuro in
ternos, unido no covalentemente a! dominio a3
de la cadena pesada. No slo es idntica en to
das las molculas de clase I, sino que tambin

204

Aspectos bsicos de ia inmunidad

C la s e I

\\

\\

//

Exterior
M em brana
p lasm tica

P ptido

F ig . 10-2. Estructura de las m olculas de histocom patibilidad. A. Esquem a sim plificado de la organizacin de los dom i
nios estructurales de las m olculas de clase I y clase II. B. Sitio de presentacin de pptidos en una M H C de clase I, segn
la interpretacin de los estudios cristalogrficos, tal coino sera visto por el receptor T. L a flecha indica el extrem o N -ter
minal. L a porcin a -h lice superior y las cuatro lm inas ^ plegadas de la izquierda provienen del dom inio a l ; las otras
cuatro lm inas (3 y el a hlice inferior corresponden al dom inio a l . C. Interpretacin artstica de la m olcula de clase 1 en
la superficie celular.

lo es en todos los individuos de una especie y

es muy conservada entre varias especies.
L os p ro d u cto s H -2K y H -2D p o seen un
enorme polimorfismo poblacional: se conocen
ms de 50 alelos para cada uno de ellos en la
naturaleza.
Las especificidades antignicas presentes en
las MHC de clase I fueron originahnente carac
terizadas por serologa, es decir, m ediante
aloantisueros y posteriorm ente mediante Acs
monoclonales. Tanto los Acs policlonales co

mo los monoclonales, se obtuvieron inm uni

zando apropiadamente diversas cepas de rato
nes con clulas linfoides o injertos de piel pro
venientes de anim ales que difieren en uno o
ms loci del CMH. Los anlisis serolgicos de
mostraron la presencia de determinantes anti
gnicos o epitopes comunes a varias molculas
de clase 1 distintas (ya sea derivadas de distin
tos loci en un haplotipo dado o de un mismo
locus en distintos haplotipos) a las que se llam
especificidades pblicas. Tambin se demos-

El complejo mayor de histocompatibilidad

C u ad ro 10-2. Homologa de la secuencia p ro
teica de diversos antgenos de clase I murinos
(expresada como %)
H -2D '
H-2D''
H-2D'
H-2K'
H-2K"

H-2Li

H -2D

H-2K'

83
81

84

84
80
85

tro la presencia de epitopes tnicos o exclusivos

de una molcula determinada, a los que se lla
m especificidades priv ad as . La inm ensa
mayora de los aloanticuerpos reconocen estas
especificidades aloantignicas en los dominios
a l y a 2 de la cadena pesada. El anlisis bio
qumico de la secuencia de aminocidos de las
cadenas pesadas de clase I y el anlisis de las
secuencias de ADN de los genes de clase I, de
mostraron la existencia de una homologa glo
bal entre los diversos productos, que oscila en
tre el 75% y el 99% a nivel de las protenas.
Precisamente en los dominios a l y a 2 es don
de aparece la mayor variabilidad entre los di
versos productos, mientras que el dominio a3,
que une la (32 micro-globulina, es el ms con
servado. En el cuadro 10-2 se comparan las se
cuencias de aminocidos de varios productos
de clase I murinos. Como se ve claramente, no
existe m ayor hom ologa entre los productos
allicos de un mismo locus (H-2K' y H-2K*)
que la homologa existente entre los productos
de distintos loci de un mismo haplotipo o dis
tinto. As, por ejem plo, H-2K'^ y H-2K'* son
84% homlogos mientras que H-2L^' y H-2D<^
son 85% homlogos. Dicho de otra forma, la
homologa global de los productos determina la
ausencia de caractersticas propias en las mol
culas codificadas por cada regin.
A diferencia de los antgenos H-2K y H-2D,
los productos de los genes de las regiones Q, T
y M (vase fig. 10-1) exhiben un polimorfismo
gentico muy limitado. Estructuralmente, estas
molculas poseen las caractersticas generales
de todos los productos de clase 1: los dominios
a l , 2 y a3 poseen longitud similar; se conser
van las cistenas requeridas para la formacin
de puentes disulfuro; el dominio a3 , que une
p2 microglobulina, muestra una homologa de
90% con el de otros pro d u cto s de clase 1,
mientras que los dominios al y a2 conservan
un 60-80% de homologa. Su funcin biolgica
se discute ms adelante.
E structura tridimensional. En los ltimos
aos se ha determinado la estructura cristalo
grfica de la MHC de clase I murina H-2K' y
de varios alelos de clase I humanos (HLA-A2,

205

HLA-Aw68 y HLA-B27; vase cap. 29). To

dos ellos coinciden en una estructura espacial
que describiremos a continuacin. Los domi
nios a l y a2 se combinan para ensamblar una
estructura de tipo fo sa acanalada, localizada en
la porcin ms externa de la molcula, y que
constituye el sitio de unin de p p tid o s (fig.
10-2). Uno de los surcos est definido por una
estructura de a-h h ce del dominio a l (entre
los aminocidos 50 y 84) y el otro est definido
por una a-hlice del dominio a 2 (entre los resi
duos 138 y 180). La base de la fosa est consti
tuida por ocho lminas 3 plegadas, cuatro apor
tadas por cada dominio. Las dim ensiones de
esta estructura son 25 A de largo x 10 A de
ancho y 11 A de profundidad, que brinda sitio
suficiente para acom odar pptidos pequeos
(menores que 15 aminocidos en alfa-hlices o
pptidos menores en conformacin m s exten
dida). Toda esta estructura estara apoyada so
bre un armazn determinado por los dominios
ms conservados a3 y (32 microglobulina (fig.
10-2). El anlisis comparativo de varios alelos
de clase I muestra que la mayor parte de los re
siduos pohmrficos implican aminocidos lo
calizados en el sitio de unin de pptidos.
Topografa de la unin de p p tid o s a las
M H C de clase 1. Uno de los detalles m s inte
resantes en estos estudios de difraccin de ra
yos X, es el hallazgo de un material electrn
denso en esta fosa acanalada, que co-purifica
con la MHC. El estudio de este m aterial esta
bleci que su naturaleza es ajena a la secuencia
conocida de las molculas de clase I. L os anh
sis cristalogrficos de mayor resolucin, reve
lan imgenes que se interpretan com o nonapptidos presentes en una conformacin exten
dida. Esta observacin es consistente con otros
estudios que caracterizaron a pptidos eluidos
de MHC de clase I purificadas y donde la lon
gitud hallada para los mismos fue tam bin de 9
aminocidos (vase ms adelante). El sitio de
unin de pptidos de la MHC de clase 1 tiene
seis bolsillos (llamados A,B,C,D,E y F), que
interactan con las cadenas laterales del ppti
do unido (fig. 10-3). Los bolsillos A y E, que
definen el extremo derecho e izquierdo del
sitio de unin, estn estructurados por residuos
bastante conservados en la MHC de clase I; es
to determina que los extremos N- y C- de los
pptidos se asocien siempre con A y E respecti
vam ente, y la orientacin de los m ism os sea
siempre la misma. Adems, la longitud preferi
da ser la mnima necesaria para cubrir la re
gin central del sitio de unin y optimizar la in
teraccin de los extremos. La longitud de los
pptidos unidos se defini tanto por mtodos
cristalogrficos como por mtodos bioqumicos
mencionados ms adelante. La figura 10-3 es
quematiza la orientacin de las cadenas latera-

206

Aspectos bsicos de la inmunidad

Bolsillo:

F ig. 10-3. Representacin esquem tica de ia orientacin de las cadenas laterales de un nonapptido unido a una M H C de
clase I. Las posiciones P I , P4 y P5 protruyen hacia el solvente y por ello son accesibles al reconocim iento por el TCR . Las
cadena.s laterales de P2, P3, P6 y P9 m iran hacia el interior del sitio de unin, se acom odan en los bolsillos correspondien
tes y no estn accesibles al TCR. En algunos alelos, son las cadenas laterales de P5 (en vez de las de P6) las que se acom o
dan en el bolsillo C.

les de los aminocidos en un nonapptido uni

do a una MHC de cJase I.
Ligandos peptdicos de las M H C de clase
I. Mediante mtodos bioqumicos se puede pu
rificar grandes cantidades de una determinada
MHC, eluir de ella los pptidos que posee aso
ciados a su sitio de unin y caracterizar la se
cuencia aminoacdica de los mismos. Este an
lisis ya se realiz para ms de diez alelos de
clase I diferentes (cuadro 10-3) y permiti con
cluir que; (a) las MHC extradas de clulas no
infectadas, poseen en su sitio de unin pptidos
derivados de protenas celulares; (b) el 80% de
los pptidos eluidos son de 8-9 residuos y el
20% restante pueden ser m s largos (hasta
10-12 aminocidos); (c) los pptidos unidos a
cada alelo poseen patrones o motivos estructu
rales conservados. Habitualm ente el extremo
C-terminal del pptido (posicin 8 o 9) es un

C u a d ro 10-3. Residuos aminoacdicos crti

cos hallados en pptidos especficos de ciertos
alelos de clase I murinos
P2

P3

P5

P7

P8/9

A lelo de clase I
H -2D '*
H-2D>*
H -2K
H -2K '*
H -2L
H-2K''
Q a-2
H -2M 3

I/L
L/M
L
1/L/V

N
F/Y

y
P
E

r
H

L/I

pptidos N -form ilados

P ara los alelo s in dicados con {*), un 2 0 % d e los pp tid o s son 10-12
am in o c id o s de longitud. E n esto s casos, se o b s e rv a el m ism o am i
n o c id o esp e cfico en la P 10-P 12, en lu g ar de P9- E n el re s to de las
p o sicio n es (P4, P 7, etc.) hay cie rta flex ib ilid ad en cu a n to ai am i
n o c id o q u e p u e d e usarse, a u n q u e hay algunos estric ta m en te p ro h i
b idos; su p re sen cia in h ib e to lah iren te su u n i n a ia M H C .

determinante importante en la especificidad de

la unin. Interactiia con el bolsillo F, cuyo resi
duo 116 es extrem ad am en te p o lim rfico y
afecta a la naturaleza de la unin. Los pptidos
tpicos de cada alelo de clase 1, tambin poseen
un am inocido conservado en la posicin 2,
que interactiia con el bolsillo B. Ocasionalmen
te, algunos alelos exhiben sitios de anclaje
complementarios en la posicin 3 del pptido,
mientras que en otros hay una fuerte selectivi
dad en la posicin 5; curiosamente en estos l
timos no hay restriccin en la posicin 2. El
cuadro 10-3 muestra los motivos estructurales
conservados de los pptidos especficos para
diversas MHC clase I murinas. Considerando
la flexibilidad que permiten ciertas posiciones
de los pptidos, resulta claro que un alelo HLA
dado tendr la capacidad de unir miltiples pp
tidos (se refiere a uno por vez). La totalidad
potencial de pptidos capaces de ser unidos por
un alelo de clase I resultar de aplicar combina
toria de los diversos aminocidos que puedan
ocupar posiciones flexibles. Se estima que un
determinado alelo de clase I puede tener en la
superficie celular, unos 1000 pptidos diferen
tes, con cientos de copias de c/u. La superficie
de una clula tendra unos 10.000 pptidos di
ferentes (exhibidos por diversos alelos de clase
I), de los que 2.000 seran las especies ms
abundantes.
Las restricciones estructurales que poseen
los pptidos en ciertos residuos para poder inte
ractuar con un determinado alelo (as como la
flexibilidad en los aminocidos que pueden ex
hibirse en las otras posiciones) fue confirmada
en muchos casos, preparando pptidos sintti
cos, los que usaron en ensayos de binding a
MHC de clase I purificadas. Todos estos traba
jos permiten identificar y predecir epitopes inm unognicos de antgenos m icrobianos, que

El complejo m ayor de histocompatibilidad

207

GENES DE CLASE I

pueden ser reconocidos por Hnfocitos T citot

xicos; son muy tiles por lo tanto, para el desa
rrollo de vacunas.
B iosntesis. La biosntesis y ensamblado de
una MHC de clase I ocurre en el retculo endo
plasmtico. El correcto plegamiento de la mo
lcula de clase I no .slo requiere de la cadena
liviana p2-microglobulina, sino de la unin de
un pptido en su sitio de presentacin. Ciertas
clulas mutantes con defectos en la capacidad
de generar o traslocar pptidos hacia el retcu
lo endoplasmtico (vase cap. 2), expresan ba
jos niveles de MHC de clase I en la superficie;
estas molculas son inestables (corta vida me
dia) y carecen de pptidos en su sitio de pre
sentacin.
El origen de los pptidos que se incorporan
durante el ensamblado de la molcula de clase
I puede ser bsicamente de tres tipos: (a) Deri
vados de la degradacin de protenas endge
nas propias de las clulas; (b) en el caso de c
lulas infectadas con patgenos intracelulares,
pptidos derivados de protenas extraas o aje
nas a la clula. As, por ejemplo, se ha eluido e
identificado de clulas normales, pptidos co
rrespondientes a protenas celulares abundan
tes, tales como histonas, protenas ribosomales
y de estrs trmico. A partir de clulas infecta
das con determinados virus, se logr eluir y ca
racterizar epitopes peptdicos virales. Los pp
tidos descritos en (a) y (b) utilizan la llamada
va endgena de procesamiento y presentacin
antignica (vase cap. 2). (c) En pequea pro
porcin, los pptidos seal (leader peptide) ge
nerados durante la traslocacin de protenas al
retculo endoplsmico, tambin pueden unirse
a las MHC de clase I.

Estructura
Con el advenimiento de las tcnicas de inge
niera gentica, a principios de la dcada de]
80 se ai.slaron los primeros ADNc de molcu
las de clase I murinas y humanas. Estos clones
fueron utilizados inm ediatam ente p ara aislar
los primeros clones genmicos de clase 1. La
estructura y organizacin de estos g enes fue
determinada al obtener su secuencia de nucle
tidos. Se han secuenciado varias decenas de ge
nes de clase I y todos ellos poseen la organiza
cin que se muestra en la fig. 10-4. Estn cons
tituidos por ocho exones separados entre s por
siete intrones. Los exones se corresponden con
los dominios estructurales presentes en la mo
lcula de clase I (fig. 10-4). El primer exn co
difica para el pptido seal; los exones 2, 3 y 4
codifican los dominios externos a l , a 2 y a3
respectivamente; el exn 5 codifica para el seg
m ento hidrofbico transmembrnico y los exo
nes 6, 7 y 8 codifican el dominio intracitoplsmico.
Organizacin gentica
Adems de los genes que codifican para las
clsicas m olculas H-2K, D y L, el genoma
m urino contiene unos 30-40 genes de clase I
(fig. fO-5). La mayora de ellos m apea en las
regiones Q, T y M. La organizacin molecular
de estos genes est bien estudiada en varias ce
pas de ratones y muestra que el nmero de ge
nes de clase I en las diversas regiones del H-2,
vara en las mismas (vase ms adelante). La

4kb

E4
GEN

u3

Cadena pesadal
de clase I
Aminocidos

E5

E6

E7 E8

3 UT

13

/TM
r"

183

275 /
\
348
315 326 339
CIT

F ig. 10-4. E structura de un gen de histocom patibilidad d clase I. L os exones (E) se indican con rectngulos verdes y los
intrones (I) con rectngulos blancos. En la protena se indican los tres dom inios externos a l , a 2 y a 3 , el transm em brnico
(TM ) y el citoplasm tico (CIT). El exn 1 codifica para el pptido seal (L). El segm ento 3 U T (rectngulo azu l) contiene
secuencias presentes en el A R N m pero ausentes en la protena.

208

Aspectos bsicos de la inm unidad

caracterizacin de cada uno de estos genes se

realiz mediante diferentes tipos de estudios.
En primer lugar, el ADN de los clones genmi
cos fue introducido en fibroblastos de ratn y
su eventual expresin se evalu mediante reac
ciones serolgicas con Acs de la especificidad
apropiada. En segundo lugar, y como se men
cion antes, se determin la secuencia nucleot
dica de muchos de ellos, la que pudo ser com
parada con datos parciales de secuencias aminoacdicas. Finalmente, la posicin relativa de
estos genes en el genoma se determin compa
rando los polimorfismos presentes en cepas de
ratones congnicas recombinantes para las dis
tintas regiones.
La figura 10-5 muestra un esquema de la or
ganizacin de los genes de clase I identificados
en los ratones Balb/c (H-2d). En la regin K se
han identificado dos genes de clase 1, separa
dos unas 15 kb entre s. Uno de ellos corres
ponde al gen que codifica para la molcula H2K. El gen vecino no parece ser funcional. A
unas 75 kb del gen H-2K se halla un gen de
clase II denominado A(33. Este gen fue mapeado en la regin I del H-2 por lo que el gen
H-2K fue orientado hacia la regin 1 y su veci
no hacia el centrmero (fig. 10-5). La presencia
de estos dos genes de clase l en la regin K fue
verificada en varias cepas de ratones.
La regin D del sistema H-2 posee un ntimero variable de genes de clase I. Por ejemplo, las
cepas H-2* y H-2' poseen slo el gen que codi
fica para H-2D, mientras que la cepa H-2' po
see en dicha reg i n cin co genes; uno para
H-2L, otro para H-2D, y otros tres genes no
funcionales (fig. 10-5). Por su posicin hom
loga en el genoma (vecino a la regin Q), H-2L
se corresponde con el gen llamado H-2D en las
cepas que slo poseen un slo gen en esta re
gin.
La regin H-2Q
A menos de 100 kb comienzan los genes de
la regin Q, cuyo nmero oscila entre 5 y 10
segn las cepas de ratones. Se numeran conse
cutivamente y se designa en superscripto la ce
pa correspondiente; por ejemplo, Q P , Q2*, etc.
El haplotipo H-2* posee diez miembros, el H-2^
tiene nueve (carece del Q3) y los ratones H-2*
poseen cinco. Todos ellos estn orientados en
el mismo sentido de transcripcin. Para investi
gar la naturaleza de los productos codificados
por estos genes, stos fueron introducidos en
clulas L de ratn y su expresin se evalu m e
diante antisuers anti Q a2,3. Slo los genes
Q6, Q7, Q8 y Q9 inducen la sntesis de prote
nas reconocidas por dichos sueros en estos fi
broblastos. Algunos de los genes de la regin Q
se presentan de a pares de genes cercanos y ho

mlogos entre s. Por ejemplo, el par Q6-Q7 es

muy similar al par Q8-Q9, no slo en los genes
sino en las regiones que los flanquean. Por
ejemplo, la secuencia nucleotdica de Q7 y Q9
muestra que son 99% homlogos. Se postula
que esta regin ha evolucionado duplicando
pares de genes de clase 1. Por otra parte, las se
cuencias que flanquean a los genes K2-H-2K
en la regin K, son similares a los pares Q6-Q7
y Q8-Q9; esto sugiere que los genes de la re
gin K se generaron por la translocacin de un
par de genes de la regin Q. Cabe recordar que
el ratn es la nica especie de todas las estudia
das que posee genes de clase I a ambos flancos
de los genes de clase II, y que en todas las
otras, los genes de clase II estn en orientacin
centromrica, los de clase I en posicin telomrica y los de clase III entre ambos. Por otra par
te, los alelos de un gen en varias cepas (por ej.,
Q7 en H-2' y H-2') muestran un 99% de homo
loga, consistente con la nocin de escaso poli
morfismo en los productos de esta regin.
Los genes Q5^ Q6^ Q6', Q 7^ Q 7' y 0 9 ^
codifican para una molcula de clase I denomi
nada Qa-2, extremadam ente conservada, que
puede ser reconocida por aloantisueros y por
linfocitos T citotxicos (CTL). Se expresan en
una variada gama de linfocitos y precursores
hematopoyticos. Los genes pueden producir
por splicng o empalme alternativo, dos for
mas; una de ellas se secreta y la otra se expresa
en superficie anclada por enlaces glicofosfatidil-inositol (GPI). El papel biolgico de Qa-2
se desconoce, aunque la molcula posee un si
tio de presentacin de pptidos de naturaleza
sim ilar al de las MHC de clase I clsicas ;
adems, de ella se han eluido y caracterizado
pptidos endgenos, perm itindose definir el
patrn estructural de los mismos (cuadro 10-3).
Q4 codifica para una m olcula denom inada
Qb-1, que tambin es secretada, o expresada en
supert'icie mediante enlaces GPI. QIO codifica
para una protena soluble, sintetizada funda
mentalmente por el hgado. La funcin de estas
molculas se desconoce.
La regin H-2T
Posee entre 15 y 20 genes, segn el haploti
po H-2. Se los designa en forma similar a los
de la regin Q: TL', T2*, etc. Los antgenos TL,
descritos originalmente en timocitos de algunas
cepas y en leucemias tmicas, son producto de
los genes T3' y TI 8'*. Asimismo, el antgeno
Qa-1 es producto del gen T23'. Ambos se de
tectan mediante aloantisueros; Qa-1 tambin
puede ser identificado por CTL. Todas las ce
pas de ratones expresan TL en epitelio intesti
nal, donde pueden presentar pptidos antignicos a linfocitos T gama/delta y activar su cito-

El complejo m ayor de histocompatibilidad

D2

D3

D4

Q1

Q2

Q4

Q5

Q6

Q7

0 8 /9

Q10

...

VA
-

209

' 1500

R e g i n I

T3 T4

T20 T21
T I6T17T 18T 19

T22T23

T24

TI

T6 T6

j / T7 T8 T9

M5 M4 M6

10

20

60

8ii J i

60

70

F ig. 10-5. Esquem a de la organizacin de los genes de clase I m urinos (vase texto).

toxicidad. Los productos de otros genes T tam

bin pueden ser reconocidos por linfocitos T
gama/delta.
M regin H-2M
Posee ocho genes, designados en form a si
milar a los de las regiones Q y T. C uatro de
ellos son funcionales. H -2M 3 codifica para
una molcula que presenta un pptido del ex
tremo N-terminal de una NADH deshidrogena
sa mitocondrial; esta enzim a tiene cuatro v a
riantes allicas y sus expresin sigue la heren
c i a materna. Se demostr luego que M3 puede
unir y presentar eficientemente una variada gaiT ia de pptidos con formil-metionina en su ex
tremo N-terminal, tpicos de procariontes. Al
gunos de estos pptidos pueden ser inmunodo
minantes en la respuesta inmune murina de lin
focitos T CD8 alfa/beta frente a Listeria m o
nocytogenes.
La expresin superficial de H-2M es norm al
mente muy baja y parece deberse a la poca dis
ponibilidad de pptidos endgenos con formilmetionina. La infeccin por bacterias intracelu
lares incrementara la oferta de estos lo que fa
cilitara la expresin superficial de H-2M.
EV O L U C I N D E LOS GENES
DE CLA SE I
Como se mencion antes, los productos de
clase I H-2K y H-2D poseen un enorme pohmorfismo poblacional. En las variantes alli
cas, los cambios se concentran en los dominios
a l y a 2 de la protena. Asimismo, los epitopes
reconocidos por los Acs fueron identificados
analizando su reactividad sobre productos codi
ficados por genes de clase 1 quimricos ; me
diante tcnicas de ingeniera gentica se reem

plaz el segundo o tercer exn de un gen dado

(p. ej, L) por el exn correspondiente de otro
gen de clase 1. Estos genes quimricos se pue
den expresar en el sistema de las clulas L de
ratn, sobre las cuales se estudi la unin de
los Acs. La inm ensa mayora de estos mapea
epitopes en el prim ero o segundo dom inio y
una minora en el tercer dominio.
Los alelos difieren entre s en varios residuos
consecutivos o cercanos y por eso se los desig
na alelos o alotipos complejos, a diferencia de
los alotipos simples presentes en los genes de
globina o citocromo c, que, en general, difieren
en sustituciones puntuales de aminocidos. A
pesar de estas sustituciones mltiples, todas las
molculas conservan un 80-90% de homologa
entre s y no existen secuencias tpicas de lo
cus H-2K o de H-2D. Sobre la base de estas
observaciones, varios investigadores han suge
rid o la existencia de mecanism os especiales
que aseguran un rpido intercambio de la infor
macin entre los genes de clase I de form a tal
de mezclar las secuencias entre s y evitar as
que los genes H-2K y H-2D evolucionen con
caractersticas propias en forma independiente.
Un mecanismo del tipo de la conversin gnica
perm itira la copia de secuencias de un gen a
otro dentro de la familia multigentica y man
tener as la homogeneidad global de las secuen
cias. En la conversin gnica (un mecanismo
slo demostrado hasta el presente en eucariotes
inferiores), un gen A interacta con un gen B
en forma tal que una parte (o toda) de la se
cuencia del gen A se hace idntica a la secuen
cia del gen B (fig. 10-6). En esta interaccin,
los genes A y B conservan su tamaiio e integri
dad y sus localizaciones originales; slo ocurre
una alteracin no recproca en la estructura de
uno de ellos. Los genes A y B pueden ser genes
alelos en crom osom as hom logos, genes no
allicos en un m ism o crom osom a, genes no

210

Aspectos bsicos de la inmunidad

A

C
c
Segregacin

EIZZMD

Apareamiento

rzE
A

Segregacin

A/B

A
A/B

B/A

A/B

/VB

HUZM D

__ D I ^

Segregacin.

3zznnzaD
~a r

MD

A/B

A/B

Segregacin

c = r:-A c iiz z iz z m
A

A/B

A/B

F ig. 10-6, Ejem plo hipottico de la interaccin de dos genes no allicos relacionados, por conversin gnica o Crossing
over desigual.

allicos en crom tides herm anas o un par de

genes relacionados ubicados en distintos cro
mosomas; la interaccin podra ocurrir durante
la meiosis o mitosis. En la figura 10-6 se mues
tra un ejemplo hipottico de la interaccin de
dos genes de una misma familia ubicados en el
brazo largo de un cromosoma. La interaccin
mostrada es la que ocurrira entre cromtides
hermanas. Hay diversos modelos moleculares
para explicar estos mecanismos de copia.
El otro mecanismo posible para mantener la
hom ogeneidad de secuencias en una fam ilia
multigentica es el llamado Crossing over des
igual (fig. 10-6). Aqu, los sucesos involucran
un Crossing over entre dos genes no allicos de
una fam ilia durante la meiosis o mitosis; los
genes que interactan pueden estar en dos cro
mtides hermanas (como en la fig. 10-6) o en
cromosomas homlogos. Como resultado de un
Crossing over desigual, adems de la modifica
cin de secuencias, hay un aumento o una dis
minucin en el nmero de genes de la familia.
La existencia en el sistema H-2 de nmeros va
riables de genes de clase I en las distintas cepas
de ratones constituye una evidencia en favor de
la existencia de mecanismos del tipo de Cross
ing over desigual que permitiran la expansin
y la contraccin de la familia.
Un sisteiTta que ha permitido evaluar el papel
de la conversin gnica en la generacin de po
limorfismo en las molculas de clase 1 es aquel
de los ratones portadores de mutantes de la mo
lcula H-2K'. Estos mutantes fueron identifica
dos cuando, en una cepa endocriada, ocasional
mente un ratn rechaza un injerto de piel de un
hermano. La caracterizacin de estos animales

mostr que con frecuencia hay catnbios en la

secuencia de aminocidos de las MHC de clase
1 o clase IL Los mutantes de H-2K', denomina
dos Kb, poseen varias caractersticas destacables: a) ocurren con una frecuencia relativa
mente alta; b) por lo general involucran a dos o
ms aminocidos vecinos o cercanos entre s,
siendo improbable que dos o ms sucesos de
mutacin puntual ocurran en forma indepen
diente en posiciones tan cercanas; c) a menudo
se observan mutantes idnticos que surgen in
dependientem ente; d) por ltim o y quiz lo
ms importante, casi todos los mutantes poseen
en las posiciones alteradas, residuos presentes
en otras molculas de clase 1. Por ejemplo, en
las posiciones 23 y 24 (dominio a l ) la molcu
la K posee los aminocidos Met-Glu, mientras
que los mutantes K*" poseen lle-Ser en su lu
gar; precisam ente, lle-Ser estn presentes en
esas posiciones en los genes Q7*^, L'*, y D'. En
posicin 89, la molcula Kb posee una Lys y la
mulante K'" tiene Ala en su lugar, al igual que
L*, D'" y D'*. Cabe destacar que el codn para
Lys difiere en por lo menos dos nucletidos del
codn para Ala, por lo que es improbable que
los cam bios hayan ocurrido por m utaciones
puntuales.
Estos y otros ejemplos sugirieron que en el
genoma de la cepa H-2' podran existir otros
genes de clase I que poseen estas secuencias
comunes a otras molculas de clase I y que ser
viran de donantes de ellas para corregir o
cambiar la secuencia del gen H-2K*. Para in
vestigar esta posibilidad, Flavell y col. estudia
ron en detalle la secuencia del gen K"' y en
contraron que difiere de K' en siete nucleti-

El complejo mayor de histocompatibilidad

C u a d ro 10-4. Comparacin de la secuencia
de aminocidos y nucletidos de varios genes
de clase /. Los guiones representan identidad
de la secuencia en esa posicin
Secuencia

Gen
H-2K'>

150
157
GCT GGT CAA GCA GAG AGA CTC AGG
Ala Gly Glu
Ala Glu Arg Leu
Arg
................... -CT .................... TAT TA-

y Q lO '
1-1^2 L'

................... Ala
................... -CT
................... Ala

................ ....Tyr Tyr

.................... TAT TA................ ....Tyr Tyr

dos, que causan el cambio de tres aminocidos.

Luego observaron que uno de los 26 genes de
clase I presentes en el genoma H-2*, el QIO'",
posee exactamente esta secuencia y podra ser
el generador de este cambio, por un mecanismo
del tipo de conversin gnica (cuadro 10-4).
Estos 7 nucletidos sustituidos (que son idnti
cos a los presentes en el gen L'*) estn ubicados
en un tramo de, como mximo, 57 nucletidos,
ya que las secuencias de QIO' y K"difieren por
fuera de este tramo. El gen QIO est ubicado a
una distancia considerable del gen H-2K; por
lo tanto, estos sucesos podran involucrar seg
mentos pequeos de ADN y ocurrir a travs de
grandes distancias en el genoma. Una observa
cin similar se hizo en el caso de la mutante
que posee Phe y Arg en lugar de Tyr y
Cys en las posiciones 116 y 121 respectiva
mente. La secuencia del ADN mostr cambios
de un nucletido en cada codn, separados en
tre s por 15 nucletidos. Se encontr que el
gen Q4 posee exactamente esa secuencia en
esas posiciones y por lo tanto constituye el do
nante potencial para la generacin del mutante
J^bm
Los genes de histocompatibilidad de clase I
(as como tambin los de clase 11) pudieron ha
ber surgido de un ancestro comn a los genes
de inmunoglobulinas, B2-microglobulina y los
antgenos de diferenciacin ThyL CD8 (Lyt2)
y otras molculas pertenecientes a la superfa
milia de las Igs. Las evidencias son las siguien
tes: el tamao de los dominios externos y la
presencia de un puente disulfuro de igual longi
tud es comn a todos estos genes. Las reglas
que gobiernan el splicing o empalme de exones
durante la maduracin del ARNm es la misma
en los genes de Igs y de histocompatibilidad.
Finalmente, las secuencias de ADN del exn 4
(dominio a3 ) de las molculas de clase 1, los
dominios a2 y 32 de las molculas de clase IJ,
la p2-microglolDulina y los exones constantes
de las inm unoglobulinas poseen algunos tra
mos de homologa ancestral.

211

MOLCULAS DE CLASE II
La regin I del sistema H-2 (denominada as
por la presencia de genes de respuesta /nmune
y no de clase 1) est ubicada entre las regiones
K y S y codifica para la expresin de las mol
culas de clase II, I-A e I-E (fig. 10-1). Las mo
lculas de clase II murinas se denominan tam
bin la (asociadas con la regin I). Am bas mo
lculas estn constituidas por heterodmeros,
con una cadena a y una cadena (3 unidas entre
s p o r unio n es no co v ale n tes (fig s. 10-2 y
10-7). Las cadenas que las componen y sus ge
nes respectivos, se ilustran en la figura 10-7 e
incluyen; se designan A a, A(3, E a y E5, y el
alelo de origen se designa con una letra mins
cula superscripta (ej. Aa^*).
Las cadenas A a y E a poseen un tam ao mo
lecular de aproximadamente 31-33 kD a. Estn
constituidas por 230 aminocidos, distribuidos
de la siguiente forma; dos dominios globulares
extracelulares de 84 y 94 aminocidos, un pe
queo tramo hidroflieo de 10 aminocidos que
lleva al segmento transmem brnico (30 ami
nocidos) y el segmento intracitoplsmico (carboxiterminal) de aproximadamente 12 amino
cidos. El segundo dominio posee su estructura
estabilizada por un puente disulfuro de ciste
nas separadas entre s por 56 residuos. Existen
dos sitios de glucosilacin unidos a asparaginas, en las posiciones 78 y 118, de! primero y
segundo dominio, respectivamente.
Las cadenas A(3 y E|3 poseen aproximada
mente 240 aminocidos, distribuidos de la si
guiente forma: dos dominios extracelulares de
95 aminocidos cada uno, un segm ento hidro
fbico transm em brnico de alrededor de 35
aminocidos, y el extremo carboxiterminal de
aproximadam ente 12 residuos. Poseen un solo
sitio de glucosilacin asociado a u n a Asn en
la posicin 20 del primer dominio. E n ambos
dominios externos hay puentes disulfuro entre
cistenas ubicadas unos 60 residuos entre s.
El tamao m olecular de las cadenas p oscila
entre 28 y 29 kO; por lo tanto, la diferencia
entre los tamaos de las cadenas a y 3 se debe
fundam entalmente a diferencias en la glucosi
lacin.
Durante su biosntesis, las cadenas a y 3 se
asocian intracelularm ente entre s y con una
tercera cadena, de alrededor de 31kD, glucosi
lada, denominada cadena Ii o invariante, codi
ficada por fuera del H-2. Las tres cadenas son
transportadas a travs del Golgi y posterior
m ente hacia los endosom as, en don d e el pH
cido y ciertas proteasas disocian la cadena i
del dmero a[3; facilitan as la unin de ppti
dos antignicos generados por la v a exgena
(vase cap. 2). Finalmente las MHC de ciase II
migran a la superficie celular.

212

Aspectos bsicos de la inmunidad

Regin

----------------------------

A -----------

Ab

Pb

Aa

Eb2

Genes

Productos

A ( i|

Ao

l-A
F ig. 10-7. M olculas de histocom patibilidad de clase 11. Cadenas que las com ponen y sus respectivos genes.

Las molculas I-A e I-E pOvSeen una distribu

cin tisular muy limitada: linfocitos B, macr
fagos (y sus equivalentes en varios tejidos) c
lulas de Langerhans, algunas clulas T activa
das. Se ha demostrado que, en la superficie ce
lular de un individuo heterocigota para dos ha
plotipos H-2 distintos, puede ocurrir la trans
asociacin entre las cadenas a de un haplotipo
con las cadenas (3 del otro, tanto para las mol
culas I-A como para las I-E. As, por ejemplo,
un ratn El (H-2*x H-2'^) podr expresar en la
superficie de una clula dendrtica ocho MHC
de clase II diferentes:
I-A:
I-E:

A a7A|3*, AaVA13\ A tfV A p\ AaVA(3>

E a '/E(3^ EaVE(3\ E a /E|3k, EaVE(3'

Los determinantes aloantignicos en las mo

lculas de clase II fueron establecidos por m e
dio de aloanticuerpos monoclonales y pohclonales. Gran parte de los epitopes fueron identi
ficados en las cadenas |3, aunque muchos de
ellos dependen de una interaccin apropiada
con la cadena a correspondiente. A causa de la
trans asociacin de molculas mencionadas an
tes, los individuos F l pueden expresar en las
molculas de clase II determinantes aloantig
nicos ausentes en ambos padres.

Los estudios bioqumicos y moleculares de

las MHC de clase II mostraron que el mayor
polimorfismo reside en las molculas A a , A(3 y
Ep. La comparacin de las secuencias de los
genes E a de los haplotipos k, d u muestra una
homologa > del 98% a nivel de las protenas.
El anlisis comparativo de las secuencias de la
cadena A a de los haplotipos k, d, b, f, u y q,
muestra que stas exhiben una homologa que
oscila entre el 82% y el 93% (cuadro 10-5),
con la mayor parte de los cambios presentes en
el primer dominio ( a l ) de la protena. La com
paracin de las secuencias de la cadena A|3 de
los haplotipos b, d y k, revela una homologa
global de 90-95%, siempre con la mayor parte

C u ad ro 10-5. Comparacin de las secuencias

de aminocidos de varias cadenas A a prove
nientes de diversos haplotipos (expresada co
mo % de disparidad)

b
n

k
q
f

11

14
13
15

12
13
13
8

16
18
14
14
11

E l complejo mayor de histocompatibilidad

de los cambios en el dominio (31. Por ltimo, la
comparacin de las secuencias de los genes E|3
de los haplotipos k, d, b, u j; s, muestra una ho
mologa global del 95%, con los cambio.s con
centrados en el primer dominio.
Cuando se comparan las cadenas E a y A a ,
se observa una homologa de aproximadamente
50%, y entre las cadenas A(3 y EP 60-65%. En
ambos casos existe una sorprendente conserva
cin (~ 80%) en la regin transm em brnica,
cosa que no ocurre en esa porcin de las mol
culas de clase I. Se ha especulado que esta ho
mologa en la regin transmembrnica de las
molculas de clase II sera importante en las in
teracciones de las cadenas a y |3 entre s o con
otras protenas.
G E N E S DE C LA SE II

El anlisis de las secuencias nucleotdicas de

numerosos genes de clase II, permiti estable
cer homologas entre las diversas molculas, ya
descritas en el punto anterior, y revel adems
que los genes E a y Ep son anlogos de los ge
nes D R a y DRp humanos, mientras que los ge
nes A a y Ap son la contraparte de los genes
D Q a y DQP humanos (vase cap. 29).
En los genes de clase II, al igual que en los
de clase I, hay una estrecha correlacin entre
los exones y los dominios proteicos (fig. 10-8).
Los genes a poseen un exn para el pptido se
al; un primer intrn significativamente largo,
de ms de 2kb (similar al gen de P2-microglobulina) y a continuacin los exones para los
dominios extremos a l y a2 ; un tnico exn de
175 n u cletidos co d ifica para el segm ento
transm em brnico y citoplsm ico. E x iste un
cuarto intrn ubicado dentro de la regin 3 no
traducida, dividindola en dos. Los genes P po

213

seen un exn para el pptido seal, dos exones

para los dominios externos, exones individua
les para los dominios transmembrnicos y citoplsmicos y no hay intrones en la regin 3 no
traducida.
Al igual que lo encontrado con las molculas
de clase I, la gentica molecular describi la
presencia de otros genes de clase II, adems de
aquellos que codifican para las molculas I-A e
I-E. La organizacin de estos genes fue estudia
da en varias cepas de ratones y est esquemati
zada en las figuras 10-7 y 10-9. En orientacin
centromrica a Ap, se hallan los genes Pb (pre
viamente designado Ap3) y Ob (antes llamado
AP2). Pb se halla a tan slo 75 kb de H-2K. Re
cibi la designacin de Pb por tener 83% de ho
mologa con el gen humano DPp. Este gen po
see una delecin de 8 nucletidos en el medio
del dominio P2 que produce un corrimiento en
el marco de lectura de los codones durante la
traduccin. Esto provoca la presencia de nume
rosos codones de term inacin, por lo que se
considera que Pb es un seudogn. Esta delecin
est presente al menos en las cepas H-2' y H-2'.
La mayor parte de los genes de clase II han
sido mapeados en un tram o de aproxim ada
mente 200 kb. Ob (antes llamado A p2) posee
un 49-56% de homologa con otros genes p y
se observ su expresin a nivel de A RN m en
los mismos tipos celulares que expresan I-A e
I-E, aunque no se conoce su producto proteico
ni su respectiva cadena alfa. Com parado con
los genes p humanos, en su segundo dominio
es un 83% homlogo con el gen DOp, un pare
cido similar al existente entre los pares I-A/DQ
y DR/I-E. Esto sugiere que han existido ances
tros comunes para cada uno de estos pares, an
tes de la especiacin hombre-ratn.
A unas 20 kb de Ob se halla Ap y a 15 kb de
ste, el gen A a. Estos codifican para el dmero

3UT

TM/CIT
12

- A a, Ea

8kb

TM

CIT
A|3. Ep

Fig. 10-8. Estructura de ios genes a y P de las m olculas de histocom patibilidad de clase 11. Los rectngulos llen o s re
presentan los exones. t^ = exn que codifica para el pptido seal, a l y il = dom inios externos distales (am inoterm inal).
a 2 y |32 = dom inios externos prximo.s a la superficie. TM = transm em brnico, C IT = intracitoplsm ico. 3 U T = regin
3 presente en el A RN m pero ausente en la protena; I = intrones.

214

Aspectos bsicos de la inmunidad

C u ad ro 10-6. Comparacin de las secuencias de parte del dominio 3J de los genes A f,

y
E p . Los guiones representan identidad en la secuencia. La secuencia subrayada muestra el tra
mo mnimo y la lnea de puntos el tramo mximo involucrado en el suceso de conversin gnica
60

AP

Glu Tyr Trp

Asn Ser Gln Pro Glu
lie Leu Glu Arg Thr Arg Ala Glu Leu Asp
GAG TAC TGG AAC AGC CAG CCG GAG ATC CTG GAG CGA ACG CGG GCC GAG CTG GAC

AP*
Ep'

70

Asn
A..

l-A (fig. 10-7) y poseen direcciones de trans

cripcin opuestas, al igual que los otros genes a
y p. A unas 20 kb se ubica el gen Ep, en cuyo
intrn 2 se localiza un punto caliente de re
combinacin; numerosas cepas de ratones que
poseen genes H-2K e I-A de un haplotipo y ge
nes H-2D de otro, y se mape el sitio de recom
binacin exactamente en este intrn. En orienta
cin telomrica, le sigue el gen Eb2, cuyo pro
ducto proteico se desconoce, aunque se transcri
be en algunos tipos celulai'es. Finalmente se ha
lla Ea y este ltimo est a unas 90 kb del gen
C4 (ya dentro de la regin S del H-2).
Ms recientemente, entre los genes Pb y Ob,
se han identificado otros genes, cuyos produc
tos juegan un papel importante en los mecanis
mos de procesamiento y presentacin antigni
ca (fig. 10-9). Los genes LMP2 y LM P7 codifi
can para subunidades catalticas de los proteasomas, implicados en el catabolismo de prote
nas en el citosol celular (vase cap. 2). Los ge
nes TAP] y TAP2 codifican para un heterod
mero que transporta pptidos desde el citosol
h acia el interior del retculo endoplsm ico,
donde ocurre su ensamble con las MHC de cla
se I. Finalmente, los genes Ma y Mb (equiva
lentes de los humanos DMA y DMB) codifican
para molculas que facilitan en los endosomas
la disociacin de la cadena li de las MHC de
clase II y la unin de pptidos generados por la
va exgena (vase cap. 2). Existe una notable
conservacin evolutiva en la organizacin de
estos genes entre el humano y el ratn.
Como hemos mencionado antes, las MHC de
clase II poseen una distribucin tisular muy
restringida. Se ha demostrado, tanto in vitro co
mo in vivo, que el IFN gama induce la expre
sin de novo de molculas de clase II en clu
las que carecen de ellas. Todas las especies de
IFN producen un aumento de la expresin de
molculas de clase 1 en clulas que ya las ex
presan. Ambos efectos involucran un aumento
en los niveles de transcripcin de los respecti
vos genes.

Phe
T..

Gln
A..

Lys
A.

Phe

Gln
A..

Lys
A.

T.

Val
.G.

Las cepas de ratones de los haplotipos b, f, q

y s no expresan molculas I-E en la superficie
y, aunque s poseen cadenas EP en el citoplas
ma, carecen de cadenas E a. Se demostr que,
al menos en la cepa H-2', esto se debe a una
delecin de aproximadamente 600 bases en el
gen E a, que involucra el pptido seal y parte
de la regin 5 que flanquea al gen (regin pro
motora).
P O L IM O R F IS M O Y EV O LU C I N
DE LA R E G I N I D EL H-2
Hay evidencias de que en los genes de clase
II tambin operaran mecanismos del tipo de la
conversin gnica para generar polimorfismo
en sus secuencias. Estas provienen de los estu
dios hechos con los matantes de las cepas H-2'.
Se ha determinado la secuencia nucleotdica del
mutante Ap''^ y se hall que difiere A p' en
tres nucletidos ubicados en un tramo de 14 ba
ses, lo que resulta en el cambio de tres amino
cidos. La secuencia cambiada es la misma que
est presente en ese tramo en el gen Epb, lo que
sugiere que Epb pudo haber sido la secuencia
donante, en un evento evolutivo del tipo de la
conversin gnica. El tramo mnimo involucra
do en la transferencia sera de 14 bases y el m
ximo de 44 bases (vase cuadro 10-6).
Como ya se mencion, existe una homologa
entre todas las cadenas a entre s y las P entre
s. Esto ha sugerido que los diversos productos
gnicos pudieron haber surgido a partir de un
ancestro a y p comn, a partir de los cuales ha
bran evolucionado independientem ente cada
locus.
Las subregiones l-A e I-E del H-2 haban si
do separadas por estudios de gentica clsica,
con la obtencin de cepas recombinantes de ra
tones que poseen alelos distintos en las molcu
las I-A e I-E. Como se mencion antes, el anli
sis molecular de varias de estas cepas recombi
nantes demostr que en todas ellas el sitio de

El complejo m ayor de histocompatibilidad

recombinacin involucra el gen Ep, cuya por
cin 5 mapea dentro de I-A y su porcin 3
dentro de 1-E (fig. 10-7) y que el sitio caliente o
hot spot en la recombinacin ocurre en el se
gundo intrn, que separa los dominios p l y p2.
Este hallazgo tiene importantes implicaciones
en l o s mecanismos evolutivos que operan en la
generacin de polim orfism o en estos genes.
Steirnmetz y col. compararon las secuencias de
A D N dentro de la regin I de las cepas Ji, d y
una cepa salvaje
mediante la ubicacin
de sitios reconocidos por nucleasas de restric
cin. Observaron un alto grado de polimorfismo
en el ADN desde el gen Ep hacia el centrmero
(hacia la izquierda del mapa) y una gran con
servacin de las secuencias desde Ep hacia la
regin S (derecha del mapa). Esto es consis
tente con el conocido escaso polimorfismo del
gen E a , Slp y C4 (de la regin S; vase ms
adelante). Nuevamente, estas observaciones su
gieren la existencia de mecanismos especiales
para la evolucin de estas secuencias.
Entre las subregiones I-A e I-E del H-2, la
gentica clsica mape la presencia de la lla
mada subregin I-J. La inmunizacin cruzada
entre cepas dispares en esta regin, genera Acs
que reconocen una sub poblacin de linfocitos
T supresores y factores solubles con activida
des supresoras, derivados de ellos. Ya que el
punto de recom binacin entre I-A e I-E fue
ubicado en el segundo intrn del gen Ep, no
existe espacio fsico para localizar la subregin
I-J. Cuando se us ad gen Ep para evaluar la
presencia de ARNm complementarios a l en
clulas T supresoras (I-J+), no se los hall. For
lo tanto, el m apa fsico no concuerda con el
mapa gentico de la subregin; alternativamen
te los genes para I-J mapean por fuera del H-2.
Evidencias en favor de esta posibilidad surgen
del reciente hallazgo que las cepas originales
que permitieron definir esta subregin, difieren
en otras porciones del genoma, adems de la
regin H-2. Una mejor caracterizacin bioqu
mica de estas molculas permitir aclarar estas
discrepancias.

REGIN S
La regin S (tambin denominada regin de
clase III) est ubicada entre las regiones I y D
del sistema H-2 (fig. 10-1). Esta regin ha sido
bien caracterizada por clonado molecular y es
similar en el humano y en el ratn (fig. 10-10).
En un tramo de alrededor de 200 kb se hallan
los genes que codifican para los componentes
del complemento C2, Bf, C4, Slp y para la 21
hidroxilasa (210H).
C4, uno de los com ponentes del sistem a
complemento (vase cap. 22) y Slp, una mol

215

cula estructuralm ente relacionada a C 4, son

glucoprotens que circulan en sangre perifri
ca. Su actividad biolgica es diferente. C4 est
presente en la circulacin de todas las cepas de
ratones, es activa su participacin en la activa
cin de la cascada del complemento (C3 con
vertasa y sustrato para C lq ) y es sintetizada en
el hgado y macrfagos. Slp slo est presente
en determinadas cepas de ratones, en algunas
de las cuales sus niveles dependen de los nive
les de testosterona. No participa en la cascada
del complemento y su funcin exacta se desco
noce. Los genes para C4 y Slp ocupan aproxi
madamente 15-20 kb, estn separados p o r unas
70 kb y son 96% hom logos entre s. En el
hombre estas dos formas de C4 son activas y
corresponden a los isotipos Rodgers y Chido.
Vecinos a cada uno de los genes C4 y Slp (a
4 kb de distancia) se hallan los genes 210HA y
210HB, respectivamente. Codifican p a ra una
protena de 52 kD con actividad de citocromo
P450, que participa en la hidroxilacin de este
roides adrenales. El gen 210HA es transcripcio n alm en te m ucho ms activo que el gen
210HB en la adrenal murina. La presencia de
un gen 21 OH vecino a cada gen C4 sugiere que
stos se originaron a partir de la duplicacin de
dos genes ancestrales. Los P450 comprenden
una familia amplia de enzimas conocidas como
monooxigenasas especializadas en la oxidacin
de sustratos hidrofbicos. El ligamiento de ge
nes absolutamente no relacionados, com o los
de 21 OH y C4, pareciera que es accidental y no
posee alguna implicancia funcional obvia.
Cercanos a la regin H-2I, se hallan los ge
nes para C2 y Bf. Son glucoprotens de 102
kD y 90 kD respectivamente, con estructura y
funcin similares. Son serina proteasas respon
sables de la actividad proteoltica de las C3 y
C5 convertasas de las vas clsica y alterna de
activacin del com plem ento (vase cap. 22).
Los genes poseen cierta homologa (37 %) y se
postula que pudieron haber surgido de un an
cestro comn, por una duplicacin m uy ante
rior a la que origin a los pares de C4 y 210H,
Se ha especulado que la estrecha cercana de
ambos (menos de 1 kb) les ha permitido evolu
cionar juntos y adquirir la especializacin fun
cional que poseen en ambas vas del comple
mento.
RESPUESTA INMUNE CONTRA
MOLCULAS DE

HISTOCOMPATIBILIDAD
Como vimos antes, si se trasplanta piel (o
cualquier rgano) entre dos animales histoin
compatibles (que poseen alelos de histocompa
tibilidad diferentes), los linfocitos T CD4 y

21 6

Aspectos bsicos de la inmunidad

Regin

Pb

Ob

Ab

Aa

Eb

Eb2

Ea

Genes

Mb2

Mbl

LMP2

TAP1

LMP7

Genes

l'J
F ig. 10-9. O tros genes de clase II ubicados entre los genes Pb y Ob.

CDS reconocen como extraas a las MHC del

donante, producen una intensa reaccin infla
matoria y destruyen a las clulas extraa.s. Las
clulas T CD4 y CDS reconocen a las molcu
las de clase II y clase I extraa.s, respectiva
mente. La respuesta inm une contra las MHC
extraas se denomina respuesta alogeneica. In
vivo, la respuesta incluye adems la sntesis de
anticuerpos contra las MHC ajenas (aloanticuerpos).
Esta reaccin puede evidenciarse y reprodu
cirse in vitro, en el llamado cultivo mixto linfo
citario (cuadro 10-7). Si se mezclan en un sis
tema de cultivo, linfocitos proveniente de dos
animales alogeneieos, las clulas T CD4 res
ponden con una intensa proliferacin y libera
cin de mediadores al reconocer molculas de
clase II extraas, presentes sobre la superficie
de clulas que estimulan (linfocitos B, clulas
dendrticas). Adems, las clulas T CDS se ac
tivan al reconocer molculas de clase I extraas
sobre la superficie de todas las clulas ajenas.
Adems de este reconocimiento directo de las
MHC extraas por el receptor T, se ha demos
trado que las MHC ajenas pueden ser procesa

das y presentadas por MHC propias: esto se de

nomina reconocimiento indirecto de aloantge
nos. En el cultivo mixto, si las cepas slo difie
ren en MHC de clase I, la proliferacin ser es
casa, aunque s se generarn efectores citotxi
cos CDS (cuadro 10-7).
La frecuencia de linfocitos T que responden
en un cultivo mixto linfocitario es de alrededor
de 0.2%, varios rdenes de magnitud mayor
que los que responden a un antgeno conven
cional. Esto explica la magnitud de la respuesta
en el cultivo mixto.
En numerosos y elegantes experimentos se
ha demostrado que un mismo clon de linfocitos
T que responde especficamente ante un ppti
do presentado por una M HC propia, puede
eventualmente responder y proliferar ante una
clula alogeneica, en ausencia aparente del
pptido especfico. Ms aun, se ha demostrado
Ibrmalmente, que es la misma molcula del re
ceptor T la responsable del reconocimiento en
ambos casos. Se ha hipotetizado la existencia
de una suerte de reactividad cruzada entre el re
conocimiento de la MHC propia + pptido y la
molcula de histocompatibilidad ajena. Sin em-

C u a d ro 10-7. Respuestas en el cultivo mixto linfocitario p or M H C alogeneicas de clase I y

clase 1
D isparidad en las M H C entre las clulas
que e.nimulan y las que responden
Clase I

Cla.se II

Proliferacin

S
S
NO

S
NO
S

++++
+
+++

Las c lu la s efectoras son de fe n o tip o C D 4 y re co n o ce n M H C d e c la se II alo g en eicas

Las c lu la s efecto ras son de fe n o tip o C D S y re co n o ce n M H C de clase I alogeneicKs

Produccin
de citocinas

E fectores citotxicos

+ ++ +

++++'=

+ ++'

+>

E l complejo mayor de histocompatibilidad

C2

20

SIp

BF

40

60

217

I21OHBI

100

120

140

160

180 Kb

Fig. O-10. O rganizacin genm ica de la regin S del sistem a H -2. L os genes estn representados por rectn g u lo s y sus
tam aos y distancias que los separan estn en escala. El gen C2 lim ita con la regin H-21 y el gen 2 1 0 H B con la regin
H-2D. Las flecha.s indican las direcciones de transcripcin.

bargo, han surgido en los ltimos aos numeros'ds evidencias que sugieren que el TCR no re
conoce MHC desnudas o vacas, sino MHC
que acarrean pptidos. En el reconocimiento
alogeneico directo, estos pptidos derivaran de
p rotenas endgenas de la clula y podrn
eventualmente ser especficas de un tejido. Se
ha demostrado que algunos clones de linfocitos
T CD4 aloreactivos proliferan ante una mol
cula de clase II alogeneica expuesta en la su
perficie de linfocitos B, pero no cuando la mis
ma molcula est sobre monocitos o fibroblas
tos. Esto implica que la especificidad fina de
este clon T reconoce la molcula de clase II
junto a un pptido especfico de linfocitos B y
derivado de una protena que estara ausente de
monocitos o fibroblastos. Otros clones T res
ponden igualmente cuando el aloantgeno est
sobre diversos tipos celulares y en este caso se
reconocera un pptido derivado de una prote
na celular presente en varios linajes.
Estas y otras evidencias son consistentes con
la hiptesis que la respuesta alogeneica directa
se produce contra antgenos celulares (por ej.,
estructurales) presentados por molculas aloge
neicas, asociaciones contra las cuales un indivi
duo no es tolerante, pero que s es tolerante a
esos autoantgenos presentados por molculas
propias. La gran magnitud de la respuesta en el
cultivo mixto se explicira segn esta nocin,
por la enorme cantidd de clones T que tendran
la capacidad de reconocer las diferentes combi
naciones entre pptidos tisulares -1- molculas
HLA alogeneicas (com binaciones co ntra las
cuales uno no es tolerante). Ms aun, por el pro
pio polimorfismo de las MHC, las molculas
alogeneicas no necesariam ente acarrearn los
mismos pptidos tisulares que aquellos presen
tes en las MHC propias; a stas ltimas seremos
tolerantes, pero no a las primeras! Esto aumenta
la magnitud de la respuesta. Finalmente, a esto
debe agregarse la contribucin de la respuesta
indirecta donde los aloantgenos procesados son
re-presentados por las MHC propias.
FUNCIONES DE LAS MOLCULAS
D E HISTOCOMPATIBILIDAD
Es evidente que la funcin biolgica esencial
de las MHC no es la de impedir trasplantes alo

geneicos. A com ienzos de la dcada del 70

surgieron varias evidencias independientes que
demostraron la participacin de las mism as en
el reconocimiento de antgenos convencionales
por parte de los hnfocitos T (el fenmeno lla
mado restriccin por el complejo mayor de his
tocompatibihdad).
Hoy est claro el papel de las M H C en la
presentacin de pptidos generados por el pro
cesam iento intracelular (cap. 2). Ms aun, es
p o sib le incubar in vitro M HC con pptidos
apropiados, m edir su afinidad, su cintica de
asociacin y ensayar su actividad biolgica por
su capacidad para activar linfocitos T. Se ha
demostrado que la unin tiene lugar con cinti
cas de asociacin y sobre todo disociacin len
tas (tl/2 = 30 hs), con constantes de afinidad
moderadas del orden de 10'" M *. Las cinticas
de asociacin obtenidas al ensayar la unin de
pptidos a clulas, revelaron ser ms rpidas.
La lenta disociacin sugiere que, una vez uni
do, el complejo pptido-molcula de histocom
patibilidad de clase II sera relativamente esta
ble; si se garantiza la presencia de este comple
jo sobre la superficie de la clula presentadora
durante un tiempo prolongado, se favorece el
encuentro con un linfocito T de especificidad
apropiada.
Para modelos en donde una misma molcula
de clase II es capaz de unir diversos pptidos,
los estudios de com peticin han sugerido la
existencia de un slo sitio de unin. Las imge
nes cristalogrficas de las MHC han confirma
do esta nocin.
En num erosos sistem as se ha dem ostrado
que determinados alelos de clase I o clase 11
sirven o no sirven para presentar ciertos
pptidos antignieos. Esto explica los primeros
estudios in vivo que mostraron que ciertas ce
pas de ratones son buenos respondedores y
otros malos respondedores a un antgeno da
do y que los genes que regulan esto mapean en
el sistema H-2. Esto ha permitido asignarle a
los genes de histocompatibilidad el nombre de
genes de re.spuesta inmune. La caracterizacin
de ligandos peptdicos naturalm ente hallados
en las MHC y los ensayos de unin in vitro a
M H C purificadas, confirm an que u n a buena
respuesta depende en primer lugar de la capaci
dad del pptido de unirse a una determinada
MHC.

218

Aspectos bsicos de la inmunidad

En la mayora de las especies donde fue es

tudiado, el sistema mayor de histocompatibili
dad es extremadamente polimrfico. En aque
llas especies donde el p o lim orfism o de las
MHC es [imitado, las protenas implicadas en
el p ro c e s a m ie n to (L m p2y7) y tra n s p o rte
(Tapl/2) de pptidos antignicos hacia el inte
rior del retculo, contribuyen con un moderado
polimorfismo, en la seleccin de los epitopes
presentados. Se ha postulado que todo este po
limorfismo y la rpida evolucin de este siste
ma, evitara la aparicin de un patgeno per
fecto que pueda evitar una adecuada presenta
cin por una MHC, o que pueda mimetizar uno
de ellos y evadir as el reconocimiento inmune.
La presentacin antignica sobre superficies
celulares m ediada por las MHC, pudo haber
evolucionado como un mecanismo especializa
do de los hnfocitos T, ya que la funcin de es
tas clulas siempre est asociada a la interac
cin con clulas presentadoras de antgeno: la
activacin de linfocitos B y la activacin de
clulas inflamatorias por la accin directa de
citoquinas. La utilizacin de dos MHC dife
rentes (clase I y clase II) quiz haya surgido
como consecuencia de una especializacin de
las poblaciones T: los CTL CD 8 -1- no pueden
eliminar bacterias y sus toxinas (funcin reser

vada a los T CD4 inductores y su efecto poste

rior sobre linfocitos B) sino que deben focali
zar su respuesta citotxica sobre cuakjuier c
lula del organismo que exhiba en sus MHC de
clase I pptidos tumorales o de patgenos in
tracelulares.
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Molculas de adhesin

MARCELA A. MANGHI

IN TRO D U C CI N
Hasta hace poco tiempo, el endotelio vascu
lar era considerado como un tejido que cubra
los vasos sanguneos cuya funcin slo era la
de prevenir la coagulacin sangunea y separar
el espacio vascular de los tejidos. Las clulas
endoteliales fueron consideradas menos acti
vas, menos complejas y menos interesantes que
muchos otros tipos celulares.
Hoy se sabe que el endotelio vascular parti
cipa activam ente en una amplia variedad de
procesos fisiopatolgicos que incluyen infla
macin e inmunidad. El intenso estudio de los
mecanismos moleculares de la adhesin de los
leucocitos al endotelio permiti identificar, ca
racterizar y clonar mltiples molculas acceso
rias en la superficie de la clula endotelial que
soportan la adhesin a travs de una interac
cin con ligandos especficos sobre los leucoci
tos facilitando su trfico.
MOLECULAS ACCESORIAS
La superfamilia de las integrinas
La familia de las integrinas incluye ms de
20 heterodmeros de superficie celular, diferen
tes pero estructuralm ente relacionados, com
puestos de cadenas a y |3 unidas en forma nocovalente. Estas molculas intervienen en la
adhesin de clulas a protenas de la matriz ex
tracelular (ECM) y en las interacciones clulaclula. Se conocen 8 subunidades |3 y 14 subu
nidades a. Varias integrinas que utilizan la ca
dena p, han sido denominadas antgenos VLA
(very late after activation) dado que dos de los
primeros miembros de este grupo aparecen so

bre los linfocitos despus de su activacin. Sin

em bargo, dado que la m ayora de las clulas
del cuerpo expresan por lo menos una de las in
tegrinas p i en forma constitutiva y puesto que
algunas de las cadenas pueden estar combina
das con otras subunidades p, la nomenclatura
VLA dej de ser apropiada y ha sido reempla
zada por la nomenclatura a P (vanse cuadros
11-1 y 11-2).
La funcin general de los miembros de la fa
m ilia de las integrinas es interactuar con una
amplia variedad de ligandos incluidos glucoprotenas de la ECM , componentes del comple
m ento, y otras clulas integrando el medio
ambiente extracelular con el citoesqueleto. Si
bien las 8 cadenas P y las 14 cadenas a podran
tericamente dar origen a ms de 100 heterod
meros, la diversidad real es mucho m s restrin
gida dado que muchas cadenas a se asocian con
una nica cadena p y que otras cadenas a (por
ej., av ) se asocian con varias cadenas P diferen
tes. Las integrinas individuales pueden unir ms
de un ligando, y los ligandos individuales pue
den ser reconocidos por ms de una integrina
(cuadro 11-1). Algunas de las integrinas pueden
reconocer protenas integrales de m em brana
pertenecientes a la superfamilia de las inmunoglobulinas (ICAM-1, 2, 3 y VCAM-1) y mediar
la adhesin directa clula-clula.
Las integrinas intervienen en la adhesin c
lula-clula y clula-matriz en muchos procesos
fisiolgicam ente importantes: desarrollo em
brional, hemostasis, trombosis, cicatrizacin de
heridas, mecanismos de defensa inm une y noinmune, y transformacin oncognica.
De acuerdo a sus caractersticas estructura
les, las integrinas pueden ser divididas en va
rios subgrupos. Un grupo que sufre clivaje postranslacional de la cadena a , y otro grupo que

218

Aspectos bsicos de la inmunidad

En la mayora de las especies donde fue es

tudiado, el sistema mayor de histocompatibili
dad es extremadamente polimrfico. En aque
llas especies donde el p o lim orfism o de las
MHC es [imitado, las protenas implicadas en
el p ro c e s a m ie n to (L m p2y7) y tra n s p o rte
(Tap 1/2) de pptidos antignieos hacia el inte
rior del retculo, contribuyen con un moderado
polimorfismo, en la seleccin de los epitopes
presentados. Se ha postulado que todo este po
limorfismo y la rpida evolucin de este siste
ma, evitara la aparicin de un patgeno per
fecto que pueda evitar una adecuada presenta
cin por una MHC, o que pueda mimetizar uno
de ellos y evadir as el reconocimiento inmune.
La presentacin antignica sobre superficies
celulares m ediada por las MHC, pudo haber
evolucionado como un mecanismo especializa
do de los hnfocitos T, ya que la funcin de es
tas clulas siempre est asociada a la interac
cin con clulas presentadoras de antgeno: la
activacin de linfocitos B y la activacin de
clulas inflamatorias por la accin directa de
citoquinas. La utilizacin de dos MHC dife
rentes (clase I y clase II) quiz haya surgido
como consecuencia de una especializacin de
las poblaciones T: los CTL CD 8 -1- no pueden
eliminar bacterias y sus toxinas (funcin reser

vada a los T CD4 inductores y su efecto poste

rior sobre linfocitos B) sino que deben focali
zar su respuesta citotxica sobre cualcjuier c
lula del organismo que exhiba en sus MHC de
clase I pptidos tumorales o de patgenos in
tracelulares.
B IB L IO G R A F IA
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Molculas de adhesin

MARCELA A. MANGHI

IN TRO D U C CI N
Hasta hace poco tiempo, el endoteUo vascu
lar era considerado como un tejido que cubra
los vasos sanguneos cuya funcin slo era la
de prevenir la coagulacin sangunea y separar
el espacio vascular de los tejidos. Las clulas
endoteliales fueron consideradas menos acti
vas, menos complejas y menos interesantes que
muchos otros tipos celulares.
Hoy se sabe que el endotelio vascular parti
cipa activam ente en una amplia variedad de
procesos fisiopatolgicos que incluyen infla
macin e inmunidad. El intenso estudio de los
mecanismos moleculares de la adhesin de los
leucocitos al endotelio permiti identificar, ca
racterizar y clonar mltiples molculas acceso
rias en la superficie de la clula endotelial que
soportan la adhesin a travs de una interac
cin con Hgandos especficos sobre los leucoci
tos facilitando su trfico.
MOLECULAS ACCESORIAS
La superfamilia de las integrinas
La familia de las integrinas incluye ms de
20 heterodmeros de superficie celular, diferen
tes pero estructuralm ente relacionados, com
puestos de cadenas a y |3 unidas en forma nocovalente. Estas molculas intervienen en la
adhesin de clulas a protenas de la matriz ex
tracelular (ECM) y en las interacciones clulaclula. Se conocen 8 subunidades |3 y 14 subu
nidades a. Varias integrinas que utilizan la ca
dena p, han sido denominadas antgenos VLA
(very late after activation) dado que dos de los
primeros miembro,s de este grupo aparecen so

bre los linfocitos despus de su activacin. Sin

em bargo, dado que la m ayora de las clulas
del cuerpo expresan por lo menos una de las in
tegrinas p i en forma constitutiva y puesto que
algunas de las cadenas pueden estar combina
das con otras subunidades p, la nomenclatura
VLA dej de ser apropiada y ha sido reempla
zada por la nomenclatura a P (vanse cuadros
11-1 y 11-2).
La funcin general de los miembros de la fa
m ilia de las integrinas es interactuar con una
amplia variedad de ligandos incluidos glucopro
tenas de la ECM , componentes del comple
m ento, y otras clulas integrando el medio
ambiente extracelular con el citoesqueleto. Si
bien las 8 cadenas P y las 14 cadenas a podran
tericamente dar origen a ms de 100 heterod
meros, la diversidad real es mucho m s restrin
gida dado que muchas cadenas a se asocian con
una nica cadena p y que otras cadenas a (por
ej., av ) se asocian con varias cadenas P diferen
tes. Las integrinas individuales pueden unir ms
de un ligando, y los ligandos individuales pue
den ser reconocidos por ms de una integrina
(cuadro 11-1). Algunas de las integrinas pueden
reconocer protenas integrales de m em brana
pertenecientes a la superfamilia de las inmunoglobulinas (ICAM-1, 2, 3 y VCAM-1) y mediar
la adhesin directa clula-clula.
Las integrinas intervienen en la adhesin c
lula-clula y clula-matriz en muchos procesos
fisiolgicam ente importantes: desarrollo em
brional, hemostasis, trombosis, cicatrizacin de
heridas, mecanismos de defensa inm une y noinmune, y transformacin oncognica.
De acuerdo a sus caractersticas estructura
les, las integrinas pueden ser divididas en va
rios subgrupos. Un grupo que sufre clivaje postranslacional de la cadena a , y otro grupo que

220

Aspectos bsicos de la inmunidad

Cuadro 11-1. Nombres alternativos _yligandos de las integrinas

C adena a

C adena i

N om bres alternativos

al
al
a2
a3
a4
a4
aS
a6
a6
a7
a8
aL
aM
aX
a l lb

pl
pl
pi
pl
57
p)
pi
p4
pi
pi
P2
P2
P2
p3
p3

C D 49a/C D 29, VLA-1

C D 49b/C D 29, V LA -2, [a/IIa
C D 49c/C D 29, LV A -3
C D 49d/C D 29, V LA -4, LPAM ^2
C D 49d/-,L P A M -l
C D 49e/C D 29. V LA -5, Ic/Ha
CD497CD29, VLA-6, Ic/Ila
C D 4 9 f/-.
-/C D 2 9
-/C D 2 9
C D H a /C D 18, LFA-1
C D Ilb /C D l8 , M A C-1, CR3
C D Ilc /C D lS , P150/95, CR4
C D 4 I/C D 6 I
CD 51/CD 61

aV
aV
aV
aV
a lE L

pi
P5
p6
ps
p7

C D 51/C D 29
C D 5 1 /C D 5 1 /C D 5 1 /H M L -I,M 2 9 0

Ligando
Colgeno, lam inina
Colgeno, lam inina
Fibronectina, lam inina, colgeno
F ibronectina, V C A M -1
Fibronectina, V C A M -1, H EV cercanas a las placas de P eyer
Fibronectina
Lam inina
L am inina (?)
L am inina
(?)
CA M -1,2,3
C 3bi, fibringeno, factor X, lCAM -1
C3bi, fibringeno
F ibringeno, fibronectina, vitronectina, throm bospondina
V itronectina, fibringeno, throm bospondina, fibronectina, osteopontina
V itronectina, fibronectina
V itronectina
Fibronectina

H EV cercanas a las placas de Peyer

contiene dominios de 180 a 200 aminocidos,

llam ado dom in io s I (in se rtiv o -in te ra c tiv o )
(cuadro 11-2). Las cadenas a clivadas estn
compuestas por un dominio transmembrana de
25-30 KD unido por unin disulfuro a una ca
dena ms larga totalmente extracelular. En ca
da cadena a hay 18 a 24 cistenas, y 14 a 16 de
ellas estn conservadas en todas las subunida
des a conocidas. El dominio I est compuesto
por 180 a 200 aminocidos insertados a partir
del aminocido 130.

Las cadenas p i, 52 y 53 humanas han sido

clonadas y completamente secuenciadas. Ellas
son semejantes en un 44% a 47% y conservan
las 56 cistenas. Hay una alta conservacin de
las cadenas p, a travs de las especies. La P4 es
claramente diferente de las otras cadenas P de
las integrinas, es ms grande (210.000 PM) y
s?u dominio citoplasmtico supera los 1.000 aa.
La asociacin de las cadenas a y p es requerida
para la expresin en la superficie celular y apa
rentemente la velocidad de expresin estara li

C uadro 11-2. Propiedades moleculares de las integrinas

Cadena
al
a2
a3
a4
aS
a6
a.1
a8
aL
aM
aX
a l lb
aV
a lE L
81
P2
33
34
P5
S6
P7
P8

Tam ao reducido
210.000
16,5.000
130.000/25.000
150,000
135,000/25.000
120.000/30.000
95.000
140,000
180,000
170,000
150,000
120,000/25,000
125,000/24,000
150.000/25.000
130.000
95.000
105,000
220.000
110.000
106.000
(estim ado)
130.000
97.000

D om inio /
de las integrinas

Clivado

200.000
160.000
150.000
140.000
155.000
140.000
120.000
160.000
170,000
165.000
145.000
145.000
150,000
175.000
110,000
90,000
90.000
210,000
100,000

S
S
No
No
No
No
No
No
S
S
S
No
No
7
No
No
No
No
No
No

No
No
S
No
S
S
S
S
No
No
No
S
S
S
No
No
No
No
No
No

105,000
95,000

No
No

No
No

T am ao no-reducido

Molculas de adhesin
mitada por la sntesis de la cadena a , la cual re
gula la maduracin y la aparicin de la cadena
p en la superficie celular.
Se acepta que en cada integrina los dominios
N-terminal de las cadenas a y p se combinan
para formar una cabeza que une al ligando y
que los dominios citoplasmticos pueden inte
ractuar con protenas del citoesqueleto. La pre
sencia en cada cadena a de los dominios cito
plasmticos, que son estructuralmente nicos,
origina la posibilidad de que estos receptores
puedan interactuar con diferentes componentes
de! citoesqueleto.
Es importante destacar que una integrina par
ticular en una clula dada puede no unirse a to
dos los ligandos listados en el cuadro 11-1, Por
ejemplo, la a2 p 1 de las plaquetas une colgeno
pero no laminina, mientras que en otros tipos
celulares puede reconocer a ambos ligandos.
L a fam ilia de las integrinas (32

Las leucointegrinas
Las leucointegrinas constituyen una familia
de tres glucoprotenas de la superficie celular
que usan la cadena P2 de la familia de las inte
grinas y que median la interaccin clula-clula en la inflamacin. Estas glucoprotenas son
tam bin com nm ente d enom inadas LFA-1
(aL , (32 o C D lla /C D 1 8 ), Mac-1 (a M , [32 o
C D llb /C D lB ) y p l5 0 /9 5 (a X , (32 o C D c/
CD 18),

La familia de las selectinas

Esta familia de molculas de adhesin est
compuesta de 3 glucoprotenas de la superficie

221

celular presentes en clulas endoteliales (E-selectina), plaquetas (P-selectina) y linfocitos (Lseleetina),

A partir de estudios de secuencia se pudo
predecir la estructura de cada una de estas 3
molculas: una protena transmembrana con un
dominio N-terminal semejante a una lectina, un
mismo factor de crecimiento epidemial (EGF),
y un nmero variable de mdulos (de aproxi
madamente 60 aa, cada uno) similares a los en
contrados en ciertas protenas que unen com
plemento (fig, 11-1), El trmino selectina fue
propuesto para resaltar el dominio lectina N~
terminal y para indicar la funcin y expresin
selectiva de estas molculas (cuadro 11-3),
La relacin encontrada entre la regin N-ter
minal de estas tres molculas y los dominios de
reconocimiento de carbohidratos presentes en
las lectinas animales dependientes de Ca^^ dio
lugar a una bsqueda intensiva de los ligandos
carbohidratos involucrados,
E-,P-, y L- selectinas se unen a uno o ms ti
pos de carbohidratos, incluyendo estructuras
re la c io n a d a s al an tg en o L ew is' sialid ad o
(s L e'), polisacridos sulfatados (heparina, fucoidn), y monosacridos y pohsacridos fosfa
tados. Adems, las protenas celulares especfi
cas pueden participar en la presentacin de li
gandos para selectinas. Si bien los detalles mo
leculares de las interacciones ligando-selectina
no han sido an determinados, se presume que
la unin de las selectinas individuales a diferen
tes tipos de carbohidratos puede involucrar o no
el mismo mecanismo. Para conocer estas inte
racciones se requerir determinar las afinidades
de unin y las constantes de velocidad, as co
mo del anlisis cristalogrfico por rayos X.

E-selectina

NH2
Lectina EGF

NH2

P-selectina
i

/ 1

i!

i,

'C O O H

Lectina EGF

L-selectina
NH2
Lectina EGF
F ig. 11-1. Esquem a de las estructuras de E P y L - .selectina. N6te.se e) dom inio lectina am ino term inal, el EG F, el n
m ero variable de m dulos sim ilares a los encontrados en protenas que unen com plem ento, el dom inio transm em brana y el
eitoplasm tico.

222

Aspectos bsicos de ia inmunidad

Cuadro 11-3. Molculas de adhesin de la fam ilia de las selectinas: expresin y funcin
N om enclatura anterior

E xpresada por:

Se une a:

E-selectina

ELAM -1

Endotelio

N eutrfilos
M onocitos
A lgunas clulas T

P-selectina

PA D G EM
G M P -140

Plaquetas
Endotelio

N eutrfilos
M onocitos
A lgunas clulas T

L-selectina

m L H R ,L e u 8 ,T Q -l,g p 9 0 S L am -],L ec an j-l

L infocitos
M onocitos
N eutrfilos

V nulas endoteliales supe

riores de los ndulos lin f
ticos

M olculas de adhesin intercelular (ICAMs)

ICAM-1, ICAM-2, e ICAM-3 son molculas
de la superficie celular que pertenecen a la su
perfamilia de las inmunoglobulinas (vase cap.
5) y estn distribuidas en diferentes tipos celu
lares (endoteliales, epidemiales, fibroblsticas).
Estas molculas intervienen frecuentemente en
las reacciones de adhesin y transmigracin de
los leucocitos sanguneos a travs de la unin
directa a las integrinas de la superficie celular
de los leucocitos.
E structuralm ente, las ICAM s varan en el
nmero de dominios de inmunoglobulina en el
fragmento extracelular (fig. 11-2). Si bien estas
porciones extracelulares presentan un alto gra
do de homologa entre s, las porciones intracitoplsmica y transmembrana presentan una ho
mologa mucho ms baja. Sin embargo, el gra
do de homologa entre los dominios extracelu-

lares de las molculas ICAM es variable. Por

ejemplo, ICAM-3 tiene una homologa de se
cuencia total del 48% con ICAM-1 y de slo
31% con ICAM-2, aunque la homologa entre
los dominios individuales vara marcadamente.
La gran similitud entre las diferentes molculas
ICAM sugiere que todas ellas podran derivar
de una misma molcula ancestral. Suponiendo
que fuera as, el grado de diversidad de estas
molculas es o suficientemente grande como
para determinar en ellas diferentes funciones,
ya que presentan diferencias en: la distribucin
celular, su actividad de unin a LFA-1, y las
regiones citoplasmticas.
VCAM-1 / INCAM-110
Si bien se conoca el rol de ICAM-1 y E-se
lectina en la adhesin de los leucocitos a las c
lulas endoteliales, se presuma de la existencia

iir v c
Dominios ig-like
iJ U iiiM ir u o l y -

7 7L

<V>^L

9T7L

20%

11

o/

ICAM-1 (CD54)
(510 aa)

ICAM-3 (CD50)
(518 aa)

lCAM-2 (GDI 02)

(256 aa)

F ig . 11-2. H om ologa entre las p rotenas ICA M . N tese la porcin transm em brana (TM ) y la porcin citoplasm tica
(Cyt).

Molculas de adhesin
de una tercera molcula de adhesin endotelial
inducible por citoquinas, dado que: I) la adhe
sin de la mayora de los linfocitos sanguneos
perifricos al endotelio activado no podra ser
explicada totalmente por lCAM-1 y E-selecti
na, y 2) ciertas clulas funcionales linfoides
(por ej., melanomas) se adhieren al endotelio
activado por mecanismos aparentemente inde
pendientes de ICAM-1 y E-selectina.
Mediante el empleo de un anticuerpo mono
clonal generado contra el endotelio activado
con TNF, se identific una glucoprotena endo
telial de 110 KD inducible por citoquinas que
es inm un o q u m icam en te d istin ta de las ya
nombradas; se la denomin molcula de adhe
sin celular inducible -110 (INCAM-110). Por
otra parte, empleando un c-DNA aislado de c
lulas endoteliales activadas con citoquinas,
otros investigadores identificaron una molcula
que participaba en la adhesin de los linfocitos
y la llamaron molcula de adhesin vascular-1
(VCAM-1). Poco despus se demostr que se
trataba de la m ism a m olcula IN CAM -110.
A ctualm ente, el nom bre VCAM-1 es el ms
empleado para esta protena, que pertenece a la
superfamilia de las Igs y est compuesta de 1
dominio extracelular que contiene 7 dominios
de Ig, una regin transmembrana y una regin
citoplsmica corta.
La expresin de VCAM-1 sobre las clulas
endoteliales es inducida rpidamente por IL-1
y TN F-a en 6-12 horas. VCAM-1 est tambin
expresada en diversos tipos celulares no-vascu
lares, incluidas clulas dendrticas en ndulo
linftico y piel, clulas estromales en m dula
sea, y clulas sinoviales en articulaciones in
flamadas.
La molcula VCAM-1 interviene en la adhe
sin de las clulas endoteliales a linfocitos y
monocitos (pero no neutrfilos) a travs de una
interaccin con la in teg rin a a 4 [3 (V L A -4;
CD49d/CD29), la que tambin se une a la fi
bronectina.
La expresin de VCAM-1 no est restringida
a las clulas endoteliales activadas, ya que esta
molcula es expresada por las clulas dendrti
cas linfoides en amgdalas, bazo y ndulos lin
fticos perifricos, y por ciertos m acrfagos
presentes en bazo y timo. En consecuencia, es
posible que VCAM-1 juegue un rol como mo
lcula coestimulatoria sobre la superficie de las
clulas accesorias durante la activacin de las
clulas T especficas en ciertos sitios anatmi
cos.
CD 44
CD44 (Pgp-1, Ly-24, ECMR-III) es una glu
coprotena de membrana de naturaleza acdica
sulfatada de PM variable (80 kD - 200 kD) se

223

gn el grado de glucosilacin y de asociacin

de condroitn sulfato. Se expresa en las clulas
epiteliales, linfocitos T y B, queratinocitos y
una variedad de tumores, presentando diferen
tes isoterm as. Tambin se ha encontrado una
form a so lu b le en sangre y fluido sin o v ia l.
CD44 interacta con diferentes superficies ce
lulares y componentes de matrices, que inclu
yen fibronectina, colgeno, y un glucosaminoglucano no-sulfatado llamado hialuronato.
CD 31 (PECAM-1, endoCAM)
CD31 Es una glucoprotena transmembrni
ca de aproximadamente 130 kD que se halla en
clulas endoteliales, plaquetas, neutrfilos, m o
nocitos y subpoblaciones de clulas T, E s un
miembro de la superfamilia de las Igs que, se
gn estudios de prediccin de secuencia efec
tuados a partir de su c-DNA, contendra 6 do
minios de Ig. Esta molcula podra m ediar la
adhesin clula-clula a travs de interacciones
h o m o flic a s (C D 3 1 -C D 3 1 ) y h e te ro flic a s
(CD31-contrarreceptor desconocido).
C D 3 1 est constitutivamente expresada y en
form a abundante en el endotelio. C uando las
clulas endoteliales entran en contacto para for
mar una monocapa, C D 31 se redistribuye hacia
los bordes celulares y participa en las interac
ciones clula endotelial-clula endotelial que
limitan la permeabilidad vascular.
Es probable que en los procesos inflam ato
rios, la retraccin celular del endotelio produci
da por mediadores como la trombina y la hista
m ina se deba a un efecto sobre CD31. Estos
mediadores estimulan la fosforilacin de los re
siduos de serina en la regin citoplasmtica de
CD31 modulando ias interacciones producidas
en el citoesqueleto.
Las interacciones de unin homoflicas entre
CD31 del leucocito y CD31 endotelial podran
ser p artic u larm e n te im p o rtan tes d u ra n te la
transmigracin, cuando el leucocito debera en
contrar la mayor densidad de molculas CD31
endoteliales.
CD 45
CD45 consiste de un grupo de glucoprotenas integrales de m em brana cuyo PM oscila
entre 180 y 220 kD, y que slo son expresadas
en linfocitos inmaduros y maduros, incluyendo
clulas T y B, tim ocitos, fagocitos m ononu
cleares y leucocitos polimorfonucleares. L a fa
milia del CD45 est constituida por mltiples
miembros que son todos productos de un nico
gen complejo. Este gen contiene 34 exones, 3
de los cuales son alternativamente olivados a
nivel de la transcripcin del RNA prim ario pa
ra generar hasta 8 RNAm diferentes y 8 pro

224

Aspectos bsicos de la inmunidad

ductos proteicos diferentes. Segn las secuen

cias de aminocidos, las protenas predecibles
incluyen dominios externos de 391-552 am i
nocidos, una regin transmembrana, y un do
minio eitoplasm tico muy conservado. A de
ms, ios diferentes patrones de glucosilacin de
la misma estructura peptdica tambin contri
buyen a ia lieterogeneidad de los miembros de
esta fam ilia de protenas. Varios anticuerpos
monoclonales diferentes que reconocen miem
bros individuales han sido de gran utilidad en
el estudio de la distribucin y de las funciones
de las protenas CD45.
Las isoformas de las protenas CD45 que son
expresadas en un grupo restringido de tipos ce
lulares son denominadas CD45R y su expre
sin sobre las clulas T es de inters por varias
razones. En primer trmino, la expresin de di
ferentes formas de CD45R es regulada por el
desarrollo durante el proceso de maduracin de
las clulas T. Las distintas subpoblaciones de
clulas T que expresan CD4 en diferentes esta
dios de maduracin o con diferentes capacida
des funcionales in vitro han sido diferenciadas
por la e x p re si n de d ife re n te s fo rm a s de
CD45R. Las clulas T nativas expresan una
forma de CD45R llamada CD45RA, y las clu
las T con memoria inducidas por la exposicin
al antgeno expresan otra isoforma denominada
CD45RO. En segundo trmino, el dominio citoplasmtico largo de CD45 tiene una actividad
fosfatasa tirosina intrnseca, la que puede ser
importante en la regulacin de los distintos ca
minos de activacin que involucran actividad
tirosina quinasa (vase cap. 13).
La migracin transendotelial de las clulas
T en la inflamacin crnica
Si bien muchas veces no se conocen los est
mulos etiolgicos iniciadores de las respuestas
inflamatorias en la enfermedad clnica, un cua
dro caracterstico de la inflamacin crnica ya
establecida es la persistente extravasacin de
clulas mononucleares dentro del tejido. A un
que en los tejidos inflamados se encuentran c
lulas de diversos tipos, incluidas las clulas T,
B, y presentadoras de Ag, parece ser que las
clulas T son las que orquestan la iniciacin y
persistencia de muchas enfermedades inflama
torias crnicas. Por ejemplo, la artritis reuma
toidea (AR), que es una enfermedad inflamato
ria crnica de etiologa desconocida, se carac
teriza por inflamacin persistente del tejido si
novia!, destruccin local de hueso y cartlago, y
muchas otras m anifestaciones sistmicas. La
activacin de las poblaciones especficas de c
lulas T que han infiltrado la sinovia reumatoi
dea, es el eje central de la evolucin de esta en
fermedad. Por consiguiente, para entender los

mecanismos inmunopatognicos de tales enfer

medades inflamatorias, es necesario entender
los mecanism os com plejos que gobiernan la
migracin y acumulacin de las clulas T en
las lesiones inflamatorias.
La capacidad de las clulas T para acceder a
los sitios inflam atorios est influenciada por
distintas propiedades de estas clulas, inclu
yendo la expresin en su superficie de una va
riedad de molculas de adhesin, su movihdad
intrnseca y su capacidad para alterar su funcio
nalidad m ediante interacciones con clulas,
molculas de matriz extracelular y otras sea
les de activacin. Las clulas T, mediante inte
racciones de adhesin mediadas por receptor,
pueden interactuar con las clulas endoteliales
que cubren las vnulas poscapilares que pue
den potencialmente facilitar la entrada de clu
las T en los tejidos. Dichos eventos mediados
por receptor son necesarios para la localizacin
celular, pero no son suficientes para la extrava
sacin, dado que no todas las clulas T que ex
presan receptores de adhesin pueden tener ac
ceso a todos los tejidos. Es decir, la extravasa
cin exitosa de las clulas T en los tejidos in
flamados parecera estar gobernada por otros
factores que incluyen la capacidad migratoria
de estas clulas.
Por otra parte, ei endotelio, que normalmen
te funciona como una barrera a la extravasa
cin celular, puede ser inducido a expresar
contrarreceptores para las molculas de adhe
sin de las clulas T, los cuales intervienen en
la unin y transmigracin de las clulas T espe
cficas. Adems, el endotelio puede tam bin
producir sustancias quemotcticas (quemoquinas) proinflamatorias que pi'omueven la trans
migracin de las clulas T especficas. Por lo
tanto, la extravasacin de las clulas T dentro
de los ciclos inflamatorios es la resultante de
un nmero de mecanismos fisiolgicos distin
tos. (Para mayor informacin vase cap. 23.)
M ecanism os de adhesin que median
el trfico de linfocitos
En general, la extravasacin de hnfocitos in
volucra las actividades concertadas de una va
riedad de receptores de adhesin. C om o se
muestra en la figura 11-3, la migracin de las
clulas T dentro del tejido perivascular es un
proceso de adhesin de mltiples pasos que in
volucra el contacto inicial de las clulas T a la
superficie de las clulas endoteliales, la induc
cin o activacin de receptores de adhesin de
la superficie celular para mediar uniones firmes
y estables con el endotelio, y luego el despegue
de las clulas unidas de modo tal que ellas pue
dan transmigrar a travs de la capa de clulas
endoteliales. La transmigracin de los linfoci-

Molculas de adhesin

225

Linfocito T

Contacto
inicial

Unin
estabilizada

Desadhesin

Trans
migracin

F ig. 11-3. E squem a de la migracin transendotelial de los linfocitos com o un proceso de m ltiples pasos.

tos unidos es tambin un proceso mediado por

receptores que involucra pares receptor-contrarreceptor especficos que pueden haber estado
implicados en la unin inicial o no. Las clulas
transmigrantes deben poseer una capacidad mi
gratoria intrnseca, de modo que ellas se m ue
van a travs de la capa de clulas endoteliales
en vez de retornar nuevamente a la circulacin.
No todas las clulas T circulantes pueden mi
grar hacia los sitios inflamatorios. Las que lo
hacen in vivo tienen un fenotipo distintivo y
son subpoblaciones de clulas T con memoria.
R ecirculacin n o rm al de los linfocitos
Durante la generacin de las respuestas in
munes efectivas, los linfocitos recirculan nor
malmente a travs de los tejidos linfoides y nolinfoides. Varios estudios han demostrado que
el sitio hacia el cual los linfocitos recirculan es
dependiente en parte de su estado de diferen
ciacin. Las clulas T nativas que no se han en
contrado previamente con el antgeno recircu
lan predominantemente desde el torrente san
guneo hacia los tejidos linfoides secundarios,
mientras que las clulas T con memoria extra
vasan dentro de los tejidos no-linfoides. Tanto
es as que cuando las elulas T con mem oria
entran a los ndulos linfticos de los sitios de
inflamacin, lo hacen principalmente a travs
de los linfticos aferentes.
La extravasacin de las clulas T en los n
dulos linfticos perifricos involucra la unin
mediada por L-selectina, que es responsable de
las interacciones dbiles de los linfocitos con
las vnulas endoteliales superiores especializa
das. Los ligandos que intervienen en esta unin
son ohgosacridos cargados que estn expresa
dos en los receptores superficiales de las clu
las e n d o te lia le s (C D 34 y G LY C A M e n tre
otros). Adems, los linfocitos usan L-selectina
para unirse a otros contrarreceptores que tam
bin expresan oligosacridos apropiados. Tal

es el caso de la adresina vascular m ucosal

(MAdCAM-1) expresada por las vnulas endo
teliales superiores del tejido mucosal.
N o se conocen bien los eventos de adhesin
que ocurren en las interacciones firmes clula
endotelial-clula T y en la migracin transen
dotelial a los ndulos linfticos perifricos. La
induccin de la firme adhesin de los linfocitos
al endotelio de los ndulos linfticos perifri
cos parecera iniciarse con el disparo de una se
al mediada por protenas G, que puede ser in
hibida por toxina pertussis. Las integrinas co
mo LFA-1 (C D lla , CDl 8) pueden tam bin ju
gar un rol, dado que se ha observado que los
anticuerpos monoclonales contra LFA-1 inhi
ben parcialmente la unin de los linfocitos a las
vnulas endoteliales superiores de los ndulos
linfticos perifricos.
Los neutrfilos tambin emplean L-selectina
para su anclaje en el endotelio y, luego, usan
L F A -1 en la estabilizacin de la adhesin y en
la migracin transendotelial.
Reclutamiento de los linfocitos en los sitios
inflamados
Contrastando con los caminos norm ales de
recirculacin de las clulas T, hay otros meca
nismos que intervienen en el reclutamiento de
las poblaciones de las clulas T en los sitios extravasculares. Durante las respuestas inflam ato
rias, las clulas T con memoria se acumulan en
los tejidos. El endotelio del tejido inflam ado
crnicam ente expresa receptores de adhesin
involucrados en la extravasacin de clulas T,
muchos de los cuales, incluidos VCAM-1, Eselectina, y P-selectina, no son expresados por
las clulas endoteliales del tejido hnfoide se
cundario ni por el tejido normal no-inflamado.
La expresin de estos receptores de adhesin
resulta de la exposicin del endotelio a citoqui
nas pro-inflamatorias como el TN F-a e inter
leuquina 1(3 (IL-lp). Estos receptores se unen a

226

Aspectos bsicos de la inmunidad

sus contrarreceptores presentes en las clulas T

y pueden facilitar as el reclutamiento selectivo
de estas clulas en los sitios inflamados.
La acumulacin de clulas T se lleva a cabo
siguiendo una serie de pasos. Primero, stas se
adhieren al endotelio, inicialm ente en form a
dbil y despus ms fuertemente. Luego, algu
nas de las clulas T unidas transmigran entre
las uniones celulares del endotelio. Estos pro
cesos estn controlados en forma separada por
molculas de adhesin, que contribuyen a la
acumulacin selectiva de subpoblaciones parti
culares de clulas T en la lesin inflamatoria.
Unin de las clulas T
Es probable que la funcin de un nmero de
receptores de adhesin sea la de facilitar la in
filtracin de las clulas T en los sitios de infla
macin. Tales pares de receptores-contrarreceptores estn esquem atizados en la figura
11-4. Como en el caso de L-selectina, las mol
culas de adhesin CD44 y CD31 parecieran no
requerir un paso de activacin y, por consi
guiente, estos receptores de adhesin constitu
tivam ente activos podran in iciar p o ten cial
mente la unin de las clulas T en reposo a las
clulas endoteliales.
La m olcula CD44, una glucoprotena ex
presada en diversos tipos celulares (clulas T,
B, granulocitos, macrfagos, eritrocitos, clu
las neurales, epiteliales y fibroblastos), une el
citoesqueleto de ciertas clulas con la m atriz
extracelular (colgeno, fibronectina, cido hia
lurnico) y, adems, tiene otros ligandos como
la adresina vascular especfica de tejido mucosal (MAd CAM -1).
Los contrarreceptores para C D 31 no son co
nocidos, aunque se ha demostrado que pueden
unirse a la heparina. D uran te la m igracin
transendotelial, la molcula C D 31 presente en
las clulas inflamatorias puede tambin inter
venir en adhesiones homotpicas por dimeriza
cin a CD31 de las clulas endoteliales. Es
probable que los receptores de adhesin cons
titutivamente activos, al unirse a sus contrarre
ceptores en las clulas endoteliales, disparen
seales intracelulares que conduzcan a la acti
vacin de las integrinas y, luego, a la estabili
zacin de la unin clula endotelial-clula T.
Por ejemplo, la unin de CD44 estimula un au
mento en el calcio libre intracelular, la asocia
cin de CD44 con el citoesqueleto, la agrega
cin homotpica de las clulas T dependientes
de L F A -1, y la unin celular a clulas endote
liales en cultivo.
En general, las uniones ms estables entre
los hnfocitos y las clulas endoteliales son las
mediadas por las integrinas. Las m olculas
VLA-4 y LFA-1, que intervienen en esta unin

en condiciones estticas, requieren ser activa;

das para poder unirse a sus contrarreceptores.
La unin no resulta de un aumento en la expre
sin de estas molculas por parte de los hnfoci
tos, sino que parecera estar relacionada con
cambios conformacionales en la estructura de
las mismas.
La m olcula de LFA-1 puede ser activada
funcionalmente in vitro por estimulacin de los
linfocitos con steres de forbol, que activan la
protena quinasa C, as como por la ligazn de
CD3 o por cultivo in vitro. En forma similar,
VLA-4 puede ser activada por la ligazn de
CD31 y presumiblemente por otras seales.
Si bien VLA-4 y LFA-1 median la adhesin
de los linfocitos a las clulas endoteliales, no
todas las uniones pueden ser explicadas por las
actividades de estas dos molculas. El recono
cimiento de VLA-4 por parte de VCAM-1 es el
ms importante en la unin de las clulas T a
las clulas endoteliales activadas por citoqui
nas. Si bien el receptor a 4 p7 es importante en
la recirculacin de las cluias T, no se conoce
su rol en el reclutamiento de las clulas T en
los sitios inflam atorios. Recientem ente se ha
demostrado que el tejido sinovial inflamado, en
comparacin con la sangre perifrica y el flui
do sinovial, est enriquecido en clulas T que
expresan a 4 37. No se sabe an si hay un re
clutamiento selectivo de clulas T a 4 |37-t- des
de la sangre perifrica hacia el tejido sinovial,
o si hay induccin de la expresin de este re
ceptor sobre las clulas T extravasadas por un
proceso de activacin local. Tampoco se cono
ce si las clulas endoteliales sinoviales expre
san MAdCAM-1, un contrarreceptor de a 4 (37.
La molcula LFA-1 de las clulas T activa
das y de las en reposo, interviene en la adhe
sin a las clulas endoteliales no estimuladas
unindose a las molculas de adhesin interce
lular ICAM -1, ICA M -2 y, potencialm ente a
ICAM-3. En la unin de los linfocitos interven
dran tambin las molculas de E-selectina y Pselectina, las que son expresadas por las clulas
endoteliales activadas. La adhesin de una sub
poblacin de clulas T con memoria a E-selectina est mediada por el antgeno linfocitario
cutneo (CLA). En el caso de la unin del lin
focito a P-selectina, no se conoce la naturaleza
del contrarreceptor del linfocito si bien es muy
p ro b ab le que est re la c io n a d o al an tg en o
Lewis^ sialidado. Otros receptores de adhesin,
como la protena vascular-1 (V A P-I) y CD2,
podran ser mediadores en las interacciones de
la clula T con el endotelio en los sitios de in
flamacin. La molcula VAP-1 interviene en la
unin de los linfocitos y est expresada en el
endotelio de muchos tejidos tales como los n
dulos linfticos perifricos normales y los in
volucrados en la inflamacin crnica.

Molculas de adhesin
La unin de los linfocitos al endotelio puede
tambin ser facilitada por la unin de CD2 a
sus contrarreceptores CD58 (LFA-3), CD59 o
CD48. CD2 est expresada en todas las clulas
T y cumple un rol accesorio durante la activa
cin de la clula T, mientras que las clulas en
doteliales expresan los tres contrarreceptores
de CD2.
Transmigracin de la clula T
En contraste con lo que sucede en la unin
de la clula T a las clulas endoteliales, slo
un nmero limitado de receptores de adhesin
intervienen en la migracin transendotelial de
las clulas T (fig. 11-4). El hecho de que no
todas las clulas T adheridas transmigren a tra
vs de la capa celular del endotelio indica que
la adhesin y la migracin son fenmenos se
parados que estaran regulados por diferentes
seales intracelulares. Por ejemplo, los agentes
que elevan los niveles de AMPc, tanto en la
clulas T como en las clulas endotehales, in
hiben la migracin transendotelial pero no la
unin clula T-clula endotelial. Si bien no se
sabe cules son las seales que conducen la
m igracin tran sen d o telial, es probable que
ellas involucren la accin de protena quinasa
C, ya que el tratamiento de las clulas T con
steres de forbol estim ula la m ovilidad y la
migracin transendotelial. Las seales que re
gulan la migracin transendotelial pueden ser
inducidas por la unin de los receptores de ad
hesin, como es el caso de LEA-1 y de VLA4, que envan seales coestimulatorias a las c
lulas T. En consecuencia, la ligazn de los re
ceptores involucrados en la unin clula T-clula endotelial podra ser importante no slo en
el contacto clula-clula, sino tambin en la
transmisin de las seales que alteran la capa
cidad funcional de las clulas.
Se ha demostrado, en experimentos de blo
queo con anticuerpos monoclonales, que en la
migracin transendotelial de las clulas T uni
das a las clulas endoteliales, intervienen LEA1 e ICAM-1, pero no VLA-4, VCAM-1, LEA3 ni E-selectina. Ms an, esto fue observado
en clulas endotehales activadas con IL -ip en
las cuales la interaccin inicial estuvo mediada
por uniones VLA-4 - VCAM-1. Estos resulta
dos implican que un nmero de receptores de
adhesin que intervienen en la adhesin inicial
entre las clulas T y las endotehales no juegan
necesariamente un rol principal durante la m i
gracin transendotelial subsiguiente.
Resultados de experiencias in vivo indican
que la molcula ICAM-1 interviene en la infil
tracin de los linfocitos dentro de la sinovia
reum atoidea. En efecto, la administracin de
anticuerpo monoclonal especfico para ICAM-

227

1 a pacientes con artritis reumatoidea provoca

una marcada modificacin en la actividad de la
enfermedad, presumiblemente por la alteracin
del trfico de las clulas T en los tejidos.
Por otra parte, la extravasacin de los linfo
citos en los sitios de inflamacin, adems de
ser facilitada por la accin de las molculas de
adhesin, es aumentada por la elaboracin de
mediadores quemotcticos. Ciertas quemoquinas, que inducen especficamente la quemotaxis de poblaciones especficas de clulas T,
tambin pueden activar receptores de la adhe
sin de linfocitos.
Marcadores de las clulas T migrantes
La naturaleza de las clulas T que han extra
vasado en los sitios inflamatorios ha sido objeto
de diversos estudios. El tejido sinovial reum a
toideo contiene poblaciones de clulas T que
tienen el fenotipo de la clula con m em oria
(CD4VCD45 ROVCD45 RA7CD29/L-selectina/CD7), y adems expresan mayor nmero de
ciertos receptores de adhesin. Estas clulas
tambin expresan cieitas molculas caractersti
cas de las clulas T activadas. La acumulacin
perivascular de clulas T con memoria activa
das tambin se ha encontrado en una variedad
de procesos inflamatorios crnicos que involu
cran a otros rganos. En tejidos inflamados y en
fluidos sinoviales en la artritis reum atoidea,
adems de clulas T CD4+ se han encontrado
clulas T CD8*. Por otra parte, las clulas T y8,
aunque en un menor nmero, estn significati
vamente enriquecidas. Por lo tanto, los tejidos
inflamados crnicamente, tales como la sinovia
reumatoidea, estn infiltrados por una variedad
de diferentes poblaciones de clulas T.
La acumulacin de poblaciones especficas
de clulas T en los tejidos inflamados podra
ser explicada por el reclutamiento especfico,
retencin, o la activacin local y posterior dife
renciacin, o ambos.
Tanto las subpoblaciones de clulas T CD4+
como las CD4^ tienen capacidad para m igrar a
travs del endotelio. Las clulas T yS son las
que tienen m ayor capacidad m ig rato ria, si
guiendo en la frecuencia de migracin las clu
las T a p CD8+ y luego las clulas T a p CD4+.
La figura 11 -5 muestra los distintos fenotipos
de las diferentes poblaciones migratorias de las
clulas T.
Las clulas T CD4^ migratorias expresan el
fe n o tip o CD45 R O V C D 29 (a u m .)/L E A -l
(aum.)/VLA-2VVLA-4 (aum.)/VLA-5 (aum .)/
CD 44 (aum .)/L F A -3 (aum .)/C D 27 (d ism .)/
CD26 (aum.)/CD31 (dism.)/L-selectina-.
Aparentemente las clulas T del torrente cir
culatorio normal no requieren ser activadas pa
ra migrar, dado que la mayora de las clulas T

228

Aspectos bsicos de la inmunidad

LFA-1/1CAM-1 # lCAM-2
VLA-4/VCAM-1
P-selectina / oligosacrido cargado
Fig. 11-4. Izares de receptor - contrarreceptor que facilitan la extravasacin de las clulas T hacia los sidos de in flam a
cin.

CD4+ migratorias no expresan los marcadores

de activacin HLA-DR, CD25 y CD69. Es no
table como todas, las clulas CD4+ migratorias
expresan densidades igualmente aumentadas de
VLA-4, CD44 y CD26, mientras que ninguna,
o muy pocas, de las clulas T no-migratorias

expresan este fenotipo. Salvo en la falta de ex

presin de los marcadores de activacin, las c
lulas T CD4+ m igratorias tienen un fenotipo
que recuerda al de las clulas T identificadas
en los tejidos inflamados crnicamente. Es pro
bable que la expresin de los m arcadores de

L-SDlcclina
CD4-

GD45RO*

CD7dis

CD8-

CD45RA
VLA-4ini

CD45RO+
VLA-5int
CD26int
CD58in

y/8RcT+

CD8-

Seleetina

I CD2r

CD 44nt

CD8-f

CD44int^l^

lA - l in t
:D 3 d is

>
/

VLA-4*
FLA-1int

C D45RO

VLA-5*
RcTo/p CD4*

CD29+
VLA-4*

VLA-5*

CD45RA

RcTy/5
CD26int

F LA -lin t
CD44int
RcTo/p CDS*

F ig. 11-5. M igracin transendotelial de las clulas T.

L-selectina

Molculas de adhesin
activacin y la retencin dentro de los tejidos
sean consecuencia de fenm enos posteriores
que ocurren en los sitios de inflamacin.
Si bien la migracin de las clulas T norma
les, aparte de la interaccin con el endotelio, no
requiere activacin especfica, la estimulacin
puede aumentar la capacidad migratoria de al
gunas clulas T adicionales. Sin embargo, slo
hay diferencias modestas en los fenotipos de
las clulas T que migran despus de haber sido
activadas.
Los resultados de investigaciones recientes
insintian que las clulas T CD4+ con memoria
m igran en form a p re fere n c ial sin ten er en
cuenta su estado de activacin. Si bien la acti
vacin aumenta el nmero de las clulas que
migran, parecera no ser necesaria para que la
mayora de las clulas crucen las barreras en
doteliales.
En concluisin, la capacidad para la m igra
cin transendotelial es una propiedad intrnseca
de las clulas con memoria que est algo au
mentada por las seales de activacin.
Transmigracin de las clulas jb
En los tejidos inflamatorios crnicos, adems
de las clulas T CD4+, hay un nmero reducido
de clulas CD4". Entre las ltimas estn las que
son TCR ap-^/CDS* como las TCR yS/CDS^ y
CD 8 . Todas estas poblaciones contienen clu
las migratorias en mayor frecuencia que las c
lulas T a p CD4+. Se ha establecido el fenotipo
de estas clulas migratorias CD4 . La mayora
(> 80%) de las clulas T TCR aP-h/CD 8 + con
una capacidad m igratoria transendotelial son
CD45 R0+, no obstante algunas clulas T CD45
RA+ (< 40%) tambin migran. Las clulas mi
gratorias tambin poseen estas caractersticas:
C D 29 (a u m .)/C D 2 6 + /L -s e le c tin a -/L E A -l
(aum .)/C D 44 (aum .)/V L A -4V V L A -5" (fig.
11-5). Adems, como ocurre con la subpobla
cin CD4+, el fenotipo de las clulas T C D 8 -Imigratorias no es afectado por la activacin o
por la estimulacin del endotelio por citoqui
nas. La intensidad de la expresin de las p l in
tegrinas (VLAs) en las clulas T CD 8 + migra
torias es menor que en las clulas T CD4+. Da
do que las p i integrinas son importantes m e
diadores de las in teraccio n es celulares con
componentes de matrices extracelulares, la lo
calizacin preferencial de las clulas T CD4+
en muchos tejidos inflamados podra reflejar su
retencin selectiva en los tejidos que poseen
expresin aumentada de los receptores de pi
integrinas. A este respecto, se ha observado
que las clulas T a p CD 8 + no son retenidas en
los sitios de hipersensibilidad de tipo retardada,
com o efe c tiv a m e n te lo son las c lu las a P
CD4+. La expresin diferencial de las pl inte

229

grinas sobre las clulas T aP CD4+ y CD 8 + po

dran contribuir a este fenmeno.
Aunque el rol de las clulas T TCR 7 8 ^ no es
totalm ente conocido, estas parecen ser funda
mentales en la vigilancia inmune. En el hombre,
estas clulas, que recirculan preferencialmente a
travs de los rganos no-linfoides, se acumulan
en los tejidos inflamados, incluyendo la sinovia
reumatoidea. No se sabe an si la presencia de
las clulas T TCR 7 8 ' en los diferentes tejidos es
debido al aumento de la capacidad migratoria
transendotelial de estas clulas.
Las clulas T TCR y8 ^ contienen una pobla
cin principal CD4 /C D 8 , y una menor CD4/CD 8 *, y tambin expresan CD45 RO y CD45
RA (fig. 11-5). Todas las clulas T yS expresan
intensamente CD29 (aum.). Algunas de las c
lulas T yS migratorias expresan tanto CD45 RO
como CD45 RA, sugiriendo que ellas pueden
haber sido recientemente activadas y estn en
el proceso de diferenciacin. Por consiguiente,
para las clulas T y5, las clulas T CD45 RA
pueden migrar efectivamente, a diferencia de
las clulas T aP migratorias, las cuales son en
su mayora CD45 RA. Esto es consistente con
la observacin de que la sinovia reum atoidea
contiene clulas T TCR y8+/CD45 RA+. Las c
lulas T y 8 de la sangre perifrica tambin ex
presan en forma intensa y uniforme LFA-1 y
CD44; por lo tanto estos dos m arcadores no
distinguen a las clulas migratorias de las otras
poblaciones.
A diferencia de otras poblaciones migratorias
de clulas T, muchas clulas T yS migratorias
expresan intensamente L-selectina. Si bien en el
bovino las clulas T y 8 usan L-selectina al unir
se a las clulas endoteliales de los ndulos lin
fticos perifricos, no se sabe si en el hombre
las clulas T y8 pueden utilizarla para la m igra
cin transendotelial. Las clulas T TCR y5+, de
bido a la expresin de L-selectina, podran estar
involucradas en la iniciacin de las respuestas
inflamatorias. Mediante un mecanismo similar
al usado por los neutrfilos, la m olcula de
L-selectina podra mediar las interacciones ini
ciales de las clulas T y8 con el endotelio cuan
do la inflamacin no est acentuada, y el flujo
sanguneo est intacto. Subsiguientemente, la
estabilizacin de la adhesin por los receptores
de adhesin para las integrinas podra permitir
la migracin transendotelial de las clulas T y5
hacia el tejido. La presencia de estas clulas en
el tejido y la activacin de las mismas, podra
inducir alteraciones fenotpicas y funcionales en
el endotelio, resultando en una disminucin del
flujo sanguneo, un aumento en la expresin de
las molculas de adhesin, o en la elaboracin
de quemoquinas, o ambos. Tales condiciones
podran permitir la extravasacin de las clulas
T TCR a p ^ con capacidad migratoria y la acu

230

Aspectos bsicos de la inmunidad

mulacin de las mismas en el tejido inflamado

y en los compartimentos fluidos.
En resumen, la migracin transendotelial es
una propiedad intrnseca de distintas subpobla
ciones de clulas T que tienen caractersticas fe
notpicas especficas. Una variedad de recepto
res de adhesin desempea un papel central en
el reclutamiento selectivo de estas poblaciones
celulares en los sitios inflamatorios y, por con
siguiente, en la patognesis de las enfermedades
inflamatorias crnicas. Durante las condiciones
inflamatorias, las molculas de adhesin inter
vienen en las interacciones de los linfocitos con
las clulas endoteliales y con las molculas de
la matriz extracelular durante la migracin tran
sendotelial, y en el envo de seales coestimulatorias involucradas en la activacin de estas c
lulas, Las poblaciones especficas de las clulas
T capaces de entrar en el tejido, pueden cambiar
a medida que evoluciona la lesin inflamatoria.
La perpetuacin de las respuestas est dada por

la orquestacin de la entrada de subpoblaciones

especficas de clulas T en los sitios inflamato
rios, y ofrece muchos blancos para las potencia
les intervenciones teraputicas.
BIBLIOGRAFA
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Citoquinas

ELIDA ALVAREZ

INTRODUCCIN
La respuesta inmune es el fruto de la interac
cin entre los linfocitos T (LT), los linfocitos B
(LB) y los monocitos/macrfagos. Esta coope
racin conduce a la proliferacin celular, la
produccin de anticuerpos (Ac), la diferencia
cin de clulas citotxicas, el aumento de la ac
tividad microbicida y la diferenciacin hematopoytica.
La regulacin de esta compleja red de res
puestas inm unitarias e inflamatorias depende
sobre todo de la comunicacin entre las clulas
participantes e interactuantes, la cual se logra
por medio de molculas proteicas solubles que
se denominan citoquinas.
En la inmunidad natural la mayora de estas
protenas son elaboradas por monocitos y fue
ron por ello denominadas monoquinas. En este
caso, las citoquinas pueden ser elaboradas co
mo respuesta directa a los microorganismos o
tambin como consecuencia de estmulos indu
cidos por el Ag sobre los LT, los que luego a
su vez estimulan la secrecin de factores solu
bles por parte de los monocitos/macrfagos.
La mayora de las citoquinas producidas en
la respuesta inmune especfica son elaboradas
por los LT y por ello tales molculas son cono
cidas como linfoquinas. Las clulas T produ
cen una serie de molculas que sirven en pri
mera instancia para regular el crecimiento y la
diferenciacin de varias poblaciones linfocita
rias y por ello son factores esenciales de la res
puesta T dependiente. Tambin producen sus
tancias que activan y regulan las clulas que
participan de las respuestas inlamatorias/efectoras ejercidas por macrfagos/mononucleares,
neutrfilos y eosinfilos.

12
Adem s, se producen otras citoquinas que
estimulan el crecimiento y la diferenciacin de
clulas indiferenciadas de mdula sea las que
son denominadas factores estimulantes de co
lonias (CSFs).
Por lo expuesto, es necesario tener presente
que las interacciones de las citoquinas deben
ser analizadas como un todo integrado en el
que se incluyan las relaciones de las clulas del
sistema inmune con clulas ubicadas fuera de
dicho sistema y tambin con las clulas que di
rigen y controlan el proceso hematopoytico.
Los prim eros estudios sobre citoquinas se
extendieron entre 1950-1970 e im plicaron la
descripcin de num erosos factores proteicos
producidos por varios tipos celulares. C ada uno
de ellos m ediaban alguna funcin b iolgica
particular definida por ensayos realizados in
vitro.
Una segunda fase de la investigacin, desa
rrollada a partir de 1970, involucr la purifica
cin parcial y la caracterizacin de m uchas ci
toquinas individuales junto con la produccin
de antisueros neutralizantes de su accin. En
este perodo, distintos investigadores estudia
ron diferentes efectos biolgicos, los cuales en
realidad eran mediados por las mismas molcu
las. Por ejem plo, el interfern j (IFN y) fue
descubierto por equipos de virlogos com o un
producto derivado de los LT, el cual posea
propiedades antivirales e independientem ente
fue descubierto por los inmunlogos tambin
como un factor producido por los LT, el que
actuaba como un activador de las funciones del
macrfago. Hechos similares acontecieron con
la IL-1, descubierta como un estimulador end
geno, mediador del aumento de la temperatura
corporal el cual se produca en respuesta a in-

230

Aspectos bsicos de la inmunidad

mulacin de las mismas en el tejido inflamado

y en los compartimentos fluidos.
En resumen, la migracin transendotelial es
una propiedad intrnseca de distintas subpobla
ciones de clulas T que tienen caractersticas fe
notpicas especficas. Una variedad de recepto
res de adhesin desempea un papel central en
el reclutamiento selectivo de estas poblaciones
celulares en los sitios inflamatorios y, por con
siguiente, en la patognesis de las enfermedades
inflamatorias crnicas. Durante las condiciones
inflamatorias, las molculas de adhesin inter
vienen en las interacciones de los linfocitos con
las clulas endoteliales y con las molculas de
la matriz extracelular durante la migracin tran
sendotelial, y en el envo de seales coestimulatorias involucradas en la activacin de estas c
lulas, Las poblaciones especficas de las clulas
T capaces de entrar en el tejido, pueden cambiar
a medida que evoluciona la lesin inflamatoria.
La perpetuacin de las respuestas est dada por

la orquestacin de la entrada de subpoblaciones

especficas de clulas T en los sitios inflamato
rios, y ofrece muchos blancos para las potencia
les intervenciones teraputicas.
BIBLIOGRAFA
O ppenheim er- Marlcs N, Lipsky PE. Transendotlielial migration of T cells in chronic inflam m ation, Im m unol, T o
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M iiller-E berhard HJ, Innate im m unity. C urrent O pinion in
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Citoquinas

ELIDA ALVAREZ

INTRODUCCIN
La respuesta inmune es el fruto de la interac
cin entre los linfocitos T (LT), los linfocitos B
(LB) y los monocitos/macrfagos. Esta coope
racin conduce a la proliferacin celular, la
produccin de anticuerpos (Ac), la diferencia
cin de clulas citotxicas, el aumento de la ac
tividad microbicida y la diferenciacin hematopoytica.
La regulacin de esta compleja red de res
puestas inm unitarias e inflamatorias depende
sobre todo de la comunicacin entre las clulas
participantes e interactuantes, la cual se logra
por medio de molculas proteicas solubles que
se denominan citoquinas.
En la inmunidad natural la mayora de estas
protenas son elaboradas por monocitos y fue
ron por ello denominadas monoquinas. En este
caso, las citoquinas pueden ser elaboradas co
mo respuesta directa a los microorganismos o
tambin como consecuencia de estmulos indu
cidos por el Ag sobre los LT, los que luego a
su vez estimulan la secrecin de factores solu
bles por parte de los monocitos/macrfagos.
La mayora de las citoquinas producidas en
la respuesta inmune especfica son elaboradas
por los LT y por ello tales molculas son cono
cidas como linfoquinas. Las clulas T produ
cen una serie de molculas que sirven en pri
mera instancia para regular el crecimiento y la
diferenciacin de varias poblaciones linfocita
rias y por ello son factores esenciales de la res
puesta T dependiente. Tambin producen sus
tancias que activan y regulan las clulas que
participan de las respuestas inflamatorias/efectoras ejercidas por macrfagos/mononucleares,
neutrfilos y eosinfilos.

12
Adem s, se producen otras citoquinas que
estimulan el crecimiento y la diferenciacin de
clulas indiferenciadas de mdula sea las que
son denominadas factores estim ulantes de co
lonias (CSEs).
Por lo expuesto, es necesario tener presente
que las interacciones de las citoquinas deben
ser analizadas como un todo integrado en el
que se incluyan las relaciones de las clulas del
sistema inmune con clulas ubicadas fuera de
dicho sistema y tambin con las clulas que di
rigen y controlan el proceso hematopoytico.
Los prim eros estudios sobre citoquinas se
extendieron entre 1950-1970 e im plicaron la
descripcin de num erosos factores proteicos
producidos por varios tipos celulares. C ada uno
de ellos m ediaban alguna funcin b iolgica
particular definida por ensayos realizados in
vitro.
Una segunda fase de la investigacin, desa
rrollada a partir de 1970, involucr la purifica
cin parcial y la caracterizacin de m uchas ci
toquinas individuales junto con la produccin
de antisueros neutralizantes de su accin. En
este perodo, distintos investigadores estudia
ron diferentes efectos biolgicos, los cuales en
realidad eran mediados por las mismas molcu
las. Por ejem plo, el interfern j (IFN y) fue
descubierto por equipos de virlogos com o un
producto derivado de los LT, el cual posea
propiedades antivirales e independientem ente
fue descubierto por los inmunlogos tambin
como un factor producido por los LT, el que
actuaba como un activador de las funciones del
macrfago. Hechos similares acontecieron con
la IL -I, descubierta como un estimulador end
geno, mediador del aumento de la temperatura
corporal el cual se produca en respuesta a in

232

Aspectos bsicos de la inmunidad

fecciones bacterianas mientras que los inmun

logos lo revelaban como un factor co-estimulante de la proliferacin de clulas tmicas. Es
importante destacar que en esta etapa la carac
terizacin biolgica y qumica fue un logro de
las investigaciones inmunolgicas. Cabe agre
gar que, como consecuencia de los estudios
realizados en estos tiempos, surgi la idea de
que las citoquinas eran principalmente produci
das por leucocitos con el fin de m antener en
prim era instancia relaciones intercelulares y
por ello surgi la idea de denominarlas interleuquinas(IL).
La era de mayores avances en la investiga
cin de las citoquinas com enz en 1.980, las
mismas fueron entonces caracterizadas a travs
del clonado molecular, la expresin en forma
individual de cada una de ellas y por la obten
cin de anticuerpos monoespecficos (frecuen
temente monoclonales) contra las mismas, los
que permitieron neutralizar su accin. Con es
tos reactivos y el desarrollo de nuevas estrate
gias se logr la identificacin de la estructura y
propiedades de cada citoquina en particular. El
entendimiento global de los complejos patrones
de estmulos inducidos, as como la participa
cin en las diferentes fases y mecanismos de la
respuesta inmune en los que estos factores par
ticipan podr obtenerse gracias al desarrollo de
nuevas estrategias de estudios con la utiliza
cin de citoquinas recom binantes, anim ales
transgnicos para la expresin de sus genes y
animales obtenidos por tecnologa knock-out
en los cuales se consigue la falta de expresin
de dichas molculas.
Los estudios emprendidos en los ltimos 25
aos han permitido reconocer que estas sustan
cias no slo afectan la respuesta inmune, la he
matopoyesis y la integracin del sistema inm u
ne con el sistem a neuroendocrino, sino que
tambin estn im plicadas en la fisiopatologa
de un gran nmero enfermedades entre otras el
cncer, las inmunodeficiencias, las enfermeda
des autoinmunes y los procesos infecciosos. Un
mejor entendimiento de su accionar permitir
el uso de las citoquinas como potenciales agen
tes bioteraputicos as com o tam bin lo p o
dran ser la utilizacin de formas solubles de
sus receptores o anticuerpos monoclonales es
pecficos y el desarrollo de biomolculas ago
nistas o antagonistas de sus efectos.
Propiedades generales
Si bien las citoquinas representan un conjun
to de molculas muy diversas comparten una
serie de propiedades que las definen desde el
punto de vista biolgico. Estas sustancias son
glucoprotenas o protenas de bajo peso mole
cular (PM), generalmente 8-75 kD, las que son

producidas durante la fase efectora de la res

puesta inmune tanto natural como de la espec
fica, con el fin de mediar y regular la amplitud
y duracin de las respuestas inmune e inflama
toria.
La produccin de las citoquinas est caracte
rizada por producirse en un evento breve y autolimitado. No se encuentran preelaboradas en
compartimentos celulares sino que la sntesis
se inicia como consecuencia de acciones bre
ves que implican la transcripcin y obtencin
del ARN mensajero (ARNm), el cual es muy
inestable. Las secuencias ricas en poli UAUU
en las regiones 3 no traducidas de los ARNm
de muchas citoquinas se relacionan de manera
directa con una rpida degradacin por aumen
to de la sensibihdad a la accin de nucleasas.
Estos hechos aseguran que la produccin de las
citoquinas sea un hecho trasciente. Se observ
adems que algunas citoquinas poseen un me
canismo postranscripcional que permite el con
trol de su produccin, por ejemplo, la libera
cin de enzimas que transforman los productos
activos en inactivos.
La sntesis de una citoquina en particular
puede estar influenciadas por la sntesis de
otras producindose entonces una reaccin en
cascada. Se generan as una serie de circuitos
regulatorios tanto para el sistema inmune como
tambin para el sistema inflamatorio.
Otro hecho que caracteriza a estas molculas
es que una misma citoquina pueden ser produ
cidas por mltiples tipos celulares y a su vez
cada una de ellas pueden actuar sobre clulas
d ife re n te s, e sta p ro p ie d a d es d e n o m in a d a
pleiotropismo.
Las acciones de las citoquinas pueden resul
tar an sobre el mismo blanco en diferentes
efectos segn el tiempo y la concentracin del
factor secretado. Existe una considerable su
perposicin y redundancia entre las mismas da
do que ciertos efectos son compartidos entre
ellas.
La accin de una citoquina puede en algunos
casos interactuar con la de otra producindose
efectos sinrgicos en algunas ocasiones y an
tagnicos en otras.
Tal como ocurre con las hormonas, la accin
de las citoquinas se produce por unin a recep
tores especficos (R) presentes en las superfi
cies celulares. Sin embargo, a diferencia de las
hormonas las citoquinas ejercen su accin a ni
vel local, activando receptores presentes en las
mismas clulas elaboradoras, ejercindose una
accin autocrina o interactuando con recepto
res de clulas que se encuentran en la cercana
ejerciendo una efecto paracrino. Slo en cier
tas ocasiones puede hallarse un efecto sobre c
lulas distantes en el caso en los que las concen
traciones liberadas hacia el torrente circulatorio

Citoquinas
son muy altas, pudiendo ejercer entonces una
accin endocrina.
Los receptores para citoquinas pertenecen a
diferentes familias, pero todos ellos se caracte
rizan por ser especficos y de muy alta afini
dad po r sus lig a n d o s, p resen ta n K d e n tre
Como consecuencia de ello slo
muy pequeas cantidades de citoquinas (con
centraciones femtomolares) son requeridas para
gatillar el efecto biolgico. La expresin celu
lar de estos receptores es regulada a travs de
seales especficas que pueden ser generadas
por otra o an la misma citoquina, lo cual per
mite amplificar una seal positiva o generar un
efecto de retroalimentacin negativa.
La respuesta celular a las citoquinas es lenta
(hs) dado que requiere de la form acin del
ARNm y de la posterior sntesis de las prote
nas. Luego la seal generada parece ser que es
timula la unin de factores nucleares especfi
cos que a su vez regulan la transcripcin. D ife
rentes mecanismos llevan a la transcripcin ge
ntica y a la sntesis de las protenas, aunque
hasta el presente para la mayora de ellas sigue
siendo desconocido el verdadero camino de ac
tivacin celular.
Clasificacin funcional de las citoquinas
De acuerdo con lo expuesto en el desarrollo
de la introduccin y las propiedades generales
de las citoquinas, se deduce que los roles fisio
lgicos atribuibles son de singular importancia.
Todos ellos se encuentran interconectados de
manera tal que, a pesar del amplio xito logra
do en la clonacin y el conocimiento de las se
cuencias nucleotdicas y aminoacdicas de cada
factor en particular y de muchos de sus recep
tores, an permanecen muchos interrogantes en
relacin con las vas a travs de las cuales se
integran las clulas blanco y la manera en que
los mltiples estm ulos recibidos se transfor
man en una respuesta eficiente.
Desde el punto de vista de una mejor inter
pretacin de sus efectos, podemos agruparlas
en diferentes categoras teniendo en cuenta las
principales acciones ejercidas por cada una en
especial pero en realidad la mayora de ellas
puede ser incluida en ms de una de las catego
ras indicadas,
- Citoquinas m.ediadoras de la respuesta in
m une innata, secretadas en respuesta a agen
tes infecciosos capaces de activar a los fa g o ci
tos mononucleares. Este conjunto de citoquinas
tiene fundam entalm ente accin contra las in
fecciones virales y/o aquellas que se inician por
procesos inflamatorios y que confieren protec
cin contra las infecciones bacterianas,
- Citoquinas reguladoras de la activacin,
el crecimiento y la diferenciacin linfocitaria,

233

las que son producidas en la respuesta in m u n e

especfica. Ejercen una accin reguladora sobre
el crecimiento y la diferenciacin de los linfo
citos a la vez que son mediadores de las fases
de activacin de la respuesta especfica, tanto
de la respuesta inmvme humoral como celular.
- Citoquinas reguladoras de las respuestas
efectoras e inflamatorias producida como con
secuencia de una respuesta inm une especfica.
Estas citoquinas derivan fundamentalmente de
los LT CD4+ y CD8+, permiten activar los m e
canismos efectores no especficos. Tienen un
rol importante en la fase efectora mediada por
clulas.
- Citoquinas que actan como factores estim ulatorios de la hem atopoyesis y del cre c i
miento y de la diferenciacin de los leucocitos
inmaduros. Dado que en las respuestas inm une
e inflamatoria se pi'oduce una utilizacin y con
sumo de clulas, stas deben ser continuamente
reemplazadas. Las nuevas clulas son produci
das como consecuencia de una progresiva ex
presin y diferenciacin a partir de clulas plu
ripotenciales {stem cells). Las citoquinas que
participan de este accionar (CSFs) estimulan la
formacin de colonias celulares en la m dula
sea (MO). La denominacin de cada u n a de
ellas refleja el tipo de colonias que son capaces
de inducir in vitro. Es interesante observar que
la mayora de los CSFs estn localizados en un
conjunto de genes ubicados sobre el crom oso
ma 5 humano y II nmrino. En el cuadro 12-1
se ejemplifica cada una de las categoras enun
ciadas.
Receptores de citoquinas
Las propiedades y efectos producidos p o r las
citoquinas se explican por la estructura y la dis
tribucin celular de los receptores de m em bra
na capaces de unirlas especficamente. A pesar
del hecho de cjue los mecanismos im plicados
en las seales de transduccin no estn an
aclarados, existe abundante informacin en re
lacin a las estructuras de la mayora de estos
receptores.
La principal funcin del receptor es recono
cer especficam ente a una citoquina d a d a y
convertir esa interaccin en una seal intracelu
lar adecuada.
Todos los receptores de citoquinas co n o ci
dos son glucoprotens, constituidos por lo m e
nos por tres regiones. Un dominio extracelular'
el cual provee de la regin de reconocimiento
para la citoquina y genera la especificidad de
unin para el ligando; una regin transmembra
na expandido a lo largo de a biocapa lipdica
de la membrana plasmtica y el dominio intra
c e lu la r resp o n sab le de g en erar la se a l de
transduccin; esta iltim a regin puede tener

234

Aspectos bsicos de la inmunidad

Cuadro 12-1. Clasificacin funcional de las citoquinas que participan de la respuesta inmu
ne e inflamatoria
l 'i iiu i p ie s circiiin c.M e d i a d o r e s t l e li! r o s p u e s u i i n i i a l a

C7aj.'/(7??s
.N-(/.. i l ' N - | l I I . i. II.- fl, ll.-.S, I N I

R egulacin de la activacin, del crecim iento y de la diferen

ciacin de los linfocitos B y T .

IL-2, IL-4, IL-6, IL-IO, IL-13, IL-14, IL-15, TGFP

A ctivacin de m ecanism os efectores

IFN-y, TN PP, IL-.5, IL-12

Estim ulacin del crecim iento y la diferenciacin de clulas

inm aduras

IL-3, IL-7, IL-9, I L - I l , G M -G SF, G -C SF, M -C SF

actividad enzimtica intrnseca o, en otros ca

sos, puede tener capacidad para unirse a otras
molculas que son responsables de crear la se
al intracelular en respuesta a la unin de la ci
toquina al dominio extracelular del receptor.
En la actualidad es bien conocido que algunos
receptores de citoquinas estn constituidos por
una simple cadena polipetdica, la cual cumple
todas las funciones y en cambio otros pueden
ser receptores constituidos por complejos multicatenarios, donde algunas cadenas efectan la
unin especfica del ligante y otra es la encar
gada de producir la seal de transduccin que
lleve a la respuesta celular, por lo general esta
ltima cadena es compartida por diferentes uni
dades receptoras (fig, 12-1).
Dado que los genes de un gran nmero de
receptores para citoquinas han sido clonados,
logrndose la expresin de las protenas y obte
nindose la secuencia de las mismas, se lleg a
determ inar las similitudes estructurales entre
ellas y se estableci la existencia de secuencias
conservadas. En base a tales unidades estructu
rales o secuencias homlogas los receptores de
citoquinas fueron agrupados en cinco superfamilias (fig. 12-2).
El primer grupo lo constituyen los receptores
que pertenecen a la su p erfa m ilia de las Igs.
Estos receptores estn caracterizados por un
nmero variable de dominios Ig. smil y pre
sentar actividad tirosin quinasa. A esta familia
pertenecen los receptores de IL-1 de tipo I, MCSF, la subunidad a del IL-6R, la subunidad P
del PDGE y varios miembros de los EGE.
La segunda familia es la ms numerosa, de
nominada superfamilia de receptores hem a
topoyticos o receptores de tipo I. Estos recep
tores estn caracterizados por la presencia de
residuos conservados de cistena y de una se
cuencia de hom ologa constituida por cinco
aminocidos caractersticos, la unidad Trp-Ser~
X-Trp-Ser (WSXWS), secuencia referida como
unidad WS, donde X es variable y representa
a cualquier aminocido. Esta unidad WS se en
cuentra localizada prxim a al dominio trans

membrnico. Esta regin funcionara como el

principal sitio de unin para el ligando.Todos
los receptores de citoquinas que utilizan esta
unidad interactan con citoquinas que compar
ten en su secuencia cuatro regiones a hlice e
incluyen a los receptores de EPO, cadenas |3 y
Y del IL-2R, cadenas a y p del IL-3R, cadena a
del IL-4, cadenas a y p del IL-5R, IL-6R, ca
dena a y 7 del IL-7R, cadena P y y del IL-I5R,
GM-CSER, G-CSER, cadena gp 130, LIE, etc.
En el caso particular del receptor de IL-6 se da
el hecho de que en una misma cadena pohpetdica se establece un dominio similar a las Igs. y
otro de unidad WS.
El tercer grupo fue denominado de la super
familia de los IFN s o receptores de Tipo II,
incluye a los IFN de tipo I y de tipo II. Su rela
cin estructural ha sido definida en relacin
con la secuencia aminoacdica. Los miembros
de esta familia comparten una organizacin si
m ilar, con un dom inio que presenta una se
cuencia de 210 aa, el cual contiene un par de
cistenas conservadas en la regin N terminal y
otro en al regin C terminal. Esta familia pare
cera estar distancialmente relacionada con los
receptores de tipo I. Estudios de transfeccin
de los distintos genes para receptores de IFN
humanos indican que probablemente el recep
tor funcional para IFN requiera de cadenas adi
cionales (IFNRT: cadena transductora del re
ceptor de IFN ), lo que gen erara un nuevo
ejemplo de receptores multicatenarios.
La cuarta familia corresponde a aquellos re
ceptores relacionados estructuralmente con los
dos receptores del TNF, tanto p55 como p75,
razn por la cual se denominan superfamilia
de receptores del TNF. A ella pertenecen ade
ms del TNFR, el receptor de baja afinidad pa
ra el NGF (factor de crecimiento neuronal), la
protena codificada por el gen Fas y glucopro
tenas transmembrnicas que incluyen a CD40,
CD27, CD30, 0X 4 0 y 4-lB B . Esta fam ilia est
caracterizada por la presencia de cuatro domi
nios ricos en residuos repetitivos de cistenas,
la localizacin de los mismos est altamente

Citoquinas
conservada sugiriendo que habran derivado de
un gen ancestral comn. Son tambin denomi
nados de Tipo III.
Finalmente, los integrantes de la quinta famiha presentan homologa estructural con pro
tenas transmembrnicas caracterizadas por la
presencia de siete regiones a hlice que actan
como receptores de alta afinidad para quim io
quinas e IL-8. Esta unidad funcional fue origi
nalmente encontrada en los receptores adrenrgicos y en la rodopsina de la retina, est am
pliamente compartida por receptores unidos a
protenas heterotrim ricas que se acoplan a
protena G {G-copulatedproteins).
De manera similar, estudios de secuencia
cin del dominio intracitoplasmtico ha perm i
tido encontrar regiones altamente conservadas.
Por ejemplo, existen estrechas regiones consti
tuidas por tres residuos aminoacdicos que es
tn altamente conservados entre los receptores
para el G-CSF y la cadena gpl30 del receptor
de IL-6, de los cuales uno o dos son crticos pa
ra la seal de transduccin.
Otra caracterstica de los receptores de citoquinas es la aparicin de formas solubles, las
que aparecen por clivaje proteoltico del recep
tor de membrana o por empalme (splicing)
alternativo de los ARNm. Estas formas poseen
capacidad para asociarse a sus ligandos espec
ficos pudiendo regular sus efectos biolgicos.
De los hallazgos encontrados hasta el pre
sente es de esperar que la mayora de los recep
tores para citoquinas estn constituidos por dos
o m s cadenas polipeptdicas y constituyan
complejos multicatenarios. Entre los distintos
complejos multicatenarios encontramos las si
guientes asociaciones;
a. com plejo IL-2R: las acciones de la IL-2
son iniciadas por unin a receptores de su
perficie que estn constituidos por tres cade
nas a , 3 y y. Las cadenas fi y y pertenecen a
la superfam ilia de receptores ele tipo I, en
cambio la cadena a no pertenece a ninguna
familia de las hasta ahora establecida. La ca
dena y se asocia a los receptores de 11-4,
IL7, IL-9 e I L l5 y es requerida para enviar
la seal de transduccin intracelular.
b. complejo IL -6R ; est constituido por una
cadena de SOkD que acta como receptor
propiamente dicho la cual interacta con un
segundo componente la gp 130 kD, molcu
la de transmembrana que contiene dominios
Ig smil y la unidad WS (de igual manera
que el Re de IL-6 propiamente dicho). La
segunda cadena es requerida para generar el
receptor de alta afinidad y la seal de trans
duccin intracitoplasmtica. Est comparti
da por otros receptores por ejemplo, IL -ll,
CNTF, oncostatna M (OSM) y LIE.

235

complejo IL-3R, IL-5R y GM-CSFR: los

receptores para estas citoquinas consisten en
dos componentes, a y 3, ambos miembros de
la superfamilia de tipo I. Cada una de ellas
)osee una cadena a especfica y una cadena
3 de 150 lD que permite la respuesta celu
lar. Esta estructura m ulticatenaria permite
explicar los resultados de com petencia de
unin y la similitud en las acciones biolgi
cas ejercidas por las citoquinas indicadas.
Con excepcin del M-CSF y c-kit, factores de
crecimiento cuyos receptores poseen tirosin-quinasas, los eventos moleculares involucrados en
generar las seales intracelulares por accin de
las citoquinas no estn completamente entendi
dos. Dado el esfuerzo de numerosos laboratorios
es de esperar que en un futuro cercano sean
completamente esclarecidos. Las similitudes es
tructurales entre los receptores de citoquinas po
dra imphear que los mismos utilicen mecanis
mos comunes o estrechamente relacionados para
medial' la seal de transduccin intracelular. Ma
yores consideraciones estructurales y funciona
les sern expuestas en los prximos prrafos.
A continuacin se describirn las caracters
ticas estructurales y funcionales ms importan
tes de las citoquinas de mayor inters que parti
cipan de las distintas fases de la respuesta in
mune, cuyas principales propiedades inmunobiolgicas se presentan en el cuadro 12-2.
INTERLEUQUINAS
Interleuquina 1 (IL-1)
Originalmente se pens que la IL-1 era pro
ducida por la serie monoetica/macrofgica. No
obstante, la IL-1 puede ser producida por una
variedad de otros tipos celulares que incluyen
queratinocitos de la piel, clulas endoteliales,
clulas mesangiales renales, astrocitos, clulas
gliales, clulas ciliares neuronales, clulas NK,
clulas del epitelio crneo, clulas dendrticas
y clulas de Kuffer.
Sin embargo, la principal fuente de produc
cin de la IL-1 son los monocitos/macrfagos
en respuesta a una variedad de estm ulos que
van desde productos bacterianos ta le s como
LPS, la accin de otras citoquinas por ejemplo,
TNF o la misma IL-1, el efecto de adyuvantes
hasta cristales de urato o shca.
Dado que esta citoquina posee una variedad
muy amplia de rganos blanco, desencadena
una serie muy amplia de efectos. Inicialmente
la IL-1 fue descrita acorde con sus funciones,
de all que fuese denom inada anteriorm ente
Factor activador de leucocitos (LAF), Pirgeno
endgeno (EP), Factor de clulas mononuclea-

236

Aspectos bsicos de la inmunidad

Ac
c

/a

c
c
c

w
w

IL-6R gp 1 3 0

c \

c
c

IL-3R |3

IL-2R
Fg. 12-1. Representacin esquem tica de !o.s receptores m ulticatenarios.

Superfamilia de re cep to res h em a to p o y tico s

Superfam ilia del TNF

Superfam ilia d e r e cep to res d e IFN

Superfam ilia d e recep to res

u nid os a p rotena G

Fig. 12-2. R epresentacin esquem tica de las diferentes fam ilias de receptores para citoquinas.

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Aspectos bsicos de la inmunidad

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Citoquinas
res (M CF), M ediador endgeno leucocitario
(LEF), Factor activador de timocitos epidrmi
cos (E T A F), F acto r inductor de p ro te lisis
(PIFX Factor sinovial (SF), catabolina, factor
de proliferacin de fibroblastos, factor activan
te de osteoclastos (OAF), hem atopoyetina 1,
Factor inhibidor del crecim iento de m elano
mas. La accesibilidad a la IL-1 recombinante,
anticuerpos monoclonales y tcnicas de clona
do molecular, ha establecido que todas estas
propiedades son atribuibles a una misma mol
cula la IL-1.
Los estudios bioqumicos y de biologa mole
cular han demostrado que tanto IL-1 humana
como la murina existen en dos formas funcio
nalmente activas I L - la e IL-1 p, cada una de
ellas codificada por un gen independiente aun
que son capaces de reconocer al mismo receptor
sobre las superficies celulares. Ambas protenas
son sintetizadas como precursores de 31-33 kD,
los cuales son clivados por enzimas citoplasmaticas especficas para generar la molcula activa
que posee 15-17 kD. Las IL-1 a y P comparten
una limitada secuencia homloga a nivel de los
aminocidos (22-26%) y las formas activas di
fieren en sus FI 5 y 7 para IL-1 ce y 5 respecti
vamente. Entre las diferentes especies, la se
cuencia aminoacdica de la IL -la est conser
vada entre un 60-70% , m ientras que para la
IL -lp dicho valor oscila entre un 73-78%.
A diferencia de la mayora de las protenas
secretadas, la IL -l posee un precursor de PM
mayor que no posee un pptido hidrofbico se
al N terminal para el clivaje o una secuencia
seal interna, la cual determine la asociacin y
el transporte dentro de la membrana microso
mal y la subsecuente entrada en el camino se
cretorio. Por lo tanto, parecera que la secrecin
de IL-1 podra ocurrir por un camino indepen
diente o que el procesamiento ocurre en el pun
to de secrecin.
La IL-1 humana es activa sobre lneas celula
res murinas, tanto IL -la como la IL -lp, poseen
sitios potenciales de glucosilacin pero las pro
tenas recombinantes no glucosiladas mantienen
su actividad biolgica.
Los ADNc para ambas formas han sido clo
nados en humanos, cerdos, vacas, conejos, rata y
ratn. El gen para IL -ip es de 7,8kb mientras
que el de IL -la posee 10,5kb, ambos se encuen
tran localizados en el cromosoma 2 humano.
La IL-1 es la citoquina ms im portante de
los procesos inflamatorios, infecciones, injuria
tisular y enfermedades malignas, desencadena
una respuesta de fase aguda que se caracteriza
por fiebre, aumento de la permeabilidad vascu
lar y de la sntesis de protenas de fase aguda
(protena C reactiva, glucoprotena cida 1, a,
antitripsina,
macroglobulina y protena amiloide srica) por parte de los hepatocitos. La

239

IL -I entre todas las citoquinas identificadas,

fue la primera para la cual se pudo establecer
sus efectos sistmicos. Entre ellos, el aumento
de temperatura parece ser un hecho fisiolgico
importante que facilita la activacin de los LT.
La IL-1 activa el eje hipotalmico-hipofisario
causando la liberacin de glucocorticoides. Es
tos datos permiten explicar cmo infecciones o
lesiones del SNC conducen a manifestaciones
sistmicas, por ejemplo, respuesta de fase agu
da. H a sido reportado un aumento de II - 1 e
IL-6 luego del dao cerebral por ejem plo, en
enfermedad por el virus HIV.
En el sistema inm une los primeros efectos
descritos lo definan como un factor co-mitognico de los timocitos y dado que ia IL-1 puede
inducir la produccin de IL-6, IFNs e IL -2 por
parte de algunas clulas, sta puede actuar si
nrgicamente con estos mediadores para esti
mular el crecimiento y diferenciacin de los LT
y los LB, clulas NK y clulas LAK.
L a IL-1 es requerida tam bin como factor
co-estimulante de los Ag. y mitgenos para la
activacin de algunas clulas T, estimula la li
beracin de IL-2 por parte de los LT perifri
cos y facilitara la expresin del IL-2R pero es
te efecto podra no ser una accin directa sino
ser debido a la produccin de IL-6 a su vez in
ducida por la IL-1.
La IL -lp es producida por el macrfago en
su form a precursora inactiva mientras que el
pptido precursor de la I L - la es procesado por
la clula a su forma madura antes de ser libera
da, no obstante el pptido precursor de IL -la
de 31kD es activo en s mismo.
De la totalidad de clulas que secretan la
lL-1 el macrfago es el mayor productor. En
h u m an o s se secreta p rep o n d eran tem en te la
IL -lp , mientras que otros tipos celulares pro
ducen preponderantemente IL -la . Los macr
fagos responden a IL-1 liberando PGE^ y pro
duciendo TNF. La PGE^ puede inhibir la pro
duccin de IL-1 por parte del macrfago y re
gular negativamente la expresin de antgenos
del CMH-II, se genera as un proceso autolimitante. La IL-1 tam bin induce la sn tesis de
PGE^ por parte de clulas endoteliales y las c
lulas del msculo liso. Es de resaltar que la IL-1
acta como una citoquina con efecto autocrino
induciendo su propia .sntesis y adems la pro
duccin de TNF e IL-6. Actuando sobre LT ac
tivados induce la sntesis de GM-CSF e IL-4.
Algunas actividades de 1a IL-1 podran ser
de significado patolgico dado que conduce a
una inflam acin crnica o shock sptico. La
IL-1 puede aumentar la expresin de molculas
de adhesin sobre clulas del endotelio vascu
lar. In vivo este efecto conducira a un aumento
del trfico de hnfocitos y neutrfilos hacia el
sitio de inflamacin. La IL-1 tambin induce la

240

Aspectos bsicos de la Inmunidad

proliferacin de fibroblastos y la sntesis de co

lgeno de tipo I, 111 y IV, por lo cual podra
ejercer algn efecto en la patologa de la artritis
reumatoidea. Posee, in vitro accin sobre los
osteoclastos, los condrocitos y sobre clulas si
noviales los que podran actuar en forma sinr
gica con otras citoquinas que conducen a las al
teraciones del cartlago y a la reabsorcin sea
observada en las enfermedades articulares.
En mdula sea, la produccin de IL-1 por
parte de las clulas endoteliales o del macrfa
go podra conducir a la sntesis de factores esti
mulantes de colonias principalmente de la serie
granuloctica y macrofgica (GM-CSF).
La produccin y la actividad de la IL-1 son
m oduladas por una variedad de agentes, por
ejemplo, ACTH. Adems, fue demostrado que
el organismo produce antagonistas endgenos
del IL -IR (IL-lRa) de importancia fisiolgica.
E sta protena acta com petitivam ente por la
unin al receptor de IL-1 (IL-IR), ha sido ori
ginalmente aislada de la orina de pacientes con
leucemias monocticas. El ADNc que codifica
para esta protena indica que posee inform a
cin para la sntesis de un producto de 152 aa,
25 kD y que presenta un 26% de hom ologa
con la IL -ip y un 19% con la IL-1 a. Su accin
inhibitoria es ejercida por unin al receptor de
tipo I, pero esta unin es incapaz de generar
una seal de transduccin. La unin con recep
tores de tipo II es de muy baja afinidad. Si bien
originalmente se vi que era producida por c
lulas monocitos/macrfagos, se encontr tam
bin que la producen los neutrfilos y los fibro
blastos. La secuencia estudiada en el humano,
ratn, rata y conejo muestra entre s un 75% de
hom ologa. Fisiolgicam ente, su produccin
permite limitar los potenciales efectos nocivos
de la superproduccin de IL-1, previniendo la
muerte por shock sptico producido por LPS y
el desarrollo de las cohtis inducidas por com
plejos inmunes, entre otros. En la actualidad, la
posible utilizacin del IL -lR a esta siendo eva
luada en ensayos preclnicos.
La mayora de las acciones de la IL-1 son
mediadas por efectos transcripcionales que in
volucran la translocacin del complejo NF-kB
desde el citoplasma al ncleo. Esa transloca
cin se logra una vez que en el citoplasma el
com plejo NF-kB se disocia en la subunidad
I-kB y la subunidad NF-kB, la cual m igra al
ncleo y produce la activacin gentica. La ac
tivacin del proceso de disociacin del comple
jo NF-kB involucra la activacin de quinasas
dependientes de ceramida.
El receptor de IL-I (IL-IR)
Los efectos producidos por la IL-1 a y P re
sultan de la unin de cualquiera de ellas con el

receptor celular. El IL-IR puede ser de dos fipo s 1 o II, am bos p o seen un v alo r de Kd
5 X 10-'M. El IL -IR de tipo I es una protena
de 80 kD presente en la superficie de LT, fibro
blastos, queratinocitos, clulas endoteliales,
condrocitos y hepatocitos. stos han sido clo
nados, secuenciados y expresados en LT y fi
broblastos tanto en el humano como en el ra
tn. Se conoce que posee tres dominios de 319
aa, 21 aa y 217 aa que constituyen las porcio
nes extracelular, transmembrnica e intracelu
lar respectivamente. El IL-IR de tipo II es una
protena de 68 kD que se expresa sobre los LB
y las clulas PMN. Ambos son miembros de la
superfamilia de las inmunoglobulinas.
En general, el IL-IR de tipo I une mejor a la
IL-1 a mientras que el IL -IR de tipo II posee
mejor capacidad para unir IL -ip . El IL -IR de
tipo II acta como precursor de una forma solu
ble del IL -IR que antagoniza y modula la acti
vidad de la IL-1. Ambos receptores muestran
aproximadamente un 28% de homologa en su
dominio extracelular. A nivel del dominio intra
citoplasmtico se observ que mientras que el
IL-I R de tipo I est constituido por 213 aa, el
de tipo II solamente presenta 29 aa. Estudios
realizados indican que el receptor de tipo I es el
nico involucrado en la gnesis de la seal de
transduccin y por ende es responsable de pro
ducir los efectos biolgicos de esta citoquina.
In te rle u q u in a 2 (IL-2)

La IL-2, in icialm ente denom inada T cell

growth factor (TCGF), es una glucoprotena que
induce la proliferacin de los LT de manera au
tocrina y favorece la expansin clonal de las c
lulas que han sido impactadas por el Ag. Condu
ce a las clulas de la fase Gj a la fase de sntesis
(S), permitiendo la produccin de IL-2 y la ex
presin sobre la membrana celular del receptor
especfico (IL-2R). Tambin acta de manera
paracrina, ejerciendo su accin sobre clulas ve
cinas del sistema inmune o no inmune.
Es producida por los LThl (CD4+) y en me
nor cantidad por las clulas CD8+, clulas NK,
m acrfagos y clulas LGL, del ingls large
granulocytes lymphocytes.
La IL-2 es una glucoprotena de 15-18 kD
que presenta diferentes grados de glucosilacin
por lo cual tambin presenta un rango de Pl
que la caracterizan 6.6-8.2. Aunque es una mo
lcula glucosilada, los hidratos de carbono no
son esenciales para ejercer sus efectos biolgi
cos, dado que la IL-2 recombinante obtenida en
clulas procariticas es igualmente efectiva en
la activacin de los LT. La IL-2 murina presen
ta un 63% de hom ologa en la secuencia de
aminocidos con la IL-2 humana, siendo ambas
activas sobre lneas celulares murinas.

Citoquinas
El gen ha sido clonado, se encuentra ubicado
en el cromosoma 4 humano. Posee informacin
para la sntesis de una protena de 153 aa, la
que presenta una secuencia seal o lder de 20
aa. Esta secuencia es clivada para obtener la
protena madura, que contiene tres residuos de
cistena conservados, dos de los cuales generan
un puente disulfuro el que es requerido para
desarrollar su actividad biolgica. La estructura
cristalogrfica revela que es una protena glo
bular, conteniendo dos regiones a hlice, sin
presentar conformacin lmina [3. Dicha estruc
tura conformacional es caracterstica de prote
nas que interactan con receptores de la familia
de Tipo L El proceso de secrecin se realiza
por la va clsica para lo cual presenta una se
al hidrofbica. La sntesis conduce a un nivel
mximo de secrecin a las 4 horas y es inhibida
por corticoides, ciclosporina A y PGs.
Las principales acciones de la IL-2 se ejer
cen sobre los LT, lo cual conduce a una expan
sin de la respuesta inm une cuya m agnitud
puede ser estim ada por determinacin de los
niveles de IL-2. Sobre dichas clulas tambin
posee actividad para inducir la sntesis de IFNy
y lini'otoxina (TNFP) y es capaz de programar
los hacia la apoptosis.
Acta como factor de crecimiento y diferen
ciacin para las clulas NK, LB, puede activar
a los macrfagos y neutrfilos. Sobre el SNC
acta como inmunomodulador, favoreciendo el
crecimiento de las clulas gliales. Sobre los LB
estimula la sntesis y secrecin de anticuerpos
pero no induce cambios en el isotipo secretado
(switching). Las clulas NK son estim uladas
cuando existen altos niveles de IL-2 capaces de
unirse a receptores de tipo py, lo que induce la
produccin de IFN y y potencia la accin citoKtica de estas clulas generando las llamadas c
lulas LAK (lymphokine activated killer cells).
El receptor de IL-2 (IL-2R)
La IL-2 ejerce sus acciones biolgicas a tra
vs de un complejo receptor multicatenario. Si
bien los prim eros estudios indicaban que la
IL-2R era un heterodmero constituido por las
cadenas a (anteriormente Tac) y p, hoy se co
noce cjue existe un tercer integrante, la cadena
y, la que es compartida por receptores de dife
rentes citoquinas (fig. 12-3). De la com bina
cin de dichas cadenas se producen diferentes
formas denominados receptores de baja, inter
media y alta afinidad las que poseen Kd 10 *,
10 * - 10 y 10 "M respectivamente. El recep
tor de afinidad intermedia esta constituido por
las cadenas P y y; se expresa sobre LT en repo
so. El receptor de alta afinidad est constituido
por las cadenas a, p y y; se expresa solamente
cuando el hnfocito est activado.

241

Las cadenas a, P y y son glicoprotenas de 55

kD, 75 kD y 64 kD. Los genes que regulan sus
sntesis no estn relacionados. La cadena a tie
ne un dominio extracelular de 219 aa, una re
gin transmembrana de 19 aa y la regin intracitoplamtica es corta, constituida por 13 aa. La
cadena a no se expresa constitutivam ente en
linfocitos en reposo pero es inducida r p id a
mente luego de la activacin del LT, puede ex
presarse anmalamente en leucemias y otros
desrdenes del sistema inmune. La cadena p,
est constituida por 214 aa en su dominio extracelular, 25 aa en la regin de transmembrana y
286 aa correspondientes a la cola intracitoplas
mtica. Esta ltima cadena, esta involucrada en
el envo de la seal de transduccin. La cadena
y es una protena de 347 aa de los cuales 232 aa
corresponden al dominio extracelular, 29 aa a la
regin transmembrana y 86 aa corresponden al
dom inio intracitoplasm tico. E sta cadena se
asocia a la cadena P y es necesaria para que se
produzca la internalizacin del ligando que
acompaa a la transduccin de seal. La cadena
y se expresa en Ja mayora de las clulas linfoi
des pero slo posee capacidad para unir la IL-2
cuando la cadena P est presente.
La expresin en fibroblastos del ADNc de la
cadena a genera un receptor de baja afinidad,
incapaz de traducir seal alguna de activacin.
La co-expresin con la cadena P permite obte
ner un receptor de afinidad intermedia que tam
poco puede efectuar la transduccin de seal.
La expresin de las cadenas p y y posee tam
bin una afinidad intermedia pero en este caso
concentraciones relativamente altas de IL-2 le
permiten enviar una seal de activacin. A pe
sar de ello, la seal solamente ser asegurada si
los dominios intracitoplasmticos de las cade
nas p y y se encuentran en estrecha relacin y
existe conjuntamente la co-expresin de la ca
dena a , la cual aumenta significativamente la
afinidad por el ligando. Cada una de las formas
del receptor indicadas, posee patrones cinticos
que las caracteriza (cuadro 12-3). Si se analizan
los tiem pos medios de asociacin y d iso cia
cin, se concluye que el organismo se asegura
de esa manera que la lL-2 sea unida, retenida e
internalizada en el rango de concentraciones fi
siolgicas.
La mayora de las clulas NK expresan cons
titutivamente el receptor de afinidad intermedia
y una subpoblacin de clulas NK (C D l6^), ex
presa el receptor de alta afinidad; Ambas po
blaciones manifiestan aumento de la actividad
citotxica luego de la incubacin de IL-2 pero
slo aquellas que expresan el receptor de alta
afinidad seran de importancia desde el punto
de vista fisiolgico.
Los monocitos humanos responden a la IL-2
con aumento del nivel del ARNm para IL-1 y

242

Aspectos bsicos de ia inmunidad

IL-2

F ig. 12-3. C om plejo m ulticatenario receptor de IL-2.

al mismo tiempo aumentan su actividad citot

xica. Estas clulas expresan solamente el re
ceptor de afinidad intermedia.
La form a soluble del recep to r a ha sido
identificada en pacientes con enferm edades
malignas, autoinmunes, enfermedades parasita
rias, etc. Se supone que el mismo sera produ
cido por clivaje proteoltico y ejercera un efec
to regulatorio sobre el sistema inmune. T am
bin se ha informado la existencia de formas
solubles de la cadena (3.
A pesar de los avances en el conocimiento
del complejo multicatenario receptor de la IL2, los eventos intracelulares que llevan a la ac
tivacin celular no estn completamente enten
didos. Hasta el presente es conocido que la ca
dena (3 carece de una secuencia de unin para
el ATP pero se unira fsica y funcionalmente a
otras m olculas para p roducir la activacin.
Existe una asociacin a travs de una regin
acdica del dom inio intracitoplasm tico con
una protena de la familia src tirosin-quinasas

(p56') capaz de activar protooncogenes nu

cleares. Otra 1egin diferente de la cadena p interactuara con el sistema de quinasas JAK, he
cho en que tambin podra estar implicada la
cadena y aunque no est completamente deter
minado todava.

Interleuquina 3 (IL-3)
La IL-3 es un factor pleiotrpico que fuera
previamente conocido como factor estimulante
de mltiples colonias (MCSF), B cell stimula
ting factor, mast cell growth factor. Es produ
cida por los LT activados, clulas epiteliales tmicas, queratinocitos y mastocitos.
La IL-3 es una glucoprotena de 26-28 kD
constituida por 134/140 aa que, si bien presenta
dos variantes murinas que se diferencian en la
regin N terminal, ambas poseen los mismos
efectos biolgicos. No obstante ser una mol
cula glucosilada, los hidratos de carbono no
son esenciales para ejercer su rol biolgico.

C u ad ro 12-3. Parmetros cinticos del receptor de IL-2

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10

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Transduccin de seal

no

no

Citoquinas
Los genes que regulan su sntesis se ubican
en el cromosoma 5 humano y 11 murino, liga
dos a los genes de IL-4, IL-5 y GM-CSF. El
ADN codifica la expresin de una protena que
es posteriormente clivada para originar la m o
lcula madura, la cual posee un puente disulfu
ro intracatenario el que es esencial para su acti
vidad. Existe un 29% de homologa entre las
protenas murinas y humana y los efectos son
especie especficos.
Produce efectos sobre el crecimiento de to
dos los linajes hematopoyticos; es responsable
de la proliferacin de progenitores multipotenciales en los primeros estadios de su desarrollo.
A cta sin rg ic a m e n te con la IL -1, IL -6 y
G'CSF. Fuera del sistema hematopoytico ac
ta fundamentalmente sobre los mastocitos de
mucosas, clulas intestinales y drmicas. Tam
bin es un importante mediador de las respues
ta inflamatorias y es capaz de inducir la expre
sin de antgenos del CMH de clase I y de las
molculas de adhesin (LFA-1) de macrfagos
peritoneales. Acta sinrgicamente con agentes
que facilitan la produccin de IL-1 pero no
produce aumento de la citotoxicidad mediada
por los macrfagos. Sobre los eosinfilos pro
mueve la fagocitosis y la quimiotaxis.
El receptor de lL-3 (IL-3R)
Las acciones biolgicas de la IL--3 son ejer
cidas por unin a un receptor especfico. Los
estudios realizados indican que existe una for
ma nica del IL-3R de alta afinidad en las clu
las hematopoyticas humanas. En cambio las
clulas hematopoyticas murinas presentan dos
formas, una de alta y otra de baja afinidad. Bl
receptor de alta afinidad, tanto humano como
murino es un heterodmero formado por las ca
denas a y p. La cadena a es especfica de la
IL-3, posee un PM de 70 kD mientras que la
cadena p posee 120-150 kD de PM y es comn
a otros receptores.
Se ha obtenido el ADNc de la cadena a hu
mana, el cual codifica para una protena de 360
aa, forma parte de los receptores de citoquinas
de Tipo I. Esta cadena puede unir la IL-3 con
baja afinidad pero la co-expresin junto a la .su
bunidad p evidencia la presencia del receptor
de alta afinidad. El sistema murino est siendo
estudiado, se ha podido clonar la cadena p, la
que presenta dos formas alternativas que pre
sentan una hom ologa del 91%. Se cree que
han surgido por duplicacin gentica a posteriori de la divergencia entre las especies huma
na y murina.
El m ecanism o involucrado en la seal de
transduccin no est completamente dilucida
do, ha sido sugerida la participacin del siste
ma lA K - STAT.

243

In terle u q u in a 4 (IL-4)
L a IL -4 fue d e n o m in ad a p rim a ria m e n te
B cell stimulcitory fa cto r (BCSF). Es una glucoprotena de 20 kD, producida por los linfoci
tos CD4+ (Th2) pero tambin la sintetizan los
timocitos fetales, LT CD8+ y en menor propor
cin los mastocitos activados, las clulas basfilas y lneas celulares de LB CD5+.
El gen ha sido clonado, tanto humano como
murino. Posee informacin para la sntesis de
protenas de 153 aa y 140 aa respectivamente.
Este precursor es clivado para originar la pro
tena madura de 129 aa y 120 aa. Es una prote
na globular, que posee cuatro regiones de con
formacin a hlice. Ambas poseen potenciales
sitios de glucosilacin y seis residuos conser
v ad o s de cisten a resp o n sa b le s de g e n e ra r
puentes de sulfuro intracatenarios. Si bien es
una protena glucosilada, los azcares no son
im portantes para ejercer in vitro su actividad
biolgica. Tanto la IL-4 humana como murina
presentan actividad especie especfica.
L a IL-4 posee mltiples funciones inmunorreguladoras, acta sobre los LT, LB, inanocitos, neutrfilos, fibroblastos, clulas epitelia
les, endoteliales y progenitores hem atopoyti
cos. Es fundamentalmente un factor regulador
de las reacciones alrgicas. Estimula el creci
miento de los LT en desarrollo, siendo im por
tante modulador de la diferenciacin de LTh2
de manera autocrina. En cambio ejerce accio
nes de retroalim entacin negativa so b re los
L T h l, como consecuencia de estos hechos la
IL-4 permite un desplazamiento hacia la res
puesta inm une hum oral en detrim ento de la
actividad NK y de la inmunidad m ediada por
clulas.
La IL-4 acta sobre los LB en reposo, favo
rece su proliferacin y diferenciacin. Produce
un aumento de la expresin de CD23 y de ant
genos del CMH de clase II, favoreciendo as el
rol del LB en la presentacin antignica y jue
ga un rol crtico favoreciendo la secrecin de
anticuerpos y el cam bio de isotipos h acia la
IgE y la IgG4,
Sobre los macrfagos favorece la expresin
de antgenos de superficie e inhibe la produc
cin de IL-1, IL-6, lL-8, T N F a, NO y PGs.; en
cambio, aumenta la produccin de L -lR a . A
nivel de mdula sea, puede ejercer efectos si
nrgicos con la IL -11. Estiinula la expresin de
molculas de adhesin (VCAM-1) sobre clu
las endoteliales. Acta sobre fibroblastos esti
mulando su proliferacin y favoreciendo la se
crecin de colgeno. Acta como factor de cre
c im ien to para m asto cito s y puede te n e r un
efecto activador sobre la funcin del epitelio
intestinal, accin que cumple en forma sinrgi
ca con la IL-3.

244

Aspectos bsicos de ia inmunidad

El receptor de IL-4 (IL-4R)

Los efectos biolgicos son ejercidos por
unin a receptores de superficie, el IL-4R per
tenece a los receptores complejos multicatena
rios. El receptor de alta afinidad est constitui
do por una cadena a especfica y una cadena y
comn a otros receptores. Una forma soluble
ha sido detectada tanto en los fluidos murinos
como en los humanos.
El ADN que codifica para la cadena espec, fica ha sido clonado para el ser humano y para
el ratn. La cadena humana es una protena de
transmembrana de 140 kD, constituida por 800
aa; 207 residuos corresponden al dominio ex
tracelular, 24 a la regin transmembrana y 569
al dominio intracelular. Esta cadena pertenece
a la superfamilia de receptores de tipo I y for
ma parte tambin del receptor para lL-13, citoquina con la que comparte la mayora de las
funciones biolgicas. La interaccin de la cade
na a con la cadena |3 le confiere una incremen
to en cinco veces el valor de su constante de
afinidad. Una forma soluble del IL-4R a ha si
do identificado en el ratn y en el hombre. El
IL-4Rs acta como inhibidor competitivo para
la LL-4.
La interaccin de la IL-4 con el complejo re
ceptor conduce a la activacin de las quinasas
de Jak 1 y Jak 3. Tambin se observ la fosfo
rilacin de la subunidad receptora a y de resi. dos tirosina de las protenas STAT.
Interleuquina 5 (IL-5)
La interleuquina 5 inicialmente denominada
T cell replacing factor (TRF) o B cell growth
factor II, es un factor soluble producido por los
LTh2, eosinfilos y mastocitos activados. La
IL-5 es una protena glucosilada de 20 kD, que
genera un homodmero glucosilado a travs de
uniones de puente disulfuro, con un PM apa
rente de 45kD.
Su principal funcin es estimular la quimio
taxis y activacin de los eosinfilos, hecho que
permite al sistema inmune que los LT puedan
regular la respuesta inflamatoria a travs de los
eosinfilos y la respuesta efectora celular diri
gida contra helmintos. Tambin acta en los l
timos estadios de diferenciacin de los eosin
filos para lo cual posee accin sinrgica con los
factores estimulantes de colonias. La IL-5 es
responsable de la eosinofilia encontrada en las
infecciones parasitarias.
Acta sinrgicamente con otras citoquinas es
timulando el crecimiento y diferenciacin de los
LB y slo por un lapso breve favorece la secre
cin de Igs, estimulando la produccin de IgA.
El gen que posee informacin para la IL-5 se
ubica en el cromosoma 5 humano y 11 murino.

El ADN, tanto humano como murino, contiene

informacin para la sntesis de una protena ma
dura constituida por 112 aa. Las protenas recombinantes han sido obtenidas utilizando sis
temas de expresin procariticos y eucariticos.
Ello permiti analizar el rol de los azcares que
lo constituyen, se sabe por dichos estudios que
la N-glucosilacin le confiere estabilidad trmi
ca a la molcula. La IL-5 humana y murina po
seen un 70% de homologa y son capaces de
producir reacciones en sistemas cruzados, es
decir, que no existe especificidad de especie.
El receptor de IL-5 (IL-5R)
El receptor para IL-5, ha sido identificado en
la superficie de clulas hum anas y murinas.
Las clulas humanas expresan un receptor de
alta afinidad; en cambio, las clulas murinas
presentan dos formas: una de alta y otra de baja
afinidad. En ratones, el IL-5R presenta al me
nos dos protenas de membrana denominadas a
o p60, la cual es capaz de unir especficamente
a la citoquina con baja afinidad y una segunda
cadena de mayor PM, denominada |3, que per
m ite gen erar el recep to r de alta afin id ad y
transducir la seal de activacin.
El ADN para la cadena a , codifica la infor
macin para una glucoprotena de 415 aa. El
dominio extracelular de esta cadena contiene 4
residuos de cistenas conservadas y prximo a
la m em brana celular presenta la unidad WS,
caracterstica de receptores de tipo 1. La cadena
P murina es compartida por los receptores para
IL-3 y GM-CSF. Si bien esta cadena no es ca
paz de unir por s misma a ninguna de las citoquinas incluidas, su expresin junto con la ca
dena a especfica estabiliza la unin. A dife
rencia del receptor murino, el IL-5R humano
posee una cadena a que le perm ite unir a la
IL-5 con alta afinidad, a pesar de ello la cadena
P es requerida para formar el complejo multi
catenario da alta afinidad, capaz de generar la
seal de transduccin. Las cadenas a humana y
murina presentan un 79% de homologa a nivel
de los aminocidos. Tal como ocurre con otros
receptores una forma soluble de la cadena a ha
sido detectada, la cual se genera por empalme
{splicing) alternativo y actuara com o ele
mento regulatorio de la respuesta inmune.
Interleuquina 6 (IL-6)
La IL-6 es una protena monomrica. Si bien
es producida principalmente por los macrfa
gos, tambin es secretada por las clulas del
endotelio vascular, fibroblastos y por algunos
LT activados, en respuesta a la estimulacin de
IL-1 y en menor grado al TNF. A su vez su
produccin es inhibida por la IL-4 y la IL-13.

Citoquinas
fil ADNc para la IL-6 humana y murina ha
sido clonado, los genes se encuentran ubicados
sobre os cromosomas 7 y 5 respectivamente.
Codifican para precursores de 212 y 211 aa, los
que posee una secuencia hidrofbica seal de
28-y 24 aa. Poseen dos sitios potenciales de
glucosilacin, sin embargo la presencia de los
hidratos de carbono no son esenciales para el
desarrollo de la actividad biolgica. La prote
na madura posee un PM de 26 kD y est cons
tituida por 184 aa. Ambas protenas presentan
un 65% de homologa en la secuencia nucleot
dica y de 42% en la secuencia de aa. La IL-6
humana y murina son igualmente activas sobre
clulas murinas, pero la IL-6 murina no ejerce
acciones sobre clulas humanas.
La IL-6 comparte acciones biolgicas con la
IL-1 pero a diferencia de ella no causa trombosi.s intravascular ni injuria tisular. Las mejores
acciones descritas son la accin sobre los hepa
tocitos a los que estimula para producir prote
nas de fase aguda. Posee una importante accin
sobre LB para los que acta como factor de
crecimiento en las ltimas etapas de la diferen
ciacin celular. La IL-6 es un factor de creci
miento para mielomas y plasmocitomas y pue
de tener un efecto co-estimulante sobre los LT
maduros y los timocitos.
El receptor de IL-6 (IL-6R)
El complejo receptor de IL-6 est constitui
do por dos cadenas glucoproteicas pertenecien
tes a superfamilia de Igs. La menor de ella po
see un PM de 80 kD, es la subunidad de unin
especfica (IL-6R). La segunda cadena posee
un PM de 130 kD (gpl30), es una cadena polipeptdica com partida con otros receptores de
factores de crecimiento. La cadena IL-6R hu
m ana est form ada por 468 aa; p resen ta un
54% de homologa con la cadena L-6R muri
na, la cual est constituida por 460 aa. La re
gin extracelular de ambas especies esta inte
grada por un dominio Ig. smil y otro dominio
perteneciente a la estructura de receptores de ti
po I (unidad WS). La gp 130 posee 77% de ho
mologa a nivel de la secuencia amonoacdica
entre la cadena humana y la murina y tambin
es una estructura que presenta un dominio Ig
smil y otro de receptor de citoquinas de tipo I.
Una forma soluble de 50 kD ha sido detectada
en humanos. Esta forma actuara facilitando la
reactividad de IL-6 por lo que sera capaz de
unirse directamente a la gp 130. Por otro lado,
ha sido encontrada una forma soluble de la ca
dena gp 130 la que puede inhibir la actividad
dei complejo IL-6/IL-6Rs indicando la comple
jidad del sistema regulatorio.
La presencia de ambas cadenas es requerida
para generar el receptor de alta afinidad y el

245

subsiguiente envo de la seal de traduccin.

La exacta composicin del complejo IL-6R no
est determinada. Algunos investigadores su
gieren que dos unidades de IL-6 se asocian con
una molcula del receptor. Otros sugieren que
una molcula de lL-6 se asocia con una de IL6R y que este complejo se une luego a gp 130 e
induce su dimerizacin. Si bien la gp 130 no
posee actividad tirosin-quinasa intrnseca, se ha
encontrado que se asocia a la familia de quina
sas Jak, lo que lleva a una rpida fosforilacin
de protenas STAT. Tambin ha sido informa
da la activacin de RAS y MAPK esenciales
para la activacin del factor NF-IL6.
Interleuquina 7 (IL-7)
La interleuquina 7 fue inicialmente denomi
nada linfopoyetina I y fue reconocida como un
factor capaz de inducir la proliferacin de lin
focitos pre-B m urinos. E studios posteriores
permitieron atribuirle una gran variedad de ac
ciones biolgicas que afectan tambin al linaje
T. La IL-7 es producida por un variedad de c
lulas que incluyen al LB, fibroblastos de mdu
la sea, clulas epiteliales y timocitos a nivel
cortical.
El ADNc murino ha sido aislado, el mismo
posee informacin para la sntesis de una pro
tena constituida por 154 aa, de los cuales 25 aa
corresponden al pptido seal. La protena po
see seis residuos de cistena y dos potenciales
puentes disulfuro. La protena madura presenta
un PM de 20-25 kD. El ADNc humano permite
la sn tesis de una p ro te n a c o n stitu id a por
177 aa, la diferencia con el murino se debe a la
insercin en el gen de un exn extra el cual so
lamente se encuentra en el genoma humano. La
protena originada presenta seis residuos de
cistenas conservados y tres sitios potenciales
de gluco.silacin. El PM estimado es de 17.4
kD. Ambas protenas, murina y hum ana, pre
sentan un 70% de homologa y mientras que la
IL-7 humana posee actividad sobre clulas mu
rinas, la IL-7 murina carece de efectos sobre
las clulas humanas.
La accin primaria atribuida la comprometa
con el linaje B, por su capacidad para favorecer
la diferenciacin de linfocitos pre-B . Actual
mente es claro que tambin favorece el creci
miento y la diferenciacin de clulas LT huma
nas y murinas, con accin a nivel del reordena
miento de los genes de receptor T. Se ha de
mostrado asimismo que estimula la prolifera
cin de LT maduros, favorece el desarrollo y la
actividad citotxica de clulas CD8" y clulas
LAK. Debido a estas ltimas acciones la IL-7
es un muy buen candidato para el tratamiento
de inmunodeficiencias primarias as como para
la inmunoterapia del cncer.

246

Aspectos bsicos de la inmunidad

El receptor de lL-7 (IL-7R)

Sus acciones biolgicas son ejercidas a tra
vs de receptores de superficie, IL-7R, el cual
es un complejo multicatenario de alta afinidad.
Est constituido por dos cadenas polipeptdicas
correspondientes a la superfamilia de recepto
res de tipo 1, una es la subunidad especfica de
nominada a y la segunda cadena y, com n a
otros receptores de citoquinas. El IL-7R huma
no presenta dos formas una de alta (Kd lO^'^M)
, y otra de baja afinidad (Kd 10 ^M), la cadena y
participa en la formacin del receptor de alta
afinidad. El estudio del receptor murino perm i
ti identificar tres formas para el IL-7R, un re
ceptor de baja afinidad (Kd 1.45 lO^^M), un re
ceptor de afinidad intermedia (Kd 2.5 10 'M) y
una forma de alta afinidad (Kd 4 1 0 ^M) de la
cual participa la cadena y.
Interleuquina 8 (IL-8)
La IL-8 integra la familia de citoquinas in
flamatorias de bajo peso molecular que han si
do referidas como quemoquinas, entre las cua
les la IL-8 es la mejor caracterizada. Estas citoquinas presentan la particularidad estructural
que las caracteriza, la presencia de cuatro resi
duos conservados de cistena. Acta como fac
tor quimiotctico y activante para los neutrfi
los y en menor grado para los basfilos y los
linfocitos.
La IL-8 es producida por fagocitos mononu
cleares, LT activados, neutrfilos, eosinfilos,
fibroblastos, clulas endoteliales, plaquetas,
queratinocitos, hepatocitos, condrocitos, astrocitos y clulas NK.
El ADNc humano indica que el precursor
proteico posee 99 aa, el cual genera una prote
na madura de 8kD. A pesar de que la IL-8 es
capaz de generar puentes disulfuro intereatenarios, no est aclarado an si la forma biolgica
mente activa est constituida por la forma m o
nomrica o dimrica. Se han obtenido produc
tos maduros que difieren el nmero de aa que
los constituyen (69-72-77 aa) dependiendo de
la fuente celular utilizada. El pptido de 72 aa
es el que posee mayor potencia biolgica, este
hecho sugiere la existencia de un mecanismo
de activacin el que podra requerir de un cli
vaje proteoltico.
La IL-8 ejerce adems un gran nmero de
actividades pro-inflamatorias. Produce degra
nulacin de los neutrfilos, induce la expresin
de molculas de adhesin y favorece as la ad
herencia de los neutrfilos a las clulas endote
liales. Posee efecto co-mitognico para los que
ratinocitos y acta como factor autocrino en
ciertos melanomas.

El receptor de IL-8 (IL-8)

Los efectos biolgicos son desarrollados a tra
vs de receptores de superficie (IL-8R). En el ser
humano han sido documentadas dos entidades
las que se cree que surgieron por duplicacin ge
ntica. Ambas poseen 77% de homologa, se las
denomina IL-8R tipo I o a e IL-8R tipo II o |3.
Son miembros de los receptores de citoquinas
acoplados a protena G y poseen capacidad para
unir a su ligando especfico con alta afinidad.
Interleuquina 9 (IL-9)
La IL-9 en una glucoprotena derivada de los
LT, tanto CD4^ como CD8+, la que favorece la
sobrevida de lneas celulares T y la actividad
de los mastocitos.
El ADNc para IL-9 humana y de ratn han
sido clonados. El gen humano se ubica sobre el
cromosoma 13 y el murino en el cromosoma 5.
Ambos codifican la sntesis de protenas pre
cursoras de 144 aa, en los cuales los 18 prime
ros aa corresponden al pptido seal. La prote
na madura presenta un PM predecible de 14 kD
conteniendo cuatro sitios potenciales de gluco
silacin. Las protenas humanas y murinas pre
sentan una homologa de 56% a nivel de la se
cuencia de aa y de 67% a nivel de los residuos
mucleotdicos. La IL-9 murina es activa sobre
clulas humanas pero la IL-9 humana no lo es
sobre las clulas murinas.
La IL-9 es un factor que perm ite el creci
miento de las clulas mieloides y de los masto
citos. En mdula sea acta sinrgicamente con
la eritropoyetina (EPO), perm ite el cultivo a
largo plazo de los LT activados, tanto CD4+ co
mo CD8+. En el ratn, han sido comunicadas
acciones a nivel de los timocitos lo que facili
tara la ontogenia de los LT. La lL-9 acta so
bre los LB, tiene accin sinrgica con la IL-4
potenciando la produccin de IgG e IgE.
El receptor de IL-9 (IL-9R)
El receptor de superficie para la IL-9 perte
nece al grupo de receptores multicatenarios que
comparten la cadena y. Adems, posee una ca
dena especfica (IL-9R). Los ADNc p ara el
IL-9R han sido clonados, tanto en humano co
mo murino, codifican la sntesis de protenas
de 533 aa y 468 aa respectivamente. Los IL-9R
humano y murino presentan 53% de hom olo
ga, pertenecen a la superfamilia de receptores
hematopoyticos o de tipo I. Tambin ha sido
aislado un ADNc que posee informacin sobre
la sntesis de una forma soluble del receptor la
que resultara de la deleccin de los dominios
transmembrnico y citoplasmtico de la cadena
especfica del IL-9R.

Citoquinas

247

Interleuquina 10 (IL-10)

El receptor de IL-10 (IL-IOR)

La IL-10 fue inicialmente denominada factor

inhibidor de la sntesis de citoquinas (CSIF),
fue descubierta como un producto de los LTh2
capaz de inhibir la produccin de citoquinas
por parte de los L T h l. La 11-10 es producida
por los LTh2, los timocitos fetales activados,
los macrfago, los LB normales y los querati
nocitos.
A partir de los estudios realizados sobre su
actividad biolgica, se lleg a aislar el ADNc
de IL-10 murino y subsecuentemente por hibridizacin cruzada se aisl el ADNc humano.
Los genes se encuentran ubicados sobre el cro
mosoma 1 y poseen 81 % de homologa a nivel
de la secuencia nucleotdica. Las protenas ob
tenidas poseen un 73% de homologa. Los pre
cursores sintetizadas estn constituidas por 178
aa, poseen una seal hidrofbica que una vez
clivada origina una protena de 160 aa, la que
contienen cinco residuos de cistena conserva
dos y dos sitios potenciales de glucosilacin.
La protena murina posee un PM 17-20 kD, de
pendiendo del grado de glucosilacin. La IL-10
humana en cambio no presenta glucosilacin y
su PM es de 18 kD. Ambas interleuquinas son
lbiles en medio cido. La IL-10 humana es ac
tiva sobre clulas m urinas m ientras que la
IL-10 murina no es activa sobre clulas hum a
nas.
La IL-IO posee acciones pleiotrpicas, tiene
efectos inmunosupresores y en otros casos pue
de ejercer efectos estimulatorios.Tiene accin
regulatoria de la actividad de los L T hl, inhi
biendo la produccin de IFN y e IL-2, sin em
bargo en la actualidad se estim a que esta ac
cin sera un efecto indirecto, dado que la ac
cin primaria se ejercera sobre los macrfagos
previniendo la produccin de la IL-12.
La IL-10 puede regular la expresin de m o
lculas del CMH de tipo II y es un potente in
munosupresor de las actividades de los macr
fagos. Sobre estas clulas suprime la produc
cin de PGEj, de citoquinas pro-inflamatorias
(TN Fa, IL-1, IL-6, IL-12) y de molculas de
adhesin (lCAM-1 y B7). Por otro lado, favo
rece la produccin del IL -lR a y la produccin
de receptor soluble para el TNF. Tambin fa
vorece la expresin de FcyR (CD64), hecho
que permite un aumento en la actividad de citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC)
ejercida por los macrfagos. Sobre estas clu
las tambin suprime la accin del anin super
xido y modula la sntesis de NO.
Dado que la IL-10 favorece la proliferacin
de los LB y la secrecin de IgA, IgG, e IgGj
tendra fundamental importancia en el desarro
llo de la respuesta inmune humoral.

El receptor para IL-10 (IL-IOR) es una glu

coprotena de 110 kD; en el ratn est consti
tuido por 561 aa y en el hombre por 557 aa,
existiendo entre ellos un 60% de homologa. El
IL-IOR est estrueturalmente relacionado con
el receptor de IFNs, une a la IL-10 con alta afi
nidad (Kd 7-20*'M).
Interleuquina 11 (I L -ll)
La IL -II es un factor pleiotrpico con fun
cin sobre la hematopoyesis, la hnfopoyesis, la
respuesta de fase aguda y el desarrollo de adipocitos, neuronas y osteoclastos. Es producida
por las clulas del estroma de mdula sea, fi
broblastos, clulas del trofoblasto, condrocitos
y clulas sinoviales. Su produccin es inducida
por la IL -l y el TGF.
El ADNc para humano, primate y ratn ha
sido clonado y secuenciado, existe una hom o
loga del 90% entre ellos. El ADNc hum ano
contiene informacin para una protena precur
sora de 199 aa, de los cuales 21 aa correspon
den al pptido seal, el que es clivado para ori
ginar la protena madura. Esta protena posee
un P l 11.7 y no posee ni residuos de cistenas
conservadas ni sitios potenciales de glucosila
cin. Su PM es de 19 kD y el gen se encuentra
ubicado en el cromosoma 19 humano.
L a IL-11 posee m ltiple efectos sobre las
poblaciones hem atopoyticas actuando como
factor de crecimiento; estim ula la megacariopoyesis y sinergiza las acciones con la IL-3,
IL-4 y GM-CSF. Su efecto lo ejerce abrevian
do el perodo Go de la diferenciacin temprana
de los progenitores hematopoyticos. Tambin
favorece la accin de la IL-7 sobre el pre LB.
A nivel de los hepatocitos favorece la snte
sis de las protenas de fase aguda, tambin pro
mueve la diferenciacin neuronal y acta como
inhibidor de la adipognesis.
El receptor de IL-11 (IL-1 IR )
Las acciones biolgicas se desencadenan por
interaccin eon un receptor de alta afinidad. El
complejo multicatenario IL-1 IR est constitui
do por una cadena a , miembro de la fam ilia de
receptores de hemopoyetinas y es capaz de unir
a la IL -II con baja afinidad. Esta cadena es si
milar a la cadena a del IL-6R y como ella inte
racta con la g p l3 0 para generar la seal de
transduccin. Los resultados del estudio de los
mecanismos de activacin mediadas por lL-11
muestran la participacin de protenas quinasas
Jak 1 y 2, junto con un nuevo miembro de la
familia de protenas STAT (APRF/STAT3).

248

Aspectos bsicos de la inmunidad

Interleuquina 12 (IL-12)
La IL-12 es una citoquina pleiotrpica que
fuera originalmente identificada en el sobrena
dante de cultivo de clulas transformadas por el
virus de Epstein Bar. Tambin se lo conoci
como natural killer stimulatory factor (NKSF)
y como cytotoxic lymphocyte maturation factor
(CLMF).
La IL-12 es una glucoprotena heterodmera
de 75 kD compuesta por dos subunidades p35 y
p40, no relacionadas genticamente. Ambas ca
denas se encuentran unidas covalentemente a
travs de un puente disulfuro, condicin esencial
para que conserve su actividad biolgica. La su
bunidad p35 presenta homologa con la IL-6 y
con G-CSF, en tanto que la subunidad mayor es
similar al receptor de IL-6. Esta estructura su
giere que la IL-12 habra derivado de genes de
algn complejo citoquina/receptor anterior.
La fuente de produccin de esta citoquina
comprende a los monocitos/macrfagos, LB y
mastocitos como respuesta a la accin de bacte
rias, productos bacterianos y parsitos intracelu
lares, establecindose as un puente funcional
entre la inmunidad natural y la especfica. La IL12 mostr tener efectos especficos de especie,
habindose reportado una actividad mnima de
IL-12 humano sobre clulas murinas.
Cada subunidad corresponde a un nico gen.
La expresin de la cadena p35 es facilitada por
la simultnea expresin de la cadena p40. La
transcripcin de ambas cadenas es normalmen
te coordinada. N inguna cadena por s misma
presenta actividad de IL-12. En los humanos la
cadena p35 est constituida por 197 aa, 22 de
los cuales corresponden al pptido seal, pre
senta 7 residuos de cys y tres sitios potenciales
de glucosilacin. La cadena p40 est constitui
da por 306 aa, conteniendo diez residuos de
c is te n a s c o n se rv a d o s y c u a tro s itio s de
glucosilacin. La subunidad p35 murina pre
senta 60% de homologa con la cadena huma
na, posee 193 aa y siete residuos de cistena
con tres sitios potenciales de glucosilacin. La
cadena p40 presenta 70% de homologa con la
humana y est constituida po 313 aa, tambin
presenta 22 aa correspondientes al pptido se
al, 11 residuos de cys conservados y tres sitios
de N-ghcosilacin.
El significado biolgico de cada cadena se
parada es hasta hoy desconocido. En el ratn se
observ que la cadena pesada forma homodmeros con actividad antagnica, hecho no de
mostrado para IL-12 humana. En relacin con
la molcula entera, los primeros estudios indi
caran ciue la p40 estara involucrada en la
unin al receptor mientras que la cadena p35 es
importante para el envo de la seal de trans
duccin a travs del IL -12R.

La IL-12 posee mltiples efectos sobre'las

clulas NK y los LT, promueve el crecimiento
y diferenciacin de las clulas NK y de las c
lulas T, tanto CD4+ (T hl) como CD8+. Favore
ce la proliferacin de la subpoblacin T h l, con
produccin de altos niveles de IFNy, el que a
su vez posee un efecto autocrino sobre esta
subpoblacin linfocitaria. A dem s, produce
una inhibicin de la produccin de la IL-4 por
parte de los LTh2. Favorece la actividad citot
xica mediada por los LT, la citotoxicidad NK e
incrementa la citotoxicidad celular mediada por
anticuerpos (ADCC). Por otro lado, como con
secuencia de la induccin de la sntesis de IFNy
indirectam ente contribuye a la activacin de
los macrfagos.
La lL-12 acta sobre clulas NK y produce
un aumento de la expresin de Ags, de mem
brana (CD 56, CD2, CDI la) y tambin posibi
lita la generacin de clulas LAK. Aumenta la
secrecin de IFN y y de T N F a y facilita la libe
racin de p55 y p75 solubles de los receptores
para TNF por parte de las clulas NK.
Recientem ente se document que la IL-12
ejerce efectos sobre la sntesis de inmunoglobuhnas, es capaz de suprimir la sntesis de IgE
inducida por IL-4 sobre clulas mononucleares
de sangre perifrica.
El receptor de IL-12 (1L-12R)
El receptor fue clonado, el ADNc codifica
para una protena de 638 aa, la cual posee un
PM predecible de 70,4 kD, pertenece al grupo
de receptores hematopoyticos. Esta protena
une IL-12 con Kd 2-5 10 ^ M correspondiente
al receptor de baja afinidad, el que se expresa
en lneas celulares de LT activados. La cadena
clonada posee un 21% de homologa en su do
minio citoplasmtico con la IL-6. En estos mo
mentos se estn realizando estudios que permi
tan dilucidar las caractersticas del mismo.
Existen evidencias experimentales que indican
que el IL-12R pertenece a un complejo multicatenario constituido al menos por dos cadenas
polipeptdicas.
Interleuquina 13 (IL-13)
La IL -13 es un factor pleiotrpico que com
parte muchas propiedades con la IL-4 con la
cual posee un 30% de homologa en su secuen
cia aminoacdica. Es secretada por LT activa
dos tanto CD4+ como CD8^. De manera similar
a la IL-4 posee efectos sobre el LB y los ma
crfagos pero a diferencia de aqulla no posee
efectos sobre los LT.
El gen que codifica para la IL-13 fue descu
bierto en 1989 en L T h l murinos y denominado
P600, habindose determinado que una vez que

Citoquinas
la clula es activada el ARNm se expresa rpi
damente y persiste por un perodo relativamen
te mayor que el ARNm para la IL-4. Los genes
de IL-4 e IL-13 estn estrechamente relaciona
dos tanto en el genom a humano como en el
murino.
El ADNc para la IL-13 murina codifica la
sntesis de una protena de 131 aa que presenta
un pptido seal de 20 aa, el cual es clivado pa
ra generar la protena madura. En el caso del
ADNc de IL-13 humano existe informacin pa
ra una protena de 132 aa. El ADNc humano
presenta un 66% de homologa con el ADNc
de IL-13 murina. Tanto la IL-13 humana como
la murina poseen en su secuencia cinco resi
duos de cistenas conservados y mltiples sitios
potenciales de glucosilacin. Existe un 58% de
homologa en su secuencia aminoacdica. Ade
ms, tambin fue clonado el gen de IL-13 de
rata y la secuencia aminoacdica deducida de
muestra que existe un 79% de homologa con
la protena de ratn y 63% con la protena hu
mana. La actividad para la IL-13 humana y la
murina sobre clulas humanas es similar. En
cambio, la IL-13 humana es menos activa que
la murina sobre clulas de ratn.
La IL-13 es un potente regulador de las res
puestas inmune e inflamatoria. De igual mane
ra que la IL-4, la IL-13 aumenta la expresin
de CD23 y favorece ia expresin de integrinas
(C D llb , C D llc , C D l8, CD29, CD49e). y de
los Ags. del CMH de clase II sobre los monoci
tos/macrfagos, pero como disminuye la expre
sin del receptor para Fe de Ig G, es capaz de
inhibir la citotoxicidad anticuerpo dependiente
y la capacidad de los macrfagos para matar
parsitos intracelulares.
Se demostr que inhibe la expresin de citoquinas pro-inflamatorias (IFN5, IL-1, IL-6, IL8, IL-12) y de quimoquinas (MIP, M FC) a la
vez que favorece la produccin de la IL -lR a.
Estudios realizados en macrfagos evidencian
una inhibicin de la produccin de xido ntri
co. Las consecuencias fisiolgicas del efecto de
la IL-13 sobre los monocitos deber ser conve
nientemente definida, pero es posible que indi
rectam ente inhiba el desarrollo de L T h l por
efecto de regulacin negativa sobre la produc
cin de IL -12 por parte de los monocitos.
Cuando se estudi la accin de IL-13 sobre
los LB humanos se encontr que la IL-13 regu
la positivamente la expresin de CD23, CD71,
CD72, Ig. de sup. y molculas del CMH de cla
se II. Favorece la proliferacin de LB maduros
e induce la sntesis de IgE e IgG^. H asta el pre
sente no se determin que la lL-13 tenga acti
vidad sobre los LB murinos.
En ensayos con clulas NK altamente purifi
cadas se encontr que la IL-13 inhibe la pro
duccin de IFN y inducida por la IL-2. En cam

249

bio ha sido reportado que al actuar sobre linfo

citos granulares grandes (LGL), la IL-13 sinergiza la accin de la IL-2, conduciendo a la pro
duccin de IFNy. Recientes investigaciones in
dican que la IL-13 posee accin quimiotctica
sobre los macrfagos pero no sobre clulas po
limorfonucleares .
El receptor de IL-13 (IL-I3R)
Basados en datos experimentales de compe
tencia de la IL-13 con la IL-4, se hipotetiza que
el receptor de L-13 es un heterodm ero que
contiene subunidades del IL-4R y una subuni
dad propia de unin de IL-13. La similitud de
las propiedades biolgicas y la alta homologa
en la secuencia de IL-13 e IL-4, sugiere una es
trecha relacin entre ambos receptores. Dife
rentes estudios son consistentes con esta hip
tesis, sus caractersticas debern ser pronto cla
rificadas.
Interleuquina 14 (IL-14)
La IL-14 es la denominacin propuesta pai'a
una factor producido por LT normales y malig
nos que tiene la capacidad de inducir la prolife
racin de LB activados pero no en reposo, ini
c ialm en te fue den o m in ad o higfi m o lecu la r
weigth B cell growth fa cto r (HMW-BCGF). El
HMW -BCGF posee similitud antignica con la
fraccin Bb del sistema complemento y ste l
timo tiene capacidad de competir por el recep
tor para HMW-BCGF.
Si bien ambos factores estn relacionados
antignicamente slo posee un 8% de homolo
ga estructural. Las nicas clulas sobre las
que se ha encontrado accin son clulas del li
naje B. Datos prelim inares sugieren que ten
dra accin sobre una subpoblacin de LB de
memoria.
La secuencia del ADNc predice que la pro
tena madura est formada por 486 aa, que con
duce a un producto de PM predecible de 53,1
kD. Presenta un pptido seal de 15 aa, el cual
facilitara su secrecin. Posee tres sitios poten
ciales de N-glucosilacin y mltiples sitios de
cistenas conservadas que podran potencial
mente participar de la formacin de puentes di
sulfuro. El ARNm es expresado entre las 8 -12
horas despus de la estimulacin de los LT con
ConA o PHA persistiendo por un perodo de
hasta 48 horas. Se ha postulado que el AMPc
acta como segundo mensajero de la seal de
activacin celular.
Interleuquina 15 (IL-15)
ste es un factor descubierto en form a si
multnea por los grupos de Gabstein y col. y

250

Aspectos bsicos de la Inmunidad

Burton y col., investigadores que lo denomina

ron IL-I 5 e IL-T respectivamente. Del mismo
modo que otras cito q u in a s (p o r ej. IL -4 e
IL-10) parece compartir funciones biolgicas
con la IL-2. Ambas protenas, IL-15 e IL-T, pa
recen ser la misma molcula, su hallazgo per
mite clarificar experiencias previas realizadas
con ratones deficientes en IL-2 en donde IL-15
e IL-T permitiran justificar los resultados en
contrados.
Gabstein y col. detectaron el factor al investigai' la presencia de citoquinas en el sobrena
dante de cultivo de una lnea celular originada
de tejido epitelial de rin de simio. Esta citoquina es capaz de producir la proliferacin de
una lnea dependiente de IL-2. La clonacin y
obtencin del ADNc permite deducir las carac
tersticas de la protena. E sta pro ten a est
constituida por 162 aa, con una secuencia seal
de 48aa, sin que posea homologa con otra citoquina conocida. La prediccin de la estructura
secundaria de la protena, sugiere la presencia
de cuatro regiones a hlice y la presencia de
dos puentes disulfuro, uno de los cuales es an
logo al puente disulfuro hallado en la estructura
cristalogrfica de la IL-2. L a expresin del
ARNm fue analizada en clulas humanas, la
mxima expresin fue encontrada en placenta y
msculo esqueltico. Es muy importante la ex
presin en monocitos, clulas epiteliales y fi
broblastos. No hay expresin ni en LT activa
dos, ni en lneas linfoblastoideas B. La IL-15
es capaz de estimular a los LT activados con
PHA, se observ que responden tanto los LT
CD4+ como los CD8+. La IL-15 es capaz de ge
nerar in vitro LT citotxicos y clulas LAK,
aunque posee menor potencia que la IL-2 para
inducir estos cambios.
Estudios de com petencia con la IL-2 y de
bloqueo del IL-2R con anticuerpos monoclona
les han permitido demostrar que la IL-15 interacta con las cadenas p/y del IL-2R pero no
con la cadena a . Fue propuesto que las subuni
dades p/y se combinan con una subunidad es
pecfica del IL-15R para generar un receptor de
alta afinidad y que la cadenas p/y son requeri
das para enviar la seal de transduccin intra
celular.
La caracterizacin original del factor IL-T
realizada por Burton y col., le otorg a este fac
tor un PM de 14 IcD y se vi que compartan las
mismas acciones biolgicas que fueron atribui
das a la IL-15. La IL-T estimula los LT y las c
lulas LAK de igual manera que lo hace la IL-2.
Dado que no existen datos sobre al secuencia
del ADN de la IL-T no puede asegurarse la
identidad absoluta de ambos factores. Sin embai'go el hecho de poseer igual PM e igual es
pecificidad por el IL-2R, sugiere que se tratara
de la misma molcula.

IN T ER FE R O N ES
Los interferones (IFNs) son un grupo de pro
tenas inmunorreguladoras sintetizadas princi
palmente en respuesta a un estmulo viral y que
se hallan fisiolgicamente relacionadas por sus
efectos antivirales.
Los interferones han sido clasificados en ti
pos I y II. El IFN de tipo I est constituido por
los IFNs a y P los que son producidos por dife
rentes clulas pero comparten la totalidad de
sus acciones biolgicas. El IFN de tipo II (INFy
o IFN inmune) se produce durante una respues
ta inmune como consecuencia de un estmulo
antignico y que comparte algunas propiedades
con los anteriores.
Interfern (IFN) de tipo I
Los integrantes de este grupo se han caracte
rizado fundamentalmente por sus efectos antiproliferativos y anti virales. Tanto el IFN a co
mo el p, pueden ser secretados durante una res
puesta inmune especfica como consecuencia
de la activacin de los macrfagos y los fibro
blastos por accin de otras citoquinas elabora
das por los LT.
Ambos IFNs, comparten los mismos recep
tores celulares, conocidos como receptores de
IFN de tipo I (IFN-Rl), ste es una glucopro
tena de 90 kD, formado por una nica cadena
que se caracteriza por la presencia de 210 resi
duos de aa conservados.
IF N a
El INF a es un conjunto de por lo menos 20
glucoprotenas inmunoregulatorias constituidas
por 189 aa, los que generan molculas de un
PM de 18 kD. La informacin para las sntesis
de las diferentes molculas se encuentra en ge
nes separados, los que se ubican en el cromoso
ma 9 humano.
Los efectos del IFN se realizan en forma paracrina, las clulas infectadas secretan las bio
molculas hacia las clulas vecinas sobre las
que ejercen sus efectos biolgicos. Algunos in
vestigadores, subclasifican al IFN a en dos
grupos a , y
u co, en relacin a la secuencia
de los aa que los constituyen.
La principal fuente de produccin son los fa
gocitos mononucleares, razn por la cual tam
bin es denominado IFN leucocitario. Su secre
cin es inducida por polinucletidos, ADN Y
ARN virales.
El INF a acta sobre receptores de tipo I el
cual se expresa en casi todas las clulas y ello
les confiere capacidad para prevenir la replica-

Citoquinas
cin viral, a travs de la induccin de enzimas
que interfieren en dicho proceso. Adems, ejer
ce efectos antiproliferativos e induce la expre
sin de antgenos del CMH de clase I.
Acta sobre clulas NK, induciendo su acti
vacin y favoreciendo as su capacidad ltica.
Acta sobre los LB ejerciendo un efecto inm u
norregulatorio sobre la secrecin de anticuer
pos.
EITFN a es utilizado como agente antiproliferativo en leucemias de clulas vellosas, sar
coma de Kaposi, leucemias mieloides, hepatitis
crnica y lesiones ocasionadas por el virus pa
piloma.
IF N 3
El IFN p, en una protena producida por un
gen nico, es una protena constituida por 187
aa que presenta un PM de 20 kD. Posee una
homologa del 30% en la secuencia aa en rela
cin con el IFN a . El IFN (3 es producido por
los fibroblastos y, al igual que todos los facto
res que integran este grupo, posee propiedades
antivirales.
Dado que comparte el receptor de superficie
con el IFN a , sus funciones biolgicas son las
mismas. Las principales acciones conducen a
establecer un estado de actividad antiviral en
las clulas, la activacin de mecanismos lticos
por parte de las clulas NK y el aumento de la
expresin de Ags del CMH de clase I con el fin
de activar los mecanismos efectores en la res
puesta especfica.

IFN tipo II
IF N Y
El INF Y o IFN inmune, es una glucoprotena
multifuncional caracterizada por sus propieda
des antivirales. Es producido por los L T h l
(CD4+), por los LT CD8+ y en menor grado por
las clulas NK.
El IFN Y humano es una glucoprotena cons
tituida pro 143 aa, que presenta diferentes gra
dos de glucosilacin, es una protena homodimrica de 21-24 kD. La informacin gentica
est codificada en un gen nico ubicado en el
cromosoma 12 humano. Existen dos variantes
allicas que difieren en la posicin del aa 137
(Arg o Gln). A pesar de ia simihtud funcional
con los IFNs de tipo I, no posee alta homologa
estructural con dichas protenas.
El IFN Y comparte muchas acciones con los
IFNs de tipo I. Produce efectos antiproliferati
vos, antivirales y antiprotozoricos. A dem s
posee acciones inmunomoduladoras; aumenta
la expresin de las molculas del CMH de cla
se I y de clase II, acta sobre los LB, ios m a

251

c r fa g o s y de m an era a u to c rin a so b re lo s
LThJ, favoreciendo su propia sntesis.
Participa de la respuesta inflamatoria; sobre
las clulas mononucleares posee un efecto acti
vador, induce la sntesis de protenas de las ca
dena respiratoria lo que le permite ejercer un
efecto microbicida, razn por la cual en alguna
clasificacin es incluido dentro de las citoqui
nas denominadas macrophage-activacting fa c
tor (MAFs). Aumenta la produccin de IL-1,
IL-12, H jO j y dism inuye la expresin d e la
IL-8. Es quimiotctico para monocitos pero no
para neutrfilos.
El IFN Y induce la diferenciacin de LB y
LT de modo tal que se promueve la m adura
cin de los LT citotxicos y a secrecin de
Igs. En el ratn se observ que favorece el
cambio de isotipo de las Ig hacia IgO^^, e IgG,,
lo que perm ite antagonizar el efecto ejercido
por la IL4, la cual conduce hacia la produccin
de IgE e IgG^.
Tambin acta sobre los neutrfilos aunque
su accin es ms dbil que la producida por
TNF o linfotoxina. Activa las clulas N K , fa
voreciendo su accin citotxica. Acta sobre
clulas endoteliales favoreciendo la extravasa
cin linfocitaria por aumento de la expresin
de m o lcu las de adhesin IC A M l p e ro no
V C A M l o selectina E.
La totah'dad de las acciones del IFN y condu
cen a promover las acciones de los LThl y los
macrfagos, suprimiendo la accin de los LTh2
y de los neutrfilos.
El receptor de membrana para IFN y est re
lacionado estructuralmente con el receptor de
los IFNs de tipo I pero es diferente y especfi
co. EL R-INFy es una glucoprotena de 90 kD,
constituido por una cadena polipeptdica. El
anlisis de la secuencia generada a p artir del
ADNc permite establecer que los 17 aa del ex
tremo amino terminal corresponden al pptido
seal, seguido por una secuencia de 228 aa co
rrespondientes al dominio extracelular, 21aa a
la regin transmembrnica y 223 aa al dominio
intracelular. El dominio extracelular es crtico
para la accin especie especfica que presentan
los IFNs. Una forma soluble del receptor h a si
do encontrada en orina humana en condiciones
fisiolgicas norm ales. El receptor se expresa
en todas las clulas a excepcin de los eritroci
tos. La informacin para su sntesis est codi
ficada en el cromosoma 6 humano. Los estu
dios realizados hasta e presente permiten infe
rir la existencia de otra cadena adicional nece
saria para generar la seal de transduccin. La
unin del IFN lleva a una dimerizacin del re
ceptor y posterior activacin de las protenas
Jak 1 y Jak 2, lo que conduce a la activacin
de protenas intracitoplasmticas de unin es
pecficas.

252

Aspectos bsicos de ia inmunidad

FACTORES ESTIMULANTES
DE COLONIAS (CSF)

gracin transendotelial de los eosinfilos pero

no de los neutrfilos.

Los factores estimulantes de colonias son ci

toquinas que inicialmente fueron identificadas
por su capacidad de estimular in vitro la forma
cin de colonias de progenitores de m dula
sea, estimulando su expansin y diferencia
cin celular. Las acciones de este grupo de ci
toquinas son influenciadas en gran medida por
otras citoquinas, existiendo efectos sinrgicos y
antagnicos entre ellas. Todas son necesarias
para mantener un correcto funcionamiento de
los mecanismos de defensa.

E l receptor para GM-CSF

GM-CSF
El factor estimulante de colonias granulocticas-macrofgicas es un factor pleiotrpico, es
timulante de la proliferacin y maduracin de
colonias de granulocitos y macrfagos. Es pro
ducido por los LT activados, los macrfagos
activados, los LB, las clulas del endotelio vas
cular, los fibroblastos y los mastocitos. Acta
en mdula sea sobre clulas que presumible
mente fueron estimuladas previamente por la
IL-3. Su accin es fundamental para el linaje
leucocitario aunque tam bin tiene capacidad
para activar leucocitos maduros.
El gen que codifica su sntesis mapea en el
cromosoma 5 humano y 11 murino, en una re
gin estrecham ente ligada con los genes de
IL-3, lL-4, lL-5, M -CSF y c-fms. Los ADNc
humano y murino han sido clonados y contie
nen informacin para una protena constituida
por 124-127 aa de los cuales 17 aa correspon
den al pptido seal. Posee mltiples sitios de
glucosilacin, aunque los hidratos de carbono
no son importantes para el ejercicio de sus ac
ciones biolgicas. Posee dos puentes disulfuro
intracatenarios que son esenciales para su fun
cin. Existe un 54% de homologa entre la se
cuencia aminoacdica del G-CSF humano y mu
rino, ambas protenas son especie especficas.
Si bien en un primer momento se le atribuy
accin sobre la diferenciacin de granulocitos
y m acrfagos, se ha dem ostrado que posee
efectos sobre la serie eritroide y megacarioctica y que adems permite la diferenciacin de
las clulas dendrticas.
El GM-CSF tiene capacidad para prolongar
la sobrevida de los eosinfilos y neutrfilos
maduros. Favorece la activacin y el desarrollo
de los mecanismos citotxicos m ediados por
los neutrfilos, los eosinfilos y los macrfa
gos contra las clulas tumorales y, adems, es
timula la sntesis y liberacin de la IL-1, IL-8 y
el T N F a por parte de los monocitos.
A cta como factor quim iotctico para los
eosinfilos y los neutrfilos y favorece la mi

Es un complejo multicatenario relacionado

con el IL-3 R y el IL-5R. Est constituido por
dos cadenas, una denominada a , responsable
de la unin de la citoquina con baja afinidad y
la segunda, denominada (3, la cual confiere al
receptor alta afinidad por el ligando. Ambas
cadenas pertenecen a los receptores de citoqui
nas de tipo I. La homologa estructural entre las
cadenas a humana y murina, es muy baja lo
que justifica la especificidad de especie esta
blecida para esta citoquina. La subunidad (3
permite el envo de la seal de transduccin,
para lo cual se ha reconocido una regin cito
plasmtica cuya integridad es requerida para la
induccin de las acciones mitognicas y la acti
vacin de las protenas Jak.
M -C SF
El factor estimulante de colonias monocticas/m acrofgicas fue originalm ente descrito
como un factor que permita originar colonias
de macrfagos desde progenitores de mdula
sea (C SF-I). Es producido por fibroblastos,
clulas del estroma de mdula sea, astroeitos,
osteoblastos, queratinocitos, macrfagos acti
vados, LB, LT y clulas endoteliales.
La principal funcin es regular el crecimien
to y diferenciacin de los fagocitos mononu
cleares. Aunque puede actuar sobre otros tipos
celulares fundam entalm ente las clulas de la
decidua y del trofoblasto placentario.
Las protenas purificadas desde sobrenadan
tes de cultivo de clulas humanas y murinas in
dican que el M-CSF es una glucoprotena de 40
kD, homodimrica. El gen responsable de su
sntesis est ubicado sobre el cromosoma 1 hu
mano y 3 del ratn. Ambas especies presentan
ARNm de diferentes longitudes como resultado
de un empalme (splicing) alternativo que ge
nera protenas maduras constituidas por 224,
406 o 522 aa. Todas ellas poseen un pptido se
al de 32 aa y contienen m ltiples sitios de
glucosilacin. Los 150 aa correspondientes a la
regin amino terminal estn altamente conserva
dos en el humano y el ratn (80%), en la regin
correspondiente a la interaccin con el receptor
especfico. Si bien el M-CSF humano es capaz
de estimular clulas murinas no ocurre lo mismo
con el factor murino que es especie especfico.
El M -CSF acta perm itiendo la pro lifera
cin, la diferenciacin y la sobrevida de las c
lulas de mdula sea comprometidas en el de
sarrollo de los monocitos. Posee efectos sobre
osteoclastos y clulas de la mieroglia. Su ac

Citoquinas
cin es local, no se lo encuentra en la circula
cin. Los efectos se ejercen sobre clulas de la
progenie, que se encuentran ms diferenciadas
que aquellas sobre las que acta el GM-CSF.

253

pacientes que sufren granulocitopenias com o

consecuencia de la aplicacin de quimioterapia
o drogas inmunosupresoras.
E l receptor del G-CSF (G-CSFR)

El receptor de M -CSF (M-CSFR)

EL M-CSF ejerce sus acciones biolgicas a
travs de un receptor de alta afinidad. El recep
tor humano es una glucoprotena transmembrnica que consiste de 512 aa para el dominio ex
tracelular, el que adquiere una distribucin si
milar a ios dominios de las Igs; 25 aa para la
regin transmembrana y 435 aa en el dominio
intracelular; este dominio contiene una regin
tirosin-quinasa.
G-CSF
El G-CSF es un factor pieiotrpico con efec
tos sobre la proliferacin, la diferenciacin y la
activacin de precursores h em atopoyticos
comprometidos con el linaje gfanuloctico. Es
producido por m acrfagos activados, clulas
endotehales, fibroblastos, astrocitos, osteoclas
tos y clulas del estroma de mdula sea.
El G -C SF es un polipptido de 19 kD, el
cual puede ser detectado en la circulacin. El
ADNc murino ha sido clonado y se ha determi
nado que el mismo posee la informacin para
un precursor de 208 aa, de los cuales 30 corres
ponden al pptido seal el que, al ser chvado
proteolticamente, origina una protena madura
de 178 aa. En el ser humano han sido identifi
cados dos clones, los cuales codifican para pre
cursores proteicos de 207 aa y 204 aa ambos
presentan un pptido seal de 30 aa. La prote
na madura de 177 aa posee una actividad biol
gica diez veces menor que la producida por la
isoform a de 174 aa. Las protenas hum ana y
murina presentan un 73% de homologa a nivel
de la secuencia de aa y se ha encontrado que
ambas especies presentan reactividad cruzada.
Existe adems una significativa homologa en
la secuencia aminoacdica en relacin con la
IL-6, lo que sugiere que podran presentar una
estructura terciaria similar.
Se ha encontrado que el G-CSF acta sobre
clulas pre-diferenciadas que se hallan compro
metidas con el desarrollo de los granulocitos,
estimulando la formacin de colonias de neu
trfilos a partir de precursores hematopoyticos
de mdula sea. Aumenta la sobrevida de ios
neutrfilos maduros a la vez que favorece la
funciones citotxicas dependientes de anticuer
pos, la produccin de anin superxido y la
sntesis de fosfatasa alcalina. Tambin se ha
encontrado que posee efectos quim iotcticos
para granulocitos y monocitos humanos.
El G-CSF es utilizado en medicina clnica en

Los efectos biolgicos son ejercidos a travs

de un receptor especfico de alta afinidad, el
cual se expresa en precursores hem atopoyti
cos, neutrfilos, clulas placentarias, clulas en
d o teliales y algunas clulas tum orales. Los
ADNc humano y murino han sido clonados. La
protena madura m urina est constituida por
812 aa y presenta un alto grado de glucosila
cin. El dominio extracelular contiene tres re
giones de homologa con otros receptores, el
extremo amino terminal presenta un dominio Ig
smil, posee otra regin caracterstica de los re
ceptores de hematopoyetinas o tipo I y un do
minio similar al dominio de fibronectna de tipo
III. El receptor humano contiene 813 aa y posee
un 62% de homologa con el receptor de las c
lulas m urinas. A dem s se han hallad o tres
transcriptos que permiten la sntesis de dos iso
formas de la protena transmembrnica y una
forma soluble para el receptor. El G-CSFR no
contiene un dominio intracelular con actividad
quinasa, sin embargo se lo ha encontrado aso
ciado a quinasas del grupo de las protenas Jak
las que a su vez activaran a la protena STAT3.
FACTOR TRANSFORMANTE
DEL CRECIMIENTO CELULAR (TGF)
El factor transformante del crecimiento celu
lar es un factor multifuncional que modifica el
crecimiento de las clulas. Este factor fue des
cubierto como una agente que permita crecer a
las clulas NK en agar blando de igual forma
que lo hacen clulas malignas.
Las acciones ejercidas por el TGF muestran
diferencias que dependen del origen tisular de
las clulas blanco. As, sobre clulas de origen
mesenquimal posee acciones estimulatorias en
cambio sobre clulas de origen epitelial o neuroectodrmico ejerce acciones inhibitorias.
El factor reconocido como TGF(3, es actual
m ente identificado como TG FP,, existe otro
grupo de protenas estrechamente relacionadas
denominada TGFp^, TGFp,, TGFp, y TOEp,,
las que poseen 70-80% de hom ologa entre
ellas. La protena madura es un dmero consti
tuido por dos cadenas de M 2 aa unidas a travs
de un puente disulfuro la cual posee un PM
aparente de 25 kD.
EL TG pp es un im portante m odulador del
crecimiento, la diferenciacin y las actividades
de diferentes tipos celulares, est involucrado
tanto en la respuesta humoral como en la celu

254

Aspectos bsicos de la inmunidad

lar. Acta sobre los LT, los LB, las clulas NK,
las clulas LAK, los monocitos/macrfagos y
los precursores hematopoyticos. Es una citoquina importante para la regulacin de la res
puesta inmune porque antagoniza los efectos
linfocitarios, por ejemplo, sobre los LT y LB
acta inhibiendo la proliferacin celular, en el
caso de los LB inhibe la secrecin de Igs, inhibe
el cultivo mixto linfocitario y la maduracin de
los LT citotxicos. Tambin inhibe la actividad
citoltica de clulas NK y de los macrfagos ac
tivados. Adems, contrarresta la accin infla
matoria de otras citoquinas sobre los PMN y las
clulas endoteliales. Por lo tanto, el TGF acta
como factor supresor de la respuesta inmune.
El receptor no est completamente identifi
cado, estudios prelim inares han identificado
tres diferentes formas de PM 53 kD, 70-85 kD
y 250-350 kD.
FA C T O R DE N EC R O SIS
TU M O R A L (TNF)
Los factores de necrosis tumoral son prote
nas generalmente referidas como citoquinas in
flamatorias. El TNF fue originalmente identifi
cado como un factor responsable de la necrosis
tumoral presente en el suero de animales trata
dos con EPS, accin de la cual deriva su nom
bre. Est constituido por dos especies molecu
lares el T N Fa y el TNFp.
El T N F a es la principal citoquina elaborada
en la respuesta contra infecciones bacterianas
por agentes gram-negativos, fue conocido ini
cialmente como cachetina. EL TNFP o linfoto
xina (LT) es elaborado durante la respuesta in
mune especfica. Ambas comparten los mismos
receptores celulares.
Los TNFs son factores altamente pleiotrpicos. El TNF es producido principalmente por
macrfagos activados, clulas NK, linfocitos
LAK, astrocitos, clulas endoteliales. El TNF
es producido por los L T hl.
El T N Fa humano es una protena constituida
por 157 aa mientras que en el ratn y la rata es
t constituida por 156 aa. El TNF es un produc
to constituido por 171 aa. Los PM aparentes de
ambas protenas en condiciones desnaturalizan
tes son de 17 y 25 kD respectivamente y po
seen un 30% de homologa. La diferencia de
PM es debida al diferente grado de glucosila
cin. EL T N F a humano es una m olcula no
glucosilada a diferencia del murino que s lo es.
Las formas biolgicam ente activas, tanto del
T N F a como del TNF p, estn constituidas por
trmeros unidos no covalentemente que presen
tan un PM de 51 kD.
El TNF a se origina de una protena precur
sora de 25 kD con un dominio hidrofbico y

otro hidroflieo, se inserta en la membrana ce

lular y luego es clivada para originar la forma
soluble de 17 kD a nivel extracelular. El TNFp
en cambio se sintetiza y hbera como cualquier
otra protena se secrecin.
Las principales acciones biolgicas son com
partidas, ello surge del hecho de compartir los
receptores celulares. Estas deben ser considera
das en relacin con la concentracin efectiva. A
bajas concentraciones (10^M) ejercen un efec
to local paracrino y autocrino que conduce a un
aumento en la expresin de las molculas de
adhesin, lo que prom ueve la adherencia de
neutrfilos, monocitos y linfocitos a las clulas
endoteliales. Esta accin permite la acum ula
cin de leucocitos en el sitio de inflamacin.
Produce tambin activacin de neutrfilos, eo
sinfilos y macrfagos. Estimula a los fagocitos
mononucleares a producir IL -I, IL-6, quemoquinas y el propio TNF. Aumenta la expresin
de molculas del CMH de clase I favoreciendo
as la citotoxicidad mediada por clulas. A altas
concentraciones posee efectos endocrinos que
conducen a un aumento de la temperatura por
accin a nivel del SNC y sobre los hepatocitos
induce un aumento de protena srica amiloide
A. Por otro lado, es capaz de activar el sistema
de coagulacin e inhibir la diferenciacin de c
lulas pluripotenciales en mdula sea y en con
diciones extremas es capaz de llevar al organis
mo a un estado de caquexia. La combinacin de
aumento de fiebre, aumento de protenas de fa
se aguda, leucopenia y activacin del sistema
de coagulacin han sido encontrados como
efectos adversos en pacientes con cncer que
reciban TNF como agente teraputico.
Los TNF presentan receptores que se expre
san en la mayor parte de las clulas del orga
nismo. Han sido identificados dos receptores
de superficie que unen tanto al T N F a como al
p. El re c e p to r d e n o m in ad o tip o A, p75 o
TNFR-II es una protena con un PM de 75 kD
constituida por 439 aa. El otro, tipo B, p55 o
TNFR-I est constituido por 426 aa y posee un
PM de 55 kD. Los receptores son inmunolgi
camente diferentes pero sus dominios extrace
lulares son similares con relacin al nmero de
cistenas que los constituyen y los dominios es
tructurales generados.
Dado que el factor biolgicamente activo es
un trmero, se requiere la aproximacin de dos
o tres unidades receptoras para que se produzca
la seal de transduccin intracelular. Los domi
nios intracelulares de ambos receptores no es
tn aparentemente relacionados. La unin de
los receptores con los dos factores es de una
afinidad relativam ente baja en relacin con
otros receptores de citoquinas (Kd para p75 5
M y para p55 Kd 1 x lO ^M), no existe eviden
cia de interaccin entre ellos.

Citoquinas
Han sido identificadas form as solubles de
ambas cadenas tambin denominadas TNF-BPI
y TNF-BPII para p35 y p75 respectivamente.
Ellas surgen como consecuencia de la libera
cin del dominio extracelular probablemente
por protelisis del receptor. Estos pueden neu
tralizar la accin de las citoquinas y serviran
como elementos regulatorios de la respuesta in
flamatoria y, al mismo tiempo, actuaran como
protectores de la accin sobre las clulas veci
nas.
Seales de activacin celular mediadas
por citoquinas
La mayora de los eventos bioqumicos im
plican la activacin de las clulas T y B, lo que
les permite pasar de su estado de reposo (GO) a
la fase (G l) del ciclo celular. Las seales que
derivan de las interacciones entre las citoquinas
y los receptores, le permiten luego a la clula
progresar de la fase S a la fase de proliferacin.
Algunas citoquinas a la vez permiten generar
eventos de diferenciacin celular.
Existen muchos mecanismos que generan las
seales intracelulares a los cuales las clulas
responden de una manera especfica,
Se ha encontrado que algunos complejos receptor-citoquina son rpidamente internaliza
dos por la clulas. Ello implica fosforilaciones
del receptor, que podra involucrar la disocia
cin del receptor y la reutilizacin del mismo
en la superficie celular y tambin podra formar
parte de seales intracelulares.
La unin del ligando a su receptor especfico
en algunos casos activa dominios intracelulares
y, as, dominios Tirosn-quinasa catalizan la
fosforilacin especfica de los residuos tirosina
de ciertas protenas intracitoplasm ticas. Sin
embargo, la mayora de los receptores conoci
dos conducen a la fosforilacin de residuos de
tirosina sin poseer actividad quinasa intrnseca.
Las seales bioqumicas en la respuesta de
IL-2 con su receptor han sido objeto de num e
rosos estudios. La IL-2 puede activar a la PKC
e inducir fosforilacin de sustratos celulares, a
pesai de no encontrarse hidrlisis de PIP2 o au
mento de Ca++ intracelular. Sin embargo, el ba
jo nivel de activacin de PKC, no parece ser
importante para inducir la proliferacin celular.
Adems, el aumento de AMPc bloquea la acti
vacin de PKC pero no bloquea la respuesta
proliferativa inducida por IL-2.
En el caso de los LT, la interaccin de la
IL-2 con su receptor induce la fosforilacin de
Tyr de varios sustratos entre ellos p56'^^ Para
que ello ocurra la presencia de la subunidad |3
es suficiente, siendo frecuente que as seales
intracelulai'cs estn mediadas por otras prote
nas con las que interacta.

255

En el caso de la IL-4; las seales de activa

cin tam poco perm iten detectar hidrlisis de
P IP 2, m o v iliza c i n de Ca++, ni a c tiv a c i n
dePKC o depolarizacin de la membrana celu
lar, pero en el caso de los LB permite la fosfo
rilacin de una protena de 42-44 kD. Los lti
mos estudios con IL-4 y los LB han sugerido
que la IL-4 podra inducir una rpida produc
cin de IP3 y aumento de Ca++ con cambios en
el nivel de AMPc. El conocimiento de las sea
les generadas por las citoquinas es hasta el pre
sente limitado.
Por otro lado, en los ltimos aos, ha sido
estudiado el mecanismos Jak-STAT como una
forma por la cual ciertas citoquinas envan se
ales de activacin a los genes especficos. En
este mecanismo participan dos familias de pro
tenas transductoras; la familia de quinasas Jak
{Janus kinase) que manifiestan su actividad co
mo integrantes de complejos multimricos de
receptores activados por sus ligandos. L a se
gunda fam ilia est constituida por protenas
que regulan la transcripcin gentica y son de
nominadas STAT (Signal transducer and activator transcription proteins), estas protenas se
encuentran inactivadas hasta que son fosforiladas por las protenas Jak.
Los miembros de las protenas Jak hasta aho
ra identificados son; Jak l, Jak2, Jak3 y Tyk2,
estn ampliamente distribuidos en los distintos
tipos celulares con excepcin, de Jak3 la cual
fue encontrada slo en leucocitos. Las protenas
Jak son rpidamente fosforiladas en un residuo
de tirosina cuando el receptor apropiado es acti
vado. El mecanismo no est completamente en
tendido pero se cree que la protena Jak unida a
la protena receptora dimerizada seran capaces
de fosforilarse una a la otra, posterior a este
evento, el complejo fosforilado producira una
accin cataltica que conduce a la fosforilacin
de las protenas citoplasmticas STAT.
La fosforilacin de tirosinas de las protenas
integrantes de la familia STAT, conducira a la
form acin de dm eros, los que activaran la
transcripcin a nivel nuclear luego de com bi
narse con secuencias de unin especfica regu
ladoras presentes en el ADN.

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256

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1994.

El reconocimiento antignico
y activacin de los linfocitos B y T

RICARDO MARGNI

Un esbozo general de la respuesta inmune y

una descripcin pormenorizada de los recepto
res antignieos de los linfocitos B y T han sido
efectuados en los captulos 2, 3, 6 y 7. Se ha in
dicado cmo los antgenos de sntesis celular
endgena o exgena son procesados por las c
lulas presentadoras de antgenos (CPA) y cmo
son expuestos en las membranas celulares para
su reconocimiento por los linfocitos T efectores (Te, LCT) y reguladores (Th). Aqu habre
mos de referirnos a cmo es ese reconocimien
to antignico por los linfocitos B y T y cul es
la consecuencia de este hecho.
El receptor antignico del linfocito B
y reconocimiento del antgeno
El receptor antignico del linfocito B es la
inm unoglobulina IgM de membrana (IgMm),
la que presenta algunas diferencias estructura
les con la secretada por los plasmocitos (IgMs).
En la IgMm los ltimos 20 aminocidos de la
porcin C-terminal de la cadena |J, de la IgMs
estn ausentes y son sustituidos por una se
cuencia diferente de 41 aminocidos, 12 de los
cuales son extracelulares, los 26 siguientes son
los residuos hidrofbicos responsables de la in
sercin de la IgM en la membrana celular, y los
3 restantes constituyen la fraccin intracitoplasmtiea. Ello es consecuencia de la existen
cia en la posicin 3 de! gen que transcribe Cji
de dos exones denominados C|is y Ciim, los
que al recombinarse con el gen C|X confieren el
carcter de IgMs o IgMm de la inmunoglobuli
na sintetizada. La IgMm capta antgeno nativo
presente en una fase fluida, sin que medien mo
dificaciones previas. Como consecuencia de la
interaccin se ponen en marcha una serie de
eventos que llevan a la proliferacin y diferen

13
ciacin celular y secrecin de anticuerpos con
una estructura idntica a la del receptor del lin
focito B, pero expresado como IgMs.
ltimamente se ha podido demostrar que pa
ra que la clula pueda transducir seales que
llevan a su activacin, se necesita de la partici
pacin de otras protenas de membrana. El re
ceptor B existe como un complejo formado por
una molcula de IgMm y al menos otros dos
polipptidos transm em brnicos denom inados
Ig -a e Ig-P, originando un complejo sim ilar al
que forman el receptor del linfocito T (RCT) y
CD3.
La existencia de los polipptidos Ig -a e Ig-p
permaneci largo tiempo inadvertida debido a
que los detergentes no inicos NP-40 y Tritn
X -100, com nm ente usados para o b ten er la
IgM m, disocian al complejo. Estos polippti
dos estn tambin asociados a los otros isotipos
de inmunoglobulinas cuando, durante la m adu
racin de la respuesta inmune, se expresan en
membrana.
Los polipptidos Ig -a e Ig-p forman heterodmeros unidos por puentes disulfuro. En el ra
tn la protena Ig a es el producto del gen lla
mado mb-l y la Ig-p, la del gen B29. Estos ge
nes se expresan en linfocitos B y no lo hacen
en los LT. El gen m b-l codifica una protena
de 220 aminocidos que incluye una secuencia
lder, un sitio extracelular con dos sitios poten
ciales de N-glucosilacin, una porcin trans
membrnica y un dominio C-terminal intracitoplasmtico.
Los polipptidos Ig-a e Ig-p aislados de c
lulas B de ratn tienen un PM de 34 y 40 kD,
respectivamente, y una estructura sim ilar a la
de los tres polipptidos (y, 8 y e) del com po
nente CD3 del linfocito T. En los polipptidos
aislados de hnfocitos B humanos los PM sea-

256

Aspectos bsicos de la inmunidad

5. D arnell, ]. Jr,, K er Tan y col. Jak-S T A T Pathway,s and

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1994.

El reconocimiento antignico
y activacin de los linfocitos B y T

RICARDO MARGNI

Un esbozo general de la respuesta inmune y

una descripcin pormenorizada de los recepto
res antignieos de los linfocitos B y T han sido
efectuados en los captulos 2, 3, 6 y 7. Se ha in
dicado cmo los antgenos de sntesis celular
endgena o exgena son procesados por las c
lulas presentadoras de antgenos (CPA) y cmo
son expuestos en las membranas celulares para
su reconocimiento por los linfocitos T efectores (Te, LCT) y reguladores (Th). Aqu habre
mos de referirnos a cmo es ese reconocimien
to antignico por los linfocitos B y T y cul es
la consecuencia de este hecho.
El receptor antignico del linfocito B
y reconocimiento del antgeno
El receptor antignico del linfocito B es la
inm unoglobulina IgM de membrana (IgMm),
la que presenta algunas diferencias estructura
les con la secretada por los plasmocitos (IgMs).
En la IgMm los ltimos 20 aminocidos de la
porcin C-terminal de la cadena |J, de la IgMs
estn ausentes y son sustituidos por una se
cuencia diferente de 41 aminocidos, 12 de los
cuales son extracelulares, los 26 siguientes son
los residuos hidrofbicos responsables de la in
sercin de la IgM en la membrana celular, y los
3 restantes constituyen la fraccin intracitoplasmtiea. Ello es consecuencia de la existen
cia en la posicin 3 de! gen que transcribe Cji
de dos exones denominados C|is y Ciim, los
que al recombinarse con el gen C|X confieren el
carcter de IgMs o IgMm de la inmunoglobuli
na sintetizada. La IgMm capta antgeno nativo
presente en una fase fluida, sin que medien mo
dificaciones previas. Como consecuencia de la
interaccin se ponen en marcha una serie de
eventos que llevan a la proliferacin y diferen

13
ciacin celular y secrecin de anticuerpos con
una estructura idntica a la del receptor del lin
focito B, pero expresado como IgMs.
ltimamente se ha podido demostrar que pa
ra que la clula pueda transducir seales que
llevan a su activacin, se necesita de la partici
pacin de otras protenas de membrana. El re
ceptor B existe como un complejo formado por
una molcula de IgMm y al menos otros dos
polipptidos transm em brnicos denom inados
Ig -a e Ig-P, originando un complejo sim ilar al
que forman el receptor del linfocito T (RCT) y
CD3.
La existencia de los polipptidos Ig -a e Ig-p
permaneci largo tiempo inadvertida debido a
que los detergentes no inicos NP-40 y Tritn
X -100, com nm ente usados para o b ten er la
IgM m, disocian al complejo. Estos polippti
dos estn tambin asociados a los otros isotipos
de inmunoglobulinas cuando, durante la m adu
racin de la respuesta inmune, se expresan en
membrana.
Los polipptidos Ig -a e Ig-p forman heterodmeros unidos por puentes disulfuro. En el ra
tn la protena Ig a es el producto del gen lla
mado mb-l y la Ig-p, la del gen B29. Estos ge
nes se expresan en linfocitos B y no lo hacen
en los LT. El gen m b-l codifica una protena
de 220 aminocidos que incluye una secuencia
lder, un sitio extracelular con dos sitios poten
ciales de N-glucosilacin, una porcin trans
membrnica y un dominio C-terminal intracitoplasmtico.
Los polipptidos Ig-a e Ig-p aislados de c
lulas B de ratn tienen un PM de 34 y 40 kD,
respectivamente, y una estructura sim ilar a la
de los tres polipptidos (y, 5 y e) del com po
nente CD3 del linfocito T. En los polipptidos
aislados de hnfocitos B humanos los PM sea

258

Aspectos bsicos de la inmunidad

Receptor antignico dei

Linfocito T
C PA

Receptor antignico del

Linfocito r

M W

CIMH-II

M M

pptido

Fig. 13-1. Representacin esquem tica de los receptores antignicos de los linfocitos B y T. El receptor del LB reconoce
un epitope conform acional de un antgeno nativo expuesto en una fase fluida. El receptor del linfocito T, en este caso un
Th, reconoce uno de los pptidos resultantes del procesado del antgeno por la CPA y expuesto en m em brana asociado al
CM H-IL

lados para ratn se encuentran invertidos, posi

blemente como consecuencia de una alta glu
cosilacin de las cadenas Ig-a.
El dominio citoplsmico de g - a consta de
61 aminocidos y el de Ig-[3 de 48 aminoci
dos, lo suficientemente largos como para transducir seales, lo que se presume ocurrira con
la participacin de estructuras patrones dom i
nantes (motifs) homlogas presentes en am
bas cadenas. Esto permitira entender el posible
mecanismo de activacin celular inducido por
la interaccin del antgeno con el receptor del
LB (IgMm), teniendo en cuenta que la cadena
[t de esta inmunoglobulina slo tiene 3 amino
cidos ubicados en la regin citoplasmtica, lo
que lim ita enorm em en te su p o sib ilid a d de
transmitir seales al interior de la clula.
Las protenas accesorias Ig -a e Ig-p tambin
son necesarias para que se produzca el trnsito
a la membrana celular de la IgMm sintetizada.
No se conoce exactamente el niimero de heterodmeros Ig-a/Ig-P que estn asociados a la

IgMm; se presume como posibles un niimero

de dos.
En la figura 13-1 puede apreciarse la estruc
tura esquemtica del complejo que constituye
el receptor antignico del linfocito B.
El antgeno especficamente reconocido por
el linfocito B como protena extraa es proce
sado de manera similar a lo que hace una clula
presentadora de antgeno (CPA), siguiendo la
va endoctica. Los diferentes pptidos resul
tantes sern expresados en su membrana aso
ciados a antgenos del CMH-clase II, segtn se
indic en el captulo 2. Esos complejos CMHll-pptido sern los que reconocern los Th ac
tivados los que, como consecuencia de esa in
teraccin, habrn de poner en marcha el efecto
cooperativo. Los linfocitos Th han aprendido a
reconocer esos complejos al contactarse eon las
CPA que han endocitado esos mismos antge
nos. Los diferentes pptidos resultantes del
p ro c e sa d o de esto s a n tg en o s a so c iad o s a
CMH-clase II sern expresados en la membra-

El reconocimiento antignico y activacin de los linfocitos B y T

IgMm

259

Ag

CPA
RE
LB
-CM H-II

CPA

Ag

CMH-II

endocitado

,
Ag
endocitado

LB p

endosomas
pptidos
CMH-ll

-I- M

R E ^^\

CPA

pptidos +
CMH-ll

RCT

LB

/Th

4
Til activado

Clula
I I plasmtica
Anticuerpos
Fig. 13-2. R econocim iento del antgeno por el linfocito B y efecto cooperativo de un Tii activado por interaccin con
CPA. El antgeno es procesado en los endosom as originndose los pptidos que se unirn al CM H -II sintetizado en el ret
culo endoplasm tico (RE) y se expondrn en la m em brana plasm tica p ara su reconocim iento por el Th.

na de la CPA y los distintos linfocitos Th con

receptores especficos para ellos se activarn al
ponerse en contacto.
Ello significa que diferentes Th podrn ejer
cer efecto cooperativo sobre un mismo linfoci
to B ya que, si bien esta clula posee un nico
receptor especfico para un epitope del antge
no extrao sin modificar, cuando ste es endo
citado y procesado son varios los pptidos pro
venientes del mismo antgeno original que se
expondrn en membrana (fig. 13-2).
El receptor antignico del linfocito T
y reconocimiento del antgeno
A diferencia de lo que ocurre con el linfocito
B, que interacciona con antgenos no modifica

dos, el linfocito T slo reconoce pptidos de

aproxim adam ente 8-15 am inocidos p ro v e
nientes de la degradacin del antgeno p o r las
clulas CPA, y estando esos pptidos expuestos
en la membrana celular y asociados a antgenos
del CM H de clase I cuando el antgeno es de
sntesis endgena (protenas virales, antgenos
tumorales), o CMH de clase l si el antgeno es
de origen exgeiio (bacterias, parsitos). Dado
que el sitio de interaccin del CMH-clase 1 con
el pptido es el producto de una sola cadena
(a) y el del CMH-clase II de las cadenas pept
dicas a y [3 (vase cap. 12), en este ltim o se
origina una estructura de mayor amplitud para
su asociacin con ios pptidos a presentar. Se
ha demostrado que las molculas del CM H -cla
se I pueden presentar pptidos de 7- 10 resi-

260

Aspectos bsicos de la inmunidad

dos, en tanto que las molculas del CM H-cla

se II normalmente presentan pptidos constitui
dos por 12-15 aminocidos.
El R C T est asociado al complejo CD3, el
que est constituido por las cadenas polipept
dicas y, 8 y e, la ltima de las cuales forma heterodmeros con Y y 5 (ey, e5) y los componen
tes de la familia zeta, que en el 90% de los
casos constituyen un homodmero (i^2: dos ca
denas zeta) y un heterm ero (T|; una cadena
zeta y una cadena eta) en el 10% de los casos
restantes. Estas cadenas polipeptdicas son fun
damentales y participan activamente en los me
canismos de activacin celular cOmo se ver
ms adelante. Los antgenos de membrana CD4
y CD8, que identifican a poblaciones de clulas
T reguladoras y efectoras, respectivamente, tie
nen tambin participacin activa (fig. 13-1).
Si bien las interacciones CM H -ILpptidoRCT y CMH-I-pptido-RCT son las responsa
bles de ia unin especfica entre las CPA-Th,
Th-LB y CPA-Tc, las mismas no son suficien
tes para que la activacin celular se efectivice.
Otras uniones entre componentes de las mem
branas de estas clulas deben ocurrir para que
se originen los entrecruzamientos o agregados
de los receptores, indispensables para que la
activacin de las clulas, su diferenciacin y
expresin de molculas con actividad biolgica
tenga lugar. En la figura 13-3 estn resumidas
las experiencias realizadas por Emmrich con el
objeto de demostrar la importancia de la agre
gacin.
Diferentes protenas de membrana presentes
en las CPA y en los Th y Te, especialmente las
conocidas con el nombre de molculas de ad
hesin, constituyen pares moleculares que inte
raccionan entre s y originan uniones protenaprotena, asegurando a la unin clula-clula la
suficiente afinidad para que los mecanismos de

activacin celular se pongan en marcha u origi

nando coestimulaciones fundamentales para la
activacin.
En el cuadro 13-1 estn indicados diferentes
pares moleculares que participan en la adhe
sin y coestimulacin entre linfocitos Th y lin
focitos B.
CD2 es una molcula proteica presente en Jos
linfocitos T y su ligando en los linfocitos B es
la molcula LPA-3 (CD58). Como consecuen
cia de esa interaccin hay activacin de quina
sas de tirosina, especialmente p59'>'" y la consi
guiente fosforilacin de diferentes sustratos.
LFA-1 (CDl la), cuyo epitope es un hidrato
de carbono, tiene com o ligando a ICAM-1
(CD54) e lC A M -2 (CD102). Estos pares de
molculas estn presentes en los linfocitos Th y
LB, lo que implica que la contribucin a la ad
hesin celular puede tener lugar en ambos sen
tidos. Cuando las elulas se activan aumenta la
afinidad de estas molculas por sus ligandos,
especulndose que en ello estn involucradas
fosforilaciones mediadas por quinasas.
La molcula CD28 y la CTLA-4 -que se ex
presa en el linfocito Th activado-, tienen como
ligando en los linfocitos B a las molculas de la
familia B7 (B7.1 y B7.2), identificadas como
CD80 y CD86 respectivamente, siendo la afini
dad de CTLA-4 por sus ligandos mayor que la
correspondiente a CD28. Esta interaccin no es
la de una simple adhesin, sino que hay una
coestimulacin para c[ue el efecto cooperador
tenga lugar. Algo similar ocurre entre CD40,
antgeno de diferenciacin del linfocito B y
CD40L (ligando de CD40) existente en la mem
brana de los linfocitos CD4+ activados (Th).
Interacciones de adhesin tambin han sido
demostradas entre los antgenos de membrana
CD45RO y CD5 de los hnfocitos T y las mol
culas CD22 y CD72 de los linfocitos B. Para

C u ad ro 13-1. Pares de molculas que interactan como ligandos en las interacciones entre lin
focitos Th y linfocitos B
Linfocitos Th

Linfocitos B
M olculas de adhesin

CD2
t.FA-1 (C D l la )
CAM-1 (CD 54)

L F A -3 (CD 58)
IC A M -1(C D 54)/IC A M -2 (CD 102)
LFA~1 (C D lla )
M olculas de coestim ulacin

CD 28
CTLA-4
CD 40L

B7 (B 7.I/B 7.2)
B7 (B 7.I/B 7.2)
CD 40
O tras m olculas

CD 45RO
CD5

CD 22
CD 72

El reconocimiento antignico y activacin de los linfocitos B y T

ms detalles sobre estas molculas y sus inte
racciones vase el apndice del captulo 2 y ca
ptulo 11.
M ecanism os de transduccin en linfocitos B
M ecanismos sim ilares a los descritos para
otras interacciones receptor-ligando, consisten
tes en la activacin y liberacin de segundos
mensajeros, han sido descritos para la unin
IgMm-Ag y RCT-CMH-II-pptido.
En el caso del receptor B o Ig-a/Ig-|3-IgMm,
la transduccin o envo de seales es puesta en
marcha por el entrecruzam iento o agregacin
del receptor por antgenos que expresan por
unidad un mismo epitope repetido. Se conside
ra que debe ser as pues artificialmente se pue
de inducir el mismo efecto con anticuerpos anti-inmunoglobulina y, en cambio, no se logra
activacin celular con ligandos univalentes. Lo
primero que se observa durante este proceso es
la aparicin de un cierto nmero de protenas
con sus tirosinas fosforiladas, entre ellas Ig -a e
Ig-p, lo que se estima es debido a la activacin
de diferentes protein-quinasas de tirosina. Por
analoga a lo que ocurre con el RCT y el com
plejo CD3, se presum e que los polipptidos
Ig-a e Ig-p deben jugar un papel importante en
los mecanismos de activacin celular. Su real
participacin en este evento no ha sido an fe
hacientemente demostrada.
Se considera, sobre la base de resultados ex
perimentales, que diferentes quinasas de tirosi
na participan en este proceso de fosforilacin
de protenas, especialmente algunos miembros
de la familia Src-tirosin quinasa, como p56 y
p59'"', protenas de 56 y 59 kD respectivamen
te, productos de expresin de los proto-oncogenes Ick y fyn.
Se especula sobre el mecanismo por el cual
el entrecruzamiento del receptor del linfocito B
puede inducir la activacin de las quinasas de
tirosina. Los componentes de la familia Src-tirosin-quinasa tienen dos dominios homlogos
denominados SH2 y SH3 (SH por homologa
Src). Los SH2 median las interacciones prote
na-protena entre la enzima y la protena con
restos de tirosina a fosforilar. Los SH3 recono
cen secuencias ricas en prolina y pueden unirse
a otras protenas capaces de transducir seales.
Tienen adems una regin N-terminal que con
tiene un sitio de miristilacin involucrado en
localizacin en membrana y un dominio estruc
tural con actividad de quinasa de tirosina, do
minio que, a su vez, tiene dos tirosinas que ac
tan como sitios de regulacin de la actvidad
de la enzima. La fosforilacin de uno de esos
sitios, el correspondiente a la tirosina 394, por
otra quinasa de tirosina, es un evento activante,
mientras que la fosforilacin de la tirosina 505

261

decrece su actividad enzimtica (fig. 13-4). En

los linfocitos en reposo la Tyr 505 est fosforilada, producindose la desfosforilacin durante
la activacin celular, seguida de la activacin
de la capacidad quinasa y autofosforilacin de
la Tyr 394. Hay quienes suponen que la p56lck
es inactiva en los linfocitos en reposo debido a
la interaccin entre el sitio de regulacin nega
tiva y el dominio SH2 de su propia molcula,
lo que llevara a producir un cambio alostrico
que inhibira la actividad quinasa o la accesibi
lidad de substrato. Se considera qufc el entrecruzamiento del receptor B llevara a la rem o
cin del fosfato correspondiente al sitio inhibi
torio, predominando el efecto activante. Jugara
un papel im portante en este proceso C D 45,
protena de membrana de los linfocitos con ac
tividad de fosfatasa de tirosina, la que ha sido
bien estudiada en las clulas T.
O tras p ro tein -q u in asas de tiro sin a co m o
p53/56'J'", p55'>", PTK72 y ZAP-70 probable
mente participen tam bin en forma activa en
los procesos de fosforilacin de protenas que
intervienen en la activacin del linfocito B.
Un mecanismo de fosforilacin que ju eg a un
rol importante en la transmisin de seales me
diadas por el receptor del linfocito B, cuando
se produce su entrecruzamiento por antgeno o
anticuerpo anti-inmunoglobulina, es el que se
inicia con la hidrlisis de fosfatidil inositol di
fosfato (PIP2) por fosfolipasa C (PLCyl), que
lleva a la produccin de inositol trifosfato (IP3)
y diacilglieerol (DAG). El IP3 formado estim u
la la salida de Ca^+ del retculo endoplasmtico
e influjo de Ca^+ desde el exterior de la clula a
travs de canales transmembrnicos y activa a
su vez una proteinquinasa dependiente de Ca^+
y calmodulina (Ca^VCaM quinasa). Este Ca^+,
juntam ente con el DAG que acta como cofac
tor, provocan una translocacin de proteinqui
nasa de serina/treonina (PKC) a la m em brana
citoplasmtica, la que as activada fosforila su
sustrato, modificando el pH y alterando la acti
vidad de estructuras responsables del transporte
de varios iones, entre ellos Na+, H+, Ca^+ y K+
(fig. 13-5) La activacin de estas cascadas le
permite al linfocito B progresar a la fase S del
ciclo celular, caracterizada por la sntesis de
ADN. Durante este proceso hay aumento de la
e x p re s i n en m em b ra n a de a n tg e n o s del
CMH-clase II, facilitndose la presentacin al
linfocito Th de los pptidos antignieos resul
tantes de la degradacin del antgeno y de re
ceptores para IL-2 e IL-4. Con posterioridad a
esa interaccin hay aumento de AMPc prom o
vindose la diferenciacin celular que llega
hasta el estado de plasmocitos, sintetizadores
de una inmunoglobulina o anticuerpo estructu
ralmente igual a la del receptor antignico, la
que es secretada.

262

Aspectos bsicos de la inmunidad

^C D 8

W ' rct

F(ab)2

hetero
dmero

(++)

anti-CD8
anti-CD3

F ig. 13-3. D em ostracin m ediante el em pleo de anticuerpos rnonoclonales unidos a una fase slida o hibridizados por m
todos qum icos de que la agregacin de R C T/CD 3 con otras m olculas es indispensable p ara la activacin celular. L a reac
cin A es negativa (control). El entrecruzam iento con anticuerpos anti-CD 3 y anti-CD 8 no resulta efectivo, si uno de los
anticuerpos est en solucin (B, C ), Las reacciones D , E y F son positivas, en los tres casos hay entrecruzam iento de CD3
con CD8 por estar am bos anticuerpos unidos a una fase slida (D), agregados por un F (ab )2 anti-IgG (E) o heterodim erizados por m todos qum icos (F). Las reacciones G , H e ! son negativas por no e.xistir entrecruzam iento. (A daptada de
Em m rich F, Im m unology Today, 90: 296, 1988.)

Mecanismos de transduccin
en el linfocito T
Un mecanismo de fosforilacin similar al in
dicado en la activacin del linfocito B ocurre

cuando el linfocito T, a travs del RCT/CD3

in teract a con el co rresp o n d ien te p ptidoCMH. Este hecho, al igual que el entrecruza
miento del RCT/CD3 con un anticuerpo mono
clonal especfico, induce cambios conformaDominio con
actividad de quinasa

Sitio de
miristilacin

SH3

SH2

Tyr 394
sitio regulador
positivo

Tyr 505
sitio reguiador
negativo

F ig. 13-4. Representacin esquem tica d p56'' com ponente de la fam ilia Src de tirosin quinasas de protenas.

El reconocimiento antignico y activacin de los linfocitos B y T

263

Fig. 13-5. E.squem atizacin de la activaciji de una clula B por agregacin del receptor (IgM m ) con un antgeno. Una
fosfolipasa C activada (PLC*) hidroliza derivados polifosfoinosnicos (PiP2) en inositol trifosfato (IP3) y diacilglicerol
(DAG). H ay m ovilizacin de Ca^*, el que junto con el DAG induce la translocacin de proteinquinasa de serina/treonina
(PKC) del citoplasm a a m em brana (PKC*). El IP3 activa a su vez u n a proteinquinasa dependiente de Ca^+ y calm o d u lin a
(Ca^VCaM). Estas enzim as fosforilan sus sustratos proteicos y se ponen en m archa los m ecanism os de activacin celu lar.

cionales en una o varias de sus unidades y la

consecuente fosforilacin por una o ms quina
sas de protenas.
As como la funcin del heterodm ero a /p
del' RCT es la de reconocer el ligando especfi
co, la funcin de los pptidos constitutivos de
CD3 y de las cadenas ^ es la de acoplar RCT a
los componentes celulares que transducen las
seales. Las dos principales quinasas de prote
nas asociadas a R C T y a los co-receptores
CD4/CD8 son pS'*'* y p59^'", las que surgen
como fosforilantes de diferentes sustratos en
dgenos. La primera de ellas est directamente
asociada a los dom inios citoplasm ticos de
CD4 o CDS, o ambos.

L a cadena C, es el nico co m p o n en te del

RCT/CD3 que experimenta fosforilacin de ti
rosinas y ha podido demostrarse que su regin
citoplasm tica es capaz de transducir seales
correspondientes a eventos relacionados con el
RCT.
Recientemente se ha descrito otra protena
que por inmuno-precipitacin coprecipita con
las cadenas ^ a partir de materiales provenien
tes de linfocitos T activados. Se la denomina
ZAP-70 por ser una protena de 70 kD asociada
a la cadena
que experimenta in vivo fosfori
lacin de tirosinas a continuacin de la estimu
lacin del RCT. La asociacin de ZAP-70 y ca
denas producida con posterioridad a la esti-

264

Aspectos bsicos de la inmunidad

muJacin del RCT se correlaciona con un au

mento de la actividad de quinasa de protena
que se detecta en los inmunoprecipitados. Ello
hace que se considere que ZAP-70 debe estar
asociada con transduccin de seales que tie
nen lugar cuando un linfocito T es estimulado,
aunque la naturaleza de la funcin que esta
PKT cumple in vivo es desconocida. Un posi
ble rol sera el de unir el RCT, a travs de la
cadena ^ a molculas adicionales que funciona
ran en otras etapas del camino que lleva a la
transduccin de seales.
En los linfocitos T activados la PLC experi
menta una rpida y transiente fosforilacin de
sus tirosinas. Ello ocurre porque la molcula
posee un dominio SH2 que le permite asocia
cin con quinasas de protenas. Cuando el RCT
fija su ligando especfico se activan algunas de
las fosfotirosin quinasas de protena asociadas
a este evento, siguiendo Ju eg o la fosforilacin
y activacin de PL C yl. sta hidroliza PIP2 pa

ra formar los segundos mensajeros IP3 y DAG,

que activan a PKC, la que fosforila una varie
dad de substratos que contienen serina o treoni
na siguiendo la cascada ya indicada en activa
cin del linfocito B.
Otras quinasas han sido identificadas en lin
focitos, entre ellas: quinasas dependientes de
AMPc (PKA), quinasas dependientes de GMPc
(PKG) y quinasas de protenas activadas por
mitgenos (MP-quinasas), se considera que
stas deben tambin participar en los eventos
que llevan a la activacin celular.
El estado de fosforilacin de las protenas es
debido a un equilibrio dinmico entre la accin
de quinasas y fosfatasas, las primeras fosforilando y las segundas desfosforilando. Una acti
vidad de fosfotirosin fosfatasa ha sido identifi
cada en la porcin citoplasmtica de CD45, un
antgeno de diferenciacin comn para los di
ferentes linfocitos. Se estima que podra inter
venir regulando el balance fosforilacin/des-

CPA
CMH-II

pptido
CD45

ATP

F ig. 13-6. Reconocim iento antignico del com plejo CIVIH-II-pptido por el R C T y puesta en m archa de los m ecanism os
de fosforilacin y desfosforilacin de protenas que llevan a la activacin celular.

El reconocimiento antignico y activacin de los linfocitos B y T

fosforilacin de las tirosinas de protenas del
linfocito T comprometidas en la puesta en m ar
cha de seales de activacin celular. Otras fosfotirosin fosfatasas, entre ellas las denominadas
PEP y SHP que presentan un dominio citoplas
mtico de gran tamao y se expresan en Hnfo
citos, podran participar tambin en los meca
nismos regulatorios de desfosforilacin (fig.
13-6).
Eventos que se ponen en marcha
por estimulacin antignica
En el linfocito B
C uando un antg en o in teraccio n a con la
IgMm, en el linfocito B ocurren una serie de
hechos, algunos de expresin inmediata y que
tienen lugar a los segundos o pocos minutos de
ocurrido el contacto, en tanto que otros slo se
expresan despus de cierto tiempo.
La produccin de segundos mensajeros, co
mo IP3, DAG e incremento de Ca^+, provenien
tes de la hidrlisis de PIP2 por P L C yl, y la fos
forilacin de tirosinas por diferentes quinasas
inducen en las clulas B en reposo (GO) la en
trada a la fase G l del ciclo celular. Esta se ca
racteriza por un aumento del tamao del linfo
cito e incremento de la sntesis de ARN, espe
cialmente el correspondiente a los proto-oncogenes c-fos y c-myc que codifican para factores
de transcripcin, los que son inducidos en dife
rentes sistemas celulares por interacciones re
ceptor-ligando. Por otra parte el aumento de
Ca^+ juega un rol muy importante en la regula
cin de genes y en el aumento de complejos de
unin a ADN.
La agregacin de IgMm induce la transcrip
cin de genes del CMH-II. El aumento de la
expresin de m olculas del CM H-II es muy
importante ya que esas molculas, siguiendo la
ruta endoctica se ponen en contacto con los
pptidos procesados por los endosomas y los
transportan a la membrana celular para su reco
nocimiento por los linfocitos Th. Durante este
proceso hay tambin activacin de los genes
que codifican la sntesis de los receptores de
IL-2 (RlL-2) e IL-4 (RIL-4).
La proliferacin celular y la sntesis de anti
cuerpos por los linfocitos B depender en pri
mera instancia de los diferentes mecanismos
expuestos que llevan a la expresin de genes y
sntesis de protenas reguladoras y, en segundo
lugar, a su reconocim iento por los linfocitos
Th. Estos habrn de actuar por contacto directo
a travs de su receptor antignico, el co-i'eceptor CD4, los diferentes pares de molculas de
adhesin y por intermedio de distintas interleu
quinas por l sintetizadas, especialmente IL-2 e
IL-4. Las interleuquinas podrn ejercer su fun

265

cin por interaccin con los correspondientes

receptores, expresados en la membrana de los
linfocitos B como consecuencia de la agrega
cin inicial del receptor Ig-a/Ig-p-IgM m por
interaccin con un ligando adecuado.
En el linfocito T
La unin del pptido-CMH al RCT/CD3 ge
nera seales al interior de la clula que, al igual
que en linfocito B, incrementan la transcripcin
de genes y la sntesis de protenas esenciales
para la mitosis y ei funcionamiento celular. Los
eventos que se originan pueden ser de ex p re
sin inmediata o tarda.
Entre los de expresin inmediata est la fos
forilacin de protenas, entre ellas las cadenas y
y 5 de CDS, que fosforilan residuos de serina
de Ja porcin intracitoplasmtica y las cadenas
^ que fosforilan sus residuos de tirosina. Se
fosforilan tam bin, y as pueden cum plir su
funcin, protenas reguladoras de transcripcin
o factores nucleares, que se fijan a determina
das secuencias de ADN de las regiones corres
pondientes a mejoradores de la expresin (enhancer) o promotores de genes. Como y a se
indicara, participan activamente en este proce
so diferentes quinasas de protenas y el D A G e
IP3 provenientes de la hidrlisis de fosfolpi
dos de la membrana plasmtica por incremento
de la actividad cataltica de la fosfolipasa C
(PLCyl). Estas fosforilaciones ocurren pocos
segundos despus de la interaccin RCT/CD3pptido/CM H, al igual que un aumento de la
actividad intercambiadora NaVH^ por parte de
la mem brana citoplasmtica, resultante en un
aumento de! pH intracelular.
Otro evento que ocurre es la transcripcin de
genes, cuyos productos proteicos son fu n d a
m entales para la activacin celular. N o rm al
m ente estos procesos requieren ms tiem po,
pueden oscilar entre m inutos y horas. E ntre
esos genes estn los proto-oncogenes ya sea
lados c~fos y c-myc, as llamados porque una
superexpresin o productos de mutaciones pue
den inducir en las clulas transformaciones ma
lignas. En condiciones normales los productos
de estos genes actan dentro del ncleo regu
lando el crecimiento celular.
La transcripcin de los genes de las interleu
quinas es un hecho muy importante, en espe
cial el de la lL-2, as como la correspondiente a
los genes que transcriben a sus receptores. En
el linfocito T la expresin del receptor de IL-2
(RIL-2) es un hecho significativo, ya que ello
permitir que la IL-2 sintetizada por a misma
clula pueda interaccionar con su receptor y
funcionar como factor de crecimiento endocri
no. (Para ms detalles sobre interleuquinas y
sus receptores vase cap. 12.)

266

Aspectos bsicos de a inmunidad

Cuando una clula inmunolgicamente com

petente -u n linfocito B o un Hnfocito T -, inte
racciona con un ligando a travs de su receptor
especfico, se activa una serie de mecanismos
bioqumicos que hacen que una clula en repo
so (fase GO) entre en el ciclo celular y se pro
duzca su pasaje a las fases G l/S . Como conse
cuencia de ello la clula sintetizar molculas
funcionalm ente activas las que le perm itirn
cum plir funciones especficas. C uando ello
ocurra, en trminos estrictamente inm unolgi
cos diremos que una respuesta inmune se ha
puesto en marcha.
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antigen and Fe receptors . Vol. 7, N 1, 1995.

Evolucin del sistema inmune

14

GUILLERMO BLANCO

INTRODUCCIN
Durante muchos aos la inmunidad fue con
siderada como la resistencia de un organismo a
la enfermedad. M edaw ar introdujo el prim er
modelo experimenta] en el cual se hizo eviden
te que la resistencia a la enfermedad no era la
nica razn de ser del sistema inmune. Sus ex
periencias con transplantes hicieron evidente
que el sistem a inm une estaba involucrado en
respuestas que no tenan una relacin aparente
con la infeccin y la enfermedad. El reconoci
miento especfico, la memoria y una segunda
respuesta aumentada fueron las evidencias fun
cionales que definan la presencia de un siste
ma inmune clsico. En la dcada del 50 Bur
net propone que la propiedad funcional que de
fine la presencia de un sistema inmune es la ca
pacidad de distinguir lo propio y lo no propio.
Si bien todas las especies del reino animal son
capaces de distinguir lo propio y lo no propio,
no todas requieren del poder de discriminacin
y adaptacin de los vertebrados.
Los invertebrados comprenden el 95% de las
especies conocidas. Poseen sistemas inmunes
no adaptativos que, pese a su relativa simplici
dad, han permitido a muchas especies sobrevi
vir satisfactoriamente durante cientos de millo
nes de aos sobre la superficie terrestre.
EL SISTEM A IN M U NE
DE L O S IN V ER TEB R A D O S
Sobre la base de diferencias embriolgicas,
los invertebrados celomados se dividen en dos
grandes lneas evolutivas; los protostomados y
los deuterostomados. De estos ltimos se origi
na a su vez la lnea evolutiva que da origen a
los vertebrados (fig. 14-1),

El conocimiento actual del sistema inm une

de los invertebrados deriva en su mayor parte
del estu d io de los protostom ados d ado que
entre los artrpodos y moluscos se cuentan es
pecies de gran importancia econmica y sani
taria.
La primera lnea de defensa frente la infec
cin es la barrera fisicoqum ica conform ada
por el exoesqueleto en los artrpodos, la cu
bierta calcrea en los bivalvos o la abundante
secrecin mucosa externa de los anlidos y mo
luscos. Una vez rota esta barrera se ponen en
marcha repuestas de defensa celulares y hum o
rales tales eomo fagocitosis, coagulacin, for
macin de ndulos, encapsulacin, activacin
de enzimas y/o liberacin de factores de opso
nizacin. Existen variaciones entre los distintos
grupos pero es posible reconocer caractersticas
esenciales compartidas por todos ellos, que re
sumen una buena parte del conocim iento que
se tiene de estos sistemas.
Fagocitosis
La fagocitosis es la respuesta celular m s co
mn y se considera que no es un proceso auto
mtico dependiente de! contacto entre fagocito
y partcula a endocitar, sino que existe una se
leccin basada en el reconocimiento del agente
extrao por medio de molculas de superficie
de membrana. En muchas especies se han iden
tificado leetinas para las que se propone un rol
similar al de los receptores de fagocitosis para
a-m ananos y p-glucanos presentes en monoci
tos y macrfagos humanos y murinos. Estos re
ceptores son los mediadores de la fagocitosis
en ausencia de opsonizacin por medio de Igs
o el factor C3 del sistema complemento (vase
fig. 14-2).

266

Aspectos bsicos de a inmunidad

Cuando una clula inmunolgicamente com

petente -u n linfocito B o un Hnfocito T -, inte
racciona con un ligando a travs de su receptor
especfico, se activa una serie de mecanismos
bioqumicos que hacen que una clula en repo
so (fase GO) entre en el ciclo celular y se pro
duzca su pasaje a las fases G l/S . Como conse
cuencia de ello la clula sintetizar molculas
funcionalm ente activas las que le perm itirn
cum plir funciones especficas. C uando ello
ocurra, en trminos estrictamente inm unolgi
cos diremos que una respuesta inmune se ha
puesto en marcha.
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Evolucin del sistema inmune

14

GUILLERMO BLANCO

INTRODUCCIN
Durante muchos aos la inmunidad fue con
siderada como la resistencia de un organismo a
la enfermedad. M edaw ar introdujo el prim er
modelo experimenta] en el cual se hizo eviden
te que la resistencia a la enfermedad no era la
nica razn de ser del sistema inmune. Sus ex
periencias con transplantes hicieron evidente
que el sistem a inm une estaba involucrado en
respuestas que no tenan una relacin aparente
con la infeccin y la enfermedad. El reconoci
miento especfico, la memoria y una segunda
respuesta aumentada fueron las evidencias fun
cionales que definan la presencia de un siste
ma inmune clsico. En la dcada del 50 Bur
net propone que la propiedad funcional que de
fine la presencia de un sistema inmune es la ca
pacidad de distinguir lo propio y lo no propio.
Si bien todas las especies del reino animal son
capaces de distinguir lo propio y lo no propio,
no todas requieren del poder de discriminacin
y adaptacin de los vertebrados.
Los invertebrados comprenden el 95% de las
especies conocidas. Poseen sistemas inmunes
no adaptativos que, pese a su relativa simplici
dad, han permitido a muchas especies sobrevi
vir satisfactoriamente durante cientos de millo
nes de aos sobre la superficie terrestre.
EL SISTEM A IN M U NE
DE L O S IN V ER TEB R A D O S
Sobre la base de diferencias embriolgicas,
los invertebrados celomados se dividen en dos
grandes lneas evolutivas; los protostomados y
los deuterostomados. De estos ltimos se origi
na a su vez la lnea evolutiva que da origen a
los vertebrados (fig. 14-1),

El conocimiento actual del sistema inm une

de los invertebrados deriva en su mayor parte
del estu d io de los protostom ados d ado que
entre los artrpodos y moluscos se cuentan es
pecies de gran importancia econmica y sani
taria.
La primera lnea de defensa frente la infec
cin es la barrera fisicoqum ica conform ada
por el exoesqueleto en los artrpodos, la cu
bierta calcrea en los bivalvos o la abundante
secrecin mucosa externa de los anlidos y mo
luscos. Una vez rota esta barrera se ponen en
marcha repuestas de defensa celulares y hum o
rales tales eomo fagocitosis, coagulacin, for
macin de ndulos, encapsulacin, activacin
de enzimas y/o liberacin de factores de opso
nizacin. Existen variaciones entre los distintos
grupos pero es posible reconocer caractersticas
esenciales compartidas por todos ellos, que re
sumen una buena parte del conocim iento que
se tiene de estos sistemas.
Fagocitosis
La fagocitosis es la respuesta celular m s co
mn y se considera que no es un proceso auto
mtico dependiente de! contacto entre fagocito
y partcula a endocitar, sino que existe una se
leccin basada en el reconocimiento del agente
extrao por medio de molculas de superficie
de membrana. En muchas especies se han iden
tificado leetinas para las que se propone un rol
similar al de los receptores de fagocitosis para
a-m ananos y p-glucanos presentes en monoci
tos y macrfagos humanos y murinos. Estos re
ceptores son los mediadores de la fagocitosis
en ausencia de opsonizacin por medio de Igs
o el factor C3 del sistema complemento (vase
fig. 14-2).

268

Aspectos bsicos de la inmunidad

Se distinguen cuatro fases: quimiotctica, de

adhesin, de ingestin y de destruccin y me
tabolism o. La prim era ha sido observada en
estudios sobre anlidos, moluscos e insectos.
La fase de adhesin requiere de la participa
cin de molculas del tipo de las lectinas aso
ciadas a membranas y, en algunos casos, se ha
identificado la participacin de molculas si
milares a los factores del complemento. La fa
se de ingestin comprende la formacin de un
fagosom a que luego se une a los lisosom as
donde el m aterial endocitado tom a contacto
con distintas hidrolasas tales como fosfatasa
cida, esterasas cidas inespecficas y peroxi
dasa. En algunos casos estas enzimas pueden
ser simultneamente liberadas al medio con un
objetivo de defensa. La fase de destruccin y
m etabolism o, com prende la destruccin por
hidrolasas lisosomales. Los artrpodos poseen
un sistema de destruccin basado en la produc
cin de melanina mediado por una fenoloxidasa en presencia de sustratos adecuados tales
como L-dopa o tirosina. La melanina u otros
intermediarios precursores son altamente txi
cos y responsables de la destruccin de parsi
tos. Se ha observado que en muchas especies
el consumo de oxgeno aumenta muy poco du
rante la fagocitosis por lo que no existira el
estallido respiratorio con la resultante produc
cin de HjOj propio de muchos fagocitos ver
tebrados.

en insectos y moluscos pero tambin ha sidp

observada en tunicados, equinodermos, crust
ceos, sipunclidos, anlidos, celenterados y es
pongiarios
Citotoxicidad
La citotoxicidad es una forma de respuesta
muy difundida entre los invertebrados y ha si
do observada en espongiarios, celenterados, si
punclidos, anlidos, moluscos, equinodermos
y protocordados. Los espongiarios, celentera
dos y protocordados son invertebrados colo
niales y en ellos las reacciones de citotoxici
dad participan en las funciones de preserva
cin de la identidad de la colonia. En los gru
pos no coloniales, la citotoxicidad natural o es
pontnea estara destinada entre otras cosas a
la eliminacin de clulas transformadas. Expe
riencias con sipunclidos demostraron la pre
sencia de citotoxicidad alogeneica cuando las
especies habitaban regiones separadas por ms
de 30 km. La citotoxicidad es dependiente del
contacto clula blanco-clula efectora, es inde
pendiente de la exposicin previa al antgeno,
no ocurre en todas las combinaciones aloge
neicas y es inhibida por la presencia de varios
carbohidratos. Se la considera similar a la citotoxicidad mediada por clulas NK de los verte
brados.
Respuestas humorales

Formacin de ndulos
Cuando la cavidad celmica o hemocele de
un invertebrado es invadida por una cantidad
de microorganismos superior a los que pueden
ser eliminados por fagocitosis, se observa la
formacin de acmulos celulares denominados
ndulos. En algunos casos los ndulos presen
tan depsitos de m elanina. A lgunos autores
consideran a los ndulos hom logos de los
granulomas de los vertebrados. En su form a
cin participan fagocitos que luego de la etapa
inicial de adhesin sufren un proceso de adel
gazamiento progresivo que culmina en la con
formacin de una envoltura m ulticelular que
encierra una masa de clulas en degeneracin
y parsitos secuestrados (fig. 14-3).
Encapsulacin
El proceso de encapsulacin permite que los
invertebrados sean capaces de inmovilizar pa
rsitos tales como cestodes, trematodes, nema
todes, hongos y protozoarios de gran tamao,
encerrndolos con varias capas de clulas. El
m ecanism o de form acin de las cpsulas se
considera idntico al de los ndulos. La encap
sulacin ha sido ms frecuentem ente descrita

Los invertebrados no poseen Igs en sus l

quidos corporales. Sin em bargo poseen una
variedad de factores con capacidad ltica, de
aglutinacin, y otros efectos antimicrobianos.
Estos factores estn presentes en forma natural
y en algunos casos su formacin ocurre luego
de una estimulacin antignica. No obstante,
se caracterizan por carecer de la propiedad
anamnsica de las Igs. Entre estas sustancias
se cuentan hsinas, aglutininas, factores simila
res a citoquinas y otros factores antimicrobia
nos. Sin embargo, esta separacin es artificial
y muchas sustancias poseen ms de una de las
propiedades sealadas.
Lisinas
En los vertebrados, el papel ms activo en la
lisis humoral de agentes extraos, est a cargo
de los componentes del sistema complemento.
En los invertebrados se ha postulado la exis
tencia de un sistema similar a la va alterna del
complemento. Su existencia ha sido sugerida a
partir de la observacin de lisinas termosensibles y calcio-dependientes, supresin de la he
mlisis con el uso de inhibidores del com ple
mento como hidrazina y suramina y opsoniza-

Evolucin del sistema inmune

cin de la fagocitosis de macrfagos de ratn.
Sin embargo an es prematuro trazar homolo
gas entre ambos sistemas. La lisozima, una li
sina capaz de hidrolizar los enlaces entre el
cido N -acetil-neuramnico y la N-acetil-glucosamina presentes en la pared de algunas bac
terias, ha sido identificada en moluscos, insec
tos y equinodermos.
A glutininas/opsoninas
M uchos invertebrados poseen factores h u
morales capaces de aglutinar bacterias, protozoarios, eritrocitos de vertebrados, linfocitos y
parsitos metazoarios. Se considera que estas
sustancias, tambin presentes en plantas y en
el suero de vertebrados, han evolucionado va
rias veces y cumplen distintas funciones m u
chas de ellas no relacionadas con la inm uni
dad. La mayora de las aglutininas de inverte
brados han sido estudiadas en base a su capa
cidad para aglutinar eritrocitos de vertebrados.
Estas h em ag lu tin in as actan por m edio de
unin a carbohidratos especficos de la super
ficie de membrana del eritrocito y pertenecen a
una categora ms general de molculas cono
cidas como leetinas. En algunas especies se ha
demostrado su participacin como factores de
opsonizacin de la fagocitosis o promotores de
la formacin de ndulos y cpsulas.
C itoquinas
Se han descrito varios factores con propieda
des similares a citoquinas en equinodermos (As
teria forbesi y Asteria rubens), insectos y tuni
cados. Evaluadas en sistemas mamferos estas
sustancias reproducen muchas de las caracters
ticas de las citoquinas de los vertebrados.
Recientemente se ha aislado y caracterizado
la interleuquina-1 (IL -l)a y P de un tunicado
utilizando un ensayo de proliferacin de tim o
citos murinos. La IL-1 de tunicado comparte
muchas de las caractersticas de la IL-1 de m a
mferos. En los invertebrados esta citoquina
estim ula la fagocitosis en hemocitos y es un
promotor de la primera etapa de la formacin
de ndulos y de la encapsulacin, dado que au
menta la adhesin y agregacin de los hem oci
tos. En los invertebrados deuterostomados se
han caracterizado factores con actividad sim i
lar a IL-2.
Inmunoprotenas no inmunoglobulinas
Las p e n trax in as, fam ilia de p ro ten a s C
reactivas, constituyen parte de un sistema ge
neral de reconocimiento extremadamente pri
mitivo. Este sistema se origin tempranamente
en la evolucin y fue conservado en especies

269

tan distantes filogenticam ente como los an

cestros de los artrpodos (el fsil viviente Limulus polyphemus) y los mamferos. Si bien
no existen evidencias de que las pentraxinas
tengan un ancestro com n con las Igs, estas
molculas pueden expresar sitios de com bina
cin muy similares a aquellos presentes en las
Igs y pueden interactuar con componentes del
sistema complemento y otras molculas inmunorreguladoras en form a anloga a los a n ti
cuerpos. Estas molculas probablemente repre
senten un sistema de reconocimiento muy anti
guo y primitivo que se ha mantenido a travs
de la evolucin de los vertebrados, a pesar de
que stos hayan desarrollado un sistema ms
complejo de reconocimiento antignico.
Reconocimiento alogeneico
Todos los invertebrados estudiados m u es
tran capacidad de rechazo de injertos xenogeneicos en tanto que el reconocimiento aloge
neico tam b in est presente en m uchos de
ellos incluyendo espongiarios, celenterados,
anhdos, sipunchdos, equinodermos y tunica
dos. No se lo ha observado en nemertinos, mo
luscos y artrpodos. Curiosamente los artrpo
dos y moluscos exhiben la mayor incidencia
de neoplasias y contienen la mayora de los
hospedadores intermediarios y vectores d e pa
rsitos protozoarios y helmnticos. Sin em bar
go no existe una correlacin entre la presencia
de alorreactividad y la eficiencia de la respues
ta contra la infeccin ni con la evolucin de
inm unidad adaptativa como la de los v e rte
brados.
Los experimentos de transplantes realizados
con esponjas y corales, invertebrados de hbi
tos coloniales, demostraron la presencia de re
conocimiento alogeneico y sugieren la presen
cia de un complejo de genes de histocom pati
bilidad conformado por varios loci con m lti
ples alelos. En tunicados coloniales se h a de
mostrado que el reconocimiento alogeneico y
el control de la fertilizacin son caracteres li
gados y controlados por un mismo locus con
mltiples alelos.
Linfocitos
Los anlidos, sipunciilidos y nemertinos po
seen clulas con caractersticas m orfolgicas
similares a linfocitos. En algunos casos se las
ha observado involucradas en las reacciones
de rechazo de aloinjertos o de citotoxicidad
alogeneica por lo que han sido consideradas
clulas T primitivas. Sin embargo se observa
respuesta de proliferacin con lipopolisacri
dos bacterianos (LPS), concanavahna A (Con
A) y fitohemaglutinina (PHA) por lo que se ha

270

Aspectos bsicos de la inmunidad

aves

: YHC (

reptiles

ciclstomos

as/

>

:YHIPC

crustceos

mamferos j YHILPC

anfibios

] YHC

telesteo^

] YHC

insectos

] LI

>8^lasmobranquios] YH

T
LP

_____ idos J P

cordados

DM|

tunicados

Deuterostomados

artrpodos

DM

anlidos

^e q u in o d e rm o s ] L

-X .
sipunclidos

T
moluscos

Protostomados

celomados
nemertinos
celenterados

plathelmintos

acelomados
LUIUIlIcK.
esp o n g la rio sjprotozoarios

Y anticuerpos
H complejo mayor de histocompatibilidad
I molculas de adhesin de la superfamilia de Igs
L leetinas tipo C asociadas a membrana o libres
P pentraxinas (protena C reactiva)
C sistema complemento
DM evento de duplicacin masiva de genes

Fig. 14-1. Las modificaciones de estructura (m olculas, clulas, rganos y tejidos) constituyen un proceso continuo en la
evolucin de las especies en el que es posible reconocer hom ologas, En cam bio, las ftinciones no se conservan y evolucio
nan en form a discontinua. Por esta razn el estudio evolutivo de un sistem a biolgico requiere la identificacin y com para
cin de estructuras ms que de funciones. La figura m uestra un rbol filogentico donde las relaciones evolutivas fueron or
ganizadas segtn m ecanism os de desarrollo em briolgico. Sobre este rbol se ilustran las molculas de reconocim iento iden
tificadas en los diversos phyla. Los protostom ados y deuterostom ados se separaron hace aproxim adam ente 500 a 600 m illo
nes de aos. Los m ecanism os de recom binacin, esenciales para la respuesta inm une anticipada m ediada por anticuerpos (y)
y receptor de clula T, surgieron en la lnea evolutiva de los deuterostom ados que conduce a los vertebrados, luego de un
evento de duplicacin m asiva (D M ) del cual se origin el sistem a m ultignico VJC. Este evento pudo haber tenido lugar an
tes de la divergencia de los tunicados contem porneos o despus de esta divergencia, pero antes del surgim iento d e los ci
clstom os ancestrales. Las m olculas que participan en funciones de adhesin celular y regulacin (I) estn am pliam ente
distribuidas en la filogenia al igual que las m olculas de reconocim iento hom logas a las leetinas tipo C de los vertebrados
(L). Las pentraxinas (P) constituyen ejem plos extraordinarios de estructuras de reconocim iento conservadas a lo largo de la
evolucin de las especies. Se las ha identificado en artrpodos, tunicados y mam feros. La protena C reactiva es especfica
para ciertas bacterias y para pequeas m olculas orgnicas, com o la tosforilcolina, e interacta con com ponentes del sistem a
inm une com o el com plem ento y el receptor Fe a pesar de que no tiene relacin estructural con las Igs.

considerado que comparten propiedades de c

lulas B y T .
Los equinodermos y protocordados poseen
clulas similares a linfocitos que participan en

las reacciones de rechazo de aloinjertos y de

citotoxicidad natural. En los protocordados es
tas clulas responden a la estim ulacin con
PHA.

Fig. 14-2. La respuesta de fase aguda es el sistem a de defensa m s antiguo y frecuente en el reino animal. C onsiste en una
com pleja red de reconocim iento y m ecanism os efectores que no tiene el elevado nivel de especificidad de la respuesta in
m une m ediada por inm unoglobulinas. Las leetinas participan en ia respuesta de fase aguda com o m ediadoras directas o in
directas de m ecanism os inm unes a travs de funciones de opsonizacin, aglutinacin, activacin de com plem ento y reco
nocim iento celular. (A) esquem a que representa el reconocim iento de agentes extraos m ediante leetinas asociadas a
m em branas por parte de clulas fagocticas. (B) reconocim iento m ediante opsonizacin por leetinas sricas. Existen co n si
derables evidencias experim entales que sugieren la exposicin por parte de lectinas-opsoninas de sitios glucosdicos crpti
cos de reconocim iento luego de un cam bio conform acional originado en la unin al agente. Estos sitios tienen afinidad por
m olculas de reconocim iento asociadas a la m em brana de los fagocitos con capacidad de unin a carbohidratos. D e esta
form a se produce una transicin del estado m olcula propia al estado m olcula no p ropia .

Evolucin del sistema inmune

271

Lectinas asociadas

Microorganismo patgeno

Lectina srica opsonizante

Microorganismo opsonizado
y exposicin de residuos
crpticos

272

Aspectos bsicos de la inmunidad

E L SISTEMA INMUNE
DE LO S VERTEBRADOS
Los vertebrados form an parte del phylum
Chordata junto con los urocordados o tunica
dos y los cefalocordados. En todas las clases se
observa la presencia de los elementos funda
mentales del sistema (fig. 14-1). Tienen capaci
dad para producir anticuerpos contra una gran
variedad de antgenos, rechazan injertos aloge
neicos y responden a una segundo injerto en
forma especfica y ms rpida. La especificidad
y memoria est asociada a la presencia de lin
focitos en todos los vertebrados estudiados. En
la mayora de las clases se ha demostrado la
presencia de un complejo mayor de histocom
patibilidad (CMH).
Anticuerpos e inm unoglobulinas
Los anticuerpos producidos por todos los
vertebrados poseen carga polidispersa, eviden
ciado por mltiples bandas en el espectrotipo
de isolelectronfoque (lEF), y estn compuestos
por cadenas polipeptdicas similares en su peso
molecular a las cadenas pesadas y livianas de
los mamferos. Los estudios de gentica mole
cular con vertebrados placodermos son an in
completos pero permiten afirmar que las inmu
noglobuhnas estn codificadas por segmentos
de genes V, J y C y que los mecanismos de re
com binacin a nivel de estos genes son una
parte esencial de la generacin de diversidad.
Los segmentos de genes que codifican las re
giones J son los ms conservados. Se considera
que esto refleja el hecho de que todos los m e
canism os de recom binacin dependen de la
presencia del segm ento J para ensam blar el
conjunto completo de genes de Igs a ser trans
cripto.
Los segmentos correspondientes a las zonas
invariantes (framework) interpuestas entre las
zonas de hipervariabilidad de las regiones V
son altamente conservadas en la evolucin de
los vertebrados, tanto cuando se las compara
con las Igs clsicas como con el receptor de c
lula T.
Los segmentos que codifican para la regin
C de las cadenas livianas de los vertebrados in
feriores son homlogos de los correspondientes
en mamferos. No obstante, el grado de conser
vacin de la estructura de la regin C en la filo
genia es menor en apariencia al de la regin V.
Es posible reproducir rboles filogenticos en
base a las regiones C pero no en base a regio
nes V. Esta generalizacin surge de numerosos
estudios filogenticos realizados con regiones
V de cadenas livianas y pesadas y algunos me
nos con regiones C. Por ejemplo, la compara
cin de las secuencias de regiones C de los ti

burones, ratones, aves y ei ser humano permite

construir un rbol evolutivo que reproduce el
conocimiento actual de las relaciones filogenticas entre estas clases.
Los elementos de reconocimiento de los an
ticuerpos han sido conservados a lo largo de la
evolucin de los vertebrados. Las regiones C
muestran el tipo de cambio evolutivo caracte
rstico de otras protenas especificadas por ge
nes de copia individual (transcripcin directa
sin previa recombinacin).
La naturaleza multignica de las regiones V
y la necesidad de recombinacin con los seg
mentos J ha establecido presiones selectivas
que condicionaron la preservacin de la estruc
tura de las zonas invariantes (framework) e hipervariables (fig. 14-4).
Los datos acerca del origen de los segmentos
V y J son consistentes con la hiptesis de que
un evento de duplicacin masiva de genes tuvo
lugar luego de la divergencia entre los proto
cordados y los vertebrados ancestrales, pero
antes de la divergencia entre placodermos y ostracodermos. Este evento dio lugar a la adquisi
cin de un sistema de reconocimiento basado
en mltiples genes V, J y C, necesario para la
generacin de diversidad en los anticuerpos y
el receptor de clula T (fig. 14-1).
Se ha identificado en la hemolinfa del tuni
cado Boltenia ovpera una protena de 26 kD
que serolgicamente exhibe reaccin cruzada
con la cadena pesada de tiburn y con la regin
J. Sin embargo la molcula no posee carga po
lidispersa. La ausencia de diversidad en el es
pectrotipo de lEE sugiere la ausencia de meca
nismos de recombinacin en el ensamblado de
la molcula. Dado que los tunicados son ances
tros prximos de los vertebrados, los estudios
con estos animales tienen el propsito de cono
cer el estado y la organizacin primitiva de los
elementos que dieron origen al sistema inmune
clsico.
El complejo mayor de histocompatibilidad
(CMH)
El CMH es una regin compleja con muchos
genes segregados en forma ligada, cuyo origen
evolutivo es difcil de conocer. Se han aislado
una gran cantidad de genes de clase I y clase II
en anfibios, reptiles, aves, peces seos y carti
laginosos, pero en muy pocos casos se estable
ci la correspondencia con las molculas fun
cionales del CMH de la especie de la cual fue
ron aislados. La observacin de molculas de
clase I y clase II en los peces cartilaginosos,
hace suponer que el surgimiento de los genes
del CMH es un evento antiguo, que tuvo lugar
a nivel de los invertebrados superiores. Actual
m ente se investiga la posibilidad de que las

Evolucin de! sistema inmune

molculas primitivas hayan sobrevivido en algiin grupo invertebrado en base a tcnicas de
biologa molecular.
En los vertebrados ms primitivos (ciclstomos) slo se han obtenido evidencias funciona
les de la existencia de un CMH: respuesta pro
life ra tiv a en el c u ltiv o m ix to lin fo c ita rio
(CML) aunque con ndices poco significativos
y rechazo crnico de aloinjertos. Los peces car
tilaginosos exhiben rechazo crnico de aloin
jertos aunque no se ha observado respuesta de
proliferacin en cultivos mixtos leucocitarios a
pesar de la presencia de timo.
En los peces seos, se ha observado el recha
zo agudo de aloinjertos, el cual es notablemen
te afectado por la temperatura. En el control de
!a respuesta estn involucrados varios loci. En
algunas especies de esta clase se observ tam
bin respuesta proliferativa en el cultivo mixto
de linfocitos (CML). El ADN genmico de ge
nes de clase I y clase II aislados por PCR
muestra similitud con los genes de mamferos.
Xenopus, un gnero de anfibios pertenecien
te al orden anura, posee un locus denominado
XLA (CMH propio de Xenopus) definido p ri
meramente como una entidad gentica. En tr
minos funcionales en Xenopus se observa re
chazo agudo de aloinjertos, respuesta citotxi
ca de clulas T ligada al CMH, y colaboracin
B-T restringida por CMH (la respuesta requiere
al menos un alelo compartido). El polimorfis
mo de las molculas del CMH de Xenopus es
alto y tambin se ha observado desequilibrio de
ligamiento. La cadena pesada de las molculas
de clase I tiene 44 kD, en tanto que las molcu
las de clase II se componen de dos cadenas de
30 a 35 kD. Existe homologa con la secuencia
de las cadenas a de mamferos.
Entre los anfibios pertenecientes al orden
Urodela los eventos que funcionalmente indi
can la presencia de un CMH (rechazo agudo de
aloinjertos, proliferacin en CML y reaccin de
injerto contra husped) han mostrado niveles
de respuesta inferiores. Sin embargo la re s
puesta observada es suprimida por timectoma
previa. En Ambistoma mexicanum (axolote) se
han identificado molculas de clase II estructu
ralmente similares a las de los mamferos.
Todos los reptiles muestran respuestas fun
cionales com patibles con la presencia de un
CMH; rechazo agudo de aloinjertos, prolifera
cin en CML y reaccin de injerto contra hus
ped. Existe una alta correlacin entre el recha
zo agudo de aloinjertos y la produccin de lin
focitos T citotxicos. Por inmunoprecipitacin
con anticuerpos que muestran reacciones cru
zadas se ha aislado lo que se considera proba
bles molculas de clase I, clase II y j32-microglobuhna en caimanes, tortugas, y ofidios. La
obtencin de numerosos ADNc de clase I en

273

algunas especies sugiere la presencia de m lti

ples loci y polimorfismo. Sin embargo an no
se ha establecido ninguna correspondencia con
la expresin de protenas.
En aves y mamferos se han identificado y
secuenciado molculas con actividad funcional.
En las aves las molculas de clase I consisten
de una cadena pesada de 43 kD unida en form a
no covalente a una P2-m icroglobulina de 12
kD. Las molculas de clase II consisten de ca
denas a y P de 30 kD y se expresan slo en c
lulas B y monocitos. Los exones que codifican
los dominios p i, P2 y de transmembrana tienen
un 62 a 66% de homologa con la secuencia p
de HLA-DQ. En los pollos existen por lo m e
nos tres genes p distintos. La caracterstica ms
prominente del CMH de las aves es el tam ao
reducido, resultado de la presencia de intrones
cortos y un nmero relativamente bajo de ge
nes de clase I y clase II.
Las comparaciones dei CM H de aves y m a
mferos demuestran similitud en la ubicacin
de los residuos polimrficos, conservacin de
los residuos invaiiantes que se unen a p p ti
dos, conservacin de los residuos de contacto
dentro y entre dom inios, y conservacin del
dominio intracitoplasmtico responsable de la
unin a quinasas. El nivel de h o m ologa es
muy diferente en cada uno de los dominios ex
tracelulares. Este hecho sugiere la existencia
de diferentes proceso de seleccin durante la
evolucin. Los dominios a-2 y a-3 evolucio
naron ms lentam ente que los dom inios a-1
dado que habran estado sometidos a mayores
restricciones: interaccin entre s y con la P-2
microglobulina.
En todas las clases de vertebrados el CM H
de clase I y clase II es muy polimrfico. Se ha
sugerido que el polimorfismo surgi como res
puesta a la necesidad de reconocim iento de
agentes patgenos, aunque hay muy pocos ca
sos en los que un alelo de MHC se asocia con
resistencia a la infeccin y, en cambio, hay m u
chos casos en los que se asocia a la susceptibi
lidad a una determinada enfermedad. Algunos
autores sostienen que el nivel de polimorfismo
sera dependiente del nmero de alelos disponi
bles en el momento de la especiacin y de la
longevidad de la especie. Para otros en cambio,
la presin selectiva que condiciona la aparicin
de polimorfismo en el CMH radica en funcio
nes no relacionadas con la resistencia a la in
feccin, tales como la seleccin durante el apa
reamiento sexual. Por ejemplo, los ratones son
capaces de distin gu ir com paeros g e n tic a
mente idnticos excepto en el conjunto d e ge
nes del CMH en base a su alta sensibilidad ol
fatoria. Existe una correspondencia e n tre el
olor de un ratn y sus genes del CMH. Los ani
males con el mismo olor se rechazan durante la

274

Aspectos bsicos de la inmunidad

Leucocitos granulares

Parsito

F ig. 14-3. Los leucocitos de invertebrados son capaces de inm ovilizar parsitos, tales com o cestodes, trem atodes, nem atodes, hongos y protozoarios, que son dem asiado grandes para ser fagocitados, encerrndolos con varias capas d e clulas.
Esta form a de respuesta ha sido observada en tunicados, equinoderm os, crustceos, sipunclidos, anlidos, celenterados y
espongiarios. En los insectos el contacto entre el parsito y leucocitos granulares induce la degranulacin y form acin de
un cogulo localizado. D e este evento se originan seales quim iotcticas que reclutan un segundo tipo celular hialino o
am eboide con actividad fagoctica (plasm atocitos). Estas clulas se agregan en capas, sufren un proceso de adelgazam iento
y form an una cubierta m ulticelular que encierra una m asa de m aterial necrotizado y parsitos secuestrados. M ecanism os
sim ilares han sido descritos en m oluscos, particularm ente en especies que actan com o vectores de parsitos que afectan al
hom bre. L a form acin de ndulos puede ser iniciada por la presencia de lipolisacridos bacterianos, glucanos p-1,3 o zymosan.

seleccin de apareamiento sexual, evitando la

endocra, garantizando la herencia de dos ha
plotipos distintos e incrementando el polimor
fismo. Se ha demostrado que es suficiente la al
teracin de un nico gen del CMH para modifi
car el olor del ratn. Es decir que CMH provee
una serie de estigmas sociales que permiten la
distincin de lo propio y lo no propio adems
de participar de los eventos de reconocimiento
clula-clula. En este sentido el CMH del ratn
cumple un rol similar a su correspondiente de
los primitivos invertebrados coloniales, deter
minando si dos colonias se fusionan en un caso
o si dos ratones se aparean en el otro. En las
aves se han obtenido ejemplos similares de co
rrespondencia entre genes de CMH y seleccin

durante el apareamiento en base a los colores

del plumaje.
Linfocitos y rganos linfoides
Los linfocitos han sido descritos en todas las
clases de vertebrados y se aprecia una gran si
militud a lo largo de toda la lnea evolutiva,
desde las lam preas hasta los mamferos. Los
rganos linfoides muestran una com plejidad
creciente a lo largo de la misma lnea evoluti
va. En las especies ms primitivas slo se ob
serva tejido hnfoide asociado al tracto intesti
nal (TLAI). Los linfocitos, derivados de la capa
mesodrmica, colonizan tejido de origen endodrmico. Muchos de los rganos linfoides que

Evolucin del sistema inmune

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Fig. 14-4. L a estructura de los anticuerpos en los distintos vertebrados es similar, pero la organizacin de los g en e s de ca
denas pesadas y livianas as com o la regulacin de la produccin de anticuerpos es diferente en las diversas clases. A. Co
mo ejem plo se m uestra la secuencia de am inocidos de cadenas livianas X del tiburn H eterodontus fra n ch e sc h ii en la
parte superior y del hom bre en la parte inferior. L a hom ologa entre am bas secuencias en la regin V es m ayor q u e 50%.
B. Los tiburones tienen ocim encias m ltiples de segm entos V nJnC n de cadenas livianas X separados entre s al m en o s por
20 kb. L a secuencia de cada uno de estos segm entos es distinta. E n la lnea germ inal, las regiones V y J estn separadas
por 0.4 kb y contienen los heptm eros y nonm eros necesarios para la recom binacin (a). En cam bio, en algunos caso s las
regiones V y J aparecen unidas por lo que no existira recom binacin p ara generar diversidad (b). Es decir que la diversi
dad en los tiburones depende de la ocurrencia m ltiple de .segmentos VJC, En (c) y (cl) se m uestra la organizacin de ge
nes de cadena liviana X de ratn y hum ana respectivam ente. Se ha postulado que la organizacin prim itiva de g en e s de Igs
hallada en los peces cartilaginosos habra dado origen a la que se observa en telesteos, anfibios, y m am feros p o r selec
cin de segm entos V JC y am plificacin por duplicacin m asiva en tndem de las regiones V. La organizacin d e genes en
las aves en las que existe una sola regin V y m ltiples seudogenes y en donde la diversidad se obtiene por co n v ersi n g
nica sera una deform acin de la lnea evolutiva telesteos-anfibios-m am feros.

se observan en las etapas posteriores de la evo

lucin, como el timo, bazo y las placas de Pe
yer constituyen especializaciones del TLAI que
se observa en las especies primitivas (cuadro
14-1).

Los linfocitos de los vertebrados primitivos

(ciclstomos) no han adquirido especializacin
y muestran simultneamente caractersticas de
clulas T y B (proliferacin en CML, capaci
dad de produccin de anticuerpos, participa-

276

Aspectos bsicos de la inmunidad

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Evolucin del sistema Inmune

cin de clulas B en las reacciones de rechazo).
No se ha demostrado la presencia de timo ni
bazo, y los principales sitios de linfopoyesis
son el TLAI que muestra acmulos linfoides a
nivel de la submucosa intestinal, y el rin en
algunas especies.
Los peces cartilaginosos (elasmobranquios)
son los primeros vertebrados en los que se de
muestra la presencia de timo. Sin embargo la
separacin funcional no es todava completa y
es posible observar clulas plasmticas en el ti
mo luego de la estim ulacin antignica. El
TLAI es muy prominente y el bazo se destaca
como rgano linfohemopoytico.
Los peces seos muestran una arquitectura y
distribucin de los rganos linfoides similar. El
bazo tiene una mayor participacin y se distin
guen estructuras similares a centros germinati
vos durante el curso de la respuesta inmune.
Las clulas de tim o responden nicam ente a
mitgenos T, las clulas provenientes del tejido
linfoide renal responden slo a LPS y las clu
las de bazo a ambos. Las respuestas a antgenos
T dependientes requieren de la presencia de c
lulas T, B y macrfagos. Las respuestas a ant
genos T independientes requieren de clulas B
y macrfagos.
Los anfibios presentan un timo con actividad
linfopoytica de estructura similar a la de otros
vertebrados. En el bazo se diferencian las reas
de pulpa blanca y pulpa roja. En Urodela, una
subclase de anfibios, se observan reas T de
pendientes pero no existen verdaderos centros
germinativos. El TLAI es prominente y se ob
servan reas con actividad linfopoytica en ri
n, mesenterio, hgado y branquias. En la sub
clase Anura se ha identificado la presencia de
clulas T colaboradoras diferenciadas de las c
lulas T citotxicas.
En los reptiles y aves el timo muestra una
clara separacin entre corteza y mdula, en tan
to que el bazo tiene bien definidas las regiones
correspondientes a pulpa blanca y pulpa roja,
pero slo en las aves se observan verdaderos
centros germinativos y se definen con claridad
las zona T y B dependientes. La presencia de
centros germinativos podra explicar las dife
rencias en la respuesta de anticuerpos entre
vertebrados de sangre fra y sangre caliente, a
pesar de que muestran una organizacin de ge
nes y mecanismos de generacin de diversidad
similares. Los centros germinativos estn invo

277

lucrados en la seleccin de mutantes y su au

sencia sera responsable de una ineficiente m a
duracin de afinidad en el caso de los reptiles y
dems vertebrados de sangre fra.
Citoquinas
Las citoquinas son molculas muy conserva
das a lo largo de la evolucin. El sistema inm u
ne de los vertebrados tiene una dependencia
crtica sobre estas molculas. De hecho, no se
han descrito casos de individuos con deficien
cias genticas en la produccin de ninguna ci
toquina. Se han identificado principalm ente
aquellas derivadas de monocitos y macrfagos.
La IL-I ha sido aislada o se ha detectado su ac
tividad en varias especies de anfibios y peces.
En el ltimo caso tambin se identific activi
dad de interfern gamm a (lEN-y) asociada a
pptidos de 32 kD y lOkD que mostraron capa
cidad de activacin de macrfagos y otras ca
ractersticas del IFN-y de mamferos. La IL-2
es detectable en los sobrenadantes de C M L y
clulas estimuladas con PHA de varios v erte
brados inferiores. Ha sido extensamente estu
diada la IL-2 de Xenopus. En los reptiles la
produccin de IL-2 tendra importantes varia
ciones estacionales. En todos los casos la IL-2
es especfica de especie.
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Respuesta inmune humoral

RICARDO MARGNI

Un vertebrado -q u e posee en su estructura

un nmero relativamente grande de molculas
que responden a las caractersticas de los ant
genos- se encuentra, a su vez, inmerso en un
universo de antgenos provenientes del medio
que lo rodea (bacterias, virus, pai'sitos, tejidos,
etc.). Si bien al comienzo su sistema inmune no
tiene capacidad para diferenciar lo suyo de lo
no propio, a medida que se desarrolla apren
de a hacerlo, poniendo en marcha mecanismos
de tolerancia que aseguren la proteccin de lo
propio y de reactividad positiva para los agen
tes extraos, de modo de evitar el dao que s
tos pudieran causarle. Los mecanismos que in
tervienen en estos procesos, como ya se vio en
el captulo 2, son los de la inmunidad humoral,
mediada por anticuerpos, y de la inm unidad
llamada celular , mediada por linfocitos. Es
tos mecanismos no son independientes, estn
interrelacionados.
Las clulas indiferenciadas m ultipotentes
{stem cells), que durante el perodo embriona
rio colonizan inicialmente el hgado y luego la
mdula sea, se diferencian en clulas capaces
de poner en marcha una respuesta inmune hu
m oral cuando encuentran el m icroam biente
adecuado. Ello ocurre en la bursa de Fabricius
en las aves; el principal equivalente en el hom
bre son las placas de Peyer. En este proceso in
terviene la interleuquina 3 (IL-3) y luego GMCSF (factor estimulante de colonias de granu
locitos y monocitos), IL-4, IL-6 e IL-7, que ha
ce que un prolinfocito m adure en linfocito.
Cuando un precursor de linfocito B madura en
linfocito B, que expresa receptor para antgeno
(inmunoglobulina de superficie), pierde sus re
ceptores para IL-3.
En el adulto, las clulas indiferenciadas, co
lonizadas en la m dula sea, constituyen la

15
fuente de produccin de linfocitos y las que re
constituyen durante la vida a los animales ago
tados en clulas linfoides.
Cuando las clulas indiferenciadas encuen
tran en el sistema bursa o bursa smihs el mi
croambiente necesario para adquirir competen
cia inmunolgica se transforman en linfocitos
B, que se caracterizan por poseer insertadas en
sus membranas molculas de inmunoglobulinas
(Ig-sup). Estas molculas constituyen los recep
tores especficos para los epitopes antignieos.
Un 20% de estas clulas se encuentra en sangre
perifrica, 27% en el bazo, 23% en la zona foli
cular de los ganghos linfticos, 18% en el con
ducto torcico, 6% en la mdula sea, 6% en
las amgdalas. Tras estimulacin antignica, los
linfocitos B se diferencian en clulas plasmti
cas que sintetizan y excretan anticuerpos, cons
tituidos por molculas de inmunoglobulinas con
una estructura idntica a la Ig-sup (receptor an
tignico) expresado por el linfocito B del que
provienen (vase cap. 2). La figura 15-1 mues
tra la evolucin de la clula indiferenciada multipotente-clula plasmtica, producto final de la
diferenciacin de un linfocito B.
La mayor parte de los antgenos, al ser ino
culados, inducen la formacin de anticuerpos,
pero es idntico el tipo de respuesta inmune
en el caso de la inoculacin de una primera do
sis de antgeno, sin inm unidad de base (res
puesta prim aria), y en las reestim ulaciones
(respuesta secundaria)? Indudablem ente, no.
Los hechos experimentales nos demuestran que
cuando un antgeno penetra por primera vez en
el receptor, la concentracin de anticuerpos au
menta en forma progresiva, hasta un nivel de
terminado, para descender luego ms o menos
rpidamente segn los casos. En la figura 15-2
puede verse la curva de inmunizacin de un co

Respuesta inmune humoral

279

Receptor
lL-3

LB activado

Piasmocito IgE

Fig. 15-1. Esquem atizacin de la respuesta inm une hum oral. P rocesos celulares que llevan en definitiva a la secreci n de
inm unoglobulinas.

nejo inoculado con Proteus vulgaris, repre.sentativa de este tipo de respuesta. La inoculacin
de antgenos en solucin produce una cantidad
de anticuerpos detectables en un lapso mayor
que en el caso anterior.
Cuando el anim al recibe varios estm ulos
reiterados, la respuesta difiere totalmente de la
descrita. Las caractersticas de sta han sido
muy bien estudiadas. La figura 15-3 correspon
de a la inmunizacin de un cobayo con toxoide
diftrico altamente purificado y obtenido por
cultivo de Corynebacterum diphtheriae en me
dio sinttico. El animal recibi el antgeno por
va subcutnea. Como puede verse, la tasa de
anticuerpos en los primeros 20 das es baja, y
aumenta con la repeticin de los estmulos. Ca
da reestimulacin causa elevacin de anticuer
pos hasta alcanzar un lmite, pasado el cual no
hay ms aum ento, y se puede llegar, por la
aplicacin de nuevos estm ulos y a m ayores
concentraciones, a la inhibicin de la produc
cin de anticuerpos, fenmeno conocido con el
nombre de parlisis inmunolgica, que luego
se ver. Si la investigacin del ttulo de anti
cuerpos se efecta a intervalos ms cortos se
podr observar que la curva presenta, al prime
ro y segundo das siguientes a la inoculacin
del reestm ulo, una pequea inflexin como
consecuencia del descenso de los anticuerpos
circulantes al reaccionar con la nueva dosis de
antgeno inoculado (fig. 15-4).

La mayor produccin de anticuerpos se debe

a que en una respuesta secundaria participan
los linfocitos con m em oria inm unolgica,
originados en una respuesta prim aria (vase
cap. 2), que tienen capacidad para reconocer el
antgeno especfico y montar de inmediato una
respuesta inmune. Estos hnfocitos con m em o
ria son de larga vida y son los que hacen que
reestimulaciones a distancia induzcan respues
tas inmunes evidenciables a plazos ms cortos
y de mayor magnitud.

200

150

100

F ig . 15-2. Respuesta in m u n e a u na nica in o c u laci n de

un antgeno paiticulado (Proteus vulgaris).

280

Aspectos bsicos de a inmunidad

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1 00

110

12 0

130 140

1 50

Das
Fig. 15-3. R espuesta inm une al estm ulo prim ario y secundario, en un anim al inoculado con un antgeno soluble (toxoide
diftrico).

Cuando se inyectan al hombre polisacridos

neumoccicos, despus de la inoculacin y de
una fase inicial de baja produccin de anticuer
pos, esta produccin aum enta y se m antiene
elevada por meses, incluso hasta aos. La rees
timulacin produce poco aumento de anticuer
pos y con este tipo de antgenos no se consigue
la respuesta anterior. Es probable que ello en
parte est relacionado con la composicin qu
mica de estos antgenos, los que por el hecho
de no ser de carcter proteico no son rpida
m ente d eg rad ad o s, p u d ie n d o a c tu a r com o
agentes estimulativos por un tiempo ms pro
longado. Adems, no debe olvidarse que estos
antgenos son T-independientes y que la res
puesta inmune inducida por ellos difiere de la
lograda con antgenos proteicos (T-dependientes) (vase cap, 2).
Es necesario destacar que en la respuesta se
cundaria desempea un papel muy importante

el tiempo transcurrido entre el primero y el se

gundo estmulo. Las inoculaciones de toxoide
diftrico en cobayos, al mes, a los dos meses y
a los tres meses de la inoculacin primaria, de
muestran que el ttulo de anticuerpos consegui
do en una y otra difieren totalmente, siendo va
rias veces superior la cantidad de antitoxina
circulante que se consigue en la tercera inocu
lacin respecto de la primera.
Estudios efectuados en el hombre, inmuniza
do con vacuna antidiftrica, evidencian que
puede conseguirse una respuesta secundaria
cinco a seis aos despus de la primera inocu
lacin, aun cuando en el plasma circulante no
hayan sido previamente detectados anticuerpos.
No hay una relacin estable entre la magni
tud de las respuestas primaria y secundaria, ya
que existen animales que responden bien al pri
mer estmulo y otros lo hacen escasamente. In
vestigaciones efectuadas en cobayos inyecta-

1/160
"

1/80

.3

1/40

1/20

O
co)

1/10
20

22

24

26

28

30

32

34

35

36

40

Das

Fig. 15-4. En las reestim ulaciones se p u ed e obser

var, inm ediatam ente despus de la inyeccin del in
m ungeno, lig era dism in u ci n de los anticuerpos
circulantes com o consecuencia de la com plejacin
de una parte de ellos con el antgeno inyectado.

Respuesta inmune humoral

dos con toxoide diftrico, y sobre todo cuando
la dosis inicial es muy pequea, permiten esta
blecer cierto grado de relaciones. Caballos ino
culados con to x o id e d iftrico p rev iam en te
puesto en contacto con antitoxina dan una res
puesta inmune de hiperinmunizacin ms rpi
da que cuando se inocula el toxoide nicamen
te, pero es de hacer notar que en tal caso el an
tgeno ya no acta por s solo, sino como fijado
a un adyuvante, y de ah que los resultados no
puedan compararse.
El aumento de anticuerpos en las reestimula
ciones y las respuestas secundarias observadas
en individuos primoinoculados mucho tiempo
atrs y en los que no se detectaban anticuerpos,
se deben a memoria inmunolgica. En este
caso, pequeos linfocitos que se generan por
estim ulacin prim aria y son los responsables
de esa memoria, al ser estimulados por el ant
geno especfico, activan el mecanismo que lle
va a la rpida proliferacin de clulas formadoras de anticuerpos.
La sntesis de los anticuerpos dura pocos m i
nutos y, por diferentes mtodos, se ha demos
trado que el nmero de clulas formadoras de
anticuerpos presentes en la pulpa esplniea de
ratones en el primer da de estimulacin es re
ducido, apenas alcanza a unas decenas, para
llegar a varios miles al cuarto y quinto da. En
las reestimulaciones, el incremento de clulas
formadoras de anticuerpos se hace muy eviden
te desde el comienzo.
PRODUCCIN DE A N T IC U E R P O S
Sntesis, catabolismo y distribucin
de las inmunoglobulinas
Si bien en los animales y el hombre adulto la
produccin de gammaglobulina est asegurada,
diferentes investigadores, empleando mtodos
analticos muy sensibles, han comprobado que
ella est muy restringida en los animales recin
nacidos. Esto tiene importancia, ya que hasta
no hace mucho tiem po se sostena que estos
animales no sintetizaban gammaglobulina.
La gammaglobulina materna que lleva el re
cin nacido es eliminada totalmente a las tres o
cuatro semanas de vida; de ah que la inmuni
dad pasiva congnita tenga esta duracin. La
relativa incapacidad del recin nacido para for
mar gammaglobulina queda evidenciada por el
hecho de que los caracteres genticos de su
gammaglobulina al nacer son similares a los de
la madre, pudiendo cambiar despus, lo que se
debe, como se indic anteriormente, a que en
este ltimo caso predom ina y se estabiliza la
gam m aglobulina propia. Hay quienes sostie
nen, sobre la base de estudios efectuados con

281

animales criados en condiciones de esterilidad,

que la iniciacin de la biosntesis de la gammaglobulina depende de estimulaciones antigni
cas, ya que en ellos la concentracin de gam
maglobulina circulante es muy baja en relacin
con animales no estriles.
L a inm unoglobulina desnaturalizada y los
complejos inmunes son catabolizados rpida
mente por las clulas del reticuloendotelio; el
hgado, por intermedio de sus clulas parenquim*ales, cataboliza alrededor de un 30%.
L a concentracin de IgG en los tejid o s es
aproximadamente igual a la circulante, m ien
tras que de la IgM slo pequeas cantidades es
tn distribuidas extravascularm ente. L a IgG
elaborada por el hombre adulto es de unos 2 g
por da, nivel que aumenta durante las inm uni
zaciones, como resultado de la replicacin de
las clulas formadoras de anticuerpos. L a infor
macin sobre las otras inmunoglobulinas puede
verse en el captulo 5, cuadro 5-11.
Biosntesis de las inmunoglobulinas
Un linfocito B produce W a 10^ molculas
de inmunoglobulina por clula, las que son uti
lizadas en su totalidad como receptores antig
nicos en a superficie celular. Una clula plas
m tica, en cambio, produce y secreta aproxi
m adam ente 2.000 molculas por segundo de
anticuerpo de especificidad definida correspon
diente a una clase o subclase de inmunoglobu
lina.
D esd e el p u nto de vista m o lecu lar se ha
comprobado, a partir de extractos de clulas esplnicas y de ndulos linfticos de animales in
munizados, que la biosntesis de las cadenas L
y H de IgG tiene lugar en los polisem as. Por
ultracentrifugacin en gradiente de sacarosa se
han separado dos picos, co rrespondientes a
conglomerados de 15 a 20 (270-290 S) y 7 a 10
(190 S) ribosomas, respectivamente. Se ha de
m ostrado que los primeros son formadores de
cadenas H, y los segundos de L. La sntesis de
las cadenas L dura 30-40 segundos, y la de las
H, 60-90. Las cadenas L y H son sintetizadas
como precursores que contienen un pptido hi
drofbico adicional de 19 residuos, llam ada se
cuencia lder, la que sirve para guiar las cade
nas al lumen del retculo endoplasmtico rugo
so (RER) donde luego es clivado.
El ensamblado y formacin del puente disul
furo entre las cadenas L y H y la glucosilacin
de las molculas de inmunoglobulinas tiene lu
gar durante el pasaje de la cisterna del RER al
Golgi y luego en las vesculas secretorias que
se fusionan con la membrana plasmtica. El or
den del ensamblado de las cadenas L y H no es
el mismo segn que se trate de la sntesis de
IgM o IgG, En el primer caso una cadena L y

282

Aspectos bsicos de la inmunidad

una cadena H se unen para formar una hemimolcula (HL), unindose luego dos hemimo
lculas para form ar una m olcula com pleta
(H2L2). En el caso de la IgG se unen dos ca
denas H (H2) las que, primero, unen una cade
na L para formar el intermediario H2L y, final
mente, la otra cadena L para formar la molcu
la completa H2L2. Si la molcula form_ada tie
ne la secuencia transm em brnica hidrofbica
de la inmunoglobuhna de membrana, se fija a
la membrana de la vescula secretoria y es in
sertada en la membrana plasmtica cuando la
vescula se fusiona con sta. Si la secuencia de
la cadena H de la inmunoglobulina sintetizada
contiene la estructura de la inm unoglobulina
que se secreta, es transportada libremente den
tro de la vescula secretoria y liberada de la c
lula cuando la vescula se fusiona con la mem
brana plasmtica.
Formados los puentes disulfuro entre las ca
denas L y H y durante el transporte del retculo
endoplsmico al Golgi, las molculas se glucosilan.
Los cinco aziicares que se encuentran en la
glucoprotena srica (N-acetil D-glucosamina,
D-manosa, D-galactosa, cido N-acetil neuramnico y L-fucosa), generalm ente estn p re
sentes en ms de una unidad, con un PM glo
bal de 2,5 kD.
La glucosamina y maosa se fijaran a las
cadenas H de las molculas de inmunoglobuli
nas unidas a las membranas asociadas a los ri
bosomas, y los restantes aziicares cuando se
encuentran ligadas a otras membranas intrace
lulares y especialmente durante el pasaje por el
aparato de Golgi, donde se forma la vescula
secretora (fig. 15-5).
Si bien durante el pasaje de la inmunoglobu
lina a travs de los elementos membranosos de
la clula hay incorporacin de carbohidratos,
no es ello prueba suficiente de la importancia
de la glucosilacin en la secrecin, ya que hay
clulas plasmticas que secretan cadenas L, las
que carecen de hidratos de carbono.
Una molcula de inmunoglobulina pasa 2/3
de su vida intracelular dentro del retculo endo
plsmico rugoso y 1/3 en el aparato de Golgi.
Aproxim adamente 30-90 minutos despus de
su sntesis las molculas son excretadas de las
clulas.
Las cadenas L que estn en exceso y no se
unen a cadenas H para formar molculas de in
munoglobulina, dado su bajo peso molecular,
son excretadas por la orina como microglobulinas. En el caso de mielomas, esas cadenas L en
exceso que filtran por rin y aparecen en la
orina constituyen la protena de Bence-Jones.
Cabe sealar que no todas las cadenas L en ex
ceso son elim inadas por este m ecanism o, ya
que en gran parte son metabolizadas por algn

mecanismo regulatorio desconocido. Se ha ob

servado tambin en ciertas patologas la apari
cin en sangre y orina de cadenas H carentes
de cadenas L. Se caracterizan por deleciones en
la zona del fragmento Fd. En esta enfermedad,
llamada de las cadenas pesadas, se han aislado
cadenas y, |J, y a con las deleciones indicadas.
En los ltimos aos se ha descrito una pro
tena, designada protena de unin de las ca
denas H o BiP (heavy chain binding protein),
una chaperona que sera responsable de la re
gulacin del transporte de las molculas H^L^
(Ig) resultantes del ensamblado de cadenas L y
H. El mecanismo propuesto para ello sera el
que se describe a continuacin. Las cadenas H
sintetizadas por los ribosomas son translocadas
al lumen del retculo endoplasmtico donde de
inmediato se unen a BiP, la cual interfiere con
la seal de expresin del transporte en las cade
nas H. Si no se sintetizan cadenas L, BiP queda
unida a la cadena H, que es degradada interna
mente. Si hubo produccin de cadenas L, cuan
do stas se acoplan a las cadenas H la protena
BiP se disocia rpidamente, la seal de trans
porte se expresa y se inicia la migracin de la
inm unoglobulina (H jLj) hacia el Golgi. Este
mecanismo tratara de explicar por qu no hay
acumulacin de cadenas H en el citoplasma de
las clulas que las sintetizan.
La prdida espontnea de expresin de cade
nas H es de 1 X 10^ por clula por generacin,
y con respecto a cadenas L, de 4,5 x 10 por c
lula por generacin, lo que explica la existencia
de mielomas que no secretan inmunoglobulinas
pero s cadenas L, hallazgo bastante frecuente
cuando se analizan protenas monoclonales.
La IgM e IgA que normalmente se encuen
tran en el suero como polmeros, en el citoplas
ma slo estn como monmeros; la polimeriza
cin ocurre durante la secrecin.
Las clulas B en reposo no expresan recepto
res para IL-2, interleuquina que parece tener un
rol muy importante en la induccin de la secre
cin de IgM pentamrica. No obstante, IL-4 in
duce en estas clulas la expresin de la subuni
dad (3 de 75 kD del receptor de IL-2, y la IL-5
induce la expresin de la cadena a de 55 kD de
dicho receptor. Como consecuencia de ello el
receptor de alta afinidad formado por la asocia
cin de ambas cadenas se expresa y la clula B
puede interaccionar con IL-2. La interaccin de
esta interleuquina con el receptor de alta afini
dad induce la expresin de cadenas I, la que es
indispensable para la secrecin de IgM penta
mrica.
En el captulo 6 se describe el ordenamiento
y distribucin de los genes que codifican para
la sntesis de las cadenas L y H, tanto en el ge
noma de las clulas indiferenciadas como en el
de los linfocitos B.

Respuesta inmune humoral

283

Ribosomas

Fig. 15-5. Representacin esquem tica de ia sntesis y secrecin de las inm unoglobulinas sricas. P rL y PrH, p recu rso res
de cadenas L y H, respectivam ente.

Factores que inciden en la formacin

de los anticuerpos
A)

R e l a t iv o s

a l e s t m u l o a n t ig n ic o

Dosis
Para conseguir una respuesta inmune es in
dispensable la inoculacin de un antgeno, pero
el grado de respuesta depende en gran parte de
la dosis inoculada. En trabajos efectuados con
Salm onella paratyphi B se comprob que la
cantidad de anticuerpos producidos dependa
del nmero de bacilos inyectados. Cuando ste
era de 10^ bacilos por kilo de peso (en el cone
jo), el ttulo de anticuerpos dosados por agluti
nacin era inferior a la dilucin 1;4; en cambio
el ttulo era 1;330 cuando los bacilos inocula
dos fueron 1 0 \ 1:1.860 para 10' y 1:3.540 para
10*^. Los ttulos consignados son los mximos
obtenidos en cada uno de los lotes de los ani
males de la experiencia.
Por inoculacin de voluntarios con polisacrido neumoccico del tipo II se encontr que con
dos dosis de 0,05 mg de antgeno se obtenan
despus de tres semanas 1,37 mg.mL de prote
na anticuerpo. Lo dicho no significa que al au
mentar las concentraciones de antgeno inocula

do habr de aumentar siempre el ttulo de los an

ticuerpos; se ha observado que la inmunizacin
de ratones blancos con polisacridos del neum o
coco tipo I es posible cuando se inoculan canti
dades comprendidas entre 1 y 0,01 (tg, en tanto
que dosis de 100 fxg a 1.000 |Ltg son ineficaces.
Dosis excesivas de antgeno pueden llevar a la
parlisis inmunolgica o ausencia de respuestas
del aparato formador de anticuerpos. P o r otra
paite, la reinoculacin de pequeas dosis de an
tgeno desencadenar una estimulacin selectiva
de los clones de mayor afinidad.
Aadido de adyuvantes
La respuesta inmune no es la misma segn
se inocule antgeno solo o adicionado de adyu
vantes (fig. 15-6). Los ms comunes y su ma
nera de comportarse han sido ya descritos en el
captulo 4, pero es conveniente recordar que su
accin no se debe nicam ente a la adsorcin
del antgeno, lo que hace que el mismo se libe
re de a poco produciendo un efecto sim ilar al
de las reestim ulaciones, sino que interviene
tambin, y eon un papel muy importante, qui
zs el principa], el granuloma formado en el
punto de inoculacin y las linfoquinas sinteti
zadas por las clulas intervinientes.

284

Aspectos bsicos de la inmunidad

F ig . 15-6. D istin ta resp u esta
in m u n o l g ica p ara u n a tnica
d o sis d e un m ism o an tg en o
inoculado solo y con adyuvan
te de Freund com pleto.

e-

Semanas
'D N P - BSA en solucin salina
'D N P - BSA en solucin salina - adyuvante de Freund completo

C uando un antgeno se inocula m ezclado

con un adyuvante, se consigue una respuesta
superior a la que se logra con la misma dosis
de antgeno solo. Se observa la aparicin de an
ticuerpos a alta concentracin y por tiem po
prolongado, similar a la lograda cuando se ha
cen reestimulaciones antignicas, con la venta
ja de que este efecto se logra con la inoculacin
de una sola dosis de antgeno. El empleo de los
adyuvantes es lo que ha permitido mejorar lti
mamente las distintas vacunas utihzadas en la
inmunizacin humana y animal y corregir fa
vorablemente los planes y mtodos de inmuni
zacin para la preparacin de los distintos anti
sueros empleados en los laboratorios con fines
de experimentacin y de los plasmas antitxi
cos obtenidos de grandes anim ales para ser
transformados luego en antitoxinas de uso tera
putico.
Concurrencia de antgenos
Un hecho que es necesario tener en cuenta
cuando se inmunizan animales es el nmero de
antgenos diferentes que se inyectan sim ult
neamente.
En el hombre, con mucha frecuencia se em
plean las vacunas combinadas, como la diftrico-tetnica, y tambin con estos toxoides aso
ciados a su vez con la Bordetella pertussis o
Salmonella typhi e incluso al virus polio.
En conejos se ha observado que la inocula
cin intravenosa simultnea de mezclas de has
ta 35 antgenos proteicos purificados, constitui
dos por hemoglobina y albminas de distinto
origen, provocaba la formacin de anticuerpos
-detectables por precipitacin- contra la mayo
ra de ellos.
Esto pudo lograrse por un balance adecuado
de la concentracin de los antgenos mezclados

en cada caso ya que, si no se procede as, pue

de haber preponderancia de uno sobre los otros
y no aparecer en los animales inoculados anti
cuerpos para todos los antgenos inyectados. Se
ha comprobado que la inoculacin simultnea
de toxoide diftrico con otros antgenos hace
que el ttulo de anticuerpos para la toxina sea
menor que el logrado cuando ese antgeno es
inoculado solo. Esto ocurre cuando uno de los
antgenos est presente en exceso.
Si se inocula un animal con toxoide tetnico
mezclado con un segundo antgeno y el animal
tiene cierta inmunidad de base para este ltimo,
ios anticuerpos formados para la toxina son es
casos, en tanto que la concentracin es alta pa
ra el otro. Probablemente se deba a que el se
gundo antgeno provoca una respuesta de tipo
reestim ulativo, lo que hara que el animal se
ocupe principalmente de la sntesis de este anti
cuerpo. Respuestas similares se observaron al
inocular conejos con protenas obtenidas de la
clara de huevo. En este caso existen cuatro
componentes antignieos predominantes que se
encuentran en la proporcin aproxim ada del
92% y otros secundarios en un 8%. El 50% de
los anticuerpos formados era para los compo
nentes principales y el 50% restante para los
secundarios, lo que nos est indicando que no
existe una relacin entre las cantidades de ant
geno inoculadas y el ttulo de anticuerpos pro
ducidos.
Al inyectar conejos con grandes cantidades
de plasma humano se encontr que, si bien no
producan anticuerpos para la albmina y glo
bulina, desarrollaban enferm edad del suero,
probablemente a causa de los componentes antignicos secundarios que se encuentran en el
plasma en menor proporcin.
De lo expuesto se deduce que, cuando haya
que inmunizar a animales con varios antgenos

Respuesta inmune humoral

285

a la vez, o cuando deba elaborarse una vacuna

polivalente, habr de tenerse en cuenta lo dicho
para lograr, mediante una dosificacin adecua
da de los distintos antgenos, una respuesta in
m unitaria correcta para todos. Como ello no
siempre es factible, es recomendable, sobre to
do en la inm unizacin hum ana, no em plear
mezclas de m uchos antgenos a la vez si se
quiere lograr el fin preventivo deseado.
Tipo de antgeno inoculado
La gam m aglobulina inm une que se form a
como consecuencia de la penetracin de un an
tgeno no siempre es de un mismo tipo, y ello
depende en gran parte del antgeno inoculado.
El caballo, cuando es inyectado con polisacri
do neum occico da anticuerpos de alto peso
molecular del tipo IgM en tanto que, cuando se
le inocula toxoide diftrico, albmina de huevo
y otros tipos de antgenos, elabora anticuerpos
que responden a las caractersticas de las IgG.
El hombre, por regla general, forma anticuer
pos de este ltimo tipo, pero cuando es inocula
do con los antgenos somticos de Salmonella
typhi, los anticuerpos que elabora responden a
las caractersticas de la IgM, de peso molecular
alrededor de un milln.
Los antgenos Rh originan por isosensibilizacin anticuerpos de tipo IgM al comienzo de
la respuesta inmune, pero stos son de tipo IgG
en las sensibilizaciones a repeticin. Las isohemoaglutininas naturales del sistema ABO son
inm unoglobulina IgM. A lgunos autores han
descrito anticuerpos contra los antgenos de los
grupos sanguneos ubicados en la IgA.
Lo dicho significa que el tipo de anticuerpo
formado, si bien puede estar influido por algu
nas circunstancias particu lares, depende en
gran parte del tipo de antgeno que acta como
inductor. Como ya se ha visto, segn su com
posicin qumica, pueden inducir una respuesta
sobre los linfocitos B, independientemente de
ios T, originando anticuerpos de tipo IgM (li
popolisacridos, polisidos), o necesitar del
efecto cooperativo T
B para lograr una res
puesta eficiente, con anticuerpos de tipo IgG
(antgenos proteicos). (Vase cap. 2.)
Es conveniente recordar tambin que el mo
mento en que cursa la inmunizacin puede in
fluir en las caractersticas fisicoqumicas del
anticuerpo producido. En el hombre y algunos
animales de experimentacin se ha comproba
do que en la fase inicial de la inmunizacin ela
boran anticuerpos IgM, produciendo posterior
mente anticuerpos IgG, si el antgeno inductor
es T-dependiente, Existen numerosos hechos
experimentales que parecen probar que la IgG
pondra en marcha un mecanismo inhibidor de
la biosntesis de IgM y que su efecto sera ma-

S em a n as
F ig. 15-7. Sntesis de inm unoglobulina durante la v id a in
trauterina y en los prim ero s meses despus del n acim iento
(hom bre).

yor a medida que aumenta su concentracin en

el plasma. Esta inhibicin es especfica, o sea,
para clases de anticuerpos con especificidad
para un mismo antgeno, y puede aun conse
guirse con digestos ppsicos del anticuerpo
IgG (fig. 15-7).
Se considera que la expresin del fragmento
constante de las cadenas |i (Cjx) es in depen
diente del tipo de antgeno y que el mecanismo
de desviacin hacia la sntesis de los fragmen
tos constantes de las otras inmunoglobulinas es
dependiente del antgeno y de determinadas in
terleuquinas (vase cap. 2). Con respecto a qu
clase de inmunoglobulina expresa las siguien
tes inducciones, las rutas posibles seran dos, la
secuencial C |i ^ C8 > Cy ^ Ce > C a o la
par-alela

Si bien la prim era pareciera que es la ms

probable, existen datos experimentales que de
notan la sntesis de IgE o IgA con posterioridad
a la sntesis de IgM. Ello estara indicando que
para determinadas inmunoglobulinas, en espe
cial IgE, la meta no sera la secuencial. En el
captulo 6 se encuentran expuestos cules son
los mecanismos responsables de estos hechos.
El cambio de clase de inm unoglobuhna puede
resultar de la unin del exn reordenado que
codifica para el fragmento variable de la cade
na H con el exn que codifica para.el fragmen
to constante de otra cadena H distinta de (y,
e, a), con delecin del ADN comprendido en
tre los dos exones recombinados. Pero tambin
pueden producirse cambios de clases de inmu
noglobulinas como consecuencia de transcrip
tos alternativos a nivel de ARN precursor, sin
que ello signifique delecin de ADN genmi-

286

Aspectos bsicos de la inmunidad

co. La induccin de respuesta con produccin

de anticuerpos gM no necesita de la coopera
cin T -T B y pueden darla todos los antgenos.
La formacin de anticuerpos de tipo IgG es ti
modependiente y la ponen en marcha los ant
genos proteicos, portadores o no de haptenos,
no as los polisidos o lipopolisacridos que en
las condiciones normales de estimulacin slo
forman anticuerpos IgM. Estos antgenos origi
nan anticuerpos por estimulacin directa de los
linfocitos B, no necesitando para ello la coope
racin de los LT.
B)

R e la t iv o s a l h u sp ed

Edad
La capacidad para formar anticuerpos es una
propiedad inherente al vertebrado adulto. En el
lactante est muy disminuida (fig. 15-8). En el
recin nacido se puede llegar a anular la res
puesta futura si las dosis de antgeno inocula
das son lo suficientemente grandes.
La infeccin de huevos embrionados con di
ferentes virus se ve facilitada por la incapaci
dad del embrin para formar anticuerpos. Al no
oponerse un mecanismo especfico de defensa
la proliferacin de los virus no encuentra resis
tencia. Hechos similares se han observado en
animales recin nacidos y de diferentes das de
vida.
Todos estos antecedentes son los que hacen
que la vacunacin profilctica en los nios con
diferentes tipos de antgenos, slo se haga des
pus de los 3-4 meses de vida, ya que antes de
esa edad el aparato inmunolgico no est bien
desarrollado.
Una serie de observaciones parece indicar
que en la vejez la capacidad normal de form a
cin de anticuerpos sufre una depresin, aun
que no tan marcada como en la lactancia.

Radiaciones ionizantes
La accin que los rayos X pueden tener sobre
la respuesta inmune difiere segn la irradiacin
haya sido efectuada antes o despus del estmu
lo antignico. En este ltimo caso las modifica
ciones a la respuesta no son significativas, en
tanto que se observa una marcada depresin si
la irradiacin es previa a la inoculacin del ant
geno. En la inmunizacin de conejos con hema
tes de carnero como antgeno, se comprob
que cuando los animales eran irradiados con
500 r la respuesta inmunitaria no difera de los
controles no irradiados, si el antgeno inmuni
zante era inoculado despus de las dos horas de
la irradiacin. En cambio, se observ una mar
cada depresin en la produccin de anticuerpos
cuando el animal era sometido a irradiacin 24
horas antes de la estimulacin. Estas experien
cias muestran que las clulas productoras de an
ticuerpos en actividad son relativamente radiorresistentes y, adems, nos permite comprender
por qu es posible conseguir la implantacin de
heteroinjertos en animales previamente irradia
dos, cosa que no se logra en los normales. Las
sustancias radiomimticas, como la mostaza ni
trogenada y sus anlogos, inhiben tambin la
produccin de anticuerpos.
Va de inoculacin
Si se inocula al caballo con toxoide diftrico,
para conseguir un buena respuesta inmune es
necesario que la misma sea hecha por va sub
cutnea, y no por va intravenosa. En cambio,
si lo que se desea obtener son anticuerpos anti
neumoccicos, los microorganismos deben ino
cularse por va intravenosa, siendo desfavora
bles los resultados si se emplea la va subcut
nea. Si el animal inoculado es el conejo y la va
de inmunizacin es la intravenosa, la inocula

F ig . 1 5 -8 . R e p re se n ta c i n
grfica seriada del ttu lo de
anticuerpos anti-D N P ub ica
dos en la IgM e IgG. M ues
tras provenientes de un cone
jo in m u n izad o con gam m ag lo b u lin a hum ana d in itro fe
nolada. Puede apreciarse una
rpida form acin de aqullos
en la IgM , la que dism inuye
rpidam ente a m edida que se
increm entan los ubicados en
la Ig G (m ecan isin o v s de
feed-back).

Respuesta inmune humoral

cin de neumococos produce anticuerpos antipolisacridos, en tanto que el mismo microor
ganismo, inoculado por va subcutnea, induce
la formacin de anticuerpos preferentem ente
antinucleoprotenas, pudiendo desarrollar al
mismo tiempo alergia de tipo retardado.
Cuando antgenos polnicos penetran en el
hombre por la mucosa y lo hacen en forma es
pontnea, originan anticuerpos, localizados en
la IgE, y si los mismos plenes son inyectados
por va subcutnea, forman anticuerpos, ubica
dos en la IgG.
Otros factores
Si bien la inanicin produce una dism inu
cin de las protenas plasmticas, en especial
de la albmina, en individuos que se encuen
tran en esta condicin no se observa una dismi
nucin en la produccin de anticuerpos, salvo
en casos muy particulares en que la inanicin
haya sido prolongada. Estudios realizados en
prisioneros de guerra mostraron que las defi
ciencias nutricias no interferan manifiestamen
te en la produccin de anticuerpos. A lgunas
h o rm o n as, y en esp ecia l la c o rtiso n a y la
ACTH, pueden influir en la respuesta inmunitaria. Conejos inoculados con un determinado
antgeno no forman anticuerpos si previamente
son tratados con cortisona y ACTH, principal
mente la primera. Su accin es muy marcada
cuando su introduccin precede a la inmuniza
cin o al comienzo de sta, en tanto que su in
fluencia es poco manifiesta cuando ya el ani
mal ha comenzado a elaborar anticuerpos y s
tos alcanzar ttulos elevados en ia sangre circu
lante. La cortisona es una sustancia que influye
desfavorablemente sobre la fagocitosis y depri
me la inflamacin, lo que hace que su accin
est relacionada con la inhibicin de la etapa
inicial de la formacin de anticuerpos.
Parlisis y tolerancia inmunolgica
La irradiacin con rayos X, la adm inistra
cin de algunas drogas como la 6-mercaptopurina, que interfiere la sntesis del ARN, o de la
cortisona, que al deprimir la respuesta inflam a
toria disminuye la actividad fagocitaria, etc.,
pueden inespecficamente inhibir la formacin
de anticuerpos. La inhibicin en estos casos no
es para un antgeno determ inado sino para
cualquiera.
Estos hechos se diferencian fundam ental
mente de otros de carcter especfico en los
que la inhibicin para la formacin de anticuer
pos es propia y particular para el antgeno en
estudio. Felton demostr que la inoculacin en
el ratn adulto de grandes cantidades de polisa
cridos neumoccicos, muchas veces superio

287

res a las necesarias para lograr la formacin de

anticuerpos, inhibe la produccin de stos. Los
ratones son incapaces de form ar anticuerpos
contra dicho poiisacrido por largo tiempo, pe
ro permanece intacta su capacidad para elabo
rar cualquier otro tipo de anticuerpo.
R espuestas similares se han conseguido en
conejos con la introduccin de grandes cantida
des, y a repeticin, de protenas heterlogas. En
este caso, como en los anteriores, la respuesta
es especfica para el antgeno interviniente. Este
fenmeno, inicialmente llamado parlisis inm u
nolgica, se produce en animales adultos y se
consigue con la inoculacin de altas dosis de
antgeno. Conviene aclarar que un animal puede
incluso quedar paralizado inmunolgicamente
con dosis de antgeno que en otros animales po
dran actuar como estimulantes; ello se observa
cuando por algn mecanismo o tratamiento es
pecial se consigue disminuir apreciablemente el
nmero de clulas inmunolgicamente com pe
tentes. En estos casos, con menores cantidades
de antgeno se logra el mismo efecto, ya que las
clulas inmunolgicamente activas se encuen
tran grandemente reducidas.
Un fenmeno similar al anterior, regulador
de la respuesta inmune, es la tolerancia inm u
nolgica (cap. 18). Se caracteriza por la falta o
depresin de la respuesta especfica a un est
mulo antignico por animales previamente ex
puestos al antgeno. Desde el punto de vista
operativo, constituira el fenmeno opuesto a
una respuesta inm une secundaria, que cursa
con un incremento de ella ante nuevos estm u
los antignieos. Numerosas observaciones y re
sultados experimentales muestran que ia tole
rancia es un hecho general en los distintos ver
tebrados, y que puede ser inducido por clulas
vivas o sustancias antignicas inertes com o las
protenas. Hay una serie de hechos que es con
veniente recordar, ya que son significativos en
el desarrollo de este fenmeno. Cuando los an
tgenos que se utilizan y los del husped no son
muy diferenciados, por ejemplo, clulas de ga
llina inoculadas al pavo, clulas de distintas ra
zas de una misma especie, la inoculacin de
protenas plasmticas del hombre al ratn, co
nejo, cobayo, etc., estos fenmenos de inmunotolerancia son muy manifiestos, siendo m s di
fciles de lograr cuando existen marcadas dife-.
rencias. Un ejemplo de ello es la tolerancia par
cial de la rata a la hemocianina, que es una pro
tena de un crustceo, con caractersticas fisico
qumicas bastante diferenciadas de las prote
nas de ese animal.
Esta tolerancia es especfica, ya que la desa
rrollada para un antgeno no lo es para los de
ms, y un animal con tolerancia para la albmi
na bovina puede elaborar sin inconveniente anti
cuerpos para cualquier otro antgeno inoculado.

288

Aspectos bsicos de la inmunidad

Factores que promueven la induccin

de tolerancia
Estado de los rganos linfoides centrales
y perifricos
Segn la teora de la seleccin clonal, si los
rganos linfoides son estimulados prem atura
mente, antes de un estado crtico durante la em
briognesis, se produce la inactivacin o elimi
nacin de las clulas sensitivas al antgeno. Lo
dicho no es totalmente cierto pues est demos
trado que el feto puede producir anticuerpos y
que es posible inducir tolerancia en adultos.
Si bien es posible inducir tolerancia ms f
cilmente en animales con su tejido linfoide da
ado o inmaduro, la falta de respuesta cuando
se inoculan simultneamente ratones con ant
geno y ciclofosfamida - la que depleta princi
palmente a los linfocitos B -, o antgeno y suero
antilinfocito, no indica claramente si ello se de
be a una interrupcin en la produccin de anti
cuerpos que llevaran rpidamente a la toleran
cia, o si es consecuencia de un cambio activo
en las clulas sensitivas al antgeno. Lo que s
est bien probado es que la tolerancia puede in
ducirse ms fcilmente en el embrin o neona
to que en el adulto. Estos distintos tipos de to
lerancia se discuten en el captulo 18.
Propiedades del antgeno
a) Tamao molecular. El estado de agrega
cin de un antgeno puede influir en su com
portamiento como inmungeno o tolergeno.
Las soluciones de albmina o IgG a las que por
centrifugacin se les elimina la protena agre
gada son tolerognicas, mientras que los pro
ductos sin centrifugar inducen buena respuesta
inmune.
La flagelina es una protena que ha sido utili
zada para estos tipos de estudios. Puede encon
trarse bajo la forma de monmero (PM 40 kD)
o polm ero (PM 10.000 kD ). E sta ltim a es
marcadamente inm unognica, en tanto que el
monmero es antignico en bajas dosis y tole
rognico en concentraciones altas. A partir de la
flagelina monomrica, por tratamiento con bro
muro de ciangeno, se ha obtenido un fragmen
to de PM 18 kD que es tolerognico a todas las
dosis ensayadas. Siendo la flagelina una mol
cula constituida por subunidades a repeticin,
esas experiencias demuestran que el efecto est
relacionado con el tamao molecular y no con
cambios en la especificidad del antgeno.
b) Caractersticas del antgeno. Algunas for
mas qumicas de determinadas molculas o pe
queos cambios introducidos en las mismas ha
cen que funcionen mejor como tolergenos que
como inmungenos.

Los polm eros de D -am inocidos general

mente son potentes tolergenos, a diferencia de
lo que ocurre con los de L-aminocidos. La fla
gelina monomrica acetilada pierde capacidad
antignica y se convierte en tolergeno.
c)
Dosis de antgeno. Hay una dosis crtica
para inducir tolerancia o inmunidad. Para algu
nas protenas hay dos zonas donde pueden in
ducir tolerancia, una de baja concentracin y
otra de alta concentracin, funcionando a con
centraciones intermedias como inductores de la
produccin de anticuerpos. La albmina bovina
induce tolerancia a las concentraciones 10 * M
(zona de baja concentracin de antgeno) y 10^^
M (zona de alta concentracin de antgeno). A
la concentracin 10 M induce respuesta inmu
ne, y las clulas as informadas dan respuesta
secundaria aun con dosis de antgeno del orden
1 0 * '0 M .

Shellam y Nossal, trabajando con flagelina

polimriea, han demostrado que es posible in
ducir tolerancia con concentraciones de antge
no 0,1 pg/g peso animal/da (zona de baja con
centracin) y 20 ng/g peso animal/da (zona de
alta concentracin). Con concentraciones inter
medias se logra respuesta inmune (fig. 15-9).
Tolerancia a nivel celular
Teniendo en cuenta que en la respuesta in
mune participan linfocitos T y B, resulta intere
sante saber si la tolerancia creada en cada una
de ellas induce o no tolerancia a todo nivel en
el animal, y por cunto tiempo esas clulas son
tolerognicas. Las experiencias de W eigle son
bien demostrativas en ese sentido. Este autor
estudi la tolerancia en clulas T y B, a varios
intervalos, despus de la induccin de toleran
cia en ratones inoculados con gammaglobulina
humana (GGH). Transfiri a ratones irradiados
clulas tolerantes de timo y clulas normales de
mdula sea, o clulas normales de timo y c
lulas tolerantes de mdula sea. La respuesta
de esas mezclas de clulas a GGH y a un ant
geno no relacionado como la gammaglobulina
de pavo (GGP), fue analizada inoculando para
ello a los animales con dosis inmunognicas de
ambas protenas. Se pudo demostrar tolerancia
para las clulas T a los dos das, la que persis
ti por 150 das. Para las clulas B la tolerancia
tuvo lugar a la semana y se mantuvo por 50
das. No obstante ser esta tolerancia de diferen
te duracin, la falta de respuesta en uno de am
bos tipos de clulas lleva a la tolerancia operacional en todo el organismo (cuadro 15-1).
Hoy se sabe que la tolerancia inducida por
alta dosis de antgeno afecta a las elulas T y
B, en tanto que la de baja dosis de antgeno so
lamente afecta a las clulas T cooperadoras. A
favor de ello est el hecho de que los antgenos

Respuesta inmune humoral

Fig. 15-9. Zonas de tolerancia (segn Shellam y N ossal).

T-independientes no inducen dos zonas de tole

rancia. Otro hecho destacable es que las clulas
T maduras son ms susceptibles a la tolerancia
que las clulas B maduras. Generalmente, el fe
nmeno se consigue con dosis de antgeno 100
a 1.000 veces inferiores que las requeridas para
las clulas B. Los precursores de linfocitos B
presentan un susceptibilidad a la tolerancia si
milar a la de los linfocitos T cooperadores.
Por qu una clula linfoide es inducible o tolerognica es algo no aclarado.
En los linfocitos B portadores de inmunoglo
bulinas de superficie aparece en primera instan
cia IgM e IgD, ambas con el mismo idiotipo
(receptor del antgeno). La funcin de la IgD
sera evitar la tolerancia en los primeros esta
dios de la diferenciacin de los LB. En los lin
focitos B ya program ados para la sntesis de

Cuadro 15-1
Clulas usadas
para reconstituir
Tim o
Norma!
GGH tolerante
Normal
GGH tolerante

M dula sea
N orm al
N orm al
G G H tolerante
G G H tolerante

Anticuerpos con
especificidad p a ra
GGH

GGP

+
+
+
+

289

IgM, IgG, IgA, etc., existe en sus comienzos

IgD de superficie, que luego se pierde. Ello
ocurrira porque esta inm unoglobulina y a no
cumple ninguna funcin, pues esos linfocitos B
son clulas que se han transformado en respon
dedoras, capaces de diferenciarse en clulas
plasmticas sintetizadoras de la correspondien
te inmunoglobulina (fig. 15-1).
Los mecanismos capaces de inducir toleran
cia pueden ser distintos, pero casi todos ellos
apuntan a alterar el funcionamiento norm al de
los linfocitos B y T cooperadores. Cabe men
cionar otros, entre ellos la hiperfuncionalidad
de clulas T funcionalmente supresoras, dele
cin o bloqueo de clones celulares, bloqueo de
los receptores antignicos, inhibicin de la di
ferenciacin celular terminal, la participacin
de anticuerpos antiidiotipos, etctera.
La tolerancia inmunolgica resulta, pues, de
la participacin de distintos mecanismos, que
tienen lugar tanto para inmungenos inertes co
mo para clulas vivas. Algunos de esos meca
nism os pareciera que son norm ales, los que
participaran en el mantenimiento de la toleran
cia a lo propio o no induccin de respuesta
inmune por parte de los componentes antigni
cos del individuo.
Respuesta inmune en las disglobulinernias
En los recin nacidos, la estimulacin anti
gnica no produce respuesta inmune. En el ni
o hay respuesta inmunolgica slo despus de
las cuatro semanas de vida y en momentos en
que sus niveles de gammaglobulina circulante
propia coinienzan a incrementarse. Al nacer, la
casi totalidad de la gammaglobulina presente
es de origen materno y en ella se encuentran lo
calizados los anticuerpos transmitidos pasiva
mente, que son los que les confieren cierta re
sistencia a las infecciones en los perodos ini
ciales de la vida.
En los casos de las hipogammaglobulinemias
congnitas o adquiridas, el estado inmunitario
del nio es deficiente para algunos tipos de in
fecciones, sobre todo las bacterianas y las fn
gicas, en tanto que es satisfactorio para las in
fecciones vricas. No obstante, pueden desarollar alergia retardada similar a la de los normoglobulinmicos, capaces de originar pruebas cu
tneas positivas para los agentes sensibilizantes,
e incluso, rechazar homoinjertos. Esta sensibili
dad adquirida puede ser transmitida pasivamen
te por transferencia de leucocitos del enfermo,
pero los resultados son negativos cuando se tra
ta de inmunizar pasivamente por la inoculacin
de sueros de estos pacientes. Ello se debe a que
en estos casos est afectado el aparato inmunolgico de la inmunidad humoral, no as el que
regula la mediada por clulas.

290

Aspectos bsicos de la inmunidad

Al comienzo de la dcada del 60 se realiza

ron los primeros estudios estructurales sobre
inmunoglobulinas y anticuerpos. En esos m o
mentos surgi e l interrogante de si en los casos
de hipergam m aglobulinem ias m onoclonales,
como lo eran ios mielomas por IgG e IgA del
hombre y el ratn, las inmunizaciones con ant
genos definidos podran significar un in cre
mento de anticuerpos producidos, localizados
en la inmunoglobulina monoclonal. Pudo de
mostrarse que la actividad anticuerpo no invo
lucraba a esta inm unogloblina. Los estudios
realizados demostraron que, por el contrario,
algunos de los portadores de mielomas son ma
los productores de anticuerpos y pueden sufrir
infecciones de distintos tipos que logran mejo
rar, muchas veces, al igual que en los casos de
hipogammaglobulinemias, con transfusiones de
gammaglobulina de personas normales.
Estas observaciones son com prensibles en
estos momentos, pues se sabe que los mielomas son la consecuencia de la transformacin
mahgna de un clon de clulas plasmticas sintetizador de un determinado tipo de inmunoglobulina -q u e ha adquirido la propiedad de
proliferar sin tasa-, sin que ello signifique que
la inmunoglobulina elaborada por este clon ce

lular tenga actividad especfica para un inmu

ngeno dado o sea diferente a la normal. La
protena elaborada est constituida por un con
junto de molculas iguales, sintetizadas por un
nico clon de plasmocitos derivado de uno de
los millones de linfocitos B que componen el
sistem a inm une de un individuo (vase fig.
15-10 y cap. 5, fig. 5-6) . En algunos casos par
ticulares se ha demostrado que esas protenas
monoclonales reconocen a determinados ant
genos. En otros ello no ha podido demostrarse,
probablemente por no haber tenido la posibili
dad de poder confrontarlas con el antgeno cu
yo epitope esa inm unoglobuhna reconoce, ya
que es sabido que el paratope de cada una de
las molculas de inmunoglobulina tiene posibi
lidad de interactuar con un antgeno dado.
Si bien en algunos casos, como en la artritis
reumatoidea y en las inmunizaciones contra an
tgenos hemticos o antgeno O de S. typhi, li
geros aumentos de la fraccin IgM estn liga
dos a aumentos del ttulo de anticuerpos, en el
caso particular de la m acroglobulinem ia de
W aldenstrom con un gran incremento de IgM
monoclonal, no se ha podido demostrar que s
te pueda estar relacionado con aumentos de la
actividad anticuerpo. Incluso la inm unizacin

F ig . 1 5 -1 0 . E l e e t r o f o r e s i s e
in m u n o e le c tro fo re s is e n a c e ta
to d e c e lu lo s a d e u n s u e ro c o
r re s p o n d ie n te a un m ie io m a
Ig G . A , e le e t r o f o r e s i s . B , in
m u n o e le c tr o fo r e s is u s a n d o
su e ro d e c a b ra a n tih u m a n o c o
m o r e a c tiv o p re c ip ita n te . Parte
su p er io r: s u e r o n o r m a l c o n
tro l; p arte in ferio r, s u e r o d e
m ie lo m a . C , el m is m o e s q u e
m a a n te r io r , u t il iz a n d o s u e ro
d e c o n e jo a n ti-Ig G m o n o e s p e c fic o p a ra la in m u n o p re c ip ita
c i n .

Respuesta inmune humoral

especfica en estos tipos de pacientes no ha
permitido evidenciar )a aparicin de anticuer
pos en dicha fraccin globulnica.

VIDA MEDIA DE LOS ANTICUERPOS

De los datos experimentales de que se dispo
ne se desprende que la vida media de los anti
cuerpos es similar a la de la gammaglobulina
de la m ism a especie animal, con variaciones
relacionadas con la especie y su actividad me
tablica. Se ha comprobado que la vida media
de la gammaglobulina es de aproximadamente
25 das para los nios de 6 a 8 aos y de 21
das para el adulto. La antitoxina diftrica,
transmitida pasivamente al recin nacido, tiene
una vida media de aproximadamente un mes, al
igual que los anticuerpos anti-Rh presentes en
el recin nacido por pasaje placentario. Cuando
anticuerpos transferidos provienen de una espe
cie homloga, su desaparicin se produce con
la misma rapidez que las globuhnas normales,
en tanto que, si es de una especie heterloga, si
bien al principio la desaparicin sigue el m is
mo ritmo, posteriormente aumenta.
Si se hace una segunda inoculacin de estos
anticuerpos heterlogos 15 das despus de la
primera inoculacin, su desaparicin se acelera
como consecuencia de los anticuerpos que el
animal ha originado contra la protena portado
ra de la actividad anticuerpo y que en primera
instancia ha actuado como antgeno.
La vida media de los anticuerpos puede estu
diarse tanto en la inmunizacin pasiva como en
la activa. En el primer caso puede hacerse m i

10

15

-m g de anticuerpo
-c.p,m.

20

25

291

diendo la desaparicin del torrente sanguneo

del anticuerpo homlogo o heterlogo inocula
do, en tanto que en el segundo se hace p o r la
introduccin de una marca interna, como es la
incorporacin de un tomo radiactivo en el an
ticuerpo que se forma en un animal que es in
munizado activamente.
Si se inm uniza un conejo con neumococos
tipo III y despus se le inoculan por va intra
venosa anticuerpos contra neumococos tipo I,
al alim entar al animal as preparado con N
glicina, se observa que el '-N aparece en los an
ticuerpos contra el neumococo tipo III, o sea,
los producidos por inmunizacin activa, pero
no aparece en los anticuerpos antineumoccicos tipo 1 inoclados ya preformados.
Los anticuerpos se sintetizan, desintegran y
resintetizan de la misma manera y con la mis
ma velocidad que las inmunoglobulinas norm a
les. Para demostrarlo se inmunizaron conejos
con neumococos y 10 das despus se los ahment durante tres das seguidos con '^N-glicina. El estudio posterior seriado de estos anim a
les permiti comprobar que el '-N se incorpora
en cantidades iguales a a nueva globulina nor
mal elaborada por el animal y a la nueva globu
lina anticuerpo, que tiene una sobrevida de
aproximadamente 14 a 15 das, sin que por ello
decline la tasa total de anticuerpos, ya que el
anim al sustituye, y en exceso, el anticuerpo
m etabolizado, como consecuencia de la esti
mulacin del aparato formador de anticuerpos
por parte del antgeno inoculado (vase fig.
15-11).
Todas estas experiencias nos indican que la
vida m edia de los anticuerpos, tanto en la in

30

35

40

45
Das

Fig. 15-11. G r fic a c o m p a ra tiv a d e la c u rv a d e p ro d u c c i n d e a n tic u e rp o s (v a lo ra d o s p o r p re c ip ita c i n ) y la v id a m edia

d e los m is m o s (c.p .in . d e lo s p re c ip ia d o s ).

292

Aspectos bsicos de la inmunidad

munidad activa como en la pasiva, es aproxi

madamente la misma, y que en el primer caso
el ttulo de los anticuerpos se mantiene cons
tante o aumenta como consecuencia de la con
tinua elaboracin de ellos, no as en la inmuni
zacin pasiva, en la que el estado inmunitario
finaliza cuando todos los anticuerpos inocula
dos han sido metabolizados.
Cabe sealar que la vida media de los anti
cuerpos depende de la clase de inmunoglobuli
na portadora de dicha actividad. En el hombre
ella es de 2-3 das para la IgE, en tanto que pa
ra la IgA es de 4-5 das, para la IgM de 5 a 6
das, y para la IgG de 21 das (vase cap. 5,
cuadro 5-11).
OBTENCIN DE ANTICUERPOS
IN VITRO
La obtencin de anticuerpos in vitro ha sido
preocupacin perm anente. Si bien existen l
neas celulares de mielomas que producen inmunoglobuhnas para algunas de las cuales ha
podido determinarse su especificidad para li
gandos, la obtencin de anticuerpos por esta
va es muy restringida. Conviene sealar que,
en estos casos, la identificacin de la especifi
cidad de la inmunoglobulina sintetizada por las
clulas ha sido determinada mediante ensayos
de confrontacin entre esas inmunoglobulinas
y gran cantidad de antgenos, tarea tediosa y en
muchos casos ineficaz.
La inmunizacin de animales portadores de
mielomas, o la induccin de mielomas en ani
males preinmunizados, no ha permitido obtener
inmunoglobulinas monoclonales con especifi
cidad para el antgeno usado.
En estos lltimos aos, mediante tcnicas de
hibridizacin, se han conseguido lneas celula
res similares a las provenientes de mielomas,
con la enorme ventaja de que por clonado se
han logrado productos que elaboran inmunoglobulinas correspondientes a una determinada
clase o .subclase y con capacidad para reaccio
nar especficamente con un antgeno preseleccionado. La especificidad de esos anticuerpos
es para un nico determinante antignico, no
obstante la complejidad que pueda tener el an
tgeno total usado.
El mtodo de hibridizacin es bastante sim
ple y consiste en la fusin de clulas tumorales
derivadas de los linfocitos B, provenientes de
un mieloma y adaptadas a crecer in vitro, con
clulas normales de origen B procedentes de un
animal preinmunizado. El producto resultante
(hibridoma) tiene capacidad para multiplicarse
en medios de cultivo apropiados y de sintetizar
una inmunoglobulina con especificidad para el
antgeno utilizado en la inmunizacin.

La lnea celular inicialmente usada fue la X6 3-A g 8 , d e riv a d a p o r c lo n ad o de la ln e a

MOPC-21 proveniente de un mieloma de ratn
(BALB/c) que sintetiza IgG l, y adaptada al cul
tivo in vitro. Actualmente se emplea con gran
ventaja una variante de esa lnea, la NS-0, que
no sintetiza cadenas H ni L, que facilita la se
leccin del clon celular que elabora inmunoglo
bulina de naturaleza similar a la sintetizada por
la parental productora de anticuerpo. No debe
olvidarse que los hbridos provenientes de dos
clulas distintas elaboradoras de inmunoglobu
linas expresan todas las cadenas peptdicas
constitutivas de esas protenas presentes en am
bos parentales pues son tetraploides. Es necesa
rio, por lo tanto, mediante clonados adecuados,
seleccionar aquella lnea que slo sintetiza la
inmunoglobulina de estructura deseada.
Afortunadamente, la seleccin de clones que
elaboran inmunoglobulinas con cadenas H y L
similares a las del parental proveniente del bazo
del animal inmunizado no es difcil de obtener.
A partir de clones que sintetizan formas tetramricas constituidas por cadenas H y L de am
bos parentales, pueden lograrse por subclonado
lneas que expresan las cadenas H de la clula
productora de anticuerpo y las cadenas L de la
clula normal y la tumoral. Subclonados poste
riores permiten seleccionar clulas que slo sin
tetizan inmunoglobulinas cuyas cadenas H y L
no estn relacionadas con la clula tumoral que
inicialmente dio origen al hbrido. El uso de la
variante celular NS-0, que no sintetiza cadenas
H ni L, facilita esta tarea.
Para la obtencin de hibridomas productores
de anticuerpos se mezclan clulas provenientes
del bazo de un ratn preinmunizado con las c
lulas tumorales ya indicadas, a las que se aade
el agente fusionante (inicialmente se us virus
Sendai, en la actualidad se emplea polietilen
glicol 1.000-1.500), mantenindolo en contacto
por dos minutos. Como medio de cultivo gene
ralm ente se usa el de Eagle m odificado por
Dulbecco (DME) o el RPMI. A partir de all se
realiza el clonado para la seleccin del hbrido
deseado.
Con el objeto de facilitar esta operacin, las
clulas tumorales han sido adaptadas para cre
cer en 8-azo guanina, por lo que carecen de la
enzima hipoxantina guanina fosforribosil trans
ferasa, requerida para el crecimiento en medios
de cultivo conteniendo hipoxantina, aminopteri
na y timidina (HAT). Cuando los productos de
hibridizacin sean cultivados en m edios con
HAT, slo podrn multiplicarse las clulas re
sultantes de la fusin de clulas tumorales y c
lulas normales del bazo, pues poseen en su ge
noma la informacin para la sntesis de la men
cionada enzima aportada por las clulas del ani
mal inmunizado. Las clulas normales del bazo

Respuesta inmune humoral

no proliferarn por carecer de la propiedad de
multiplicarse in vitro, y las clulas tumorales no
hibridizadas tampoco por ser enzima-deficientes y el medio de cultivo contener HAT.
Los hbridos que se cultivaron en las condi
ciones sealadas deben ser clonados y seleccio
nados en cuanto a su especificidad como anti
cuerpo y clase de inmunoglobulina; esto puede
realizarse por el mtodo de las clulas formadoras de placas de hemlisis, empleando la tc
nica directa o indirecta segn la clase de inm u
noglobulina que se desea investigar.
La seleccin se puede efectuar tambin me
diante el anlisis de los sobrenadantes de los
cultivos de los hbridos.
Los clones seleccionados son cultivados lue
go en frascos para obtener los anticuerpos se
cretados. Con el objeto de asegurar su estabili
dad todos aquellos clones que interesen deben
ser conservados a muy baja temperatura (nitr
geno lquido), que en estas condiciones se
mantienen viables por muy largo tiempo.
Numerosos laboratorios estn dedicados a la
obtencin de hbridos por fusin celular. Se
han aislado clones productores de anticuerpos
monoclonales contra diferentes protenas, poli
sacridos, haptenos, heteroantgenos y haloantgenos contenidos en superficies celulares (in
cluidos los de histocompatibilidad), etc. Tam
bin se han logrado hbridos productores de an
ticuerpos resultantes de la fusin de clulas de
mieloma de ratn y de bazo de ratas inmunes.
Como consecuencia del xito obtenido en la
fusin de clulas de m ielom as (derivadas de
linfocitos B), se han efectuado numerosos in
tentos para lograr hibridomas a partir de clu
las de linfomas (derivadas de linfocitos T). Se
han logrado lneas celulares de hnfomas T en
zima-deficiente que han facilitado la tarea. Ello
ha posibilitado la obtencin de clones de clu
las T que expresan diferentes funciones y que
contienen en su superficie antgenos determina
dos, en especial de la regin I del com plejo
mayor de histocompatibihdad.
A diferencia de lo que ocurre con los hibri
domas derivados de clulas de mielom as, el
clonado resulta muy dificultoso cuando provie
ne de linfocitos T, como consecuencia de las
tcnicas a utilizar en estos casos, sobre todo si
se trata del aislamiento de clulas con funcio
nes efectoras, cooperadoras o secretoras de di
ferentes factores.
No caben dudas de que la obtencin de hi
bridomas por fusin de clulas tumorales con
clulas normales participantes de la respuesta
inmune ha ampliado el horizonte de la inm uno
loga.
En el captulo 36 se trata este tema en detalle
y se describe la metodologa usada con tal fin
en nuestros laboratorios.

293

TIPOS DE ANTICUERPOS
Sabem os que los anticuerpos pueden estar
ubicados en las diferentes inm unoglobulinas, y
al referirnos a sus estructuras hemos visto que
sus m olculas tienen repetido, por lo m enos
dos veces, el sitio de combinacin para el de
terminante antignico. Se los denomina biva
lentes. En la naturaleza no ha podido com pro
barse que estos sitios dentro de la m ism a mo
lcula puedan reaccionar con determ inantes
antignieos diferentes, y solamente en el labo
ratorio, por recombinacin, se han conseguido
hbridos con estas caractersticas. Vimos tam
bin que en determinadas circunstancias, por
degradacin enzimtica o qumica, estos anti
cuerpos se desdoblan transformndose en uni
valentes.
C uando un anim al es inm unizado, form a
siem pre anticuerpos bivalentes, pero pueden
aparecer anticuerpos funcionalm ente univa
lentes o incom pletos , como se observa con
mucha frecuencia en las sensibihzaciones que
experimentan madres Rh negativas por transfe
rencia de eritrocitos del tipo Rh positivo. Estu
dios llevados a cabo con hbridos obtenidos a
partir de anticuerpos anti-Rh y anti-B, han de
m o s tra d o c la ra m e n te que los a n tic u e rp o s
anti-Rh incompletos son bivalentes. En medio
sahno no pueden aglutinar ni precipitar por no
originar com plejos antgeno-anticuerpo sufi
cientem ente grandes. Tienen capacidad para
aglutinar en medio albuminoso.
Los anticuerpos bivalentes y univalentes
obtenidos por inmunizacin con un m ism o an
tgeno, si bien tienen la particularidad de pre
sentar la misma especificidad para el antgeno
inmunizante, se diferencian fundamentalmente
en que slo los bivalentes pueden dar con el
antgeno reacciones de aglutinacin o precipi
tacin visibles, ya que la bivalencia ser 1a que
perm itir formar el conglomerado de com ple
jos iniciales que llevarn a la aglutinacin o
precipitacin, teniendo lugar estas reacciones
en medios salinos.
Los anticuerpos univalentes o incom ple
tos, en cambio, como consecuencia de su ni
ca valencia activa, saturan las molculas de an
tgeno e impiden la formacin de agregados y
por lo tanto la aparicin del fenmeno visible.
Este tipo de anticuerpo puede ponerse en evi
dencia por otros mecanismos, como el ideado
por Coombs. Teniendo en cuenta que el anti
cuerpo univalente al saturar la partcula antig
nica expone sus propios determinantes, si dicho
producto de reaccin es enfrentado con un sue
ro antiglobulina de la misma especie animal, se
producir aglutinacin. En este caso, la gam
maglobulina anticuerpo fijada al antgeno ac
tuar como antgeno particulado multivalente.

294

Aspectos bsicos de la inmunidad

Estos anticuerpos tienen capacidad para atrave

sar la placenta, razn por la cual en las isoinmuizaciones maternofetales su presencia puede
provocar dao al feto.
Cada vez son mayores las pruebas de que en
las distintas enfermedades, sobre todo en las
infecciones crnicas como la brucelosis, salmonelosis, tripanosom iasis americana, gonococia, etc., pueden aparecer estos tipos de anti
cuerpos. Los mismos, con especificidad para
los antgenos paternales, juegan un rol muy
importante en la proteccin al feto en el tero
materno, ya que al bloquear dichos antgenos
los protegen y evitan su destruccin por los di
ferentes m ecanism os b iolgicos p uestos en
marcha en una respuesta inmune. Un enfoque
amplio sobre el tema se efecta en los captu
los 19 y 34.
A esto cabe aadir, como ya se ha indicado,
que los anticuerpos pueden estar ubicados en
inmunoglobuhnas diferentes al comienzo y fi
nal de la inmunizacin, o la actividad anticuer
po ser patrimonio exclusivo de la IgM.
En el suero de pacientes con fiebre de heno,
asma y otros tipos de alergia, conocidas con el
nombre de alergias atpicas, se han identifica
do anticuerpos originariamente llamados rea
ginas. Tienen algunas de las caractersticas de
los anticuerpos bivalentes clsicos, pero se di
ferencian en que no dan reacciones de precipi
tacin en el tubo de ensayo, son en cierto mo
do termolbiles -u n calentamiento a 56C du
rante 60 minutos anula su actividad sensibili
zante-, no atraviesan la barrera placentaria y
tienen la particularidad de permanecer locali
zados por largo tiempo en las zonas de la piel
de los sitios donde han sido transferidos pasi
vamente. Este com portam iento particular se
debe a que pertenecen a la clase IgE, la que se
fija a receptores especficos. En diferentes es
pecies anim ales han sido identificados anti
cuerpos que responden a estas caractersticas.
El del cobayo ha sido inicialmente aislado por
nosotros.
Es im portante recordar tam bin que an ti
cuerpos ubicados en la IgG e IgM tienen la
particularidad de fijarse, por intermedio de sus
Fe, a receptores especficos existentes en los
macrfagos y polimorfonucleares neutrfilos.
Estos anticuerpos, llamados citoflicos, arman
esas clulas para su accin captadora de ant
genos. Las partculas antignicas que reaccio
nan con los sitios de combinacin de anticuer
pos fijados a la superficie celular quedan an
cladas, con lo cual la accin fagoctica se ve
facilitada.
A esto cabe aadir que en toda respuesta in
mune los anticuerpos IgG formados no son ho
mogneos, corresponden a diferentes tipos, he
cho que ser analizado en el captulo 19.

TRANSFERENCIA DE ANTICUERPOS '

DE LA M A DRE AL FETO
El feto se encuentra incapacitado para for
mar anticuerpos contra los agentes antignicos
externos, protegido como est en su enclaustramiento intrauterino materno y, adems, como
ya hemos visto, por su incapacidad para elabo
rar gammaglobulina a niveles suficientes aun
en los primeros estadios de vida.
A pesar de todo ello y del medio infeccioso
en que se encuentra despus del nacimiento, el
recin nacido no se infecta como consecuencia
de cierta resisten cia esp ecfica log rad a por
transferencia m aterna de anticuerpos. Estos
pueden llegar al feto o al recin nacido por va
uterina o por el calostro y la leche, lo cual de
pende de la especie animal, y sobre todo en el
caso del feto, de la estructura constitutiva de la
placenta en cuanto al nmero de capas y grosor
del tejido que se interpone entre la circulacin
fetal y la materna. Por supuesto que el pasaje
de protenas ser dificultoso cuando haya va
rias capas de clulas interpuestas, en tanto que
en aquellos casos en que no existe capa mater
na y slo capas fetales m nim as com o en el
hombre, mono, conejo, cobayo, ratn, etc., esto
ocurre con alguna facilidad. Se ha comprobado
que los cerdos y rumiantes, cuyo nmero de ca
pas entre la circulacin materna y fetal es de 5
y 4 respectivamente, solamente transfieren an
ticuerpos por el calostro, en tanto que el hom
bre y roedores, que poseen una, lo hacen por
va placentaria.
En el hombre, el pasaje de inm unoglobuh
nas de la madre al feto se produce despus del
primer trimestre de la gestacin, y slo pueden
atravesar la placenta la IgG, no as la IgM, IgA
e IgE, entre las que se encuentran isoaglutininas para los antgenos hemticos, que induda
blemente podran resultar perjudiciales para el
feto. Ese pasaje placentario de los anticuerpos
es selectivo,y no est relacionado con su tama
o m olecular, como se supuso inicialm ente.
En la placenta existen receptores para el frag
mento Fe de IgG y es sta la nica inm unoglo
bulina que puede atravesarla siem pre que la
molcula mantenga su integridad. El fragmen
to F(ab)2, carente del fragmento Fe, no la atra
viesa no obstante su menor peso molecular. Si
a una embarazada se le inocula con fines tera
puticos un suero antitxico que contiene anti
cuerpos IgG que han sido sometidos a proce
sos de purificacin por tratamiento con pepsi
na, lo que en realidad recibe son los fragmen
tos F(ab )2 de esos anticuerpos los que, por lo
expuesto anteriormente, no atravesarn la pla
centa y no podrn conferir inm unidad pasiva
congnita, si hubiese sido sa la finalidad de la
inoculacin.

Respuesta inmune humoral

En casos particulares existen otras vas de
transmisin. La gallina puede transferir anticuer
pos a la yema del huevo de donde son absorbi
dos por el embrin a travs del saco vitelino.
En cobayas preadas se observ que, cuando
se las inmunizaba con antitoxinas diftricas ob
tenidas de distintos animales, la antitoxina ho
mloga pasaba de la madre al feto con ms fa
cilidad que las heterlogas. Experiencias reali
zadas en conejas en gestacin llevan a conclu
siones similares.
Un punto no muy claro es la manera en que
esa transmisin de los anticuerpos se produce a
travs del tero, ya que ha sido demostrado en
experiencias efectuadas con antitoxina estafilo
ccica y anticuerpo m-Escherichia coli que el
pasaje de ellos no es igual en el sentido maternofetal y viceversa. En dichas experiencias se
han encontrado diferencias entre la tasa de anti
cuerpos maternos y los dosados en el cordn
umbilical o en el recin nacido, y se ha llegado
a establecer que el ttulo de anticuerpos es su
perior en el feto comparado con el de la madre.
En el calostro de la mujer se ha demostrado
la existencia de anticuerpos, pero siempre con
un ttulo inferior que el de los presentes en ia
sangre, salvo en los casos particulares de infec
ciones mamarias, ya que se podran desarrollar
anticuerpos locales contra el agente infeccioso;
lo interesante es que dichos anticuerpos dism i
nuyen por la succin y son absorbidos por los
lactantes. En terneros se ha observado que los
anticuerpos del calostro son ms absorbibles
que los del suero. Parecera que la glndula
mam aria acondicionara de alguna m anera la
globulina que segrega, generando esta propie
dad. En los ratones se ha observado tambin
que en los casos de infecciones experimentales
con virus herpes, hay un pasaje de anticuerpos
contra este virus de la madre al recin nacido
por transferencia a travs de la leche.
Se ha comprobado que la absorcin de anti
cuerpos transmitidos por la leche y el calostro
en terneros y en ratones se produce por va in
testinal y que dicha absorcin, en cierto modo
selectiva, se mantiene por uno o varios das se
gn la especie animal.
Si bien la transferencia de anticuerpos de la
madre al feto resulta sumamente til en la ma
yor parte de los casos, en algunas oportunidades
puede ser perjudicial, como ocurre en el hom
bre en las isoinmunizaciones por antgenos con
tenidos en los elementos figurados de la sangre.
(Para mayor informacin vase cap. 34.)

295

B IB L IO G R A FIA
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Hipersensibilidad tarda y otras reacciones

de inmunidad mediada por la activacin
de macrfagos

MARTA BRAUN

INTRODUCCIN
La respuesta inmune especfica se desarrolla
por la suma de una serie de fenmenos de inte
raccin celular cuya resultante final es la apari
cin de clulas efectoras que, en algunos casos,
secretan inmunoglobulinas especficas para el
antgeno y, en otros, no producen anticuerpos
especficos sino que actan directa o indirecta
mente sobre el antgeno. En esta divisin sim
plificada, a la primera se la llama inmunidad
humoral y a la segunda inm unidad celular o
mediada por clulas. Es decir que, en la protec
cin de un individuo co n tra la invasin de
agentes patgenos, intervienen no slo los anti
cuerpos secretados sino tambin clulas que los
reconocen especficam ente pero no secretan
sustancias especficas.
Estas ltimas funciones seran, filogentica
mente, ms antiguas que la inmunidad humoral
y provendran de mecanismos primitivos de re
conocimiento interespecie e intraespecie, pero
fueron descritas mucho despus que los anti
cuerpos y las reacciones mediadas por ellos.
Durante un tiempo relativamente largo, la in
munologa estuvo dominada por la serologa y
tanto las clulas que intervienen en la sntesis
de los anticuerpos como las que actan en la
inmunidad mediada por clulas fueron conoci
das mucho despus.
Las primeras nociones sobre inmunidad m e
diada por clulas surgieron del estudio de las
reacciones de hipersensibiUdad tarda, provoca
das por la tuberculina y por ciertas sustancias
qum icas capaces de pro d u cir derm atitis de
contacto, por lo cual se las consider slo co
mo una forma de alergia, como un efecto perju

16
dicial de la respuesta inm une. Ms tarde, se
comprendi la importancia de estas reacciones
no slo en el rechazo de injertos sino tambin
en la proteccin contra microorganismos pat
genos, sobre todo contra los patgenos intrace
lulares obligados o facultativos (virus, parsi
tos protozoarios, ciertas bacterias y hongos).
Luego se comprob que algunos de los meca
nismos de colaboracin que intervienen en las
respuestas celulares son necesarios tambin en
la respuesta humoral contra los antgenos pro
teicos, aun cuando la resultante visible de s
ta sea una respuesta humoral. Hubo entonces, y
existe todava, cierta confusin sobre el trm i
no inm unidad celular, pues ste abarc no
slo las reacciones celulares cuya resultante es
la respuesta humoral sino tambin los mecanis
mos efectores de sta ltima mediados por c
lulas como, por ejemplo, la citotoxicidad celu
lar dependiente de anticuerpos. Por eso se utili
za la expresin de inmunidad mediada por c
lulas para definir las reacciones especficas en
las que no intervienen anticuerpos.
Sin embargo, entre stas existen dos tipos de
fenmenos efectores: la citotoxicidad directa
ejercida por los linfocitos T, que se discute en
el captulo 2, y las reacciones celulares media
das por los linfocitos de fenotipo T h l, cuyo
efecto final es la activacin de los macrfagos,
con un aumento enorme de su poder ltico. Se
ra entonces mejor definir a esta ltima funcin
como inmunidad mediada por macrfagos acti
vados, Estos macrfagos activados, efectores
finales de la reaccin de los linfocitos T h l, son
muy diferentes, tanto de los macrfagos en re
poso, como de los estimulados por efecto de la
fagocitosis, y no slo por su mayor actividad l-

Hipersensibilidad tarda y otras reacciones de inmunidad

tica externa e interna sino por la secrecin de
factores capaces de accin a distancia.
En trminos generales, puede decirse que la
activacin de los macrfagos es el arma ms
poderosa que tienen los organismos superiores
para defenderse de patgenos intracelulares
optativos, capaces de escapar de la lisis luego
de ser fagocitados por macrfagos no activa
dos. Pero tam bin es un arm a de doble filo
pues im plica, en m ayor o m enor m edida, la
aparicin de reacciones tpicas de hipersensibi
lidad tarda, cuya resultante es la destruccin
de tejidos propios, incluso de clulas no parasitadas, que vendran a ser los testigos ino
centes que mueren como consecuencia de la
interaccin patgeno-husped.
En general, dada la existencia de fenmenos
exquisitos de regulacin de las respuestas in
munes, luego de la infeccin con un patgeno
extracelular, se ponen en m archa en form a
prioritaria los procesos de inmunidad humoral
y/o de citotoxicidad directa por linfocitos T; la
inmunidad mediada por macrfagos activados
slo se hace preponderante en las infecciones
crnicas y, sobre todo, en las producidas por
patgenos intracelulares. Un buen nivel de an
ticuerpos locales o circulantes es a menudo su
ficiente para im pedir la entrada de un agente o
su diseminacin, pero para la eliminacin de
patgenos intracelulares obligados o la conten
cin de aquellos con capacidad de eludir la li
sis en los fagocitos, uno u otro tipo de inm uni
dad m ediada por clulas es a menudo indis
pensable. Esta im plica casi siempre un cierto
grado de lesin, que puede llegar a veces a ser
ms importante que la lesin directa producida
por el invasor.
Historia
La historia de la inmunidad mediada por c
lulas comenz en 1891, con las observaciones
de Koch, sobre la diferencia en la respuesta a
la inoculacin cutnea de bacilos virulentos de
la tuberculosis en cobayos sanos o previamen
te infectados con el mismo bacilo. Comprob
que, en los animales sanos, a las tres semanas
de la inoculacin apareca una ulceracin, se
guida de adenopata satlite y de generaliza
cin de la infeccin; por el contrario, en los
animales previamente infectados, la reinocula
cin provocaba la formacin acelerada de esa
ulceracin, con necrosis y eliminacin de! teji
do neerosado, pero sin adenopata satlite y sin
generalizacin de la reinfeccin. En 1906, von
Pirket estudi las reacciones locales en cone
jos inyectados con turberculina, pero recin
Jans Zinssen, en 1921, pudo distinguir entre
las reacciones de tipo anafilaxia hum oral de
las provocadas por la tuberculina. Segn Zins

297

sen en cobayos hay dos tipos de reacciones

intradrm icas fundam entalm ente diferentes.
Una es inm ediata y transitoria, y aparece en
animales sensibilizados contra protenas; pue
de clasificarse como una manifestacin de hi
persensibilidad proteica general, o anafilaxis.
La otra es del tipo de la reaccin cutnea con
tra la tuberculina, que se desarrolla despacio,
lleva a una mayor injuria de los tejidos y es in
dependiente de la anafilaxis .
En 1932, Dienes y Mallory demostraron que
la hipersensibilidad tarda puede hacerse evi
dente poco despus de la inmunizacin, antes
de la aparicin de anticuerpos circulantes, y
que no puede ser transmitida pasivamente por
suero; hicieron tambin una descripcin histo
lgica de la reaccin cutnea tarda. En 1948
Raffel y, en 1956, Freund describieron la im
portancia del uso de adyuvantes en la in d u c
cin de hipersensibilidad tarda.
H asta ese momento, la hipersensibilidad tar
da tena una posicin poco clara en la inm uno
loga. No pareca ser una reaccin claramente
protectora, sino slo un fenmeno inflamatorio,
indoloro, observable en la piel en el lugar de la
inyeccin de un antgeno hacia el cual el hus
ped estab a previam ente sensibilizado. C on
tribua a la confusin la dificultad para obtener
reacciones puras de inmunidad mediada p o r c
lulas, sin la aparicin simultnea de anafilaxia
o de reacciones tipo Arthus. La ausencia de an
ticuerpos circulantes no slo haca dudar de la
naturaleza inmune del fenmeno, sino que ade
ms impeda su anlisis, hasta que Lansteiner y
Chase lograron, con gran sorpresa de la com u
nidad cientfica de entonces, transferir hiper
sensibilidad tarda con clulas provenientes de
ganglio o exudado peritoneal de animales sen
sibilizados. Este descubrimiento hizo posible la
separacin de as respuestas inmunes mediadas
por anticuerpos de las mediadas por clulas y
permiti que comenzase el anlisis in vivo de
stas. La tcnica de transferencia celular fue
muy usada para el estudio de los rechazos de
injertos, de enfermedades autoinmunes, de la
inmunidad en infecciones y tumores, y para el
conocimiento de las clulas responsables y el
mecanism o ntimo de la reaccin. Se defini
as a la hipersensibilidad tarda como una reac
cin inflamatoria, que aparece slo en sujetos
presensibilizados, que tarda 24 hs o ms en de
sarrollarse luego de la reestimulacin local con
el antgeno, que tiene un aspecto histolgico
caracterizado por infiltrado celular m ononu
clear, que no necesita de la presencia de anti
cuerpos para hacerse patente y que no es transferible por suero pero s por clulas linfoides
viables. Gells y Coombs, en su sistematizacin
de las alergias. Ja denominaron hipersensibili
dad de tipo IV.

298

Aspectos bsicos de la Inmunidad

Para conocer los mecanismos de esta reac

cin contribuyeron mucho los trabajos de Davies y de Bloom y Benet, que demostraron que
los linfocitos T presensibilizados, en presencia
del antgeno especfico, producen y liberan al
medio factores capaces de actuar sobre otras
clulas en forma inespecfica, dando como re
sultado reacciones tpicas de hipersensibilidad
tarda. Luego se estudiaron estos factores, a los
que se llam linfoquinas, y se determin que
son producidos por una subpoblacin funcio
nal de clulas T presensibilizadas, a las que se
llam T inductoras,
o
se determin
que el principal mecanismo efector de la hiper
sensibilidad tarda es la produccin de factores
capaces de reclutar y activar macrfagos, con
aumento de su capacidad ltica.
Durante todo este perodo se fue descubrien
do que las reacciones m ediadas por clulas
pueden intervenir en la defensa de los organis
mos pero que, adems de los fenmenos del ti
po de la hipersensibilidad tarda, existan otras
reacciones mediadas por leucocitos que, con o
sin la intervencin de los anticuerpos y por di
ferentes mecanismos, pueden llevar a la lisis
de clulas u organism os propios o extraos.
Estos m ecanism os celulares citotxicos son
analizados en el captulo 21.
A dems, tam bin se fue dem ostrando que
en la colaboracin celular intervenan clulas,
las llamadas T colaboradores o Th, que no p o
dan ser distin g u id as p o r sus antg en o s de
membrana de las inductoras de la hipersensibi
lidad tarda, pues ambas son CD4+, por lo que
se llam a esta poblacin linfocitos T colabo
radores/inductores. Se demostr que en la co
laboracin tambin intervienen factores, y que
algunos de ellos son comunes en muchas reac
ciones inmunes. Por fin, se pudo determ inar
que dentro de la poblacin CD4'" ya sensibili
zada pueden distinguirse dos fenotipos funcio
nales, los Th2, cuyos factores actan principal
mente en la colaboracin con los linfocitos B,
y los Thl cuyos factores actan principalmen
te en el reclutamiento y activacin de macrfa
gos.
A ctualm ente, el aislam iento de genes que
codifican para estos factores (que incluyen las
llamadas interleuquinas, linfoquinas, monoqui
nas, etc.) ha permitido conocer mejor su fun
cin, pues se han podido aislar en pureza para
estudiar su accin in vivo e in vitro sobre pblaciones celulares. Adems su efecto biolgi
co in vivo se est conociendo mediante el estu
dio de ratones transfectados y knock out, a
los que se ha agregado o eliminado, respecti
vamente, uno de dichos genes. Todo esto est
llevando a comenzar a comprender la intrinca
da red de factores regulatorios de la funcin

ASPECTO MORFOLGICO
DE LAS REACCIONES MEDIADAS
POR LINFOCITOS TIPO Thl
Respuesta cutnea. Hipersensibilidad
de tipo IV
La caracterstica comn y principal de las
reacciones inmunes mediadas por los linfocitos
de fenotipo T hl es la presencia de linfocitos y
de macrfagos activados en la zona de depsito
del antgeno. El fenmeno puede adoptar dife
rentes aspectos morfolgicos segn el rgano
donde se desarrolla o las caractersticas del an
tgeno. La forma ms comn de observarlo es
mediante la inyeccin intradrmica de antge
nos proteicos.
Como ya se mencion, la primera reaccin
conocida de inm unidad celular fue la clsica
reaccin de hipersensibilidad tarda o retardada,
que puede ser inducida en la piel de individuos
presensibilizados y es fcilmente distinguible
de otras reacciones cutneas (cuadro 16-1).
M acroscpicam ente se caracteriza por una
induracin indolora, acompaada o no de erite
ma: es una reaccin que se toca ms que se
ve . La induracin, comn en todas las espe
cies, se debe mucho al infiltrado celular y poco
a la hiperemia y el edema. Microscpicamente,
este infiltrado est constituido por linfocitos
pequeos y monocitos, pero, por sobre todo,
est acom paado por m acrfagos activados.
Estos infiltran la dermis superficial y profunda
y hasta el panculo adiposo, y persisten despus
de desaparecido el edema o eritema.
Es comn que las reacciones sean mixtas y
estn acompaadas de cierto grado de reaccin
de Arthus. Esta es provocada por la formacin
local de complejos inmunes y su deposicin a
lo largo de las paredes vasculares y est carac
terizada por desarrollo temprano (2 a 4 horas),
presencia de hemorragia por dao vascular e
infiltrado neutroflico. La reaccin de Arthus

Cuadro 16-1. Caractersticas de las reaccio

nes inmunes en piel
Reaccin

Tiem po

H ip e rs e n s i 2 4 -4 8 hs
b ilid a d ta r
d a

H istologa

M ecanism os

In filtra d o d e
m a c r fa g o s y
alg u n o s lin f o
c ito s
In filtra d o d e
n e u tr filo s

L in fo c ito s T ->
lin fo q u in a s ->
m a c r fa g o s

Arthu.s

2a4hs

A n a fila x ia

P o c o s m i E d e m a , m u y
n u to s
p o c a s c lu la s

C o m p le jo s
A g -A c -C >
p o lim o rf o
n u c le a re s
Ig E -> m a s to c i
to s

Hipersensibilidad tarda y otras reacciones de inmunidad

requiere la inyeccin de cantidades relativa
mente grandes de antgeno en la piel; si se re
duce su cantidad, se puede minimizar ese com
ponente sin que desaparezca la reaccin de hi
persensibilidad tarda.
La h ip ersen sib ilid ad tard a cutnea, muy
evidente en el hombre, puede ser ms o menos
fcil de ver en diferentes especies de animales
de laboratorio o domsticos. As, en los coba
yos es muy evidente, mientras que en los rato
nes es poco notable y para medirla se usa la in
yeccin en la almohadilla plantar o en la oreja.
En los grandes anim ales dom sticos, deben
elegirse sitios de piel fina o transparente, como
los pliegues de alrededor del rabo, m ientras
que en especies domsticas pequeas es muy
difcil de identificar, por lo tardo de su apari cin y el rascado que provoca la inyeccin,
con la consecuente inflamacin secundaria que
induce. En todas las especies, la infiltracin
celular mononuclear da el diagnstico de cer
teza.
Tambin pueden provocarse reacciones de
hipersensibiUdad de tipo IV en otros rganos,
como crnea, vejiga, mucosas u rganos sli
dos, y en todos tienen caractersticas sem ejan
tes a las descritas, es decir, la infiltracin con
clulas m ononucleares y la aparicin de m a
crfagos activados.
Si bien la gran m ayora de las reacciones
alrgicas cutneas son debidas a otros m eca
nismos de hipersensibilidad, algunos haptenos,
capaces de penetrar a travs de la piel y unirse
a una protena propia que le sirve de carrier
o soporte, inducen hipersensibilidad de tipo
IV. Entre dichos alergenos se cuentan sustan
cias inorgnicas, como detergentes, derivados
del petrleo, colorantes, sustancias usadas en
cosmtica, dinitro o trinitrofenoles, y tambin
de origen biolgico, como un hapteno de la sa
liva de la pulga y toxinas de ciertas plantas,
entre las cuales la ms conocida es ia hiedra
p o nzoosa (poison ivy), m aleza com iin en
Amrica del Norte. Este tipo de alergias p re
sentan caractersticas clnicas diferentes de !a
alergia mediada por IgE, son generalmente de
difcil tratam iento y configuran el cuadro de
las dermatitis por contacto.
Reacciones producidas por inyeccin
endovenosa del antgeno
Si a un animal con manifestaciones de hi
persensibilidad tarda se le inyecta el antgeno
en form a endovenosa, se le induce una reac
cin sistmica, que puede ser grave, y cuyas
manifestaciones incluyen fiebre, m sh cutneo,
m onocitopenia y produccin de protenas de
fase aguda. Estas m anifestaciones son la ex
presin de la liberacin sistmica de factores

299

de los linfocitos tipo T h l, que inducen la sali

da de los monocitos de la sangre y la activa
cin generalizada de los macrfagos. A su vez,
stos liberan tambin nuevos factores, capaces
de inducir fiebre, sntesis de protenas de fase
aguda, caquexia, etctera.
Reacciones producidas
por m icroorganism os patgenos:
inflamacin crnica
Cuando el antgeno no es una sustancia que
penetra en pequea cantidad por la piel sino
que es un patgeno que forma un foco infec
cioso local, la reaccin mediada por linfocitos
tipo T h l conduce a la formacin del granulo
ma tpico de la inflam acin crnica. ste se
caracteriza por la presencia de gran nm ero de
macrfagos, con o sin bacterias fagocitadas en
su interior, que adhieren ntimamente entre s
hasta adoptar el aspecto tpico de clula epitelioide y que pueden llegar a fusionarse entre
ellos formando clulas gigantes multinucleares. En el interior del granuloma puede apre
ciarse necrosis en distintos grados, que puede
progresar hasta la ulceracin o la formacin de
caseum.
E ste granulom a ya fue descrito por Koch,
que remarc tanto la necesidad de presensibilizacin para su formacin como su importancia
en la proteccin del animal: si bien la reaccin
produce gran dao tisular, el animal inm une
puede circunscribir la infeccin y as frenar la
progresin de la enfermedad. El mecanism o de
esta proteccin fue estudiado por los grupos de
Lurie y MacKaness, quienes demostraron que
la diferencia entre los fagocitos de anim ales
sensibilizados y no sensibilizados es q u e los
prim eros pueden lisar este tipo de bacterias
que escapa al ataque ltico, mientras, q ue, en
los fagocitos de los animales del segundo gru
po, las bacterias no slo sobreviven, sino que
hasta se replican y aprovechan a los m acrfa
gos para migrar desde el foco de entrada e in
vadir otras regiones del organismo.
Estudios posteriores dem ostraron q u e los
m ecanism os que activan a los m acrfagos,
con aum ento de su capacidad ltica, son los
mismos que se ponen en juego en la hipersen
sibilidad tarda y que ambos fenm enos son
m anifestaciones de una sola funcin. Se en
tiende ahora que esta respuesta inmune es una
form a de proteccin mediada por los linfoci
tos de tipo T h l y los factores que producen,
que reclutan y activan macrfagos en el sitio
de interaccin entre el antgeno y los linfoci
tos presensibilizados y que, si bien es sum^am ente importante en la defensa contra patge
nos intracelulares, tiene como consecuencia
lesiones tisulares.

300

Aspectos bsicos de la inmunidad

ACTIVACIN DE LOS MACRFAGOS

Cambios en el sistema inmune durante
la induccin de una respuesta celular
La fase inductiva de la inmunidad mediada
por clulas implica una serie de cambios en el
sistema inmune, que toman por lo menos 4 das
en desarrollarse; en general, pasan 9 a 12 das
desde el primer contacto con el antgeno hasta
que pueda apreciarse una tpica reaccin de hi
persensibilidad tarda. Durante este tiempo, los
linfocitos Th vrgenes, preefectores, se conyierten en hnfocitos sensibilizados tipo T hl, efectores. Esto, igual que para una reaccin de tipo hu
moral, sucede en los rganos secundarios, parti
cularmente en el ganglio que drena el sitio de
penetracin del antgeno, el cual generalmente
queda retenido en ellos. Microscpicamente, en
sus zonas timodependientes, o sea la zona pai-acortical de los ganglios o el manguito que rodea
a las arteriolas de la pulpa blanca, se aprecia una
mayor celularidad con aparicin de clulas gran
des de tipo linfoblstico. Este crecimiento en n
mero y tamao de las clulas refleja el atrapa
miento y la estimulacin de los linfocitos T pre
determinados pai'a reconocer a ese antgeno que
ha quedado atrapado en el ganglio; los que lo re
conocen quedan retenidos, proliferan, y se pro
duce en ellos la maduracin a efectores T h l. Es
tos hnfocitos as modificados salen luego del r
gano secundario, recirculan por todo el organis
mo y sern capaces de producir una reaccin lo
cal en cadena dondequiera que se encuentren
nuevamente con el antgeno.
Estados fisiolgicos de los macrfagos
Si bien los macrfagos son clulas que siem
pre tienen capacidad fag o ctica y ltica, no
siempre estn en el mismo estado de actividad
y podemos distinguir por lo menos tres grados,
a saber:
1) M acrfagos en reposo. Los m onocitos
migran de la sangre y se instalan en los tejidos,
donde se transforman en macrfagos o en otras
clulas de la lnea m onocito/m acrfago. En
condiciones normales, estos macrfagos tisula
res residentes estn en reposo y su actividad se
expresa slo por su movilidad ameboide y su
migracin a travs de lo tejidos.
2) Macrfagos estimulados. Si durante dicha
migracin chocan con una partcula y la fagocitan, se estimulan; este estmulo contribuye a la
lisis de la partcula ingerida y a una mejor pre
sentacin antignica. En estas con d icio n es
muestran un aumento de la actividad ameboide,
lo que aumenta su capacidad fagoctica, se pro
duce la unin de los grnulos preformados al

fagosoma, al que convierten en fagolisosoma, y

hay un estallido respiratorio, que contribuye a
la lisis de las bacterias ingeridas. Adems, hay
un aumento de la expresin de m olculas de
histocompatibihdad y de varios receptores su
perficiales, que permitirn una mejor presenta
cin de los antgenos a los hnfocitos T CD4+, y
hay sntesis y secrecin de factores, especial
mente IL l, que contribuyen a la iniciacin de
la respuesta inmune.
3)
M acrfagos activados. Si el m acrfago
recibe la influencia de las linfoquinas produci
das por los linfocitos de fenotipo T h l, haya o
no haya preingerido una partcula, se activa.
Esta activacin se traduce en varios cambios.
Hay, fundamentalmente, una disminucin de su
m ovilidad y capacidad de traslacin (la muy
estudiada inhibicin de la migracin de los ma
crfagos), y un gran aumento de su capacidad
ltica, dado por la produccin de NO. La capa
cidad ltica se manifiesta no slo sobre las bac
terias ingeridas, sino que puede hacerse exter
namente, con liberacin de enzimas y NO al
exterior del macrfago, y lleva a la destruccin
de clulas propias normales, los famosos testi
gos inocentes de la reaccin, y a la necrosis
local. Por ltimo, los macrfagos activados, in
movilizados en el sitio, tienden a unirse entre
ellos formando las clulas multinucleadas de
Langerhans, tpicas de la inflamacin crnica.
Activacin de los macrfagos
Como ya se mencion, la hipersensibilidad
tarda y los fenmenos de inmunidad protectiva
mediada por clulas, obedecen a esta activa
cin de los macrfagos, pero los mecanismos
que llevan a esta activacin fueron difciles de
conocer.
La tcnica de transferencias celulares posibi
lit que se los comenzara a estudiar, pues se
demostr que los linfocitos B son totalmente
incapaces de transferir la reaccin, m ientras
que s la transfieren los T y, entre stos, los
TCD4+. Los experim entos con transferencias
mostraron tambin que las clulas que se acu
mulan en el lugar de inyeccin del antgeno
son, en su mayora, originarias del husped y
producto de una divisin recicnte; es decir,
unas pocas clulas presensibilizadas son capa
ces de reclutar clulas no sensibilizadas e indu
cir en ellas mitosis. En algn momento se pos
tul la existencia de un factor de transferencia,
obtenido a partir de lisados de linfocitos de un
individuo sensibilizado, pero su real existencia
no pudo ser confirmada. En cambio, se demos
tr en ratones, que deba haber identidad gen
tica en los antgenos de histocompatibilidad del
dador y el receptor para obtener una transferen
cia efectiva.

Hipersensibilidad tarda y otras reacciones de inmunidad

La definicin de los mecanismos de inmuni
dad mediada por clulas se logr mediante es
tudios in vitro. En efecto, primero se demostr
que los linfocitos de un individuo presensibilizado se desdiferencian y entran en mitosis al
ser cultivados en presencia de antgenos. Luego
se vio que la adicin de antgeno a los macrfa
gos peritoneales o los leucocitos perifricos de
individuos presensibilizados, empacados en un
capilar y cultivados en una cmara, inhiben la
migracin espontnea de dichas clulas hacia
la periferia de la cmara de cultivo. Esta tcni
ca, la llamada de inhibicin de la migracin de
los macrfagos, se us durante bastante tiempo
como diagnstico de inm unidad mediada por
clulas, pues se correlaciona muy bien con fe
nmenos de hipersensibilidad tai'da pero, ade
ms, perm iti que se com enzaran a conocer
muchos de los m ecanism os de las respuestas
inmunes pues sirvi para demostrar que los lin
focitos T producen y secretan al medio factores
inespecficos capaces de actuar sobre otras c
lulas. En efecto, se demostr que el sobrena
dante de linfocitos sensibilizados, en contacto
con el antgeno especfico, tambin inhibe la
migracin de los macrfagos normales, aun en
ausencia de antgeno. Al factor capaz de produ
cir esta inhibicin se lo llam MIE (de macrophage migration inhibiting factor).
A partir de estas observaciones se comenza
ron a estudiar los efectos demostrables tanto in
vitro como in vivo de los sobrenadantes de lin
focitos estimulados, pues se comprob que la
inyeccin intradrmica de estos sobrenadantes
puede inducir una reaccin inflamatoria prcti
camente idntica a la de la hipersensibilidad
tarda, slo que de aparicin ms precoz. Se
definieron as las linfoquinas y se comprendi
entonces que la hipersensibilidad tarda y los
fenmenos de proteccin contra patgenos in
tracelulares tienen dos componentes: uno especfco, dado por la interaccin entre un linfoci
to presensibilizado y un antgeno presentado
por un macrfago, y esto induce la produccin
de linfoquinas; el otro componente es ine.specfico y est dado por el reclutamiento y la acti
vacin local de los macrfagos, lo que produce
el fenmeno inflamatorio y ltico.
Luego de la descripcin del MIE, se siguie
ron estudiando, casi siem pre in vitro, otros
efectos demostrables en los sobrenadantes de
linfocitos estimulados y se definieron otras lin
foquinas, a las que se dio nom bre segn su
efecto, Se describieron as una serie de factores
reclutadores y mitognicos para diferentes ti
pos celulares, factores inhibidores de la mitosis, el interfern y (IFNy), que es un importante
mediador inmungeno, el factor de necrosis tu
moral (TNF), capaz de disminuir el crecimien
to de tumores in vitro y de provocar caquexia

301

in vivo, y un cmulo tal de factores mitogni

cos y quimiotcticos para los leucocitos y con
efectos sobre otras clulas y tejidos no hnfoides, que hizo casi imposible la mera enumera
cin de todos. Lamentablemente, los factores
fueron estudiados por diferentes grupos de tra
bajo, que usaron mtodos y poblaciones celula
res distintos, y muchas veces se comprob des
pus que varios efectos eran producidos por un
solo factor, o viceversa, que un efecto poda ser
producido por la suma de varios factores. M s
o menos por ese mismo tiempo, se comenzaron
a analizar los factores que intervienen en la co
laboracin celular para las respuestas hum ora
les y celulares, a los que se llam interleuqui
nas, y se demostr que stas pueden tener gran
des similitudes con algunas de las linfoquinas
e, incluso, ser idnticas a ellas (vase cap. 12).
Pese a que la nom en clatu ra sigue sien d o
confusa, actualmente no se admite como in ter
leuquina ni como factor de activacin de macrofagos o de colaboracin celular, a ninguno
cuyo gen no se haya aislado y transfectado a
una clula productora, y pueda as ser obtenido
en pureza. Una de las ironas de este rigor cien
tfico es que el MIE, el primer factor inespecfico producido por hnfocitos T especficos, no
ha podido ser aislado y ya no se admite que
exista como tal, sino que la inhibicin de la m i
gracin de los macrfagos se debe a la activa
cin de esas clulas.
En resumen, actualmente se entiende que las
reacciones de hipersensibilidad tarda y de la
llamada inmunidad mediada por clulas, estn
mediadas por linfocitos de tipo T h l, es decir,
linfocitos TCD4+ presensibilizados por el ant
geno que, al ser reestimulados por ste, produ
cen factores capaces de reclutar y estim ular
otros linfocitos, atraer monocitos y m acrfa
gos, y activar a stos aumentando su capacidad
ltica.
Los principales factores producidos por los
linfocitos T hl estimulados, como se indica en
el captulo 18, son el INFy, el TNEp y las IL2,
IL3, IL6, ILl O y IL l 2, cuyas estructuras y p rin
cipales funciones son analizadas en otros cap
tulos. D e stos, el principal activador de los
macrfagos parece ser el INEy, mientras que
TNFp tiene efectos citolticos directos y efec
tos caquectizantes a distancia.
Sin embargo, debe tenerse en cuenta que es
tos mismos factores, o por lo menos algunos de
ellos o con efectos muy pai'ecidos, pueden ser
producidos por otras clulas, muy especialmen
te por los mismos macrfagos activados, que
secretan grandes cantidades de IL6 y T N F a, los
linfocitos T citotxicos CD8^ y las clulas NK,
que secretan INFy e IL2. A su vez, stos no tie
nen efecto slo sobre los macrfagos sino tam
bin sobre las clulas citotxicas. Se comprende

302

Aspectos bsicos de la Inmunidad

entonces que ambas ramas de la inmunidad me

diada por clulas, la activacin de los macrfa
gos y la citotoxicidad celular, pueden estar nti
mamente ligadas y la citotoxicidad ejercida por
los macrfagos activados puede verse aumenta
da por la ejercida por los linfocitos T CD8^' y
las clulas NK, y viceversa. Si tenem os en
cuenta que los linfocitos CD4+ tambin pueden
ejercer funciones citotxicas directas, compren
deremos una vez ms que las diferentes formas
que adopta la respuesta inmune efectora estn
ntimamente ligadas entre s.
Finalmente, si se recuerda que la diferencia
cin de los linfocitos TCD4+ hacia los fenoti
pos T hl o Th2 est influida por los factores
presentes en el medio en el momento de su sen
sibilizacin, se comprender que una reaccin
que comienza con la estimulacin de clulas ci
totxicas pueda llevar a la modulacin del sis
tema inmune hacia una respuesta de activacin
de macrfagos.
IMPORTANCIA FISIOLGICA DE LA
INM UNIDAD M EDIADA P O R C LU LA S
Durante mucho tiempo se discuti cul era el
papel que le caba a la inmunidad humoral y
celular en la defensa co ntra los patgenos:
M etehnikoff propuso que las bacterias eran
destruidas por los fagocitos, mientras que Ehrlich y Bordet mostraban la capacidad defensiva
de los anticuerpos humorales. En realidad, am
bas propuestas son correctas y ambos sistemas,
el humoral y el celular, actan en forma com
plementaria: prcticamente, no existen reaccio
nes puras de ninguno de ellos. Pero si bien los
anticuerpos pueden, por s mismos o en colabo
racin con sistemas inespecficos (complemen
to, fagocitosis, etc), eliminar muchos patge
nos extracelulares, no llegan al interior de las
clulas propias que puedan albergar patgenos
intracelulares. Adems, existen otras bacterias
y parsitos que, como se mencion antes, han
desarrollado durante su evolucin la capacidad
de eludir los mecanismos lticos de los fagoci
tos y slo los m acrfagos activados pueden
matarlos o, por lo menos, circunscribir su loca
lizacin. Entre estos patgenos, considerados
como intracelulares optativos, pueden mencio
narse varias familias de bacterias (Salmonellae,
Listeria monocytogenes, Brucellae, Mycobacteriae), hongos (Candida, Criptococcus, H isto
plasma, Coccidiodes) y a casi todos los parsi
tos protozoarios (Tripanosomae, Plasmodiae,
Toxoplasma, Leishmaniae, etc). En la infeccin
por alguno de estos patgenos, la defensa est
basada en la acumulacin de linfocitos T sensi
bilizados y macrfagos activados en ei sitio de
infeccin.

Para la eliminacin de los virus en su etapa

intracelular u otros patgenos intracelulares '
obligados, los linfocitos T citotxicos CD8+,
que reconocen clulas propias parasitadas por
virus, tienen un papel fundamental en la elimi
nacin del invasor. La puesta en marcha de este
mecanismo, como ya mencionamos, est nti
mamente relacionada con los linfocitos ThL
Por todo esto, se comprende por qu un indi
viduo con un sistema T deficiente es extrema
damente sensible a infecciones virales, parasi
tarias o por microorganismos intracelulares op
tativos, mientras que puede defenderse relati
vamente bien contra bacterias extracelulares.
Los mecanismos de defensa contra los diferen
tes patgenos son analizados en detalle en los
captulos 24, 25, 26 y 27.
La inmunidad celular en el rechazo
de injertos y tumores
Histricam ente hablando, uno de los datos
que primero contribuy a la determinacin de
la dualidad T-B del sistem a inm une fu e la
com probacin cte que los anim ales gentica
mente atfmicos aceptaban injertos de tumores
xenogeneicos, mientras que pollos bursectomizados los rechazaban. Esto hizo que se atribu
yera al sistema T la funcin del rechazo de in
jertos y, a falta de una funcin fisiolgica f
cilmente detectable, la de vigilancia contra los
tumores.
En el rechazo de injertos, inducido por dife
rencias genticas en los antgenos de h isto
compatibilidad, la funcin efectora de los lin
focitos T, tanto CD4+ como CD8+, es de im
portancia fundam ental. En la defensa contra
los tumores, la funcin del sistema inmune es
pecfico no es tan clara. Esto se ver en detalle
en el captulo 33.
PATOLOGIA DE LA RESPUESTA
INMUNE MEDIADA POR CLULAS
Infecciones
Como ya se recalc varias veces, todos los
procesos mediados por linfocitos T efectores,
tanto si activan macrfagos como si son citot
xicos directos, implican un dao tisular ms o
menos importante; por eso, cualquier alteracin
de su regulacin puede traducirse en enferme
dad.
De hecho, las reacciones norm ales contra
cualquiera de los patgenos intracelulares antes
mencionados se acompaa siempre de una le
sin tisu lar, que puede ser muy p eq u e a o
enorme: una infeccin tuberculosa puede ter
minar en un pequeo ndulo calcificado o lie-

Hipersensibilidad tarda y otras reacciones de inmunidad

gar a una caverna; muchas veces deja cicatrices
indelebles.
En otros casos, como en ciertas enfermeda
des virales, el agente no es muy citopatognico
p er se, pero la reaccin celular puede llevar a
daos tisulares irreversibles. Las lesiones cut
neas, propias de la varicela y el sarampin, se
atribuyen en general a reacciones de tipo hiper
sensibilidad retardada sistmica y en el herpes
simple las lesiones se deben a linfocitos T citotxicos. En ciertas hepatitis el dao heptico
irreversible puede deberse tambin a los linfo
citos T citotxicos.
Dermatitis de contacto
Adems de estas consecuencias de una res
puesta de proteccin contra agentes patgenos,
la inmunidad mediada por clulas puede cons
tituirse en una verdadera alergia y dar el cuadro
de dermatitis de contacto, que es una reaccin
de hipersensibilidad tarda o de tipo IV. Como
en todos los casos de hipersensibilidades o
alergias, existe una enorme variacin indivi
dual, tanto en el establecimiento o no de hiper
sensibilidad contra distintos antgenos, como
en la magnitud de las reacciones, pero, en ge
neral, si los antgenos penetran por va intra
drmica se favorece la aparicin de este tipo de
respuestas m ientras que, si penetran por va
oral, se favorece una tolerancia a nivel de reac
ciones celulares.
Como se mencion antes, ciertos haptenos
pueden unirse a protenas propias y desencade
nar hipersensibilidad de contacto. Estos p ro
ductos qum icos pueden presentar problemas
propios de la medicina laboral; adems de los
picrilos y los benzenos ya mencionados, ciertos
compuestos de cromo, nquel y berilio liberan
iones de estos metales que, unidos a las prote
nas propias, forman neoantgenos capaces de
sensibilizar el sistem a inmune. En las indus
trias que utilizan estos compuestos, los obreros
que los manipulan sin las debidas precauciones
pueden sensibilizarse y presentar problem as
cutneos. Es ms, hay sustancias como el as
besto cuya inhalacin, luego de la sensibiliza
cin, puede llevar a daos irreversibles en el
pulmn, siempre por el mismo mecanismo in
mune.
Otros productos qumicos de uso domicilia
rio, como la p-fenilen diamina, presente en los
colorantes para el cabello, y otros compuestos
presentes en detergentes y cosmticos, tambin
pueden producir reacciones semejantes. Algu
nos de estos haptenos se encuentran en la natu
raleza, en la saliva de insectos hematfagos,
muy especialm ente las pulgas, o en ciertas
plantas, y pueden dai lugar a reacciones de tipo
hipersensibilidad tarda que desemboca en una

303

dermatitis de contacto, tanto en el hombre co

mo en los animales domsticos.
En todos estos casos, la desensibihzacin es
difcil, pues no se logra mediante la inyeccin
repetida del antgeno como sucede en la hiper
sensibilidad de tipo I, y el tratamiento se hace a
base de corticoides y, en lo posible, por la eli
minacin del contacto con el antgeno. Un m
todo preventivo sera la induccin de tolerancia
mediante la administracin oral del antgeno.
Algunas de los compuestos qumicos sintti
cos mencionados, como el dinitro o trinitro clorobenzeno y el cloruro de picrilo, inducen h i
persensibilidad tarda en casi todos los indivi
duos; por eso han sido muy utilizados, tanto
para la investigacin bsica de la inm unidad
celular, como en la clnica, para estudiar la ca
pacidad de un paciente para iniciar respuestas
inmunes mediadas por clulas.
La inmunidad mediada por clulas es a m e
nudo un componente importante de las en fer
medades autoinmunes, muy especialm ente en
aquellas provocadas por la liberacin de los lla
mados antgenos secuestrados (sistema nervio
so central, testculos, glndulas endocrinas); es
tas enfermedades se vern en detalle en el cap
tulo 28.
CONSIDERACIONES FINALES
En resumen, puede decirse que, en un orga
nismo con un sistema inmune normal y en re
poso, es decir, en una actividad organizada y
regulada preexistente, producida por el recono
cimiento constante de lo propio, ms las m odi
ficaciones que puedan haber causado a esta ac
tividad otros estmulos antignieos anteriores,
la en trada y reconocim iento de un antgeno
provoca una nueva respuesta, que se traducir
en una alteracin de dicho equilibrio. La res
puesta se inicia por la estimulacin de los lin
focitos T preefectores y, segn la forma en que
se haya presentado el antgeno y otra serie de
circunstancias, puede dar como resultado su di
ferenciacin hacia efectores de tipo Th2 o T h l,
o bien citotxicos. Los prim eros dirigirn la
respuesta hacia la estimulacin de los linfocitos
B, con sntesis de anticuerpos especficos, que
apuntarn hacia el antgeno otros mecanismos
efectores humorales o celulares; activacin de
las cascadas del complemento, la coagulacin y
las quininas, opsonizacin, citotoxicidad celu
lar anticuerpo dependiente, etc. Este tip o de
reaccin produce inflamacin aguda con sus t
picos signos; tumor, rubor, dolor y calor.
La d iferenciacin hacia efectores de tipo
T hl dirige la respuesta hacia la estimulacin de
mecanismos celulares efectores no dependien
tes de anticuerpos, principalmente la activacin

304

Aspectos bsicos de la inmunidad

de los macrfagos. Este tipo de reaccin produ

ce inflamacin crnica y es generalmente ms
lesiva para los rganos y tejidos propios.
Si bien ambos tipos de reacciones tienden a
autoperpetuarse por la regulacin cruzada que
existe entre los linfocitos T h l y Th2, es muy
raro encontrar en la naturaleza respuestas puras
de uno u otro tipo. Adems, tanto en la induc
cin de ambas como en los sistemas efectores
finales, hay factores y mecanismos que son co
munes, de manera que es imposible hablar de
una respuesta mediada exclusivamente por c
lulas o por anticuerpos.
Sin embargo, es im portante el concepto de
que una de las formas en que puede desembo
car una reaccin inmune especfica es en la ac
tivacin de los macrfagos inespecficos y que
esta activacin, si bien es peligrosa o directa
mente lesiva, es tambin esencial para la defen
sa contra ciertos patgenos.
APLICACIONES CLNICAS
Pruebas para la deteccin de inmunidad
mediada por clulas
Pruebas in vivo
Desde un punto de vista prctico se utilizan
las reacciones cutneas de hipersensibilidad de
tipo IV para conocer si un paciente est o no
sensibilizado hacia un antgeno dado y para co
nocer su capacidad para m ontar este tipo de
respuestas.
Una de las pruebas ms comunes, an usada,
es la reaccin de Mantoux, que se lleva a cabo
mediante la inyeccin de derivado proteico pu
rificado (PPD) de bacilos tuberculosos: en este
caso, la presencia de reacciones positivas no
indica enfermedad, sino un contacto previo con
el bacilo y la capacidad del individuo para
reaccionar contra l mediante la activacin de
macrfagos que, como ya se vio, tienen un pa
pel fundam ental contra este patgeno. De la
misma manera, la ausencia de reaccin positiva
no indica ausencia de enferm edad, sino que
puede ser de muy mal pronstico en un indivi
duo infectado pues indica anergia, es decir in
capacidad de montar respuestas celulares con
tra esta enfermedad.
Para la exploracin de la capacidad del siste
ma inm une de un individuo se han utilizado
dos tipos de antgenos: a) los de memoria, co
munes en la naturaleza, para los cuales la m a
yora de los individuos de la regin estn pre
sensibilizados, como la misma PPD, o antge
nos del sarampin, varicela, micticos, estreptoquinasa-estreptodornasa, etc. y b) antgenos
sintticos, como el dinitroclorobenzeno, para

los cules primero se sensibiliza al paciente y

luego se aplica una segunda dosis para medir la
reaccin. La positividad de la reaccin contra
los primeros indica que hay una conservacin
de la memoria del sistema inmune. La presen
cia de reacciones contra los segundos, indica
que hay capacidad en el sistema inmune para
activarse contra antgenos nuevos: sta ltima
es la que se pierde primero en las inmunodefi
ciencias adquiridas.
Actualmente, estas pruebas in vivo, que son
bastante desagradables para el paciente, son
reem plazadas por pruebas in vitro y por la
identificacin y cuantificacin de subpoblacio
nes linfoides.
Pruebas in vitro
Una de las primeras pruebas utilizada para
medir las respuestas inmunes mediadas por c
lulas fue la reaccin b lasto-m itognica que
muestran los linfocitos en cultivo, cuando son
estimulados in vitro por antgenos especficos o
por mitgenos inespecficos para los linfocitos
T, como la concanavalina A o la fitohemoaglutinina. En efecto, los linfocitos tipo T hl y los T
citotxicos al ser estim ulados producen IL2,
que es un poderoso mitgeno para los linfoci
tos T. La respuesta mitognica de un individuo
frente a un antgeno especfico indica su sensi
bilizacin previa. El nivel de respuesta a los
mitgenos inespecfico es ndice de la capaci
dad general del sistema T. Existen varios mto
dos para medir esta respuesta blastognica que
son detallados en el captulo 36.
Otra prueba que fue muy usada como ndice
de inmunidad mediada por clulas, que tambin
fue de gran utilidad para el estudio de sus meca
nismos, es la inhibicin de la migracin de los
macrfagos o de los leucocitos perifricos. Para
ella, las clulas se empaquetan dentro de un ca
pilar que se corta por su interfase clulas/medio
y se coloca en una cmara con medio de culti
vo. Los macrfagos y leucocitos tienden a salir
del capilar y a migrar por el piso de la cmara,
pero, en presencia de un antgeno para el cual el
individuo estaba previamente sensibihzado, la
migracin se inhibe y el rea cubierta por clu
las se hace significativamente menor.
Esta reaccin mostr muy buena correlacin
con la presencia de hipersensibilidad tarda, pe
ro es poco confiable y de medicin subjetiva.
Actualmente, ha sido reemplazada por la medi
da de la produccin de los factores propios de
los linfocitos T h l, muy particularmente la sn
tesis de IL2 e IFNy, que pueden detectarse en
los sobrenadantes de cultivos de linfocitos esti
mulados in vitro mediante sistemas biolgicos
o, mejor an, por prcticos sistema preestandarizados.

Hipersensibilidad tarda y otras reacciones de inmunidad

305

B IB L IO G R A F IA

E special

G eneral

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El sistema inmune de mucosas

PRIMERA PARTE

MARA ESTELA ROUX

INTRODUCCIN
La superficie de las mucosas est en contac
to permanente con el medio ambiente externo e
interno y ha desarrollado una gran cantidad de
mecanismos protectores, tanto inmunolgicos
como no inm unolgicos, para defenderse de
distintos agentes patgenos (virus, bacterias,
etc.) y de la absorcin de antgenos forneos.
Esta proteccin especfica a nivel de la superfi
cie de las mucosas se realiza por la existencia
de inmunidad secretoria. Este trmino indica
que existen diferencias con las respuestas in
munes provocadas por exposicin sistmica al
antgeno. Trabajos realizados por distintos gru
pos de in v e stig aci n han d em o strad o que,
cuando el virus influenza es introducido en el
tracto respiratorio, la respuesta inmune local no
va acompaada de anticuerpos sricos; en cam
bio, la resistencia a este virus estaba correlacio
nada con la produccin de anticuerpos protec
tores locales. En muchos casos, los antgenos
actuando localmente son ms efectivos en la
produccin de estos anticuerpos que la inmuni
zacin por va parenteral.
Por consiguiente, la produccin de anticuer
pos protectores locales puede ser independiente
de la respuesta de anticuerpos sricos, y cuan
do se producen conjuntamente la respuesta sis
tmica y la local a nivel de mucosa, la inmuni
dad producida se relaciona mejor con la res
puesta secretoria local.
E L SISTEM A DE LA IgA SE C R E TO R IA '
La inm unoglobulina A (IgA) constituye la
clase principal de inmunoglobulina de las se
creciones. La IgA que se va a transformar en

17
IgA secretoria es sintetizada localmente por c
lulas plasmticas que se encuentran en determi
nadas glndulas (salival, lacrimal, mamaria) y
en las mucosas que tienen contacto con el me
dio externo (aunque no est excluida la prove
niente de los vasos sanguneos). Tambin debe
recordarse que en ratas se ha demostrado que la
IgA es transportada en la bilis por un mecanis
mo mediado por componente secretorio, y que
en el hombre existe IgA e IgA secretoria en la
bilis. Esta IgA secretoria tiene caractersticas
estru ctu rales y antig n icas m uy esp eciales
(vase cap. 5).
La Ig secretoria bajo la form a dim rica
(IgA)^, se une al componente secretorio (CS)
en la membrana de las clulas epiteliales que
sin te tiz a n este p o lip p tid o , y el co m p lejo
(IgA)2S formado es transportado a travs de las
clulas epiteliales en vesculas y puesto en li
bertad a nivel de la superficie apical dentro de
la luz intestinal (fig. 17-1). La existencia de
una molcula especializada de IgA secretoria
explica la resistencia inmunolgica especfica a
infecciones de mucosas que existen en ausen
cia de anticuerpo srico de clase IgA demostra
ble. Es decir, anticuerpos de clase IgA, contra
una gran variedad de virus, bacterias y otros
agentes como componentes de la dieta, se en
cuentran en las secreciones locales; la resisten
cia a ellos correlaciona mejor con este anticuer
po local que con el anticuerpo circulante.
Estudios recientes de Keith E. M ostov han
demostrado la existencia (estructura y el cami
no celular) de un receptor de inmunoglobulina
polimrico pIgR (vase cap. 5) que interviene
en el transporte transepitelial de inmunoglobu
linas (trancistosis) y, muy especialmente, para
la IgA (fig. 17-2). El receptor es sintetizado por
el retculo endoplasm tico (paso 1) y luego

El sistema inmune de mucosas

307

Luz intestinal
(lgA),S

i
> ^ C S |

(lgA),S

V -J

-Uniones estrechas
-Espacio celular
interepitelial

Clula
'plasmtica
OS: Componente secretorio
G: Golgi
N; Ncleo
U g . 17-1. G eneracin y transporte epitelial de la IgA secretoria (IgA -S). La IgA dim rica en la lm ina propia p ro v ie n e de
clulas plasm ticas locales, no excluyndose una pequea contribucin srica. La (IgA )j cruza la m em brana b asal entran
do en el espacio celular intraepitelial. Los m ecanism os que llevan a la form acin de (IgA )jS podran ser dos: 1) D en tro de
la clula epitelial, el com ponente secretorio (CS), luego de com pactarse en la zona de G olgi, es segregado dentro d el espa
cio celular interepitelial y all se com bina con la (IgA )j para form ar extracelularm ente la IgA secretoria. Esta (Ig A )jS por
pinocitosis (?) entra en la clula epitelial y es secretada en la luz intestinal ya que es m uy difcil q ue atraviese directam ente
las uniones estrechas. 2) E l com ponente secretorio sera un receptor de la m em brana celular. Por consiguiente, la (IgA ) 2S
se ensam blara en la m em brana plasm tica y, luego de entrar a travs de la clula epitelial, llegara a la luz intestinal.

transportado al aparato de Golgi (paso 2). En la

cisterna trans, llamada red trans-Golgi (TGN),
las protenas destinadas a la superficie celular
son reconocidas y empaquetadas en vesculas
transportadoras que las llevarn directamente a
la superficie celular apical o basolateral. El
pIgR es liberado en la superficie basolateral
(paso 3) donde puede unirse a la IgA o IgM
(paso 4) y a continuacin es endocitado (paso
5). En las protenas del endosoma, el pIgR es
empaquetado en vesculas transcistticas (paso
6) y transportado a la superficie celular opues
ta. Luego de la trancistosis a la superficie celu
lar apical (paso 7), la porcin extracelular del
pIgR unida al ligando es clivada y puesta en li
bertad (paso 8). El fragmento clivado se deno
mina componente secretorio (CS) y permanece
unido a la IgA en las secreciones extracelula
res. El pIgR es llamado, algunas veces, compo
nente secretorio de membrna.
R ecientem ente se ha dem ostrado que IgA
con' actividad anti-virus Sendai, unida al pIgR
y endocitada en la superficie basolateral puede
neutralizar al virus Sendai que est entrando

por la superficie apical de la clula epitelial.

Este nuevo mecanismo de defensa contra la in
feccin viral, sugiere que la IgA puede usarse
para proteger clulas que ya han sido infecta
das. Adems, el pIgR puede exportar a travs
de las clulas epiteliales, los complejos inmu
nes que contienen IgA y, de esta forma, contri
buir a su remocin del cuerpo.
ORIGEN DE LAS CELULAS QUE
SINTETIZAN INMUNOGLOBULINA DE
CLASE IgA. CICLO CELULAR DE LA IgA
La inmunoglobulina preponderante en las se
creciones intestinales es la IgA y su prevalen
cia se refleja en la gran proporcin de clulas
plasm ticas, que se encuentran en la lmina
propia del intestino, que producen IgA con res
pecto a los otros isotipos.
El modelo general de proliferacin con cam
bio a otro isotipo, maduracin y migracin de
las clulas B en el sistema inmune de mucosas,
indica que la proliferacin y la predetermina-

308

Aspectos bsicos de la inmunidad

UE

*
IgA

Fig. 17-2. C am ino intracelular .seguido po r el pIgR (vase explicacin en el texto) (A daptada de K. E. M ostov, Annu.
Rev. Im m unol., 12:63, 1994).

cin a la produccin de IgA se realiza en los

cmulos linfoides de los tejidos linfoides aso
ciados a intestino (TLAI) y de los tejidos lin
foides asociados a bronquios (TLAB).
Los precursores de las clulas plasm ticas
productoras de IgA son hallados, en su primer
estadio, en las placas de Peyer, como linfocitos
B provenientes de la mdula sea. Es all donde
estos precursores se encuentran con los antge
nos, que entran desde el intestino a travs de c
lulas epiteliales especializadas, y donde inician
su sntesis de ADN y expresan IgA
pudien
do, en un segundo estadio, migrar a los ganglios
mesentricos (va linfticos aferentes). En estos
ganglios proliferan y maduran, transformndose
en clulas blsticas que contienen IgA (a^.;,) y, a
continuacin, va linfticos eferentes, dejan los
ganglios y migran al intestino delgado. Estos
blastos son transportados desde los ganglios mesentricos por los linfticos eferentes y la linfa
del conducto torcico en el torrente sanguneo,
emergiendo as en las distintas mucosas.
Este proceso completo mediante el cual las
clulas B, que se originaron en las placas de
Peyer, vuelven a la lmina propia del intestino

como plasmablastos que contienen IgA, es lo

que se ha llam ado ciclo celular de la Ig A
(fig. 17-3). En el intestino delgado o en otras
mucosas siguen proliferando y maduran com
pletamente encontrndose clulas plasmticas
productoras de IgA. Un ciclo similar es segui
do, aparentem ente, por los linfocitos B del
TLAB en su migracin a los sitios de mucosas
del tracto respiratorio. Existe evidencia de que
muchas de las clulas plasmticas de clase IgA
encontradas en el sistema murino provienen de
linfocitos B precursores procesados en la cavi
dad peritoneal. Por consiguiente, existen dos l
neas de clulas B que contienen a la poblacin
de clulas plasmticas sintetizadoras de IgA en
el intestino.
GENESIS Y MANTENIMIENTO
DEL CICLO CELULAR DE LA IgA
Se han postulado dos hiptesis principales
para la gnesis y mantenimiento del ciclo celu
lar de la IgA. Ambas consideran que la prede
terminacin a la produccin de IgA no contro-

El sistema inmune de mucosas

F ig . 17-3. M odelo de la
circulacin de inm unocitos de clase IgA al intes
tino, glndula m am aria y
otro.s s itio s d e m u c o sa .
Los linfocitos que se ori
ginan en las placas de Peyer m igran a los ganglios
m e s e n t ric o s , d o n d e se
d iv id e n y d if e r e n c ia n .
E llos d ejan los gan g lio s
m esentricos por el co n
d u c to to r c ic o y p o r el
torrente sanguneo circu
lan hacia su destino final:
lm ina propia del intesti
no delgado.

Conducto torcico

Ja, por s sola, la migracin de las clulas B a

las mucosas. Esta suposicin toma sustento en
las siguientes observaciones: 1) los blastos T
migran al igual que los blastos B, 2) la migra
cin no es inhibida por la inyeccin por va en
dovenosa de IgA monomrica o dimrica o por
antisuero anti-com ponente secretorio; y 3) la
lmina propia de individuos deficientes en IgA
est poblada de clulas plasmticas que produ
cen otros isotipos. Las dos hiptesis asum en
que la migracin es antgeno independiente, y
en ambas se incluye la necesidad de la presen
cia de clulas T especiales capaces de ayudar a
la produccin de IgA.
En la primera hiptesis el ciclo est controla
do principalmente por mecanismos instructivos
(fig. 17-4). Las clulas B de la circulacin ex
presan receptores especficos para las paredes
altas del endotelio de las vnulas y llegan a las
placas de Peyer o a los ndulos de los TLAM
(tejidos linfoides asociados a mucosas) donde
reciben una o ambas de las dos clases de ins
truccin. Una instruccin, que proviene de una
clu la T (c lu la T co n m u tad o ra o c lu las
switch) regula la conmutacin o switch de
los linfocitos que expresan IgM
a linfoci
tos que expresan IgA (a^^j). La otra instruccin,
que podra provenir del estroma de las placas
de Peyer o de los ndulos de los TLAM, inicia
una secuencia de diferenciacin y proliferacin
que permite que los blastos lleguen a un esta
dio celular de maduracin en los ganglios m e
sentricos, transform ndose en plasmablastos
que migran a la lmina propia donde son rete
nidos para transformarse en clulas efectoras,
llamadas clulas plasmticas. En los ganglios
mesentricos, algunos blastos quedan como c

309

Glndula m am aria

lulas B de memoria que migran y recirculan a

travs de las paredes altas del endotelio de las
vnulas, de los ndulos o de las placas de Pe
yer, y son expuestas a las mismas influencias
inductoras y antgenos como los precursores
primarios. Esto provoca la expansin de la po
blacin de clulas B de clase IgA predeterm i
nada a las mucosas.
En la segunda hiptesis, el ciclo es controla
do principalmente por mecanismos selectivos
(fig. 17-5). Las subclases de clulas B en la
mdula sea (o hgado fetal) estn predeterm i
nadas a la extravasacin de la lm ina propia
del intestino. Cuando llegan al intestino por la
va sangunea se extravasan en la lmina propia
en mayor nmero que en las placas de Peyer e
inmediatamente entran en la linfa que drena en
los ganglios mesentricos. En stos, los blastos
precursores de IgA son impactados por el ant
geno que llega a la linfa proveniente de las pla
cas de Peyer y a continuacin se produce, por
accin conjunta del antgeno y de clulas T, la
expansin de clones celulares predeterminados
a extravasarse en la lmina propia. Las clulas
que salen de los ganglios mesentricos consti
tuyen una poblacin mixta de plasmablastos y
clulas de memoria. Cuando llegan a la lmina
propia, los plasmablastos se extravasan y que
dan retenidos all porque se convierten en clu
las plasmticas productoras de IgA. La capaci
dad migratoria declina por haberse transforma
do en clulas maduras que han alcanzado su di
ferenciacin terminal. Las clulas B de memo
ria recirculan a travs de varios tejidos linfoi
des, pero parece que encuentran el antgeno pa
ra el que ellas son especficas en los tejidos lin
foides asociados al intestino, que estn consti-

310

Aspectos bsicos de la Inmunidad

Las clulas B en la placas

de Peyer reciben dos
instrucciones: 1) Conmutacin
a IgA. 2) Predeterminacin de
dirigirse a las mucosas como
plasmoblastos

Clulas
de memoria

(5)
(4 )
Plasmablasto

Otras mucosas y
glndulas exocrinas

Ciclo celular
de ia IgA

Clulas B provenientes
de la circulacin llegan a
las placas de Peyer por
seleccin de las vnulas
de las paredes altas del
endotelio

Proliferacin y diferenciacin
ocurre en los ganglios
mesentricos
Fig. 17-4. M odelo hipottico para el control de las m ucosas m ediante el m ecanism o instructivo.

tuidos por las placas de Peyer y los ganglios

mesentricos. Adems, la expansin de los clo
nes por el antgeno acoplado, con la ayuda de
clulas T especficas por IgA, resulta en el pre

dominio, en los tejidos linfoides asociados a las

mucosas, de clones que estn predeterminados
para la produccin de IgA y tienen la habilidad
de ir a las mucosas.

Clulas T colaboradoras
especficas de IgA en las
placas de Peyer o en
ndulo de TLAM

Inmunizacin de las
clulas B predeterminadas
ocurre en los ganglios
mesentricos; la respuesta
secundaria ocurre aqu
o en las placas dePeyer
Fig. 17-5. M odelo hipottico del control de la m igracin a las m ucosas por m ecanism os selectivos.

El sistema Inmune de mucosas

Las dos hiptesis pueden combinarse de va
rias maneras. Por ejemplo, un mecanismo ins
tructivo que controle la conmutacin de IgA
puede ser acoplado con un mecanismo selectivo
para la expansin de las poblaciones celulares B
que tienen la capacidad de ir a las mucosas.
Debemos hacer hincapi en que solamente
aquellas clulas de memoria, que expresan re
ceptores para unirse a las paredes altas del en
dotelio de las vnulas (especficas de cada m u
cosa), recircularn a travs de los ndulos de
los TLAM.
Tanto los linfocitos efectores como los de
memoria provenientes, por ejemplo, de placas
de Peyer, que es un tejido linfoide secundario,
en respuesta al antgeno: a) migran en forma
efectiva a los tejidos linfoides terciarios (piel,
lmina propia del intestino, etc.) que estn in
flam ados; b) la diferenciacin a la subclase
clulas de memoria est acompaada por el
desarrollo de especificidad de migracin (a la
piel o a las mucosas). La unin del linfocito al
endotelio es necesaria para el proceso de extra
vasacin.
T E JID O S L IN FO ID E S ASOCIADOS
A LAS MUCOSAS
Las estructuras linfoid es de las m ucosas
exi.sten en los tejidos de los mamferos, ya sea
com o agregados o com o folculos aislad o s
(ganglios linfoides aislados). En el intestino
delgado, estos folculos se hallan diseminados,
siendo ms prominentes en el colon. Los teji
dos linfoides asociados al intestino (TLAI), los
tejidos linfoides asociados a los bronquios
(TLAB) y los folculos solitarios tienen linfoepitelio y elulas B y T que sufren una divisin
y recambio rpido. Se cree que tambin existen
m acrfagos y clulas dendrticas, p rin cip al
mente en los centros germinales. Los macrfa
gos se encuentran, adems, en la lmina propia,
fuera del tejido linfoide organizado.

311

transportar antgenos y cuya verdadera funcin

no ha sido an determinada.
Por otra parte se ha demostrado que:
1) Mujeres embarazadas que haban ingerido
Escherchia coli no patgeno, posean en la le
che clulas productoras de IgA con actividad
anticuerpo especfico contra E. coli.
2) Blastos de ganglios mesentricos m igra
ban a la glndula m am aria (lactante) p o r un
mecanismo que est bajo control hormonal.
Adems, blastos del ganglios mesentrico se
localizan en forma selectiva en la mucosa bron
quial y cervical, sintetizando predom inante
mente IgA. La localizacin cervical depende
del estado hormonal del individuo, siendo ma
yor durante el proestro.
Otro tejido linfoide asociado a mucosa es el
TLAN (tejido linfoide asociado a la nasofaringe). El TLAN se diferencia del TLAB y del
TLAI, y es el principal tejido linfoide del tracto
respiratorio alto (vase cuadro 17-1); se desa
rrolla antes que el TLAB. El TLAN tiene gran
cantidad de clulas T, a diferencia del TLA I
(placas de Peyer) que contiene gran cantidad de
clulas B que expresan IgA. Existe separacin
entre la respuesta inmune sistmica y la secreto
ria de mucosas en el tracto respiratorio alto. La
naturaleza del antgeno que llega a la mucosa
nasal y a los TLAN y la va de entrada determ i
nan el tipo de respuesta. Los antgenos solubles
penetran todo el epitelio nasal y llegan a los
ganglios cervicales superficiales, induciendo as
una respuesta inmune sistmica o estableciendo
tolerancia. Los antgenos particulados son re
movidos de la mucosa nasal, tomados p o r las
clulas M (M cells) y llegan a los TLAN slo
luego de exposiciones repetidas al antgeno y/o
cuando el aparato ciliar est afectado. (Estas
condiciones antignicas las presentan los pat
genos viables que son capaces de replicarse.)

E L SISTEM A IN M U N E COM UN
A TODAS LAS MUCOSAS

FACTORES QUE PUEDEN AFECTAR LA

LOCALIZACIN EN LAS MUCOSAS DE
LOS LINFOBLASTOS PRODUCTORES
DE IgA

Esta denominacin proviene de las similitu

des morfolgicas y funcionales encontradas en
el TLAI y TLAB, N um erosos experim entos
han demostrado que las clulas provenientes de
TLAB son capaces de repoblar el intestino, el
bazo y los pulmones con linfocitos productores
de IgA; linfocitos provenientes del TLAI pue
den repoblar no slo el intestino, sino tambin
jos bronquios. Asociadas al epitelio existen las
clulas M, tambin llamadas FAE (follicule
associated ep iteliu m ), con capacidad p ara

La localizacin en las mucosas de los linfoblastos productores de IgA puede estar afecta
da por diferentes factores, entre los que cabe
destacar ciertas caractersticas de los linfocitos
y de la vasculatura (cuadro 17-2). No se h a en
contrado que esta localizacin pueda ser afecta
da por un solo factor. Por ejemplo, la remocin
de todas las placas de Peyer del, intestino de la
rata no impide que los blastos productores de
IgA, provenientes de los ganglios m esentri
cos, se localicen en el intestino. La acum ula

312

Aspectos bsicos de la inmunidad

C u ad ro 17-1. Caractersticas de los PP, TLAN y TLAB en ratas no tratadas (Wistar)

PP

TLA N

TLAB

O NTO G ENIA
Presencia de tejido

A ntes del nacim iento

A l nacim iento

I^infocitos 1*

B (IgA )

Al da 4 despus del
nacim iento
B

A reas B y T definidas

Al da 10 despus del n a
cim iento

Al da 10 despus del nacim iento

> 21 das despus del

nacim iento

TEJID O AD U LTO
C entros germ inales

++

-H- Lewis

+ Lew is, BN
PVG

ND

Linfocitos intraepiteliales

++

++

reas T/B

T<B
T<B

T =B
T<B Lewis

ND

R elacin T:B

0,2
0,2 Lewis

0,9
0,7 Lewis

0,7
ND

Relacin CD 4:CD 8

5,0
6,6 Lewis

2,4
5,1 Lew is

2,6
ND

C lulas B IgAm

-H-

M acrfagos

+ Lew is

++ Lewis

ND

Clulas linfoides que llegan a

PP 0 TLAN

+ Lewis

++ Lew is

ND

A dhesin de linfocitos a las

H EV en PP o TLA N

+ Lew is

-H- Lew is

ND

A SP E C T O S FU N C IO N ALES
M igracin de PP o clulas lin
foides de TL A N en rganos
linfoides

cin de clulas productoras de IgA en estos si

tios especializados se explicara por la accin
de varios factores. El medio que rodea a las
mucosas es rico en antgenos m icrobianos y
mitgenos, influyendo de esta forma la inmunoespecificidad de los linfocitos en las muco
sas. La superposicin de estimulacin antigni
ca crnica a la modulacin que realizan las c
lulas T vecinas producira la predeterminacin
de las clulas B a la sntesis de IgA. Tambin
se ha estudiado y demostrado la regulacin de
la produccin de IgA por las clulas T. Se han
aislado clones de clulas T de las placas de Pe
yer en los ratones. Estos clones actan sobre
las clulas B, estim uladas por lipopolisacri
dos, que expresan IgM pero no IgA. Las clu
las B se diferencian y com ienzan a expresar
IgA, convirtindose en precursores directos de
las clulas productoras de IgA. Estas clulas T
se llaman clulas T switch o conmutadoras.
Tambin se han descrito clulas T que ac
tan en un estadio ms tardo de la diferencia
cin. Estas clulas presentan receptores para la

regin Fe de la IgA (clulas Th). Estas clulas

Th, que actan sobre las clulas B que expre
san IgA, pueden inducir o suprimir la secrecin
de IgA. Estas clulas T envan seales para la
colaboracin o la supresin mediante la pro
duccin de factores solubles capaces de unirse
a la IgA.
Antgenos del medio ambiente o de la dieta
pueden influir en la localizacin, tanto en el
tramo intestinal como en el respiratorio, de c
lulas productoras de IgA. Se ha dem ostrado
que azcares simples inhiben in vivo varias ac
tividades de los linfocitos. Tambin, que la de
ficiencia de vitamina A causa una migracin y
localizacin defectuosa de los blastos de clase
IgA provenientes de la mucosa y que factores
que se encuentran tanto en el calostro como en
la leche pueden influir en la diferenciacin ce
lular de la IgA o suprimir la capacidad de los
recin nacidos para montar una respuesta in
mune de clase IgE.
Adems se ha establecido que la especifici
dad por determinado rgano, que existe en la

El sistema inmune de mucosas

313

C uadro 17-2. Factores que pueden afectar la localizacin de linfoblastos productores de IgA
en las mucosas
C aractersticas ele los linfoblastos

IgA en la m em brana celular

C om ponente secretorio
R eceptores para antgeno
R eceptores para factores quim iotcticos
R eceptores para productos de clulas T colaboradoras
M acrfagos
D eficiencia de vitam ina A
G lucoprotenas de la m em brana celular
y de P, integrina

V ascularizacin
- R egulacin del flujo sanguneo
- Paredes altas del endotelio de las vnulas poscapilares
- Influencia horm onal

poblacin de linfocitos que es capaz de migrar,

est determinada por la interaccin selectiva de
los linfocitos circulantes con las clulas endo
teliales. Esta interaccin est mediada por re
ceptores de migracin en los linfocitos que se
unen a los ligandos endoteliales, que son m ol
culas de adhesin especficas. Se conoce que la
y la a^P integrinas participan en la unin
de los linfocitos a las paredes altas del endote
lio de las vnulas (HEV) en las placas de Peyer
que presentan MAdCAM-1 (mucosal vascular
addresin cell adhesin m olecule-l). La expre
sin de M A dCAM -1 ocurre tam bin en las
HEV de los ganglios mesentricos y en las v
nulas de la lmina propia, siendo su ligando la
a^P^ integrina. Funcionalmente, MAdCAM-1
est relacionada con la migracin selectiva a
tejidos de mucosa. Trabajos recientes han de
mostrado la existencia de una
integrina
(llam ada an tgeno de lin fo c ito de m u co sa,
ALM o MEA por su expresin selectiva en las
clulas T asociadas a mucosas) en intestino y
pulm ones, que m edia la unin a un ligando
existente sobre las clulas epiteliales de las m u
cosas, contribuyendo a la retencin de las clu
las T asociadas a mucosas en esos sitios. Este
ligando ha sido recientemente caracterizado y
se lo denomina E-cadherina.
Resumiendo, los estudios de migracin in vi
vo e in vitro demuestran que las clulas B pre
sentan preferencia por las venas poscapilares
del endotelio. Las clulas endoteliales de los
tejidos linfoides de mucosas, as como perifri
cos, expresan determinantes especficos o fac
tores que median el reconocimiento de los lin
focitos. Por consiguiente, los modelos de mi
gracin linfocitaria estn programados, en m u
chos casos, por los receptores de Ja superficie
de linfocitos, que son complementarios de di
chos determinantes endoteliales que, a su vez

son especficos de rgano. Se ha discutido la

probabilidad de que la induccin de receptores
de migracin rgano especficos probablemen
te sea un factor im portante en la distribucin
restringida a ciertos tejidos de subpoblaciones
linfocitarias, responsables de las caractersticas
tnicas de las respuestas inmunes que ocurren
en la periferia y en las mucosas.
C ELU LA S T EN LAS MUCOSAS
Las clulas del sistema inmune que se locali
zan en las mucosas no son solamente las deriva
das de] linfocito B, productoras de anticuerpos.
La presencia de linfocitos T as como su proce
dencia y distribucin han sido demostradas.
Los inm unoblastos T provenientes de gan
glios mesentricos y del conducto torcico se
localizan en la lmina propia del intestino y de
las vellosidades epiteliales. Esto se ha observa
do no slo en el intestino delgado normal, sino
tambin en isoinjertos del intestino fetal ubica
do bajo la cpsula del rin. En contraste, los
blastos T provenientes de ganglios perifricos
slo han sido detectados en los intestinos infec
tados e inflamados por la Trichinella spiralis;
por consiguiente, normalmente no migran a la
lmina propia del intestino.
Clulas T se encuentran presentes en el c a -,
lostro y la leche. Estudios realizados en ratas
dem uestran que las clulas T halladas en la
glndula mamaria provienen tanto de tejidos
linfoides intestinales como de tejidos linfoides
perifricos. Adems, dado que se encontr que
en la glndula mamaria de la rata se acumulan
linfocitos B que contienen IgA y linfocitos T
cuyo fenotipo principal corresponde al asigna
do a las clulas T colaboradoras (W3/25'^), se
sugiri que estas clulas T regulan la diferen

314

Aspectos bsicos de la Inmunidad

ciacin de las clulas B dentro de la glndula

mamaria. Se ha dem ostrado en la leche que
puede haber transmisin de resistencia a tum o
res durante el perodo de lactancia. Si este he
cho se debe o no a la transferencia de clulas T
no est totalmente demostrado, pero se conoce
que en los humanos la reaccin de hipersensi
bilidad retardada puede transferirse al recin
nacido durante la lactancia.
Finalmente recordaremos la existencia de los
linfocitos intraepiteliales, que en su gran mayo
ra son linfocitos T que presentan el fenotipo
supresor/citotxico. Esto ocurre tanto en los
animales como en el hombre. La lmina propia
humana contiene clulas T que presentan prin
cipalm ente el fenotipo colaborador/inductor.
Una caracterstica nica de la poblacin celular
T del intestino delgado es el gran porcentaje de
clulas que tienen grnulos citoplasm ticos
metacromticos que contienen histamina. Por
consiguiente, estos grnulos se asemejan a los
grnulos de los mastocitos. Evidencia experi
mental sugiere que la clula T granulada del in
testino puede ser una clula de transicin pro
veniente de una lnea celular especial para la
cual el estadio de diferenciacin terminal es un
mastocito.
Otros investigadores sugieren, como alterna
tiva, que la clula T del intestino induce a que
otro tipo celular se diferencie a mastocito de
mucosas. Los m astocitos de las m ucosas no
son idnticos a los clsicos mastocitos, como
los aislados de la cavidad peritoneal, puesto
que presentan caractersticas morfolgicas, bio
qumicas y farmacolgicas que son distintas de
las de stos.
Las clulas T del intestino, como todas las
clulas T, provienen de clulas precursoras del
timo. Las clulas precursoras ms inmediatas
son estimuladas por antgenos y mitgenos en
los tejidos linfoides organizados asociados con
el intestino, como lo son las placas de Peyer. A
medida que los precursores se diferencian, migran va los ganglios mesentricos drenantes,
conducto torcico y torrente sanguneo y retor
nan eventualmente a la pared intestinal, tanto a
la lmina propia como al epitelio. El ciclo es
anlogo al camino de diferenciacin de los pre
cursores de las clulas plasmticas que sinteti
zan IgA, que tambin son estimulados en las
placas de Peyer. El nmero de hnfocitos intraepitehales depende de la estimulacin antigni
ca; el mecanismo de migracin a la mucosa in
testina] no. Las clulas intraepiteliales proba
blemente no entran en gran nmero en el lu
men del intestino.
Las propiedades funcionales de las clulas T
del intestino indican que son capaces de mediar
reacciones de citotoxicidad en ciertas condicio
nes. Los tipos de reacciones para los que existe

evidencia experimental son; citotoxicidad celu

lar inducida por mitgeno, actividad natural
killer y citotoxicidad celular anticuerpo de
pendiente.
La funcionalidad de los linfocitos intraepite
liales (LIE) no est bien definida, y la comple
jidad de los fenotipos que definen esta pojlacin Iinfocitaria hace pensar que el epitelio in
testinal constituye un compartimento linfoide
nico y distinto dentro del organismo.
Trabajos recientes indican que el epitelio in
testinal es un rgano linfopoytico T primario
y, por consiguiente, esto confirma en parte el
origen timoindependiente de los LIE. Mientras
el epitelio tmico y el intestinal derivan del endodermo, la maduracin funcional, es decir, la
capacidad linfopoytica de clulas T no se pro
duce al mismo tiempo. Los LIE, en los ratones
y en las ratas, aparecen recin a las 4 semanas
despus del parto y su cintica de aparicin es
independiente del antgeno del medio y depen
de slo del estadio de desarrollo del intestino.
Las primeras clulas T que aparecen en el epi
telio intestinal de ratones singeneicos expresan
el receptor T (y/5) (Rec T I) y conmutan a LIE
que expresan el receptor T (a/p) (Rec T2). El
nmero de LIE que expresan RecT (oc/P) est
directamente relacionado con la edad del ani
mal y con la dieta. La m ayora de los LIE
RecT (y/5)+ expresa CD8 constituido por un
homodmero de cadenas a y no expresa cade
nas p de esta molcula. Los LIE RecT (a/P)*
expresan en su gran mayora cadenas a y p de
CD8. Existen distintas poblaciones de clulas T
RecT (y/5)+ que se definen por su localizacin
especfica en ciertos tejidos y por la expresin
de regiones variables (V) especficas de los ge
nes que codifican el RecT (y/5).
CLULAS RecT (Vy7+)
El gen que codifica el RecT (Vy7+) est fun
cionalm ente reacom odado y expresado en el
hgado fetal al da 11 de la gestacin, es decir
antes de migrar al timo, y se expresa en el timo
en gran cantidad en otros tiempo de su desarro
llo. Las clulas que expresan este gen se en
cuentran principalmente en el intestino y en el
hgado, y tienen la capacidad de desarrollarse
extratm icam ente puesto que los transcriptos
Vy? son encontrados en el intestino de los rato
nes desnudos (nude mice).
FUNCIONALIDAD DE LAS CLULAS T
O RIGIN AD A S EN E L IN T ESTIN O
Las clulas T RecT (y/5)"' provenientes del
intestino ejecutan su funcin in situ y probable

El sistema inmune de mucosas

mente tambin lo liacen los LIE RecT (a /p )^.
Los LIE maduros CD4+ son capaces de funcio
nar como clulas T colaboradoras en el proceso
de activacin de las clulas B y de su diferen
ciacin, mientras que los LIE CD8 (a+p") son
menos eficientes en esta capacidad. Los LIE
son capaces de producir citoquinas tales como
IL-5 e INF-y [LIE CD4+ y CD8+; y parece ser
que tanto los RecT (a /p )+ como los (y/5)+ estn
involucrados]. A dem s, ciertos estudios d e
muestran que los LIE RecT (a/p)^ y (y/5)+ que
expresan Thyl (ThyL) producen 10 veces ms
cantidad de lL-2, IL-3 e I,NE-y que los que no
los expresan (Thyl -).
Dada la excepcional y singular funcin de
los TLAI, como es promover y sostener la pro
duccin de grandes cantidades de IgA que es
secretada en la luz intestinal, sera interesante
pensar que las clulas T derivadas del intestino
contribuyen a este proceso. Al menos se puede
suponer que los LIE RecT (a/P )^ que emigran
a la lm ina propia estn involucrados puesto
que ah estn las clulas B.
Por consiguiente, se considera que el epitelio
intestinal es un rgano linfoide primario y que
el sistema inmune asociado a mucosas aparece
primero en el timo, debido a la carga antignica
a que este sitio est sometido.
CAM INO H E PA T O B IL IA R DE LA IgA
El hepatocito presenta receptores que asegu
ran el transporte de la IgA de la sangre a la bi
lis. Se ha demostrado, en ratn y en rata, que el
hgado interviene en el transporte activo de
grandes cantidades de IgA polmero desde el
plasma a la bilis. Cuando se inyect por va en
dovenosa la IgA polmero, se observ que sta
era removida rpidamente de la circulacin y
transportada a la bilis, como IgA unida al com
ponente secretorio. Si se realizaba la obstruc
cin del conducto biliar se obtena un aumento
rpido y selectivo en suero, tanto de com po
nente secretorio com o de la IgA p olm ero.
Adems, se demostr que los hepatocitos de la
rata sintetizan y expresan en su membrana el
com ponente secretorio. Por consiguiente, la
unin de la IgA polmero al componente secre
torio del hepatocito facilita el transporte activo
a travs de ste.
Este transporte activo ocurre en conejos, po
lios, ovejas, pero no puede ser generalizado a
todas las especies animales. En los humanos,
slo el 2% de una dosis de IgA polimrica se
encuentra en la bilis a las 3 horas de inyectada.
Este escaso transporte de la IgA polimrica del
plasma a la bilis podra estar relacionado con la
incapacidad de detectar componente secretorio
en los hepatocitos hum anos, aunque s se lo

315

puede detectar en las clulas del conducto bi

liar.
El aumento de IgA y componente secretorio
en plasma humano visto en el curso de distintas
enferm edades hepticas se debera a un gran
aumento de factores que incluyen:
1. Hallazgo de una mucosa anormal que sin
tetiza mayor cantidad de IgA.
2. Disminucin de la integridad de la m uco
sa intestinal que provoca el influjo de la IgA en
la circulacin.
3. Elim inacin alterada de la IgA, d e los
com plejos inm unes que contienen IgA y del
antgeno libre en el hgado.
Por consiguiente, se considera que to d a la
IgA de las secreciones proviene de sntesis lo
cal, con una contribucin mnima de la sangre.
La ventaja de este mecanismo se refleja en el
nivel de secrecin que as puede ser regulado
localmente para responder a las necesidades fi
siolgicas, puesto que vara en los distintos pe
rodos del ciclo estrual o cuando existe infec-

U TILID A D DE LA PR O D U C C IO N D E IgA
S E C R E T O R IA P O R IN M U N IZ A C I N
POR VIA ORAL Y SU APLICACIN EN
LA PROTECCIN ESPECFICA DE LAS
SUPERFICIES DE LAS MUCOSAS
Se ha demostrado que la inm unizacin por
va oral y bronquial conduce a la secrecin se
lectiva del anticuerpo de la clase IgA en las
gln d u las m am arias, sin evidencias d e que
exista anticuerpo de clase IgA en la secrecin.
En form a experimental pudo confirmarse que
esto se debe a la migracin de clulas que sin
tetizan IgA con actividad anticuerpo especfica,
desde el intestno y/o pulmn a ia glndula ma
maria.
La existencia de memoria en el sistem a in
munolgico secretorio se ha puesto en eviden
cia, al determinarse que este sistema es capaz
de montar una respuesta inmune rpida secun
daria a la administracin local del antgeno.
En el humano, una sola inoculacin subcut
nea con vacuna colrica puede inducir anticuer-.
pos especficos de la clase IgA en leche, saliva
y otras secreciones. Se supone que e sta res
puesta se debe a la previa sensibilizacin por
exposicin natural a la bacteria.
El concepto de un sistema inmune com n de
mucosas, en el que varios sitios de mucosas es
tn integrados a travs de los movimientos de
las clulas o de anticuerpos, provee un princi
pio sobre el que se pueden establecer estudios
para la proteccin de un sitio de mucosa por in

316

Aspectos bsicos de la inmunidad

munizacin de otro. La vacunacin oral con vi

rus herpes simple tipo I aument la proteccin
contra la infeccin intravaginal con virus her
pes simple tipo n, presumiblemente por reac
cin cruzada entre estos dos serotipos.
Adems, experim entos realizados en doce
nios con doble colecistotoma demuestra que,
si se los inmuniza en el segmento colnico dis
tal con vacuna de polio viva, se detectan anti
cuerpos especficos de la clase IgA en el seg
mento local del colon infectado, pero no en el
otro segmento del colon o en los lavados nasa
les. Una vez cerrada la colecistotoma, la vacu
na polio fue administrada por va oral a tres ni
os. Una respuesta significativa de clase IgA
ocurri en la nasofaringe. La respuesta de estos
tres nios da soporte al concepto de un sistema
comn de defensa a nivel de mucosas, pues el
anticuerpo nasal apareci luego de la adminis
tracin por va oral del virus polio.
No debemos olvidar la existencia de la induc
cin de tolerancia por la administracin de ant
geno por va oral, que est influida por una va
riedad de factores que incluyen la dosis de ant
geno, la frecuencia de la administracin y la
distancia en el tiempo entre la administracin
del antgeno por va oral y la siguiente inmuni
zacin. En esta induccin de tolerancia intervie

nen clulas T supresoras antgeno especficas'

que deprimen la habilidad de los linfocitos de
proliferar como respuesta al antgeno. La activi
dad supresora concomitante que se genera du
rante el proceso de inmunizacin cohabita en un
delicado equilibrio que favorece la inmunidad.
Este fenmeno de tolerancia oral puede ser
utilizado para la administracin de autoantge
nos por va oral en el tratamiento de enfermeda
des autoinmunes rgano especficas. La dosis es
muy importante para la estimulacin del compo
nente de supresin activa de la tolerancia oral.
La identificacin de las clulas regulatorias
en los humanos, luego de que se ha realizado la
tolerizacin por va oral, es crtica para la de
mostracin de los efectos inmunolgicos de la
tolerizacin oral.
M O D E L O PR O B A BLE PARA
EL SISTEM A INMUNE DE CLASE IgA
En este modelo, que experimentalmente se
representa en la figura 17-6, se intenta estable
cer la relacin entre la respuesta srica de la
clase IgA y la correspondiente a nivel de las
mucosas (intestinal y bronquial) mediada por
IgA secretoria.
/

Neocolonizacin bacteriana

'S!t( A

v P M iy

Reintroduccin

Parenteral

Suero
B Cl
V >

IgM
IgA

'X / / / I n m u n o c i t o )
de m emorial
riai

Fagocitosis

-IgM

Ig A --

"Feedb ack"

negativo mediado
por IgG sobre
la produccin
de IgA mediante
bloqueo de la
unin a las placas
de Peyer

\
Entera!
IgAs

VA
Precursor

Cl.plasm tica Espacio

linfoide que contiene subepitelial
distal y expresa IgA
epneiiai

Intestoo luz
^

Eliminacin inmune (
por cross H nkin^ que '
impide colonizacin

Restriccin
al muous

- Mucosa
secretoria distal

Respuesta de Ig
tiempo ^

Induccin

Pasaje a periferia

Secretoria

Diversificacin
y amplificacin

Senescencia

Eliminacin

Fig. 17-6. S istem a inm une de clase IgA en ei que se presenta la relacin entre respuesta srica de clase IgA y respuesta a
nivel de m ucosas m ediada por IgA secretoria (IgAS).

E l sistema Inmune de mucosas

Se conoce por experimentos realizados con
una cepa de Escherchia coli que la bacteria se
une primero a las placas de Peyer, y esta unin
ocurre antes de que se una a las vellosidades
del epitelio. Por consiguiente, al unirse la bac
teria a las placas de Peyer se inducen los pre
cursores de las clulas elaboradoras de IgA antgeno-especficas. La IgA es producida antes
del probable trnsito de la bacteria a travs de
las vellosidades epiteliales, y es en ese lapso
que los precursores de las clulas plasmticas
que sintetizan IgA han migrado a los distintos
sitios de mucosa armando al husped contra la
bacteria presentadora de este antgeno.
Mientras tanto, la bacteria que ha entrado en
los canales linfticos o en la circulacin va a
ser opsonizada inmediatamente por la IgA, pre
vinindose as la activacin del complemento y
facilitando su toma por los monocitos y macr
fagos, particularmente las clulas de Kupffer.
El exceso de IgA es removido por las clulas
hepticas a travs de la ruta hepatobiliar descri
ta, mientras que la IgM permanecer constante
o aumentar discretamente como un resultado
del procedimiento inmunolgico de la bacteria
fagocitada.

317

En ausencia de una nueva estimulacin, las

clulas plasmticas productoras de IgA morirn
y los niveles de IgA e IgM srica declinarn,
dejando espacio para los productores de los
clones de inmunocitos estimulados con poste
rioridad.
Alternativamente, si el mismo antgeno fue
se presentado a las superficies de las mucosas
habr una respuesta breve de IgA secretoria; en
tanto que, si fuese inoculado por va parenteral,
se producir IgM y luego IgG, por la influencia
de los macrfagos activados. La IgG suprimira
el bloqueo de IgA, opsonizara la bacteria para
su depuracin o clearance por los polimorfo
nucleares y suprimira la induccin de IgA a
nivel del intestino por competicin con el ant
geno dentro del lumen. Esta secuencia de he
chos tendra lugar para cada presentacin ent
rica de un nuevo antgeno, ocurriendo al mis
mo tiempo la estimulacin del TLAB. De esta
manera, los tejidos linforreticulares asociados
del intestino y bronquios actuarn como centi
nelas, haciendo el muestreo de los antgenos
del m edio am biente encontrados en la dieta
diaria y en el aire que respiramos, respectiva
mente.

SEGUNDA PARTE

Regulacin neuroendocrina
de la inmunidad de mocosas:
un sistema interactivo-adaptativo
MARA ESTELA ROUX
LILIANA GRACIELA VAUTHAY

GENERALIDADES
El medio ambiente como fuente
de estmulos. Homeostasis y adaptacin
Los organismos superiores se comportan co
mo sistemas abiertos. Esto implica que inter
cambian perm anentem ente materia, energa e
informacin con su entorno. Por su parte, el
medio ambiente externo constituye una rica
fuente de estmulos, que incluye circunstancias
estresantes.
Nuestro medio interno tambin genera est
mulos. Su sensibilidad a la realidad le permite

percibir cambios del mundo psicofisicosocial

en el cual el in d iv id u o v iv e y al q u e debe
adaptarse.
El xito de adaptacin individual frente a es
tmulos medioambientales est determinado en
gran parte, tanto por las interacciones entre los
componentes de un mismo sistema, com o tam
bin por la interrelacin entre sistemas corpo
rales. Resulta interesante destacar que las pro
piedades que surgen de un orden de sistemas
complejos interrelacionados e interconectados
superan la suma de las caractersticas de sus
componentes en forma individual.
Los organismos superiores estn constitu-

318

Aspectos bsicos de a inm unidad

dos por sistemas que tienen capacidad natural

para la interaccin funcional modulando res
puestas biolgicas de manera integrada. Esta
interaccin entre sistemas adaptativos es funda
mental para la superviviencia y convivencia del
individuo con el medio externo.
El interjuego entre estmulos y condiciones
del individuo (genticas, biolgicas, psicosocioculturales) da lugar a modificaciones del es
tado salud-enfermedad. Los estmulos cognitivos (psquicos, sensoriales, em ociones), no
cognitivos (virus, bacterias, hongos, parsitos,
LPS, clulas tumorales) y el comportamiento
pueden mantener o reestablecer la homeostasis
con respecto a una variedad de estados de salud
y enfermedad (fig. 17-7).
En condiciones fisiolgicas los mecanismos
hom eostticos, pueden d iferir cu alita tiv a y
cuantitativam ente de aquellos que operan en
condiciones patolgicas. En el curso de estos
estados, la regulacin de variables biolgicas
sufre ajustes en diferentes niveles. Cuando di
chos ajustes son apropiados, pueden resultar
beneficiosos para el husped; de lo contrario
generan o agravan el curso de la enfermedad.

La respuesta inmune como mecanismo

homeosttico
Las molculas normalmente presentes sobre
las membranas celulares y en los fluidos corpo
rales, pueden ser consideradas como marcado
res biolgicos de la constancia e integridad de
las clulas y los tejidos (homeostasis). El siste
ma inmune, debido a su capacidad de discrimi
nar entre antgenos que estn siempre presentes
y aquellos que no lo estn (lo propio y lo no
propio), y lo propio modificado, percibe una
imagen interna de los componentes moleculares
del cuerpo y reacciona a particulares distorsio
nes de dicha imagen. Modificaciones de los an
tgenos propios y/o la presencia de neoantge
nos implican alteraciones en los componentes
moleculares/celulares del organismo y por con
siguiente una perturbacin en la homeostasis.
En estas circunstancias la respuesta adaptativa
del sistema inmune es tender a eliminar esa per
turbacin. Esta propiedad permite ubicar a la
respuesta inmune en el contexto de los mecanis
mos homeostticos. En estas condiciones la ac
tivacin del sistema inmune constituye una res-

ESTMULOS COGNITIVOS
(Psquicos, emociones, sensoriales, etc.)

ESTIMULOS NO COGNITIVOS

(VIRUS, BACTERIAS, PARSITOS, ETC.)

F ig. 17-7. In teraccio

nes p o te n ciales en tre
e s tm u lo s m e d io a m
b ie n ta le s y s is te m a s
c o r p o r a le s a d a p ta ti
vos. N tese la org an i
zaci n co m p artim en talizada intrasistem a y
la integracin intersistem a a n iv el del m e
dio interno.

El sistema inmune de mucosas

319

Cuadro 17-3. Caractersticas comunes entre los sistemas homeostticos mayores

S IS T E M A S H O M E O S T T IC O S M AYO R E S. N E R V IO S - E N D O C R IN O - IN M U N E
- C ognitivos
C AR AC T E R IST IC A S C O M U N E S - PR O CESA R ESTM U LO S.
-- N o cognitivos
~
~
~
-

A U TO N O M A
D istribucin sistm ica
D iversidad celular y m olecular
Tolerancia
M emoria
M ecanismos: - arco reflejo
- retroalim entacin
- condicionam iento

FU N CIO NES. ^ A D A P T A C I N - REG U LA CIN - M O D U LA C I N - IN TEG R A C I N

H O M E O STASIS. - R E A C T IV A - PRED ICTIV A

puesta homoesttica reactiva, es decir, el est

mulo precede a la respuesta.
As, dependiendo deJ tipo de estmulo anti
gnico, pueden surgir mltiples combinaciones
posibles de productos derivados de subpobla
ciones de linfocitos y clulas accesorias activa
das. En este contexto, se puede concebir un c
digo basado sobre una combinacin de mensa
jeros solubles que reflejan el tipo de respuesta
inmune puesta en marcha.
Niveles de regulacin de la respuesta
inmune
El sistema inmune cuenta con numerosos y
eficientes mecanismos de autorregulacin cu
ya finalidad es m odular su propia respuesta.
Esta diversidad autorregulatoria confiere al sis
tema cierto grado de autonoma.
Una extensin desde el punto de vista inte
ractivo incluye la proposicin de que, como
ocurre con otros mecanismos homeostticos, la
respuesta inmune est bajo control neuroendocrino. Este nivel externo de regulacin re
presenta uno de los mecanismos de interrela
cin funcional entre sistemas, a travs de in
fluencias muitidireccionales donde m odifica
ciones en un sistema producen variaciones en
otros y viceversa.
Dentro de la organizacin jerrquica de las
funciones corporales los mecanismos de adap
tacin, expresin de la actividad de los siste
mas hom eostticos mayores, son esenciales
para la superviviencia del individuo.
Caractersticas de los sistemas
homeostticos mayores
Los sistemas nervioso, endocrino e inmune
comparten una serie de caractersticas. Una de
ellas es ia capacidad de recibir, discriminar, in

terpretar, responder y recordar formas espec

ficas de estmulos, originados en el medio am
biente interno y/o externo, desarrollando res
puestas adaptativas. E sta capacidad perm ite
catalogarlos com o sistem as h om eo st tico s
mayores. Su delicada percepcin frente a est
mulos, llega a tal punto que, cuando una m odi
fic a c i n del m e d io a m b ie n te se p ro d u c e
peridicam ente (tem peratura corporal, ritm os
hormonales, etc), el sistema prepara con antici
pacin los cambios fisiolgicos necesarios para
el estm ulo predecible (hom oestasis predictiva).
Para preservar la constancia e integridad del
medio ambiente interno, los sistemas homeostaticos mayores deben interactuar permanente
mente integrando sus actividades dentro de un
contexto dinmico donde el sinergismo, la re
dundancia regulatoria y la retroalim entacin
son mecanismos esenciales.
Las caractersticas comunes a estos sistemas
y sus implicancias funcionales se resumen en el
cuadro 17-3.
Fundamentos de interaccin entre
los Sistemas Homeostticos Mayores
Para establecer un nivel externo de inm uno
rregulacin es un prerrequisito la identificacin
de mecanism os responsables del perm anente
estado de integracin funcional entre los siste
mas homeostticos mayores concebidos como
un sistema interactivo.
Este marco conceptual condujo a que disci
plinas como la Inmunologa, la Endocrinologa
y la Neurologa, que surgieron y se desarrolla
ron en forma independiente, se integraran con
formando un nuevo campo multidiscipJinario:
Inm unoneuroendocrinologa. Al igual c]ue la
fase inicial de otros campos cientficos, esta
disciplina interactiva enfoca sus investigacio

320

Aspectos bsicos de la inmunidad

nes sobre la base de descripciones, observacio

nes y comparaciones.
A partir del anlisis bibliogrfico referido a
las interacciones inmunoneuroendocrinas, sur
gen ejemplos que pueden ser ordenados en tres
tipos de condiciones: 1) patolgicas, 2) experi
mentales, y 3) fisiolgicas.
En situaciones patolgicas se observ retar
do de la maduracin sexual en ratones con au
sencia congnita de timo. Pacientes diabticos
presentan una mayor susceptibilidad a infeccio
nes, con respuesta a mitgenos disminuida. La
administracin de insulina normaliza dicha res
puesta. Tambin se observ, en pacientes, en el
curso de procesos inflamatorios y sepsis, inhi
bicin de la secrecin de hormona tirotrfica y
gonadotrfica. Se detect que las endorfinas
participaran en la fisiopatologa del shock en
dotxico bacteriano. Esta observacin est ava
lada por el hecho de que la naloxona (b lo
queante de los receptores de las endorfinas)
anula los cambios fisiopatolgicos inducidos
por la administracin de endotoxina.
En condiciones experimentales surgen con
clusiones obtenidas a partir de: administracin
de dosis farmacolgicas de hormonas, neurotransmisores, citoquinas; extirpacin de gln
dulas endocrinas y rganos del sistema inmune,
procedim ientos que pueden ocasionar daos
funcionales temporarios y/o definitivos. Ejem
plos: la timectoma neonatal en ratones, lleva a
una alteracin profunda del sistema endocrino
a nivel hipofisario, adrenal y gonadal; la bursectoma en embriones de pollo de 62 horas
produjo subdesarrollo del oviducto, hipertrofia
de adrenales, aumento de testosterona y dismi
nucin de corticoides. La castracin en conejos
da por resultado un significativo incremento de
la masa tmica. La administracin de hormona
de crecimiento y prolctica reconstruye la in
munocompetencia celular en animales hipofisectomizados.
En condiciones fisiolgicas, pocos son los da
tos aportados por la literatura: diferencias en la
respuesta inmune durante el ciclo estral en rato
nes; modificaciones de la respuesta inmune du
rante la preez; inmunidad y dimorfismo sexual;
influencia del sexo en la incidencia de enferme
dades autoinmunes. Estas observaciones en con
diciones fisiolgicas, avalan el permanente esta
do de interaccin entre los sistemas homeostti
cos mayores. Estas mismas observaciones orien
taron la bsqueda de evidencias fenotpicas inte
ractivas en los niveles de organizacin. En este
contexto se describen a nivel funcional, cambios
en la actividad de clulas del sistema inmune
sincrnicos con las modificaciones hormonales
durante el ciclo estral y menstrual.
El sustrato interactivo a nivel estructural es
t representado por la inervacin y vasculariza

cin de los rganos del sistema inmune. El Sis

tema Nervioso Central (SNC) se relaciona a tra
vs de sus nervios perifricos con todos los r
ganos del sistema inmune. La deteccin de fi
bras nerviosas autonmicas en los rganos linf
ticos permite que por va aferente llegue infor
macin al SNC sobre el estado funcional de di
chos rganos. Por su parte, la va eferente cons
tituye una forma directa de influencia del SNC a
travs de productos neuroendocrinos. Estas mo
lculas tambin pueden llegar a los rganos del
Sistema Inmune a travs de la circulacin.
El intercambio de informacin y por consi
guiente la posibilidad de interaccin con el me
dio ambiente implica, a nivel celular, la capa
cidad de recibir (receptores) y emitir (molcu
las difusibles) seales.
Los aspectos meeanicistas que fundamentan
la capacidad natural de interaccin entre siste
mas adaptativos tiene su mxima expresin en
el nivel de organizacin molecular. El perm a
nente intercambio de informacin entre estos
sistemas se debe a que tienen receptores y m o
lculas difusibles comunes. Es decir, las clu
las del sistema inmune tienen receptores para
productos neuroendocrinos y, adems, pueden
sintetizarlos. A su vez, el sistema nervioso pue
de sintetizar y tiene receptores para citoquinas.
Esta reciprocidad molecular perm ite un nivel
externo de regulacin de la magnitud de la res
puesta inmune. Por su parte, el sistema inmune,
por su capacidad de producir sustancias neuroendocrinas, tambin participa en el control de
ajustes n eu ro en d o crin o s y m etab lico s del
husped durante el curso de procesos inflama
torios y neoplsicos.
En el SNC se identificaron receptores para
IL-1, L-2, IL-3, IL-6, TNF e IFN. Las citoqui
nas que actan sobre estos receptores pueden
provenir de clulas del sistema inmune activa
das localizadas perifricamente (accin endo
crina), o que bajo ciertas circunstancias atravie
san la barrera hem atoenceflica. Otra fuente
son las propias clulas del SNC. Se demostr la
presencia de ARNm para citoquinas no slo en
clulas de la gla sino tam bin en neuronas
(IL-1, IL-6, etc.).
Por su parte, el sistema inmune se comporta
ra como un rgano neuroendocrino ya que
sus clulas activadas producen hormonas pept
dicas (ACTH, PRL, GH, etc.) y neuropptidos
(VIP, SP, encefalinas, etc). Adems existen re
ceptores en clulas del SI para productos neuroendoainos. La sntesis de novo local de mo
lculas neuroendocrinas, por el sistema inm u
ne, y citoquinas, por estructuras neuroendocri
nas, se produce en clulas activadas y es de
pendiente del tipo de estmulo (produccin inducible) y m enos frecuentem ente de form a
constitutiva. Adems, a esta produccin local

El sistema inmune de mucosas

de molculas recprocas se le atribuye una fun
cin regulatoria paracrina/autocrina.
Se comprob para la mayora de las molcu
las y receptores compartidos que sus caracters
ticas bioqumicas son similares a las que pre
sentan los tejidos que son la fuente clsica.
Desde el punto de vista filognico, la inte
raccin entre los sistemas homeostticos mayo
res representa la mxima adquisicin evolutiva
alcanzada por los vertebrados superiores. La
pluricelularidad llev a incrementar la comple

321

jidad en la organizacin y funcin corporal. Sin

embargo, la comunicacin celular es esencial
para el intercambio de informacin de la clula
con su entorno tanto en organismos unicelu
lares com o p luricelulares. En estos ltim os
constituye un mecanismo ancestral y altamente
conservado.
La reciprocidad m olecular estara tam bin
avalada desde el punto de vista ontognico. En
los organismos pluricelulares todas sus clulas
tienen un origen comn: el cigoto, estado uni

Fig. 17-8. Esquem a sim plificado de las interacciones entre sistem as hom eostticos m ayores a nivel molecular: 11.-1 y glu
cocorticoides. E stm ulo no cognitivo con capacidad potencial de p ro d u cir una respuesta inm une sistm ica, activ a a un ma
crfago. ste produce IL-1 que p or m ecanism o endocrino llega al cerebro y la hipfisis. En estos rganos se p ro d u ce un
aum ento local de esta citoquina (redundancia). L a produccin local a travs de efectos paracrinos estim ula la liberacin
del factor liberador de A C TH y tam bin directam ente sobre la hipfisis la liberacin d e ACTH. Esta horm ona ac tiia sobre
la corteza adrenal liberando glucocorticoides que p or retroalim entacin inhiben la produccin de IL-1 por los m acrfagos,
contribuyendo de esta m anera a la inm unoespecificidad de la respuesta. Los glucocorticoides tam bin inhiben la produc
cin de A C TH y su factor liberador. (M odificado de E. Blalock, Im m unology Today 15:11, 1994.)

322

Aspectos bsicos de la inmunidad

celular resultante de la fecundacin. D,e esta

manera todas las clulas de un mismo indivi
duo tenen la misma informacin gentica. La
diversidad celular es el resultado de la expre
sin diferencial de genes. Por este motivo el
sistema inmune es efector y fuente de produc
tos neuroendocrinos. Lo mismo ocurre con el
sistem a nervioso. Los efectos de productos
neuroendocrinos y citoquinas depender en
parte de la naturaleza del estmulo, que influir
sobre la concentracin y combinacin de mol
culas y, por otro lado, de las caracterstica fenotpicas de las clulas efectoras (grado de di
ferenciacin, estado metablico, etc.).
Las bases moleculares de la interaccin entre
sistemas homeostticos mayores y sus implican
cias funcionales se resumen en el cuadro 17-4.
La figura 17-8 muestra uno de los circuitos
moleculares interactivos mejor conocidos: IL-1
y glucocorticoides.
Ventajas conceptuales e implicancias
prcticas
Considerar a los sistemas inmune, nervioso y
neuroendocrino como sistemas homeostticos
mayores e integrados funcionalm ente confor
mando un sistema interactivo-adaptativo es la
resultante de un enfoque holstico. Estos siste
mas interactan de tal manera que su funciona
miento tnico le permite un continuo intercam
bio de informacin funcional en condiciones fi
siolgicas. Por esta modalidad funcional frente
a estmulos, independientemente de su natura
leza (cognitivos, no cognitivos), se activan si
multneamente.
En este contexto, el sistema inmune puede
enviar seales moleculares al sistema neuroen
docrino a travs de citoquinas (inmunotransmisores con accin sobre target neuroendocri
nos). La capacidad del sistema inmune de res
ponder a estmulos especficos y de tener una

va aferente de informacin hacia el sistema ner

vioso central, permite postularlo como un rga
no receptor sensorial (nuestro sexto sentido?).
La magnitud de la respuesta inmune puede
ser considerada como una funcin del estado
psicofisiolgico del husped, que incluye ade
ms de la autorregulacin, un nivel externo de
regulacin de dicha respuesta. Este nivel exter
no establece las bases para los potenciales me
canismos que pueden mediar alteraciones de la
funcin inm une inducidas por el com porta
miento. En este sentido, las reacciones alrgi
cas pueden ser desencadenadas por estmulos
cognitivos (inmunolgicamente neutros, pero
que son potentes emocionalmente). Adems el
nivel externo de regulacin de la respuesta in
mune permiti a nivel experimental lograr con
dicionamiento de dicha respuesta. Estos datos
llevaron a extender la denom inacin de este
campo multidisciplinario surgiendo el trmino:
PSICONEUROENDOCRNOINMUNOLOGA.
La participacin permanente y activa de este
sistema interactivo en los estados de salud y
enferm edad avala su extensin en el terreno
farmacolgico y teraputico. Drogas neurotrficas y psicotrfieas pueden modificar la fun
cionalidad del sistema inmune actuando sobre
la liberacin de hormonas del eje hipotlamohipofisario y/o sobre receptores para benzodiazepinas presentes en macrfagos.

REGULACIN NEUROENDOCRINA
DE LA INMUNIDAD DE MUCOSAS
Caractersticas fenotpicas de las mucosas
en general
D urante el desarrollo em brionario normal,
como resultado de interacciones epitelio-m esenquimticas, surge una organizacin tisular
que, formando parte de la pared de los rganos

Cuadro 17-4. Bases moleculares para el intercambio de informacin entre los componentes
del Sistema Interactivo
BASES MOLECULARES DE LA COMUNICACIN CELULAR ENTRE LOS SISTEMAS HOMEOST
TICOS MAYORES
~ Citoquinas - H orm onas - N europptidos
M O L C U L A S CO M P A R TID A S:
~ N eurotransm isores - Receptores
E F E C TO S:

- Pleitrpicos

M E C A N IS M O S D E A C C I N :

- Endocrino - A utocrino - Paracrino

PR O D U C C I N Y T A R G E T :

- S istem a Inm unoendocrino

SN TE SIS:

- C onstitutiva - Inducible

El sistema Inmune de mucosas

huecos, recibe el nombre de mucosa. Toda m u
cosa, independientemente de su origen embrio
nario, est constituida bsicamente por:

323

cos (neuropptidos) y no peptidrgicos (acetil

colina) (fig. 17-9).
Estructuras neuroendocrinas estn presen
tes en el intestino representadas por un conjun
1)
Un tejido epitehal en contacto con la luz to de clulas, predominantemente intraepiteliadel rgano que, apoyado sobre una membrana les, especializadas en sintetizar y liberar neuro
basal, se relaciona con 2) el tejido conectivo pptidos. Estas clulas conforman el sistem a
subepitelial denominado corion o lmina pro neuroendocrino difuso de las mucosas, consi
pia. El componente conectivo de la mucosa im derado el sistema neuroendocrino corporal ms
plica la presencia de vasos sanguneos y linfti extenso.
El sistema inmune de mucosas est consti
cos, nervios, agregados linfticos y diversos ti
pos celulares fijos y migrantes. Por su parte, el tuido por: 1) tejido linftico asociado: infiltra
componente epitelial ofrece diversidad celular dos linfticos relativamente constantes; 2) una
y constituye una barrera biolgica que interac- poblacin difusa de clulas inmunes efectoras
ta permanentemente con la luz del rgano. La (leucocitos, linfocitos, macrfagos, mastocitos)
compartimentalizacin tisular en las mucosas a nivel de la lmina propia, y 3) una poblacin
establece el sustrato morfolgico para una gran de leucocitos intraepiteliales. Los leucocitos
variedad de efectos paracrinos entre sus com activados pueden sintetizar y liberar neuropp
ponentes. Las diferencias regionales en cada tidos (fig. 17-10).
De acuerdo con lo mencionado, las tres es
mucosa dependern de las hojas germinativas
tructuras que representan a nivel intestinal a los
de donde derivan sus componentes tisulares.
El fenotipo bsico de las mucosas sustenta la sistem as nervioso, neuroendocrino e inm une
deteccin de un nivel externo de inmunorregu constituyen fuentes tisulares de neuropptidos.
lacin. La mayor parte de la informacin sobre Esto es una evidencia de redundancia regulato
regulacin neuroendocrina de la inmunidad de ria a nivel molecular.
Los neuropptidos ms importantes cuanti
m ucosas proviene de estudios que analizan
principalmente la influencia neurohormonal so tativamente en la mucosa intestinal son: sustan
bre varios aspectos de la respuesta inmunoin- cia P (SP), pptido intestinal vasoactivo (VIP)
fiamatoria en la mucosa del aparato digestivo, y somatostatina (SOM). Considerados por al
fundam entalmente a nivel intestinal. Por este gunos autores com o horm onas in testin ales,
motivo centraremos nuestras descripciones de desem pean un im portante papel regulatorio
acuerdo con datos bibUogrficos referidos a la sobre la mucosa intestinal incluyendo el tejido
mucosa intestinal.
linftico asociado. SP, VIP y SOM pertenecen
al grupo de pptidos regulatorios. Dentro de es
te grupo conforman un subgrupo denominado
C aractersticas fenotpicas de la mucosa
pptidos integrativos. Estos pptidos estn lo
intestinal
calizados a nivel central (cerebro) y perifrico
La pared intestinal contiene subdivisiones al (resto del cuerpo). Pueden funcionar como hor
tam ente especializadas que representan a los monas y neurotransmisores para integrar fun
sistemas inmune, endocrino y nervioso. La su ciones biolgicas y psicolgicas.
perficie de la mucosa intestinal est especial
mente diseada para permitir interacciones en Inervacin de la mucosa intestinal;
tre nervios, clulas neuroendrocrinas y del sis distribucin de fib ras peptidrgicas
tema inmune.
E l sistema nervioso entrico (SNE), consi
a)
Tejido linftico asociado a mucosa. Las
derado el tercer componente del sistema ner placas de Peyer son sitios de induccin de res
vioso autnomo, est formado por una extensa puesta inmune y tambin de generacin de hired de fibras nerviosas simpticas, parasimp- porrespuesta especfica a antgenos de las m u
ticas y nervios aferentes sensitivos. Las fibras cosas (tolerancia oral). Dentro de estos agrega
parasimpticas son prolongaciones de neuro dos linfticos se demostr la existencia de ner
nas cuyos cuerpos estn incluidos en la pared vios peptidrgicos (SP, SOM, VIP y pptido
del tubo digestivo. En el tracto gastrointestinal relacionado al gen de la calcitonina [CGRP]).
hum ano se estim a que existen alrededor de Las fibras VIP son abundantes en las reas que
100 millones de neuronas. Los cuerpos neuro rodean a las vnulas de endotelio alto post-canales se localizan predominantemente confor pilares. A travs de ellas los hnfocitos T y B
mando el com ponente ganglionar del plexo pasan desde la circulacin sistm ica h acia la
m ientrico y subm ucoso. E sta descrip ci n
mucosa intestinal. Esto implica que el neuroconfirma la redundancia del sistema a nivel es pptido VIP regulara la migracin de linfoci
tructural. El SNE, regula las funciones intesti tos en los tejidos linfoides asociados a intestino
nales a travs de neurotransmisores peptidrgi- (fig. 17-10).

324

Aspectos bsicos de la inmunidad

F ig. 17-9. R epresentacin esquem tica de los tejidos y estructuras que integran la pared del intestino delgado (tom ado de
Junqueiras. H istologa Bsica. Ed. Salvat.)

Los receptores para VIP dentro de las subpo distribuyen en tres reas principales: 1) una
blaciones de linfocitos T estn asociados con la densa red alrededor de las criptas glandulares,
Subpoblacin CD4+ ms que con la CD8+.
2) a lo largo de los capilares, y 3) red sin rela
Se considera que la sustancia P induce la ex cin con las criptas y capilares, estrechamente
presin de E-selectina en el endotelio alto de vinculada con clulas inm unes efectoras. La
las vnulas. Esta molcula de adhesin induce microscopia electrnica muestra contactos nti
la migracin de linfocitos y leucocitos.
mos entre la membrana plasmtica de los ner
b)
Lmina propia. La mayora de los estu vios y linfocitos.
dios referidos a inervacin de mucosa intestinal
Los nervios cjue contienen SP muestran un
analizaron las neuronas de los plexos mientri- modelo similar pero menos denso en la lmina
cos y submucosos y su relacin con la motili- propia. Establecen contactos ntimos con m as
dad gastrointestinal. Dentro del intestino delga tocitos que son abundantes en la mucosa intes
do una minora de los nervios que provienen tinal. Se conoce que la estimulacin de nervios
del plexo mientrico y una mayora de los que puede inducir degranulacin (liberacin de
provienen del plexo submucoso contienen neu aminas vasoactivas) de m astocitos y edem a
ropptidos. Dado que la mayora de las clulas neurognico. Esto comprueba que los mastoci
inmunes efectoras estn localizadas dentro de tos pueden degranularse por estmulos inmunola lmina propia de la mucosa, el anhsis de la lgicos y no inmunolgicos. Se comprob que
inervacin de este tejido es fundamental para el epitelio, los nervios y los mastocitos interacestablecer la influencia de los neuropptidos cionan en los tractos respiratorio y gastrointes
sobre la inmunidad de mucosas.
tinal promoviendo cambios funcionales espec
A nivel de la lmina propia de la mucosa in ficos, antgeno dependientes.
testinal existe un extenso plexo nervioso. Las
Las fibras nerviosas peptidrgicas son uno
fibras nerviosas que contienen VIP son los ner de los componentes ms abundantes de la mu
vios ms abundantes en la lmina propia y se cosa. La identificacin de neuropptidos regu-

El sistema inmune de mucosas

Luz

325

Antgenos

Vnula
endotelio
alto

L-4

IL-2^y

Citoquinas

IFN
Eosinfllo

M }crfago

Neutrfllo

Capilar
IL-5
If n

IL-6

F ig . 17-10. R epresentacin esquem tica de la m ucosa in testin a l N tese la localizacin del tejido linftico asociado a m u
cosa, clulas inm unes efectoras y parte de la distribucin de las fibras peptidrgicas en contacto con vnulas de en d o telio
alto y con m astocitos de m ucosa (M M ). SP: sustancia P. M odificado de RH Stead y col. (Im m unological Review , 100:333,
1987 ) y de S. Targan (N etiroim m unophysiology of the G astrointestinal M ucosa. Ann. N ew York A ca d Se., 6 6 4 :6 1, 1992).

Latorios en la mucosa, sugiere que su liberacin

local puede afectar directamente la funcin de
las clulas epiteliales, endoteliales y leucocitos.
Estos diversos tipos celulares responden de
manera paracrina por la presencia de receptores
de membrana plasmtica para neuropptidos.
Regulacin neuroendocrina de la respuesta
inmune a nivel de mucosas
En el microambiente de las mucosas, las c
lulas del sistema inmune de mucosas estn con
tinuamente expuestas a seales locales y sist
micas derivadas de neuropptidos. Para respon
der a estas seales neurofisiolgicas expresan
receptores. La demostracin de receptores para
neuropptidos sobre los leucocitos fortalece la
idea de que existe interaccin entre las clulas
inmunes efectoras y los nervios peptidrgicos.
Los neuropptidos influyen sobre una gran
variedad de reacciones inmunes incluidas proli
feracin linfocitaria y activacin, sntesis de
anticuerpos, funcin NK, activacin m acrof
gica y puesta en libertad de aminas vasoactivas
por mastocitos.

La demostracin de receptores para n eu ro

pptidos sobre clulas inmunes efectoras, fun
damenta el nivel externo de regulacin neurohorm onal de la respuesta inm une a nivel de
mucosas frente a una gran variedad de antge
nos que pueden estar presentes en el medio am
biente intraluminal del intestino.
Los efectos especficos de los neuropptidos
sobre la respuesta inmune intestinal depende
rn del estmulo desencadenante, de la integri
dad funcional de las fuentes tisulares de neuro
pptidos y de la cantidad y condiciones fenot
picas de las clulas efectoras. A normalidades
en la inervacin peptidrgica pueden conducir
a perturbaciones de la inm unorregulacin y
causar dao e inflamacin prolongada.
Podemos concluir que las mucosas en g en e
ral, y la intestinal en particular, presentan las
caractersticas fenotpicas en todos los niveles
de organizacin (funcional, estructural, celular
y molecular) para el permanente intercam bio
de informacin entre los sistemas hom eostti
cos mayores. La estrecha asociacin entre fi
bras peptidrgicas y mastocitos constituye el
sustrato m icroanatm ico para in tercam bios

326

Aspectos bsicos de la inmunidad

m ultidireccionales entre sistemas adaptativos

(inmunorregulaein del sistema nervioso ent
rico).

B IB L IO G R A FIA
(Prim era parte)
E l sistem a inm une de m ucosas
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(Segunda parte)
R egulacin neuroendocrina
LIBRO S
N eurom odulation o f im m unity and hypersensitivity. P ro
ceed in g s o f a C onference. V olum e E d ito r E.J. G oetzl.
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Regulacin de la respuesta inmune

MARTA BRAUN

IN TR O D U C C I N
El sistema inmune, como tocios los sistemas
fisiolgicos, es un sistema regulado. Ms aun,
dada la peligrosidad potencial de un sistema es
pecializado en la homeostasis y en la protec
cin del individuo mediante la agresin contra
lo externo, es lgico suponer que, junto con la
evolucin de cada una de sus funciones efectoras agresivas, hayan desarrollado mecanismos
capaces de regularlas. Sin embargo, en los pri
meros tiempos de la inmunologa, se supona
que la respuesta inmune frente a los antgenos
externos era todo o nada : el antgeno ingresa
ba a un organismo, era reconocido como ex
trao y esto provocaba una respuesta; una
nueva entrada del mismo antgeno provocaba
una respuesta mayor y ms rpida, y as sucesi
vamente. Pronto se dem ostr que esto no es
as: estmulos repetidos con el mismo antgeno
no provocan respuestas cada vez mayores y
hasta pueden causar- una falta de respuesta a ese
antgeno, o tolerancia.
Esta regulacin, de la que an no se conocen
todos sus mecanismos y muchos de los conoci
dos an se discuten, est basada en mltiples
sistemas, en los cuales intervienen las propias
clulas inm unes y los factores que segregan,
seales provenientes del microambiente donde
se produce la reaccin y tam bin seales de
otros rganos y sistemas, muy especialmente,
el sistema nervioso central y el endocrino, co
nectados po r el eje h ip o tlam o -h ip o fisario
(vase cap. 17, segunda parte). El estudio de la
funcin de estas clulas implica dificultades, ya
que son aparentemente idnticas entre s, cam
bian permanentemente de lugar y pueden ejer
cer funciones muy diferentes y hasta contra
puestas, como de regulacin hacia arriba o ha

18
cia abajo de otra clula. Muchos de los conoci
mientos fueron adquiridos mediante el estudio
de clulas aisladas in vitro, lo que significa que
no se sabe todava si esos mecanismos funcio
nan de igual manera o no en un organismo n
tegro.
Uno de los primeros arcos regulatorios que
se conoci fue el de retroalimentacin negativa
producida por los propios anticuerpos, que hoy
se sabe que es un tpico sistema feed-back ,
pues tambin pequeas cantidades de un an ti
cuerpo pueden aumentar la respuesta, como ve
remos luego.
Para esa misma poca, se comenz a c o n o
cer la importancia de los hnfocitos T como co
laboradores de los B, indispensables para ini
ciar y m antener Jas respuestas inmunes, y a
com prender que el sistem a inm une no slo
puede regular en forma cuantitativa sino tam
bin cualitatva, pues regula tanto el nivel g e
neral como el tipo de Ja respuesta. En efecto,
segn una serie de factores que luego veremos,
la respuesta puede hacerse en el sentido celular
o humoral, pasar de un tipo de respuesta a otro
y dentro de cada uno de ellos, pasar, por ejem
plo, de una clase de g a otra. A esta capacidad
del sistema inmune, que hace a su adaptabili
dad, se la conoce como modulacin de la res
puesta, y si bien an quedan muchos puntos
por conocer, est basada en la colaboracin en
tre clulas inmunes y en las influencias del res
to del organism o. Se ha dem ostrado que las
mismas clulas capaces de iniciar una respues
ta pueden tambin ejercer su regulacin hacia
abajo.
Otro concepto fundam ental, que fue c o m
prendindose poco a poco y hoy es aceptado
universalmente, fue que el sistema inmune no
reconoce y agrede directam ente lo extrao ,

326

Aspectos bsicos de la inmunidad

m ultidireccionales entre sistemas adaptativos

(inmunorregulacin del sistema nervioso ent
rico).

B IB L IO G R A FIA
(Prim era parte)
E l sistem a inm une de m ucosas
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Im m une N euroendocrine Interactions. W. Savino and M.
D ardenne. Im m unology Today, 16: N 7 , 318, 1995.

Regulacin de la respuesta inmune

MARTA BRAUN

INTRODUCCIN
El sistema inmune, como todos los sistemas
fisiolgicos, es un sistema regulado. Ms aun,
dada la peligrosidad potencial de un sistema es
pecializado en la homeostasis y en la protec
cin del individuo mediante la agresin contra
lo externo, es lgico suponer que, junto con la
evolucin de cada una de sus funciones efectoras agresivas, hayan desarrollado mecanismos
capaces de regularlas. Sin embargo, en los pri
meros tiempos de la inmunologa, se supona
que la respuesta inmune frente a los antgenos
externos era todo o nada : el antgeno ingresa
ba a un organismo, era reconocido como ex
trao y esto provocaba una respuesta; una
nueva entrada del mismo antgeno provocaba
una respuesta mayor y ms rpida, y as sucesi
vamente. Pronto se dem ostr que esto no es
as: estmulos repetidos con el mismo antgeno
no provocan respuestas cada vez mayores y
hasta pueden causar- una falta de respuesta a ese
antgeno, o tolerancia.
Esta regulacin, de la que an no se conocen
todos sus mecanismos y muchos de los conoci
dos an se discuten, est basada en mltiples
sistemas, en los cuales intervienen las propias
clulas inm unes y los factores que segregan,
seales provenientes del microambiente donde
se produce la reaccin y tam bin seales de
otros rganos y sistemas, muy especialmente,
el sistema nervioso central y el endocrino, co
nectados po r el eje h ip o tlam o -h ip o fisario
(vase cap. 17, segunda parte). El estudio de la
funcin de estas clulas implica dificultades, ya
que son aparentemente idnticas entre s, cam
bian permanentemente de lugar y pueden ejer
cer funciones muy diferentes y hasta contra
puestas, como de regulacin hacia arriba o ha

18
cia abajo de otra clula. Muchos de los conoci
mientos fueron adquiridos mediante el estudio
de clulas aisladas in vitro, lo que significa que
no se sabe todava si esos mecanismos funcio
nan de igual manera o no en un organismo n
tegro.
Uno de los primeros arcos regulatorios que
se conoci fue el de retroalimentacin negativa
producida por los propios anticuerpos, que hoy
se sabe que es un tpico sistema feed-back ,
pues tambin pequeas cantidades de un an ti
cuerpo pueden aumentar la respuesta, como ve
remos luego.
Para esa misma poca, se comenz a c o n o
cer la importancia de los linfocitos T como co
laboradores de los B, indispensables para ini
ciar y m antener Jas respuestas inmunes, y a
com prender que el sistem a inm une no slo
puede regular en forma cuantitativa sino tam
bin cualitativa, pues regula tanto el nivel g e
neral como el tipo de Ja respuesta. En efecto,
segn una serie de factores que luego veremos,
la respuesta puede hacerse en el sentido celular
o humoral, pasar de un tipo de respuesta a otro
y dentro de cada uno de ellos, pasar, por ejem
plo, de una clase de g a otra. A esta capacidad
del sistema inmune, que hace a su adaptabili
dad, se la conoce como modulacin de la res
puesta, y si bien an quedan muchos puntos
por conocer, est basada en la colaboracin en
tre clulas inmunes y en las influencias del res
to del organism o. Se ha dem ostrado que las
mismas clulas capaces de iniciar una respues
ta pueden tambin ejercer su regulacin hacia
abajo.
Otro concepto fundam ental, que fue c o m
prendindose poco a poco y hoy es aceptado
universalmente, fue que el sistema inmune no
reconoce y agrede directam ente lo extrao ,

328

Aspectos bsicos de ia inmunidad

sino que su funcionamiento est basado en el

reconocimiento constante y no agresivo de lo
propio , es decir, de los antgenos de histo
compatibilidad de Clase I y TI unidos a pptidos
propios, y que slo reacciona frente a modifica
ciones de lo propio cuando a una de estas mol
culas se le une un pptido de origen extrao.
Un concepto que se desarroll en los aos
70 fue que la regulacin del sistema inmune
estaba basada en los linfocitos T supresores y
fue cuando se nombr al timo director de la
orquesta inmunolgica. La funcin supresora
fue adjudicada a los linfocitos T CD8 positivos,
que pronto fueron encontrados presentes y acti
vos en prcticamente todas las reacciones inmu
nes, a tal punto que el mismo investigador que
defini por primera vez a los linfocitos T supre
sores, el Dr. Gershon, lleg a decir que frente a
tanta supresin le llamaba la atencin que pu
diera haber respuestas inmunes positivas. Hoy,
la existencia de linfocitos T supresores est
muy discutida; ello puede deberse no slo a que
no se ha encontrado un linfocito identificable
que inhiba siempre a todas las respuestas inmu
nes, sino a que diferentes subpoblaciones de hn
focitos T pueden aumentar un tipo de respuesta
mientras que disminuyen otras o bien aumentar
o disminuir una misma respuesta segn las se
ales que reciben de otros linfocitos o del me
dio ambiente, como veremos ms adelante.
Por todo esto se comprender que no se co
nocen todava todos los circuitos regulatorios
del sistema inmune y que muchos de los con
ceptos que siguen pueden estar sujetos a revi
sin.
LA COLABORACION CELULAR
EN LA RESPU ESTA INMUNE
G eneralidades. Las citoquinas
Desde hace mucho tiempo se conoce que la
respuesta inmune, tanto humoral como celular,
no es llevada a cabo por la intervencin de un
solo tipo celular, sino que est dada por la inte
raccin de varios. Puede representarse como
una cascada, altamente regulada en cada uno
de sus pasos, en la que intervienen clulas con
diferentes funciones y formas de maduracin,
esquematizada en la figura 2-8, captulo 2.
Esta multiplicidad de accin permite al siste
ma inm une tener una enorm e flexibilidad o
adaptabilidad, que se traduce en una gran efica
cia cada vez que se le presenta el caso concreto
de la defensa contra algn agente invasor. Al
mismo tiempo, al ser regulable en muchos pun
tos distintos, esta cascada provee al sistema de
m ltiples m ecanism os de reaseg u ro co n tra
reacciones nocivas.

Tiene como contrapartida una cierta lentitud

en la respuesta: en efecto, desde la primera en
trada de un antgeno desconocido hasta la apa
ricin de una respuesta, por ejemplo, la sntesis
de anticuerpos contra l, pasa cierto tiempo. Si
bien existen clones capaces de reconocer cual
quier antgeno antes de su entrada, las clulas
que los componen son pocas en nmero y, ade
ms, estn en estado precursor, no activo, y de
ben sufrir una serie de mitosis antes de diferen
ciarse a clulas efectoras. Adems, para que es
to suceda, deben intervenir otras clulas cola
boradoras, que tam bin son pocas y estn en
estado de precursoras y tambin deben sufrir
mitosis y diferenciacin. Durante estas diferen
ciaciones en cadena pasa cierto tiempo, y pue
de sobrevenir la enfermedad, si los sistem as
inespecfcos de defensa fueron insuficientes
para la proteccin del individuo.
Muchas de las clulas especficas que inter
vienen en cada uno de estos pasos no mueren
despus de cumplir con su funcin, sino que se
retrotraen a un estado de reposo; en este estado,
si bien siguen reconociendo al mismo antgeno,
no son funcionalmente iguales a la clula vir
gen que les dio origen, y van a reaccionar en
forma diferente al encontrar nuevamente a ese
antgeno. La concentracin en que lo recono
cen y la necesidad de otras seales para ser ac
tivadas cambian, y cambia tambin la naturale
za de la sustancias que segregan al ser activa
das. Es decir, cada vez que un linfocito es esti
mulado, entra en mitosis y sufre una diferen
ciacin que implica un cambio en su programa
de activacin y respuesta; esto hace que las c
lulas resultantes no slo estn en mayor nme
ro que antes de la entrada del antgeno (expan
sin clonal) sino tambin que sean funcional
mente diferentes y ms aptas. En esta expan
sin y en este cambio funcional reside la m e
m oria del sistem a inm une y la facultad para
que las respuestas secundarias sean ms rpi
das y ms eficientes que las primarias. Esta es
la razn por la cual un individuo que ya ha co
nocido al antgeno, ya sea por enfermedad pre
via o por vacunacin, no enferme, pues sus res
puestas son ms rpidas y eficientes.
En lneas generales puede decirse que, para
una respuesta humoral, los hnfocitos B deben
recibir una seal de activacin del antgeno, al
que reconocen directamente por sus Igs de su
perficie; esta seal los hace capaces de recibir
los mensajes que le envan los linfocitos T co
laboradores. A su vez, estos mensajes induci
rn en los hnfocitos B mitosis, switch, muta
ciones puntuales y diferenciacin a plasmocitos
o linfocitos B de memoria.
Para la activacin de los linfocitos T que co
laboran con ellos, la cosa es ms complicada,
pues stos reconocen al antgeno slo si est

Regulacin de la respuesta inmune

procesado, es decir, si le es presentado como
pptido unido a una molcula de antgeno del
CMH por una clula especializada en presenta
cin; ya aqu deben intervenir dos poblaciones
diferentes. Adems, debe recibir seales coestimulatorias que le enva la clula presentadora.
Recin entonces, y dependiendo de una serie
de factores del microambiente, el linfocito T se
diferencia a clula efectora de colaboracin.
Estos conocimientos fueron muy difciles de
entender cuando comenzaron a estudiarse los
mecanismos de colaboracin celular, mediante
experimentos con clulas provenientes de indi
viduos previam ente inmunizados. Primero se
demostr que, para la respuesta humoral, tanto
in vivo como in vitro, eran necesarios linfoci
tos T y B. Luego se vio que, para la respuesta
mittica in vitro de linfocitos T sensibilizados,
eran necesarios dos tipos de clulas; los linfoci
tos T y una poblacin adherente al vidrio. A si
mismo, para otras respuestas in vitro, interve
nan tres poblaciones celulares, una de ellas ad
herente. Pronto se demostr que esas clulas
adherentes eran macrfagos, que deban expre
sar antgenos de histocompatibilidad de clase
II, y que ellos y los linfocitos deban provenir
de un mismo animal, o de dos idnticos en sus
antgenos de histocompatibihdad, para que hu
biera reaccin. Una restriccin similar se d e
mostr con la citotoxicidad; las clulas blan
co deban tener los mismos alelos que las c
lulas que haban pre-sensibilizado a los linfoci
tos T citotxicos. La comprobacin del recono
cimiento dual del linfocito T provoc una serie
de polmicas y estudios, que lograron esclare
cer, en los ltim os aos, los mecanismos de
presentacin del antgeno y su reconocimiento
por el linfocito T (vanse caps. 2 y 13).
La necesidad de contacto o no entre las clu
las para la colaboracin fue otro punto que pro
voc tam bin polm icas. En algunos experi
mentos se demostr la necesidad de contacto
fsico entre macrfagos y linfocitos T o entre
linfocitos T y B. Sin em bargo, otros experi
mentos demostraron que los sobrenadantes de
cultivos de macrfagos y de linfocitos T podan
actuar aumentando la respuesta de linfocitos f
sicamente separados. As se demostr que los
macrfagos y los linfocitos Th sintetizan y se
cretan factores, llamados citoquinas, capaces
de activar otras poblaciones. En un primer m o
mento, se pens que estos factores eran espec
ficos para el antgeno, pues ste era necesario
para su accin. Luego se comprob que el efec
to del antgeno es inducir, en las clulas espec
ficas que lo reconocen, la sntesis y expresin
de receptores para las citoquinas, pero que s
tas no reconocen antgenos, es decir, son ines
pecficas. Se comprob tambin que las citoquinas actan en forma autocrina y paracrina.

329

es decir, sobre la misma clula que las produjo

y sobre clulas cercanas, y tambin se dem os
tr que pueden actuar a distancia, com o las
hormonas, y de esta manera ejercer efectos so
bre otros rganos y tejidos.
Entre las citoquinas ms importantes en la
respuesta inmune, las primeras en ser definidas
fueron las linfoquinas, cuando se estudiaron los
mecanismos de inmunidad celular, y se las des
cribi como producidas por linfocitos T sensi
bilizados y con efecto sobre los macrfagos y
otras clulas. Sus nombres se atuvieron a su
funcin y durante mucho tiempo hubo una gran
confusin sobre la identidad y realidad de estos
factores. Luego se habl de las m onoquinas,
producidas por los macrfagos, con efectos so
bre clulas inmunes. Finalmente se definieron
las interleuquinas (IL), o mensajeros p a ra la
comunicacin entre leucocitos, producidas por
los linfocitos Th y con efectos principalmente
sobre los linfocitos B; estas IL fueron n o m
brndose por nmeros consecutivos, segn se
fueron identificando fehacientemente por aisla
miento de sus genes.
N inguno de estos nombres se atiene a una
realidad estricta, sino ms bien a las circuns
tancias de su descubrimiento y a la tradicin;
por ejem plo, la IL l es producida, p rin cip al
mente, por los macrfagos y, si bien tiene efec
tos importantes sobre los linfocitos, tiene efec
tos sistmicos aun ms importantes. Adems,
muchas ILs son producidas tambin por clulas
no inmunes. Esta falla de la nom enclatura ha
producido y sigue produciendo mltiples con
fusiones.
A ctualm ente, se siguen aislando genes de
ILs producidas por clulas comprometidas en
las respuestas inmunes. Para una hsta de las ci
toquinas hoy conocidas y sus principales efec
tos, vase el captulo 12.
Con respecto a las funciones de las ILs, de
ben tenerse en cuenta varios conceptos. Por
una parte, si bien los linfocitos las producen y
secretan por efecto de un estmulo especfico,
sus accin sobre otras clulas es inespecfica,
es decir, actan sobre cualquier clula que pre
sente receptores para ellas en su superficie. Pa
ra que acten sobre un linfocito, ste debe de
haber tenido contacto recientemente con el an
tgeno y expresar as receptores. Por otra parte,
muchas ILs y hnfoquinas pueden ser produci
das por clulas no linfoides, como macrfagos
o clulas dendrticas, comprometidas en la res
puesta inmune, pero tambin por otras clulas
del organismo con funciones no estrictamente
relacionadas, como las del sistem a nervioso
central. Asimismo, sus efectos van ms all de
la respuesta inmune y de la inflamacin, pues
son capaces de actuar sobre clulas que no per
tenecen al sistem a inm une, desde el h gado

330

Aspectos bsicos de ia inmunidad

hasta el sistema nervioso central. Finalmente, y

la im portancia de este concepto va tom ando
ms cuerpo cada da, la mayora de las TLs no
acttian solas, sino en forma de una red compli
cada; sobre una clula actan varias ILs en for
ma coordinada y el resultado final de su accin
depende de la com binacin que acta, de la
concentracin de cada una de ellas y, adems,
de otras seales del microambiente.
Dado que la mayora de los conocimientos
sobre la funcin de las ILs y de las subpobla
ciones de linfocitos que las producen, han sido
obtenidos mediante el estudio in vitro de lneas
de linfocitos T, su verdadera funcin in vivo es
difcil de conocer an. El resultado final del
efecto de las ILs sobre una clula particular in
vivo, por influencia del m icroam biente y de
otras citoquinas an no conocidas, puede ser
muy diferente del que puede verse in vitro,
cuando se usan Ls puras o en mezclas. Esto se
ve agravado porque an no se conocen todas y
permanentemente se estn aislando nuevos fac
tores celulares, cuyas funciones deben ser an
develadas. Todo esto hace que existan todava
muchas diferencias de opinin sobre los pape
les individuales de cada una de ellas.
La mayora de los estudios se han hecho con
lneas in vitro de clulas T productoras de citoquinas de ratones y de humanos. Estas dos es
pecies muestran grandes homologas, pero no
siempre son idnticas, de modo que se debe ser
cauto en las extrapolaciones. El estudio de
otras especies de vertebrados superiores est
mostrando analogas y diferencias que perm i
ten adoptar ciertos conceptos generales que, si
bien pueden ser tiles, son a menudo sobresimplificaciones.
El descubrimiento de los efectos tan im por
tantes de las citoquinas en la respuesta inmune
y la posibilidad de aislarlas en pureza, as como
obtenerlas por ingeniera gentica, ya que la
mayora de sus genes han sido clonados, hizo
que se trataran de utilizar en la manipulacin
teraputica del sistema inmune, especialmente
en la inmunoterapia del cncer y como activa
dores inespecficos o especficos del sistema.
Sin embargo, dado que la mayora de las linfo
quinas actan en forma de red, con efectos que
hasta pueden ser contrarios a lo esperado segn
las circunstancias, y el hecho de que casi todas
tengan efectos sistmicos que pueden ser txi
cos si la citoquina se usa en dosis teraputicas,
estos ensayos no dieron Jos resultados espera
dos.
La posibilidad de transfectar o ehminar ge
nes de las ILs en animales de experimentacin
permiti el estudio in vivo. Actualmente, se es
tn usando mtodos de transfeccin de estos
genes en clulas que forman parte o migran a
un tumor, a fin de concentrar su produccin en

la zona o para realizar vacunas contra ciertos

tipos de tumores. Pero para poder usarlas con
xito como estimulantes de la respuesta inmu
ne, debern conocerse mejor sus interacciones,
tanto entre ellas como con el microambiente en
dnde se produce la respuesta.
Colaboracin macrfago/linfocitos T.
Diferenciacin de los linfocitos T vrgenes
La activacin de los linfocitos Th es un paso
esencial en la iniciacin de prcticamente todas
las respuestas inmunes especficas y requiere la
participacin de clulas presentadoras especia
lizadas, pues los principales colaboradores, los
linfocitos CD4+, slo reconocen pptidos uni
dos a antgenos de histocompatibilidad de clase
II. Por ello, la funcin principal de las clulas
de la lnea monocito-macrfago que expresan
Clase II es Ja presentacin de antgeno procesa
do a Jos linfocitos Th. La forma en que ellas
procesan y presentan el antgeno y el complejo
molecular que usan los linfocitos T para reco
nocerlo, fueron expuestas en el captulo 2.
Con los conocimientos actuales se entiende
fcilmente que, en los experimentos in vitro,
deba haber identidad entre los antgenos que
expresa el macrfago y los del individuo del
cual provienen los linfocitos, pues los antge
nos de InstocompatibiJidad que reconocen los
linfocitos T son slo los propios, ya que as han
sido seleccionados en el timo (vase cap. 3).
Por otra parte, la necesidad de reconocer lo
propio por parte del linfocito T explica el apa
rente gasto de la seleccin tmica positiva, pues
gracias a ella los rganos linfticos secundarios
no se ven atorados por linfocitos intiles.
Los macrfagos que han captado una part
cula la digieren y exponen sus pptidos unidos
a las molculas de Clase II que salen a su su
perficie; de esa m anera un linfocito TCD4+
puede reconocer el antgeno para el cual est
precom prom etido. Pero este solo re c o n o c i
miento no es suficiente para activar un linfocito
T virgen o precursor. Para ello es necesario un
contacto ntimo y relativamente prolongado en
tre ambas clulas, que est asegurado por una
serie de molculas de adhesin en ambas su
perficies, entre las que se cuentan p rincipal
mente las molculas CD4, que interactan con
la parte invariante del antgeno de Clase II, y
otra serie de molculas que actan como coactivadoras. En efecto, en estos ltimos aos se
ha descubierto la necesidad de, por lo menos,
una segunda seal para la activacin de los lin
focitos Th. Estas seales accesorias no slo
perm iten la activacin del linfocito Th, sino
que participarn, como veremos luego, en la
eleccin del camino de diferenciacin que se
guir iuego el linfocito Th precursor. Las prin

Regulacin de la respuesta inmune

cipales molculas coactivadoras fueron descri
tas en el captulo 13. Entre ellas, las que han si
do identificadas como capaces de intervenir en
la diferenciacin futura del linfocito T, estn la
IL l y la molcula B7 de la superficie de las c
lulas presentadoras de antgenos.
La IL L producida por los macrfagos luego
de estim ulacin por diferentes factores, entre
los cuales se cuenta la ingestin de partculas,
fue considerada, durante algunos aos, como
una molcula fundamenta] para la activacin
de los linfocitos T. Luego se comprob que, en
muchas situaciones, la IL l no es necesaria ni
suficiente para ello, pero que tiene en cambio
una serie de efectos sistmicos, no relacionados
con la respuesta especfica, como la induccin
de fiebre, somnolencia, malestar y caquexia, la
reabsorcin del cartlago, etc. Hoy se admite
que la IL l tiene efecto como segunda seal,
que sta no se ejerce necesariamente a distan
cia sino que se hara por el contacto clula/c
lula y que tiene un papel muy importante en el
camino de diferenciacin del linfocito pues, co
mo veremos luego, induce la funcin Th2.
Otra segunda seal conocida es la interac
cin de la molcula B7, que se expresa en la
superficie de las clulas presentadoras de ant
geno, con la molcula CD28, que se expresa en
los linfocitos Th. La interaccin entre estas dos
molculas llevara aJ linfocito Th hacia la inun
cin T hl.
La existencia de otras molculas que puedan
actuar como segunda seal explica la discusin
sobre la necesidad o no de IL l en la activacin
de los linfocitos T y es posible que existan otras
segundas seales, capaces de influir sobre la di
ferenciacin del linfocito Th que ain no se co
nocen. Sean cuales fueren las seales que acom
paan al antgeno, el resultado de esta interac
cin mltiple es que se activan en el linfocito
Th virgen dos fenmenos muy importantes: la
sntesis y expresin superficial de receptores de
alta afinidad para IL2 y la sntesis y secrecin
de IL2. Dado que es posible que existan linfoci
tos presensibilizados que continen respondien
do de esta manera, es decir, por secrecin de
IL2, muchos autores llaman precursores (pTh) a
este fenotipo funcional de Th.
Adems de otras funciones extra-inmunes, la
IL2 tiene como efecto principal la induccin de
mitosis en las clulas que componen el sistema
inmune especfico. Como cualquier IL, la IL2
no es especfica para el antgeno, pero su efecto
depende de que existan en la clula receptores
para ella. El hecho de que slo las clulas que
estn siendo activadas especficamente por el
antgeno expresen estos receptores, lim ita el
efecto policlonal de la IL2.
AJ respecto cabe decir que la sntesis de re
ceptores se produce cuando hay activacin por

331

el antgeno, pero se hace en forma explosiva y

corta y, cuando el linfocito se separa de la clu
la presentadora y com ienza su desdiferencia
cin y mitosis, deja de sintetizar receptores pa
ra IL-2 (RIL-2). Como stos tienen bajo tur
nover en la superficie celular, las clulas hijas
los expresarn todava, si bien en la m itad o
menos de la concentracin que tena la clula
madre, y podrn continuar siendo estimuladas
por la IL2 que se produce en la zona. Pero, a
medida que se induzcan ms mitosis, la canti
dad de molculas descender hasta debajo del
umbral y el linfocito volver al reposo.
Estos linfocitos que vuelven al reposo no son
iguales, como ya se dijo, al que les dio origen.
En general, las mitosis en el sistema inm une
van acompaadas por una diferenciacin, por
la puesta en marcha de un nuevo programa. En
tre los linfocitos Th, pueden ponerse en marcha
dos programas diferentes, que darn com o re
sultado dos fenotipos distintos, T h l y Th2, que
pueden individualizarse por la cantidad de m o
lculas CD35RO que expresan en su superficie.
Estos dos fenotipos polares tienen funciones
distintas, pues van a dirigir al sistema inm une
hacia una respuesta de tipo celular o humoral,
respectivamente. Debe tenerse en cuenta que la
divisin en estas subpoblaciones es una sobresimplificacin, pues sus funciones no son tan
rgidas como aqu se expresa; adems, estn
bien descritos y diferenciados en el ratn pero
no tanto en el hombre. En ste y otras especies
se habla de linfocitos tipo Th l o Th2 y se han
encontrado linfocitos con fenotipos in term e
dios, a los que se llama ThO.
Haciendo esta salvedad, puede decirse que
los Th 1, ya sea un tiempo despus de su prim er
contacto con el antgeno (sensibihzacin) o en
contactos posteriores con l, pasan a secretar,
adem s de la IL2, una serie de linfoquinas,
principalmente interfern y (IFNy) y factor de
necrosis tumoral (3 (TNFp) que, como se ver
en el captulo 12, son las principales activadoras de los macrfagos y de los linfocitos citot
xicos, es decir, son las efectoras de la inm uni
dad m ediada por clulas. Adem s, secretan
1L12 (que tiene un importante efecto en la dife
renciacin de los linfocitos Th vrgenes en lin
focitos T hl y su activacin), IL6 y probable
mente ILIO.
Los Th2, en iguales circunstancias, dejan de
secretar IL2 y pasan a producir otras ILs, entre
las que se cuentan las IL4, IL5, IL7, IL9, ILIO
e I L l3. Estas ILs tienen efecto sobre la prolife
racin y la diferenciacin de los linfocitos B y
sobre la secrecin de Igs y tambin actan so
bre la diferenciacin de los linfocitos vrgenes
en T h l o Th2.
C om o se dijo antes, se han encontrado l
neas celulares ThO que producen IL2, IFN (t

332

Aspectos bsicos de la inmunidad

picos de las T lil) e 1L4 (propia de las Th2) si

multneamente, lo cual demuestra que slo al
gunas de las clulas T sensibilizadas estn tan
polarizadas como se pens en un primer m o
mento.
Si bien la L2 es necesaria para la diferencia
cin de los linfocitos vrgenes o precursores,
productores de IL2, en linfocitos T h l o Th2,
una serie de factores inclina la balanza hacia la
aparicin de uno u otro fenotipo, segn puede
verse en la figura 18-1. Estos han sido bien es
tudiados in vitro en el ratn y son menos cono
cidos y no siempre iguales en el hombre.
Para que se desarrollen linfocitos T h l, pro
ductores de IFNy, se ha postulado como impor
tante que la segunda seal se haga a travs de
la interaccin del B7 con el CD28; adems, la
presencia de IFNy e IL 12 aumenta la diferen
ciacin hacia Th 1. Por el contrario, la presencia
de IL4 inhibe la transformacin de los T vrge
nes en T hl. Es posible que otros factores del

antgeno y de su forma de presentacin, as co

mo del microambiente, tengan tambin inter
vencin.
De forma similar, hay factores que estimulan
e inhiben la transformacin de precursores a
Th2 (fig. 18-1). La presencia de IL4 parece in
dispensable para la diferenciacin a Th2 y tam
bin se aumenta la transformacin hacia Th2,
si la segunda seal es a travs de la IL l, mien
tras que el IFNy y ia IL I2, en algunas circuns
tancias, la dism inuyen. D eben considerarse
tambin otros factores provenientes de la forma
de presentacin del antgeno y otros muy im
portantes del microambiente.
Finalmente debe tenerse en cuenta que no to
das las citoquinas actan de la misma forma en
todas las circunstancias: como ya se dijo, en
general actan en forma de red, su efecto puede
depender de la concentracin y las interaccio
nes entre ellas pueden influir sobre el resultado
final.

IFNy

Activacin de
macrfagos

IL-12

Fig. 18-1. Se m uestran las principales interacciones celulares en la activacin de los m acrfagos y la relacin de los lin fo
citos C D 4+ con los CD8+. 1.a funcin de las interleuquinas puede ejercerse tanto en la diferenciacin de los linfocitos v r
genes CD + a T h l o Th2, com o en la proliferacin y secrecin de factores por parte de stos. Las interacciones que llevan a
un aum ento de la funcin estn dibujadas en azul; las que llevan a una dism inucin de la funcin, en rojo. Los factores
m s caractersticos e im portantes de los T h l y Th2 estn en negrita .

Regulacin de la respuesta inmune

Si bien los linfocitos Th vrgenes podran es
tar precom prom etidos para una u otra de las
funciones, se ha demostrado in vitro que lneas
de una u otra clase de Th pueden cambiar su
fenotipo en presencia de los factores antes
mencionados; incluso se ha logrado que una l
nea de linfocitos T citotxicos, secretores de
IL2 e IFNy, pasaran a tener un fenotipo tpico
de linfocito Th2, con secrecin de IL4, 5 y 7.
Haya precompromiso o no, lo que s resulta de
estos fenotipos en muchos casos es una autoestimulacin, con inhibicin de la funcin contra
ria, por efecto de los mismos factores que ellos
secretan, es decir, una regulacin cruzada.
Esto explica el balance que puede verse en
las respuestas inmunes humorales y celulares,
en las que, generalmente, cuando una est au
mentada la otra est disminuida y viceversa. Un
ejemplo tpico de esto es la lepra, en la cual
pueden haber individuos con muy altas respues
tas celulares, que llevan a importantes datios ti
sulares pero hacen ms fcil la curacin (lepra
tuberculoide), o individuos con respuestas casi
exclusivamente humorales, donde la curacin
es ms difcil (lepra lepromatosa). Explica asi
mismo la dificultad que se tiene clnicamente en
modular la respuesta en uno u otro sentido. Pero
as como entre las formas polares de la lepra
hay formas intermedias, entre los linfocitos Th
tambin hay formas intermedias, los ThO.
No obstante que estas consideraciones se
han referido a los linfocitos T CD4+, debe te
nerse en cuenta que la diferencia funcional en
tre stos y los CD8+ no es tan rgida como se
supuso en un primer momento, en que se atri
bua a estos ltimos slo la funcin citotxica/
supresora y slo a los CD4'' la funcin colabo
radora.
En efecto, por una parte, los CD8+ adems
de ser citotxicos, secretan linfoquinas y existe
entre ellos una heterogenicidad similar a la de
los CD4+. En general, los CD8+ citotxicos
producen factores similares a los de los T h l,
principalmente IL2, IL l O e IFNy, y se han ais
lado clones supresores que secretan IL5 pero
no IL4, y tambin clones tipo Th2, secretores
de IL4 e IL5. La funcin de estas clulas in vi
vo todava est por dilucidarse. Por otra parte,
si bien la mayora de los linfocitos CD4+ ejer
cen funcin colaboradora, tambin pueden ser
citotxicos y muchos clones T h l lo son. Inclu
so podran ser citolticos contra los propios lin
focitos B que les presentan antgenos, contribu
yendo as a la regulacin negativa de las res
puestas inmunes.
Colaboracin linfocito T-linfocito B
Los linfocitos B pueden reconocer y ligar a
los antgenos a travs de su Ig superficial espe

333

cfica. Pero este reconocimiento no es suficien

te (salvo en el caso de los antgenos timo-independientes) para estimular la respuesta. Frente
a antgenos proteicos, slo hay una diferencia
cin del linfocito B, que se traduce en la snte
sis y secrecin de Igs, cuando hay interaccin
entre linfocitos T y B.
La existencia de- esta necesidad de colabora
cin se conoce desde hace tiempo, cuando se
estudiaron ratones irradiados y repoblados con
poblaciones linfocitarias de diferentes o rg e
nes; se vio que para la induccin de sntesis de
anticuerpos era necesario que se repoblaran con
linfocitos de mdula sea (que se sabe son ri
cos en linfocitos B) y de timo o conducto linf
tico (ricos en linfocitos T). Luego se demostr
que los linfocitos derivados de la mdula sea
son los precursores de las clulas secretoras de
Ig y que los derivados del timo no producen
nunca anticuerpos, pero que aumentan la fun
cin de aqullos. Finalmente se demostr que
ambas poblaciones deben reconocer especfica
mente al antgeno para que se desarrolle la res
puesta de anticuerpos.
Otra serie de experimentos que demostr la
existencia de colaboracin entre ambas pobla
ciones fue la realizada mediante la transferen
cia a ratones irradiados de clulas de ratones
preinmunizados con diferentes combinaciones
de haptenos y carriers. En ellos se m idi la
sntesis de anticuerpos contra el hapteno y se
demostr que, para que se produjera una res
puesta secundaria, los ratones dadores deban
ser sensibilizados con el mismo carrier que
se usaba luego para reinm unizar los ratones
transferidos. Estos resultados dieron pie a gran
des polmicas, pero demostraron que los linfo
citos T podan sensibilizarse con el carrier y
actuar sinergsticamente con linfocitos B que
haban reconocido al hapteno. Dado que ahora
sabemos que los linfocitos T y B no reconocen
de la m ism a manera y que las bibliotecas de
ambos son diferentes, estos experimentos son
fciles de comprender en estos momentos.
Estos y otros resultados demostraron la exis
tencia de los linfocitos colaboradores. Sin em
bargo, el mecanismo ntimo de la colaboracin
entre ambas poblaciones, fue ms difcil de di
lucidar y es ms complejo de lo que se supona,
pues implica dos tipos de interacciones: por una
parte, los linfocitos T producen factores que in
ducen en el linfocito B la sntesis de Igs de se
crecin y, por la otra, el linfocito B puede pre
sentar al linfocito T el antgeno (para esta fun
cin, vanse caps. 2 y 13). Adems, el linfocito
T no slo induce la secrecin de Ig en el linfoci
to B, sino que induce mitosis, acompaadas por
switch y mutaciones puntuales en la regin
variable de la cadena, y diferenciacin a plas
mocitos o a clulas de memoria.

334

Aspectos bsicos de ia inmunidad

Hoy se sabe que la simple interaccin entre

el ligando especfico con las Igs superficiales
del linfocito B induce una activacin que, en la
mayora de los casos, slo se manifiesta en la
sntesi.s y expresin en su superficie de recepto
res de alta afinidad para las lis, especialmente
IL2. Slo en el caso de antgenos timoindependientes, capaces de efectos posteriores, por su
mitogenieidad intrnseca o por la presencia de
determ inantes repetitivos, esta activacin se
acompaa de mitosis y secrecin de Igs, pero
no se produce el switch, de modo que slo se
secreta IgM, y no hay diferenciacin a linfoci
tos B de memoria.
Para que se den estos fenmenos debe haber,
en el medio que rodea al linfocito B, ILs pro
ducidas por los Hnfocitos Th y stas podrn ac
tuar slo sobre los linfocitos B que hayan reco
nocido al antgeno y que, por lo tanto, expresen
receptores para ellas. Una vez ms, la especifi
cidad de la accin de las ILs est dada por la
activacin previa de los clones especficos para
el antgeno inductor de la activacin.
El efecto de las diferentes ILs sobre cada
una de las funciones del linfocito B ha sido
muy discutido y existen diferencias entre las
distintas especies. Nuevamente aqu, debe te
nerse en cuenta que las ILs actan sinergsticamente entre ellas y, de la combinacin de ILs
que actan en el sitio donde se halla el linfocito
B y de otros factores del microambiente, ser el
resultado que se obtenga, sobre todo, la clase
de Ig que se secrete.
Desde hace tiempo se conoce que algunos
factores tienen especial efecto mitognico so
bre los linfocitos B; stos fueron llam ados
BCGF (B cell growth factors). Hoy se atribuye
a la IL2, y muy especialmente a la IL4, la fun
cin de inducir las mitosis en los linfocitos B.
La IL4 tiene un papel fundamental en la res
puesta de anticuerpos. Si bien esta interleuqui
na puede ser producida por otras clulas (linfo
citos recin emigrados del timo y clulas de la
lnea basfilo-mastocito y tal vez otras no co
nocidas an) la principal fuente de IL4 son los
linfocitos tipo Th2. Si se considera que tam
bin es necesaria para la induccin de clulas
Th2 y es mitognica para ellas, mientras que
inhibe las mitosis de las T h l, su papel no que
da slo en la induccin de mitosis en los linfo
citos B sino que pasa a modular la respuesta en
forma tal que se mantenga como una respuesta
humoral.
Otros factores influyen en la diferenciacin
celular. En un primer momento se supuso un
factor nico, que fue llamado BCDF (B cell diferenciation factor), pero actualmente se sabe
que en la diferenciacin actan varios de ellos.
Varias ILs pueden inducir el switch; entre
stas se han responsabilizado a la IL4, la IL5 y

tal vez las IL6 y las IL7. Actualmente se co n si-'

dera que la IL5 es la principal inducidora de
switch, pero nuevamente aqu lo que parece
determinar el isotipo de Ig que se producir se
ra la combinacin de varias ILs. Por ejemplo,
se ha visto en linfocitos humanos que la suma
de factores producidos por los linfocitos Th2,
en presencia de antgeno, puede inducir sntesis
in vitro de IgM, IgG, IgA e IgE. Tambin in vi
tro, los linfocitos T h l, si estn en una relacin
baja con respecto a los B, pueden inducir en s
tos sntesis de IgM, IgG e IgA pero no IgE,
mientras que cuando estn en en alta propor
cin, inhiben la respuesta de anticuerpos, tal
vez por citlisis de los linfocitos B que recono
cieron y le presentan el antgeno.
Una serie de observaciones y experimentos
han demostrado que, para la diferenciacin del
linfocito B virgen en un linfocito de B memo
ria, los linfocitos T son indispensables, pero es
posible que aqu tambin varias ILs acten sinergsticamente. Si se tiene en cuenta que un
linfocito B de memoria se diferencia de uno vir
gen en varios aspectos, no slo en su mayor so
brevida, sino tambin en sus patrones de migra
cin, la presencia de switch y su capacidad de
presentar antgenos a los linfocitos T, es posible
suponer que varias ILs tuvieron que actuar.
Por ltim o, debe tenerse en cuenta el m i
croambiente en que se produce la interaccin
T-B. En efecto, esta interaccin tiene lugar casi
siempre en los rganos secundarios y ms es
pecficamente en los folculos primarios, cons
tituidos principalmente por linfocitos B. Luego
de la entrada de un antgeno, las prolongacio
nes de las clulas dendrticas, portadoras del
antgeno, penetran en el folculo, y tambin pe
netran los linfocitos T que han sido estim ula
dos en la regin timodependiente, convirtin
dolo as en un folculo secundario. La impor
tancia del medio ambiente se comprende si se
tiene en cuenta que, si el antgeno ha penetrado
por piel o sangre, de manera que la interaccin
se produce en los ganglios aferentes o en el ba
zo, respectivamente, el resultado es la sntesis
en proporcin mayoritaria de Igs de las diferen
tes subclases de IgG, mientras que, si la pene
tracin del antgeno fue a travs de las muco
sas, de modo que la interaccin se hace en el
tejido linfoide asociado a stas, el resultado es
una sntesis de una gran proporcin de IgA y,
en menor medida, IgE, que priman sobre la sn
tesis de IgG.
Interaccin T-T. Regulacin
de los linfocitos T
La interaccin entre diferentes subpoblacio
nes de linfocitos T se comenz a conocer cuan
do se comprob que la repoblacin de animales

Regulacin de la respuesta inmune

irradiados, con linfocitos T provenientes de di
ferentes rganos, poda llevar a una accin sinergstica entre s. Ms tarde, se demostr que
cuando los linfocitos T provenan de animales
hechos tolerantes a un antgeno, podan disnoinuir la respuesta de los linfocitos de un animal
con una reaccin positiva a ese mismo antge
no, lo que llev a la postulacin de la existen
cia de linfocitos T supresores. Hoy se tienen
evidencias de que ambas funciones, regulacin
hacia arriba o hacia abajo de una respuesta da
da, pueden ser ejercidas, segiin las circunstan
cias, por clulas de una misma subpoblacin y
no se han encontrado evidencias de la existen
cia de linfocitos T con funcin supresora ex
clusiva.
Cuando se trata de analizar la regulacin de
los linfocitos T, deben tenerse en mente varios
conceptos. El primero es que sta se hace, co
mo todas las interacciones entre Hnfocitos, a
travs de molculas no especficas para el ant
geno producidas por clulas que s lo son y que
el estmulo para que se secreten estas molcu
las es doble; el antgeno y alguna de esas mol
culas. El segundo es que para que estas mol
culas acten deben existir receptores para ellas
en la superficie de la clula a quien va dirigida
la seal, y para que existan estos receptores el
linfocito debe estar contactando o haber con
tactado recientemente con su antgeno especfi
co. El tercero es que, salvo en casos excepcio
nales que posiblemente no se den in vivo, las
molculas no actan solas sino que actan sinergstica o antagnicamente entre s. Adems,
el sistema inmune recibe seales de otros siste
mas que influyen en su respuesta.
De esto se desprende que, pese a que el sis
tema inmune est particionado en clones, que
reconocen y reaccionan frente a un solo deter
minante antignico, la respuesta a uno de ellos
influye en las respuestas a otros determinantes,
pertenezcan o no a una misma molcula. As,
las ILs que se producen en respuesta a un ant
geno de alto poder inm unognico pueden au
mentar la respuesta a uno de bajo poder; ste es
el mecanismo de accin de muchos adyuvan
tes, sobre todo los derivados de bacterias, que
se usaron durante mucho tiempo en forma em
prica.
Las funcin efectora de los linfocitos T hl
ser analizada en el captulo 16 y la activacin
y funcin de los linfocitos T citotxicos, en el
captulo 21.
Entre los linfocitos T h l y Th2 existen meca
nismos de regulacin cruzada; algunos se co
mentaron antes, al discutir la induccin de su
diferenciacin hacia uno u otro de estos fenoti
pos funcionales.
Se vern aqu las acciones de las citoquinas
cuyos efectos regulatorios mejor se conocen in

335

vitro y que parecen tener mayor importancia in

vivo, como lo son la IL2, IL4, ILIO, I L l 2 y el
IFNy.
Funcin regulatoria de la IL2. La interac
cin entre linfocitos T es necesaria para todas
las funciones de stos. En efecto, como ya se
mencion, los linfocitos T vrgenes estn en es
tado de precursores y para que se conviertan en
efectores, deben recibir seales no slo del an
tgeno y de la clula presentadora, sino tambin
de factores producidos por los propios linfoci
tos T. Frente a esta situacin podra pensarse
que la iniciacin de una respuesta es imposible,
pero debe tenerse en cuenta que la activacin
del hnfocito T virgen por el antgeno y las se
ales accesorias, lleva a la sntesis no slo de
receptores para IL2, sino tambin de IL2, y que
sta puede actuar en forma autocrina sobre el
mismo linfocito que la produjo, induciendo en
l mitosis y diferenciacin.
La IL2 tiene as un papel imprescindible en
la iniciacin de las respuestas inmunes, pues
induce mitosis y diferenciacin en p r c tic a
mente cualquier linfocito que haya reconocido
el antgeno y exprese receptores para ella. Es el
principal factor de crecimiento de los linfocitos
T y es indispensable para el mantenimiento in
vitro de lneas de linfocitos T. Segn todos los
experimentos realizados in vitro, sera necesa
ria para que puedan generarse linfocitos T citotxicos efectores (vase cap. 12) y linfocitos
colaboradores de tipo Thl o Th2. Si bien los
primeros son capaces de secretar IL2, de modo
que podran autoactivarse y autom antenerse,
los tipo Th2 no sintetizan IL2, sino IL4 y otras.
In vitro, en ausencia de IL2, no se generan lin
focitos productores de IL4, incluso si se agre
gan otros factores de crecimiento T, com o la
IL12.
El papel fundamental de la IL2 en la induc
cin de linfocitos Th2 ha sido confirm ado in
vivo mediante experimentos que han mostrado
que la eliminacin de la funcin de la IL2 por
anticuerpos dirigidos contra ella, disminuye la
produccin de IL4 e induce un aumento de la
funcin T hl. Sin embargo, ratones knock o u f
a los que se les elimin el gen de la IL2, pue
den producir IL4, por lo que podra haber otros
factores que permiten la diferenciacin de clu
las precursoras a clulas Th2.
De todas m aneras, recordem os que es una
sobresimplificacin pensar que cada uno de los
linfocitos que actan en una respuesta inmune
en un organismo est estrictamente polarizado
en alguna de estas funciones dado que puede
actuar en forma intermedia.
Funcin regulatoria ce la IL-4. La presencia
de IL4 aumenta la produccin de clones que la
producen y estimula sus funciones. En efecto,
la presencia de IL-4 hace que los linfocitos T

336

Aspectos bsicos de la inmunidad

vrgenes se diferencien a Th2 y es necesaria pa

ra la produccin de IL5, es decir, en su ausen
cia no se completa la diferenciacin funcional.
En esta funcin, actuara directam ente sobre
los linfocitos T vrgenes.
Sobre los linfocitos Th2 ya diferenciados, la
IL4 es un potente mitgeno y aumenta la proli
feracin de Th2 sobre todo en presencia de IL l.
Adems, inhibe la diferenciacin de los T
precursores a T H I, posiblemente por un efecto
sobre los macrfagos.
Funcin regulatoria de la ILIO. La ILl O es
un potente inhibidor de la funcin de los T hl.
Por una parte, inhibe la diferenciacin de los T
precursores a Th 1, posiblemente a travs de los
macrfagos, en los que reduce la expresin su
perficial de la molcula B7 que, como ya se
mencion, es una importante segunda seal pa
ra su diferenciacin. Por la otra, en los T h l
sensibilizados, inhibe la sntesis de IL2 e IFNy.
Funcin regulatoria del IFNy. El IFNy tiene
una im portante funcin regulatoria pues au
menta la funcin T hl y disminuye la Th2. En
efecto, inhibe la diferenciacin de linfocitos T
precursores a Th2, as como la proliferacin de
clones Th2 presensibilizados, en los que, ade
ms, limita la produccin de IL4. Esto ltimo
tiene a su vez un efecto indirecto por la funcin
de la IL4 en la diferenciacin de Th2.
Adems, estimulara la diferenciacin a Thl
en presencia de IL2. Si bien estos efectos han
sido demostrados in vitro, su funcin in vivo
tambin parece similar, pues anticuerpos anti
IFNy resultan en menos produccin de IFNy y
ms de IL4, que podra ser directo o indirecto,
a travs de la IL4. Tambin se ha visto que el
IF N a produce aumento de IFNy y disminucin
de IL4. Sin embargo, experimentos in vitro han
demostrado que pequeas concentraciones de
IFNy pueden tener efectos opuestos.
Funcin regulatoria de la 1LI2. La 1L12, es
producida por los linfocitos T hl pero tambin
por las clulas NK y las clulas B. Aumenta la
diferenciacin de precursores a clulas T h l, ac
tuando directamente sobre aqullos, aun en au
sencia de IFNy, y tambin indirectamente pues
reduce el efecto inhibitorio de 1L4 sobre la sen
sibilizacin para T h l. Su efecto final es au
mentar la sntesis de IFNy al aumentar el nu
mero de clulas que lo producen.
El resultado final de la accin combinada de
estas citoquinas es que tienden a aumentar la
polarizacin de la respuesta hacia el sentido de
sntesis de anticuerpos o respuesta de tipo celu
lar. Esto puede ser importante desde un punto
de vista clnico, si se tiene en cuenta la falta de
especificidad de las citoquinas; un organismo
que, en el momento de entrada de un antgeno,
est respondiendo a otro con un tipo de res
puesta va a modular su respuesta en forma di

ferente a lo que vena haciendo. Este efecto se

ha postulado para explicar, por ejemplo, la di
ferente evolucin de los enfermos de SIDA en
frica, pues en esta regin la infestacin con
parsitos helmintos es muy comn y muy alta,
y el sistema inmune responde a ellos con acti
vacin de linfocitos de tipo Th2.
Existen los linfocitos supresores?
La creencia en la existencia de los linfocitos
supresores sufri fuertemente los avalares de
la moda. Luego de que fuera descubierto el
efecto supresor de una reaccin dada por linfo
citos provenientes de animales tolerantes, se
comenzaron a estudiar sus mecanismos de ac
cin y se describieron varios circuitos, que in
cluan hasta cinco subpoblaciones supresoras,
que actuaban directa o indirectamente a travs
de macrfagos y que podan ser linfocitos idiotpicos y antiidiotpicos. Ms aun, se describi
la existencia de linfocitos contrasupresores,
que no actuaban solos sino inhibiendo la su
presin causada por los supresores, y de linfo
citos contra-contrasupresores, que inhiban a
stos. Todos los experimentos realizados para
definir estas funciones se hicieron por m ez
clas, ya sea in vitro o por repoblacin de ani
males irradiados, de poblaciones celulares pro
venientes de ratones que haban recibido dife
rentes tratamientos inmunizantes. Pero, en ge
neral, fueron limitados ya que slo se meda
una reaccin dada (proliferacin, citotoxici
dad, sntesis de Igs) y no se poda m edir su
efecto en otras reacciones simultneas.
Cuando se comenzaron a aislar poblaciones
puras de clones de linfocitos T y se pudo medir
in vitro los factores que producan frente a di
ferentes estmulos, se comprob que no existen
poblaciones que tengan siempre efecto supre
sor y ni siquiera hay factores que tengan efecto
supresor sobre todas las funciones. Los hnfoci
tos supresores se convirtieron entonces en un
anatema, cuya existencia la mayora de los in
vestigadores prefiere no mencionar.
Sin embargo, hay mltiples mecanismos de
supresin de respuestas, pues casi todos los
factores producidos por los linfocitos T pue
den, directa o indirectamente, disminuir las res
puestas de otros linfocitos T. Por una parte, los
factores producidos por los T h l, si bien au
mentan la funcin de s mismos, tienden a dis
minuir las de los Th2, y viceversa. Pero es ms,
muchos factores estudiados in vitro, que en una
concentracin tienen efecto de regulacin posi
tiva, en otra concentracin pueden tener el
efecto contrario, aun sobre la misma funcin.
Hasta ahora, no se sabe cual es la concentra
cin efectiva in situ de cada una de las linfo
quinas conocidas.

Regulacin de la respuesta Inmune

H asta tanto no se aclaren m uchos de los
conceptos actuales, debe admitirse que los lin
focitos T pueden tener funciones supresoras,
que stas se ejercen a travs de sus factores, y
por lo tanto en forma inespecfica, y que el re
sultado final de supresin depender de la pre
sencia o ausencia de factores de otras clulas,
del microam biente en el que se producen las
interacciones y de la condicin en que est el
linfocito que recibe la seal.
Un factor que en los ltimos tiempos ha ad
quirido importancia en los mecanismos de su
presin es el factor de crecim iento transfor
mante (transform ing grow th factor) o TGpp.
El TGF fue descubierto como un factor produ
cido por clulas cancerosas, capaz de hacer
crecer y transformar in vitro clulas normales.
Luego se determin que existan varios com
ponentes en este grupo y que clulas del siste
m a inm une podan secretar T G E ^ l, que es
producido por varios tipos celulares, entre los
que se cuentan los macrfagos y los linfocitos
T CD8+. In vitro, los efectos de TG pp son muy
pleiotrpicos, pues puede inhibir o estimular el
crecimiento de clulas, dependiendo ello de las
condiciones del medio.
La funcin en la respuesta inmune de este
factor fue discutida porque en sta tambin sus
efectos son pliotrpicos y hasta antagnicos:
aunque in vitro induce una disminucin de la
produccin de IL4 con aumento del IFNy, in
vivo inhibe las respuestas defensivas de tipo
T h l, segn se comprob en ratones parasitados. Si bien induce switch a IgA en linfoci
tos B de ratones, tambin parece ser importan
te en la induccin de tolerancia por va oral:
esto fue estudiado en animales con encefalitis
experimental, en los que la enfermedad puede
disminuirse mediante la ingestin del Ag. En
este caso, el efecto es mediado por linfocitos
CD8+, especficos para el antgeno usado, pro
ductores de TGF(3 y por este factor.
En general, la mayora de los autores coinci
den hoy en que el TGFp es una anti-citoquina, pues inhibe la accin de otras citoquinas y
linfoquinas. En efecto, se ha demostrado que
inhibe la proliferacin de linfocitos T estim u
lados, la maduracin de linfocitos T citotxi
cos y la accin de citoquinas proinflamatorias
sobre macrfagos, polimorfonucleares y otras
clulas de la inflamacin. Recientemente se ha
co n firm ad o el efecto su p re so r in vivo del
TGFp, mediante el uso de ratones knock out
a los que se suprimi el gen de TGFp: estos
animales desarrollan reacciones inflamatorias
incontroladas y, a los pocos m eses de edad,
una serie de enfermedades autoinmunes.
Otro de los m ecanism os que ha sido p ro
puesto como supresor y que podra estar invo
lucrado en ia regulacin hacia abajo de una

337

respuesta en marcha, sera por el efecto citot

xico que han dem ostrado muchos linfocitos
Th CD4+, o por los propios linfocitos citotxi
cos clsicos CD8+, que podra lisar las clulas
que le presentan el antgeno.
En ambos casos, las clulas CD8+ ya sea d i
rectamente, por eliminacin de clulas reacti
vas, o bien indirectamente, por produccin de
TGFp, tienen un papel importante en la inhibi
cin o supresin de respuestas. Esto coincide
con todos los primeros trabajos sobre linfoci
tos T supresores, en los que se atribuy la su
presin a los linfocitos T CD8+. Tan es as que
en muchas partes todava se clasifica a la p o
blacin CD8+ como citotxico/supresora.
Sea cual fuere la form a de accin de la su
presin, debe tenerse en cuenta que toda re s
puesta inm une positiva est acom paada de
fenmenos regulatorios que la limitan. Luego
de una inm unizacin, aun antes de que se a l
cance el pico de la respuesta, aparecen fen
menos de regulacin h acia abajo, ejercidos
por la com binacin de factores de linfocitos
T. Estos conceptos tienen aplicaciones prcti
cas, y una de ellas es en los planes de vacuna
cin. D ado que todos los factores secretados
por los linfocitos son inespecficos, la inm uni
zacin con dos o ms antgenos sim ultnea
mente puede aumentar la respuesta hacia uno
de ellos, sobre todo si es poco inm ungeno
p er se, pues aprovecha las ILs inducidas p o r
los otros; es la base del efecto de varios adyu
vantes. Sin embargo, si se vacuna con un an t
geno y algunos das despus se inyecta un se
gundo antgeno, la resp u esta a este ltim o
puede verse disminuida, por presencia de fa c
tores que estn regulando hacia abajo la re s
puesta al primero.
MECANISMOS
DE RETROALIM ENTACIN
POR INM UNOGLOBULINAS
Si bien los linfocitos T son los principales
iniciadores y reguladores de la sntesis de Igs,
stas tam bin conforman un perfecto sistem a
de regulacin por retroalim entacin (feed back); si estn en muy baja concentracin con
respecto al antgeno, aum entan la resp u esta
mientras que, si estn en alta concentracin re
lativa, la disminuyen.
La capacidad de las Igs especficas de a u
mentar o disminuir las respuestas a un antge
no es especialm ente notable en las experientiae naturae que nos brinda la naturaleza. Si
bien la mayora de los vertebrados, incluido el
hombre, nace con su sistema inmune ya m a
duro, con sus clones formados y sus rganos
secundarios sembrados con ellos, pasa por un

338

Aspectos bsicos de la Inmunidad

perodo de inm unodeficiencia fisio l g ica

durante el cual su respuesta a una vacunacin
es mala. Esto se debe a: 1) en parte, a la falta
de interaccin entre sus clones, que no slo
pueden colaborar por sus ILs no especficas
en respuesta a otros antgenos sino que, como
veremos luego, mantienen entre s un equili
brio dado por la red de Jem e, y 2) en parte, a
la presencia de Igs m aternas, que le fueron
transferidas por la madre a travs de la p la
centa y/o el calostro.
Si la madre fue vacunada durante su preez,
la falta de respuesta es especialmente notable
en su hijo y hasta puede extenderse en forma
de tolerancia, si se lo revacuna cuando los an
ticuerpos maternos ya han sido consum idos.
Hubo un exceso de anticuerpos especficos lo
que indujo una inhibicin de la respuesta.
Pero en aquellas especies cuya placenta es
impermeable a las Igs y reciben toda la Ig ma
terna a travs del calostro, si no maman o ab
sorben bien el calostro, su respuesta a cual
quier antgeno, incluso a los microorganismos
ambientales de baja patogenicidad contra los
cuales los recin nacidos se protegen rpida
mente bien, es mala, y su vida corre serio pehgro. Ello es debido a que estn ausentes las Igs
que directamente, o por reaccin cruzada, pue
dan reconocer al antgeno y ayudar a la inicia
cin de la respuesta.
Los mecanismos por los cuales la Ig espec
fica, en pequea concentracin respecto al an
tgeno, puede colaborar para iniciar o aumen
tar una respuesta se basan principalnente en la
formacin de complejos. Por una parte, stos
hacen ai antgeno ms fagocitable por los ma
crfagos, no slo por su accin opsonizante si
no porque, al convertir antgenos pequeos o
solubles en precipitados, pueden darles tamao
suficiente para ser fagocitados. La importancia
de los macrfagos en la iniciacin de la res
puesta inmune ya ha sido analizada. Por otra
parte, la fijacin de complemento no slo au
menta la fagocitosis por el C3b, sino que las
fracciones C3a, C4a y C5a liberadas producen
inflamacin y acumulan clulas inm unocom
petentes en el sitio de ingreso del antgeno.
Otra funcin importantsima de los comple
jos en exceso de Ag es a travs de las clulas
dendrticas, pues stas tienen efectos muy po
tentes en la estimulacin primaria y tal vez son
indispensables, en ciertas circunstancias, para
iniciar respuesta en T vrgenes. Como ya se
mencion, las clulas dendrticas ofrecen sus
grnulos de antgeno a las clulas B y as las
activan. Las clulas B activadas, pero no en re
poso, podran presentarlo a los linfocitos T vr
genes.
Las Igs tienen tam bin im portancia en el
m antenim iento de una respuesta y lo hacen

principalmente a travs del secuestro del ant

geno sobre las clulas dendrticas. Cuando la
concentracin de Igs desciende, se libera el an
tgeno y es transferido al linfocito B de mem o
ria, lo que inicia un nuevo ciclo de estim ula
cin, con neosntesis de Ig y reposicin de c
lulas B de memoria. Por el contrario, cuando
la co ncentracin de anticuerpos es alta, su
efecto es disminuir la respuesta. Este fenme
no fue uno de los primeros mecanismos regu
latorios descritos, cuando se comprob que la
plasmafresis o las sangras repetidas pueden
aumentar la sntesis de anticuerpos y, por el
contrario, la inyeccin de anticuerpos prefor
mados puede inhibir la respuesta. Tam bin,
fue el prim er conocim iento de inm unologa
b sic a , que lle v a un m to d o in m u n o te raputico no emprico, como es el tratamiento
preventivo de la sensibilizacin de madres Rhluego del parto de un hijo Rh+. Si inmediata
mente despus del parto se adm inistran a la
madre anticuerpos anti-Rh, no se sensibiliza y
no producir anticuerpos que pongan en peli
gro la vida de sus futuros hijos.
Este fenm eno de inhibicin por retro ali
m entacin se hace por varios m ecanism os y
tambin a travs de la formacin de complejos
inmunes con el anticuerpo en exceso sobre el
antgeno, y depende en gran parte de que el
anticuerpo sea completo; el efecto de las frac
ciones Fab es mucho menor.
Una de las primeras consecuencias de la for
macin de estos complejos es que gran parte
del antgeno es eliminado, generalm ente por
fagocitosis y digestin. Este efecto neutrali
zante es ms evidente si se trata de un organis
mo vivo, cuando los sistemas efectores inm u
nes pueden inhibir su replicacin.
Pero adems existe otro mecanismo, basado
en el ligamiento cruzado de receptores para el
Fe y para el antgeno en la superficie del linfo
cito B. En efecto, los determinantes antignicos an libres de estos complejos pueden ser
reconocidos por los linfocitos B a travs de sus
Igs de superficie y, simultnemente, los recep
tores Fe ligan al complejo por los fragmentos
Fe del anticuerpo. Este entrecruzamiento blo
quea la fase productiva de la respuesta B indu
cida por los linfocitos T y lleva a ese linfocito
B a la tolerancia.
Si bien la IgG tiene efecto inhibidor de la
respuesta, la IgM tiene un efecto contrario. Si
se inyecta IgM junto con el antgeno, la canti
dad de clulas formadoras de anticuerpos de
clase IgG es mayor mientras que, si se la eli
mina, la respuesta es menor. El mecanismo por
el cual la IgM aumenta la produccin de IgG
no es conocido, pero es evidentemente til en
la produccin de una respuesta de tipo secun
dario.

Regulacin de la respuesta inmune

R EG U LA C I N P O R IN TER A C C IO N ES
ID IO T PIC A S
Las molculas de Igs, en sus regiones hipervariables que forman el sitio de combinacin
del antgeno, o paratope, presentan caractersti
cas individuales que son, en s mismas, deter
minantes antignicos o idiotopos. Cada m ol
cula individual puede presentar varios idioto
pos, los que constituyen el idiotipo de esa mo
lcula (vase cap. 5). Dada la variabilidad de
las Igs de cada organismo, hay muchos miles,
tal vez muchos millones, de idiotipos diferentes
en un individuo.
Jeme postul que la diversidad de idiotipos
sera como un espejo de la diversidad de ant
genos en el mundo externo y, si los linfocitos
pueden reconocer todos los determinantes anti
gnicos externos, pueden reconocer tam bin
los idiotipos internos. Formaran as una o va
rias redes dependientes del reconocim iento
idiotipO/anti-idiotipo, que interconeetaran las
distintas subpoblaciones de clulas especficas.
Para cada clon de clulas capaces de reconocer
un antgeno (o ms correctamente un epitope),
al que llam clon 1, existiran clones (clon 2)

339

que reconoceran el idiotipo de ese clon. A su

vez, para estos clon 2, existiran clones (clon 3)
que lo reconocen, y as sucesivamente, hasta
formar una red, que podra ser cerrada o abier
ta, para incluir todos los clones de la poblacin
celular. Daba por sentado que estos clones re
conocen tambin los antgenos externos. Jem e
propuso que la expansin del clon 1, inducida
por un antgeno externo, estimulara al clon 2,
que producira anticuerpos capaces de neutrali
zar al clon 1 y disminuir as la produccin de
anticuerpos de esa especificidad. A su vez, la
expansin del clon 2 estimulara al clon 3, que
frenara la accin del clon 2 y perm itira una
nueva expansin del clon 1. Otra vez, la expan
sin del clon 3 estimulara al clon 4, que inhi
bira al 3, y as sucesivamente. Esta red abierta
implicara una posibilidad para que el sistema
inmune se autorregulase (fig. 18-2).
La geniahdad de Jem e fue postular esta teo
ra, que luego fue demostrada en gran parte por
mltiples observaciones y experimentos, cuan
do no se tenan datos an para ello.
Ya haba llamado la atencin que, al hiperinmunizar a un animal, cuando puede observarse
un aumento total de las Igs circulantes, este au

F ig. 18-2. Esquem a de la red de regulacin por antiidiotipo. El clon 1 reconoce a un epitope por el paratope de sus ig s de
superficie, lo cual lo lleva a .su estim ulacin y expansin. El clon 2 reconoce al idiotipo del clon I: la expansin d e ste lo
estim ula. Los productos de estim ulacin del clon 2 producen, por una parte, la iniiibicin del clon I y la estim ulacin del
clon .3. ste a su vez, intiibe al clon 2 y estimula aJ clon 4, etc. D e esta m anera se mim tiene el equilibrio activo del sistem a
inm une. Estos clones no slo reconocen los idiotipos de otros paratopes .sino que pueden reaccionar, adems, contra epitopes externos.

340

Aspectos bsicos de la inmunidad

ment no est dado solamente por anticuerpos

dirigidos contra el antgeno usado sino que tie
nen otras especificidades. A partir de la formu
lacin de la hiptesis, vai'ios investigadores pu
dieron demostrar la existencia del clon 2 antiidiotpico, y la aparicin de clulas productoras
de anticuerpos anti-idiotpicos aun antes de que
la secrecin de anticuerpos llegue a su pico
mximo. Tambin se demostr la existencia de
clones 3, 4 y 5.
Cuando se produjeron anticuerpos anti-idio
tpicos, pudo com probarse que su inyeccin
poda tener efecto inhibitorio de la respuesta B,
o incluso T, al antgeno. Pero tambin se vie
ron anticuerpos anti-idiotpicos capaces de au
mentar la respuesta al antgeno, cuyo efecto se
explica de la siguiente manera. Cada Ig espec
fica presenta varios epitopes, por lo que puede
estimular la sntesis de varios anticuerpos antiidiotpicos. Algunos de estos, pero no todos, se
unen al paratope exactamente de la misma ma
nera en que se une el antgeno y no slo compi
ten con l in vitro sino que, al interactuar con la
Ig superficial del linfocito, inducen una seal
similar a la del antgeno. Esos anticuerpos y los
clones que los producen, que son la imagen in
terna de un antgeno externo, son estimulantes
de la respuesta. Los que no se unen al paratope
exactamente igual que el antgeno podran en
cambio producir inhibicin del clon, ya sea por
citotoxicidad, fijando complemento que mata a
la clula sobre la que se unieron, ya sea por un
mecanismo similar al de los complejos inm u
nes, al producir un ligamiento cruzado del re
ceptor para el Fe y las Igs superficiales.
En la red que postulara Jeme, el clon 1 esti
mula al clon 2; en este caso, el clon 1 es la ima
gen interna del antgeno externo para el cual
est predeterm inado el clon 2 (fig. 18-2). La
existencia de anticuerpos anti-idiotpicos ima
gen interna ha tratado de ser utilizada para la
inmunizacin con vacunas que no tengan el an
tgeno, y por lo tanto no obliguen a la produc
cin de grandes cantidades de m icroorganis
mos, cuyo escape es siempre potencialm ente
peligroso. Sin embargo, si bien estos anticuer
po imagen interna pueden actuar aumentando
la respuesta al antgeno convencional, no se ha
logrado una buena inmunizacin protectora con
ellos en ausencia de ste, por lo que la investi
gacin est siendo reem plazada en el sentido
del uso de vacunas obtenidas por ingeniera ge
ntica, que estn mostrando mejores resultados.
Sin embargo, la existencia de redes que interconectan los diferentes clones entre s tiene
un importante sentido fisiolgico. Por una par
te, interviene en la regulacin de las respuestas
y permite moderar las respuestas a cada antge
no, como se indic ms arriba. Por otra parte,
contribuye a que las respuestas de los indivi

duos contra antgenos externos mejoren con el

paso del tiempo, lo que explica parcialmente la
inm unoincom petencia de los recin nacidos.
En efecto, en el m om ento del nacim iento, si
bien los clones existen, estn en un estado de
reposo y en un equilibrio a nivel mnimo entre
ellos. La estim ulacin de un grupo relativa
mente pequeo de clones luego de la entrada
de un antgeno induce la estimulacin de mu
chos ms, lo que lleva al sistema inmune en ge
neral a un nuevo equilibrio, a un nivel ms alto
que el anterior. Sucesivas estimulaciones lle
van a aum entos sucesivos del nivel de este
equilibrio, hasta lograr un equilibrio semejante
al del adulto, que se traduce en un nivel de Igs
circulantes propio de esta edad. Adems, al es
timularse clones contra antgenos no relaciona
dos, se mejora la respuesta inmune a esos ant
genos, al proveer esa pequea cantidad de anti
cuerpos til para inicial' una respuesta primaria.
La consideracin prctica que resulta de esto
es que la estimulacin permanente que recibe
el sistema inmune por antgenos ambientales es
la base de su correcto funcionamiento frente a
agresiones por patgenos. Por eso, al criar a los
nios en ambientes excesivamente protegidos,
puede no estimularse suficientemente a su sis
tema inmune por antgenos externos y, llegado
el caso, su respuesta frente a un patgeno pue
de ser deficiente.
TOLERANCIA
Concepto
Se entiende por tolerancia la capacidad espe
cfica y adquirida por el sistema inmune para
no responder a uno o ms antgenos, mientras
mantiene su capacidad para responder a todos
los otros. Esta especificidad es lo que distingue
la tolerancia de la inmunodeficiencia, en la que
la respuesta a todos los antgenos est anulada
o disminuida.
La enorme capacidad agresiva del sistema
inmune exigi que, junto con esta funcin de
agresin, evolucionaran sistemas capaces de
evitar la autoagresin, de manera que pudiera
atacar sustancias externas sin atacar a sus pro
pios constituyentes. Si la tolerancia contra lo
propio falla, se producen enfermedades autoin
munes que pueden ser muy graves.
La autotolerancia es un mecanismo propio
de todos los individuos, que se establece duran
te e l desarrollo fetal y se mantiene durante toda
la vida, pero tambin existen otros tipos de to
lerancia que pueden establecerse luego de la
maduracin del sistema inmune. Un caso im
portante de tolerancia de este tipo, indispensa
ble para la perpetuacin de las especies vivpa

Regulacin de la respuesta inmune

ras, es el de la madre con respecto al feto, al
que tolera durante todo el embarazo pese a que
es semi-alogeneico y debera ser rechazado.
Ambos tipos de tolerancia son diferentes,
llevados a cabo por distintos m ecanism os y
fueron denominados, respectivamente, toleran
cia neonatal o central y del individuo adulto o
perifrica. Estos trminos no son correctos y
deberan ser llamados fetal o primaria y del in
dividuo maduro o secundaria, como veremos
luego.
Tolerancia fe t a l. AutotoLerancia
Se define como tolerancia fetal a la tolerancia
que se establece durante la maduracin del sis
tema inmune, que est basada en la ausencia de
clones reactivos por lo que puede ser rota m e
diante la transferencia de linfocitos no toleran
tes normales y que no se transmite de un animal
a otro mediante la transferencia de clulas.
Esta tolerancia, establecida durante el desa
rrollo fetal y mantenida durante toda la vida del
individuo, es la base de la autotolerancia, cuya
necesidad ya fue intuida por Ehrlich cuando
postul la existencia del horror autotoxicus.
La primera observacin sobre tolerancia fe
tal fue hecha por Owen en 1945 cuando estudi
varios casos e freemartins, es decir, terneros
mellizos no gemelares, que comparten en tero
la misma placenta y que despus de nacidos
son quim eras que llevan clulas sanguneas
propias de ambos mellizos. Estos freemartins,
pese a que son genticamente dismiles, no ha
cen respuestas inmunes contra el otro y hasta
aceptan injertos de piel cruzados. Esta observa
cin llev a Brent y Medawar a realizar una se
rie de experim entos en los que dem ostraron
que, si se inyectan ratones recin nacidos de
una cepa, con clulas viables-de otra cepa alo
geneica, los animales as tratados, al hacerse
adultos, aceptan transplantes de la cepa dadora.
Demostraron que esta tolerancia es especfica,
pues no aceptan transplantes de una tercera ce
pa no relacionada. Otro concepto que estable
cieron es que el antgeno debe permanecer en
el organismo para que la tolerancia se manten
ga. En efecto, para que los ratones se hicieran
tolerantes y aceptaran injertos de piel al llegar
a adultos, deban ser inyectados con clulas
viables y no con extractos celulares que indu
cen slo una tolerancia pasajera.
El hecho de que se pueda inducir el rechazo
del injerto, si a estos ratones tolerantes se les
inyectan linfocitos de un ratn singeneico no
tratado, llev a que se postulase que la toleran
cia dependa de la delecin de los clones que
reconocen antgenos propios.
Este tipo de experimentos fueron realizados
en otras especies animales con resultados simi

341

lares, salvo que para la mayora de las especies

la inmunizacin debe hacerse in tero para que
se establezca la tolerancia. Tambin fueron co
rroborados por observaciones sobre el efecto
de virus capaces de atravesar la placenta y con
tagiar al feto. Cuando un virus, aun uno poco
patgeno para los adultos o recin n acidos,
contagia a una hembra gestante, las consecuen
cias para el feto pueden ser mucho ms graves
que para la madre, sobre todo si el contagio se
hace durante el prim er tercio de la gestacin.
As, por ejemplo, la rubola, que es una enfer
m edad lev e en los in d iv id u o s de cu alq u ier
edad, puede producir muerte o malformaciones
fetales. En form a parecida, muchas vacunas
por virus vivos atenuados pueden tener conse
cuencias graves para el feto; en otros casos, c o
mo sucedi con una vacuna atenuada contra la
peste porcina, el animal nace sano pero se hace
tolerante al virus vacunal al que contina alber
gando toda la vida, de modo que no slo no
responde a la vacuna sino que, si es infectado
por el virus patgeno, no puede defenderse y
muere.
Todos estos datos llevaron a comprender que
si el sistem a inmune se pone en contacto con
un antgeno durante su maduracin, la conse
cuencia es la tolerancia especfica hacia ese an
tgeno. En la mayora de las especies, la capa
cidad para responder a los antgenos externos
com ienza a aparecer durante la gestacin, no
as en el ratn que nace an inmaduro inmunolgicamente, con lo que puede hacerse toleran
te neonatalmente. Esto hizo llamar tolerancia
neonatal a lo que en realidad es tolerancia fetal.
Los mecanismos que llevan a esta tolerancia
fueron discutidos durante mucho tiempo y al
gunos son conocidos hoy. Durante un tiempo,
se supuso que haba una delecin o aborto clo
nal de todos los linfocitos capaces de reconocer
lo propio. Sin embargo, hoy se sabe que es in
dispensable para los linfocitos T reconocer lo
propio para poder reaccionar contra lo extrao.
Es ms, si se estimulan in vitro linfocitos de un
individuo normal, es bastante fcil obtener an
ticuerpos contra antgenos propios de ese indi
viduo, lo cual demuestra que existen clones de
linfocitos B potencialmente autorreactivos, que
in vivo no secretan anticuerpos. Adems, p u e
den aparecer autoanticuerpos en ciertas situ a
ciones de dao o lesin tisular. Por ejem plo,
luego de un infarto o de una operacin carda
ca, pueden haber anticuerpos antimiocardio cir
culantes, pero la reaccin es efmera y no deja
secuelas. Si la lesin se produce en otros rga
nos, aquellos a cuyos antgenos se los ha llam a
do secuestrados pues estaran separados por
barreras hemticas, como las gonadas o el sis
tema nervioso central, la agresin puede ser autoperpetuante. Todo esto indica que ex isten

342

Aspectos bsicos de la inmunidad

mltiples factores que inciden en el estableci

miento de la autotolerancia.
Una serie de experimentos demostraron que
puede establecerse tolerancia tanto a nivel de
los linfocitos T eomo de los B y que en la autotolerancia existen ambas pero, como en todas
las reacciones inmunes, el que manda es el T y
la base de la autotolerancia es la seleccin nega
tiva que ocurre en el timo. Esta seleccin, que
se discuti en el captulo 3, no elimina los linfo
citos que reconocen los antgenos propios, sino
a aquellos que, adems de reconocer, reaccio
nan con los antgenos propios. Estos linfocitos
que reaccionan positivamente en presencia de
molculas de histocompatibilidad de clase I o II
modificadas por pptidos propios, son elimina
dos por mecanismos que an se discuten. Las
protenas plasmticas penetran en la mdula t
mica y all sera el punto donde se produce gran
parte de la seleccin negativa. Dado que el timo
puede mantener su funcin luego de la siembra
fetal de clones en los rganos secundarios, es
com prensible que el antgeno deba continuar
presente para que se mantenga la tolerancia.
Por este mecanismo, los clones autorreactivos son ehminados; esto explica que no se ha
yan encontrado linfocitos supresores contra an
tgenos propios y que la transferencia de linfo
citos normales a un ratn hecho tolerante neo
natalmente provoque la rotura de su tolerancia.
Adems de esta tolerancia central, basada en
la eliminacin o tolerizacin de los linfocitos
potencialmente autorreaetivos, existen mecanis
mos perifricos que tambin intervienen en el
horror autotoxieus, es decir, en el manteni
miento de un sistema inmune capaz de reaccio
nar contra lo no propio mientras que reconoce
pero no agrede lo propio. Muchos autores han
postulado diversas teoras para explicar esta to
lerizacin perifrica de los linfocitos autorreaetivos. Ultimamente, la Dra. Matzinger ha pro
puesto una hiptesis atractiva que explicara
muchos fenmenos difciles de entender. Esta
teora sostiene que el sistema inmune no est
basado en la distincin de lo propio y lo no pro
pio, sino que distingue lo sano de lo enfermo.
Sostiene que necesitara una segunda seal para
reaccionar y sta es la seal de peligro dada por
clulas enferm as, en estado de stress o en
proceso de muerte. La clula que muere por
apoptosis no em ite seales de peligro; pero
aquella que es invadida por un patgeno, o su
fre lesin o stress, o muere no por programa
propio, s emite seales que son las que activa
ran a los linfocitos T en reposo. En cambio, los
linfocitos que reciben seales del antgeno sin
la seal de peligro, se tolerarizaran o moriran.
Esta hiptesis parece por lo menos parcial
mente vlida: si bien una clula que muere por
apoptosis no produce factores quim iotcticos

y/o activadores de los linfocitos, toda clula en

stress produce estos factores como, por ejem
plo, las protenas de shock trmico, que s
son altamente activadoras de los distintos com
ponentes del sistema inmune. La hiptesis ex
plica, adems, por qu se pueden producir anti
cuerpos contra estructuras propias luego de una
lesin, como los ya mencionados Acs antimio
cardio luego de una lesin cardaca, y explica
tambin la desaparicin de la reaccin al desa
parecer el dao tisular.
Sea o no vlida la hiptesis, es un hecho que
toda reaccin inmune se ve aumentada por la
inflamacin inespecfica, que se produce en un
lugar de dao tisular, y que, sin inflam acin
inespecfica (p. ej., dando el antgeno como ali
mento o por introduccin de antgenos no parti
culados por va endovenosa), es mucho ms f
cil inducir tolerancia. Tambin es un hecho que
prcticamente todos los adyuvantes conocidos,
en mayor o menor grado, producen inflamacin
y dao tisular y ste es uno de sus principales
mecanismos de accin.
Tambin existe tolerancia a nivel B. La snte
sis de receptores B se hace al azar, por lo que
pueden aparecer durante toda la vida clones autorreactivos; pero, durante el perodo de madu
racin de los linfocitos B, cuando stos expre
san solamente IgM superficial, el contacto con
el antgeno puede llevarlos a la tolerancia. D u
rante un perodo se supuso que la estimulacin
dependa de que la interaccin con el linfocito
B se hiciera a travs de la IgM e IgD, y que el
contacto a travs de la IgM superficial llevaba a
la tolerancia de esa clula, pero se ha demostra
do que depende ms bien de la concentracin de
los receptores y del establecimiento del entrecruzamiento entre ellos. Este entrecruzamiento
puede llevar a la muerte del linfocito en madu
racin (aborto clonal) o, si el antgeno est en
concentraciones menores, a una tolerizacin.
Se ha comprobado que en ratones transgni
cos, cuando se hace sintetizar al animal una pro
tena no propia, desde su concepcin y en gran
des cantidades, los clones de linfocitos B capa
ces de reconocerla prcticamente desaparecen.
La aparicin de clones B autorreaetivos tam
bin puede darse en linfocitos B maduros, pues
stos sufren mutaciones puntuales luego de ser
estimulados por el antgeno y los factores de co
laboracin T. Pero aun cuando existan linfoci
tos B autorreaetivos, la ausencia de clones T ca
paces de colaborar con ellos impide que se esta
blezca una reaccin autoinmune persistente.
Esta ausencia de clones T autorreaetivos ha
ce que sea muy difcil establecer una reaccin
inmune positiva contra antgenos propios, pese
a que existan clones B potencialm ente autorreactivos. Explica tambin la desaparicin de
las respuestas autoinmunes luego de la lesin

Regulacin de la respuesta inmune

de la mayora de los rganos, pues ha habido
una seleccin negativa en el timo para los lin
focitos que reaccionaron contra sus antgenos.
Sin embargo, en aquellos rganos con barreras
hemticas (retina, testculos, etc) cuyos antge
nos estaran secuestrados y no estableceran
una perfecta tolerancia T, una lesin puede lle
var a una enfermedad autoinmune que se autoperpeta, pues los linfocitos B encuentran lin
focitos T colaboradores especficos, y la reac
cin inmune agrava la lesin con liberacin de
ms antgeno; de esta manera el rgano contralateral tambin puede ser atacado.
Tolerancia del individuo inmunolgieamente
maduro
Se define como tolerancia del individuo ma
duro a aquella que puede establecerse en indi
viduos de cualquier edad, en la que existen clo
nes capaces de reaccionar, por lo que no se
rompe por la transferencia de clulas de indivi
duos normales y que s puede ser transferida de
una animal tolerante a otro normal. La induc
cin de tolerancia en un individuo es mucho
ms difcil que en un feto, su duracin es ms
corta y posiblemente nunca sea total.
Una de las primeras observaciones con res
pecto a la posibilidad de inducir tolerancia fue
la que estudi la relacin entre la dosis de ant
geno y la respuesta. Si se inyecta un antgeno
en dosis muy altas o muy bajas, no slo no se
induce una respuesta de anticuerpos, sino que
una inyeccin posterior en dosis normalmente
inmunognicas tampoco es seguida de una bue
na respuesta. Asimismo, las inyecciones repeti
das de un mismo antgeno no slo no aumentan
indefinidamente la respuesta de anticuerpos, si
no que pueden llevar a una cada en su ttulo.
Esto se aprecia no slo a nivel experimental, si
no que es observable en enfermedades infeccio
sas o parasitarias crnicas, en las que el ttulo
de anticuerpos, luego de mantenerse en un pla
teau durante cierto tiempo, cae marcadamente.
La va de introduccin del antgeno tambin
es importante; es ms fcil inducir tolerancia
dndolo por va endovenosa u oral que dndolo
intradrmica o subcutneamente. Asimismo, un
antgeno soluble es ms tolerognico que uno
particulado.
Otras maneras de inducir tolerancia es m e
diante molculas no metabolizables, por ejem
plo, con antgenos proteicos compuestos por Daminocidos. Si se inyecta una de estas prote
nas unidas a un hapteno, se induce tolerancia
contra el carrier y tambin contra el hapteno.
En todos los casos, la tolerancia se rompe en
tiempos variables luego de la desaparicin del
antgeno y las clulas de animales tolerizados
pueden dism inuir o anular la reaccin de los

343

linfocitos de anim ales norm ales, ya sea por

mezclas in vitro o por transferencia a animales
singeneicos, es decir, actan como los contro
vertidos linfocitos T supresores.
Los mecanismos que intervienen en este tipo
de tolerancia son los que intervienen en la cola
boracin y regulacin de las respuestas inmunes
positivas y puede hacerse a nivel de linfocitos T
o B, o ambos, y de las clulas presentadoras.
Los antgenos no particulados, los no metaboli
zables y los que estn en muy baja concentra
cin no pueden ser procesados por los m acrfa
gos y presentados a los linfocitos Th, por lo que
no pueden iniciar una respuesta positiva. L a for
ma en que podran inducir la aparicin de linfo
citos T supresores est tan controvertida como
la existencia misma de los T supresores. Una
dosis excesiva de antgeno podra tolerizar a los
linfocitos B por contacto con ellos durante la
maduracin. Asimismo, la presencia constante
de antgeno puede llevar a la tolerizacin de los
linfocitos B por este mismo mecanismo, que al
gunos autores llaman de agotamiento clonal. La
presencia de anticuerpos, por el mecanismo de
fe e d -b ac k n egativo que fu era com entado
antes, tambin puede llevar a la tolerancia. Esto
sucede cuando se inmuniza al individuo por pri
mera vez, como puede ser el caso de un nio
que se vacuna cuando an tiene anticuerpos re
cibidos pasivamente de la madre. En este caso,
no slo se consumen ms rpidamente los anti
cuerpos maternos, sino que una segunda inyec
cin del antgeno cuando stos ya se han reduci
do provoca una respuesta deficiente pues en
cuentra a los linfocitos B en estado de toleran
cia. La respuesta slo ser normal cuando esos
linfocitos tolerantes hayan sido reem plazados
por linfocitos B de reciente m aduracin. Un
mecanismo similar a ste interviene en la cada
del ttulo de anticuerpos por inyecciones repeti
das de un mismo antgeno.
Como se puede comprobar, en la tolerancia
del individuo maduro intervienen todos los njecanismos que regulan las respuestas inm unes
positivas normales, slo que con mayor intensi
dad y preponderancia. En una respuesta positi
va, intervienen siempre sistemas de regulacin
hacia arriba y hacia abajo; el nivel de dicha res
puesta depende de la actividad de cada uno de
ellos. Cuando los m ecanism os de regulacin
hacia abajo priman sobre los de colaboracin,
la resultante es la tolerancia secundaria.

B IB L IO G R A FA
G enera!
A bbas, A . K., Lichtm an, A. H., Pober, J. S. C eilu la r and
M o le c u la r Im m u n o lo g y , 2" ed . W . B. S a u n d e r s co.
U .S.A ., 1994.

344

Aspectos bsicos de la inmunidad

F ain b o in , L., S atz, M. L. Intro d u cci n a la Inm unologa

Hum ana. 3 ed. Edicin del A utor, B uenos A ires, 1995.
E special
M iller, I. F. A. P., G rant, M.: P eripheral T cell Tolerance.
A nnual R eview o f Im m unology, 10: 51, 1992.
C o h n , J. J., D uke, R, C ., F ad o k , V . A ., S e llin s, K. S.
A poptosis and Program m ed C ell D eath in Im m unity. A n
nual R eview o f Im m unology, 10: 267, 1992.
R osenberg, A. S., Singer, A.: C ellular Basis o f Skin A liograft R ejection: A n in vivo m odel o f Im m une-M ediated
T issue D estruction. A nnual R eview o f Im m unology, 10:
333, 1992.
G oodnow , C. C.: Transgenic m ice and analysis o f B-Cell
Tolerance. A nnual Review o f Im m unology, 10: 489, 1992.
S her, A., C offm an, R. L. R egulation o f im m unity to parasytes by T cells and T-cell derivad cytokines, A nnual
Review o f Im m unology, 10, 385, 1992.
Trow brigdge, I. S., Thom as, M . L. CD 45: an em erging role
as protein tyrosine phosphatase required for lym phocyte
activation and developm ent. A nnual R eview o f Im m unology: 12, 85, 1994,

Rom agnani, S, Lym phkine production by hum an T cells in

disease states, A nnual R eview o f Im m unology: 12, 227,
1994.
Seder, R, A., Paul, W , E, A dquisition o f lym phokine-producing phenotype by CDR+ T cells. A nnual R eview of
Im m unology: 12, 635, 1994.
C harlton, B., A uchincloss, H. Jr., Fathm an, G. G, M echa
nism s o f transplantation tolerance. A nnual R eview of Im m unology: 1 2 ,7 0 7 , 1994,
W einer, H. L, y col. O ral tolerance: Im m u n o lo g ic m echanism and treatm en t o f anim al and hu m an org an -sp ecific autoim m u n e d iseases by oral ad m in istratio n o f a u
to a n tig e n s. A n n u al R ev iew o f Im m u n o lo g y : 12, 809,
1994.
M atzinger, P. Tolerance, danger, and the extended fam ily.
A nnual Review o f Im m unology: 12, 991, 1994.
M atzinger, P, T olerance and the four Ds (danger, d estru c
tion, death and d istress), P rogress in Im m u n o lo g y IX ,
T he Im m unologist, en prensa,
L eterio, J,: T he T G F - a l knockout: N ew insights and implicatios for the ro le o f TGF(3 in autoim m une disorders,
P ro g e s s in I m m u n o lo g y IX , T h e I m m u n o lo g is t, en
prensa.

Anticuerpos no precipitantes, anticuerpos

asimtricos de ias clases IgG
Su relacin con los precipitantes

RICARDO MARGNI

INTRODUCCIN
La reestim ulacin de un vertebrado adulto
con un antgeno T-dependiente induce una res
puesta inmune en la que prevalecen los anti
cuerpos de la clase IgG. Durante el curso de esa
respuesta, la capacidad de unin del anticuerpo
al ligando vara, apareciendo incluso anticuer
pos incapaces de formar complejos Ac-Ag inso
lubles. En muchos casos, ello se debe a la baja
afinidad de los anticuerpos como consecuencia
de que la constante de unin del sistema anticuerpo-ligando, a equilibrio, es muy baja.
No obstante lo expuesto, hay anticuerpos de
!a clase IgG de relativa alta afinidad, que se
unen firmemente al antgeno, pero que carecen
de la capacidad de formar complejos Ac-Ag in
solubles. Estos anticuerpos fueron identificados
originariamente por Heidelberger y Kendall en
1935. Ellos mostraron que mediante curva de
precipitacin cuantitativa era posible dosar los
anticuerpos preeipitables presentes en el suero
y establecer la zona de equivalencia o cantidad
de antgeno capaz de lograr la mxima precipi
tacin. Pero observaron tambin que, si la dosis
de antgeno correspondiente a la zona de equi
valencia era aadida en form a fraccionada, a
repeticin, se requeran cantidades m enores
que en el caso anterior para conseguir la sepa
racin de los anticuerpos preeipitables. R epi
tiendo la valoracin del suero original, con
aadido del sobrenadante de las precipitaciones
seriadas y sin l, comprobaron que en el primer
caso haba un incremento del 10-15% en el t
tulo de los anticuerpos (fig. 19-1). Ello los lle
v a considerar que en el sobrenadante queda
ban anticuerpos que no precipitaban el antge
no, pero con aptitud para incorporarse firm e
mente a los complejos Ac-Ag formados por los

anticuerpos precipitantes de la misma especifi

cidad. Los designaron anticuerpos eoprecipitantes . La figura 19-2 corresponde a una grafi
cacin de Sips efectuada con valores p ro v e
n ientes de estudios de interaccin p rim aria
Ac-Hp, de anticuerpos precipitantes, eoprecipitantes y no precipitantes de baja afinidad.
Hasta 1970 se hizo muy poco para aclarar el
mecanismo de la no precipitacin con el ant
geno por parte de los anticuerpos coprecipitantes, cules eran sus propiedades fisicoqumicas
y biolgicas, clase de inmunoglobulina a la que
pertenecan, y la funcin que cumplan en la
respuesta inmune. En un trabajo cooperativo
desarrollado entre nuestro laboratorio y el deJ
doctor R. A. Binaghi en Francia, iniciamos en
esa poca el estudio de esos anticuerpos.
Estudios inmunoqumicos
Los anticuerpos copreeipitantes h a n sido
aislados del suero de diferentes especies ani
males (conejos, caballo, oveja, ratas, hombre,
vaca, asno, merin, ratn) inoculados con dis
tin to s antgenos T -d ep en d ien tes (p ro ten a s
haptenadas, gam m aglobulinas y albm ina de
diferente origen, ovoalbmina, toxoide tetni
co, bacterias, parsitos y otros). En el sobrena
dante del suero agotado en anticuerpos preci
pitantes por precipitaciones seriadas, segn fue
descrito por H eidelberger y Kendall, quedan
los anticuerpos no precipitantes de baja afini
dad y los copreeipitantes. Estos ltimos fueron
separados de la m ezcla por crom atografa de
afinidad (fig. 19-3).
Los anticuerpos copreeipitantes pertenecen a
la clase IgG y, si el animal elabora varias sub
clases de esta inm unoglobulina y form a anti
cuerpos precipitantes en todas ellas, lo mismo

344

Aspectos bsicos de la inmunidad

F ain b o in , L., S atz, M. L. Intro d u cci n a la Intnunologa

Hum ana. 3 ed. Edicin del A utor, B uenos A ires, 1995.
E special
M iller, I. F. A. P., G rant, M.: P eripheral T cell Tolerance.
A nnual R eview o f Im m unology, 10: 51, 1992.
C o h n , J. J., D uke, R, C ., F ad o k , V . A ., S e llin s, K. S.
A poptosis and Program m ed C ell D eath in Im m unity. A n
nual R eview o f Im m unology, 10: 267, 1992.
R osenberg, A. S., Singer, A.: C ellular Basis o f Skin A llograft R ejection: A n in vivo m odel o f Im m une-M ediated
T issue D estruction. A nnual R eview o f Im m unology, 10:
333, 1992.
G oodnow , C. C.: Transgenic m ice and analysis o f B-Cell
Tolerance. A nnual Review o f Im m unology, 10: 489, 1992.
S her, A., C offm an, R. L. R egulation o f im m unity to parasytes by T cells and T-cell derived cytokine,s, A nnual
Review o f Im m unology, 10, 385, 1992.
Trow brigdge, I. S., Thom as, M , L. CD 45: an em erging role
as protein tyrosine phosphatase required for lym phocyte
activation and developm ent. A nnual R eview o f Im m unology: 12, 85, 1994,

Rom agnani, S, Lym phkine production by hum an T cells in

di,sease states, A nnual R eview o f Im m unology: 12, 227,
1994.
Seder, R, A., Paul, W . E. A dquisition o f lym phokine-producing phenotype by CDR+ T cells. A nnual R eview of
Im m unology: 12, 635, 1994.
C harlton, B., A uchincloss, H. Jr., Fathm an, G. G, M echa
nism s o f transplantation tolerance. A nnual R eview of Im m unology: 1 2 ,7 0 7 , 1994,
W einer, H. L, y col. O ral tolerance: Im m u n o lo g ic m echanism and treatm en t o f anim al and hu m an org an -sp ecific autoim m u n e d iseases by oral ad m in istratio n o f a u
to a n tig e n s. A n n u al R ev iew o f Im m u n o lo g y : 12, 809,
1994.
M atzinger, P. Tolerance, danger, and the extended fam ily.
A nnual Review o f Im m unology: 12, 991, 1994.
M atzinger, P, T olerance and the four Ds (danger, d estru c
tion, death and d istress). Progress in Im m u n o lo g y IX ,
T he Im m unologist, en prensa,
L eterio, J,: T he T G F - a l knockout: N ew insights and implicatios for the ro le o f TGF(3 in autoim m une disorders,
P ro g e s s in I m m u n o lo g y IX , T h e I m m u n o lo g is t, en
prensa.

Anticuerpos no precipitantes, anticuerpos

asimtricos de ias clases IgG
Su relacin con los precipitantes

RICARDO MARGNI

INTRODUCCIN
La reestim ulacin de un vertebrado adulto
con un antgeno T-dependiente induce una res
puesta inmune en la que prevalecen los anti
cuerpos de la clase IgG. Durante el curso de esa
respuesta, la capacidad de unin del anticuerpo
al ligando vara, apareciendo incluso anticuer
pos incapaces de formar complejos Ac-Ag inso
lubles. En muchos casos, ello se debe a la baja
afinidad de los anticuerpos como consecuencia
de que la constante de unin del sistema anticuerpo-ligando, a equilibrio, es muy baja.
No obstante lo expuesto, hay anticuerpos de
la clase IgG de relativa alta afinidad, que se
unen firmemente al antgeno, pero que carecen
de la capacidad de formar complejos Ac-Ag in
solubles. Estos anticuerpos fueron identificados
originariamente por Heidelberger y Kendall en
1935. Ellos mostraron que mediante curva de
precipitacin cuantitativa era posible dosar los
anticuerpos precipitables presentes en el suero
y establecer la zona de equivalencia o cantidad
de antgeno capaz de lograr la mxima precipi
tacin. Pero observaron tambin que, si la dosis
de antgeno correspondiente a la zona de equi
valencia era aadida en form a fraccionada, a
repeticin, se requeran cantidades m enores
que en el caso anterior para conseguir la sepa
racin de los anticuerpos precipitables. R epi
tiendo la valoracin del suero original, con
aadido del sobrenadante de las precipitaciones
seriadas y sin l, comprobaron que en el primer
caso haba un incremento del 10-15% en el t
tulo de los anticuerpos (fig. 19-1). Ello los lle
v a considerar que en el sobrenadante queda
ban anticuerpos que no precipitaban el antge
no, pero con aptitud para incorporarse firm e
mente a los complejos Ac-Ag formados por los

anticuerpos precipitantes de la misma especifi

cidad. Los designaron anticuerpos coprecipi
tantes . La figura 19-2 corresponde a una grafi
cacin de Sips efectuada con valores p ro v e
n ientes de estudios de interaccin p rim aria
Ac-Hp, de anticuerpos precipitantes, coprecipi
tantes y no precipitantes de baja afinidad.
Hasta 1970 se hizo muy poco para aclarar el
mecanismo de la no precipitacin con el ant
geno por parte de los anticuerpos coprecipitan
tes, cules eran sus propiedades fisicoqumicas
y biolgicas, clase de inmunoglobulina a la que
pertenecan, y la funcin que cumplan en la
respuesta inmune. En un trabajo cooperativo
desarrollado entre nuestro laboratorio y el deJ
doctor R. A. Binaghi en Francia, iniciamos en
esa poca el estudio de esos anticuerpos.
Estudios inmunoqumicos
Los anticuerpos coprecipitantes h a n sido
aislados del suero de diferentes especies ani
males (conejos, caballo, oveja, ratas, hombre,
vaca, asno, merin, ratn) inoculados con dis
tin to s antgenos T -d ep en d ien tes (p ro ten a s
haptenadas, gam m aglobulinas y albm ina de
diferente origen, ovoalbmina, toxoide tetni
co, bacterias, parsitos y otros). En el sobrena
dante del suero agotado en anticuerpos preci
pitantes por precipitaciones seriadas, segn fue
descrito por H eidelberger y Kendall, quedan
los anticuerpos no precipitantes de baja afini
dad y los coprecipitantes. Estos ltimos fueron
separados de la m ezcla por crom atografa de
afinidad (fig. 19-3).
Los anticuerpos coprecipitantes pertenecen a
la clase IgG y, si el animal elabora varias sub
clases de esta inm unoglobulina y form a anti
cuerpos precipitantes en todas ellas, lo mismo

346

Aspectos bsicos de la inmunidad

2,5

C
/3 1,5
Hc
O

0,5

_i_

100

200

300

400

500

|ig de antgeno aadido

Fig. 19-1. Valoracin de los anticuerpos preeipitables en
un suero de oveja y en el m ism o suero adicionado del so
brenadante carente de anticuerpos precipitantes separados
por precipitaciones a repeticin con 1/20 de la dosis total
del antgeno correspondiente a la zona de equivalencia.
---------- Curva de valoracin de los anticuerpos anti-D N P
en un suero de oveja (2,1 m g/m l).
---------- C urva de valoracin del m ism o suero inm une ad i
cionado del sobrenadante de las precipitaciones
seriadas (2,4 m g/ml).

ocurre eon los anticuerpos copreeipitantes (fig.

19-4). Cuando ios animales son inoculados con
antgenos en solucin, a repeticin, los anti
cuerpos copreeipitantes constituyen el 10% a
15% de la poblacin total y estn presentes a lo
largo de toda la respuesta inmune.
Por inmunodifusin no se han detectado di
ferencias antignicas entre los anticuerpos pre
cipitantes y copreeipitantes con la misma espe
cificidad, ubicados en la m ism a subclase de

(1/20 E)

Fig. 19-2. C o n stan te de aso ciaci n in trn seca p ro m ed io

(Ko e ndice de heterogeneidad (a) determ inados segn la
graficacin de Sips. A ( - ) , anticuerpo precipitante (K o =
1,14 X 10' L/M , a = 0,72), 15 (- ) anticuerpo copreeipitante (Ko = 3,16 x 10 L/M a = 0,51). C (B - ), anticuerpo
no precipitante (Ko = 1,05 x 10- L/M , a = 0,69). Los anti
cuerpos analizad o s fu ero n aislad o s d e su ero in m u n e de
oveja antidinitrofenol (a-D N P). El ligando usado fue d in i
trofenol .

IgG y provenientes de la m ism a m uestra de

suero. Anticuerpos precipitantes y coprecipitantes de la clase IgG l de oveja, eon especifici
dad antidinitrofenol (a-DNP), dan bandas que
se fusionan, sin aparicin de espolones, cuando
reaccionan con suero de ratas inoculadas con el
anticuerpo precipitante o eoprecipitante. Cuan
do un suero de rata contra anticuerpo aDNP
precipitante de oveja (IgG l) es adsorbido con
an ticu erp o a-D N P e o p re cip ita n te de oveja
(IgG l), obtenido de la misma muestra de suero
de la que provena el anticuerpo precipitante,
en el suero no quedan anticuerpos capaces de

.Ag

(1/20 E)

(1/20 E)

(1/20 E)

Inmunoadsorbente

E: dosis precipitante ptima

a + b -I- o ei anticuerpo de los precipitados es disociado y purificado (anticuerpo precipitante),
q: el anticuerpo fijado al inmunoadsorbente es desorbido y purificado (anticuerpo coprecipitante).
Fig. 19-3. E squem a del m todo de separacin de anticuerpos precipitantes y copreeipitantes.

Anticuerpos no precipitantes
reconocer el anticuerpo precipitante. El mismo
fenmeno se produce cuando el suero antianti
cuerpo coprecipitante es adsorbido con anti
cuerpo precipitante purificado. Estos resultados
indican que es poco probable que el diferente
comportamiento de los anticuerpos precipitan
tes y coprecipitantes pueda estar relacionado
con diferencias en sus idiotipos.
M apas peptdicos desarrollados con a n ti
cuerpos precipitantes y coprecipitantes de co
bayo de la clase IgG2, aislados de la m ism a
muestra de suero, no presentan diferencias. Se
han obtenido resultados similares con anticuer
pos precipitantes y coprecipitantes de oveja de
la clase IgG l. Estos mismos anticuerpos tam
poco mostraron diferencias en los mapas dia
gonales, ni cuando se hizo la tipificacin qu
mica por eleetroforesis de alto voltaje de los
pptidos de digestin enzimtica, previa reduc
cin con mereaptoetanol y alquilacin con io
doacetamida.
Los coeficientes de sedimentacin de todos
los anticuerpos coprecipitantes analizados son
aproximadamente 7S y similares a los de los
anticuerpos precipitantes ubicados en las m is
mas fracciones globulnicas, al igual que sus

347

pesos y volmenes moleculares determinados

por filtracin por geles.
Los estudios de interaccin prim aria an ti
cuerpo coprecipitante-hapteno han mostrado en
todos los casos que estos anticuerpos son biva
lentes.
El fenm eno de la copreeipitacin es una
propiedad general no restringida a los anticuer
pos de una misma especie animal. Es posible
obtener copreeipitacin con anticuerpos preci
pitantes y coprecipitantes con la misma especi
ficidad, provenientes de diferentes especies
animales o ubicados en distintas subclases de
IgG.
En el cuadro 19-1 figuran algunas de las ca
ractersticas fisicoqumicas e inmunoqumicas
de los anticuerpos precipitantes y coprecipitan
tes de la clase IgG del hombre y de algunas es
pecies animales.
Un hecho muy particular, que lu eg o ser
analizado en detalle, es que los anticuerpos co
precipitantes carentes de capacidad para preci
pitar el antgeno, aglutinan los glbulos rojos
de carnero y otras especies animales especfica
mente sensibihzados, no as los glbulos rojos
humanos.

Fig. 19-4. A . E leetroforesis en acetato de celulosa de anticuerpo precipitante (a) y coprecipitante (b) de oveja: 1: I g G l; 2:
IgG2. B y C. Inm unoelectroforesis de anticuerpo anti-D N P precipitante (a), y coprecipitante (b) de cobayo
la clase
IgG l (B) c IgG 2 (C). I: seroalbm ina bovina dinitrofenolada; II: suero de conejo anticobayo.

348

Aspectos bsicos de la inmunidad

Cuadro 19-1. Caractersticas fisicoqum icas e inmunoqumicas de los anticuerpos precipitantes

y copreeipitantes de algunas especies animales
Anticuerpos
E specie anim al

Inm unoglobulina en la que se

encuentran localizados

C onejo
C obayo
C aballo
A sno
O veja
V aca
H om bre

Proporcin en el suero
Precipitacin con el antgeno
F ijacin a inm unoadsorbente
M ovilidad electrofortica
Peso m olecular aproxim ado
C oeficiente de sedim entacin
C onstante de afinidad (K^)*
V alencia
ndice de heterogeneidad

Precipitante

Coprecipitcmte

IgG
Ig G l,I g G 2
IgG a, IgG b, IgGc
IgG a, IgG b, IgGc
I g 0 1 ,Ig G 2
Ig G l,Ig G 2
IgG
85% -90%

IgG
Ig G l, IgG2
IgG a, IgG b, IgG c
IgG a, IgG b, IgGc
g G l,I g G 2
I g G l,Ig G 2
IgG
10% -15%

Y
150 kD
7S
1 X IQo M-'
a 1 X 10 M-'

ISOkD
7S
1 X 10-5 M-'
a 2 x lO-M-'

0,6-0,7

0,4-0,5

a; los an ticu e rp o s h u m an o s ana liz ad o s son an tito x in a tetn ic a; los d e las re sta n tes especies an im ale s son anti-D N P.
b: corresp o n d e n a los v alores p ro m ed io s o b ten id o s co n los a n ticu e rp o s d e las diferen tes esp e cies anim ales.

Propiedades biolgicas de los anticuerpos

copreeipitantes
Diferentes propiedades biolgieas de los an
ticuerpos precipitantes y copreeipitantes de la
clase IgG, aislados de diferentes especies ani
males, han sido analizadas en forma compara
tiva.
Los anticuerpos precipitantes del hombre,
conejo, IgG2 de cobayo e IgG l de oveja, en
forma de complejos solubles en ligero exceso
de antgeno, activan el complemento por la va
clsica y por la va alterna cuando estn pre
sentes en forma de precipitados. Los anticuer
pos copreeipitantes no activan el complemento
por ninguna de las dos vas. En ensayos de
competicin efectuados por fijacin del com
plemento, mezclando dos dosis mnimas efecti
vas fijadoras de com plem ento de anticuerpo
aDNP precipitante de conejo y cantidades va
riables de anticuerpo coprecipitante con la mis
ma especificidad, de modo que las relaciones
Ac ppte/A c coppte oscilara n entre 90/10 y
10/90, se pudo demostrar que estos anticuerpos
compiten por el antgeno (SAB-DNP) y lo ha
cen por m asa. La capacidad fijad o ra de las
mezclas disminuye a medida que se incrementa
la proporcin de anticuerpo coprecipitante, pa
ra llegar a anularse cuando la relacin es infe
rior a 20/80 (fig. 19-5). Teniendo en cuenta
ello, conviene destacar que las reacciones de fi
jacin de complemento efectuadas con sueros
que pueden contener mezclas de anticuerpos
precipitantes y copreeipitantes deben ser inter
pretadas cuidadosam ente, sobre todo cuando
exista la posibilidad de que la concentracin

srica de anticuerpos copreeipitantes pueda ser

superior al 20% de los anticuerpos totales. Este
aspecto ser comentado ms adelante.
Los anticuerpos precipitantes y coprecipitantes son citoflicos, pero slo los primeros tienen
capacidad para activar la fagocitosis in vitro.
Los anticuerpos precipitantes son buenos de
puradores de antgenos in vivo, no as los eoprecipitantes. Si se inoculan ratones con un an
tgeno isotpicam ente marcado, y cuando la
marca radiactiva se estabiliza en sangre se les
inyecta por va endovenosa un anticuerpo espe
cfico, el curso que sigue la radiactividad san
gunea ser un ndice de la capacidad depura
dora inducida por el anticuerpo inoculado.
Ensayos de com peticin entre anticuerpos
precipitantes y copreeipitantes en los mecanis
mos de depuracin, efectuados en forma simi
lar a los indicados para fijacin del com ple
mento mostraron que tambin hay competicin
por masa. Los valores del ndice fagoctico (K)
disminuyen a medida que aumenta la propor
cin de anticuerpo coprecipitante en la mezcla
(fig. 19-5).
El poder protector de los anticuerpos preci
pitantes y copreeipitantes no es el mismo. Ra
tones inmunizados pasivamente con anticuer
pos aglutinantes y no aglutinantes cinti-Salmonella typhimurium, que poseen las mismas ca
ractersticas fisicoqumicas, inmunoqumicas y
propiedades biolgicas de los anticuerpos pre
cipitantes y copreeipitantes, respectivamente,
requieren una cantidad cinco veces superior de
anticuerpo no aglutinante para conferir una
proteccin del 50% cuando los animales son
desafiados con 10 DEM de Salmonella typhi-

Anticuerpos no precipitantes

349

F ig. 19-5. A = variaciones en el consum o de com plem ento po r p arte de diferentes m ezclas de anticuerpos precip itan tes y
copi'ecipitantes. B = depuracin antignica en ratones inoculados con '^^j s.ty p h i-D N P (Ag). D iferentes ndices fagocticos
(K) inducidos por anticuerpos anti-D N P precipitante (1), coprecipitante (4) y m ezclas de anticuerpo precipitante/anticuer
po coprecipitante en las relaciones 66/33 (2) y 33/66 (3). L a curva (c) corresponde a ratones en los q ue los an ticu erp o s ino
culados fueron sustituidos por solucin salina (control).

murium. Se obtuvieron resultados similares al

determinarse el ndice de infeccin esplnica
(HE) en ratones inmunizados pasivamente con
anticuerpos bovinos aglutinantes y no agluti
nantes m -Brucella abortus y desafiados luego
con B. abortus, cepa 19. A los 7 das de desa
fo, el niimero de brcelas vivas, por bazo de
ratn, fue cuatro veces superior cuando el anti
cuerpo inoculado a los animales era no agluti
nante.
Anticuerpos anti-toxina tetnica, precipitan
tes y coprecipitantes, aislados de gammaglobu
lina comercial especfica, mostraron que la ca
pacidad para neutralizar a la toxina es 5-6 ve
ces superior para los anticuerpos precipitantes.
Por qu los anticuerpos coprecipitantes
no precipitan el antgeno
Com o ya se indicara, la no form acin de
complejos Ac-Ag insolubles por los anticuer
pos coprecipitantes no es consecuencia de baja
afinidad, ni parecera estar relacionado con
grandes cambios estructurales respecto de los
anticuerpos precipitantes. Tampoco puede ser
atribuido a repulsin de sus molculas como
consecuencia de estar muy cargados sus frag
mentos Fe, ya que los fragmentos F (ab)^ ais

lados tienen frente al antgeno el m ism o com

portamiento de la m olcula entera.
La no precipitacin del antgeno por los anti
cuerpos coprecipitantes no se debe a limitacin
del reconocimiento de epitopes mltiples pre
sentes en una molcula de antgeno, com o se
supuso. Si el nmero de uno de esos epitopes
fuera muy bajo, los anticuerpos formados ten
dran muy pocas posibilidades de originar con
stos complejos insolubles. Este argumento, si
bien puede ser vlido en algn caso particular,
no lo es para la generalidad de los anticuerpos
coprecipitantes. Cuando se hicieron reaccionar
anticuerpos precipitantes y coprecipitantes con
especificidad anti-DNP con DNP^,-BSA (alto
nmero de grupos haptnicos por molcula de
seroalbmina bovina) y DNP^-OVA (reducido
nmero de grupos haptnicos por molcula de
ovoalbm ina), los anticuerpos precipitantes
precipitaron a ambos antgenos, m ientras que
los anticuerpos coprecipitantes no form aron
com plejos Ac-Ag insolubles con ninguno de
ellos.
En los anticuerpos coprecipitantes no existen
puentes S-S intercadenas H-H adicionales que
podran reducir la flexibilidad de los fragmen
tos Fab y crear impedimentos estricos, hacien
do que slo uno de los sitios de combinacin

350

Aspectos bsicos de ia inmunidad

interaccione con el antgeno y, como conse

cuencia, no se formen com plejos insolubles.
Un argumento de este tipo es poco consistente,
ya que los anticuerpos precipitantes y copreci
pitantes reducidos en condiciones adecuadas
con 2-mercaptoetanol o ditiotreitol y alquilados
con iodoacetamida, siguen manteniendo su ca
pacidad inicial de reaccin. Por otra parte, no
se han observado diferencias en los mapas dia
gonales y en la tipificacin qum ica de anti
cuerpos precipitantes y coprecipitantes.
No obstante los argumentos expuestos, exis
ten hechos experimentales que permiten espe
cular sobre las causas de la no precipitacin del
antgeno por parte de los anticuerpos coprecipi
tantes. Anticuerpos precipitantes y coprecipi
tantes anti-DNP de oveja (IgG l) ligados a in
munoadsorbente tienen distinta capacidad para
fijar ligandos grandes y pequeos. Un nmol de
anticuerpo precipitante fija aproximadam ente
0,6-0,7 nmoles de DNP-BSA (1,3 x lO-M), en
tanto que el anticuerpo coprecipitante ligado a
inmunoadsorbente fija 0,04 nmoles de antgeno
por nmol de anticuerpo. Para la misma concen
tracin molar de hapteno (DNP-OH), la capaci
dad de unin para anticuerpos precipitantes y
coprecipitantes ligados a inmunoadsorbente es
de 0,7 nmol y 0,2 nmol de hapteno por 1 nmol
de anticuerpo, respectivamente. Estos resulta
dos indican que, si bien los anticuerpos precipi
tantes ligados a inmunoadsorbente fijan antge
no y hapteno en solucin, en el caso de los an
ticu erp o s co p recip itan tes esa caplicidad es
prcticamente nula para el antgeno. Esto des
carta la posibilidad de que la no formacin de
complejos insolubles con el antgeno por parte
de los anticuerpos coprecipitantes pudiera de
berse a un impedimento esttico para ligandos
de gran tamao nicamente, o a que esos anti
cuerpos se com porten com o m onogm icos
frente al antgeno, como ocurre con la IgG(T)
de caballo. Si se tratara de un impedimento estrico exclusivam ente para grandes ligandos,
no tendran que existir diferencias en la capaci
dad fijadora de haptenos por los anticuerpos
precipitantes y coprecipitantes; y si los anti
cuerpos coprecipitantes se comportaran como
m onogm icos, cuando estn fijados a inm u
noadsorbente, adems de no fijar molculas de
antgeno no tendran que fijar m olculas de
hapteno. Estos resultados indicaran que los
dos sitios de combinacin de la molcula del
anticuerpo coprecipitante tienen un comporta
miento diferente frente al ligando.
Los estudios de interaccin prim aria entre
anticuerpos anti-DNP precipitantes y copreci
pitantes y el hapteno dinitrofenil-cido-y-aminocaproico (DNP-EACA) muestran curvas de
Scatchard, resultantes de graficar r/c versus r,
bien diferentes (r = moles de hapteno combina

do por mol de anticuerpo, y c = moles de hap

teno libre). Los anticuerpos precipitantes mues
tran curvas sin marcadas inflexiones cuya pro
longacin intercepta a r = 2, mientras que los
anticuerpos coprecipitantes dan curvas bimodales. En este caso, la extrapolacin de la porcin
de la curva correspondiente a la ms alta con
centracin de hapteno intercepta a r = 2 y la
extrapolacin de la otra parte de la curva inter
cepta a r = 1, lo que indica que cada poblacin
de sitios de combinacin constituye aproxima
damente el 50% del total. Para el caso de los
anticuerpos coprecipitantes anti-DNP de oveja
de la clase IgG l, los valores experimentales de
Ko calculados para ambas ramas de la curva
oscilan entre 100 y 200 veces (fig. 19-6A). Un
hecho similar fue observado cuando se analiza
ron anticuerpos coprecipitantes de conejo.
Esto podra hacer suponer: a) que hay dos
poblaciones de anticuerpos coprecipitantes, una
de alta afinidad y otra de baja afinidad, hecho
poco probable ya que estos anticuerpos fueron
purificados por inmunoadsorcin, que slo re
tiene anticuerpos de alta afinidad, y b) que los
anticuerpos coprecipitantes funcionen como
molculas de IgG con un sitio de combinacin
de diferente afinidad en cada uno de los Fab de
la molcula. Los productos de desorcin de las
adsorciones sucesivas de anticuerpo coprecipi
tante anti-DNP de oveja efectuadas con alcuo
tas de la cantidad de inmunoadsorbente necesa
ria para la fijacin total del anticuerpo, al ser
analizados por estudios de interaccin prima
ria, mostraron en todos los casos grficos de
Scatchard con curvas bimodales. Estos resulta
dos hacen presumir una asimetra molecular, y
que muy probablemente en cada molcula de
anticuerpo coprecipitante exista un sitio de
combinacin de alta afinidad y otro de baja afi
nidad. Si las curvas bimodales descritas para
los anticuerpos coprecipitantes fueran conse
cuencia de una mezcla de dos poblaciones de
anticuerpos, una de alta afinidad*y otra de baja
afinidad, los anlisis de los productos de desor
cin de las adsorciones seriadas tendran que
haber dado curvas norm ales, con pendientes
variables como consecuencia de la seleccin
por afinidad, pero nunca curvas bimodales.
Esa presuncin se ve reforzada con los resul
tados obtenidos en los estudios de inmunoad
sorcin y de interaccin primaria logrados con
los fragmentos F (ab)2 de anticuerpo precipi
tante y coprecipitante, purificados por cromato
grafa de afinidad, y sus correspondientes frag
mentos Fab obtenidos por reduccin con mercaptoetanol y alquilacin con iodoacetamida.
El fragmento Fab de anticuerpo precipitante es
retenido en su totalidad por el inm unoadsor
bente usado en la purificacin del fragmento E
(ab)2, en tanto que slo es retenido el 50% y

Anticuerpos no precipitantes
el resto no se adsorbe, si el Fab procede de F
(ab)2 coprecipitante. Los valores de Ko de los
fragmentos Fab* retenidos y no retenidos por el
inmunoadsorbente difieren grandemente, sien
do mayor para el fragmento que se fij (fig. 196B). Por otra parte, los grficos de Scatchard
correspondientes a la interaccin de anticuerpo
precipitante y coprecipitante anti-DNP de oveja
de la clase IgG l con un ligando de gran tamao
(SAB-DNP), analizada por radioinm unoanli
sis, muestran curvas normales, sin inflexiones
en ambos casos, pero con r = 2 para los anti
cuerpos precipitants y r = 1 para los anticuer
pos coprecipitantes (fig. 19-6C).
Un hecho que confirma la suposicin de la
existencia de dos sitios de combinacin o paratopes de distinta afinidad en cada molcula de
anticuerpo coprecipitante es el correspondiente
a la hibridizacin al azar de hemimolculas de
este anticuerpo. En ensayos de este tipo se ha
obtenido 16-17% de anticuerpo precipitante, lo
que est de acuerdo con la posibilidad terica
del 25%, si los anticuerpos coprecipitantes tu
vieran en cada hemimolcula sitios de combi
nacin de alta afinidad y baja afinidad, respec
tivamente.
Los datos experimentales descritos, corres
pondientes a ensayos efectuados con anticuer
po precipitante entero, hem im olculas y los
fragmentos E (ab)^ y Fab, sugieren que la m o
lcula de anticuerpo coprecipitante de la clase
IgG funcionalmente es asimtrica y que en ella
existen dos sitios de combinacin con distinta
afinidad por el antgeno. Permiten suponer ade
ms que el com portam iento diferente de los
dos sitios de combinacin de este anticuerpo no
es consecuencia de una variacin de la afinidad
de uno de los sitios de com binacin por un
efecto alostrico negativo originado por la inte
raccin del otro sitio con un ligando, ya que a
partir del fragmento F (ab)^ de anticuerpo co
precipitante purificado por inmunoadsorein es
posible separar dos poblaciones de fragmentos
F ab, con diferente comportam iento frente al
inmunoadsorbente y distinta afinidad.
La accesibilidad de los sitios de com bina
cin de los anticuerpos precipitantes y copreci
pitantes por grandes hgandos ha sido analizada,
haciendo reaccionar para ello anticuerpos antiDNP de conejo y de oveja de la clase IgG l
con se ro a lb m in a b o v in a d in itro fe n o la d a
(SAB-DNP) y seroalbmina bovina dinitrofe
nolada en la que el grupo DNP estaba separado
del soporte proteico por el espaciador cido
gammaaminobutrico (SAB-GABA-DNP). Los
anticuerpos precipitantes mostraron el mismo
com portam iento inm unoqum ieo y biolgico
frente a los dos antgenos, en tanto que los co
precipitantes funcionaron como tales frente a
SAB-DNP y como precipitantes frente a SAB-

351

GABA-DNP, tanto desde el punto de vista inmunoqumico como biolgico (fijan com ple
mento, activan fagocitosis, etc.). En ensayos de
radioligando en fase fluida, los anticuerpos co
p re c ip ita n te s d iero n cu rv as n o rm ales co n
SAB-DNP, que cortan a r = 1 y curvas bimodales con ^T.SAB-GABA-DNP, en las que
la proyeccin de cada mdulo corta a r = 1 y r
= 2, hecho similar al que ocurre cuando este
anticuerpo interacciona con el hapteno.
Cuando el anticuerpo coprecipitante fue fija
do a colum na de Sepharosa-SAB-DNP y fue
puesto en contacto con ^^I.SAB-DNP en fase
fluida, la radiactividad fijada fue prcticamente
nula (0,4%), en tanto que el porcentaje de re
tencin de la marca se elev al 5,4% cuando el
antgeno fijado a la Sepharosa fue SAB-GABA-DNP. En las mismas condiciones experi
mentales, la radiactividad retenida por el an ti
cuerpo precipitante fue del 28% para am bos
antgenos. La menor capacidad de fijacin de
'^'I.SA B-DN P por los anticuerpos coprecipi
tantes, respecto de los precipitantes, cuando es
tn unidos a B SA -G A BA -D N P sera c o n se
cuencia de que slo podrn fijar el lig an d o
aquellas molculas de anticuerpo que se han
unido al inmunoadsorbente por el sitio de com
binacin de baja afinidad y exponen el de alta
afinidad, y no as cuando la unin es por el si
tio de alta afinidad.
En ensayos de radioligando por competicin
con ^^I.SAB-DNP se ha dem ostrado que el
comportamiento del anticuerpo precipitante es
el m ism o fre n te a S A B -D N P y S A B -G A BADNP, indicando que la competicin por los
sitios de combinacin entre estos antgenos y el
trazador ( ' I.SA B -D N P) es idntica. P o r el
contrario, con el anticuerpo coprecipitante las
curvas de desplazam iento son distintas con
SA B-DN P y SAB-GABA-DNP. La cantidad
de SAB-GABA-DNP necesaria para desplazar
'^^I.BSA-DNP fue mayor que la correspondien
te a SAB-DNP. Esto demuestra que la com peti
cin entre los dos antgenos y el trazador no
fue la misma. Ello puede explicarse asumiendo
que SAB-DNP reacciona con uno solo de los
sitios de combinacin de la molcula, mientras
que SA B-GA BA -D NP reacciona con am bos.
Como consecuencia, se necesitar mayor canti
dad de SA B-GA BA -D NP que de SA B-D N P
para desplazar al trazador.
Los ensayos precedentes muestran c]ue una
accesibilidad diferente de uno de los sitios de
combinacin de la molcula del anticuerpo co
precipitante es la responsable de la variacin de
su afinidad, y la causante del peculiar com por
tamiento de estos anticuerpos, hecho que se re
vierte con el uso de un ligando en el que el gru
po haptnico est separado del soporte antig
nico por un espaciador.

352

Aspectos bsicos de la Inmunidad

66

F ig . 19-6. G rficos de Scatchard correspondientes a interacciones de anticuerpos anti-D N P precipitantes y copreeipitantes

y sus fragm entos, eon pequeos y grandes ligandos.
A =
anticuerpo precipitante; o - o fragm ento F (ab )2 de anticuerpo precipitante; ArA. anticuerpo coprecipitante; A -A
fragm ento F (ab )2 de anticuerpo coprecipitante. Ligando: D N P-cido e-am inocaproico (D NP-EA C A ).
B = - fragm ento F ab de anticuerpo precipitante;
fragm ento F a b de anticuerpo eoprecipitante retenido por el in
m unoadsorbente,
fragm ento F ab de anticuerpo coprecipitante no retenido por el inm unoadsorbente. Ligando:
DNP-EA G A .
C =
anticuerpo precipitante; A r . anticuerpo coprecipitante. Ligando: SA B-D N P.
D = anticuerpo precipitante tratado (-) y no tratado o - o con endo-p-glucosam inidasa FI; anticuerpo coprecipitante tra
tado A - A y no tratado A -A con la enzim a glucosdica.
Las interacciones con D N P-EA C A fueron analizadas por quenching de fluorescencia. Los correspondientes a SA B -D N P,
po r radioinm unoanlisis.

Los resultados expuestos indican asimetra

molecular en los anticuerpos copreeipitantes,
pero ninguno de ellos est en favor de que las
diferencias entre anticuerpos precipitantes y
copreeipitantes, aislados de la misma muestra
de suero y ubicados en misma clase o subclase
de IgG, sea consecuencia de una diferente in
formacin en el genoma (igualdad en la estruc
tura antignica, similitud en los mapas peptdi

cos, mapas diagonales y tipificacin qumica).

Esas diferencias entre los dos tipos de anticuer
pos son de origen postraduccional y hoy sabe
mos que afectan a la parte hidrocarbonada de la
molcula de anticuerpo. Estudios de crom ato
grafa en fase gaseosa desarrollados con IgG l
de oveja mostraron una diferencia cuantitativa
de 6 maosas y 2 (?) glucosaminas en favor de
los anticuerpos copreeipitantes. Basados en es

Anticuerpos no precipitantes
te antecedente se han desarrollado estudios que
demostraron que en los anticuerpos coprecipi
tantes hay un resto glucosdico del tipo rico en
maosa que puede ser removido mediante el
em pleo de endo-P-acetilglucosam inidasa H.
Cuando ello ocuire, los anticuerpos coprecipi
tantes se convierten en precipitantes y expresan
la actividad biolgica de estos anticuerpos. En
sayos efectuados con anticuerpos enteros y sus
fragmentos E (ab ) 2 y Fab muestran que el oligosacrido est ubicado en uno de los fragmen
tos Fab, el de menor afinidad, y que su rem o
cin por accin enzim tica hace que el frag
mento Fab exprese alta afinidad por el ligando
(fig. 19-6D).
M ediante el em pleo de co n can av alin a A
(lectina con especificidad para grupos termina
les maosa y glucosa) unida en forma covalen
te a Sepharosa (Con A-Sepharosa) ha sido po
sible separar los anticuerpos precipitantes y co
precipitantes.
De la poblacin de fragmentos Fab obteni
dos de anticuerpos coprecipitantes purificados
por cromatografa de afinidad con Con A-Sepharosa, el 50% es retenida cuando el producto
se pasa por una colum na de afinidad con esa
lectina. La poblacin de Fab que eluye es de
afinidad alta y la retenida, de afinidad baja. E s
ta ltima aumenta su afinidad si es tratada con
la enzima glucosdica.
Estos resultados confirman los anteriores y
ponen claramente en evidencia que una glucosilacin que afecta a uno solo de los fragmen
tos Fab es la responsable del particular com
portamiento inmunoqumico y biolgico de es
tos anticuerpos.
Se ha podido demostrar que el oligosacrido
responsable de este fenm eno est unido al
fragmento Fd. Este fragmento es el que queda
unido a la Con A -Sepharosa cuando el frag
mento Fab, reducido y alquilado, se pasa por
una colum na con esa lectina, y el nico que
compite con los glbulos rojos de cobayo, que
poseen glucoprotenas que se unen a concana
valina A, por la fijacin a esa lectina. Las cade
nas L provenientes de la misma muestra y los
fragmentos Fd y cadenas L de Fab de alta afini
dad del anticuerpo coprecipitante y los mismos
fragmentos provenientes de anticuerpos preci
pitantes no son efectivos.
El conocimiento de la asimetra molecular de
los anticuerpos coprecipitantes y la diferente
afinidad por el ligando de sus paratopes o sitios
de combinacin hacen comprensible el hecho
de que estos anticuerpos no formen complejos
insolubles con el antgeno; que coprecipiten
junto con los anticuerpos precipitantes y se
unan firmemente a los complejos formados por
stos. Adems, permiten entender por qu los
anticuerpos coprecipitantes pueden ser purifica

353

dos por inmunoadsorcin; el valor relativamen

te alto de sus K^, que expresa el promedio de
los respectivos valores de cada sitio de com bi
nacin de la molcula y su mayor heterogenei
dad respecto de los anticuerpos precipitantes.
Teniendo en cuenta estos hechos, y para que
los an ticu erp o s c o p recip itan tes p u ed an ser
identificados de una manera ms definida, he
mos propuesto que sean denominados a n ti
cuerpos IgG asimtricos, ya que ello estara
indicando la anomala responsable del particu
lar comportamiento.
Cules podran ser los mecanismos inducto
res de la glucosilacin asimtrica de las m ol
culas de IgG?
Las molculas de inmunoglobulinas tienen la
composicin H2L2 y resultan de asociacin de
dos hemimolculas (H lL l), cada una de ellas
formada por la asociacin de una cadena pesa
da H y una cadena liviana L. En el citoplasma
de las clulas plasmticas han sido detectadas
tam bin, como formas libres, las estrucutrras
H lL l y H2L1. Anlisis de IgG srica han de
mostrado que cada molcula de inmunoglobuli
na tiene fijadas 2,8 molculas de oligosacridos
0,8 de los cuales, en promedio, estn unidos al
fragmento Fab. Se ha propuesto que la frecuen
cia y localizacin del sequon de N-glucosilacin Asn-X-Ser/Thr es el responsable de esta
glucosilacin extra. En ratn se ha demostrado
que genes Vjj contienen sequones de glucosila
cin, sugiriendo su participacin en la genera
cin de glucosilacin del Fab. En fragmentos
Fab de anticuerpos monoclonales hem os de
mostrado la presencia de olgiosacridos con es
tructuras monosialiladas y de alto contenido en
maosa. Estas diferentes estructuras son las
responsables de la microheterogeneidad obser
vada en molculas de IgG, lo que sugiere que
las clulas B estn equipadas con conjuntos de
glucosiltransferasas los que se encuentran en
diferentes proporciones. En determinadas cir
cunstancias, modificaciones postraduccionales
de un pptido por N-glucosilacin pueden lle
var al incremento de una glucoforma particular.
Glucoformas provenientes de la misma clula
son consecuencia de modificaciones de un pp
tido simple por la accin de glucosiltransfera
sas y glucosidasas.
Los mecanismos arriba indicados probable
mente participen en la glucosilacin asimtrica
de las molculas de IgG, pero quin determina
la modificacin? Teniendo en cuenta las dife
rencias observadas cuando antgenos solubles o
particulados se inoculan en forma repetida por
largos perodos es posible que diferentes clu
las presentadoras participen en la captura anti
gnica. Estas clulas podran sintetizai- diferen
tes factores (citoquinas) que actuaran inhibien
do o estimulando la actividad de glucosiltrans-

354

Aspectos bsicos de la Inmunidad

ferasas, cambiando los patrones de glucosila

cin y llevando a la sntesis de diferentes glucoformas. Si la clula que reconoce a los ant
genos solubles y particulados fuera la misma,
su captura por pinocitosis (antgeno soluble), o
fagocitosis (antgeno particulado) podra acti
var diferentes sistem as internos, los que po
dran inducir m odificaciones en los patrones
normales de glucosilacin.
Cambios en la glucosilacin podran tambin
ocurrir a travs de variaciones en el plegado
del pptido H el que llevara a la exposicin de
nuevos sequones de glucosilacin. En expe
riencias realizadas por nosotros pudo demos
trarse que, cuando a cultivos de hibridomas se
Jes aade cistena 10*- M o mecaptoetanol lO -'
M, la proporcin de anticuerpos IgG asimtri
cos sintetizados vara. Ello podra deberse a va
riaciones en el plegado de las cadenas H, por
competicin entre los grupos sulfidrilos de la
cistena y del metacaptoetanol y el sulfidrilo de
la cadena H, por la enzima involucrada en la
formacin de los puentes di sulfuro intracatenarios.
Otra posibilidad es que la clula presentado
ra de antgeno reaccione de una manera dife
rente cuando reconoce un antgeno particulado,
induciendo al linfocito B a sintetizar una mol
cula citoslica que acte como chaperona o
celadora. Hay algunas evidencias que sugieren
que el plegado en el citoplasma de nuevas tra
ducciones de protenas precursoras est preve
nida por la presencia de presecuencias aminoterminales. Ello permitira al polipptido H no
plegado o parcialmente plegado interaccionar
con chaperones citoslicos del tipo de la fa
milia ct-hps 70, lo que retardara su transporte
a membrana. Como consecuencia podra, en un
estado de plegam iento conform acional poco
consistente, interactuar con glucosiltransferasas, facilitando la glucosilacin de sequones
normalmente no funcionales por no estar ex
puestos adecuadamente.

Por qu los anticuerpos IgG asimtricos

aglutinan eritrocitos especficamente
sensibilizados.
En la membrana de los eritrocitos de un gran
nmero, de vertebrados existen receptores para
el fragmento Fe de IgG. En los glbulos rojos
humanos no estn expuestos y deben ser libera
dos por tripsinizacin previa. Se han efectuado
estudios sobre su evolucin filogentica y so
bre su evolucin ontognica en el pollo. Su n
mero por eritrocito vara; ello depende del ta
mao globular. El receptor ha jido aislado y
purificado; responde a las caractersticas de una
glucoprotena de PM 30 kD. Su capacidad para
interaccionar con ligando en fase fluida tam

bin ha sido analizada. Este receptor es espec

fico para el fragmento Fe de las diferentes sub
clases de IgG agregadas por interaccin previa
con el antgeno (complejos Ac-Ag) o por mto
dos fsicos y qumicos. Fija tambin Fcy y Fc|j,
purificados e IgM .7S no agregada, con una
unin de alta afinidad (K^ = 10* M '); no fija
IgM. 198, Fcix5 e IgA. La interaccin ptima li
gando-receptor tiene lugar a 4C por 18 horas,
y cuando la reaccin se efecta a 37C se pro
duce la movilizacin o capping de los com
plejos formados. Por ensayos de competicin
se ha demostrado la especificidad de la unin
ligando-receptor.
La existencia de este receptor hemtico para
Fe, identificado en nuestros laboratorios, ha
permitido interpretar la aglutinacin de los eri
trocitos de carnero especficamente sensibiliza
dos, por los anticuerpos anti-ovoalbmina coprecipitantes, como consecuencia de la forma
cin de complejos mixtos, constituidos por la
unin del sitio de combinacin de alta afinidad
de una molcula con un determinante antigni
co existente en la superficie de un eritrocito, y
el fragmento Fe de la misma molcula, activa
do por esa interaccin, con un receptor para Fe
presente en un eritrocito adyacente. En favor
de esta interpretacin est el hecho de que slo
los anticuerpos copreeipitantes y no sus frag
mentos F(ab ) 2 aglutinan los eritrocitos sensibi
lizados y que dicha aglutinacin se ve inhibida
si los receptores eritrocitarios son previamente
bloqueados con IgG agregada por calor, Fcy,
Fc^oIgM .V S. (fig. 19-7).
El hecho de que los glbulos rojos humanos
sensibilizados no sean aglutinados por los anti
cuerpos copreeipitantes, cosa que hacen los
precipitantes, y que los glbulos rojos de car
nero sensibilizados sean aglutinados por ambos
anticuerpos, permite la deteccin de anticuer
pos precipitantes como contaminantes de una
poblacin de anticuerpos copreeipitantes puri
ficados. Dada la sensibilidad de la reaccin de
hemaglutinacin, se han podido poner en evi
dencia pequeas cantidades de anticuerpos pre
cipitantes en muestras purificadas de anticuer
pos copreeipitantes que daban inmunoprecipi
tacin negativa.

Evolucin de los anticuerpos IgG simtricos

precipitantes y asimtricos (copreeipitantes)
en la respuesta inmune
La concentracin srica de anticuerpos pre
cipitantes y copreeipitantes ha sido investigada
en ovejas inoculadas a repeticin, durante un
ao, con un antgeno T-dependiente en solu
cin (GGH-DNP). Los anticuerpos anti-DNP
copreeipitantes estn presentes durante todo el
curso de la respuesta inmune, y en todos los ca-

355

Anticuerpos no precipitantes

F(ab )2

/
m

G lbu los rojos

d e carnero
se n sib iliz a d o s

Fe

Anticuerpo
IgG asim trico

D eterm inan te a n tign ico

#

Aglutinacin

R ecep to r para Fe

F ig . 19-7. R epresentacin esquem tica de la hem aglutinacin pasiva m ediada por anticuerpos no precipitantes IgG asim
tricos o coprecipitantes, com o un fenm eno mixto en el c[ue participan los fragm entos Fab y Fe,

SOS su concentracin srica no sobrepasa el

10% a 15% de los anticuerpos totales (relacin
Ac ppte/Ac coppte, aproximadamente 90/10).
En conejos inoculados en form a similar con
Salmonella typhimurium y vacas infectadas con
Brucella abortus, cepa l9, la concentracin de
anticuerpos no aglutinantes capaces de fijarse
al antgeno y detectables por reaccin con anti
gammaglobulina (Coombs) se incrementa, lle

F lg . 19-8. C urvas de produccin de anticuerpos p re c ip i

tantes y coprecipitantes po r conejos inoculados a re p e ti
cin con ovoalbm ina en solucin (A), ovoalbm ina fijada
covalentem ente a Brucella abortus (B), y ovoalbm ina p o
lim erizada por tratam iento con glutaraldehdo (C).

gndose a obtener relaciones Ac aglt/Ac noaglt de 25/75. Este hecho es consecuencia de la

forma de presentacin del antgeno (soluble o
particulado), lo que queda demostrado con los
resultados de la fig. 19-8, Como puede verse, la
ovoalbm ina polimerizada con glutaraldehdo
y la ovoalbmina monomrica covalentemente
fijada a una partcula (bacteria) dan una res
puesta similar, con un alto contenido en anti-

12

16

Semanas

20

24

356

Aspectos bsicos de la inmunidad

cuerpos coprecipitantes, a diferencia de lo que

ocurre con la ovoalbmina en solucin. Es de
destacar que esos incrementos ocurren cuando
los antgenos particulados son inoculados a re
peticin, por perodos largos. Los resultados
anteriores descartan, adems, la participacin
de algn componente de la pared o membrana
bacteriana en la modulacin de la respuesta in
mune.

Funcin de los anticuerpos IgG asimtricos

Los resultados obtenidos en el estudio de los
anticuerpos coprecipitantes en diferentes espe
cies animales muestran que estos anticuerpos
estn constituidos por molculas asimtricas,
funcionalmente univalentes y, dada la capaci
dad que tienen para unirse firmemente al ant
geno por el sitio de combinacin de alta afini
dad, constituyen excelentes anticuerpos de blo
queo. Considerando este hecho y el particular
comportamiento biolgico de los anticuerpos
IgG asimtricos, la existencia de estos anticuer
pos podr resultar beneficiosa o perjudicial pa
ra el husped segn el carcter propio o no
propio de los antgenos involucrados y de la si
tuacin particular en la que actan.
Si se tienen en cuenta los resultados obteni
dos en los estudios seriados efectuados en ove
jas y conejos inoculados con antgenos T-dependientes en solucin, cabra suponer que los
anticuerpos IgG asimtricos no tienen signifi
cacin en la respuesta inmune, ya que como se
ha sealado, en el transcurso de la respuesta,
durante un ao, la relacin anticuerpo IgG si
mtrico/ asimtrico ha sido 90/10 en forma per
manente, y la eficacia de estos anticuerpos, en
esa relacin, es prcticamente nula. No obstan
te las cosas cambian cuando los inmungenos
son particulados. En estos casos, a medida que
transcurre el tiempo se incrementan los anti
cuerpos asim tricos invirtindose la relacin
anteriorm ente indicada, llegando estos an ti
cuerpos a constituir el 30-70% del total. Sueros
de estos animales con diferentes relaciones de
am bos anticuerpos han sido an alizad o s en
cuanto a su capacidad opsonizante in vivo, y
los resultados obtenidos muestran similitud con
los logrados cuando se analizaron m ezclas
preestablecidas de anticuerpos IgG simtricos
precipitantes y asimtricos no precipitantes.
En infecciones m icrobianas y parasitarias
crnicas como brucelosis, gonococcia, tripano
somiasis americana, triquinosis, y las produci
das por Necator americanus y Fascioia hepti
ca, se ha demostrado la presencia de anticuer
pos bloqueantes de alto ttulo. De sueros de pa
cientes con enfermedad de Chagas crnica he
mos aislado anticuerpos que responden a las
caractersticas de los anticuerpos IgG asimtri

cos, que no obstante fijarse firmemente al par

sito no son inm unolticos, lo que dem uestra
que no son protectores del husped. Un aumen
to de estos anticuerpos en las infecciones crni
cas sera comprensible, teniendo en cuenta que
en estos casos antgenos particulados (bacte
rias, parsitos) estimulan en forma repetida por
largos perodos.
Anticuerpos no precipitantes han sido d e
mostrados en tumores. Diferentes mecanismos
podran estimular clulas tumorales en reposo
y los neoantgenos expuestos podran inducir
una respuesta inmune humoral con predominio
de anticuerpos IgG asimtricos. Dada su capa
cidad bloqueante, al impedir la agresin de los
neoantgenos por los mecanismos efectores de
una respuesta inmune normal, en lugar de indu
cir surveiliance mejoraran y facilitaran el cre
cimiento tumoral y las metstasis.
Estudios desarrollados en nuestros laborato
rios en conejos inoculados con tiroglobulina
homloga en solucin y pohmerizada con glu
taraldehdo mostraron resultados que difieren
entre s. Slo la forma soluble del antgeno in
dujo la produccin de anticuerpos IgG precipi
tantes, fijadores del com plem ento, m ientras
que con el antgeno polimerizado se obtuvieron
anticuerpos no fijadores del complemento, pre
dominantemente no precipitantes. Los estudios
anatomopatolgicos mostraron la existencia de
dao glandular slo despus de la inoculacin
de tiroglobulina soluble por largos perodos.
Estos resultados estaran de acuerdo con lo ob
servado en algunos casos de enferm edad de
Hashimoto, en los que la tiroiditis puede estar
presente o no, aun con los mismos ttulos de
anticuerpos anti-tiroglobulina totales.
La misma paradoja ocurre en diabetes, don
de pacientes con alto ttulo de anticuerpos anti
insulina pueden presentar hiperglucemia o hipoglucemia. El radioinmunoanlisis usado para
la cuantificacin de anticuerpos no puede dis
criminar entre molculas normales y asimtri
cas. Es posible que en algunas hiperglucemias
los anticuerpos presentes sean normales, sim
tricos, capaces de formar complejos Ag-Ac que
fijan complemento, opsonizan y activan la de
puracin antignica. Estos eventos dism inui
ran los niveles de insulina. La presencia de an
ticuerpos anti-insulina asimtricos inhibira la
rama efectora del sistema inmune por no for
mar complejos Ag-Ac con la adecuada estruc
tura, y el antgeno insulina resultara bloqueado
y protegido por sus propios anticuerpos y man
tenido en circulacin. De acuerdo con la cons
tante de asociacin a equilibrio K, que define la
afinidad antgeno-anticuerpo como la relacin
entre los reactivos complejados y libres del sis
tema, la hipoglucemia observada podra ser de
bida a la presencia de hormona libre circulante.

Anticuerpos no precipitantes
La intensidad de la hipoglucem ia dependera
de la relacin entre anticuerpos simtricos/asi
mtricos en el suero.
R ecientem ente hem os dem ostrado que el
10-12% de las molculas de IgG provenientes
de suero hum ano norm al y de otras especies
animales estn asim tricam ente glucosiladas.
Muchos de los antgenos propios generalmente
asociados con clulas podran actuar como in
mungenos particulados. Como consecuencia,
gran parte de las molculas asimtricas no in
munes del husped podran ser especficas de
lo propio actuando como anticuerpos protecto
res, reguladores. Esto estara de acuerdo con lo
sugerido por Cohn y Cooke de que los anti
cuerpos naturales podran actuar bloqueando
epitopes propios o epitopes extraos que mimetizan lo propio, previniendo de esta manera la
iniciacin de una respuesta de autoinmunidad.
Clculos efectuados nos permiten decir que
por mi de suero deberan existir 6 x 10' mol
culas IgG asimtricas, si consideramos que el
10-15% de la IgG total del suero es equivalente
a 1,5 mg.ml o 10" M. Si este valor se multiphca por el nmero de Avogadro (6,02 x 10^^)
el producto obtenido corresponde al nmero de
molculas IgG asimtricas por mi de suero an
tes indicado. Si admitimos que en un individuo
el nmero de paratopes capaces de reconocer
distintas especificidades, incluidas las de los
idiotipos puede llegar a 2-5 x 10*, los clculos
nos dicen que aproximadamente 10 m ol.m f'
(6 X 10'V2,5 X 10*) reconocern el mismo epi
tope. Este nmero de molculas sera suficiente
para participar en diferentes funciones inmunes
como el bloqueo de antgenos que podran esti
m ular o deprim ir clulas inm unolgicamente
componetentes o en la creacin de tolerancia.
Es tentador especular que los anticuerpos IgG
asimtricos, no precipitantes, son capaces de
bloquear antgenos o epitopes, disminuyendo
su concentracin y como consecuencia intervi
niendo en la induccin de tolerancia de baja
dosis.
Podra argum entarse que los anticuerpos
norm ales, b ivalentes, sim tricos, no son el
reactivo ideal para un encadenamiento idiotipoantiidiotipo efectivo propuesto por Jem e, ya
que por poseer dos paratopes activos podran
originar agregados disparando mecanismos in
munes efectores. Los anticuerpos IgG asimtri
cos, funcionalmente univalentes, podran m an
tener ese encadenamiento, perpetuando adems
las clulas B con m em oria dependientes del
idiotipo. La unin entre molculas de anticuer
pos asimtricos sera estable porque, a travs
de su paratope de alta afinidad, podra unirse a
idiotipos, exponiendo al mismo tiempo su pro
pio idiotipo a travs del paratope o sitio de
combinacin de baja afinidad. Este paratope es

357

incapaz de fijar grandes ligandos, pero actuan

do como epitope (idiotipo) podra ser fijado fir
mem ente por el paratope de alta afinidad de
otra molcula IgG asimtrica.
Anticuerpos IgG asimtricos pueden adems
actuar en forma beneficiosa, cuando son indu
cidos con el objeto de lograr una terapia antialergnica especfica. Hay marcadas evidencias
de que el anticuerpo bloqueante especfico IgG
asimtrico funciona como protector en la aler
gia, y que la eficacia de la inmunoterapia es d e
pendiente del cambio del balance entre a n ti
cuerpos perjudiciales de la clase IgE y anti
cuerpos protectores, bloqueantes, de la clase
IgG. Cuando con fines teraputicos se inocula
ron en form a repetida alrgenos m odificados
por tratamiento con polietilenglicol, se obtuvie
ron mejores resultados que cuando se usaron
alrgenos solubles. Esto est de acuerdo con la
sntesis preferencial de anticuerpos IgG asim
tricos bloqueantes obtenida cuando conejos y
ratas fueron inoculados con antgenos solubles
polimerizados (seroalbmina bovina) o antge
nos particulados (clulas esplnieas).
En estudios previos demostramos que duran
te la preez hay un aumento considerable de
molculas IgG asimtricas especficas (contra
antgenos paternales) y no especficas, llegando
a valores de 25-30% en suero y 35-60% en los
eluidos de placenta con KCL 4M. La actividad
anti-paternal localizada en la IgG asim trica,
medida por inmunofluorescencia (IF) y fijacin
del complemento, usando linfocitos paternales
como blanco, es menor en el suero que en los
eluidos de placenta. En los eluidos la actividad
anti-paternal de la IgG asimtrica es tres veces
superior a la misma actividad detectada en la
fraccin IgG simtrica. Este hecho y el efecto
bloqueante de los anticuerpos asimtricos, su
gieren que estos anticuerpos con especificidad
para los antgenos de origen paterno deben p a r
ticipar en la proteccin del feto en el tero m a
terno.
En ratas Fischer hembras inmunizadas con
antgenos particulados (clulas esplnieas) p ro
venientes de ratas machos Buffalo, hemos o b
servado una sntesis preferencial de anticuerpos
asimtricos. Cuando las ratas Fischer fueron in
munizadas durante 3 meses previo al aparea
miento eon machos Buffalo, el peso de los fe
tos y la placenta y la sobrevida de las cras fue
mayor que en el grupo control, lo que sugiere
un efecto beneficioso de los anticuerpos asim
tricos en la preez. Esto est de acuerdo con
los resultados obtenidos cuando mujeres que
han padecido abortos espontneos recurrentes
son inmunizadas con linfocitos paternales. Con
estos tratamientos se ha observado ausencia de
abortos y la gesta de nios de mayor peso y ta
mao.

358

Aspectos bsicos de la inmunidad

Cuadro 19-2. Estudios serolgicos en pacientes con enfermedad de Chagas

Reacciones serolgicas

Sueros

Precipitacin
en geles

H em aglutinacin
GRH
G RC

1/512
1/256
1/64
1/64
1/64
1/64
1/64
1/32

1/512
1/512
1/256
1/256
1/512
1/256
1/256
1/256

La sntesis de factores supresores de la res

puesta inmune celular, por parte de la placenta,
ha sido descrita. Recientemente hemos demos
trado que cuando el sobrenadante de cultivos
de placenta es adicionado a un hibridoma, es
posible incrementar la relacin anticuerpo asi
mtrico/simtrico de las molculas IgG sinteti
zadas. C am bios sim ilares hem os observado
cuando se inm u n izaro n ratas v rg en es con
ovoalbmina y simultneamente se les inocul
por va intraperitoneal sobrenadante de cultivos
de placenta. En este caso fue detectado un mar
cado incremento de molculas IgG asimtricas
con especificidad anti-ovoalbmina.
Durante la preez, los linfocitos expresan re
ceptores especficos para progesterona. Estos
linfocitos, al ser pulsados con la hormona pro
ducen un factor con actividad inm unolgica
que incluye inhibicin de la lisis mediada por
clulas NK (natural killer), aumento de clu
las que expresan fenotipo de supresoras, e inhi
bicin de la proliferacin de cultivos mixtos de
linfocitos. Este factor ha demostrado funcionar
de una manera similar a la antes indicada para
los factores placentarios, en especial incremen
tando la proporcin de molculas IgG asimtri
cas sintetizadas (vase cap. 34).
Considerando los hechos sealados, en los
que se pone en evidencia que durante la preez
hay una sntesis preferencial de anticuerpos
IgG asimtricos inducida por factores placenta
rios, cabe preguntarse si es siempre correcto
vacunar a las madres para lograr transferencia
pasiva de inmunidad. Ello porque estos anti
cuerpos, cuando estn dirigidos contra bacte
rias o parsitos, son pro tecto res del agente
agresor.
Consideraciones que deben tenerse
en cuenta para la correcta interpretacin
de resultados serolgicos
Con mucha frecuencia se seleccionan, con
fines de diagnstico, las reacciones serolgicas
ms sensibles. G eneralm ente se presta poca

Fijacin
ele com plem ento
1/512
1/64
1/32
1/32
1 /8

1/16

1/8
1/4

ELISA

IFI

1/800
1/3.200
1/800
1/400
1/800
1/800
1/1.600
1/400

1/1.600
1/1.600
1/800
1/800
1/800
1/1.600
1/800
1/800

atencin al hecho de si se trata de reacciones de

interaccin prim aria Ag-Ac o interaccin se
cundaria, y las diferencias en los ttulos logra
dos por dos o ms de estas reacciones, para una
misma muestra de suero, se atribuyen a varia
ciones en su sensibilidad. Los cuadros 19-2 y
19-3 muestran resultados obtenidos cuando se
analizaron sueros hum anos provenientes de
chagsicos crnicos y sueros de bovinos infec
tados con B. abortas, usando reacciones serol
gicas de interaccin primaria (ELISA, IFI) y de
interaccin secundaria (inm unoprecipitacin,
fijacin del complemento). Las primeras se ca
racterizan porque dosan todos los anticuerpos
presentes, sin discriminar tipo o calidad; las se
gundas, en cambio, slo dosan anticuerpos fun
cionalm ente bivalentes o plurivalentes. Los
sueros analizados, que contienen proporciones
variables de anticuerpos simtricos y asimtri
cos (precipitante/no precipitante; aglutinante/n o a g lu tin an te) p re v iam e n te d em o strad o ,
muestran en algunos casos equivalencia entre
ambos tipos de reacciones serolgicas, m ien
tras que en otras hay m arcada discordancia.
Ello se debe a las proporciones relativas de Ac
sim trico/asim trico presentes en los sueros,
los que al com petir por masa hacen que las
reacciones serolgicas secundarias tengan dis
tinta positividad para ttulos similares logrados
por ELISA y por IFI. En algunos de los casos
es bien notorio que las diferencias observadas
no pueden deberse a diferentes sensibilidades
de las reacciones (vase cap. 9, cuadro 9-4).
El cuadro 19-4 muestra los resultados logra
dos al cuantificar los anticuerpos sricos anti-r.
cruzi por hemaglutinacin pasiva, usando eri
trocitos de carnero (que poseen receptores para
Fe) y eritrocitos humanos (carentes de recepto
res para Fe expuestos). Como puede verse, slo
con eritrocitos de carnero se consigue una bue
na cuantificacin, pues pueden ser aglutinados
por anticuerpos simtricos, bivalentes y anti
cuerpos asimtricos, univalentes. Con los eri
trocitos humanos no ocurre lo mismo, siendo
muy frecuente las variaciones de los ttulos res-

359

Anticuerpos no precipitantes

Cuadro 19-3. Estudios serolgicos de sueros bovinos infectados con B. Abortus.

R eacciones serolgicas
Wright
(Ttulo aglutinante)

Sueros

Coom bs
(Ttulo no aglutinante)

1/640

IFI

1/1.280
1/640
1/5.120
1/320
1/640

1/20

1/40
1/20
1/80

pecto de los obtenidos con eritrocitos de carne

ro, y muy especialmente los fenmenos de pro
zona, dado el poder bloqueante de los anticuer
pos IgG asimtricos. Esto hace que sean muy
poco recom endables las hem aglutinaciones
cualitativas, con fines de descarte, cuando el
soporte usado son glbulos rojos humanos.
Los hechos relatados son de fundam ental
importancia y hacen que para poder efectuar un
buen diagnstico y pronstico de un proceso
infeccioso, con discriminacin de la calidad de
los anticuerpos presentes, sea necesario selec
cionar una batera adecuada de reacciones sero
lgicas, que midan interaccin primaria e inte
raccin secundaria Ag-Ac.
A N TIC U ER PO S A N T I-R h
IN C O M PL E T O S
Al comienzo de las isosensibilizaciones por
antgenos Rh aparecen anticuerpos localizados
en la IgM, que no atraviesan la placenta y por
lo tanto no son responsables del dao fetal. En
las sensibilizaciones a repeticin se forman an
ticuerpos IgG, que atraviesan la placenta y que
al reaccionar con los eritrocitos Rh+ del feto
desencadenan el mecanismo que lleva a la ane
mia hem oltica del recin nacido. Estos anti
cuerpos, en su mayora son del tipo incomple
to, caracterizados por no aglutinar los glbu
los rojos ORh+ en medio sahno, no obstante es
tar fijados a los eritrocitos como se demuestra
con los sueros antigamm aglobulina (reaccin

1/1.600
1/800
1/3.200
1/800
1/800

de Coombs), cosa que hacen si los eritrocitos

fueron tratados previamente con tripsina, p a
pana o bromelina. En medio albuminoso tie
nen tambin capacidad aglutinante.
El hecho de que aglutinen glbulos ro jo s
ORh+ tripsinados y no lo hagan con los no trata
dos, a diferencia de lo que pasa con los an ti
cuerpos anti-Rh completos (normalmente IgM )
fue interpretado como una mejor accesibilidad
0 liberacin de un mayor nmero de determ i
nantes antignicos Rh, lo que ocurre durante el
tratamiento enzimtico. De este modo, los anti
cuerpos incompletos (IgG) tendran una m ejor
oportunidad de interaccionar con sus determ i
nantes especficos y aglutinar los glbulos ro
jos. Los anticuerpos completos, dada la mayor
capacidad reactiva de la molcula, aglutinaran
las clulas no tratadas, que contendran un n
mero reducido de determinantes antignicos.
Parecera que esta interpretacin no est de
acuerdo con algunos resultados experim enta
les:
a) El nmero de epitopes Rh por clula no es
tan reducido; oscila, segn los autores, entre
1 y 4 X 101
b) En nuestros laboratorios se ha observado
que slo la molcula entera de IgG anti-Rh (an
ticuerpo incompleto) aglutina los glbulos ro
jo s 0Rh+ tripsinados, no as sus fragm entos
F(ab ) 2 y Fcy. Las reacciones de Coombs efec
tuadas con los tubos que no dieron aglutinacin
directa, usando sueros anti-Fab y anti-Fcy co
mo reactivos indican que, si bien la IgG anti-

C uadro 19-4. Sueros humanos de chagsicos valorados p o r hemaglutinacin pasiva.

Suero
N"
1
2

Eritrocitos
sensibilizados
carnero hum ano
carnero hum ano

H emaglutin-cin (Dilucin)
1/10

1/20

1/40

1/80

J/I6 0

1/320

4+
+

+
+
+

+
+
+

+
+
+
+
+
+
+
+

+
+
+

+
+

3
4

carnero hum ano

carnero hum ano

+
+

+
+
+

+
+

1/640

I /J .2 8 0
-

+
+

+
-

360

Aspectos bsicos de la inmunidad

Rh y sus fragmentos F ab)^ y P cy u c aglutinan

los eritrocitos no tripsinados, los dos primeros
se fijan a su superficie. En cambio, todos se fi
jan a los eritrocitos tripsinados. En el caso del
fragmento Fcy, la unin no es tan firme como
la del fragmento F(ab) 2 , deducible del nmero
de lavados a que pueden ser sometidos los gl
bulos rojos que han estado en contacto con
l, previo al aadido del antisuero correspon
diente.
c) El contacto previo del fragmento Fe o in
munoglobulinas con glbulos rojos ORh+ tripsi
nados interfiere en algunos casos en la agluti
nacin por anticuerpos anti-Rh, y en los tubos
de interferencia se ha demostrado que el inhibi
dor est unido a los hemates. Esta capacidad
inhibitoria es mnima o nula para la IgG nor
mal, sin actividad anti-Rh, y su fragmento Fcy
y es muy manifiesta para Fcjj, e IgM monom
rica (IgM.7S), los complejos Ac-Ag y la IgG y
Fcy agregados por el mtodo de la bencidina
bisdiazotizada. La IgM (19S) y el fragmento
Fc|i5 no inhiben la reaccin.
d) Cuando se tripsinan glbulos rojos ORh+
previamente sensibilizados por 1 hora a 37C
con IgG anti-Rh y fragmento Fiah)^ obtenido
de sta, los primeros aglutinan espontneamen
te, cosa que no ocurre con los segundos. No
obstante, la reaccin de Coombs con suero anti-Fab efectuada en estos ltimos es positiva, lo
que demuestra que el fragmento F (ab)j antiRh se encuentra fijado a los glbulos rojos
ORh+ tripsinados.

no. Como consecuencia, la reaccin de agluti

nacin slo tendra lugar cuando el fragmento
Fe de esa molcula, activada por la interaccin
previa del Fab con el determinante antignico
Rh, se fije a su receptor especfico oculto en la
membrana de otro hemate, el que slo se libe
rara por la accin de enzimas hidrolticas.
En un caso de anemia hemoltica de tipo au
toinmune pudimos demostrar la presencia de
receptores expuestos para Fe. Los hemates de
ese paciente eran aglutinados, sin tripsinizacin
previa, por anticuerpos anti-Rh incompletos y
adems fijaban complejos Ac-Ag, reacciones
stas que eran inhibidas por Fcix. Este caso po
ne en evidencia, desde el punto de vista de la
patologa, la significacin que tendra la libera
cin in situ de dichos receptores.
Otro hecho interesante de destacar sobre los
anticuerpos anti-Rh incom pleto es el corres
pondiente a la capacidad aglutinante en medio
albuminoso de la IgG anti-Rh y su fragmento
F (ab)2. Utilizando como vehculo albm ina
bovina al 20%, el anticuerpo entero aglutina
eritrocitos ORh+, no as el fragmento F(ab) 2 .
Esto hace c]ue la interpretacin de que la agluti
nacin en medio albuminoso sea consecuencia
exclusiva de modificaciones del potencial zeta,
lo que facilitara la aproximacin de las mol
culas de anticuerpo, se vuelva dubitativa. Todo
pareciera indicar un efecto directo o indirecto
de la albmina sobre el fragmento Fe.

BIBLIOGRAFA

Los resultados experimentales indicados no

estaran de acuerdo con la interpretacin de que
la aglutinacin de los glbulos rojos ORh+ trip
sinados por parte de los anticuerpos anti-Rh in
completos es consecuencia de la liberacin de
un mayor nmero de determinantes antignieos
Rh, lo que facilitara la interaccin. Todo hace
suponer que el fragmento Fe podra tener algu
na participacin en la reaccin de aglutinacin.
Ella queda evidenciada por la interferencia en
la capacidad aglutinante de los anticuerpos anti-Rh incom pletos cuando los glbulos rojos
ORh+ tripsinados son puestos previam ente en
contacto con Fcy agregado. La fijacin del
fragmento Fe al eritrocito se hara por unin a
receptores para Fe, cuya existencia ha sido de
mostrada por nosotros segn se expuso en anti
cuerpos coprecipitantes.
Estos resultados permitiran suponer que los
anticuerpos anti-Rh incompletos funcionan de
manera similar a los anticuerpos coprecipitan
tes ya descritos. Es posible que por algn impe
dimento estrico o por variaciones en los valo
res individuales de
de cada fragmento Fab
de la molcula de IgG anticuerpo, slo uno de
ellos pudiera dar uniones firmes con el antge

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Inmunizacin activa
y pasiva

20

RICARDO MARGNI

Los mecanismos inmunolgicos puestos en

marcha por la introduccin de un inmungeno
confieren, en la mayor parte de los casos, pro
teccin contra ese agente agresor. La inmunoterapia, en sus formas de inmunizacin activa
(vacunacin) y pasiva (seroterapia), se basa en
ese principio.
V A CUN OTERAPIA
Las vacunas, usadas para prevenir enferme
dades infectocontagiosas, han sido uno de los
triunfos ms significativos de la medicina. Tan
ta es su eficacia que, gracias a su empleo se ha
podido dominar uno de los flagelos de la hu
manidad, la viruela, que prcticamente ha sido
eliminada. Otra enfermedad viral, la poliomie
litis, que produjo gran cantidad de invlidos
durante mucho tiempo, ha disminuido en inten
sidad como consecuencia de buenas campaas
de vacunacin.
Los conocimientos sobre mecanismos de la
respuesta inmune, estructura, biosmtesis y lo
calizacin de las diferentes clases de inmunoglobulinas, han permitido seleccionar mtodos
de vacunacin. n efecto, el virus polio inacti
vado, inoculado parenteralm ente, induce res
puesta inmune con formacin de anticuerpos
de tipo IgG. Una cepa viva atenuada del mismo
virus dada por va oral, si bien finalmente pro
ducir anticuerpos de tipo IgG, inicialm ente
origina anticuerpos locahzados en mucosa, de
tipo (IgA) 2S.
La vacunacin por va oral con virus polio
vivo atenuado hace que los vacunados, adems
de elaborar mecanismos defensivos generaliza
dos eficaces contra la viremia, produzcan a ni
vel de la mucosa intestinal anticuerpos locali

zados en la IgA secretoria, lo que reduce al m

nimo la posibilidad de que los vacunados por
va oral se transformen en portadores sanos.
En otros casos, la vacunacin por va oral
asegura la proteccin de la mucosa del rbol
respiratorio contra numerosos agentes infeccio
sos.
Inmungenos
El mecanismo de agresin de un microorga
nismo es el que determina el tipo de inmunge
no que se ha de usar para conferir proteccin
contra l. Si se trata de un microorganismo in
vasor, capaz de producir directam ente dao
hstico, la vacuna habr de elaborarse con el
agente agresor en cuestin. En aquellos casos
en que el efecto patgeno se deba a la accin
de exotoxinas elaboradas por el microorganis
mo, los inmungenos que se han de usar sern
las toxinas atenuadas. Las vacunas usadas en
las inm unizaciones, en especial del hombre,
forman parte de dos grandes grupos; las virales
y las bacterianas. ltimamente se estn elabo
rando tambin vacunas contra algunos parsi
tos, entre ellos el paludismo.
Vacunas virales. Los inmungenos usados
con tal fin pueden ser de tres tipos distintos:
a)
Virus atenuados. En estos casos se em
plean cepas de virus vivos que han perdido su
virulencia para el hombre como consecuencia
de pasajes prolongados por otros huspedes o
repiques sucesivos en cultivos de tejidos. Virus
que responden a estas caractersticas son los
polio 1, 2 y 3 que componen la vacuna Sabin.
Por este procedimiento los virus experimentan
mutaciones que, si son apreciables hacen que
difcilmente vayan a ocurrir reversiones a la ce

Inmunizacin activa y pasiva

pa virulenta. No obstante ello, estas cepas de
ben ser permanentemente controladas.
Puede ocurrir tambin, como se ha observa
do en el virus influenza, que, como consecuen
cia del pasaje por huspedes no humanos como
el embrin de pollo, la cepa mutada exprese
antigenicidad diferente a la del virus original y
que su poder protector como agente vacunante
sea deficitario.
Otra posibilidad es obtener mulantes tempe
ratura sensibles que crecen poco a 37C y lo
hacen satisfactoriamente a 25-28"C. Este tipo
de inmungeno se ha usado en la vacunacin
de animales, pero su uso debe ser muy contro
lado por las posibilidades de reversiones.
Tambin se emplea, en la vacunacin con vi
rus vivos, especies virales que son patgenas
para otros huspedes y que no lo son para el
hombre. El ejemplo ms representativo es el
virus vaccinia, que cruza con el virus de la vi
ruela humana y que se lo emplea para vacunar
al hombre con tal fin.
La inmunidad que confieren estas vacunas es
de larga duracin, generalmente de por vida y
superior a la lograda con agentes infecciosos
muertos. La mayor duracin de la inmunidad
en estos casos probablemente est ms relacio
nada con los estm ulos de repeticin que se
producen como consecuencia de la rephcacin
viral en las clulas del husped, que con otros
hechos inherentes a las diferentes etapas de la
respuesta inmune.
b) Virus inactivados. En estos casos, los vi
rus han perdido su capacidad de replicarse por
tratamiento eon agentes fsicos o qumicos. Va
cunas que responden a estas caractersticas son
la anti-polio elaborada por Salk, la antirrbica
y anti-influenza. Todas ellas han demostrado
ejercer efecto protector en el husped. La vacu
na anti-polio de virus inactivado, como ya se
indicara, no confiere proteccin contra una in
feccin de la mucosa intestinal.
La proteccin conferida por estas vacunas es
de menor duracin que la inducida por los vi
rus atenuados, y para conseguir efecto positivo
generalmente se necesitan vaiias reinoculacio
nes del inmungeno.
c) Sub-m idades virales. Diferentes subunida
des del virin pueden estar expuestas y ser el
blanco de neutralizacin por los correspon
dientes anticuerpos. Por consiguiente, vacunas
elaboradas con estas subunidades pueden ser
efectivas. El caso ms representativo es el ant
geno de superficie HbsAg de virus de la hepati
tis B. Este antgeno se encuentra en el plasma
circulante, material del cual inicialmente se lo
aisl. Con el advenimiento de los pptidos sint
ticos y las tcnicas de biologa molecular (vase
ms adelante) el uso de estas vacunas con subu
nidades virales naturales ha cado en desuso.

363

Vacunas bacterianas. Las vacunas bacteria

nas pueden elaborarse con cepas vivas atenua
das, bacterias muertas o con toxinas inactivadas (toxoides) en el caso de ser stas las re s
ponsables de la agresin en el husped.
a) B acterias vivas atenuadas. Slo se las
emplea en casos muy particulares. Una vacuna
que responde a estas caractersticas es la BCG
o vacuna de Calmette y Guerin, elaborada con
una cepa de M. tuberculosis variedad bovina
atenuada en su virulencia por pasajes sucesivos
en papa biliada glicerinada. Si bien sta es una
vacuna que se encuentra dentro de los progra
mas de vacunacin en nios de la OMS, donde
parecera haber demostrado eficiencia, los estu
dios efectuados donde la tuberculosis constitu
ye an un problema serio, corno la India, m ues
tran que los resultados obtenidos en adultos va
cunados han sido variables.
b) Bacterias enteras inactivadas. Las bacte
rias son inactivadas por calor o por otros agen
tes fsicos como radiaciones ultravioleta, o por
tratamiento con productos qumicos con poder
bactericida como form ol, fenol, m erthiolate,
etc. Las vacunas que responden a estas caracte
rsticas ms usadas hasta el momento son la an
ticolrica, antitfica y antipertussis. D ado que
su eficiencia ha sido cuestionada en algunos
casos, actualm ente hay marcada tendencia a
elaborar vacunas con productos acelulares, en
especial los obtenidos de B. pertussis, donde
algunos productos definidos como la toxina
p ertussis, la hem oaglutinina filam en to sa, la
adenilato ciclasa y otros han demostrado capa
cidad para inducir en ratn proteccin a la in
feccin por el microorganismo vivo.
c) Toxoides bacterianos. Hay microorganis
mos que ejercen su efecto patognico a travs
de toxinas que secretan. Dado que las mismas
son altam ente inm unognicas, la vacunacin
para inducir la sntesis de anticuerpos especfi
cos resulta muy eficiente. Como inmungeno se
usan las toxinas detoxificadas o toxoides, obte
nidos por tratamiento de las toxinas con formol.
Los toxoides ms empleados en la inm uniza
cin humana son el diftrico y el tetnico.
d) Polisacridos bacterianos. Existen num e
rosas bacterias que presentan cpsula o antge
nos de envoltura constituidos por polisacridos,
los que le confieren al microorganismo una re
sistencia particular a los mecanismos biolgi
cos de depuracin an tig n ica y fa g o cito sis
puestos en marcha por el husped. Entre estos
microorganismos se encuentran los estreptoco
cos, meningococos, neumococos, klebsiellas, y
otros.
Las inm unizaciones con p o lisacrid o s no
siempre son efectivas, pues estos antgenos son
T-independientes y cursan respuestas inmunes
con produccin de anticuerpos gM; en algunos

364

Aspectos bsicos de la inmunidad

casos, dadas las caractersticas y tamao mole

cular del polisido, no inducen respuesta al ser
inoculados. Este inconveniente ha sido subsa
nado en parte acoplndolos a soportes o ca
rrier como seroalbtimina bovina (SAB) u otras
protenas de origen bacteriano. Ello hace que
estos inmungenos induzcan una respuesta Tdependiente, con la participacin de linfocitos
T-cooperadores y produccin de IgG, la que es
marcadamente heterognea como consecuencia
de la antigenicidad del soporte.
Con frecuencia, y con el objeto de disminuir
el nmero de inyecciones, se utilizan las vacu
nas poUvalentes. Si bien sta es una ventaja, no
debe descartarse la posibilidad de que, por con
currencia de antgenos con diferente inmunoge
nicidad, haya competicin antignica y la res
puesta sea efectiva para un nmero reducido de
ellos. Las estadsticas han mostrado que la va
cuna triple (difteria, ttanos, pertussis) y la va
cuna antipolio hechas por separado son ms
efectivas en el logro de buena respuesta inmu
ne para los antgenos mencionados, que cuando
se ha intentado inmunizar con una vacuna cu
druple.
Las mezclas antignicas a veces modifican
los resultados esperados. A quellas vacunas
mixtas en las que participa la B. pertussis, dado
el factor histaminosensibilizante que esta bac
teria contiene, pueden hacer que se desencade
nen ms fcilmente fenmenos de hipersensibi
lidad contra los antgenos acompaantes.
Si bien en un comienzo las vacunas prepara
das con antgenos inanimados se elaboraron en
forma fluida, en la actualidad, por regla gene
ral, esos antgenos son inoculados mezclados
con adyuvantes, los cuales, como ya se ha visto
en los captulos 4 y 15, inducen una respuesta
ms efectiva. Los agentes de mayor uso en la
inmunizacin humana, en ese sentido, son los
geles de hidrxido de aluminio y de fosfato de
aluminio. En la inmunizacin humana se est
intentando con xito la inoculacin de antge
nos incorporados en vesculas lipoidales como
los liposomas y los ICCOMS. En las inmuniza
ciones experimentales el adyuvante de mayor
uso es el de Freund completo.
Vas de introduccin del inmungeno
Durante mucho tiempo la va principal para
introducir agentes vacunantes ha sido la parenteral. La va subcutnea se utiliza con frecuen
cia y se la emplea especialmente para la inocu
lacin de vacunas preparadas con microorga
nismos muertos y toxoides. La va oral, que fue
dejada de lado en un comienzo, resulta muy
til en algunas oportunidades. Cuando se usa
esta va de introduccin y no se trata de agentes
infecciosos vivos, es conveniente que ellos es

tn asociados con productos capaces de modifi

car las condiciones normales de la barrera in
testinal, haciendo que por muclisis y conges
tin se faciliten las posibilidades de penetra
cin de los antgenos en la va general. La hia
luronidasa y las sales biliares son eficaces en
estos casos. En otras ocasiones, como la ya
mencionada de la vacuna polio preparada con
virus vivo (Sabin), la estimulacin de una res
puesta local en las placas de Peyer, asociada
con una respuesta generalizada, hace que el va
cunado, adems de estar protegido, tenga a ni
vel de la mucosa intestinal anticuerpos elabora
dos localmente capaces de neutralizar virus po
lio, lo que evita que un protegido contra la in
feccin pueda ser un diseminador del virus.
Con el descubrimiento de la IgA secretoria,
su elaboracin local y el papel que ella tiene en
los m ecanism os de p ro tecci n de m ucosas
(vase cap. 17), se han comenzado a utilizar
con aparente xito las instilaciones o pulveriza
ciones zonales, en especial de la rinofaringe,
con el objeto de incrementar la proteccin con
tra agentes agresores que tienen esa va de pe
netracin. Un hecho alentador en este sentido
es el que antgenos incorporados en ISCOMs
tienen capacidad para inducir buenas respues
tas inmunes cuando son administrados por va
parenteral u oral.
En la formulacin de una vacuna deben te
nerse en cuenta una serie de aspectos, que in
dudablemente no lo fueron, en la elaboracin
de las primeras vacunas usadas en inmunotera
pia.
Es indispensable considerar si la infeccin
producida por el agente agresor cursa en forma
aguda o crnica; cul es la va de penetracin
del agente patgeno; si la respuesta inmune a
inducir para lograr un efecto positivo debe ser
preferentemente humoral o celular, cul es la
evolucin inmunopatolgica posterior a la in
feccin; si lo que se busca es una neutraliza
cin de la infectividad o de la replicacin del
agente infeccioso, en cvspecial los virus; si es
indispensable o no el aadido de adyuvantes
para lograr la mxima efectividad deseada; si el
agente infeccioso sufre mutaciones durante las
infecciones naturales que modifican su estruc
tura antignica, como ocurre con el virus in
fluenza o algunos parsitos o como el T. brusei, constituyendo esto verdaderos mecanismos
de escape, etc. Todo ello har que la vacuna a
elaborar est condicionada para inducir una
buena respuesta de anticuerpos, especialmente
cuando se quiere proteger contra bacterias pigenas, o si la estimulacin de los linfocitos Th
y Te y la produccin de interleuquinas, interfe
rn, clulas NK, es tambin indispensable co
mo ocurre en las infecciones virales. Tambin
debe considerarse el acondicionamiento y dosis

Inmunizacin activa y pasiva

de las vacunas para que induzcan memoria in
munolgica, a efectos de asegurar una protec
cin de larga duracin, especialmente cuando
se requiere proteger contra bacterias pigenas,
o si la estimulacin de los linfocitos Th y Te y
la produccin de interleuquinas, interfern, c
lulas NK, es tambin indispensable como ocu
rre en las infecciones virales. Tambin debe
considerarse el acondicionamiento y dosis de
las vacunas para que induzcan memoria inmu
nolgica, a efectos de asegurar una proteccin
de larga duracin, especialmente cuando la in
munidad es mediada por anticuerpos.
Por todo ello, para que una vacuna resulte
exitosa debe responder a los siguientes requeri
mientos:
a) activar clulas presentadoras de antgeno
(CPA) para que haya un buen procesado del in
mungeno y presentacin adecuada, a las clu
las inm unolgicam ente com petentes, de los
pptidos asociados a los antgenos del CMH
clase I y 11, as como produccin de interleu
quinas y otros factores por los linfocitos en re
poso al ser estimulados;
b) buena estim ulacin de linfocitos T y B
para lograr adecuada memoria inmunolgica y
generar linfocitos Th y Te capaces de recono
cer todos los determinantes antignicos contra
los cuales quiere inducirse respuesta;
c) persistencia de los inm ungenos en su
conformacin nativa en las clulas dendrticas
foliculares de los tejidos linfoides donde se ori
ginan las clulas B con memoria, las que per
sisten por mucho tiem po para originar final
mente clulas secretoras de anticuerpos.
No todas las vacunas responden a estas ca
ractersticas. No obstante ello, quien determi
nar su verdadera eficacia sern los ensayos
experimentales de proteccin in vivo.

que se encuentran en el calostro y la leche m a

terna [(IgA)2S] y que son incorporados por
succin durante la lactancia. La presencia de
estos anticuerpos puede bloquear la inmunoge
nicidad de antgenos vacunantes y hacer que
stos resulten poco efectivos inoculados en es
tas circunstancias. Despus de los seis m eses
las inmunoglobulinas maternas han desapareci
do; de ah que algunos pases europeos rec o
mienden iniciar los planes de vacunacin en in
fantes de esa edad. En otros centros sanitarios
se aconseja vacunar a los 3 meses de vida, con
un plan de vacunacin coordinado para evitar
superposicin de antgenos y fenmenos de in
terferencia, especialm ente cuando se trata de
vacunas antivirales.
Para algunos inmungenos como las vacunas
BCG y antipolio (Sabin), las vacunaciones sue
len iniciarse antes, por el hecho de que como
estos microorganismos vivos atenuados necesi
tan implantarse previamente para poder inducir
una respuesta inmune, se procura lograr la d o
sis ptima de antgeno para el momento ade
cuado.
En todo plan de vacunacin es necesario: a)
que el agente vacunante altamente efectivo sea
aplicado lo ms tempranamente posible, dentro
de las limitaciones ya indicadas; b) que el nimero de inoculaciones sea el adecuado, de m o
do que se consiga el mximo de eficacia, y c)
que las reinm unizaciones se hagan dentro de
los perodos preestablecidos. El cumplimiento
de estos requisitos permitir que se asegure una
correcta proteccin a los agentes agresores e x
ternos y que la actividad futura del mdico est
dirigida, ms que a curar enfermos, a atender
pacientes cuya preocupacin es m antener su
salud.
El cuadro 20-1 transcribe uno de los progra
mas de vacunacin recomendados.

Edad para la vacunacin

La inmunizacin de un nio no debe hacerse
antes de que ste haya alcanzado la madurez
inmunolgica. Las aplicaciones de inmunge
nos pueden iniciarse entre los dos y tres meses
de vida y resultan plenam ente efectivas des
pus de los seis meses. Inyecciones de antge
nos inmediatas al nacimiento pueden crear to
lerancia parcial al inm ungeno. Adem s, y
mientras no sean estrictamente necesarias co
mo consecuencia de posibles infecciones, no
son recomendables las vacunaciones prematu
ras. No debe olvidarse que es prctica corriente
la vacunacin de las mujeres grvidas con el
objeto de asegurar la transferencia congnita de
anticuerpos y por consiguiente la creacin en el
recin nacido de una inmunidad pasiva transi
toria. Ello tiene lugar por la transferencia de
anticuerpos a travs de placenta (IgG) y por los

Complicaciones de las vacunaciones

Las complicaciones que pueden surgir como
consecuencia de las vacunaciones son varias.
Debemos citar en prim er lugar las reacciones
de hipersensibilidad, que generalmente se desa
rrollan contra agentes acompaantes del inm u
ngeno provenientes de los medios de cultivo o
tejidos donde el microorganismo ha prospera
do. Cabe mencionar en tal sentido las reaccio
nes anafilcticas observadas en personas sensi
bilizadas a las protenas del polio, que fueron
inoculadas con vacunas preparadas por cultivos
de virus inrnunognicos en embrin de pollo.
A gentes inm unizantes, en especial v iru s,
pueden producir alteraciones en los tejidos del
vacunado, originando antgenos modificados,
que actan desencadenando reacciones de autoagresin, como la encefalitis observada en

Aspectos bsicos de la inmunidad

366

Cuadro 20-1. Programa de vacunaciones

Edad
l mes
2 mes

3' mes
4 mes
6 mes
Entre 9 y 12
meses

Vacuna
BCG
Triple (difteria-ttanoscoqtieluclie)
Sabin
Triple
Triple
Salin
A ntivarilica#
Saram pin

Paperas
R ubola
Triple
Sabin
Ingreso escolar BCG
D oble (difteria-ttanos)
Sabin
12 aos
A ntivarilica
BCG
18 aos
A ntivarilica
BCG
c/5 aos
A ntivarilica
c /lO a o s
A ntivarilica
A ntitetnica
18 m eses

D osis
nica
Prim era
Prim era
Segunda
T ercera
Segunda
nica
nica
nica
nica
C uarta
T ercera
*
nica
R efuerzo
Refuerzo
*
Refuerzo
*
Refuerzo
Refuerzo
R efuerzo

L a vac u n ac i n se har en los in d iv id u o s ubercuJinonegavo.s.

# En m u ch o s p ases Ur v ac u n ac i n an tiv iri lic a h a d eja d o d e ser
obligatoria.
E m barazadas: V acu n a a n tip o lio in ieltica (S abin); al 5 y 7 m es de
e m b a raz o en las n o v acu n ad as y al 7 m es en las a n te rio rm en te v a
cunadas.
V a cu n a antitetnica: al 5 m es d e em b arazo .

vacunados contra la viruela. Felizmente, dado

que esta enferm edad ha sido p rcticam ente
erradicada como plaga mundial, la vacunacin
antivarilica tiende a desaparecer.
Las vasculitis observadas en algunas revacu
naciones con antgenos proteicos como el to
xoide tetnico, seran consecuencia del depsi
to de complejos antgeno-anticuerpo. En estos
casos, la reestimulacin producira niveles ele
vados de IgG que al combinai'se con el antge
no especfico y fijar complemento desencade
nara el fenmeno citado.
Controles para determinar la eficacia
de las vacunas
Toda vacuna debe ser previamente controla
da a efectos de establecer su eficacia. Los m
todos usados con tal fin no pueden ser generali
zados. La medida de los niveles de anticuerpos
alcanzados en los animales inoculados experi
mentalmente puede en algunos casos expresar
el estado inmune, por ser esos anticuerpos los
responsables de la proteccin, como ocurre con
las antitoxinas. Estas determinaciones, no obs
tante, son relativas: deben efectuarse simult
neamente, en igualdad de condiciones experi
mentales, con vacunas de referencia y los re
sultados evaluarse estadsticamente. Teniendo

en cuenta que la estimulacin antignica no s

lo pone en marcha la produccin de anticuer
pos, los mtodos de valoracin que se han de
usar deben ser aquellos que miden el grado de
proteccin que ellas confieren a animales de
experimentacin sometidos posteriormente a la
infeccin. Estos mtodos a su vez deben ser
evaluados en relacin con los resultados obte
nidos en pruebas de campo efectuadas con gru
pos humanos altamente significativos. Estos ti
pos de controles son inchspensables, ya que no
siempre la infeccin que un microorganism o
produce en un animal de experimentacin cur
sa de manera similar a la que ocurre en el hom
bre. La inoculacin de B. pertussis en ratn,
por va intracerebral, origina una infeccin ge
neralizada; en el nio este microorganismo es
el responsable de la tos convulsa o coqueluche.
No obstante este comportamiento distinto en el
ratn y el hombre, las pruebas de campo han
demostrado que aquellas vacunas que resultan
efectivas cuando se mide su potencia en rato
nes, son las que proporcionan proteccin ade
cuada en los nios. Desafortunadamente, la co
rrelacin observada en este caso no ocurre con
otros microorganismos.
En estos ltimos tiempos se est intentando
sustituir algunos de los mtodos biolgicos de
medicin de la potencia de vacunas por mto
dos inm unoqum icos de alta sensibilidad, en
especial el ELISA cuando la respuesta cursa en
produccin de anticuerpos. En nuestros labora
torios se ha observado buena correlacin esta
dstica entre los mtodos biolgicos usados pa
ra valorar vacuna anti-pertussis, anti-tetnica y
antidifteria con ELISAS diseados para tales
fines.
Nuevas estrategias en la elaboracin
de vacunas
Han surgido tecnologas modernas para el
desarrollo de vacunas para utilizar en la inmu
nizacin del hombre y del ganado. Por una par
te, el uso de pptidos sintticos ha permitido
disponer de inmungenos definidos. Por otro
lado, los avances de la biologa molecular y las
tcnicas de ingeniera gentica han facilitado la
clonacin de ADN de bacterias y virus, y por
m ecanism os de recom binacin su in co rp o
racin a vectores adecuados. Los ADN clona
dos constituyen la parte 'del genoma que codifi
ca para determinados epitopes, contra los cua
les quiere lograrse proteccin. Los vectores no
patgenos que se han de usar pueden ser dife
rentes, y han resultado tiles, entre otros, poxavirus o virus vaccinia, Escherichia coli y Saccharomyces cerevisae. Tambin se han cifrado
esperanzas, sobre todo para agentes inmunizan
tes muy agresores, en las vacunas que utilizan

Inmunizacin activa y pasiva

como inmungeno anticuerpos contra el idiotipo del paratope que reconoce al epitope del
agente agresor.
Cualquiera que sea el tipo de vacuna que .se
utilice, para que sea til debe inducir una res
puesta sim ilar a la correspondiente al agente
inductor que sustituye. Una vacuna antiviral,
por ejemplo, adems de inducir la produccin
de anticuerpos protectores y estimular clulas
efectoras, debe asegurar la sntesis de interfe
rn, interleuquinas y otros moduladores de la
respuesta inmune. Adems, no debe producir
efectos secundarios, debe ser accesible, de
costo aceptable, estable y de fcil administra
cin.
Vacunas obtenidas por recom binacin de
AD N han sido preparadas para diferentes agen
tes inmunolgicos. As, el gen de V. cholerae
que transcribe la informacin para la sntesis de
la subunidad (3 de la toxina colrica, ha sido
clonado e incorporado al genoma de E. coli. Lo
mismo ha ocurrido para protenas de origen vi
ral y parasitario. El ADN con informacin para
el antgeno de superficie del virus de la hepati
tis B humana (HBsAg) ha sido clonado e incor
porado al Saccharomyce.s serevisae.
El uso de poxavirus como vector para la pre
paracin de vacunas an tivirales presenta la
ventaja de su gran tamao, que permite la in
corporacin de grandes cantidades de ADN ex

367

trao y la posibilidad de obtener un inmunge

no mltiple. Adems, no es oncognico, no es
patognico para el hombre y es fcil de conser
var y administrar. Sin embargo, su utilizacin
definitiva depende todava de varios factores
que deben ser ampliam ente estudiados, entre
ellos, la efectividad de la respuesta inmune in
ducida y la seguridad de que el producto de re
combinacin no puede originar en el husped
efectos desfavorables.
Estas vacunas presentan muchas posibilida
des de futuro, entre ellas la obtencin de inm u
ngenos contra agentes como el virus del sn
drome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA),
para el que hasta estos momentos no se dispone
de inmungeno capaz de inducir respuesta es
pecfica.
Es conveniente tener en cuenta que las p ro
tenas o pptidos finalmente traducidos por el
vector no son glucosiladas, dada la inhabilidad
intrnseca de las bacterias y levaduras de glucosilar los productos expresados. En ciertos c a
sos, ello puede influir significativamente en la
inmunogenicidad del producto obtenido. A fo r
tunadamente se ha conseguido emplear clulas
de mamferos como vectores, lo que evita este
inconveniente.
Las inmunizaciones con pptidos .unt ti cas
han resultado efectivas en algunos casos. Se
conoce la secuencia de protenas antignicas y

Ciula productora
de anticuerpo Ac1
Idiotipo A

Paratope A
(anti-epitope)
idiotipo A

Paratope

M 1
tKjmy

(ariti-idiotif

Ac2

F ig. 20-1. I. R eaccin A g (X) - A cl.; II. Reaccin A cl (diotipo) - R ecepto r (Ac2) ^ sntesis de A c2 (anti-idiotipo); III.
A c2 (anti-idiotipo) interacciona con R eceptor (Acl portador dei idiotipo A) e induce ia sntesis de A c l (anti-epitope del
AgX).

368

Aspectos bsicos de la inmunidad

la correspondiente a genes que eodifican para

protenas cuya secuencia puede traducirse. M e
diante mtodos de computacin se pudo prede
cir, fundamentalmente por deduccin de la es
tructura terciaria, qu fragmentos peptdicos de
una protena pueden constituir determ inantes
antignicos, teniendo en cuenta especialmente
la hidrofilicidad de d eterm inadas regiones.
Pptidos sintticos con esas estructuras, aco
plados a soportes como seroalbm ina bovina
(SAB) o asociados a adyuvantes como el hidr
xido de aluminio, adyuvante de Freund incom
pleto, etc., han mostrado que son inductores de
la produccin de anticuerpos, con resultados
variables. En ocasiones, un mismo pptido bajo
la forma lineal o cclica ha inducido respuesta
especfica, pero generalmente con mayor afini
dad para el ltimo.
Entre los pptidos sintticos que han demos
trado ser efectivos pueden citarse, entre otros,
el pptido cclico correspondiente a la secuen
cia 139-147 del determ inante antignico a
del HBsAg; los residuos 8-20 y 50-64 de la su
bunidad P de la toxina colrica; los residuos
131-160 de la protena V P l del virus de la fie
bre aosa.
Conviene no olvidar que hay determinantes
antignicos que son topogrficos y, como ocu
rre en el caso de la lisozima, estn comprometi
dos residuos distantes unos de otros, lo que di
ficulta la posibilidad de la obtencin de un pp
tido restringido que pueda inducir una respues
ta especfica.
La activacin de clulas B y T cooperadoras
para lograr buena colaboracin, generalmente
requiere la accin de epitopes diferentes de un
mismo antgeno, no sobrepuestos. Ello ha sido
demostrado en seroalbm ina bovina y lisozi
ma. Los linfocitos B pueden reconocer epitopes
estructurales y conformacionales, y los linfoci
tos T slo epitopes estructurales.
Todos estos hechos ponen de manifiesto que,
si bien en algunos casos es posible conseguir
proteccin contra agentes agresores usando
pptidos sintticos, lamentablemente ello no es
todava la solucin en el campo de la vacuna
cin. Adems, por los mtodos de recombina
cin de ADN y de la preparacin de pptidos
sintticos, no es posible elaborar vacunas con
tra epitopes antignicos de naturaleza hidrocar
bonada.
El empleo como inmungenos contra deter
minados agentes de paratopes que reconocen el
idiotipo del sitio de combinacin que interaeciona con dichos agentes, ha sido oportuna
mente propuesto. En algunos casos, como ra
bia, hepatitis B, polio tipo II, Tripanozoma cruzi, se han elaborado vacunas de este tipo, utili
zando anticuerpos monoclonales o policlona
les. La respuesta inm une lograda es variada.

mostrando efectividad en algunos casos. El uso '

de adyuvantes asociados ha contribuido en for
ma efectiva.
La similitud en el comportamiento entre los
epitopes antignicos y los paratopes {antiidiotipos) que reconocen a los idiotipos de los sitios
de combinacin que reaccionan con el epitope
(imagen interna) se debe a que ambas reaccio
nes son similares. El epitope y el antiidiotipo,
cuando reaccionan con el idiotipo, tienen la
misma capacidad de proveer contactos simila
res a causa de los puentes de hidrgeno, fuerzas
de Van der Waals, uniones inicas y otros tipos
de uniones no covalentes que ellos originan.
Como consecuencia, tanto el epitope antignico
como el antiidiotipo, al tener capacidad para
reaccionar con el mismo idiotipo llevado por el
paratope que reconoce al antgeno (receptor an
tignico), ponen en marcha los mecanismos que
aseguran el incremento de la sntesis de ese pa
ratope o anticuerpo antiepitope. Los anticuerpos
antiidiotpicos inoculados inducen una respues
ta similar a la que podra inducir el epitope anti
gnico correspondiente (fig. 20-1), Tienen la
ventaja de que pueden sustituir al antgeno para
conferir inmunidad activa, cuando el agente in
m unizante es m arcadam ente agresor para el
husped. Adems, estas vacunas podran em
plearse con xito cuando el epitope del inmungeno es un polisacrido.
Si bien es posible elaborar inmungenos va
cunantes m ediante las estrategias descritas,
cuando ello ocurra no debe olvidarse que hay
agentes infectivos que inducen inmunidad hu
moral y otros inmunidad mediada por clulas.
Los epitopes reconocidos por los linfocitos B y
T no son los mismos, de all que es indispensa
ble saber correctam ente contra qu se quiere
proteger y cul es el mecanismo de esa protec
cin, si es que se espera lograr xito.
Un nuevo tipo de vacunas ha sido propuesta
en los ltimos tiempos: las rbosomales. Estn
constituidas por suspensiones de ribosomas ob
tenidos de bacterias rotas por diferentes proce
dimientos. A partir de los productos libres de
membranas y pared celular, se procura separar
los contaminantes proteicos y los lipopolisaeridos que acompaan a los ribosomas, utilizan
do para ello diferentes metodologas como cen
trifugacin diferencial, filtracin por geles, cro
matografa de afinidad, etc. En algunas oportu
nidades son indispensables tratamientos enzi
mticos previos para lograr los fines deseados.
La cromatografa de afinidad con anticuerpos
monoclonales dirigidos contra los contaminan
tes, especialmente los lipopolisacridos de las
bacterias gramnegativas, ha demostrado ser efi
ciente. Pequeas contaminaciones han sido re
sueltas por esta metodologa. Para algunos ti
pos particulares de microorganismos, la crom a

Inmunizacin activa y pasiva

tografa de afinidad con lectinas ha dado bue
nos resultados.
Cuando se preparan vacunas ribosomales se
recomienda que los ribosomas estn lo menos
contaminados posible, recurriendo para ello a
las metodologas descritas; no obstante, la ad
sorcin de protenas de membrana a los riboso
mas, liberadas por los procesos de ruptura bac
teriana, dificultan m uchas veces la p u rifica
cin. Hay autores que han recurrido a la formalizacin de los ribosomas para obtener produc
tos ms estables y efectivos, sobre todo porque
la integridad de los ribosom as puede verse
afectada por los procedim ientos de p urifica
cin.
Si bien los primeros estudios sobre vacunas
ribosom ales atribuan su eficacia al A RN de
doble cadena que ellos contienen, estudios pos
teriores demostraron que estaban contaminados
con componentes antignieos de la superficie
bacteriana. Esto ha hecho que todava no se ha
ya dilucidado cul es el verdadero mecanismo
por el que estas vacunas inducen inmunidad.
Hay quienes sostienen que la proteccin se de
be a las contaminaciones con antgenos de su
perficie, en tanto que otros consideran que los
ribosomas son los responsables de esa funcin,
aunque la causa de ello no se conoce. Algunos
suponen que los ribosomas slo ejerceran un
efecto potenciador de los antgenos que conta
minan las preparaciones usadas como vacunas.
Sea cual fuere el mecanismo, es conveniente
resaltar que la mxima eficiencia se consigue
con ribosomas monomricos, por lo que duran
te su procesamiento debe evitarse todo aquello
que pueda llevar a la disociacin o fragmenta
cin de los ribosomas.
Ensayos de seguridad a que deben ser
sometidas las vacunas antes de su uso
definitivo en el hombre
Las vacunas son usadas como profilcticos
para prevenir enfermedades causadas por agen
tes infecciosos y no deben producir, o deben
estar reducidos al mnimo, los efectos adver
sos. Es por ello que su aprobacin pai'a el uso
definitivo en humanos requiere que, despus de
haber cumplido las pruebas de laboratorio de
eficiencia y no toxicidad, hayan aprobado los
ensayos clnicos en el hombre, los que tienen
lugar en tres etapas o fases:
Fase 1: la vacuna administrada a voluntarios
humanos no debe inducir reacciones adversas,
y, de ser posible, debe determinarse su eficien
cias como vacunante. Estos ensayos deben ha
cerse preferentemente en lugares con condicio
nes ambientales y climticas similares a las co
rrespondientes a los lugares donde la vacuna va
a ser usada definitivamente (pases industriali

zados, pases no industrializados, zonas tropi

cales, etc.).
Fase 2: es una extensin de la fase 1, sobre
todo cuando se ha demostrado efecto p ro tec
tor, y se lleva a cabo en pequea escala en vo
luntarios, a los que se desafa con el agente in
feccioso.
Fase 3: el ensayo se hace en gran escala, ge
neralmente seleccionando comunidades que vi
ven en zonas endmicas, en los que se valora el
poder protector contra la enfermedad o las me
joras experimentales en los previamente infec
tados.
Las autoridades sanitarias slo podrn auto
rizar, para su uso en el hombre, a aquellas va
cunas que hayan cumplido satisfactoriam ente
con las 3 fases arriba establecidas.
SEROTERAPIA
La transferencia pasiva de anticuerpos puede
ser congnita y experim ental. La seroterapia
utiliza como agentes inmunizantes pasivos los
inm unosueros que contienen anticuerpos ho
mlogos o heterlogos experimentalmente ela
borados.
Antisueros especficos heterlogos
Si bien antes del advenimiento de los anti
biticos y quimioterpicos fue frecuente el em
pleo de sueros antibacterianos heterlogos, en
especial antineumoccico, antimeningoccico,
antitfico, etc., en la actualidad no se usan. Los
antisueros obtenidos por inoculacin de gran
des animales que todava se siguen usando son
los antitxicos, en especial antidiftrico, antite
tnico, antigangrenoso, antibotulnico y los es
pecficos para venenos de ofidios y arcnidos.
Su calidad ha sido m ejorada por desespeciaein enzimtica, mediante tratamiento con pep
sina, la que al liberar el fragmento Fe de la mo
lcula de inmunoglobulina permite obtener un
suero rico en F (ab)2. Este sigue funcionando
como anticuerpo neutralizante muy activo, y
carece del fragmento donde se encuentra ubica
da la mayor parte de los determinantes antignicos con especificidad de especie.
El uso de algunos de estos antisueros h a dis
minuido considerablemente, en especial el del
antidiftrico y del antitetnico, com o conse
cuencia del grado de inmunizacin activa con
tra esos agentes alcanzado por la poblacin, lo
grado con planes de vacunacin eficaces elabo
rados por las autoridades sanitarias.
Gammaglobulina humana
Se utiliza con fines teraputicos con el obje
to de conferir inmunidad pasiva contra nume

370

Aspectos bsicos de la inmunidad

rosos agentes infecciosos, en especial virales.

Se obtiene de placenta hum ana y se purifica
por tratamiento salino o alcohlico. Se conside
ra que, como consecuencia de inm unizacin
activa por enfermedad o por vacunacin ocurri
da en las madres de donde dichas placentas
provienen, la gammaglobulina resultante puede
ser efectiva.
Antisueros especficos homlogos
Se obtienen por inmunizacin activa de vo
luntarios sanos contra determ inados agentes;
toxina tetnica, B. pertussis, sarampin, pape
ras, etc. La ventaja que tienen sobre los anti
sueros heterlogos es que reducen al mnimo
las reacciones de hipersensibilidad.
Gammaglobulinas especficas
Son soluciones en riq u ecid as en fraccin
gammaglobulina y obtenidas por precipitacin
alcohlica de sueros humanos inmunes, prove
nientes de personas eficazm ente vacunadas
contra determinados virus, bacterias o sus toxi
nas. Son productos concentrados con un alto
contenido en anticuerpos. Al igual que los an
teriores, son muy efectivas cuando los meca
nismos reguladores de la agresin son los de la
inmunidad humoral.
Complicaciones de la seroterapia
Cuando se usan sueros heterlogos, las pro
tenas de la especie animal de la que provienen,
actuando como antgenos, pueden inducir res
puesta inmune con produccin de anticuerpos
de clase IgE. stos, al sensibilizar a mastocitos,
pueden desencadenar, ante nuevas inoculacio
nes de esa protena, un choque anafilctico.
Cuando se emplean estos antisueros es necesa
rio efectuar pruebas cutneas de sensibilizacin
en todas aquellas personas que hubiesen sido
inyectadas alguna vez con sueros heterlogos.
Otra complicacin es la enfermedad del sue
ro (vase cap. 32), la que se observa a los 8-10
das de la inoculacin y es debida a que los an
ticuerpos no citotrpicos originados contra la
protena heterloga, al reaccionar con el exceso
de la misma an no degradada, forman comple
jos Ag-Ac en la zona de ligero exceso de ant
geno. Estos complejos, fijadores del com ple
mento, se depositan especialmente en piel y ri
n, y son los responsables de las diferentes
manifestaciones clnicas de la enfermedad.
Los sueros homlogos y productos de ellos
derivados no dan enfermedad del suero, pero s
pueden originar reacciones de hipersensibilidad
debidas a aloantgenos. Otro de los inconve
nientes es la posibilidad de transmitir el virus

de la hepatitis B y del SIDA (Sndrome de in

munodeficiencia adquirida). Este ltimo hecho
obliga a seleccionar cuidadosamente a los hemodadores voluntarios.
Existe informacin de que se han obtenido
cepas de ratones transgnicos que sintetizan
IgG humana completa, y que cuando son esti
mulados con inmungenos inducen la form a
cin de anticuerpos localizados en dicha inmu
noglobulina. De confirmarse estos resultados
los mismos seran de valor extraordinario, ya
que las clulas de bazo de esos ratones inocula
dos con antgenos convencionales podran ser
hibridizadas y originar hibridomas sintetizadores de anticuerpos monoclonales humanos. Su
uso en teraputica humana sera fascinante, ya
que permitira seleccionar la calidad del anti
cuerpo a usar en cuanto a su afinidad y capaci
dad protectora, a la vez que se veran minimi
zados los actuales problemas de transmisin de
enfermedades infecto-contagiosas debidas a in
munizaciones pasivas.
Control de los antisueros
Los sueros inmunes homlogos y heterlo
gos y las gammaglobulinas especficas deben
ser controlados antes de su uso para establecer
su eficacia.
La actividad antitxica se determina midien
do la capacidad que tienen para neutralizar to
xinas letales de actividad conocida sobre deter
m inadas especies anim ales. Los anticuerpos
antimicrobianos se miden por aglutinacin, y
los antivirales, por inhibicin de efecto, en es
pecial sobre la capacidad aglutinante que la
mayor parte de los virus tienen sobre los hema
tes de pollo, o sobre el efecto citopatognico
que producen en fibroblastos u otras lneas ce
lulares.

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IVIecanismos citotxicos
mediados por clulas

MARTN ISTURIZ
MIRTA GIORDANO

E! conjunto de fenm enos que integran la

respuesta inmune se encuentra asociado, por ra
zones histricas, al concepto de proteccin o
defensa del individuo contra las agresiones ex
ternas causadas por diferentes m icroorganis
mos. En el presente captulo se analizarn las
caractersticas de las clulas que actan como
efectoras de los mecanismos citotxicos, as co
mo la forma en que reconocen a las diferentes
noxas y cules son sus mecanismos de ataque.
Si bien es habitual referirse a estos mecanis
mos citotxicos como pertenecientes a la inm u
nidad celular, esto no es ms que una clasifica
cin acadmica para facilitar su comprensin.
Ms adelante veremos que, muchas veces, las
clulas efectoras actan en estrecha relacin
con sustancias que corresponden al comparti
miento humoral.
G EN ERA LID A D ES
En todo sistema citotxico mediado por c
lulas existe, por un lado, una clula agresora y
por otro, una bacteria, parsito, clula infectada
por virus o una clula tumoral que es agredida
durante el proceso y que se denomina genrica
mente clula blanco (o target cell en la lite
ratura en ingls).
Hay dos condiciones necesarias, pero no su
ficientes, para que cualquier mecanismo citot
xico mediado por clulas se lleve a cabo: 1) la
viabilidad de las clulas efectoras, y 2) el con
tacto estrecho entre las clulas efectoras y las
clulas blanco. La lisis de estas ltimas es la
fase final de la reaccin citotxica.
C onceptualm ente, debe tenerse en cuenta
que los procesos citotxicos fisiolgicos ejer
cen su accin ltica en mbitos muy circuns

21
criptos y no actan por la liberacin de sustan
cias al medio, lo que podra destruir clulas o
tejidos no comprometidos con el proceso.
Cuando se aborda el anlisis de un fenmeno
de este tipo es necesario contar, en prim er lu
gar, con un mtodo apropiado para evaluar la
muerte de la clula blanco. Por ejemplo, si se
trata de una bacteria o un parsito, es posible
observar microscpicamente su destruccin o
la inhibicin de su capacidad para proliferar en
medios de cultivo adecuados luego de su con
tacto con la clula efectora. Si, en cambio, la
clula blanco es una clula tumoral o normal,
puede utilizarse el colorante azul trypan para
poner en evidencia la lisis, ya que este coloran
te tiene la particularidad de teir nicamente a
las clulas muertas. Asimismo, es posible recu
rrir a alguna caracterstica metablica particu
lar que pueda asociarse con la viabilidad de la
clula blanco utilizada en la reaccin. Por
ejemplo, si se trata de una clula secretora, me
dir su capacidad para liberar un determinado
producto de secrecin. Estos mtodos tienen la
desventaja de ser muy laboriosos y slo se uti
lizan para la evaluacin de algn sistem a en
particular. El mtodo ms difundido para el es
tudio de los mecanismos citotxicos es el de la
incorporacin de sustancias radiactivas a las
clulas blanco . La destruccin de stas per
mite que la sustancia radiactiva se libere al me
dio y pueda ser cuantificada fcilmente.
Las sustancias radiactivas deben cu m p lir
ciertos requisitos para ser utilizadas:
1) Deben incorporarse a las clulas blanco
en cantidades compatibles con sistem as
de microrreacciones.
2) No deben liberarse al medio espontnea
mente.

376

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

3) Una vez liberadas al sobrenadante, no de

ben ser reutilizables, en forma significati
va, por las clulas restantes.
4) Su liberacin al medio debe tener correla
cin directa con el efecto ltico produci
do.
Sin lugar a dudas el agente radiactivo ms
utilizado es el Na^^'CrO^C'Cr), que tiene la
ventaja adicional de poner de manifiesto rpi
damente el efecto citotxico. Para el caso de
bacterias o parsitos que no incorporan el ^Cr
o que lo liberan en forma espontnea, se usan
bases nitrogenadas radiactivas como, por ejem
plo, la ^H-timidina, que se incorporan a los ci
dos nucleicos.
Este captulo fue escrito con el objeto de
brindar al lector las caractersticas bsicas y los
aspectos conceptuales ms sobresalientes de
los mecanismos citotxicos mediados por clu
las, marcando semejanzas y diferencias entre
ellos, con la finalidad de facilitar el acceso a
publicaciones especializadas en cada uno de
los temas.
Los seis tipos de mecanismos citotxicos a
los que haremos referencia son funcionales a
nivel fisiolgico. C abe se alar que existen
otros sistemas lticos mediados por clulas que
han sido desarrollados en forma experimental
para ser utilizados como modelos en el estudio
de las funciones citotxicas. El ejem plo ms
conocido quiz sea el de la citotoxicidad indu
cida en clulas linfoides y m onocitarias por
ciertas leetinas mitognicas como la concana
v a lin a A (C on A) y la fito h e m a g lu tin in a
(PHA). Estos sistemas artificiales no sern des
critos.
CITOTOXICIDAD MEDIADA
POR LINFOCITOS T
En el ao 1960, A. Govaerts inform que los
linfocitos del conducto torcico de un perro,
que haba rechazado un trasplante renal aloge
neico, eran capaces de lisar clulas epiteliales
de rin provenientes del perro dador del rga
no. Este experimento fue una de las primeras
demostraciones directas de que los linfocitos
pueden actuar como clulas citotxicas.
Una dcada despus, Hayry y Defend, culti
vando linfocitos normales junto con clulas tu
morales, consiguieron obtener linfocitos citot
xicos especficos para las clulas tumorales. El
hecho de haber podido reproducir el fenmeno
totalmente in vitro permiti la realizacin, de
all en ms, de un estudio detallado del sistema,
ya que pudieron hacerse ensayos en condicio
nes experimentales bien definidas.
Los m ecanism os citotxicos mediados por

linfocitos T son de gran importancia para la de

fensa del individuo contra las infecciones cau
sadas por virus, y ocasionalmente contra algu
nos parsitos intracelulares. Tienen participa
cin, adems, en el rechazo de los trasplantes y
de ciertos tumores.
Caractersticas de las clulas efectoras
Las clulas efectoras pertenecen a una sub
poblacin de linfocitos T, denominados linfoci
tos T citotxicos, y que generalmente expresan
en su membrana el antgeno CD8.
Para que la citotoxicidad mediada por linfo
citos T se lleve a cabo es necesario que las c
lulas efectoras hayan sido previamente sensibi
lizadas contra un antgeno determinado, ya sea
en el curso de una infeccin natural, o experi
mentalmente por su inoculacin. Es as que los
linfocitos T reconocern sobre la membrana de
la clula blanco, nicamente el antgeno con
tra el cual fueron sensibilizados, lo que implica
que la citotoxicidad T es un mecanismo espec
fico.
Mecanismos de generacin de linfocitos T
citotxicos
Tomemos como ejemplo una infeccin viral.
Al invadir un organismo los virus son capaces
de penetrar activamente en las clulas permisi
vas y reproducirse en ellas. Durante el proceso
de multiplicacin, muchas protenas virales, o
ms bien pequeos pptidos de entre 8 y 11
aminocidos, son expresados en la membrana
de la clula infectada, asociados a molculas de
clase I del complejo mayor de histocompatibi
lidad (CMH). Esta asociacin entre protenas
virales y molculas de clase I posibilita el reco
nocimiento del antgeno por parte de una sub
poblacin de linfocitos T CD8+, conocidos co
mnmente como linfocitos T citotxicos. For
lo tanto, es importante recordar que, a diferen
cia de lo que ocurre con el receptor antignico
de los linfocitos B, el receptor (TCR, del in
gls: T cell receptor) de los linfocitos T CD8+
no reconoce al antgeno en su forma nativa, si
no nicamente al complejo formado por el ant
geno y las molculas de clase I del CMH (fig.
21-la).
Las molculas de clase I estn expresadas en
forma constitutiva en casi todas las clulas del
organismo. Aparentemente la unin entre el re
ceptor antignico del linfocito T y el conjunto
antgeno-molcula de clase I no tiene la sufi
ciente afinidad como para desencadenar el pro
ceso ltico por parte de la clula T CD8+. Para
ello son necesarias las molculas de adhesin,
que interactan entre clulas efectoras y clulas
blanco y que perm iten iniciar el fenmeno

377

Mecanismos citotxicos mediados p o r clulas

CPA

F ig. 21-1. R econocim iento del antgeno por p arte de los linfocitos T: a) T citotxicos; b) T colaboradores.

citotxico. Las molculas CDS presentes en los

linfocitos T tienen la particularidad de unirse a
la porcin no polimrfica de las molculas de
clase I en las clulas blanco, lo que significa
que las CDS actan como molculas de adhe
sin en estos sistemas, y permite explicar por
qu los linfocitos T CD8+, y no otros, son los
que intervienen en estos procesos restringidos
por molculas de clase I (fig. 21-1 a).
En un individuo no sensibilizado, son muy
pocos los clones de linfocitos T CD8+ capaces
de reconocer las protenas especficas de un vi
rus determinado y, por ende, son insuficientes
para detener el curso de una infeccin. La am
plificacin del sistema citotxico especfico es,
por consiguiente, una condicin imprescindible
para que se lleve a cabo la total eliminacin de
las clulas infectadas. Este proceso de amplifi
cacin depende de linfocitos T CD4+ y es deta
llado a continuacin.
En el curso de una infeccin viral se liberan
al medio extracelular una serie de virus infecti
vos, virus defectivos y protenas virales, que
van a ser captados por clulas del sistema mo
nonuclear fagoctico y otras, como los linfoci
tos B y las clulas dendrticas, conocidas gen
ricamente como clulas presentadoras de ant
genos (CPA). Las CPA expresan constitutiva
mente molculas de clase II del CMH, y son
capaces de captar antgenos por fagocitosis o
endocitosis, degradarlos parcialmente y expre
sarlos en su membrana asociados a las m olcu
las de clase II. Es justam ente esta asociacin
entre determinante antignico y molculas de
clase II la que es reconocida por los receptores
antignicos de una subpoblacin linfocitaria T
CD4+ conocidos genricamente como linfocitos

T colaboradores (helper). En forma anloga a

la d escrita para los linfocitos T CDS"^, esta
unin no tiene la afinidad suficiente para que la
clula prolifere y son necesarias las molculas
de adhesin para que ello ocurra; entre ellas, las
molculas de CD4, que se unen a la porcin no
polimrfica de las molculas de clase II de las
CPA. Hay otras uniones entre molculas de ad
hesin que son necesarias para obtener una acti
vacin satisfactoria de las clulas T. De particu
lar importancia para iniciar la proliferacin pa
rece ser la unin entre la protena B7 en las
CPA y la CD28 en la clula T (fig. 21-lb).
Cuando los linfocitos CD4+ reconocen al an
tgeno expresado con las molculas de clase II
en las CPA hay tres eventos (no son los nicos)
fundamentales que se producen casi simultnea
mente a la interaccin entre el receptor T y el
antgeno; 1) secrecin de la interleu q u in a 1
(IL-1) por parte de las CPA, 2) induccin de la
expresin de receptores para interleuquina 2
(IL-2) en los linfocitos CD4+ y 3) secrecin de
IL-2 por parte de las clulas CD4^.
La IL-2 actia como el mitgeno natural de
las clulas CD4-h, por lo tanto, estos linfocitos
proliferan a travs de un mecanismo autocrino,
ya que fabricaron los receptores para prolife
rar (receptores para IL-2) y el agente que indu
ce la proliferacin (IL-2). De esta m anera se
produce una expansin elonal de linfocitos T
CD4+ restringida, por supuesto, a las clulas
CD4+ que fueron capaces de reconocer al ant
geno originalmente (fig. 21-2).
En cuanto a los linfocitos citotxicos, que
son casi exclusivamente CD8+, tambin sufren
un proceso de amplificacin despus de reco
nocer al antgeno en asociacin con las mol

378

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

IL-1

/A
Lisis

F ig. 21-2. R epresentacin de la expansin clonal de los Im tocitos T citotxicos.

culas de clase I del CMH sobre la clula infec

tada. Si bien esta interaccin induce la expre
sin de receptores para IL-2 en la membrana de
los linfocitos citotxicos, stos son incapaces
de sintetizar IL-2. Por lo tanto, para expandirse
necesitan de la IL-2 producida por las clulas
CD4+ (fig. 21-2). De aqu se puede deducir la
gran importancia que tienen las clulas CD4+
en el proceso de generacin de las clulas cito
txicas. En efecto, en ausencia de ellas prcti
camente no hay desarrollo de mecanismos citotxicos mediados por clulas T. Ms an, tam
poco hay produccin de anticuerpos.
Finalm ente cabe sealar que las clulas T
CD4+ esquematizadas en la figura 21-2 com
prenden, en realidad, dos poblaciones bien de
finidas fenotpica y funcionalmente en el ratn
y, por lo menos, funcionalmente en el hombre.
Estas clulas denominadas T H l y TH2 (TH, de
T helper) tienen un patrn muy amplio y de
finido de secrecin de interleuquinas que inter
vienen en los distintos pasos de activacin, ex
pansin, y maduracin de los linfocitos T CD4+
y CD8+. Hoy es conocido que las clulas THI
son las responsables de la secrecin de IL-2,
interfern gamma, factor de necrosis tumoral
(TNF) e IL-12; mientras que las TH2 son las
clulas encargadas de la secrecin de IL-4, IL5, IL-t e IL-10 luego del reconocim iento del
antgeno.
C IT O T O X IC ID A D N ATURA L K IL L E R
El sistema inmune de todos los vertebrados
presenta subpoblaciones linfocitarias que tie
nen la capacidad innata de lisar cierto tipo de
clulas tumorales y de clulas infectadas por
virus. Este fenmeno citotxico, descrito alre
dedor del ao 1970, se conoce como citotoxici

dad natural killer o actividad NK. A diferen

cia de lo que ocurre con la citotoxicidad T, p a
ra que se lleve a cabo no es necesario que haya
habido sensibilizacin previa de las clulas
efectoras; ms an, la actividad NK no se ve
influida por la exposicin previa al antgeno.
El hecho de que la actividad NK se ejerciera
in vitro contra clulas tumorales sin afectar a
las clulas normales despert una gran expecta
tiva entre los inmunlogos clnicos. Sin embar
go, a pesar de numerosos experimentos realiza
dos no ha sido posible demostrar que las clu
las NK tengan un papel relevante en la preven
cin del desarrollo tumoral. Por ejemplo, la ci
totoxicidad NK mediada por los linfocitos peri
fricos de pacientes con cncer no se ve dismi
nuida hasta que no se alcanza un deterioro im
portante en la condicin general del individuo.
Asimismo, no se ha encontrado potenciacin
de la actividad NK en aquellos pacientes que
responden positivam ente a la inm unoterapia.
No obstante, algunos autores han argumentado
que el control del crecimiento tumoral por par
te de las clulas NK se dara en una etapa tem
prana de la transformacin maligna; siendo los
tumores que se expresan clnicamente resisten
tes a la lisis por esta va.
Caractersticas de las clulas efectoras
Las clulas NK constituyen una subpobla
cin con variaciones morfolgicas respecto de
los linfocitos tpicos que comprende entre el 10
y el 20% de los linfocitos perifricos humanos.
Se conocen como linfocitos de grnulos gran
des (LGL = large granular lymphocytes, del in
gls), en alusin a la presencia de gran cantidad
de grnulos eosinfilos en su citoplasma
En cuanto a su fenotipo, las clulas NK se
definen como linfocitos maduros CD2^, que no

379

Mecanismos citotxicos mediados p o r cluias

expresan inmunoglobulinas de superficie ni el
complejo CD3-TcR que corresponde al recep
tor antignico de linfocitos T. Por lo tanto, son
una subpoblacin diferente de las clulas T ci
totxicas. Adems, ciertas clulas NK presen
tan marcadores de monocitos/macrfagos co
mo los antgenos M I y M A C l, mientras que
otras no expresan marcadores de linfocitos T,
B o monocitos. Estas ltimas se conocen como
clulas nulas o linfocitos K y, tal como se ver
ms adelante, tambin son efectoras de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.
Esta gran heterogeneidad fenotpica de las c
lulas efectoras indica que la actividad NK no
est restringida a un determinado tipo celular
sino que, por el contrario, es una funcin cito
txica capaz de ser mediada por clulas de di
ferente linaje.
Merece destacarse el hecho de que todas las
clulas NK expresan receptores para el frag
mento Fe de la IgG, relacionado con el antge
no G D I6, no obstante lo cual este receptor no
est involucrado en la induccin de la lisis, ni
es privativo de ellas. La molcula de CD56 es
el marcador ms caracterstico de las clulas
NK maduras, y el CD57 de las inmaduras.
El proceso citotxico se inicia con la unin
entre la clula efectora y la clula blanco . Es
to supone la existencia de receptores en las c
lulas NK, capaces de reconocer ciertas estruc
turas expresadas sobre la clula blanco . H as
ta el ao 1994 no haban podido caracterizarse
el o los receptores responsables del reconoci
miento de la clula blanco por paite de la c
lula NK. En poco tiempo, sin embargo, se clo
naron e identificaron ms de 10 molculas que
estn presentes en subpoblaciones de clulas
NK y que, cuando interactan con el ligando
correspondiente sobre la clula blanco , son
capaces de inducir seales estimulatorias o in
hibitorias de la lisis. Un subgrupo de estos re
ceptores pertenece a 1a familia de leetinas de ti
po C, que unen oligosacridos presentes en
muchos tipos distintos de glucoprotens y glu
colpidos (fig. 21-3).
Evidencias recientes indican que las clulas
NK son capaces, adems, de reconocer antge
nos de clase I del com plejo mayor de h isto
compatibilidad. Este reconocimiento es necesa
rio para evitar que, una vez producida la unin
entre clulas efectora y blanco, se ponga en
marcha la maquinaria ltica. Es decir que, cuan
do los antgenos de clase I estn ausentes de la
m em brana de una clula m utada o han sido
modificados por un pptido viral (fig. 21-3), la
clula NK se activa para eliminar las clulas
tumorales o infectadas por un virus.
La capacidad ltica de las clulas NK est re
gulada por distintas linfoquinas. Por ejemplo,
se ha visto que los interferones, en especial el

Clula normal

Clula NK

No-lisis

Clula mutada

Clula Infectada
por un virus

F ig. 21-3. M odelo de reconocim iento y activacin d e las

clulas natural killer .

interfern y, aumentan la actividad NK, tal co

mo lo hacen con la citotoxicidad T. Por su par
te, la IL-2 que, como se mencion anteriormen
te, juega un papel fundamental en la prolifera
cin y diferenciacin de los linfocitos T citot
xicos, incrementa la actividad NK.
Por ltimo sealaremos que la actividad NK
en elulas humanas se evala comnmente uti
lizando como blanco la lnea celular derivada
de una eritroleucemia humana, K562, m uy sen
sible a su actividad. En ratones se utiliza la l
nea celular YAC-1 que deriva de una leucemia
murina inducida por el virus de Maloney.

380

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

CITOTOXICIDAD CELULAR INDUCIDA

POR INTERLEUQUINA 2
En los ltimos aos se ha demostrado que el
tratamiento in vitro de linfocitos perifricos
humanos con IL-2, adems de favorecer la ci
totoxicidad T y NK, induce una actividad citoltica adicional a la manifestada por las clulas
NK. Estos linfocitos susceptibles a la IL-2 pa
recen pertenecer al linaje de los NK aunque es
evidente que presentan caractersticas fenotpi
cas diferentes entre ellos, quizs por su diferen
te estado de activacin, por lo que es imposible
considerarlos como un tipo celular definido. A
estas clulas capaces de ser activadas por IL-2
se las conoce con el nombre de clulas LAK
(de lym phokine activated killer cells). Las
clulas LAK son capaces de lisar una gran va
riedad de clulas tum orales, incluso muchas
que no son sensibles a las clulas NK. En expe
riencias clnicas que se estn llevando a cabo,
las clulas LAK han demostrado ser efectivas
en los tratamientos de melanomas, linfomas, y
en metstasis renales llevados a cabo en pa
cientes term inales. A ctualm ente, aunque en
forma parcial o limitada, las clulas LAK cons
tituyen una herramienta potencial para la inmu
noterapia del cncer.
CITOTOXICIDAD CELULAR
DEPENDIENTE DE ANTICUERPOS
En el ao 1965, E. Moller describi un fen
meno citotxico por el cual los esplenocitos de

ratones normales no sensibilizados previamen

te con antgenos eran capaces de lisar clulas
tumorales reeubiertas con anticuerpos especfi
cos. El proceso citotxico, que no involucraba
la participacin del sistema del complemento,
mostr su eficiencia contra un amplio panel de
clulas blanco . A este sistema ltico, esen
cialmente extracelular, se lo denomin citoto
x icidad celular d ependiente de anticuerpos
(ADCC); esta sigla, proveniente del ingls an
tibody dependent cell mediated cytotoxicity,
es la utilizada en la literatura cientfica para
describir a este mecanismo. Recientemente se
ha demostrado que esta funcin est compro
metida en procesos de inmunidad contra tumo
res, en el rechazo de trasplantes, as como tam
bin en la destruccin de bacterias, parsitos, y
clulas infectadas por virus.
La reaccin citotxica se inicia con el reco
nocimiento, por parte de la clula efectora, de
los anticuerpos que recubren a la clula blan
co, a travs de los receptores para el fragmen
to Ec de las Ig (REc) expresados en la membra
na (fig. 21-4). En la mayor parte de los casos,
el anticuerpo que participa en la ADCC es de la
clase IgG y, por consiguiente, los receptores
celulares de las clulas efectoras intervinientes
son los REc de IgG. Sin embargo, ciertos linfo
citos T con RFc de IgA y los polimorfonuclea
res neutrfilos son capaces de mediar la ADCC
contra clulas blanco sensibilizadas con IgA.
Asimismo, los monocitos y los polim orfonu
cleares eosinfilos que expresan RFc de IgE in
ducen la destruccin de clulas recubiertas con
IgE. Este sistema parece ser muy importante en

Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos

Lisis

Clula efectora
(linfocito K, Ty, B,
monocito, PMN, macrfago)

Clula blanco

F ig . 21-4. E squem a representativo del reconocim iento entre la clula efectora y la clula blanco en la citotoxicidad c e
lular dependiente de anticuerpos.

Mecanismos citotxicos mediados por clulas

la inmunidad contra parsitos. En cuanto a la
capacidad de los anticuerpos IgM para iniciar
una reaccin de ADCC, no se encuentra total
mente definida. No obstante, est aceptado que
la IgM puede potenciar la ADCC inducida por
anticuerpos de la clase IgG.
Una caracterstica de la ADCC es que la c
lula efectora no presenta restricciones en cuan
to a antgenos de histocom patibilidad. Por lo
tanto, resulta operativa contra clulas blanco
isogeneicas, alogeneicas y xenogeneicas.
A sim ism o m erece destacarse que la ADC
desarrolla su actividad mxima a concentracio
nes muy bajas de anticuerpos. Por ejemplo, se
ha comprobado que para producir la destruc
cin de la clula blanco por ADCC es sufi
ciente una concentracin de anticuerpos sensi
bilizantes de 100 a 1.000 veces menor que la
necesaria para inducir la lisis por el sistema de
complemento.
Mediante estudios cinticos fue posible de
mostrar que el efecto ltico inducido por la c
lula efectora de ADCC es sumamente rpido.
As, a los 5 minutos de producido l contacto
con la clula blanco se observan los primeros
signos de dao que se manifiestan por un au
mento de la fragilidad osmtica, seguida por la
liberacin de los componentes intracelulares.
Esto, sumado al hecho de que los anticuerpos
sensibilizantes pueden ser reutilizados en otro
ciclo citoltico hace de la ADCC el proceso ci
totxico conocido ms eficaz en presencia de
anticuerpos.
An no se ha podido establecer cules son
las especies moleculares responsables del dao
celular. En cambio, queda claro que no se pro
duce la liberacin al medio de sustancias citolticas. Es ms, si las clulas efectoras son en
frentadas simultneamente con clulas blan
co sensibilizadas y no sensibilizadas, slo se
rn destruidas las primeras, lo que confirma el
papel fundamental que desempean los RFc en
la ADCC. Algunos autores, empleando mono
citos como clulas efectoras, han sugerido la
participacin de mecanismos dependientes del
oxgeno en la lisis de la clula blanco . Sin
embargo, hasta el presente no se ha podido de
term inar con precisin si los interm ediarios
reactivos del oxgeno, al igual que las enzimas
lisosom ales, estn involucradas en la A DCC
mediada por otros tipos celulares.
Caractersticas de las clulas efectoras
Las clulas efectoras mejor estudiadas han si
do los linfocitos denominados killer (linfoci
tos K), que se distinguen por no presentar m ar
cadores propios de clulas T o B. No obstante,
son muchos otros los tipos celulares que pueden
mediar la ADCC. Entre ellos, podemos nom

381

brar a los monocitos, los macrfagos y los p oli

morfonucleares neutrfilos y eosinfilos, as co
mo tambin a los linfocitos B y algunas subpo
blaciones de linfocitos T CD16+. La caracters
tica comn que permite agrupar a todas estas
clulas efectoras es la de que expresan sobre su
membrana RFc, no como simples marcadores
fenotpicos, sino como unidades de reconoci
miento e induccin de su actividad citotxica.
Mecanismos lticos
Los mecanismos lticos de los linfocitos T
sensibilizados, de las clulas NK y LAK, as
como de las diferentes poblaciones efectoras de
la ADCC no han sido hasta el momento total
mente clarificados. Se sabe que ninguna de es
tas clulas citolticas libera sustancias txicas
al medio que puedan afectar a otras clulas no
com prom etidas en el evento citotxico. P o r
otra parte, se ha comprobado que los inhibido
res de la sntesis de protenas o de cidos nu
cleicos no afectan el desarrollo del fenm eno
citotxico propiamente dicho, por lo que se in
fiere que el mecanismo ltico se encuentra preformado.
Sin embargo, en los ltimos aos ha habido
un avance notorio en el esclarecimiento de los
mecanismos citotxicos que, aunque lejano de
una comprensin total de los sistemas, perm ite
ir armando el rompecabezas en un rea que ha
sido particularm ente elusiva durante m uchos
aos. La mayora de estos estudios fueron lle
vados a cabo en ios linfocitos T CD8* y en las
clulas NK. Algunos autores, con alguna ev i
dencia experimental, han extrapolado estos da
tos al m ecanism o de la ADCC y las clulas
LAK.
Se ha demostrado que el efecto ltico se rea
liza solamente en el espacio confinado al rea
de contacto entre la clula efectora y la clula
blanco en donde se libera por exocitosis de la
clula efectora una familia de protenas conoci
das genricamente como perforinas (fig. 215). Estas protenas se hallan localizadas en los
grnulos de las clulas T y NK. Dichos grnu
los aislados muestran una actividad citoltica
rpida y potente, que depende de la presencia
de Ca'^'^. Los anticuerpos preparados co n tra
ellos neutralizan la citotoxicidad m ediada no
slo por los grnulos aislados, sino tambin por
las clulas T y NK. El anlisis de la formacin
de las lesiones revela que stas se producen por
la polimerizacin de precursores monomricos
localizados en los grnulos, generndose un ti
po de lesin (formacin de poros) semejante a
la provocada por el sistema complemento.
La descripcin del mecanismo de ruptura ce
lular por medio de las perforinas planteaba la
p arad o ja de que slo las clulas b la n c o

382

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

F ig . 21-5. Representacin e s
q uem tica de la lisis por p e r
forinas.

Clula citotxica

Protectina

^'C'Vfvr(vr,

I?

p |?

? P e rfo rin a

tttT )

1.1w.*-'

Clula blanco

eran lisadas, siendo que, como se dijo anterior

m ente, las perforinas eran liberadas en microambientes formados por las mernbranas de
las clulas efectora y blanco. Con posteriori
dad se comprob que las clulas citotxicas tie
nen en su membrana una protena, denominada
protectina , que es capaz de n eu tralizar el
efecto de las perforinas.
Los grnulos citoplasmticos de las clulas
NK fueron estudiados en form a com parativa
con los obtenidos de las clulas T citotxicas,
demostrndose que tienen propiedades biolgi
cas y bioqumicas iguales. El hecho de que los
grnulos aislados de ambos tipos de clulas
efectoras sean citotxicos contra todas las clu
las blanco estudiadas indica que la diferencia
bsica entre los dos sistemas ocurre a nivel del
reconocimiento de la clula agredida.
El tipo de lesin que producen las perforinas
permite la entrada a la clula de otro tipo de
protenas, las granzimas, proteasas que pene
tran a la clula blanco porque estn asocia
dos a los mismos proteoglicanos que las perfo
rinas. Las granzimas tam bin pueden acceder
al interior de la clula blanco por medio de
procesos endocticos que stas llevan a cabo
con el objeto de reparar la membrana celular.
L a absorcin de granzim as, prin cip alm en te
granzima B, inicia una cadena de eventos que
culmina en la apoptosis de la clula blanco.
M ediante experimentos de ablacin gnica
que perm itieron generar anim ales deficientes
de perforinas fue posible demostrar categrica
mente la importancia de estas protenas en los
eventos lticos. De hecho, estos animales son
incapaces de liberarse de los virus que los in

fectan mientras que todas las otras funciones

inmunes mediadas, sobre todo por linfocitos T,
son normales.
Se ha propuesto otro mecanismo ltico, dife
rente del de las perforinas y granzimas, que re
cibe el nombre de apoptosis o muerte celular
programada. En este proceso participan, por un
lado, una protena conocida con el nombre de
Fas que se encuentra expresada sobre la super
ficie de las elulas blanco y, por otro, un li
gando especfico presente en la membrana de
las clulas efectoras denom inado Fasligand.
Cuando se produce la unin entre clulas efec
toras y clulas blanco, hay reconocimiento e
interaccin de ambas protenas. Debido a que
la porcin intracitoplasm tica de la protena
Fas tiene un dominio letal, esta interaccin
conduce a la apoptosis, con el consiguiente cli
vaje del ADN de la clula blanco y, obvia
mente, su destruccin. Futuros estudios defini
rn si este mecanismo, que est bastante bien
definido, es funcional o no en los sistemas citotxicos.
A nivel conceptual, es im portante tener en
cuenta que la coexistencia de varios mecanis
mos lticos hace casi imposible que un agente
infeccioso escape a la destruccin por parte de
las clulas efectoras.
F A G O C ITO SIS
La fagocitosis, descrita por Metehnikoff en
el siglo pasado, es uno de los mecanismos de
defensa que aparece ms tempranamente en la
escala filogentica. Consiste en la ingestin de

Mecanismos citotxicos mediados p o r clulas

partculas extraas al organisnio (bacterias, pa
rsitos, clulas muertas) por ls clulas fagoc
ticas (m onocitos, m acrfagos, polim orfonu
cleares) y en su posterior degradacin intrace
lular.
No todos los microorganismos son suscepti
bles de ser fagocitados. Aparentemente, duran
te el curso de la evolucin, muchos de ellos
han adquirido ciertas cara c te rstic a s en su
membrana que les permiten eludir el reconoci
miento y, por lo tanto, la ingestin por parte de
los fagocitos. Para contrarrestar este sistema de
evasin, los vertebrados, a lo largo de su cam i
no evolutivo, han desarrollado la propiedad de
sintetizar algunos factores sricos que son ca
paces de unirse a los microorganismos y de esa
manera facilitar su ingestin. Estos factores,
genricam ente conocidos con el nombre de
opsoninas , estn constituidos principalmente
por los anticuerpos y algunas protenas del sis
tema Complemento (fig. 21-6). Los anticuerpos
ms relevantes que funcionan como opsoninas
pertenecen a las clases IgM e IgG; mientras
que los productos activos que provienen del
clivaje del componente C3 (C3b, C3bi, C3dg
entre otros) son las ms importantes opsoninas
aportadas por el sistema del complemento. El
reconocim iento de estas m olculas que recu
bren la clula blanco de la fagocitosis ocurre
a travs de distintos receptores especficos ex
presados por las clulas efectoras, y que recoFAGOCITOSIS

383

nocen a los fragmentos Ec de las IgG com o a

los diferentes productos de clivaje del com po
nente C3. Se ha demostrado que la interaccin
entre la porcin Fe de las IgG que sensibilizan
a la clula blanco es capaz de prom over la
adhesin y la ingestin por macrfagos a travs
de los receptores para el fragmento Fe de las
IgG presentes en estas clulas, mientras que la
interaccin a travs de los receptores para el
fragmento C3b, y otros, promueve usualmente
slo la adhesin. No obstante, como las clulas
fagocticas tienen los dos tipos de receptores en
sus membranas, generalmente estos acttian en
forma cooperativa (fig. 21-7). As, se ha visto
que la cantidad de anticuerpos IgG necesarios
para inducir la ingestin de un microorganismo
se reduce alrededor de 100 veces si ste, ade
ms, est recubierto por C3b.
Caractersticas de las clulas efectoras
T an to los fag o cito s m o n o n u cleares, q u e
comprenden a los monocitos y a los inacrfagos, com o los leucocitos polim orfonucleares,
estn involucrados en la actividad fagoctica.
Los polimorfonucleares constituyen una b a
rrera fundamental frente a una infeccin b acte
riana, ya que son los primeros en arribar al fo
co infeccioso atrados por la liberacin in situ de diferentes sustancias quimiotcticas. Por
su parte, los fagocitos mononuclares no slo
participan en funciones inmunolgicas de d e
fensa, sino que adems cumplen un papel rele
vante en la depuracin de complejos inmunes,
restos celulares, etc. Los monocitos son clulas
de la circulacin que normalmente se extrava
san y se diferencian en los distintos tejid o s
dando lugar a poblaciones relativamente esta
bles en el hgado (clulas de Kupffer), pulmn
(macrfagos alveolares), bazo (macrfagos esplnicos) y tejido conectivo (histiocitos). L a
transicin de monocito a macrfago im porta
una serie de cambios morfolgicos y bioqumi
cos como el aumento en el tamao celular, en
el ntimero y complejidad de las organelas y en
el contenido de enzimas lisosomales.
Mecanismos lticos en la fagocitosis

F ig . 21-6. R econocim iento o ingestin p o r parte de la clula

fagoctica.

Una vez que la clula blanco se ha adheri

do al fagocito se inicia el proceso de ingestin
mediante la extensin de sendpodos que la ro
dean y finalmente se fusionan formando la v e
scula fago 9 tica o fagosom a primario (vase
fig. 21-6). ste, posteriormente se fusiona con
los lisosomas dando lugar al fagolisosoma, en
cuyo interior la clula blanco queda expuesta
a un conjunto de sistem as m icrobicidas que
pueden ser dependientes, o no, del oxgeno. Es
importante sealar que, en ocasiones, estos sis

F ig. 21-7. Proceso de opvsonizacin de microom anism os.

temas microbicidas actan en forma extracelu

lar. Por ejemplo, cuando la fagocitosis se ve
im posibilitada por el tam ao excesivam ente
grande de una partcula, la interaccin del fa
gocito con un estmulo desencadenante adecua
do induce la liberacin de las especies txicas
al medio extracelular. Otro tanto ocurre cuando
los fagocitos son gatillados por estmulos so
lubles, como los pptidos quimiotcticos o los
complejos inmunes. Mecanismos de este tipo
son los responsables del dao tisular que se ob
serva en las reacciones inflamatorias.
Sistemas microbicidas independientes
del oxgeno
Este sistema est constituido por una serie de
componentes presentes en los lisosom as que
pueden actuar intracelularmente, localizando su
accionar en los fagolisosomas, o extracelularmente por efecto de estmulos que induzcan su
liberacin.
Entre ellos cabe sealar a las protenas cati
nicas conocidas como fagocitina y leucina,
que atacan las membranas microbianas. Tam
bin, la lactoferrina, que fija y retiene el hierro
privando as a las bacterias de l. Asimismo, la
lisozima, que ataca a los mucopptidos de la
pared celular bacteriana. Por ltimo, existe una
amplia variedad de enzimas hidrolticas, capa
ces de degradar lpidos, polisacridos y prote
nas, que cumple un papel fundam ental en la
destruccin de los microorganismos en el m
bito del fagolisosoma.
Sistemas microbicidas dependientes
del oxgeno
Durante el proceso fagoctico se produce un
marcado cambio en el manejo del oxgeno por

parte de las clulas efectoras. As, la cantidad

de oxgeno consum ido puede llegar a in cre
mentarse en 50 veces respecto de los valores
normales. Por otra parte, se produce la metabo
lizacin de grandes cantidades de glucosa por
la va de las hexosas monofosfato, con la consi
guiente produccin de NADPH. Debido al no
table aumento en el consumo de oxgeno a este
fenmeno se lo conoce con el nombre de esta
llido respiratorio. Sin embargo, a pesar de la
denominacin, ste consumo de oxgeno no es
utilizado con fines energticos por las clulas
fagocticas. Ms bien el propsito de este siste
ma es utilizar grandes cantidades de oxgeno
molecular para producir sustancias txicas de
rivadas del oxgeno como el anin superxido,
perxido de hidrgeno, radicales hidroxilo,
oxgeno singlete, hipocloritos, cloraminas, etc.,
que se conocen genricamente con el nombre
de intermediarios reactivos de oxgeno o espe
cies reactivas del oxgeno.
La produccin de todas estas especies reacti
vas del oxgeno comienza con la activacin de
la clula fagoctica por un estmulo apropiado
como puede ser, por ejemplo, una clula blan
co sensibilizada. Lo primero que ocurre es la
activacin de una enzima denominada NADPHoxidasa. Esta enzima est constituida por subu
nidades que se encuentran en la membrana ce
lular y en el citosol. El proceso de activacin
enzimtica involucra la participacin de prote
nas G en la transduccin de seales, moviliza
cin de calcio y fosforilaciones, que finalmente
conducen al ensamble de las distintas subunida
des de la enzima en la superficie celular.
De esta manera, y utilizando el NADPH co
mo cofactor, es como - a travs del oxgeno
molecular como sustrato-, la NADPH-oxidasa
genera la primera especie reactiva del oxgeno,
el anin superxido (O^) segn:

Mecanismos citotxicos mediados p o r clulas

NADPH + 2 0 ,

2 O 2 ' + NADP+ + H+

El O f puede generar por dismutacin per

xido de hidrgeno (H 2 O 2 ), ya sea en forma es
pontnea o a travs de la enzim a superxido
dismutasa (SOD):
2 O^- + 2H+

O,

Existen diferentes mecanismos fisiolgicos a

travs de los cuales la potencialidad microbicida del li^O^ puede ser incrementada de manera
significativa. Uno de ellos involucra la accin
de las peroxidasas, en particular la mielopero
xidasa (MPO), que se halla presente en altas
concentraciones en monocitos y en polimorfo
nucleares neutrfilos. La MPO cataliza la oxi
dacin y halogenacin de diferentes estructuras
presentes en los microorganismos, por medio
del HjO^ y los haluros (X). Los compuestos
responsables de ejercer la accin txica seran
los hipohalitos (XO), formados segn:
X + H ,0 ,

XO- + H p

La potencia microbicida de los hipohalitos

resulta, en la mayor parte de los casos, notable
mente superior a la del HjOj. As, en distintos
sistemas desarrollados in vitro se ha encon
trado que la concentracin de H^O^ necesaria
para ejercer una accin microbicida determina
da se reduce en aproximadamente 100 veces,
por la adicin de MPO y haluros.
La interaccin entre X 0 y HjOj es capaz de
producir otra especie agresiva como el oxgeno
singlete ('O^),
CIO- + H ,0 ,

c r -h H p + 'O 2

Por otra parte el O 2 - puede generar especies

aun ms agresivas, como los radicales hidroxilo
(H O ) a travs de una serie de reacciones, en las
que participa el hierro como cofactor, y que en
conjunto se denomina reaccin de Haber-Weiss
O-

H ,0 ,

^ O, + HO- + OH-

La relevancia fisiolgica de los sistemas mi

crobicidas dependientes del oxgeno ha sido

385

ampliam ente certificada por numerosos estu

dios. En tal sentido cabe sealar que los indivi
duos que padecen la enfermedad granulomato
sa crnica (ECG), cuya caracterstica principal
es la aparicin de infecciones graves y recu
rrentes, poseen leucocitos incapaces de inducir
el estallido respiratorio. El defecto gentico de
estos enfermos se localiza en alguna de las su
bunidades de la NADPH-oxidasa, de tal m ane
ra que la enzima no se puede ensam blar adecuadainente. Estos enfermos tienen intactos to
dos los otros, mecanismos humorales y celula
res de defensa, pero dan negativa la reduccin
del nitro blue tetrazolium, una prueba clsica
de la determinacin de productos del estallido
respiratorio.
PARTE EXPERIMENTAL
Los mtodos usados para medicin de citoto xicidad celular dependiente de anticuerpo
(CC D A ), citotoxicidad NK, citoto x icid ad T
alogeneica y fagocitosis se describen en el ca
ptulo 36.

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Complemento

RICARDO MARGNI

El sistem a com plem ento es un com plejo

proteico polimolecular, constituido por varias
sustancias, algunas precedidas de precursores,
que se encuentran en el plasm a sanguneo de
los vertebrados y que desem pean un papel
importante en distintos tipos de reacciones in
munolgicas. Se lo identifica con C. Dar una
definicin correcta de l resulta difcil, ya que
cuando ese complejo se fija sobre un sistema
antgeno-anticuerpo y el determinante antig
nico est ubicado en una clula, su efecto es
citocida; en otros tipos de reacciones su accin
es diferente. En las reacciones de inmunohemlisis intervienen todos los factores constitu
tivos del complemento hasta ahora descriptos,
cosa que no es indispensable en otros tipos
de reacciones en las que el complemento parti
cipa.
La mayor parte de las definiciones del com
plemento son hechas sobre la base de su activi
dad citoltica, y una de las ms claras y com
pletas es la propuesta por Mayer, quien lo defi
ne como un sistema reaccional citocida que es
activado por complejos antgeno-anticuerpo o
agregados de gammaglobulina o algunos otros
m ateriales . Con esta definicin queda claro
que el efecto citocida es la accin de un siste
ma activado y no un atributo exclusivo del
complemento tal como se encuentra en el to
rrente sanguneo. Este tipo de definicin es
preferida porque en el mecanismo a que se ha
ce referencia intervienen todos los factores
constitutivos del complemento descriptos hasta
el momento.
Adems de la intervencin directa del com
plemento en las reacciones citolticas especfi
cas, se ha demostrado su participacin en otros
mecanismos inmunolgicos tales como inmo
vilizacin de los treponemas, fenmenos de in

22
munoadherencia, neutralizacin de los virus,
fagocitosis y algunas reacciones de hipersensi
bilidad.
La existencia en el plasma sanguneo de una
sustancia que responda a las caractersticas del
com plem ento surge a fines del siglo pasado
con los trabajos de Buchner, von. Eodor y Nuttal, y fue Bordet quien demostr bacterilisis in
vitro y comprob que dicha actividad del inm u
nosuero desapareca con el calentamiento y que
era recuperada por la adicin de suero fresco
normal. Propuso para dicha sustancia, a la que
consider sim ilar a la alex in a d escrita por
Buchner, el nombre de complemento, por en
tender que complementaba la accin del anti
cuerpo sobre el antgeno.
Ehrlich y M orgenroth demostraron que los
hemates de carnero y su correspondiente he
molisina, obtenida por inmunizacin de cone
jos con glbulos rojos de carnero, se combinan
en ausencia y en presencia del complemento.
En el prim er caso hay hem oaglutinacin en
tanto que en el segundo se produce la hemli
sis, lo que indica la necesidad del complemento
para que se produzca dao celular.
El complemento es un sistema de activacin
en cascada y est constituido por numerosos
componentes, lo que habla de su complejidad y
lo dificultoso que ha resultado poner en eviden
cia los mecanismos de enlace y su secuencia en
la reaccin de inmunohemlisis.
La nomenclatura usada para la identificacin
de los componentes del complemento es la que
figura en el cuadro 22-1.
El sistema complemento, para ejercer su ac
cin, debe activarse previam ente, cosa que
puede lograrse por dos mecanismos distintos,
designados como vas de activacin clsica y
alterna.

Complemento

387

Cuadro 22-1. Nomenclatura recomendada p or la Organizacin Mundial de la Salud p a ra los

componentes del complemento
1. Al sistem a com plem ento se lo identifica con la letra C y a cada uno de sus com ponentes con el nm ero siguiente a C
(C l, C2, C3, C4, C5, C 6, C7, C8 y C9).
2. Cuando un com ponente o grupos de com ponentes del com plem ento han adquirido activW ad enzim tica u otra actividad
biolgica, se los identifica colocando una barra sobre los com ponentes afectados (C l, C42, C567, etc.).
3. Los com ponentes que se enum eran despus de E A C denotan un estado de reactividad, pero no necesariam ente su p re
sencia fsica. EA C 1423 puede escribirse en form a sim plificada E A C l-3 .
4. Cuando en una reaccin algn com ponente de com plejo interm edio pierde su actividad, se lo suprim e. Si C l y C 2 ,
com ponentes del com plejo EA C 1423, se inactivaran, se escribe EA C 4,3.
5. La prdida de una actividad definida por parte de un com ponente del com plem ento se identifica con la letra i (C 4 i, C2i,
C3i).
6. Los fragm entos resultantes de rupturas peptdicas que aparecen durante la activacin del com plem ento se iden tifican
con una letra m inscula siguiendo al com ponente afectado (C3a, C 3b, C5a, etc.).

Por la primera, el complemento se activa por

agregados de inmunoglobulinas IgG e IgM, ge
neralm ente presentes en form a de com plejos
Ag-Ac, Si no hay agregacin de estas inmunoglobulinas, que podran im plicar cambios de
conformacin del Fe, no fijan el complemento.
En la va de activacin clsica no todos los
componentes cum plen la mism a funcin; C l
constituye la unidad de reconocimiento, C2, C3
y C4 las de activacin, C5, C6, C7, C8 y C9, el
sistema de ataque a las membranas.
La activacin por la va alterna se consigue
por agregados de IgA (Ag-Ac), polisacridos y
lipopolisacridos naturales. Intervienen en este
mecanismo cuatro protenas, una de las cuales,
C3, es operativa tambin en la va clsica. Esas
protenas son las siguientes: C3, componente B
(B), componente D (D), y properdina (P). Ini
cialmente al componente B se lo design C3
proactivador (C3PA) y al D C3, proactivador
convertasa (C3PAasa), nombres stos ya fuera
de uso. La va alterna ensambla con la va cl
sica a nivel de C3, eludiendo C l, C2 y C4, para
continuar con la activacin de C5 a C9.
Existen adems, asociadas a este sistema, un
conjunto de protenas reguladoras y de recepto
res celulares, que cumplen un papel muy im
portante en la funcionalidad del complemento.
VA DE ACTIVACIN CLSICA
En la IgG e IgM los sitios de combinacin
con C l estn ubicados en el fragmento Fe; el
fragmento F (ab) 2 carece de actividad fijado
ra. Se ha demostrado que en la IgG de conejo
el dominio de CH2 (PM 17 kD) es el que est
comprometido en la fijacin de C l. m ientras
que el CH3 es inactivo. Asimismo se ha puesto
en evidencia que la (32 m icroglobulina, que
muestra cierta homologa con el dominio CH2,
fija C l en forma similar a CH2 y Fe. Con res
pecto a IgM, se ha comprobado que el dominio
C h3 (PM, 6,8 k p ) es el principal responsable
de la fijacin de C L Si bien ios dominios cita^

dos son los comprendidos en la fijacin de C l,

la capacidad de fijacin total slo se expresa
cuando el fragmento Fe est intacto,
Componentes del complemento
que intervienen en la va clsica
El orden de descripcin no es el numrico si
no el que ocupa en la secuencia de activacin.
P r im e r

co m po n en te

(C l)

Es termolbil (56C 30 minutos) y en el suero

fresco se encuentra en forma de complejo polimolecular, el que se mantiene como unidad en
presencia de Ca^^, Complejando este catin es
posible separar por cromatografa en DEAE-eelulosa los tres componentes constitutivos, desig
nados C lq, C lr y C ls, El complejo polimolecular C l tiene la composicin C lq ,C lr 2 C ls^, Es
tos tres componentes se fijan a los complejos de
IgG e IgM en forma reversible.
El componente C lq es la unidad de recono
cimiento, Su peso molecular es de 410 kD , su
coeficiente de sedimentacin 1IS, y su m ovili
dad electrofortica de tipo f l . Su concentracin
srica promedio es de 70 |ig mi '. Es una de
las protenas ms bsicas del organism o; el
19% de sus aminocidos constitutivos son gli
cina y un 15% de su masa est constituida por
hidratos de carbono. Es una protena con se
cuencias en su molcula similares al colgeno
y est compuesta por seis subunidades de PM
67 kD unidas no covalentemente. Cada subuni
dad est formada por tres cadenas polipeptdi
cas ligadas entre s por uniones di sulfuro. Cada
cadena peptdica tiene aproxim adam ente 200
residuos. De ellos, los 3 a 9 residuos N-terminales no tienen relacin con el colgeno, los 78
residuos siguientes son similares a los hallados
en la protena del colgeno, y los 110 residuos
de la zona C -term inal no estn relacionados
con aquella protena. Las tres zonas colgenosmiles de cada subunidad form pan un^ tupie
hlice, y las tres zonas C-terminales. u n a re-

388

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

unidas por fibrillas a una estructura central (fig.

22-1). En realidad C lq estara constituido por
la unin de tres unidades dimricas similares
que responderan a la estructura de la figura
22-2. P or tratam iento con colagenasa, C lq
pierde su capacidad para iniciar la actividad he
moltica, por ruptura de la estructura fibrilar,
pero no tan rpidamente su capacidad de fija
cin de IgG agregada, lo que sugiere que la zo
na globular sera la responsable de la fijacin.
Mediante estudios de equilibrio de dilisis se
ha dem ostrado que C lq tiene seis sitios de
combinacin, cada uno de ellos con una cons
tante de asociacin 5 x 10^ a 1 X 10^ M '. Cuan
do C lq interacciona con agregados de IgG, su
fre cambios conformacionales (C lq).
C lr es una (3-globulina con coeficiente de
sedimentacin 7,5 S, un PM de 85 kD y con
centracin srica aproximada de 35 |lg m l .
Los cambios experimentados por C lq durante
su fijacin a los agregados de IgG e IgM indu
cen cambios en la conformacin de C lr hacien
do que este componente, que se hallaba como
F ig . 22-1. M ic ro s c o p ia e le c tr n ic a d e l c o m p o n e n te . C l q .
proenzima, se active (C lr) y adquiera capaci
( T o m a d a d e Europ. J. Inm unol. 19 7 5 .)
dad para continuar con la cascada de reaccio
nes que llevan a la lisis. Inicialmente una mol
cula de C lr es clivada por un mecanismo poco
gin globosa. Al microscopio electrnico, C lq conocido, y esta molcula as activada cliva a
purificado aparece como una estructura consti la otra C lr y luego a C ls, la que es un precur
tuida por seis unidades globosas perifricas sor de una proteasa de serina.
C ls tiene una movilidad electrofortica de
a2-globulina, una constante de sedimentacin
de 4S y un peso molecular de 85 kD. La con
centracin srica es de 70 ag-ml''. Est como
proenzima y despus de interaccionar con C l f
se transforma en C ls. Los pesos moleculares
de C ls y Cl's son similares pero, en este ltimo
caso, y como consecuencia de la activacin por
CIF, se rompe una unin peptdica y se origi
nan dos pptidos, que se mantienen unidos por
un puente disulfuro. Por reduccin y alquila
cin es posible su separacin. A estos pptidos
se los denomina H (PM, 59 kD) y L (PM, 27
kD). El sitio activo de C l^ est localizado en el
pptido L, lo que ha sido demostrado por la fi
jacin al m ism o de diisopropil-fM or-fosfato
(DEP) y por la capacidad para complejarse con
Cl-inhibidor (Clinh). Adems del DEP, los s
teres fosfonados inhiben la accin enzimtica
de C ls. La actividad estersiea de este compo
nente puede ponerse en evidencia hacindolo
reaccionar con TAMe (ster metlico de p-toluensulfonil arginina) o ATEe (ster etlico de
N-acetil L-tirosina) y midiendo la cantidad de
aminocido liberado.
110
78
_2: ^ nh3
El componente C l, constituido por las tres
COO;
-colgeno sim ili- no colgeno simili subunidades indicadas (C lq , C lr, C ls), tiene
un coeficiente de sedimentacin de 18S, un pe
so molecular de 750 kD y se mantiene como tal
F ig . 22-2. E s tru c tu ra d e C l q {Porter R. R.: B iochem istry
o f com plem ent. L a R ic h e rc a 7 :1 9 1 , 1977).
en presencia de Ca^+.

Complemento
C

ua rto co m po n en te

(C 4 )

Es una p-globulina identificada electroforticamente como (31E. Su coeficiente de sedi

mentacin es IOS, y su peso molecular, 200
kD. Contiene 14% de hidratos de carbono y su
concentracin srica es de 400 |ag m i E s
termoestable y por accin de C ls sufre m odi
ficaciones en su actividad y propiedades fisi
coqumicas. Es inactivado por hidrazina, am i
nas primarias, amonaco y ter. Est formado
por tres cadenas polipeptdicas: a (PM , 93
kD), p (PM, 78 kD) y y (PM, 33 kD), hgadas
entre s por uniones disulfuro y fuerzas no co
valentes.
C4 es sintetizado como un precursor consti
tuido por una cadena simple, el que previa se
crecin al plasma sanguneo es clivado en las
tres cadenas peptdicas indicadas (fig. 22-3).
Cuando C ls acta sobre C4 d iv a un peque
o pptido de la cadena a (PM, 6 kD) al que se
identifica como C4a y expone un sitio de unin
lbil (C4b). Se especula con que la cadena y
podra intervenir en la un i n jle C4 y C2 para
formar la C42 convertasa (C42).
S egundo

co m po n en te

(C 2 )

Pl^globulina de PM 117 kD y coeficiente de

sedimentacin 5,5S. El parahidroximercuribenzoato o el paracloromercuribenzoato^jiisminuyen su actividad. El complejo EAC142 que se

Componente del
complemento

Precursor
(endocitoplasmtico)

389

forma durante la activacin es lbil y su activi

dad disminuye con el tiempo. Su vida m edia es
de 10 minutos a 37C, pero se prolonga a 150200 minutos si C2 es previamente tratado con
iodo en presencia de ioduro de potasio. Se pre
sume que ello es consecuencia de la oxidacin
de algn grupo crtico existente en la molcula,
probablemente un grupo sulfhidrilo. El C2 oxi
dado no es inactivado por el paracloromercuribenzoato, pero s por algunos agentes reducto
res como la ditionita sdica.
Su concentracin srica es de 30 |ig rah'.
T e r c e r c o m p o n e n te

(C3)

Es una globulina termoestable a la que por

su movilidad electrofortica se identifica como
p i e , con un coeficiente de sedim entacin de
9,5S. Por envejecimiento se modifica transfor
mndose en plA , con coeficiente de sedim en
tacin 7S. Su peso molecular aproximado es de
195 kD y su molcula contiene 2,7% de hidra
tos de carbono. Su concentracin srica es de
1.400 (xg-ml-'.
Estructuralmente est constituido por dos ca
denas polipeptdicas, a (PM, 120 kD) y P (PM,
75 kD), unidas por puentes disulfuro. Al igual
que C4, stas se originan por_clivaje de un pre
cursor (fig. 22-3). Cuando C42 acta sobre C3,
de la cadena a se separa un pptido (C3a) con
actividad anafilotxica y C3b, el cual se asocia
con la enzim a que lo activ o rig inan d o un

Producto final
(srico)

a (93 kD)
C4
p (78 kD)

y (33 kD)

a (120 kD)
C3
(3 (75 kD)

a (124 kD)
C5
|3(76 kD)
Fig. 22-3. E structura esquem tica de ios precursores citoplasm ticos y productos secretados al plasm a sanguneo d e los
com ponentes de com plem ento C4, C3 y C5,

390

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

complejo trimolecular (C423) llamado C5 con

vertasa.
El fragmento C3a est formado por los lti
mos 77 residuos de la cadena a y constituye el
40-45% de la estructura a-helicoidal de la mo
lcula entera. Se conoce su secuencia primaria.
Su peso molecular es de 9 kD y la movilidad
electrofortica es de a l . Mediante el empleo de
agentes reductores y desnaturalizantes se ha
dem ostrado que la estructura a-helicoidal es
indispensable para su actividad biolgica, de
igual modo que la arginina C-terminal, ya que
C3a pierde actividad cuando es tratado con carboxipeptidasa B, la que separa a dicho amino
cido de la cadena polipeptdica.
C3b tiene un peso molecular de 185 kD y est
formado por dos cadenas polipeptdicas: a , PM
110 kD y P, PM 75 kD gadas por uniones disul
furo. En la cadena a existe un tioster que juega
un papel fundamental en la fijacin de C3b a
membranas. Un hecho similar ocurre en C4.
La fijacin de C3 y C4 a membrana es de ti
po covalente. Cuando C3b se inactiva se trans
forma en C3bi, que se origina por ruptura de la
cadena a en dos pptidos de PM 67 kD y 43
kD respectivamente, los que se mantienen uni
dos a la cadena |3 por las uniones disulfuro ori
ginales. Al escindirse del pptido de 67 kD un
fragmento de PM 40 kD (C3d, g), se origina
C3c (P,A). C3dg da origen, por escisin a C3d
(a^D) (30 kD) y C3g (10 kD). Por degradacin
de C3c se forma un pequeo fragmento acdico
al que se lo denomina C3e (fig. 22-4).
En la figura 22-5 pueden observarse los pa
trones inmunoelectroforticos con-espondientes
a los productos de conversin de algunos de los
componentes del sistema complemento.

Tioster
S - C=0

_l_____ I_____

OR

C3a

C3b
(C3a

(C5)

Es una pjglobulina relativamente termolbil,

la que por su movilidad electrofortica se iden
tifica como Pjp. Su coeficiente de sedimenta
cin es 8,78 y su peso molecular 200 kD. Con
tiene 19% de hidratos de carbono y su concen
tracin srica es de 160 |xg mi '.
Es sintetizado com o precu rso r de cadena
simple y est constituido por dos cadenas pep
tdicas resultantes de su escisin. La cadena a ,
PM, 124 kD, y la p, PM, 76 kD. A diferencia
de C3 y C4, no posee tioster en la cadena a.
Cuando sobre C5 acta la C5 convertasa, se
escinde un pequeo pptido (C5a), de PM 12
kD con actividad anafilotxica similar a la de
C3a. Es distinta a esta ltima, lo que queda de
mostrado por su capacidad para contraer un tro
zo de msculo liso previamente transformado
en no reactivo por agotamiento con la anafiloto^
xina C3a. El resto de la molcula (C5b) inter
viene en la formacin del complejo citoltico,

C3b)

OR

^H(|: = 0
C3bi

OR
SHC = 0
C3d,g

C3c
OR
SH C = 0
,

I-------,
C3g

(C3d

-I-

C3g)

C3d

F ig . 22-4. Productos de clivaje obtenidos a partir de C3

(para detalles vase el texto). Las flechas indican los p u n
tos de ruptura.

S e x to c o m p o n e n te
Q u in to c o m p o n e n te

-I-

(C6)

Se comporta como una Pglobulina de despla

zamiento electrofortico lento (p2), y al igual
que C7 y C9 est formado por una sola cadena
peptdica. Tiene un coeficiente de sedimenta
cin 5-6S y un peso molecular de aproximada
mente 130 kD. Su concentracin srica prome
dio es de 75 |Tg m i '.
S p tim o c o m p o n e n te

(C7)

Es termoestable, con movilidad electroforti

ca de pjglobulina y coeficiente de sedimenta
cin 5-6S. Su peso molecular se aproxima a los
120 k D . La concentracin srica promedio es
de 65 |J.g m i '.
O c ta v o c o m p o n e n te

(C8)

Tiene un peso molecular de 155 kD, un coe

ficiente de sedim entacin 8S y la movilidad
electrofortica es de p-globulina. Es relativa-

Complemento
Fig. 22-5. P a tro n e s inm u n o electro fo rtico s de
los productos de conver
s i n d e a lg u n o s de los
c o m p o n e n te s d e l c o m
plem ento. El hallazgo de
productos de conversin
en el suero fresco es una
e v id e n c ia s ig n ific a tiv a
d e ac tiv ac i n in v ivo y
g en e ra lm e n te p rece d e a
d escen so s significativos
d etecta d o s p o r m todos
cuantitativos.

C3
(p1-C)

Convelas

Proteasa

391

' C3c + C3d

(p1-A)(a2-D)
^Suero fresco

A C3 nativo
(no activado)

C3

(+)

(-)

B Conversin
parcial
(activacin)

fA NTI-C3

C Conversin
completa
(activacin
total)

C3c

inactivador de

^ C 4 a .C 4 b - - - i^

C4
(131-E)

..Suero fresco
D

No activado

(+)

(-)
- ANTI-C4

E Activado

C4

C4bi

FRAGMENTO
Bb

(y)

F No activado

(+)

PEPTDICO

(Ba)

.Suero fresco

{-)

ANTI-B

G Activado

mente termolbil. Su concentracin en el to

rrente sanguneo es de aproxim adam ente 80
|ig m i .
Est formado por tres subunidades, dos de
ellas (cadena a , PM, 77 kD y cadena y, PM, 13
kD) unidas covalentemente por puente disulfu
ro, y una de stas asociada no covalentemente a
la tercera cadena peptdica (cadena (3, PM, 63
kD).
N o v e n o c o m p o n e n te

(C9)

Ha sido aislado en un gran estado de pureza.

Tiene un PM de 79 kD y coeficiente de sedi
mentacin 4,5S. Su m ovilidad electrofortica
es de a2globulina. En el suero sanguneo est
presente en concentraciones de 200 \ig ml.

El cuadro 22-2 contiene las caractersticas

ms sobresalientes de los diferentes componen
tes del complemento.
Cintica de la inmunohemlisis por accin
del complemento activado por la v a clsica
Los estudios que han llevado al aislamiento
y purificacin de los diferentes com ponentes
del complemento y a la demostracin de la ac
tividad enzimtica de algunos de los complejos
formados han permitido considerar que el m e
canismo de la lisis de los glbulos rojos de car
nero sensibilizados con hemolisina anticamero,
cuando sobre ellos actan los componentes del
complemento activados por la va clsica es el
indicado en la fig. 22-5bis.

392

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

C2d

mas de sensibilizacin se aaden 1.000 m ol

culas de anticuerpos por hemate. De acuerdo
con clculos efectuados, cada sitio Forssman
de un hemate debera reaccionar con 2 mol
culas de anticuerpo de tipo IgG o I molcula
del tipo IgM para fijar el complemento. Si lla
mamos S al sitio y A al anticuerpo, la esque
matizacin sera SA^ y SA, respectivamente.
Sin em bargo, esta hiptesis no se apoya en
pruebas directas y, por este motivo, la combi
nacin de un sitio Forssman de un glbulo rojo
de camero con la hemolisina se representa
S + A-

-^SA

Existiendo en los hemates numerosos sitios

S, cuando se encuentran en el estado anterior se
los representa
E - h A ----- >EA
EAC1423567

+
C8

EA significa hemate sensibilizado que pue

de tener uno o varios sitios Forssman en esas
condiciones, en tanto que SA significa la sensi
bilizacin especfica de un solo sitio Forssman.
P r im e r a

EAC14235678
(dao parcial)
LISIS
(hemoglobina,
nucletidos,
aminocidos,
potasio, restos
celulares)

E*
EAC142356789
(poros en la
membrana del
eritrocito)

+
-C 9

F ig . 22-5bis. Esquem a de la activacin del com plem ento

p o r la va clsica.

Para su mejor interpretacin se estudiar ca

da una de las etapas por separado y se discuti
rn las causas de la inmunohemhsis.
E

t a p a p r e l im in a r

Si bien la fijacin de la hemolisina a los gl

bulos rojos ocurre de una manera simple y sin
inconvenientes en condiciones norm ales, no
hay que olvidar que todas las hemolisinas no
tienen el mismo comportamiento. La curva de
la actividad hemoltica del anticuerpo depende
del antgeno usado en la inmunizacin -glbu
los rojos enteros o estroma celular- y de la po
sibilidad de la transferencia de molculas de an
ticuerpo de sitio a sitio reactivo en un hemate o
de clula a clula, como se ver ms adelante.
En los glbulos rojos de carnero existen por
clula, aproxim adam ente 5.000 sitios F orss
man o sitios capaces de interaccionar con el an
ticuerpo anti-hemate, y en condiciones pti

eta pa

A 0C, en presencia de Ca^+ y ausencia de

Mg^+ los hemates sensibilizados fijan C l y C4:
0C
_
EA + C E A C 1 4
Ca2+
E sta etapa es rp id a -a lg u n o s m inutos a
37C- y va seguida, en presencia de Mg^^, de la
fijacin de C2. Si la reaccin se hace a 0C y
en ausencia de Mg^^ (suero previamente tratado
con resinas de intercambio inico), esta ltima
fraccin_no se l'ija y se obtienen clulas al esta
do EAC 14, estables a 0C y aun a 37C.
Si bien la descripta es la forma simplificada
de la primera etapa, ella es algo ms compleja:
a)
Como ya hemos visto el componente del
com plem ento que se fija a los com plejos de
IgG e IgM es C lq . Como consecuencia de esa
fijacin, C lq sufre un cambio de conformacin
crtico, el que a su vez induce un cambio en la
conformacin de C lr. Por este mecanismo la
proenzima adquiere actividad enzimtica (C lr)
a travs de la cual C ls (proenzima) se convier
te en C ls, enzima con actividad de serina esterasa. En realidad, el complejo C lq rs formado
no es equimolecular sino que responde a la es
tructura Clqr^s^.
E A 'd q r s i

C1q + C1r + C1s

393

Complemento

CA

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394

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

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Complemento

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396

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

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C Di 0

397

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

398

Durante esta conversin, por ruptura de una

En presencia de Mg^^ se forma EAC14b2b
unin peptdica en Cl s, se originan las cadenas siendo esta conversin rpida a 37C y lenta a
H y L, estando localizado el sitio activo en esta 0C. En el sobrenadante de la reaccin puede
ltima. U sando DFP m arcado con
se de aparecer un derivado inactivo de C2, el C2i.
mostr que una sola molcula del inhibidor de
serina esterasa se fija por molcula de C ls, y
que ello ocurre en la cadena L. El pptido mar
E A C l 4b2b
cado fue secuenciado y se encontr que el sitio
(C onvertasa de C3)
activo era similar al de otras serinas esterasas
com o la tripsina, quim otripsina, trom bina y
___
plasmina.
_
T ratando EAC 14 o EAC 142 con EDTA o
diaminas alifticas de 3 a 8 tomos de carbono,
La vida media de EAC 14b2b es muy corta a
en especial 1-4 butano diamina-, es posible se 37C, aproximadam ente 10 minutos, y de 10
parar C l con actividad estersiea, la que se h o ras a 0 C. L a e sta b ilid a d del co m p lejo
mantiene a pH 3,3, perdiendo en cambio, en EAC 14b2b depende de la temperatura y ello se
esas condiciones, su capacidad para fijarse a debe a la reversibilidad de la reaccin:
EA. Ello se debe a que en el complejo macro
molecular existen productos que poseen activi
EAC14b2b ^ EAC 14b -i- C2d
dad diferente, relacionados con C ls y C lq res
pectivamente.
C2d, que es hemolticamente inactivo, se h a
b)
Inmediatamente despus, C l acta sobre lla en el sobrenadante y puede ser investigado
C4 y C2 activando sitios de unin lbiles en con anticuerpos especficos. Una vez liberado
ambas molculas, lo que perm ite la unin de del complejo, C2d no vuelve a fijarse.
C2 a C4 formando un complejo C42, el que se
Para que C2 se fije a los glbulos rojos sen
fija a EA originando EAC 142. Cuando C l ata sibilizados (EA) es necesaria la presencia de
ca a C4, libera a partir de sus cadenas a un pe C l y la activacin previa de C4, la que a su vez
queo pptido de PM 6 kD, denominado C4a, es dependiente de C l. El complejo C4b2b ad
con actividad algo similar a la de C3a. El resto quiere actividad convertsica catalizando la ac
de la molcula constituye C4b. La accin de tivacin de C3. La actividad de C ls sobre C2
C ls sobre C2 da origen a C2b y C2a, siendo el es ms efectiva si ste se ha fijado previamente
primero de ellos el que participa en la secuen a C4b.
cia de activacin del sistema complemento, y
C2a el pequeo fragmento peptdico que se li S e g u n d a e t a p a
bera.
Es im portante hacer notar que hasta hace
Para la fijacin de C4 y C2 es necesaria la
muy poco, la nomenclatura correspondiente a presencia de C l. El componente C3 no lo nece
los fragmentos de escisin de C2 estaba inver sita; por accin de la C3 convertasa (C4b2b) es
tida, y se designaba C2a al fragmento que al escindido, y parte de l adquiere capacidad pa
unirse a C4b da origen a la convertasa de C3, y ra fijarse a receptores de la membrana de los
C2b al pequeo pptido que se libera. Esta ,mo eritrocitos. Durante el clivado, a partir de la ca
dificacin introducida tiene por objeto identifi dena a se forma C3a (anafilotoxina) constitu
car con el mismo subndice (b) a todos los frag yendo el resto de la molcula C3b, el que en su
mentos que participan en la activacin del sis forma naciente se une a la enzima que sirvi
tem a complemento, y con el subndice (a) a los para su activacin originando un complejo tripequeos fragmentos peptdicos escindidos. La molecular (EAC14b2b3b) que tiene capacidad
nomenclatura incluida en el texto corresponde para convertir a C5 (C5 convertasa). Hay estu
a la modificacin usada actualmente.
dios que demuestran que este complejo, en for
Para que ocurra la activacin de C4 no es ne ma relativamente estable y con actividad con
cesaria la presencia de Mg^+, y ella se produce vertsica de C5, puede formarse adems en la
rpidamente, en 1 a 2 minutos a 37C. Durante la fase Huida. Su coeficiente de sedimentacin es
formacin de EAC 14b, una fraccin de C4 deno de 15S.
minada C4i puede aparecer en el sobrenadante.

I----------- !

eaIc T i

E A C l 4b

E A C l 4b2b3b
(C onvertasa de C.5)

C4*
C4i
C4

Complemento
El C3b libre en la fase fluida se inactiva r
pidam ente, transform ndose en C3i. Slo un
10% del C3 activado se fija a la clula. Un solo
complejo EAC14b2b puede activar numerosas
molculas de C3.
La convertasa de C5 tiene actividad peptidsica, la que se pone de manifiesto por su capa
cidad para desdoblar dipptidos en que uno de
sus aminocidos constitutivos es aromtico, co
mo glicil-tirosina. stos pueden inhibir la lisis
de EAC14b2b3b si son adicionados previamen
te al agregado de los restantes componentes del
complemento.
T

ercera eta pa

El ataque de C5 por EAC14b2b3b inicia el

proceso de autoensamblado por el cual, y sin
ninguna otra accin enzim tica, se form a el
complejo estable de C5b-9. Inicialm ente C5
se une a C3b fijado a m em branas y en esas
condiciones sufre sutiles cambios conform a
cionales que lo hacen accesible a la accin de
las convertasas de C5. Si no est fijado a C3b,
en condiciones fisiolgicas C5 no es clivado
por las enzimas. La C5 convertasa escinde de
C5 un pequeo pptido, C5a, con actividad
anafilotxica, que al igual que C3a tiene un
alto contenido de estructura a-helicoidal, uno
de los requerim ientos para su actividad biol
gica. El resto de la molcula, C5b, es el que
form a con los co m p o n en te s te rm in a le s el
complejo estable con capacidad para producir
el dao. En la fase fluida el complejo C5b-9
se acumula en su form a inactiva. Ha sido ais
lado de sueros activados, siendo su peso m o
lecular de 1.000 kD , el coeficiente de sed i
mentacin 23S y su movilidad electrofortica
de aglobulina. Las uniones de este complejo
no son covalentes, lo que ha perm itido, por
electroforesis en geles. adicionados de dodecil
sulfato de sodio, lograr su separacin. Se han
obtenido siete bandas, las que por anlisis an
tignico y peso m olecular corresponden, se
gn la posicin que ocupan las bandas: (1)
C5b (PM, 170 kD); (2) C7 (PM, 120 kD); (3)
C6 (PM, 95 kD); (4) C8 (PM, 93 kD); (5) des
conocido (PM, 88 kD); (6) C9 (PM, 79 kD) y
(7) C8 (PM, 70 kD). Las bandas (4) y (7) re
presentan dos subunidades de C8, unidas no
covalentemente, las que tambin han sido h a
lladas en el C8 nativo y a las que se denomina
C 8 a y C8j3. La banda (5) inicialmente no fu
identificada con ninguna otra protena conoci
da y podra constituir un nuevo com ponente
del complemento; actualmente se sabe que es
un inhibidor del complejo C5b-9. Los com po
nentes C5b, C6, C7 y C8 estn presentes en
concentraciones equim oleculares, en tanto que
C9 lo est en una proporcin mayor.

399

C uando EAC14b2b3b d iv a a C5, el fra g

mento naciente C5b, que sirve como centro fo
cal de ataque a la membrana por parte del com
plejo, expone sitios que le permiten la fijacin
de C6 y C l. C6 tiene actividad de serina esterasa y muy probablemente C5 constituya su sus
trato. C5b se une a C6 originando un interm e
diario inestable EAC14b2b3b5b6, el que al fi
ja r C l se estabiliza (EA C 14b2b3b5b67). El
complejo trimolecular C5b67 aumenta su afini
dad por las superficies lipoflicas y su insercin
en las membranas probablemente se deba a que
en C l existen sitios ocultos de unin a aqu
llas, de carcter hidrofbico. La especificidad
de las clulas de fijar C8 se inhibe si C5, C 6 y
C7 son adicionados juntamente con suero antiC5, lo que demuestra su activa participacin en
el proceso.
E A C l I4 b 2 b 3 b i-

=* E A C l 4b2b3b5b

E A C l 4 b 2 b 3 b l5 b i

= E A C l 4 b2b3b5b67

1_____ L^

C 6 , C7

C (567)i

C8 se fija sobre las clulas que han adquiri

do el estado anterior.
E A C l 4 b 2 b 3 b l5 b 6 7 |

i------ (

E A C l 4 b 2b3b5b678

Se ha demostrado que la interaccin de C5b7

con C8 tiene lugar a travs de la cadena C8)3, a
la que sigue la fijacin de C9. Que la participa
cin de C8 es indispensable para la fijacin de
C9, puede ponerse en evidencia mediante la in
hibicin de la reaccin por el aadido de suero
anti-C8. El dao en las clulas es inidado por
el C8 fijado y que en la elaboracin del canal
transm em brnico que lleva a la lisis celu lar
participa C9. C8 actuara como una fosfolipasa.
E A C l 4b2b3b5b678

E A C ! 4b2b3b5b6789

Un efecto similar al logrado por e l aadido

de C9 se consigue con la adicin de quelantes
de iones F e^+ , como la 1 - 1 0 fenantrolina o l a
bipiridina. La accin de C9 es inhibida p o r los
iones Fe^'*. Todo parecera indicar que C 9 po
dra actuar de una manera similar a los quelan
tes en su mecanismo de activacin sobre C8 fi
jado a clulas.

400

Mecanismos efectores de a respuesta inmune

Con posterioridad a la fijacin del ltim o

com ponente del com plem ento ocurren en la
membrana celular una serie de cambios que en
definitiva llevan a la lisis.
C9 contiene dominios hidrobficos ocultos y
cuando interacciona con C5b-8 polim eriza y
forma estructuras tubulares de carcter anfiflico, las que dan origen a los canales transmembrnicos que llevan al dao celular. C5b-8 pro
mueve la insercin de C9 en el centro hidrocar
bonado de la membrana, favoreciendo su acce
so a la bicapa lipdica. Durante este proceso,
C9 polim eriza aumentando su estructura P y
exponiendo neoantgenos C9 especficos. Los
grupos hidrofbicos se unen a la membrana y
originan un canal central de pasaje de carcter
hidroflico. El dimetro del canal vara segn el
nmero de molculas de C9 que polimerizaron.
Se han descrito polmeros con 2, 3, 6, 10, 12 y
16 molculas de C9, las que incrementaran el
dimetro de los canales transmembrnicos ori
ginados (fig. 22-6). Es a travs de esos canales
que los eritrocitos pierden hemoglobina, pota
sio, nuclotidos, aminocidos, etc., prdida sta
que puede ser bloqueada por albmina bovina

C 5 b -9

C 5 b -8

al 25%, lo que supone la implicancia de una re

gulacin osmtica.
Un hecho interesante ha surgido al analizar
los productos originados por el ataque va com
plemento de las membranas de macrfagos y
polimorfonucleares neutrfilos. Cuando la le
sin de la membrana se produce, hay activa-^
cin de fosfolipasa celular, que inicia el meca
nismo que lleva a la liberacin de prostaglandi
nas, tromboxanos, hidroxiderivados e hidroperoxiderivados del cido eicosatetraenoico (HE
TE y HPETEs), leucotrienos y otros productos.
Esto pone en evidencia que adems de la ac
cin inflamatoria de C3a y C5a, ya conocida, el
ataque a membranas por los componentes ter
minales de la secuencia de activacin del com
plemento inicia el mecanismo inflamatorio ba
sado en la liberacin de cido araquidnico a
partir de los fosfolpidos de membrana. H^asta
el momento no se tena conocimiento de que el
ataque a membranas por los componentes ter
minales del complemento mediaran la libera
cin de productos que participan en los fen
menos de hipersensibilidad inmediata y de la
inflamacin (vanse caps. 23 y 32).

(C 5b-8 ) C 9 n

a)

C5b

C6

C8

C7

r.fi

re

f'Q -------

b)
C9 Qg C9

c)

F ig . 22-6. Representacin esquem tica de los poros que se form an en la m em brana de los eritrocitos durante la lisis m e
diada por com plem ento.
a) Insercin del com plejo C5b-8 en la m em brana celular y fijacin posterior de C9. Inicialm ente hay desplegam iento y
activacin de C9, seguida de polim erizacin y form acin com pleta del tubo al participar en el suceso nuevas m olculas
d e C9.
b) F orm acin del canal transm em brnico, que aum enta su dim etro en funcin de las m olculas de C9 que participan.
c) Esquem a de los productos que se observan al m icroscopio electrnico cuando la m em brana de un eritrocito es atacada
por el sistem a com plem ento: I - poros de un trozo de m em brana atacada por com plem ento; II - corte longitudinal de la
m em brana en la zona correspondiente a un poro, donde se observa una form acin infundibuliform e.

Complemento
La figura 22-7 esquematiza la activacin del
sistema complemento por la va clsica.
Recientemente se ha demostrado que, cuan
do la protena fijadora de maosa (MBP: mari
nse binding protein), presente en varios verte
brados, fija a travs de sus dominios de lee ti nadpo C estru ctu ras con m aosa o acetilglucosamina presentes en la superficie de varios
p atgenos (b acterias, viru s), se activa una
proenzima denominada (M AS? (MBP-associa ted serin e-p ro tea se). La enzim a a c tiv ad a
acta sobre C4 y C2 originando C4b y C2d,
poniendo en marcha, de esta manera, la acti
vacin del complemento por la va clsica sin
la participacin de anticuerpos.
VA DE A C T IV A C I N A LTERNA
D EL C O M PL E M E N T O
El conocim iento del mecanismo de accin
de la va alterna, caracterizado por la activacin
de C3-9 sin la participacin de C142, es recien
te. Hace ya varios aos Pillemer y col. demos
traron que una protena srica llamada proper
dina (P), en presencia de Mg^+, un factor A hidrazina sensible, un factor B termolbil y una
fraccin euglobulnica del suero, tena capaci
dad para reaccionar con extractos de pared ce
lular de levadura de cerveza (zimosn) y origi
nar a 17C un com plejo capaz de in activ ar
C3-9 a 37C. Teniendo en cuenta que las carac
tersticas de los tres factores descritos eran se
mejantes a las de C4, C2 y C l, se sostuvo que
ello no era ms que una reaccin clsica de
inactivacin de C y que probablemente deba
ocurrir como consecuencia de una interaccin
previa del zimosn con anticuerpos naturales.
Posteriormente se demostr que lipopolisacri
dos bacterianos, al interaccionar con sueros
frescos, inactivaban C3-9 sin consumos apre
ciables de C l, C2 y C4.
El hecho que sirvi para interpretar este m e
canismo de accin fue el hallazgo del factor B
o C3PA, descubierto al explorar, no el sistema
de la properdina, sino el mecanismo por el cual
un factor obtenido del veneno de cobra (CVF)
inactivaba a C3. Las aparentes relaciones entre
C3PA o B con el sistema de la properdina han
permitido formular hiptesis sobre el funciona
miento de la va alterna.
Si bien hasta hace muy poco existan contro
versias sobre el mecanismo inicial de la activa
cin del sistema complemento por la va alter
na, en estos momentos el hecho est aclarado.
Durante cierto tiempo se sostuvo que ello era
consecuencia de que sustancias llamadas facto
res de iniciacin (FI), al activarse con ciertos
productos se transformaban en FI el que, al fi
jarse sobre m em branas celulares, funcionaba

401

como unidad de reconocimiento, iniciando el

m ecanismo. Entre esas sustancias activadoras
figuraban especialm ente los lipopolisacridos
de la pared celular de bacilos gramnegativos.
Actualmente, la existencia de los factores de
iniciacin ha sido descartada, y se sabe que la
reaccin se pone en marcha por intermedio de
los activadores de superficie (receptores), m o
lculas particulares generalmente cargadas po
sitivamente, ricas en grupos OH y muy pobres
en cido silico, existentes en membranas celu
lares, que facilitaran la formacin de interm e
diarios ms estables. E ntre esas sustancias,
adems de los lipopolisacridos sealados, fi
guran productos de la pared celular de levadu
ras (zimosn), polisacridos complejos, inulina,
etc., probablemente sin la participacin de in
munoglobulinas. La fijacin de C % a esas m o
lculas lo vuelve menos accesible a la degrada
cin por los factores I y H.
La remocin de cido silico de membranas
disminuye la fijacin de H a C3b unido a m em
brana y favorece la activacin del complemen
to por la va alterna. Membranas pobres en ci
do silico son buenas activadoras del com ple
mento por esta va, como ocurre con los eritro
citos de conejo. No acontece lo mismo con los
glbulos rojos de carnero pues sus membranas
tienen un alto contenido de cido silico.
El empleo de sueros deficientes en C2, que
carecen de la posibilidad de originar C3b p o r la
va clsica, ha demostrado que la IgA e IgE hu
manas y la IgG l de cobayo agregadas bajo la
forma de complejos Ag-Ac o por medios fsi
cos o qumicos son tambin sustancias capaces
de iniciar la activacin del complemento por la
va alterna. Cosa similar ocurre con los agrega
dos insolubles de IgG.
Las unidades de activacin, que llevan final
mente a la elaboracin de la convertasa de C5
de la va alterna, son las que luego hacen posi
ble la participacin de las unidades de ataque a
las membranas, las mismas que actan cuando
la activacin ocurre por la va clsica.
Para que la activacin de la va alterna tenga
lugar se requieren cuatro protenas. Por un me
canismo no especfico C3 nativo y e factor B
forman un complejo reversible que puede ser
activado por el factor D en presencia de
Como consecuencia de ello se forma C 3B o
C3Bb, enzima que inicia el clivado de C3 dan
do lugar a la formacin de pequeas cantidades
de C3b el que, si no est protegido, es inactiva
do por el factor I transformndose en C3bi. Por
accin de proteasas C3b se desdobla en C3c y
C3d. Una protena srica conocida como H al
fijarse competitivamente a C3b desaloja a Bb y
facilita la actividad olivante de I.
La segunda etapa requiere que el C 3b na
ciente se fije a un activador presente en una su

402

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

perficie. Una molcula de C3b puede unirse a la

membrana de la clula o volcarse a la fase flui
da. Cuando el C3b est unido a membrana fija
el factor B, el que despus de la fijacin se
vuelve susceptible de ser clivado por el factor D
y Mg2+ originndose C3bB o C3bBb, converta
sa de C3 y C5 lbil, de rpida inactivacin. Para
que esta enzima funcione eficazmente se nece
sitan no menos de 2 molculas de C3b unidas a
la superficie celular, ubicadas en forma adecua
da y ^ probable que crticam ente alineadas
(C3bnB o C3bnBb) (Sitio 1). La vida media de
esta enzim a es muy corta, slo 2 m inutos a
37C, de ah se infiere su reducida eficacia.
Los estudios llevados a cabo con tioster de
rivados de C3b son los que han perm itido a
Mller-Eberhard estimar cul debe ser el meca
C ir

nismo por el que C3 nativo se une a B para for

mar C3B o C3Bb. Ello se debera a que C3 na
tivo fijara agua en la fase fluida y al hacerlo
adquirira una estructura similar a la de C3b fi
jado a receptor. La cadena P de C3b, protegida
por la cadena a , estara bajo una forma metaestable, la que se estabilizara al unirse a un re
ceptor en la fase slida, posibilitando de esa
manera su unin al factor B. La unin de C3b a
la fase shda se hace a travs de tioster hidra
tado de la cadena y grupos OH de los hidratos
de carbono o grupos NH2 de protenas de la su
perficie receptora. Esta unin de tipo covalente
no es especfica (fig. 22-8).
Para que el factor B pueda transformarse en
Bb y participar en el mecanismo de activacin
de C3 es necesaria la presencia de iones Mg^+ y

C ir

C ls

Anticuerpo

li

Fe
Antgeno
1^ ETAPA: EA + C1q + C1r + C1s

IVIembrana eritroctaria

C4a

ETAPA: C1 + C4 + V - C4b
CT + C4b + C2 J !'? L c 4 b 2 b
Fig. 22-7. R epresentacin grfica de la cintica de la inm unohem lisis por accin del com plem ento (va clsica).

CT

Complemento

403

C6
C 3a
C3

C3

O
C6 A

C3a

C3b

[p

C3b

C7

c f

! ETAPA: C5b + C6 + C7 ^

3 ETAPA: C4b2b + C3

C5b67

C4b2b3b

C5

OC5a
! ETAPA: C5b67 + C8 ^C5b678

C9

48 ETAPA: C4b2b3b + C5

nC7

C5b

K+, Hb.

C 5bl

poli C9

_i|j^
IN a * . HjO
Fig. 22-7. Continuacin.

7 ETAPA: C5b678 + nC9

C5b-C9n - > |l i SIS|

Cada a forma
inactiva

Cistena
cido
glutmico

Membrana
F ig . 22-8. M ecanism o de fijacin de C3b a m em brana a travs del tioster activado de la cadena a.

404

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

del factor D. ste es una serina esterasa capaz

de ser inhibida por el DFP. La enzima (D) tiene
un precursor inactivo (D) que no es afectado,
por el DFP. Su peso molecular es de 25 kD y
est formada por una cadena peptdica simple.
La form a inactiva puede activarse por trata
miento con pepsina. Ambas formas de la enzi
ma estn presentes en el suero conjuntamente.
El factor D que es olivante y activante del fac
tor B (PM, 95 kD y movilidad [3) le escinde a
ste un pequeo pptido acdico llamado frag
mento Ba, de PM, 30 kD y movilidad a , y libe
ra el factor Bb de PM, 63 kD y movilidad y.
El fragmento Ba, que no participa en la acti
vacin del complemento por la va alterna, es
un pptido difusible que posee una muy discre
ta capacidad para inducir co n tractu ra de la
musculatura hsa.
A esta altura de la secuencia de activacin
de la va alterna entra en funciones una nueva
protena, la properdina (P), de PM 220 kD, for
mada por 4 subunidades de PM 53 kD unidas
no covalentemente, y de movilidad (3 o y segn
las preparaciones usadas para los ensayos por
los diferentes investigadores y que el medio so
porte para la corrida sea agar o agarosa. El
compuesto C3bnB o C3bnBb fija la properdina
y la activa (P), probablemente por un cambio
c o n fo rm a c io n a l, o rig in n d o s e C3bnBP o
C3bnBbP (Sitio 2), producto estable con activi
dad convertsica de C3 y C5 (vida media: 8
minutos a 31C).
Es interesante hacer notar que la properdina,
considerada como iniciadora de la activacin
de la va alterna en las primeras interpretacio
nes de este mecanismo, slo interviene en la
etapa final del proceso funcionando como estabilizadora. Parecera que no slo aumenta la vi
da media de la enzima evitando la disociacin
de Bb del complejo, sino que tambin la prote
ge contra inactivadores como el I.
La va alterna de activacin del complemen
to puede funcionar en ausencia de properdina
pero con una eficiencia muy reducida.
__
La C5-convertasa de la va alterna (C3bnBP
o C3bnBbP) al actuar sobre C5 lo desdobla en
C5a y C5b. ste, al fijarse a la membrana celu
lar capaz de ser lesionada, en un Sitio 3, facilita
la formacin de la unidad de ataque C5b-9, que
funciona de manera similar a la descrita en la
va clsica (fig. 22-9).
El C3b originado por las vas clsica o alter
na de activacin del complemento, al fijarse a
la membrana celular en el Sitio 1 inicia un m e
canismo de amplificacin de esta ltima va, ya
que en esas condiciones puede con el compo
nente B o Bb formar C3bnB o C3bnBb, la que a
su vez puede originar nuevas m olculas de
C3b. La estabilidad de la enzima por interme
dio de P lleva a la conversin de C5 y a la

puesta en m archa de las unidades de ataque

(fig. 22-10).
Si los hechos se desarrollaran normalmente
de esta manera, la activacin del sistema com
plemento por cualquiera de las vas llevara al
agotamiento de C3. Ello no ocurre porque hay
un inactivador, el factor I que se encuentra nor
malmente en el suero y que al actuar sobre C3b
lo inactiva. Este inactivador es efectivo sobre
C3b libre o unido a membrana, pero en este l
timo caso su accesibilidad es menor. Como ya
se indicara, su actividad se ve facilitada por la
protena H.
En algunos pacientes con glomerulonefritis
h ip o co m p lem en tm ica se ha encontrado el
C3factor nefrtico (C3NeF = C3 nefritic fa c
tor) que es un activador endgeno de la va al
terna. Es una inmunoglobuhna, la que se une a
C3bnBb formando C3bnBbNeF. Este complejo
funciona como convertasa estabilizada de C3 y
C5, es decir que el NeF cumple una funcin si
milar a la properdina. Se ha demostrado que el
NeF es un autoanticuerpo con especificidad p a
ra C3bnBb que reconoce un neoantgeno que se
expone en Bb.
En el cuadro 22-2 figuran las caractersticas
principales y la sinonimia de los componentes
que participan en la activacin del complemen
to por la va alterna.
R E C E PT O R E S DE C O M PO N EN TES
DEL SISTEMA COMPLEMENTO
R eceptores para C lq y C4
Si bien se ha sugerido la existencia de un re
ceptor para C lq unido a complejos inmunes en
la fase fluida, su naturaleza an no ha sido cla
rificada. Segn algunos autores, la porcin colgeno-smil del C lq en las condiciones indica
das se unira a la membrana de granulocitos,
monocitos y linfocitos B, hecho que tendra lu
gar a travs de un receptor. La funcin de este
receptor en esas clulas es desconocida.
La fijacin de C4 nativo a macrfagos peri
toneales de cobayo mantenidos en m onocapa
ha sido descrita. No obstante existen dudas de
que esa fijacin sea a travs de un receptor C4especfico.
Receptores para fragm entos de C3
Receptor de tipo (CRJ), Receptor para C3b
(CD35). Diversos estudios se han realizado p a
ra identificar un receptor presente en eritrocitos
humanos, macrfagos y hnfocitos B, que fija a
C3b monomrico, dimrico o polimrico inte
grante de complejos inmunes solubles y parti
culados. El nmero de CRl por eritrocito osci

Complemento
la entre 5-8 x 10*; 4 x 10* a 1,4 x 10= en los
granulocitos y 3-4 x 10'* en los linfocitos B.
Cuando C R l fija a C3b lo hace con un valor
del Ko del orden de 2-6 x 10^ M .
E ste receptor tiene un polim orfism o muy
marcado, con cuatro alelos codominantes que
difieren de sus pesos moleculares, oscilando en
tre 190 y 280 kD segn el alelo. Otra caracters
tica de este receptor es que presenta, al igual
que otras protenas del sistema complemento,
mltiples estructuras repetidas, una a continua
cin de otra, de aproximadamente 60 aminoci
dos y conteniendo 10 a 16 residuos muy conser
vados. Estas unidades son conocidas en la lite
ratura como short consensus repeats.
C R l, al fijar C3b a las clulas indicadas, faci
lita distintos mecanismos inmunolgicos en los
que C3b participa como la inmunoadherencia,
la fagocitosis, la citotoxicidad complemento de
pendiente y tambin, como ha sido demostrado
recientem ente, aum entando la produccin de
IL-2 por ciertos grupos de linfocitos T.
El receptor para C3b produce adems altera
ciones en este compuesto, actuando por esa cir
cunstancia como un excelente cofactor de I en
la transformacin d C3b en C3bi. Este efecto es
ms acentuado en la fase slida que en la fase
fluida, siendo su eficiencia, en este ltimo caso,
comparable a la del factor H.
Si bien el ligando preferido de CRl es C3b,
puede fijar tambin partculas que tienen adheri
do C4b, con una afinidad (Ko) inferior a la de
C3b.
Receptor de tipo 2 (CR2), Receptor para C3d,
(CD2I). Este receptor ha sido identificado en
linfocitos B, no as en macrfagos, granulocitos
y linfocitos T. La mayor parte de los linfocitos
B tisulares expresan receptores para C3b y C3d.
El receptor CR2, aislado de sobrenadante de
cultivos de clulas Raji, presenta caractersticas
de una glucoprotena de PM 72 kD. No se tiene
conocimiento de su nmero por clula ni de su
afinidad por el ligando. Este receptor fijara,
adems de C3d, el fragmento C3dg.
La funcin de CR2 es poco clara. Adems de
potenciar la citotoxicidad complemento-depen
diente en aquellos linfocitos que tienen CR2 y
C R l, parecera que permite a inmunoadheren
cia y suprimira la activacin linfocitaria en los
cultivos mixtos de linfocitos.
R eceptor de tipo 3 (CR3), R eceptor p a ra
C3hi (G D IIhi 18). Es un heterodmero consti
tuido por dos cadenas polipeptdicas: a de 170
kD (CD 11 b) y p de 95 kD (CD18), respectiva
mente. Investigaciones realizadas pareceran in
dicar que el fragmento C3dg, constitutivo de
C3bi, es el que actuara como ligando ante el re
ceptor. No se conoce con seguridad cul es el
nmero de CR3 por clula y la afinidad de la
unin al ligando.

405

La funcin de C3bi es similar a la de C3b, y

al unirse al receptor media reacciones de inm u
noadherencia y fagocitosis entre otras.
CR3 tiene adems capacidad de unin similar
a las leetinas, lo que le permite fijar ciertos hi
dratos de carbono presentes en la superficie de
microorganismos, facilitando la fagocitosis.
Receptor de tipo 4 (CR4), Receptor de C3bi
(G D I Id 18). Constituido por una cadena a de
150 kD (C D l le ) y una cadena P de 95 kD
(CD18), idntica a la cadena p del CR3. Est
presente en las mism as clulas que expresan
CR3 y su especificidad es tambin C3bi.
CR3 y CR4 forman parte de la familia de las
integrinas.
La denominacin de C R l, CR2, CR3 y CR4
a los receptores de C3b, C3d y C3bi h a sido
propuesta teniendo en cuenta que los sealados
no son los nicos ligandos de esos receptores.
Con ello se ha procurado poner ms atencin
en el receptor que en su especificidad para el li
gando.
Receptores para C4a, C3a, C5a y Ba
El clivaje de C4, C3, C5 y B da lugar a la
formacin de los pptidos C4a, C3a, C5a y Ba.
Todos ellos son biolgicam ente activos, pro
m oviendo con m ayor o m enor intensidad la
contraccin del msculo liso; los ms efectivos
son C3a y C5a.
Todos esos pptidos, al actuar sobre recepto
res existentes en diferentes clulas promueven,
adems de la contraccin de la musculatura li
sa, la liberacin de histamina por los m astoci
tos y de serotonina por las plaquetas. C5a indu
ce quimiotaxismo celular y adems incrementa
la expresin del nmero de receptores para C3b
en los granulocitos.
Se ha demostrado que C3a y C5a intervienen
como moduladores de la respuesta inmune. El
primero de ellos suprimiendo ciertas funciones
linfocitarias al actuar presumiblemente sobre
un tipo particular de clula supresora-inductora, en tanto que C5a ejerce una funcin potenciadora al inducir la produccin de IL-1 p o r los
macrfagos.
Las funciones descritas tienen lugar cuando
los pptidos difusibles C3a y C5a interactan
con los correspondientes receptores celulares.
En el caso de la unin de C5a con sus recepto
res presentes en granulocitos -unin que pro
mueve el quimiotaxismo-, el valor de la cons
tante de asociacin oscila entre 10 y 10 M".
Hasta el momento no se tiene conocimiento
de la naturaleza, caractersticas fisicoqumicas
y distribucin celular de los receptores de estos
pptidos difusibles originados por fragm enta
cin de algunos componentes del sistema com
plemento.

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

406

La unin del factor H polimrico a clulas

blastoides y linfocitos de sangre perifrica presu
miblemente induce la liberacin de factor I, que
es calcio-dependiente y energa-dependiente.

Receptor para el factor H

En linfocitos perifricos y en algunas lneas
celulares linfoblastoides B se ha demostrado la
existencia de un receptor para el factor H. Ello
se ha evidenciado por la adherencia a granulo
citos de partculas que tenan fijado el factor H.
El nmero de receptores por clula, determi
nado por estudios de interaccin ligante-ligando a saturacin es aproxim adam ente de 2 X
1Q5; este valor vara segn los autores.
Del receptor purificado no reducido se han
identificado cadenas peptdicas de PM 100 kD
y 50 kD y de 50 kD de la forma reducida.

C !D

MECANISMOS REGULATORIOS
DE LA ACTIVACIN
DEL COMPLEMENTO
En el suero del hombre y del cobayo han sido
hallados inhibidores e inactivadores del comple
mento. Ello es consecuencia de una necesidad
biolgica derivada de la accin de componentes
activados del complemento y de pptidos acti-

C3a

..........L

C3 B

C3 Bb
C3c

C3

l/H
proteasa

C3d

C3b

C3b

1- ETAPA: C3 + B + D ^

C3b (Fijacin de C3b a membrana)

C3a

( J g )

C3b

ETAPA: C3b + B + D

C3b

G3bBb + n C 3 b

F ig. 22-9. A ctivacin del sistem a com plem ento (va alterna).

-C3bnBb

Complemento

407

kC3a

C5

nC 5a
y

C5b

n-h
C3b
3^ ETAPA: C3bnBb + P - i^C 3 bnB bP

Bb

' ib

4 ^ ETAPA: C3bnBbP + C5 ^C5b

C3bnBbP + C3 CSb
(El C3b formado puede unirse a
membrana y amplificar la va alterna)
C7
C6

C8

C 9

C5b

^Na*, HjO
5^ ETAPA: C5b + C 6, C7, C 8, n C 9 ^ s ^ C5b-C9n

[Q ^

Fig. 22-9 (cont.). A ctivacin del sistem a com plem ento (va alterna).

vos originados de ellos, cuya permanencia po

dra resultar perjudicial para el organismo.
Uno de ellos es el inhibidor de C l esterasa
(Clinh), denominado tambin a^-neuraminoglicoprotena, de PM 104 kD y movilidad electro
fortica de a ,. Tiene un alto contenido de hidra
tos de carbono, 40%, y su estructura es la de una
cadena peptdica simple segn algunos autores,
en tanto que otros admiten que est formado por
subunidades de PM 18,5 kD. Su concentracin
srica es de 180 |i.g mi '. Este inhibidor acta
tambin sobre las plasm a kalicrenas. Form a
parte de la superfamilia de las serpinas, inhi
bidores de proteasas de serina. En pacientes con
edema angioneurtico hereditario hay disminu
cin de los niveles de C linh y en ellos se obser
van edemas no inflamatorios en reas localiza
das, pudiendo originar la muerte por asfixia si se
localizan en la laringe. Toda esta sintomatologa
se debe a la falta de inhibicin de la C ls, que
adems provoca una disminucin de los compo
nentes C4 y C l, pues stos son, como ya se ha
visto, sus sustratos naturales.

C3b, por accin del factor I, es clivado en

los fragmentos C3c y C3d. El factor I tiene un
peso molecular de 93 kD y movilidad electro
fortica de P 2globulina. Est com puesto por
una cadena a (55 kD) y una cadena p (42 kD)
unidas por puentes disulfuro. Su concentracin
srica aproximada es de 50 |ig m i '. Su fun
cin biolgica es la de regular C3b, ya que si
as no ocurriera ste actuara como un am plifi
cador permanente de la va alterna, con el con
siguiente consumo de C5-9. El factor I acta
tambin sobre C4b inactivndolo.
El componente C4bp (C4 binding protein),
que ms que un inhibidor sera un regulador de
la convertasa de C3 de la va clsica, es un
multm ero de PM 1.300-1.500 kD, resultante
de la unin no covalente de monmeros de PM
550 kD, que a su vez estn constituidos por 8
subunidades de PM 70 kD unidas entre s pior
uniones disulfuro. El C4bp acelera la disocia
cin de C4b2b que lleva a la formacin de C2i,
actuando a la vez como cofactor en el clivaje
de C4b por I, proceso que da origen a C 4c y

408

Mecanismos efectores de ia respuesta inmune

V IA C L S IC A

C -q u in in a s-

^ In m u n oa d h ere n oia -

P
C 3B B
(lbil)

^C 3blN A^,

C 3 b '< '

C 3b n B P
^ (estable)

,
^C 3b

M O D IFIC A C IO N
D E LA
P E R M E A B IL ID A D

> 'C 3,C 3d

________________ _
fragm ento-B

4 F A G 0 C IT 0 S IS k

->C3a-anafilotoxina

fQ-gl
C5b

- B f - B + D + Mg2*
C 3 b n 4" y

de, .

a m p lific a c i n

C3i

C 3a

Lipo po lisacrid os,

inulina, polisidos, etc.
IgA, IgE, lg G 4 h um an as
a g re g a d a s (Ac-Ag),
Ig G l co b a yo (A c-A g)

l/H

|
i
i
|

B + C 3 + D + Mg2*
FA S E FL U ID A
V A a l t e r n a

V a de activacin c l sica
jiB , Inhibicin de activacin

\ V a de activacin altem a

Producto de inactivacin

F ig. 22-10. In te rre la c i n e n tre c o a g u la c i n , f ib rin lisis , g e n e ra c i n d e q u in in a s y a lg u n o s c o m p o n e n te s d e l c o m p le m e n to ,

y a c tiv id a d d e lo s p r o d u c to s o rig in a d o s.

C4d. Su contenido en el suero es de 250 ig

m l'.
El componente H, de PM 150 kD, es una beta-globulina constituida por una sola cadena
peptdica. Su funcin es la de regular la expre
sin de la convertasa de C3 de la va alterna
(C3bBb). Ello lo consigue inhibiendo competi
tivamente la combinacin de B con C3b, au
mentando a su vez el clivaje de C3b por . La
actividad de H est regulada por el cido sili
co de las membranas celulares, el que favorece
la unin de H a C3b. Las membranas pobres en
cido silico facilitan la activacin del comple
mento por la va alterna al dificultar la partici
pacin de H. La concentracin srica de H es
de 400 |ig ml >.
DAF (decay acelerating factor), factor que
acelera la cada de la actividad de las convertasas de C3, es una protena de 70 kD, conocida
tambin como CDS5. Esta protena no se en
cuentra en el plasm a, sino que est unida a
membranas celulares por unin fosfatidilinosi
tol. Decae la actividad de las convertasas de C3
de ambas vas, actuando en los tejidos propios
del husped. Actta como cofactor de C3b y
C4b para su clivado por el factor L
Otra protena reguladora de la va clsica es
MCP (protena cofactor, de membrana), de 5863 kD e identificada como CD46. Se encuentra
unida a membrana por unin fosfatidilinositol

y cumple una funcin similar a la de DAF, ac

tuando como cofactor de C4b y C3b para su
clivado por el factor I.
Ha sido descrito un inactivador de C6, con
movilidad electrofortica de p l globulina. Una
forma inactiva de C8, obtenida a partir de la
forma hemolticamente activa, a pH 7,5 y fuer
za inica baja, bloquea la capacidad de EACI-7
de fijar C8 activo.
El llamado inactivador de anafilotoxina, una
a globulina de PM 310 kD que responde a las
caractersticas de la carboxipeptidasa N, supri
me la actividad anafilotxica de C3a y C5a d i
vn do la arginina C -term inal de estos com
puestos. La capacidad leucoquim iotctica de
los mismos no se modifica.
Algunas enzimas pueden modificar compo
nentes del complemento. La plasmina, derivada
de su precursor, el plasmingeno, puede trans
formar C ls en C ls sin la intervencin de C lq y
C lr, e incluso destruye la actividad funcional
del factor L Plasmina y tripsina pueden clivar
C3 y C5 originando las anafilotoxinas C3a y
C5a.
Adems de los inhibidores e inactivadores
citados, existe en el plasma la protena S, que
acta en la etapa terminal de la secuencia de
activacin del sistema complemento durante la
formacin del componente de ataque a m em
brana (MAC). Su funcin es la de restringir la

Complemento
lisis a aquellas m em branas portadoras de la
convertasa de C5, previniendo la lisis de otras
clulas existentes en el medio que no se en
cuentren en esas condiciones. En ausencia de la
protena de control, clulas vecinas no sensibi
lizadas pueden Usarse por fijacin de los com
plejos C5b-6 o C5b-7 que son liberados al m e
dio por las clulas activadoras. Sobre el parti
cular conviene recordar que algunas bacterias,
en especial salmonelas que han sufrido el ata
que del complemento, pueden liberar con faci
lidad los citados intermediarios, que podran fi
jarse a nuevas clulas e iniciar su dao, sobre
todo en focos inflamatorios. Para que ello no
ocurra se necesitan sistemas de control, partici
pando en ese mecanismo la protena S, gluco
protena monocatenaria de PM 88 kD, que actia bloqueando en la fase fluida los sitios de
unin a membrana de los complejos C5b-7. Es
tos complejos unidos a la protena S permiten
la fijacin de C8 y de slo 2 o 3 molculas de
C9 por cada com plejo C5b-9, bloqueando la
polimerizacin del ltimo componente. Por es
te mecanismo se evita el consumo inefectivo de
C9 y se convierte al complejo en un producto

C5 C S b

409

soluble en agua. E sta transicin antiflica-hidroflica ocurre por fijacin de 2 o 3 molculas

de S a los sitios hid ro f b ico s de fija c i n a
membrana de los complejos C5b-7 y C5b-8. La
falta de polimerizacin de C9 originan com ple
jos que carecen de estructura tubular, a diferen
cia de lo que ocurre cuando los componentes
del complemento estn unidos a mem branas.
La figura 22-11 esquematiza lo expuesto.
Es un hecho bien conocido que la efectivi
dad del complemento es mayor cuando su acti
vidad se ejerce sobre eritrocitos y otras clulas
hemticas heterlogas, en tanto que es menor
cuando las clulas son homlogas. En los lti
mos aos se ha encontrado explicacin a este
hecho, al demostrarse que hay dos protenas de
m embrana localizadas en una variedad de clu
las que bloquean la formacin del complejo
de ataque a m em brana (MAC). Estas prote
nas son el factor de restriccin ho m lo g a
(HRE) y CD59, las que protegen las clulas del
propio individuo contra la posible lisis induci
da por com ponentes hom logos del co m p le
mento. Actan unindose a C8, impidiendo la
unin de C9 y su insercin en la m em brana
plasmtica. Slo bloquean la unin si el com
plemento y las clulas a lisar son de la misma
especie.

C o n v erta sa
d eC 5

C 5a

OTROS MECANISMOS
INM UNOLGICOS EN LOS
QUE PARTICIPA EL COMPLEMENTO

t
C 5b
C6

I
C 5b6

M C 5b -7
(Insercin
en m em b ran a)

'

M C 5b-8
1 0 -1 6 C 9

M C 5b-8 poli-9
FORIVIACIN DE CANAL
TRANSMEIVIBRNICO

S C 5 b - 7 (F a s e
I
fluida)
C8

S C 5b-8

2C 9

S C 5b-9
CONTROL

Fig. 22-11. M ecanism o de control de los com plejos C5b-7

de la fase fluida. P o r com binacin con la protena S dei
p lasm a se inhibe la p o lim erizaci n de C9 y su u n i n a
m em brana.

Si bien en los fenmenos de hemlisis y citlisis especfica intervienen todos los com po
nentes del complemento descritos, otros, tales
como la conglutinacin, inmunoadherencia, fa
gocitosis, formacin de factor leucoquimiotxico, produccin de anafilotoxina, etc., se desa
rrollan con la participacin de slo algunos de
ellos, los que tienen intervencin activa en los
mecanismos de la inflamacin.

Formacin de anafilotoxina
A partir de C3 y C5 pueden obtenerse dos
sustancias distintas, de bajo peso m olecular,
llamadas anafilotoxinas, las que se caracterizan
por provocar contractura de la musculatura lisa,
m odificaciones de la permeabilidad capilar y
choque anafilctico generalizado. Este efecto
puede inhibirse con antihistamnicos, lo que in
dica que las anafilotoxinas son liberadoras de
histamina.
Cuando C3 es tratado con C3 convertasas
(C4b2a, C3bBb), complejo P-globulnico cons
titutivo del factor aislado del veneno de vbora
cobra (CVF), tripsina o plasmina, se obtiene
C3a, de peso molecular aproximadamente 9 kD

410

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

y con actividad anafilotxica. Los productos

que se obtienen con la C3 convertasa y el CVF
son ms activos que los logrados con la tripsi
na, la que puede no liberar anafilotoxina si pro
longa su accin sobre C3.
Si so b re C5 se h a c e a c tu a r C 1 4 b 2 a 3 b ,
CSbnBbP, o tripsina, se obtiene un producto
llamado C5a, de peso molecular aproximada
mente 12 kD que tambin se comporta como
anafilotoxina. Es distinta de la obtenida a p ar
tir de C3, lo que queda demostrado por su ca
pacidad para contraer un trozo de msculo liso
previamente transformado en no reactivo por
agotam iento con C3a anafilotoxina. La C5a
anafilotoxina es 500 veces ms activa que la
C3a.
Si bien no ha sido dem ostrado, se supone
que ambas pueden actuar in vivo como libera
doras de histamina. C3a y C5a estn bajo es
tricto control in vivo. Una enzima circulante,
la carboxipeptidasa N, los inactiva al escindir
les la arginina C-terminal. Si bien C3a des-Arg
y C5a des-Arg no tienen actividad anafilotxi
ca, conservan su capacidad para inducir leucoquimiotaxismo.
El componente C4a, resultante del clivaje de
C4, tiene una actividad similar a C3a, aunque
m enos efectiva. Una accin sim ilar ha sido
descrita por Ba.
Formacin del factor leucocitoquimiotctico
Los complejos antgeno-anticuerpo pueden
in vitro, o in vivo si estn en presencia de suero
fresco, inducir la formacin de sustancias mar
cadamente quimiotcticas para los neutrfilos.
En su elaboracin participa el complemento, lo
que ha sido bien demostrado in vitro mediante
el empleo de cmaras de difusin con membra
nas de permeabilidad seleccionada. Colocando
polim orfonucleares en uno de los com parti
mientos de la cmara y en el otro complejos
Ag-Ac a los que se les adicionaron los distintos
com ponentes del com plem ento, se pudo de
mostrar que C3a y C5a eran quimiotcticos. La
actividad fue establecida sobre la base de la ca
pacidad para inducir el pasaje de los polimorfo
nucleares del compartimiento en que se encon
traban al que tena el com plejo Ag-Ac y los
componentes del complemento. El mecanismo
de la adquisicin de la actividad quimiotctica
no ha sido investigado. Se supone que actan
como activadores de una proesterasa presente
en la membrana de los polimorfonucleares neu
trfilos, proceso que sera indispensable para la
migracin.
La atraccin de los leucocitos por quimiotaxismo, que sigue a la fijacin del complemento
in vivo a com plejos antgeno-anticuerpo, es

parte esencial del mecanism o que lleva a la

produccin del fenmeno de Arthus, el que se
describe en detalle en el captulo 32.
Inmunoconglutinacin
y conglutinacin
La inmunoconglutinacin (IK) consiste en la
aglutinacin de clulas que tienen fijado com
plemento y es originada por anticuerpos contra
determinantes antignieos ocultos de C3 o C4 y
que quedan expuestos despus de su fijacin al
complejo antgeno-anticuerpo. Las inmunoconglutininas se forman contra el com plem ento
autlogo, pero su formacin depende de la apa
ricin de los determinantes de ste que surgen
durante la fijacin, C3 y C4 no fijados no for
man inmunoconglutininas.
La conglutinacin (K) es originada por una
sustancia llamada conglutinina, presente en el
suero bovino, y que no es una inmunoglobuli
na. Su peso molecular es 75 kD y el coeficiente
de sedimentacin 7,8S. Cuando a clulas que
han fijado anticuerpos especficos y com ple
mento se les aade albmina bovina al 25% (ri
ca en conglutinina), se produce aglutinacin.
Ello se debe a que dicha sustancia tiene capaci
dad para fijarse a hidratos de carbono presentes
en C3. La conglutinina se fija tambin al zimosn (poiisacrido de la levadura de cerveza) y
com o el grupo re a c tiv o del m ism o es u n a
a - 1-2-manotriosa, se supone que dicho grupo
est presente en C3. Para que la reaccin se
produzca, es necesaria la presencia de un factor
activante del conglutingeno (KAF), presente
en el suero fresco, y de Ca^+. Los quelantes in
hiben la reaccin. Se ha demostrado que KAF
y el factor I son una misma sustancia.
Inmunoadherencia y fagocitosis
La inmunoadherencia consiste en la fijacin
de complejos antgeno-anticuerpo-complemento a la superficie de partculas no sensibiliza
das, como hemates, leucocitos, plaquetas, y
aun partculas inertes como grnulos de alm i
dn. Para que la reaccin tenga lugar, es nece
saria la fijacin de C3, resultando activos los
p ro d u c to s E A C 1 4 b 2 b 3 b , E A C 1 4 b 3 b y
EAC4b3b.
T eniendo en cu enta que este m ecanism o
puede desarrollarse in vivo, se estima que en
las infecciones microbianas y virales, los agen
tes infecciosos, al ser anclados a la superficie
de los hemates va receptor para C3b o C R l,
pueden ser captados ms fcilm ente por los
macrfagos. A ello cabe aadir que en los m a
crfagos hay receptores para C3b. La fagocito
sis se ve por lo tanto favorecida por el comple
mento.

Complemento

411

Fig. 22-1 lA . I n te rre la c i n e n tre c o a g u la c i n , f ib r in lis is , g e n e ra c i n d e q u in in a s y a lg u n o s c o m p o n e n te s del c o m p l e

m ento.

Quininas
Una sustancia sim ilar a las quininas, la Cquinina, es liberada por accin de C ls sobre
C2. El pptido originado, que es diferente de la
bradiquinina, es vasoactivo y aumenta la per
meabilidad vascular.
Clase I

IN T E R R E L A C IO N EN TR E
C O M P L E M E N T O Y O TR O S SISTEM A S
Otros sistemas sanguneos, como la coagula
cin, fibrinlisis y generacin de quininas, es
tn interrelacionados con el sistema co m p le
mento, y algunos de sus componentes pueden
Clase I

Clase I

21-hidroxiasa
DP, DQ, DR: genes CMH clase II
B, C, A: genes CMH clase I
C2, Bf, C4A, C4B: genes que codifican para los componentes
del complemento C2, B, C4A y C4B
C4A y C4B codifican dos protenas funcionalmente no diferenciables
C4 y C2 son polimorfos
21A y 21B: genes de la 21 -hidroxilasa
HSP: genes de las protenas de cioque trmico (ieat shock protein)
tipo 1 y 2
TNF: genes del factor necrosante de tumores, tipo a y p
Fig. 2 2 - l l B . U b ic a c i n d e los g e n e s q u e c o d if ic a n p a ra a lg u n o s d e lo s c o m p o n e n te s d e l s is te m a c o m p le m e n to .

412

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

ser activados o potenciados en su accin como

consecuencia de ello. Cabe sealar la influen
cia del factor de H agem an activvdo, el que,
adems de iniciar la secuencia de la coagula
cin, interacta con el plasmingeno originan
do plasmina, la cual, como ya se ha indicado,
puede activar componentes del complemento.
Adems, la plasmina puede clivar el factor de
Hageman activado, originando fragmentos que
actan en forma activa en la conversin de precalicrena en calicrena, la que a su vez d iv a el
quiningeno originat\do bradiquinina, sustancia
vasoactiva y quim iotctica que interviene en
los fenmenos de inflamacin. En esos proce
sos tambin se forma el factor Kf, con capaci
dad para hacer que CT reaccione ms eficaz
mente con C4 y C2 (fig. 22-11 A).
GENES QUE CODIFICAN
PARA PROTENAS
DEL SISTEM A COMPLEMENTO
Teniendo en cuenta la homologa de sus se
cuencias, los componentes del sistema comple
mento han sido incluidos en diferentes familias
de genes.
Un grupo de estas protenas que fijan C4b y
C3b, entre las que se incluyen C4bp, factor H,
C R l, CR2, DAF, MCP y factor B, se caracteri
zan por presentar repetidas mltiples pequeas
estructuras, dispuestas una a continuacin de la
otra (short concensus repeats: SCRs) las que
constituyen una parte significativa de las es
tructuras totales de esas protenas. En este sen
tido cabe m encionar que C R l co n tien e 34
SCRs y que el factor H est constituido por 20
SCRs. Estas estructuras constan de 60 a 70
aminocidos, con 10 a 16 residuos muy conser
vados, entre los que se incluyen 4 cistenas que
forman dos puentes disulfuro intracadena origi
nando un doble bucle o loop, proveyendo la
conformacin adecuada para la fijacin de C3
y C4. Estas estructuras han sido bien observa
das en otras protenas que no forman parte del
sistema complemento, desconocindose la fun
cin que pueden cumphr.
Otras protenas del sistem a com plem ento
son miembros de otras familias de genes, cum
pliendo funciones similares y presentando se
cuencias de aminocidos que son crticas para
el cumplimiento de esas funciones. Las serinoesterasas factor 1, factor B, Clr, Cls y C2 pre
sentan secuencias homlogas, incluso con otras
serino-esterasas no integ ran tes del sistem a
complemento como tripsina y quimiotripsina.
Clinh, inhibidor de esterasas de serina, for
m a parte de la superfam ilia de las serpinas
(erine-proteasa-activactor), en las que se
incluyen otras protenas inhibidoras de estera
sas de serina como la al-a n titrip sin a y anti-

trombina II. Estas protenas mimetizan el sitio

reactivo del sustrato, logrando desviar la fija
cin normal de la proteasa.
C3 y C4 son miembros de una pequea fami
lia, que tambin incluye a la a2-macroglobulina, caracterizadas por presentar uniones tioster
intemas, las que como ya se indicara, al produ
cirse su apertura por hid r lisis, facilitan .la
unin de estos componentes a fases slidas.
La properdina est constituida por seis m
dulos contiguos, de 60 aminocidos cada uno,
los que fueron originariamente descritos en la
trombospondina, una protena de adhesin de
420 kD secretada por las plaquetas. Tres triptfanos y seis cistenas estn presentes, y pare
ciera que stas forman tres puentes disulfuro
intramodulares los que originaran una unidad
independientemente plegada.
Varias de las protenas del sistema comple
mento presentan un estrecho encadenamiento
crom osm ico de sus m iem bros. A s C 4bp,
DAF, CRl y CR2 protenas de regulacin que
contienen SCRs homlogos se encuentran dis
tribuidos en un segmento de 950 kb de ADN,
ubicado en el brazo largo del cromosoma 1, co
nocido como grupo de genes reguladores de la
activacin del complemento (RAC). En el hom
bre, los genes que codifican para C2, C4 y fac
tor B se encuentran ubicados en el cromosoma
6, entre los locus del Complejo Mayor de H is
tocompatibilidad (CMH) de clase II HLA-DR y
clase I-B (fig. 22-1 IB). A estos genes ligados al
CMH, generalmente se los designa de clase-Ill.
EL COMPLEMENTO EN LAS
DIFERENTES ESPECIES ANIMALES
En los distintos vertebrados adultos ha sido
demostrada la presencia del complejo polimolecular que constituye complemento, aunque
no en todos los casos, segn la especie animal,
con la misma actividad. Numerosas investiga
ciones llevadas a cabo con suero de vaca, palo
ma, caballo, gato, rana, etc., demuestran un dis
tinto comportamiento segn la especie animal
de que se trate y en especial del sistema que se
utilice para verificarlo. Los resultados varan
segn se empleen sistemas hemolticos consti
tuidos por glbulos rojos de diferentes especies
anim ales, sensibilizados con sus corresp o n
dientes antisueros o, como ha ocurrido en otros
casos, mediante el estudio de la accin bacteri
cida sobre ciertos m icroorganism os, como el
Haemophilus influenzae. Para este sistema, el
co m p lem en to de cobayo p r c tic a m e n te se
m uestra inactivo, cosa que no ocurre con el
suero humano y de conejo.
En las lampreas se ha descrito una sustancia
opsonizante con caractersticas similares a C3.

Complemento
En tiburones se han identificado dos protenas
anlogas a C8 y C9 que participaran en la se
cuencia de ataque citoltico a membranas. En
este caso, las funciones de C3, C5, C6 y C7 son
ejercidas por un tnico producto similar a C3,
que por interaccin con C8 y C9 induciran las
lesiones. En la trucha arco iris se han identifi
cado cuatro componentes: C5, un anlogo de
C6 o C7 de los m am feros, y C9, los que al
unirse al complejo C3 originaran el dao en la
membrana celular.
La actividad del complemento, m edida en
funcin de su actividad hemoltica frente a gl
bulos rojos de carnero sensibilizados, vara en
las diferentes especies. En el suero fresco de
cobayo se dosan de 300 a 400 unidades hem o
lticas 50% (CHjg); en el hombre, entre 80 y
100; en el conejo, de 40 a 60 unidades, en tanto
que otras especies, como el ratn y el caballo,
efectuando el dosaje en las mismas condiciones
que en los casos anteriores, prcticam ente se
muestran como inactivas. Ello se debe a que la
concentracin de los distintos componentes no
es la misma en todas ellas; as por ejemplo, en
la vaca y en el caballo hay valores bajos de C2,
en tanto que en la oveja hay valores bajos de
C2 y C4. Pero no hay que olvidar tampoco que,
como algunas de las etapas de reaccin de fija
cin del complemento son reversibles, como la
EA14b2b que revierte a EA14b, hecho depen
diente de la tem peratura y la especie animal,
los resultados obtenidos en las valoraciones del
com plem ento pueden estar influidos por esa
circunstancia. A ello cabe aadir que algunas
lneas endocriadas de animales, especialmente
ratones, son deficientes en com ponentes del
complemento.
Dado que el complemento de cobayo es uno
de los que mejor se comportan para los ensayos
de inmunohemlisis y reacciones de fijacin de
complemento, es el que preferentemente se usa
para estos tipos de estudios.
ORIGEN DEL COMPLEMENTO
Numerosos trabajos han sido realizados para
determinar el origen del complemento y ha ha
bido comunicaciones iniciales en las que se su
puso que las fuentes de origen eran los leucoci
tos. Hoy sabemos que el complejo conocido
con el nombre de complemento est constitui
do por varios com ponentes presentes en el
plasma sanguneo y que responden a las carac
tersticas de las globulinas; de ah que la mayor
parte de los trabajos realizados ltim am ente
hayan sido dirigidos en este sentido. En cierto
modo tiene im portancia conocer el origen del
complemento, ya que perm itira com prender
mejor las modificaciones de sus niveles como

413

consecuencia de ciertas enfermedades que pue

den afectar rganos diversos; saber si la snte
sis de las globulinas inmunes en el tejido linf
tico corre paralela a la del complemento y, ade
m s, ten er conocim iento de si los distin to s
componentes son elaborados por un m ism o sis
tema o por sistemas diferentes.
Ha habido intentos por parte de distintos in
vestigadores con el objeto de establecer el o los
rganos que lo elaboran. En su m ayora han
usado el mtodo que consiste en provocar un
dao en determinado rgano y medir luego los
niveles de complemento circulante. Provocan
do daos en la clula heptica mediante la ino
culacin de tetracloruro de carbono o clorofor
mo, se pudo demostrar la disminucin del com
plemento circulante. Estas experiencias no son
concluyentes en este sentido, ni tampoco otras
investigaciones sobre el particular, entre ellas,
ensayos a efectos de demostrar la formacin de
complemento in vitro, utilizando para ello cul
tivos de tejidos. Todas estas operaciones y la
medicin del complemento elaborado resultan
sum amente difciles, sobre todo porque algu
nos de los componentes no son estables a la
tem peratura del cultivo, o por los inhibidores
de su actividad que puedan paralelamente desa
rrollarse. En cultivos de tejido de hgado y de
bazo provenientes de cobayo se ha comproba
do aumento de C2.
Como consecuencia de haberse establecido
que algunos componentes estn identificados
com o seroprotenas definidas, fciles d e de
m ostrar por inmunoelectroforesis, como C3 =
P,C y C4 = PjF, se han hecho una serie de in
vestigaciones sobre cultivos de tejidos de coba
yo, ratn, rata, mono y hombre, en las que se
ha tratado de dilucidar cules son los tejidos de
rganos que muestran incremento de estos dos
componentes. La identificacin se hizo p o r in
munoelectroforesis y autorradiografa, m edian
te el aadido de aminocidos con 'C a los me
dios de cultivo, establecindose la actividad de
sntesis por la cantidad de P,C y P,E que pre
sentaban radiactividad. En todas estas investi
gaciones se ha podido comprobar que el hgado
y los tejidos linfoides, en especial bazo y gan
glios, son los principales formadores de estos
com ponentes, actividad com partida tam bin
por la mdula sea y algunos otros tipos de te
jidos. En los macrfagos se ha demostrado ca
pacidad de sntesis para C2, C4 y C5, y de C lq
y C ls por el epitelio intestinal.
Como corolario de las diferentes investiga
ciones realizadas, hoy sabemos que las prote
nas del sistema complemento son sintetizadas
por el hgado, aunque en otros sitios extrahepticos tambin se sintetizan (monocitos, m acr
fagos, clulas epiteliales del tejido gastrointes
tinal y sistema genitourinario, fibroblastos).

414

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

EVOLUCIN ONTOGNICA
Y FILOGNICA DEL SISTEMA
COMPLEMENTO
No existen datos precisos sobre la evolucin
ontognica de los diferentes componentes del
complemento. La actividad hemoltica total del
complemento ha sido demostrada en sueros de
fetos de oveja, de cerdo y de vacuno provenien
tes de muestras de sangre obtenidas lo ms pre
cozmente posible. A las nueve semanas de ges
tacin se ha podido detectar C3 y C4 en el cor
dn umbilical de fetos humanos. La actividad
hemoltica del suero fetal humano y de recin
nacidos es inferior a la del adulto, alcanzando
los niveles de ste entre los 3 y 6 meses de vida.
En relacin con la evolucin filognica del
sistema complemento, no se ha podido demos
trar actividad hemoltica por el mtodo clsico
en la hemolinfa de invertebrados, crustceos y
peces gelatinosos. Algunos vertebrados inferio
res tienen sistemas muy similares al com ple
mento de los mam feros. U ltim am ente se ha
sostenido que en algunos invertebrados podran
existir componentes de ia va de activacin al
terna del complemento, lo que hara suponer
que esta va podra ser ms prim itiva que la
clsica.
VARIACIONES DE LO^ NIVELES
SRICOS DEL COMPLEMENTO
En algunas patologas y en casos de d efi
ciencias congnitas, los n iveles sricos del
complemento total o de algunos de sus compo
nentes pueden experimentar variaciones.
En el hom bre se han descrito deficiencias
congnitas de C2 y en ellas las concentraciones
sricas de este componente son nfimas con re
lacin a los nrmales, lo que hace que la acti
vacin del sistema complemento por la va cl
sica sea prcticamente nula. No obstante, la va
alterna funciona normalmente, por lo que estas
deficiencias, en lo que a resistencia a las infec
ciones se refiere, no alcanzan mayor trascen
dencia. Se han descrito tambin deficiencias de
C3, C5, C6, C7, C ir y de algunos inhibidores e
inactivadores de componentes del sistema com
plemento, entre ellas las deficiencias de C3b
inactivador (I) y de C l inhibidor (C linh). En el
primero de los casos hay un exagerado catabo
lismo de C3, y en el segundo, como consecuen
cia de la falta de inactivacin de C ls, hay con
sumo de C4 y C2 srico y se producen edemas
no inflamatorios del tejido subcutneo y de la
m ucosa del tracto respiratorio y alim entario
que pueden llevar a la asfixia. A este cuadro
clnico se lo conoce con el nombre de edema
angioneurtico hereditario.

D eficiencias de com ponentes del com ple

mento han sido tam bin descritas en cobayo
(C4), ratn (5) y conejo (C6).
En la mayora de las deficiencias de compo
nentes del complemento hay una marcada sus
ceptibilidad a las infecciones microbianas. Para
ms informacin vase captulo 30.
Los niveles de los componentes del comple
mento pueden estar modificados en algunas pa
tologas como el lupus eritematoso sistmico,
la artritis reumatoidea, la glomerulonefritis hi
pocomplementmica, la nefritis postestreptoccica, la anemia hemoltica autoinmune, etc. Es
tas variaciones dependen de la va que se acti
ve, ya que en alguna de ellas lo est la clsica,
en otras la alterna y en algunos casos, ambas.
LISIS DE GLBULOS ROJOS POR
COMPLEMENTO EN AUSENCIA
DE ANTICUERPOS
_Si a glbulos rojos de carnero se les aade
C l (C l esterasa), esto es, el primer componen
te activado y luego los restantes componentes
del complemento, aadidos en orden de fija
cin, al agregar C9 se produce la lisis. Ello se
debe a que C l se aade bajo la forma de estera
sa activa, que no necesita del anticuerpo para
su conversin. A partir de esa esterasa se pro
ducir la activacin de C4 y C2, y luego, conti
nuando con el encadenamiento, se originar el
complejo citoltico C5b-9, que es el que produ
ce el dao celular y la siguiente hemlisis. Esto
se consigue con C ls, y no es indispensable la
presencia de C lq y C ir.
CURVA DE HEMOLISIS EN FUNCIN
DEL COMPLEMENTO
Hasta no hace mucho tiempo, la actividad
complementaria de un suero era determinada
por la menor cantidad suya capaz de producir
el 100% de lisis del sistema hemoltico ensaya
do. En los ltimos aos, los estudios sobre ci
ntica de la inmunohemlisis han demostrado
la m ayor sensibilidad de estas valoraciones
cuando se establece el ttulo sobre la base de la
dosis que produce el 50% de lisis de los hema
tes del sistema.
Ello tiene una explicacin clara si se analiza
la curva que resulta de graficar los porcentajes
de hemlisis en funcin de la cantidad de com
plem ento (fig. 22-12). Puede observarse que
dicha graficacin no es una recta, sino una cur
va sigmoidal, con una marcada pendiente en la
zona que va del 25 al 75% de hemlisis aproxi
m adam ente, con una depresin inicial y una
marcada cada que se contina en forma gra-

Complemento

415

oportunidades hay lisis espontnea de hema

tes, que se reflejan en el blanco, se recomienda
la adicin de 0 ,1% de albmina bovina o de ge
latina al buffer, la que debe ser aadida des
pus de la dilucin a isotona.
Preparacin de la suspensin de hemates
Sangre de oveja obtenida por puncin yugu
lar se mezcla por agitacin suave con un volu
men igual de solucin de Alsever (glucosa-citrato), siendo recomendable la siguiente:
0,05 0,1

0,2 0,3

0,4 0,5 0,6 0,7

0,8 0,9

Suero fresco de cobayo diluido 1:100

Fig. 22-12. Curva obtenida por graficacin de los p o rcen
tajes de liemlisi.s de un m ism o volum en de sistem a hem oltco frente a cantidades variables de com plem ento. Su
aspecto sigm oidal es caracterstico: m uestra una pendiente
p ronunciada para los valores com prendidos entre 25% y
75% de lisis.

dual en los tlltimos tramos de la curva. De todo

esto se deduce que, cuando se hacen cuantificaciones de C o reacciones de fijacin del com
plemento con lecturas del 100% y 50% de he
mlisis, el consumo de pequetias cantidades de
ese complemento acusa una sensibilidad total
mente diferente en ambos casos.
R EA C TIV O S NECESARIOS PARA LA
VALORACIN DEL COMPLEMENTO
Diluyente
A efectos de asegurar una fuerza inica ade
cuada, un pH estabilizado y la concentracin
ideal de calcio y magnesio para que la fijacin
del com plem ento se realice en condiciones
ideales, en todas las operaciones relacionadas
con la valoracin del complemento o reaccio
nes de fijacin del complemento no debe em
plearse solucin fisiolgica como diluyente o
lquido de lavado para los hemates de carnero,
sino una solucin tam ponada que rena tales
condiciones; la ideal es la descrita por Mayer.
Para su preparacin, disolver 83 g de NaCl y
10,19 g de veronal sdico en aproximadamente
1.500 ml de agua destilada; atiadir HCl N hasta
pH 7,5 (aproximadamente 31 ml) y 5 ml de una
solucin que contenga 1 M MgCl^ y 0,3 M
CaClj, completando luego con agua destilada
hasta 2.000 ml.
Para el uso, diluir 1/5 en agua destilada, vi
gilando el pH que debe ser 7,5. Este diluyente
es el que debe usarse para el trabajo diario y
deber descartarse el no utilizado. La solucin
concentrada se conserva en heladera por cierto
tiem po. T eniendo en cuenta que en algunas

Glucosa .............................................
20,5 g
Citrato de s o d io ................................
8 g
Cloruro de so d io ...............................
4,2 g
A gua destilada.................................. 900
ml
cido ctrico al 10%
aproximadamente .........................
8 ml
para ajustar a pH 6,1; se completa finalmente
con agua destilada hasta 1.000 ml. Esterilizar
por filtracin.
La sangre as obtenida y preferentemente es
tabilizada en heladera a 2-5C durante una se
mana, para uniformar el comportamiento de los
eritrocitos para la lisis por el anticuerpo y el
complemento, resulta til por aproximadamen
te un mes. Es conveniente tambin teniendo en
cuenta que no todos los hemates de carnero se
comportan de la misma manera, seleccionar los
dadores ms adecuados.
Es preferible guardar la sangre en heladera
en form a fraccionada, de manera que en cada
recipiente exista la cantidad necesaria para un
da de trabajo.
P ara valorar com plem ento se p rep ara una
suspensin de glbulos rojos al 5%. P ara ello,
centrifugar la sangre citada y eliminar el plas
ma sobrenadante; efectuar luego tres lavados
con aproximadamente 5 a 10 volmenes de so
lucin isotnica tamponada, y desechar las sus
pensiones que despus del tercer lavado an li
beren hemoglobina. Ello debe hacerse porque
en estos casos, por excesiva fragilidad, habr
liberacin de hemoglobina que corresponde a
clulas que no han sufrido el impacto del com
plemento. El sedimento de glbulos rojos obte
n id o s por cen trifu g aci n es su sp en d id o en
aproximadamente 15 a 18 volmenes de dilu
yente y, una vez mezclados para homogeneizar, son valorados por lectura espectrofotomtrica a 530 nm, previo acondicionamiento de la
muestra.
C om o frecuentem ente en el laboratorio se
efectan determinaciones de niveles de com
plemento y reacciones de fijacin del com ple
mento, y como en este ltimo caso las concen
traciones de las suspensiones de hemates utili
zados en el sistema hemoltico indicador varan

416

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

aaden 9,8 mi de solucin de carbonato de so
dio al 0,1%, y se invierte varias veces para lacar. Leer al espectofotmetro el porcentaje de
transmisin y, utilizando la curva, calcular el
porcentaje de glbulos rojos. C onociendo la
concentracin de hemates que tiene dicha sus
pensin, por simple regla de tres puede calcu
larse el diluyente que es necesario aadir para
que finalmente la suspensin tenga la cantidad
de glbulos rojos de carnero al 5%, equivale,
aproximadamente, a 10 clulas por mililitro,
dato que conviene tener en cuenta, ya que m u
chas veces la concentracin de hemates se ex
presa por el nmero de clulas presentes.
Hemolisina
% de glbulos rojos

F ig . 22-13. C urva p ara d eterm in ar la co n c en trac i n de

glbulos rojos de una suspensin, obtenida graficando %
de transm isin versus % de glbulos rojos. (Indicaciones
en el texto.)

de una tcnica a otra, es conveniente tener pre

parada una curva de calibracin, que permitir
obtener un.\ suspensin de hemates a la con
centracin que se desee, entre dos rangos extre
mos determinados.
Para confeccionarla se lava la sangre de ove
ja en diluyente isotnico tamponado, de la mis
ma manera que se indic anteriormente, pero
diluyendo en un volumen del mismo aproxima
damente igual a 5 veces el volumen de hema
tes. Con dicha suspensin se determ ina m e
diante el hematcrito el volumen globular, y se
prepara sobre la base de este dato una suspen
sin de hemates al 15%. A 0,4 mi de dicha
suspensin se le aaden 19,6 mi de solucin de
carbonato de sodio al 0,1%; se obtiene as un
lacado cuyo tenor en hemoglobina equivale al
de una suspensin de hem ates al 15%; 8 mi
del lacado anterior son diluidos con 8 mi de so
lucin de carbonato de sodio al 0,1% y 5 mi de
esta solucin son diluidos con 5 mi del mismo
diluyente. De esta manera se tienen preparadas
tres soluciones que corresponden a lacados hemticos cuyas concentraciones son, respectiva
mente, 15%, 7,5% y 3,75%. Cada una de ellas
es leda al espectrofotmetro a 530 nm, en por
centaje de transmisin, y con los datos obteni
dos se traza la grfica en papel semilogartmico
en funcin de la concentracin de hem ates
(fig. 22-13).
Para determinar la concentracin de hem a
tes de una suspensin dada, preparada de la
misma manera que la suspensin obtenida para
la curva de calibracin, se procede del siguien
te modo: a 0,2 mi de dicha suspensin se le

El anticuerpo hemoltico se obtiene por in

m unizacin de conejos adultos, de 2-3 kg de
peso, pudindose emplear como antgeno gl
bulos rojos enteros o estroma celular. En el pri
mer caso existen distintos planes de inmuniza
cin, pero es recomendable el siguiente:
D a

Antgeno

Va

Sangre total de oveja

Sangre total de oveja
Sangre total de oveja
Sangre total de oveja
Sangre total de oveja
G lbulos rojos 20%*
G lbulos rojos 20%*
G lbulos rojos 20%*
Sangra exploratoria

S ubcutnea
S ubcutnea
Subcutnea
Subcutnea
Subcutnea
Intravenosa
Intravenosa
Intravenosa

3
5
7
9

12
14
16
18

D osis
0,5
0,5
1,5

2,5

1
1
1

mi
mi
mi
mi
mi
mi
mi
mi

* G l b u lo s ro jo s al 20% en solucin 0,15 M de N a C l ad ic io n a d a de

0 ,01% de M gSO^,

Si el ttulo de anticuerpos es conveniente se

efecta el sangrado definitivo.
El suero obtenido despus de la coagulacin
es mezclado con un volumen igual de glicerina
y se lo conserva en heladera a 2-4C, previa ti
tulacin definitiva.
El otro mtodo de preparacin de hemolisina
consiste en inocular conejos con estrom a de
glbulos rojos de carnero, que se prepara de la
siguiente manera: recoger un litro de sangre de
oveja en 250 mi de solucin de citrato de sodio
(2 mol. HjO) al 3,8%, agitando continuamente.
Despus de filtrar por gasa para eliminar co
gulos, centrifugar y lavar el sedimento de gl
bulos rojos dos veces con solucin salina.
Efectuada la ltima centrifugacin, el sedimen
to de glbulos es volcado en 10 litros de agua
destilada fra, a la que se le han aadido 4 mi
de cido actico, y se contina la agitacin du
rante 10 minutos.
Se deja la mezcla en heladera hasta el da si
guiente, con lo cual se logra la separacin del
estroma.

Complemento
Se aspira la mayor cantidad posible del so
brenadante y el sedimento se centrifuga en fro
durante 15 minutos a 2.000 revoluciones por
minuto; el sobrenadante se elimina por aspira
cin. El estroma se lava 4 a 6 veces con buffer
de acetato 0,001 M, pH 5 y se centrifuga en
fro a 2.000 revoluciones por minuto durante
15 minutos. El estroma as obtenido se suspen
de en un volumen igual de NaCl 0,15 M, fro, y
se centrifuga a 0C y 4.000 revoluciones por
minuto durante 20 minutos. Se hacen dos nue
vos lavados con NaCl 0,15 M en las mismas
condiciones que el ensayo anterior con el obje
to de eliminar todo el acetato y se lo suspende
en aproxim adam ente 300 a 400 mi de N aCl
0,15 M. Esta suspensin as preparada se colo
ca en un Erlenmeyer y se calienta durante una
hora a 100C por inmersin en un bao de agua
hirviendo. Enfriar y agitar hasta obtener una
suspensin hom ognea. T ransferir asp tica
mente el contenido a un recipiente estril, de
terminar por micro-Kjeldahl el contenido en ni
trgeno, y por dilucin con solucin de NaCl
0,15 M estril llevar a un contenido final de
1 mg de nitrgeno por mi, usando como con
servador Merthiolate al 0,01%. Esta suspensin
as preparada es la que sirve para la inmuniza
cin de los animales, los que son inoculados
por va intravenosa con una inyeccin de 0,1
mi de suspensin, 5 inyecciones de 1 mi y 5 in
yecciones de 2 mi cada una. El total de las ino
culaciones debe hacerse en un perodo de apro
ximadamente dos semanas pero sin dejar pasar
ms de dos das entre inoculacin e inocula
cin. Cuatro o cinco das despus de la ltima
inyeccin los animales son sangrados y el sue
ro, una vez separado, es calentado a 56C du
rante 30 minutos y conservado a -2 0 C. Para
su uso o mediciones de su actividad, hacer una
dilucin madre 1:100 que puede ser conservada
por muchsimo tiempo a ~20C.
Cuando se preparan hemolisinas por los m
todos indicados, el producto final obtenido di
fiere en cuanto a calidad. Ello se debe a que los
glbulos rojos del carnero tienen dos grupos de
antgenos; los isfilos, termolbiles y destrui
bles por calor a 100C, y los heterfilos, ter
m oestables, correspondientes al antgeno de
Eorssman. En el caso de la inmunizacin con
glbulos rojos intactos se obtienen anticuerpos
contra los antgenos isfilos y heterfilos, lo
que dificulta la estandarizacin, mientras que
cuando la inmunizacin se hace con estroma,
los anticuerpos formados son anti-Forssman.
Cuando se inmunizan conejos, los anticuer
pos anti-Forssm an que se producen g en eral
mente son de alto peso molecular, ubicados en
la IgM de constante de sedimentacin 198.
Se ha observado que en los sueros de cone
jos indistintamente inmunizados con glbulos

417

rojos intactos o con estroma globular, se en

cuentran anticuerpos IgM de alto peso molecu
lar (198) e IgG de bajo peso m olecular (7S).
Ambos anticuerpos pueden separarse por dife
rentes procedimientos, habindose demostrado
que los anticuerpos IgM son aproximadamente
100 veces ms activos que los IgG.
Cuando interese la obtencin de hemolisinas
en las que predom inen los anticuerpos de la
clase IgG, una vez finalizado el plan de inmu
nizacin indicado para glbulos rojos enteros,
conviene dejar los animales en reposo p o r 2 a 3
meses. Transcurrido ese tiempo hacer una ino
culacin endovenosa de 1 mi de glbulos rojos
al 2 0 % en N a C l 0 ,1 5 M , a d ic io n a n d o de
SO^Mg 0,01%, seguida de una reinoculacin
similar 10 das despus. Sangrar a los 7-8 das
de la ltima inoculacin.
P ara los estudios de inm unohem lisis, las
hemolisinas que deben utilizarse son aquellas
que contienen nicam ente anticuerpos antiForssm an (19S) obtenidas por inm unizacin
con estroma de glbulos rojos previamente ca
lentados. En estos casos la dosis hem oltica
eficaz vara entre 1/20 a 1/50 de la dosis m ni
ma aglutinante, lo que explica por qu los gl
bulos rojos sensib ilizad o s nunca p resen tan
aglutinacin.
El dosaje de la hemolisina puede hacerse mi
diendo directamente la hemlisis provocada so
bre los correspondientes hemates adicionados
de com plem ento, m idiendo el n itrgeno del
p recip itad o o btenido cuando el h a p te n o de
Eorssman es enfrentado con la hem olisina, o
determinando la actividad hemoltica del sobre
nadante anterior, para establecer su ttulo sobre
la base de la inhibicin producida.
Para medir hemohsina por el mtodo hem o
ltico directo se efectan diluciones convenien
tes de la misma, generalmente 1/400, 1/800, 1/
1600, 1/3200 y 1/6400. A 5 mi de cada una de
ellas se les aade 5 mi de suspensin de glbu
los rojos de carnero al 5%, agitando continua
mente; 1 mi de cada una de estas m ezclas es
distribuido en una serie de tubos, a los que se
les aade 5,5 mi de diluyente isotnico tamponado seguido de una dilu ci n ad ecu ad a de
complemento (1 mi de dilucin 1/20 a 1/50 de
suero fresco de cobayo es la que responde a es
tas exigencias).
Los tubos son incubados a 37C durante 90
minutos y sometidos a agitacin peridica con
el objeto de m antener las clulas en suspen
sin, y finalmente se centrifugan a efectos de
establecer el grado de lisis producido en cada
uno de los tubos, estimacin que se hace con el
espectrofotmetro de manera similar a la que
se emplea para titulacin del complemento, que
luego se ver. En todos los casos es necesario
colocar un blanco preparado con 1 mi de sus

418

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

pensin de glbulos rojos lavados al 2,5% y

6,5 ml de dilucin del complemento 1/50, co
rrespondiendo esta lectura al 0% de hemlisis.
El tubo cuya lectura corresponde al 100% de
hemlisis se prepara con 0,5 ml de suspensin
de glbulos rojos al 5%, 0,5 ml de hemolisina
1/400 y 6,5 mi de complemento diluido. El t
tulo se expresa en unidades AcH^^ y se deter
mina por el mismo mtodo indicado para cal
cular CHjp (unidades del com plem ento 50%
hemolticas). Puede trabajarse con volmenes
menores de muestra, manteniendo las propor
ciones indicadas.
Cabe sealar que cualquiera que sea el mto
do de valoracin utilizado, la curva que expre
sa la concentracin de anticuerpos es sigmoi
dal, similar a la indicada para la inmunohem
lisis del complemento.
Cuando con una hem olisina titulada de la
manera ya indicada quiere prepararse una sus
pensin de hemates ptimamente sensibiliza
dos, la dilucin de hemolisina elegida es verti
da con agitacin constante sobre la suspensin
de hemates y no en sentido contrario, logrn
dose as una sensibilizacin homognea de los
eritrocitos. Los hemates as sensibilizados se
conservan en la heladera hasta el momento de
su uso, debiendo ser utilizados en el da y pre
parrselos toda vez que se los necesite.

te se le aaden 70 mg de cloruro de sodio por

ml o se mezcla con un volumen igual de una
solucin que contenga 12 g de acetato de so
dio, 4 g de cido brico y agua hasta 100 ml,
puede conservarse en heladera a 2-4'C por 3-4
das.
VALORACIN DEL COMPLEMENTO
Los mtodos ms utilizados para la valora
cin del complemento son los que se basan en
la determinacin de su efecto citotxico sobre
glbulos rojos especficamente sensibilizados,
determinacin que se hace en funcin de la he
moglobina liberada.
El esquema simplificado de la reaccin es el
siguiente:
E -h A
EA -h C

Mg2
Como el com plem ento puede m edirse en
unidades CH,oo y CH, y existen num erosos
factores que modifican los resultados, antes de
describir los mtodos de valoracin es conve
niente definir correctamente ambas unidades.
La unidad de complemento hemoltica 50%
(CHjo) corresponde a los m ililitros de suero
fresco que lisan 2,5 x 10 hemates ptimamen
te sensibilizados sobre un total de 5 x 10* eri
trocitos, en presencia de cantidades ptimas de
calc io y m ag n esio , a una fu erza i n ica de
0,147, a pH 7,4 y durante una incubacin de
una hora a 37C en un volumen total de 7,5 ml.
La unidad de complemento hemoltica 100%
equivale a la cantidad de suero fresco capaz de
hemolisar 1 ml de un sistema hemoltico cons
tituido por partes iguales de glbulos rojos al
5% y hemolisina a la concentracin ptima, en
presencia de calcio y magnesio durante 30 mi
nutos a 37C y en un volumen final de 2 ml.

Obtencin de la muestra de suero

y su conservacin para los dosajes
de complemento
Se obtiene de sangre extrada aspticamente
y conservada en refrigeradora hasta el momento
de su uso. Mantenido el suero a 2-4"C, su valo
racin debe efectuarse en el da, en tanto que a
-40C conserva su ttulo por varias semanas.
Teniendo en cuenta que en las reacciones de
inmunohemlisis se utiliza como fuente suero
fresco de cobayo, conviene en estos casos em
plear una mezcla obtenida del mayor nmero
posible de animales, con el objeto de lograr un
producto homogneo y sin deficiencias en nin
guno de los componentes, lo que podra afec
tar los resultados, como se vio en cintica de la
inmunohemlisis. El suero puede conservarse
congelado a -4 0 C o liofilizado. Si previamen

T ubo
S uero diluido 1:30
Solucin salina tam ponada
(diluyente) hasta
S istem a hem oltico*

EA
Ca2+

Valoracin del complemento determinando

el 100% de hemlisis
El esquema que sigue corresponde a una va
loracin de este tipo:

10

0,05

0 ,!0

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

0,50

1
1

1
1

1
1

1
1

1
1

1
1

1
1

1
1

1
1

Incubar a 37C durante 30 m inutos

^ S istem a c o n stitu id o p o r p arte s ig u ales de gibuJos ro jo s ai 5% y iiernolisina (5A cH,Qyrnl)

Complemento
La dosis mnima iiemoltica corresponder al
tubo de la serie que contiene la menor cantidad
de suero capaz de producir la lisis completa de
los glbulos rojos sensibilizados. Suponiendo
que dicho tubo fuera el N 5 de la serie que
contiene 0,25 mi de suero fresco diluido 1/30,
el nmero de unidades de complemento 100%
hemolticas (CH|,)(,) que contiene dicho suero
30
resulta de d iv id ir------ = 120
0,25
Valoracin dei complemento
en dosis hemolticas 50% (CH,^)
Hemos visto que la curva de hemlisis en
funcin de la cantidad de complemento es sigmoidal y que su parte central corresponde a la
dosis que produce el 50% de hemlisis.
Por lo comn se emplea la ecuacin de von
Un
Krough X = K
como expresin m a
temtica de dicha curva. En ella, j: es la canti
dad de complemento expresada en mi de dilu
cin; y corresponde al grado de lisis como frac
cin de 1 , 0 multiplicando x 100 el % de hemUsis; K es una constante que equivale a la dosis
de complemento que produce el 50% de hem
lisis; Un es el valor de la pendiente, que vara
segn las condiciones del ensayo, y que para
los indicados en la unidad hem oltiea 50%
(CHju), ya definida, es 0,2 + 0,02. El nmero
de clulas por mililitro y la concentracin de
Ca^+ son los factores que ms influyen; debe
respetarse el volumen final de la reaccin para
no modificar la relacin hemates/ml.
La transform acin logartm ica de la ecua
cin de von Krough sum inistra una frm ula
muy til para la valoracin del complemento,
ya que su representacin es una recta.
log

= log K + 1/n log

419

Esquema de valoracin
Tubo

H em ates sen sib ilizados'*'

S olucin s alin a
tam p o n ad a
S u ero fre sc o d i
luido 1:400 en
so lu ci n s alin a
tam ponada*^'
S uero fresco d i
luido d e 1:40
D ilu ci n final

7
1

,1

5,5

4,5

3,5

2,5

1,5

6,5

6,5
1 :4 0 0

1:200 1:133 1:100

1:80

In c u b a r 6 0 m inutos a 3 7 'C ag itan d o peri d ic am en te

* S istem a h em o ltic o c o n stitu id o p o r p arte s ig u ales de s u s p e n s i n
d e hem ates d e ca rn ero (5 x 10^ c e ll./m l) y h e m o lisin a (4A cH ^ ,/m l).
L a d ilu c i n in d icad a es p a ra su ero d e co b a y o . P ara suero h u m a
no co n v ie n e em p le a r dilucin 1 :.100 a 1:150.
Los tu b o s 6 y 7 co rresp o n d e n a O y 100% de h em lisis, r e s p e c tiv a
m ente.

Centrifugar rpidamente y medir oxihem oglobina en el sobrenadante, a 541 nm, utilizan

do para ello un espectrofotmetro.
Para facilitar las operaciones conviene v alo
rar en tubos de centrfuga, tapndolos durante
la incubacin para evitar evaporacin.
Si el complemento que se valora es para em
plearlo luego en trabajos de investigacin o en
reacciones de fijacin del com plem ento, es
conveniente, antes de su titulacin, absorberle
los anticuerpos lticos naturales. Para ello m ez
clar aproximadamente 100 mi de suero fresco
con 5 mi del paquete correspondiente a glbu
los rojos de carnero lavados, mantenerlo en b a
o de hielo durante 15 minutos y centrifugar,
repitiendo la absorcin nuevamente. A lm ace
narlo convenientemente. No conviene prolon
gar los tiempos pues a 0C, segn el perodo de
incubacin, puede haber menor o mayor fija
cin del complemento.
El clculo de las unidades CHj^ por mililitro
que corresponden a la inversa de la dilucin se
hace graficando los valores de log j: y

l-y
log
Cuando y = 50%,

ser 1 y log X ser

J~y
igual a log K, esto es, la dosis de complemento
que produce el 50% de hemlisis. Por lo tanto,
graficando los valores de log x en funcin de
log

/ -y

log

en el punto que la curva corta a

= O, esa cantidad de suero corres]^y,

ponder a la unidad CH^^,.

I-y
Si se dispone de papel logartmico de tres c i
clos, la operacin se simplifica, ya que no ser
necesario determinar los log de x y de

l )

Un ejemplo de cmo calcular dichas unida

des en ambos casos facilitar la comprensin.
Los valores de v son calculados por sim ple
regla de tres tomando el valor de la DO del tu
bo N 7 como la correspondiente al 100% de
hem lisis. Cuando los valores del tubo N" 6
(0% de lisis) son significativos es necesario h a
cer las correcciones pertinentes.

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

420

Tubo
1:80
1:100

1:133

1:200
1:400
0% H
100% H

DO

~ y

0,434
0,355
0,270
0,168
0,099
0,080
0,440

98.6
80.7
60.7
36,3
22,5

70,428
4,181
1,545
0,567
0,289

O
100

Marcando en el papel logartmico los valores

de

para cada valor de x y uniendo esos

puntos, se obtiene una recta.

El valor de x para el punto de la recta en que
= 1 corresponder al nmero de unida\]^y}
des CH que contiene el suero analizado (fig.
22-14).'
Si no se dispone de papel logartmico el cl
culo se hace como lo ilustra la fig. 22-15.
En todas las valoraciones de CH^g, teniendo
en cuenta la forma sigmoidal de la curva de he
mlisis, los valores inferiores a 20% y superio
res a 75% de hemlisis deben desecharse para
los clculos.
El mtodo se aphca igualmente para la valo
racin de la hem olisina en dosis hem olticas
50%, correspondiendo en este caso los valores
de X a las unidades de anticuerpo hemoltico.
Con el objeto de facilitar los clculos pueden
confeccionarse tablas, las que estn en funcin
de 1/n, igual a 0,2 en este caso. Cuando se las
utilice es necesario respetar estrictamente las
condiciones de la prueba; en caso contrario de
ben elaborarse nuevas tablas para los diferentes
valores de 1/n.
Estos factores de conversin se calculan de
la siguiente manera: si a la dosis de com ple
mento necesaria para producir el 50% de he
mlisis se le asigna el valor 1 y a 1/n el de 0,2,
C uadro 22-3
% de tisis

Factor

% de lisis

F actor

10
12

0,644
0,671
0,696
0,718
0,738
0,758
0,803
0,844
0,884
0,922
0,961

55
60
65
70
75
80
82
84

1,041
1,084
1,132
1,185
1,246
1,320
1,354
1,393
1,438
1,490
1552

14
16
18

20
25
30
35
40
45
50

86
88
90

sustituyendo los mismos en la ecuacin de von

Krough queda x = y 1 - y
la que relaciona a
X, cantidad de suero capaz de producir una he
mlisis y como fraccin de 1 con la dosis del
suero necesaria para obtener 50% de hemlisis.
El cuadro 22-3 contiene dichos valores. Para
su uso se procede de la siguiente manera; reto
mando como ejemplo el de las valoraciones an
teriores, la dilucin 1:133 produce 60,7% de
hemlisis. Si dicha dilucin se multiplica por el
correspondiente factor tabulado para 61% de
hemhsis, en este caso 1,091 obtenido por ex
trapolacin, resulta 133 x 1,091 = 146, m ien
tras que el hallado experimentalmente fue 150.
Para estos clculos los valores utilizados deben
ser aquellos que ms se aproximan al 50% de
hemlisis.
La determinacin de la dosis de complemen
to CH50 puede hacerse tambin transformando
la curva sigmoidal en recta, relacionando los
logaritmos de la dosis de complemento con los
porcentajes de hemlisis transformados en p ro
hits, teniendo en cuenta que el probit 5 corres
ponde a 50% de hemlisis. Para ello, pueden
em plearse las tablas de Fischer y Yates que
permiten tal conversin o, ms fcilmente aun,
utilizando papel especial probit/logaritmo.

C u ad ro 22-4. Para la transformacin de los

% de hemlisis en probits
% de hem lisis
5

10
15

20
22
25
27
30
32
35
37
40
42
45
47
50
52
55
57
60
62
65
67
70
72
75
77
80
85
90
95

Prohits
3,3551
3,7184
3,9636
4,1584
4,2278
4,3255
4,3872
4,4756
4,5323
4,6147
4,6681
4,7467
4,7981
4,8743
4,9247
5
5,0502
5,12.57
5,1764
5,2533
5,3055
5,3853
5,4399
5,5244
5,5828
5,6745
5,7388
5,8416
6,0364
6,2816
6,6449

Complemento

421

16

32

64

128

256

512

F ig. 22-14. D eterm inacin de la dosis CHj,., utilizando papel logartm ico de tres ciclo

La figura 22-16 corresponde a la valoracin

de un suero de cobayo diluido 1/10.
En el cuadro 22-4 se encuentran los probits
correspondientes a diferentes % de hemlisis.

En la figura 22-17 puede verse que la curva

correspondiente al % de hemlisis en relacin
con la concentracin de hemolisina no es siem
pre del mismo tipo. En algunos casos, com o la
I, hay un aumento progresivo de dicha actividad
para estabilizarse dando una curva en form a de
Factores que pueden modificar los resultados
meseta; en tanto que otras veces, como la curva
Diversos factores pueden influir en la deter II, se observa un aumento progresivo al aum en
minacin de la actividad hemoltica del com tar la concentracin. El tipo III de curva es muy
plemento. Merecen destacarse entre ellos:
raro, pero puede observarse. El tipo I co rres
a)
La concentracin de la Itemolisina. Es ponde a hemolisinas obtenidas por inm uniza
fundamental, sobre todo para trabajos de inm u cin con estroma de glbulos rojos calentados,
nohemlisis y de cintica de la actividad del o sea sueros hem olticos que contienen a n ti
complemento, sensibilizar ptimamente a los cuerpos anti-Forssman, en tanto que las restan
glbulos rojos con hemohsina. A veces esto re tes corresponden a conejos inm unizados con
sulta tarea difcil por las caractersticas de los glbulos rojos intactos, los que indudablemente
anticuerpos obtenidos al inmunizar los conejos, elaboran anticuerpos contra antgenos isfiios y
las que dependen de diversos factores y en es heterfilos, siendo esta mezcla la responsable
pecial del tipo de antgeno utilizado.
del comportamiento de esas hemolisinas.

422

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

log

5
4
3

2
1
6
7

y -V

Logx

DO

1:80

1,90

1:100

2
2,12

0,434
0,355
0,270
0,168
0,099
0,08
0,440

Tubo

1:133

1:200

2,30
2,60

1:400
0% H
100% H

98,6
90,7
60,7
36,3
22,5

I ~y j

70,428
4,181
1,545
0,567
0,289

1,85
0,62
0,19
-0 ,2 5
-0 ,5 4

0
100

-2,60
-2,50
2,40

.o

2,30
2,20
2,18

2 ,10

'B '

- 2 ,00

-1,90

-1 ,0 -0 ,9

-0 ,8 -0 ,7 -0 ,6 -0 .5 -0 ,4 -0 ,3

-0 .2 -0,1

Log 2.18 =

Fig. 22-15. D eterm inacin de la dosis

ejem plo anterior.)

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0.7

0.8
Log

= dil 1/150 = 150 dosis CH j/m l

0.9

1.0

y
1 -y

m ediante graficacin de log x versus lo g -------. (Elaborada con los datos del
1- y

Cuando se trabaja con los sueros del tipo I,

c) Importancia del volumen fin a l de la reac
la sensibilizacin de los hemates puede conse cin. Cuando se valore complemento o se mida
guirse correctamente con la dosis adecuada de su actividad como parte de un sistema hemol
hemolisina, cosa que no ocurre en los otros dos tico en una reaccin de fijacin de complemen
casos; y muchas veces por el empleo de hemo to, es necesario respetar en forma estricta el vo
lisinas de este tipo pueden sensibihzarse inade lumen final previamente fijado, ya que la acti
cuadamente los glbulos rojos y requerir dosis vidad hemoltiea del complemento disminuye
de complemento superiores a las reales.
al aumentar el volumen final. Si el mismo se
b)
Nmero de hemates. Al duplicar la con duplica, la actividad del complemento descien
centracin de hemates por mi, con respecto a de aproximadamente en un 25%, descenso que
los requeridos para que una determinada dosis alcanza al 50% si el volumen final es el cu
de complemento produzca el 50% de hem li druple del inicial. La causa fundamental de es
sis, los mi de complemento necesarios para lo tas modificaciones son las variaciones de las
grar este mismo efecto no corresponden al do concentraciones de C2 y C3, las que inciden en
ble de la dosis de complemento inicialm ente la reversibilidad de la reaccin EAC14b2b
utilizada. Tampoco estos valores se correspon EAC 14b -HC2d.
den si se triplican o cuadruplican las concentra
d) Fuerza inica. La fuerza inica del dilu
ciones de hemates. Al duplicar dicha dosis, se yente es importante en la determinacin de la
requiere aproxim adam ente un 25% m s de actividad del complemento. La del buffer clo
complemento que la establecida para el nmero ruro de sodio-veronal sdico, ya indicada, es la
inicial de glbulos rojos sensibilizados. Esto es ideal e igual a 0,147. Cuando sta aumenta, la
muy importante y es necesario recordarlo cuan actividad del complemento disminuye.
e) Temperatura. Las valoraciones de com
do se trabaja en dosaje de complemento y prin
cipalmente en reacciones de fijacin del com plemento generalmente se hacen a 37C, pero
plemento.
cuando se realizan a tem peraturas inferiores.

Complemento

Dosis de C (escala logartmica)

1,699

2,000

2,301

2,602

2,903

Log dosis de C
Fig. 22-16. D eterm inacin de la dosis CH jo po r grafica
cin de probits versus log de C. El em pleo de papeles espe
ciales probits/iog, los que a su vez tienen tabulados ios por
centajes de hem lisis en escala proporcional a los probits,
facilita los clculos.

423

alrededor de 30C, los ttulos de complemento

pueden a veces aumentar. Ello se debe a que el
complejo EAC14b2b es ms estable a esa tem
peratura y por lo tanto habr ms sitios en esas
condiciones para la conversin de C3. Un he
cho evidente sobre este particular es que, cuan
do se valora complemento de caballo, el mismo
debe ser dosado a 30C, en que la estabilidad
del complejo anterior alcanza a 8-10 minutos y
permite la interaccin de los restantes compo
nentes. A 37C la m ism a es de aproxim ada
mente un minuto, razn por la cual las medidas
hechas a esta temperatura arrojan valores muy
bajos. Los ensayos hechos con complemento
de cobayo demuestran que entre 28C y 37C
hay una disminucin paulatina de su ttulo a
medida que la temperatura aumenta.
f) Accin del pH. El aumento del pH en el
tubo de reaccin provoca una cada del ttulo
del com p lem en to , de ap ro x im ad am en te un
25% cuando el pH vara de 7,2 a 8,5.
g) Los iones calcio y magnesio. Generalmen
te se observan variaciones en los ttu lo s del
com plem ento cuando se emplean com o dilu
yentes del sistema solucin fisiolgica o buffer
veronal-salino. Ello se debe a que en el primer
caso no existen cantidades adecuadas de calcio
y m agnesio, cosa que ocurre en el segundo.
Ca^+ 0,00015 M y Mg^+ 0,0005 M constituyen
las concentraciones ptimas. Ello se debe a que
estos dos iones son Ixindamentales para la acti
v aci n de algunos de los co m p o n en tes del
complemento durante la dinmica de la reac-

Diluciones de hemolisina
Fig. 22-17. D istinto com portam iento de hem olisinas de conejo anti-glbulos rojos de carnero. La tipo I fue obtenida por
inm unizacin con estrom a de glbulos rojos, y las de tipo II y III, p o r inoculacin d e glbulos rojos lavados. D e la grfica
se deduce que, cuando se em plean hem olisinas del tipo I, un exceso de la m ism a no m odifica los resultados. E s por esto
que en los sistem as hem olticos se utiliza ms de 1 dosis AcH,,,, sin que ello incida en la calidad del reactivo.

424

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

cin y es la causa por la que la presencia de

quelantes como citrato de sodio, EDTA, etc.,
inhibe la actividad hem oltica de los sueros
frescos. La presencia de calcio y magnesio no
slo es indispensable para la fijacin del com
plemento a glbulos rojos sensibilizados, sino
tambin para su fijacin a precipitados espec
ficos. La accin del calcio es altamente espec
fica e insustituible y otros cationes bivalentes,
como cobalto, bario, cinc, manganeso, cadmio,
nquel o magnesio, no pueden reemplazarlo. En
cambio el cobalto y el nquel pueden sustituir
al magnesio, aunque indudablemente su efica
cia es inferior.
CINETICA DE LA HEMOLISIS
POR COMPLEMENTO LIMITADO
Y POR ANTICUERPO LIMITADO
Los estudios sobre cintica de la hemlisis
por anticuerpos y complemento realizados du
rante los ltim os aos, llevados a cabo con
concentraciones ptimas de calcio y magnesio
y lecturas espectrofotomtricas de la hemoglo
bina liberada, han permitido comprender mejor
el mecanismo de la accin hemoltica del com
plemento. Para estos estudios pueden emplear
se los llamados sistemas de complemento limi
tado o de anticuerpo limitado.
En el primer caso, las clulas o glbulos ro
jos estn en presencia de la dosis de comple
mento necesaria para producir el 50% de he

mlisis y son las distintas concentraciones de

anticuerpos las que actan sobre esos glbulos
rojos as tratados, estudindose su accin he
moltica en funcin del tiempo. En los sistemas
de anticuerpo limitado, los glbulos son pti
mamente sensibilizados con el anticuerpo y lo
que vara es la dosis de complemento. Para es
tos estudios se prepara una suspensin de clu
las a una concentracin adecuada, generalmen
te 2%, y se la mantiene en agitacin constante
en un bao term orregulado para que est en
contacto ntimo con los reactivos al ser aadi
dos. Para establecer el grado de lisis se extraen
volmenes determinados a intervalos preesta
blecidos. Un hecho muy importante es que la
reaccin debe ser detenida bruscamente para
que no haya aumento de hemlisis durante el
proceso de centrifugacin, y esta detencin se
consigue, en el caso de sistemas de com ple
mento lim itado, m ediante dilucin y enfria
miento; en tanto que los casos de sistemas de
anticuerpo limitado, la inhibicin se hace con
EDTA. En el primer caso, la reaccin no puede
detenerse con EDTA porque esta sustancia, que
es complejante del calcio y magnesio, resulta
inefectiva despus de pasado cierto tiempo, ya
que las etapas de fijacin del complemento en
las que estos iones intervienen, tienen lugar en
los primeros minutos de la reaccin. El proce
dimiento indicado de dilucin y enfriamiento
no es del todo adecuado pero, si se procede a
centrifugar rpidamente y en fro, los resulta
dos son aceptables.

Minutos
F ig . 22-18. Curvas de hem lisis en funcin del tiem po obtenidas con diferentes diluciones de suero de cobayo, com para
das con las logradas con suero hum ano. El com plem ento de cobayo da curvas que adquieren la tpica form a de m eseta, co
sa difcil de lograr con el de origen hum ano.

Complemento
La figura 22-18 muestra un comportamiento
similar de las curvas de hemlisis en funcin
del tiem po para distintas concentraciones de
complemento de cobayo; que todas ellas tienen
un incremento inicial para luego tomar el aspec
to de mesesa; y que la reaccin se ha completa
do a los 90 minutos, cuando se analiza suero de
cobayo, en tanto que si es humano la curva que
se obtiene es brusca al comienzo y continta con
un discreto ascenso, aun hasta las 4 o 5 horas.
Ello indica que, cuando se valore complemento
de distinto origen, el tiempo de incubacin para
determinar su actividad indudablemente deber
ser establecido previamente a efecto de que los
resultados puedan ser comparados.
En los sistemas de complemento limitado,
las curvas de hemlisis pueden tener distintas
caractersticas, las que dependen del tipo de an
ticuerpo. Cuando las hemolisinas son prepara
das por inmunizacin de conejos con estroma
de glbulos rojos hervidos (anticuerpos heter
filos anti-Forssm an) habitualm ente m uestran
un incremento que llega al mximo alrededor
de los 90 minutos, y luego la curva se aplana y
mantiene constante su actividad. Otras hemoli
sinas, sobre todo las preparadas por inmuniza
cin de animales con glbulos intactos lavados
(mezcla de anticuerpos isfilos y heterfilos),
tienen caractersticas distintas, ya que muestran
una marcada actividad en los primeros momen
tos y continan luego una curva ascendente que
se prolonga por un tiempo bastante largo (fig.
22-19). Se supone que ese com portam iento
puede ser debido a la disociacin de complejos

425

hemate-anticuerpo, seguida de una nueva reac

cin con otros sitios antignicos en la m ism a o
en otra clula, lo que originara una continua
transferencia de sitio a sitio o de clula a clula
durante la reaccin.
Como corolario de estas observaciones con
viene recordar que en todos los ensayos de inmunohemlisis deben utilizarse preferentemente
hemolisinas obtenidas por inmunizacin de co
nejos con esti'oma de glbulos rojos calentados
(anti-Forssman), ya que los mismos se caracteri
zan porque su actividad hemoltiea es marcada
mente superior a su capacidad aglutinante.
La cantidad ptima de hemolisina para utili
zar en la reaccin debe ser establecida por en
sayos previos, y han de elegirse preferentem en
te aquellos sueros hemolticos que se caracteri
zan por dar curvas que presentan una m eseta
terminal. Estos hechos conviene tenerlos p re
sentes, ya que permitirn reducir en parte los
mltiples factores que pueden variar los resu l
tados cuando se efecten reacciones de fijacin
del complemento con fines diagnsticos o de
identificacin.
VALORACIN DE LA ACTIVIDAD
FUNCIONAL DEL COMPLEMENTO
POR LA VA ALTERNA
El dosaje de esta actividad puede hacerse, al
igual que para la va clsica, en unidades 100%
h e m o ltic a s (V A H ,) y 50% h e m o ltic a s
(VAH,).

Minutos
F ig. 22-19. D istinto com portam iento de hem olisinas de conejo anti-carnero obtenidas: a, por inm unizacin con estro m a
de glbulos rojos; b, por inoculacin de glbulos rojos lavados.

426

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

El mtodo es similar al de la va clsica. La

diferencia fundamental radica en que el sistema
revelador est constituido por glbulos rojos de
conejo no sensibilizados por anticuerpos. Estos
eritrocitos, por su bajo contenido en cido sili
co, son capaces de activar el complemento por
la va alterna. Si a un suero fresco (fuente de
complemento), conteniendo EGTA (cido eti
lenglicol amino etil tetraactico) 10 mM, sus
tancia quelante de Ca^'' y no de Mg^^ a esa con
centracin, ya que el EGTA es 100 veces mejor
complejante de Ca^+ que de Mg^+, se lo mezcla
con una suspensin de glbulos rojos de cone
jo, al estar bloqueada la capacidad de actividad
de la va clsica, cualquier hemoglobina libera
da ser un ndice de la actividad funcional del
complemento por la va alterna.
El mtodo de dosaje que se describir es el
que mide actividad en unidades VAHjg, y las
precauciones que se deben tener son las m is
mas que las indicadas para la determinacin de
las unidades CH^g por la va clsica.
Materiales necesarios
a) Buffer. El diluyente que se usa para los
ensayos de activacin del sistema complemen
to por la va alterna se prepara aadiendo a 83
voMmenes de buffer de veronal-cloruro de so
dio, pH 7,2 de Mayer libre de Ca^+ y Mg^+, 10
volmenes de EGTA 0,1 M, pH 7,2 y 7 vol
menes de MgClj 0,1 M (DFC-VA).
Antes de su uso aadir 0,1% de gelatina.
b) Suero para valorar. Se lo obtiene por coa
gulacin de sangre extrada por puncin veno
sa. El suero separado por centrifugacin se
conserva congelado. A -20C resulta til hasta
una semana, y hasta 3 meses si se lo mantiene a
-70C . Inm ediatamente antes de su uso se le
aade EGTA y MgCI^ hasta una concentracin
de 10 mM y 7 mM, respectivamente.
c) Eritrocitos de conejo. Se los obtiene a
partir de sangre recogida por puncin de la ve
na marginal de la oreja, que se mezcla con 20%
v/v de solucin de AIsever. Los eritrocitos se
parados por centrifugacin se lavan tres veces
con DFC-VA y finalmente se los sspende al
1% en este diluyente.
Mtodo
Efectuar con ei suero conteniendo EGTA 10
mM y M gC lj 7 mM diluciones en razn 2,
usando como diluyente DFC-VA. En pequeos
tubos de hemlisis mezclar 0,2 mi de cada dilu
cin con 0,2 mi de DFC-VA y 0,2 mi de glbu
los rojos de conejo al 1%. Incubar a 37C por
30 minutos y detener la reaccin mediante el
aadido a cada tubo de 2 mi de buffer de Ma
yer libre'de Ca^+ y Mg^+, adicionado de EDTA

0,01 M. Centrifugar a 2.000 rpm durante 1 mi

nuto y leer la absorbancia de los sobrenadantes
a 413 nm. Esto da la medida de la hemoglobina
liberada por hsis, con la que puede calcularse
y y mediante la aplicacin de la ecuacin de
von Krogh x = K (y/100-y)^"; en forma similar
a la indicada en determinacin de las unidades
de CHjg, establecer las VAH.^(, del suero.
Los controles que se deben incluir en este
ensayo son los siguientes: 1) suero conteniendo
EDTA 10 mM para inhibir la activacin del
complemento por ambas vas, la clsica y la al
terna (control negativo, 0% de lisis); 2) control
de 100% de lisis preparado con 0,2 mi de sue
ro, 0,2 mi de glbulos rojos de conejo, 0,2 mi
de DFC-VA y 2 mi de agua destilada, y 3) si
los sueros para analizar contienen hemoglobina
liberada durante la separacin debe prepararse
un blanco constituido por una serie paralela de
diluciones del suero (0,2 mi) a los que se le
aaden 2,4 mi de buffer de Mayer libre de Ca*'^
y Mg^+, adicionado de EDTA 0,01 M. En este
caso, el clculo del valor de y para cada dilu
cin del suero se hace de acuerdo con la si
guiente frmula:
DO tubo de reaccin - DO blanco
correspondiente a ese tubo

y = ----------- ^
----------------

DO testigo 100% lisis - DO testigo

0% lisis

M EDIDA DE LA CAPACIDAD
DE DIFERENTES SISTEMAS
PARA ACTIVAR EL COMPLEMENTO
POR LA VA ALTERNA
Existen numerosos mtodos para ello. Algu
nos usan tcnicas muy sofisticadas y difciles de
llevar a cabo. El mtodo que se describe se fun
da en la caracterstica particular de los glbulos
rojos de conejo de activar el complemento por
la va alterna. Si la sustancia o complejo que se
ha de ensayar se mezcla con suero fresco (fuen
te de complemento) conteniendo EGTA, al es
tar bloqueada la capacidad para activar el com
plemento por la va clsica, cualquier consumo
de complemento que ocurra por la va alterna
dar como resultado una disminucin de ste en
el suero. Si a ese sistema se le aaden eritroci
tos de conejo no sensibilizados con anticuerpo,
una reduccin en la hemlisis, comparada con
controles en los que el sistema activador en en
sayo ha sido eliminado, ser proporcional a la
concentracin del sistema activador.
Materiales necesarios
Los descritos en valoracin del complemen
to por la va alterna.

Complemento
M todo
Conociendo la actividad VAH,g de un suero,
d ilu irlo en D F C -V A h a sta '25 u n id a d e s
VAHjp/ml (0,2 ml = 5 VAHjp). A 0,2 ml de esa
dilucin aadirle 0,2 ml del sistema que se ha
de ensayar (disuelto o suspendido en DFC-VA)
e incubar a 37C durante 30 minutos. Frenar la
reaccin por el aadido de 2 ml de buffer de
Mayer libre de Ca^^ y Mg*+, adicionado de ED
TA 0,01 M. Centrifugar a 2.000 rpm durante 1
minuto y en los sobrenadantes medir la hem o
globina liberada como se indic para dosaje de
VAHjg. Incluir en la reaccin controles de 0%
y 100% de lisis.
El porcentaje de complemento consumido se
calcula aplicando la siguiente frmula:
% de complemento consumido
Am - At
= ----------------- X

100

Am - Ab
siendo Am: absorbancia a 413 nm del control
de 100% de lisis; Ab: absorbancia a 413 nm
del control negativo (0% lisis); y At: absorban
cia a la m ism a longitud de onda del sistem a
analizado.
Si se sospecha que el sistema para analizar
puede causar autlisis de los eritrocitos de co
nejo, es necesario incluir un control constituido
por ese sistema y eritrocitos de conejo en au
sencia de suero (fuente de complemento).
El mtodo puede transformarse en cuantitati
vo desarrollndolo en una batera de tubos con
cantidades crecientes del sistema a ensayar.
V A LO R A CIO N DE LOS
C O M PO N EN TES
DEL C O M P L E M E N T O
Inicialmente se utilizaron mtodos que em
pleaban un reactivo constituido por todos los
componentes del complemento, excepto el que
se quera valorar, el cual era adicionado a una
serie de diluciones del suero cuyo componente
interesaba medir. A cada uno de los tubos de la
serie, igualados en volumen, se le adicionaba
un volumen igual de glbulos rojos sensibiliza
dos. Previa incubacin a 37C se determinaba
cul era la mxima dilucin del suero que pro
duca 100% de lisis, correspondiendo la inversa
de dicha dilucin al nmero de unidades por ml
del componente que se valoraba. Los reactivos
utilizados para la valoracin de C l, C2, C4 y
C3 global (C3-C9), se denominan, respectiva
mente, R l, R2, R4 y R3.
Mejor informacin suministran aquellos m
todos que miden la actividad de cada com po

427

nente del complemento haciendo actuar al sue

ro sobre glbulos rojos sensibilizados que ya
han fijado ptim am ente a las fracciones del
complemento que interaccionan antes del com
ponente a valorar, y modificndolo de tal modo
que los restantes no se fijen. Para valorar C4 se
utilizar E A C l, y para C2 EAC 14b.
C onsiderando que en alguna oportunidad
puede interesar la dosificacin de C l, C2, C4 y
C3 global con R l, R2, R4 y R3, respectiva
mente, se describir dicho mtodo previo a la
valoracin de los componentes del complemen
to mediante las correspondientes clulas inter
medias.
P re p a ra c i n d e

Rl

R2

Para su obtencin es necesario preparar p ie

za m edia y pieza terminal, ya que esta lti
ma est constituida por C2 y C4 y la pieza m e
dia por C l y C3. Si ambas son enriquecidas
con suero calentado a 56C durante 30 minutos
(C3 y C4), se obtendrn dos reactivos en los
que estarn ausentes C l y C2 respectivamente,
en tanto que los restantes com ponentes del
com plem ento se hallarn a concentraciones
normales. La pieza media puede prepararse por
dilucin o dihsis, de acuerdo con tcnicas in
dicadas por distintos investigadores.
Un mtodo recomendado es el descrito por
M ayer, el que puede ser utilizado tanto p ara
suero humano como de cobayo: aadir un v o lu
men de suero fresco helado, con a g itac i n
constante, sobre 10 volmenes de fosfato monopotsico 0,02 M enfriado. Mantener a 0C y
despus de 20 a 30 minutos centrifugar rpida
mente en fro, separando el sobrenadante del
precipitado. El precipitado, en el caso de suero
de cobayo, es lavado con solucin de fosfato de
pH 5,4 y fuerza inica 0,02 (este lavado no de
ber efectuarse en el caso de suero hum ano,
por su menor contenido de C2). El precipitado
se disuelve en cloruro de sodio 0,15 M y se
ajusta a pH 6,5-7 con bicarbonato de sodio 0,1
N, diluyendo a un volumen cinco veces supe
rior al del original. Esto constituye la pieza m e
dia, rica en C l y C3. Para ser transformada en
R2 debe aadrsele, en el momento del uso, un
volumen igual de suero calentado a 56C du
rante 30 minutos y diluido 1/5 eon el objeto de
enriquecerla en C3 y C4.
El sobrenadante de la operacin anterior o
pieza terminal se lleva a isotona con cloruro
de sodio al 10% y rpidamente a pH 7,5 con bi
carbonato de sodio 0 ,1 N, ya que a pH inferio
res a 6,5 este reactivo resulta inestable. Su dilu
cin final es 1:2 y para transformarlo en R l, al
igual que se describi en R2, es necesario m ez
clarlo en el momento del uso con volm enes
iguales de suero calentado diluido 1/5.

428

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

P r e p a r a c i n d e R 3

La inactivacin de C3 puede lograrse de dis

tintas maneras, siendo la ms corriente la que
emplea zimosn, un polisido insoluble obteni
do de la levadura de cerveza. Tiene la particu
laridad de combinarse a 37C, fuerza inica no
superior a 0,15 y pH entre 6,8 y 8,6 con la pro
perdina; activa la va alterna consumiendo C3,
no as C l, C2 y C4. Las cantidades de zimosn
necesarias para inactivar 1 ral de suero humano
varan entre 1 mg y 1,35 mg, requirindose
cantidades mayores para inactivar el mismo
volumen de suero de cobayo. Para preparar R3
por este procedimiento es necesario activar pre
viamente el zimosn, para lo cual 10 mg del
mismo se suspenden en 1 mi de NaCl 0,15 M y
se calientan en bao de agua a ebullicin du
rante media hora.
Se centrifuga, y al sedimento que contiene
el zimosn activado se le aaden 10 mi de sue
ro fresco humano, el que es incubado a 37C
por una hora, agitando peridicam ente con el
objeto de suspender el zimosn. Se centrifuga,
repitiendo una segunda adsorcin del sobrena
dante con zimosn, si fuera necesario y se lo
diluye finalmente con solucin de cloruro de
sodio 0,15 M a un volumen cinco veces mayor
que el original. E ste reactivo as preparado
constituye R3.
P r e p a ra c i n

de

R4

Se lo obtiene por tratamiento de suero fresco

con amonaco. Para ello a 1 mi de suero se le
aade 0,25 mi de amonaco 0,15 N. Se deja en
contacto a 37C durante 1 hora y m edia y se
n eutraliza con 0,25 mi de cido clorhdrico
0,15 N. Para su uso se lo diluye en el quntuplo
del volumen inicial.
R l, R2, R3 y R4 deben ser probados a efec
tos de establecer que no tienen actividad anti
complementaria. Si la tuvieran, debe ser titula
dos, y el reactivo, diluido a concentracin con
veniente para que no interfiera en la reaccin.
De todos ellos R2 es el que con ms frecuencia
presenta actividad anticomplementaria.

El mtodo de valoracin para C l, C2, C3 y

C4 es el mismo en todos los casos; la diferen
cia consiste en el empleo de R l, R2, R3 y R4
segn el componente a valorar. El cuadro 22-5
corresponde a un dosaje de C 1 y puede ser to
mado como tipo para la valoracin de los otros
componentes.
Estos mtodos de valoracin, si bien fueron
utilizados inicialmente, no son correctos para
establecer la actividad ltica del complemento,
ya que la misma depende, no de las cantidades
absolutas de cada uno de los componentes pre
sentes, sino de ciertas relaciones entre ellos. Lo
ms acertado es hacerlo mediante la determina
cin de la capacidad que cada uno de ellos tie
ne para transformar clulas en el estado ante
rior a su intervencin, en clulas activadas por
su presencia. La actividad de C2, por ejemplo,
se establece determinando la cantidad de clu
las que en estado EAC 14b se transforman en
EAC14b2a.
P re p a ra c i n d e c l u la s

EAC 1

Puede hacerse m ezclando glbulos rojos

sensibilizados (EA) con R4, lo que permite, en
presencia de Ca^+ y ausencia de Mg^+, nica
mente la fijacin de C l. Para ello en un reci
piente de vidrio adecuado se colocm 100 mi de
ter etlico no anestsico, los que son calenta
dos a 30C en un bao de agua. Se los agita con
la ayuda de un agitador magntico y se aaden
4 mi de suero fresco de cobayo, continuando
con la agitacin durante cinco minutos. Se de
canta rpidamente el ter y se eliminan los res
tos con aire comprimido. El suero as obtenido
se diluye 1/10 con buffer barbital salino aadi
do de Ca^+ 0,001 M y se lo conserva en bao de
hielo hasta el momento del uso.
Para la preparacin de clulas E A C l, 1,5 mi
de EA a la concentracin de 5 x 10* clulas ' y
suspendidas en buffer con Ca^+ 0,001 M, pre
viamente calentadas a 37C, son mezclados con
5 mi de la dilucin 1/10 del suero-ter, tambin
calentados a 37C. La mezcla es incubada a esa
temperatura durante diez minutos, centrifugada

C u ad ro 2 2 - 5 . Valoracin de C l
Tubos

S uero fresco diluido 1:10

R eactivo R 1
B uffer-barbital salino
S istem a hem oltico*

0,05
0,25
0,45
0,50

0,10

0,15
0,25
0,35
0,50

0,20

0,25
0,25
0,25
0,50

0,30
0,25

0,35
0,25
0,15
0,50

0,40
0,25

0,45
0,25
0,05
0,50

0,25
0,40
0,50

0,25
0,30
0,50

Incubar I hora a 37C

Lectura de los resultados
* G l b u lo s ro jo s de carnero 5 x 10^ c/m y 4 A cH |p/m e n p arte s ig u ales

0,20
0,50

0,10
0,50

Complemento
luego y lavada dos veces con 10 mi de buffer
adicionado de Ca^+ 0,001 M; finalmente las c
lulas se suspenden a 10"^ clulas/ml. Deben ser
conservadas a 0C.
P re p a ra c i n d e c lu la s

EAC14b
Se utiliza el mtodo descrito por Mayer, el
que se basa en el hecho de que a 0C y en pre
sencia de Ca^+ slo se fijan a clulas sensililizadas C l y C4. Teniendo en cuenta que a 37C
EAC14b2b revierte a EAC14b, el pasaje previo
del suero de cobayo por columna de intercam
bio, para ehminar magnesio, no es indispensa
ble. Por lo tanto, para obtener las clulas desea
das, se mezclan 10 mi de EA a la concentra
cin de 10^ cl mi *, suspendidas en buffer
adicionado de Ca^+ 0,001 M, con 0,5 a 1 mi de
suero fresco de cobayo, los que son incubados
a 0"C, con agitacin peridica, por un tiempo
que oscila entre 30 y 90 minutos, el que debe
ser correctamente establecido, en ensayos pre
vios, para cada lote de complemento. Este debe
ser tal que las clulas E* formadas no excedan
del 5%.
Despus de la incubacin se centrifuga, se
elimina el sobrenadante, se lavan las clulas
dos veces con buffer enfriado, se suspenden
en 20 mi del mismo y se incuban a 37C du
rante 90 minutos. Se centrifuga, se elimina el
sobrenadante y las clulas E A C 4b se suspen
den en b u ffer con Ca^" 0,00015 M y Mg^+
0,005 M a la concentracin deseada. Se con
servan a 0C durante varios das, siendo con
veniente hacer un lavado con el mismo buffer
antes de su uso.
P re p a ra c i n d e c lu la s

EAC14b2b
Un mtodo muy utilizado es el de Levine y
colaboradores, para lo cual a 10 mi de clulas
EA (10^ cl m f') suspendidas en buffer adi
cionado de Ca^+ y Mg^+ se les aade 1 mi de
suero fresco de cobayo y se incuban a 0C du
rante 30 a 40 minutos. Se centrifugan, se elim i
na el sobrenadante y se suspenden en buffer
con Ca^+ y Mg^+ a la concentracin deseada.
Antes del uso, mantenerlas a 0C durante 4 ho
ras para que todas las clulas E* que pudieron
formarse se destruyan, centrifugando luego en
fro y suspendiendo finalmente en buffer.
Otra manera de preparar EAC14b2b es tra
tando EA con suero adicionado de floridzina,
la que acta como inhibidor de C3.
A 1 volumen de EA al 5% (10^ EA m f )
aadir 1 volumen de floridzina (10,6 mg de flo
ridzina mi de buffer de veronal adicionado
de Mg2+ y Ca^+) y 0 ,1-0,2 volmenes de suero

429

humano normal (fresco). Despus de mantener

a 37C por 90 segundos, interrumpir la reac
cin por el aadido de buffer de veronal fro;
lavar dos veces con el mismo buffer y resus
pender, llevando las clulas a la concentracin
inicial (buffer de veronal adicionado de Mg^+ y
Ca2+).
En lugar de EAC142 puede prepararse el de
rivado EAC142oxy, el que resulta mucho ms
estable pues el componente C2 previo a su fija
cin es oxidado con iodo, y como ya se indica
ra, la vida media del complejo que se form a es
superior (62 minutos a 32C). Adems, la acti
vidad hemoltica se incrementa 5 a 6 veces.
El mtodo de preparacin es similar al arriba
indicado, con la diferencia de que el tiem po de
contacto a 37C de la m ezcla constituida por
EA, floridzina y suero iodado es de 13 minutos
en lugar de 90 segundos.
El suero iodado se prepara aadindole al
suero fresco una solucin de 12 en IK hasta
concentracin final en I^ de 5 x 1 0 'M.
Conviene tener preparada una solucin ma
dre de L lO ^M en IK 5 X lO 'M. (Disolver 0,25
g de Ij y 8,3 g de IK en 4 mi de buffer de fosfa
tos 0,1 M, pH 7,6. Completar a 100 mi con el
m ism o buffer.) Para cualquier dilucin de la
solucin concentrada utilizar el buffer de fosfa
tos indicado.
Se han descrito numerosos casos de inmunodeficiencias asociadas a dficit gentico de al
gunos de los componentes del sistema com ple
mento. Deficiencias de C2 y C4 han sido detec
tadas en casos de glomerulonefritis y lupus eri
tematoso sistmico; de C3 en infecciones gra
ves por bacterias pigenas; as como de los
constituyentes del MAC (C5-C9) detectadas en
pacientes con infecciones por microorganismos
de lo calizaci n in tracelu lar, esp ecialm en te
Neisserias. (Para mayor informacin vase cap.
30.) Disponiendo de sueros de estos pacientes,
es posible usarlos como excelentes reactivos
que sustituyen a los antes indicados en la pre
p araci n ce clulas EA sensibilizadas (Ej.:
E A C l; EAC14b; EAC14b2b; etc) para la valo
racin en sueros desconocidos de domponentes
individuales del complemento. Sueros deficien
tes en C2 o C3, por ejemplo, resultan tiles pa
ra la preparacin de clulas a usar en la titula
cin en sueros de los componentes C2 y C3,
respectivamente.

V a lo ra c i n de

C l, C4, C2

C3

g lo b a l

(C3C9)
Valoracin de C l
Transformar el suero a valorar en R4 por tra
tamiento eon NH3 y HCl para eliminar C4.

430

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

/

EA 5% en buffer con Ca^+ .sin

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Suero a valorar (R4) en buffer con

Ca^+ sin Mg^*' (0,5 ml diluido)

1;2

1:4

1:8

1:16

1:32

1:64

1:128

Tubos

Incubar 10 m inutos a 37^C

C en trifu g a r, lav a r y su sp en d e r e n b uffer c o n
E A C l (B).

Tubos

E A C l (B)
Rl
N aC I 0,15 M , helado

y iVlg^^ (0,5 m l p o r liibo). E n esta p rim era in cubacin las c lu la s E A se tran sfo rm aro n en

0,5
0,5
0,5
0,5
Incubar I hora a 37C
5
5

0,5
0,5

0,5
0,5

0,5
0,5

0,5
0,5

0.5
0,5

C en trifu g a r, v alo r liem o g lo b in a en el so b re n ad an te por lec tu ra esp e ctro fo to m tric a a 541 nm y c a lcu lar la in v ersa de la d ilucin que da 50%
d e lisis. L a m ism a c o rresp o n d e a las un id ad e s de C l p o r m l de suero.
E n la re acc i n deb e n incluirse testig o s d e 0% y 100% d e hem lisis.

Valoracin de C4
El suero a valorar debe ser previamente calentado a 52C durante 30 minutos para destruir C l
yC2.
Tubos

E A C l 5% en buffer con Ca^+ sin

M g 2-^
D iluciones suero a valorar calenta
do, en buffer con Ca^'^ sin Mg^+
(0,5 ml)

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

1:2

1:4

1:8

1:16

1:32

1:64

1:128

Centrifugar, lavar y suspender en buffer con Ca^+ y

en EACI4b (B).

Tubos

EA C 14b (B)
R4
N aC I 0,15 M , helado

Incubar 10 m inutos a 37C

(0,5 ml por tubo). En esta primera incubacin las clulas EACl se transformiiron

0,5
0,5
0,5
0,5
Incubar 1 hora a 37C
5
5

0,5
0,5

0,5
0,5

0,5
0,5

0,5
0,5

0,5
0,5

C entrifugir, v alo r h e m o g lo b in a en el so b re n ad an te p o r lectura esp e ctro fo to m tric a a 541 nm y c a lcu lar la in v ersa d e la d ilu ci n q u e d a 50%
d e lisis. L a m ism a co rresp o n d e a las u n id ad e s de C 4 p o r m l de suero.
E n la reaccin deb e n in clu irse testig o s de 0% y 100% d e hem lisis.

Valoracin de C2
Transformar el suero a valorar en R4 por tratamiento con NH3 y HCl para destruir C4.
Tubos

E A C l4 b 5% en buffer con Ca^* y

Mg^t
D iluciones suero a valorar (R4) en
buffer con Ca^+ y Mg^+ (0,5 ml/dil.)

0,5
1:4

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

1:8

1:16

1:2

1:32

1:64

1:128

incubar 30-60 m inutos a 0*C*

C en trifu g a r, lav a r y su sp en d e r en b u ffer sin Ca^'" ni Mg^'" (0,5 m l p o r tubo). E n esta p rim era eta p a d e c lu la s E A C 1 4 b se tran sfo rm aro n en
E A C 1 4 b 2 b (B ).

Complemento

431

Tubos
E A C U b lb (B)
Suero ED TA (suero fresco de co
bayo 1:3() en ED T A 0,005 M )
N aC I 0 ,15 M, helado

0,5
0,5

0,5
0,5

Incubar 1 hora a 37C

5
5

0,5
0,5

0,5
0,5

0,5
0,5

0,5
0,5

0,5
0,5

CevUvvfv\gaY, valovar h e m o g lo b in a a n los 'iobvemtlanVei p o r le c tu ra especlrofotom V rica a 541 nm y c a lc u la r la in v ersa de la dilucin q u e da

el 50% de iisis. L a m ism a c o rre s p o n d e a las iinidacies de C 2 p o r m i d e suero analizado.
E n la re acc i n deb e n in clu irse testig o s de 0% y 100% de hem lisis.
* E l tiem po ex a c to d eb e d e te rm in a rs e p re v ia m en te por tanteo. D e b e n se r tal q u e n o p e rm ita la fo rm a ci n de m s d e un 5% d e clulas E .*

Valoracin de C3-global (C3-C9)

Tubos
EA C 14b2a 5% en buffer sin Ca^+
ni
Suero a valorar-ED TA . D ilucio
nes del suero en EDTA 0,005
]M en buffer sin Co^+ ni IVIg^"
(0,5 m l/dil.)
N aCI 0,15 M , helado

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

1:8

1:16

1:32

1:64

1:128

1:256

1:512

Incubar 1 hora a 37C

5
5

C entrifugar, v a lo r h em o g lo b in a en los so b re n ad an te s y c a lcu lar las un io n es del C 3 g lo b al C 3-C 9 co m o se in d ic p a ra lo s otros co m p o n e n te s

del com piem eirto.

Valoracin de otros componentes

del complemento
La valoracin de los restantes componentes
del complemento resulta difcil en los laborato
rios corrientes, ya que para ello son necesarios
componentes purificados y sueros con deficien
cias en algunos de los componentes. Como ya
se ha indicad o, se conocen fam ilias cuyos
miembros presentan deficiencias de C2, coba
yos con deficiencias de C4, ratones con defi
ciencias de C5 y conejos con deficiencias de
C6. Sus sueros son muy tiles para la prepara
cin de clulas intermedias y de los reactivos
que actan sobre stas.
Componentes del complemento valorados
como antgenos
Los mtodos anteriormente descriptos p er
miten medir la actividad funcional de los com
ponentes del complemento.
Teniendo en cuenta que son protenas anti
gnicas, mediante el empleo de antisueros m o
n o esp ecfico s algunos de ello s pueden ser
cuantificados por inm unodifusin radial. Por
este mtodo se tiene conocimiento de la con
centracin srica del componente del comple
mento cuantificado, pero no de su actividad.
Adems, est limitado por la concentracin en
que ellos se encuentran en el plasma, ya que
hay algunos en que sta es inferior a los lmites
de resolucin del mtodo.

Por inmunodifusin radial pueden cuantifc a rs e C 3 ,C 4 ,C lq y B .

VALORACIN DE PROPERDINA*
El mtodo que se describe resulta muy til
para valorar properdina, protena no anticuerpo
presente en el suero humano y de otros verte
brados, la que tiene la particularidad de complejarse con Zimosn y fijar C3, constituyendo
un sistema con poder bactericida inespecfico.
Su contenido srico se expresa en unidades.
La unidad constituye la mnim a cantidad de
suero que en presencia de Zimosn inactiva d u
rante 1 hora a 37C 120 unidades de C3 conte
nidas en 1 mi de RP. La inversa de dicha can
tidad constituye el nmero de unidades por mi
que contiene la muestra analizada.
M aterial necesario
a) Zimosn: debe ser de buena calidad, y uno
de los ms utilizados el de Fleichsmann L abo
ratories. Quince mg de Zimosn suspendidos
en 2 mi de NaCl 0,15 M se calientan durante
una hora en bao de agua hirviendo. Se centri
fuga, se elimina el sobrenadante y el sedimento
se resuspende en 1 mi de buffer Veronal-salino. Cada 0,1 mi contiene 1,5 mg de Zimosn.
* M argni, R. A. L aboratorio (G ranada - Espaa) p. 5 0 1 ,
1967.

432

Mecanismos efectores de ia respuesta inmune

Tubos

RP a valorar (0,5 m l/tubo) dil.

S istem a hem oltico
B uffer veronal-salina
A gua destilada
Solucin frenadora citrato-salina

1:16
0,5

1:32
0,5

1:128
0,5

1:256
0,5

0,5
0,5

0,5
0,5

Incubar a 37"C durante 30 minutos

4
4
4
, 4
C entrifugar a 3.500 rpm durante 5 minutos

b) Buffer Veronal-salino: se utiliza el indi

cado en reacciones de fijacin del com ple
mento.
c) Reactivo RP: se lo obtiene tratando suero
fresco humano o de cobayo con Zimosn. Para
preparar 3 ml de reactivo se procede de la si
guiente manera: se suspenden 20 mg de Zim o
sn en 4 ml de NaCl 0,15 M y se los hierve du
rante una hora. Se los reparte en voMmenes
iguales en dos tubos de hemlisis, se centrifu
ga, se elim ina el sobrenadante y se aade a
uno de ellos 3 ml de suero fresco humano o de
cobayo, mantenindolo con agitacin peridi
ca a 17 + 1C durante una hora. Se separa el
sobrenadante por centrifugacin, se lo vierte
sobre el segundo tubo que contiene Zimosn y
se vuelve a repetir el tratamiento anterior. El
sobrenadante de centrifugacin constituye el
reactivo RP. Su conservacin es precaria, por
lo que conviene prepararlo para su uso inm e
diato y mantenerlo en bao de hielo. Congela
do,a - 4 0 C se conserva por algunos das.
Consiste en suero fresco desprovisto de properdin" y se lo valora en unidades hemolticas
50% (CH jq). La valoracin se hace de acuerdo
con el siguiente esquema, utilizando como di
luyente de RP buffer Veronal-salino.
La hemoglobina liberada se lee en el espec
trofotmetro a 565 nm, en DO, utilizando el tu
bo 6 como blanco. El tubo 7 corresponde al
100% de lisis y con l se calculan los otros por
centajes de hemlisis, por relacin directa entre
su DO y la de los tubos restantes. Con esos va
lores se determ inan las unidades CH50 del
reactivo RP, mediante cualquiera de los mto
dos descriptos al hablar de valoracin de com
plemento. Para las condiciones del ensayo, el
valor de 1/n en la ecuacin de von Krough es
0,28. A partir de x =

1:64
0,5

se ha calculado

el cuadro 22-6 con el que directamente pueden

determinarse las unidades CH,. Para ello slo
es necesario multiplicar la inversa de la dilu
cin que ms se aproxime al 50% de lisis por
el factor indicado en el cuadro para ese grado
de lisis. El resultado corresponder al ntimero

de unidades CH^^ que contiene el RP anali

zado.
Para la valoracin de properdina conviene
ajustar el RP a 100-120 unidades CH,g/mf'.
d) Reactivo R3: consiste en un suero despro
visto de properdina y C3. Se prepara de igual
manera que RP, pero incubando a 37C en lu
gar de 17C. Contiene cofactores. Para su pre
paracin conviene usar suero humano, ya que
el de cobayo, por su bajo contenido en proper
dina y alto ttulo de C, resulta difcil de agotar
en C3.
La valoracin del reactivo se hace previa
mente a su preparacin, enfrentando 1 ml de
diluciones crecientes de suero fresco con 1 ml
de sistema hemoltico y determinando cul es
la mxima dilucin que produce 100% de lisis
despus de 30 minutos de incubacin a 37C.
El reactivo debe contener 2 unidades en 0,05
ml. Se conserva como el RP.
e) Sistema hemoltico: se lo prepara comp
se indic al hablar de valoracin de com ple
mento. La mezcla final debe contener partes
iguales de glbulos rojos de carnero al 5% y
hem olisina a la concentracin de 5 unidades

A c H j/m f.
f) Solucin frenadora de hemlisis: citrato
de sodio al 4% en NaCl 0,15 M.
g) Pipetas de 0,2, 1 ml y 5 ml.
h) Gradillas, bao termorregulado, centrfu
ga.
i) Espectrofotmetro.

C u ad ro 22-6
% de Usis

Factor

% de Usis

Factor

20

0,68

23
25
28
30
33
35
38
40
43
45
48
50

0,71
0,73
0,77
0,79
0,82
0,85

53
55
58
60
63
65

1,03
1,06
1,09

0,88
0,90
0,93
0,95
0,98

68
70
73
75
78
80

1,12
1,16
1,19
1,23
1,26
1,31
1,35
1,43
1,49

i
5p
1
ei
li
II
1
i

Complemento

433

Para establecer las unidades de properdina se

aplica la siguiente ecuacin;

Mtodo
La properdina se valora de acuerdo con los
esquemas indicados (Primera y Segunda etapa).
Las valoraciones de hemoglobina en las se
ries de diluciones correspondientes a los tubos
A y B se efectan al espectrofotmetro, a 565
nm, leyendo en DO.
Las unidades de complemento residual (C3)
se calculan de manera similar a la indicada en
valoracin de RP, correspondiendo los tubos
11 y 12 al O y 100% de lisis respectivamente.
La serie del tubo A indica el complemento
(C3) existente en RP, no fijado por el sistema
properdina-Zimosn, ms el C3 propio del sue
ro a valorar. La serie del tubo B corresponde a
la suma del C3 existente en RP y el del suero
en valoracin.

[CHjo (tubo B) - CH 50 (tubo A)] x 4 x 10

120

por mi, o en su forma simplificada;

[CHjo (tubo B) - CH 5Q(tubo A)]
------------------------------------------------: U de properdina p o r m i
3

En la ecuacin los valores indicados corres

ponden a:
4; V o lu m en de v a lo ra c i n 0,5 m i de
un v o lu m en in ic ia l 2 m i. D ilu c i n
2/0,5 = 4.
10; La cantidad de suero a valorar que se
enfrenta con 1 mi de RP es 0,1 mi. D i
lucin 1/0,1 = 10.
120: Como 1 unidad de properdina co rres
ponde a la inactivacin de 120 unida
des de C3, es necesario dividir por 120
a las unidades de C3 consumidas para
establecer las unidades de properdina
por mi.

P rim era etapa

Tubos

Suero a valorar
Reactivo RP
Suspensin de Zim osn
(0,15 m g/ 0,1 mi)
B ufer V eronal-salina

0,1
1
0,1

0,1
1

0,8

0,9

Los sueros a valo rar deben ser fre sc o s y

mantenidos en bao de hielo hasta su uso. En
caso contrario debe conservrselos congelados
a -4 0 C no ms de una semana.

Incubar una hora a 37C

C entrifugar a 3,500 rpm durante 5 minutos

Segunda etapa
Tubos
Sobrenadante A (0,5 m i) diluc.
S obrenadante B (0,5 m i) diluc.
R eactivo R3
B uffer V eronal-salina
A gua destilada
Sistem a hem oltico
Solucin frenadora (citrato-salina)

1:4

1:8

1:16

1:32

1:64

10

II

12

1:32
0,05
0,45

1:64
0,05
0,45

1:128
0,05
0,45

1:256
0,05
0,45

0,05
0,45

1:16
0,05
0,45

0,05
0,95

0,05

0,05
0,45

0,05
0,45

0,05
0,45

0,05
0,45

0,95
In cu b ar 30 minutos a 37C
3
3
3
3

Centrifugar a 3. 500 rpm durante 5 m inutos y leer

en el fobrenadante la hem oglobina liberada

El mtodo se funda en la determinacin de

las unidades VAH^p en un suero, utilizando un
reactivo al que se le ha eliminado el com po
nente B.

Mg^+. A 0,95 mi de suero dializado aadir 0,05

mi de una solucin constituida por MgCl^ 100
nM, EGTA 100 mM, pH 7,2 (reactivo RBM gEGTA).
Otros reactivos. Son los indicados en la va
loracin de la actividad funcional del com ple
mento en unidades VAtL.

Materiales

Mtodo

R eactivo carente del com ponente B (RB).

Mezclar 9 volmenes de suero humano fresco
con un volumen de EDTA 0,086 M. Calentar a
50C por 20 minutos y dializar a 4C contra ex
ceso de buffer de M ayer carente de Ca^+ y

P reparar diluciones de suero en D FC-V A

como se indic para VAH^q.
En una batera de tubos colocar 0,2 mi de las
diluciones del suero que se ha de ensayar, 0,2
mi de RB-Mg-EGTA y 0,2 mi de glbulos ro

DOSAJE DE LA ACTIVIDAD
FUNCIONAL DE PROPERDINA

434

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

jos de conejo al 1% en DFC-VA, continuando

la reaccin com o se indic para dosaje del
complemento en unidades VHAjp.
Los resultados son expresados por compara
cin con la lisis obtenida en presencia de dilu
ciones de una mezcla de sueros normales de re
ferencia.
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plem ent system . En: P rogress in Im m u n o lo g y V. pp.
385-452. A cadem ic P ress Inc., 1983.

Inflamacin

NORMA SPEZIALE

M EC A N ISM O S BSICOS
DE LA INFLAMACIN
1. CARACTERSTICAS DEL PROCESO
INFLAMATORIO
La inflamacin es un proceso cjue ocurre lue
go de la injuria a un tejido. Puede ser descripta
como una respuesta de irritacin a la injuria. Se
caracteriza por presentar movimiento de fluido,
protenas plasmticas y leucocitos a los tejidos
en respuesta a la injuria, invasin microbiana o
antgenos.
El propsito de esta respuesta es la de conte
ner o destruir la injuria patgena y retirar del
tejido los desechos que resultaron de la re s
puesta inflamatoria.
La inflamacin se caracteriza por la presen
cia de calor, rubor, edema, dolor y prdida de
la funcin celular. Todos estos signos ocurren
como consecuencia directa de cambios en la
permeabilidad vascular que permite el escape
de electrlitos, macromolculas y clulas desde
los vasos sanguneos al espacio extravascular.
La inflamacin es un proceso complejo que
involucra a num erosos mediadores de origen
celular y plasmtico con efectos biolgicos interrelacionados.
Las fases de la inflamacin se han definido
como aguda, crnica y de resolucin. En la in
flamacin aguda, los vasos sanguneos se dila
tan, razn por la cual se presenta calor y rubor
en el rea. El edema es producido por el escape
de fluidos y clulas al tejido extravascular. El
dolor y la prdida de funcin que acompaan a
la inflamacin se deben a la presin ejercida en
las terminales nerviosas por la acumulacin de
lquido extravascular y a la liberacin de m e
diadores qumicos.

23
La reaccin inflam atoria es un iliecanismo
vital de defensa, que provee el medio p o r el
cual factores protectivos tales como anticuer
pos, com plem ento y clulas fagocticas, que
norm alm ente se encuentran confinadas en el
torrente circulatorio, puedan penetrar en el teji
do y ganar el acceso a los sitios de invasin por
elementos extraos. Por lo tanto, la inflamacin
es considerada como un medio destinado a fo
calizar los mecanismos inmunolgicos protecti
vos en una regin localizada dentro del tejido.
El proceso inflamatorio en su fase aguda se
inicia con la liberacin local de mediadores que
aum entan el flujo sanguneo de los capilares
cercanos e inducen trasvasacin de plasm a al
tejido. Posteriorm ente, se produce activacin
de los sistemas de complemento y de coagula
cin. Asimismo, las clulas inflamatorias circu
lantes y las endoteliales liberan mediadores so
lubles de la inflamacin y productos biolgica
mente activos. Estos mediadores tam bin tie
nen efectos sistmicos, provocando fiebre, neutrofilia y la respuesta de fase aguda (APR).
En las inmediaciones del sitio de la injuria,
los neutrfilos se acumulan en loscapilares y
en las vnulas poscapilares, cruzan la capa endotelial y se mueven hacia la fuente de los m e
diadores inflamatorios. En el sitio de inflam a
cin, los neutrfilos fagocitan el material extra
o, liberan enzimas digestivas, protenas bacte
ricidas y potentes oxidantes.
Siguiendo a la fase aguda, se produce un re
clutamiento de monocitos, macrfagos y linfo
citos en el sitio de la injuria. Los monocitos y
macrfagos ingieren y/o matan a los agentes in
fecciosos o al material extrao que fue resisten
te a la accin de los neutrfilos. Adems, estas
clulas digieren y retiran el tejido daado que
no ha sobrevivido a la respuesta inflamatoria.

434

Mecanismos efectores de ia respuesta inmune

jos de conejo al 1% en DFC-VA, continuando

la reaccin com o se indic para dosaje del
complemento en unidades VHAjp.
Los resultados son expresados por compara
cin con la lisis obtenida en presencia de dilu
ciones de una mezcla de sueros normales de re
ferencia.
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Inflamacin

NORMA SPEZIALE

M EC A N ISM O S BSICOS
DE LA INFLAMACIN
1. CARACTERSTICAS DEL PROCESO
INFLAMATORIO
La inflamacin es un proceso cjue ocurre lue
go de la injuria a un tejido. Puede ser descripta
como una respuesta de irritacin a la injuria. Se
caracteriza por presentar movimiento de fluido,
protenas plasmticas y leucocitos a los tejidos
en respuesta a la injuria, invasin microbiana o
antgenos.
El propsito de esta respuesta es la de conte
ner o destruir la injuria patgena y retirar del
tejido los desechos que resultaron de la re s
puesta inflamatoria.
La inflamacin se caracteriza por la presen
cia de calor, rubor, edema, dolor y prdida de
la funcin celular. Todos estos signos ocurren
como consecuencia directa de cambios en la
permeabilidad vascular que permite el escape
de electrlitos, macromolculas y clulas desde
los vasos sanguneos al espacio extravascular.
La inflamacin es un proceso complejo que
involucra a num erosos mediadores de origen
celular y plasmtico con efectos biolgicos interrelacionados.
Las fases de la inflamacin se han definido
como aguda, crnica y de resolucin. En la in
flamacin aguda, los vasos sanguneos se dila
tan, razn por la cual se presenta calor y rubor
en el rea. El edema es producido por el escape
de fluidos y clulas al tejido extravascular. El
dolor y la prdida de funcin que acompaan a
la inflamacin se deben a la presin ejercida en
las terminales nerviosas por la acumulacin de
lquido extravascular y a la liberacin de m e
diadores qumicos.

23
La reaccin inflam atoria es un iliecanismo
vital de defensa, que provee el medio p o r el
cual factores protectivos tales como anticuer
pos, com plem ento y clulas fagocticas, que
norm alm ente se encuentran confinadas en el
torrente circulatorio, puedan penetrar en el teji
do y ganar el acceso a los sitios de invasin por
elementos extraos. Por lo tanto, la inflamacin
es considerada como un medio destinado a fo
calizar los mecanismos inmunolgicos protecti
vos en una regin localizada dentro del tejido.
El proceso inflamatorio en su fase aguda se
inicia con la liberacin local de mediadores que
aum entan el flujo sanguneo de los capilares
cercanos e inducen trasvasacin de plasm a al
tejido. Posteriorm ente, se produce activacin
de los sistemas de complemento y de coagula
cin. Asimismo, las clulas inflamatorias circu
lantes y las endoteliales liberan mediadores so
lubles de la inflamacin y productos biolgica
mente activos. Estos mediadores tam bin tie
nen efectos sistmicos, provocando fiebre, neutrofilia y la respuesta de fase aguda (APR).
En las inmediaciones del sitio de la injuria,
los neutrfilos se acumulan en loscapilares y
en las vnulas poscapilares, cruzan la capa endotelial y se mueven hacia la fuente de los m e
diadores inflamatorios. En el sitio de inflam a
cin, los neutrfilos fagocitan el material extra
o, liberan enzimas digestivas, protenas bacte
ricidas y potentes oxidantes.
Siguiendo a la fase aguda, se produce un re
clutamiento de monocitos, macrfagos y linfo
citos en el sitio de la injuria. Los monocitos y
macrfagos ingieren y/o matan a los agentes in
fecciosos o al material extrao que fue resisten
te a la accin de los neutrfilos. Adems, estas
clulas digieren y retiran el tejido daado que
no ha sobrevivido a la respuesta inflamatoria.

436

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

Finalmente, se produce la etapa de resolu

cin. sta comienza cuando las clulas viables
del sitio de inflamacin, o cercanas al mismo,
comienzan a proliferar con el objeto de restau
rar la arquitectura normal del tejido y su fun
cin. Segn la magnitud y la naturaleza de la
injuria, puede ocurrir: retorno a la estructura y
funcin normal del tejido; formacin de cica
triz y funcin tisular alterada; form acin de
absceso o bien persistencia del proceso infla
matorio crnico.
Para su mejor comprensin, analizaremos en
primer trmino los elementos que participan de
la respuesta inflamatoria y luego estudiaremos
la dinmica del proceso inflamatorio.

para C3b (CR3) y pueden unirse a las clulasopsonizadas preparando la ingestin. La fija
cin del componente C3b a las clulas blanco
tambin incrementa la lisis por clulas NK a
travs de la citotoxicidad mediada por clulas
dependiente de anticuerpos.
El resultado de la interaccin de estos facto
res es la habilidad de la activacin local del
complemento a inducir aumento del flujo san
guneo al tejido afectado, qujmiotaxismo, acti
vacin de fagocitos neutrfilos y mononuclea
res, secrecin de citoquinas, amplificacin del
efecto del complemento y aumento de las de
fensas inmunolgicas.
2.1.b Sistema de activacin p or contacto

2. ELEMENTOS QUE INTERVIENEN

EN LA RESPU ESTA INFLAMATORIA
2.1. Factores plasmticos
El plasma contiene factores que aumentan la
funcin de las clulas inflamatorias.
El complejo proceso inflamatorio es, en pri
mer trmino, iniciado y propagado por compo
nentes del sistema del complemento, el sistema
de coagulacin (factores de contacto), las quini
nas y los componentes del sistema fibrinoltico.
2.1.a E l sistema de complemento
El sistem a de com plem ento es uno de los
importantes mediadores de la inflamacin. La
accin del com plem ento incluye destruccin
celular, inflamacin y efectos inmunolgicos.
La activacin del complemento produce pp
tidos que median la quimiotaxia, la anafilaxia,
la vasodilatacin y la secrecin celular de citoquinas. Los componentes C3a y C5a actan co
mo anafilotoxinas, causando degranulacin de
clulas mastoideas y de basfilos, liberando
histamina y otros mediadores. De este proceso
resulta la produccin de vasodilatacin, enroje
cimiento, hinchazn y otros efectos que inclu
yen la contraccin del misculo liso y la secre
cin de mucus por las clulas de las vas respi
ratorias.
El componente C5a es un potente estmulo
qumico para la migracin de neutrfilos, mo
nocitos y eosinfilos al rea de la inflamacin.
Adems, unido a la superficie de los neutrlos estimula su adherencia, degranulacin y es
tallido respiratorio. El C5a tambin induce la
liberacin del factor de necrosis tumoral (TNF)
e interleuquina 1 (IL-1), incrementando de esta
forma la respuesta inflamatoria.
El C3b, que proviene del clivaje de C3, cu
bre a las clulas blanco (opsonizacin). Las c
lulas fagocticas poseen receptores especficos

Existen una serie de protenas que se activan

por contacto con sustancias naturales, tales co
mo cristales de urato de sodio, cristales de pirofosfato de calcio, sulfato de colesterol y homocistena. Estas protenas conforman lo que se
conoce como sistem a de contacto. F unda
mentalmente son cuatro las protenas que com
ponen este sistema: el factor XII (factor Hageman), la pre-calicrena, el factor XI (anteceden
te plasmtico de tromboplastina) y un quiningeno de alto peso molecular.
El factor XII, como iniciador de la va de
contacto, sufre cambios conformacionales lue
go de la unin a superficies cargadas negativa
mente. Adems, la autoactivacin del factor
XII provee una pequea concentracin de fac
tor XII activado (factor Xlla) que convierte a la
pre-calicrena en calicrena (fig. 23-1). Esta ca
licrena activa al factor XII en presencia de quiningeno de alto peso molecular. En ausencia
de una superficie slida, la activacin del fac
tor XII por calicrena puede ocurrir en fase flui
da, aunque la velocidad es mucho menor. El
factor XII tam bin puede ser activado por el
factor XI o por la plasmina, pero estos activa
dores tiene una potencia diez veces menor. Los
sustratos para la forma activada del factor XII
incluyen a: la pre-calicrena (HK), el factor XI,
el primer componente del complemento (Cl), el
quiningeno de alto peso molecular y el factor
VII. Por lo tanto, el factor XII es el responsable
de la activacin no inmunolgica de la va cl
sica del complemento.
La pre-calicrena plasmtica humana (factor
Fletcher), es una y-globulina, que circula en el
plasma en un 75% formando un complejo con
el quiningeno de alto peso molecular, mientras
que el 25% restante circula en forma libre. La
enzima activa, calicrena, se forma por clivaje
de la pre-calicrena (zimgeno) por accin del
factor X lla o los fragmentos del factor XII.
El factor XI humano es activado a factor
X la por clivaje producido por el factor X lla.

Inflamacin
Los sustratos para este factor activatio incluyen
a: el quiningeno de alto peso m olecular, el
plasmingeno y el factor IX (fig. 23-1). Virtualrnente todo el factor XI forma un complejo
con el quiningeno de alto peso molecular que
de esta forma lo protege de su inhibidor.
Para la activacin por contacto se requiere el
quiningeno de alto peso m olecular humano
(HK), razn por la cual se lo denomina cofactor de la activacin por contacto. Existen dos
tipos de quiningeno en el plasma humano: una
forma de alto peso molecular (120 kD) que es
rpidamente clivada por la calicrena plasmti
ca humana, y una de bajo peso molecular (67
kD) que es ms rpidamente proteolizada por
la calicrena tisular. El quiningeno de alto pe
so molecular es una y-globulina que existe en
el p lasm a y p o see una cad en a liv ia n a (56
kD)(D5-D6) que le confiere la actividad coagu
lante. El quiningeno de bajo peso molecular
tambin existe en el plasma y contiene una ca
dena liviana diferente (5 kD), cuya funcin no
se conoce. Ambos tipos de quiningeno contie
nen bradiquinina (D4) y dos regiones de cade
nas pesadas idnticas (D1-D3) (fig. 23-2). El
quiningeno de alto peso molecular es sinteti
zado en el hgado y se encuentra presente en
plaquetas humanas, neutrfilos y en las clulas
endoteliales.
El quiningeno de alto peso molecular incre
menta directamente la formacin y funcin del
factor XII, de la pre-calicrena y del factor XI.
De esta forma la activacin ocurre en forma
ptima. El dominio D5 contiene cargas positi
vas debido a la presencia de residuos de histidi
nas y Usinas que facilitan la interaccin con su
perficies negativas. El dominio D6 posee una
secuencia de aminocidos especfica que une
tanto pre-calicrena como factor XI, brindando
as estos zimgenos a la superficie para el cli
vaje por el factor X lla.
La calicrena plasm tica hum ana cliv a al
quiningeno de alto peso molecular en tres eta
pas secuenciales. En el segundo clivaje se libe
ra bradiquinina, m ediadora de la inflam acin
(fig. 23-2).
Interaccin entre el sistema de contacto
y los neutrfilos
Considerando el im portante papel que ju e
gan los neutrfilos en la inflamacin es intere
sante describir su interaccin con la va de las
protenas de contacto.
El factor X lla humano estimula la agrega
cin y degranulacin de los neutrfilos. La es
pecie activa de la calicrena humana, pero no
su forma zimgeno inactiva, es quimiotctica
para los neutrfilos. La exposicin de los neu
trfilos a niveles quim iotcticos de calicrena

437

plasmtica aumenta la gliclisis aerbica y la

actividad del cam bio de va (shunt) de las
pentosas. Los neutrfilos, en presencia de ca
tiones divalentes (calcio y magnesio), se agre
gan en repuesta a calicrena plasmtica huma
na. Esta interaccin est asociada con la esti
mulacin del estallido respiratorio de los neu
tr filo s, como se indica por el aum ento del
consumo de oxgeno. La calicrena plasmtica
tambin induce, en los neutrfilos, la liberacin
de la elastasa de sus grnulos azurfilos.
El quiningeno de alto peso m olecular se
une a los neutrfilos en forma especfica, rever
sible y saturable. Se requiere dicha unin para
la ptima estimulacin de los neutrfilos por la
calicrena.
2.1.C Sistema de las quininas

La bradiquinina es generada por el clivaje

del quiningeno de alto pesQ molecular por ac
cin de la calicrena. La bradiquinina es un nonapptido con la secuencia de aminocidos:
Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg.
De todos los mediadores de la inflamacin,
la bradiquinina juega un papel muy importante.
Todos los sntomas y signos cardinales de la
inflamacin se observan cuando la bradiquini
na se inyecta en piel humana. En prim er trmi
no hay dolor, debido a la estimulacin de las
terminales sensoriales de las fibras C y luego la
liberacin de sustancia P, la cual adhiere a la
inflamacin el componente neurognico.
Posteriormente, estalla el reflejo axonal cau
sado por la vasodilatacin y el edema creado
por el aumento de permeabilidad vascular y la
extravasacin de protenas y fluidos. E n segui
da, la liberacin de citoquinas desde los mono
citos, inducida por la bradiquinina, atrae a los
leucocitos al sitio de inyeccin. Es de particu
lar importancia la capacidad de la bradiquinina
de liberar citoquinas tales como IL-1 y TNF, y
otros mediadores, de los cuales las prostaglan
dinas y los leucotrienos, ambos form ados por
estimulacin de la fosfolipasa A^, son los ms
frecuentemente formados.
La mayora de los efectos de la bradiquinina
son mediados por receptores conocidos como
BK,. Distinto a cualquier otro pptido, la bradiquiina prom ueve todas las seales de trans
duccin a nivel celular: a) movilizacin de cal
cio, b) transporte de cloruro, c) activacin de la
fosfolipasa especfica para fosfatidilinositol, d)
sntesis de xido ntrico, cuyo resultado es la
formacin de GMPc, e) estimulacin de la fos
folipasa A,, la cual form a prostaglandinas y
leucotrienos, f) estimulacin de la adenil ciclasa que produce aumento de AMPc.
Como parte de la respuesta inflamatoria, los
neutrfilos, luego de recibir la seal quimio-

438

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

^ hkJ
Xil

Pre-cai

X lla

H K '\ cal

HK
Conversin
Activacin

01

_C5 /

Ccia .

F ig. 23-1. A ctivacin del sistem a de contacto.

tctica, se marginan y adhieren a la pared del

endotelio vascular. Luego de la adhesin de los
neutrfilos a las clulas del endotelio, la prxi
ma etapa es la apertura de las uniones endote
liales cjue permiten la migracin de los neutr
filos hacia el espacio del tejido intersticial. En
esta etapa se torna importante la presencia de la
bradiquinina (fig. 23-3).

F ig . 23-2. Estructura del quiningeno de alto peso m ole

cular.

La reciente descripcin de la presencia de

calicrena tisular y la de quiningeno de alto y
bajo peso molecular en los neutrfilos, as co
mo la de pre-calicrena en su superficie, provee
un nuevo mecanismo para la diapdesis de los
neutrfilos entre las clulas de los capilares.
Los neutrfilos tienen receptores para quinin
geno de alto peso molecular y debido a que la
pre-cahcrena plasmtica se localiza con el qui
ningeno de alto peso molecular en la superfi
cie de la membrana, se produce la activacin
de esta enzima generando bradiquinina en las
inmediaciones. La bradiquinina tiene un poten
te efecto sobre las clulas endoteliales, causan
do retraccin de las mismas y permitiendo, por
lo tanto, ia migracin de los neutrfilos y la
exudacin de constituyentes del plasma. Simul
tneamente, los neutrfilos secretan pro-gelatinasa y procolagenasa, las cuales son activadas
por la calicrena tisular. La accin de la gelatinasa y de la colagenasa facilita el movimiento
de los neutrfilos a travs de la membrana ba
sal y el pasaje a travs de las uniones al espacio
del tejido intersticial.
La funcin de generar bradiquinina cerca de
las uniones endoteliales puede no estar restrin
gida a la calicrena tisular. Los neutrfilos tie
nen una serie de enzimas con capacidad de for
mar quininas. Son quininogenasas que se en-

Inflamacin
Fig. 23-."?. P a r ti c ip a
cin de la bradiquinina.
'

Seales quimiotcticas

' Injuria

c a l.

y'fPK

BK

__ /

-Colagenasa

( _

< ss>
Diapdesis

cal

;<Flbringeno
PIgn

-H.

Pin

^Fibrina

FIBRINLI5S
Fig. 23-4. F ibrinlisis,

439

440

Mecanismos efectores de ia respuesta inmune

cuentran depositadas intracelularm ente en los

grnulos citoplasmticos. Los mecanismos que
movilizan los grnulos que contienen las enzi
mas hacia la membrana plasmtica y los facto
res que controlan la risin no se han dilucida
do, aunque se ha demostrado la existencia de
exocitosis durante el proceso de adherencia y
de diapdesis de los neutrfilos.
2.1.d SistemafibrinoUtico
El sistema fibrinoltico regula la deposicin
de fibrina en los vasos sanguneos y en los teji
dos.
Siguiendo a la formacin de la placa hemos
ttica, o del trombo, se inicia un perodo de di
solucin de la fibrina depositada. Esta reaccin
incluye una secuencia de activacin de precur
sores del plasm ingeno por activadores del
mismo.
C uando describim os las accio n es de los
miembros de la va del sistema de contacto,
mencionamos al plasmingeno como sustrato
del factor X lla, fragmentos del factor XII, cali
crena y del factor Xla. El plasmingeno es ac
tivado para formar plasmina y, de esta forma,
el sistema fibrinoltico sera iniciado por la va
del sistema de contacto.
Una de las vas por la cual el plasmingeno
es activado a plasmina, para iniciar la fibrinlisis, es por accin de la uroquinasa. La pro-uroquinasa (ProUK), es convertida a uroquinasa
(UK) por la calicrena (Kal), de esta forma, se
poi.c en evidencia el papel iniciador de la va
de contacto de la coagulacin intrnseca en la
fibrinlisis. Por lo tanto, el mismo mecanismo
que inicia la coagulacin tambin da comienzo
a la fibrinlisis.
El componente clave de la va fibrinoltica es
el plasm ingeno (Plgn). El plasm ingeno es
una cadena polipeptdica simple (80 kD), que
es activada a plasm ina por clivaje producido
por la accin de la uroquinasa. Posteriormente,
son sustrato de la plasmina, la fibrina y el fibringeno, inicindose la fibrinlisis (fig. 23-4).
La fibrinlisis tam bin puede ser iniciada
por un mecanismo dependiente de los neutrfi
los. Las proteasas liberadas de los neutrfilos,
luego de la migracin al sitio de inflamacin,
degradan al fibringeno. Los neutrfilos unen
especficamente fibringeno y fibrina y pueden
estar involucrados en la disolucin de las pla
cas.

ma y calor) son producidos, por lo menos en

parte, por mediadores lipdicos tales como los
eicosanoides y el factor activador de plaquetas
(PAE), que son sintetizados de novo desde
los fosfolpidos de las membranas de las clu
las inflamatorias.
Los eicosanoides son productos oxigenados
de 20 tomos de carbono que derivan, en la
mayora de los casos, del cido araquidnico, y
son generados por la accin de tres clases de
en zim as in tra c elu la re s: la c ic lo -o x ig e n a sa
(COX) que genera prostaglandinas y tromboxano; las lipoxigenasas que generan leueotrienos,
lipoxinas e hidroxicidos, y la epoxigenasa,
que genera epoxicidos. En el cuadro 23-1 se
resumen las acciones pro-inflamatorias de estos
mediadores.
Seales para la liberacin del precursor
Los mediadores lipdicos no se encuentran
depositados en las clulas sino que su sntesis
es iniciada por diversos estm ulos. El cido
araquidnico deriva de la dieta o bien de la
transformacin del cido graso esencial linoleico. Se deposita en la bicapa lipd ica de las
membranas celulares esterificando a fosfolpi
dos tales como fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina y fosfatidilinositol. As, la etapa lim i
tante en la sntesis de eicosanoides es la libera
cin del cido araquidnico por la accin de la
fosfolipasa A 2. Esta fosfolipasa, en particular,
degrada la unin ster del cido araquidnico
al glicerol del fosfolpido precursor. En m u
chos tejidos, la fosfolipasa A^ es una enzima
asociada a membranas, dependiente de calcio y
es activada por aumento de la concentracin
del calcio intracelular. As, la biosntesis de ei
cosanoides puede ser iniciada por una gran va
riedad de estm ulos con capacidad de in cre
mentar la concentracin del calcio intracelular.
Esto puede ocurrir a travs de la transduccin
de seales mediadas por la interaccin de hor
monas o neurotransmisores con sus receptores
especficos, o a travs de alteraciones de la in-

C u a d ro 23 - 1 . A cciones pro-inflam atorias

de los mediadores lipdicos
Signo cardinal
D olor

PGE2, LTB4, PAF

R ubor

PGE2, PGI2, LTB 4

LXA4, PAF

2.2 M ediadores lipdicos

Introduccin
Muchas evidencias sugieren que los signos
cardinales de la inflamacin (rubor, dolor, ede

M ediadores lipdicos

Calor

PGEj, PGI2, LXA4, PAF

Edem a

PGE2, LTB4, LTC4. LTD4

LTE4, PAF

Inflamacin
tegridad de la membrana mediada por agentes
fsicos, qumicos, o el trauma. Por ejemplo, la
trombina, un potente agonista plaquetario, esti
mula la liberacin de tromboxano
por las
plaquetas, debido a su interaccin con los re
ceptores de la membrana. La interaccin de la
hormona con el receptor, a travs de la activa
cin de una protena que une GTP y que tiene
propiedades de GTPasa (protena G), inicia una
cascada de reacciones que culminan con un au
mento del calcio intracelular, la activacin de
la fosfolipasa A 2 y la liberacin del cido ara
quidnico, seguida por la biosntesis y libera
cin de eicosanoides en las inmediaciones del
tejido.
Transform acin del precursor
El destino del cido araquidnico (20:4) li
berado de su depsito en los fosfolpidos de la
membrana, es especfico de las clulas en cues
tin y depende de la presencia de las enzimas
que transform an al cido araquidnico, tales
como las ciclo-oxigenasas (COX) y las lipoxigenasas y luego de la presencia de sintetasas
especficas que convierten a los productos del
cido araquidnico en eicosanoides biolgica
mente activos (fig. 23-5). El cido araquidni
co es convertido a prostaglandinas por la ac
cin inicial de la ciclo-oxigenasa, mientras que
los leucotrienos y las lipoxinas son formadas
por la accin in icial ce las lip o x ig en asas.
M ientras que la ciclo-oxigenasa se encuentra
presente en todas las clulas de los mamferos
excepto en los eritrocitos, la lipoxigenasa se
encuentra principalmente expresada en los neu
trfilos, eosinfilos, monocitos, macrfagos y
clulas mastoideas.
Otros cidos grasos pueden ser sustrato de la
ciclo-oxigenasa y las lipoxigenasas, com o el
cido di-homogamahnolnico (20:3) y el cido
eicosapentaenoico (20:5) formando productos
con propiedades biolgicas de diferente poten
cia pero del mismo tipo que los eicosanoides
derivados del cido araquidnico. Este hecho
dio origen a los estudios sobre la importancia
de la dieta de grasas en la salud hum ana, ya
que el cido graso 20:3 es de origen vegetal, el
20:4 de origen animal y los pescados son ricos
en cido graso 20:5 (fig. 23-6).
H istricam ente se consideraba a la ciclooxigenasa como el nico sistema enzim tico
expresado constitutivamente en la mayora de
los tejidos e involucrado en la produccin de
prostaglandinas pro-inflamatorias en el sitio de
inflamacin. Sin embargo, adems de la bien
conocida forma constitutiva de la ciclo-oxige
nasa (CO X-1), se ha descrito recientem ente
una segunda form a (COX-2), la cual no se en
cuentra constitutivamente expresada sino que

441

es inducida en macrfagos, fibroblastos o clu

las endoteliales por agentes pro-inflamatorios
incluido lipo-polisacrido e in terleu q u in a-1.
La induccin de COX-2 y su posterior activa
cin es la responsable de la produccin exage
rada de PGEj observada en los procesos infla
matorios.
Es sabido que existen sitios para la produc
cin de prostaglandinas, que contribuyen a la
funcin fisiolgica normal. En la actualidad se
propone que mientras la COX-1 es constituti
vamente expresada en los diversos tejidos don
de las prostaglandinas ejercen funcin fisiol
gica, la COX-2 es inducida por m ediadores
pro-inflamatorios en el sitio de la inflamacin
y contribuye al curso fisiopatolgico de la in
juria.
Los glucocorticoides son potentes agentes
antiinflamatorios que inhiben la produccin de
prostaglandinas por inhibicin selectiva de la
expresin de COX-2 inducida por citoquinas,
m ien tras que no afectan la ex p resi n de la
CO X -1. Por el contrario, los analgsicos no esteroideos del tipo de la aspirina o indometacina
inhiben indiscrim inadam ente ambos tipos de
ciclo-oxigenasas.
Las clulas mononucleares responden, en el
sitio de inflamacin, a endotoxinas o factores
endgenos con la liberacin de citoquinas proinflamatorias como, IL-1 y TNF y aumentando
la sntesis de prostaglandinas. La dexametasona ejerce su efecto anti-inflamatorio a travs de
la selectiva inhibicin de la COX-2 inducida
por las citoquinas. Por lo tanto, los glucocorti
coides endgenos pueden, por lo menos en par
te, regular la produccin de prostaglandinas a
travs de la inhibicin crnica de la form a ind ucible de ciclo-oxigenasa, la C O X -2, para
m antener la fisiologa normal (fig, 23-7).
El factor activador de las plaquetas (PAF),
se sintetiza de novo, teniendo como precur
sores a los fo sfo lp id o s de las m em branas.
Tambin en este caso la fosfolipasa A 2 juega
una papel crucial. La fosfolipasa A^, p o r hidr
lisis de un fosfolpido de la membrana, la alquil-acil fosfatidilcolina, produce la liberacin
de una molcula precursora del PAF, llamada
hso-PAF (fig. 23-5).
Debido a la complejidad que presenta el sis
tem a de m ediadores lipdicos de la inflam a
cin, se tratarn por separado las vas de snte
sis como as tambin las acciones biolgicas de
cada clase.
2.2.a Las prostaglandinas y el trom boxano
L a va de las prostaglandinas y del trombo
xano se inicia cuando 1a enzima ciclo-oxigenasa convierte al cido araquidnico en endoperxido cclico (PGG2) por introduccin de ox-

442

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

Fosfolpidos

Fosfolipasa A2

cido araquidnico

LIso-PAF

15-LO

COX
5-LO

15-HETE

PGG2
5-LO

5-HETE

Acetil-transferasa

12-LO

''
Lxs

LTs

12-HETE

PGs
TxA2

! PAF

F ig. 23-5. M ediadores lipidiaos de la inflam acin.

geno molecular (fig. 23-8). Esta etapa enzim

tica puede ser bloqueada irreversiblemente por
aspirina y en forma reversible por compuestos
antiinflamatorios no esteroideos tales como la
indometacina.
El segundo endoperxido cclico (PGH^) es
generado enzim ticam ente a partir de PGG2
por reduccin del grupo perxido del C,j a gru
po hidroxilo. Como producto de esta reaccin
se originan grupos oxidantes que regulan la ac
cin de la cicloxigenasa y adems poseen im
portancia en el proceso inflamatorio.
Las prostaglandinas endoperxido PG G 2 y
PGI 2 poseen vida media muy corta y son raetabolizadas rpidamente para dar origen a sus
productos. Cuatro de ellos son prostaglandinas
(PGE^, PGF^a, PGD^ y PGI^), un compuesto
de 17 tomos de carbono(cido 12-L heptaenoico o HHT) que es acompaado por malonil
aldehido (MDA) y tromboxano A^.
La etapa de transformacin del cido araqui
dnico a prostaglandina endoperxido (PGHj)
es comn a todos los sistem as celulares. La

metabolizacin posterior del PGH2 depende de

la caracterstica de cada clula en particular, de
las enzimas que contenga y del balance en cofactores. As, las plaquetas sanguneas son ri
cas en trom boxano sintetasa y producen una
cantidad mayor de tromboxano; mientras que
en las clulas del endotelio vascular predomina
la prostaciclina sintetasa, formando PGI2. El
resto de las prostaglandinas (PGE,, PG F jtt y
PGD^) se encuentran difundidas rs am plia
mente y en mayor o menor proporcin son sin
tetizadas en casi todas las clulas del organis
mo (excepto glbulos rojos y linfocitos).
Las prostaglandinas interactan con recepto
res de superficie presentes en las clulas de di
versos tejidos. Por ejemplo, los linfocitos peri
fricos de sangre humana unen reversiblemente
PGEj con una
= 2 x 1 0 M. Se calcul que
los linfocitos poseen un mximo de 200 sitios
de unin por clula. El efecto de las prostaglan
dinas se prolonga a travs de los nucletidos
cclicos (fig. 23-9). Las PGE^, PGA^, PGD, y
PGL incrementan los niveles intracelulares de

Inflamacin

.PG,-

COOH

Fig. 23-6. Precursores de eicosanoides.

443

TxA,
LT,
cido di-homo y linolnico

COOH

cido araquidnico

COOH

A /"

<

TXA3

i/V

LT,

cido eicosapentaenoico

AMP cclico, que acta como segundo mensa

jero. Este mecanismo es similar al que opera en
la accin de agonistas adrenrgicos, histamina,
leetinas, enzimas proteolticas y hormonas polipepticas. Las prostaglandinas, adems, pue
den influir en el comportamiento celular a tra
vs de cambios de la funcin de la membrana,
a causa de alteraciones en lpidos, protenas,
composicin de glicoprotenas y por alteracio
nes en la captacin de nutrientes esenciales y
iones por la clula (particularmente calcio). El
aumento de AMP cclico en los linfocitos est
asociado con inhibicin de mitognesis, reduc
cin en la formacin de linfoquinas e inhibi

cin de citlisis mediada por linfocitos y la for

macin de la roseta de linfocito T.
Otro prostanoide, como la PCF^a, afecta la
sntesis de GMP cclico. Por lo tanto, prom ue
ve funciones como proliferacin celular, citoxicidad, produccin de linfoquinas y formacin
de rosetas de linfocitos T.
Los productos de la oxidacin del cido ara
quidnico estn involucrados en la produccin
de todos los signos cardinales de la inflamacin.
La vasodilatacin y el enrojecimiento son cau
sados por la liberacin en los tejidos de PG^,
PGEj, PGE, y PGDj. El efecto de estos com
puestos es antagonizado por el tromboxano A^.

cido araquidnico

^Glucocorticoides

CCX '

F ig . 23 -7. Inhibicin de
cicloxigenasas.

Efectos fisiolgicos
rin
estmago

Efectos inflamatorios
macrfagos
sinoviocitos

444

Mecanismos efectores de ia respuesta inmune

Aunque las prostaglandinas vasodilatadoras

son poco activas en el increm ento de la per
meabilidad vascular, tienen la habilidad de au
m entar el edema producido por bradiquinina e
histamina. La cantidad de protenas plasm ti
cas exudada de la red m icrovascular depende'
de la extensin de la perm eabilidad venular y
de la magnitud de la dilatacin arteriolar. Las
prostaglandinas vasodilatadoras dilatan arte
riolas, dando como resultado una dilatacin
pasiva de las vnulas por un incremento en la
presin hidrosttica en la luz de la vnula. El
incremento del rea de la pared venular y el in
cremento de la presin hidrosttica contribu
yen a la potenciacin del edema. As, la accin
com bin ada de los agente s v a so d ila ta d o re s
(prostaglandinas) y de aquellos que incremen
tan la perm eabilidad (bradiquinina e histam i

na) aumenta la cantidad de protenas exudadas.

Las prostaglandinas ms c'omprometidas con
este fenm eno son la PGE^ y la PGI^. Las
prostaglandinas, particularm ente la PGI^, ac
tan en form a sinrgica en la form acin de
edema con pptidos derivados del complemen
to (C5a). A diferencia de la bradiquinina y la
histamina, el C5a no acta directamente en la
vnula, sino que el aumento de permeabilidad
inducido por C5a depende de la interaccin
entre los polimorfonucleares y el endotelio de
las vnulas.
No se conoce con certeza la funcin de las
prostaglandinas en la produccin de fiebre, ya
que el cido araquidnico no es por s mismo
pirognico. Sin embargo, los antiinflamatorios
no esteroideos como indom etacina o aspirina
tienen efecto antipirtico.

Inflamacin
Con respecto al dolor, las prostaglandinas
E j , e 1^ p roducen dolo r de m odo sin rg ico
con la bradiquinina e histam ina. La PG Ij es
ms efectiva que la POE^ en la induccin de
dolor.
Esta capacidad se encuentra relacionada con
la propiedad que poseen estas prostaglandinas
de aumentar el AMPc.
Las prostaglandinas que producen aumento
de AMPc participan de la expresin del quinto
signo cardinal de la inflamacin, o prdida de
la funcin celular, a travs de la inhibicin de
la respuesta inmune.
La concentracin de prostaglandinas se en
cuentra aumentada en la lesin inflamatoria. Si
bien los polimorfonucleares son, en condicio
nes basales, pobres productores de estos eico
sanoides, es probable que durante el proceso
inflamatorio se encuentre activa la COX-2, in
ducida por mediadores de la inflamacin, pro
moviendo el aumento de la sntesis de eicosa
noides.

2.2.b L os leucotrienos
Las lipoxigenasas son enzimas que inician la
va de la conversin del cido araquidnico en
hidroperxidos no cclicos, los cidos hidroperoxitetranoicos (HPETE).
En los distintos sistemas celulares existen li
poxigenasas especficas que dan origen a diver
sos mediadores lipdicos. Por ejemplo, la 5 li
poxigenasa predomina en basfilos, polim orfo
nucleares y macrfagos, dando origen al hidroperxido 5-HPETE; la 12 lipoxigenasa d a ori
gen a 12-HPETE en plaquetas, pncreas y glo
m rulo renal. En reticulocitos, eosinfilos y
linfocitos T predomina la 15-lipoxigenasa dan
do origen a 15-HPETE.
Los leucocitos, a partir exclusivam ente del
5-HPETE, forman una familia de cidos 5-hidroxieicosatetraenoicos llamados leucotrienos.
La form acin de un grupo epoxi en posicin
5-6 da origen al leucotrieno A^ el cual se trans
forma en el leucotrieno B, (fig. 23-9).

COOH

W r= y \A Z

445

cido araquidnico

5-LO
OOH
COOH

OH
COOH
COOH

C 3H,,

S-cistena-glicina
c. glutmico
LTC ,

Leucotrieno A4
OH
CO O H

OH

LTB,

COOH
C 5H,,

\ =

Fig. 23-9. B iosntesis de leucotrienos.

5-cistena
LTE,

446

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

U na va alternativa de transform acin del

leucotrieno
es mediada por la accin de la
glutatin-S-transferasa, que cataliza la adicin
de glutatin, para dar origen al leucotrieno C^.
La prdida posterior de cido glutmico, es en
zimticamente mediada por la glutamil trans
peptidasa formando leucocitrieno D^. En forma
secuencial, tambin el leucotrieno D4 es con
vertido en leucotrieno
por accin de una cistenilglicinasa (fig, 23-9).
Es interesante destacar que, en la transfor
macin secuencial del leucotrieno Q , los pro
ductos originados poseen propiedades biolgi
cas cualitativamente comparables, pero la po
tencia de accin se incrementa con la metaboli
zacin, llegando el leucotrieno E^ a constituirse
en el ms activo.
Los leucotrienos C^,
y E^ son potentes
agentes estim ulantes de la contraccin de la
musculatura lisa y de los vasos sanguneos, sin
tetizados en diversos tejidos, el pulm n los
produce en cantidades considerables, actuando
como agentes broncoconstrictores y participan
do en forma preponderante en la patologa del
asma. Los leucotrienos C^,
y E^ son los prin
cipales constituyentes de la sustancia de libera
cin lenta de la anafilaxis (SRS-A), trmino in
troducido en 1938 por Eeldberg y Kellaaway.
En el anlisis del efecto biolgico de los leu
cotrienos, debemos distinguir las acciones del
leucotrieno
y los efectos biolgicos de los
leucotrienos que conforman la SRS-A.
El leucotrieno B^ es un potente activador de
la funcfn y comportamiento del leucocito. Sus
actividades biolgicas principales residen en la
produccin de agregacin de los leucocitos y
estimulacin de la funcin leucocitaria. Es el
factor quimiotctico ms potente conocido has
ta el momento. En este contexto ejerce una se
rie de efectos citotcticos. Estos comprenden
acumulacin de neutrfilos en las zonas donde
se producen cantidades ligeram ente aumenta
das de leucotrieno B^ (25-100 ug), neutropenia,
adherencia y diapdesis de leucocitos desde los
vasos sanguneos pequeos e incremento de la
perm eabilidad vascular en p resen cia de las
prostaglandinas vasodilatadoras.
El leucotrieno B^ es un mediador natural de
la inflamacin. Es sintetizado por los leucoci
tos presentes en el exudado que se produce en
el proceso inflam atorio en desarrollo, y sus
efectos se asemejan y suplementan a los produ
cidos por el pptido que deriva del complemen
to C5a, el cual es formado en fase fluida. La in
teraccin posterior es con las prostaglandinas,
causando aumento en la permeabilidad vascu
lar y formacin local de edema. As las prosta
glandinas, el C5a, y el leucotrieno B^ pueden
actuar en forma secuencial y en combinacin
para producir la permeabilidad vascular y la in

filtracin celular que caracteriza a la respuesta

inflamatoria.
Existen otros efectos del leucotrieno B^ so
bre los leucocitos, tales como expresin de re
ceptores de superficie, aumento de la expresin
de los receptores de C3b en eosinfilos e incre
mento de los niveles de GMP cclico intracelu
lar. Tambin, y como parte del mecanismo ac
tivador de leucocitos, incluye la estimulacin
en la captacin de Ca^^ extracelular y D-fucosa.
Sin embargo, ejercen un efecto mnimo en la
produccin de aniones superxido y liberacin
de enzimas lisosomales.
La importancia biolgica de los leucotrienos
constituyentes de la SRS-A (leucotrienos C, D,
E) reside principalmente en los efectos sobre
las vas respiratorias y, por lo tanto, como m e
diadores de los fenmenos de hipersensibilidad
y asma. Tambin funcionan como importantes
mediadores qumicos de la inflamacin por su
accin en el lecho microvascular. As, los leu
cotrienos C 4,
y E^ producen exudacin del
plasma de las vnulas poscapilares con una efi
cacia 100 veces mayor que la histamina. El au
mento de perm eabilidad producido por estos
leucotrienos es directo sobre las clulas endote
liales, ocurre rpidamente y no requiere libera
cin de histamina, prostaglandinas, ni presen
cia de polimorfonucleares. Por lo tanto, la p re
sencia nica de leucotrienos C, D y E origina
edema, contribuyendo a la m anifestacin de
uno de los signos cardinales del proceso infla
matorio. Un anlisis en compendio de la parti
cipacin de los derivados del cido araquidni
co en la expresin de los signos cardinales de
la inflamacin nos permite deducir que algunos
efectos de productos de la cicloxigenasa son
complementarios del efecto de los leucotrienos.
Las prostaglandinas, el trom boxano y los
leucotrienos son parte de un sistema ms gene
ral de control biolgico basado en el cido ara
quidnico como precursor. Este compuesto se
encuentra norm alm ente depositado en la e s
tructura de las membranas biolgicas y puede
ser liberado por activacin de un sistema hidroltico (fosfolipasa A^) por una serie de estmu
los. Con dependencia de la disponibilidad de
krs enzimas activas (cicloxigenasa o lipoxige
nasas) en la clula estimulada, el cido araqui
dnico es convertido en uno o ms compuestos
biolgicam ente activos. As, una variedad de
estmulos pueden ser convertidos en mltiples
compuestos, los cuales pueden ser usados para
regular o mediar distintas funciones biolgicas.
2.2.c Las lipoxinas
Mientras que la sntesis de leucotrienos se
inicia con la insercin de una molcula de ox
geno molecular en el carbono en posicin 5 del

Inflamacin
cido araquidnico, por accin de la 5-lipoxi
genasa, para la formacin de lipoxinas se re
quiere la oxigenacin secuencial en el carbono
15 y luego en el carbono 5 por las 15 y 5 lipo
xigenasas, respectivamente (fig. 23-10). Estos
compuestos son ios que se han incorporado a la
familia de los eicosanoides recientemente. D i
fieren marcadamente de los leueotrienos tanto
en su estructura como en sus propiedades bio
lgicas. La oxigenacin dual produce un inter
mediario epxido, 5-6 epoxitetraeno, el cual es
rpidamente convertido en lipoxina A4 o lipoxina B4 por epoxi-hidrolasas (fg. 23-10).
Recientemente se ha demostrado que las li
poxinas tambin pueden generarse por oxige
nacin del leucotrieno
derivado de los leu
cocitos por accin de la lipoxigenasa plaqueta
ria en un proceso de interaccin ciula-cluia.
Estructuralmente las lipoxinas se caracteri
zan por tener cuatro dobles ligaduras, lo cual

les confiere la caracterstica de poder ser detec

tadas por espectroscopia ultravioleta. Parece
existir una relacin inversa entre la cantidad de
leueotrienos y lipoxinas sintetizadas, lo que su
giere algtn tipo de autorregulacin del sistema,
cuyo mecanismo se desconoce.
Las lipoxinas muestran importantes efectos
biolgicos en diversas clulas inflamatorias. A
diferencia del leucotrieno B^, la administracin
de la lipoxina in vivo, no provoca adhesin de
los neutrfilos al endotelio vascular, ni m igra
cin al espacio extracelular. Por el contrario, la
lipoxina A^ inhibe la migracin de los neutrfi
los inducida por el LTA^. Por lo tanto, las ipoxinas tendran un efecto an ti-inflam atorio o
bien regulador negativo de la inflamacin.
Adems de sus efectos en los neutrfilos, las
LXA^ y LXB^ inhiben el efecto citotxico de la
clulas NK, lo que sugiere otros efectos regula
dores de la respuesta inmune.
COOH

cido araquidnico

COOH

5-fiidroperoxi-15 hidroxi ETE

HO

OH

OH

447

COOH

COOH

HO
Lipoxina
Fig. 23-10. B iosntesis de lipoxinas.

OH

448

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

Las lipoxinas tambin ejercen efectos sobre

los vasos sanguneos. La LXA^ es vasodilata
dora, mientras que la LXB^ es vasoconstrictora.
El efecto vasodilatador de la LXA_^ est m edia
do por la sntesis de PGIj y/o FGE^ ya que, en
presencia de inhibidores de la sntesis de pros
taglandinas, la LXA^ tiene efecto vasoconstric
tor. Por lo tanto, las lipoxinas regulan la pro
duccin de otros eicosanoides por estimulacin
de la sntesis de prostaglandinas.
Se observ que las lipoxinas atenan los
efectos de los LTC^ y LTD^ en la musculatura
lisa bronquial y en la m icrocirculacin renal,
sugiriendo que estos compuestos pueden servir
como antagonistas endgenos de los leucotrie
nos. Asimismo, las lipoxinas tambin poseen la
capacidad de actuar en sus propios sitios de re
conocimiento.
Las lipoxinas se encuentran involucradas
tanto en la inflamacin aguda como en el con
trol de la inmunidad. Se han hallado en concen
traciones elevadas en el lavado broncoalveolar
de pacientes con sarcoidosis y neumona. El
papel exacto que tienen las lipoxinas, en este
contexto, no se conoce exactamente. En este
momento se considera que las lipoxinas repre
sentan a los moduladores endgenos de la res
puesta inflamatoria de los leucotrienos.
2.2.d Factor activador de plaquetas (PAF)
El nombre factor activador de plaquetas se
utiliz en 1970, para describir la actividad de
un compuesto de naturaleza lipdica que se li
beraba de los basfilos durante la anafilaxis in
ducida por IgE. Se trata de un lpido complejo
cuya estructura es 1-0-alquil-2-acil-glicero-3
fosfocolina. Los diferentes compuestos difieren
en el nmero de tomos de carbono en el grupo
alquilo.
Al igual que los eicosanoides, el PAF deriva
de los fosfolpidos de la membrana por la ac
cin de la fosfolipasa A^. Luego de la activa
cin celular, la fosfolipasa A^ efecta la deacilacin de la 1-0-alquil fosfatidilcolina, gene
rando liso-PAF, el cual es luego acetilado por
acetil-CoA transferasa generando PAF. El ci
do graso liberado por accin de la fosfolipasa
Aj es principalmente el cido araquidnico, por
lo que el aumento de la sntesis del PAF en las
clulas inflamatorias se encuentra generalmen
te acompaado por un aumento de la sntesis
de eicosanoides (fig. 23-11). El PAF puede ser
sintetizado por los leucocitos, incluidos neutr
filos, eosinfilos y basfilos, por clulas mastoideas, por macrfagos y por plaquetas. Tam
bin pueden generar PAF las clulas endotelia
les y las epitehales.
La fuente del PAF en el rin es el 1-0-alquil-2-acetil-glicerol, el cual por accin de la

fosfocolina transferasa origina PAF. La impor

tancia de esta va de sntesis es que, en este ca
so, la sntesis de PAF no va acompaada por la
liberacin de eicosanoides.
La sntesis del PAF por los neutrfilos es es
timulada por los factores que producen eleva
cin del calcio intracelular y activan a la fosfo
lipasa A2. Sin embargo, el estmulo para la sn
tesis del PAF presenta especificidad celular ya
que, por ejemplo, la trombina, la angiotensina
2 y la vasopresina no generan aumento de sn
tesis del PAF en las clulas inflamatorias, pero
son efectivas en producir PAF en las clulas
del endotelio vascular.
El PAF se encuentra comprometido con la
patognesis tanto de la inflamacin aguda co
mo en los desrdenes de la hipersensibilidad.
Adicionalmente, el PAF es un importante m e
diador inflamatorio en el shock endotxico, en
la vasculitis y en la trombosis vascular.
El PAF es un potente activador de los neu
trfilos humanos, ya que estimula la adhesin,
la liberacin de enzimas lisosomales, la genera
cin de especies reactivas del oxgeno y de ei
cosanoides. Adems produce marginacin de
los neutrfilos en la pared del endotelio vascu
lar y promueve su migracin al espacio extravascular. Produce activacin y agregacin pla
quetaria. Por lo tanto, la inyeccin intradrmica
del PAF en humanos o animales de laboratorio
se encuentra asociada con marginacin de neu
trfilos y la trombosis intravascular. Tambin
se encuentra aumentada la permeabilidad vas
cular, edem a e hiperalgia. Como vem os, el
PAF causa la mayora de los signos cardinales
de la inflamacin.
La inyeccin intravenosa de PAF provoca
profundos efectos en el tono de la musculatura
lisa bronquial y en la funcin cardiovascular en
los animales de laboratorio, provocando un sn
drome muy similar al de la anafilaxis aguda. El
PAF produce contraccin bronquial y vascular,
incluyendo contraccin de las arterias corona
rias. A dicionalmente se presenta un aumento
importante de la permeabilidad vascular y exu
dacin de plasma al espacio extra vascular, in
clusive en pulmn (edema pulm onar). Como
resultado, los animales desarrollan insuficien
cia respiratoria, dism inucin de la eficiencia
cardaca e hipotensin.
El PAF tambin es regulador de la funcin
de los linfocitos, tanto directa como indirecta
m ente, a travs de la generacin de p ro sta
glandinas y leucotrienos. El PA F inhibe la
proliferacin Iinfocitaria en repuesta a m itge
nos. Adems, los linfocitos generan PAF en
repuesta a agentes que elevan el calcio intra
c e lu la r. L a im p o rta n c ia de esto s fe n m e
nos es, en la actualidad, motivo de investiga
cin.

Inflamacin
Interaccin clula-clula y sntesis
de eicosanoides
La inflam acin aguda se caracteriza por la
acumulacin de clulas inflamatorias en el sitio
de la injuria donde ellas funcionan en yuxtapo
sicin mientras se encuentran adheridas al en
dotelio, al epitelio, a clulas mesenquimales y a
otras clulas inflamatorias (fig. 23-12).
El cido araquidnico y los productos deri
vados de la accin de las lipoxigenasas pue
den pasar de un tipo celular a otro y los distin
tos tipos celulares pueden cooperar entre ellos
para generar eicosanoides. De esta manera, ti
pos celulares que, por s mismos, no son capa
ces de generar un tipo particular de eicosanoide (por ejemplo, clulas que no poseen lipoxi
genasa), pueden form ar eicosanoides a partir
de intermediarios generados en otros tipos ce
lulares, si ellas poseen las enzimas para con
vertir al intermediario en el producto biolgi
cam ente activo. L a figura 23-12 ilustra este
fenmeno. En este ejemplo ni los neutrfilos
solos ni las plaquetas solas pueden generar
LTC^, ya que los neutrfilos no poseen la sintetasa de LTC^ y las plaquetas no poseen acti
vidad de 5-lipoxigenasa. Sin embargo, cuando
estos dos tipos celulares interactan, se sinte
tiza LTC^ en abundancia, ya que las plaquetas
pueden convertir LTA^ derivado de los neu
trfilos en LTC,^. De manera similar, el LTC^
puede ser generado por clulas endoteliales
a partir del LTA^ que proviene de los neutr
filos.
Tambin se forman lipoxinas durante la in
teraccin de las plaquetas con los neutrfilos.
Las plaquetas por s mismas no generan lipo
xinas. Sin em bargo, cuando interactan con
los neutrfilos, las plaquetas generan lipoxi
nas a partir de interm ediarios que provienen
de los neutrfilos. As, el fenmeno de inte
raccin clula-clula no slo expande la bate
ra de eicosanoides que pueden ser sintetiza
dos en los sitios de inflamacin sino que, ade
m s, am plifica la cantidad de eicosanoides
producidos.
2.3. xido ntrico
El Oxido ntrico (N =0), es un radical libre
gaseoso inestable, potencialm ente txico, que
puede difundir libremente a travs de las m em
branas celulares, con efecto vasodilatador. T ie
ne una vida media de 3-5()s y su labilidad es
debida a su rpida conversin a nitritos y nitra
tos por el oxgeno.
El NO se sintetiza por accin de la NO-sintasa que acta sobre la L-arginina. Se han des
crito dos formas distintas de la enzima, una for
ma constitutiva y la otra forma inducible.

449

L a form a constitutiva de la NO sintasa es

calcio-calmodulina dependiente. Es la respon
sable del aumento transitorio de NO, en peque
as cantidades, del orden de los pmoles, por el
endotelio vascular, plaquetas, tejido nervioso,
clulas mesangiales de la mdula adrenal y de
las clulas de la mcula densa. Puede ser acti
vada por amonicidos excitatorios, por la ace
tilcolina, bradiquinina y calcio.
La forma inducible no es dependiente de calcio-calmodulina, y produce una liberacin pro
longada de NO en concentraciones del orden
de nmoles por los macrfagos, neutrfilos, en
dotelio vascular y clulas m icrogliales. Los
ms importantes inductores de la forma induci
ble de la NO-sintasa son, el lipopolisacrido o
endotoxina, el TNF, la IL-1 y el interfern-y.
Esta form a enzimtica puede ser regulada ne
gativamente por los glucocorticoides, la interleuquina-4, el PAF, y el TGF.
Funciones del xido ntrico
El NO activa a las formas constitutiva e in
ducible de las cicloxigenasas. El efecto citot
xico de los macrfagos sobre las clulas tumorales se encuentra asociado a la liberacin del
NO. El xido ntrico daa a enzimas mitocondriales tales como la cis-aconitasa y N AD Hsuccinato oxidoreductasa. La interaccin del
NO con enzimas m icrobianas que contengan
Fe-S puede ser la causa del efecto bactericida
del NO. Otro mecanism o de citotoxicidad se
debe a la nitrosilacin de los cidos nucleicos
causando la ruptura del ADN.
El NO provoca dao tisular debido a la ac
cin de los aniones peroxinitrilo (ONOO-) ge
nerados por la interaccin del NO con el anin
superxido 02-.
El efecto fisiolgico ms importante del NO,
es el de comportarse como un potente vasodila
tador. Esta propiedad, y su capacidad de induc
cin de la COX-2 hacen que el NO sea un im
portante mediador del proceso inflamatorio. Es
importante hacer notar que las citoquinas proinflamatorias activan a la forma inducible de la
NO sintasa, im plicando al mecanismo p o r el
cual el tono de NO se encuentra elevado en la
reaccin inflamatoria.
Al NO se lo indica como el ms im portante
agente responsable de la hipotensin arterial
presente en el shock sptico.
2.4. H istam ina
Es una amina natural producida por decarboxilacin de la histidina. La histam ina se en
cuentra depositada en forma de grnulos en las
clulas mastoideas y en los basfilos. Tambin
se encuentra en los tejidos en distintas concen-

450

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

Estmulo

OQOOQ
, '

OOQQO

OOOQQQ
1-alquil-2-acetil
glicerofosfocolina

OOO

, '

1-alquil-2-acil
glicerol

.... O "

Fosfolipasa A2
Acido
araquidnico

OOO

Fosfocolinatransferasa

Liso PAF
Fosfocolina

Acetiltransferasa

PAF
F ig. 23-11. Biosntesis del PAF.

Estmulo

Plaqueta

F ig . 23-12. Interaccin clula-clula y la sntesis de eicosanoides.

Inflamacin
traciones, la mayor parte de ellos la proveen en
cantidad suficiente como para producir efectos
fisiolgicos o patolgicos. Si la liberacin local
de histamina es suplementada por la provenien
te de basfilos circulantes, sus efectos biolgi
cos se ven incrementados.
La histamina induce la clsica respuesta vas
cular de la inflamacin aguda, incrementando
el flujo sanguneo, la permeabilidad vascular y
produciendo edema. Tambin produce dolor y
picazn. Aunque no posee efecto quimiotctico
general, puede ejercer quimiotactismo especfi
co para eosinfilos y tambin facilitar el egreso
de clulas de la serie blanca al espacio extravascular por increm ento de la perm eabilidad
microvascular. Sin embargo, el efecto movilizador de clulas de la serie blanca producido
por la histamina es poco relevante si se lo com
para con la movilizacin tota! de dichas clulas
en la respuesta inflamatoria.
Existe la teora de que la respuesta inflama
toria deriva de la accin combinada de agentes
vasodilatadores y agentes que producen au
mento de la permeabilidad vascular. La impor
tancia potencial de la interaccin de mediado
res se desarroll sobre la base del sinergismo
entre prostaglandinas vasodilatadoras y los fac
tores que incrementan la permeabilidad microvascular y, posteriormente, se extendi inclu
yendo a vasodilatadores no prostaglandnicos.
En la inflamacin aguda existen evidencias
que prueban la importancia de la histamina co
mo mediador qumico. Sin embargo, no parece
que se encuentre involucrada en la inflamacin
crnica.
La accin ms importante de la histamina se
presenta en la respuesta inicial a la injuria y es
irrelevante en las etapas posteriores.
El anlisis farmacolgico de los receptores
de histamina comprometidos en la respuesta in
flam atoria dem uestra que ambos receptores,
H1 y H2, se encuentran involucrados.
2.5. L as citoquinas
Las citoquinas son seales intercelulares no
especficas, por las cuales, las clulas activadas
pueden atraer otras clulas y, en algunas situa
ciones, controlar procesos fisiolgicos. Las ci
toquinas desempean un papel vital en la coor
dinacin de las respuestas inmunes e inflama
torias. En este captulo se describirn las citoquinas comprometidas con el proceso inflama
torio. Estas citoquinas incluyen: factor de n e
crosis tumoral (TNF), interleuquina-1 (IL-1),
interleuquina-6 (IL-6).
Estos mediadores se diferencian de la m ayo
ra de los mediadores inmunolgicos, tales co
mo inmunoglobulinas, en que no presentan es
pecificidad por los antgenos y en que operan a

451

muy bajas concentraciones. Por ejemplo, para

IL-1 la concentracin es de 10^*' M, la cual se
encuentra dentro de las concentraciones de las
hormonas endocrinas. Pero, a su vez, se dife
rencian de las hormonas clsicas en que acttan
localmente y en clulas vecinas de un tejido,
como los neurotransm isores. A diferencia de
los neurotransmisores, no se encuentran preformadas, sino que son sintetizadas cuando ocurre
la estimulacin.
Todas las citoquinas son pptidos, en general
de entre 70 y 190 am onocidos. La m ayora
pueden ser producidas por varios tipos celula
res, con acciones mltiples y, tambin, la m a
yora presenta actividades sobrepuestas. La ac
tividad de cada cito q u ina sobre las clu la s
blanco est mediada por la unin a distintos re
ceptores de la superficie celular con alta afini
dad (Kp= 10 -1 0 M ). Los receptores de cada
citoquina son generalmente productos de genes
diferentes.
2.5.a In te re uq ulna-1
La interleuquina-1 es un producto de diver
sos tipos celulares. Tiene un amplio espectro
de actividades biolgicas, generalmente estimulatorias sobre las clulas inmunes, as como
sobre las clulas que no pertenecen al sistema
inmune, y es considerada como un importante
mediador de la inflamacin. El ms importante
regulador de la actividad de la interleuquina-1,
es el poderoso inhibidor natural de su receptor,
IL-IRA.
Se han detectado dos genes que codifican
para dos tipos de IL-1, la IL-1 alfa y la lL-1 be
ta; y un tercer gen de la familia, que codifica
p a ra el a n ta g o n is ta d el re c e p to r de IL -1
(IL -lR A ). Diversos tipos celulares expresan
los dos genes que codifican para ambas IL-1,
pero las relaciones entre alfa y beta, varan se
gn los tipos celulares. Por ejemplo, monocitos
humanos expresan predominantemente la fo r
ma beta, mientras que los queratinocitos expre
san la forma alfa. La expresin del IL -IR es
inducida por diversos estmulos en monocitos y
se encuentra constitutivam ente expresada en
neutrfilos, queratinocitos y clulas epiteliales.
Diversos tipos de clulas normales y tran s
formadas son capaces de producir IL-1 in vitro,
incluyendo monocitos/macrfagos, queratino
citos, clulas mesangiales del rin, epitelio de
la crnea, clulas T, linfocitos granulares gran
des, astroeitos, clulas endoteliales, clulas de
Langerhans, neutrfilos y clulas del msculo
liso. Sin embargo, probablemente los m acrfa
gos y los queratinocitos son los mayores p ro
ductores de IL-1. Los monocitos no producen
IL-1 constitutivamente sino que requieren est
mulo para transcribir el gen. Diversos agentes

452

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

endgenos y exgenos pueden proveer tal est

mulo. Los productos microbianos, como endo
toxinas, exotoxinas, restos de pared celular de
hongos y hemoaglutininas virales, inducen la
produccin de IL-1 por monocitos. Los agentes
endgenos que inducen la produccin de IL-1
por m onocitos incluyen, C5a, C SF-1, TNF,
TGpp, la propia IL-1 y linfoquinas provenien
tes de linfocitos T que an no han sido clona
das. Las clulas T tambin pueden inducir a los
macrfagos a producir IL -1, durante el contac
to celular dependiente de antgeno. Otros facto
res que inducen produccin de IL-1 por varios
tipos celulares incluye a la injuria producida
por radiacin ultravioleta y cristales de urato y
slica.
Los monocitos y queratinocitos tambin pro
ducen IL-IRA. En los monocitos diferentes es
tmulos controlan el balance entre la IL-1 y el
IL-lRA . As, el lipopolisacrido (LPS) induce
la formacin de ms IL-1 que de IL -lR A , y la
inversa ocurre para los complejos inmunes, que
inducen ms a IL-lRA que a IL-1.
Diversos factores inhiben la produccin de
IL-1. Las prostaglandinas inhiben la produc
cin de IL-1 de los macrfagos mientras que
no afectan a la transcripcin. La IL-10 inhibe
fuertemente la transcripcin de IL-1 alfa y beta,
as como el TNF-alfa e IL-6. La interleuquina4 tambin inhibe la produccin de IL-1 y ade
ms induce la produccin de IL-lRA .
La IL-I es considerada un importante m edia
dor de la inflamacin. Este concepto est basa
do en que induce muchas de las respuestas inflam atCiias. La IL-1 induce, in vitro, la libera
cin de PGEj por diversos tejidos, la produc
cin de proteasas, el catabolismo del cartlago
y del hueso y el crecimiento de los fibroblastos.
Todos estos hechos contribuyen a la patogne
sis de la inflamacin crnica tales como las que
afectan a las articulaciones en la artritis reuma
toidea o la inflamacin de la gingiva.
In vivo, la IL -1 lleva a cabo reacciones infla
matorias sistmicas, tales como la fiebre y la
fase aguda de respuesta del hgado, reduce el
hierro, el cinc, y aumenta el cobre plasmtico.
Localmente, la IL-1 lleva a cabo reacciones
inflamatorias inmediatas que estn caracteriza
das por promover la unin de los neutrfilos
sanguneos a las clulas endoteliales de la pa
red de los vasos sanguneos, seguida de infil
tracin y edema. Contrariam ente, una libera
cin lenta de IL-1, produce una tpica reaccin
de hipersensibilidad tarda con infiltrado de
mononucleares, fibroplastia y angioplastia.
Los neutrfilos son liberados de la mdula
sea al torrente circulatorio en repuesta a la
IL-1. Los efectos de la IL-1 en la mdula sea
incluyen la induccin de factores estimulantes
del crecimiento de colonias (CSF) y la capaci

dad de actuar sinrgicamente con estos factores

como estmulo para el crecimiento y diferen
ciacin celular durante la hematopoyesis.
Los efectos neuroendocrinos de la IL-1 in
cluyen accin en el hipotlamo lo que resulta
en fiebre, y tambin produccin del factor libe
rador de corticotrofina, el cual estimula la libe
racin de hormona adrenocorticotrfica desde
la hipfisis, la que, a su vez, induce la produc
cin de corticosteroides por las glndulas adrenales.
Los efectos de la IL -1 in vivo se encuentran
com plicados por la induccin de un nm ero
considerable de mediadores qumicos que in
cluyen al factor activador de plaquetas, IL-6,
TNF, CSF, y aun la induccin de ms IL-I.
La IL-1 produce un efecto positivo sobre las
clulas T. Sin embargo, esos efectos varan se
gn se trate de clulas T maduras o inmaduras.
Los efectos positivos de IL-1 pueden ser direc
tos sobre las clulas T, o indirectos, a travs del
aumento de la temperatura corporal y mejoran
do la funcin de las clulas presentadoras de an
tgenos (APC). Los efectos sobre las APCs pue
den estar mediados por la induccin de molculas de a d h e si n p o r el en d o te lio v a sc u la r
(ICAM-1), a las que pueden unirse las clulas
T. Los efectos positivos de la IL -1 sobre las c
lulas T pueden ir acompaados de efectos nega
tivos. As la PGE2 y los corticoesteroides, am
bos inducidos por la IL-1, son poderosos inhibi
dores de la replicacin de los linfocitos T. Por
lo tanto, si se inyecta IL -1 predominar el efec
to negativo, producindose una prdida de clu
las T, presumiblemente por los efectos de los
glucocorticoides inducidos por la propia IL-1.
La IL-1 afecta a las clulas B en dos etapas.
Sobre pre-clulas B, induce maduracin y la
expresin com pleta de la Ig en la m em brana
plasmtica. Luego, durante la activacin anti
gnica, la IL-1 sinergiza con la IL-2 la prolife
racin de clulas B y la produccin de Ig. A di
cionalmente, IL -1 induce a diversos tipos celu
lares al producir IL-6, la cual promueve la se
crecin de clulas B activadas. La IL-1 aumen
ta el crecimiento de las clulas T y la secrecin
de citoquinas tales como,IL-2, IL-4 e IL-5,las
cuales controlan varias etapas de la activacin
de las clulas B.
Otras clulas del sistema inmune, como los
macrfagos, responden a la IL-1 aumentando la
sntesis de IL-1, IL-6, IL-8, TNF, prostaglandi
nas y activador de plasm ingeno. Las APCs
pueden tambin responder a IL-1, aumentando
la capacidad de inducir la proliferacin de clu
las T.
Se han evaluado los efectos de la administra
cin de IL-1 a humanos, fundamentalmente por
su potencial efecto como agente anti-tumoral.
Administrada en bajas dosis presenta efectos

Inflamacin
no deseables comparables a los beneficiosos.
Induce un cuadro de hipotensin arterial debi
do a la vasodilatacin perifrica producida por
la sntesis de prostaglandinas, factor activador
de plaquetas, TNF y xido ntrico.
La actividad inmunoactivadora de la IL -1 en
humanos est reflejada por el aumento de los
niveles de los receptores de IL-2, coincidente
con la activacin de las clulas T. El tratamien
to con IL-1 tambin produce aumento de la acti
vacin de monocitos. Este aumento de la activi
dad inmunitaria de la IL-1 puede constituir el li
mitado efecto antitumoral observado en pacien
tes con melanoma con metstasis no visceral.
Se puede concluir que la IL -1 puede prom o
ver defensa, restauracin y reparacin, espe
cialmente de la hem atopoyesis, pero tam bin
tiene considerables efectos laterales txicos.
Bajas dosis de IL-1 pueden ser administradas
sin riesgo en pacientes con cncer, produciendo
efectos teraputicos beneficiosos.
2.5.b Factor de necrosis tum oral (TNF)
El TNF es considerado uno de los ms im
portantes mediadores de la inflamacin. Ha si
do descubierto por su accin inductora de ne
crosis hemorrgica en ciertos tumores. El TNF
es producido por macrfagos activados y otros
tipos celulares y tiene un amplio espectro de
efectos biolgicos en diversos tipos celulares,
tanto inmunes como no inmunes.
Una verdadera malla de citoquinas controla
a la induccin de TNF y su accin, incluyendo
a la IL -1, que induce la produccin de TNF por
los m acrfagos. El TNF a su vez, induce la
produccin de IL-1 por los macrfagos, la pro
duccin de interfern (31 por los fibroblastos, y
la produccin de GM -CSF por diversos tipos
celulares.
Las clulas que responden al TNF tienen re
ceptores de alta afinidad. Han sido clonados
dos tipos de receptores en humanos, uno de 55
kD y otro de 75 kD. Los receptores de TNF son
parte de una familia de protenas de membrana,
que poseen cuatro regiones ricas en residuos de
cistena en su dominio extracelular. El dominio
intracelular no es homlogo en los dos tipos de
receptores de TNF. Aunque la mayora de las
clulas expresan ambos receptores, se conside
ra que cada receptor media respuestas diferen
tes. Las respuestas atribuidas al receptor de 55
kD son de citotoxicidad, actividad anti viral y
proliferacin de fibroblastos. En cam bio, la
proliferacin de clulas T est mediada por el
receptor de 75 kD.
La accin del TNF puede ser poderosamente
aumentada en diversos sistemas celulares por
el interfern-y a travs, por lo menos parcial
mente, del incremento del niimero de recepto

453

res de 75 kD. Las clulas T expresan receptores

de TNF luego de la activacin, y el incremento
posterior es inducido por la IL-2. Una rpida
regulacin negativa ocurre por activacin de la
protena quinasa C (PKC), posiblemente debi
do al rpido clivaje del receptor, el cual puede
ser luego encontrado intacto en los fluidos bio
lgicos, reteniendo la capacidad de unir TN F y
actuando de esta forma como un inhibidor.
La va de segundos mensajeros para el TNF,
como para el resto de la citoquinas, no se en
cuentra totalmente aclarada. Sin em bargo, se
ha encontrado recientemente la temprana libe
racin de diacilglicerol (DAG) de fosfatidilcoMna, lo cual indicara que la va de transduc
cin estara mediada por una fosfolipasa C que
hidrolizara a la fosfatidilcolina. El D AG for
mado activara luego a la PKC, la cual es acti
vada por TNF. Una va similar a sido inform a
da para la IL-1.
El TN F induce la fosforilacin de diversas
protenas, entre ellas la hsp27, posiblemente in
volucrada en la proteccin celular al efecto de
TNF.
El efecto intracelular directo del TNF ha si
do evaluado por microinyeccin celular; es ci
totxico. Sin embargo, parece que ms que un
efecto directo del TNF, los receptores, tanto in
tracelulares como extracelulares, estaran m e
diando a la seal citotxica, ya que anticuerpos
anti receptor de TNF mimetizan la toxicidad
del TNF.
La necrosis hem orrgica y la regresin de
ciertos tumores en ratn fueron las propiedades
que perm itieron descubrir al TNF, y fueron
tam bin la base de su nombre. Ciertas lneas
celulares de tumores humanos son matadas por
el TNF in vitro. Las lneas sensibles al T N F in
cluyen dos carcinomas de mama, un carcinoma
de pulm n y un carcinoma de colon. In vivo se
ha observado efecto citosttico en un carcino
ma de mama, un carcinoma de vejiga y un fibrosarcoma. Las clulas normales no son afec
tadas por el TNF. El mecanismo por el cual el
TNF m ata a las clulas tumorales in vitro no
est totalm ente dilucidado, sin em bargo, se
cree que lo hace por un mecanismo sim ilar a la
apoptosis, en el cual se produce fragmentacin
de ADN, precedida por la generacin de radi
cales libres del oxgeno o enzimas lisosomales.
La muerte celular se encuentra aum entada
por inhibicin de la sntesis de protenas, lo
cual puede aun provocan la muerte de clulas
normales, no transformadas inducida por TNF.
Por lo tanto, se sugiere que la sntesis continua
de ciertas protenas protegen a las clulas nor
males del efecto citotxico del TNF, mientras
que las clulas tumorales no poseeran este me
canismo de defensa o reparacin. Un producto
que parece proteger del efecto letal de T N F es

454

Mecanismos efectores de ia respuesta inmune

la superxido dism utasa m anganeso depen

diente.
Ei TNE es un muy importante mediador de
la inflamacin. La purificacin bioqumica de
mostr que el TNF tiene actividad de catexina, una citoquina txica letal que m edia el
desgaste (caquexia) durante la infeccin parasi
taria o bien luego de la inyeccin de lipopolisacarido (LPS). Este desgaste ocurre en parte por
la habilidad del TNF de suprimir la actividad
de la lipoprotena lipasa de los adipocitos,
EL TNF tiene otras propiedades inflam ato
rias sistmicas. Al igual que la IL-1 induce fie
bre, promueve respuesta de los hepatocitos pro
duciendo diversos reactantes de la fase aguda
(la fase aguda se discute al tratar IL-6). Tam
bin se presenta neumonitis intersticial aguda,
con infiltracin de polim orfonucleares, sugi
riendo efecto del TNF en el sndrome de dao
respiratorio agudo observado en el shoclc
sptico y no sptico.
En el sitio de inflamacin se pueden predecir
ciertos efectos basados en lo que se conoce in
vitro. Los neutrfilos responden al TNF, au
mentando su capacidad de unin a las clulas
del endotelio producen estallido respiratorio y
degranulacin. Las clulas endoteliales expre
sando ms ICAM -1, tam bin increm entan la
capacidad de adhesin de los neu tr filo s y
otros elementos formes sanguneos, etapa que
debe preceder a la extravasacin de estas clu
las a los sitios de inflamacin. Tambin local
mente, las clulas endoteliales vasculares pue
den reaccionar al TNF presentando un perfil
trombognico por produccin de procoagulan
tes, supresin de actividades anticoagulantes y
culminando en un bloqueo del aporte de sangre
y por ello producir necrosis tisular. El TNF
tambin presenta actividad sobre los macrfa
gos, incluyendo induccin de la IL-1 y de pros
taglandinas. Administrado localmente (intracutneo), el TNF presenta una actividad inflama
toria mediana, con una acumulacin leucocita
ria transitoria y sin edema.
La destruccin de la matriz extracelular in
ducida por el TNF se asemeja a la presentada
por la IL-1. La reabsorcin del hueso se produ
ce va la activacin de los osteoclastos y la in
hibicin de la sntesis del hueso. El TNF indu
ce actividad de la colagenasa en los sinovioci
tos en el cartlago. Ja reabsorcin de los proteoglieanos e inhibicin de su sntesis. Estos m e
canismos de destruccin tisular estn implica
dos en la patognesis de la artritis reumatoidea.
Tanto el TNF, como la IL-1, se encuentran au
mentados en los fluidos de las articulaciones
afectadas.
El TNF, al igual que la IL-1, induce proUferacin de los fibroblastos, propiedad que se en
cuentra involucrada con el proceso de repara

cin, pero con potencial efecto patolgico en

los procesos de fibrosis observados en la infla
macin crnica.
Diversas molculas de superficie inmunolgicamente relevantes son inducidas por el TNF.
En clulas endoteliales, el TNF as com o la
IL-1, inducen ICAJVI-1, VCAM-1, y SelectinaE, que son molculas de adhesin involucradas
en la unin de las clulas T al endotelio vascu
lar y de las clulas presentadoras de antgenos
(APC). Estos efectos sobre estructuras compro
metidas con la presentacin de antgenos a las
clulas T, junto con la induccin de la produc
cin de la IL-1 por el TNF, pueden tener efec
tos positivos sobre la migracin y activacin de
las clulas B y T.
Las clulas B en reposo, no expresan recep
tores de TNF.
EL TNF presenta efectos protectores no es
pecficos contra patgenos. La actividad antivi
ral del TNF ha sido demostrada en fibroblastos.
Las infecciones por Pasmodium chahaudi en
ratones es suprimida por el TNF liberado por
bomba osmtica intraperitoneal. La muerte de
la Leishmania mayor, del Tripanosoma cruzi y
de la Shistosoma masoni ocurren va la activa
cin de los macrfagos por el TNF. Algunas de
estas actividades txicas ocurren va produc
cin de xido ntrico por los m acrfagos lo
cual puede a su vez mediar alguna toxicidad
del TNF in vivo.
El uso clnico del TNF se encuentra hmitado
debido a que presenta efectos txicos ms im
portantes que la IL-1. La hipotensin es la m a
yor causa de la limitacin del uso de la dosis
que provoca toxicidad. El TNF tiende a produ
cir ms extravasacin capilar y recam bio de
protenas que la IL-1. La diferencia ms impor
tante entre ambas citoquinas es que, aunque
ambas poseen efecto radioprotector, la IL-1 es
hematopoytiea, mientras que el TNF reduce
los niveles perifricos de neutrfilos, monoci
tos, linfocitos y plaquetas. A unque el trata
miento sistmico del cncer con TNF en hum a
nos se encuentra vencido por los problemas t
xicos, el TNF puede ser til usado localmente
para el tratamiento de melanomas o sarcomas.
En un esfuerzo por evitar la amputacin de ex
tremidades, se ensay la perfusin aislada de la
extremidad para administrar TNF junto a IFN-y
y melfalan, en condiciones de hipertermia. Este
ensayo dio como resultado un 80% de respues
ta positiva.
Las enfermedades neoplsicas no son la ni
cas aplicaciones del TNF. D iversos estudios
han encontrado respuesta positiva en el trata
miento de la Psoriasis vulgar. Un paciente tra
tado por un proceso maligno muy avanzado,
present coincidentemente una total reversin
de un cuadro de psoriasis severa refractaria.

Inflamacin
La administracin de anticuerpos anti-TNF
tambin lia sido ensayada en clnica. Si bien no
se ha encontrado efecto beneficioso para el tra
tamiento del shock sptico en humanos, a dife
rencia del tratamiento con IL -lR A el cual re
sult efectivo, se observ algn mejoramiento
de la funcin ventricular izquierda en pacientes
en shock.
O tra condicin inflam atoria que puede ser
eventualmente controlada por bloqueo del TNF
son el sndrome de enfermedad respiratoria agu
da, la artritis reumatoidea, la malaria cerebral,
la caquexia de la tuberculosis y el cncer.
2.5.c Interleuquina-6
La IL-6 ha sido descubierta por su actividad
antiviral, activadora del crecimiento de hibri
domas y plasmocitomas y estimulante de hepa
tocitos y clulas B. Sin embargo, la IL-6 posee
un amplio espectro de efectos, algunos de los
cuales se sobreponen a los de la IL -1 y el TNF.
Similarmente, por lo tanto, la IL-6 es conside
rada un im portante mediador inmune e infla
matorio. Adems de los macrfagos, diversos
tipos celulares producen lL-6.
Se ha descrito que clulas B transformadas
producen IL-6 como factor co-autocrino y tam
bin las clulas B normales pueden producirlo.
Las clulas de mielom a producen IL-6 como
un factor de crecimiento autocrino, como lo ha
ce el sarcom a de Kaposi, el cual puede usar
IL-6 como factor co-autocrino secundario a la
respuesta a oncostatin M. Otras clulas B trans
formadas que producen IL-6 incluye a glioblastos, osteosarcoma, mixoma y clulas del carci
noma cervical y de vejiga.
El lquido sinovial de pacientes con artritis
reumatoidea contiene IL-6, as como la mayo
ra de las otras citoquinas discutidas en este ca
ptulo, que parecen ser producidas por las clu
las T. La osteoporosis po.smenopusica parece
comprometer a la IL-6, ya que la misma es su
primida por los estrgenos.
Sitios de unin para IL-6 han sido detectados
en diversas lneas celulares. El mecanismo que
opera luego de la interaccin con el receptor no
se encuentra completamente dilucidado.
La IL-6 se encuentra relacionada a la IL-1 y
al TNF en el sentido de que estas tres citoquinas
pueden ser coordinadamente liberadas por los
monocitos. Tambin se encuentran relacionadas
porque una puede inducir la liberacin de la
otra: la IL-1 o el TNF, pueden inducir a la IL-6,
el TNF puede inducir a la IL -L y la IL-1 puede
inducir a la IL -1. Sin embargo, la IL-6 no indu
ce ni a la IL-1 ni al TNF sino que, ms bien, su
prime su produccin por los macrfagos.
Las tres citoquinas son transportadas por el
torrente circulatorio a sitios distantes, inducien

455

do procesos inflamatorios llamados fase agu

da de respuesta. Este trmino se refiere a la
respuesta global del organismo a agentes extra
os, tales como endotoxinas microbianas. Con
siste en fiebre e importantes cambios en los ti
pos de protenas sricas sintetizadas por los he
patocitos. As, en humanos, una m edida de la
inflamacin es la velocidad de eritrosedimentacin, la cual refleja principalmente la concen
tracin de fibringeno. Tanto la fiebre como
las protenas de la fase aguda son inducidas por
la tres citoquinas. Los glucocorticoides, que
generalm ente tienen efecto anti-inflam atorio,
potencian la accin de las citoquinas en inducir
la respuesta heptica.
Los efectos hematopoyticos de la IL-6, son
sinrgicos con los de la lL-3. La IL-6 produci
da endgenamente es aparentemente requerida
para la resistencia a la radiacin.
La caquexia, originalmente atribuida al TNF,
ha sido tambin descrita para la IL-6. El meca
nismo propuesto involucra infiltracin del tu
mor por los macrfagos husped que a su vez
producen IL-1. Esta induce al tumor a producir
grandes cantidades de IL-6, lo cual es un ele
mento necesario en los efectos caquxicos.
Conclusin
Las citoquinas inflamatorias tienen efectos
sobre el crecimiento y diferenciacin celular.
Algunos de estos efectos son indirectos y basa
dos en la capacidad de las citoquinas de inducir
la produccin de una cascada de otras citoqui
nas. Por ejemplo: aunque el TNF y la lL-1 ex
hiben efecto antiviral, ste es mediados por el
IFN-(3. Las citoquinas no slo interactan secuencialmente (induciendo una a otra) sino que
se refuerzan mutuamente. Por ejemplo: el TNF
no slo induce a las IL-6 e IL-1, sino que am
bas, IL-6 e IL-1, pueden incrementar los efec
tos biolgicos del TNF. Adems, la IL-1 puede
aun inducir a la propia IL-1. Las interacciones
se tom an aun ms complejas cuando se consi
deran las observaciones de que la IL -I y el
TNF modulan no slo la produccin de otras
citoquinas sino que tambin modulan la expre
sin de los receptores funcionales de las citoquinas.
El uso teraputico de las citoquinas y sus in
hibidores es un rea de estudio en continuo cre
cimiento, aunque se aprecia la dificultad de la
administracin sistmica.
2.6 Q uim ioqum as
M iem bros de la fam ilia de citoquinas quim iotxicas, llam adas quim ioquinas, han sido
identificadas como mediadores y promulgado-

456

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

res vitales de la inflamacin. Tienen un rango

de peso molecular que oscila entre 8 y 12 kD,
son activas en una concentracin de 1 a 100
ng m i ' y son producidas por una gran varie
dad de tipos celulares. Son inducidas por irri
tantes exgenos y por mediadores endgenos
tales como IL-1, TNF, PDGF e IFN-y. Las quimioquinas se unen a receptores especficos de
la superficie de las membranas con una Kp de
0.4 a 4.0 nM.
Estas quimioquinas pueden ser consideradas
como citoquinas de segundo orden. Parecen
ser menos pleiotrpicas que las citoquinas proinflamatorias de primer orden porque no son
potentes inductores de otras citoquinas y exhi
ben funciones ms especficas en la inflam a
cin y la reparacin.
Algunas quimioquinas se han asignado como
subgrupo quimioquina alfa, basados en el he
cho de que dos de sus cuatro grupos cistenas
se encuentran separados por un aminocido (CX-C). Este grupo de quimioquinas incluye a la
IL-8, al activador del crecimiento de melanoma
(MGSA/GRO), al factor plaquetario 4 (PF-4),
P-tromboglobulina (pTG).
En el segundo subgrupo, o (3, no intervienen
aminocidos entre las dos primeras cistenas e
incluyen el factor quimiotxico y activador de
m acrfagos (M C A F/M C P-1), R A N TES as
como aLD-78.
2.6.a La interleuquina 8
LA IL-8 es producida por diversos tipos ce
lulares, incluidos las clulas N K y los linfoci
tos T en repuesta a estm ulos exgenos tales
como mitgenos policlonales, injuria, y agentes
infecciosos, as como citoquinas proinflamatorias tales como lL-1 y TNF. La lL-8 es un qui
mioatractante de neutrfilos, basfilos, y una
pequea proporcin ( 10% o menos) de linfoci
tos CD4-h y CD8-I-. Adicionalmente, la IL-8 ac
tiva la liberacin de enzimas de los neutrfilos
activados.
La IL-8 promueve la adherencia de los neu
trfilos a las clulas endoteliales y lo hace in
duciendo la produccin de integrinas por los
neutrfilos. De esta manera los neutrfilos su
fren extravasacin por m ovim iento entre la
uniones de las clulas endoteliales y a travs de
la membrana basal se acumulan en los tejidos.
La inyeccin subcutnea de IL-8 causa rpida
infiltracin local de los neutrfilos con un m
ximo a las tres horas. La administracin sist
mica de IL-8 no provoca fiebre ni elevacin de
protenas de la fase aguda, pero s induce
neutrofilia.
Han sido clonados dos tipos distintos de re
ceptores para IL-8. Son miembros de la familia
de la rodopsina y tienen siete dominios trans

membrana. Los receptores estn probablemente,

acoplados a una protena G. Al interaccionar
con la IL-8 se produce hidrlisis del fbsfatidihnositol, se libera rpidamente el diacilglicerol
(DAG) y se eleva el nivel de calcio citoslico,
lo cual lleva a la activacin de la quinasa C
(PKC). Los receptores de IL-8 se encuentran
expresados en neutrfilos. Los neutrfilos m a
duros expresan 20.000 receptores por clula.
La IL-8 se ha encontrado en pacientes con
reacciones inflamatorias sistmicas y en trauma
severo. Ha sido tambin detectada en sitios in
flamatorios tales como en fluido sinovial en ar
tritis reumatoidea, extractos de piel de psoriasis
y en circulacin en pacientes con shock sp
tico. Por lo tanto, la IL-8 se encuentra implica
da como un participante mayor en reacciones
inflamatorias agudas as como en las ms pro
longadas.
2.6.b Rantes
R AN TES p ertenece al segundo grupo de
quim ioquinas (tipo beta). Es moderadam ente
quimioatractante para monocitos. Es producido
por linfocitos T activados y por plaquetas. Las
clulas T activadas responden ms a RANTES
que las no estimuladas. Promueve la adhesin
de las clulas T a las clulas endoteliales vas
culares, este efecto es ms notable cuando el
endotelio ha sido previam ente activado por
IL-1 o bien por anti-CD3.
Ha sido detectado en los sitios de inflam a
cin ateromatosa. Adems, RANTES causa r
pida degranulacin de los basfilos, liberacin
de histamina y puede participar en la fase tar
da de las reacciones alrgicas.
Los miembros de la familia de las quim io
quinas parecen ser potentes quimioatractantes y
activadores de las clulas inflamatorias y fibro
blastos. Sin em bargo, su contribucin a las
reacciones inm unes no ha sido caracterizada
completamente.
2.7. Sistem a celular de defensa
Erente a la presencia de un elemento extrao
se pone en funcionam iento, un sistem a que
atrapa, ingiere, y destruye a las partculas en un
proceso conocido como fagocitosis.
Las clulas fagocticas pertenecen a dos sis
temas. Un primer sistema est constituido por
clulas del sistema mieloideo, que actan rpi
da y eficientemente, fagocitan, pero son incapa
ces de efectuar un segundo esfuerzo. Estas clu
las constituyen lo que se conoce como prim e
ra lnea de defensa. Se trata fundamentalmen
te de los polimorfonucleares neutrfilos, aun
que en ciertos casos participan otras clulas
(eosinfilos, basfilos, clulas ma.stoideas).

Inflamacin
El segundo sistem a, el sistem a fagoetieo
mononuclear est formado por elulas fagocti
cas ms lentas. Estas clulas son capaces de re
petir la fagoeitocis y pueden procesar a los an
tgenos con el objeto de iniciar la repuesta in
mune. El sistema fagoctico mononuclear cons
tituye la segunda lnea de defensa".
2.7.a Primera lnea de defensa
Neutrfilos
Los neutrfilos son clulas fagocticas cuya
funcin principal es la de atrapar y destruir mi
croorganismos, particularmente bacterias. Para
ello deben poseer la habilidad de migrar al sitio
de localizacin del organismo invasor, y una
vez all participar en el proceso de la elimina
cin del invasor.
El movimiento de migracin al sitio de in
feccin o de injuria se conoce con el nombre de
quim iotaxismo. Se produce en repuesta a un
gradiente qumico positivo de quimioatractantes producidos en ese sitio. Los quimioatractantes son producidos o liberados por la bacteria
(fMLP), o bien por otras clulas inflamatorias
o por las clulas del tejido daado involucradas
en la reaccin inflamatoria.
Ejemplos especficos de quimioatractantes lo
constituyen: los formil-metionil-pptidos de la
bacteria (fMLP), los componentes del sistema
de complemento activados C3 y C5a, y los pro
ductos de la lipoxigenacin del cido araquid
nico como el LTB^.
Los neutrfilos humanos poseen receptores
especficos para los quimioatractantes. Una vez
que los quimioatractantes se unen a sus recep
tores de las membranas se inicia una serie de
reacciones que incluyen: interaccin con pro
tenas G; activacin de las fosfolipasas C eon
subsecuente activacin de la protena quinasa
C y aumento de la concentracin del calcio in
tracelular, activacin de fosfolipasas
y la
consecuente movilizacin del cido araquid
nico para la sntesis de eicosanoides. Como
consecuencia de la activacin de las seales de
transduccin antedicha se produce la liberacin
de grnulos secundarios y terciarios y la preactivacin del estallido respiratorio.
Los primeros cambios morfolgicos que se
producen cuando los neutrfilos se preparan
para moverse hacia sitios de mayor concentra
cin de quimioatractantes involucra la polariza
cin u orientacin. Los grnulos se ubican en el
frente de la clula mientras el ncleo se ubica
en la parte posterior y los sendpodos se hacen
prominentes, facilitando el movimiento.
La m igracin de los neutrfilos com ienza
con la marginacin de los mismos y la adhe
sin a la superficie del endotelio, seguido de

457

procesos de profundizacin de la adhesin y

m igracin, cuyo fundam ento bio q u m ico se
discutir ms adelante. Los leucocitos, luego
de migrar a travs de los tejidos llegan al sitio
de inflamacin. Una vez que los neutrfilos sa
lieron del torrente circulatorio, no pueden re
tornar a la circulacin, permanecen en el tejido
por varias horas, mueren y son removidos lue
go por los macrfagos.
D espus de la llegada al sitio de inflam a
cin, los neutrfilos se unen al microorganismo
y lo fagocitan. Luego de la fagocitosis ocm-re la
degranulacin al espacio extracelular que cons
ta de dos etapas secuenciales: la liberacin de
grnulos secundarios seguida por la liberacin
de grnulos primarios. La liberacin del conte
nido de los grnulos puede causar dao tisular
como el observado en la artritis reumatoidea.
Durante la fagocitosis se produce el estalli
do respiratorio, que es el mecanism o por el
cual los neutrfilos participan de la m uerte del
microorganismo. Inicialmente una oxidasa de
m em b ran a oxida (N A PH -O X I) N A D P H o
NADH para formar un radical O j, y N AD P o
NAD (fig. 23-13).
El superxido (0^0 reacciona con iones hi
drgeno espontneamente o por accin de la
superxido dismutasa para formar perxido de
hidrgeno. El NADP y el
estim ulan al
shunt de las hexosas (HMP) lo cual aumenta
la disponibilidad de N ADPH. C onsecuente
m ente aumenta la utilizacin de glucosa y la
produccin de lactato. La d etoxificacin va
acompaada por las siguientes reacciones que
incluyen a glutatin oxidado (GSSG) y reduci
do (GSH).
2GSH -HH p ^ ---------------GSSG + H p
GSSG + N A D PH ---------------2GSH + NADP"
La catalasa tambin puede detoxificar catali
zando la reduccin del H^O^ por cationes divalentes a agua y oxgeno. En la figura 23-13, se
puede observar un resumen de estas vas metablicas.
La muerte de las bacterias tambin se puede
producir por vas no dependientes del oxgeno.
La muerte de la bacteria ocurre cuando se for
man especies ms reactivas, como el radical hi
drxido e hidroxilo. La lisozima, es una enzima
catinica que destruye al cido murmico de la
pared de la bacteria. La catepsina G, es una
proteasa de serina eon actividad de tripsina,
que se encuentra localizada en los grnulos pri
marios y que tiene actividad antimicrobiana y
anti fungicida. Existe otra protena que aumen
ta la perm eabilidad de las bacterias y posee
propiedades bactericidas contra los grmenes
gram negativos. Se ha descrito una fam ilia de
pptidos eatinicos de 30 aminocidos llama

458

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

F ig. 23-13. Estallido respiratorio y m e
tabolism o de neutrfilos.

dos defensinas que juegan un papel im por

tante en la m uerte de microorgani,smos tales
como bacterias, hongos y virus. Adicionalmen
te, muchas de las enzimas que se encuentran en
la vacuola fagoctica contribuyen a la digestin
completa del microorganismo muerto.
Eosinfilos
Los eosinfilos se forman en la mdula sea
a partir de precursores, los cuales a su vez deri
van de un precursor comtn de neutrfilos y ba
sfilos (stem cell); maduran en 2 a 6 das,
luego entran al torrente circulatorio y poseen
una vida media de 6 a 12 horas. El porcentaje
de eosinfilos circulantes es bajo si se compara
con la cantidad de eosinfilos tisulares. Se esti
m a que por cada eosinfilo circulante existen
200 en la mdula sea y 500 en la submucosa
tisular. Por lo tanto estas clulas residen prima
riamente en los tejidos y en la mayora de los
casos se encuentran en los mismos sitios que
las clulas m asto id eas, frec u en te m e n te en
aquellos tejidos que estn en contacto con el
exterior.
Los eosinfilos, basfilos, clulas m astoi
deas e IgE son componentes de la inmunidad
que se encuentran en las superficies. Los eosi
nfilos tienen mucho en comiin con los basfi
los y las clulas mastoideas, aunque tambin
presentan diferencias importantes con ellas.
En la superficie de la membrana, los eosin
filos poseen receptores para IgE, IgA e IgG.
Tambin tienen receptores para los componen
tes del complemento C3b y C4. El niimero de
receptores aumenta luego de la exposicin de
los eosinfilos a mediadores inflamatorios deri
vados de los basfilos, tales como histamina, y
factor quimiotxico de eosinfilos. La superfi
cie de los eosinfilos tambin contiene lisofosfolipasa. Cuando un niimero grande de eosin

filos se encuentran involucrados en un proceso

inmunolgico y mueren, se libera lisofosfolipasa, la cual puede coalescer formando partculas
llamadas cristales de Charcot-Leyden,
Los eosinfilos poseen grnulos caractersti
cos a los cuales le deben su nombre. En cada
clula hay 200 grnulos de tres tipos diferentes:
los grnulos pequeos , que se encuentran s
lo en los eosinfilos maduros, contienen fosfa
tasa cida y arilsulfatasa, la que modula la pro
duccin de la sustancia de liberacin lenta de la
anafilaxis que hoy se sabe son los leucotrienos;
los grnulos primarios" que son prominentes
slo en promielocitos; el tercer tipo de grnulo,
llamado grnulo secundario que provee la
mayor parte del poder de los eosinfilos.
El grnulo secundario est formado princi
palmente por cristales de una protena conocida
como protena bsica mayor (MBP), Es qumi
camente una protena bsica (punto isoelctrico
11.6), que posee un 16% de residuos de argini
na y constituye el 55% de las protenas de los
grnulos y el 25% del total de las protenas del
eosinfilo. La MBP genera la liberacin de his
tamina de ls basfilos y de las clulas mastoi
deas, se une a la heparina y neutrahza su activi
dad anticoagulante. La MBP juega un papel
muy importante en la destruccin de parsitos,
aunque tambin se encuentra involucrada en
otros procesos. En el grnulo secu n d ario
tambin se encuentran otras protenas como la
protena catinica del eosinfilo (ECP), la neurotoxina derivada de eosinfilos (EDN) y la p e
roxidasa del eosinfilo (EPO).
La EDN es una potente neurotoxina y helmintotoxina. La EDN, posee homologa de se
cuencia eon la ECP en el dominio N-terminal.
Posee propiedades de RNasa, es txica para
helmintos pero su nombre se debe a que tiene
propiedades de inducir dao en la neuronas
mielinizadas en animales de laboratorio.

Inflamacin
La EPO es muy activa en provocar la muerte
de microorganismos, incluyendo bacterias, m i
coplasma, virus, hongos, helmintos y otros pa
rsitos as como otras clulas como la neoplsi
cas y las clulas mastoideas. Esto ocurre cuan
do la EPO, el perxido de hidrgeno y el ioduro interactan para iodinar y matar a las clu
las. La EPO y el perxido de hidrgeno pueden
oxidar a otras molculas, por ejemplo, oxidan e
inactivan a los leueotrienos.
La degranulacin de las clulas mastoideas
puede ser inducida por la EPO. La EPO puede
unirse a la superficie de la clulas mastoideas y,
a niveles no txicos para la clula mastoidea in
ducir degranulacin y liberacin de histamina.
Existen evidencias que le permiten atribuir
otras funciones a los eosinfilos. Los eosinfilos
son capaces de inactivar a ciertos mediadores de
la inflamacin producidos por las clulas m as
toideas. De esta manera disminuyen la severidad
de los fenmenos mediados por la IgE, que in
cluyen a la respuesta a parsitos as como tam
bin algunas reacciones alrgicas (anafilaxis).
Los eosinfilos juegan un papel muy impor
tante en la defensa contra los parsitos. Se han
observado niveles altos de eosinfilos en plas
ma (eosinofilia), en pacientes con diversos ti
pos de desrdenes. Se encuentra aceptado que
los eosinfilos juegan un papel en la patogne
sis del fenmeno de hipersensibilidad tales co
mo asma, dermatitis atpiea y anafilaxia.
Un gran nmero de compuestos pueden ser
quimiotxicos para los eosinfilos o modificar
su funcin. Las clulas T producen factores de
crecimiento que inducen diferenciacin de los
eosinfilos en la mdula sea y factores quimiotxieos que provocan la infiltracin de los eosi
nfilos a los tejidos. Las clulas mastoideas pro
ducen histamina y otros pptidos que atraen eo
sinfilos y potencian su accin destructora. El
factor estimulante de colonias de macrfagos y
monocitos y el llamado factor de diferenciacin
de eosinfilos (lL-4), tienen efecto en ia activa
cin y maduracin de los eosinfilos. El TNE y
el LTB^ tambin aumentan la capacidad citot
xica de los eosinfilos. Los complejos inmunes
y los fragmentos de complemento C5a son tam
bin quimiotcticos para los eosinfilos y neu
trfilos. Asimismo, los eosinfilos pueden fagocitar complejos inmunes. Finalmente, molculas
derivadas de los parsitos sirven como factores
quimioatractantes, atrayendo a las clulas efec
toras al sitio mismo donde son necesarias.
Basfilos y clulas mastoideas
Los basfilos provienen del precursor de la
lnea de los neutrfilos y monocitos. Maduran
en la m dula sea y luego entran en circula
cin, representando el 0.5% del total de los

459

granulocitos. En general, la cintica del recam

bio de los basfilos es similar a la de los eosi
nfilos, lo cual no es sorprendente ya que am
bas clulas se encuentran involucradas en los
procesos alrgicos y provienen de un m ism o
precursor. Como los eosinfilos, los basfilos
pueden ser reclutados en un tejido luego de que
se ponga en evidencia una seal apropiada que
los convoque.
Los clulas mastoideas, a diferencia de los
basfilos, no se encuentran normalmente en cir
culacin, sino que conforman una porcin fija
de clulas del tejido conectivo. Virtualmente to
dos los rganos poseen clulas mastoideas. As,
son particularmente abundantes en el pulmn y
la piel, en el sistema gastrointestinal, en los alre
dedores de los vasos sanguneos y linfticos, en
los nervios o en la proximidad de los fibroblas
tos. El origen de las clulas mastoideas tambin
es la mdula sea pero se sabe poco de su proli
feracin, maduracin y reclutamiento. El hecho
de que las clulas mastoideas puedan sintetizar
y secretar citoquinas especficas, reconocidas
como productos de linfocitos y monocitos, su
giere origen monoctieo para estas clulas.
Tanto los basfilos como las clulas m astoi
deas, se encuentran unidas a la respuesta alr
gica a travs de su capacidad de unir IgE.
La respuesta alrgica es m ediada por una
compleja red de reacciones que empiezan en la
mem brana celular. La reaccin comienza con
la unin de dos molculas de IgE a la m em bra
na, las cuales interactan con sus receptores y
luego transmiten la seal al interior de la clula
culminando en la degranulacin con liberacin
de mediadores. La liberacin de los mediadores
sigue a un aumento del calcio intracelular. A
pesar de que existe cierta controversia acerca
de la transduccin de la seal de activacin,
hoy se encuentra aceptada la mediacin de la
liberacin de inositol-fosfato, movilizacin del
calcio y activacin de la va de la quinasa C.
Adicionalmente, se produce la movihzacin de
cidos grasos poliinsaturados asociados a la
membrana (cido araquidnico). El m etabolis
mo de dicho cido graso permite la formacin
de productos de la ciclo-oxigenasa, de la lip o
xigenasa y del PAF.
Por otro lado los basfilos y las clulas m as
toideas se encuentran plenas de sustancias que
pueden m odificar la m icrocirculacin, o rig i
nando cambios en la perm eabilidad vascular.
La liberacin masiva de productos de las clu
las mastoideas y de los basfilos puede m ediar
la reaccin violenta de la hipersensibilidad, que
puede llevar a la muerte en un perodo breve.
Este tipo de respuesta se denomina anafilaxis.
Por conveniencia, a los mediadores de las
clulas mastoideas se los clasifica en tres gru
pos (cuadro 23-2);

460

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

C u a d ro 23-2. M ediadores de las clulas

mastoideas
Pre form ados y eluidos
H istam ina
A nin superxido
Enzim as depradativas de m atriz
extracelular
C alicrena
Interleuquinas 3, 4, 5, 6 y 8
Pre form ados y asociados a los grnulos
Proteasas
C arboxipeptidasas
H eparina- C ondrotin sulfato
Triptasa
A ril sulfatasa
G enerados recientem ente
Leucotrienos (LT C ,, D ,, E.)
PA F
Prostaglandinas (Dj)

a) preformados y fcilmente liberados

b) preformados y asociados a grnulos
e) generados recientemente
(Para mayor informacin vase eap. 32.)
2.7.b Segunda lnea de defensa
Monocitos y macrfagos
Los m onocitos y los m acrfagos son e le
mentos fundam entales del sistem a fagoctico
mononuclear (MPS). Los monocitos constitu
yen el com ponente sanguneo del sistem a,
mientras que los macrfagos residen en lugares
especficos de los tejidos tales como hgado
(elulas de Kupffer), pulmones (macrfagos al
veolares), bazo, ndulos lin ftico s, m dula
sea, tero y cerebro (mieroglia). Los monoci
tos m aduran a m acrfagos cuando entran al
compartimiento tisular. Durante la maduracin,
estas elulas adquieren diversas funciones, al
gunas de ellas relacionadas eon la actividad fagoetica incluyendo: defensa contra los m i
croorganismos, capacidad para iniciar respues
ta inmune, secretar mediadores que regulen la
proliferacin y produccin de factores linfoeitarios.
Una de las funciones ms importantes de los
monocitos y de los macrfagos es su capacidad
para ingerir material extrao, conocida como
fagoeitocis.
Los monocitos poseen la capacidad de pro
ducir mediadores solubles de amplia actividad
biolgica. La produccin de estos mediadores
se encuentra bajo control de los linfocitos T.
Los mediadores ms importantes son: la inter

leuquina - 1 , factores estimulantes de colonias,

la interleuquina- 6 , y el factor de necrosis tu
moral.
Otro aspecto del papel de los macrfagos en
la respuesta inmune es el desarrollo del estado
de activacin. El trmino activado se refiere
al aumento de la capacidad bactericida del maerfago y se debe fundamentalmente a la pro
duccin de aniones superxido (O ^) y perxido
de hidrgeno. Esta activacin se produce por la
interaccin de los monocitos con productos de
las clulas T activadas.
Los macrfagos secretan enzimas que juegan
un papel importante en diversos estados patol
gicos. Entre ellas las ms importantes son: acti
vador del plasmingeno, colagenasa, elastasa,
y proteasas activas a pH neutro. Tambin son
secretados por los macrfagos componentes del
sistema de complemento tales como, C l, C4,
C2, C3, C5, factor B, factor D y properdina as
como los fragmentos activados C3a y C5a por
la accin de proteasas de los macrfagos. Los
m acrfagos tam bin sintetizan eicosanoides
(PGEj, TXA^, leucotrienos B y C, 5-HETE y
15-HETE).

2.7.C Plaquetas
El papel de las plaquetas en la inflamacin no
ha sido muy mencionado. Sin embargo las pla
quetas son las segundas en abundancia en el to
rrente circulatorio (le anteceden los eritrocitos) y
hay 20 a 50 plaquetas por cada leucocito en cir
culacin. Muchas de las condiciones que produ
cen activacin de los leucocitos se encuentran
asociadas con la agregacin plaquetaria.
Durante la respuesta inflamatoria los leuco
citos y las plaquetas se encuentran en ntimo
contacto lo cual aumenta la posibilidad de in
tercambio de los mediadores.
El papel de las plaquetas abarca cuatro reas:
1 ) homeostasis, 2 )modulacin de la respuesta
inflamatoria, 3) toxicidad directa como clula
efectora, 4) reparacin.
La cascada de coagulacin y la agregacin
plaquetaria son dos armas im portantes en la
respuesta a la injuria.
La agregacin plaquetaria otorga un contacto
directo con otras clulas vecinas, permitindole
a las plaquetas modular la funcin de las clu
las endoteliales e inflamatorias. Las plaquetas,
en forma similar a las clulas endoteliales y los
leucocitos, poseen molculas de adhesin espe
cficas en su superficie, las cuales promueven
contacto intercelular. La glucoprotena Ib, en
combinacin con el factor vWF (factor de von
Willebrand), es responsable de la adhesin de
las plaquetas a la superficie sub-endotelial. La
interaccin con los monocitos se produce va la
trombospondina presente en la superficie de las

Inflamacin
plaquetas y los receptores de trombospondina
de los monocitos. Las plaquetas se unen simi
larmente a los neutrfilos, pero no se conoce la
naturaleza exacta de esa interaccin. La agre
gacin plaquetaria expone a las clulas endote
liales, a las clulas del msculo liso y a los leu
cocitos a concentraciones altas de los produc
tos liberados de los grnulos de las plaquetas y
los sintetizados de novo. Estos productos tie
nen actividad predominantemente pro-inflamatoria e incluyen: metabolitos del cido araqui
dnico, proteasas, ADP, y factores de creci
miento. Las plaquetas son capaces de modular
a los neutrfilos en todas las fases de la res
puesta inflamatoria.
Las plaquetas, a travs de la induccin de la
adherencia, la agregacin, y la quimiotaxis, re
clutan a los neutrfilos al sitio de inflamacin.
Adicionalmente, los productos de las plaquetas
inician o potencian la respuesta de los neutrfi
los sobre sus clulas blanco. Las plaquetas pue
den tener el mismo efecto sobre los monocitos
y los eosinfilos.
La tercera funcin de las plaquetas es como
efector en la infecciones parasitarias. Si bien
no poseen la posibilidad de generar anin supe
rxido, sin embargo las plaquetas presentan ac
tividad citotxica, aunque el mecanismo por el
cual transcurre no se conoce.
Las plaquetas completan su cuarta funcin
promoviendo la respuesta celular asociada a la
reparacin. El factor de crecimiento derivado
de las plaquetas y el factor de transformacin
beta (TG F-p) son estm ulos potentes para la

migracin, proliferacin y estimulacin de fi

broblastos y del msculo liso y juegan un im
portante papel en la reparacin y cicatrizacin.
2.8 La respuesta de fase aguda
de la inflamacin
La respuesta de fase aguda (APR), tam bin
conocida como reaccin aguda, representa una
respuesta rpida, compleja, no especfica a di
versos tipos de dao tisular. Se caracteriza por
presentar modificaciones locales y sistm icas
de la fisiologa normal, todo lo cual sirve para
controlar el dao, producir la limpieza de los
desechos, y comenzar la reparacin tisular (fig.
23-14). Estas funciones se llevan a cabo m e
diante la alteracin de la sntesis de protenas
por el hgado, que acompaan a la inflamacin.
Las protenas que estn reguladas positiva
mente durante la inflamacin, se llaman reactantes positivos de la fase aguda. Las protenas
cuya sntesis es disminuida se denominan reactantes negativos de la fase aguda.
Induccin de la respuesta de fa se aguda
En la fase muy temprana de la inflamacin
los macrfagos tisulares reclutados de la sangre
comienzan a producir citoquinas. Las citoqui
nas ms claramente implicadas en la APR son:
la IL-1, el TNF, y la IL- 6 .
En la inflam acin temprana, aumentan los
niveles de cortisol, llegando a un mximo a las
6 horas. El nmero de clulas de la serie blanca

Injuria

Reaccin sistmica

Reaccin local

-Fiebre y dolor

- vasodilatacin

-Leucocitosis

transudacin
- Agregacin plaquetaria
formacin de cogulos

-Segregacin de hormonas
Mediadores
-Interleuquinas 1 y 6
-Eicosanoides
-H istam ina
-Serotonina
-T N F
-Q uininas

- Acumulacin de neutrfilos
y macrfagos
- Liberacin de proteasas
y otras enzimas

-Activacin del complemento

y cascadas de coagulacin
-Disminucin de Fe y Zn
-Transferencia de aminoci
dos del msculo al hgado

- Formacin de mediadores
-A um ento de protenas de
fase aguda

- Estimulacin de fibroblastos

Respuesta de fase aguda

Muerte celular
Necrosis

461

Reparacin

F ig. 23-14. D esarrollo y efectos de la APR.

462

Mecanismos efectores de ia respuesta inmune

circulantes com ienza a aum entar llegando al

mximo a las 10 horas. Un gran nmero de c
lulas blancas se encuentran dbilmente asocia
das a las clulas del endotelio vascular. Estas
clulas se liberan a la circulacin durante la in
flamacin en un proceso conocido como demarginacin. Este proceso se ve favorecido por
el cortisol. Otro mecanismo por el cual se pro
duce leucocitosis es por la liberacin de neutr
filos de la mdula sea, inducido por la IL-1.
Las citoquinas alteran la funcin heptica.
Como consecuencia de ello se producen cam
bios en el metabolismo de las grasas con au
m ento de la sntesis de las lipoproteinas de
muy baja densidad (VEDE) y disminucin de
las lipoproteinas de alta densidad (HDL). Los
aminocidos liberados del msculo son capta
dos por el hgado y tambin se encuentra modi
ficado el perfil de protenas sintetizadas. Existe
una disminucin de los niveles de enzimas in
volucradas en la gluconeognesis y un aumento
de las que participan en las vas m etablicas
que proveen energa y de las que participan de
la glucosilacin de protenas.
Existen evidencias de que la APR tiene dife
rentes caractersticas en los distintos tipos de
inflamacin. Los cambios en la velocidad de
sntesis de las diferentes protenas de la APR, y
del tipo de protena glucosilada varan segn
los distintos procesos patolgicos.
La funcin que cumple la APR, depende de
la funcin que cum ple cada protena. C ono
ciendo el papel que cumple la protena se eva
la el propsito de su cambio durante la infla
macin.
2.8.a Respuesta de fa se aguda negativa
A lbm ina. El hecho de que la albmina no
presentara funcin especfica, hizo que los in
vestigadores la consideraran como un adapta
dor metablico. La albmina conserva un pro
ceso de sntesis activo que, en caso de que sea
necesario el aumento de sntesis de otras pro
tenas, disminuye su propia sntesis, preservan
do de esta forma la presin onetica.
T ran sferrin a. Es otra protena regulada ne
gativamente durante la APR. Pertenece al gru
po de las beta-globulinas. Es la mayor respon
sable del transporte de hierro. El hierro es ne
cesario para el crecimiento de la clulas de los
mamferos y de las bacterias. La disminucin
de la transferrina circulante con el aumento
concomitante de la ferritina intraheptica dis
minuyen ia disponibilidad del hierro en el sitio
de la infeccin.
Transtiretina. Conocida como pre-albmina. Es la protena transportadora de la hormona
tiroidea. Su disminucin es til para disminuir
los niveles de hormona tiroidea en la periferia,

modificando el metabolismo en el sitio de la

inflamacin.
2.8.b Respuesta de fase aguda positiva
G rupo/
Ceruloplasmina. Es una aj-globulina. Es la
ms im portante para el transporte de cobre.
Tiene la propiedad de actuar en la eliminacin
de radicales libres del oxgeno de forma no ca
taltica y estequiomtrica y tiene actividad de
superxido dismutasa, protegiendo del dao ti
sular.
Componentes del complemento B, C , y C^.
Este grupo de protenas posee capacidad de op
sonizar, propiedades quimiotxicas, vasodilata
doras y eitolticas por lo que resulta evidente la
importancia de su aumento durante la fase agu
da de inflamacin.
Grupo II
AGP. Conocida como orosomucoide. C on
forma el 30% de las a|-globinas. Se encuentra
glucosilada en un 50% lo cual le confiere pro
piedades para interactuar con una gran variedad
de membranas celulares. Inhibe la interaccin
de los parsitos de la malaria con las membra
nas de los glbulos rojos, inhibe la agregacin
plaquetaria, acta como antiproteasa y se une a
una heparina inactivante.
H aptoglobina. Es el 25% del total de las
fraccin a^-globinas. Une hemoglobina y cum
ple funciones en el aporte de hemoglobina al
sitio de inflamacin, pudiendo modificar la sn
tesis de prostaglandinas ya que la cicloxigenasa
es una hemo-protena. Tambin posee activi
dad de antiproteasa y poder bacteriosttico na
tural. La haptoglobina tambin puede ser inmunomoduladora, puede suprimir la blastognesis
linfocitaria y la quimiotaxis de los monocitos.
Fibringeno. Es una p-globulina y es la pro
tena clave de la coagulacin. Tambin acta
como una opsonina aum entando el agrupamiento de ciertos microorganismos, como esta
filococos y estreptococos. El fibringeno blo
quea la reactividad mitognica da las clulas T
y la quimiotaxis de los macrfagos.
Inhibidor de proteasas. La a ,-P I es el ms
im portante inhibidor de proteasa del plasm a
humano. El 55% de la actividad es extravascular, lo cual denota su papel en el control de la
actividad de proteasas tisulares.
Grupo III
Componente amiloideo A (SSA). Su nivel
aumenta de 1 0 0 a 1 .0 0 0 veces durante la infla
macin. SAA se encuentra asociada a las lipo-

Inflamacin

Cuadro 23-3. Protenas de APR

APR

463

1. Iniciacin de la respuesta inflamatoria.

2. Movilizacin de las clulas inflamatorias.

N ivel en plasm a

3.1. Iniciacin de la respuesta inflamatoria

A PR -positiva
G rupo 1
G rupo II

G rupo III

APR negativa

T 50% C eruloplasm ina

C om plem ento C |-C , B,
t 2-4 X al-g lo b in a s
H aptoglobina
Fibringeno
Inhibidor de proteasas
t l O O - 1000 X Protena
reactiva
com ponente
am iloideo A
i A lbm ina
T ransferrina
T ranstiretna

protenas de alta densidad (HDL), lo que le

atribuira propiedades de ayudar a la elim ina
cin de derivados lipdicos de los microorga
nismos o toxinas que formen complejos con las
lipoprotenas.
Protena C reactiva (CRP). Debe su nom
bre a su capacidad de precipitar al poiisacrido
de microorganismos. La CRP se puede unir a
polisacridos, fosfolpidos y policationes. El
resultado final de la unin de la CRP a bacte
rias es producir la precipitacin y aglutinacin
de los microorganismos. La CRP, unida a los
microorganismos, a los fosfolpidos o a los po
licationes, aumenta la opsonizacin y causa la
generacin de factores quimiotcticos. La CRP
se une a tejido necrtico y de ese modo puede
aumentar la velocidad de su remocin por fa
gocitosis (cuadro 23-3).
La medida ms comn de la APR es la eritrosedimentacin. Los glbulos rojos poseen en
su superficie residuos de cido silico que pro
voca la repulsin de las clulas entre s. La pre
sencia de protenas sricas con carga positiva
neutraliza las cargas del cido silico, facilitan
do que las clulas se empaqueten y sedimenten
juntas. El fibringeno est cargado positiva
mente y es la protena plasmtica ms asimtri
ca, por lo que es el mayor responsable del au
mento de la eritrosedimentacin que se presen
ta en la inflamacin.
3. DINAMICA DE LA RESPUESTA
INFLAMATORIA
En el sitio de la inflamacin ocurren im por
tantes cambios. Estos cambios y el influjo de
clulas que toman parte en la inflamacin es
lo que se conoce como la respuesta inflam a
toria.
En la respuesta inflamatoria aguda se pueden
distinguir dos etapas que denominaremos;

La iniciacin de la respuesta inflamatoria es

un proceso dinmico que involucra a la interac
cin de mediadores solubles derivados del teji
do con la pared vascular, las clulas inflam ato
rias y los componentes plasmticos.
De los cuatro signos cardinales de la infla
macin, el calor y el rubor son debidos a un in
cremento del flujo sanguneo en el sitio de la
inflamacin. Luego de la injuria tisular, poten
tes m ediadores vasoactivos liberados p o r las
clulas mastoideas de los tejidos y por com po
nentes de la pared vascular inducen un episodio
breve de vasoconstriccin (3 a 5 segundos), se
guido por dilatacin de las arteriolas pre-capilares y aumento del flujo sanguneo en la red
vascular. La manifestacin clnica de este pro
ceso es el rubor.
El aumento del flujo sanguneo va acom pa
ado de aumento de la perm eabilidad en las
vnulas poscapilares, debido a la retraccin de
las clulas endoteliales y de la form acin de
espacios en las uniones clula endotelial- clu
la endotelial. El aum ento de perm eabilidad
permite al fluido y a las protenas salir del es
pacio intravascular, generando edema e h in
chazn. Este proceso tambin genera una con
centracin relativa de glbulos rojos en la vasculatura con retardo del flujo sanguneo en las
vnulas, lo cual facilita la marginacin de los
leucocitos y fom enta la adhesin de los m is
mos al endotelio.
La formacin de edema y la redistribucin
sangunea por las arteriolas es tambin afectada
por factores neurognicos liberados en el sitio
de injuria.
En el cuadro 23-4 se encuentra un resumen
de los mediadores, los mediadores vasoactivos
y de su fuente de origen.
3.2. M ovilizacin de las clulas
inflamatorias
La movilizacin de las clulas inflamatorias
se encuentra comprendida en dos fenm enos
fundamentales:
a. leucocitosis.
b. migracin celular
3.2.a Leucocitosis
Los neutrfilos, eosinfilos y monocitos son
producidos en la mdula sea donde perm ane
cen depositados por un corto perodo y luego
son liberados al torrente circulatorio. Los m a
crfagos derivan fundamentalmente de los mo-

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

C u ad ro 23-4. Mediadores vasoactivos

Fuente

M ediador
V asoconstriccin
N eurognicos
LTC4, LTD4, LTE4

N ervios
C lulas m astoideas, basfilos
Vasodilatacin

PG12

C lulas endoteliales

PGE2, PG D 2

M onocitos, m acrfagos, c lu
las m astoideas

H istam ina

C lulas m astoideas, basfilos

S erotonina

Plaquetas

Bradiquina

Plasm a (sist. celular de co n

tacto)

NO

C lulas endoteliales
A um ento de perm eabilidad vascular

Histam ina

C lulas m astoideas, basfilos

S erotonina

P laquetas

C3a, C 5a

Plasm a (sistem a de contacto)

Bradiquinina

P lasm a (sistem a de contacto)

LTC4, LT D 4, LTE4

Eosinfilos, clulas m asto i

deas, m onocitos

PAF

C lulas m astoideas, basfi

los, m onocitos, m acrfagos,
neutrfilos, eosinfilos,
plaquetas, clulas m asto i
deas

la poblacin total de neutrfilos del torrente

circulatorio, el 45% son circulantes y el 55%
son neutrfilos m arginados. Los neutrfilos
pueden ser rpidamente movilizados y son los
responsables del aumento de neutrfilos perif
ricos asociados al ejercicio intenso o al uso de
esteroides.
El depsito en mdula sea est constituido
por clulas maduras o que se encuentran en las
ltimas etapas de maduracin, las cuales estn
normalmente retenidas antes de ser liberadas al
torrente circulatorio. El nmero de clulas en
esta situacin es 2 0 veces mayor que el de cir
culacin. En respuesta a mediadores inflamato
rios como la IL-1, el TNF y la endotoxina estas
clulas son liberadas al torrente circulatorio. El
aporte del compartimiento de la mdula sea a
la reaccin inflamatoria se hace evidente por el
nm ero de neutrfilos en cayado que se en
cuentran en el torrente circulatorio.
Los monocitos, por el contrario, se encuen
tran depositados en muy escasa cantidad en la
mdula sea y su movilizacin requiere divi
sin de la stem cell al responder a la deman
da perifrica.
3.2.b Reclutamiento celular

nocitos circulantes, pero poseen una habilidad

limitada de presentar mitosis en los tejidos.
La vida media de los neutrfilos, eosinfilos
y fagocitos m ononucleares es relativam ente
corta. Por lo tanto para mantener su ntimero en
el sitio de inflamacin requiere un influjo cons
tante de nuevas clulas.
En la inflamacin aguda el ntimero de leuco
citos asciende de 5000 a 30.000/mL. Este au
mento es debido al movimiento de neutrfilos
al torrente circulatorio desde dos sitios de de
psito; las clulas marginadas intravasculares y
las de la mdula sea.
El depsito de clulas marginadas representa
una poblacin de neutrfilos que se encuentran
adheridos tem porariam ente a la pared de los
vasos sanguneos y que de esta manera perm a
necen fuera del torrente circulatorio principal.
Esta marginacin ocurre en los vasos donde la
dinmica del flujo sanguneo hace que los gl
bulos rojos ocupen el torrente central, despla
zando a los leucocitos a la periferia, en contac
to eon el endotelio de los vasos sanguneos. De

3.2.b.l Factores que regulan

el reclutamiento celular
La extravasacin de los leucocitos es un de
terminante crucial de la reaccin inflamatoria.
La IL-1 y el TNF, inyectados localmente, cau
san infiltracin leucocitaria en los tejidos. Las
clulas endoteliales participan en el reclu ta
miento de leucocitos provocado por las citoqui
nas inflainatorias, produciendo quimioatractan
tes que activan y atraen leucocitos, por expre
sin de molculas de adhesin y por la altera
cin del flujo sanguneo.
Las estructuras de adhesin inducidas por
IL-1 y TNF pertenecen a dos grupos estructura
les: el gen de la superfamilia de las inmunoglo
bulinas (Ig) y la familia de las selectinas. Las
clulas endotehales expresan constitutivamen
te, a bajos niveles, tres molculas del tipo Ig;
ICAM-1, ICAM-2, y VCAM-1. El tratamiento
eon IL-1 y T N F in c rem e n ta la sn te sis de
IC A M -1 y V C A M -1 , m ie n tra s q u e la de
ICAM-2 no es afectada.
Los ligandos de estas Ig son miembros de
los receptores de adhesin de la familia de las
integrinas: LFA-1 y Mac-1 ( que pertenecen a
la subfamilia de integrinas 32, C D l 1/18 o Leu
C A M ) q u e a c t a n co m o re c e p to re s p a ra
ICAM-1 mientras que VLA-4 ( o alfa4|3l)es el
receptor para VCAM - 1 .
La activacin de los leucocitos por ciertos
estmulos aumenta intensamente la afinidad de

Inflamacin
LFA-1 y Mac-1 por ICAM-1, posiblemente de
bido a cambios conformacionales de las mol
culas de integrinas mediadas por el dominio citoplasmtico de la cadena P2. Por otro lado, la
afinidad y especificidad de ICAM-1 para los
receptores-integrinas es modificada por el gra
do de glucosilacin.
La otra protena de adhesin inducida por el
tratamiento con citoquinas en las clulas endo
teliales es la selectina -E. Los tres componentes
de este grupo comparten una estructura similar,
con un dominio lectina dependiente del calcio
en el terminal amino. Los otros dos componen
tes de este grupo son: la selectina -P o GMP14 0 /P A D G E M y la s e le c tin a -L o M E L 14/LAM -l. Diversos trabajos demuestran que
los carbohidratos son ligandos para las selecti
nas a travs del reconocim iento del dominio
lectina de estas m olculas. Un azcar de es
tructura simple, Slex, fue identificada para la
unin de ia selectina-E en las clulas de origen
mieloide. El mismo azcar puede unir tambin
selectina-P. Sin em bargo, otro grupo azcar,
Slea, presente en las clulas del carcinoma de
colon, pero no en polimorfonucleares neutrfi
los o monocitos, puede unir vidamente selecti
na-E y promover adhesin de las clulas tumorales. Adems, la selectina-L, presente en linfo
citos y polimorfonucleares, puede unirse a la
selectina-E.
La induccin de la selectina-E en clulas en
doteliales por IL-1 es de corta duracin, llega
al mximo en 4h y luego cae en 8-12h, por lo
que tiene un papel importante slo en la prime
ra fase del reclutamiento leucocitario.
Los monocitos, eosinfilos y los linfocitos
T, reconocen las tres molculas de adhesin in
ducidas por la IL-1. Los neutrfilos se unen a
lCA M -1 y a ELA M -1, pero no reconocen a
V CAM -1. Las clulas NK se unen esencial
mente a ICAM-1 y a VCAM-1 y slo en menor
proporcin a la selectina -E.
Aparentemente, una accin concertada de es
tas molculas de adhesin inducibles de las c
lulas del endotelio son requeridas para la m i
gracin celular a travs del endotelio. En trmi
nos generales, la selectina-E juega el pape) de
permitir la primera adhesin de los leucocitos
en vnulas, mientras que el mecanismo de re
conocim iento de ICAM-1 y Mac-1 dominan
los sucesos posteriores. La interaccin de los
monocitos y neutrfilos con las selectinas E y
P, median el rodamiento a lo largo de la su
perficie del endotelio. La activacin leucocita
ria con citoquinas quimioatractantes (quimio
quinas), promueve su unin a ICAM-1, la cual
es entonces responsable de una adhesin ms
fuerte y de la migracin a las capas sub-endoteliales.
La adhesin de los leucocitos a los recepto

465

res de adhesin del endotelio, los activan. La

interaccin de los linfocitos T con VCAM-1 e
ICAM -1, pero no con selectina E, es co-estimulatoria con el receptor de clulas para indu
cir proliferacin y expresin del receptor de
IL-2.
La expresin de las protenas de adhesin de
las clulas endoteliales se ha observado en dis
tintas patologas en seres humanos, incluyendo
la fase tarda de las reacciones alrgicas, artritis
reumatoidea y linfoma.
Las m olculas de adhesin inducidas por
IL-1 y TNF no son reconocidas especficamen
te por los leucocitos, sino que pueden unir otras
clulas invasivas. Por ejemplo, IC A M -I, puede
unir a la mayora de los rinovirus y pro-eritrocitos infectados por Plasmodium falciparum-, la
Candida albicans puede expresar receptores de
adhesin homlogos a M ac-1, por lo que se su
giere que puede unirse a ICA M -1.
VCAM-1 es reconocida por clulas tumora
les tales como las de melanoma y las de osteo
sarcoma, mientras que la selectina-E es unida
por clulas del carcinoma de colon. Este fen
meno est acompaado por un aumento de la
adhesividad de las clulas tumorales a las clu
las endoteliales activadas y es, por lo tanto, la
causa del incremento de la incidencia de mets
tasis artificial o espontnea en los animales tra
tados con IL-1.
3.2.b.2 Migracin celular
La migracin de los leucocitos a los tejidos
involucra una secuencia coordinada de fenme
nos de adherencia, mediados por la interaccin
entre los leucocitos y las molculas de adhe
sin de la superficie de las clulas del endotelio
vascular. Esta cascada de fenm enos se en
cuentra ilustrada en la figura 23-15 y puede ser
dividida en cuatro etapas.
1. La primera etapa involucra la generacin de
mediadores (incluyendo citoquinas) y la ac
tivacin inicial del endotelio en el sitio de
inflamacin para inducir la expresin de se
lectinas y ligandos de selectinas. E sto oca
siona el debilitam iento del contacto entre
los leucocitos y el endotelio vascular, indu
ciendo de esta form a el rodam iento de
los leucocitos a lo largo del endotelio.
2. En la segunda etapa de la cascada, la de
activacin, los leucocitos que se encuen
tran rodando son activados por citoquinas,
quimioquinas y quimioatractantes, que son
producidos localmente. La activacin de los
leucocitos produce entonces un aumento de
la afinidad de la unin de las integrinas de
los leucocitos a sus ligandos endoteliales,
llevando a una adhesin firme.

466

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

Etapa

Leucocitos

R odam iento

Carbotiidratos
sialilados y
glucosllados
Selectina L

A ctivacin

Adhesin

Receptores de
quimioquinas y
quimioatractantes

LFA-1

Citoquina
Quimioquinas
PAF
Selectina-E

ICAM-1
ICAM-2
VCAM-1

M igracin transendotelial

LFA-1
Mac-1
VLA-4
PECAM-1

Mac-1
MLA-4

Endotelio
Selectlna-P
Selectina-E
LIg. seiectina-L

F ig. 23-15. M igracin leucocitaria.

3. La tercera etapa es de adhesin firm e ,

mediada por la unin de una integrina del
leucocito a un ligando tipo superfamilia
de las inmunoglobulinas (Ig).
4. En la cuarta etapa de la cascada, la m i
gracin trans-endotelial, los leucocitos
adheridos migran entre las uniones de las
clulas endoteliales. La migracin trans
endotelial involucra a integrinas leucocitarias y ligandos endoteliales tipo Ig, as
como a molculas de adhesin de leuco
citos y plaquetas del endotelio vascular
(PECAM-1).
Rodamiento leucocitario
El rodamiento de los leucocitos en el sen
tido del flujo sanguneo es la prim era etapa

previa a la firme adhesin al endotelio. Es me

diada por distintos tipos de selectinas. La selectina-P se encuentra preformada, depositada en
las clulas endoteliales, y es movilizada a la su
perficie celular cuando el endotelio es estimu
lado por mediadores de las clulas mastoideas,
por ejemplo, histam ina y factor activador de
plaquetas (PAF). La selectina-E es inducida en
las clulas del endotelio vascular por citoqui
nas tales como IL -1 y TNF.
Las selectinas P y E del endotelio vascular
luego interactan con oligosacridos sialilados
de los leucocitos del torrente circulatorio (va
se cuadro 23-5) causando a su vez rodamien
to leucocitario.
La selectina- L de los leucocitos tam bin
contribuye al rodamiento leucocitario a tra
vs de su interaccin con oligosacridos del en-

C uadro 23-5. Molculas de adhesin en leucocitos

M olculas de adhesin
en leucocitos

D istribucin

Ligando endotelial

C ontraparte para .selectinas

C arbotiidratos sialilados
C arbohidratos fucosilados

Todos los leucocitos

T odos los leucocitos

Selectinas - P y E
Selectinas Pg y E

Selectina-L

Todos los leucocitos

N o determ inado

Integrinas - B
L F A -1 (CD lla /C D 1 8 )
M A C -1 (CD rib /C D 1 8 )
p l5 0 (C D tlc /C D 1 8 )

Todos los leucocitos

E, B ,N , M
E, B ,N ,M

Integrinas B,
V LA -4 (CD 49d/CD 29)

E, B, L, M

R eferencias: B: b as filo s, E: eo sin filo s; L: lin fo cito s; M : m o n o cito s; N: n e u tr io s .

lC A M -L IC A M -2
ICAM-1
N o determ inado

VCAM -1

Inflamacin
dotelio (ligando de seleetina -L) que son a su
vez inducidos por eitoquinas.
Activacin
La aetivaein de los leucocitos rodantes
por quim ioatractantes resulta en un aumento
rpido de la adhesividad de las integrinas. Este
aumento de adhesividad ha sido demostrado en
neutrfilos, eosinfilos, monocitos y clulas T.
En este sentido, adems del PAF y del leuco
trieno B^, han sido identificados como im por
tantes factores activadores a quimioquinas que
adems determinan la especificidad de activa
cin (vase cuadro 23-6).
Basados en la homologa de la secuencia pri
maria y en la secuencia de las dos primeras cistenas, se distinguen dos familias de quimioqui
nas: las alfa q u im io q u in as, eon se c u e n c ia
C-X-C, que actan sobre neutrfilos y las beta
quimioquinas con secuencia C-C, que actan so
bre monocitos, y en algunos casos eosinfilos y
clulas T (cuadro 23-6). Estas quimioquinas son
producidas en grandes cantidades por clulas T
activadas, m onocitos, clulas endoteliales y
otros tipos celulares. Por ejemplo: la lL -8 dispa
ra la adhesin de neutrfilos a los ligandos en
doteliales ICAM -1 e ICAM-2 a travs de las in
tegrinas [32, en cambio la quimioquina MIP-1(3
induce adhesin de hnfocitos T al ligando endotelial VCAM-1 a travs de las integrinas (31.
Los receptores de quim ioatractantes se en
cuentran acoplados eon protenas que unen
GTP. Luego de la unin del ligando al recep
tor, las seales son transducidas para generar
conformaciones activas de los heterodm eros
de las integrinas. As, la especificidad de la ac
tivacin leucocitaria est determinada por qui

C uadro 23-6. Quimioatractantes ele leuco

citos
Q uim ioractantes
LTB4
PAF
C5
Q uim ioquinas
C-X -C
IL -8
N AP-2

Q uim ioquinas C-C

MCP-1
M CP-3
M T P - la
M T P -lp
Rantes

Fuentes

Clula blanco

M C ,N
E ,B ,N ,M
E, B ,N , M
E C ,E
Com plem ento E ,B ,N ,M

T,M ,EC,
fibroblastos
Plaquetas

N, B
N, B, fibroblastos

T, M, EC,
fibroblastos
M , T ,B
M, T, B
T, plaquetas

B ,M
E ,B ,M
E ,B ,M
T, M
E, B, T, M

467

mioatractantes producidos localmente y la dis

tribucin celular de sus receptores. Adems las
citoquinas, el factor de necrosis tumoral alfa
(TNF-alfa), el factor estimulante de crecim ien
to de granulocitos y macrfagos (GM-CSF), la
interleucjuina 3 (IL-3) y tambin la interleuqui
na 5 (IL-5) incrementan la adhesividad de las
integrinas leucocitarias.
Adhesin
La adhesin firme de los leucocitos al endo
telio es mediada por la unin de las integrinas
de los leucocitos a los ligandos endoteliales ti
po Ig. Cada integrina consiste en cadenas heterodmeras alfa y beta. Existen dos tipos de in
tegrinas, llamadas integrinas Pj e integrinas P,.
Dentro de las integrinas
se distinguen a
su vez tres tipos: LFA-1; Mae-1 y p l5 0 ,9 5 .
Las distintas integrinas P2 se diferencian en el
tipo de cadena alfa las cuales se encuentran no
covalentemente asociadas a dos cadenas p. La
expresin de integrinas p 2 est restringida a
leucocitos, sin embargo la distribucin de las
cadenas p difiere en los distintos tipos de leu
cocitos. LFA-1, es expresado en todos los leu
cocitos, mientras que Mac-1 y pl50,95 estn
expresados en todos los leucocitos excepto lin
focitos. Las integrinas leucocitarias p2, unen
especficamente los ligandos endoteliales tipo
Ig: LFA-1 une a ICAM-1 y a ICAM-2; Mae-1
une a ICAM-1. As la adhesin de los neutrfi
los, eosinfilos, basfilos y monocitos al endo
te lio v a sc u la r d e p en d e p rin c ip a lm e n te de
LFA-1 y Mae-1 y en menor grado de pl5 0 ,9 5 .
La adhesin de los linfocitos involucra slo a
LFA-1.
La integrina p l, VLA-4, se expresa en todos
los leucocitos excepto en neutrfilos y une
VCAM-1 expresada en clulas endoteliales ac
tivadas por eitoquinas. As, VLA-4 est involu
crada en la adhesin de linfocitos, monocitos,
eosinfilos, y basfilos a clulas endoteliales
a c tiv a d a s a tra v s de la in te ra c c i n con
VCAM -1. Como los neutrfilos no expresan
VLA-4, ellos no pueden usar esta va para ad
herirse al endotelio estimulado.
La expresin de ICAM-1 y VCAM-1 en las
clulas del endotelio vascular es regulada por
citoquinas: IL-1, T N F -a y TNF-p inducen la
expresin de lCAM-1 y VCAM-1. El interfern-y reg u la positiv am en te la e x p resi n de
ICAM-1, pero no de VCAM-1. La IL-4 induce
la expresin de VCAM -1, pero no IC A M -1.
Por el contrario ICAM-2 est constitutivamente
expresada en el endotelio vascular y no es afec
tada por las citocuinas.
Por lo tanto, la unin especfica de las inte
grinas leucocitarias a los ligandos tipo Ig del
endotelio y la regulacin de la expresin de los

468

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

ligandos por las citoquinas contribuyen a la se

lectividad de adhesin de los distintos subtipos
de leucocitos, mediando as un reclutam iento
selectivo de leucocitos al sitio de inflamacin.
Migracin trans-endotelial
Finalmente, los leucocitos se arrastran sobre
la superficie del endotelio a la unin intercelu
lar y luego se deslizan entre las clulas endote
liales al tejido extravascular. Se ha demostrado
que la migracin de los leucocitos a travs de
monocapas endoteliales in vitro es inducida por
la activacin de los leucocitos por quimioatrac
tantes y por la estimulacin de las clulas en
doteliales con citoquinas, totalm ente d epen
diente de CD11/CD18. Sin embargo, la adhe
rencia al endotelio es un requisito previo para
la subsecuente migracin trans-epitelial. As,
bloqueando cualquier etapa de adherencia, se
conseguir reducir la migracin trans-endotehal.
Adems de los mecanismos involucrados en
la adhesin firme, hay por lo menos dos meca
nismos diferentes para la migracin trans-endo
telial, llamados quimiotaxismo y haptotaxismo.
En el quimiotaxismo, los leucocitos adherentes
se mueven en el sentido de la concentracin de
un quimioatractante. stos son importantes tan
to en la migracin trans-endotelial de los leuco
citos como en la activacin de las integrinas de
adherencia. En el haptotaxismo, los leucocitos
migran a lo largo de un gradiente de los ligandos de adhesividad de las clulas endoteliales a
la regin de mxima densidad de ligando. En
este sentido, una molcula de adhesin tipo Ig,
PECAM -1, puede cumplir alguna funcin en la
m igracin trans-endotelial de leucocitos. AI
contrario de ICAM-1, la cual es expresada so
bre toda la superficie de las clulas endotelia
les, PECAM-1 est localizada en las uniones
intercelulares por lo que presenta un gradiente
hapotxico que posibilita la migracin transendotelial.
Mecanismo selectivo para la acumulacin
de eosinfilos
Las tres selectinas y sus tres carbohidratos li
gandos, junto a las cuatro integrinas y sus li
gandos tipo Ig, proveen suficiente diversidad
com binatoria como para perm itir el reclu ta
m iento de los subtipos de leucocitos. Por lo
tanto, existen tres componentes clave para se
leccionar el tipo de leucocito reclutado;
1. La expresin selectiva de las selectinas y
sus ligandos en las clulas epiteliales (selectina-P, selectina-E , selectina-L ) inducida
por citoquinas y mediadores inflamatorios.

2. La activacin selectiva de las integrinas leucocitarias (LFA-1, Mac-1 y VLA-4) induci

da por citoquinas, quimioquinas y quimioa
tractantes.
3. La expresin selectiva de las molculas de
adhesin del tipo de Ig en las clulas endo
teliales inducida por citoquinas.
Estudios in vitro demostraron que en la etapa
de rodamiento, existen diferencias entre los
carbohidratos sialilados del ligando de la selec
tina-E de la superficie de los neutrfilos y eosi
nfilos. Esto puede explicar la menor adhesivi
dad de los eosinfilos a la selectina-E.
Tambin se ha demostrado activacin selec
tiva de los eosinfilos por citoquinas, quimio
quinas y quimioatractantes especficos para eo
sinfilos, que prom ueven su adherencia y la
migracin trans-endotelial.
La IL-5, una citoquina derivada de las clu
las T, que activa eosinfilos especficamente e
induce eosinopoyesis, aumenta la adherencia
de los eosinfilos y poten cia su m igracin
trans-endotelial. GM -CSF, que es producido
por clulas T y tambin por clulas endoteliales
activadas, tambin estimula la migracin transendotelial de los eosinfilos, sin afectar la m i
gracin trans-endotelial de los neutrfilos aun
que induce la adherencia de arabas especies
sub-leucocitarias.
La quimioquina especfica para eosinfilos,
RANTES, induce selectivamente la migracin
trans-endotelial de los eosinfilos pero no de
los neutrfilos y lo hace sin afectar a la etapa
de adherencia. El PAF tambin induce selecti
vamente la migracin trans-endotelial de los
eosinfilos, aunque en la etapa de adherencia
no presenta selectividad entre los eosinfilos y
los neutrfilos.
En las'etapas de adhesin firme y migracin
trans-endotelial, la interaccin entre VLA-4 y
VCAM-1 media la migracin de los eosinfilos
selectivamente, ya que los eosinfilos, y no los
neutrfilos, expresan VLA-4 en la superficie
celular y pueden por lo tanto unir al ligando en
dotelial VCAM-1 el cual es especficam ente
regulado por las citoquinas. La IL-4 induce se
lectivamente VCAM-1 pero no ICAM-1 o se
lectina-E. Contrariamente, TNF e IL-1 inducen
la expresin de ICAM-1 y de VCAM-1 en c
lulas endoteliales, por lo que tam bin incre
mentan la adhesin de los eosinfilos por esti
mulacin de las clulas endoteliales.
Existen evidencias de que la infiltracin de
eosinfilos causa dao tisular en tejidos como
el de las vas respiratorias e hiperreactividad
del mismo debido a la liberacin de grnulos
citotxicos y de mediadores lipdicos.
Adems de la infiltracin de eosinfilos, se
ha demostrado un aumento de clulas T CD4+

Inflamacin
y de su citoquina IL-5 en los sitios de reaccin
alrgica tarda, lo que sugiere la intervencin
de ambos factores en el reclutamiento de eosi
nfilos inducido por la citoquina de las clulas
Th2, IL-5 y la IL-4; tambin las quimioquinas
RANTES y M T P -la inducen selectivamente la
acumulacin de eosinfilos. La IL-5 activa a
los eosinfilos para que aumenten su adhesivi
dad a integrinas. Tambin induce eosinopoyesis y la liberacin de eosinfilos de la mdula
sea. La IL-4, induce selectivamente la expre
sin de VCAM-1 en el endotelio, por lo tanto
la activacin de las clulas Th2 es un pre-requisito para la acumulacin selectiva de eosi
nfilos (vase fig. 23-16).
4. FUNCIN DEL ENDOTELIO
VASCULAR EN LA IN FLA M A C I N
Introduccin
Las clulas del endotelio vascular han sido,
por m ucho tiem po consideradas un re v e sti
miento pasivo de los vasos sanguneos dotado
de propiedades negativas, siendo la ms im por
tante la de representar un sustrato no trombognico para la sangre.
Sin embargo, las clulas del endotelio vas
cular se encuentran estratgicamente localiza
das en la interfase entre la sangre y el tejido.
Por lo tanto no es sorprendente que estas clu
las, las cuales disparan el trfico de las m ol
culas y de las clulas a travs de los vasos san
guneos, juegan un papel activo en la hom eos
tasis, las reacciones inflamatorias y ia inm uni
dad. Adems de responder rpidamente, en tr
minos de segundos, a agonistas tales como his
tamina y trombina, las clulas vasculares, lue
go de ser expuestas a las citoquinas, sufren
profundas alteraciones de la funcin que inclu
ye expresin gentica y sntesis de protenas,
lo que requiere horas para desarrollarse y son
relativamente duraderas. Esta reprogramacin
funcional de las clulas endoteliales se ha de
nominado activacin, en analoga con el tr
mino ampliamente usado para la lnea monoeitos/macrfagos.
Las clulas vasculares son tanto blanco,
como fuente de citoquinas, y estos mediadores
polipeptdicos operan como seales de comuni
cacin con leucocitos (productores principales
de citoquinas), as como con diversos tejidos y
rganos. En este captulo analizaremos slo las
respuestas llevadas a cabo por las citoquinas en
las clulas vasculares y analizaremos la forma
en que los elementos de los vasos sanguneos
participan en la cascada de citoquinas, produ
ciendo grandes cantidades de estos mediadores
polipeptdicos.

469

Respuesta de las clulas endoteliales

a las citoquinas
Respuesta a la IL-1 y al TN F
Estas citoquinas pro-inflam atorias y pleiotrpicas as como el lipopolisacrido (LPS) de
las bacterias, orientan la funcin de la clulas
endoteliales en un sentido trombognico e in
flamatorio.
A m bas citoquinas inducen la sntesis del
PAF por las clulas endoteliales. Este fosfolpi
do es un potente activador de las plaquetas y de
los leucocitos y es vaso constrictor. Se ha suge
rido que el PAF liberado es el responsable de la
capacidad inmunosupresora de las clulas del
endotelio vascular activadas. Adems, las clu
las asociadas al PAF activan a los polimorfonu
cleares, los cuales se adhieren a las clulas en
doteliales y las condicionan para la posterior
respuesta estimulatoria.
Luego de la activacin, las plaquetas expre
san IL-1, la cual, asociada a las plaquetas acta
sobre el endotelio vascular induciendo la p ro
duccin de molculas de adhesin y la produc
cin de citoquinas. As, en los sitios de infla
m acin ocurre un interjuego entre las clulas
endoteliales y las plaquetas am plificando la
reaccin inflamatoria.
La induccin de NO por la IL-1 puede ser
vista en la misma perspectiva de repuesta vaso
dilatadora local o sistmica a esta citoquina in
flamatoria. La exposicin del tejido vascular al
LPS, lo vuelve refractario a la accin v a so
constrictora de las drogas adrenrgicas. Este
efecto se produce a travs de la induccin de
NO va la IL-1 y cL TNF. La resistencia adrenrgica es tambin un hecho que se presenta en
el sndrome del shock sptico. El significado
de la alteracin del flujo vascular en la infla
macin todava no ha sido establecido.
El TNF altera la permeabilidad vascular, pe
ro su accin depende de la presencia de neutr
filos. As, la alteracin vascular alterada p o r ci
toquinas inflamatorias probablemente depende
de la interaccin directa con el endotelio como
del reclutamiento y activacin de los leucocitos
circulantes.
R espuesta al interfern-y
El IF N - 7 es la prim era citoquina d efin id a
molecularmente que se demostr tiene accin
sobre el endotelio vascular.
El IFN-Y aumenta la produccin de IL-1 esti
mulada por el LPS. Tambin amplifica la ac
cin del TNF sobre las clulas endoteliales,
causa un aumento lento de la produccin de
IC A M -I, tornando al endotelio vascular ms
adhesivo para los linfocitos T.

470

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

Etapa

Eosinfilos

R odam iento

Lig. seiectina-P
Lig. selectina-E
Seleetina L

A dhesin

Activacin

M igracin transendotelial

Receptores de
quimioquinas y
quimioatractantes

LFA-1
Mac-I
VLA-4

Endotelio

Selectina-P
Selectina-E
Lig. selectina-L

Selectina-E

F ig. 23-16. M ecanism o selectivo de acum ulacin de eosinfilos.

La inform acin disponible sugiere para el

INF-y una accin nica, distinta del resto de las
eitoquinas, que es la de inducir a las clulas a
actuar como clulas accesorias sin presentar
por ellas mismas efecto pro-inflamatorio, trom
btico, proliferativo o migratorio.
Respuesta a la interleuquina-4
La IL-4 es un factor de crecimiento y dife
renciacin linfocitaria que ha emergido recien
temente como modulador de la funcin de las
clulas endoteliales. La exposicin de las clu
las endoteliales a la IL-4, sola o en combina
cin con IL-1 y TNF, produce aumento de la
unin de linfocitos pero no de neutrfilos, de
bido a que aumenta la expresin de VCAM-1,
pero inhibe la expresin de ICAM-1 y selectina-E. Adicionalmente, la IL-4 es un inductor
dbil de la IL - 6 en las elulas endoteliales, pero
amplifica su produccin en combinacin con
otros estmulos.
La IL-4 es un factor de crecimiento para la
mierovaseulatura, pero no de los grandes vasos.
Colectivamente, los efectos de la IL-4 pueden
ser interpretados como favoreciendo el recluta
miento de linfocitos y la activacin de elementos
linfoeticos y monocticos, cruciales para la in
flamacin sub-aguda y crnica y las reacciones
inmunes. Aunque este punto de vista es atracti
vo, resulta iiitrigante que esta misma citoquina
posea una accin inhibitoria sobre la adhesin
de los monocitos a las clulas endoteliales.
Respuesta al factor de permeabilidad
vascular
Clulas tumorales de diferente origen y clu
las del m sculo liso vascular, producen una

protena de 46 kD denominada factor de per

m eabilidad vascular (VPF) tam bin llainado
factor de crecimiento vascular (VEGF). El VPF
promueve prdida de lquido vascular por inte
raccin con receptores especficos a alta afini
dad, a travs de cambios en la homeostasis del
calcio. Posee accin sinrgica con el TNF en la
induccin de factores pro-coagulantes en el en
dotelio vascular y en promover la migracin de
monocitos a travs del endotelio vascular. As,
el VPF afecta la funcin del endotelio relacio
nada con la angiognesis y con la trombosis e
inflamacin.
Produccin de quimioquinas
Las clulas vasculares producen diversos
m iem bros de la fam ilia de las cito q u in a s,
muchas de las cuales son quimiotcticas para
la poblacin de leucocitos, son las quim ioqui
nas.
Por exposicin a seales inflamatorias como
IL-1, TNF y LPS, las clulas endoteliales pro
ducen una protena quimiotctica de inonocitos
(MCP), que pertenece a la familia de las C-C y
es importante para la regulacin de la infiltra
cin de monocitos en ciertos tumores.
La IL-1, el TNF y el LPS, tambin inducen
IL -8 y gro-alfa, dos quimioquinas de la familia
de las C-X-C. Ambas son activos quimioatrac
tantes para neutrfilos, pero adems afectan a
los basfilos (con IL-3), linfocitos y clulas de
melanoma.
A s, las clulas vasculares producen q u i
mioatractantes (IL -8 y MCP), que atraen y acti
van a diferentes sub-poblaciones de leucocitos.
Estos mediadores actan concertadamente con
el aumento de la expresin de las molculas de
adhesin, as como con las alteraciones reol-

Inflamacin
gicas determinadas por la induccin de la snte
sis de las prostaglandinas y del NO para provo
car extravasacin de leucocitos, as como clu
las tumorales metastsicas a los tejidos. La pro
duccin de los quim ioatractanes por los ele
mentos vasculares puede ser importante en la
patognesis de las enfermedades que afectan
directamente a los vasos sanguneos. La infil
tracin de monocitos es un hecho temprano en
la historia de la ateroesclerosis y es prominente
en la vaseulitis.
Tono y permeabilidad vascular
La lL-1 y el TNF aumenta la produccin de
PGI2 a travs de la induccin de la COX-2.
La induccin del xido ntrico (NO) por la
IL-1 puede ser vista en la misma perspectiva
de repuesta vasodilatadora local o sistmica a
esta citoquina inflamatoria. La exposicin del
tejido vascular al LPS, vuelve refractario al
mismo a la accin vasoconstrictora de las dro
gas adrenrgicas. Este efecto se produce a tra
vs de la induccin de NO va IL-1 y TNF. La
resistencia adrenrgica es tambin un hecho
que se presenta en el sndrom e del sh o ck
sptico.
El TNF altera la permeabilidad vascular, pe
ro su accin depende de la presencia de neutrfos. As, la alteracin vascular alterada por ci
toquinas inflamatorias probablemente depende
de la interaccin directa con el endotelio como
del reclutamiento y activacin de los leucocitos
circulantes.
5. R ESPU ESTA IN FLA M A TO R IA .
R ESU M EN Y CON CLU SIO NES
5.1. Inflamacin aguda
La etapa inicial de la respuesta inflamatoria
clsica a la injuria tisular, est caracterizada
por la liberacin de m ediadores vasoactivos
desde las clulas mastoideas de los tejidos (por
ejemplo, histamina y leueotrienos), plaquetas y
componentes plasm ticos (bradiquinina), que
producen vasodilatacin y formacin de ede
ma. Esta etapa es seguida por la activacin de
los componentes de la coagulacin y del siste
ma de complemento y la generacin de factores
quimiotcticos para neutrfilos y para otras c
lulas inflamatorias derivados del plasma (C5a)
y de elulas (IL-8). Los factores quimiotcticos
funcionan reclutando clulas inam atorias en
el sitio de inflamacin y promueven su migra
cin a los tejidos. Una vez presentes en el teji
do, las clulas inflamatorias (neutrfilos) pue
den ser estimuladas para liberar productos bac
tericidas, inclusive m etabolitos reactivos del

471

oxgeno y proteasas, como as tambin m edia

dores lipdicos como leucotrieno
y factor ac
tivador de plaquetas (PAF).
Adicionalm ente, y segn la naturaleza del
dao patognico, las clulas fagocticas mononucleares pueden ser estimuladas por vas in
m unes o no inm unes para generar productos
del cido araquidnico y potentes citoquinas,
que luego modulan la evolucin de la respuesta
inflamatoria.
R ecientem ente, se ha puesto en evidencia
que las clulas del endotelio vascular son parti
cipantes activos de la modulacin de la repues
ta inflamatoria, secundaria a la habilidad que
poseen de expresar en su superficie y secretar
potentes mediadores que regulan no slo el to
no vascular y su permeabilidad, sino tam bin la
coagulacin, la va fibrinoltica y la funcin de
clulas inflamatorias.
El sello morfolgico de la inflamacin agu
da es la formacin de edema, deposicin de
fibrina y presencia de neutrfilos en el sitio de
injuria. Dependiendo del tipo de injuria, el n
mero de neutrfilos en el sitio de injuria puede
disminuir en la respuesta inflamatoria crnica.
La inflamacin crnica se caracteriza por el
aumento del nmero de macrfagos, linfocitos,
clulas plasmticas y eosinfilos. En este punto
puede haber distintas posibilidades. Primero,
puede haber eliminacin del elemento patog
nico y el tejido injuriado comienza a repararse
y a retornar a su estructura y funcin normal.
Segundo, puede haber persistencia del agente
patognico, con o sin activacin del m ecanis
mo inmunolgico, llevando al desarrollo de la
inflamacin granulomatosa. Tercero, puede ha
ber injuria irreversible del tejido, seguido de
una activa proliferacin de capilares, fibroblas
tos y de elementos mesenquimatosos que lleva
ra a la prdida de la funcin del tejido. L a evo
lucin de la repuesta inflamatoria depende de
la naturaleza de la agresin, de la extensin de
la injuria y del grado de activacin inm unolgi
ca que se presenta.
La fase inflamatoria aguda tiene una exten
sin limitada de 5-12 horas, la que luego puede
ser seguida por la fase crnica.
5.2. Inflamacin crnica
Siguiendo a la repuesta inm ediata aguda,
existe un influjo subsecuente de monocitos, eo
sinfilos y linfocitos. En la medida de que la
agresin inicial es controlada o contenida no se
produce ms reclutamiento de neutrfilos, los
neutrfilos presentes degeneran y se acumulan
las clulas mononucleares. En el m om ento en
que en el sitio de inflamacin predominan los
m onocitos, linfocitos, m acrfagos y clulas
plasmticas comienza la inflamacin crnica,

472

Mecanismos efectores de la respuesta inmune

La funcin que cumplen ios monocitos y ma

crfagos es doble: por un lado, la de fagocitar,
ingerir o degradar microbios, desechos celula
res y neutrfilos degenerados y, por el otro la
do, la de modular la respuesta inmune y la fun
cin de las clulas T a travs de la presenta
cin del antgeno y la secrecin de citoquinas
especficas. Posteriorm ente, los m onocitos y
los macrfagos tienen la funcin de modular la
etapa de cicatrizacin y reparacin secundaria
a la secrecin de citoquinas que afectan a las
clulas parenquimales y a la funcin de las c
lulas inflamatorias. Mientras el proceso infla
matorio transita la fase crnica, los monocitos
y los macrfagos contintan fagocitando dese
chos celulares y material que no ha sido ade
cuadamente removido por los neutrfilos. De
pendiendo de la extensin de la injuria, el teji
do daado puede retornar a la estructura y fun
cin normal o transitar hacia la reparacin ac
tiva con fibrosis llegando a una estructura y
funcin alterada.
Alternativamente, si existe persistencia de la
injuria, los macrfagos pueden cambiar la res
puesta hacia un tipo de reaccin de hipersensi
bilidad demorada que incluye al perfil comple
to de respuesta linfocitaria. As, la inflamacin
crnica puede ser vista como un punto de infle
xin en la respuesta inflamatoria y a los mono
citos y macrfagos como pivotes que dirigen el
curso de la respuesta.

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INMUNOPATOLOGA

III

inmunologa de las infecciones

bacterianas

MIRTA A. FRANCO

IN FE C C I N Y EN FER M ED A D
Cuando un microorganismo es capaz de es
tablecerse en un husped, se habla de in fec
cin. Si, adems, le produce dao a ese hus
ped el proceso se denomina enfermedad infec
ciosa. La capacidad potencial de un microorga
nismo de causar enfermedad se denomina pa
togenicidad y es un atributo de especie. De es
ta m anera, puede decirse de ciertas especies
bacterianas que son patgenas para un husped
determinado. Sin embargo, cepas individuales
pertenecientes a una especie considerada pat
gena pueden variar ampliamente en su capaci
dad para daar al husped, y esta patogenicidad
relativa se conoce como virulencia. La viralencia es as un atributo de cepa, no de especie,
por lo que pueden encontrarse cepas altamente
virulentas, poco virulentas y aun avirulentas
dentro de una misma especie patgena. G ene
ralmente, la virulencia se relaciona con el n
mero de bacterias necesarias para producir en
fermedad.
Es obvio que una infeccin per se no condu
ce invariablemente a una enfermedad infeccio
sa, sino que esta ltima es la resultante de una
serie de interacciones complejas entre el hus
ped susceptible y el agente infeccioso (rela
cin husped-parsito).
El husped constituye un sistema cerrado,
separado del ambiente externo por la piel y las
membranas mucosas. Por ello, todas las infec
ciones bacterianas comienzan en la superficie
corporal, con excepcin de aquellas transm iti
das intrauterinamente.
La piel intacta raram ente es penetrada por
las bacterias, por lo que regiones ubicadas po
cos micrones por debajo de ella son norm al
mente aspticas. Cuando se rompe la integridad

24
de la superficie epitelial, a menudo se desarro
llan infecciones subcutneas provocadas por
bacterias del gnero Staphyloccoccus, que ha
bitan en folculos pilosos y glndulas sudorpa
ras. Tambin se ha sealado que discontinuida
des de la piel constituyen la ruta inicial de in
feccin en algunas enfermedades infecciosas.
Otras vas de entrada para bacterias patge
nas son; a travs de mordeduras de animales o
por introduccin de materiales contam inados
en heridas. Con algunas excepciones, la inocu
lacin intradrmica directa con bacterias viru
lentas requiere un elevado nmero de organis
mos viables para producir enfermedad.
A diferencia de la piel, las membranas mu
cosas del ojo y de los tractos respiratorio, gas
trointestinal y genitourinario pueden ser atrave
sadas por la m ayora de las bacterias patge
nas. Esto es particularmente cierto cuando es
tn expuestas a un elevado nmero de bacte
rias, como ocurre en la penetracin de salmonelas a travs de la mucosa gastrointestinal, en
tre muchos otros ejemplos. La superficie espe
cficam ente involucrada depende de la forma
en que las b acte rias p at g en as a lca n z an al
husped (inhalacin de aerosoles, ingestin de
sustancias contam inadas o transm isin ven
rea).
Las infecciones se inician con la coloniza
cin de las membranas mucosas, y pueden per
manecer localizadas en la superficie de las mu
cosas o pueden avanzar a los tejidos subepiteliales. En las primeras, las toxinas producidas
por las bacterias pueden actuar localm ente o
bien difundir a travs del husped para ejercer
su accin sobre las clulas especficam ente
susceptibles. Especies patgenas tales como
Bordetella pertussis y Vibrio cholerae, produ
cen toxinas de accin localizada, mientras que

476

Inmunopatologa

la exotoxina de Corynehacterium diphtheriae

es diseminada por la circulacin sangunea y
produce daos a varios tejidos. En las infeccio
nes de los tejidos subepiteliales, las bacterias
invasoras que han atravesado las mem branas
mucosas deben ser capaces de multiplicarse en
el medio ambiente que le proveen los fluidos y
tejidos del husped. Es decir, que su sobrevi
vencia depende del balance entre los factores
que promueven su desarrollo y los que lo inhi
ben, que incluyen los mecanismos de defensa
del husped. Las variaciones de estos factores
entre diferentes especies animales y entre di
versos tejidos de una misma especie, determi
nan las especificidades del husped y tejido de
cada bacteria patgena.
Una infeccin bacteriana produce alguno de
los siguientes efectos: 1) dao debido al m i
croorganism o, 2) dao debido a la respuesta
del husped frente al microorganismo (reaccio
nes inmunopatolgicas), o 3) ningn dao apa
rente.
Los determinantes de virulencia de las bacte
rias y los mecanismos con que el husped res
ponde a una infeccin bacteriana, incluidas las
reacciones inm unopatolgicas, se describen
ms adelante.
Entre las infecciones que no producen enfer
medad se incluyen las infecciones subclnicas.

Tambin, de algn modo, la colonizacin de u n .

husped por la flora microbiana residente cons
tituye una infeccin. Estas bacterias se estable
cen sobre la piel y las membranas mucosas po
co despus del nacimiento y se mantienen, con
algunas variaciones, durante toda la vida del
husped (fig. 24-1). Constituyen una barrera
que se opone a la colonizacin por bacterias
patgenas, ya sea compitiendo por nutrientes o
por sitios receptores en las clulas epiteliales, o
produciendo sustancias inhibitorias. Por ello, la
eliminacin de la flora habitual especfica fa
vorece la infeccin por bacterias patgenas. Es
conocido que la terapia antibacteriana produce
una alteracin de la flora habitual especfica,
que lleva a una seleccin de cepas resistentes
de la misma especie o a su reemplazo por espe
cies patgenas. Excepcionalmente, cuando las
defensas del husped estn dism inuidas, las
bacterias de la flora habitual pueden invadir al
husped y causar enfermedad.
EL AGENTE INFECCIOSO
En general, la virulencia de una cepa bacte
riana de una especie patgena est determinada
por; 1) su capacidad para proliferar en los teji
dos del hu.sped, o invasividad, y 2) su capaci-

Ojos (conjuntivas)
Staphyococcus epdermds

Ncr iz y nasofaringe
Staphyococcus epdermds
Staphyococcus aureus
Streptococcus spp.

Piel

Staphylococus epidermidis,
Corynebacterum,
Proponbacterum, Mcrococcus

Boca y orofaringe
S. epdermds,
Streptococcus pneumonae,
Strepcoccus mts,
Streptococcus savars,

Intestino delgado
Lactobacus, Streptococcus spp,
Enterococcus, Veonea

estreptococos no grupo A,
Neisseria, Haemophius,
Veionea, Bacterodes,
Fusobacenum, Treponema.
Lactobacus

Tracto genitourinario
Corynebacterum, S. epdermds,
Enterococcus, Lactobacus,
Mycobacterum smegmatc,
Bacterodes, Fusobacterum,

estreptococo alfa y no hemoltico,

Enterobacteriaceae

Intestino grueso
Bacterodes, Costrdum, Fusobacterum,
Eubacterium, Bifidobacterum,
Lactobacus, Peptostreptococcus,
Enterococcus, Enterobacteriaceae

F ig. 24-1. F lora bacteriana predom inante en distintas regiones del cuerpo hum ano norm al.

Inmunologa de las infecciones bacterianas

dad para producir sustancias qumicas txicas
para las clulas del husped, o toxigenicidad.
El papel de la invasividad en la produccin
de dao al husped es variable. Las bacterias
fuertemente toxignicas que causan infecciones
localizadas pueden producir dao a distancia, a
travs de la difusin de productos txicos (por
ejemplo, Corynebacterium diphtheriae). Otras,
en cambio, deben invadir al husped y m ulti
plicarse en l para que las toxinas producidas
puedan actuar sobre los tejidos susceptibles
(por ejemplo, Bacillus anthracis).
Determinantes de virulencia
Varias propiedades de las clulas bacterianas
les confieren la capacidad potencial de sobrevi
vir y multiplicarse en los tejidos del husped.
En general, se asocian con la posibilidad de in
terferir con los m ecanism os defensivos del
husped y de disponer de nutrientes para su de
sarrollo. Dichas propiedades constituyen facto
res o determinantes de virulencia y se relacio
nan, principalm ente, con componentes de las
envolturas bacterianas (fig. 24-2) y con la pro
duccin de m etabolitos txicos. A lgunas de
ellas se tratan a continuacin.
Adherencia
Como fuera sealado, la mayora de las in
fecciones bacterianas se inician con la coloni
zacin de las membranas mucosas. Las bacte
rias que son capaces de colonizar las m em bra
nas mucosas parecen tener la propiedad comn

477

de adherirse a los epitelios superficiales, sugi

riendo que esa adherencia constituye un deter
minante de virulencia.
Existen evidencias sobre la existencia de si
tios receptores, tanto en las clulas del husped
como en la superficie de las bacterias, com pro
metidos en la fijacin del microorganismo a las
clulas que subyacen en el sitio de contacto.
En este proceso de fijacin han sido im plica
das estructuras filam entosas (fimhriae o pli),
las cjue han sido demostradas en diferentes es
pecies bacterianas (enterobacterias, N eisseria
gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Bordetella pertussis y varias otras). En Escherchia co
li se han descrito varios p ili antignicam ente
diferentes. La capacidad de adherencia de estas
cepas es un importante factor de seleccin que
determ ina que estos componentes de la flora
intestinal sean capaces de colonizar el tracto
urinario. Neisseria gonorrhoeae se adhiere a la
superficie de la mucosa del tracto genitourina
rio a travs de sus pili, y posiblem ente de la
protena II de la membrana externa. Bordetella
p ertussis m uestra un marcado trofismo hacia
las clulas ciliadas del tracto respiratorio, y la
primera etapa de la infeccin es necesariamente
su unin a esas clulas. Se ha sugerido que las
fim brias serotipo 2 (aglutingeno 2) tendran
propiedades adhesivas.
Otros componentes de la superficie bacteria
na involucrados en la adherencia son: antge
nos de superficie, mucopolisacridos asociados
a la superficie y cidos lipoteicoicos. U na de
las pi'otenas superficiales asociadas a la adhe
rencia ms estudiadas es la hemaglutinina fila-

Polisacrido
especfico

Antgeno D

cido teicoico
Core

cido
lipoteicoico

LPS

KDO
Lpido A
Porina
Peptidoglicano

/
in

rmw
mu'

Peptidoglicano
Periplasma
Lipoprotena
Protena OMPA
l\/lembrana
citoplasmtica
Fosfolpidos
Protena

F ig. 24-2. E squem a de las estructuras principales de las envolturas de A: bacterias gram positivas. B: bacterias gram n eg a
tivas. (D e Zinsser, M icrobiology, m odificado.)

478

Inmunopatologa

mentosa (FHA) de Bordetella pertussis. Los re

sultados de estudios in vitro de adhesin a una
variedad de clulas eucariticas ciliadas y no
ciliadas, sugieren que la FHA es la adhesina
ms im portante que m edia la interaccin B.
pertussis-clula husped. Adems de su fun
cin como adhesina, la FFIA estimula una res
puesta inmune en humanos que sufrieron enfer
medad (tos convulsa) y acta como antgeno
inmunoprotector en ratones. Esas propiedades
han llevado a utilizarla como uno de los com
ponentes de vacunas acelulares para prevenir la
tos convulsa.
Resistencia a la fagocitosis
Adems de perm itir la unin a las clulas
del husped, la superficie bacteriana desem pe
a un papel importante en la resistencia a la fa
gocitosis.
La resistencia a la unin e ingestin por fa
gocitos est usualmente asociada a la presencia
de eapas mucosas o cpsulas de naturaleza polis a c a rd ic a { S tr e p to c o c c u s p n e u m o n ia e ,

N eisseria m eningitidis, etc.) o polipeptdiCa

{Bacillus anthracis). Experiencias realizadas en
ratn con Streptococcus pneumoniae demostra
ron que las cepas S (lisas, eneapsuladas) son
virulentas, mientras que las cepas R (rugosas,
no eneapsuladas) son rpidamente fagocitadas
y, por lo tanto, avirulentas. La remocin de la
cpsula transforma una cepa S en una cepa R.
Tambin el tratamiento de una cepa encapsula
da con anticuerpos especficos para esos ant
genos de superficie elimina la resistencia a ia
fagocitosis. Tales anticuerpos se denom inan
opsoninas y, en presencia de com plemento y
granulocitos, constituyen el mecanismo de de
fensa ms importante contra las bacterias que
se comportan como parsitos extracelulares. La
encapsulacin es un aspecto importante no slo
de la virulencia sino tambin de la inmunogenicidad. En efecto, se com ercializan vacunas
compuestas por polisacridos capsulares para
la prevencin de enfermedades producidas por
bacterias eneapsuladas, tales como meningococos y neumococos.
Tambin protenas de superficie actan co
mo molculas antifagocticas. El ejemplo me
jor estudiado es la protena M de Streptococcus
pyogenes grupo A, que es el principal factor de
virulencia de este grupo. Hay un gran nmero
de variantes serolgicas de esta protena, pero
el aspecto invariable es su organizacin global
que se muestra en la figura 24-3. Los estrepto
cocos que carecen de la protena M son fcil
mente fagocitados y muertos, mientras que los
que la producen no son ingeridos a menos que
estn presentes anticuerpos opsonizantes (con
tra la porcin N-terminal de la molcula). Aun
que los anticuerpos anti-protena M son capa
ces de neutralizar su capacidad antifagoctica,
esa actividad opsnica es especfica de tipo.
En bacilos gramnegativos, los antgenos so
mticos O, pueden inhibir la fagocitosis.
Tambin puede ser inhibida la destruccin
intracelular de bacterias fagocitadas. Adems,
muchas bacterias patgenas excretan sustancias
llamadas leucocidinas, que matan a los fagoci
tos.
Actividad IgA protesica

F ig . 24-3. R epresentacin esquem tica de la m olcula de

p ro te n a M de la p a re d c e lu la r de e s tre p to c o c o s . (D e
Z insser, M icrobiology, m odificado.)

Frente a muchas infecciones que se inician

sobre las superficies mucosas, el husped ofre
ce una respuesta inmune mucosal mediada por
IgA secretorias (IgA)2S. Luego, la hidrlisis de
la (JgA)2S por determinadas bacterias podra
contribuir a la virulencia potencial de las bacte
rias que la producen. En varias especies bacte
rianas ha sido detectada actividad IgA l prote
sica (que hidroliza las cadenas pesadas de las
IgA l humanas). Dichas especies no estn rela
cionadas entre s por criterios taxonmicos pe-

Inmunologa de las infecciones bacterianas

C u a d ro 24-1. Especies bacterianas que p o
seen actividad IgA^ proteasa y sus asociacio
nes principales con enfermedades infecciosas*
E nferm edad
M eningitis

G onorrea
Enferm edades periodontales destructivas

F orm acin de placas

dentales (?)

E specie bacteriana
Neisseria m eningitidis
H aem ophius influenzae
Streptococcus pneum onae
N eisseria gonorrhoeae
B acterodes assacharolytcus**
B . m elaninogenicus
Capnocytophaga ochracea
C. sputgena
C. gingivalis
Streptococcus mtior* *
lS", sanguis**

* D e K ilian , M ., en R o b b in s, J. B ., H ill, J, C. y SadolT, J. C. (eds.):

Seminar.^ in infection.^ disease.';. V ol. 4, Bacterial Vaccines. Thieme-Straton. Inc., Mew York, 1982.
Slo algunas cepas de la especie producen IgA proteasa.

479

Toxinas
La produccin de toxinas como determinan
tes de virulencia fue sugerida por prim era vez
por Loeffier, en 1884, al comprobar la capaci
dad txica de filtrados estriles de cultivos de
Corynehacterium diphtheriae. Aunque actual
mente se conocen muchas sustancias txicas de
origen bacteriano, el papel de varias de ellas en
la produccin de enfermedades permanece sin
aclarar. Las toxinas bacterianas son de dos ti
pos: 1) las que pueden separarse fcilmente de
las clulas productoras, de naturaleza proteica,
sensibles al calor o exotoxinas, y 2) las que for
man parte de la estructura celular, de naturaleza
qumica compleja, resistentes al calor, o endotoxinas.
EXOTOXINAS (toxinas extracelulares)

ro s por las enfermedades infecciosas en las

que estn implicadas. Como se muestra en el
cuadro 24-1, los tres principales agentes de las
m eningitis bacterianas, los gonococos y los
agentes que se supone causan enferm edades
periodontales destructivas, elaboran IgA pro
teasa. Tambin la producen algunas cepas de
Streptococcus sanguis y Streptococcus mitior.
Ninguna otra bacteria, incluidas las especies no
patgenas de Haemophyius y Neisseria, parece
poseer esta actividad.
Competencia por nutrientes
M uchas bacterias patgenas deben penetrar
los tejidos del husped y multiplicarse en ellos
para expresar su patogenicidad. Se trata de ce
pas invasoras y la capacidad de proliferar m vi
vo constituye, por lo tanto, un determinante de
virulencia. Es probable que el desarrollo de las
bacterias dependa de sus requerimientos nutri
cionales y de la posibilidad de que sean aporta
dos por el husped. Por ejemplo, entre los re
querimientos de iones metlicos, el de hierro es
de particular importancia en la relacin hus
ped-parsito. En el husped animal, el hierro
forma complejos con protenas, como la trans
ferrina, y no est disponible para las bacterias
invasoras. Por esto, para satisfacer sus requeri
mientos de hierro, las bacterias deben competir
con el husped. Las micobacterias producen
una sustancia llamada micobactina que libera
el hierro de la transferrina, hacindolo disponi
ble para las bacterias. Las micobactinas consti
tuyen as uno de los determinantes de la viru
lencia del bacilo de la tuberculosis. De manera
semejante, clulas de Escherichia coli secretan
caecoles que compiten con la transferrina por
el hierro.

Las exotoxinas bacterianas son protenas que

tienen la propiedad de transloearse en clulas
de mamferos. Muchas de ellas, que responden
al modelo de dos componentes A-B, tienen ac
cin directa sobre las clulas susceptibles. En
ellas, el com ponente B es responsable de la
unin especfica a la superficie de la clula re
ceptora y el componente A posee la actividad
enzimtica que actiia sobre los componentes o
funciones celulares especficos. Algunas de es
tas toxinas y sus sitios de accin se describen
en el cuadro 24-2.
O tras exotoxinas bacterianas, denominadas
su p e ra n tg e n o s, actian induciendo u n a res
puesta exagerada en el husped, ya que tienen
la propiedad de activar un alto porcentaje de

C u a d ro 24-2. Principales exotoxinas bacte

rianas de dos componentes (A-B) y sus meca
nismos de accin
Toxina
B ordetella pertussis
T o x in a pertussis
C lostridium botulinum
T o x in a botulnica
C lostridium tetcmi
T oxina tetnica

C orynebacterum diphtheriae
T o x in a diftrica
P seudom onas aeruginosa
E xotoxina A
Vibrio cholerae
T o x in a colrica

M ecanism o d e accin

A D P ribosilacin d e prote
n a fijadora G
B loquea uniones n eu ro musculares
Inhibe la liberacin de GA~
B A y glicina en la s sinapsis inhibidoras
A D P ribosilacin del factor
de elongacin 2
A D P ribosilacin d el factor
de elongacin 2
A ctivacin de h orm onas

480

Inmunopatologa

clulas T. Estas toxinas se unen sim ultnea

mente a molculas clase II del complejo mayor
de histocom patibilidad (MHC) de las clulas
antignicas y a la regin VP del receptor en las
clulas T, produciendo la activacin de las m is
mas. La alta proporcin de clulas T activadas
se explica porque diferentes toxinas reconocen
diferentes regiones Vp. Existen evidencias de
que al menos parte de la respuesta a estas toxi
nas, si no toda, se debe a la hiperproduccin de
citoquinas que resultan de la activacin de c
lulas T.
Estreptococos grupo A y estafilococos ex
cretan varias toxinas superantgenos. E ntre
ellas se encuentran las entertexinas A, B, C L
C2, D y E producidas por Staphylococcus au
reus, responsables de intoxicaciones alimenta
rias y shock sistm ico. Los estafilococos
tambin excretan las toxinas exfoliativas A y
B que originan el sndrome de la piel escalda
da y la toxina 1 del sndrome del shock txi
co (TSST-1), asociado a tam pones. Ms del
90% de la cepas aisladas de estreptococos gru
po A producen exotoxinas pirognicas (eritrognicas). Se conocen al m enos tres serotipos
diferentes. A, B y C, que causan la fiebre es
carlatina.
Como factor de virulencia, una toxina debe
cum plir ciertos requisitos; 1) producir uno o
ms sntomas de la enfermedad, 2) debe existir
correlacin entre la virulencia de diferentes ce
pas de una especie bacteriana y la produccin
de toxinas, 3) el sitio de accin y la concentra
cin efectiva deben ser alcanzables durante una
infeccin natural, y 4) el suero antitxico debe
proteger al husped de la infeccin.
Algunas toxinas como las exotoxinas clsi
cas (botulnica, tetnica, diftrica), cum plen
con todos los requisitos de un factor de virulen
cia. Tambin han sido establecidas las propie
dades patognicas de la enterotoxina estafiloccica, la toxina eritrognica de Streptococcus
pyogenes, la toxina pertussis, la toxina letal de
Bacillus anthracis, la toxina alfa de Staphylo
coccus aureus, la neurotoxina de Shigella dysenteriae, las exotoxinas de Vibrio cholerae y
Yersinia pests, la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, etc.
Otras toxinas extracelulares no han sido cla
ramente relacionadas con la produccin de en
fermedades. Forman parte de este grupo num e
rosas toxinas eitolticas producidas por bacte
rias grampositivas pertenecientes a los gneros
Streptococcus, Staphylococcus y Clostridium.
Estas toxinas incluyen hem olisinas, enzim as
hidrolticas, etc.
La produccin de algunas exotoxinas est
codificada en genes localizados en plsmidos
(toxinas de Escherchia coli) o en profagos (to
xina diftrica, enterotoxina y toxina alfa de

Staphylococcus aureus, etc.). En estos casos, la

prdida del plsmido o del profago transforma
a las bacterias en no toxignicas. Adems, la
sntesis de algunas exotoxinas bacterianas est
fuertem ente influida por la concentracin de
ciertos iones metlicos.
Entre las exotoxinas se encuentran los vene
nos ms potentes que se conocen. Su potencia
es anloga, en general, a su eficiencia como an
tgeno. El tratam iento de algunas exotoxinas
con formaldehdo ha permitido eliminar su to
xicidad fisiolgica, dejando mucha de la anti
genicidad original. Estas toxinas alteradas se
denominan toxoides, y en algunos casos, como
el tetnico y el diftrico, se utilizan para indu
cir inmunizaciones activas.
ENDOTOXINAS
Son com plejos lipopolisacridos-protenas
extrables de las membranas externas de las en
volturas de bacterias gramnegativas. Han sido
aisladas de todas las bacterias gramnegativas
patgenas y de muchas no patgenas. Las en
dotoxinas mejor estudiadas son las de las ente
robacterias pertenecientes a los gneros Salmonella, Shigella y Escherchia. Se identifican
con el antgeno somtico (O) de las clulas en
teras.
Las endotoxinas son poco especficas, ya
que aquellas de distinto origen tienen activida
des semejantes. Las endotoxinas purificadas de
enterobacterias virulentas y no virulentas cau
san muchos de los sntomas de la enfermedad
cuando se inyectan en animales. Poseen propie
dades pirognicas (producen fiebre), adems de
ser txicas. Su toxicidad es relativamente baja
y se neutraliza parcialmente por accin de anti
cuerpos especficos.
Las molculas de lipopohsacridos (LPS) de
las bacterias gram negativas actan indirecta
mente, promoviendo una autointoxicacin del
husped. En el suero, los LPS liberados por las
bacterias se unen, a travs del lpido A (estruc
turalm ente conservado en todas las bacterias
gramnegativas), a una protena reactiva de fase
aguda. Este complejo se une a las molculas
CD14 de m acrfagos, activndolos y pro d u
ciendo factor de necrosis tumoral alfa (T N Fa e
interleuquina 1 (IL-1). La excrecin de estas
citoquinas desencadena la produccin de citoquinas por otras clulas del sistema inmune y
causa la sintomatologa de la intoxicacin por
LPS (leucocitosis, shock, coagulacin intravascular disem inada y m uerte). T am bin es
posible que los LPS puedan activar caminos
independientes del CD14 induciendo la p ro
duccin de TNF por clulas no macrofgicas.
La importancia del TNF en la toxicidad indu

Inmunologa de las infecciones bacterianas

481

cida por LPS ha sido probada, ya que anticuer

pos anti-TNF revierten el sndrome. Adems,
tanto TNF como IL-1 actan sobre el endotelio
vascular promoviendo la actividad anticoagu
lante y disminuyendo la presencia de trombomodulina. Estos efectos contribuyen a los dis
turbios en la coagulacin sangunea que ocu
rren en respuesta a LPS o a sepsis por bacte
rias gramnegativas.
Otro constituyente de las envolturas bacte
rianas, como el peptidoglicano de la pared ce
lular, tambin produce induccin de citoquinas.
El conocimiento de que una respuesta exage
rada del husped puede tener efectos nocivos
en las enfermedades bacterianas, ha producido
avances importantes en el tratamiento de algu
nas enfermedades infecciosas, como ocurre en
las meningitis bacterianas.

cia que interfieren en la respuesta inmune o le

confieren resistencia a ella. Por otra parte, en
algunas enfermedades infecciosas la respuesta
inm une produce daos severos en los tejidos
del husped por reacciones de hipersensibili
dad.

DEFENSAS DEL HUESPED FRENTE

A LAS INFECCIONES BACTERIANAS

Factores fsicos

Durante su evolucin, los organismos verte

brados han desarrollado numerosos m ecanis
mos para mantener bajo control a las bacterias
patgenas. Algunos de estos mecanismos son
constitutivos, es decir, propiedades del hus
ped normal; otros aparecen slo luego de la ex
posicin a un agente infeccioso, por lo que se
denominan inducibles o adaptativos. Entre los
ltimos se incluyen aquellos que derivan de la
exposicin previa a bacterias com ensales y
otros patgenos o sustancias que presentan an
tgenos comunes con el agente en cuestin.
Las reacciones especficas inducidas se co
nocen genricamente como respuesta inmune.
Como ha sido dicho, hay dos clases de r e s
puesta inmune: 1) la produccin de anticuer
pos circulantes y secretados, y 2) la produccin
de clu las e sp e c ficam e n te sen sib iliza d as.
Usualmente, la respuesta inmune reduce la invasividad y toxigenicidad bacterianas al punto
de poder ser controladas por las defensas cons
titutivas del husped. Sin embargo, como se se
alara oportunam ente, en algunos casos las
bacterias patgenas poseen factores de virulen

M ecanismos de defensa en la superficie

del husped
Entre los mecanismos constitutivos, aquellos
que posibilitan la eliminacin de las bacterias
en el sitio de contacto inicial con el husped
desem pean un papel muy im portante en la
prevencin de infecciones. Factores fsico s,
qumicos y biolgicos contribuyen a esta fun
cin, y limitan la colonizacin de las superfi
cies del cuerpo por las bacterias patgenas.

L a p iel y las m em branas m ucosas d e los

tractos respiratorio, gastrointestinal y genitouri
nario estn ampliam ente expuestas a m uchas
bacterias patgenas y constituyen la prim era l
nea de defensa contra la invasin bacteriana
(cuadro 24-3). La piel ofrece una barrera fsica
eficaz contra la penetracin de bacterias, capaz
de eliminar patgenos a travs de la descam a
cin del epitelio estratificado.
Otros factores fsicos que ayudan a proteger
las superficies epiteliales de las mucosas son:
1) la accin de lavado que ejercen lgrim as y
saliva, 2) la capacidad adhesiva del m oco que
recubre las vas areas superiores y el intestino,
3) el movimiento ciliar de las clulas del tracto
respiratorio y la expulsin de bacterias p o r me
dio de la tos y el estornudo, y 4) el flujo de ori
na por la uretra.
Alteraciones de estos factores aum entan la
susceptibilidad a las enfermedades infecciosas.
Es conocido el alto riesgo de sobreinfecciones
en quemados, la alta incidencia de infecciones
urinarias debidas a obstrucciones que provocan
retencin urinaria o de neumonas por daos en
las clulas del epitelio respiratorio.

Cuadro 24-3. Barreras fsicas contra la infeccin bacteriana

Sistem a u rgano
Piel
M ucosas

(D e J.K . S pitm agel.)

Tipo de clulas

M ecanism o de depuracin

Escam osas

D escam acin

Colum nares no ciliadas (tracto gastrointestinal)

F eristaltism o

C olum nares ciliadas (trquea)

M ovim iento m ucociliar

C uboideas ciliadas (nasofaringe)

Lgrim as, saliva, m oco, su doracin

Secretoras

F lujo de lquidos

482

Inmunopatologa

Factores qumicos
La piel y las m em branas m ucosas no se
comportan como superficies inertes que actan
simplemente como barreras fsicas. Las secre
ciones y excreciones son de gran importancia
en cuanto proveen factores qumicos que con
tribuyen a la resistencia del husped.
Los factores qum icos incluyen la produc
cin de sustancias antibacterianas y de otras
que inhiben la adherencia bacteriana.
En la piel se comprueba actividad bacterici
da sobre microorganismos que no se encuen
tran habitualmente sobre ella. Ha sido atribui
da a los cidos grasos no saturados, principal
mente cido oleico, presentes en las secrecio
nes sebceas, Esta actividad es inhibida por la
albmina del suero, lo que puede tener im por
tancia en el caso de la piel que rodea una que
madura.
T am bin ejercen accin antibacteriana la
acidez gstrica, como se demuestra por las fre
cuentes colonizaciones de mucosa gstrica que
acompaan casos de hipocloridia; la lisozima
presente en la saliva, lgrim as y secreciones
nasales; la lactoperoxidasa de la saliva, etc.
Por otra parte, la adherencia bacteriana a
ciertos epitelios puede ser inhibida por glucopptidos.
En el cuadro 24-4 se resumen las sustancias
que actan como barreras qumicas frente a la
infeccin bacteriana.
Factores biolgicos
Los factores biolgicos estn dados funda
mentalm ente por el antagonism o que ejercen
las bacterias componentes de la flora residente
(fig. 24-1). Las acciones antagnicas de la flora
normal fueron mencionadas al hablar de infec
cin y enfermedad.

Algunos ejemplos ayudarn a comprender kv

importancia de estos factores. Si la flora bacte
riana normal de las vas respiratorias superiores
es muy reducida como consecuencia de un tra
tamiento a base de penicilinas, los hongos co
mo Candida albicans, pueden fijarse y coloni
zar las mucosas de la boca y la faringe, produ
ciendo infecciones severas. De igual forma, la
reduccin de la flora intestinal producida por
las tetraciclinas puede llevar a una invasin estafiloccica, acompaada de una afeccin exu
dativa grave, que puede ser mortal.
Mecanismos inmunolgicos
A los efectos fsicos, qumicos y biolgicos,
no inmunolgicos, que protegen al husped en
el sitio de contacto inicial con una bacteria pa
tgena, se suma la inhibicin inmunolgica de
la fijacin de la bacteria a la superficie epite
lial. Las secreciones mucosas contienen niveles
significativos de inmunoglobulinas de diferen
tes clases. En la orofaringe, el tracto respirato
rio superior y el intestino, p redom ina IgA ,
mientras que en el tracto respiratorio inferior y
en el tracto genital femenino predomina IgG.
Las secreciones mucosas tam bin contienen
pequeas cantidades de IgM, que puede alcan
zar altos niveles en pacientes con deficiencias
selectivas de IgA. La produccin local y la se
crecin de anticuerpos IgA constituyen tal vez
el medio ms importante de defensa inmunol
gica a nivel de las superficies m ucosas. Se
acepta que los anticuerpos (IgA)2S mantienen
la integridad de las membranas mucosas inhi
biendo su colonizacin por los m icroorganis
mos, neutralizando toxinas y previniendo la pe
netracin de bacterias a travs de sus superfi
cies. La unin de (IgAj^S a una bacteria puede
activar el complemento por la va alternativa,
producir opsonizacin y, en algunos casos, in

C uadro 24-4. Barreras qumicas contra la infeccin bacteriana

Sistem a u rgano

O rigen

Sustancias

Piel

G lndulas sudorparas y sebceas

A cidos orgnicos

M ucosas

C lulas parietales del estm ago

cido clorhdrico, pH bajo

S ecreciones

C om puestos antim icrobianos

N eutrfilos

Lisozim a, lactoferrina, peroxidasa

A parato digestivo alto

G lndulas salivales
N eutrfilos

T iocianato
M ieloperoxldasa
P rotenas catinicas
Lactoferrina
Lisozim a

Intestino delgado y ms adelante

A rbol biliar
B iota intestinal

cidos biliares
cidos grasos de bajo peso m olecular

Inmunologa de las infecciones bacterianas

ducir lisis. Sin embargo, este mecanismo sera
poco relevante por la baja concentracin de
componentes del complemento en las secrecio
nes. Adems, se ha sugerido que la (IgA)2S
puede inducir una actividad antibacteriana m e
diada por clulas.
Existen numerosas evidencias de los efectos
antibacterianos de la (IgA)jS presente en secre
ciones. Ha sido demostrado que la inyeccin
subcutnea de un hibridoma productor de IgA
contra el LPS de Vibrio cholerae en ratones re
cin nacidos, produce la excrecin de anticuer
pos en el intestino y protege al ratn contra un
desafo letal con bacilo colrico.
Es conocido que en las secreciones que ba
an las mem branas mucosas, la (IgA) 2S est
expuesta a una serie de enzimas proteolticas
del husped y de origen microbiano. Sin em
bargo, la molcula de IgA est protegida contra
algunas enzimas proteoJticas por la pieza se
cretoria (S) que se sintetiza en clulas epitelia
les. A dem s las subclases de IgA secretoria
((IgA,)2S e (IgA 2)2S) poseen diferentes suscep
tibilidades a productos proteolticos de varias
bacterias, aumentando as su poder protector,
ya que todas las IgA proteasas bacterianas de
tectadas hasta ahora son especficas para la
subclase IgA de la (IgA)2S humana. La activi
dad IgA protesica es considerada por algunos
autores un factor de virulencia y, como tal, ha
sido tratada en prrafos anteriores.
Todos estos mecanismos de defensa deben
ser superados por una bacteria patgena para
establecerse sobre el epitelio mucoso. Como
hemos dicho, la alteracin de cualquiera de
ellos resulta en un aumento de la susceptibili
dad a las infecciones bacterianas.
Mecanismos

de

defensa a nivel tisular

Las defensas constitutivas principales que

encuentran las bacterias invasoras que penetran
ms all de las capas epiteliales son las clulas
fagocticas (que engloban y digieren a las clu
las bacterianas); ciertas sustancias an tib a cte
rianas presentes en los tejidos y fluidos circu
lantes, y una serie de reacciones que dan lugar
a la inflamacin.
Fagocitosis
La fagocitosis es el principal mecanismo por
el que se destruyen las bacterias patgenas ex
tracelulares. Como ha sido descrito en el cap
tulo 3, las clulas fagocticas se encuentran tan
to en el sistema circulatorio como en los teji
dos. Entre las clulas blancas sanguneas, son
activam ente fagocticos los m onocitos y los
leucocitos polimorfonucleares. Si bien estos l
timos son todos capaces de llevar a cabo la fa

483

gocitosis, solamente los neutrfilos tienen un

papel significativo en las defensas del husped.
Los macrfagos tambin existen como clulas
fijas en ciertos rganos (hgado, bazo, mdula
sea y ndulos linfticos), y forman el sistema
reteuloendotehal.
La fagocitosis comprende varias etapas, que
van desde la atraccin de fagocitos h asta la
muerte y digestin del organismo fagocitado,
las que han sido explicadas detalladamente en
el captulo 21.
D ado que m uchas bacterias patgenas po
seen estructuras de superficie que impiden su
unin al fagocito, existen varias opsoninas que
al unirse a la bacteria aumentan su susceptibili
dad fagoctica. Normalmente, diversas sustan
cias sirven como opsoninas. Entre ellas, los an
ticuerpos y el com ponente C3b del co m p le
mento. El C3b se une covalentemente a la su
perficie de las bacterias proporcionando un li
gando que es reconocido por los receptores de
los neutrfilos, los monocitos y los m acrfa
gos. Los microorganismos recubiertos con C3b
quedan anclados en la superficie de los fagoci
tos, lo que facilita su captacin (fig. 24-4). Los
nios con deficiencia de receptor leucocitario
CR3 (el receptor de C3bi, producto del clivage
de C3b) son altamente vulnerables a las infec
ciones bacterianas.
La unin de la bacteria al fagocito desenca
dena el proceso de ingestin. Una vez que en el
fagocito se ha formado la vacuola fagoctica,
sta se fusiona con los lisosomas, quedando la
bacteria expuesta al contenido lisosomal. H a si
do demostrado que muchas bacterias son inca
paces de multiplicarse cuando son transferidas
a medios adecuados pocos minutos despus de
ser ingeridas. En los leucocitos esta accin bac
tericida se debe a los constituyentes lisosom a
les y a productos metablicos. Entre los pro
ductos del metabolismo con actividad antilaacteriana pueden citarse el cido lctico, que pro
duce una disminucin del pH suficiente como
para provocar la prdida de viabilidad de algu
nas bacterias patgenas, y la formacin de pe
rxido de hidrgeno por mecanismos d ep en
dientes del O^. La actividad bactericida del
H jO j parece deberse a la oxidacin de iones
haluros (principalmente cloruros) para form ar
radicales hipohalitos en una reaccin catalizada
por la enzima mieloperoxidasa. La deficiencia
en el sistema de mieloperoxidasas resulta en fa
gocitosis poco eficiente para destruir bacterias
ingeridas y los individuos son altamente sus
ceptibles a las enfermedades infecciosas. A de
ms, el H^Oj en altas concentraciones puede
actuar directamente como agente letal y tam
bin interactuar con radicales superxidos para
formar radicales hidroxlicos txicos.
Otras sustancias bactericidas, cuya actividad

484

Inmunopatologa

oE
l 'S

03

Tiempo en das
Fig. 24-4. Evolucin de L isteria m onocytogenes en bazo de ratones infectados experim entalm ente con dosis letales. UFC
en listeriosis prim aria (-o o-) y en listeriosis secundaria en ratones vacunados (- -), En la escala de Proteccin se
grafica la diferencia de U D C entre ratones vacunados y ratones sin inm unizar (-o~ -o-). (De Stefan H. E. K aufm an, m o d ifi
cado. Fundam ental Im m unology, 3 ed.)

es independiente de m ecanism os oxidativos,

son tambin producidas por los fagocitos. Estas
incluyen lisozima (muramidasa), protenas ca
tinicas y lactoferrina. La lisozima es una enzi
ma cappz de hidrolizar los componentes mucop eptdicos de la pared celu lar de bacterias
grampositivas susceptibles, hacindolas sensi
bles al shock osmtico. Las protenas cati
nicas presentes en los grnulos de leucocitos
alteran la barrera de permeabilidad de bacterias
grampositivas y gramnegativas. La lactoferri
na, una protena que se une al hierro, posee ac
tividad bacteriosttica.
Estudios con bacterias marcadas radiactiva
mente permitieron demostrar que en los fagolisosomas las bacterias muertas son rpidamente
degradadas a componentes de bajo peso m ole
cular por enzimas hidrolticas (proteasas, peptidasas, nucleasas, fosfatasas, lipasas, carbohidrasas) con actividad ptima a pH cido.
La importancia de la fagocitosis como meca
nismo de defensa contra las infecciones bacte
rianas se refleja en la incrementada susceptibili
dad en pacientes con desrdenes primarios y se
cundarios de la funcin fagoctica. Entre los pri
meros el ms serio es la enfermedad granulomatosa crnica. Los secundarios comprenden
efectos colaterales de inmunosupresores y corticoesteroides sobre la funcin fagoctica, y defi
ciencias de complemento o inmunoglobulinas.

Las bacterias han desarrollado estrategias

efectivas para escapar de la fagocitosis, princi
palmente relacionadas con la composicin de
sus envolturas que fueron descritas al tratar los
determinantes de virulencia.
La cpsula produce dos efectos: 1) interfiere
la unin del complemento a la superficie bacte
riana, y 2) previene la unin de los receptores
de complemento presentes en los fagocitos con
el C3b unido a la superficie bacteriana. Este
mecanismo adicional adquiere importancia par
ticular en el caso de bacterias grampositivas, en
las que su superficie puede representar un ex
celente blanco para la unin de C3b por la va
alternativa. Otra molcula con actividad antifagoctica, ya mencionada, es la protena M de
los estreptococos. Se cree que dicha actividad
se debe a su capacidad de unir factor H de con
trol de complemento a la regin repetida C de
la m olcula (fig. 24-3), que elim inara cual
quier C3b unido a la protena M, aunque esto
no est an aclarado.
Una estrategia singular est relacionada con
la produccin de componentes bacterianos de
superficie que, por su semejanza con com po
nentes del husped, son difciles de reconocer
por su sistema inmune Por ejemplo, el cido
hialurnico de la cpsula de los estreptococos
es qumicamente indistinguible del cido hialu
rnico humano. Otros ejemplos son la estructu

Inmunologa de las Infecciones bacterianas

ra hidrocarbonada de la cpsula de meningoco
cos del grupo B y de Escherchia coli K l. No
es sorprendente que estos componentes sean
entonces, inmungenos pobres.
No ha sido descrita en bacterias la capacidad
de enmascarar sus propios antgenos por adsor
cin de componentes del husped, como ocurre
en algunos parsitos.
Sustancias antibacterianas
Desde hace tiempo se reconoce la presencia
de sustancias antibacterianas en tejidos y flui
dos corporales. Sin embargo, la relacin de ca
da una de estas sustancias, individualm ente,
con la resistencia a las infecciones no ha sido
bien establecida. Es posible que contribuyan a
la resistencia total del husped cuando actan
en conjunto y asociadas a otros mecanismos de
defensa. En diversos tejidos se han encontrado
sustancias como lisozima (que tambin se en
cuentra en lgrimas, saliva, moco y secreciones
nasales), y polipptidos bsicos ricos en lisina,
arginina y poliaminas. Adems, el suero nor
mal contiene sustancias antim icrobianas term oestables (diferencia con el complem ento)
denominadas p-lisinas que se forman por coa
gulacin de plaquetas. Son activas contra una
cantidad de bacterias grampositivas, principal
mente bacilos aerobios formadores de esporos
y algunos M icrococcus. Tam bin se extraen
sustancias bactericidas de leucocitos (leuquinas), de plaquetas (plaquinas) y de glbulos ro
jos (hematina y mesohematina). Indudablemen
te, muchos otros constituyentes qumicos de los
tejidos y fluidos pueden inhibir el crecimiento
de bacterias patgenas.
Inflamacin
Una respuesta inespecfica, como lo es la in
flamacin, es producida por diferentes agentes,
entre ellos una infeccin bacteriana. La respues
ta inflamatoria posibilita la accin de varios m e
canismos de resistencia constitutivos en el sitio
de la infeccin por proveer: 1) una alta concen
tracin de fagocitos y 2) un aumento de la con
centracin local de factores antibacterianos sri
cos y liberados de clulas muertas y, en anima
les inmunes, de anticuerpos. Adems, la dismi
nucin de la tensin de oxgeno y la acumula
cin de cido lctico en el centro del rea necrtica podran constituir condiciones adversas para
el desarrollo bacteriano (vase cap. 23).
Respuesta inmune
Adems de los mecanismos constitutivos ya
sealados, el husped animal posee la capaci
dad de responder a las infecciones bacterianas

485

mediante una serie de reacciones especficas,

inducidas por el agente infeccioso, que consti
tuyen la respuesta inmune. Se ha dicho que la
complejidad del sistema inmune en seres hu
m anos es un reflejo de la diversidad de los
agentes infecciosos a los que est expuesto. Si
se tiene en cuenta el nmero de microorganis
mos potencialmente patgenos, la cantidad de
antgenos que puede expresar cada uno de ellos
y la constante evolucin de las especies, resulta
explicable que la respuesta inmune del husped
posea un alto grado de versatilidad. Este aspec
to fue considerado en el captulo 2.
Los mecanismos inmunes de defensa que se
inducen en un husped animal frente a una in
feccin bacteriana deben protegerlo de la viru
lencia de las bacterias, es decir, evitar su proli
feracin in vivo y la accin de las toxinas rela
cionadas con su patogenicidad. Con respecto a
estos m ecanism os, debe hacerse una prim era
distincin entre las bacterias que se comportan
como parsitos extracelulares y aquellas que lo
hacen como parsitos intracelulares facultati
vos.
BACTERIAS EXTRACELULARES
Las bacterias que se comportan como parsi
tos extracelulares son capaces de provocar da
o a los tejidos slo mientras permanecen fuera
de las clulas fagocticas. Generalmente produ
cen enfermedades agudas y de corta duracin.
Su presencia en los tejidos estimula la produc
cin de anticuerpos especficos de distintas cla
ses. Estos anticuerpos confieren resistencia a
las infecciones por diferentes mecanismos, pro
duciendo: 1)opsonizacin (fagocitosis facilita
da); 2) neutralizacin; 3) muerte y Usis m edia
da por complemento, y 4) incremento de la res
puesta inflamatoria.
Opsonizacin
La produccin de anticuerpos opsonizantes
constituye el mecanismo de defensa especfico
ms importante en las enfermedades bacteria
nas agudas; particularmente en aquellas que re
conocen como agente causal a bacterias encapsuladas que basan su virulencia en la resisten
cia a la ingestin fagoctica, como ocurre en la
neum ona neumoccica. Las opsoninas reac
cionan con los componentes antignicos de las
bacterias que impiden su ingestin por las clu
las fagocticas. De esta manera facilitan la fija
cin de las bacterias a los fagocitos y aumentan
su susceptibilidad a la fagocitosis. T anto los
macrfagos como los leucocitos polim orfonu
cleares poseen receptores de superficie para las
porciones Fe de las IgGj, IgG., o C3b. D e esta

486

Inmunopatologa

forma la opsonizacin puede ocurrir cuando; 1)

se producen suficientes anticuerpos especficos
IgGl o IgG3 que se unen a las bacterias; 2) la
respuesta de anticuerpos por s misma es insu
ficiente para la opsonizacin, pero se puede fi
jar suficiente complemento sobre la superficie
de las bacterias, y 3) los distintos componentes
de las bacterias, por ejemplo endotoxinas, acti
van directamente el complemento utilizando la
va alternativa.
Los anticuerpos inductores de aglutinacin
tambin promueven la fagocitosis al formar un
cmulo o clump de clulas.
Neutralizacin
La neutralizacin representa una respuesta
humoral particularmente eficiente como meca
nismo de defensa contra la accin de toxinas
bacterianas, las cuales, para ejercer su efecto,
deben u n irse in ic ia lm e n te a re c ep to re s de
membrana de las clulas susceptibles. La m a
yora de las exotoxinas estimulan la produccin
de anticuerpos especficos, a n tito x in a s, que
neutralizan su efecto. Estos anticuerpos se unen
a las toxinas, produciendo una modificacin es
ttica que im pide su unin a la clulas del
husped.
Las antitoxinas especficas son altam ente
protectoras contra las enfermedades causadas
por bacterias que producen exotoxinas como
nico o principal factor de virulencia, como
son difteria y ttanos. La prevencin de estas
enfermedades por medio de vacunaciones con
toxoides (toxinas tratadas con formaldehdo),
ha probado ser eficientes. Tambin se practica,
con fines teraputicos, la inmunizacin pasiva
con antitoxinas homlogas o heterlogas.
Por otra parte, anticuerpos n eutralizantes
preexistentes pueden prevenir la fijacin de
bacterias a los receptores celulares. Tambin
pueden red u cir la in fectiv id ad p ro vocando
agregacin fsica, e inhibir la movilidad bacte
riana reaccionando con pili y flagelos.
Muerte y lisis bacteriana mediada
por complemento
En 1884, R. Pfeiffer y sus colaboradores de
mostraron que ciertas bacterias gramnegativas
eran lisadas por antisueros preparados contra
ellas, y que esa actividad ltica se perda por
calentamiento a 56- C, sugiriendo la participa
cin del complemento. Estudios ms recientes
permitieron demostrar que la muerte se produ
ce por accin de las protenas terminales de la
cascada del complemento. A menudo, pero no
invariablemente, la muerte bacteriana va acom
paada por lisis, que depende de que las canti
dades de lisozima sean las adecuadas.

La susceptibilidad al sistema bactericida del

suero es una caracterstica muy difundida entre
las bacterias gramnegativas.
La activacin del com plem ento por la va
clsica usualmente requiere el reconocimiento
de antgenos bacterianos de superficie por cier
tas clases de anticuerpos, sobre todo IgM y, en
menor grado, IgG. Tambin se ha sugerido la
activacin por IgA, en Escherichia coli. Estos
anticuerpos estaran dirigidos al core de lipopo
lisacridos y otros antgenos comunes, en ente
robacterias, y a protenas de membrana exter
na, en Neisseria spp.
Por otra parte, las endotoxinas de las bacte
rias gramnegativas pueden inducir la lisis acti
vando el complemento por la va alternativa.
Debido a las dificultades para distinguir los
fenmenos bactericidas y bacteriolticos m e
diados por complemento de otros sistemas de
defensa especficos e inespecficos, resulta dif
cil evaluar el rol in vivo de este m ecanism o
bactericida contra bacterias gramnegativas. Es
probable que los distintos componentes defen
sivos del husped acten en forma concertada
ante un desafo con bacterias potencialm ente
patgenas y que los m ecanism ds hum orales
mediados por complemento sean ms im por
tantes en la patognesis de algunas enfermeda
des que en la de otras.
La resistencia a la accin bactericida de los
sistemas anticuerpo-com plem ento parece de
sempear un papel importante en la patogne
sis de algunas infecciones debidas a bacterias
gram negativas. Por ejemplo, en endocarditis
por bacterias gramnegativas, en las que las bac
terias invasoras colonizan un sitio aparente
mente inaccesible para las clulas fagocticas,
la resistencia a los factores bactericidas del
suero parece ser un importante factor de pato
genicidad. Varios polmeros de la cubierta ce
lular, tales como protenas de membrana exter
na, lipopolisacridos y exopolisacridos, han
sido considerados como mediadores de esta re
sistencia, cuyo mecanismo no ha sido an defi
nitivamente aclarado.
La susceptibilidad al sistema bactericida del
suero parece ser tambin decisiva en la patog
nesis de infecciones debidas a Neisseria spp.
Los gonococos que causan infecciones genita
les locales son generalm ente susceptibles al
suero humano, mientras que los que invaden el
torrente sanguneo y producen infecciones di
seminadas son resistentes a la muerte por sue
ro. Por otra parte, la falta de niveles adecuados
de anticuerpos y complemento en lquido cefa
lorraqudeo puede contribuir al mantenimiento
de altas concentraciones de bacterias en casos
de meningitis no tratadas. Las evidencias qui
zs ms importantes en favor de la importancia
de esta actividad bactericida in vivo surgen de

Inmunologa de las Infecciones bacterianas

observaciones realizadas en pacientes con defi
ciencias congnitas de protenas del com ple
mento. Deficiencias de C5, C6, C l y C8 estn
asociadas con episodios de bacteriemia gonoccica y m eningoccica, y meningitis. Dado
que la ausencia de estos componentes no im pi
de las funciones opsnicas y quimiotcticas del
complemento se sugiri un papel directo de la
actividad bactericida del suero. Adems, es
probable que en individuos deficientes en C l,
C4 y C2, el camino alternativo sea el que acta
en la prevencin de infecciones recurrentes de
caractersticas serias.
Las bacterias gramnegativas disponen de un
nmero de estrategias para obviar los efectos
de ambas vas de activacin del complemento.
Uno de los mecanismos ms comunes para im
pedir la unin del complemento es la capacidad
de las bacterias de sintetizar cpsulas que, con
la nica excepcin de la del Bacillus anthracis,
son de naturaleza polisaeardica. Como ya se
ha dicho, la produccin de cpsula est clara
mente relacionada con la patogenicidad de m u
chas especies bacterian as, g ram positivas y
gramnegativas, tales como Streptococcus spp,
Neisseria meningitidis, Salmonella typhi, Haemophilus influenzae, Klebsiella spp, etc. Existe
un gran nmero de antgenos capsulares, pero
slo un reducido nmero de ellos est asociado
con bacterias que causan enfermedades invasi
vas. En Escherichia coli se han definido, serolgicamente, ms de 80 antgenos capsulares,
denominados K. Sin embargo, la mayora de
las cepas de Escherichia coli aisladas de sangre
poseen antgenos de tipo K1 y slo unos pocos
tipos de K causan las restantes enfermedades
invasivas producidas por Escherichia coli.
Se cree que el mecanismo molecular de la
inhibicin del efecto bactericida del suero por
los polisacridos capsulares es la restriccin de
la difusin de anticuerpos y componentes del
complemento a las superficies de clulas sub
yacentes. Probablemente ms importante es la
capacidad de las cpsulas de inhibir la fijacin
de complemento por la va alternativa al pro
veer una superficie que potencia la degradacin
del C3b unido, de manera similar a lo que pro
duce el cido silico de la superficie de clulas
eucariticas. De hecho, algunas cpsulas con
sisten exclusivamente de cido silico {Neisse
ria m eningitidis grupos B y C y Escherichia
coli K 1) o lo contienen {Streptococcus agalactiae tipos la, 11 y III). Adems, en Haemophilus
influenzae tipo b, la resistencia puede ser fenotpicamente modulada por condiciones ambien
tales, confirm ando el rol de la cpsula en la
evasin de la muerte bacteriana mediada por el
complemento.
Al igual que Hemophilus influenzae, cepas
de N eisseria gonorrhoeae sensibles al suero

487

muestran un fenotipo resistente al suero cuando

son preincubadas en suero o extractos de teji
dos, demostrndose que el componente activo
es el cido eitidin 5 -monofosfo-N acetilneuramnico (CMP-NANA), el nucletido activado
de cido sihco. El CMP-NANA acta com o
dador para una sialotransferasa que agrega este
azcar al lipooligosacrido (LOS) del organis
mo. Con ello no slo se enmascaran los epito
pes antignieos del LOS que normalmente sir
ven como blancos bactericidas, sino que tam
bin se inhibe la muerte por anticuerpos a otros
antgenos, tales como molculas de porinas.
Otro mecanismo que permite evadir la m uer
te m ediada por com plem ento, especialm ente
im portante en especies de enterobacterias, in
volucra a los LPS. Estos organismos sintetizan
LPS con largas cadenas laterales O, que im pe
diran estricam ente el acceso del com plejo
C5b-9 a la m em brana externa de la bacteria.
Las bacterias tam bin evaden el sistem a del
com plemento presentando al sistema inm une
antgenos que estimulan la formacin de anti
cuerpos bloqueantes. Estos anticuerpos b lo
quean la depuracin de bacterias por la reac
cin bactericida del suero. Se ha propuesto que
los anticuerpos bloqueantes tienen dos efectos:
1) desvan la localizacin molecular del com
plemento fijado a sitios que no resultan en le
siones bactericidas y 2) interfieren con la fija
cin de anticuerpos normalmente bactericidas.
Un mecanismo usado por Brucella y meningococos es la estimulacin de altos niveles de an
ticuerpos IgA sricos no fijadores de com ple
mento que parecen competir con los anticuer
pos IgG bactericidas. En el caso de Neisseria
gonorrhoeae, el suero humano normal puede
co n ten e r anticuerpos bloqueantes d irig id o s
principalmente contra una protena de superfi
cie expuesta denominada PIII o rmp que es ca
paz de bloquear el fuerte efecto bactericida del
suero de pacientes que se han recuperado de
una infeccin gonoceica diseminada.
Incremento de la respuesta
inflamatoria
A travs de la activacin del complemento,
complejos antgeno-anticuerpo incrementan la
intensidad de la respuesta inflamatoria inducida
por el agente infeccioso.
BACTERIAS INTRACELULARES
Las bacterias intracelulares comprenden al
gunas especies patgenas de importancia m di
ca reconocida y otros patgenos emergentes y
oportunistas que cobran importancia con el au
mento de pacientes inmunodeficientes.

488

Inmunopatologa

Con respecto a su hbitat, las bacterias intra

celulares pueden ser de dos tipos; facultativas y
obligadas. Las primeras son capaces de multi
plicarse y persistir dentro de fagocitos mononucleares y, en algunos casos, dentro de otras
clulas del husped. Estas incluyen Mycobacterium spp, Salmonella spp, Brucella spp, Legionella pneumophila y Listeria monocytogenes.
Las segundas, que no pueden sobrevivir fuera
de la clula husped, prefieren los fagocitos no
profesionales (clulas epiteliales y endotelia
les), y slo a veces se encuentran en fagocitos
m onocelulares. Estas incluyen R ickettsiae y
Chlamidiae,
Debido a su localizacin intracelular estn
protegidas de la inmunidad humoral. Sin em
bargo, protenas bacterianas son procesadas y
los p ptidos expresados en el contexto del
CMH promueven interacciones con linfocitos
T. Tanto la patogenicidad de bacterias intrace
lulares como la resistencia adquirida a dicha in
feccin dependen de los linfocitos T, La activa
cin de macrfagos por linfocitos T CD4 que
producen interfern gamma (lEN-y) se conside
ra crucial en la resistencia adquirida.
Las bacterias intracelulares presentan cinco
caractersticas principales; 1) estn obligadas a
explotar mecanismos de evasin que le perm i
tan sobrevivir en ambientes tan hostiles; 2) po
seen baja toxicidad, y la patogenicidad no es
consecuencia directa de los factores de virulen
cia bacterianos sino de la respuesta del husped
por la estimulacin de linfocitos T; 3) las reac
ciones tisulares son tpicamente granulomatosas; 4) as enfermedades tienden a la cronici
dad, y 5) la proteccin contra las infecciones
producidas por bacterias intracelulares est m e
diada por clulas T, las que no interactan di
rectamente con la bacteria sino con la clula in
fectada.
Slo unas pocas especies bacterianas patge
nas cumplen con estos criterios y, dependiendo
de cul o cules de ellos se consideren, el con
cepto de bacterias intracelulares puede variar.
Entre las bacterias que cumplen todos los crite
rios m encionados se encuentran especies de
Mycobacterium. La listeriosis experimental en
ratones, causada por Listeria monocytogenes
cumple casi todos los criterios, pero es una en
fermedad aguda. Otras enfermedades, tales co
mo fiebre tifoidea (causada por Salm.onella typhi o Salmonella thyphimurium), o la enferme
dad de los legionarios, causada por Legionella
pneumophila, son slo parcialmente intracelu
lares, ya que la respuesta del husped es influi
da por anticuerpos. La tuberculosis y la liste
riosis experim ental en ratones, son m odelos
importantes de infecciones por bacterias intra
celulares, a los que nos referiremos en este ca
ptulo. La primera por su implicancia en salud

pblica y la segunda por ser el modelo mejor

estudiado,
Mycobacterium tuberculosis es una bacteria
cido alcohol resistente, de crecimiento lento,
cuya cubierta celular es rica en lpidos, glucol
pidos y ceras, que son responsables de su hidro
fobicidad, su adyuvanticidad y su persistencia
intracelular. Es agente causal de la tuberculosis,
enfermedad que afecta a numerosos individuos.
Sin embargo, estos representan no ms del 10%
de los infectados, ya que el aproximadamente
90% restante permanece saludable al mantener
un equilibrio entre la respuesta inmune del hus
ped y el desarrollo de la bacteria persistente.
Fagocitos profesionales
Los fagocitos profesionales constituyen los
principales efectores de las defensas antibacte
rianas. Estos com prenden a los granulocitos
polimorfonucleares (PNGs) y fagocitos mononucleares (MPs). Los PNGs juegan un rol espe
cial en la infeccin intracelular aguda, aunque
su corta vida los hace inapropiados como hbi
tat intracelular. Ms bien actan como clulas
letales para bacterias intracelulares como Liste
ria monocytogenes. El rol de los MPs es doble,
ya que representan un hbitat esencial y los
principales efectores de las defensas.
La fagocitosis se induce de dos maneras; 1)
Los fagocitos profesionales expresan glucoprotenas lectin-like con especificidad por azcares
comnmente expuestos en la superficie bacte
riana. La unin a estos receptores induce la fa
gocitosis por los fagocitos profesionales, 2) La
unin de ligandos a las bacterias (IgG, produc
tos del clivaje de C3 o fibronectina) promueve
la fagocitosis va receptores especficos (FcR,
C R l y CR3 o EnR),
Las funciones efectoras de los fagocitos pro
fesionales incluyen; 1) generacin de interme
diarios del oxgeno reactivos (ROIs); 2) pro
duccin de intermediarios del nitrgeno reacti
vos (RNIs); 3) limitacin de la disponibilidad
del hierro intracelular; 4) produccin de defensinas; y 5) acidificacin de fagosomas y fusin
fagosomas-lisosomas. La mayora de estos me
canismos son solamente inducidos por una ac
tivacin apropiadi- En el caso de MPs murinos
por estimulacin de IFNy, aunque tambin par
ticipan otra interleuquinas. El sistema humano
es ms complejo y es probable que se requiera
la co-estimulacin de diferentes factores.
Produccin de ROIs
Los RO Is son txicos para todos los m i
croorganismos, incluyendo las bacterias intra
celulares. Sin embargo, su contribucin para
combatir la tuberculosis no es clara.

Inmunologa de las infecciones bacterianas

Produccin de RNIs
Los RNIs han demostrado estar involucrados
en la actividad tubercuiosttica de MPs m uri
nos. Estos interm ediarios son producidos no
slo por los fagocitos profesionales sino tam
bin por otras clulas, incluyendo los hepatoci
tos, una de las clulas blanco de L. monocytogenes. Por lo tanto, es posible que los RNIs
participen en la proteccin de fagocitos no pro
fesionales contra las bacterias intracelulares.
Tambin se ha sugerido que los RNIs participa
ran en la inhibicin del crecimiento de micobacterias en MPs humanos.
Requerimiento de hierro
El hierro es un requerimiento crucial para la
sobrevivencia de bacterias intracelulares, entre
ellas h is te ria m ono cyto g en es y L eg io n eila
pneumophila. Por otra parte, los MPs requieren
hierro para activacin de los mecanismos anti
b acte rian o s que inclu y en la g en eraci n de
ROIs y RNIs. De esta manera, la competencia
por el hierro representa un factor decisivo para
la accin de los MPs como hbitat o efectores.
Produccin de defensnas, acidificacin
de fagosom as y fusin fagosoma-lisosoma
Durante la fagocitosis, el pH endosomal au
menta a niveles bsicos por un corto perodo y
luego disminuye a valores cidos. El medio b
sico crea condiciones ptimas para las defensinas, mientras que el pH cido es ptimo para
las enzimas lisosomales.
Las defensinas son polipptidos bsicos que
abundan en los PNGs y estn presentes en al
gunos, aunque no todos, los MPs. Ha sido de
m ostrado que defensinas purificadas poseen
una fuerte actividad bactericida y pueden jugar
un rol defensivo contra ciertas bacterias intra
celulares, tales como S. typhimurium y L. m o
nocytogenes. Adems, mulantes de S. typhimu
rium phoP-, por insercin de un transposn,
que son avirulentas para ratn e incapaces de
sobrevivir en MPs murinos, son altamente sen
sibles a las defensinas.
La contribucin de las enzimas lisosomales a
la muerte bacteriana es poco importante; su rol
principal es la degradacin de bacterias m uer
tas. Estas enzimas residen en los lisosomas y
llegan al fagosoma a travs de la fusin fagoso
ma-lisosoma.
Estrategias bacterianas de sobrevivencia
intracelular
Las bacterias intracelulares explotan diferen
tes estrategias para multiplicarse dentro de las

489

clulas husped: 1) invasin de fagocitos no

profesionales; 2) evasin desde el fagosom a
hacia el compartimento citoplasmtico; 3) in
terferencia con los ROIs; 4) inhibicin de la fu
sin fagosom a-lisosom a y neutralizacin del
pH fagosomal; 5) resistencia a las enzimas lisosomales; y 6) induccin de heat-shock p ro
teins (hsp)L isteria m onocytogenes y M ycobacterium
tuberculosis presentan diferentes estrategias de
sobrevivencia, probablemente relacionadas con
la duracin de las enfermedades que causan.
L. monocytogenes, que causa una infeccin
aguda, es relativam ente sensible a la m uerte
por fagocitos y slo puede sobrevivir en el in
terior de fagocitos no profesionales y aquellos
pocos MPs insuficientem ente calificados. M.
tuberculosis habita principalmente en M Ps y
raramente en fagocitos no profesionales.
En L. monocytogenes la invasin activa de
fagocitos no profesionales es mediada p o r una
invasina, llam ada internalina y una pi'otena
extracelular, p60. Por este mecanismo L. mo
nocytogenes atraviesa las clulas epiteliales in
testinales. En el hgado, las clulas de K upffer
captan L. monocytogenes de la sangre y algu
nas bacterias pueden salir del fagosoma y en
trar en en citoplasma. En esta etapa la sobrevi
vencia celular se debe, principalmente, a listeriolisina, aunque otros factores de virulencia
(fosfolipasas C, lecitinasa y m etaloproteasa)
tambin contribuiran. Luego, L. monocytoge
nes se mueve hacia la membrana desde donde
se disemina a los hepatocitos, sin exposicin al
medio extracelular ni intervencin de invasinas. Con posterioridad a la estimulacin de los
MPs por IFN-y, L. monocytogenes no puede
escapar de los fagosomas, donde es m uerta f
cilmente por accin de los ROIs, RNIs y/o de
fensinas. Aun en ausencia de clulas T, las c
lulas NK controlan la listeriosis bastante efi
cientem ente, aunque no c o m p leta m en te. El
compartimento endosom al de los hepatocitos
es m ucho m enos hostil que el de lo s MPs,
constituyendo un nicho propicio para la sobre
vivencia bacteriana.
En M. tuberculosis no se conocen invasinas
y la entrada al husped se produce por medio
de la fagocitosis por MP alveolares. G eneral
m ente no ocurre evasin en el citoplasm a y
existe una alta resistencia a los mecanism os
efectores que operan en MP activados. A pesar
de su im portancia clnica, los conocim ientos
sobre los factores de virulencia que perm iten
la sobrevivencia intracelular de Ai. tuberculo
sis son poco conocidos. La fagocitosis ocurre
por dos mecanismos: 1) las micobacterias se
cretan abundante cantidad de molculas que se
unen a fibronectina, las que promueven la fa
gocitosis por receptores de fibronectina, y 2)

490

Inmunopatologa

M. tuberculosis induce la activacin de C3 se

guida por fijacin de productos de C3 y capta
cin va CR; esta entrada no produce induc
cin de ROIs. Adems, M. tuberculosis produ
ce enzimas que detoxifican los ROIs e inhiben
la fusin fagosoma-lisosoma. Tambin los glucolpidos participan en la sobrevivencia del
bacilo de la tuberculosis. El lipoarabinomanano interfiere con la activacin de MPs y los
sulfolpidos inhiben la fusin fagosoma-lisosoma e interfieren con la produccin de ROIs.
Por ltimo, en virtud de su pared celular rica
en lipoides, su actividad metablica reducida y
su replicacin retardada, M. tuberculosis pare
ce estar equipado adecuadamente para su so
brevivencia intraendosomal.
R ol central de las clulas T
Como ya se mencion, los linfocitos T son
elem entos indispensables para la patognesis
de infecciones producidas por bacterias intra
celulares. Por una parte, la expansin de gra
nulomas dificulta las funciones tisulares, ocu
pando espacio y afectando a las clulas que lo
rodean. Por otra parte, los linfocitos T espec
ficos pueden afectar la fisiologa de las clulas
del husped infectadas.
La adquisicin de resistencia contra bacte
rias intracelulares tambin depende principal
mente de los linfocitos T. En el caso de bacte
rias susceptibles, como histeria monocytogenes, la depuracin bacteriana es llevada a cabo
rpidamente, mientras que en el caso de pat
genos resistentes, como M. tuberculosis, la de
puracin es generalmente incompleta, quedan
do focos con bacterias controladas. La presen
cia de bacterias y su erradicacin se localizan
en las lesiones granulomatosas, donde las citoquinas prom ueven la accin de linfocitos T,
MPs y Otras clulas.
En la dcada del 60, G. B. Mackanes revel
que la resistencia contra bacterias intracelula
res poda ser transferida por medio de linfoci
tos viables obtenidos de animales inmunes, y
posteriormente realiz estudios sobre el m ode
lo de listeriosis experimental en ratones.
Se infectaron ratones intravenosamente con
dosis subletales de L. monocytogenes. A varios
tiempos post-infeccin se mataron los ratones,
se extrajeron sus bazos e hgados y se determi
n el nmero de bacterias viables (por recuento
de unidades formadoras de colonias en placa)
en homogenatos de esos rganos. Ms del 95%
de las bacterias fueron eliminadas de la circula
cin durante los primeros 15 minutos, y se en
contraron en los rganos, donde se multiplica
ron continuamente hasta los 4-6 das. Luego, el
nmero de bacterias dism inuy rpidam ente
hasta niveles no detectables, alrededor de los

8-10 das. El cambio ocurrido en los das 5-6 se

correlaciona con la aparicin de linfocitos T es
pecficos, capaces de transferir proteccin a re
ceptores com unes. La infeccin con L. m o
nocytogenes induce inmunidad protectora, y ra
tones que sufrieron la infeccin subletal, fueron
capaces de tolerar una segunda dosis, mucho
mayor, normalmente letal (fig. 24-4).
Subpoblaciones de clulas T involucradas
Clulas T a/(3 CD4 (principalmente T H l) y
clulas T a /p CD8 participan en la resistencia
adquirida contra bacterias intracelulares, como
surge de algunas observaciones reahzadas en
ratones infectados con L. monocytogenes que
demuestran que: 1) la transferencia adoptiva
de inmunidad antilisteria depende de la histo
compatibilidad entre las clulas T transferidas
y los ratones receptores, en sus loci para m ol
culas clase I y clase II del CMH; 2) la elimina
cin in vitro de clulas T CD4 y CD8 de la po
blacin de lin fo cito s inm u n es, d ific u lta la
transferencia de proteccin contra L. monocy
togenes-, 3) se han aislado clones de clulas T
CD4 y CD8 especficos para L. m onocytoge
nes capaces de transferir proteccin adoptiva
mente y 4) las lesiones de ratones infectados
consisten de clulas T CD4 y CD8.
Se ha dem ostrado que en la listeriosis, la
proteccin depende principalmente de clulas
T CD8, con alguna participacin de clulas T
CD4,
Tambin existen evidencias que indican la
participacin de clulas T CD4 y CD8 en in
fecciones por otras bacterias intracelulares, in
cluidas m icobacterias, Salm onella typhim urium y Brucella abortus.
La residencia primaria de las bacterias intra
celulares es el compartimento endosmico de
los MPs y desde aqu tienen acceso a la va de
presentacin de CMH clase II. Sin embargo,
las bacterias intracelulares tambin invaden fa
gocitos no profesionales, algunos de los cuales
no expresan constitutivamente molculas clase
II del CMH. En consecuencia, esas clulas no
son reconocidas por los linfocitos T CD4 y
brindan un sitio adecuado para la bacteria in
tracelular, influyendo en el curso de la enfer
medad.
Varias lneas circunstanciales de evidencias
indican que las clulas T y/5 estn involucra
das en la inmunidad contra bacterias gramne
gativas.
Citoquinas
Las citoquinas juegan un rol central en la re
sistencia contra las bacterias intracelulares.
Actan en las siguientes etapas:

Inmunologa de las infecciones bacterianas

infiltracin temprana de fagocitos
inflamatorios
En la acumulacin temprana de fagocitos in
flamatorios en el sitio de multiplicacin bacte
riana estn involucradas IL-1, lL-6 y TNF. E s
tas citoquinas proinflamatorias son producidas
por MPs y/o clulas epiteliales muy pronto des
pus de la infeccin.

491

clulas T CD4 y CD8 obtenidas de lesiones de

pacientes con tuberculosis expresan m arcado
res fenotpicos caractersticos de actividad cito
ltica. Si bien las clulas T CD4 aisladas de pa
cientes tuberculosos generalmente expresan ac
tividad citoltica especfica luego de su re-esti
mulacin in vitro, esto rara vez ocurre con las
clulas T CD8.
La lesin granulomatosa

Formacin de lesiones granulomatosas

Participan TNF e IL-4. Sin embargo, debido
a que los granulomas son indispensables para
la proteccin contra M. tuberculosis, la form a
cin de granuloma inducido por TNF es prim a
riamente un mecanismo protector, A diferencia
de ello, la proteccin contra L. monocytogenes
no depende estrictamente de la formacin de
granulomas, y lesiones excesivas son perjudi
ciales para el husped.
Activacin de funciones antibacterianas
en los M Ps (activacin de macrfagos)
Esta etapa ha sido extensamente estudiada in
vitro usando macrfagos murinos. En este sis
tema, el IFN-Y ha sido identificado com o la
principal citoquina de activacin de MPs. Los
m acrfagos activados son capaces de m atar
bacterias susceptibles, como L. monocytogenes,
y, aunque no hacen lo propio con M. tuberculo
sis, son capaces de inhibir fuertemente el creci
miento de estas bacterias. El IFN-y es produci
do por diferentes clulas que infiltran secuencialmente la lesin (clulas NK, clulas T y/5 y
clulas T a /p CD4 y CD8. (fig. 24-5).
La produccin de IFN-y por las clulas NK y
T y/6 favorece la difei'enciacin de clulas T
CD4 en el tipo T H l, durante las tiltimas fases
de la activacin de macrfagos.
Mecanismos citolticos
Mecanismos citolticos parecen estar involu
crados tanto en la patognesis de las bacterias
intracelulares como en la proteccin contra las
mismas. En la patogenia, ya que la lisis de fa
gocitos no profesionales afecta las funciones fi
siolgicas de los rganos afectados. En cuanto
a su funcin en la proteccin, la lisis de clulas
infectadas libera bacterias que mueren fc il
mente al ser fagocitadas por monocitos sangu
neos, constituyendo as un prerrequisito para la
depuracin de bacterias. Las clulas potencial
mente eitolticas incluyen PNGs, NK, y clulas
T y/5 y a/p. Clulas T a /p CD4 y CD8 de rato
nes inmunes contra M. tuberculosis o L. m o
nocytogenes expresan actividad citoltica des
pus de su re-estimulacin in vitro. Tam bin

En general, la respuesta inmune que protege

contra bacterias intracelulares es un evento lo
cal centrado en los g ran u lo m as, que no slo
restringen la multiplicacin bacteriana sino que
confinan a las bacterias en un espacio fsico de
finido.
La lesin granulomatosa est compuesta por
MPs (en diferentes estados de maduracin y di
ferenciacin) y clulas T de diferentes fenoti
pos. Las bacterias se encuentran en el interior
de los MPs.
La formacin del granuloma se inicia con un
proceso inflamatorio. Este proceso es desenca
denado por productos bacterianos (pptidos
conteniendo N-formil metionina), componentes
del complemento (C5a) y citoquinas produci
das por los MPs infectados (IL-1, lL-6, IL-8 y
T N F -a ). Las citoquinas producidas p o r los
MPs estimulan a las clulas endoteliales loca
les y a fagocitos sanguneos. Las clulas endo
teliales activadas que rodean a la lesin prim a
ria expresan selectinas e integrinas, prom ovien
do la adhesin y extravasacin de los fagocitos
inflam atorios que, a su vez, liberan enzim as
proteolticas con el consiguiente dao tisular.
Esta lesin es, a menudo, exudativa. En una se
gunda etapa, los linfocitos T y los macrfagos
interacttian entre s. Las clulas T producen ci
toquinas (que incluyen IFN-y e IL-2) que esti
mulan a los linfocitos T recirculantes en la san
gre, producen su interaccin con las clulas en
doteliales activadas (va selectinas e integrinas)
y migran hacia el foco infeccioso. Gradualmen
te, las clulas infiltradas se organizan y forman
un granuloma, en el que predominan los MPs.
Al interactuar con los MPs infectados, los lin
focitos T producen IFN-y y activan las funcio
nes antibacterianas de los macrfagos.
La imposibilidad de desarrollar granulomas
o la ruptura de granulomas organizados suele
estar asociada con una evolucin desfavorable
de la enfermedad infecciosa debida a bacterias
intracelulares.
CARACTERSTICAS DEL HUSPED
QUE MODIFICAN LA RESPUESTA INM U NE
La susceptibilidad y el tipo de respuesta ante
muchas infecciones bacterianas depende de las

492

Inmunopatologa

Fig. 24-5. P r jduccin secuencial de IFN-"y en el sitio de m ultiplicacin bacteriana, en la listeriosis experim ental en ratn.
(D e Stefan HE K aufm an, m odificado. F undam ental Im m unology, W . Paul, 3 ed.)

caractersticas del husped. Las ms importan

tes a tener en cuenta incluyen edad, factores
genticos y factores nutricionales.
Edad
La evolucin del sistema inmune durante el
desarrollo fetal, neon atal y adulto p ro d u ce
cambios en la susceptibilidad del husped a di
ferentes tipos de infeccin. Durante el desarro
llo fetal la susceptibilidad est limitada a aque
llos organismos que pueden ser transm itidos
por la circulacin materna (el agente productor
de la sfilis, entre las bacterias). Entre los neo
natos, un factor importante, aunque no el ni
co, es la falta de una respuesta inmune humo
ral. Esta se compensa en parte por los anticuer
pos maternos, sobre todo de la clase IgG, aun
que tambin se transfieren IgM e IgA, estos l
timos fundam entalemnte en leche y calostro.
Como consecuencia de los bajos niveles de
IgM hay una mayor susceptibilidad frente a las

bacterias gramnegativas. Adems, la desapari

cin de los anticuerpos IgG va acompaada de
un aumento en la susceptibilidad a infecciones
por estafilococos, estreptococos, Haemophius
influenzae Neisseria meningitidis.
Fothergill y Wright realizaron estudios sobre
la respuesta de anticuerpos en meningitis cau
sadas por H. influenzae y demostraron que la
incidencia de la enfermedad aumenta a medida
que disminuye el nivel de anticuerpos. Los ni
os nacen con anticuerpos m aternos y estn
protegidos m ientras estos anticuerpos estn
presentes. Entre los 3 meses y los 2 aos de
edad los nios son altamente susceptibles a la
enfermedad por ser naturalmente deficientes en
anticuerpos dirigidos contra la cpsula de tipo
b. Despus de los 2 aos, los ttulos de anti
cuerpos aumentan y la enfermedad se vuelve
menos frecuente. Adems, cuanto mayor es la
capacidad de la sangre para destruir al agente
causal, menos son los casos de enfermedad. En
la figura 24-6 se muestra la relacin entre la

Inmunologa de las infecciones bacterianas

493

lo

Edad (aos)
F ig. 24-6. Relacin entre edad, incidencia de m eningitis por H. influenzae y ttulos bactericidas en sangre. (De S m ith ,
A .L., m odificado. M icrobiologa. M ecanism os de la enferm edad infecciosa, 2 ed.)

edad, la incidencia de m eningitis por H. in

fluenzae y los ttulos bactericidas en sangre.
La inmunidad mediada por clulas aparece
prcticamente intacta en neonatos.
Es importante destacar que los procesos in
fecciosos de la infancia pueden provocai' altera
ciones perdurables al interferir en el desarrollo
y el crecimiento.

de las membranas lisosomales y la deficiencia

de vitamina A parece disminuir la resistencia a
la tuberculosis, al afectar la funcin fagoctica
normal. Por otra parte, una disminucin de h ie
rro parece estar asociada con un incremento de
la susceptibilidad a infecciones por bacterias
gramnegativas.

Factores genticos

R EA C C IO N ES
INM UNOPATOLGICAS

E ntre los facto res gen tico s se in clu y en

aquellos relacionados con la resistencia de es
pecie, raza, etc. Adems, muchos estudios su
gieren que existe un componente hereditario en
la susceptibilidad a la tuberculousis. Tambin se
han hecho observaciones sobre otros sistemas
microbianos, no bacterianos. Uno de los casos
mejor establecido de control hereditario de re
sistencia a una infeccin especfica es el de la
ausencia relativa de susceptibilidad al paludis
mo asociada con algunos tipos de anemia.
Factores nutricionales
Existen evidencias de que dietas cualitativa
mente o cuantitativamente inadecuadas pueden
predisponer a las infecciones bacterianas. Esta
disminucin de la resistencia ha sido asociada,
al menos, con deficiencias proteicas, vitamni
cas o de iones metlicos. U na dieta proteica
inadecuada produce depresin de la respuesta
inmune celular y humoral. Las vitaminas A y D
aparecen como esenciales para la funcionalidad

Hemos dicho anteriormente cjue una in fec

cin bacteriana es capaz de provocar dao en
un husped susceptible por accin directa de
los microrganismos y tambin por los m ecanis
mos de defensa que pone en juego el husped
frente a esa infeccin.
Tambin hemos visto que la respuesta infla
matoria es uno de los mecanismos de defensa
que un husped susceptible opone a una infec
cin. Sin embargo, la inflamacin en s m ism a
es una condicin patolgica y, en algunos ca
sos, el dao debido al proceso inflamatorio es
mayor que el producido por el agente infeccio
so, tal como ocurre, por ejemplo, en la tubercu
losis y la lepra. En infecciones por M ycobacte
rium tuberculosis, las clulas T activadas p o r el
antgeno no slo activan macrfagos, sino que
los atraen e inmovilizan. Puesto que, a su vez,
las clulas son atradas ai foco de infeccin, el
resultado neto es la concentracin de clulas
activadas y macrfagos en el sitio de infeccin.
La liberacin de linfotoxinas y enzimas lisoso-

494

Inmunopatologa

Clula epitelial

:^MBG
C lu la ^
endotelial^

rzr f Clula
jm mi m>\ endotelial

mm

'

A n tg e n o * * ,
Complejos
antgeno-anticuerpo
solubles

5=1 Anticuerpo

Giba

<^3 2> ^
03

Clula \
endotelial

C3

m um mrum
im

(PiC)
[

Activacin del sistema

del complemento

-Proteinuria

Clula
endotelial
^Polimorfonucleares
quimiotctica'
de 05, 0 6 y 07
F ig. 24-7. R epresentacin esquem tica del desarrollo de
lesiones glom erulares por los com plejos solubles de antgeno-anticuerpo. (De Fish y col.: en -Strauss, M. B. y W elt,
L. G. (eds.). D iseases o f the kidney, 2 ed. Boston, Little,
Brown & C o 1971.)

males por las clulas T y los macrfagos, res

pectivamente, produce la necrosis de los teji
dos, originando una reaccin de hipersensibili
dad mediada por clulas.
Otras reacciones inm unopatolgicas causa
das por infecciones bacterianas incluyen las de
nominadas enfermedades autoinmunes y la for
macin de complejos inmunes.
En el caso de las enfermedades autoinmunes
han sido implicados varios productos del meta
bolism o bacteriano, como lipopolisacridos,
protenas, etc. Estos productos inducen reaccio
nes inmunes no especficas que pueden supri
mir las respuestas especficas involucradas en
la capacidad protectora. A lgunos ejem plos
aclararn este concepto. La p ro ten a A de
Staphyococcus aureus tiene la propiedad de
combinarse con la porcin Ec de la IgG huma
na. As, el complejo formado reacciona con el
complemento del suero, produciendo su agota
miento; por este mecanismo una infeccin esta-

filoccica podra reducir las defensas del hus

ped contra otros microorganism os invasores.
Tambin se ha demostrado que un extracto de
poUsacridos de Bordetella pertussis disminu
ye la respuesta de hipersensibilidad tarda a la
tuberculina, probablemente por inhibicin de la
proliferacin o de la actividad de linfocitos o
de ambas.
Los complejos inmunes que se forman du
rante las infecciones bacterianas usualmente no
provocan un dao importante. Sin embargo, al
gunas infecciones pueden producir enfermeda
des debidas a la formacin de complejos inm u
nes. Uno de los ejemplos ms conocidos es la
glom erulonefritis aguda post-estreptocccica.
En eUa, los complejos antgeno-anticuerpo de
sencadenan varios mecanismos locales secun
darios que contribuyen a la formacin de lesio
nes glomerulares, que se presentan al m icros
copio electrnico como depsitos electrnica
mente densos. Mediante tcnicas histopatolgi
cas se demostr que estos depsitos contienen
cominmente IgG, C3 y properdina. Aun cuan
do no est definido el antgeno especfico que
provoca la glomerulonefritis post-estreptocccica, su patogenia parece semejante a la forma
aguda de la enfermedad del suero en conejos,
segtn se esquem atiza en la figura 24-7. Se
piensa que las lesiones glomerulares de la en
docarditis bacteriana subaguda, la bacteriemia
estafiloccica y la neumona neumoccica obe
deceran a mecanismos similares.

B IB L IO G R A F IA
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Inmunologa de las micosis

RICARDO NEGRONI

INTRODUCCIN
Se agrupan dentro de las micosis sistmicas
todas aquellas afecciones cuyo agente etiolgi
co es capaz de diseminarse por va linfohemtica en algn momento de su evolucin, provo
cando la agresin simultnea a diversos rga
nos con serio riesgo para la vida del pacien^e_26,39 Estas m icosis deben dividirse en dos
grandes c a t e g o r a s , a q u e l l a s ocasionadas
por hongos patgenos primitivos como el Histoplasm a capsulatum o el P aracoccidioides
brasiliensis, y las producidas por hongos de ba
ja virulencia, llamadas micosis oportunistas, a
causa de que su presentacin depende de la
existencia en el husped de una patologa pre
via que disminuye sus defensas, ya sea en el
orden local o en el general.
Estos dos tipos de afecciones son muy dife
rentes en lo que atae a las relaciones huspedparsito y conviene tratarlas separadamente.
I. MICOSIS SISTMICAS
Caracteres de las micosis sistmicas
Generales
Reservaremos el nombre de micosis sistmi
cas para aquellas producidas por hongos pat
genos primitivos. stos viven normalmente en
el mundo exterior, donde desarrollan una vida
saprofita en el suelo o sobre deyecciones de
animales y pueden infectar al hombre y otros
vertebrados por medio de sus esporas. La va
de penetracin es generalm ente inhalatoria,
producen cuadros de primoinfeccin pulmonar

25
habitualmente benignos que, en su mayor parte
curan en forma espontnea. Un reducido n
mero de sujetos infectados, uno de cada 500 o
1.000, segn la micosis, no se defiende ade
cuadam ente; su afeccin pulm onar se torna
progresiva y, por ltimo, el agente etiolgico
se disemina por va linfohemtica y ataca di
versos rganos llevando al paciente, de no me
diar un tratamiento adecuado, a la muerte en
un lapso variable.
A este grupo pertenecen 5 enferm edades:
coccidioidomicosis, histoplasmosis, paracoccidioidomicosis, blastomicosis y criptococosis.
Se designa con el nombre de micosis-infec
cin a las formas respiratorias benignas, subclnicas o asintom ticas que curan espontnea
mente y con el de m icosis-enferm edad a las
evolutivas y graves.
Una caracterstica importante de estas mico
sis es que cada una de ellas posee una distribu
cin geogrfica peculiar. Todas son ms fre
cuentes en el continente americano y, salvo la
blastomicosis (antes conocida como blastom i
cosis norteamericana), todas han sido halladas
en la Argentina.>3->33-'
Otro rasgo distintivo de importancia es que,
eon excepcin del Cryptococcus neoformans,
todos los agentes productores de micosis sist
micas son dimorfos, es decir, que se presentan
como hongos filamentosos con produccin de
distintos tipos de esporas en su vida saproftica
y como elementos levaduriformes o esporan
gios en la parasitaria. Ello se debe probable
mente a que en el seno de los tejidos parasitados el hongo debe adaptarse a las defensas del
husped y a condiciones de desarrollo constan
tes en lo que atae a temperatura y humedad.
Este proceso fue llamado animalizacin .'^

Inmunologa de las micosis

Epidemiolgicos y relaciones
husped-parsito
Los estudios realizados sobre la coccidioidomicosis-infeccin'^''-permitieron establecer una
serie de hechos fundamentales que ms tarde
fueron comprobados en otras micosis sistmi
cas. stos pueden resumirse as: 1 ) la primoinfeccin pulmonar origina un complejo primario
similar al de la tuberculosis; 2 ) los animales do
msticos y silvestres de las zonas endmicas se
infectan espontneamente de la misma forma
que el hombre; 3) la fuente de infeccin comn
para ambos es el suelo; 4) la primoinfeccin es,
en la mayora de los casos, asintomtica o subclnica, cura espontneamente, deja una slida
inm unidad frente a las reinfecciones y como
nicas secuelas produce la alergia cutnea fren
te a los antgenos del agente causal y, en ocasio
nes, focos de calcificacin pulmonar. Estas m i
cosis no son contagiosas de hombre a hombre
ni de los animales al hombre; slo se producen
pequeas epidemias cuando un grupo de suje
tos, por razones diversas, se expone simultnea
mente a una fuente de infeccin masiva.
Las encuestas realizadas mediante intrader
morreacciones han demostrado que la micosisinfeccin es extrem adam ente com n en las
reas endmicas, en particular en el continente
americano.
Se calcula que en el sudoeste de los Estados
Unidos existen 10 millones de sujetos infecta
dos por el C. immitis,^^^ y las encuestas realiza
das en nuestro pas acusan un ndice de infec
cin en la poblacin infantil que vara entre el
10,6 y 19,72%.'2s-3o
En lo referente a histoplasmosis, la poblacin
de la zona estadounidense del valle del Mississippi-Missouri presenta un ndice de infeccin
del 90% y se calcula que el nmero total de in
fectados es de 40 millones. En la pampa hm e
da argentina el porcentaje de infeccin es del 33
al 35%,*'^^ lo cual hace suponer la existencia de
6 millones de personas infectadas.
Las encuestas similares realizadas con ant
genos del P. brasiliensis han demostrado, se
gn las zonas endmicas, ndices de positividad
de las pruebas cutneas que varan entre el 9,2
y el
Desde hace poco tiempo se cuenta con un
reactivo eficaz para reacciones intradrmicas
del C ryptococcus neoform ans,'^'^ un estudio
realizado en Oklahoma demostr 19% de reac
tores positivos entre 477 personas sanas,*
14,1% en Crdoba (Argentina) y 2% en la ciu
dad de Sao Paulo (Brasil).
En contraste con la alta frecuencia de la in
feccin, los casos clnicos evolutivos de estas
micosis sistmicas son relativamente raros; por
ejemplo, la prevalencia de la paracoccidioido-

497

micosis en la zona endmica de la Argentina ha

sido calculada en uno de cada 1 0 0 . 0 0 0 habitan
tes por ao.*' Esta desproporcin indica, por
una parte, deficiencias de diagnstico y de de
nuncia y, por otra, la existencia de numerosas
infecciones subclnicas.
La edad, el sexo, la profesin, la raza y los
hbitos constituyen factores predisponentes p a
ra la presentacin de las formas progresivas de
m icosis-enferm edad. Es ms frecuente en la
edad media, entre 30 y 60 aos. El sexo m ascu
lino es ms atacado que el femenino; la d ife
rencia vara segn la micosis y las zonas end
micas. En la Argentina, la incidencia en el sexo
masculino en relacin con el femenino es m
xima en la paracoccidioidomicosis (70:1), le si
guen la histoplasmosis (40:1), la coccidioidomicosis (4:1), y la criptococosis (2 : 1 ),
La diferente susceptibilidad segn el sexo
fue atribuida a razones profesionales, pero esta
explicacin resulta poco plausible ya q u e la
proporcin de infectados es aproximadamente
igual en ambos sexos. Mucho ms lgico resul
ta aceptar la existencia de factores hormonales;
al respecto se ha demostrado que los estrge
nos inhiben el desarrollo del P. brasiliensis y
del H. capsulatum, aunque en concentraciones
ms elevadas que las presentes en los tejidos
humanos,'^ Se ha comprobado que en el cito
plasma de la fase filamentosa del P. brasilien
sis existen receptores para estrgenos que im
piden su transformacin a la fase levaduriforme, que los fagocitos provenientes de animales
hembras son ms eficaces,'^' y que los hm ster
hembras son ms resistentes que los machos a
la infeccin por el Blastomyces derm a titid isy
Las tareas rurales, por su m ayor contacto
con la fuente de infeccin, constituyen un fac
tor predisponente, pero cabe destacar la exis
tencia de casos urbanos de histoplasm osis y
criptococosis.
La importancia de la raza ha sido sealada
en la coccidioidomicosis,*^'' ya que los indivi
duos de piel oscura presentan formas disem ina
das con mayor frecuencia; en la histoplasmosis,
por el contrario, las formas pulmonares evoluti
vas son 24 veces ms frecuentes en los blancos
que en los negros,*^* An no han sido confirm a
do que haya una mayor incidencia de la para
coccidioidomicosis entre los eslavos y sajones.
En relacin con los hbitos, cabe destacar
una elevada frecuencia de alcohlicos entre los
pacientes con micosis sistmicas graves.
Ciertas enfermedades preexistentes pueden
actuar favoreciendo la diseminacin de la histoplasm oss o la aparicin de formas m e n n
geas en la criptococosis, como sucede con los
lin fo m a s, la e n fe rm e d a d de H o d g k in y el
SIDA, La criptococosis es la micosis sistmica
asociada al SIDA que se observa con mayor

498

Inmunopatologa

frecuencia. A ctualm ente en el Hospital F. J.

Muiz de la ciudad de Buenos Aires, se inter
nan 90 nuevos casos por ao, en tanto que an
tes de la pandemia slo se observaban 3 o 4 ca
sos en igual lapso. En el mismo nosocomio se
diagnosticaron en 1994, 48 casos de histoplas
mosis progresiva diseminada, de los cuales 40
se asociaron al SIDA. Se ha comprobado que la
administracin de corticoides y drogas citotxi
cas pueden exacerbar m icosis laten tes, por
ejemplo, histoplasmosis, coccidioidomicosis y
criptococosis.'
Aspectos inmunolgicos de las micosis
sistmicas
Las pruebas cutneas; su valor pronstico
y diagnstico
Las pruebas cutneas en las micosis sistmi
cas son realizadas en form a sem ejante a la
reaccin de Mantoux en la tuberculosis. Los
antgenos empleados: histoplasmina, eoccidioidina, paracoccidioidina, se preparan segn tc
nicas estandarizadas que han sido descritas por
diversos a u t o r e s . Recientemente, se ha
insistido en la mayor sensibilidad de los antge
nos obtenidos a partir de la fase parasitaria de
sarrollada in vitro, tanto en C. immitis como en
H. capsulatum y P. brasiliensis?'^-'^^''^'^''^'^'^
La potencia antignica de cada lote debe ser
probada en animales infectados experimental
mente y en humanos cuya capacidad reactiva
sea conocida, ya que se carece por el momento
de mtodos qumicos tiles para tal fin.''^*
Las intraderm orreacciones son ledas a las
24, 48 y 72 horas y su resultado se expresa en
milmetros del rea de induracin. Actualmente
se aconseja realizar una primera lectura entre
las 2 y 6 horas, para excluir cualquier posibili
dad de fenmeno de Arthus que podra falsear
el resultado;'* asimismo, hay casos raros en que
estas pruebas se tornan positivas 4 o 5 das des
pus de su realizacin.''
Estas reacciones de hipersensibilidad retar
dada se hacen presentes entre los 15 y los 40
das siguientes a la infeccin, se mantienen po
sitivas muchos aos, habitualmente toda la vi
da, pero con frecuencia declinan despus de los
60 aos. La reaccin cutnea positiva indica,
por lo tanto, infeccin actual o pasada. Es de
gran utilidad para el estudio de las reas end
micas, pero su valor diagnstico de infeccin
actual se limita a los siguientes casos: 1 ) cuan
do se com prueba en lactantes; 2 ) cuando se
asiste al viraje de la reaccin de negativa a po
sitiva, y 3) cuando aparece en una persona que
no ha habitado anteriormente en zona endmi
ca y que no presenta reacciones fuertem ente
positivas con otros antgenos fngicos.^

Se pueden com probar reacciones cruzadas

entre los diversos agentes causales de micosis
sistmica a causa de la existencia de antgenos
semejantes. Sin embargo, las pruebas son ms
intensas con el antgeno homlogo; por lo tan
to, es aconsejable realizar las intradermorreac
ciones con todos ellos y considerar positivo s
lo a aquel que proporciona la ppula ms ex
tensa. La frecuencia de las reacciones cruzadas
disminuye con el empleo de antgenos diluidos;
por ello se aconseja utilizar la dilucin ptima,
que es la m nim a concentracin del reactivo
que p ro p o rc io n a un elevado p o rc en taje de
pruebas cutneas positivas en sujetos que su
frieron la infeccin y en animales infectados
experimentalmente.
Los estudios histolgicos de las pruebas cu
tneas positivas han demostrado que el infiltra
do est constituido por cmulos de clulas mo
n onu cleares, en esp ecial lin fo cito s, que se
agrupan alrededor de los vasos sanguneos y
los anexos cutneos, tanto en la dermis como
en la hipodermis; se observa, adems, vasodila
tacin y edema. Con la paracoccidioidina''y,
en algunos casos, con la c o c c i d i o i d i n a , s e
comprob eosinofilia.
En las formas evolutivas de las micosis sist
micas, el resultado de las intradermorreaccio
nes tiene gran inters pronstico, pues su nega
tividad es ndice de gravedad y de tendencia a
la diseminacin hematgena.
En la coccidioidomicosis se ha demostrado
que el empleo de diversas diluciones de coccidioidina hace de la reaccin cutnea una prue
ba, en cierta form a cuantitativa, que perm ite
m edir la hipersensibilidad, la cual guarda un
estrecho paralelismo con la capacidad del suje
to para resistir la infeccin.^^'
Se ha podido demostrar que el 30% de las
histoplasmosis*'*' y el 51% de las paracoccidioidomicosis diseminadas graves* presentan
intraderm orreacciones negativas con la dilu
cin ptima del antgeno homlogo. La mayo
ra de estos pacientes viraron hacia la positivi
dad, muchas veces intensa, despus de la cura
cin merced a un tratamiento adecuado.
En los casos asociados al SIDA, en los cua
les este viraje de negativo a positivo es im posi
ble por la ausencia de un nmero adecuado de
clulas TCD^ positivas, debe instituirse un tra
tamiento supresivo para evitar las recadas. Es
ta misma conducta se debera adoptar en otros
enfermos que sean incapaces de recuperar la
positividad de la prueba cutnea especfica.
La inmunidad mediada por clulas
Se han establecido numerosas alteraciones
de la inmunidad mediada por clulas en los en
fermos que padecen micosis sistmicas; la gra

Inmunologa de las micosis

499

vedad de aqullas es proporcional a la severi d o s . S e observa, en las formas graves y di

seminadas, una declinacin de los niveles de
dad de la afeccin.
Las anormalidades comprobadas son las si linfoquinas en respuesta a la interleuquina 2
guientes: 1 ) pruebas cutneas de hipersensibili (IL-2), as como una menor produccin del fac
dad retardadas negativas, tanto con el antgeno tor de necrosis tumoral (FNT) y del interfern-Y
especfico como con otros a los cuales gran (IFN-y), este ltimo es un importante activEidor
parte de la poblacin reacciona positivamente, de los macrfagos^'^ Se piensa que la dism inu
como candidina, PPD y tricofitina;^-*^'"''''*^ 2) cin de clulas CD^ en la sangre circulante es,
ausencia de respuesta cutnea a la fitohemaglu- al menos en parte, debida a que estas clulas
tinina;'^'*-'^' 3) incapacidad para adquirir sensi quedan atrapadas en los granulomas.
Entre las clulas que actan como m ecanis
bilizacin frente al dinitroclorobenzeno;"''''^'* ^'
4) disminucin de la transformacin linfobls- mos defensivos naturales deben destacarse las
tica y captacin de timidina tritiada frente al asesinas naturales (NK). Estas se unen a la pa
antgeno especfico, la candidina y la fitohema- red celular de algunos hongos patgenos por
glutinina;*^-^-"'''* 5) presencia en el plasma de medio de microvellosidades y producen citoliun factor inhibidor de la transformacin blsti sina y perforinas que destruyen las clulas fnca que no est relacionado con los anticuerpos gicas. Estas interacciones han sido particular
esp ecfico s, se tra ta ra de una a.2 globuli- mente bien estudiadas entre las NK y el C. neona;i24,i6i 5 ^ ausencia del factor inhibidor de la formans."'^''
Los macrfagos parecen desempear un pa
migracin de monocitos en tubo capilar (MIF)
frente al antgeno especfico y la candidina;^'* pel relevante en la defensa contra la m icosis.
7) disminucin del porcentaje de linfocitos T Se ha comprobado que los macrfagos del exu
en sangre perifrica, determinado por la tcnica dado peritoneal de ratones inmunizados con H.
capsulatum poseen una fagocitosis mucho ms
de form acin de rosetas
en casos
graves puede haber una inversin de la propor activa que los de animales no inmunes y que
cin de linfocitos T cooperadores CD^supreso- dicha propiedad es mediada por los linfocitos T
res CDg, y 8 ) prolongacin del tiempo de su sensibilizados. Estos actan por m edio de
pervivencia de los injertos cutneos no autlo- algunas citoquinas, particularm ente el IFN -y
gos,- disminucin del numero de linfocitos T que es un potente activador de los maerfagoen el rea paracortical de los ganglios linfticos s 212a Lqj, mononucleares inhiben el desarrollo
del H. capsulatum al provocar alteraciones en
y reduccin del tamao de sus folculos."'
La prdida de funciones de los linfocitos T la sntesis de sus protenas, pero el mecanismo
parece seguir un orden progresivo. Inicialmen ntimo por el cual actan es desconocido.Por
te se pierde la capacidad de sensibilizacin al el contrario, es sabido que los polimorfonuclea
dinitroclorobenzeno; ms tarde se tornan nega res ejercen su accin deletrea sobre estos gr
tivas las pruebas cutneas de hipersensibilidad menes mediante diversos elementos: pH cido,
retardada con antgenos microbianos, en parti lisozima, mieloperoxidasa, fagocitina, histona
cular con el especfico de la micosis que aqueja y otras protenas catinicas. El estudio de la ca
al paciente; luego se comprueba depresin de pacidad fagocitaria y ltica de los leucocitos de
la transformacin linfoblstica frente a la fito- sangre perifrica obtenidos de 17 pacientes con
hemaglutinina, y la ltima funcin en alterarse paracoccidioidomicosis frente al P. hrasiliensis
es la capacidad para rechazar injertos heterlo- y R hodotorula spp., dem ostr que aq u llas
eran adecuadas y que el suero de los enfermos
gos.'*-^-'^^
Algunos pacientes pueden modificar su esta posea opsoninas estim ulantes de dicha fun
do inmunolgico desde una inmunodeficiencia cin.'*-" El estudio de la capacidad fagocitaria y
acentuada a una inmunocompetencia satisfac ltica de los macrfagos y leucocitos polim or
toria por medio del tratamiento adecuado. T o fonucleares de sangre perifrica en pacientes
das las alteraciones de la respuesta celular, tan portadores de formas graves de paracoccidioi
to in vivo como in vitro, son ms acentuadas domicosis e histoplasmosis, ha perm itido ob
con el antgeno especfico'"* y la recuperacin servar que estas funciones estn deterioradas
de la reactividad cutnea frente a ste se asocia durante la progresin activa de la enfermedad y
que se recuperan parcialm ente con el trata
con la remisin de la enfermedad.
Todo parece indicar que el dficit de la inm u miento exitoso de estas micosis."-*
nidad mediada por clulas se debe a varios fac
tores: formacin de com plejos antgeno-anti- La inmunidad humoral,
cuerpo-complemento; exceso de antgeno libre las inmunoglobulinas y las reacciones
que estimula las poblaciones de linfocitos T su serolgicas
presores CDg y aumento de las globulinas a que
Los estudios de la inmunidad humoral han
actan como un factor inhibidor de la transfor
macin blstica de los linfocitos T sensibiliza demostrado que los pacientes con micosis sis-

500

Inmunopatologa

tmicas no exhiben deficiencias en cuanto a la

produccin de anticuerpos y que la realizacin
de pruebas serolgicas presenta un importante
valor diagnstico y pronstico en estas enfer
medades.
Las reacciones serolgicas ms frecuente
mente empleadas son la precipitacin en tubo,
la aglutinacin de partculas de ltex sensibili
zadas con antgenos fngieos, la fijacin de
complemento, la inmunodifusin, la contrain
m unoelectroforesis y las pruebas de ELISA
(enzimoinmunoensayo); el empleo conjunto de
dos o ms de estas tcnicas permite el diagns
tico serolgico de ms del 90% de los procesos
evolutivos.
Los antgenos empleados son diversos: fil
trados del desarrollo en medios lquidos, des
pus de 6 a 9 meses de incubacin esttica" o
de 4 semanas en agitador mecnico,' sobrena
dante de clulas levaduriformes rotas por ultra
sonidos o procedimientos mecnicos de ruptu
r a , U s a d o s de m icelio joven con toluol al
3%,"'* exoantgenos, que son extractos acuosos
de levaduras o hifas sin romper, obtenidos des
pus del contacto de agua destilada con mertiolato de sodio l/1 0.000, durante 24 horas con
las colonias fngicas, o fracciones parcialmen
te purificadas por precipitacin con alcohol,
acetona u otras tcnicas, que consisten por lo
general en polisacridos n i t r o g e n a d o s . E n
realidad, estos preparados son un mosaico del
cual pueden separarse numerosas parcelas por
eleetroforesis, algunas de ellas dotadas de gran
e s p e c i f i c i d a d . P o r ejemplo, de la paracoc
cidioidina pudo purificarse una glucoprotena
de 43kD que ha sido exitosamente empleada en
varias pruebas serolgicas, incluso en una de
unin inmunolgica en gota (dot immunobiding assay) que result muy econmica y efi
caz,220a
De la histoplasmina se han obtenido 2 gluco
protenas de gran especificidad, la M posee
55% de carbohidratos y su PM es de 150 kD,
en tanto que la H pesa 120 kD y contiene 32%
de carbohidratos.
En las prim oinfecciones sintom ticas, las
reacciones de precipitacin en tubo (PT) se tor
nan positivas 4 a 7 das despus del contacto
infectante. Alcanzan su ttulo mximo a las 2 o
3 semanas y se negativizan entre 1 y 5 meses
ms ta rd e .G e n e ra lm e n te no tienen valor pro
nstico pues se tornan negativas en el plazo in
dicado, aun en aquellos casos que evolucionan
hacia la diseminacin.^'*
En la paracoccidioidomicosis la PT es positi
va en el 1 0 0 % de los casos con menos de 1 ao
de evolucin; es la primera reaccin serolgica
en negativizarse despus de la curacin clnica
y la ms precoz en tornarse positiva en las reci
divas.^' Su principal inconveniente lo constitu

ye la difcil lectura a causa del fino precipitadoproducido.

Las reacciones de aglutinacin de partculas
de ltex (AL), sensibilizadas con antgenos fil
trados (histoplasmina y coccidioidina), son ms
sensibles y de lectura ms fcil que la PT. Se
las ha empleado como sustituto de la precipita
cin, pero producen con mayor frecuencia re
sultados falsos positivos.^
Las pruebas de fijacin de com plem ento
(PFC) se positivizan ms tardamente, despus
de. 1 mes o ms del contacto infectante. En las
primoinfecciones leves, la PFC permanece ne
gativa y se torna positiva slo en las moderadas
o graves. En las formas diseminadas, su ttulo
aumenta en proporcin a la severidad de la en
fermedad y cae gradualmente al producirse la
curacin clnica por el tratamiento adecuado,
hasta negativizarse varios meses o un par de
aos despus.^' En general, estos anticuerpos
son persistentes y pueden quedar cicatrices se
rolgicas, con ttulos bajos, en pacientes clni
camente c u r a d o s . E n los casos no controla
dos por el tratamiento, los anticuerpos aumen
tan hasta alcanzar niveles muy elevados y, fi
nalmente, descienden en forma brusca poco an
tes de la muerte.*'*^
La tcnica de esta prueba ha sido estandari
zada, ** y para confeccionar curvas serolgicas
se aconseja su repeticin cada 8 semanas.
En algunas oportunidades, la interpretacin
de los resultados de la PFC es difcil a causa de
la existencia de reacciones cruzadas con antge
nos de otros hongos; tambin se pueden obser
var pruebas positivas en sujetos sanos que han
sido sometidos recientemente a pruebas cut
neas, en especial con histoplasmina.**" En es
tos casos, los ttulos son habitualmente bajos,
1 /8 o 1/16, y casi siempre se los com prueba
con los antgenos de la fase levaduriforme.^
En la p a ra co ccid io id o m ico sis in fa n til la
prueba de fijacin de complemento suele ser
negativa, aun en casos muy graves.
La inmunodifusin en gel de agar (ID) es el
mtodo serolgico ms empleado en las mico
sis a causa de su tcnica sencilla y resultados
especficos;^'*' ha sido estandarizada por la
Oficina Sanitaria Panamericana.
Sus resultados coinciden con los de la PFC,
y el empleo simultneo de ambas reacciones es
aconsejable ya que la ID est dotada de una
mayor especificidad a causa de su menor sensi
bilidad, en tanto que la PFC permite una mejor
cuantificacin. La frecuencia de reacciones
cruzadas con otros antgenos fngieos en la ID
es slo del 1 o
Los sueros de pacientes con histoplasmosis
presentan dos bandas de precipitacin con la
histoplasmina, llamadas H y M cuyas caracte
rsticas fisicoqumicas ya han sido comentadas.

Inmunologa de las micosis

La banda H indica actividad lesiona! y no es in
fluida por la prueba cutnea, en tanto que la M
puede aparecer en el suero de personas sanas
que hayan tenido recientemente una prueba cu
tnea positiva con histoplasmina.^*La paracoccidioidina presenta 3 bandas de
precipitacin con los sueros de enfermos con
paracoccidioidomicosis, una de ellas de reac
ciones cruzadas con la banda M de la histoplasmina.'**"* Como ya sealamos el principal com
ponente antignico es una glucoprotena de 43
kD (gp 43).
La ID ha permitido separar 4 componentes
antignicos en la eoccidioidina, la banda 1 co
rresponde al antgeno que es responsable de la
aglutinacin del ltex y la 2 al que produce la
fijacin del complemento.'"* Pudo demostrarse
que calentando la coccidioidina a 60C durante
30 minutos, se elimina la fraccin 2 responsa
ble de la fijacin de complemento y que tam
bin da resultados positivos frente a IgG espe
cfica en reacciones de inmunodifusin en gel
de agar. E m pleando esta ltim a tcnica con
coccidioidina sin calentar puede ponerse en
evidencia la IgM e s p e c f i c a . S e demostr
que la ID puede ser cuantificada mediante el
empleo de diluciones de suero y que sus ttulos,
aunque inferiores, son proporcionales a los de
la PFC.'3s.'35.i*8
La contrainm unoelectroforesis es una v a
riante de la ID que ha sido empleada en el serodiagnstico de las micosis a causa de la facili
dad que otorga su rpida lectura.^''-'''
Su utilizacin se ha generalizado en los lti
mos aos en virtud de su mayor sensibilidad y
gran e s p e c i f i c i d a d . P u e d e utilizrsela aisla
damente o combinada con la inm unodifusin
secundaria, lo cual permite demostrar la exis
tencia de parcelas antignicas de migracin catdica.-^^^ El agregado de 1% de polietilengli
col 6 . 0 0 0 al gel de corrida torna a esta reaccin
muy s e n s i b l e . L a realizacin de pruebas de
inmunodifusin en gel de agar o contrainm u
noelectroforesis con el empleo de sueros patro
nes positivos o sueros m onoespecficos que
reaccionan contra parcelas antignicas de apa
ricin frecuente, ha dotado a estas tcnicas de
una gran especificidad.
Recientemente se han ensayado nuevas tc
nicas serolgicas dotadas de mayor sensibili
dad, como el ELISA. Tambin en esta micosis
se han ensayado la inmunodifusin radial y la
aglutinacin de partculas de ltex.*'**
El radioinm unoensayo para detectar a n ti
cuerpos antiantgeno M en histoplasmosis ha
sido empleado con xito.*''*
Se necesita an una mayor experiencia para
valorar la utilidad definitiva de estas pruebas.
La inmunodifusin radial y la inmunodifusin
com parativa con antisueros m onoespecficos

501

parecen destinados a tener una amplia aplica

cin en el serodiagnstico de estas micosis.
Los resultados de las pruebas de ELISA y
RIA en las micosis sistmicas son an difciles
de interpretar debido a que su mayor sensibili
dad va en desmedro de su especificidad.
Los resultados de las reacciones serolgicas
en la criptococosis han sido bastante equvocos
a causa de la existencia de un estado de no res
puesta inmunolgica, producido por exceso de
antgeno polisacrido liberado por C. neoform ans.'^' M ediante una com binacin de tres
pruebas se ha conseguido alcanzar el diagnsti
co serolgico del 92% de los casos comproba
dos por cultivos.*'*****-' Para detectar la p resen
cia de anticuerpos circulantes se emplean la in
munofluorescencia indirecta y la aglutinacin
en tubo; la primera es ms sensible y la ltim a
ms especfica. La presencia de polisacrido
capsular en el suero, lquido cefalorraqudeo u
otros fluidos se demuestra por la aglutinacin
de partculas de ltex sensibilizadas con suero
de conejo anticriptococo.*^ Tambin se puede
utilizar con este propsito un ELISA cuyos re
sultados coinciden con los de la aglutinacin
del ltex en ms del 95% de las muestras.
En los casos en los cuales la investigacin de
anticuerpos es negativa y la de polisacrido
capsular positiva, el pronstico es malo; p o r el
contrario, la negativizacin de la prueba del l
tex para polisacrido capsular es ndice de m e
jora. Se han podido demostrar antgenos espe
cficos en el suero y la orina concentrada de en
fermos graves con histoplasmosis y paracocci
dioidomicosis. Para la primera se emplea un ra
dioinmunoensayo con anticuerpos m onoclona
les contra una glucoprotena de la pared del H.
capsulatum, esta reaccin es positiva en el 90%
de los casos asociados al SIDA^^* En la para
coccidioidom icosis se comprob la presencia
de la gp 43 en el suero de enfermos graves, m e
diante el empleo del Western blott.**'>''
Las micosis sistmicas graves muestran alte
raciones del proteinograma, que consisten en
dism inucin de la albm ina y aum entos del
porcentaje de globulinas a expensas de las a ,,
y y-globulinas, en tanto que las 3-globulinas
y la cifra total de protenas sricas se m antie
nen norm ales. Estas alteraciones son p ro p o r
cionales a la gravedad y la extensin de la enferm edad.7'>--**>3.*s>,i38,)58

Los niveles de IgM determinados por medio

de inmunodifusin radial estn elevados en las
primoinfecciones moderadas o graves de histo
plasmosis y su tenor guarda relacin con los t
tulos de la PT y la AL.^^ La positividad de estas
reacciones depende de un anticuerpo especfico
19 S. En un estudio realizado en B rasil por
Mota y Franco" no fue posible demostrar va
lores elevados de IgM en la paracoccidioidomi-

502

Inmunopatologa

cosis y no hubo relacin entre el nivel de esta

inmunoglobulina y la forma clnica presentada
por el paciente. Por lo tanto, el significado de
anticuerpos IgM en esta afeccin necesita ain
ser establecido.
Por el contrario, el anticuerpo responsable de
la ID y la PFC es una IgG; los niveles de esta
inmunoglobulina estn elevados en las formas
crnicas y guardan correlacin con los ttulos
de las re a c c io n e s s e r o l g i c a s m e n c i o n a
d a s . E n las histoplasm osis crnicas,
particularmente las que presentan participacin
pulmonar, hay aumento de la IgA.^^
Aspectos histopatolgicos vinculados
a la reaccin husped-parsito
Los estudios histopatolgicos realizados en
la paracoccidioidomicosis, tanto experimental
como humana, han demostrado que las carac
tersticas del proceso inflamatorio, as como la
morfologa del parsito, estn influidos por el
estado inmunoalrgico del husped.-'**'^^-'-* *
En la fase aguda, cuando an no se ha instala
do la inmunidad adquirida, y en los procesos
evolutivos graves, predominan las lesiones su
purativas y necrticas, y no existe una adecua
da barrera conjuntivo-histiocitaria. En estos
casos, el P. hrasiliensis se m ultiplica lib re
mente y se observa la brotacin mltiple acele
rada (criptoesporulacin) que le confiere el as
pecto tpico de rueda de timn. Por el contra
rio, en las formas crnicas cuando el husped
ofrece una mayor resistencia, predominan los
procesos productivos con formacin de granu
lomas foliculares, de clulas epitelioides y gi
gantes, con los que pueden coexistir reas de
supuracin. Las clulas gigantes y los macr
fagos engloban al hongo y retardan su evolu
cin o lo destruyen: se comprueban en estos
casos formas catenuladas o de brotacin sim
ple y aun parsitos con alteraciones morfolgi
cas visibles y sin brotes. La etapa final de este
proceso es la cicatrizacin fibrosa y, ms rara
mente, la calcificacin.'
Hace poco tiempo se comprob la presencia
de IgG y C3 en los granulomas productivos. Lo
que parece indicar que la formacin de comple
jos antgeno-anticuerpo-compleraento desem
pea un papel im portante en la formacin de
estos granulomas. En realidad el papel desem
peado por las inmunoglobulinas y el comple
mento, as como el de ia inmunidad humoral en
general, ha dado lugar a varias hiptesis. Po
dran cooperar con la destruccin de los hongos
in situ al opsonizar las elulas fngicas y po
dran im pedir el escape de antgenos h acia
afuera de los granulomas.
En la coccidioidom icosis experim ental se
han comprobado las mismas alteraciones infla

matorias en relacin con el estado defensivo

del husped.
El C. immitis form a esporangios grandes,
con endosporos pequeos, am eboides y d is
puestos en una franja de citoplasma perifrico
(esporangio de primoinfeccin), en el seno de
las lesiones supurativas, cuando las defensas
son nulas. A la inversa, cuando se encuentra
dentro de un proceso inflamatorio productivo
con clulas gigantes y macrfagos, el esporan
gio es ms pequeo, posee una pared celular
ms gruesa, y todo su interior se encuentra ocu
pado por endosporas menos numerosos pero de
mayor tamao (esporangio qustico); tambin
puede verse una corona de radiaciones acidfilas que rodea el esporangio y cuya aparicin
coincide con la de los anticuerpos circulan
tes.
En la histoplasmosis, los casos graves con
escasas defensas presentan una hiperplasia histiocitaria simple con numerosos parsitos o hay
necrosis caseosa masiva. Como en las afeccio
nes anteriores, en los procesos ms defensivos
aparece el granuloma tuberculoide, disminuye
el nmero de hongos y hay una tendencia a la
cicatrizacin fibrosa.'-'^'^
Inmungenos vacunantes e inmunoterapia
en las micosis sistmicas
No se dispone en la actualidad de vacunas
para uso humano, pero todo parece indicar que
se contar con ellas en un futuro no muy leja
no. En la coccidioidomicosis se han ensayado
diversos tipos de inmungenos: los esporangios
muertos poseen un poder protector satisfactorio.^- Recientemente se ha comprobado que los
ribosomas de la fase levaduriforme del H. cap
sulatum aumentan la tasa de sobrevida en los
ratones som etidos a la infeccin experim en
tal.'*'
Los efectos del factor de transferencia obte
nido de leucocitos de sujetos coccidioidina-positivos sobre las pruebas de hipersensibilidad
retardada, realizadas tanto in vivo como in vi
tro, demostraron que es capaz de transmitir el
estado de sensibilizacin a sujetos vrgenes de
i n f e c c i n . H echos sim ilares fueron
comprobados en histoplasm osis y paracocci
dioidomicosis
Una revisin de los efectos de la aphcacin
del factor de transferencia en la coccidioidomi
cosis disem inada-" mostr que, sobre 40 pa
cientes tratados, 80% recuper la capacidad de
producir linfoquininas, 75% adquiri respues
tas blastognicas norm ales de sus linfocitos,
50% present pruebas cutneas que viraron ha
cia la positividad y 60% exhibi mejoras clni
cas. El factor de transferencia dej de producir
se por el peligro de transmitir el HIV.

Inmunologa de las micosis

La aplicacin de inmunoestimulantes como
el levamizol ha demostrado que puede recupe
rarse la capacidad reactiva de los linfocitos T
tanto in vivo como in vitro, pero su efecto so
bre la evolucin de la enfermedad necesita an
ms pruebas.
El mayor inters se ha centrado en el IFN-y
que ha demostrado su utilidad en el tratam ien
to de varias infecciones debidas a microorga
nismos intracelulares con patogenia y m eca
nismos defensivos semejantes a los de las m i
cosis sistmicas endmicas. Su eficacia en va
rias micosis experim entales ha sido com pro
bada, pero resta an por establecer en forma
definitiva su accin en las micosis humanas,
as como la dosis y la frecuencia de su aplicaC i0 n .1 4 ii.2 1 2 a

La inmunoterapia de las micosis sistmicas

constituye pues un promisorio campo de inves
tigacin clnica que debe ser ms explorado.
Conclusiones
De lo expuesto se deduce que el principal
mecanismo defensivo contra las micosis sist
micas lo constituye una adecuada inmunidad
celular, ya que la depresin de sta condiciona
la aparicin de m icosis-enferm edad. Por el
contrario, la inmunidad humoral no parece con
tribuir en forma clara como mecanismo defen
sivo, pues los pacientes portadores de formas
clnicas severas presentan niveles normales o
aumentados de inmunoglobulinas y la produc
cin de anticuerpos se encuentra exaltada; por
otra parte, los sujetos con agam m aglobuline
mia pero con inmunidad celular normal no es
tn ms predispuestos que los normales a pade
cer micosis diseminadas.
La depresin de los linfocitos T puede pro
ducirse por diversos factores, en especial por la
carga antignica excesiva en primoinfecciones
severas; causas individuales como edad, sexo,
profesin, raza, condiciones socioeconmicas y
hbitos del paciente parecen tambin influir.
Ciertas enfermedades que producen depresin
de la inmunidad celular, como los linfomas, la
enfermedad de Hodgkin y el SIDA, favorecen
la aparicin de micosis diseminadas graves. De
la misma forma actan los corticoides, citost
ticos y las radiaciones.
Pese al avance de los conocimientos inm u
nolgicos, se ignora la razn por la cual se pro
duce la falla de los mecanismos defensivos s
lo en uno de cada 1 .0 0 0 infectados.
El sistem a de linfocitos tim odependientes
acta sensibilizando a los macrfagos y tornn
dolos ms aptos para la fagocitosis; stos, a su
vez, interfieren en la sntesis de protenas por
parte del parsito, retardan su crecimiento y fi
nalmente lo destruyen.

503

El pronstico de las micosis sistmicas p u e

de establecerse sobre la base de cuatro elem en
tos de juicio: 1 ) histopatologa de las lesiones;
2 ) pruebas cutneas con antgeno homlogo y
otros antgenos microbianos de uso comn, co
mo PPD y candidina; 3) reacciones serolgicas,
y 4) proteinograma. En las formas graves, la
histopatologa muestra predominio de los p ro
cesos exudativo-necrticos con abundantes p a
rsitos, las pruebas cutneas son negativas, las
reacciones serolgicas se presentan positivas
con ttulos elevados y el proteinograma m ues
tra aumento de la proporcin de globulinas, a ,,
y y. Lo inverso sucede en las formas ms b e
nignas.
Resulta interesante consignar que estas alte
raciones dependen, sobre todo, de un exceso de
antgeno, as como el atrapado de las clulas
CD^ en los granulomas epitelioides, ya que es
posible que el sujeto, al ser tratado adecuada
mente, retorne a una inmunocompetencia n o r
mal con la disminucin de los hongos parsitos.
Seguramente la utilizacin de vacunas en la
profilaxis de esas afecciones, y el empleo de
inmunoterapia para favorecer el control de las
formas diseminadas, son las metas que ofrecen
para el futuro los estudios inmunolgicos de las
micosis sistmicas.
IL MICOSIS OPORTUNISTAS
Se conocen con el nombre de micosis o por
tunistas las afecciones producidas por hongos
que se comportan como saprfitos o com ensa
les del hombre y forman parte de su flora n o r
mal en el intestino, boca o rbol traqueobronquial o que integran la flora m ictiea del ai
r e . E s t o s hongos aprovechan las oportunida
des que les ofrece el husped al disminuir su
capacidad defensiva, para invadir los tejidos y
producir alteraciones patolgicas que pueden
llegar a provocar la muerte.
Esta definicin lleva implcitos los siguien
tes conceptos; 1 ) los hongos productores de m i
cosis oportunistas poseen una amplia distribu
cin en la naturaleza y pueden ser cultivados
frecuentem ente de materiales de personas sa
nas; 2 ) su aislam iento no im plica de p o r s
diagnstico de enferm edad m ictiea, y 3) la
disminucin de las defensas del husped, que
se transform a prcticam ente en un medio de
cultivo, y no el aumento de la virulencia del
microorganismo constituye la causa principal
que determina la aparicin de la enfermedad.'*
Las micosis oportunistas presentan caracte
rsticas que las diferencian de las micosis sist
micas producidas por hongos patgenos prim i
tivos; son cosmopolitas. La edad, el sexo y la
profesin no constituyen causas predisponentes

504

Inmunopatologa

de importancia; no existe un estado de micosisinfeccin sin enfermedad, y sus agentes causa

les son hongos monomorfos que poseen carac
teres semejantes en Los cultivos y en los tejidos
parasitarios.'3'
Los factores predisponentes ms frecuentes
son: diabetes, acidosis m etablica (urm ica,
diabtica, etc.), linfomas, leucemias, agranuloeitosis, SIDA, anem ias graves, tratam ientos
con antibiticos antibacterianos, corticoides,
inm unosupresores, c ito sttico s y rad iacio 26 ,1 35 ,17 4

Las m icosis oportunistas de presentacin

ms comn son: candidiasis, aspergillosis y
mucormicosis (cigomicosis);^' mucho menos
habituales son las micosis producidas por Can
dida glahrata'''-''^^''^'^, Nocardia asteroides^'
Trichosporon beigelii,'^'^\ Fusarium spp., Geotrichum candidium'^^^-'^''' y varias especies de
hongos negros.
Slo nos referiremos a las tres primeras por
ser las de mayor importancia y las mejor estu
diadas.
Micosis oportunistas ms comunes
Candidiasis
Los hongos del gnero Candida son comen
sales habituales de la superficie de la piel y las
mucosas. La especie ms patgena, C. albicans,
es habitante frecuente de las mucosas del hom
bre sano. Ha sido cultivado de las secreciones
de sujetos normales, en la boca y el intestino
(20 a 50%), en la vagina de la mujer no gestante
(10 a 17%) y de las embarazadas (25 a 34%). Ei
simple hecho de tomar antibiticos eleva el n
mero de portadoras vaginales de C. albicans de
10 a 34%."''^^ Las otras especies de! gnero,
como C. tropicalis y C. parapsilosis, son culti
vadas a partir de piel y uas sanas.'**
Como consecuencia de causas predisponen
tes locales, como humedad, maceracin y tem
peratura prxima a los 37C, estos hongos son
capaces de producir micosis superficiales como
el muguet, estomatitis crnicas atrficas o hi
pertrficas del adulto por el uso de prtesis
dentarias, boqueras, intertrigos de grandes y
pequeos pliegues cutneos, onixis con perionixis, onicolisis, vulvovaginitis, etc.
A lgunas causas de orden general pueden
tambin facilitar la aparicin de estos procesos;
en primer trmino la diabetes subclnica, el uso
de anticonceptivos, de antibiticos de amplio
espectro y de dosis moderadas de corticoides.
En estos casos, y a pesar de las causas predis
ponentes generales mencionadas, el husped no
es un inmunodeficiente, tiende a limitar su in
feccin y responde al tratam iento local satis
factoriamente.

Tanto en los individuos sanos como en los

que presentan candidiasis superficiales, estn
intactos los mecanismos defensivos que perm i
ten confinar las inspecciones producidas por
estos hongos a la superficie de los tegumentos.
En tal sentido, ha sido demostrado un factor
anticndida en el suero humano normal, cuyo
tenor es escaso o nulo en los pacientes afecta
dos por linfomas, leucemias o neoplasias.'**^-'''^
La transferrina,'' y en particular la relacin
entre el hierro plasmtico y ia transferrina li
bre,^'* desempean un importante papel defensi
vo. Shiraishi y col. demostraron que la acti
vidad anticndida de la transferrina est rela
cionada a su capacidad de unirse al hierro no
saturado y es estimulada por un factor srico.
Se consideran adems indispensables una
buena formacin en cantidad y calidad de in
munoglobulinas, tanto sricas como secreto
rias, una adecuada respuesta inflam atoria, un
sistema de inmunidad celular ntegro, la pre
sencia de factores quim iotcticos en el suero
(fracciones del complemento C3 y C4), opsoni
zacin satisfactoria y buena capacidad candicida de los polimorfonucleares neutrfilos''-'** y
los macrfagos.* Ms recientemente se ha des
tacado el papel desempeado por las citoquinas
producidas por las clulas CD^ en respuesta a
la Lj, estas son especialmente el F N T -a y el
IFN -7 , el ltimo un poderoso estimulante de la
actividad fungicida de los m acrfagos y los
neutrfilos.' 22
Una de las afecciones de este grupo que ha
sido objeto de numerosos y detenidos estudios
inmunolgicos es la candidiasis mucocutnea
crnica. El granuloma candidisico fue la pri
mera forma clnica reconocida de esta enferme
dad.'' Su aspecto clnico difiere del resto de las
candidiasis cutaneomucosas ya que las lesiones
se presentan como ppulas vascularizadas, cu
biertas de gruesas escamocostras ubicadas en
las partes salientes del cuerpo (uas, cuero ca
belludo, regin frontal, pmulos, etc.). Los pa
cientes son habitualmente nios, con diversos
defectos inmunolgicos y la muerte se produce
como consecuencia de infecciones sobreagregadas.
Las otras candidiasis mucocutneas crnicas
predominan tambin en la infancia, las lesiones
son extensas, miltiples, de curso crnico y res
ponden pobremente a los tratamientos locales.
Su aspecto clnico es idntico al de una candidiasis comn en cada una de las localizaciones,
excepto por su persistencia, extensin y falta
de respuesta al tratamiento,*'^ Se locahza en las
mucosas de boca, faringe, laringe y vagina, en
los pliegues cutneos y en las uas; no hay ata
que visceral, ni se produce sepsis. Las candi
diasis mucocutneas crnicas han sido dividi
das en los siguientes grupos,"

Inmunologa de las micosis

C a n d id ia s is m u c o c u t n e a c r n ic a
ASOCIADA A INMUNODEFICIENCIAS

1. A gam m aglobulinem ia de tipo suizo; es

una alteracin hereditaria, ligada al cromosoma
X, de tipo autosmico recesivo. Presenta defec
tos de la inmunidad celular y ausencia de for
macin de inm unoglobulinas. Los pacientes
mueren muy pronto presa de infecciones seve
ras.
2. Sndrome de Di George; falta de form a
cin del 3' arco branquial con agenesia dei ti
mo y las paratiroides. Se producen signos de
ausencia de inmunidad celular e hipoparatiroidismo.
3. Sndrom e de N ezelof-A llibone; es una
displasia tmica hereditaria con carcter autos
mico recesivo.
4. Enferm edad granulom atosa crnica; es
una afeccin hereditaria ligada al cromosoma
X, se presenta con carcter autosmico recesivo
y se traduce en defectos funcionales de los leu
cocitos polimorfonucleares.^'* ( Para ms deta
lles vase cap. 23.)
Podran incluirse aqu a los pacientes con
SIDA, que presentan con frecuencia candidiasis
orales y esofgicas muy severas, recidivantes y
que retroceden lentam ente con antimieticos.
Igualmente ha podido comprobarse que las can
didiasis vaginal recurrente, afeccin muy co
mn entre la menarca y la menopausia y que
consiste en al menos cuatro episodios documen
tados de candidiasis vaginal por ao, es debida
a una alteracin de la inmunidad mediada por
clulas. Esta parece consistir en una deficiente
capacidad fagocitaria y ltica de los macrfagos
de sangre perifrica producida por la formacin
insuficiente de IFN -a en las clulas CD^.*"

C a n d id ia s is m u c o c u t n e a c r n ic a ,
COMO e n f e r m e d a d PREDOMINANTE

1. C andidiasis m ucocutnea crnica fam i

liar; afecta a ambos sexos, predominan las m a
nifestaciones orales y ungueales, y se encuen
tran alteraciones de la inmunidad celular.
2. Candidiasis mucocutnea crnica difusa;
presenta las tpicas alteraciones del granuloma
candidisico; los pacientes padecen con fre
cuencia infecciones por otros grmenes tales
como tias por Microsporum catiLs y procesos
pigenos de las vas areas superiores y del o
do.
3. Sndrome endocrino-monilisico; es una
afeccin hereditaria con carcter autosmico
recesivo y los defectos endocrinos son hipoparatiroidism o, hipotiroidism o e hipocorticalismo, que se presentan ya sea en forma aislada o
en conjunto.

505

4.
Candidiasis mucocutnea crnica de p re
sentacin tarda; son los casos que aparecen
despus de los 35 aos; ias causas predisponen
tes son diabetes, corticoterapia, inm unosupre
sores o tumores malignos. Se ha destacado par
ticularmente su asociacin con timomas.^^'* E s
tos enfermos no presentan una falla de la inm u
nidad celular selectiva sino global y se co m
prueba con frecuencia la presencia de autoanti
cuerpos.
En la mayor parte de los casos de candidiasis
mucocutnea crnica, la iniciacin se produce
antes de los 20 aos. Los enfermos presentan
diversas alteraciones de la inmunidad celular,
pero la formacin de inmunoglobulinas es nor
mal; es comn la aparicin de infecciones bac
terianas del rbol traqueobronquial, displasias
dentarias, enfermedad poliqustica del pulmn,
esteatorrea, hepatitis crnica, queratoconjuntivitis, defectos ectodrmicos diversos, endocrinopatas y la presencia de autoanticuerpos, en
particular factor reumatoideo.*^ Cn frecuencia
la muerte se produce antes de los 30 aos, y si
bien se consiguen remisiones importantes con
la aplicacin de anfotericina B por va venosa y
la 5-fluorocitosina o el ketoconazol p o r va
oral, las recidivas son muy comunes y las cura
ciones definitivas son raras.
Los defectos inmunolgicos deben ser per
fectamente diagnosticados a fin de proporcio
nar al paciente la teraputica sustitutiva ade
cuada. Para ello se debe seguir el p lan que
enunciam os a continuacin; 1) pruebas cut
neas con candidina, PPD, estreptoquinasa-estreptodornasa (Varidasa), antgeno de saram
pin e histoplasmina;^^-^^^''^^ 2) prueba de sen
sibilidad al dinitroclorobenceno; 3) recuento de
linfocitos perifricos (nmero total) y porcenta
je de linfocitos T determinado por el m todo de
las rosetas E,^^ as como de las subpoblaciones
de linfocitos T por inm unofluorescencia con
anticuerpos monoclonales CD^ y CD^; 4) inhi
bicin de la migracin de macrfagos en tubo
capilar frente a candidina (MIF); 5) prueba de
transformacin linfoblstica con timidina mar
cada
frente a fitohemaglutinina, candidina y
PPD, y 6) estudio de la funcin fagocitaria y
candicida de los leucocitos polimorfonucleares
y m a c r f a g o s . R e s p e c t o a estos ltimos
hay que estudiar su nmero total, movilidad en
cmara de Rebuck, fagocitosis de partculas de
ltex, Staphylococcus aureus y Candida alhicans, reduccin del nitroazultetrazolium, efecto
candicida y quim iotaxis. Los defectos de las
enzimas intracelulares, como la mieloperoxida
sa, pueden producir candidiasis crnica.
La mayor parte de los defectos inmunolgi
cos encontratlos en 26 casos de candidiasis mu
cocutnea crnica^^^ se ajusta a cuatro patrones

Inmunopatologa
fundam entales: tipo I, buena transform acin
linfoblstica, pruebas cutneas negativas y au
sencia de MIF; tipo II, aceptable secrecin de
MIF in vitro por parte de los linfocitos del pa
ciente, pero pruebas cutneas negativas posi
blemente por una falla de los macrfagos y co
mo consecuencia del sistema amplificador que
hace posible la visualizacin in vivo de la reac
cin; tipo III, el suero de los pacientes posee un
factor inhibidor de la transformacin blstica,
en especial para cndidas, las pruebas de trans
form acin linfoblstica y M IF son negativas
as como las intradermorreacciones con candi
dina, y pueden ser positivas las practicadas con
otros antgenos; tipo IV, sin dficit de su inmu
nidad celular deteetable. En la enfermedad que
nos ocupa se han sealado xitos teraputicos
con tratamientos sustitutivos como transfusin
de leucocitos con antgenos de histocompatibi
lidad comunes entre el dador y el receptor,^^2
aplicacin del factor de t r a n s f e r e n c i a * ' y
trasplante de timo.* Se prefieren los dos prim e
ros por ser habitualmente mejor aceptados por
el receptor. Estos tratamientos han conseguido
remisiones prolongadas de 5 aos o ms, im po
sibles de obtener con drogas antimicticas.^^^
Aunque las alteraciones de la inmunidad hu
moral son menos frecuentes en la candidiasis
mucocutnea crnica, no se debe descuidar su
estudio. Es aconsejable efectuar un proteino
grama electrofortico, dosaje de inmunoglobu
hnas por inmunodifusin radial y dosaje de an
ticuerpos especficos por inmunofluorescencia
i n d i r e c t a . C o n esta ltima tcnica se ha podi
do demostrar que, por lo general, los enfermos
portadores de este tipo de candidiasis presentan
aumento del ttulo de anticuerpos especficos;
los ligados a la IgM estn incrementados du
rante la fase aguda seudomembranosa, los vin
culados a la IgA, en las formas crnicas hiper
trficas, y los relacionados con la IgG, en cual
quiera de las form as clnicas de candidiasis
mucocutnea.'^'
La frecuencia de las candidiasis diseminadas
graves, como sepsis, endocarditis, meningoencefalitis e infecciones urinarias altas, aument
desde la aplicacin de los antibiticos de am
plio espectro, citostticos y corticoides; otro
factor predisponente ha sido la ciruga cardio
vascular, particularm ente las operaciones de
vlvulas. Con todo, su aparicin contina sien
do espordica, pero su pronstico es muy serio
ya que, con frecuencia, conducen a la muerte
sin tratamiento a d e c u a d o . La puerta de en
trada suele ser el aparato digestivo o directa
mente el sistema venoso perifrico, como suce
de en los sujetos canalizados y en los toxicmanos. Se considera que para que se produzca
sepsis es necesaria la presencia de un dficit de
ios mecanismos defensivos pues, aun en casos

de trombosis venosas colonizadas por cndi

das, no se produce la septicemia si el estado inmunitario del enfermo es normal. Las afeccio
nes del grupo linfomas-leucemias,'* la toxico
mana (morfina o herona) y las causas favore
cedoras mencionadas anteriormente alteran los
mecanismos defensivos contra Candida.
Los estudios serolgicos han sido de notable
valor como elemento auxiliar de diagnstico en
las c a n d i d i a s i s d i s e m i n a d a s . 3 5 . > i s . i , i 7 9 .2o s . 2 w ,2 1 5
La reaccin de h em o ag lu tin aci n p asiv a
puede dar resultados positivos en casi todos los
sujetos adultos normales y es negativa en el re
cin nacido o en personas con defectos de la in
munidad humoral; los anticuerpos que inter
vienen son del tipo IgM. Las pruebas de inm u
nofluorescencia indirecta es positiva en un n
mero apreciable de portadores sanos de candi
da o en pacientes con micosis superficiales, pe
ro sus ttulos se elevan por encima de 1:1.280
en los casos de sepsis o endocarditis.'"
La aglutinacin en tubo presenta resultados
semejantes a los de la inmunofluorescencia y
se considera que los ttulos superiores a 1:160
representan un ndice de diseminacin; en estos
pacientes el anticuerpo producido es de tipo
IgG.2>
Las pruebas de inm unodifusin en gel de
agar y de fijacin de complemento, que utilizan
como antgenos el sobrenadante de seudomicelios rotos, proporcionan resultados positivos
slo en pacientes con candidiasis visceral o sistmiea que no presenten alteraciones de la in
munidad humoral primitiva o producida por el
em pleo de c o rtico id e s, in m u n o su p reso res,
gtc.'.'79

Tambin se han observado reacciones dbil

m ente positivas en el granulom a candidisico.60.215 En la aetuahdad se considera que la es
pecificidad de estas reacciones para el diagns
tico de las candidiasis sistmicas es del 90%.^
El empleo simultneo de la contrainmunoelec
troforesis y eoncavalina A, que excluye las fal
sas reacciones producidas por los polisacridos
de la pared celular, aumenta el valor diagnsti
co de las pruebas serolgicas en las candidiasis
profundas.*-^"*
Las principales causas de error son: 1) prue
bas falsas negativas por incapacidad para for
mar anticuerpos en los inmunodeficientes o en
los estadios muy tempranos de la afeccin, an
tes de que ellos aparezcmi; 2) reacciones falsas
positivas en sujetos con canalizaciones venosas
infectadas por cndida y con reiteradas fungemias, pero sin sepsis ni metstasis infecciosas
viscerales. La electrosinresis es un sustituto de
la inmunodiisin que permite obtener resulta
dos en 2 horas-^ '^ y posee mayor sensibilidad.
Todo parece indicar que gran parte de los su
jetos normales posee anticuerpos naturales an-

Inmunologa de las micosis

licndida que son del tipo IgM y que la gran
produccin de anticuerpos observada en las
candidiasis sistmicas depende de la acelerada
sntesis de IgG especfica."*
En ciertas circunstancias las pruebas serol
gicas en busca de anticuerpos resultan poco efi
caces, stas son; las etapas muy tempranas de
la infeccin, en pacientes inmunocomprometidos o cuando las micosis son producidas por
agentes endgenos contra los cuales existe,
normalmente, una determinada produccin de
anticuerpos. En las candidiasis estas circuns
tancias se producen con cierta frecuencia obli
gando a la bsqueda de antgenos especficos
en los fluidos orgnicos (suero y orina) como
reemplazante de las pruebas serolgicas clsi
cas. Se han detectado galactomananos y enolasa como antgenos dominantes en los fluidos
orgnicos. Las pruebas ms utilizadas son las
aglutinacin de partculas de ltex sensibiliza
das con anticuerpos especficos. Existen actual
mente dos equipos com erciales, el PastorexCandida'^ con anticuerpo monoclonal antimanano y el Cand-Tec, con anticuerpos policlonales de conejo. La sensibilidad de estas reaccio
nes es del 47 al 52% y su especificidad es muy
elevada. La bsqueda de enolasa posee una
sensibilidad mayor, cercana al
El
mayor problema son los falsos negativos, origi
nados en el hecho que, tanto la antigenemia co
mo la antigenuria, son transitorias en las candi
diasis sistm icas. Tambin se ha utilizado la
determinacin de los niveles sanguneos de Darabinitol, como una evidencia indirecta de
candidiasis invasiva. R equiere el em pleo de
crom atografa gas-quido y debe tenerse en
cuenta, especialm ente, la relacin arabinitol/
creatinina, sta aumenta en las candidiasis sis
tmicas y disminuye con el tratamiento. El va
lor definitivo de estos dosajes necesita an ser
establecido.
Aspergilosis
La mayor parte de los autores coinciden en
clasificar las aspergilosis broncopulmonares en
tres grupos; alrgicas, intracavitarias e invasiVas.26.188
Aun cuando las esporas de ios hongos del
gnero Aspergillus forman parte de la flora del
aire, y los hombres de todas partes del mundo
inhalan diariamente miles de ellos, no contraen
la enfermedad salvo en circunstancias especia
les. Algunos sujetos atpicos pueden presentar
la afeccin de tipo alrgica por inhalacin rei
terada de esporas, en particular de la especie A.
fumigatus.
Cuando se presenta la forma asmtica, parti
cularmente en los casos crnicos, adems de
las crisis disneicas peridicas, suelen aparecer

507

lesiones radiolgicas de fibrosis pulmonar e in

filtrados transitorios con predominio en ambos
vrtices. Son frecuentes, adems, febrcula in
termitente, cefaleas, estornudos, tos y eosinofi
lia, tanto sangunea como en la expectoracin.
El hongo se detecta reiteradamente en el esputo
y estos pacientes poseen anticuerpos especfi
cos de tip o IgE, d em o strab les m ed ia n te la
transmisin pasiva de la sensibilidad (fenm e
no P-K), empleando como receptores a seres
humanos o a p r i m a t e s , o por radioinmunoen
sayo,
Se ha podido demostrar que la presencia de
esporas de A. fumigatus en las vas areas dei
hombre es un potente estmulo para la produc
cin de IgE especfica e inespecfica.'''2.
El dosaje de IgE posee un valor pronstico
pues su elevacin permite anticipar la aparicin
de las crisis asmticas.
Las aspergilosis broncopulmonar alrgica o
bronquitis mucomembranosa es otra de las for
mas clnicas que presentan los sujetos atpicos.
Se caracteriza por crisis de asma, neumonitis o
atelectasias migratrices y recurrentes, aparecen
tapones o moldes bronquiales, expectoracin
purulenta, a veces hem optoica, y eosinofilia
sangunea. El examen del esputo muestra cris
tales de Charcot-Leyden, espirales de Curshm an, eosinfilos y filam entos del A sp ero illusf'^^
Esta forma clnica presenta simultneamente
dos tipos de anticuerpos, los precipitantes del
tipo IgG y los responsables del fenmeno P-K,
a los extractos de A. fum igatus, que son el tipo
lgE.S7.205
Mediante la inoculacin por va venosa del
suero no calentado de paciente con aspergilosis
alrgica se ha conseguido hipersensibilizar pa
sivamente a primates, obteniendo luego la re
produccin de la crisis asmtica al hacerles in
halar esporas del hongo. Este anticuerpo reagnico es menos especfico que el precipitante,
presenta reacciones cruzadas entre los hongos
del gnero Aspergillus, es termolbil y deja de
producirse el fenmeno P-K cuando el suero es
tratado con anticuerpos anti-IgE.^
El tenor de IgE en el suero de estos pacientes
est aumentado considerablemente. Esta altera
cin tiene valor diagnstico, pues estara rela
cionada con el estado atpico de los enfermos,
la produccin de reacciones cutneas de tipo
inmediato hacia los antgenos del hongo, la eo
sinofilia y el b ro n co sp asm o .'2 En las crisis
agudas de esta afeccin, el nivel srico de IgE
llega a 6-30 fig m f '.'
Los anticuerpos precipitantes del tip o IgG
son ms especficos, termoestables, pueden de
m ostrarse por pruebas de inm unodifusin en
gel de agar, contrainmunoelectroforesis y fija
cin de complemento, y seran los que deterrni-

508

Inmunopatologa

nan la aparicin de infiltrados pulm onares y

reacciones cutneas que se tornan positivas en
tre las 6 y 12 horas despus de haber inyectado
el a n t g e n o . E n las dos formas clnicas de aspergilosis alrgica es posible demostrar la exis
tencia de hipersensibilidad mediante la inocula
cin intradrmica de antgenos de A. fum igato';'*se observa una reaccin de tipo inmediata
y, en oportunidades, otra ms demorada que se
hace evidente, como ya fue sealado, entre las 6
y 12 horas de la inyeccin. Esta ltima reaccin
slo se presenta en sujetos con abundantes anti
cuerpos precipitantes, e histopatolgicamente es
idntica a un fenmeno de Arthus.
Se realizan tambin pruebas de sensibilidad
bronquial, nebulizando extractos liofilizados de
A. fumigatus; dicho estmulo produce en el en
fermo una marcada disminucin del volumen
respiratorio mximo.
En las formas intracavitarias, los hongos del
gnero Aspergilus desarrollan en el interior de
una cavidad preform ada, sea sta bronquial,
pulmonar o pleural, formando una masa fngiea, a veces en forma de bola, que ocupa total o
parcialmente su luz y provoca una reaccin in
flamatoria pericavitaria, pero el hongo no inva
de el parnquima pulmonar vecino. La mayor
parte de las cavidades preformadas correspon
den a tuberculosis curadas y en menor propor
cin a bronquiectasias, quistes congnitos, mi
cosis pulmonares,
Los enfermos presentan tos con expectoracin
mucopuruenta y hemoptisis, a veces tan intensa
que conduce a la muerte por hipovolemia.
Las alteraciones clnicas son ocasionadas por
la liberacin de diversas toxinas que posee el
A.spergiHus fum igatus, unas obtenidas de ex
tractos endocelulares y otras, de productos de
secrecin del micelio. Dichas sustancias tienen
efectos citotxicos, hemohlicos, fibrinolticos e
inactivadores del complemento.
Gran cantidad de antgenos de la masa fngica pasan la pared cavitaria y provocan la for
macin de anticuerpos especficos. Las reac
ciones serolgicas practicadas con esos antge
nos dan resultados intensam ente positivos en
pacientes afectados por esta forma clnica y su
realizacin reviste un gran inters para el diag
nstico y el control de la curacin del proce8,38,149

Las pruebas serolgicas que se emplearon

son las siguientes: inmunoelectroforesis en gel
de a g a r o s a , inmunodifusin en gel
de a g a r , f i j a c i n de c o mp l eme n t o , 8 9 ,1 4 3 ,149,I7,22.S contrainmunoelectToforesis,'*'^-^''
precipitacin en tubo con dosaje de protenas
precipitadas,^' inm unofluorescencia indirecta^36.78,2i7 aglutinacin de partculas de ltex
sensibilizadas con glucom ananos de la pared
celular del Aspergillus,^^^-'^''^ y ELISA. Los ant

genos utilizados han sido: celulares, obtenidos

del sobrenadante de miceho roto, y metablicos, constituidos por el filtrado de desarrollo en
medios lcjuidos o fracciones ricas en polisac
ridos, parcialm ente purificados por precipita
cin con acetona de dichos filtrados.
La realizacin sistemtica de las pruebas se
rolgicas ha perm itido extraer las siguientes
conclusiones: 1) ms del 95% de los pacientes
eon aspergilosis intracavitaria presenta an ti
cuerpos precipitantes contra una o varias parce
las antignicas del A. fum igatus, detectables
por las pruebas de inmunodifusin, inm unoe
lectroforesis o contrainmunoelectroforesis;'''^"^''
2) estas reacciones son negativas en los contro
les normales as como en los sujetos afectados
por otras micosis profundas; su especificidad
es tan estricta que presenta resultados negcitivos en pacientes eon aspergi lomas producidos
por otras especies de Aspergilus, haciendo ne
cesario el empleo de una batera de antgenos
que incluyan A. niger, A. flavus, A. nidulans y
A. terreus;^^ 3) estas pruebas presentan como
causa de error la precipitacin de una protena
C existente en el contenido celular de los hon
gos del gnero Aspergilus; estas falsas reac
ciones se eliminan tratando las placas de inmu
nodifusin con una solucin estabilizada de ci
trato de sodio pH 8,2;'* 4) la aparicin de 3 o
ms bandas de precipitacin en el inmunoeleetroforetograma en gel de agarosa permite afir
mar el diagnstico de aspergilosis pulm onar
activa;^^ 5) se ha establecido que uno de estos
arcos tiene actividad catalsica y otro quimiotrpsica, su demostracin posee un valor diag
nstico casi a b s o l u t o ; 6) existe una evidente
relacin entre los resultados de las pruebas de
inmunodifusin en medios gelificados y los de
ia reaccin de fijacin de complemento, con la
ventaja para esta ltima de ser ms fcil su
cuantificacin; 7) las pruebas de inm unofluo
rescencia indirecta y de aglutinacin de part
culas de ltex no estn dotadas de la especifici
dad necesaria para tener valor diagnstico; 8)
la extirpacin quirrgica de la cavidad afectada
o, ms raras veces, la muerte espontnea del
aspergiloma, va seguida de la prdida progre.siva de anticuerpos y, finalmente, la negativizacin de las reacciones serolgicas; si por el
contrario stas continan positivas despus de
6 meses del acto quirrgico, es ndice de infec
cin residual en los bronquios vecinos,'* y 9)
los anticuerpos que intervienen en las pruebas
de precipitacin en medios gelificados son del
tipo lg G .'^-22
Los extractos endocelulares de los hongos de
diversas especies del gnero Aspergilus produ
cen inactivacin del complemento actuando so
bre C3;^" en el caso de A. fum igatus se ha podi
do observar descensos de la complementemia

Inmunologa de las micosis

in vivo, utilizando cobayos; este efecto va
acompaado de una accin citotxica y hemo
l t i c a . A la inversa de lo que se podr esperar,
los pacientes eon aspergilosis intracavitaria
presentan complementemia normal o elevada,
en general tanto ms alta cuanto ms extensa
sea la infeccin y cuanto ms prximo est el
paciente a sufrir una hemoptisis grave.
Las pruebas cutneas son habitualmente ne
gativas en este tipo de aspergilosis; slo en al
gunos casos se observa reaccin de tipo inm e
diato, como consecuencia de estar sensibiliza
do el enfermo a los antgenos del hongo. La
mayor parte de los sujetos que presentan aler
gia inmediata sufre de broncospasmo y la inter
pretacin de la prueba cutnea es en este caso
idntica a la ya mencionada para el asma aspergilar.
Se ha podido demostrar en esta forma clnica
que la presencia de A. fum igatus en el aparato
respiratorio actiia como un importante estmulo
para la produccin de IgE especfica e inespe
cfica, tal como sucede en las formas alrgicas.
En las aspergilosis invasivas, los filamentos
del hongo penetran en el parnquima pulm o
nar, invaden y lesionan a pared de los vasos
sanguneos, provocan trombosis e isquemia, as
como lesiones metastsicas en otros rganos.
Clnicamente es un proceso subagudo o crni
co, de tipo neumnico con tos, expectoracin,
catarro purulento, hemoptisis, fiebre, disnea y
leucocitosis.7-'3'2'-.2i3
La frecuencia de este proceso ha aumentado
intimamente, en particular como infeccin sobreagregada en enfermos con leucemias o lin
fomas que reciben tratam ientos eon corticoi
des, antimitticos, inmunosupresores, suero antilinfocitario y radiaciones.'** En su mayor par
te son enfermos con leucopenia (< 500 leucoci
tos por mm^).
El estudio histopatolgieo de las piezas de
autopsia muestra la presencia de abundantes hi
fas del hongo, dispuestas en forma radiada y ro
deadas de una extensa zona de necrosis y supu
racin. Se ha sugerido que este cuadro es pro
ducido por la falta total de respuesta inmunitaria por parte del husped y por la accin ncer
tica de las endotoxinas del A. fumigatus.
El mecanismo defensivo normal contra estos
hongos necesita de factores sricos opsonizantes que favorecen la fagocitosis de las esporas
por os neutrfilos; aqullos, una vez fagocitados, son destruidos por ia mieloperoxidasa, el
perxido de hidrgeno y el ioduro de potasio.*'^
Uno o varios de estos mecanismos se encuen
tran alterados en los enfermos que padecen las
graves hemopatas que actan como factores
predisponentes.
Las investigaciones serolgicas realizadas en
los pacientes que presentan esta forma clnica

509

han demostrado con frecuencia reacciones ne

gativas, especialmente si se trata de sujetos con
inm unodeficiencias producidas ya sea p o r la
enfermedad de base (leucemia o linfoma) o por
los tratamientos recibidos.*
Se han realizado varias pruebas experim en
tales para efectuar el diagnstico serolgico de
esta form a clnica mediante la demostracin de
antigenem ia con el radioinm unoensayo y la
tcnica de ELISA.9- 3.22*
En la actualidad se estn empleando con ma
yor frecuencia tcnicas de aglutinacin de ltex
y ELISA sandwich o inhibicin de ELISA. Es
tas pruebas permiten detectar una glucoprote
na de 18 kD, tanto en suero como en orina. La
reiteracin de las muestras incrementa la sensi
bilidad de estos mtodos.'**'
Zigomicosis
Las zigomicosis son micosis profundas que
poseen la caracterstica comn de ser produci
das por hongos de micelio filamentoso conti
nuo. Dentro de ellas se incluyen las mucormieosis, producidas por Mucorales de los gneros
Rhizopus, Absidia, M ucor y M orierella, que
p resen tan las caractersticas de las m icosis
oportunistas. Son afecciones de distribucin
geogrfica universal, de curso grave y que con
ducen frecuentem ente a la muerte de lo s pa
cientes; la mayor parte de los diagnsticos son
realizados por estudios histopatolgicos de las
piezas de autopsia.'-"^
Desde el punto de vista clnico, las mueormieosis se dividen en: 1) formas sinuso-rbitocerebrales, cuyas causas predisponentes ms
frecuentes son la diabetes acidtica, la uremia
y las grandes quemaduras; 2) formas pulm ona
res o diseminadas que se asocian por lo comn
con leucemias, linfomas, anemias graves, en
pacientes que reciben corticoides, citostticos e
inmunosupresores; 3) formas abdominales, cu
yo punto de partida es intestinal y presentan
como factor predisponente la desnutricin gra
ve y las poliparasitosis, y 4) la mucormicosis
cutnea, de presentacin menos frecuente y cu
ya aparicin es favorecida por las acidosis me
tablicas y los traumatismos.
El examen histopatolgieo de las mucormi
cosis m uestra las alteraciones propias de las
micosis graves, en las cuales las defensas del
husped estn seriamente deterioradas. Se ob
servan abundantes filamentos no tabicados, an
chos, de dimetro algo irregular, que tienden a
invadir los vasos sanguneos, producen trom
bosis y necrosis isqumica de los tejidos veci
nos. Junto a las lesiones -necrticas puede haber
supuracin y se comprueba una total ausencia
de granulom as defensivos que tiendan a cir
cunscribir el proceso.

510

Inmunopatologa

Los estudios inmunolgicos han sido esca

sos. Se han preparado antgenos solubles, obte
nidos del sobrenadante del micelio roto por ul
trasonido, a partir de cultivos de Absidia, Mucor y Rhizopus. Dichos antgenos han demos
trado su utilidad diagnstica en pruebas de in
munodifusin. Esta reaccin da resultados ne
gativos en estadios tempranos o cuando la en
fermedad es controlada muy rpidamente, pero
es intensamente positiva en los casos avanza
dos y se observan reacciones cruzadas entre los
tres gneros de hongos p roductores de esta
afeccin.'O

tienden a la curacin espontnea y habitual- '

mente no se cxo n i c m }''^^'
La otra forma clnica es causada por agentes
antropfilos como el Trichophyton ruhrum,
Epiderm ophyton floccosum , T. Schoenleinii,
etc., muy adaptados al parasitismo de la capa
crnea humana y que despiertan escasa reac
cin inflamatoria. Las lesiones son descamativas, hiperqueratsicas y con frecuencia com
prometen las uas; desde el punto de vista sub
jetivo, casi no producen prurito y su curso es
muy crnico. La prueba de la tricofitina da re
sultados frecuentemente negativos y jams cu
ran espontneamente. Por lo general su cura
cin es difcil aun con tratam ientos adecua-

INMUNIDAD EN LAS DERMATOFITIAS

dos.41.127.231

Las dermatofitias son micosis superficiales

producidas por un grupo de hongos llamados
derm alfitos, que pertenecen a tres gneros,
Microsporum, Blpidermophyton y Trichaphyton
y numerosas especies. Estos microorganismos
atacan la capa crnea de ia piel y sus faneras;
producen lesiones inflamatorias en la piel lam
pia, barba, bigote, cuero cabelludo y otras re
giones pilosas del cuerpo, y en las uas deter
minan hiperqueratosis. A causa de su condicin
de parsitos de la capa crnea, los derrnatfitos
son incapaces de invadir otros tejidos vivos;
por lo general su nico mecanismo para produ
cir enfermedad es actuar por medio de sus ant
genos. Estos son captados por las clulas de
Langerhans de la epiderm is, las que m igran
hasta ponerse en contacto con los tejidos linfoi
des inm unocompetentes; all los linfocitos T
son sensibilizados y desencadenan un proceso
de hipersensibilidad mediada por clulas, con
exteriorizacin principalmente cutnea. Puede
decirse, pues, que las dermatofitias son derma
titis de contacto producidas por los antgenos
de los dermatfitos.'"
Ha sido reiteradamente sealado que existen
dos tipos polares de dermatofitias desde el pun
to de vista clnico e inmunolgico. Unas son
producidas por hongos procedentes del suelo
(gefilos) o de los animales (zofilos) y que
por lo tanto estn poco adaptadas al parasitis
mo de la capa crnea de la piel del hombre. Es
tos agentes determinan una intensa reaccin in
flam atoria con vesculas y pstulas, con fre
cuencia hay infiltracin inflamatoria de la der
mis e hipodermis y los ganglios satlites estn
infartados. Este cuadro clnico va acompaado
de reacciones cutneas a la tricofitina intensa
mente positivas y, en oportunidades, se obser
van erupciones cutneas deshabitadas llamadas
dermatoftides. Esta intensa reaccin inflama
toria elimina gran cantidad del estrato crneo
afectado y, por lo tanto, tambin de dermatfitos; como consecuencia, luego de un tiempo

Se considera que la quinta parte de la pobla

cin mundial padece micosis superficiales, de
las cuales la mayora son dermatofitias y pitiriasis versicolor. La aparicin de una de estas
micosis superficiales depende de una serie de
factores. Algunos actan en forma local como
la humedad y el grosor de la capa crnea; en
general es ms frecuente la im plantacin de
una dermatofitia en zonas hmedas y de capa
crnea gruesa. La transpiracin excesiva, el
uso de calzado cerrado y de suela gruesa, la ro
pa ajustada, la maceracin de la piel, las m ar
chas prolongadas y la obesidad son factores
predisponentes para la aparicin de estos pro
cesos en los pies y los pliegues inguinales. El
uso de cabellos largos protege mecnicamente
a las nias contra ios hongos productores de ti
as del cuero cabelludo.^^* La edad es un factor
de suma importancia, as las tias de cuero ca
belludo son casi exclusivas de la infancia, en
tanto que las dermatofitias de ios piel y el plie
gue inguinocrural son propias del adulto. El se
xo masculino presenta estas micosis con una
frecuencia discretamente mayor que el femeni
no, El contacto con animales favorece la im
plantacin de tias inflamatorias y micosis tricoftica y las prcticas deportivas, en particular
la natacin, predisponen a contraer dermatofi
tias de los pies.
Existe adems una acentuada tendencia ge
ntica, en particular para padecer aquellas der
matofitias crnicas poco inflamatorias; stas se
transmiten dentro de la misma familia siguien
do una lnea gentica y no contagian a otros in
tegrantes del grupo familiar no predispuestos.
Por ejemplo, la existencia de contagio m atri
monial es rara y, por el contrario, es frecuente
de padres a h ijo s o en tre otros c o n san g u neos.'".23
Se ha comprobado que el suero normal con
tiene componentes que frenan el desarrollo de
los dermatfitos. Ayres y Anderson (1934) de
m ostraron que el agregado de 8% de suero,
procedente de pacientes con tias inflam ato

Inmunologa de las micosis

rias, al medio de Sabouraud, impeda el creci
miento de estos hongos. Posteriormente, los es
tudios de Lorincz y Roth'*''-''*^ comprobaron que
el suero fresco de la mayor parte de las perso
nas posee una actividad fungosttica frente a
los dermatfitos. Estas sustancias condiciona
ran el ataque restringido a la capa crnea de la
piel y sus faneras por tratarse de tejidos no irri
gados. Se han reconocido dos sustancias plas
mticas que actan como factores contrarios a
la invasin de los dermatfitos, la transferrina
no saturada y una a 2-macroglobulina inhibi
dora de la queratinasa.^"
En las clulas sanguneas tienen importancia
los neutrfilos, los mastocitos, los linfocitos y
los macrfagos. Ciertas condiciones de la salud
general pueden influir en la aparicin de las
dermatofitias y especialmente en su extensin
y cronicidad. La diabetes, el empleo de corticoesteroides, el sndrome de Cushing, los tras
plantados y los linfomas coexisten con tricofitias extensas y rebeldes al tratamiento causadas
por el T.
En pacientes jvenes con defectos de la in
munidad mediada por clulas se ha comproba
do la aparicin de tricofitias extensas que afec
tan uas, cuero cabelludo y piel, presentando
esta ltima una descamacin difusa, ictiosiforme, con escasa o nula reaccin inflamatoria.
Esta forma clnica ha sido denominada recien
temente enfermedad dermatoftica'* y es produ
cida habitualmente por Trichophyton antropfilos (T. tonsurans, T. vioaceum o T. rubrum).
Un hecho frecuente que an aguarda expli
cacin es la tendencia que presentan ciertas tri
cofitias a permanecer localizadas en una mano
o un pie sin afectar el otro. Wilson atribuye es
te fenmeno a alteraciones locales en el meta
bolismo de los hidratos de carbono.
Otro factor im portante es la velocidad de
reemplazo de la capa crnea. Para que un dermatfito pueda sobrevivir e invadir nuevas zo
nas, su velocidad de crecimiento debe ser m a
yor que la de eliminacin del estrato crneo,
pues de lo contrario es expulsado de la piel.
Por lo tanto, si la tia se expande es porque su
agente etiolgico es capaz de desarrollarse aun
contra la corriente de renovacin epidrmica.
Esto explica las curaciones espontneas que se
producen cuando es eliminada una gran masa
de capa crnea, tal como sucede en las tias
muy inflamatorias, por factores mecnicos co
mo la depilacin (manual o radioterpica) o la
extirpacin quirrgica de las uas enfermas.
Plato y Neisser (1902) obtuvieron un antge
no de cultivos de dermatfitos por medio de un
procedimiento similar al utilizado para preparar
la tuberculina vieja de Koch. Este extracto fue
llamado tricofitina. La inyeccin de esta sus
tancia por va intravenosa produce en los pa

511

cientes portadores de derm atfitos un cuadro

general con fiebre, escalofros, esplenomegalia
y cefaleas. La inyeccin intradrmica produce
una reaccin tem prana con urticaria a los 15
minutos y otra tarda con eritema y ppula a las
24 o 48 horas.
El estado de hipersensibilidad a la tricofitina
se instala a los 7 u 8 das de producida la infec
cin y persiste por lo general en forma indefi
nida. Se ha establecido que la aplicacin reite
rada de tricofitina no vuelve positiva esta prue
ba. En algunos casos, la prueba de tricofitina
desencadena fenmenos focales, como aum en
to de la reaccin inflamatoria de la tia, o ge
nerales con discreta hipertermia y aparicin de
erupciones cutneas a distancia del foco dermatoftico conocidas como ides.
Desde el punto de vista histolgico, la reac
cin se caracteriza por infiltrados drmicos de
clulas linfoides y monocitos; stos se acum u
lan en torno a los vasos sanguneos y los ane
xos cutneos. En los casos ms intensos puede
haber necrosis y aflujo de polimorfonucleares.
Como ya fue sealado, hay especies que pro
ducen una mayor sensibilizacin a la tricofitina
como el Microsporum canis, Microsporum. gypseum, Trichophyton mentagrophytes var. yeso
sa, Trichophyton verrucosum, etc., en tanto que
otras parecen no sensibilizar a sus portadores,
como sucede con el Epiderm ophyton flo c c o sum , T richophyton rubrum y T rich o p h yto n
mentagrophytes var. vellosa. Lewis y Hopper**
demostraron la especificidad de esta reaccin,
de tal forma que una prueba de tricofitina posi
tiva indica infeccin actual o pasada por un dermatfito. La especificidad es de grupo y en ge
neral los reactivos que se preparan son poliva
lentes, con una especie de cada gnero.
Los sujetos atpicos, con altos n iveles de
IgE, suelen ser ms susceptibles a las derm ato
fitias crnicas y no desarrollan pruebas tardas
de trico fitin a positivas."*' Neves* enco n tr
23% de reacciones positivas a la tricofitina le
da a las 48 horas en 571 individuos que no pa
decan derm atofitias en el momento del exa
men. Esta prueba fue positiva en el 41% de los
170 pacientes con derm atofitias y el 97% de
los pacientes tenan tias con signos de infla
macin.
La tricofitina es un polisacrido nitrogenado,
dializable y que da glucosamina por hidrlisis,
as com o enzimas queratinasas. Se considera
cjue los componentes dominantes de la tricofiti
na son los glucopptidos y la queratinasa, la
porcin proteica de los primeros y la queratina
sa estimulan en el husped la inmunidad me
diada por clulas, en tanto que los polisacri
dos incrementan la actividad de la inmunidad
humoral.^-'*". Con l se han estudiado reaccio
nes de hipersensibilidad retardada in vitro de

512

Inmunopatologa

las cuales la inhibicin de la migracin de m a

crfagos (MIF) parece la ms eficaz.'*'
Las dermatofitias inflamatorias generan con
cierta frecuencia la aparicin de erupciones
segundas llamadas dermatoftides. stas pue
den presentarse espontneamente o despus de
una inyeccin de tricofitina; igualmente, toda
medicacin que irrite el foco primario facilitar
su aparicin. Las tias del cuero cabelludo o
las tricofitias supurativas de la barba producen
dermatoftides liquenoides, foliculares o papulovesiculosas y raramente eritema nudoso, en
tanto que las dermatofitias de los pies determi
nan lesiones vesiculares dishidrosiform es en
las manos. Estas manifestaciones cutneas cu
ran espontneamente una vez que el foco pri
mario es tratado con xito.
Las reacciones serolgicas dan resultados
poco tiles para el diagnstico de estos proce
sos, ello parece deberse a la existencia de ant
genos com unes entre los derm atfitos y los
hongos saprfitos y al escaso poder invasivo de
estos microorganismos.'' Cabrita y Estvez^'
comprobaron, sin embargo, que un nmero sig
nificativamente elevado de pacientes con tias
supuradas (querion) presentaban anticuerpos
precipitantes demostrables por la reaccin de
inmunodifut in en gel de agar. Recientemente
se han incorporado reacciones de fijacin de
complemento y tcnicas de ELISA con antge
nos ms depurados. Por lo general se observan
anticuerpos detectables en casos inflamatorios,
de larga duracin y acompaados de tricoftides. Los anticuerpos corresponden a IgG, y con
menor frecuencia a IgM o IgE.
Un interesante fenmeno observado en la in
munidad adquirida en las dermatofitias es el de
Bloek. Este autor, y luego otros investigadores,
comprobaron que, cuando se inocula un dermatfito por primera vez a un cobayo, ste presen
ta una tia experimental despus de una sema
na de incubacin; los sntomas alcanzan el m
ximo a los 14 a 19 das y luego cura en el plazo
de un par de meses. Si este animal es reinocu
lado con el mismo hongo, la reaccin es com
pletamente diferente; el perodo de incubacin
se acorta a 24 o 48 horas, la descamacin e in
flamacin van en aumento hasta los 4 o 7 das
siguientes y alcanza la curacin a los 20 das.
Los exmenes micolgicos revelan la ausencia
de hongos en la reinoculacin. Esta trada del
fenm eno de Block con reaccin tem prana,
evolucin acortada y ausencia de hongos es
muy similar al fenmeno de Koch en la tuber
culosis experimental. Se ha podido comprobar
que las reinoculaeiones en el hombre presentan
tam bin una evo lu ci n aco rtad a y p reco z,
Louste y col.'^ demostraron un cierto grado de
inmunidad a la reinfecciones aun en pacientes
portadores de tias no inflamatorias.

Se han realizado numerosos estudios para

producir inmungenos contra las dermatofitias.
Casi todas las tentativas exitosas emplearon las
clulas fngicas com pletas, incluyendo los
componentes de su pared celular, y casi todos
los intentos fallidos usaron extractos de los
hongos o subproductos de su desarrollo. Debe
sealarse que la tcnica de Warton, que utiliza
una suspensin de dermatfitos en coadyuvan
te, result ser la ms eficaz en cuanto a su efec
to protector.' Estos compuestos son inoculados
por escarificacin cutnea y producen hiper
sensibilidad e inmunidad locales cuyo grado
decrece a medida que se aleja del foco de ino
culacin.
INMUNOLOGA
DE LAS CROMOMICOSIS
Las cromomicosis son afecciones de la der
mis e hipodermis producidas por hongos pig
mentados (Dematiaceae) pertenecientes a los
gneros P hialophora, Fonsecae y Cladosporiiim, caracterizadas por el aspecto verrugoso de
las lesiones cutneas, que habitualmente estn
ubicadas en las partes descubiertas del cuerpo,
en particular en los miembros inferiores.
Se ha podido comprobar la presencia de anti
cuerpos fijadores del complemento tanto en pa
cientes afectados de cromomicosis como en co
nejos inm unizados con las diversas especies
productoras de esta a f e c c i n . E s t a s reac
ciones presentan ttulos elevados con el antge
no homlogo y, por el contrario, stos son ba
jos o la reaccin es negativa con los extractos
procedentes de otros hongos productores de la
m ism a enferm edad. P rcticam en te, no hay
reacciones cruzadas entre los antg en o s de
Phialophora y Fonsecae^-^'^ No se ha estableci
do an si existe relacin entre el ttulo de las
pruebas de fijacin de complemento y la seve
ridad del proceso que aqueja al paciente.'*'^*'
En sueros de pacientes con cromomicosis'* se
ha obtenido igualmente un alto porcentaje de
resultados positivos eon la prueba de inmunodi
fusin en gel de agar. Se comprobaron reaccio
nes cruzadas entre antgenos de F. pedrosoi y F.
compactum, en tanto que stas fueron mucho
menores entre F. pedrosoi y Ph. verrucosa.'^'^
Biguel y col.'* y Cooper y Sehmeideu"* estu
diaron las relaciones antignicas de los agentes
etiolgicos de cromomicosis por medio de la
inmunodifusin en gel de agar y la microinmunoelectroforesis. Pudo comprobarse que existe
cierto grado de reacciones cruzadas entre las
tres especies ms comunes: Ph. verrucosa, F.
pedrosoi y CL carrionii, pero se demostraron
algunas diferencias antignicas que permiten su
ubicacin en gneros separados.

Inmunologa de las micosis

Gordon y Al-Doory'-^^ estudiaron las relacio
nes antignicas de diversos hongos pigmenta
dos, tanto patgenos como saprfitos, mediante
pruebas de inm unofluorescencia directa con
conjugados especficos preparados a partir de
F. pedrosoi, F. compactum y F. dermatitidis.
Son muy escasos los datos acerca de la hi
persensibilidad m ediada por clulas en esta
afeccin. Se han realizado algunos estudios en
Cuba y en la Repblica Dominicana, pero sus
resultados no son an concluyentes. Las prue
bas cutneas son positivas en todos los casos
de cromomicosis confirmada y en el 25% de
los habitantes de zonas endmicas. Este ltimo
dato ha hecho pensar a algunos autores'* en la
existencia de una cromomicosis-infeccin asin
tomtica.
IN M U N O LO G A
DE LAS E SPO R O T R IC O S IS
Los estudios inmunolgicos en esta afeccin
han perm itido establecer un comportam iento
diferente del sistema inmune de acuerdo con la
form a clnica de la enferm edad, realizar en
cuestas epidemiolgicas, determinar la existen
cia de una infeccin asintomtica y estudiar los
antgenos del Sp. schencki as como sus rela
ciones con antgenos de hongos vecinos o vin
culados a l.
Las pruebas cutneas tienen importancia tan
to en el diagnstico de casos clnicos de esporotricosis como en la realizacin de encuestas
epidemiolgicas. Se han utilizado dos tipos de
antgenos; uno de ellos consiste en una suspen
sin de clulas levaduriformes muertas por ca
lor, en solucin fisiolgica fenicada, en la pro
porcin de 1/1.000 vol/vol y el otro es un poli
sacrido obtenido por alcohol-acetato de sodio
a partir de filtrados del desarrollo en medios l
quidos de la fase filamentosa del Sp. schenckii.
La tcnica de realizacin y la lectura son sem e
jantes a las pruebas intradrm icas realizadas
con otros a n t g e n o s . .53,54,io5.i.-i4
La suspensin de elementos levaduriformes
da resultados positivos tanto en pacientes con
esporotricosis com o en personas sin historia
clnica de enfermedad que habitan zonas end
micas. Al parecer esto se debe a la existencia
de una infeccin asintomtica. Por este motivo
este antgeno es el preferido en las encuestas
epidemiolgicas.
Por el contrario, el polisacrido de Gonzlez
Ochoa que slo da resultados positivos en la
esporotricosis clnica, constituye un elemento
de gran utilidad diagnstica, pues su negatividad permite excluir el diagnstico de este pro
ceso, salvo en casos diseminados que presentan
a veces anergia. 52,53,54

513

De Britos y col.'"'* estudiaron las m odifica

ciones histopatolgicas producidas por la esporotriquina y comprobaron la formacin de infil
trados histiocitarios perivasculares, pequeos
granulomas y reas de supuracin.
La especificidad de esta prueba cutnea es
muy grande ya que presenta slo un dbil gra
do de reacciones cruzadas en los cobayos in
fectados con N. capsulatum. Flan sido utiliza
das diversas pruebas serolgicas en esta enfer
medad: aglutinacin en tubo de una suspensin
de elem entos levaduriformes, aglutinacin de
partculas de ltex sensibilizadas con un antge
no obtenido por filtracin del desarrollo del Sp.
schenckii en medio lciuido, inmunofluorescen
cia indirecta, fijacin de complemento e inm u
nodifusin en gel de agar. Las principales con
clusiones que pueden extraerse es que las reac
ciones dotadas de m ayor sensibilidad son la
aglutinacin en tubo y la aglutinacin de part
culas de ltex; la primera de ellas es poco espe
cfica ya que pueden observai'se reacciones po
sitivas con ttulos de hasta 1/80 en personas sin
antecedentes de esporotricosis. Las pruebas
ms especficas son la inmunodifusin en ge!
de agar y la fijacin de complemento, stas son
constantemente positivas en los pacientes con
formas viscerales; slo dan 60% de positividad
en los portadores de esporotricosis cutnea, los
ttulos son proporcionales a la extensin de la
enfermedad y tienden a negativizarse despus
que cura el proceso.'*'"'*^-^^^^
Recientemente hemos preparado dos antge
nos, uno obtenido del sobrenadante de clulas
l e v a d u r i f or me s rotas, y el se g u n d o es un
exoantgeno de la fase filamentosa (en form a
de extracto acuoso). Con estos reactivos fueron
practicadas diversas reacciones serolgicas en
cobayos y ratones infectados experimentalmen
te, as como en humanos con esporotricosis cu
tneas. Las pruebas m s sensibles fueron la
contrainm unoelectroforesis con inm unodifu
sin secundaria y la aglutinacin de clulas le
vaduriform es enteras; la especificidad de la
contrainmunoelectroforesis fue absoluta cuan
do se estudi frente a sueros de cobayos sanos,
personas sin micosis y pacientes con diversas
micosis profundas.^
IN M U N O LO G A D E LOS M IC E T O M A S
Los mtodos inmunolgicos, en especial las
reacciones serolgicas aplicadas al diagnstico
de os micetomas, han constituido una valiosa
ayuda por la simplicidad de su realizacin, la
especificidad y la rapidez de sus resultados. Su
empleo, sin embargo, no se ha generalizado.
Murray y Moghraby*^^ emplearon antgenos
obtenidos de filtrados de cultivos y antgenos

514

Inmunopatologa

polisacridos de diversos agentes productores

de m icetom as, tanto A ctin o m yceta les com o
Eumycetes. Estos preparados fueron ensayados
en pruebas cutneas practicadas a pacientes
portadores de micetomas. Los resultados com
probados fueron relativam ente satisfactorios
para los actinomicetomas y malos en los maduromicetomas.
B ojalil y M agnusson'*'- prepararon una
sensibilizina por medio de un procedimiento
similar al de PPD, a partir de cultivos de Nocardia hrasiliensis y Nocardia asteroides. Es
tos autores comprobaron que las intraderm o
rreacciones realizadas con 0,002 mg del extrac
to, en 0,1 mi de volumen, daba resultados fran
camente positivos (14-35 mm de infiltrado) en
los pacientes portadores de micetomas debidos
a estos microorganismos. Las pruebas eran es
pecficas y no se observaban reacciones cruza
das entre ambas especies de Nocardia. Con do
sis diez veces mayores se obtuvieron reaccio
nes inespecficas en pacientes tuberculosos o
con actinomicosis. Se realizaron ensayos simi
lares con Actinomadura y Streptomyces sin re
sultados satisfactorios.
Murray y Mahgoub'^^ introdujeron el empleo
de la inm unodifusin en gel de agar para el
diagnstico serolgico de los micetomas. Co
mo antgeno se utiliza el sobrenadante de mice
lio homogeneizado y roto, que luego es dializa
do y liofilizado. Los resultados obtenidos per
miten separar con facilidad los actinom iceto
mas de los maduromicetomas, esto tiene gran
importancia pues los primeros responden al tra
tamiento mdico en tanto que en los segundos
la teraputica es siempre quirrgica. Existen
reacciones cruzadas entre microorganismos ta
xonmicamente relacionados, pero la reaccin
es siempre mayor con el antgeno homlogo,
ya sea por presentar mayor nmero de bandas
de precipitacin o por ser stas ms ntidas.
Los sueros que presenten pocos anticuerpos
pueden ser concentrados por PVP o se puede
realizar electrosinresis cuya sensibilidad es
mayor. Otras pruebas serolgicas, como la he
moaglutinacin pasiva' con antgenos polisa
cridos de P. hoydii, no han sobrepasado an la
fase experimental al igual que las tcnicas inmunoenzimolgicas (ELISA).

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520

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Inmunologa de las infecciones

parasitarias

STELLA M. GONZLEZ CAPPA

ELVIRA L. DURANTE DE ISOLA
GERARDO A. MIRKIN

Debido a su gran difusin y alta frecuencia

las enferm edades parasitarias constituyen un
problema mdico importante que se acenta en
los pases tropicales y subtropicales. Estas in
fecciones son producidas por protozoarios y
helmintos y presentan, como una de las carac
tersticas ms relevantes, tendencia a la cronici
dad. El parsito rara vez desencadena la muerte
del husped y en general establece con ste una
relacin de equilibrio. Como consecuencia de
la infeccin crnica la estimulacin antignica
es muy prolongada en el tiempo y los estmulos
varan desde complejos productos metablicos,
como los antgenos de excrecin-secrecin de
los helmintos y las mudas que eliminan los nematodos en su progresin a diversos estadios
larvales, hasta pptidos y protenas de la super
ficie parasitaria. La respuesta inmunolgica re
sultante de la interaccin husped-parsito est
tambin condicionada por la localizacin de los
parsitos ya que stos pueden ser intracelula
res [T rypanosom a cruzi, L eish m a n ia spp.,
Plasmodium spp., Toxoplasma gondii, Trichinella spiralis), intratisulares (Cysticercus cellulosae, Echinococcus granulosas), de cavida
des (parsitos de localizacin intestinal), o ex
ternos (artrpodos). Estas localizaciones pue
den adems ser permanentes o temporarias de
pendiendo del ciclo evolutivo del parsito.
Otra condicin que influye en la com pleji
dad de la estimulacin antignica es que los pa
rsitos pasan por sucesivos estadios durante su
ciclo biolgico y cada uno de stos puede pre
sentar antgenos distintivos. Los nematodos tie
nen por lo menos 4 estadios larvarios y uno
adulto, y algunos protozoarios presentan dife
rentes estadios en ei insecto vector y en el
husped mamfero y, dentro de ste, varan de
acuerdo a su localizacin intra o extracelular

26
(por ej., T. cruzi). Adems, y para aumentar la
complejidad, algunos parsitos varan sus ant
genos en el tiempo, aun para el mismo estadio
(plasm odios y tripanosom as africanos). Esta
p erm an en cia p ro lo n g ad a del parsito , cuya
consecuencia es la exposicin progresiva del
husped a sus diferentes estmulos antignieos,
conduce a una respuesta inmune que, en gene
ral, lim ita la infeccin aunque no la erradica.
En ocasiones, el proceso de dao es consecuen
cia de la misma re.spuesta inmune (esquistosomiasis, filariasis, paludismo, etc.). Sin em bar
go, el hecho de que el parsito sobreviva en el
husped y a sus expensas a pesar de la respues
ta inmune, seala la existencia de mecanismos
que le permiten evadir in vivo la accin de los
anticuerpos y de las clulas sensibilizadas.
RELACIN H U SP ED -P A R S ITO
Para estudiar esta relacin deben considerarse
diversos factores, que se sealan a continuacin.
1 - Inmunidad natural del husped
Determina que, dentro de un nmero de indi
viduos, algunos sean m s su sce p tib le s que
otros a ciertas infecciones p arasita rias. Por
ejem plo, Plasmodium vivax no penetra en los
glbulos rojos de individuos con grupo Duffy
negativo y se ha detectado una asociacin sig
nificativa entre HLA-B53 (molcula de clase I)
y resistencia a desarrollar formas severas de
paludismo. Experimentalmente se ha com pro
bado que en leishmaniasis murina la resistencia
es regida por un gen dominante, Lsh, no ligado
al MHC, que controla la activacin de macr
fagos; esto determina las diferencias en la sus
ceptibilidad de distintas cepas de ratones.

520

Inmunopatologa

21 7 . T h o m a s -A m b ro s e , P; K ie n T r o u n g , T ; B a tte s ti, M R ;
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Inmunologa de las infecciones

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STELLA M. GONZLEZ CAPPA

ELVIRA L. DURANTE DE ISOLA
GERARDO A. MIRKIN

Debido a su gran difusin y alta frecuencia

las enferm edades parasitarias constituyen un
problema mdico importante que se acenta en
los pases tropicales y subtropicales. Estas in
fecciones son producidas por protozoarios y
helmintos y presentan, como una de las carac
tersticas ms relevantes, tendencia a la cronici
dad. El parsito rara vez desencadena la muerte
del husped y en general establece con ste una
relacin de equilibrio. Como consecuencia de
la infeccin crnica la estimulacin antignica
es muy prolongada en el tiempo y los estmulos
varan desde complejos productos metablicos,
como los antgenos de excrecin-secrecin de
los helmintos y las mudas que eliminan los ne
matodos en su progresin a diversos estadios
larvales, hasta pptidos y protenas de la super
ficie parasitaria. La respuesta inmunolgica re
sultante de la interaccin husped-parsito est
tambin condicionada por la localizacin de los
parsitos ya que stos pueden ser intracelula
res [T rypanosom a cruzi, L eish m a n ia spp.,
Plasmodium spp., Toxoplasma gondii, Trichinella spiralis), intratisulares {Cysticercus cellulosae, Echinococcus granulosas), de cavida
des (parsitos de localizacin intestinal), o ex
ternos (artrpodos). Estas localizaciones pue
den adems ser permanentes o temporarias de
pendiendo del ciclo evolutivo del parsito.
Otra condicin que influye en la com pleji
dad de la estimulacin antignica es que los pa
rsitos pasan por sucesivos estadios durante su
ciclo biolgico y cada uno de stos puede pre
sentar antgenos distintivos. Los nematodos tie
nen por lo menos 4 estadios larvarios y uno
adulto, y algunos protozoarios presentan dife
rentes estadios en ei insecto vector y en el
husped mamfero y, dentro de ste, varan de
acuerdo a su localizacin intra o extracelular

26
(por ej., T. cruzi). Adems, y para aumentar la
complejidad, algunos parsitos varan sus ant
genos en el tiempo, aun para el mismo estadio
(plasm odios y tripanosom as africanos). Esta
p erm an en cia p ro lo n g ad a del parsito , cuya
consecuencia es la exposicin progresiva del
husped a sus diferentes estmulos antignieos,
conduce a una respuesta inmune que, en gene
ral, lim ita la infeccin aunque no la erradica.
En ocasiones, el proceso de dao es consecuen
cia de la misma re.spuesta inmune (esquistosomiasis, filariasis, paludismo, etc.). Sin em bar
go, el hecho de que el parsito sobreviva en el
husped y a sus expensas a pesar de la respues
ta inmune, seala la existencia de mecanismos
que le permiten evadir in vivo la accin de los
anticuerpos y de las clulas sensibilizadas.
RELACIN H U SP ED -P A R S ITO
Para estudiar esta relacin deben considerarse
diversos factores, que se sealan a continuacin.
1 - Inmunidad natural del husped
Determina que, dentro de un nmero de indi
viduos, algunos sean m s su sce p tib le s que
otros a ciertas infecciones p arasita rias. Por
ejem plo, Plasmodium vivax no penetra en los
glbulos rojos de individuos con grupo Duffy
negativo y se ha detectado una asociacin sig
nificativa entre HLA-B53 (molcula de clase I)
y resistencia a desarrollar formas severas de
paludismo. Experimentalmente se ha com pro
bado que en leishmaniasis murina la resistencia
es regida por un gen dominante, Lsh, no ligado
al MHC, que controla la activacin de macr
fagos; esto determina las diferencias en la sus
ceptibilidad de distintas cepas de ratones.

522

Inmunopatologa

2 - Especificidad de husped
Los parsitos presentan en mayor o menor
grado especificidad con respecto a su husped
por lo que algunos los seleccionan dentro de
determinadas especies de una manera muy res
tringida, como por ejemplo el Enterobius verrnicularis, especie de nerriatodo exclusivo del
humano. Otro ejemplo de husped restringido
corresponde a las especies del gnero Plasmodium, dentro del cual 4 parasitan exclusivamiente al hombre, existiendo otras con especifi
cidad particular para otras especies de mamfe
ro y de aves. Hay otros parsitos menos espec
ficos que pueden infectar una amplia gama de
huspedes, como por ejemplo el T.gondii, par
sito de mamferos y aves, o el T.cruzi que pro
gresa en diferentes especies de mamferos in
cluido el hombre, pero que es incapaz de hacer
lo en las aves.
Una vez alcanzado su husped,, los parsitos
en algunos de sus estadios pueden presentar
tambin alta especificidad por el sitio en que se
ubican (por ej. los esporozotos de las especies
de Plasmodium que parasitan al hombre slo
ingresan en el hepatocito, las larvas de
esta
dio de 'Trichinella spiralis, despus de una m i
gracin inicial, se alojan intracelularmente en
msculo esqueltico, los estadios adultos de
Cestodes slo se ubican en la luz del intestino
delgado). Esto est en general determ inado
porque en ese hbitat particular los parsitos
encuentran las seales adecuadas para su desa
rrollo y/o porque poseen receptores para ingre
sar a un determinado nicho.
3 - Mecanismos de defensa no especficos
Despus de una primera exposicin al agente
infeccioso transcurre un tiempo hasta que se
monta una respuesta antgeno especfica. D u

rante este lapso la defensa recae en una serie de

mecanismos locales y sistmicos mediados por
factores humorales y fagocitos.
En el sitio de ingreso de los parsitos, sobre
todo si penetran por piel, se registra una reac
cin local que sirve para lim itar la disem ina
cin, y a la vez facilita el acceso de clulas in
flamatorias y el gatillado de una serie de reac
ciones sistm icas com o fiebre, leucocitosis,
produccin de protenas de fase aguda, activa
cin de mecanismos microbicidas por los fago
citos. Entre las protenas de fase aguda la pro
tena C reactiva acta como opsonina colabo
rando en la fagocitosis del patgeno. El com
plemento puede tambin favorecer la fagocito
sis de algunos parsitos; adems, en algunos de
ellos (o en algunos de sus estadios) existen en
su membrana externa factores activadores de la
va alterna del complemento que conducen a su
destruccin sin requerir anticuerpos.
La llave que conecta la respuesta inespecfi
ca con la especfica es la secrecin de lN-y e
IL-4, que inducen y modulan la actividad de
los linfocitos T hl y Th2.
4 - Mecanismos efectores de inmunidad
El husped pone en marcha diferentes meca
nismos para protegerse y limitar la masa parasi
taria (cuadro 26-1). En la mayora de los casos
se requiere de la accin combinada de diversos
eslabones de la respuesta inmune. En este pro
ceso pueden participar m acrfagos, com ple
mento, anticuerpos, mecanismos de citotoxici
dad directos o mediados por anticuerpos, citoquinas, etc., y predominar la accin de unos
sobre otros dependiendo del parsito, del pero
do de la infeccin y de las caractersticas gen
ticas del husped. Sin embargo, todos los esla
bones de la respuesta inmune sern insuficien
tes para erradicar las parasitosis en las que la

C u ad ro 26-1. Ejemplos de mecanismos inmunes de control de las parasitosis

M ecanism o efector
A nticuerpo,s ltico,>>

A nticuerpo.s n e u ti'a iiz an te s

C ito to x ic id a d c e lu la r a n tic u e rp o d e p e n d ie n te
Linfocito.s c ito t x ic o s
M a c r fa g o s a c tiv a d o s
D e g ra n u la c i n c e lu la r d e b a s filo s
(Ig E )

Parasitosis

E stadio/clula blanco

E n f e rm e d a d d e i s u e o
P a lu d is m o
E n fe rm e d a d d e C h a g a s
T o x o p la s m o s is
P a lu d is m o
E n fe rm e d a d d e C h a g a s
T o x o p la s m o s is
E n fe rm e d a d d e C h a g a s
P a lu d is m o
T riq u in o s is
E n fe rm e d a d d e C h a g a s

T r ip o m a s tig o te
E ritro c ito p a ra s ita d o
T rip o m a s tig o te
Z o ito c irc u la n te
E s p o ro z o ilo -M e ro z o ito
T rip o m a s tig o te
Z o ito c irc u la n te
T r ip o m a s tig o te
E ritro c ito p a ra s ita d o
L a rv a re c i n n a id a
M io c ito p a ra s ita d o

L e ish m a n ia s is
T o x o p la .sm o sis
H e lm in tia s is in te s tin a le s

A m a s tig o ie
Z o ito
L a rv a s - A d u lto s

Inmunologa de las infecciones parasitarias

multiplicacin del parsito se perpeta en el
mismo husped. Hasta hace poco se afirmaba
que la leishmaniasis cutnea, producida por L.
trpica, en pacientes con reactividad inmunol
gica normal para el parsito, era una excepcin;
sin embargo, el hecho de que en casos de SIDA
se hayan detectado reactivaciones en pacientes
supuestamente curados de la parasitosis, hace
que deban reverse estos supuestos.
El control efectivo es difcil de alcanzar en
parte por el complejo ciclo de vida de los par
sitos que en los sucesivos estadios pueden pre
sentar antgenos propios, algunos de ellos nece
sarios para el reconocimiento del husped, teji
do o clula donde el parsito se ubicar y por
los diversos mecanismos de escape de la res
puesta inmune que los parsitos han desarrolla
do. De la interaccin entre la respuesta inmune
del husped y los mecanismos de escape del p a
rsito surge el estado de equilibrio que lleva a la
cronicidad de la mayora de las parasitosis; si el
equilibrio se rompe puede producirse la enfer
medad parasitaria y aun la muerte de la persona
parasitaria y esto depender tanto del parsito
(tamao del inculo, virulencia, etc.) como del
husped (capacidad de respuesta inmune).
Los anticuerpos pueden favorecer el control
de la masa parasitaria de variadas maneras, por
ejem plo, bloqueando receptores parasitarios
(protena CS del esporozoito en diversas espe
cies de Plasm.odium), destruyendo al parsito o
a la clula infectada por activacin del comple
m ento o por A D CC (form as circulantes de
T. cruzi o eritrocitos infectados con P lasm o
dium), opsonizando al parsito y promoviendo
su destruccin por fagocitosis (T.gondii, T.cru
zi), activando mecanismos de degranulacin en
mastocitos y basfilos, y secrecin de mucus
por parte de las clulas caliciformes que, en el
caso de los verm es ubicados en el intestino,
contribuiran a su deterioro y eliminacin.
En el hombre, un ejemplo de la participacin
de los anticuerpos en los mecanismos de pro
teccin se evidencia en la infeccin por plas
modios ya que, en rea endmica y durante los
primeros meses de vida, los hijos de mujeres
infectadas presentan resistencia a la infeccin
malrica.
Sin embargo, los linfocitos T son las clulas
fundamentales para el control de la masa para
sitaria; as, en ratones atmicos se ha demostra
do un empeoramiento del transcurso de algunas
enferm edades, como por ejem plo en m alaria
murina y enfermedad de Chagas. El tipo de c
lula T involucrada depende de la naturaleza del
patgeno, de la ubicacin del parsito, de las
caractersticas genticas del husped y del esta
dio de la infeccin. Adems, pueden actuar de
manera directa o mediante la secrecin de citoquinas.

523

En el paludismo, por ejemplo, los linfocitos

T C D 8 son clulas efectoras de citotoxicidad
directa cuyo blanco es el hepatocito parasitario;
pero adems, mediante la secrecin de IFN-y,
inhiben la multiplicacin del parsito en esta
clula. La falta de molculas de clase II en el
hepatocito, y la ausencia de expresin de ant
genos parasitarios en la membrana de estas c
lulas, hace que los linfocitos T CD4 sean ine
fectivos. stos, sin embargo, participan en el
control de la fase eritroctica por mecanismos
de ADCC, Usando glbulos rojos que expresan
antgenos parasitarios en su superficie.
D entro de las clulas CD4 se reconocen 2
subpoblaciones; Thl y Th2, las que se diferen
cian por las citoquinas que producen. El tipo
de subpoblacin estimulada por un parsito es
producto de sus caractersticas, entre ellas el
modo de interaccin con su husped. En fun
cin de que predomine una u otra poblacin,
se estim ular ms eficientem ente un tip o de
respuesta que conducir a una efectiva activa
cin m acrofgica (T h l), con produccin de
TNF e IFN-y, o deficitaria en activacin m a
crofgica (Th2) con produccin de IL-4, IL-5
e L-IO, induccin de la proliferacin de LB,
produccin exacerbada de IgE, activacin de
mastocitos y eosinfilos. En general, la resis
tencia contra parsitos intracelulares est aso
ciada a T hl y la de parsitos extracelulares, a
Th2. Sin embargo, en la mayora de las parasi
tosis se estimulan ambos mecanismos, aunque
con diferente preponderancia, y la relacin en
tre ambos puede variar con el progreso de la
infeccin, ya que ambas poblaciones se interregulan negativamente. El concepto bsico de
esta respuesta polarizada se extiende a b acte
rias {IVlycobacteriun'i tuberculosis y iVI.leprae),
a virus y a hongos, pero las evidencias de este
fenmeno fueron presentadas en principio por
investigadores que trabajaban en modelos pa
rasitarios. En ausencia de seales claram ente
polarizadas, puede aparecer una subpoblacin
ThO con un perfil de citoquinas menos diferen
ciado.
L a p articipacin de estos subtipos d e LT
CD4 se ha estudiado muy bien en leishm ania
sis, donde se ha demostrado experimentalmen
te que para L.major la resistencia se asocia a la
produccin de IFNry y que, si se transfieren c
lulas Th2 productoras de IL-4, se agrava el cur
so de la parasitosis. En el caso de leishmaniasis
visceral, la estimulacin antignica in vitro de
linfocitos de pacientes produce secrecin de
IL-10, la cual se inhibe despus del tratamiento
antiparasitario. Una linfoquina probablemente
determ inante del subtipo celular que vaya a
predominar en una parasitosis dada es la IL-12
que junto con el IFN-y favorecera la diferen
ciacin de Thl.

524

Inmunopatologa

Las clulas Thl al activar al macrfago, esti

mulan el estallido respiratorio y la produccin
de NO, lo ciue favorecer el control de los par
sitos ubicados en el interior de estas clulas.
Los macrfagos activados secretan citoquinas;
una de ellas es el TNF que puede reforzar los
mecanismos inmunolgicos tendientes a con
trolar al parsito (eishmanias, esquistosmulas), pero tam bin puede ser responsable de
parte del dao producido en el husped, como
sucede en malaria cerebral.
En las infecciones por helmintos una carac
terstica bastante generalizada es la eosinofilia,
consecuencia de la estimulacin de eosinfilos
por un factor estimulador de colonias y que se
asocia con niveles elevados de IgE y mastocitosis, todo ello como consecuencia de una res
puesta inmune polarizada hacia Th2 por los an
tgenos parasitarios. Se ha sugerido que la pre
sentacin de antgenos en el contexto de pro
teasas, que son usadas por los vermes migran
tes para pasar a travs de los tejidos, mediara
la maduracin de las CD4 al fenotipo Th2.
La participacin de las clulas NK como m e
canismo efector de control de parasitosis est
menos explorada. Sin em bargo, se sabe que
funcionan en infecciones por Theileria parva,
un protozoario de linfocitos del ganado vacuno.
Tambin se ha descrito su accin mediadora de
ADCC contra helmintos.
5 - Mecanismos de evasin de la respuesta
inmune utilizados por los p arsitos
Algunos de los mecanismos que utilizan los
parsitos para evadir las defensas del husped y
asegurar as su persistencia, se resumen en el
cuadro 26-2.
a. Hbitat intracelular
Los parsitos de localizacin intracelular es
tn protegidos de la accin directa que anti
cuerpos o linfocitos puedan ejercer sobre ellos,
aunque stos eventualmente puedan actuar so
bre la clula husped. Por lo tanto, una adecua
da y rpida internalizacin celular les facilita la
evasin de la respuesta inmune del husped.
El T. gondii y el P. falciparum secretan pro
tenas que facilitan su internalizacin en clu
las nucleadas y en eritrocitos, respectivamente.
El T. cruzi acelera su penetracin tisular in vi
tro en presencia de inmunosueros.
Cuando la clula invadida es un fagocito, los
parsitos deben desarrollar estrategias que les
posibiliten evadir la muerte por fagocitosis. El
T.cruzi y el T.gondii son capaces de invadir,
adems de otras clulas nucleadas, a los fagoci
tos, y las leishmanias slo invaden macrfagos.
En estas clulas estos tres parsitos activan di-

Cuadro 26-2. M ecanism os p a ra sita rio s de

evasin de la respuesta inmune
M ecanism os

Parsitos en ei que es efectivo

Plasrnodium falciparum
Trypatiosonta rhoclesiense
M im eti.sm o
Shistosom a m ansoni
Trypanosom a brucei
Trypanosom a vivax
C a p p in g
L eishm ania donovani
Trypanosom a cruzi
E ntam oeha histolytica
E v a s i n d e la a c tiv id a d mi- T oxopiasm a gondii
Trypanosom a cruzi
c i'o b ic id a d e l m a c r fa g o
L eishm ania sp p
In ra u n o d e p re s i n d e l h u s P asm odium fa lcip a ru m
p ed
T rypanosom a cruzi
L eislim ania m exicana pifanoi
L o c a liz a c i n in tra c e lu la r
Trypanosom a cruzi
Toxopiasm a gondii
P asm odium .spp
T oxocara canis
L ib e ra c i n d e a n tg e n o s
R e s is te n c ia a la a c c i n del Leishm ania sp p
c o m p le m e n to
Trypanosom a sp p
V a ria c i n a n tig n ic a

versos m ecanism os que los protegen de los

efectores normales de la fagocitosis. El T.cruzi,
en su estadio intracelular o amastigote, secreta
una hemolisina activa a pH 5,5 que actuara lisando la vacuola parasitfora y permitiendo el
escape del parsito al citoplasma. Estas vacuo
las son acdicas. Existe una analoga entre la
accin de esta hemolisina y la lisis por comple
mento. El T.gondii al contactar a una clula,
primero se orienta y luego sus roptras secretan
diversos componentes entre ellos el PEF (Penetration enhancement factor) que facilita la
penetracin, mientras que una vez en el interior
de la clula, protenas de los micronemas y de
los cuerpos densos contribuyen a form ar la
m em brana de la vacuola parasitfora que lo
protege de la acidificacin y de la fusin con
los lisosomas, con permeabilidad selectiva que
permite la nutricin del parsito.
Las leishm anias entran pasivamente en las
clulas macrofgicas y se multiplican en la va
cuola fagoctica resistiendo a la digestin. Los
componentes que actuaran protegiendo al pa
rsito son un lipofosfoglicano (LPG) que inhi
be el estallido respiratorio, una superxido dismutasa que degrada el radical anin superxido
de los peroxisomas del fagocito, una proteasa
(GP63) que degrada las enzimas lisosomales, y
una fosfatasa cida.
En todos los casos estos parsitos pueden ser
fagocitados y destruidos ms eficientemente si
los macrfagos estn activados, lo que explica
que en general, con la progresin de la infec
cin, los m acrfagos puedan participar en el
control de la parasitosis.

Inmunologa de las infecciones parasitarias

h. Variacin antignica
Fue descrita como un fenmeno que se pro
duce durante la infeccin de un husped por
una especie nica de protozoario patgeno, a
partir del la cual se origina una sucesin de po
blaciones parasitarias, cada una de ellas reco
nocida como antignicam ente distinta por la
respuesta inmune del husped.
Esto determina la formacin de anticuerpos
especficos para cada poblacin, los que pueden
evidenciarse m ediante pruebas de reconoci
miento de los antgenos de superficie del parsi
to o de las clulas parasitadas (aglutinacin, Jisis, etc.) (Doyle, 1975). Este fenmeno que
ocurre en un nico husped y en un corto pero
do (semanas o meses) ha sido comparado con lo
que ocurre con el virus de la influenza a nivel
de la poblacin mundial y en perodos de aos.
La capacidad de variacin antignica ha sido
probada para diversas especies de tripanosomas
africanos y plasmodios. Los antgenos varia
bles son glucoprotens de superficie (VSGs)
que determinan el tipo de variable antignica
(VATs). El nmero de genes capaces de codifi
car VSGs en tripanosomas africanos es extenso
(tericamente ms de 1 0 0 0 ), pudiendo expre
sarse a partir de una infeccin clonal cientos de
VATs; adems, el repertorio de VSGs puede
variar para diferentes poblaciones parasitarias.
En e] caso del gnero Plasmodium, los eritroci
tos parasitados expresan la variante antignica
en la superficie. Adems se ha demostrado que
la CSP (circum sporozoite surface protein ,
protena de superficie del esporozoito) de algu
nas especies de este gnero tambin manifies
tan variabilidad clonal.
El fenm eno de variacin antignica debe
ser considerado cuando se intenta desarrollar
una vacuna, ya que la neutralizacin de un ant
geno variable puede ser sumamente ineficiente
contrastando con la elevada eficiencia de este
mecanismo de escape.
c. Mimetismo
Consiste en la adquisicin o sntesis por par
te del parsito de com ponentes propios del
husped que lo harn pasar inadvertido para ei
sistema inmune o interferirn por accin mec
nica en la interaccin entre los anticuerpos y/o
clulas y el parsito. As, en el Trypanosoma
vivax, parsito de caprinos y bovinos, se han
descrito globulinas alfa y beta, cuyo reconoci
miento se realiz por lisis del parsito em
pleando inmunosueros antiglobulinas de ratn
en presencia de complemento. Esto tambin ha
sido descrito para T.brucei.
Este fenmeno ha sido observado no slo en
protozoarios sino tambin en metazoarios. En

525

el caso de los esquistosomas se ha demostrado

que el parsito en su estadio adulto es capaz de
estimular la respuesta inmune sin ser afectado
por ella (inmunidad concomitante) ya que es
capaz de evadirla enmascarando su superficie
con antgenos provenientes del husped o codi
ficados por l a semejanza del husped. E xperi
mentalmente se ha demostrado que estos ant
genos suelen presentarse como glucolpidos
(grupos sanguneos, antgenos de Forssm an,
etc.) y excepcionalmente como glucoprotena
(MHC). Tambin se ha demostrado la presen
cia de inmunoglobulinas, las que se adheriran
por el fragm ento Fe a receptores especficos
presentes en la superficie del parsito.
d - Capping"
La membrana de la clula eucariota es una
estructura dinmica y fluida y, en consecuen
cia, las protenas pueden redistribuirse m odifi
cando su posicin. La movilidad de estas p ro
tenas puede ser inducida o acelerada por anticuei-pos o por otras sustancias (por ej., conca
navalina A) constituyendo complejos que tien
den a agruparse formando un casquete o cap ,
generalmente cerca del aparato de Golgi; estos
complejos luego sern exocitados o endocitados por la clula.
El fenmeno, denominado capping, se ha
descrito para algunos protozoarios como Entamoeba histolytica, T.cruzi, L.donovani, T .gon
dii, etc. Una rpida redistribucin de los co m
plejos antgeno-anticuerpo en la superficie de
un parsito puede determinar que las inmunoglobulinas que participan de dichos complejos
presenten una distribucin espacial que im pida
la adecuada fijacin del complemento, evitn
dose as la lisis del parsito. El recambio de an
tgenos de superficie puede tambin evitar que
se e je c u te n otro s m e c a n ism o s eom o el de
ADCC o citotxicos por linfocitos T CD 8 +.
? - Elem.entos distractores
de la respuesta inmune
En esta categora podemos considerar la li
beracin de antgenos al medio y la existencia
de antgenos inmunodominantes (superantge
nos?) carentes de la funcionalidad requerida
para la sobrevida del parsito.
i - Liberacin de antgenos
Algunos de los mecanismos por los que es
tos antgenos pueden interferir en la respuesta
inmune son;
Combinacin con anticuerpos neutralizando
su accin.

526

Inmunopatologa

Bloqueo de las clulas efectoras, directamen

te, o por formacin de inmunocomplejos.
Induccin de tolerancia T o B.
Activacin policlonal en respuesta a compo
nentes mitognicos del parsito.
Activacin de clulas supresoras.
Este mecanismo es importante para la persis
tencia de algunos nematodos, como por ejem
plo el Toxocara canis, que es capaz de secretar
elevadas cantidades de antgeno y cuya larva
de segundo estadio puede permanecer viable en
el ser humano por largos periodos. En S. mansoni se alcanza la inhibicin de los LT citotxi
cos por inmunocomplejos, y en la mayora de
las infecciones por protozoarios tisulares se ge
neran activacin policlonal e inmunodepresin
relativa (paludism o, enferm edad de Chagas,
enfermedad del sueo, etc.).
ii - Antgenos inmunodominantes
como distractores
En el caso del T.cruzi la trans-sialidasa es
una protena que ha sido relacionada con el
proceso de invasin celular. Est formada por
dos dominios, uno altamente antignico consti
tuido por unidades repetitivas y denominado
SAPA, y el otro cataltico. El antgeno SAPA
genera altos ttulos de anticuerpos que no son
capaces de inhibir la actividad enzimtica. Esta
actividad sera requerida por el parsito para
transportar sobre su superficie cido silico,
molcula requerida para interaccionar con las
clulas hospedadoras iniciando as el proceso
de internalizacin. La respuesta inmune al ant
geno dom inante durante la infeccin aguda
protegera al sitio cataltico permitiendo as la
internalizacin celular del parsito. Pasado el
perodo agudo de la infeccin por T.cruzi, se
detectan anticuerpos anti-trans-sialidasa que
podran participar en el control de la infeccin.
f - Preadaptacin y resistencia al complemento
El trmino preadaptacin se aplica para defi
nir el proceso de diferenciacin de vm parsito,
dentro del insecto vector, que lo habilita para
sobrevivir y establecer la infeccin en el hus
ped mamfero. Una de las estrategias ms im
portantes de la preadaptacin es el desarrollo
de la resistencia al complemento. Este proceso
es de gran im portancia en T.cruzi, tripanoso
mas africanos y leishmanias.
El estadio epimastigote de T. cruzi, replicativo y no infectivo, que se encuentra en el intes
tino de la vinchuca, es sensible al complemen
to. El estadio tripomastigote metacclico, no replicativo e infectivo, que se elimina con las de
yecciones del vector, es resistente al com ple

mento. Este ltimo es semejante en sus caracte

rsticas al tripomastigote circulante y al tripmastigote obtenido en cultivos celulares y axnicos. Las evidencias experimentales sugieren
claramente que la serorresistencia de este esta
dio es una consecuencia de la pobre activacin
del complemento por parte de los estadios in
fectivos. A diferencia de lo que ocurre en los
estadios no infectivos que fijan C3 a un recep
tor de su mem brana convirtindolo luego en
C3b. El C3 fijado a los estadios tripomastigotes
(infectivos), adems de depositarse entre 7 a 8
veces menos, se convierte principalm ente en
C3bi, fallando en consecuencia en el gatillado
de la cascada que conduce a la formacin de
C5b-9 y a la lisis del parsito. La ineficacia del
C3 fijado al estadio infectivo de este parsito
es el resultado de la produccin de una molcu
la funcionalm ente smil al Factor A celerador
del Decaimiento (DAF) presente en los huma
nos. Esto en ltima instancia es una modalidad
de mimetismo ya que el parsito est produ
ciendo protenas homlogas a las del husped
para restringir la accin del complemento.
En el caso de las leishmanias, se ha demos
trado que el promastigote en la fase de creci
miento logartmico de un cultivo, cuando an
no es infectivo, es sensible a la accin del com
plemento, mientras que en la fase estacionaria
(promastigotes maduros) es infectivo y resis
tente al complemento. El promastigote maduro,
al ser inoculado en el husped mamfero, activa
la va alterna del complemento con dos conse
cuencias : a) atrae macrfagos al sitio de entra
da y, b) facilita la adhesin del parsito a los
receptores RC3 del macrfago y su posterior
fagocitosis; ambos hechos favorecen la sobre
vida del parsito ya que su hbitat exclusivo es
esta clula.
Este parsito tiene sobre su superficie un lipo fosfoglicano (LPG) y una glucoprotena,
GP63, ambos implicados en la unin del par
sito al macrfago y a su posterior internaliza
cin; como ya se mencion, ambos participan
en los mecanismos de resistencia a las enzimas
lisosomales e inhibicin del estallido respirato
rio de estas clulas. Los promastigotes maduros
fijan C3 que se transforma en C3b, con la con
siguiente activacin de C5b-9; sin embargo, la
elongacin del LPG impedira la insercin de
C5b-9 y producira su liberacin impidiendo la
lisis del parsito.
6 - Mecanismos de patogenicidad
En ausencia de un patgeno, la respuesta in
mune especfica est limitada por mecanismos
supresores que operan a nivel clonal (redes
idiotipo-antiidiotipo) o policlonal (citoquinas
supresoras como IL-IO), pero persisten meca

Inmunologa de as infecciones parasitarias

nismos de memoria inmunolgica, asociados a
la presencia de clulas de memoria en sangre
perifrica. Las infecciones parasitarias, como ya
se ha mencionado, tienen habitualmente evolu
cin crnica, a diferencia de la mayora de las
infecciones bacterianas y virales. Como resulta
do de la cronicidad se manifiesta persistencia
antignica, que da lugar a dos fenmenos dife
rentes desde el punto de vista inmunolgico.
Por un lado, se desarrollan los mecanismos de
inmunidad concomitante y, por otro, se pueden
presentar reacciones de hipersensibilidad. En
relacin a esta liltima posibilidad, debemos con
siderar que en algunos casos existe, adems,
identidad antignica entre macromolculas del
husped y el parsito (mimetismo molecular)
dando lugar a fenmenos autoinmunes. Por otra
parte, ciertos antgenos son capaces de activar
en forma diferente subpoblaciones de linfocitos
T cooperadores (linfocitos Thl y Th2) que pro
ducen distintas linfoquinas dando lugar a las
reacciones de hipersensibilidad por activacin
de determinadas clulas efectoras (macrfagos,
eosinfilos, mastocitos, etc.).
Algunas parasitosis inducen reacciones inmunolgicas las cuales, a su vez, desempean
un papel primordial en la patogenia de la enfer
medad parasitaria. A continuacin describire
mos algunos ejemplos.
Los adultos del helm into S. mansoni viven
en las vnulas m esentricas inferiores. Las
hembras ovipositan y los huevos son arrastra
dos por la circulacin portal hacia el hgado,
quedando retenidos en el endotelio vascular
merced a la presencia de una espenla y al pe
queo calibre de algunos capilares. Los huevos
poseen gran diversidad de antgenos, que en
conjunto se denominan antgenos solubles del
huevo (SEA, soluble egg antigens), de carcter
proteico con pesos m oleculares desde m enos
de 21 kD a ms de 200 kD. Algunas de estas
protenas tienen capacidad linfoestimulatoria,
com o la p ro ten a m ayor lin fo e stim u lato ria
(LMP), cjue es una protena acdica. Los SEA
promueven, adems, la formacin de un granu
loma periovular, debido a que desencadenan
una reaccin de hipersensibilidad retardada. El
desarrollo y mantenimiento del granuloma est
bajo control de distintas subpoblaciones de lin
focitos T, que modulan el tamao del mismo
mediante citoquinas. Adems de las citoquinas
clsicamente descritas, otras ms recientemente
caracterizadas tienen un papel importante en el
desarrollo del granuloma. Por ejemplo, el fa c
tor estimulante del los fibroblastos-1 (E sF - 1 ,
PM 60 kD, pl 6,2), producido por linfocitos T
CD4, promueve la multiplicacin de fibroblas
tos y la sntesis de hialuronanos y fibronectina.
Esta ltima es, adems, un quimioatractor de
fibroblastos. Este factor sera el responsable de

527

la fibrosis heptica observada en el curso de la

infeccin. Se ha comunicado que los linfocitos
de pacien tes con fibrosis severa responden
fuertemente a antgenos del huevo de S. nmnsoni en la fase crnica. Existen evidencias que
indican que la intensidad de la resp u esta es
controlada por el MHC: individuos con haplo
tipos HLA-A2 y B12 responden fuertemente y
manifiestan fibrosis severa con mayor frecuen
cia, en tanto que pacientes con haplotipo HLADR2 tienen escasa reactividad y menor in ci
dencia de fibrosis severa.
El anlisis de clones de linfocitos T CD4 hu
manos de pacientes con esquistosomiasis revela
que estos pueden ser de tipo ThO, T hl, T h2 y
Th3 (estos ltimos producen IL-5 disociada de
la produccin de IL-4). Se ha observado que las
distintas poblaciones de Th reconocen antge
nos de diferente peso molecular. Los linfocitos
Th2 seran responsables de la produccin de an
ticuerpos y de la eosinofilia perifrica observa
das en la fase crnica de esta parasitosis. Los
SEA tam bin prom ueven la proliferacin de
clones CDS supresores (CDllb-h) y citotxicos
(C D llb -), productores de IFN-y, con capacidad
regulatoria de la formacin del granuloma. Es
tudios in vitro e in vivo demuestran que esta ci
toquina es activa en la fase de induccin y cre
cimiento del granuloma, en tanto que las IL -2 e
lL-4 son activas en la fase de mantenim iento
del mismo, probablemente mediante m ecanis
mos de retroalimentacin negativa entre los lin
focitos CD4 Thl y Th2, respectivamente. A es
tos mecanismos de retroalimentacin mediados
por citoquinas se agregaran mecanismos de re
gulacin especfica mediados por linfocitos T
autoantiidiotpicos y la accin de macrfagos
in trag ra n u lo m ato so s los cuales pro m u ev en
anergia de linfocitos T h l a SEA in vitro. La
causa de la anergia sera la modulacin de ia
molcula B7 en las clulas presentadoras de an
tgeno (CPA), con lo cual la seal coestimulato
ria para la activacin de los linfocitos T h l, ejer
cida a travs de la unin de CD28 (o CTLA-4)
a B7, no sera posible. Otras citoquinas que ten
dran un papel preponderante en la generacin
de la anergia son e\ factor de crecimiento transform ante-p (TGF-p), producido por los m acr
fagos activados presentes en el granuloma, y la
IL-10, producida por linfocitos T CD4 Th2, lin
focitos B y macrfagos. De hecho, esta citoquima es la responsable de la modulacin de B7 en
Jas CPA. Por ltimo, se ha observado que pro
tenas de choque trmico, que seran traducidas
durante la inflamacin granulomatosa, inhiben
la actividad de macrfagos como CPA m edian
te el mismo mecanismo.
Otra parasitosis en la cual se han observado
fenm enos inm unopatognicos es el p alu d is
mo. Establecida la invasin de los eritrocitos.

528

Inmunopatologa

los posteriores fenmenos que llevan a la pato

loga estn ligados con algunos de los siguien
tes mecanismos: lisis inmune de eritrocitos pa
rasitados y no parasitados, glom erulonefritis
por deposicin de inmunocomplejos y, en palu
dismo por P . falciparum, malaria cerebral.
Las propiedades adhesivas de los eritrocitos
parasitados, responsables del secuestro de eri
trocitos parasitados por P. falciparum a nivel
visceral y cerebral, estn relacionadas con la
presencia de receptores especficos en el endo
telio vascular, conocidos como molculas de
adhesin celular (CAM); gp CD36 en plaque
tas (formacin de un puente entre eritrocitos
parasitados y el endotelio vascular), ICAM-1,
tro m b o sp o n d in a, E -se le c tin a (E L A M -1) y
VCAM-1, entre otros.
En la infeccin por P. falciparum, se ha iden
tificado un antgeno presente en eritrocitos pa
rasitados (PfEMP-1) el cual est asociado a la
unin de eritrocitos al endotelio. Esta molcula
sera la responsable de la form acin de los
knobs, pequeas protuberancias en el eritroci
to, de los cuales depende la adhesin de los
mismos al endotelio vascular. La presencia de
diversas CAM que promueven la unin de eri
trocitos parasitados al endotelio es de funda
mental importancia al considerar la malaria ce
rebral y su patogenia. La formacin de microtrombos que originan focos de isquemia, hipoglucemia y necrosis, dara lugar a un proceso
inflamatorio en el que los macrfagos juegan un
papel fundamental. La liberacin de citoquinas
(L-1 y TNF) por estas clulas induce la pro
duccin NO. Este factor es producido, adems,
por los neutrfilos atrados al foco necrtico,
por las clulas endoteliales y por el mtsculo li
so vascular. El pasaje del NO desde el torrente
circulatorio al parnciuima cerebral sera posible
merced al carcter no polar de la molcula. El
NO, identificado actualmente como el Factor
relajante del endotelio vascular (EDRF) dara
lugar, como consecuencia de su liberacin lo
cal, a un aumento del volumen sanguneo cere
bral y, por consiguiente, a hipertensin endocraneana. Paralelamente, el aumento sistmico de
este mediador sera responsable de la hipoten
sin sistmica observada en algunos pacientes.
Cuadros similares se han comunicado en pa
cientes sometidos a terapia antineoplsica con
TNF, lo que apoya lo observado sobre la accin
de esta citoquina en la malaria cerebral.
Las parasitosis precedentes presentan como
rasgo caracterstico un evidente sesgo hacia m e
canismos inmunes celulares de dao tisular si
bien, como se enunci en el caso de paludismo,
los mecanismos pueden ser mixtos, con compo
nentes tanto humorales como celulares. En con
traposicin, las helmintiasis intestinales presen
tan como rasgo caracterstico un componente

inmunopatolgico primariamente desencadena;do por la respuesta humoral. En las infecciones

por nematodos se observa frecuentemente hi
perproduccin de IgE y eosinofilia perifrica. Si
bien arin no se comprende totalmente la rela
cin entre la identidad estructural de los antge
nos parasitarios y los mecanismos que determi
nan el switch de isotipo de IgM a IgE en los
linfocitos B, lo cierto es que esos antgenos pre.sentan algunas caractersticas com unes con
alrgenos ambientales, responsables de proce
sos atpicos: punto isoelctrico acdico y bajo
peso molecular (generalmente en el rango de 1 0
kD a 70 kD). Una caracterstica pecuhar de los
alrgenos de nematodos es que estos se sinteti
zan com o protenas de alto peso m olecular
(200-400 kD) formadas por unidades repetiti
vas, que son olivadas por enzimas proteolticas.
Estas protenas muestran homologa secuencial
entre s pero no con otras protenas. Sus propie
dades alergnicas dependeran de la estructura
primaria, ya que el sometimiento de las mismas
a calor no afecta estas propiedades. Estos alr
genos seran tanto componentes somticos co
mo protenas de excrecin-secrecin de los ne
matodos. Aparte de las caractersticas estructu
rales particulares de estos alrgenos, las caracte
rsticas genticas del husped parecen tener
gran importancia: en modelos experimentales se
ha demostrado que ratones endocriados con di
ferente haplotipo de histocom patibilidad res
ponden generando IgG o IgE contra el mismo
alrgeno. Aun ms, estudios realizados con ad
yuvantes demuestran que el sesgo hacia la pro
duccin de IgE estara relacionado con diferen
cias en el procesamiento y presentacin antig
nicos que determinara la expansin clonal de
clulas Th2, con la consiguiente produccin de
citoquinas inductoras del switch IgM/IgE.
Los ejemplos precedentes ilustran la comple
jidad de mecanismos inmupatognicos desen
cadenados en las parasitosis (cuadro 26-3). La
importancia de su conocimiento, a nivel celular
y molecular, reside en la posibilidad, a partir de
ello, de interferir en el desencadenamiento de
la patologa sobre la base de terapias racional
mente fundadas.
INMUNODIAGNSTICO
En parasitologa, la deteccin de anticuerpos
especficos es tradicional y se utiliza con fines
diagnsticos mientras que la respuesta mediada
por clulas, si bien se ha encontrado positiva pa
ra muchas de las infecciones parasitarias, slo
ha sido empleada para diagnstico de unas po
cas (por ej., toxoplasmosis y leishmaniasis). La
incorporacin de antgenos definidos, de mayor
especificidad, es til en el diagnstico diferen
cial de especies y/o gneros relacionados, como

Inmunologa de tas infecciones parasitarias

529

Cuadro 26-3. Mecanismos patognicos dependientes de la respuesta Inmune en algunas infec

ciones parasitarias
P atologa

M ecanism o

Parsito
S. m ansoni
Plasm odium s p p
P. fa lcip a rum

H ip e rs e n s ib ilid a d re ta rd a d a a S E A
L is is d e e ritro c ito s p a ra s ita d o s y n o p a ra sita rio s
P ro d u c c i n a u m e n ta d a d e T N F y N O

P. m alariae
D e p o s ic i n d e co tB p lejo s in m u n e s
A sca ris lum hricoides y H ip e rs e n s ib ilid a d tip o I a a n tg e n o s d e excrecino tro s n e m a to d o s

s e c re c i n

es el caso de T.cruzi y Leishmania spp. En algu

nos casos tambin se realiza la bsqueda de an
tgenos en sangre, orina, materia fecal y material
de biopsias, por tcnicas inm unoenzim ticas,
utilizando anticuerpos monoclonales o policlo
nales. Todos estos mtodos tienden a lograr una
mayor especificidad y sensibilidad diagnstica y
pueden ser sumamente tiles especialmente en
los pacientes inm unocom prom etidos. Con el
mismo propsito, recientemente se han incorpo
rado tcnicas diferentes del inmunodiagnstico,
como la deteccin de ADN por sondas especfi
cas (PCR e hibridacin).
Para el inm unodiagnstico de rutina deben
seleccionarse una o ms pruebas segn su obje
tivo. Este puede ser esclarecimiento del diag
nstico individual, prevalencia de la enferme
dad en una poblacin dada, discriminacin en
tre dadores de sangre reactivos y no reactivos,
etc. En el cuadro 26-4 se resumen las pruebas
ms utilizadas en el diagnstico de diversas p a
rasitosis.

G ra n u lo m a s h e p tic o s e in te s tin a le s
A n e m ia
M a la ria c e re b ra l, h e m a tu ria se v e ra (b la c ltw a te r f e v e r )
G lo m e ru lo n e fritis , s n d ro m e n e fr tic o
R iis h e rite m a to s o , s n d ro m e de L o e f fle r,
e n te ritis a l rg ic a

VACUNAS
La manera ideal de realizar profilaxis en en
fermedades infecciosas es contar con una vacu
na segura, que estimule la respuesta de m odo
persistente, brindando proteccin duradera a un
alto porcentaje de la poblacin que la recibe.
En la infeccin natural por virus, en general se
adquiere esta inmunidad duradera, que brinda
resistencia a reinfecciones. En el caso de los
parsitos, salvo excepciones, la resistencia a in
fecciones se relaciona con el fenmeno de in
munidad concom itante y se sospecha fu e rte
mente que desaparecida la persistencia del est
mulo antignico los mecanismos efectores de
defensa disminuiran hasta hacerse inefectivos.
Este fenmeno llega a su mxima expresin en
los casos de paludismo, donde la resistencia se
adquiere despus de aos de infecciones recu
rrentes y se extingue rpidamente a menos que
la persona est expuesta a reinfecciones fre
cuentes.

C uadro 26-4. Mtodos de inmunodiagnstico utilizados en parasitologa

In m unidad hum oral
Parasitosis

D eteccin de antgeno

Serologa

ID R

Inm unidad c e lu la r
IDR

No

No

No
No
No
No
N o

No
S
No
No
N o*

No
No
No
No
No
No

Protozoarios
A m e b ia s is

C I E (su e ro ), E L IS A
( m a te ria fec a l)
P a lu d is m o
E L IS A
L e ish m a n ia s is
IF I, P A P
T r ip a n o s o m ia s is a m e ric a n a IP , P A P
T r ip a n o s o m ia s is a fric a n a
E L IS A ( a g u d o s o r e a c ti
T o x o p la sm o s is
v a c io n e s )

F C , FIA I, lE F , IP , E L IS A
E C , H A I, IF I, E L I S A . R IA
F C , IF I, H A I, A D , E L IS A
F C , H A I, IF I, A D , E L IS A
F C , IF I, IP , H A I, A D , E L IS A
E L IS A , D T , IF I, H A I,
IS A G A (Ig M )

H elm intos
T riq u in o s is
T o x o c a ria s is
A s c a rid ia s is
E squi.stosom iasi,s
H id a tid o s is
C is tic e rc o s is

E L IS A , I F I

H A I, IF I, IP , T F , T E
E L IS A , H A I
E L IS A , H A I
F C , IF I, IP , T F , E L IS A
F C , H A I, lE F , IP , T F , T L
C IE , H A I, E L I S A

No
No

A D : a g lu tin ac i n d irec ta, C IE : c o n tra in m u n o e lectro fo resis, D T : d y t-test (S ab i-F cld m an ), FC; fijacin d e co m p lem e n to , H A I: h e m o a g lu tin a
cin in d irec ta , ID R : in trad e rm o rre acc i n , lE F : in m u n o elec tro fo re sis, IP: in m u n o p rec ip itac i n , IS A G A : te s t de in m u n o ag lu tin a ci n e n fase
s lid a , P A P : p ero x id a sa-a n ti-p ero x id a sa , R A : ra d io in m u n o an lisis, T L : test d e ltex .
* S lo e x c ep c io n a lm e n te en alg u n o s pases.

530

Inmunopatologa

En el desarrollo de una vacuna tambin debe

considerarse la seguridad de la misma. Esto
implica que no pueda revertir en su virulencia
(riesgo de las vacunas de microorganismos ate
nuados ) y que no contenga molculas nocivas
para quien ser vacunado. Si consideramos que
en numerosas enfermedades parasitarias el da
o es de carcter inmunolgico, deber descar
tarse el riesgo de producir dao con los antge
nos parasitarios que compongan la vacuna. Si a
estas dificultades le agregamos ios mecanismos
de escape de la respuesta inmune que pueden
poner en marcha los parsitos y los cambios
antignicos que los mismos sufren durante sus
sucesivos estadios evolutivos, entendemos por
qu an no se han desarrollado vacunas efecti
vas contra parsitos de inters humano.
Sin embargo, el conocimiento molecular de
los parsitos est abriendo uno de los caminos
posibles para el desarrollo de inm ungenos
efectivos. Este conocimiento est permitiendo
determinar qu molculas estn implicadas en
la seleccin del husped y, dentro de l, la se
leccin del tejido o clula en que el parsito se
instalar, las seales que se inician desde la
membrana del parsito y que son indispensa
bles para que se gatille su diferenciacin a un
nuevo estadio (sin esta diferenciacin se inte
rrumpe el ciclo), las molculas distractoras de
la respuesta inmune que se constituyen en ant
genos mayores y que protegeran a otros de
menor antigenicidad pero cuya funcionalidad
es indispensable para la sobrevida del parsito.
Como los parsitos tienen un ciclo complejo
y como en cada parte del ciclo pueden variar
las molculas im plicadas en cada uno de los
procesos antes mencionados, es muy probable
que para alcanzar una vacuna efectiva deba
considerarse el uso com binado de antgenos
destinados a interrumpir el ciclo en na suma
toria de blancos. Un ejemplo podra ser una va
cuna anti-paldica que interfiera tanto con la
CSP*** a un receptor del hepatocito, iniciando
as su invasin, como en el establecimiento del
parsito en el eritrocito, disminuyendo la carga
parasitaria y la incidencia de formas clnicas.
La eficiencia parcial, por separado, se ha pro
bado en ambos casos, por lo que hoy ya se pue
de hablar de vacuna antim.alaria, aunque toda
va falten estudios para que la misma se apli
que sistemticamente a la poblacin en riesgo,
y aunque, por el momento, no se haya pensado

en el uso de ambas molculas para lograr una

vacuna combinada.
Actualmente, se est trabajando en diversos
laboratorios del mundo con el objeto de identi
ficar molculas con capacidad de inducir pro
teccin contra diferentes parsitos tales como
Schistosoma spp., T.cruzi, Leishmania spp. y
T.spiralis, entre otros.

BIBLIOGRAFA
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Inmunologa en las infecciones

virales

RAMN A. DE TORRES
JUAN ANGEL BASUALDO
MARTA C. MINVIELLE

1. Introduccin
Las caractersticas biolgicas de los agentes
virales, su difcil visualizacin por microscopa
electrnica y el necesario desarrollo de m ode
los vacunales aplicados al control de las infec
ciones humanas y anim ales, han generado la
necesidad de un estudio profundo de la re s
puesta inmune en el campo de la virologa.
Aiin hoy la caracterizacin de una poblacin
viral se basa fundamentalmente en la capacidad
de estos virones de infectar clulas suscepti
bles y su reconocimiento posterior est relacio
nado siempre, en forma directa o indirecta, con
cualquiera de las muchas tcnicas que se basan
en principios inmunolgicos.
A travs de la historia, las vacunas han sido
las formas ms efectivas e importantes de con
trolar las infecciones virales.
El gran desarrollo cientfico en los campos
de la virologa y de la inmunologa ha perm iti
do comprender los mecanismos de proteccin
por los cuales algunas vacunas desarrolladas
casi empricamente hace muchos aos, han ser
vido en el control de las enfermedades virales
de alta incidencia en seres humanos y anim a
les. Este avance, sin embargo, es an insufi
ciente para explicar muchos fenmenos de ia
relacin virus-husped en infecciones agudas,
crnicas, degenerativas y oncognicas, lo que
mantiene la necesidad de una profunda y conti
nua investigacin de estos problemas.
El estudio de la respuesta inmune en la in
feccin viral de un individuo incluye fu n d a
mentalmente los siguientes aspectos;
a) establecer la cintica de sntesis de ant
genos virales y su localizacin en las clulas en

las que se inicia la infeccin y los blancos en

tejidos secundarios, cuando los hay;
b) establecer cualitativa y cuantitativamente
las caractersticas de la respuesta inmune h u
moral, informando sobre la cintica de sntesis
de inmunoglobulinas. Este estudio se completa
correlacionando su aparicin con mecanismos
especficos de reaccin con los antgenos vira
les, como formacin de complejos inmunes, in
duccin de citotoxicidad mediada por com ple
mento, fenmenos de bloqueo, etc.;
c) detectar y cuantificar las modificaciones
que se producen en las clulas inmunocompe
tentes, en funcin de la agresin viral, con es
pecial referencia a la capacidad de clulas lin
foides tipo T de reconocer e interaccionar con
clulas infectadas (inmunidad mediada por c
lulas);
d) estudiar la respuesta general inespecfica,
analizando la participacin del interfern en el
curso de la infeccin u otros mediadores (linfo
quinas) asociados al fenmeno de respuesta in
flamatoria. En este nivel inespecfico la im por
tancia de clulas con capacidad citotxica natu
ral (NK, natural killer) y clulas con funciones
endocticas es cada vez ms evidente en el con
trol del inicio de la infeccin viral.
Cuando esta informacin se correlaciona es
tadsticam ente con la evolucin clnica y los
estudios citoanatomopaolgicos, recin enton
ces se puede construir un cuadro descriptivo
completo de la enfermedad, que es la base ne
cesaria para establecer la correcta aplicacin e
interpretacin de tcnicas de laboratorio en
funcin diagnstica. De una manera fundam en
tal, la integracin de un slido estudio inmunolgico perm itir com prender los mecanism os

530

Inmunopatologa

En el desarrollo de una vacuna tambin debe

considerarse la seguridad de la misma. Esto
implica que no pueda revertir en su virulencia
(riesgo de las vacunas de microorganismos ate
nuados ) y que no contenga molculas nocivas
para quien ser vacunado. Si consideramos que
en numerosas enfermedades parasitarias el da
o es de carcter inmunolgico, deber descar
tarse el riesgo de producir dao con los antge
nos parasitarios que compongan la vacuna. Si a
estas dificultades le agregamos ios mecanismos
de escape de la respuesta inmune que pueden
poner en marcha los parsitos y los cambios
antignieos que los mismos sufren durante sus
sucesivos estadios evolutivos, entendemos por
qu an no se han desarrollado vacunas efecti
vas contra parsitos de inters humano.
Sin embargo, el conocimiento molecular de
los parsitos est abriendo uno de los caminos
posibles para el desarrollo de inm ungenos
efectivos. Este conocimiento est permitiendo
determinar qu molculas estn implicadas en
la seleccin del husped y, dentro de l, la se
leccin del tejido o clula en que el parsito se
instalar, las seales que se inician desde la
membrana del parsito y que son indispensa
bles para que se gatille su diferenciacin a un
nuevo estadio (sin esta diferenciacin se inte
rrumpe el ciclo), las molculas distractoras de
la respuesta inmune que se constituyen en ant
genos mayores y que protegeran a otros de
menor antigenicidad pero cuya funcionalidad
es indispensable para la sobrevida del parsito.
Como los parsitos tienen un ciclo complejo
y como en cada parte del ciclo pueden variar
las molculas im plicadas en cada uno de los
procesos antes mencionados, es muy probable
que para alcanzar una vacuna efectiva deba
considerarse el uso com binado de antgenos
destinados a interrumpir el ciclo en na suma
toria de blancos. Un ejemplo podra ser una va
cuna anti-paldica que interfiera tanto con la
CSP*** a un receptor del hepatocito, iniciando
as su invasin, como en el establecimiento del
parsito en el eritrocito, disminuyendo la carga
parasitaria y la incidencia de formas clnicas.
La eficiencia parcial, por separado, se ha pro
bado en ambos casos, por lo que hoy ya se pue
de hablar de vacuna antim.alaria, aunque toda
va falten estudios para que la misma se apli
que sistemticamente a la poblacin en riesgo,
y aunque, por el momento, no se haya pensado

en el uso de ambas molculas para lograr una

vacuna combinada.
Actualmente, se est trabajando en diversos
laboratorios del mundo con el objeto de identi
ficar molculas con capacidad de inducir pro
teccin contra diferentes parsitos tales como
Schistosoma spp., T.cruzi, Leishmania spp. y
T.spiralis, entre otros.

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Inmunologa en las infecciones

virales

RAMN A. DE TORRES
JUAN ANGEL BASUALDO
MARTA C. MINVIELLE

1. Introduccin
Las caractersticas biogicas de los agentes
virales, su difcil visualizacin por microscopa
electrnica y el necesario desarrollo de m ode
los vacunales aplicados al control de las infec
ciones humanas y anim ales, han generado la
necesidad de un estudio profundo de la re s
puesta inmune en el campo de la virologa.
Aiin hoy la caracterizacin de una poblacin
viral se basa fundamentalmente en la capacidad
de estos virones de infectar clulas suscepti
bles y su reconocimiento posterior est relacio
nado siempre, en forma directa o indirecta, con
cualquiera de las muchas tcnicas que se basan
en principios inmunolgicos.
A travs de la historia, las vacunas han sido
las formas ms efectivas e importantes de con
trolar las infecciones virales.
El gran desarrollo cientfico en los campos
de la virologa y de la inmunologa ha perm iti
do comprender los mecanismos de proteccin
por los cuales algunas vacunas desarrolladas
casi empricamente hace muchos aos, han ser
vido en el control de las enfermedades virales
de alta incidencia en seres humanos y anim a
les. Este avance, sin embargo, es an insufi
ciente para explicar muchos fenmenos de la
relacin virus-husped en infecciones agudas,
crnicas, degenerativas y oncognicas, lo que
mantiene la necesidad de una profunda y conti
nua investigacin de estos problemas.
El estudio de la respuesta inmune en la in
feccin viral de un individuo incluye fu n d a
mentalmente los siguientes aspectos;
a) establecer la cintica de sntesis de ant
genos virales y su localizacin en las clulas en

las que se inicia la infeccin y los blancos en

tejidos secundarios, cuando los hay;
b) establecer cualitativa y cuantitativamente
las caractersticas de la respuesta inmune h u
moral, informando sobre la cintica de sntesis
de inmunoglobulinas. Este estudio se completa
correlacionando su aparicin con mecanismos
especficos de reaccin con los antgenos vira
les, como formacin de complejos inmunes, in
duccin de citotoxicidad mediada por com ple
mento, fenmenos de bloqueo, etc.;
c) detectar y cuantificar las modificaciones
que se producen en las clulas inmunocompe
tentes, en funcin de la agresin viral, con es
pecial referencia a la capacidad de clulas lin
foides tipo T de reconocer e interaccionar con
clulas infectadas (inmunidad mediada por c
lulas);
d) estudiar la respuesta general inespecfica,
analizando la participacin del interfern en el
curso de la infeccin u otros mediadores (linfo
quinas) asociados al fenmeno de respuesta in
flamatoria. En este nivel inespecfico la im por
tancia de clulas con capacidad citotxica natu
ral (NK, natural killer) y clulas con funciones
endocticas es cada vez ms evidente en el con
trol del inicio de la infeccin viral.
Cuando esta informacin se correlaciona es
tadsticam ente con la evolucin clnica y los
estudios citoanatomopaolgicos, recin enton
ces se puede construir un cuadro descriptivo
completo de la enfermedad, que es la base ne
cesaria para establecer la correcta aplicacin e
interpretacin de tcnicas de laboratorio en
funcin diagnstica. De una manera fundam en
tal, la integracin de un slido estudio inmunolgico perm itir com prender los mecanism os

532

Inmunopatologa

ntimos de patogenia de la infeccin, con lo

cual se podrn desarrollar racionalmente mode
los de inmunizacin preventiva o ensayar trata
mientos con drogas, ya sean antivirales directos
o moduladores de la respuesta inmune.
En forma general, puede decirse que los sig
nos y los sntomas de las enfermedades virales
son la culminacin de una serie de interaccio
nes entre los virus y el husped. Entre muchos
otros aspectos quiz ahora sea necesario llamar
la atencin sobre la gran diferencia que existe
en la infeccin por virus que, una vez que ata
can a un individuo, son eliminados (polio, sa
rampin, paperas) y las que producen virus que
persisten en el infectado (herpes, HBV, HIV y
otros).
De manera simple, podemos mencionar que
diversos factores participarn en la defensa del
husped.
1) Defensas constitutivas
La edad del husped. Los neonatos, por
ejemplo, son particularmente susceptibles
a las infecciones diseminadas severas por
el virus herpes simple (HSV). En contras
te, muchas de las enfermedades exantematosas, la infeccin por poliovirus y la
infeccin por el virus de E p stein -B arr
(EBV) tpicamente son ms severas en los
individuos ms viejos que en los nios.
Estado nutricional. Si el husped posee un
estado nutricional inadecuado tiene mayor
susceptibilidad a diversas infecciones vi
rales, por ejemplo, en el sarampin existe
una mayor morbilidad en nios desnutri
dos.
2) Defensas inducidas
Inmunoglobulinas. La mayor parte de los vi
rus actan como buenos antgenos, y generan
una respuesta de inmunoglobulinas que, por lo
comn, no desempean un papel primario en la
terminacin de las infecciones virales agudas
aunque son muy importantes para prevenir las
reinfecciones. Especialmente, la actividad de
anticuerpos neutralizantes que pueden inhibir
diversos pasos del ciclo de replicacin, como la
adherencia, la penetracin o el desnudamiento
de los virus. Adems, estos anticuerpos pueden
producir la agregacin de los viriones, lo que
facilita su fagocitosis.
Complemento. Los virus pueden desencade
nar la activacin del complemento por va al
terna y por va clsica, aun en ausencia de la
respuesta de anticuerpos. Los componentes del
com plem ento activado pueden actuar in cre
mentando la inflamacin y pueden producir la
lisis de los virus envueltos o de las clulas in
fectadas por virus. No es probable que este sis
tema desempee un papel tan importante en la

defensa contra las infecciones virales como,

contra las infecciones bacterianas, pues en los
estados de hipocomplementemia no se asocian
con un aumento de la frecuencia o de la severi
dad de las enfermedades virales.
Inmunidad mediada por clulas. Es el prin
cipal factor en la terminacin de las infecciones
virales y en la patogenia de estas enfermeda
des.
D ebido a que los virus son intracelulares,
son susceptibles a la accin de los linfocitos
que reconocen antgenos virales en la superfi
cie celular. Estas clulas infectadas pueden ser
lisadas por linfocitos por va de la citotoxicidad
independiente y dependiente de anticuerpos.
De forma independiente de los anticuerpos,
la accin de las clulas natural killer (NK)
proporciona una de las defensas ms tempranas
del husped contra las infecciones virales (2-3
das) y precede a la aparicin de anticuerpos
(5-7 das). Estas clulas son activadas inespeefieamente por los interferones.
La cito to x icid ad an ticu erp o -d ep en d ien te
(ADCC) est mediada por anticuerpos especfi
camente unidos a los antgenos virales expresa
dos en la superficie de las clulas infectadas.
Estas inmunoglobulinas interactan por su por
cin Ec con los receptores Fe de las clulas ki
ller (LK) y esta interaccin da como resultado
la activacin de las clulas LK y la posterior
destruccin de la clula blanco. Los macrfa
gos, los linfocitos y los neutrfilos tambin po
seen receptores Fe y colaboran en la ADCC,
Se agregan los linfocitos T citotxicos con
capacidad ltica especfica para destruir clulas
infectadas por virus. Adems, como veremos
ms adelante, se suma la actividad de los linfo
citos T de hipersensibilidad (L T jJ, especial
mente en las infecciones virales persistentes,
Interferones. Adems de la respuesta hum o
ral y celular, las infecciones virales provocan
un mecanismo de defensa inducible: los inter
ferones, Estos inhiben la replicacin viral de
forma indirecta, por induccin de la sntesis de
protenas celulares que reducen o bloquean la
multiplicacin de los virus.
La cantidad de interfern producida vara
con los diferentes virus. Todos los interferones
actan en concentraciones muy bajas y, en ge
neral, son muy activos en las clulas de la es
pecie en la cual son inducidos (especficos de
especie) supuestamente, debido a la variacin
evolutiva de la naturaleza de los receptores de
los interferones.
Los interferones son producidos por la des
represin de genes celulares inducida por la
presencia de cido nucleico viral en el citoplas
ma de la clula husped. Esto provoca la pro
duccin de ARN, para los interferones y la p os
terior sntesis de stos.

Inmunologa en las infecciones virales

Los interferones neoproducidos son libera
dos hacia el lquido extracelular y all se unen
con los receptores especficos en las clulas ad
yacentes. Por esto, los interferones tienden a
actuar de forma local ms que sistmica.
Adems de bloquear la replicacin viral, los
interferones aumentan la actividad de las clu
las NK, de los linfocitos T citotxicos y de
las clu las in v o lu crad as en las reaccio n es
ADCC.
Como resumen podemos indicar que el m e
canismo de defensa inducido ms im portante
contra las infecciones virales es la inmunidad
mediada por clulas. Los pacientes con buena
respuesta m ediada por anticuerpos, pero con
defectos en su inmunidad celular generalmente
se recuperan mal de las infecciones virales. La
inversa, buena respuesta celular y anormal res
puesta humoral, no trae graves consecuencias
para el paciente en las enfermedades virales.
En el ltimo cuarto de siglo se ha ampliado
el concepto de la respuesta inmune en las en
fermedades virales, individualizando un com
plejo repertorio de problem as que deben ser
analizados individualmente. Respuestas como
las asociadas a polio o viruela, contrastan con
las inducidas por rubola congnita, coriomeningitis, hepatitis B, infeccin por agentes del
grupo herpes o aquellas inducidas por retrovi
rus humanos.
Es necesario entonces revisar conceptos es
tructurales de algunos virus para comprender
su grado de diversidad y, sobre todo, analizar
los problemas que se generan cuando algunos
agentes infectan a un individuo y su accin no
culmina con la destruccin de las clulas infec
tadas, sino que se establece un tipo de equili
brio con subsistencia de la clula husped y del
material gentico viral. En estos casos, la per
sistencia viral se traduce en un nmero grande
de variables que inducen respuestas inm unes
altamente complejas.
En este captulo trataremos de dar un pano
rama general del problema asociado a las res
puestas inmunes en infecciones virales y m os
trar slo algunos ejemplos de relaciones virushusped en humanos, que derivan de la persis
tencia de la infeccin viral. Se procurar poner
en evidencia cmo tm mismo agente infeccioso
puede condicionar en el mismo husped enfer
medades (patologas) muy diferentes, lo cual
depende de la relacin que se establezca entre
el virus y la respuesta inmune.
Con la excusa form al de que no son virus
verdaderos, pero honestamente por la poca cla
ridad que existe sobre el problema, aun para
quienes trabajan directamente en el tema, no se
hace referencia ampliada sobre la respuesta in
mune en las infecciones por agentes virales
no convencionales (priones, viroides).

533

2. Complejidad estructural de los agentes

virales
El nivel de conocimiento actual permite re
conocer que, en el conjunto de los virus, estn
incluidos agentes infecciosos que difieren n eta
mente entre s, no slo en lo estructural sino
tambin en el ejercicio de sus funciones. C ons
tituye un objetivo de este trabajo hacer resaltar
las diferencias estructurales de algunos m ode
los, para reforzar el concepto de heterogenei
dad en virologa. Se intenta de esta forma supe
rar poco a poco la interpretacin inexacta con
que a veces se engloba a los virus en un grupo
taxonmico poco diferenciado.
En las figuras 27-1 a 27-5, se presentan dia
gramas de los modelos estructurales de los vi
rus de poliomielitis, rubola, herpes simple h e
patitis B (HBV) y HIV (Virus de la Inmunodeficieneia Humana).
Es de importancia resaltar las diferencias de
tamao de las partculas y las diferencias cuali
tativas (ARN o ADN) y cuantitativas (funda
mentalm ente el peso molecular) de los genomas respectivos. El HBV tiene como genom a
ADN de doble cadena circular de peso m olecu
lar 1, 6 X 10 daltons. El herpes, cuyo genoma
es ADN, es lineal y tiene un peso molecular de
100 X 10 daltons. El genoma de poho y de ru
bola es ARN, pero de 2 x 10 daltons el p ri
mero y de 3,6 x 10 el de rubola.
Esto indica que la capacidad gentica de in
formacin de estos agentes vara desde la posi
bilidad de codificacin de unas pocas protenas
estructurales y no estructurales, como es el ca
so de poliovirus, a la de promover la sntesis de
ms de 30 polipptidos distintos como en el ca
so de herpes virus.
La rubola puede plantearse como un caso
cuantitativamente similar a la polio, pero cua
litativam ente ms com plejo (protenas co m
plejas), y la informacin de que se dispone so
bre hepatitis indica una capacidad m ayor que
la de la rubola en cuanto a diversidad de po
lipptidos.
Al final del captulo se indica la capacidad
gnica del retrovirus HIV, agente etiolgico del
Sndrom e de In m unodeficiencia A dquirida.
Ntese en este agente la presencia de una enzi
ma que sintetiza ADN a partir de ARN y que le
permite una estrategia infectiva muy compleja.
Para el caso del virus de la Hepatitis B, se ha
logrado una aproximacin muy importante.
En la actualidad se conoce en form a muy
precisa la secuencia del ADN viral, sus genes y
los productos de expresin de stos. Se identi
fican perfectamente los polipptidos de los an
tgenos de superficie y sus secuencias lim itan
tes, al igual que aquellos pertenecientes a la in
formacin para core.

534

Inmunopatologa
Fig. 27-1. D ia g ra m a d e p o lio v iru s c o n sii
f o r m a ic o s a d ric a d e s n u d a . L a s p r o te n a s
p rin c ip a le s n o p o s e e n re s id u o s g lu c o s ila d o s .

P r o te n a s e s tru c tu ra le s p rin c ip a le s

G enom a

A R N m o n o c a te n a ria
2 X 10' d a lto n s

P rotena

N" de unidades
p o r virin

Peso m olecular
en daltons

VP,

34

3 5 .0 0 0

VPj

53

2 8 .0 0 0

VP,

68

2 4 .0 0 0

VP.,

41

8 .0 0 0

Tomando simplemente un concepto estructu

ral, en funcin del total de protenas que estn
asociadas a los viriones completos de los agen
tes mencionados, podemos asegurar que la in
yeccin de virus inactivado en un husped inmunocompetente inducir una respuesta distin

ta en cada caso. Distinta en funcin del tamao

del antgeno particulado inicial y de la calidad
antignica; 4 a 5 polipptidos en el caso de po
liovirus, 4 a 5 en el de rubola virus, 8 a 9 en el
de hepatitis y 33 en el caso de herpes virus. En
este ltimo, as como en rubola y hepatitis, se

Nucleoprotena interna
ARN monocatenario 3,6 x
10daltons
Firmemente unido a VP,
(protena interna) de
35.000 daltons
Envoltura
Sensible a detergentes
y solventes de lpidos
Contiene glucoprotenas
VP, (62.000 daltons)
VP^ (47.500 daltons)
Un complejo de la
envoltura
de la capacidad
hemoaglutinante

Protenas principales
Genoma

a.I;-

VP, 35.000 daltons

3
VP, 62.000 daltons

ARN monocatenario
3,6 X 10 daltons

Ovo, 47.500 daltons

Fig. 27-2. D ia g ra m a d e v iri n c o n -e s p o n d ie n te a ru b o la en el q u e c ie rta s p ro te n a s d e la e n v o ltu ra s o n g lu c o p ro te n a s . L a

e s tru c tu ra d e la e n v o ltu ra e s s e n s ib le al tra ta m ie n to c o n d e te rg e n te s y s o lv e n te s d e lp id o s.

Inmunologa en las infecciones virales

535

Envoltura
Tegumento
Nucleocpside

Capsmero

F ig . 2 7 -3 . D ia g ra m a d e l v iri n d e h e rp e s q u e m u e s tra su g ran c o m p le jid a d . E l A D N tie n e u n p e s o m o le c u la r d e 1 0 0 x 10^,

uno d e lo s m a y o re s g e n o m a s v ira le s , a p ro x im a d a m e n te 3 0 p ro te n a s e s tru c tu ra le s . U n p p tid o in te rn o f irm e m e n te a s o c ia
d o a A D N r ic o e n a rg in in a . G lu c o p ro te n a s a so c ia d a s a u n a e n v o ltu ra . U n p p tid o c a p s o m ric o , re p e tid o 3 v eces p o r c a d a
c a p s m e ro . L a e n v o ltu ra es se n sib le a d e te rg e n te s y s o lv e n te s lip id e o s , Jo q u e re d u c e en fo rm a im p o rta n te la in fe c tiv id a d .

alcanza un alto grado de complejidad cualitati

va, especialmente en algunas glucoprotenas y
lipoproteinas que no han sido detectadas en po
liovirus.
Hay protenas antignicas asociadas al virin
(estructurales) y otras que se sintetizan slo
cuando el virus se multiplica (no estructurales);
esto marca la diferencia entre vacunas de virus
muertos (antgenos estructurales) y vacunas
de virus vivos en las que el individuo respon
de a la constelacin total (estructurales y no es
tructurales).
As la inoculacin de un virin de herpes
sim ple inactivado, inoculado prom ueve una
respuesta a 30-33 polipptidos mientras que,
cuando replica en clulas humanas, el indivi
duo se ve expuesto a un nitmero mayor de ant
genos (alrededor de 59).
3. Breve consideracin sobre los distintos
tipos de infeccin viral y su relacin con
la patogenia
Hemos planteado antes ejemplos de diversi
dad estructural. Es fcil comprender que estos
agentes tambin tengan diferentes mecanismos
de replicacin, lo cual nos indica que, cuando
infectan a un husped susceptible inmunocompetente, la respuesta inmune tendr una com

plejidad de mecanismos y una cintica tambin

distintas.
Existen agentes virales, como el poliovirus,
que cu an d o in fe c ta una c lu la su sc e p tib le
cumple con un ciclo de replicacin que culm i
na con la lisis celular. Este tipo de infeccin se
llama genricamente infeccin ltica. L a pato
genia y la respuesta inmune que genera estn
en funcin de este mecanismo que define esta
cl sic a evolu ci n den o m in ada en ferm ed ad
aguda.
El virus de rubola puede inducir una infec
cin de tipo ltico, pero con facilidad puede re
plicarse en clulas que no evolucionan en for
ma inmediata a la lisis y que pueden continuar
produciendo virus por largos perodos. Obvia
m ente, en este tltimo caso la patogenia y la
respuesta inmune son mucho ms com plejas
que en el caso de polio. En la rubola del adul
to los mecanismos generales de respuesta pue
den ser explicados por un tipo de infeccin de
resolucin aguda, parecido al que genera polio
en la enfermedad paraltica. En cambio, en la
rubola congnita, se observa la persistencia de
produccin de virus por ciertas clulas del feto
y el recin nacido, durante largos perodos, y
una respuesta inmune muy particular en la que
se ha llegado a manejar la expresin de tole
rancia pasajera.

536

Inmunopatologa

P artcula de Dae

20 nm

F ig . 2 7 -4 . D ia g ra m a d e la e s tru c tu ra d e l a g e n te d e la h e p a titis B . L a e n v o ltu ra H B s A g ( a n tg e n o d e s u p e rfic ie ) e s e n r e a li

d a d u n a m e z c la d e e s p e c ific id a d e s a n tig n ic a s d e v a rio s p o lip p tid o s .

Para ampliar el concepto de distintos tipos

de infeccin viral y su compleja relacin con la
respuesta inmune y la patogenia, hemos toma
do las infecciones humanas con el virus herpes
simple (HSV) y con el HBV en las que existe
una gama de variables en los sndromes que in
ducen (agudos y crnicos). Se incluye adems
una brevsim a referencia a la infeccin con
HIV (SIDA) para incorporar un modelo en que
la evolucin de la enfermedad depende de la
relacin directa del virus con clulas del siste
ma inmune. Es relativam ente fcil asociar la
diversidad de la respuesta inmune en funcin
de virus estructuralmente distintos.
Se debe tener en cuenta que en el caso de
herpes, rubola, hepatitis y HIV, los diferentes
tipos de infeccin viral que condicionan varia
das patogenias y, obviamente, distintas cinti
cas de respuestas inm une, no son originados
por distintas especies virales, sino por diversas
relaciones virus-clula, originadas por un mis
mo tipo de virus, incluso en un mismo hus
ped. Es bien conocido que el virus herpes sim
ple (tipo 1 y tipo 2 ), produce enfermedades pri
maria y recurrente, las que tienen relacin con
el tipo de infeccin ltica y el fenmeno de la
tencia, respectivamente. Esto nos permite reco
nocer que habr una infeccin en la cual el m e
canismo de replicacin inducir la muerte celu
lar o alteraciones profundas como formacin
de sincitios, cariorrexis, inclusiones, etc., y,
asociada, una respuesta inflamatoria e inmune
localizada que genera las tpicas lesiones de la
enfermedad herptica aguda.

Habr, adems, otro tipo de infeccin que

no termina con las funciones celulares, pero en
el que la produccin de viriones est regulada
por distintos mecanismos, y este proceso que
da interrumpido por perodos variables. Efec
tores fsicos o qumicos, variaciones en el esta
do inmune del husped, reestablecen la sntesis
viral y se produce la recurrencia. Esto ocurre
en presencia de anticuerpos circulantes neutra
lizantes y la paradoja se explica en funcin de
que el virus puede invadir nuevas clulas sus
ceptibles, pasando de clula a clula, sin salir a
los espacios intercelulares. El virus se aloja en
neuronas de ganglios del trigmino o sacros y
desde stas alcanza los sitios perifricos, via
jando por los espacios intraaxonales. Factores
emocionales, irradiacin, fiebre, etc., producen
las tpicas recurrencias herpticas. Los meca
nismos de latencia, las caractersticas de las
clulas donde el virus se acantona, el proceso
de reactivacin, son motivo de estudio.
En los casos anteriores, infeccin prim aria
y recurrencia, el individuo produce anticuer
pos contra el total de las protenas inducidas
por herpes, las estructurales y las no estructu
rales.
Sobre este problema de la infeccin herpti
ca se brinda ms informacin al final del cap
tulo.
La hepatitis B puede evolucionar bajo for
mas clnicas anictricas inaparentes, agudas,
crnicas o fulminantes, con lo cual puede su
ponerse que distintos tipos de infeccin o res
puestas las estn condicionando. Lamentable

Inmunologa en las infecciones virales

537

F ig . 2 7 -5 . V ir u s de l S ID A . E l g e n o
m a es A R N , p e ro Ja e n z im a tra n s c rip
ta s a in v e rs a s in te tiz a A D N v ira l a p a r
tir d e a q u l, y e s te A D N p u e d e in te
g ra rs e al genom a ceJular. D e e s ta f o r
m a p u e d e n e s ta b le c e r s e s is te m a s p r o
d u c tiv o s (lric o s o n o ) d e v iru s o la in
te g ra c i n determ ina el e s ta d o d e p r o
v irus.

m ente, el tnico m odelo v iab le fu era de la

in f e c c i n h u m a n a es el c h im p a n c , en
consecuencia muchos estudios resultan imita
dos.
Es un hecho demostrado que un nmero de
enfermos evoluciona de forma que el antgeno
asociado a la hepatitis B persiste en el indivi
duo por tiempos variados, llegando a aos, lo
que plantea obviamente una respuesta inmune
de alta complejidad. Este modelo ser analiza
do ms adelante.
En los ltimos aos se han reconocido infec
ciones virales cuya caracterstica principal es
que las clulas en las cuales el virus se replica
son clulas del sistema celular inmunocompetente.
Es de inters reconocer que dentro de este ti
po de infeccin, en una generalizacin muy
elemental, tenemos dos tipos de respuesta dife
rentes:
1. Virus -f clula; generalmente resulta en
proliferacin celular limitada o que puede re
sultar en cierto tipo de anomalas permanentes
(caso de citomegalovirus CMV y linfocitos).
2. Virus + clula: destruccin celular (caso
de virus HIV, clula T4+ [helper]).
En todos estos casos, mediado por m ecanis
mos bioqumicos diferentes para los virus EBV
y CMV con respecto al HIV, la infeccin se
perpeta en el individuo que queda sujeto a va
riaciones dei equilibrio que pueden dar diferen

te s
c o n

s ig n o s

s n to m a s ,

e n

f o rm a

p e rm a n e n te

re c u iT e n c ia s in te r m ite n te s .

La persistencia vira! parece ser un factor que

asocia las funciones genticas virales con la
evolucin degenerativa o proliferativa de teji
dos infectados.
La asociacin de la infeccin viral con dis
plasias severas, carcinoma in situ de cuello de
tero y sus variantes invasoras, carcinoma pri
mario de hgado, leucemias y linfom as, etc.,
parece reconocer una relacin necesaria pero
no suficiente. En todos los casos, complejas in
terrelaciones con el sistema inmune son las que
definen la evolucin.
El objetivo fundamental de introducir la va
riante distintos tipos de infeccin viral es dejar
claros dos aspectos muy generales pero altamen
te prcticos: a) diferentes tipos de virus inducen
distintos mecanismos de infeccin y obviamente
patogenia y respuesta inmune diferentes cuando
infectan al hombre u otro husped. No es posi
ble hablar de un solo tipo de respuesta inmune
en todas las infecciones virales, y b) un mismo
tipo de virus en un mismo husped puede, en
funcin de los mecanismos de relacin virus-c
lula, inducir distintos tipos de infeccin que se
traducirn en modelos de patogenia diferentes y
en respuestas inmunes cuya calidad y cantidad
sern funcin del tipo de infeccin.
Inversamente, puede pensarse que luego de
una infeccin viral primaria la respuesta inmu
ne ser la que condicione el tipo de infeccin,
persistente o no, que se establezca.

Inmunopatologa
Debemos fijar el concepto de que todos los
aspectos relacionados con la respuesta inespe
cfica, la cintica de sntesis de las distintas in
munoglobulinas y los procesos de diferencia
cin celular asociados, no son iguales para todo
el conjunto de los virus, y que en la infeccin
de un mismo husped, por un mismo tipo de
virus, pueden obtenerse respuestas distintas se
gn la relacin de equilibrio que se establezca.
De lo expuesto surge como conclusin que
para efectuar el diagnstico de laboratorio fun
dado en estudios de exploracin inmunolgica
debemos analizar y conocer todas las respuestas
posibles que las infecciones con un virus deter
minado pueden originar. Ello plantea una per
manente bsqueda de nuevos sistemas de estu
dio, que incluyen el mejoramiento y el desarro
llo de nuevos reactivos (sueros y antgenos) y
tcnicas de deteccin de fcil aplicacin y clara
interpretacin. La toma de muestras apropiadas,
en funcin del tipo de antgeno o inmunoglobu
linas que se desee detectar, es una exigencia
esencial, sobre todo teniendo en cuenta el pero
do de evolucin de la enfermedad.
Obviam ente, el diseo de un inm ungeno
destinado a prevenir una enfermedad determi
nada exige conocer todas las variedades posi
bles de la relacin virus-clula en el individuo.

4. Sumario de los sndromes inducidos

por infecciones virales en humanos,
y breves consideraciones vlidas para
el diagnstico serolgico de laboratorio
En el cuadro 27-1 se presenta un ordena
miento prctico de las enfermedades virales que
nos revela la necesidad de ubicar el panorama
general, pero teniendo en cuenta los factores
particulares que se plantean en los distintos gru
pos, con especial referencia a las posibilidades
de persistencia del agente viral infectante.
Al tener claro el concepto de complejidad
real asociado con la respuesta del individuo a
los distintos tipos de infecciones virales, es po
sible formular un enfoque general que nos per
mita desarrollar actitudes prcticas frente al es
tudio de los individuos infectados.
En el cuadro 27-2 se presenta en forma es
quemtica la secuencia general de hechos que
ocurren durante una infeccin viral aguda. En
ella se ve claramente el perodo de ataque y di
seminacin del virus, del que resulta, luego de
un tiempo variable, una patogenia dada que ge
neralmente se traduce en alteraciones morfol
gicas y bioqumicas objetivables por mtodos
de laboratorio. Este perodo agudo, rico en sn
tomas y signos, es por lo general el ms propi-

Cuadro 27-1. Agrupamiento de algunas enfermedades virales

H e p a titis v ira les
P o lio p a ra ltic a
L o c a liz a d a s

V e rriig a s
R e s fria d o c o m n

M olluscuin contagiosum
S ID A
S e g n la e x te n s i n d e lo s te jid o s y /u r g a
n o s a fe c ta d o s
S a ra m p i n
V iru e la
D is e m in a d a s

V a ric e la
F ie b re h e m o rr g ic a

A gudas
In a p a i'e n te s o su b c ln ic a s
S e g n el c u rs o d e e v o lu c i n c ln ic a

L a te n te s re c u rre n te s
L a te n te s a s o c ia d a s a la rg o p e ro d o d e in c u b a c i n
C r n ic a s
In fe c c io n e s c u y a p a to g e n ia e s t re la c io n a d a co n

S e g n el m e c a n ism o d e p a to g e n ia

el e fe c to ltic o v ira l
I n fe c c io n e s c u y a p a to g e n ia e s t a s o c ia d a c o n la
in m u n o rre s p u e s ta

E ste ag ru p am ien to es m uy e m p ric o y d eb e an a liz arse ca d a c a so . Npte.se q u e se re fiere a los sn to m a s y signos m s im p o rtan tes d e l a e n fe r
m ed a d y no siem p re a la io ca zac i n d e las clulas que re p lic a n el virus. E l S ID A re su lta p rin cip a lm e n te de la d estru c ci n de c lu la s T
C D^' p o r ei H V , p ero la en ferm e d ad es un c u a d ro g e n e ra d o p o r la in m u n o d cficic n cia con una variada .signo-sinlojiatoJoga genem lm enlc
en c u ad ra d a en in fec cio n es o p o rtu n istas.

Inmunologa en las infecciones virales

539

Cuadro 27-2
In fe c c i n
R e s p u e s ta in e s p e c fic a
In fla m a c i n
I n te rfe r n
F ie b re

T e jid o d e a ta q u e
P rim e ra a m p lific a c i n
d e m a te ria l v ira l y
v irio n e s lib re s

V ire m ia p r im a ria c o m o d ise m in a c i n c o n

v e n c io n a l a p a rtir d e l re a d e a ta q u e a
o tra s re a s.
T ra n s p o rte n o c o n v e n c io n a l:
C a n a le s a x n ic o s
m a c r fa g o s b r o n c o a s p ira c i n

A lc a n c e d e tejid o s s u s c e p tib le s se c u n d a rio s

ll
I{

R e s p u e s ta e s p e c fic a
P ro c e s o d e a n tg e n o s
D ife re n c ia c i n c e lu la r lin fo id e
P ro life ra c i n c e lu la r
B io s n te sis d e in m u n o g lo b u lin a s e s p e c fic a s
C o n d ic io n e s e s p e c ia le s p u e d e n c o rta r
el d e s a rro llo d e l p e ro d o a g u d o

o d is m in u ir d r s tic a m e n te lo s
s n to m a s

S e g u n d a a m p lific a c i n d e m ate ria l v ira l

G e n e ra lm e n te p a rtic ip a en los s n o m a s , la p a to g e n ia y la re c u p e ra c i n

__

V ire m ia s e c u n d a ria
S u p re s i n d e c lu la s in fe c ta d a s . F in
d e l p e ro d o a g u d o . R e s o lu c i n
A ta q u e d e l rg a n o b la n c o
P e rs is te n c ia d e c lo n e s c e lu la re s p ro d u c to re s
S o b re p a s o d e la r e s p u e s ta in m u n e. M u e rte .
E q u ilib rio d e c lu la s p ro d u c to ra s y re s p u e s ta
in m u n e . M o d u la d o c o n p a to g e n ia v a ria b le .
P e rs is te n c ia

o o a
'o 2 3
o
'S

c o

p a ra

fe c c io s o

in te n ta r
y

p a to l g ic o s

la
d e

e l

a is la m ie n to

d e te c c i n
le s io n e s

p o r

d e l

e s tu d io s

tis u la r e s

a g e n te

in

c ito h is to -

c e lu la re s .

A partir de la infeccin y de los fenmenos

primarios se desarrolla la reaccin del husped
sobre la base de las llamadas respuestas inespe
cficas y la respuesta inmune especfica. La pri
mera se caracteriza por la aparicin del fen
meno de inflamacin, con la participacin de
clulas con capacidad de endocitosis, de las
cuales los m acrfagos p arecen ser los m s
conspicuos, y de linfocitos con capacidad cito
txica inespecfica natural killers, sntesis de
interfern, fiebre, etc,, y la segunda por activi
dad de clulas presentadoras de antgeno y la
posterior proliferacin de clulas inmunocom
petentes, seguida de sntesis de inmunoglobuli
nas especficas.
Con esto queda justificado el trptico en que
se basa la estrategia general del diagnstico de
laboratorio de las enfermedades virales: a) in
tento de aislam iento y/o caracterizacin del
agente etiolgico, fundamentalmente durante el
perodo prodrmico y el episodio agudo de en
ferm edad; b) observaci n en m ateriales de
biopsias o necropsias, obtenidos para estudios
citolgicos o histopatolgicos de lesiones, y c)

estudio cintico de las modificaciones cualitati

vas y cuantitativas de la respuesta inespecfica
y de la inmune especfica. Esta liltima requiere
el estudio comparativo de muestras biolgicas
obtenidas en el transcurso de la enferm edad
(perodo agudo y convaleciente), sobre todo,
estudios en suero.
En la figura 27-6 se presenta el esquem a de
J. M. Vanella, vlido para enfocar el tipo de
tcnicas aplicables al estudio de laboratorio en
virologa. Del anlisis de ste surge cjue la base
operativa ms im portante para el diagnstico
etiolgico se fundam enta en el estudio de la
respuesta inmune especfica, que se realiza de
tectando los cambios cualitativos y cuantitati
vos de las inm unoglobulinas presentes en el
suero del paciente durante la evolucin de la
enfermedad.
Las bases fundamentales del diagnstico de
laboratorio de la infeccin viral p u ed en ser
analizadas de acuerdo con la llamada cadena de
Mrquez, relacionada con los pasos que deben
cumplirse. stos son; a) decisin de realizar el
estudio de laboratorio; b) toma y transporte de
la muestra; c) procesamiento de la muestra; d)
informe, y e) interpretacin.
Analizaremos en conjunto los puntos a y b.

540

Inmunopatologa
Lmite del
primer suero

i
Area crtica

Segundo
suero

para la decisin
de iniciar un estudio
de laboratorio

1
T

Tercer
suero

Posibilidad de
establecer datos sobre

Tiempo en das

Perodo de
incubacin

Perodo
agudo

Perodo de
convalecencia

F ig . 2 7 -6 . D ia g ra m a d e e v o lu c i n d e m a rc a d o re s esp ecifico .s en u n a in fe c c i n v ira l a g u d a p rim a ria .

a y b) Decisin de realizar el estudio de labo

ratorio, toma y transporte de la muestra
En funcin de limitarnos al estudio de la res
puesta inmune, no analizamos aqu la toma de
otros materiales destinados a aislamiento de vi
rus, anlisis citolgicos, biopsias, etc.
Ante la sospecha de una enfermedad de etio
loga viral, nunca se dejar de tomar una mues
tra de suero del paciente en el primer examen
del individuo. Si la decisin de iniciar el estu
dio no se toma a tiempo, todo intento posterior
ser fatuo.
Se deber asegurar que en el perodo que
abarca de 15 a 2 0 das de iniciada la enferme
dad, se tome una nueva muestra de suero. La
base del estudio de la respuesta inmune humo
ral es poder demostrar cambios cualitativos y
cuantitativos en funcin del tiempo y relacio
narlos con la evolucin clnica.
La mayor cantidad de muestras posible obte
nidas durante la evolucin, sean ellas destina
das a estudios de la respuesta humoral, celular
u otros objetivos, permitir construir una infor
macin mucho ms precisa acerca del perfil de
respuesta y relacionar fehacientem ente estos
datos con los mecanismos de patogenia.
c) Procesado de la muestra
Los sueros recibidos en el laboratorio se pro
cesarn de acuerdo con las tcnicas apropiadas
segn las sospechas que se desprendan de la fi

cha epidemiolgica, y se tomarn precauciones

elementales como la inclusin de todos los sue
ros que se dispongan del paciente en una mis
ma prueba de laboratorio, analizados con los
mismos reactivos, operador, equipo, etc.
La inclusin de sueros y antgenos controles
de referencia no deber obviarse bajo ningn
concepto.
La incorporacin de la actividad diagnstica
a un serio y continuo programa de acreditacin
y de control de calidad son mandatorios.
Se debern establecer y respetar normas ele
mentales de bioseguridad ya que todo suero de
be considerarse de alto riesgo independiente
mente de una presuncin particular.
d y e) Informe e interpretacin
No comentaremos ahora estos puntos ya que
se trata de un enfoque general. Sim plem ente
diremos que el informe debe ser claro y llevar
un comentario sobre los resultados que ayude a
la interpretacin posterior.
Como corolario, queremos condicionar al in
dividuo que encara la investigacin de forma
que este concepto operativo del estudio serol
gico sea un verdadero dogma inamovible; la to
ma de una muestra de suero del perodo de co
mienzo de la enfermedad y, por lo menos, otra
entre 15 y 20 das ms tarde. As se cubrir con
una gran eficiencia la posibilidad de efectuar
un diagnstico preciso de laboratorio, cualquie
ra que sea el tipo de infeccin viral en estudio

Inmunologa en las infecciones virales

y la tcnica usada. Diremos, adems, que toda
vez que se pueda agregar una tercera muestra o
ms eon intervalos de 30 das, esta serie de
sueros ampliar las posibilidades de arribar a
un diagnstico seguro y a un estudio consciente
de la evolucin de la respuesta inmune que, co
mo en el caso de la hepatitis B, SIDA y otras,
es de absoluto valor pronstico.
La conservacin de los sueros permitir que
en un futuro, cuando por distintos adelantos
tcnicos se disponga de los reactivos, aqullos
puedan ser reestudiados y establecer un diag
nstico correcto retrospectivo. Al referirnos a
que no se disponen reactivos estamos indican
do dos posibilidades: que el agente sea desco
nocido an, o que sea muy difcil preparar ant
genos por sus caractersticas biolgicas.
Otro aspecto que tiene que ver con lo ante
rior es el relacionado con la deteccin de nue
vos tipos de infeccin, en los que es necesario
explorar respuestas inmunes con una gama de
antgenos purificados, como en el caso de in
fecciones abortivas, persistentes, etc.
Quedan as planteados los problemas de va
riacin de respuesta inmune y un enfoque ge
neral de cmo abordarlos, que deber ser usado
teniendo en cuenta las limitaciones de toda ge
neralizacin.
5. Concepto general de la respuesta inmune
en la infeccin viral aguda
Una vez alcanzadas las clulas susceptibles
por un agente viral, ste inicia un ciclo de re
plicacin que culm ina con la produccin de
nuevos viriones, los que, de disponerlas, atacan
nuevas clulas susceptibles. En ciertos casos
este proceso del ciclo de replicacin viral pro
duce la muerte celular. De esta forma se induce
en el organismo una cantidad creciente de m a
teria] antignico viral, suficiente para provocar
una respuesta de los mecanismos inespecficos
y de los sistemas inmunes especficos del indi
viduo. ste, m ediante la actividad de clulas
com petentes, procesa en los sitios de activa
sntesis de material viral, los distintos antge
nos que reconoce como extraos y pone en
marcha la diferenciacin de clones celulares es
pecficamente informados para reconocer estos
antgenos y la biosntesis de inmunoglobulinas
especficas.
En forma general, y siempre en el ciclo ltico
asociado con infeccin que define a una enfer
medad aguda, el sistema de informacin inm u
nolgica toma contacto con la totalidad de los
antgenos del virus; antgenos de la superficie
viral, porque hay en circulacin viriones ente
ros, y antgenos de las nucleocpsides de los
viriones (protenas internas), porque de las c
lulas rotas salen estos antgenos, que siempre

541

son sintetizados en exceso. Adems, en virtud

de la lisis celular, tambin el sistema de detec
cin inmunolgica se informa sobre antgenos
virales no estructurales, es decir, aquellos que
no forman parte del virin.
Se produce as, sucediendo o acompaando a
toda la respuesta inflam atoria local, la induc
cin de produccin de inmunoglobulinas espe
cficas de distribucin sistm ica. Estos an ti
cuerpos estarn dirigidos cualitativamente con
tra cada una de las especificaciones antignicas
virales (epitopes). Cuantitativamente depende
rn de factores propios de los antgenos como
antigenicidad, cantidad relativa de ellos, rela
cin y forma de exposicin a las clulas de pro
cesamiento, mecanismos generales de reg u la
cin, etc.
Los macrfagos son clulas que procesan el
m aterial viral y expresan en sus m em branas
plasmticas los epitopes; por eso se los consi
dera como clulas procesadores y presentado
ras de antgenos. Adems de ellos, se encuen
tran las clulas dendrticas (CeD en), q u e si
bien no procesan al antgeno, tienen la capaci
dad de fijar epitopes en su superficie, am plifi
cando as la presentacin del antgeno. Se las
encuentra en los tejidos linfoides, sobre todo en
bazo, ndulos linfticos y en la piel se denom i
nan clulas de Langerhans.
Tanto los macrfagos, como las clulas den
drticas, secretan una importante citoquina, la
Interleuquina 1, considerada como la segunda
seal estimuladora de los linfocitos T (la pri
mera seal la constituye la presentacin del an
tgeno).
El macrfago o la CeDen presentan el ant
geno viral estrechamente relacionado a las pro
tenas de clase I o II del CMH (Complejo Ma
yor de Histocompatibilidad) en sus membranas
plasmticas. Este complejo antignico (m ol
cula del CMH + epitope viral) es identificado
por los receptores de los linfocitos T, que solo
reconocen al antgeno viral si est asociado a
una molcula del CMH.
Las molculas del CMH de clase I se enla
zan con epitopes virales presentes en el com
partimiento citoslico de la clula infectada y
los exponen en la superficie celular. D e esta
manera ser reconocido por una clula T que
pase. Si esta clula porta el m arcador C D 8 CD28 (linfocito T citotxico) en su superficie,
pondr en marcha una respuesta inmune contra
las clulas infectadas, liberando diferentes sus
tancias qumicas que las destruyen porque es
tn programadas para destruir clulas que ex
presan antgenos virales. Esta respuesta consti
tuye una forma eficaz de evitar la creacin de
ms virus por las clulas infectadas.
Los linfocitos T citotxicos son los efectores
ms importantes en la eliminacin de clulas

542

Inmunopatologa

infectadas por virus. Sin embargo, es necesario

recalcar que en el caso de virus que no produ
cen lisis celular manifiesta, por ejemplo, hepa
titis B, el dao heptico que genera la insufi
ciencia est dado por el ataque de linfocitos ci
totxicos al hepatocito. Como ya se mencion,
estos linfocitos tienen una restriccin manifies
ta para clulas que exhiben el antgeno viral y
antgenos de la clase 1 del CMH, lo que abre
una permanente necesidad de bsqueda sobre
la posible asociacin de diferentes patologas
inducidas por virus, que estuvieran condiciona
das por el perfil de antgenos de histocompati
bilidad del individuo infectado.
Si la m olcula del CMH que acompaa al
epitope viral es de clase II, ser reconocida co
mo extraa por las clulas T CD4+ (T helperTh) que pueden ser T h l, llamadas tambin c
lulas T inflamatorias pues secretan mediadores
qumicos que atraen clulas inflamatorias al si
tio de multiplicacin viral. Adems secreta in
terfern y, que intentar bloquear la replicacin
del virus. Las clulas Th2, llamadas clulas co
laboradoras, tambin son CD4+ y su rol funda
mental es aumentar la respuesta B dependiente
mediante la secrecin de Interleuquina 2 (citoquina que amplifica la respuesta de Linf. B).
De esta ltima respuesta, depender la calidad
y cantidad de inmunoglobulinas que intentarn,
por diversos mecanismos (neutralizacin, opsonizacin, fijacin de complemento, etc.), des
truir los viriones extracelulares.
Las clulas T supresoras (CD 8 +), tienen una
probable relacin con los estados de tolerancia
a antgenos extraos y tambin con la toleran
cia a autoantgenos. Por ello, se asocia una de
ficiencia de las clulas T supresoras con el de
sarrollo de sndromes autoinmunes.
En la prctica podemos identificar anticuer
pos dirigidos contra antgenos de la estructura
externa, que se reconocen por la propiedad de
unirse a viriones enteros y de disminuir o abo
lir su capacidad infectiva in vitro y a los que se
llam a neutralizantes . La estructura externa
depende de que se trate de virus desnudos, en
los cuales esta estructura externa est inte
grada por los polipptidos que forman los capsmeros (p. ej., poho), o que sean virus envuel
tos, en los que esta estructura externa est in
tegrada por glucoprotenas, lipoprotenas de la
envoltura, o ambas.
Tambin se forman anticuerpos contra las
estructuras proteicas internas virales (nucleoepsides). La actividad de estos anticuerpos no
puede ser medida por su capacidad de abolir la
infectividad viral in vitro; por lo general, se es
tudian por otros sistemas de deteccin inmunolgica, utilizando como antgenos las partes in
ternas de virus. Se los llama por ello anticuer
pos contra antgenos internos o core.

Una vez puesta en marcha la respuesta inm u

ne se pueden integrar los siguientes fenmenos
que condicionan el escjuema clsico de una in
feccin viral aguda:
a) Clulas infectadas que producen virus,
eon lisis celular, respuesta inmune funcional
integral contra el virus y partculas subvirales.
b) Virus que son liberados al torrente extracelular estn ahora expuestos a la accin de an
ticuerpos neutralizantes, los que, obviamente,
contribuyen a reducir el riesgo de infeccin de
nuevas clulas susceptibles. Los inm unocom
plejos formados son rpidamente captados por
los sistemas de depuracin.
Los anticuerpos contra otras estructuras tam
bin actan formando complejos inmunes y los
mecanismos de eliminacin de stos forman un
captulo aparte en inmunopatogenia.
c) La clula que se encuentra infectada e ini
cia un ciclo de replicacin est sometida a esta
altura a acciones directas: interfern, tempera
tura y, si en el ciclo de replicacin incluye la
sntesis de antgenos virales en la superficie ce
lular, esta clula es pasible de ataque ltico, por
parte de sistem as com o an ticuerpo-com ple
mento y el de linfocitos capaces de adosarse a
ella e inducir su lisis, antes de producir virio
nes.
d) La accin conjunta de los sistemas m en
cionados culmina con la abolicin de la exis
tencia de clulas infectadas productoras de an
tgenos de superficie, las cuales son destruidas.
Todo antgeno viral libre ser complejado con
sus anticuerpos respectivos y seguir distintos
caminos de eliminacin segn las caractersti
cas del inmunocomplejo formado.
e) El perodo agudo de la replicacin viral
estar terminado y la enfermedad, sus snto
mas y sus signos estarn determinados por el
dao que este proceso haya inducido; ste se
halla relacionado con el tipo de clulas blanco
alteradas o destruidas en el ataque inicial y
con las clulas que se hayan infectado en la
diseminacin secundaria. En este caso el dao
celular est dado por la accin ltica viral per
se y la accin ltica asociada a la respuesta in
mune.
El resultado de una infeccin de este tipo se
analiza ms adelante, al hablar del virus de la
polio.
Conviene resaltar aqu que en estos casos, en
el tiempo que media entre la infeccin en los
tejidos de ataque en que se inicia la respuesta
inmune y el ataque a otros rganos, hay gene
ralmente un perodo de viremia. La amplifica
cin de la replicacin viral de los rganos ge
nera un nuevo episodio de viremia secundaria,
que es tan extensa o im portante como pobre

Inmunologa en las infecciones virales

haya sido la respuesta inmune humoral. Estas
infecciones inducen una respuesta inmune ge
neralmente de por vida con persistencia de
anticuerpos neutralizantes detectables.
6

. R espuesta inmune en infecciones virales

con persistencia de virus

Cabe aclarar que el efectuar esta distincin

entre infecciones agudas y aquellas con persis
tencia de virus tiene un carcter didctico y el
lector deber tomarlo como un paso necesario
hacia la comprensin del problema y deber es
tar alertado de que existen variables tan com
plejas que no pueden sintetizarse en una apre
ciacin tan simple como la propuesta.
Lo que interesa plantear aqu es que, a dife
rencia de lo detallado en el punto 5, en ciertas
infecciones virales el agente alcanza las clu
las susceptibles, inicia la amplificacin de m a
terial antignico viral, pero en este caso las c
lulas productoras de virus no son destruidas
debido al mecanismo de replicacin viral y los
viriones emergen de ellas por procesos diver
sos, entre los cuales el de brotacin a travs
de mem branas citoplasm ticas es el ms comtn.
Veremos cmo es la respuesta en estos ca
sos, que generalmente corresponden a infeccio
nes con virus envueltos:
a) Al no haber destruccin celular, el proce
so inflamatorio local es mucho menor.
b) El virus liberado, que en su envoltura lle
va ciertas especificidades antignicas del hus
ped, inicia la respuesta. Al ser tomado por ma
crfagos, si stos lo procesan, se informan de
sus antgenos externos. Recordemos que, al no
haber destruccin celular inicial, el organismo
no tiene contacto con antgenos internos y me
nos con los no estructurales, intracelulares. La
respuesta inmune es lenta y parcial,
c) Se forma escasa cantidad de anticuerpos
neutralizantes, que generalmente forman inm u
nocomplejos con el virus producido, tendiendo
a un equilibrio.
d) La respuesta inmune celular genera clu
las que son capaces de reconocer a los clones
celulares que estn produciendo virus. Si en es
te caso la respuesta celular y la inmune hum o
ral condicionan que estos clones sean destrui
dos, el proceso se comportar como una infec
cin aguda o mixta.
Puede ocurrir que por ambas variables, de
fectos en las clulas T o en otros efectores del
sistema de inmunidad celular y/o la presencia
de anticuerpos bloqueadores que tapicen las
membranas de clulas infectadas y las exclu
yan del reconocimiento de los linfocitos T, las
clulas infectadas no sean eliminadas y conti-

543

niien produciendo virus. En este caso estamos

en presencia de una infeccin con persistencia
de clones celulares productores y la instalacin
de una etapa de cronicidad del proceso.
e)
La patogenia que ese estado general de
equ ilib rio pueda inducir depende del tejid o
afectado, la modulacin de produccin viral,
que puede ser perm anente o interm itente, los
complejos inmunes que se forman, etc.
Un caso particular de este tipo de problema
es el que se plantea en clulas infectadas que
no producen virus, porque parte del genoma es
t integrado (infeccin abortiva) y slo se sin
tetizan antgenos virales muy dbiles. En este
caso, el organism o no produce anticu erp o s
neutralizantes de la infectividad viral, pero s
contra estos antgenos que pueden modular es
tados celulares tales como proliferacin celular
(oncognesis).
Vemos entonces con claridad cmo u n a in
feccin viral con un mismo tipo de virus podr,
en individuos de la misma especie, establecer
infecciones agudas o crnicas segn sean la
respuesta de este individuo y el equilibrio que
se establezca. En esto influyen fundam ental
m ente estados fisiolgicos, tratam ientos con
drogas, enfermedades concomitantes, factores
psicolgicos, etctera.
7. Concepto de fenmenos
de autoinmunidad asociados
a infecciones virales
Se desprende de lo anterior que ciertos virus
no citocidas modifican las membranas de las
clulas del husped, induciendo especificidades
antignicas mixtas. Se pueden exponer, adems
de los nuevos antgenos del virus, antgenos
propios del husped, secuestrados durante el
proceso embrionario y que resultarn nuevos
para el adulto. El husped puede reconocer es
tas m odificaciones, por pequeas que ellas
sean, como extraas y en un proceso lento pro
ducir ataque directo a estas estructuras desen
cadenando un fenmeno autoinmune.
La relacin de un tipo definido de infeccin
viral con cualquiera de los estados autoinm u
nes detectados en humanos es algo an no defi
nitivam ente demostrado. En algunos modelos
experimentales la relacin de infecciones vira
les y el ulterior desarrollo de un estado inmunopatogico autoinmune es real.
En general, existe la posibilidad de que mu
chos de los fenmenos clasificados com o au
toinmunes inducidos por virus resulten de un
mecanismo de inmunopatologa secundaria a la
formacin y evolucin de complejos inmunes
generados por antgenos virales o virus-hus
ped compartidos y anticuerpos del husped.

544

Inmunopa tologa

8. Inmunocomplejos en infecciones virales

Hemos visto emo durante la infeccin ltica
se induce la formacin de anticuerpos neutrali
zantes de la infectividad viral y aquellos capa
ces de reconocer antgenos internos del virin
o, en el caso particular de virus envueltos, con
tra antgenos de envoltura, asociados general
mente a las membranas de clulas infectadas
(clulas productoras de virus pero que no se lisan).
Los anticuerpos y antgenos circulantes en
fase lquida forman com plejos inm unes, que
estarn listos para interactuar con otros siste
mas efectores, de los cuales el complemento es
el mejor conocido. Una vez formado el com
plejo antgeno-anticuerpo-eom plem ento, au
m enta de tam ao y puede lleg ar a o rig in ar
agregados, por entrecruzamiento de varias uni
dades con participacin de C3 y otras fraccio
nes de complemento. En el caso de la infeccin
del ratn con virus polioma se ha podido deter
minar que el complejo virus-anticuerpo tiene
un coeficiente de sedimentacin de 270S, que
aumenta a 450S cuando reacciona con el com
plemento.
En el caso de virus muy complejos como los
R etroviridae, el com plejo virus-anticuerpocomplemento, induce dao de la superficie lip
dica del virin. Este dao origina la ruptura del
virin y la liberacin de antgenos internos del
virus que inducen, en cadena, la produccin de
nuevos anticuerpos contra este tipo de estructu
ra interna, adems de aquellos dirigidos contra
la envoltura. Esto es compatible con la secuen
cia de aparicin de anticuerpos en la infeccin
con HIV (SIDA).
En infecciones persistentes, con produccin
permanente o intermitente de viriones, la for
m acin de inm unocom plejos es frecuente y
constituye un factor importante de los fenme
nos patolgicos que condicionan fundamental
mente depsitos en tejidos donde producen res
puestas floggenas. Los sndrom es ms fre
cuentes son nefritis, arteritis y coroiditis.
Los complejos virus-antieuerpo-complemento pueden actuar sobre clulas que tienen re
ceptores para la fraccin Fe, como importantes
agentes de dao de membrana.
Complejos inmunes de estructuras variables
pueden formarse en la superficie de clulas que
estn sintetizando antgenos y actan bloquean
do factores necesarios para que aqullas pue
dan ser eliminadas por fenmenos de inmuni
dad mediada por clulas T.
Este m ecanism o ha sido observado en las
formas crnicas que suceden a la infeccin saram pionosa (panencefalitis esclerosante subaguda), en las que se ha demostrado un factor
que bloquea la inmunidad mediada por clulas.

la actividad MIE e inclusive la linfoprolifera

cin.
Inmunocomplejos del tipo antes descrito han
sido claramente detectados en una serie de in
fecciones virales en animales. En humanos, s
tos han sido relacionados con aspectos patol
gicos en hepatitis viral tipo B, en infecciones
producidas por el agente Epstein-Barr, princi
palm ente en su asociacin eon el linfom a de
Burkitt, en el dengue y en la ya m encionada
forma encefaltica crnica postsarampionosa.
De acuerdo con datos provenientes de algu
nos modelos experimentales, en especial el de
induccin de enfermedad del suero, en las in
fecciones virales, los sntomas como mialgias,
artralgias, rash, disturbios de conducta y le
targa, pueden asociarse al aumento de la res
puesta inmune humoral y del perodo de supre
sin del virus circulante. Esta patogenia puede
compatibilizarse con el mecanismo que resulta
del depsito de complejos inmunes y la actua
cin de mecanismos efectores en los que parti
cipan basfilos recubiertos de IgE, aminas va
soactivas, perm eabilidad capilar y dao en la
trama sinusoide.
Por ltimo, conviene recordar que reciente
mente se han encontrado factores genticos que
pueden influir en las distintas respuestas del
husped a la infeccin viral, de las cuales tene
mos, por una parte, una produccin de alto ttu
lo de anticuerpos de alta afinidad que facilita la
eliminacin total del virus generando una sola
onda de depsito de complejos inm unes y la
eliminacin de los clones productores de virus,
y, por otro lado, una respuesta con baja canti
dad de anticuerpos o de baja afinidad que lleva
a una prolongada evolucin de los fenmenos
induciendo una continua circulacin de com
plejos inmunes.
9. Respuesta inmune en poliomielitis
En la figura 27-1, hemos planteado detalles
de la estructura del virus de la poliom ielitis.
R ecordem os que inm unolgieam ente se han
demostrado tres tipos de virus diferentes, lla
mados poliovirus tipo 1, 2 y 3. Si bien difieren
en la especificidad antignica, las caractersti
cas morfolgicas y funcionales de replicacin
son prcticam ente idnticas. Por ello, si bien
pueden admitirse diferencias, los comentarios
sobre respuesta inmune se realizarn en gene
ral, sin especificar el tipo de virus.
Las partculas virales estn integradas por
cuatro polipptidos V P l, VP2, VP3 y VP4.
Una serie de molculas proteicas interm edia
rias son sintetizadas en la clula infectada, cu
yas caractersticas inmunolgicas no son cono
cidas, pero obviamente participan en la conste
lacin de la respuesta inmune productiva. Entre

Inmunologa en las Infecciones virales

ellas las principales son N C V P l A (non capsid
viral protein), que es precursora de las prote
nas de la cpside, y la NCVP2 de 77 kD.
La P63 (nica protena con actividad polimersica netamente viral) deriva de NCVP2.
Todas ellas contribuyen en la respuesta in
mune cuando se produce la infeccin natural o
la inducida con vacunas de virus atenuado. O b
viamente, en la vacunacin con virus inactiva
do la respuesta est limitada a los polipptidos
estructurales solamente.
En la figura 27-7 se presentan diagramas de
la respuesta inmune en una infeccin natural en
su tipo de localizacin faringoentrica y la
complicacin paraltica. En la figura 27-8 se
incluyen los correspondientes a la respuesta in
ducida por vacuna inactivada y por virus ate
nuado.
Es obvio que la localizacin farngea e intes
tinal constituye la fase inicial de la infeccin,
que genera una sintomatologa local de curso
variable, desde casi asintomtico hasta episo
dios de faringitis y enteritis agudas.
En el individuo virgen de inmunizacin pre
via, su estado de defensa general condicionar
la intensidad de produccin de virus, el cual po
dr alcanzar el espacio extracelular e inducir vi
remia. El virus tendr as posibilidades de con
tactar todas las clulas del organismo. Recepto
res muy particulares, mecanismos de replica
cin condicionantes, virulencia de la cepa viral,
hacen que algunas clulas del asta motora de la
mdula sean atacadas y destruidas por proceso
ltico. Cuando una cantidad considerable de es
tas neuronas pierden funcionalidad se estable

545

cen los signos de parlisis flccida tpica de la

complicacin de la infeccin poliomieltica.
Este mecanismo, en especial la viremia co
mo factor necesario para el ataque a las clulas
del sistema nervioso, explica la eficacia rotun
da de la vacunacin poliomieltica con vacuna
inactivada. Esta vacuna, aunque slo induce
una respuesta de anticuerpos del tipo IgM e
IgG neutralizantes, poca respuesta inmune ce
lular o ninguna y nada de IgA secretoria (no
deteetable), es suficiente para complejar el vi
rus que invade el espacio intersticial y circula
en la sangre. El xito individual de cada caso
depender de la cantidad de anticuerpos dispo
nible en el momento de la entrada del virus. Es
importante recalcar que la inmunidad que con
fiere la vacuna inactivada es pobre o nula para
prevenir la replicacin viral en mucosa intesti
nal y farngea.
En el caso de la infeccin natural o la induci
da por vacuna atenuada, la produccin de anti
cuerpos de tipo IgM, IgG e IgA circulantes es
mayor y se agrega la sntesis de IgA secretoria
en os tejidos expuestos. La respuesta de inm u
nidad celular es deteetable tambin en estas cir
cunstancias.
Reiteramos adems que los anticuerpos for
mados son inducidos por una variedad de ant
genos mayor que la que tiene la vacuna inacti
vada.
A pesar de todo, la vacuna inactivada tiene
un xito indiscutido en el control epidemiolgi
co de polio y un riesgo menor que la atenuada
en casos de nios deficientes en su respuesta
inmune.

Tiempo en das
F ig . 2 7 -7 . E v o lu c i n d e m aix a d o re s e n la in fe c c i n p o lio m ie ltic a c o n c o m p lic a c i n p a ra ltic a .

546

Inmunopatologa

VIRUS

F ig . 2 7 -8 , R e s p u e s ta a la v a c u n a c i n c o n tr a p o lio .

10. Respuesta inmune en rubola

En la figura 27-9 se presentan datos sobre la
evolucin de la excrecin de virus, la viremia y
la cintica de sntesis de anticuerpos de distin
tos tipos en la infeccin primaria del adulto y
en la infeccin del feto en ttere por virus de la
rubola.
Estos datos refuerzan algunos de los concep
tos que ya hemos expresado. Queda indicado el
corto perodo a partir de la aparicin de los sn
tomas, en el cual se pueden obtener aislamien
INFECCIN
DEL ADULTO

Anticuerpos inhibidores
de la hemaglutinacin
(IgG + IgM)

Virus en
fa rin g e /

Anticuerpos
fijadores de complemento

Virus en / /
sa n g re /' j

- too

tos durante la evolucin de la infeccin prima

ria del adulto, contrastando con el extenso pe
rodo en que puede detectarse virus en el nio
infectado durante la gestacin y el perodo pos
parto, cuando nace con vida.
La variacin de la cintica de evolucin de
los distintos anticuerpos que se detectan segn
el tipo de tcnica y los antgenos que se utili
cen, nos brinda un claro ejemplo de la necesi
dad de elegir con conocimiento el sistema sero
lgico que se emplear para llegar a un diag
nstico de certeza, segn sea el perodo de evo
lucin de la enfermedad y el tipo de infeccin
que se desarrolla.
Fijem os brevem ente la atencin en lo que
ocurre durante la infeccin del adulto con los
anticuerpos inhibidores de la hemaglutinacin
(IHA), que son los que pueden ser estudiados
por tcnicas ms comunes y que son compatibilizables con los neutralizantes. Si la primera
muestra de suero es tomada correctamente den
tro de los 3 das de iniciada la enferm edad,
cualquiera que sea la poca de toma de la se
gunda (10, 20 o 30 das), permitir su estudio
com parado con la tcnica de IHA o con las
otras y se podr demostrar un aumento signifi
cativo del ttulo de anticuerpos, hecho bsico
que permite hablar de una infeccin especfica
reciente. Sin embargo, si la prim era toma se
efecta entre 5 a 10 das despus de la inicia
cin de los sntomas (decisin tarda), no se p o
dr demostrar, mediante la tcnica de inhibi
cin de la hemaglutinacin (IHA) comn, un
aumento significativo de anticuerpos; en este
caso se necesitara obtener nuevas muestras de
suero, ms adelante, para objetivar la cada del
ttulo que ocurre normalmente, o recurrir a la
titulacin especfica de IgG e IgM. No obstan
te, el mismo tipo de muestras, tomadas entre
los 5 o 10 das y otra de 30 das, permite de
mostrar el aumento de anticuerpos si se utiliza
la reaccin de fijacin de complemento.

10

-10

100

1000

INFECCIN
FETAL

"O

igiVI del nio /

'8

V I g G m a te rn a ,/

CD

IgG del nio

1
N a c im ie n to 'V
-

100

-1 0

1
Tiempo en das

10

100

F ig . 2 7 -9 . E v o lu c i n d e m a rc a d o re s d e te c
ta b le s e n la in fe c c i n r u b e lic a .

Inmunologa en las infecciones virales

En el caso p articu lar de la infeccin del
adulto por virus de rubola, si se dispone de
una muestra de 5 a 10 das, luego del inicio de
los sntomas y se pueden efectuar tcnicas de
estudio de ttulo de inm unoglobulinas 7S y
19S, con una sola m uestra en la que se detecte
un alto ttu lo de an ticu erp o s IH A del tipo
19S se podr inferir una posible infeccin re
ciente.
La tcnica que permite evaluar las globuli
nas 19S y 7S ha sido la base de la informacin
que hoy se dispone sobre la infeccin congni
ta de rubola y la evaluacin de la respuesta del
nio, la cual puede observarse al pie de la figu
ra 27-9. Se demuestra que durante la persisten
cia de sntesis de virus en el recin nacido, ste
produce IgM especfica de rubola, lo cual in
dica que el nio es inmunolgicamente compe
tente, pero evoluciona con una lenta madura
cin, para eliminar finalmente los clones celu
lares productores de virus. Mientras esto ocu
rre, en el suero aumenta lentamente el tenor de
IgG inmune propia del nio. La deteccin en
este caso de un ttulo alto de IgM especfico en
los primeros das y durante los primeros meses
de vida en presencia de concentraciones muy
inferiores de IgG, constituye fuerte evidencia
en favor de una infeccin en tero.
En beneficio del tiem po y la claridad no
ofrecemos aqu detalles operativos de las prue
bas de laboratorios desarrolladas. Slo diremos
que la tcnica de inhibicin de la hemaglutinacin puede ser llevada a cabo en laboratorios
perifricos, ya que pueden distribuirse antge
nos inactivados y sueros apropiados de referen
cia.
R ecientemente se han introducido tcnicas
de investigacin de anticuerpos por inm unofluorescencia y enzim oinm unoensayo de alto
valor diagnstico que prcticam ente han des
plazado la IHA.
La demostrada peligrosidad de la infeccin
por rubola en el curso de las primeras sema
nas de embarazo, hacen necesario que en todos
los casos de dudas se solicite la informacin
que el laboratorio puede brindar a los efectos
de fijar una conducta ms racional sobre la in
dicacin mdica. Esto justifica que la disponi
bilidad de este recurso de laboratorio sea exten
dida a toda la poblacin.
11. Respuesta inmune en la infeccin
herptica humana
a) Generalidades
Dentro de la familia herpes viridae hay siete
agentes que producen infeccin natural en hu
manos:

547

Herpes simples tipo 1 (facial), HSV I

Herpes simples tipo 2 (genital), HSV2
Citomegalovirus, CMV
Epstein-Barr, EBV
Varicela zoster, VZV
Herpes virus humano tipo 6 (HHV 6 )
Herpes virus humano tipo 7 (HHV7)
Los dos primeros, H SV l y HSV2, son res
ponsables de infecciones humanas, cuya form a
ms comn es la induccin de patologa en m u
cosas tanto oral como genital. Otras localiza
ciones como el ataque a tejidos oculares, piel,
sistem a nervioso central, form as sistm icas,
etc. son menos frecuentes aunque obviamente
de mucho mayor riesgo, sobre todo en recin
nacidos. A estos agentes nos referiremos con
alguna extensin ms adelante.
La infeccin citomeglica es muy frecuente
en seres humanos y, en todos los lugares donde
se ha explorado, se demuestra que alrededor de
un 80% de individuos adultos tienen anticuer
pos circulantes que revelan una infeccin p re
via en algn momento de su vida. La mayora
de las infecciones generalm ente asociadas a
distribucin sistmica pasan como formas in a
parentes. Cuando existen, uno de los signos
ms frecuentes es la induccin de un sndrome
ictrico leve, con inflamacin heptica.
La infeccin in tero induce variadas r e s
puestas que van desde el nacimiento de un nio
que excreta virus sin ningn sntoma o signo de
enfermedad hasta severas alteraciones acom pa
adas de malformaciones, que pueden ocasio
nar la muerte fetal. La infeccin in tero o p o s
parto induce un estado de persistencia que p u e
de, en funcin del estado inmunitario del indivi
duo, tener reactivaciones a lo lai-go de su vida.
Las correlaciones entre el tipo de anticuerpos
y su modulacin en el estado de actividad de
esta infeccin p ersistente de] hom bre y sus
reactivaciones es an objeto de estudio.
El virus de Epstein-Barr ha cobrado una gran
importancia en los ltimos aos. Se lo encuen
tra asociado a una serie de sndromes, en m u
chos de los cuales su etiologa directa an re
quiere confirmacin.
Se presum e con fundam ento que el agente
EBV tiene un papel etiolgico en la m ononu
cleosis infecciosa. Es frecuente que en la ev o
lucin de esta infeccin se induzca una m ode
rada ictericia que, junto con otros aspectos del
sndrome, hacen en ciertos casos relativamente
difcil establecer un diagnstico clnico d ife
rencial con las hepatitis virales clsicas.
Para enfatizar el problema (tipo de infeccin
viral, estado inmunitario del husped, reaccin
del husped, distintas enfermedades) verem os
una serie de sndromes a los cuales se asocian
distintos tipos de marcadores antignieos del

548

Inmunopatologa

virus EBV y en los cuales la respuesta inmune

humoral revela reaccin contra determinados
antgenos en especial.
Est relacionado con la mononucleosis infec
ciosa, ya sea en sus formas clnicas convencio
nales benignas o sus complicaciones a formas
fatales, a las agammaglobulinemias posmononucleosis infecciosa y al sarcoma de clulas B
posmononucleosis infecciosa.
Su estrecha relacin con el linfoma america
no de Burkitt, el linfoma africano de Burkitt, el
carcinoma nasofarngeo, y una entidad carac
terizada por un sndrome linfoproliferativo, li
gado recesivamente al gen, nos ejem phfica la
gran variabilidad de estados patognicos que
dependen de distintos equihbrios inmunolgi
cos a los que se llega.
Se ha demostrado que el genoma del virus
EBV puede integrarse en cromosomas de las
clulas que infecta, induciendo persistencia de
fracciones genticas virales.
De todos estos casos de enfermedades distin
tas originadas por un solo agente viral podemos
inferir que las diferentes respuestas que se in
ducen en individuos determinados son las que
condicionan la evolucin.
El virus varicela zoster es el agente causal
de la varicela en su infeccin primaria, clsico
sndrome de amplia distribucin en la especie
humana, especialmente en nios. Como regla
general de los virus de esta familia, establece
un estado de persistencia en el individuo infec
tado.
El herpes zoster, forma clnica cuya mayor
frecuencia se presenta en individuos de edad
avanzada o adultos condicionados, consiste en
una reactivacin viral en un husped parcial
mente inmune. Se explica este fenmeno como
asociado a defectos de equilibrio fisiolgico de
la respuesta inmune integral y es frecuente aso
ciar la aparicin de herpes zoster en individuos
con enfermedades neoplsicas, disturbios metablicos severos y enfermedades degenerativas.
Los herpesvirus humanos de los tipos 6 y 7
infectan hnfocitos T. El HHV 6 causa una leve
infeccin eruptiva de la infancia conocida co
mo rosola o exantema sbito. Ambos (HHV 6
y HHV7) han sido asociados a trastornos linfo
proliferativos, pero restan an mayores estu
dios para confirmar esta asociacin.
Como hecho general podemos decir que este
tremendo nivel de complejidad que se plantea
en la infeccin herptica humana es la causa por
la cual an no se ha podido desarrollar ninguna
vacuna eficiente que perm ita controlar cual
quiera de los sndromes a que hemos hecho re
ferencia. Por el contrario, la idea general que
existe es la de alertar enrgicamente contra la
utilizacin de cualquier tipo de inmungeno, sin
haber comprendido previamente su real accin

en el individuo, aunque una vacuna con virus '

Varicela vivos atenuados es casi inminente.
Se sospecha, con muchas probabilidades de
certeza, que el camino que separa una infeccin
con HSVI que induce una enfermedad banal de
mucosas, su complicacin con un estado recu
rrente y la infeccin abortiva que genera clones
proliferativos pasibles de formar un tumor, son
fenmenos en los cuales la modulacin del tipo
y la cantidad de inmunoglobulinas, clulas in
m unocom petentes y toda la constelacin de
mediadores del sistema inmune desempean un
papel decisivo y quiz determinante.
En distintos grados de complejidad ocurre lo
mismo en la infeccin con el agente de EBV y
con el HBV.
b) Sumario de aspectos de la respuesta inmune
en la infeccin con virus herpes simple
Una serie de evidencias epidemiolgicas, inmunovirolgicas y de estudios de biologa mo
lecular muestran una estrecha asociacin del
agente HSV^ (infeccin genital) y el carcinoma
de cuello uterino. Estos estudios en el gran
contexto de la induccin de malignidad por in
fecciones virales, han hecho que en el sistema
de la infeccin herptica humana en general, y
para el caso particular de herpes simple, se ha
ya acumulado una cantidad considerable de in
formacin.
Las consideraciones y Jos diagramas que a
continuacin se presentan tienen un objetivo
didctico de introduccin al problema y no el
de hacer una presentacin exhaustiva y crtica.
Es necesario repasar las caractersticas es
tructurales del virus herpes simple, con el obje
to de tener presente su capacidad gentica por
la cual es capaz de inducir la sntesis de cerca
de 30 polipptidos codificados por el genoma
viral. Esto, cuando el virus produce una infec
cin productiva, es decir, cuando los mecanis
mos bioqumicos funcionan de tal manera que
se producen nuevos viriones infectivos.
Recordemos que el agente del herpes simple
(tanto su tipo 1 o 2 ) puede inducir una infec
cin primaria, de la cual el individuo puede re
cuperarse y no tener un nuevo problema en el
resto de su vida. Otros individuos, con frecuen
cias y causahdades diversas, repiten peridica
mente la enfermedad, en el mismo sitio con in
tensidades variables. A este fenmeno se llama
recurrencia.
Existen algunos problemas de nomenclatura,
pero podemos aceptar recurrencia sin incurrir
en ningn error.
El problema se genera porque existe pasaje
del ganglio a la superficie de la piel (va axnica), que puede producir excrecin de virus con
sntomas y signos o sin ellos. Alguien ha pro

Inmunologa en las infecciones virales

F ig . 2 7 -1 0 . E v o lu c i n d e m arcad o re.s d e
te c ta b le s en la in fe c c i n h e rp tie a p r im a
r ia d e m u c o s a s (fa c ia l y /o g e n ita l).

549

Aislamiento y/o
caracterizacin de
virus a partir de
lesiones externas
Anticuerpos contra antgenos
internos virales demostrados
por fijacin de complemento

10,000

-10

Tiem po en das

puesto llamar en forma diferente a la excrecin

viral sin lesiones y a fa excrecin vira! con le
siones, a la que reconocemos como recurrencia.
Lo que importa es aceptar que tanto en in
fecciones primarias como en reactivaciones a
partir del ganglio puede haber excrecin de vi
rus con enfermedad manifiesta o sin ella.
Desde el punto de vista de la respuesta in
mune es de inters hacer algunas consideracio
nes. En la figura 27-10 se presenta la respuesta
inmune clsica de la infeccin primaria, en la
que se ve un aumento tpico de anticuerpos.
En la figura 27-11 se diagrama lo que ocurre
en el estado recurrente. El virus, por un meca
nismo de traslado por el canal intraaxnico,
viaja desde los terminales nerviosos hasta neu
ronas de los ganglios del trigmino (infeccin
facial) o sacros (en la infeccin genital). En la
neurona, clula que no se divide, se aloja en un
estado particular de latencia y fenmenos an
no definitivamente aclarados producen el viaje
inverso del virus, desde el ganglio a los term i
nales nerviosos del sitio original de infeccin.
A ll alcanza clulas susceptibles y se induce
una multiplicacin viral que se transmite en su
mayor parte por mecanismos de formacin de
sncicios y fusin de membranas, alcanzando
clulas vecinas. Consecuentemente, se produce
el fenmeno de inflamacin y una nueva esti
mulacin del sistema inmune (fig. 27-12).
Es de gran importancia resaltar que este fe
nmeno representa una verdadera paradoja in
munolgica. Esto es, la reactivacin de la re

plicacin viral con induccin de la patologa

local o sin ella, se produce en individuos que
tienen en su sangre un ttulo importante de an
ticuerpos neutralizantes contra virus HSV. Las
explicaciones que pueden aportarse en funcin
de dar una interpretacin de este fenm eno
son:
1. El trnsito del virus en el canal intraax
nico se realiza en ausencia de anticuerpos n eu
tralizantes en este compartimiento.
2. El virus a nivel de los terminales nervio
sos, y antes de acceder a las clulas suscepti
bles, interaccionara con cierto tipo de inmunoglobulina IgG, a la cual bloqueara, protegien
do los receptores virales que haran a este virus
insensible a anticuerpos neutralizantes. El virus
as protegido por cierto tipo de IgG podra
ingresar a las clulas susceptibles e infectarlas.
3. Una vez que el virus ha penetrado en las
clulas susceptibles y amplificado el nmero de
nuevos viriones infecciosos, el mecanismo de
traspaso de clula a clula puede hacerse por
mecanismo de fusin de membrana con clulas
contiguas, que lo pone fuera del alcance de los
anticuerpos presentes en el espacio extracelular.
4. La inmunidad dependiente de clulas y el
m ecanism o de inflam acin actan, y nuevas
clulas se informan con antgenos procedentes
de las clulas infectadas destruidas por m eca
nismos de citotoxicidad dependiente de linfoci
tos. Ello mantiene una produccin casi p erm a
nente de clulas B productoras de anticuerpos
Anticuerpos
neutralizantes

F ig . 2 7 -1 1 . E v o lu c i n d e
m a r c a d o re s d e te c ta b le s e n la
i n fe c c i n h e r p t ie a p r im a r i a
d e m u c o s a s ( fa c ia l y /o g e n i
ta l) y r e c u r r e n c ia s p e ri d ic a s
an u ales.

-1 0

10

100

Tiempo en das

Recurrencias
virales

10.000

550

Inmunopatologa
F ig . 2 7 -1 2 . D ia g ra m a d e l
p o s ib le m e c a n is m o de
t r a n s p o r te v ira l e n la recuiTencia h e rp tic a .

Ganglio trigmino

ganglio sacro
Viaje intraaxnico de ganglio
i receptores perifricos, donde
alcanza clulas de piel y/o mucosas

Neurona
ganglionar que
alberga el virus

De ganglio trigmino 3 o 4sacros, se ha aislado virus herpes.

Siempre que se cultive como
explanto y en presencia de
clulas permisivas (cocuitlvo)

Represin y/o induccin

de la replicacin viral. Puede
participar IgG inmune pegada
a antgenos de superficie
en la neurona

circulantes, del tipo neutralizante, y contra to

dos los otros antgenos virales que se producen
en cantidad suficiente.
En este fenmeno intervienen una serie de
factores concomitantes, contra los cuales la in
tegridad de la habilidad de respuesta T depen
diente a nivel de inmunidad celular, la sntesis
de intefern, la IgA secretoria inmune, etc., de
sempean papeles crticos.
Es de importancia, refirindonos aJ tema de
respuesta inimine en infecciones virales, inser
tar aqu un refuerzo del concepto de inmuniza
cin. Obviamente, una vacuna clsica de virus
herpes inactivado slo ser capaz de inducir efi
cientemente anticuerpos contra antgenos de su
perficie viral (neutralizantes) y muy poco o na
da contra estructuras antignicas internas. Una
vacuna de este tipo ser intil, como lo ha de
mostrado la experiencia, para producir un cam
bio en el fenmeno de recurrencia, ya que estos
individuos tienen un alto ttulo de anticuerpos.
12. R espuesta inmune en hepatitis B
Se conoce perfectamente la constelacin de
pruebas de laboratorio inespecficas (desde el
punto de vista de los agentes etiolgicos), apli
cadas al diagnstico y seguimiento de los en
fermos con hepatitis infecciosa.
Desde el punto de vista epidemiolgico, po
demos reconocer la llamada hepatitis viral in
fecciosa epidmica o hepatitis A, y la asociada
fundamentalmente a transfusiones de sangre y
aplicaciones parenterales o hepatitis B.

A fines de la dcada de 1970, cientficos ita

lianos describieron el virus de la hepatitis D
(HDV) o Delta cue slo afecta a pacientes que
tambin estn infectados con el HBV, existien
do la co-infeccin y la sobreinfeccin.
A fines de los aos 80, se describen los vi
rus de la hepatitis C (HCV) y de la hepatitis E
(HEV), ambos ARN virus, pero de diferente
va de transmisin = fundamentalmente parenteral para HCV y oral para HEV.
En 1965, Blumberg evidenci la presencia,
en la sangre de ciertos individuos, de un antge
no al que llam Australiano. En la actualidad
se acepta que este antgeno est asociado a la
infeccin con el agente etiolgico de la hepati
tis B y se trata de la presencia, en la sangre de
individuos infectados, de partculas completas
(DAE) o partculas subvirales de este com
plejo antignico (vase fig. 27-4).
La era del antgeno de Blumberg, como ha
sido dado en llamarse al importante trabajo de
investigacin desarrollado en los ltim os 1 0
aos, ha permitido disponer de tcnicas de la
boratorio de discreta simplicidad, que brindan
un enfoque especfico al estudio de diagnstico
de las hepatitis infecciosas virales. La posibili
dad de investigar en grandes grupos de pobla
cin la presencia del antgeno asociado a la he
patitis producida por el virus de la hepatitis B
(HBV) ha permitido establecer la existencia de
portadores de antgenos por perodos diversos
que pueden alcanzar desde ms de seis meses a
aos.
Estudios epidem iolgicos bien controlados
han demostrado que la transfusin o los contac

Inmunologa en las infecciones virales

tos parenterales con la sangre de portadores es
capaz de transmitir la hepatitis B a los recepto
res. El control de la sangre de los donantes, que
permite eliminar a aquellos en los que se detec
ta el antgeno asociado a hepatitis, disminuye
drsticamente los casos postransfusionales.
Esto justifica ampliamente la aplicacin ruti
naria de tcnicas de deteccin en todos los ca
sos de transfusin. Es necesario recordar que
otros m ecanism os, adem s de las p rcticas
transfusionales y algunas de carcter yatrognico (prcticas dentales, endoscopias, acupuntu
ra, etc.), ayudan a mantener la endemia natural
del virus en la naturaleza (ritos rehgiosos, ho
m osexualidad m asculina, heterosexualidad,
etc.).
Antes de presentar un breve comentario so
bre los aspectos relacionados con la respuesta
inmune en hepatitis B conviene repasar los as
pectos estructurales del agente (vase fig. 27-4).
Recordemos que la infeccin humana con el
HBV puede inducir distintos sndromes (vase
grfico en esta pgina).
Veamos ahora algunos de los aspectos gene
rales de la respuesta inmune en estos casos:
a) Individuos refractarios
Se conoce que un reducido nmero de indi
viduos han recibido transfusiones de sangre
provenientes de personas infectadas con HBV
y no han respondido con desarrollo de enfer
medad ni con la produccin de una respuesta
inmune detectable. El margen nulo de experi
mentacin en humanos, ya que estas com pro

baciones provienen de interpretaciones fra g

mentarias de casos de accidentes, no perm ite
ningn comentario para dar explicacin de este
hecho. Sin embargo es lcito pensar que, por
problemas de receptores u otra causa, el agente
no infecta clulas susceptibles y es degradado
por mecanismos del husped antes de que al
cance a inducir una respuesta inmune detectable. En otros casos no hay enfermedad, pero s
resp u esta de anticuerpos fundam entalm ente
contra HBsAg.
b) Hepatitis viral aguda
Uno de los hechos que caracteriza esta enfer
medad por virus B es el largo y variable pero
do de incubacin, que media desde la exposi
cin hasta la aparicin de los sntomas. L a se
cuencia de la cintica de los principales m arca
dores se presenta en la figura 27-13. Antes de
la aparicin de los sntomas clnicos y de la
elevacin significativa en el suero del paciente
de las aminotransferasas, puede detectarse en l
HBsAg. Esto, junto con un alto ttulo de ADN
polimerasa viral en suero, son indicadores fe
hacientes de una im portante sntesis de virus
por parte de la clula heptica.
El virus obviamente se replica en el hepato
cito sin producir dao celular (Usis) per se y
en la sangre de este individuo se encuentran
partculas de DAE (42 nm) y una gran canti
dad de HBsAg en su forma particulada de 20
nm y agrupaciones filamentosas. La aparicin
de sntomas clnicos y la elevacin de las ami
notransferasas coincide con la brusca aparicin

HBV
N a d a d e te c ta b le
( In d iv id u o s re fra c ta rio s )
H e p a titis v ira l a g u d a
fu lm in a n te (m u e rte )

P o rta d o r o lig o s in to m tic o

o a s in to m tic o

H u m a n o s s u s c e p tib le s

I n fe c c i n in a p a re n te
a n ic t ric a
S in s in to m a to lo g a
c ln ic a su b je tiv a

H e p a titis p e rs is te n te

H e p a titis v i r a l '
aguda

R e c u p e ra c i n con
e lim in a c i n d e fin itiv a
d e m ai-cadores de
r e p lic a c i n v ira l

551

P e r s is te n c ia d e uno
o m s m a rc a d o re s
d e r e p lic a c i n v iral
en e l in d iv id u o
(d e fin itiv a o
i n te rm ite n te )

D is p la s ia d e las c lu la s -< * h e p tic a s , h e p a to m a

H e p a titis viral
c r n ic a a g re s iv a

. C irro sis

552

Inmunopatologa
F ig . 2 7 -1 3 . E v o lu c i n d e m a rc a d o re s d e te c ta b le s en
la in fe c c i n c o n v iru s d e la h e p a titis B . (C a s o d e h e
p a titis v ira l a g u d a re s u e lta .)

y el eJevado aumento en suero de anti-HBc, el

anticuerpo contra la m asa antignica interna
del virin (core). En un tiempo poco definido y
siempre que la recuperacin general del enfer
mo sea un hecho clnico, cae la concentracin
de HBsAg en suero.
Sigue a esto un pero d o sin antig en em ia
(HBsAg) detectable que puede extenderse por
semanas y luego comienza a detectarse con una
elevacin muy lenta el anticuerpo anti-H Bs
contra el antgeno de superficie.
En una hepatitis viral aguda resuelta, no se
detectan marcadores fehacientes de la replica
cin del virus (ADN polimerasa y HBeAg en
suero), y s se observa una cada del anticuerpo
anti-core y un mantenimiento del ttulo de anti
cuerpos anti-HBs. Este cuadro indica un buen
pronstico de la infeccin. Los anticuerpos anti-HBc son primero IgM y luego del tipo IgG y
los anti-HBs son, en el caso de detectarse, del
tipo IgG.
El silencio serolgico de HBsAg y anti-HBs
durante el perodo de transicin no se debe en
realidad a una ausencia absoluta, sino a la falta
de sensibilidad de las tcnicas empleadas en su
deteccin, ya que gran parte de la masa de cada
uno de ellos se encuentra formando complejos
inmunes.
Es muy importante plantear la categrica di
ferencia de la respuesta de anticuerpos antiHBc y la de anti-HBs. Cada vez se tiene ms
evidencia de que los antgenos de la estructura
del core son realmente nuevos en el organismo
humano, mientras que la constelacin de poli
pptidos que constituyen el antgeno HBsAg
tendran especificaciones tanto del virus como
de algunas de las protenas del hepatocito.
El antgeno e del virus de la hepatitis B
(HBeAg) se encuentra en el core de la partcula
de DAE en forma crptica; es detectable en
suero sim ultneam ente con la aparicin del
HBsAg o poco tiempo despus. El HBeAg per
siste menos tiempo que el HBsAg en la mayo
ra de los pacientes. El HBeAg es un marcador
de infectividad y su presencia sugiere la conti
nua actividad del HBV. Adems, los inmuno-

complejos HBeAg-IgG se consideran inducto

res de glomerulonefritis membranosa. La desa
paricin del HBeAg es seguida por la aparicin
de su anticuerpo, el anti-HBe. Esta seroconversin, que ocurre alrededor del pico de sntomas
clnicos, indica que la enfermedad evoluciona
favorablemente, pudiendo ser interpretada co
mo probable recuperacin y elim inacin de
clones productores de virus en el hgado del
husped (fig. 27-13).
E stas co n sid eracio n es sern n uevam ente
evaluadas al tratar las otras variables de la in
feccin con virus B.
Es de importancia trabajar sobre el concepto
de que la patologa que desencadena el sndro
me de hepatitis no es inducida por la replica
cin viral p er se, sino por la serie de m eca
nismos que siguen a la respuesta del individuo
y que generan el dao celular del hepatocito.
La imagen microscpica de la biopsia hep
tica se caracteriza predominantemente por in
filtracin m ononuclear linfocitaria. Los estu
dios de la respuesta de inmunidad celular en la
hepatitis viral aguda no arrojan resultados uni
formes, pero orientan hacia la comprensin de
su importante papel en la induccin de patolo
ga. Algunos autores han encontrado una pro
duccin aumentada del factor inhibitorio de la
migracin de macrfagos, cuando linfocitos de
pacientes tomados entre la iniciaciti y el pico
de tra n sa m in a sa s fu e ro n e n fre n ta d o s con
HBsAg purificado. Otros autores han hallado
un aumento de la respuesta celular especfica
en la iniciacin de la convalecencia, cuando el
antgeno HBsAg deja de detectarse en suero.
Existen resultados que indiean, en enfermos
agudos, una respuesta linfocitaria activa contra
HBeAg. Esta tuvo una intensidad de aproxima
damente el doble eon relacin a cundo se estu
di la inducida en los mismos pacientes contra
HBsAg. Otros autores han relatado que durante
la fase aguda y la convalecencia temprana se
produce un aumento del nmero relativo de c
lulas hiporreactivas (mull cells) que pueden al
canzar un valor del 25% del total de linfocitos
perifricos en el mximo perodo de supresin.

Inmunologa en las infecciones virales

La interpretacin de todos estos datos, no
siempre discrepantes, semeja un rompecabezas,
en el que faltan piezas y el juego consiste en
armar lo ms posible y disear los estudios faltantes para completar la imagen final.
c) Hepatitis viral aguda fulminante
Algunas hepatitis virales agudas inducidas
por virus B, con desenlace fatal, siguen ei cua
dro general ya planteado con la sola e im por
tante excepcin de que en forma muy tempra
na, y precediendo a la instalacin de los graves
signos y sntomas que preceden a la muerte, se
detecta un aumento marcado de anti-HBs. El
reducido nmero de casos estudiados no perm i
te an correlacionar este aumento de anti-HBs
y el desenlace fatal, pero obviamente abre aun
ms el camino a la hiptesis de que el dao he
ptico estara relacionado con la exclusin por
citli.sis de clulas hepticas nobles afectadas
por mecanismos inmunes y no por accin di
recta del virus.
En cuanto a si ese mecanismo es dependien
te o no de anticuerpo circulante es materia de
estudio.
d) Infeccin con persistencia de uno o ms
marcadores de replicacin viral en el
individuo
Un porcentaje no conocido de los individuos
que se infectan (independientemente de que de
sarrollen o no una hepatitis aguda o una infec
cin con sintomatologa en niveles que no lle
van al individuo a requerir atencin mdica)
pueden evolucionar en forma que la respuesta
inmune y otros parmetros involucrados deter
minen la no ehminaein de hepatocitos persis
tentemente infectados, los que continan, prpduciendo virus completos y partculas suf)yirales, como la partcula de 2 0 nm correspondien
te a HBsAg.
C asusticas efectuadas m ediante estudios
controlados indican que un 5% de las hepatitis
agudas tipo B evolucionan a la persistencia.
Este dato es para reas epidemiolgicas deter
minadas y no puede generalizarse, pero da una
idea del problema.
Como se present en el diagrama, el estado
de persistencia viral en el hgado puede estar
acompaado de una gama de otros hechos que
condicionan polos didcticos de clasificacin,
y cuya definicin es muchas veces imposible.
Estos son;
dj) Portador oligosintomtico o asintomtico.
d^) Hepatitis persistente.
d,) Hepatitis viral crnica agresiva.

d ,)

553

P o r t a d o r o l ig o s in t o m t ic o o a s in t o m t ic o

Este individuo est definido como aquel que

sin sentir ninguna sintomatologa, o sntom as
muy ligeros que no obligan a la consulta espe
cfica, y que por razones diversas, pero funda
mentalmente por su intento de donar sangre, es
detectado como portador de HBsAg en su san
gre. Es necesario aadir, para ampliar la defini
cin, que no debe ser alcohlico ni drogadicto,
y que se demuestre que tiene antgeno HBsAg
detectable en sangre por un perodo mayor de 6
meses. Adems del estudio completo deber te
nerse en cuenta que una puncin biopsia de h
gado no revele ningn tipo de patologa defini
ble. Los estudios referentes a otros parmetros
como aminotransferasas, otras enzimas, facto
res de coagulacin, etc. debern corresponder a
lmites de normalidad.
En la figura 27-14 planteamos el perfil de n i
veles de antigenemia y otros datos relacionados
con la respuesta inmune en un portador. En l
se ve como elemento definitorio un alto y con
tinuo ttulo de anticuerpos anti-HBc, acom pa
ando la presencia de HBsAg. Es prcticam en
te nula la posibilidad de detectar en estos indi
viduos anti-HBs.
Estudios de inmunidad celular han dem ostra
do que los linfocitos no tienen ninguna re s
puesta activa cuando se utiliza HBsAg p u rifi
cado como antgeno inductor en las pruebas in
vitro.
En nuestro seguimiento de una serie de p o r
tadores asintomticos detectada en el banco de
sangre, 80% de los casos estudiados con evolu
cin favorable presentaron deteccin de antiHBe y no pudo demostrarse HBeAg.
d^ y dj)

H e p a titis p e r s is te n te y h e p a titis v ir a l

CRNICA a g r e s i v a

A qu conviene introducir un concepto que

tiene que ver con el armado del rompecabezas
inmunolgico de la infeccin con virus B.
Resulta, como hemos visto, que la infeccin
puede causar una hepatitis viral que va desde el
sndrome fulminante, con altos y abruptos te
nores de bilirrubinemia pre mortem, a formas
agudas severas eon franca bilirrubinemia, altos
niveles de aminotransferasas y aguda presencia
de sntom as subjetivos (anorexia, cansancio,
etc.) y, por ltimo, formas muy leves hasta ne
tamente anictricas.
El concepto a que hacamos referencia es el
que perm ite aceptar que cuanto ms leve sea e]
cuadro y preferentemente las formas anictri
cas, ms tendencia tienen estas infecciones a
generar el estado de persistencia.
La diferencia entre un cuadro de hepatitis vi
ral p ersisten te y una h epatitis viral cr n ica

554

Inmunopatologa

F ig . 2 7 -1 4 . E v o lu c i n d e m a rc a d o re s d e te c ta b le s e n la in fe c c i n co n v iru s d e la h e p a titis B , e n in d iv id u o s o lig o s in to m tico s o a s in to m tic o s (p o rta d o re s).

agresiva tiene que ver con las imgenes de pa

tologa del tejido heptico y, en obvia relacin
con ella, la sintomatologa y la signologa que
se acompaa. Aproximadamente el 5 al 10% de
los pacientes con hepatitis viral aguda tipo B
desarrollan formas crnicas.
El HBeAg y la ADN polim erasa viral en
suero (no incluidas en la figura 27-15 por razo
nes de claridad) tambin son francamente de
tectados en el perodo de enfermedad asinto
mtica, y en realidad es probable que en canti
dades no detectables se sinteticen en forma per
manente en este tipo grave de infeccin.
Siempre, en estos casos, altos ttulos de antiHBc acompaan la evolucin.
La incapacidad de desairollar una respuesta
policlonal eficiente de anti-HBs en este tipo de
pacientes puede ser interpretada como un m e
canismo de tolerancia sobre el que no dispo
nemos de evidencias experimentales.
En cuanto al perfil de la respuesta inmune, y
con referencia especial a la hepatitis viral cr
nica agresiva, vemos en la figura 27-15 un dia
grama de la evolucin de los marcadores ms
importantes, a manera de ejemplo que refleja
los resultados de algunos casos estudiados por
nuestro grupo. Lo importante es que la presen
cia de HBsAg y anti-HBs se alternan de forma
que se flucta entre la formacin de inmunocomplejos en exceso de antgeno y la situacin
inversa, con la formacin de inmunocomplejos
en exceso de anticuerpos.
Esta es la razn por la cual es necesario utili
zar tcnicas apropiadas para su deteccin. Por
ejemplo la contrainm unoelectroforesis (CIE)
no detecta ni antgeno ni anticuerpo en los pe
rodos de cantidades equivalentes, mientras que

el radioinmunoensayo s detecta a ambos. Esto

habla claro de la eficiencia de la CIE para de
teccin de HBsAg en portadores. La contrain
munoelectroforesis, en el seguimiento de pa
cientes, muestra una eficiencia con respecto al
RIA que no pasa del 40%, mientras que en da
dores de sangre llega al 75% de lo que se de
tecta con RIA.
El cuadro de complejidad de la respuesta in
mune en la hepatitis crnica agresiva explica
per se cmo estos casos, en un gran nmero,
evolucionaron a la fibrosis y culm inan como
sndromes cirrticos.
Como indicador adicional de replicacin vi
ral tambin encontraremos aqu un alto nivel de
anti-HBc.
e)

C o r o la r io

Q ueda as aclarado que la p ato g en ia que

acompaa a la hepatitis viral inducida por el vi
rus tipo B tene un componente fundamental en
la respuesta inmune. El agente tiene una accin
citoptica muy limitada o nula y es comn en
contrar hepatocitos productores de virus (reve
lados por inmunofluorescencia o microscopia
electrnica) perfectamente conservados citolgicamente.
En portadores asintom ticos, una cantidad
de material viral se vuelca al torrente sangu
neo, sin indicios de dao celular heptico.
Las lesiones hepticas pueden estar modula
das por la respuesta inmune celular y humoral.
Dao heptico:
e,) Ataque a antgenos virales en la superfi
cie de las clulas infectadas.

Inmunologa en las infecciones virales

555

F ig . 2 7 -1 5 . E v o lu c i n d e m a rc a d o re s d e te c ta b le s en
l a in fe c c i n c o n v iru s h e p a titis B co n p e rs is te n c ia d e
s n te s is v ira l y s in t o m a t o lo g a p e r i d i c a (h e p a titis
c r n ic a a c tiv a ).

e^) A taque a antgenos modificados (hus

ped-virus) de la superficie celular.
Dao extraheptico: Accin mediada por inmunocompiejos.
Existe marcada evidencia de que la respuesta
humoral mediada a travs de interacciones di
rectas antgeno-anticuerpo, activacin de com
plem ento y citotoxicidad anticuerpo-depen
diente, no .son causa primiria de lesin de hepatocitos. Este concepto se apoya en datos en
tre los cuales los ms relevantes incluyen el he
cho de que la inoculacin de anticuerpos antiHBs a portadores de HBsAg no induce nin
gn dao detectable del hepatocito, explorado
por tcnicas convencionales de laboratorio y un
estudio clnico minucioso.
Si bien el anti-H Bc aparece concom itante
con el dao heptico, el anti-HBs aparece en la
convalecencia, en total ausencia de HBsAg, y
es sign o de re c u p e ra c i n del p acie n te. El
abrupto aumento de anti-HBs en la hepatitis
fulm inante resulta paradjico y an no tiene
explicacin.
Otro dato que apoya una patogenia no de
pendiente de anticuerpos lo constituye la obser
vacin de que pacientes con agammaglobuline
mia que desarrollan hepatitis B, tienden a dar
formas ms severas, a menudo fatales, cuando
se com paran con la evolucin de individuos
normales.
La clara infiltracin monocitaria linfoctica
de las lesiones hepticas abre ya camino a pen
sar en una dependencia de la actividad inmune
celular en la destruccin del hepatocito. Ha sido
demostrado que individuos con defectos en la
inmunidad mediada por clulas desarrollan he
patitis inducidas por infeccin con virus B m u
cho ms leves que las personas normales. La in
munosupresin resulta en una disminucin de la
sintomatologa en los procesos crnicos.

Por ltimo, linfocitos o factor de transferen

cia obtenidos de individuos convalecientes de
hepatitis B, administrados a pacientes que so
brellevan una hep atitis crnica, inducen un
agravamiento temporal de la severidad del cua
dro de hepatitis en todos sus parmetros.
Lesiones extrahepticas
Durante la hepatitis viral aguda tipo B, y no
en la A, los sntomas que siempre acompaan
el cuadro general son aquellos derivados de la
formacin y el procesamiento de inmunocomplejos. Se hacen evidentes en piel con peque
as petequias, exantema, dolores articulares y
alteracin de los pequeos capilares. Tambin
se ha descrito una breve reaccin sistm ica
comparable con el sndrome de la enfermedad
del suero, que es prodrm ico, y que precede
hasta en seis semanas a la aparicin de los sn
tomas.
La importancia de los inm unocomplejos en
el desarrollo de la evolucin hacia la persisten
cia viral o no, es material de estudio.
Apndice de aplicacin
prctica
Existen equipos de laboratorio, fundamental
mente basados en enzimoinmunodeteccin, con
los cuales se pueden explorar cualitativamente
la presencia o la ausencia de los distintos m ar
cadores.
Un estudio completo de una hepatopata que
se sospecha de origen viral incluira la lgica
a p licaci n de una can tid ad de p ru eb as. En
nuestra experiencia, resulta muy prctico el uso
de solamente tres para el inicio de un estudio
serolgico de un paciente.
En el cuadro 27-3 se expone la interpreta
cin ms probable.

556

Inmunopatologa

Cuadro 27-3
H BsAg

Ani-H Bc

Ig M anti-H A V

Interpretacin

)+

H e p a titis v ira l a g u d a tip o B en in cu b a c i n

)+

H e p a titis v iral a g u d a tip o B p o rta d o r c r n ic o o h e p a to p a ta c r n ic a

3)^

H e p a titis v ira l a g u d a tip o B en la c o n v a le c e n c ia , p e rio d o d e s ile n c io

s e ro l g ic o d e l s is te m a d e s u p e rfic ie o iie p a titis tip o B d e la rg a d a ta

4 )-

H e p a titis v ira l a g u d a tip o A

5 )-

H e p a titis n o A n o B

)+

H e p a titis v iral a g u d a tip o A c o n las v a ria n te s d e 2)

13. Respuesta inmune en la infeccin

con HIV (agente desencadenante
del sndrome de inmunodeficiencia
adquirida - SIDA)
El SIDA (AIDS, notacin inglesa) est ca
racterizado por una deficiencia bsica de la in
munidad celular, sin otra causa primaria cono
cida que la infeccin viral, y es acompaado
por un conjunto de anormalidades inmunolgi
cas y neurolgicas que culminan con un dete
rioro del sistema linfoide y que, generalmente,
puede conducir a la m uerte del paciente por
aparicin de infecciones oportunistas o neopla
sias.
Agente etiolgico
El virus causante del SIDA (vase fig. 27-5)
fue descubierto en forma casi simultnea por
el grupo de Montagnier, en el Instituto Pasteur
de Pars (Francia) bajo la denom inacin de
LAV (lymphoadenopathy-associated-virus),
por el equipo de Gallo, en el Instituto Nacional
de Cncer (EE.UU.), con el nombre de HTLVIII (H uman-T cell lym photropic virus, type
III), y por Levy en San Francisco (EE.UU.),
como ARV (AIDS-related virus), habindo
se adoptado a partir de junio de 1986 en la n o
menclatura internacional las siglas VIH (virus
de la inmunodeficiencia humana) o HIV (nota
cin inglesa), que es la reconocida en todo el
mundo.
Recientemente se ha aislado un nuevo retrovirus de pacientes con SIDA que viven en el
oeste de frica. Este nuevo virus, denominado
HIV-II, tiene una glucoprotena de envoltura
relacionada con el SIV (virus de la inmunodefi
ciencia de los simios). Existen grandes diferen
cias de secuencias entre los dos tipos de HIV.
Los anticuerpos contra la glucoprotena de su
perficie del HIV tipo I tienen una reactividad
parcial cruzada con el HIV tipo II. Lo mismo
ocurre con los anticuerpos dirigidos contra las

protenas del core de ambos virus. Por lo tanto,

se ha concluido que el SIDA es un sndrome
que puede ser causado por uno o ms virus di
ferentes, pero relacionados entre s.
Taxonm icam ente pertenecen a la fam ilia
Retroviridae, gnero Lentivirus y estn consti
tu id o s por cido rib o n u cleico (A R N ), una
transcriptasa reversa, protenas estructurales y
glucoprotenas de envoltura. Las partculas ma
duras tienen un dimetro de 1 1 0 a 1 2 0 nm.
Se reconocen en el genoma del HIV diferen
tes genes, gag, que codifica para las protenas
de la n u cleo cp sid e: p ro ten a de la m atriz
(MA), protena de la cpside (CA) y ncleo
protena (NC); el gen pro codifica para la proteasa (PR); el p o l codifica para la integrasa
(IN) y para la transcriptasa reversa (TR) y el
env que codifica la glucoprotena de transmem
brana (TM) y las glucoprotenas de superficie
(SU).
Adems, contiene por lo menos seis genes
adicionales que codifican protenas con funcio
nes reguladoras, es decir, funciones que afectan
ei grado de expresin del HIV y la naturaleza
de las partculas virales que se producen. Estos
genes se traducen en diversas protenas, de las
cuales las ms estudiadas son tat y Rev . La
protena tat (activador-trans) se une a una se
cuencia de ARN (elemento tar) y, junto con
otras protenas, incrementa en unas cien veces
la cantidad de transcriptos de HIV que se for
man.
La protena R ev se une a otra secuencia y
promueve el transporte al citoplasma de canti
dades crecientes de aquellas especies de ARN
mensajeros que codifican las protenas estruc
turales del HIV. Las funciones de las protenas
reguladoras son menos claras.
El conocimiento alcanzado en la estructura y
la biologa moleculares del virus, desde su ais
lamiento a la actualidad, revela la tremenda po
tencialidad de los cientficos para dar respuesta
a un problema que emerge a principio de la d
cada del 80.

Inmunologa en las infecciones virales

Respuesta inmune humoral a la infeccin
p or H IV
Obviaremos datos de epidemiologa y trans
misin que no encuadran en esta presentacin y
haremos una brevsima referencia a la evolu
cin de la respuesta inmune. sta nos ayuda a
rescatar un nuevo modelo y a tener inform a
cin que permita orientar diagnstico y prons
tico de la infeccin.
Cuando un virus como el HIV penetra en la
clula, una enzima exclusiva de los Retrovirus,
llam ada transcriptasa inversa, transform a en
ADN el material gentico (ARN) que stos p o
seen. Ese ADN se integra al material gentico
celular y a partir de ese momento cada vez que
la clula husped se divida, las clulas hijas
contendrn tambin genes virales. Estos genes
virales, segn su estado de expresin, codifican
para protenas virales. En el mximo estado
permisivo (replicacin viral) inducen la sntesis
de: a) protenas estructurales internas o del core
(gag) identificadas como p24, p25, (CA), p. 17
(MA), p7 (NC) y el precursor del gag p55; b)
enzim as com o la transcrip tasa reversa (TR,
p 6 6 ) y la integrasa (IN, p32); c) protenas de la
envoltura que con diversos azcares configuran
las g lu c o p ro te n s id e n tific a d a s co m o
SU (gpl20) y TM(tp 41), y d) otras potenas cu
yo papel an se desconoce.
Cuando se efecta el seguimiento de la in
feccin por HIV, el primer marcador serolgico detectable es el antgeno p24 (CA) del HIV
generado por amplificacin viral en las clulas
blanco (fundamentalmente linfocitos TCD^+).
La antigenemia aparece de dos a cuatro se
manas despus de la infeccin y persiste duran
te ocho a diez semanas como se observa en la
figura 27-16.

557

Los anticuerpos contra el core son los p ri

meros en aparecer, aproximadamente cinco se
manas a partir de la infeccin por HIV, y fu e
ron detectados en el 75-95% de los enfermos
con SIDA o sndromes relacionados. Los an ti
cuerpos contra la envoltura se detectaran a
partir de la 5- a 1- semanas posinfeccin; su
declinacin constituye signo evidente de d ete
rioro del estado general del paciente. Junto con
la disminucin de la concentracin de los anti
cuerpos core, el antgeno vuelve a ser detecta
do y esta inversin serolgica generalm ente
precede al comienzo de los sntomas clnicos
del SIDA.
La interpretacin del papel de los anticuer
pos, inmunocomplejos y el resto de la constela
cin de hechos asociados a la respuesta inmune
son an difciles de ordenar.
Puede haber individuos portadores del virus
con serologa negativa, tratndose de portado
res o enfermos con dficit inmunolgico. Este
hecho, sin embargo, es excepcional.
Durante la fase asintomtiea de la infeccin
por HIV se detectan en suero anticuerpos con
tra el core y anticuerpos contra la envoltura
(fig. 27-16).
Anom alas inm unolgicas en la infeccin
por H IV
El trastorno inmunitario de esta infeccin se
caracteriza por anomalas cuantitativas y cuali
tativas de la poblacin linfocitaria, esp ecial
mente en los linfocitos que expresan en su su
perficie el receptor CD^^, denominados ta m
bin linfocitos T4 (linfocitos cooperadores).
Si bien se han comunicado alteraciones fun
cionales en los distintos componentes del siste
ma inmune y en otros sistemas del organismo,

Serologa del HIV

Fig. 27-16. N iveles sricos de antgenos y anticuerpos en la infeccin por HIV.

558

Inmunopatologa

la anomala bsica de la infeccin por HIV es

la destruccin de la poblacin linfocitaria T4
ocasionada por el HIV.
Adems de infectar las clulas T
se ha
demostrado que el HIV puede infectar: mono
citos de sangre perifrica, lneas celulares monocticas, diversos macrfagos tisulares, clu
las dendrticas, clulas microgliales del cere
bro; todos tipos celulares que expresan el re
ceptor CD^ en sus membranas plasmticas.
Los mecanismos de la Inmunodeficiencia in
ducida por el HIV estn relacionados con la
particularidad de estos virus de reducir la capa
cidad funcional de los linfocitos T perifricos y
de las clulas presentadoras de antgenos, e in
hibir la produccin y maduracin de precurso
res de las clulas T, por lo que afectara en can
tidad y calidad el nmero de clulas T perifri
cas.
A n o m a la s c u a n ti ta t iv a s d e l o s T 4

En los casos que concuerdan con la defini

cin aceptada de SIDA, la anomala ms evi
dente es la linfopenia, en contraste con el n
mero absoluto de los linfocitos TCD 8 + que es
normal o aumentado. Se utiliza el cociente en
tre el nmero absoluto de TCD4+ y el nmero
absoluto de TCD 8 + como indicador de la alte
ra c i n . E s te c o c ie n te o re la c i n T C D 8 "
TCD4+ debe ser menor que 1 para tener signi
ficacin.
Tanto la linfopenia como el descenso de la
relacin TCD4+nCD8^, varan segn el tiempo
de evolucin y la gravedad del caso. Por lo ge
neral, la anom ala se va acentuando, y llega
paulatinamente a su expresin ms intensa en
los pacientes de fase terminal.
En los pacientes con SID A los linfocitos
TCD4+ casi desaparecen de la sangre circulan
te. En los pacientes con complejo relacionado
con el SIDA, la alteracin no es siempre tan
evidente, y en algunos casos oscila en perodos
de mayor o menor intensidad.
Conviene destacar que estas anom alas no
son especficas de la infeccin por HIV, y pue
den encontrarse en otros procesos infecciosos o
no.
Existe generalmente anergia cutnea a diver
sas intradermorreacciones, especialmente a la
candidina y tuberculina. Como otras anomalas
descritas, su presentacin se hace con grado
variable de intensidad a lo largo de la evolu
cin, pero en los pacientes con formas termina

les de la enfermedad, las pruebas cutneas no

detectan ninguna reaccin.
O t r a s a n o m a l a s in m u n e s

Se atribuyen generalmente a las anomalas

de la poblacin T CD^+. Se han descrito: a) un
aumento policlonal de las inmunoglobulinas; b)
una disfuncin de la actividad macrofgica y
de eitotoxicidad, y c) un aumento de la (32-microglobulina srica. Esto ha sido comunicado
como indicador de evolucin a formas graves.
Nunca antes haba sido producida en tan cor
to tiempo tal cantidad de publicaciones cientfi
cas sobre una enfermedad humana como ha su
cedido en la actualidad con el SIDA. Los datos
obtenidos sobre la biologa molecular, la clni
ca, los posibles tratamientos, el desarrollo de
eventuales microorganismos y el problema so
cial son el resultado de una extraordinaria deci
sin del hombre para vencer el problema.
Como norma para cerrar este captulo, pode
mos decir que es necesario conocer aun ms la
patogenia y la respuesta inm une para actuar
con drogas y/o inmungenos en un desequili
brio tan complejo como el que genera el HIV.

BIB L IO G R A FIA
1. C o to , C y d e T o rre s , R A: N a tu ra le z a y e s tru c tu ra de
lo s v iru s a n im a le s . S e rie d e U ro lo g a . D IG E N , B u e
n o s A ire s , 1983.
2. F ra e n k e l-C o n ra t, H y Vv'agner, R R (e d s). V ir u s - h o s t
in te ra c tio n s . Im m u n ity to v iru s e s . C om prehensive Virology. V o l 15, 1979, P le n u m .
3. S is so n s , J G P y O ld s to n e , M : f to s t r e s p o n s e to v ira l
in fe c tio n s. E n : Virology. B e rn a rd E ie ld E d ito r. R a v e n
P re ss B o o k . N u e v a Y o rk, 1985.
4. K a rc h e r, D , L o w e n th a l, A y S tro s b e rg , A D: H um oral
im m unity in neurologicai diseases. P le n u m P re ss . N u e
v a Y o rk , 1979.
L e n n e tte , E; S p a u ld in g , E y T ru a n t, J P: M a n u a l o f cli
nical m icrobiology. 2 ed , A m e ric a n S o c ie ty f o r M i
c ro b io lo g y . W a s h in g to n D C , 1974,
6. N o tk in s , A L : V iral im m unology a n d im m unopathology. N a tio n a l In s titu te s o f H ea lt. A c a d e m ic P r e s s ,
N u e v a Y o rk , 1975.
7. R o s e , N y F rie d m a n , H : M a n u a l o f clinical im m u n o
logy. A m e ric a n S o c ie ty fo r M ic ro b io lo g y , W a sh in g to n
D C , 1976.
8. E p s te in , A ; V iru s h e rp e s sim p le x , u n v iru s n o tatt s im
p le. E n : C o to , C; C a c c h io n e , R y d e T o rre s , R A (ed s).
A d e la n to s en M ic ro b io lo g a y E n fe rm e d a d e s I n fe c c io
sas. V o l. 5, B u e n o s A ire s , 1986.
9. N ie d fe ld , G ., M in v ie lle , M . G e n e ra lid a d e s d e l s is te m a
in m u n e . F a s c c u l o 1. C o l e c c i n C t e d r a E d i t o r i a l
U .N .L .P . 1994.
10. S c h a e c h te r, M e d o ff y c o l. M ic r o b io lo g a 2- ed . d it.
M d ic a P a n a m e ric a n a , 1994.

Autoinmunidad

CLELIA RIERA
JULIANA LEON!
NORA YRANZO-VOLONT

AUTOINMUNIDAD
Se denomina autoinmunidad a la respuesta
inmune contra componentes propios, y es debi
da a la presencia de linfocitos T o B autorreactivos. En condiciones normales, los m ecanis
mos de tolerancia a lo propio protegen al indi
viduo de estas clulas potencialm ente autorreactivas.
Hasta la dcada del 60 se crea que los lin
focitos autorreactivos eran eliminados durante
el desarrollo del sistema inmune y que, por una
falla en su eliminacin, se implantaba la enfer
medad autoinmune. A fines de los aos 70 nu
m erosos hallazgos han contribuido a revelar
que no todos los linfocitos T y B autorreactivos
son eliminados durante su maduracin. Por en
de, individuos normales poseen en su circula
cin linfocitos autorreactivos, cuya presencia
no indica necesariamente un estado patolgico
autoinmune ya que su actividad seguramente es
regulada mediante clones anrgicos o supreso
res. Una ruptura de esta regulacin puede lle
var a la activacin de las clulas autorreactivas
T o B, generando una respuesta humoral o ce
lular contra antgenos propios. Estas reacciones
pueden causar serios daos a clulas u rganos,
que a veces tienen consecuencias fatales.
En este captulo se describirn algunas en
fermedades autoinmunes humanas y modelos
en animales de experimentacin, como tambin
los mecanismos que pueden contribuir al de
sencadenamiento de la autoinmunidad.
Las enfermedades autoinmunes se caracteri
zan por la presencia de autoanticuerpos y/o lin
focitos T sensibilizados contra diferentes ma
cromolculas del organismo, que en individuos
normales son reconocidas como propias y por
lo tanto no desencadenan respuesta. El recono

28
cimiento de lo propio es el principio central del
funcionamiento del sistema inmune que no se
contrapone al desarrollo de enfermedades au
toinmunes, sino que permite explicar su apari
cin a travs de disturbios en el equilibrio in
mune, el que se autorregula constantemente en
respuesta a seales internas y externas.
La capacidad del sistema inmune para discri
m inar entre lo propio y lo extrao es adquirida
en primer lugar en el timo, durante la m adura
cin de los linfocitos T. Los tim ocitos auto
rreactivos especficos para antgenos expresa
dos intratmicamente y presentados en asocia
cin con molculas del complejo mayor de his
tocom patibilidad (MHC) son elim inados du
rante el desarrollo y maduracin del timo. Esto
se m anifiesta en la elim inacin de clones de
linfocitos T que reconocen antgenos propios
expresados sobre la superficie de linfocitos T y
B, m acrfagos, clulas dendrticas y clulas
epiteliales. Las clulas T que reconocen antge
nos propios que no estn presentes en el timo
no son eliminadas y permanecen en el organis
mo, siendo un peligro potencial para el mismo.
L a respuesta inm une a antgenos propios
puede observarse en individuos normales, pero
la potencialidad para desarrollar autoinm uni
dad est controlada por diferentes mecanismos:
linfocitos T supresores, interacciones idiotipoantiidiotipo, bloqueo de receptores celulares
por antgenos circulantes, etc.
Debe diferenciarse, por lo tanto, la respuesta
autoinmune de la enfermedad autoinmune. La
respuesta autoinmune es la demostracin de la
existencia de autoanticuerpos que reconocen
antgenos propios o la reactividad de linfocitos
sensibihzados contra un antgeno propio; esta
respuesta puede estar asociada o no con una en
fermedad autoinmune. En medicina clnica hay

558

Inmunopatologa

la anomala bsica de la infeccin por HIV es

la destruccin de la poblacin linfocitaria T4
ocasionada por el HIV.
Adems de infectar las clulas T
se ha
demostrado que el HIV puede infectar: mono
citos de sangre perifrica, lneas celulares monoctieas, diversos macrfagos tisulares, elu
las dendrticas, clulas microgliales del cere
bro; todos tipos celulares que expresan el re
ceptor CD^ en sus membranas plasmticas.
Los mecanismos de la Inmunodeficiencia in
ducida por el HIV estn relacionados con la
particularidad de estos virus de reducir la capa
cidad funcional de los linfocitos T perifricos y
de las clulas presentadoras de antgenos, e in
hibir la produccin y maduracin de precurso
res de las clulas T, por lo que afectara en can
tidad y calidad el nmero de clulas T perifri
cas.
A n o m a l a s c u a n t it a t iv a s d l o s T 4

En los casos que concuerdan con la defini

cin aceptada de SIDA, la anomala ms evi
dente es la linfopenia, en contraste con el n
mero absoluto de los linfocitos TCD 8 + que es
normal o aumentado. Se utiliza el cociente en
tre el nmero absoluto de TCD4+ y el nmero
absoluto de TCD 8 + como indicador de la alte
ra c i n . E s te c o c ie n te o re la c i n T C D 8 "
TCD4+ debe ser menor que 1 para tener signi
ficacin.
Tanto la linfopenia como el descenso de la
relacin TCD4+nCD8^, varan segn el tiempo
de evolucin y la gravedad del caso. Por lo ge
neral, la anom ala se va acentuando, y llega
paulatinamente a su expresin ms intensa en
los pacientes de fase terminal.
En los pacientes con SID A los linfocitos
TCD4+ casi desaparecen de la sangre circulan
te. En los pacientes con complejo relacionado
con el SIDA, la alteracin no es siempre tan
evidente, y en algunos casos oscila en perodos
de mayor o menor intensidad.
Conviene destacar que estas anom alas no
son especficas de la infeccin por HIV, y pue
den encontrarse en otros procesos infecciosos o
no.
Existe generalmente anergia cutnea a diver
sas intradermorreacciones, especialmente a la
candidina y tuberculina. Como otras anomalas
descritas, su presentacin se hace con grado
variable de intensidad a lo largo de la evolu
cin, pero en los pacientes con formas termina

les de la enfermedad, las pruebas cutneas no

detectan ninguna reaccin.
O t r a s a n o m a l a s in m u n e s

Se atribuyen generalmente a las anomalas

de la poblacin T CD^+. Se han descrito: a) un
aumento policlonal de las inmunoglobulinas; b)
una disfunein de la actividad macrofgica y
de citotoxicidad, y c) un aumento de la (32-microglobulina srica. Esto ha sido comunicado
como indicador de evolucin a formas graves.
Nunca antes haba sido producida en tan cor
to tiempo tal cantidad de publicaciones cientfi
cas sobre una enfermedad humana como ha su
cedido en la actualidad con el SIDA. Los datos
obtenidos sobre la biologa molecular, la clni
ca, los posibles tratamientos, el desarrollo de
eventuales microorganismos y el problema so
cial son el resultado de una extraordinaria deci
sin del hombre para vencer el problema.
Como norma para cerrar este captulo, pode
mos decir que es necesario conocer aun ms la
patogenia y la respuesta inm une para actuar
con drogas y/o inmungenos en un desequili
brio tan complejo como el que genera el HIV.

BIB L IO G R A FIA
1. C o to , C y d e T o rre s , R A: N a tu ra le z a y e s tru c tu ra de
lo s v iru s a n im a le s . S e rie d e U ro lo g a . E D IG E N , B u e
n o s A ire s , 1983.
2. F ra e n k e l-C o n ra t, H y Vv'agner, R R (e d s). V ir u s - h o s t
in te ra c tio n s . Im m u n ity to -virases. C om prehensive Virology. V o l 15, 1979, P le n u m .
3. S is so n s , J G P y O ld s to n e , M : H o s t r e s p o n s e to v ira l
in fe c tio n s. E n : Virology. B e rn a rd F ie ld E d ito r. R a v e n
P re ss B o o k . N u e v a Y o rk , 1985.
4. K a rc h e r, D , L o w e n th a l, A y S tro s b e rg , A D: H um oral
im m unity in neurological diseases. P le n u m P re ss . N u e
v a Y o rk , 1979.
5. L e n n e tte , E; S p a u ld in g , E y T ru a n t, I P: M a n u a l o f cli
nical m icrobiology. 2 ed , A m e ric a n S o c ie ty f o r M ic ro b io lo g y . W a s h in g to n D C , 1974.
6. N o tk in s , A L : V iral im m unology a n d im m unopathology. N a tio n a l In s titu te s o f H ea lt. A c a d e m ic P r e s s ,
N u e v a Y o rk , 1975.
7. R o s e , N y F rie d m a n , H : M a n u a l o f clinical im m u n o
logy. A m e ric a n S o c ie ty fo r M ic ro b io lo g y , W a sh in g to n
D C , 1976.
8. E p s te in , A ; V iru s h e rp e s sim p le x , u n v iru s n o tan s im
p le. E n : C o to , C; C a c c h io n e , R y d e T o rre s , R A (ed s).
A d e la n to s en M ic ro b io lo g a y E n fe rm e d a d e s I n fe c c io
sas. V o l. 5, B u e n o s A ire s , 1986.
9. N ie d fe ld , G ., M in v ie lle , M . G e n e ra lid a d e s d e l s is te m a
in m u n e . F a s c c u l o 1. C o l e c c i n C t e d r a E d i t o r i a l
U .N .L .P . 1994.
10. S c h a e c h te r, M e d o ff y c o l. M ic r o b io lo g a 2- ed . E d it.
M d ic a P a n a m e ric a n a , 1994.

Autoinmunidad

CLELIA RIERA
JULIANA LEON!
NORA YRANZO-VOLONT

AUTOINMUNIDAD
Se denomina autoinmunidad a la respuesta
inmune contra componentes propios, y es debi
da a la presencia de linfocitos T o B autorreactivos. En condiciones normales, los m ecanis
mos de tolerancia a lo propio protegen al indi
viduo de estas clulas potencialm ente autorreactivas.
Hasta la dcada del 60 se crea que los lin
focitos autorreactivos eran eliminados durante
el desarrollo del sistema inmune y que, por una
falla en su eliminacin, se implantaba la enfer
medad autoinmune. A fines de los aos 70 nu
m erosos hallazgos han contribuido a revelar
que no todos los linfocitos T y B autorreactivos
son eliminados durante su maduracin. Por en
de, individuos normales poseen en su circula
cin linfocitos autorreactivos, cuya presencia
no indica necesariamente un estado patolgico
autoinmune ya que su actividad seguramente es
regulada mediante clones anrgicos o supreso
res. Una ruptura de esta regulacin puede lle
var a la activacin de las clulas autorreactivas
T o B, generando una respuesta humoral o ce
lular contra antgenos propios. Estas reacciones
pueden causar serios daos a clulas u rganos,
que a veces tienen consecuencias fatales.
En este captulo se describirn algunas en
fermedades autoinmunes humanas y modelos
en animales de experimentacin, como tambin
los mecanismos que pueden contribuir al de
sencadenamiento de la autoinmunidad.
Las enfermedades autoinmunes se caracteri
zan por la presencia de autoanticuerpos y/o lin
focitos T sensibilizados contra diferentes ma
cromolculas del organismo, que en individuos
normales son reconocidas como propias y por
lo tanto no desencadenan respuesta. El recono

28
cimiento de lo propio es el principio central del
funcionamiento del sistema inmune que no se
contrapone al desarrollo de enfermedades au
toinmunes, sino que permite explicar su apari
cin a travs de disturbios en el equilibrio in
mune, el que se autorregula constantemente en
respuesta a seales internas y externas.
La capacidad del sistema inmune para discri
m inar entre lo propio y lo extrao es adquirida
en primer lugar en el timo, durante la m adura
cin de los linfocitos T. Los tim ocitos auto
rreactivos especficos para antgenos expresa
dos intratmicamente y presentados en asocia
cin con molculas del complejo mayor de his
tocom patibilidad (MHC) son elim inados du
rante el desarrollo y maduracin del timo. Esto
se m anifiesta en la elim inacin de clones de
linfocitos T que reconocen antgenos propios
expresados sobre la superficie de linfocitos T y
B, m acrfagos, clulas dendrticas y clulas
epiteliales. Las clulas T que reconocen antge
nos propios que no estn presentes en el timo
no son eliminadas y permanecen en el organis
mo, siendo un peligro potencial para el mismo.
L a respuesta inm une a antgenos propios
puede observarse en individuos normales, pero
la potencialidad para desarrollar autoinm uni
dad est controlada por diferentes mecanismos:
hnfocitos T supresores, interacciones idiotipoantiidiotipo, bloqueo de receptores celulares
por antgenos circulantes, etc.
Debe diferenciarse, por lo tanto, la respuesta
autoinmune de la enfermedad autoinmune. La
respuesta autoinmune es la demostracin de la
existencia de autoanticuerpos que reconocen
antgenos propios o la reactividad de linfocitos
sensibihzados contra un antgeno propio; esta
respuesta puede estar asociada o no con una en
fermedad autoinmune. En medicina clnica hay

560

Inmunopatologa

C u a d ro 28-1. E n ferm ed a d es auto in m u n es

ms comunes
rgano-especficas T iro id itis d e H a s h im o to

N o rgano-especfic a s (sistm icas)

M ix e d e m a p rim a rio
T iro to x ic o s is
A n e m ia p e rn ic io s a
G a s tritis a tr fic a a u to in m u n e
E n fe rm e d a d d e A d d is o n
D ia b e te s m e llitu s in s u lin o d e p e n d ie n te
U v e tis fo e o a n a fil c tic a
S n d ro m e d e G o o d p a s tu re
M ia s te n ia g rav is
M e n o p a u s ia p r e m a tu r a (p o c o c o m n )
In fe rtilid a d m a s c u lin a (p o c o c o m n )
P n fig o v u lg a r
P e n fig o id e
O f ta lm a s im p tic a
E s c le ro s is m iiltip le
A n e m ia h e m o ltic a a u to in m u n e
P rp u ra tro in b o c ito p n ic a id io p tic a
L e u c o p e n ia id io p tic a
C irro s is b ilia r p rim a ria
H e p a titis c r n ic a a c tiv a c o n a n tg e n o
H B s n e g a tiv o
C irro s is c rip t g e n a (p o c o c o m n )
C o litis u lc e ro s a
S n d ro m e d e S jo g re n
A rtritis re u m a to id e a
D e rm a to m io s itis
E s c le ro d e rm ia
L E cUscoide
L u p u s e rite m a to s o s is t m ic o (L E S )

numerosos ejemplos de produccin de autoan

ticuerpos sin que estn relacionados con una
enfermedad autoinmune. Ciertos desrdenes de
origen infeccioso y que tienden a la cronicidad,
drogas o envejecimiento pueden estar asocia
dos a una forma controlada de autoinmunidad.
Luego de la eliminacin del agente infectivo o
de la suspensin de la droga las manifestacio

nes de autoinmunidad desaparecen. En cambio,

en las enfermedades autoinmunes, la presencia
de autoanticuerpos o linfocitos T sensibilizados
producen lesin tisular y disfunciones de los
rganos blanco, mecanismos totalm ente des
controlados y generalmente irreversibles.
Existe una am plia gama de enferm edades
autoinmunes (cuadro 28-1), en cuyos extremos
se encuentran las enfermedades rgano-especficas y no rgano-especficas, y las que quedan
comprendidas entre estos dos tipos poseen ca
ractersticas de ambos.
1. E T IO L O G A
Los desrdenes autoinmunes han sido am
pliam ente estudiados en seres humanos y en
m odelos anim ales. E stas enferm edades son
multifactoriales y en cada una de ellas puede
estar comprendido ms de un mecanismo de in
duccin. Se conocen numerosos factores que
pueden contribuir a la eclosin de las enferme
dades autoinmunes:
1.1. F actores genticos
Estudios poblacionales realizados en fam i
lias o hermanos gemelos han revelado clara
mente que los factores genticos tienen una in
fluencia significativa sobre la predisposicin a
adquirir enfermedades autoinmunes. Los facto
res genticos ms importantes involucrados en
estas enfermedades son los relacionados con
los genes del complejo mayor de histocompati
bilidad (MHC), los genes del receptor de los
linfocitos T y los genes del receptor de los lin
focitos B (Inmunoglobulinas).

C uadro 28-2. Alelos del complejo mayor de histocompatibilidad asociados con el incremento del
riesgo en varias enfermedades autoinmunes
E nferm edad
E s p o n d ilitis a n q u ilo s a n te
S n d ro m e d e G o o d p a s tu re
E n fe rm e d a d d e G ra v e s
D ia b e te s m e llitu s
in su lin o -d e p e n d ie n te
A rtritis r e u m a to id e a
ju v e n il
E s c le ro s is m ltip le
M ia s te n ia g rav is
A n e m ia p e rn ic io s a
A rtritis p s o ri tic a
S n d ro m e d e R e its r
A rtritis re u m a to id e a
S n d ro m e d e S jo g re n
L u p u s e rite m a to s o sis t m ic o
C o litis u lc e ro s a

A lelo del C M H
B27
DR2
B 8 /D R 3
D R 4 /D R 3
D R 3 /D Q W 8
D w l4
B 2 7 /D R 5
DR2
DR3
DR5
B27
B27
D w 4 /D R 4
Dw3
DR3
B5

R iesgo relativo*
80
16
3 -4
20

100
Al
4
5
10
5
11
37
10
6
5
4

* P ro b ab ilid ad d e que u n a p erso n a h ete ro cig o ta q u e p o rta el ale lo in d icad o d esa rro lle la e n ferm e d ad , co m p a rad a c o n la p ro b a b ilid ad de la
p o b lac i n general a la cual se le asig n un riesg o ig u al a 1.

Autoinmunidad
1.1.1. Relacionados con los genes
del complejo mayor de histocompatibilidad
La asociacin gentica ms estudiada y ms
claramente establecida es la relacionada con los
antgenos del MHC (cuadro 28-2). Esta asocia
cin no es sorprendente ya que las enfermeda
des autoinmunes son dependientes de los linfo
citos T y las respuestas inmunes que dependen
de los linfocitos T estn restringidas por el
MHC. Por tal motivo, el MHC puede afectar la
predisposicin a adquirir enfermedades autoin
munes por varios mecanismos que no son m u
tuamente excluyentes, e incluyen el haplotipo
del receptor del linfocito T (TCR) y la selec
cin, presentacin y transporte de los pptidos
antignicos. Entre los modelos animales estu
diados hay uno que es muy interesante y es la
introduccin de la mutacin (bm \2) en la cade
na LA en ratones NZB; estos animales sufrie
ron una enfermedad autoinmune severa, similar

561

al lupus eritem atoso sistmico que presentan

los ratones NZB/NZW. La mutacin bm i2 d i
fiere de la secuencia convencional H-2b LA en
slo tres aminocidos en las posiciones 67, 70
y 71. Los resultados sugieren que estos re si
duos, localizados en la zona del MHC, respon
sable de la unin con el pptido, son importan
tes en la induccin de enfermedad autoinmune
en el contexto del baekground gentico del
NZB. Entre los casos ms conocidos se puede
citar el de la diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM) observada en humanos donde el
cambio de un nico aminocido en la secuencia
de la molcula DQ 1 del MHC de clase II p u e
de inducir proteccin o susceptibilidad a la en
fermedad. Esta molcula, en individuos norm a
les o resistentes a la enfermedad contiene cido
asprtico en la posicin 57, en cambio, en p a
cientes de poblaciones caussicas afectados de
IDDM esa posicin est ocupada por la valina,
serina o alanina (fig. 28-1). El cambio por un

La posicin 57 del DQ (o 1-A) de ia cadena (3 modifica ia susceptibiiidad para enfermarse de

diabetes mellitus insuiinodependiente (IDDIVI)
Asociado con ia resistencia
a la IDDM

Asociado con ia susceptibiiidad

a la IDDM

Fig. 28-1. E l cam bio de un am inocido en la secuencia de un C M H de clase II est relacion ad o con la su scep tib ili
dad de adquirir diabetes. L a s e c u e n c ia d e l C M H -D Q |3 l d e la m a y o ra d e ia p o b la c i n tie n e a s p rtic o en la p o s ic i n .57.
L a p o b la c i n c o n d ia b e te s m e llitu s p r e s e n ta se rin a , v a lin a o a la n in a en d ic h a p o s ic i n . E l c a m b io d e u n a m in o c id o c a r g a
d o p o r u n o n o c a rg a d o r o m p e el p u e n te sa lin o a lte rn a d o la e s ta b ilid a d d e la m o l c u la . T o m a d o d e J e n e w a y y T ra v ers.

562

Inmunopatologa

residuo no cargado rompe el puente salino alte

rando la estabilidad de la molcula de DQ. En
otros modelos animales de enfermedades au
toinmunes especficas de rgano o sistmicas,
que tienen un defecto en los genes I-E, la pro
teccin a la enfermedad se pudo inducir por la
introduccin de genes lE a o IE(3.
1.1.2. Relacionados con los genes
del receptor de los Linfocitos T (TCR)
Se ha estudiado la asociacin de los genes
del TCR con las enferm edades autoinm unes
dado que estas enfermedades, como ya dijimos,
son dependientes de linfocitos T. Sin embargo,
hasta el momento, y con muy pocas excepcio
nes, no hay evidencias claras en animales o hu
manos que indiquen una relacin entre haploti
pos particulares de TCR y predisposicin a ad
quirir enfermedades autoinmunes. Sin embar
go, hallazgos interesantes que, aunque necesi
tan mayores estudios, indican por ejemplo que
la respuesta a pptidos encefalognicos, prove
nientes de la pro tena bsica de mielina en rato
nes y ratas, tiene una utilizacin restringida del
TCR V p/V a. Algunos investigadores preten
dieron aphcar este conocimiento a la produc
cin de vacunas sintticas Vp o anticuerpos anti-Vp. Sin embargo, cuando en enfermedades
autoinmunes se demostr la existencia de res
tricciones del gen del TCR, el gen o los genes
V dominantes, diferan en los distintos indivi
duos con la m ism a enferm edad autoinm une,
aunque se pudo observar algunos elem entos
conservados en ciertos V/D/J.
La importancia de determinadas citoquinas
en el control del balance de linfocitos T h l y
Th2 puede ser un factor importante en la pato
gnesis de enfermedades autoinmunes. Los de
fectos en la estructura del gen, la transcripcin
y la funcin de citoquinas y sus receptores han
sido detectados en varias enfermedades autoin
munes. Adems se ha demostrado, en modelos
animales, que las citoquinas o sus inhibidores
afectan el desarrollo de la autoinmunidad, ya
que se observaron signos de autoinmunidad o
inflamacin en ratones transgnicos para una
determinada citoquina o con defectos genticos
para su induccin.
1.1.3. Relacionados con genes
de las InmunoglobuUnas
Cmo se desencadenan las enfermedades au
toinmunes es uno de los enigmas de la Inmuno
loga moderna. El marco principal de la enfer
medad autoinmune es la presencia de anticuer
pos circulantes que reaccionan con algunos
componentes u rganos del cuerpo. Si estos an
ticuerpos causan los sntomas de la enferme

dad, o son el resultado de sta, depende de cada

patologa.
La asociacin de enfermedades autoinmunes
con alotipos e idiotipos de inmunoglobulinas
fue observada por muchos investigadores, sin
em bargo los resultados obtenidos por todos
ellos an son contradictorios.
Una cuestin fundamental en este tema es la
relacionada al origen de los autoanticuerpos, o
sea: si stos provienen o no de genes de la lnea
germinal, si son el reordenamiento de genes di
ferentes de aquellos que codifican para anti
cuerpos de una respuesta inmune normal, o si
son el resultado de mutaciones som ticas de
genes de la lnea germinal. Muchos investiga
dores han tratado de resolver estas preguntas a
travs del estudio de los idiotipos presentes en
autoanticuerpos. Estas investigaciones han re
velado, en autoanticuerpos con diferente espe
cificidad, la existencia de idiotipos con reacti
vidad cruzada (cross-reactive idiotypes'. CRI),
lo que dem ostrara que todos estos autoanti
cuerpos provienen de un mismo gen o de genes
similares y, por ende, la existencia de una res
triccin idiotpica. Que la respuesta inmune es
altamente restrictiva tambin fue demostrado
en anticuerpos inducidos por polisacridos y
haptenos. Se cree que la restriccin idiotpica
es el resultado de la respuesta a la estimulacin
antignica de un nmero limitado de clones B.
Los estudios de restriccin en anticuerpos antiADN en pacientes con Lupus eritematoso sist
mico (LES), prototipo de las enfermedades au
toinmunes sistmicas, han indicado que estos
autoanticuerpos presentan un alto grado de
CRL Diamond y Solomon mostraron en sus es
tudios que el 80% de los pacientes con LES,
que presentan en su suero anticuerpos antiADNds (ADN de doble cadena), expresan un
idiotpo denominado 3L Este idiotipo fue aso
ciado con la oligoclonalidad de los anticuerpos
que unen ADN.
Para determinar si los autoanticuerpos pro
vienen de un determinado grupo de genes de la
lnea germinal, varios autores han estudiado la
secuencia del idiotipo involucrado en la restric
cin y la compararon con la secuencia de los
respectivos genes. Recin en los ltimos aos
se ha comenzado a conocer la secuencia de las
regiones variables de algunos autoanticuerpos;
gracias a ello ha comenzado a surgir informa
cin con respecto a la restriccin idiotpica en
la sntesis de estos anticuerpos.
Es claro que el reconocimiento a lo propio es
normal, hecho demostrado por la existencia de
la red idiotipo-antidiotipo y la presencia de au
toanticuerpos naturales. Los autoanticuerpos
naturales aparentemente son de tipo IgM, polireactivos y de baja afinidad. Fundamentalmen
te difieren de los IgG monoespecficos en que

Autoinmunidad
estos ltim os son de alta afinidad y general
mente estn asociados con la patologa autoin
mune. Los autoanticuerpos naturales tambin
exhiben un alto grado de reaccin idiotpica
cruzada y son el producto de la estimulacin de
las clulas B CDS^. Tambin se sabe que los
autoanticuerpos naturales son el producto de
genes no mutados de la lnea germinal, m ien
tras que los asociados a enfermedades autoin
munes presentan gran nmero de mutaciones,
tanto en el segmento
como en el V^. El in
cremento de mutaciones en los autoanticuerpos
patognicos hace que se incremente su afinidad
por el autoantgeno, y por lo tanto presentan
una mayor selectividad antignica. En contras
te, los anticuerpos polirreactivos naturales son
la expresin de genes no mutados de la lnea
germinal. Es importante destacar que la m ayo
ra de los investigadores opinan que, tanto los
autoanticuerpos patognicos como los autoanti
cuerpos naturales y los anticuerpos contra ant
genos extraos, se originan por el reordena
miento de los mismos genes, ya que no se ha
demostrado de manera fehaciente la existencia
de una restriccin gentica para la sntesis de
autoanticuerpos. Sin embargo, en el caso de los
autoanticuerpos presentes en la anemia hemol
tica denominada crioaglutinemia, se ha obser
vado una restriccin en el uso del gen V,:,4-21,
perteneciente a la fam ilia de genes Vjj4 (ver
ms adelante).
La pregunta que cabe hacer es si los autoan
ticuerpos naturales son o no los precursores de
los autoanticuerpos patognicos y cmo apare
cen. La respuesta an no existe. El estado ac
tual de los conocimientos indica que autoanti
cuerpos naturales y autoanticuerpos que causan
patologas se originan a partir de diferentes l
neas celulares, por lo menos en el sistema m u
rino. An no se sabe si las clulas CD5^ se ori
ginan a partir de las CD5+; tampoco si los au
toanticuerpos IgG sintetizados por las clulas
CDS'" son patognicos. Por lo tanto, qu fun
cin cumplen las clulas CD5"' y los autoanti
cuerpos naturales que ellas producen? Algunos
autores han sugerido una funcin de defensa
prim aria que, debido a su polireactividad, se
uniran a un vasto repertorio de organismos in
vasores. Otros autores han postulado que los
autoanticuerpos son parte de la red idiotipo-anti-idiotipo que contribuye a la homeostasis del
organismo. Por ejemplo, se vi que estos anti
cuerpos unen a autoanticuerpos de tipo IgG in
hibiendo su reactividad, lo que sugiere que la
red idiotpica es responsable de la regulacin y
mantenim iento de la m em oria inmune de las
clulas en ausencia del antgeno.
La pregunta crucial, an sin respuesta, es c
mo se producen los autoanticuerpos patogni
cos, ya que el estmulo para su formacin no se

563

conoce. El evento inicial parece ser la activa

cin policlonal de las clulas B o su estim ula
cin por un organismo invasor que da reaccin
cruzada con un componente propio (similitud
antignica). En ambos casos, la produccin de
un autoanticuerpo de alta afinidad, monoespecfico y patolgico puede ser debida a una selecti
vidad antignica a travs de un proceso rautacional que no puede ser iniciado o exacerbado
por inm unizacin exgena de antgenos p ro
pios, aunque algunos casos de autoinmunidad
experimental pareceran demostrar lo contrario.
Es evidente que la respuesta autoinmune es
un complicado proceso que requiere una serie
de factores, que incluyen activacin de clulas
T, prdida de la supresin, efectos hormonales
y factores genticos.
1.2. Liberacin de antgenos secuestrados
o ubicados en sitios privilegiados
Los antgenos asociados con tejidos perifri
cos, especialmente aquellos secuestrados detrs
de barreras anatmicas, no se ponen en contac
to con el repertorio de linfocitos T que se est
desarrollando, por lo tanto, la tolerancia central
para estos antgenos no puede ser inducida. La
induccin de enfermedades autoinmunes d es
pus del contacto con antgenos ubicados en
los llamados sitios privilegiados ha sido bien
documentada y ejemplo de ello son la oftalm a
simptica observada despus de la injuria tisu
lar y la orquitis que se induce despus de la vasectoma. Recientemente se ha demostrado que
los antgenos asociados a tejidos perifricos
pueden causar tolerancia cuando se introducen
experimentalmente en el timo. Algunos autores
pudieron observar que la inyeccin intratmica
de clulas pancreticas puede prevenir la diabe
tes autoinmune en ratas Bio-hreeding (B B ) y
en ratones non-obese diabetic (NOD), y que la
inyeccin intratmica o intravenosa de glutamic
acid decarboxylase (GAD) que parece se r el
principal autoantgeno de la diabetes autoinm u
ne, puede prevenir la enfermedad en ratones
NOD. Resultados similares se pudieron obser
var en otros modelos experimentales de autoin
munidad, como encefalitis alrgica experimen
tal (EAE) y gastritis experimental autoinmune,
donde la enfermedad se pudo prevenir p o r la
expresin en el timo en animales transgnicos,
de antgenos responsables de la autoinmunidad.
En varias enfermedades autoinmunes se ob
serv que la liberacin de un antgeno secues
trado induce enfermedad. En la oftalma sim p
tica, el trauma en un ojo induce la liberacin al
medio de antgenos que estaban secuestrados,
haciendo que dichos antgenos sean accesibles
para las clulas T. Las clulas efectoras induci
das atacan al ojo traumatizado y adems infil

564

Inmunopatologa

Fig. 2 8 -2 . F i dao a un rgano inm u n olgicam ente p rivilegiado p uede causar una respuesta autoinm une. E n la ofa h n a s im p tic a , el Ira u m a e n un o jo , p u e d e lib e ra r a n tg e n o s s e c u e s tra d o s y lib e ra rlo s al m ed io . L as c lu la s e le c to ra s a ta
c a n ta n to al o jo d a a d o c o m o al s a n o . A : E l tra u m a e n un o jo p u e d e c a u sa r ia lib e ra c i n d e a n tg e n o s in tra o c u la re s s e c u e s
tra d o s. B: E l a n tg e n o in tra o c u la r lib e r a d o e s lle v a d o a lo s n d u lo s lin f tic o s y a c tiv a r a lo s L T . C ; L T e fe c to re s v u e lv e n
p o r v a s a n g u n e a y e n c u e n tra n al a n tg e n o en a m b o s o jo s.

tran y atacan el ojo sano (fig. 28-2). Por lo tan

to, aunque los antgenos no indueen una res
puesta inmune por s mismos, si una respuesta
inmune se inicia en otro sitio, ellos pueden ser
vir como blanco para el ataque. Las evidencias
indiean que la liberacin de autoantgenos se
cuestrados puede ser una causa de autoinmuni
dad, que posiblem ente se com plem ente con
otros factores para mantener la respuesta inmu
ne, eomo por ejemplo una injuria tisular indu
cida por un virus puede ser un mecanismo libe
rador de autoantgenos y adems proveera fac
tores eoestim ulatorios que coadyuven en el
proceso de autoinmunidad.
1.3. Epitopes no accesibles o subdominantes
Los principios de esta teora se basan en que
cada protena propia presenta un nmero p e
queo de determinantes antignicos dominan
tes que estn involucrados en la seleccin ne
gativa, siendo el organismo tolerante a ellos.
Por otra parte hay determinantes que, por no
ser dominantes no inducen tolerancia, y son los
denominados epitopes crpticos o subdominan
tes, lo que permite la existencia de un gran n
mero de clulas T potencialmente autorreaetivas. La falta de tolerancia hacia los epitopes
crpticos puede deberse a un procesam iento
inefectivo del antgeno o porque estn cerca de
un epitope dominante con el que compiten por
la unin a las molculas del MHC o del recep
tor de linfocitos T (TCR). El rol de los determi
nantes crpticos en la patognesis de la autoin
m unidad ha sido observ ad o en los ratones
NOD, posiblemente porque los virus dan el es
tmulo inicial a travs de una incrementada pre
sentacin del determinante crptico o subdomi
nante, ya sea por similitud molecular o por la
regulacin inducida por el interfern y (IFN-y)
para la expresin de genes entre los que se in
cluyen las molculas del MHC, importantes pa

ra la presentacin de antgenos. Elson y col.,

han sugerido la existencia de una estrecha aso
ciacin entre los epitopes crpticos y los linfo
citos T h l. Estos linfocitos liberan citoquinas
entre las que se encuentran el IFN-y y otras que
producen alteracin de las enzimas lisosom a
les, con los consiguientes cambios en la ruptura
de protenas durante el procesamiento antignieo. Se ha observado adems la homologa entre
determinantes dominantes en una molcula ex
traa y determinantes crpticos de las molcu
las propias, as eomo tambin la induccin de
elulas T y B autorreactivas despus de la in
munizacin con una molcula propia y con una
molcula extraa que presentan reaccin cruza
da. Recientemente se ha postulado que una vez
que se inicia una respuesta contra un determi
nante crptico se induciran posteriores respues
tas contra determinantes adicionales.
1.4. Desconocimiento de lo propio
Para que las clulas T se activen en la perife
ria se necesitan dos seales: la primera est da
da por el antgeno asociado a las molculas del
c o m p le jo m ay o r de h is to c o m p a tib ilid a d
(MHC) y la segunda por la coestim ulacin a
travs de molculas accesorias no polimrfieas
presentes en las elulas presentadoras de ant
geno (APCs). Si se da la primera seal pero es
t ausente la segunda habr falta de respuesta o
anergia. Por ejemplo; los linfocitos T que no
fueron eliminados intratmieamente y que son
especficos para pptidos propios que no estn
expresados en las APCs se harn tolerantes.
Posteriormente, si los linfocitos T potencial
mente autorreaetivos no se activan no tendrn
acceso a tejidos no linfoides. Por lo tanto, la
presencia de clones de linfocitos T especficos
para antgenos propios que no son expresados
sobre la superficie de APCs no representan un
dao importante en una situacin fisiolgica.

Autoinmunidad
1
i

Sio seal del

coestimulador

' ''
...
! ' ' -- ' ' '

1 '

565

Slo seal
especfica

' ' '

CPA

RLT

Sin efecto en LT

Inactivacin de LT
(anergia)

Fig. 28-3. Los LT toleran tes a antgenos expresados sobre clulas pueden producir reconocim iento en a u se n c ia de
co-estim ulacin. L a s c lu la s p re s e n ta d o ra s de a n tg e n o s (A P C ) n o p u e d e n re c o n o c e r lo s L T a c tiv a d o s o in a c tiv a d o s si no
e s t p r e s e n te so b re la s u p e rfic ie d e la c lu la el a n tg e n o e s p e c fic o , e n c a m b io , si e x p re s a n u n a m o l c u la c o -e s tim u la d o r a
p u e d e n p ro d u c ir la se a l 2. S in e m b a rg o , c u a n d o ias c lu la s re c o n o c e n a n tg e n o s en a u s e n c ia d e m o l c u la s c o -e s tim u la d o ^
ras, e lla s a c e p ta n la se a l 1 y son in a c tiv a d a s.

Se ha postulado que clulas T maduras espe

cficas para antgenos extratmicos sufren aner
gia cuando estos antgenos son presentados por
clulas presentadoras de antgeno no profesiona
les (distintas a clulas dendrticas y m acrfa
gos). Esto se debera a la ausencia de una segun
da seal apropiada o de factores coestimulatorios (fig. 28-j). Una posibilidad alternativa es
que no haya induccin de anergia, pero que las
clulas T maduras no puedan recibir seales
apropiadas y/o ayuda. Esto dara como resultado
que las clulas T simplemente ignoren a estos
antgenos. Si posteriormente hay una adecuada
presentacin a travs de clulas profesionales,
las clulas autorreactivas que estn silenciosas
pueden ser activadas y causar dao tisular.
O sahi y col., realizaron experimentos con
animales doblemente transgnicos, para la pro
tena del virus de la coriomeningitis linfoctica

(LCMV) y para el TCR especfico. Los resulta

dos indican que las clulas T especficas para
el virus no fueron eliminadas ni anergizadas,
ya que se demostr que haba un nmero gran
de de las mismas que eran funcionales in vitro
dando respuesta proliferativa y citotoxicidad,
aunque no fueran eficientes in vivo para reco
nocer y atacar al virus presente en las clulas
pancreticas. Sin embargo, despus de la infec
cin con la cepa viral apropiada se observ in
filtracin celular y dao del pncreas. Estos ha
llazgos fueron interpretados como una indica
cin de que las clulas T autorreactivas del teji
do estn presentes pero no fueron activadas o
se volvieron anrgicas porque las clulas que
expresan autoantgeno (por ej. islotes 3) pue
den tener niveles bajos de molculas del CMH
de clase L no expresar molculas del CM H de
clase II y no tener seales coestimulatorias.

566

Inmunopatologa

Sin embargo, los resultados obtenidos con

animales transgnicos, aunque de gran signifi
cacin, deben ser tomados con gran precaucin
para formular conceptos generales en autoin
m unidad ya que, por ejem plo, los anim ales
TCR-transgnicos son anim ales inm unocomprometidos y muy susceptibles a las enferme
dades infecciosas.
1.5. Sim ilitud m olecular
La sim ilitud m olecular, tam bin conocida
como mimetizacin molecular, se puede definir
como la homologa en una secuencia de am i
nocidos entre molculas propias y extraas.
Las teoras de epitopes crpticos o de falta de
segunda seal son compatibles con las hipte
sis de similitud molecular entre antgenos pro
pios y extraos, particularmente si estos liltimos son agentes infecciosos. Es bastante fre
cuente encontrar polipptidos muy similares o
idnticos en protenas no relacionadas, y se ha
observado que muchos fragmentos peptdicos
de agentes infecciosos son homlogos con pro
tenas del husped inclu id as m o lculas del
MHC (cuadro 28-3). Entre los antgenos micro
bianos involucrados en autoinmunidad, los ms
estudiados son las protenas del estrs (Hsps),
encontradas en prcticamente todas las formas

vivas. Cuando se compararon las secuencias dC'

aminocidos de la HspO con las bases de da
tos de secuencias de pptidos humanos conoci
dos se observ que 8 6 pptidos humanos tienen
regiones similares a la HspO y de stos, 19 es
tn asociados a autoantgenos involucrados en
enferm edades autoinm unes. Sin em bargo, la
importancia de la similitud molecular en la pa
tognesis de enfermedades autoinmunes espon
tneas no est muy bien definida, como tam po
co est definido por qu las respuestas inmunolgicas a las Hsps, que son expresadas en todas
las clulas, pueden llevar a una enfermedad au
toinmune especfica de rgano.
En un estudio muy interesante, utilizando ra
tones transgnicos que expresan una protena
del LCM V en clulas de los islotes del pn
creas, se pudo observar que no responden a la
protena y que no enferman de IDDM. Sin em
bargo, si los ratones transgnicos son infecta
dos con LCMV se induce una potente respuesta
de clulas T citotxicas anti-virus y esto mata
las clulas llevando a la IDDM (fig. 28-4). Se
debe tener en cuenta que, si bien hay varios
ejemplos de induccin de autoinmunidad, des
pus de la infeccin por algunos microorganis
mos (miocarditis por streptococos del grupo A,
artritis por micobacterias, etc.) para la mayora
de las enfermedades autoinmunes humanas no

C u ad ro 28-3. Sim ilitud molecular entre protenas de organismos infecciosos y protenas del
husped humano
Protena*

R esiduo

Secuencia^

C ito m e g a lo v iru s h u m a n o
M o l c u la H L A -D R

79
60

PD PLG R PD ED
VTELG RPD A E

P o lio v iru s V P 2
R e c e p to r d e a c e tilc o lin a

70
176

STTKESRGTT
T V IK E S R G T K

Viru.s d e p a p ilo m a E 2
R e c e p to r d e in su lin a

76
66

SLH LESLKDS
V Y G LESLK D L

G lu c o p ro te n a d e l v iru s d e la ra b ia
R e c e p to r d e in su lin a

147
764

T K E S L V II S
N K E S L V IS E

K lebsiella pneum oiae n itro g e n a s a

M o l c u la H L A -B 2 7

186
70

SR Q TD R ED E
KAQTDREDL

A d e n o v iru s 12 E l B
a -g lia d in a

384
206

LRRGM QTDREQCN
LG QG SQTD REQ QN

P ro te n a p 2 4 d e l v iru s del S ID A
R e g i n c o n s ta n te d e la IgG

160
466

GV ETTTPS
GV ETTTPS

P ro te n a P 3 del v iru s d e s a ra m p i n
C o rtic o tro p in a

13
18

L E C IR A L K
L E C IR A C K

P ro te n a P 3 del v iru s d e s a ra m p i n
P ro te n a b s ic a d e m ie lin a

3]
61

E IS D N L G Q E
ELSFKLG QE

* E n cada par, la p ro le/n a h u m a n a es lista d a segunda. S e h a o b serv ad o q u e las p ro len a s de cada p a r p re sen tan re activ id ad cruzada.
^ C ada n m ero indica la p osicin a m in o -term in a l del p p tid o in d icad o , en la p ro ten a nativa.
2 La sec u en cia es re p rese n ta d a con el c d ig o d e una sola letra.

Autoinmunidad
se ha determinado un agente patgeno que est
totalmente identificado con un determinado r
gano. No se puede descartar que el microorga
nismo haya estado en contacto con el organis
mo antes de la manifestacin de la enfermedad
y que los rganos que tengan el epitope de
reaccin cruzada puedan estar afectados sin es
tar presente el microorganismo.
Es interesante destacar que los agentes infec
ciosos pueden participar en la induccin de las
enfermedades autoinmunes no slo por la simi
litud molecular con un autoantgeno sino que
adems producen dao tisular y liberacin de
antgenos secuestrados, disponibilidad de epi
topes crpticos a travs de una increm entada
expresin de molculas MHC, cambios en el
espectro de la produccin de citoquinas, activa
cin aberrante de linfocitos T, etc.
1.6. Teora de lo propio modificado
Esta teora postula que la autoinmunidad se
puede inducir como consecuencia de una res
puesta inmune contra determinantes antigni
cos propios modificados. Aunque no hay una
demostracin clara de esta teora, han sido pu
blicados varios ejemplos, entre ellos, aquellos
que indican que pueden aparecer nuevos deter
minantes antignicos en anticuerpos que sufrie
ron alguna mutacin somtica durante la m adu
racin de la respuesta inmune. Tambin se pos
tula que la modificacin de la IgG al form ar
complejos inmunes o los defectos en la glucosilacin de la IgG podran inducir la formacin
de los denominados factores reumatoideos (ver
en Artritis reumadoidea), o que el C3 del com
plemento podra exponer nuevos determinantes
durante su activacin. Por otra parte, hay una
gran lista de drogas a las que se han relaciona
do con la induccin de LES por la posibilidad
de que se unan a epitopes de molculas pro
pios, induciendo una modificacin molecular.
1.7. Defectos en la tolerancia central
o perifrica
Los defectos en la tolerancia central o perifri
ca como inductores de autoinmunidad tienden a
inducir, fundamentalmente, enfermedades autoin
munes sistmicas y pueden ser debidos a proble
mas de los linfocitos T o de los linfocitos B.
1.7.1. Defectos en la tolerancia
de linfocitos T
Existen varios modelos experim entales de
autoinmunidad inducida por falta de tolerancia
de linfocitos T. Uno que est bastante desarro
llado es la induccin de enfermedades autoin
munes rgano-especficas en ratones irradia

567

dos, reconstituidos con mdula sea y tratados

con ciclosporina; el efecto posiblemente es de
bido a la interferencia de esta droga en la apoptosis durante la seleccin negativa de clones
autorreactivos. Otro ejemplo bastante estudiado
es el desarrollo de manifestaciones autoinmu
nes en distintos rganos en animales que fue
ron timectomizados los primeros das de vida.
Parecera que hay una correlacin entre el esca
pe a la periferia de clones V de superantgenos
(SAg) propios y el dao tisular. Sin embargo,
otros hallazgos no apoyan esta hiptesis. Se ha
observado que ratones susceptibles al LES, in
cluidos los ratones Ipr y glcl, que tienen defec
tos en el Fas (CD95) y en el ligando del mismo
(Fas L), tienen las protenas endgenas del
SAg, que seran las mediadoras de la elimina
cin del clon V. Se observ que este proceso
no se altera con la edad ni con el desarrollo de
la enfermedad. Sprent sugiri que la autoinmu
nidad en anim ales neonatos tim ectom izados
puede ser causada por deficiencias cuantitati
vas de linfocitos T, as como tambin la sus
ceptibilidad a la infeccin y la posterior libera
cin de antgenos propios desde el sitio de la
infeccin. Los hallazgos relacionados a elimi
naciones intratmicas mediadas por el SAg no
excluyen la posibilidad de que haya defectos en
la tolerancia central a linfocitos T por antge
nos convencionales en la patognesis de au
toinmunidad.
1.7.2. Defectos en la tolerancia
de linfocitos B
No hay evidencias claras que indiquen que un
defecto en este proceso pueda contribuir marca
damente a la induccin de una enfermedad au
toinmune. Sin embargo, hay varios estudios rea
lizados con animales transgnicos donde se ob
serva falta de tolerancia a linfocitos B, lo que se
trat de explicar diciendo que habra antes una
activacin de linfocitos T, los que sacaran de la
anergia a los linfocitos B. Otra posibilidad para
explicar esta falta de tolerancia sera que haya
sido inefectiva la muerte de linfocitos B auto
rreactivos por tener deficiencias del Fas y no ha
ber podido ser eliminados por los linfocitos T ci
totxicos CD4+ que expresan Fas.
1.8. Activadores polielonales
La activacin policlonal de linfocitos T y B
es considerada un mecanismo importante en la
induccin o mantenimiento de las enfermeda
des autoinmunes, especialmente las enfermeda
des sistmicas. Se ha demostrado la existencia
de linfocitos B autorreactivos y de clulas aner
gizadas que se pueden activar despus de un
estm ulo apropiado. Hay un gran nm ero de

568

Inmunopatologa

B
Pncreas

Promotor
de insulina

Nucleoprotena
LCMV (NP)

Fig. 28-4. U na infeccin viral p uede rom per la toleran cia por una protena transgnica viral expresada en clulas
pancreticas p . R a to n e s q u e e x p re s a n u n a p ro te n a d e l L C M V en las c lu la s p a n c re tic a s (3 n o r e s p o n d e n a la p ro te n a y
p o r lo ta n to n o se e n fe rm a n . S in e m b a rg o , si ra to n e s tra n s e g n ic o s so n in fe c ta d o s c o n el L C M V , se p ro d u c e u n a p o te n te
re s p u e s ta a n ti-v ira l c o n p ro d u c c i n d e L T c ito t x ic o s q u e d e s tru y e n las c lu la s p a n c re tic a s (3, p ro d u c i n d o s e la e n fe r m e
dad. A lg u n o s a g e n te s in fe c c io s o s p u e d e n d e s e n c a d e n a r u n a re s p u e s ta a c lu la s T , y p ro d u c ir u n a re a c c i n c r u z a d a co n
p p tid o s p ro p io s, p ro c e s o c o n o c id o c o n el n o m b re d e m im e tiz a c i n m o le c u la r o s im ilitu d a n tig n ic a , p u d ie n d o c a u s a r e n
fe rm e d a d m e d ia n te u n a v a sim ila r. A : G e n h b rid o p ro d u c id o p o r in se rc i n del g e n d e la n u c le o p ro te n a (N P ) del L C M V
al p r o m o to r d e in su lin a . B : R a t n tra n s g n ic o q u e e x p re s a s lo la N P s o b re las c lu la s p d e l p n c re a s , p o r lo n o se p ro d u c e
re s p u e s ta a L T . C: L o s L T C D 8 e s p e c fic o s p a ra N P so n a c tiv a d o s p o r in fe c c i n c o n el v iru s L C M V . L o s L T C D 8 in fil
tra n a los islo te s y d e s tru y e n las c lu la s p q u e e x p re s a n la N P , p ro d u c i n d o s e d iab e te s.

molculas, especialmente de origen microbia

no, que tienen capacidad para activar polielonalmente linfocitos B e inducir autoanticuerpos. Sin embargo, es discutible la patogenicidad que estos activadores pueden originar en
las enfermedades sistmicas ya que, por ejem
plo, los anticuerpos que inducen son general
mente de tipo IgM y de baja afinidad, mientras
que el dao ms importante en el LES est da
do por los anticuerpos tipo IgG. Por otra parte,
en animales de experimentacin, aunque se ob
serven ttulos altos de anticuerpos, las manifes
taciones histolgicas se observan slo en los
animales con predisposicin gentica a adquirir
la enfermedad. Tambin es interesante tener en
cuenta que la im plantacin de enferm edades
autoinmunes requiere, en la mayora de los ca
sos, la participacin de linfocitos T.
Estudios llevados a cabo para determinar la
activacin de linfocitos T por los superantge
nos (SAgs), demostraron que SAgs bacterianos
o virales unidos a molculas del MHC sobre
los linfocitos B llevan a la produccin policlo
nal de inmunoglobulinas y en algunos casos de
autoanticuerpos. Alternativamente, los linfoci
tos T activados pueden inducir por s mismos
dao tisular a travs de reacciones cruzadas
con molculas propias. Se ha inferido que este

mecanism o es el que estara presente en p a

cientes afectados de artritis reumatoidea donde
se observa un enriquecimiento en la sinovia de
linfocitos T que expresan V[3l4, y una dismi
nucin de stos en linfocitos T de sangre peri
frica. Se ha postulado adems que las elulas
activadas por el SAg (incluyendo las que ex
presan V pl4 ) son expandidas y luego elimina
das, pero que algunas son atradas a la sinovia
porque expresan TCRs que dan reaccin cruza
da con una molcula propia presente en este si
tio. Los ensayos realizados para inducir experi
mentalm ente enferm edades autoinm unes por
activacin de linfocitos T con SAg in vitro e in
vivo son poco promisorios, aunque se ha podi
do inducir artritis por un SAg producido por el
micoplasma, al igual que algunas manifestacio
nes autoinmunes se asociaron con infecciones
estreptoccicas. Sin embargo, estas manifesta
ciones generalm ente estuvieron relacionadas
con la similitud m olecular entre epitopes del
microorganismo y del husped.
1.9. A lteraciones de los mecanismos
de inmunorregulacin
La ausencia de una inmunorregulacin ade
cuada ha sido considerada una de las principa

Autoinmunidad
les causas de la induccin de autoinmunidad,
aunque estos mecanism os no han sido clara
m ente d efin id o s. Sin em bargo, hay v ario s
ejemplos de modelos experimentales de enfer
medades autoinmunes donde sub-poblaciones
de linfocitos T pueden inducir o inhibir el desa
rrollo de las enfermedades. Por ejemplo, si se
eliminan clulas T RT6.1+ de una sublnea de
ratas BB resistentes a la diabetes, se revierte el
proceso y las ratas enferman. Por el contrario,
la enfermedad se puede inhibir por transferen
cia de clulas T CD4+CD45RC (low) en cepas
de ratas linfopnicas (timectomizadas e irradia
das). Se ha postulado que estas clulas proveen
IL4 e ILIO, que disminuyen la produccin de
IFNy disminuyendo las clulas citotxicas inductoras de diabetes.
2. CO N CLU SIO N ES
Con respecto a las enfermedades autoinmu
nes especficas de rgano, se puede concluir
que son causadas por respuestas inmunes con
vencionales contra antgenos propios hacia los
que no se indujo tolerancia. La ausencia de to
lerancia para antgenos especficos de determi
nados tejidos puede ser atribuida a antgenos
que no estaban presentes o disponibles en con
diciones norm ales como consecuencia de un
secuestro anatmico, una presentacin inade
cuada debido a la naturaleza crptica del deter
m inante, etc. En caso de que hubiera algn
trauma tisular o inflamacin por un microorga
nismo o reaccin cruzada con algn epitope del
elemento patgeno, se podra iniciar una enfer
medad autoinmune especfica de rgano.
Con respecto a las enfermedades autoinmu
nes sistmicas tales como el LES, la situacin
es menos clara, ya que ni la activacin policlo
nal de linfocitos T o B ni los elementos que al
teran los mecanismos inmunorregulatorios pa
receran ser suficientes para inducir la enferme
dad. Sin embargo, la induccin de LES en ce
pas de anim ales susceptibles, independiente
mente de las condiciones del bioterio, sugiere
que un elemento patgeno, exgena o endge
no, podra estar involucrado. El hecho de que
en el LES haya respuesta autoinmune contra
una vasta variedad de autoantgenos estara en
contra de la similitud molecular con un antge
no externo. Estos argumentos no excluyen los
efectos precipitantes de una variedad de facto
res fsicos, qumicos e infecciosos. Esta enfer
medad heterognea podra estar causada por el
compromiso de un gran numero de linfocitos T
no tolerantes que reconocen varios pptidos
propios presentados por molculas del CMH de
clase II a distintos niveles. Otra posibilidad, co
mo est ejemplificada en los modelos murinos

569

Ipr/gld de LES, puede ser que defectos en la

apoptosis lleven a una inadecuada tolerancia de
linfocitos T y linfocitos B.
3. PA TO G E N IA
Cada enfermedad autoinmune tiene una ca
racterstica inm unopatognica que involucra
uno o ms mecanismos de dao tisular. L a pa
tologa de la enfermedad est determinada por
el antgeno o el grupo de antgenos contra los
que est dirigida la respuesta inmune y el m e
canismo por el cual el tejido que presenta dicho
antgeno es daado. Una clasificacin m uy di
fundida de las enfermedades autoinm unes se
basa en el mecanismo inm unopatognico res
ponsable de la lesin observada en las mismas
(cuadro 28-4).
La interaccin antgeno-anticuerpo puede
producir diferentes tipos de lesin tisular segn
que los anticuerpos estn dirigidos contra ant
genos de la clula o estn formando parte de
complejos inmunes. El primer caso se observa
frecuentemente en anemia hemoltica, neutro
penias, linfopenias y trombocitopenias asintomticas debido a la presencia de anticuerpos
contra clulas de la sangre. En el sndrome de
Goodpasture, cuya lesin principal es debida al
prim er mecanismo descripto, se observa glom erulonefritis debida a la presencia de an ti
cuerpos contra antgenos de la membrana basal
del glomrulo y fijacin de complemento. En
otras ocasiones el dao tisular es producido por
anticuerpos que median la citotoxicidad celular

C u a d ro 28-4. Clasificacin de las enfermeda

des autoinmunes de acuerdo al mecanismo in
munopatognico involucrado
1. LESIN MEDIADA POR ANTICUERPOS
L L A n tic u e rp o s d irig id o s c o n tra a n tg e n o s d e la m a tr iz o
d e la s u p e rfic ie c e lu la r
A n e m ia h e m o ltic a a u to in m u n e
P irp u ra tro m b o c ito p n ic a a u to in m u n e
S n d ro m e d e G o o d p a s tu re
P n fig o v u lg a ris
F ie b re r e u m tic a a g u d a
1.2. L e s i n p ro d u c id a p o r c o m p le jo s in m u n e s
G lo m e ru lo n e fritis p o s e s tr e p to c c ic a
P o lia r te r itis n o d o sa
L u p u s e rite m a to s o s is t m ic o

2. LESIN MEDIADA POR LINFOCITOS T

D ia b e te s m e llitu s in s u lin o d e p e n d ie n te
A r tritis re u m a to id e a
E n c e fa lo m ie litis

570

Inmunopatologa

dependiente de anticuerpos; por ejemplo, la ti

roiditis autoinmune espontnea de pollos obe
sos.
Sin embargo, existen otras situaciones donde
la combinacin del antgeno (ligado a la clula)
y el anticuerpo no produce dao de la membra
na celular sino estimulacin de la clula. Este
es el caso de la deteccin de anticuerpos que se
fijan al receptor de la hormona estimulante de
tiroides (TSH) y activan la glndula (enferme
dad de Graves) estimulando la produccin ex
cesiva de hormona tiroidea (fig. 28-5). La pro
duccin de horm ona tiroidea en condiciones
normales es controlada por un fenmeno de re
troalimentacin, ya que altos niveles de hormo
na tiroidea inhiben la liberacin de TSH por la
glndula pituitaria; este mecanismo de retroalimentacin no tiene efecto cuando el receptor es
estimulado de manera patolgica, como es el
caso de autoanticuerpos anti-receptor. En la en
fermedad de Graves, se producen estos autoan
ticuerpos que estimulan al receptor, por lo tan
to el fenmeno de retroalimentacin no funcio
na y los pacientes presentan hipertiroidism o
(vase ms adelante).
La presencia de autoanticuerpos contra re
ceptores celulares se ha detectado en diversas
enfermedades o estados autoinmunes as, por
ejemplo, se observan anticuerpos antagonistas
contra el receptor de insulina inducindose hiperglucemia y quetoaeidosis con resistencia a
la insulina. Si por el contrario el anticuerpo es
un agonista del receptor de la insulina, se ob
serva hipoglucemia. En la miastenia gravis se
detectan anticuerpos contra el receptor de la
acetilcolina; tam bin se han observado anti
cuerpos contra receptores de la prolactina, de la
hormona de crecimiento y p-adrenrgicos. En
la miastenia gravis los anticuerpos contra la ca
dena a del receptor de la acetilcolina bloquean
la transmisin neuromuscular normal (fig. 286 ). Se ha postulado que los anticuerpos colabo
ran en la internalizacin y degradacin intrace
lular de los receptores de acetilcolina. Los pa
cientes con miastenia gravis tienen un debili
dad progresiva y eventualmente mueren como
consecuencia de esta enfermedad autoinmune.
Varios autores han estudiado enfermedades au

toinmunes en las que se detectaron anticuerpos

contra receptores de la prolactina y de la hor
mona de crecimiento, los que bloquean princi
palmente la unin de la hormona homloga. En
el cuadro 28-5 se detallan algunas de las enfer
medades en las cuales los autoanticuerpos con
tra receptores celulares tienen un rol importan
te pudiendo actuar como agonistas o antagonis
tas de las hormonas.
En el caso de la lesin producida por com
plejos inmunes, los anticuerpos tipo IgG e IgM
se combinan con el antgeno y forman comple
jos inmunes que fijan complemento. Los com
plejos inmunes pueden estar formados por ant
genos solubles o antgenos que forman parte de
la estructura de un tejido o una clula. Los
complejos inmunes solubles pueden producir
vaseulitis y nefritis por su depsito en los endotehos de los vasos o en el glomrulo renal.
Los factores del complemento, adems de los
granulocitos y monocitos, son atrados a los si
tios de depsito de los complejos inmunes, pro
vocando muerte celular. Este mecanismo es el
principal responsable de las lesiones observa
das en el LES, y es muy importante tambin en
la patogenia de los ratones NZB/NZW.
Las reacciones inm unitarias m ediadas por
clulas ocurren eomo resultado de las acciones
recprocas de linfocitos T activamente sensibi
lizados y sus antgenos especficos, y son m e
diadas por linfoquinas o son debidas a citotoxi
cidad directa. Es posible clonar lneas celulares
T que transfieren la enfermedad a un animal
del m ism o haplotipo. Esto ha hecho posible
identificar los autoantgenos involucrados en
muchas enfermedades autoinmunes experimen
tales. Los antgenos son pptidos que se unen a
molculas determinadas del MHC. Por ejem
plo, lneas T clonadas pueden causar una enfer
medad desmielinizante del cerebro, la encefalom ielitis alrgica experim ental (EAE), que se
asemeja a la esclerosis mtltiple del ser huma
no. Estas lneas celulares clonadas son estimu
ladas por pptidos de la protena bsica de mielina. La identificacin de pptidos autoantignicos es particularmente difcil en el caso de
enfermedades autoinmunes mediadas por clu
las T CD 8 +.

C u ad ro 28-5. Enfermedades mediadas por anticuerpos contra receptores celulares

Antgeno

M ecanism o

Sintonas

E n fe rm e d a d d e G ra v e s

Enferm edad

R e c e p to r d e la T S H

E s tim u la n te

H ip e rtiro id is m o

M ia s te n ia g rav is

R e c e p to r d e a c e tilc o lin a

B lo q u e a n te

D e b ilid a d p ro g re s iv a

D ia b e te s m e llitu s

A n ta g o n is ta d e l re c e p to r

B lo q u e a n te

H ip e rg iu c e m ia

571

Autoinmunidad

Cuadro 28-6. Modelos experimentales de autoinmunidad espontnea

M odelo anim al

Posible contrapartida
de enferm edad en hittrumos

Antgeno
inductor

E nferm edad
transm itida p o r L T

R a to n e s d ia b tic o s n o -o b e s o s
(N O D )

D ia b e te s m ellitu s in su lin o -d e p e n d ie n te (IDDIVI)

N o c o n o c id o

R a to n e s F l
(N Z B X N Z U ')

L u p u s e rite m a to s o s is t m ic o
(L E S )

N o c o n o c id o

C e p a d e p o llo s o b e so s

T iro id itis d e H a s h im o to

T iro g lo b u lin a

A l realizar una prueba de la actividad de c

lulas de los nodulos linfticos sobre monocapas
de clulas de tiroides provenientes de ratones
inm unizados con tiroglobulina homloga, se
detectaron clulas citotxicas efectoras. La ci
totoxicidad se produjo despus de la estim ula
cin in vitro con tiroglobulina durante 5 o 6
das. Sin embargo, en esta enfermedad no se
excluye el papel de los autoanticuerpos en el
agravam iento de la lesin tiroidea, especial
mente en el ser humano, donde las clulas B
activas se encuentran en nmero elevado.
En algunas enferm edades autoinmunes es
pontneas como la IDDM observada en ratones
NOD, el 60-80% de las hembras se vuelven hiperglucmicas a las 30 semanas de edad y to
dos los ratones presentan infiltracin linfocita
ria de los islotes de Langerhans. Estos infiltra
dos estn constituidos principalmente por linfo
citos T CD4+ y CD 8 +, linfocitos B y m acrfa
gos pero, por experim entos de transferencia
adoptiva, se demostr que los linfocitos T son
los principales responsables de la enfermedad.
Existen evidencias que demuestran que las c
lulas T hl tienen un rol patognico en la IDDM;
por ejemplo, se pudo prevenir el desarrollo de
diabetes en ratones NOD por la aplicacin de
anticuerpos anti-IFN-y. Es posible que este an
ticuerpo acte sobre el IFN-'y producido por los
linfocitos T h l o el producido por las clulas
NK. En la EAE se pudo demostrar el rol prota-

gnico de las clulas T hl y no de las Th2, es

pecficas para la protena bsica de mielina, ya
que la enfermedad pudo ser transferida por c
lulas T h ly no por Th2.
4. MODELOS EXPERIMENTALES
DE A UTOINM UNIDAD
Los modelos animales de autoinmunidad es
pontnea o experim entalm ente inducida son
tiles para tratar de dilucidar la etiopatogenia
de estas enfermedades.
4.1. M odelos de autoinmunidad espontnea
Diferentes cepas de animales que presentan
alteraciones en el sistema inmune han sido m o
delos tiles para estudiar enfermedades autoin
munes (cuadros 28-6 y 28-7). Entre los anim a
les ms utilizados para estudiar enfermedades
autoinm unes sistm icas podem os citar a un
gran nmero de cepas de ratones, y entre ellas,
a la cepa NZB/NZW. En estos animales se ob
serva nefritis autoinm une con p rese n c ia de
complejos inmunes, y son ampliamente utiliza
dos como modelo experimental para el estudio
del lupus eritematoso sistmico (LES) en hu
manos. El LES murino es una enfermedad que
est determinada genticamente y es muy simi
lar a la enfermedad humana. Las anormalida-

Cuadro 28-7. Modelos de autoinmunidad experimentalmente inducidos'^

IVIiastenia g ra v is a u to in m u n e
e x p e rim e n ta l (E A M G )

M ia s te n ia g rav is

R e c e p to r d e a c e til-e o lin a

Si

E n c e fa l itis e x p e rim e n ta l a u
to in m u n e (E A E )

E s c le ro s is m ltip le (M S )

P r o te n a b s ic a d e la m ie lin a

Si

A rtritis a u to in m u n e (A A )

A r tritis re u rn a to id e a

M . tuberculosis ( p ro te o g lic a n o s )

Si

T iro id itis e x p e rim e n ta l auto in m u n e (E A T )

T iro id itis de H a s h im o to

T iro g lo b u lin a

Si

E stas e n ferm e d ad es p u e d e n s e r in ducidas en anim ales a p ro p ia d o s, por in y ec ci n del antgeno con a d y u v a n te co m p leto de F reu n d . E x ce p to
para la irtritis a u to in m u n e, el a n tg en o usad o co rresponde al au to a n tg e n o a so c ia d o con la en ferm e d ad h u m ana. L a artritis re u rn a to id e a est
asociada a re acc io n es co n tra p ro teo g lica n o s, q u e son au to a n tg e n o s asociados c o n el tejido conectivo.

572

Inmunopatologa

Pituitaria

Tiroides

F ig. 28-5. E n la enferm edad de G raves, la regulacin de la produccin de horm ona tiroidea se halla interrum pida.
L a e n fe rm e d a d d e G ra v e s es c a u s a d a p o r a n tic u e rp o s a n ti-re c e p to re s d e la T S H . E n c o n d ic io n e s n o rm a le s , las h o rm o n a s t i
ro id e a s se p ro d u c e n c o m o r e s p u e s ta a la T S H la q u e p o r a u to rre g u la c i n lim ita su p ro d u c c i n p o r la g l n d u la p itu ita ria . E n
la e n fe rm e d a d d e G ra v e s , los a u to a n tic u e rp o s s o n a g o n is ta s d e la T S H y p o r lo ta n to e s tim u la n d e m a n e ra d e s c o n tro la d a la
p ro d u c c i n d e h o rm o n a s tiro id e a s , p ro d u c i n d o s e h ip e rtiro id is m o . A: L a g l n d u la p itu ita r ia s e c re ta T S H q u e a c t a so b re
la tiro id e s p a ra in d u c ir la lib e ra c i n d e h o rm o n a s tiro id e a s . B : L a s h o rm o n a s tiro id e a s a c t a n s o b re la p itu ita ria , p o r d is m i
n u c i n d e la p ro d u c c i n d e T S H , lo q u e p o r fe e d b a c k s u p rim e la sn te s is d e las h o rm o n a s . C : L o s L B a u to in m u n e s p r o d u
c e n a n tic u e rp o s a n ti-re c e p to r d e la T S H , q u e e s tim u la n ta m b i n la p ro d u c c i n d e h o rm o n a s . D: L a p ro d u c c i n d e h o n n o a s p o r e s tim u la c i n de l re c e p to r a tra v s d e la u n i n d e a u to a n tic u e rp o s n o p u e d e a u to rre g u la rs e , lo q u e c a u s a e x c e s iv a
p ro d u c c i n d e h o rm o n a s .

des inmunolgicas iniciales en cada cepa de ra

tn pueden variar pero la patogenia es similar
en todas las cepas y se caracteriza por hiperfuncin de las clulas B,. produccin de autoanti
cuerpos, formacin de \complejos inmunes cir
culantes, desarrollo de 'glomerulonefritis y en
ferm edad cardiovascular. Las anorm alidades
serolgicas primarias comunes incluyen: con
centraciones elevadas de inmunoglobulinas s
ricas, gran cantidad de autoanticuerpos entre
los que se Incluyen anticuerpos antinucleares y

anti-ADN de cadena doble y simple. Cada una

de las caractersticas autoinmunes de los rato
nes NZB/W se halla bajo un control gentico
especfico y mltiples genes estn involucrados
en las alteraciones autoinmunes observadas en
estos ratones. Se demostr que determinados
genes estn comprometidos en la aparicin de
anticuerpos anti-ADN, nativo y desnaturaliza
do, pero no en la aparicin de autoanticuerpos
naturales timocitotxicos, anti-eritrocitarios e
IgG m onoclonal. En otro grupo de ratones

Autoinmunidad

Receptores de
acetilcolina

M l isc u Io

Los receptores
de acetilcolina
son endocitados
y degradados

573

Flujo de Na+
Contraccin muscular

No flujo de Na+
No contraccin muscular

Fig. 28-6. A utoan ticuerp os dirigidos contra el recep tor de la acetilcolin a inhiben su funcin. L a m ia s te n ia g r a v i s es
c a u sa d a p o r a n tic u e rp o s d irig id o s c o n tr a la su b u n id a d a d e l r e c e p to r d e a c e tilc o lin a , q u e e s t r e la c io n a d o co n la t r a s m i
s i n n e u ro m u s c u la r. A: P o r im p u ls o s n e u ro n a le s se lib e r a a c e tilc o lin a q u e se u n e a su s r e c e p to re s , p r o d u c ie n d o c o n tr a c
c i n m u sc u la r. B : E n la m ia s te n ia g ra v is , lo s a n tic u e rp o s a n ti-re c e p to r d e a c e tilc o lin a se u n e n a lo s r e c e p to re s , p r o d u c i n
d o s e e n d o c ito s is y d e g ra d a c i n d e lo s re c e p to re s , p o r e n d e la a c e tilc o lin a n o p u e d e ac tu a r.

MRL/lpr el gen Ipr produce linfoproliferacin

de linfocitos T y es un modelo bastante utiliza
do para estudiar la artritis reurnatoidea.
Los animales ms empleados en el estudio
de enfermedades autoinm unes especficas de
rgano son los ratones diabticos no obesos
(NOD) y ratas bio-breeding (BB), que se utili
zan en el estudio de la diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM ). En ambas cepas de
animales se observa reaccin autoinmune con
tra clulas del pncreas. En estos animales hay
aparicin espontnea de IDDM con destruccin
de clulas e insulitis. Inicialmente slo el 10%
de las cras de ratas BB eran diabticas, pero
los cruzam ientos selectivos incrementaron la
frecuencia de diabetes en forma significativa.
La aparicin de diabetes en ratas BB es abrupta

y la mayora de los animales diabticos mueren

de cetoacidosis dentro de la semana de apari
cin de la enfermedad, a menos que se les ad
ministre insulina. Un pequeo nmero de ani
males manifiesta slo hiperglucemia y no re
quiere insulina exgena. En ambos modelos la
gentica es compleja, pero estudios de entrecruzamiento permitieron demostrar en am bos
casos que la susceptibilidad a la diabetes est
relacionada con el complejo mayor de h isto
compatibilidad.
Hay tambin varios modelos espontneos de
enfermedad tiroidea, en los que se observa de
sarrollo de tiroiditis autoinmune; esto se puede
ver especialm ente en ratas Bfalo, y en los de
nom inados pollos obesos . La tiroiditis au
toinmune espontnea observada en pollos obe

574

Inmunopatologa

sos es una enfermedad autoinmune espontnea

eon earaeterstieas de rgano-especfica, que se
asemeja a la tiroiditis de Hashimoto del ser hu
mano. En estos pollos se observan autoanti
cuerpos contra antgenos de tiroides y la gln
dula experim enta destruccin progresiva por
lesin inflam atoria crnica. Este m odelo es
pontneo tiene varias ventajas; por ejem plo,
que en las aves, la bursa y el timo estn anat
micamente separados, que el embrin se desa
rrolla en un huevo accesible y que m uchas
cras pueden ser derivadas de un par de padres.
4.2. Modelos de autoinmunidad
experimentalmente inducidos
Un modelo muy empleado en la induccin
de autoinmunidad en determinadas cepas de ra
tones es realizar timectoma en animales de tres
a cinco das de edad. Cuando estos animales
son adultos desarrollan enfermedades autoin
munes caracterizadas por la presencia de au
toanticuerpos e infiltrados de linfocitos T en
los rganos afectados. En ratones BALB/c la
principal enfermedad que se induce es la gastri
tis, aunque tambin pueden estar presentes la
orquitis, ooforitis, pancreatitis, prostatitis y ti
roiditis. Es poco probable que el m ism o autoantgeno sea el blanco en los diferentes rga
nos. Se pudo observar que diferentes poblacio
nes de clulas efectoras inducen diferentes en
fermedades, ya que la expresin intratmica de
antgenos responsables de la gastritis elimina el
desarrollo de gastritis en animales timectomizados pero no el de ooforitis. Se cree que la en
fermedad est mediada por linfocitos T CD4+
porque pudo ser transferida por este tipo de c
lulas obtenidas de animales timectomizados.
Sin em bargo, para obtener autoinm unidad
experimental es necesario, en la mayora de los
casos, incorporar al material inmunizante sus
tancias adyuvantes. El uso de adyuvantes tiene
importancia no slo en la induccin sino tam
bin en la regulacin del tipo de respuesta in
mune; por ejemplo, el tejido cerebral inyectado
en animales de experimentacin induce encefalomielitis alrgica experimental (EAE) (cuadro
28-7). En esta enfermedad se demostr que el
antgeno responsable es la protena bsica de
m ielin a, que in c o rp o rad a al ad y u v a n te de
Freund completo e inyectada en ratas singenei
cas induce EAE. Por el contrario, el tratamien
to de ratas con protena bsica de mielina en
adyuvante de Freund incom pleto previene el
desarrollo de EAE. Ratas no tratadas y ratas
pretratadas con albmina bovina o protena b
sica de ratn en solucin fisiolgica no fueron
protegidas al ser posteriormente inmunizadas
con protena bsica incorporada a adyuvante de
Freund completo. Los sntomas que se m ani

fiestan en ratas enfermas son falta de tonicidad

de la cola y debilidad definida de las patas tra
seras, que ev o lu cio n a a p arlisis com pleta
acompaada por incontinencia. Se ha demos
trado que las clulas T son responsables de las
lesiones observadas en la mdula espinal y de
la desmielinizacin producida en estos anima
les, la mayora de los cuales se recupera espon
tneamente y se vuelve resistente a posteriores
intentos de inducir la enfermedad. Se ha de
mostrado que esto es debido a la presencia de
clulas T supresoras. Algunas de las manifesta
ciones de esta enfermedad experimental se ase
mejan a una enfermedad desm ielinizante del
hombre, la esclerosis mltiple, lo que ha hecho
suponer su origen inmunolgico.
5. ENFERMEDADES AUTOINM UNES
ORGANO-ESPECFICAS Y SISTMICAS
Las enfermedades autoinmunes afectan entre
el 5 y 7% de la poblacin mundial, pudiendo
causar desde afecciones crnicas leves hasta al
teraciones muy severas que pueden llevar a la
muerte al individuo que la padece. En general,
las enfermedades autoinmunes que se observan
en humanos pueden ser divididas en dos cate
goras: especficas de rgano y sistmicas (cua
dros 28-8 y 28-9). En las enfermedades rga
no-especficas, la respuesta autoinmune prima
ria es dirigida contra un nico rgano, glndula
o tejido, por tal motivo a esta categora de en
fermedades tambin se la puede dividir tam
bin tomando en cuenta el rgano blanco invo
lucrado (cuadro 28-10).
5.1. Enfermedades autoinmunes
rgano-especficas
En las enfermedades rgano-especficas, la
inmunidad humoral y/o la inmunidad mediada
por clulas inducidas, estn dirigidas contra au
toantgenos localizados en un solo rgano. Es
tas patologas tambin pueden ser clasificadas
segn la enfermedad sea debida principalmente
a la inmunidad humoral, celular o a ambas. En
algunas ocasiones se presenta ms de una en
fermedad autoinmune en un mismo individuo,
especialmente cuando estn implicadas glndu
las de secrecin endocrina. En el cuadro 28-8
se detallan las principales enfermedades englo
badas en este grupo.
Enfermedades autoinmunes tiroideas
Las hormonas secretadas por la glndula ti
roides, 3,5,3,-5-tetraiodotironina (T^, tiroxina) y 3,5,3-triiodotironina (Tj), regulan la sn
tesis de protenas por accin sobre la transcrip-

Autoinmunidad

575

Cuadro 28-8. Enfermedades autoinmunes rgano-especficas

Enferm edad

Respuesta inm une

Autoantgeno involucrado

E n fe rm e d a d d e G ra v e s

R e c e p to r d e la h o r m o n a d e tiro id e s

A u to a n tic u e rp o s (e s tim u la n te s )

T iro id itis d e H a s h im o to

C lu la s y p ro te n a s d e tiro id e s

A u to a n tic u e rp o s y L T q u e m e d ia n h i
p e rs e n s ib ilid a d re ta rd a d a

D ia b e te s m e llitu s in s u lin o d e p e n d ie n te

C lu la s p a n c re tic a s tip o b e ta

A u to a n tic u e rp o s y L T q u e m e d ia n h i
p e rs e n s ib ilid a d re ta rd a d a

M ia s te n ia g ra v is

R e c e p to re s d e a c e tilc o lin a

A u to a n tic u e rp o s (b lo q u e a n te s )

E s c le ro s is m iltip le

M a te ria g ris o b la n c a d e c e re b ro

C lu la s T c ito t x ic a s y m e d ia d o ra s d e
h ip e rs e n s ib ilid a d re ta rd a d a
A u to a n tic u e rp o s

E n fe rm e d a d d e A d d is o n

C lu la s a d re n a le s

A u to a n tic u e rp o s

A n e m ia h e m o ltic a a u to in m u n e

P ro te n a s d e m e m b r a n a d e g l b u lo s ro jo s

A u to a n tic u e rp o s

S n d ro m e d e G o o d s p a s tu re

C lu la s b a s a le s d e ri n y e s t m a g o

A u to a n tic u e rp o s

P rp u ra tro m b o c ito p n ic a id io p tic a

P ro te n a s d e m e m b r a n a d e p la q u e ta s

A u to a n tic u e rp o s

A n e m ia p e rn ic io s a

C lu la s g s tric a s p a rie ta le s ( fa c to r in tr n
se co )

A u to a n tic u e rp o s

cin y estabilizacin del ARN. El 65% del peso

de la
es iodo y su forma desiodada (Tj), es la
forma activa de la hormona. La accin de la
es mediada a travs de su receptor, una nucleoprotena que une ADN. La principal protena
intratiroide es la tiroglobulina, glucoprotena
de 660 kD, rica en tirosinas, que tiene la capa
cidad de atrapar iodo ionizado dentro de la
glndula. La incorporacin de T y su posterior
oxidacin dentro de la glndula requiere la pre
sencia de peroxidasa (TPO); esta enzima es una
protena de 107 kD y se halla ubicada en la
fraccin microsomal del citoplasma de las c
lulas tiroideas. La tiroglobulina iodada es alm a
cenada en los espacios foliculares de la glndu
la. La secrecin de las hormonas tiroideas,
y
Tj, se produce por accin de enzimas proteol
ticas que las liberan de la protena almacenada
y un sistema de feedbaclc regula la funcin de
la glndula. Las clulas del hipotlamo sinteti

zan la thyroid releasing hormone (TRH), que

estimula a la glndula pituitaria a producir y li
berar la tyhyroid stimulating hormone (TSH).
La TSH estimula al tiroides para que sintetice y
libere T 4 y Tj, que finalmente suprimen la ac
cin de la TSH por competicin con la TRH en
la pituitaria. De esta manera se cierra el ciclo.
Los tests para evaluar la funcin de la gln
dula tiroides miden la concentracin srica de
T^, Tj y TSH. El tratamiento de hipotiroidismo
se realiza mediante el empleo de tiroxina. E n el
caso de hipertiroidismo requiere el uso de dro
gas que inhiban la sntesis de tiroxina, tra ta
miento quirrgico del total o parte de la gln
dula o destruccin de la glndula con iodo ra
diactivo.
Las principales enfermedades autoinm unes
tiroideas humanas (tiroiditis de Hashimoto, h i
potiroidismo autoinmune priinario y enferm e
dad de Graves) se caracterizan por una reactivi-

C uadro 28-9. Enfermedades autoinmunes sistmicas ms comunes

Enferm edad

A utoantgeno involucrado

Respuesta inmune

L u p u s e rite m a to s o s is t m ic o

A D N , p ro te n a s n u c le a re s ( rib o n u c le o p ro te n a s ) m e m b r a n a d e p la q u e ta s

A u to a n tic u e rp o s , c o m p le jo s i n m u n e s

A rtritis re u m a to id e a

T e jid o c o n e c tiv o Ig G

A u to a n tic u e rp o s , c o m p le jo s i n m u n e s

D e rm a to m io s itis y p o lio m io s itis

I n fla m a c i n d e m s c u lo y p iel

A u to a n tic u e rp o s

E s c le ro d e rm ia

C o ra z n , r i o n e s , tra c to g a s tro in te s tin a l

A u to a n tic u e rp o s

S n d ro m e d e S jo g re n

G l n d u la s s a liv a le s , h g a d o , r i o n e s , t i
ro id e s

A u to a n tic u e rp o s

576

Inmunopatologa

C uadro 28-10. Clasificacin de las principales

enfermedades autoinmunes rgano especficas
humanas segn el rgano o sistema afectado
Sistem a endocrino
T iro id itis d e H a siiim o to
E n fe rm e d a d d e G ra v e s (h ip e rtiro id is m o , tiro to x ic o s is )
D ia b e te s m e llitu s tip o I ( in s u lin o d e p e n d ie n te o d ia b e te s
ju v e n il)
In su fic ie n c ia a d re n a l (e n fe rm e d a d d e A d d is o n )
O rq u itis a u to in m u n e

Sistem a hem atopoy tico

A n e m ia h e m o ltic a a u to in m u n e (c o n a u to a n tic u e rp o s ti
p o c a lie n te s )
A n e m ia h e m o ltic a a u to in m u n e (co n a u to a n tic u e rp o s
fro s o c ro a g lu tin in a s )
T ro m b o c ito p e n ia a u to in m u n e
A n e m ia p e rn ic io s a
C o a g u lo p a ta s a u to in m u n e s ( a n tic o a g u la n te s c irc u la n te s
o s n d ro m e fo sfo lip d ic o )

Sistem a neurom uscular

M ia s te n ia g rav is
P o lin e u ritis a u to in m u n e
E s c le ro s is m ltip le
P o lim io s itis

Piel
P n fig o y o tra s e n fe rm e d a d e s a m p o lla re s

Sistem a cardiopulm onar

M io c a rd itis re u m tic a
S n d ro m e d e G o o d p a s tu re ( h e m o rra g ia p u lm o n a r y n e fr i
tis)

dad hacia antgenos tiroideos propios, la que

puede estar expresada como una respuesta au
toinm une de tipo inflam atorio destructivo o
una respuesta autoinmune anti-receptor.
Tiroiditis de Hashimoto
La tiroiditis de Hashimoto es una de las en
fermedades ms comunes que causan hipotiroidismo en adultos. Generalmente afecta a muje
res de mediana edad y su principal manifesta
cin es el hipofuncionamiento de la glndula,
produciendo severas complicaciones metablicas, debido a la hipoproduccin de la hormona
por tumefaccin de la glndula tiroides. El hipotiroidism o com ienza con una variedad de
signos y sntomas como por ejemplo la apata
por disminucin del metabolismo. El mixedema es una manifestacin muy comiin del hipotiroidismo y se caracteriza por la tumefaccin
del tejido subcutneo, especialmente alrededor
de los ojos. En la tiroiditis de Hashimoto, coino
en la mayora de las enfermedades autoinmu
nes, podra estar involucrado un componente
gentico, ya que se ha observado, que mieiTibros asintomticos de una familia tienen mayor
incidencia a padecer la enfermedad, si en dicha
familia existen antecedentes de la enfermedad.

En la Tiroiditis de Hashimoto el dao princi

pal est relacionado con la inmunidad mediada
por clulas ya que se encuentran infiltrados de
clulas plasiTiticas, macrfagos, linfocitos B y
linfocitos T, principalmente CD4+. Estas clu
las pueden, en algunos casos, reemplazar com
pletamente la arquitectura normal de la glndu
la tiroides. Las clulas epiteliales tiroideas pue
den interaccionar directamente con las clulas
T que expresan tanto antgenos de clase I como
antgenos de clase IL La expresin de estos lltimos por parte de las clulas tiroideas es indu
cida por el lEN-y liberado por la clula T y di
cho efecto es incrementado por el factor de ne
crosis tum oral (TNF). Recprocamente, estas
clulas tiroideas pueden presentar antgenos a
las clulas T aumentando de esta forma la libe
racin de citoquinas. El INF-y y T N F a tambin
induciran la expresin de algunas molculas
de adhesin sobre las clulas tiroideas como,
por ejemplo, la molcula de adhesin intercelu
lar (CAM -1). Adem s, IL -ip y T N F -a son
sintetizados por las clulas epiteliales tiroideas,
creando la posibilidad de un control autocrino
por estas citoquinas. Otras molculas de adhe
sin expresadas sobre la clula tiroidea inclu
yen al CD56 y CD58.
El 95% de los sueros de los pacientes con ti
roiditis de Hashimoto contienen anticuerpos di
rigidos contra la tiroglobulina y la peroxidasa.
Estudios realizados con anticuerpos m onoclo
nales anti-tiroglobulina humana han contribui
do a dem ostrar que los epitopes reconocidos
por los autoanticuerpos presentes en el suero de
estos pacientes se encuentran en la regin cen
tral (no hormonognica) de la molcula de tiroglobulina, es decir que esta zona estara ex
puesta sobre la superficie de la molcula de ti
roglobulina nativa. El clonado de los genes de
los antgenos involucrados en la tiroiditis de
Hashimoto permiti conocer la autoantigenicidad de los mismos, definiendo cules son los
epitopes especficos para las clulas T y cules
para las clulas B.
Los autoanticuerpos anti-tiroglobulina quizs
tengan un rol patognico limitado, pero se obser
v que el reconocimiento de esta porcin central
por autoanticuerpos en pacientes con el SndroiTie de Sjogren (ver ms adelante) se correlacio
nara con la severidad de la lesin tiroidea.
En el modelo animal de tiroiditis autoinmu
ne experimental inducido por la inmunizacin
de ratones con tiroglobulina, se demostr que
los determinantes iodados son los responsables
de la patogenicidad de la enfermedad, ya que
son reconocidos por las clulas T autorreacti
vas y forman parte de los dominios hormonognicos de la tiroglobulina.
Tanto la tiroglobulina como la peroxidasa ti
roidea pueden ser expresadas sobre las clulas

Autoinmunidad
foliculares de la tiroides, por lo tanto pueden
ser reconocidas por clulas inmunes y anticuer
pos. Por otra parte, los LB aislados de sangre
de pacientes con tiroiditis de Hashimoto son
capaces de producir in vitro anticuerpos anti-tiroglobulina, cuando son co-cultivados con c
lulas T antologas y tiroglobulina.
Los anticuerpos anti-TPO aparentemente tie
nen mayor importancia patognica que los antitiroglobulina. Esto se basa en las siguientes ob
servaciones: 1) la mayora de los pacientes con
tiroiditis de Hashimoto presentan anticuerpos
anti-TPO mientras que los anticuerpos anti-tiroglobulina estn a veces ausentes o presentes
en pequea cantidad; 2) los niveles sricos se
correlacionan con los estadios activos de la en
fermedad; 3) a diferencia de los anticuerpos anti-tiroglobulina, los anti-TPO produciran dao
directo a las clulas tiroideas por fijacin de
complemento; in vitro se observ que daan las
clulas tiroideas por ADCC con clulas natural
killer.
La tiroiditis experimental autoinmune (EAT)
puede ser inducida en ratones H-2b por inm u
nizacin con TPO porcina purificada o por
transferencia adoptiva de clulas T sensibiliza
das. En general, los epitopes reconocidos por el
receptor de las clulas T involucrados en la pa
tognesis de la enfermedad son poco conoci
dos.
Enfermedad de Graves
La manifestacin clnica ms importante es
la hiperactividad de la glndula tiroides, con
excesiva liberacin de hormonas tiroideas (tirotoxicosis). Esta anorm alidad funcional causa
hiperactividad con temblores, insomnio y alte
raciones en el ritm o cardaco. Un im portante
aspecto del hipertiroidismo es la exoftalmia, un
peculiar agrandamiento de los globos oculares,
que, si es severo, puede causar su dao. Los
pacientes con hipertiroidismo tienen anticuer
pos de tipo IgG contra el receptor de la TSH.
Estos anticuerpos m im ifican la accin de la
TSH, estimulando inapropiadamente a las clu
las tiroides a producir excesivas cantidades de
tiroxina; las anticuerpos anti-TSH tambin pue
den estimular in vitro el crecimiento de las c
lulas tiroideas, efecto que podra correlacionar
se con el agrandamiento de la glndula tiroidea
que se observa en la enfermedad de Graves.
Existen evidencias de una respuesta inmune
dentro de la glndula, ya que se han encontrado
LT CD4+ y en menor grado, LT CD8+. Por otro
lado, se ha observado in vitro que, LB prove
nientes de glndulas de pacientes con la enfer
medad, producen anticuerpos anti-TSH. Tam
bin se ha visto que estos anticuerpos estn res
tringidos a una nica cadena liviana ( k o X), su

577

giriendo que provienen de una restringida po

blacin de clones B, a pesar de que no ha sido
posible detectar LB especficos. Que en el de
sencadenamiento del hipertiroidismo sean res
ponsables los anticuerpos anti-TSH ha sido do
cumentado por el xito del tratamiento, en al
gunos pacientes, con methamazole, compuesto
con actividad antitiroidea, que reduce la pro
duccin de anticuerpos. Pero ms convincente
aun es la induccin de hipertiroidismo en nios
recin nacidos, debido al pasaje placentario de
dichos anticuerpos.
El receptor de la TSH ha sido objeto de estu
dios debido a su importancia fisiolgica e im
plican cia en la enferm edad de G raves. E st
compuesto por una subunidad extracelular de
unin a la hormona y una subunidad de m em
brana, unidas por puentes disulfuro. L os pa
cientes con enfermedad de Graves presentan
autoanticuerpos estim ulantes dirigidos contra
el receptor de la TSH mientras que pacientes
con hipotiroidismo autoinmune primario pre
sentan anticuerpos que bloquean la unin de la
TSH y que no son estimulantes. Ambos tipos
de anticuerpos se uniran a distintos sitios del
receptor. Los anticuerpos estimulantes activan
la adenilciclasa elevando los niveles intracelu
lares de AMPc y los niveles de ARNm para la
tiroglobulina y TPO.
La oftalmopata en la enfermedad de Graves
est asociada con anticuerpos dirigidos contra
una protena de 64 kD, especfica de la m em
brana del msculo del ojo. No se sabe cul es
el origen de estos anticuerpos y por qu no to
dos los pacientes con enferm edad de G aves
presentan dao ocular.
Diabetes mellitus
La diabetes m ellitus es un desorden en el
metabohsmo de la glucosa, debido a una dism i
nucin o falta total de insulina. La deficiencia
de insulina produce hipergiucemia, causando
aumento de la osmolaridad plasmtica, lo que
increm enta la produccin de orina, que es el
primer sntoma de diabetes.
Existen dos formas principales de la enfer
medad: diabetes tipo I, en la que los pacientes
dependen de insulina exgena para el m anteni
miento del metabolismo normal de la glucosa,
y diabetes tipo II, donde el tratamiento es fre
cuentemente innecesario, ya que es suficiente
una dieta sin carbohidratos. La diabetes tipo II
es debida a disturbios bioqumicos del receptor
de la insulina, mientras que la diabetes de tipo 1
es una enfermedad autoinmune que destruye
las clulas p de los islotes de Langerhans del
pncreas, clulas productoras de insulina. Las
lesiones especficas de la enfermedad se cono
cen como insulitis, infiltrado de los islotes de

578

Inmunopatologa

Langerhans con clulas mononucleares, espe

cialmente LT CD8+ y en menor cantidad LT
CD4+.
La diabetes tipo I, tam bin conocida como
diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM)
afecta aproximadamente al 0,2-0,5% de la po
blacin y el pico de aparicin de la enfermedad
es a los 11-12 aos de edad, por lo que a la dia
betes tipo I tambin se la conoce con el nombre
de diabetes juvenil insulinodependiente. Se ha
observado una mayor incidencia de la enferme
dad segn el grupo tnico o raza, lo que indica
su estrecha relacin con los antgenos del com
plejo mayor de histocompatibihdad. La IDDM,
si no se trata tempranamente, puede llevar al
paciente a un desenlace fatal, debido a la total
destruccin de las clulas de los islotes de Lan
gerhans del pncreas. La retinopata diabtica,
daos renales, y un tipo acelerado de arteriees
clerosis, que puede llevar a la amputacin de
las piernas o pies, son las complicaciones ms
severas de esta enfermedad.
La IDDM es considerada una enferm edad
autoinmune especfica de rgano debido a la
presencia de anticuerpos contra distintos com
ponentes de las clulas de los islotes y a la
morfologa que presenta el pncreas. Adems,
se ha visto que est frecuentem ente asociada
con otras enfermedades autoinmunes especfi
cas de rgano, como enfermedades autoinmu
nes tiroideas, anemia perniciosa y la enferme
dad idioptica de A ddison. Los anticuerpos
contra las clulas de los islotes son una caracte
rstica de esta enfermedad; algunos se unen a
componentes del citoplasma; otros, a protenas
de la membrana de las clulas [3. Un hecho im
portante de estos anticuerpos es que pueden ser
un m arcador im portante de la enferm edad, y
predecir si un individuo es susceptible o no. Se
ha observado que el 80% de los pacientes pre
sentan anticuerpos contra una protena de 64
kD localizada en el citoplasma de las clulas [3.
Estos anticuerpos se han detectado antes de la
aparicin de la enfermedad, por lo tanto, pue
den servir como marcadores predictivos. Esta
protena de 64 kD ha sido identificada como la
cido glutmico decarboxilasa (GAD), enzima
presente en una gran variedad de tejidos que
cataliza la sntesis del cido y-aminobutrico.
Se han encontrado dos isoterm as, de 65 y 67
kD respectivamente, pero ambas contienen una
secuencia peptdica homloga a un pptido de
la protena P2-C del virus Coxsackie B4, lo que
hace suponer que la IDDM se gatillara por es
ta infeccin viral, aunque todava no ha sido
demostrada reaccin cruzada entre el G AD y la
molcula P2-C. Los anticuerpos anti-GAD en
la IDDM son un enigma, debido a la distribu
cin de esta enzima en los diversos tejidos del
organismo.

En el suero de pacientes, tanto diabticos co

mo prediabticos, se ha detectado la presencia
de anticuerpos anti-GAD. Los autoanticuerpos
detectados en sujetos en un estadio pre-clnico
y en pacientes en quienes la enfermedad es de
reciente aparicin, estn dirigidos contra clu
las de los islotes (ICA) y autoanticuerpos anti
insulina (lAA). Durante aos se ha tratado de
encontrar un marcador srico en personas sus
ceptibles a la diabetes antes de la aparicin cl
nica de la misma. Sin embargo, no se han en
contrado diferencias significativas en el riesgo
a desencadenar diabetes entre personas con al
tos y medianos ttulos de anti-GAD.
La respuesta autoinmune que se genera tiene
bases genticas, es decir que est relacionada
con la presencia de determinados haplotipos de
los antgenos del complejo mayor de histocom
patibilidad de ciase II (especialm ente DR3DR4). El riesgo de un individuo, cuando uno
de los progenitores presenta la enfermedad es
del 8-10%, y aumenta al 25 % si ambos la pa
decen. Tambin los factores ambientales pue
den ejercer efectos moduladores profundos so
bre dicha predisposicin gentica; si estos fac
tores gatillan o protegen de la enfermedad an
no se sabe. Ciertos virus han sido implicados
en la induccin de IDDM en humanos, como
virus de rubola, Coxsackie y citomegalovirus.
Sin embargo, las evidencias que la IDDM en
hum anos resulte de una infeccin viral que
afecte directa o indirectamente a travs del sis
tema inmune a las clulas, son poco claras.
An no existen evidencias claras respecto al
gatillado de la destruccin celular por algn ti
po especial de anticuerpo o por algn particular
autoantgeno. El argumento en contra de la hi
ptesis que sugiere que los autoanticuerpos son
la causa primaria de la enfermedad es que los
LT son las clulas mayoritarias que se obser
van en el infiltrado de los islotes.
La cepa de ratn NOD es un modelo animal
de IDDM ampliamente estudiado. Muchas l
neas de trabajo apuntan hacia la importancia de
los hnfocitos T en el proceso de destruccin de
las clulas de los islotes dando como resultan
do el desarrollo de diabetes. Sin embargo, no
ha sido fcil la purificacin de las clulas auto
rreactivas. Tambin se ha comprobado que di
ferentes citoquinas, liberadas por las clulas del
sistema inmune, juegan un rol muy importante
en la patognesis de IDDM y en el dao celu
lar. Estudios in vitro han demostrado que cier
tas citoquinas (IL-1, TN F-a, lEN-y) pueden ser
citotxicas para las clulas, inhibir la secrecin
de insulina y, generalmente en combinacin,
daar y destruir a las clulas. La expresin de
las mismas se encontr en las lesiones de insulitis en ratones NOD y en ratas BB. El IFN -yha
sido detectado en infiltrados de islotes hum a

Autoinmunidad
nos diabticos con la presencia de linfocitos.
Tambin se observ que la administracin de
IL-2, IL-4, e IL-10 a ratones NOD y ratas BB
in vivo pueden prevenir el desarrollo de diabe
tes. Englobando los resultados mencionados se
sugiere que, dada la importancia del IFN-y co
mo mediador en la destruccin de las clulas
de los islotes in vitro y de la insulitis y diabetes
in vivo, las clulas T hl productoras de IFN-y
participaran en el proceso de destruccin de
las clulas de los islotes. Por otro lado, los
efectos protectores contra insulitis y diabetes
producidos por la L-4 e IL-10, sugieren que
las clulas Th2 productoras de estas citoquinas
seran las responsables de prevenir la respuesta
autoinmune. Por lo tanto, la respuesta autoin
mune en IDDM involucrara algn tipo de des
balance en los circuitos inm unorregulatorios
que llevaran a un dominio en la funcin y pro
duccin de citoquinas de la poblacin T h l so
bre la Th2.
Miastenia gravis
La miastenia gravis (MG) es una enferm e
dad autoinmune en la que se observa bloqueo
de la trasmisin neuromuscular, por la produc
cin de autoanticuerpos contra el receptor de la
acetil colina (AChR). La enfermedad es ms
frecuente en m ujeres que en hombres; en las
mujeres la enfermedad aparece generalmente
durante la tercera dcada de vida y en los hom
bres, a partir de los 60 aos. El sistema m uscu
lar ms afectado es el ocular, larngeo y respi
ratorio. Es muy comn la asociacin entre MG
y otras enferm edades autoinmunes, especial
mente hipertiroidismo. El timo juega un papel
muy importante, ya que se ha visto que la timectoma puede curar a pacientes jovenes. El
90% de los enfermos presentan anticuerpos anti-AChR y las madres pueden trasmitir la enfer
medad a sus hijos, muy probablemente por pa
saje por placenta de dichos autoanticuerpos.
La MG es una enfermedad poco comn, pe
ro es muy estudiada debido a que el autoantge
no involucrado en la enfermedad est muy bien
caracterizado, lo que permite un excelente sis
tema para investigar las interacciones molecu
lares que ocurren en la respuesta autoinmune
en humanos. Los anticuerpos contra el AChR
son la principal causa de los sntomas que se
observan en la enfermedad, la que puede ser in
ducida en animales sanos por tratamiento con
suero o IgG de pacientes con MG o con anti
cuerpos anti-ACliR. En la MG tambin hay an
ticuerpos contra otros epitopes presentes en
msculo, contra protenas sinpticas y contra
una protena de membrana del sarcoplasma in
volucrada en la liberacin del Ca^^. Estos anti
cuerpos pueden tener un rol en Ja patognesis

579

de la enfermedad, especialmente en casos don

de los anticuerpos contra la AChR no son detectables.
El AChR es una protena compleja formada
por cuatro subunidades homlogas a , (3, y y (e)
6. En el msculo em brionario el A C hR est
compuesto de subunidades a , [3, y y 5; despus
de la inervacin, la subunidad y es reemplazada
por la subunidad homloga.
No se conoce si la respuesta contra el AChR
es iniciada por el mismo receptor o por una pro
tena de reaccin cruzada. Se ha postulado que
en pacientes con miastenia gravis, el tim o sera
el rgano donde se inicia la induccin contra el
AChR. En estos pacientes es comn la hiperpla
sia del timo y en algunos casos se observa la
presencia de un timoma y hay presencia de lin
focitos T y B con receptores anti-AChR. Por lo
tanto la timectoma, en estos pacientes es consi
derada en algunos casos un tratamiento benefi
cioso. Diferentes protenas similares al AChR
han sido descritas en el timo. Una de estas pro
tenas es expresada en timomas pero no es un
verdadero AChR porque, aunque si bien algu
nos anticuerpos contra el receptor se unen a ella
no se unen a Ja a-bungaroto.xina (pptido de v
bora, antagonista colinrgico que reconoce es
pecficamente el AChR muscular).
El AChR em brionario parece ten er un rol
importante en la patognesis de la MG, lo que
explicara en parte el hecho de que algunos pa
cientes reconocen solamente AChR embriona
rio. Se ha propuesto que los anticuerpos contra
el AChR en MG reconocen epitopes nicos del
AChR embrionario o comunes a ambas formas,
em brionaria y adulta, pero nunca reconocen
epitopes pertenecientes solamente a la forma
adulta del AChR.
Los anticuerpos anti-AChR de pacientes con
M G causan degradacin acelerada del AChR
por entrecruzamiento o por lisis m ediada por
complemento de la membrana post-sinptica y
raramente bloquean el sitio de unin colinrgica. Estos anticuerpos son polielonales y hay
poca correlacin entre el ttulo de anticuerpos y
la severidad de los sntomas, sugiriendo que
slo ciertas subpoblaciones de anticuerpos con
tra AChR son patognicas, quizs debido a su
capacidad de degradar el AChR y/o de activar
el complemento. Algunos pacientes con MG no
tienen anticuerpos detectables contra el AChR,
y otros pueden producir anticuerpos contra epi
topes del AchR que no estn relacionados con
de la unin neuromuscular.
L a mayora de los anticuerpos anti-AChR
estn dirigidos contra una porcin extracelular
de la subunidad denominada MIR (principal re
gin inmunognica) y que est conservada en
diferentes especies animales. Los anticuerpos
anti-MIR jugaran un rol muy im portante en la

580

Inmunopatologa

patogenicidad de la enferm edad, ya que su

transferencia pasiva en ratas Lewis puede des
encadenar MG; en cambio la enfermedad no se
desencadena si se inoculan anticuerpos dirigi
dos contra otras porciones de la misma subuni
dad y contra otras subunidades del receptor.
Por otro lado, los anticuerpos anti-MIR, cuan
do se aaden a cultivos de clulas musculares
son capaces de inhibir la expresin del AChR,
causando el mismo efecto los sueros de pacien
tes con MG.
Se puede concluir que los anticuerpos son
los principales responsables de los sntom as
observados en MG y que los anticuerpos antiMIR pueden tener un rol predom inante en la
enfermedad. Los anticuerpos anti-MIR tienen
diferentes idiotipos y parecera que la activa
cin de los anticuerpos anti-idiotipos del cir
cuito inm unorregulatorio podran ser de uso
prctico en el tratam iento de la enferm edad.
Los sntomas de la MG pueden ser disminuidos
por el uso de toxinas unidas a AGhR ya que
pueden llevar la toxina a los linfocitos B antiAGhR.
Esclerosis mltiple
La esclerosis m iiltiple es una enferm edad
desm ielinizante del sistem a nervioso central,
siendo los linfocitos T importantes mediadores
de la misma. En la actualidad se estn realizan
do numerosos estudios sobre esta enfermedad y
las investigaciones se basan fundamentalmente
en un modelo experimental de encefalitis au
toinmune (EAE) inducido en ratas Lewis. Estos
animales, cuando son inyectados con mielina o
protena bsica de mielina (MBP), al cabo de
14 das desarrollan una parlisis ascendente de
la cola seguida por debilidad de las patas trase
ras o parlisis de las mismas. En los estudios
histolgicos se observa inflamacin de las m e
ninges asociada a desmielinizacin primaria de
la mdula espinal. Por microscopa electrnica
se observan clulas apoptticas presentes en el
sistema nervioso central desde el da de la apa
ricin de la enfermedad hasta el momento en
que comenz la recuperacin del animal. Los
linfocitos CD4+ que reaccionan contra la pro
tena bsica de mielina son los factores patog
nicos en la EAE. Si se inyectan linfocitos T
que reaccionan con MBP, en animales norma
les en form a endovenosa, estos linfocitos se
acumulan en el sistema nervioso central y cau
san EAE. Su patogenicidad involucra procesos
complejos tales como localizacin, extravasa
cin de clulas que inducen EAE e induccin
de dao en el sistema nervioso central. La hi
persensibilidad de tipo retardada es uno de los
procesos patognicos de los linfocitos T encefalognicos. Los linfocitos T-MBP pueden in

terferir en la conductividad o ser citolticos. Se

ha observado que los astrocitos que presentan .
MBP pueden ser Usados por clulas especficas
para MBP. La actividad ltica est restringida a
las m olculas del CM H -II, es especfica de
MBP y est asociada con la encefalogenicidad
de las clulas T.
5.1.1. Clasificacin de las enfermedades
autoinm unes segn el sistema involucrado
Como se puede ver en el Cuadro 28-10, las
enfermedades autoinmunes especficas de r
gano se pueden clasificar tambin segn el sis
tema involucrado. Aqu mencionaremos algu
nas de ellas.
E nferm edades autoinm unes del sistema
hematopoytieo
Sndrome antifosfoUpdico
En 1963 Bowie y col. describieron que un
grupo de pacientes con LES presentaban una
extraa sintomatologa clnica: trombosis recu
rrente, y el plasma contena un factor que era
capaz de inhibir la coagulacin in vitro, por lo
que aos ms tarde se lo llam anti-coagulante
lpico. En el ao 1987, se agrup a estos pa
cientes bajo el trmino de sndrome antifosfolipdico (APS), ya que sus sueros presentaban
anticuerpos anticardiolipina y anti-fosfolpidos. Por otro lado, este sndrome ocurra gene
ralm ente en ausencia de m anifestaciones de
LES.
El APS puede presentarse con diferentes ma
nifestaciones, pero siem pre depende de una
trombosis primaria. La trombosis comienza en
las venas de las piernas, contina con embolis
mo pulmonar e infarto placentario con abortos
espontneos recurrentes.
Los anticuerpos anti-fosfolpidos tienen pre
ferencia por los lpidos cargados, clasificados
como cardiolipinas, unindose al grupo polar
del fosfato. Se pueden encontrar dos formas de
fosfolpidos: la forma laminar, que es el mayor
componente fosfolipdico de la bicapa de las
m em branas celulares, m ientras que la form a
hexagonal es componente menor. Los anticuer
pos anti-fosfolpidos preferentemente se unen a
la forma hexagonal. Por otro lado, ste es el
fosfolpido inmunognico para ratones, sin ne
cesidad de adyuvantes, mientras que la forma
laminar no es inmunognica, aunque se inyecte
con adyuvante. Por lo tanto, los anticuerpos anti-fosfolpidos pueden ser el resultado de una
respuesta inmune contra la forma hexagonal,
que por alguna causa se exprese de m anera
anormal sobre la membrana celular. Algunos
investigadores creen que el cofactor P^-gluco-

Autoinmunidad
protena, componente normal del plasma, pue
da ser fundamental para la unin de los anti
cuerpos a la cardiolipina.
Algunos anticuerpos anti-fosfolpidos pue
den reaccionar con ADN, va el fosfato del ci
do nucleico. Ms aun, ratones normales inmu
nizados con cardiolipina conjugada a una pro
tena, producen anticuerpos que reaccionan con
cardiolipina y ADN. Estos resultados estaran
explicando la reactividad cruzada de los anti
cuerpos anti-fosfolpidos en el LES.
An se desconocen los mecanismos median
te los cuales los anticuerpos anti-fosfolpidos
producen trombosis. Dos grupos de investiga
dores han dem ostrado que la adm inistracin
endovenosa de anticuerpos anti-fosfolpidos en
ratones preados causa la muerte fetal. A pesar
de ello, la patogenicidad de estos anticuerpos
no est universalmente aceptada.
Vasculitis
Los sndromes vasculticos son un grupo de
desrdenes heterogneos, en los cuales la ma
nifestacin principal es la inflamacin de las
paredes de los vasos sanguneos. Pueden afec
tar los vasos grandes, medios y pequeos de to
do el organismo, pero con mayor frecuencia,
los vasos de la piel, riones, pulmones y cere
bro.
El hallazgo de anticuerpos contra componen
tes del citoplasm a de neutrfilos (ANCA) ha
sido una importante contribucin para dilucidar
los mecanismos de estos sndromes. Uno de los
ANCA se une especficamente a una serin-proteasa (m ieloblastina) que se encuentra dentro
de los grnulos azurfilos de los neutrfilos.
Estos anticuerpos son caractersticos de la granulom atosis de W egener y su concentracin
tiende a correlacionarse con el perodo activo
de la enfermedad. Un segundo tipo de ANCA
se une a mieloperoxidasa, otra enzima neutrfila. Los anticuerpos anti-mieloperoxidasa apare
cen en diferentes tipos de vasculitis, principal
mente poliartritis nodosa y glom erulonefritis
necrotizante. Se vio que los dos tipos de ANCAs eran capaces de activar a los neutrfilos in
vitro, causando la degranulacin y produccin
de radicales libres, y estos efectos eran incre
mentados por efecto del TNF. Estos hallazgos
estaran indicando que los ANCA tienen un rol
patognico en los diferentes tipos de vasculitis.
No se conoce an si estos anticuerpos son el re
sultado de una primera injuria que causa libera
cin de antgenos potencialmente inmunogni
cos a partir de neutrfilos, o a travs de algn
otro mecanismo.
Muchas agentes infecciosos tienen la capaci
dad de activar neutrfilos, pero no inducen vas
culitis o la produccin de ANCAs, por lo tanto

581

la v asculitis m ediada por ANCA es an un

enigma, como la mayora de las enfermedades
autoinmunes.
Anemia hemoltica autoinmune (AHAI)
La AHAI comprende un grupo de enferme
dades que se caracterizan por la presencia de
autoanticuerpos contra glbulos rojos, causan
do una severa disminucin de la vida m edia de
dichas clulas.
Se conocen dos tipos de autoanticuerpos anti-glbulos rojos, IgG e IgM, ambos con dife
rente especificidad y asociados a diferentes
AHAI. Los autoanticuerpos de tipo IgG , aun
que se unen a eritrocitos, no son capaces de
aglutinarlos y slo pueden ser evidenciados
m ediante el uso del suero anti-Y-globulinas
(test de Coombs). Los antgenos a los cuales se
unen estos autoanticuerpos han sido difciles de
caracterizar. Hoy se sabe que se hallan dentro
del altamente polirtirfico sistema Rh. L a ca
racterstica de esta enfermedad es la anem ia he
moltica por la depuracin de eritrocitos unidos
a los anticuerpos, va receptor Fe de m acrfa
gos. Estos autoanticuerpos no son fijadores de
complemento, por lo tanto, la hsis intravascular
es poco comn. La AHAI asociada con anti
cuerpos de tipo IgG puede ser idioptica o estar
asociada a LES u otras enfermedades autoininunes.
Los anticuerpos de tipo IgM asociados a ia
AHAI a son capaces de aglutinar a los glbulos
rojos, por lo se los conoce con el nom bre de
crioaglutininas (CA), ya que lo hacen a bajas
temperaturas (4-22C). Las CA reconocen un
sistema de antgenos llamado I/i, cuyo epitope
est formado por unidades repetidas de N-acetil-lactosam ina de manera lineal o ram ificada
respectivamente. El antgeno i se h alla sobre
los glbulos rojos fetales y de recin nacidos;
el antgeno I aparece luego de los tres m eses de
vida.
E stos anticuerpos norm alm ente se hallan
presentes en el sitero de individuos normales,
en ttulos muy bajos, pero en la enfermedad se
incrementan enormemente, pudindose obser
var aglutinacin con sueros diluidos hasta 1:
10''. La enfermedad crnica por CA es debida
generalmente a anticuerpos monoclonales de ti
po IgM producidos por clulas B neoplsicas.
Un hecho llamativo de estos autoanticuerpos
es que, hasta el presente, son el nico modelo
de autoanticuerpos con restriccin en el uso de
un determinado gen Vj^. La asociacin es con
el Vj^4-21, gen da la familia V h4. Este gen es
altamente representado en el repertorio de LB
normales. Si un antgeno extrao o propio se
lecciona una clula B V h4-21+ y, si esta clula
sufre una transformacin maligna, el resultado

582

Inmunopatologa

puede ser la produccin de un alto nivel de an

ticuerpos monoclonales patognicos y con es
pecificidad de CA.
Enferm edades autoinm unes de la piel
Antes de hablar de las enfermedades autoin
munes de la piel es importante hacer una intro
duccin, aunque breve, de cmo est constitui
do este rgano.
La piel es el rgano ms extendido del cuer
po. Est formado por un epitelio (epidermis),
una matriz de tejido conectivo (dermis) y tejido
adiposo (hipodermis) y muchas de las estructu
ras de la piel han sido clasificadas en funcin
de su composicin bioqumica.
La epidermis est constituida por un epitelio
estratificado, clulas pigm entarias (melanocitos), clulas dendrticas (clulas de L an g er
hans), y linfocitos residentes. Los queratinocitos, componente mayoritario de la epidermis,
contienen un citoesqueleto form ado por fila
mentos de queratina. Dichos filamentos se in
sertan en la placa de desmosomas y hemidesmosoraas estableciendo uniones con las clulas
adyacentes. Los queratinocitos se distribuyen
formando diferentes capas con distinto grado
de diferenciacin.
La dermis est formada por tejido conectivo,
sistema de fibras, filamentos y un sistema co
nectivo amorfo, que acomoda la red de nervios
y vasos. Las clulas ms caractersticas son los
fibroblastos y macrfagos. En la dermis, en res
puesta a diferentes estmulos, pueden aparecer
clulas derivadas de la sangre como linfocitos,
clulas plasmticas y leucocitos. La dermis pro
tege al cuerpo de injurias mecnicas externas.
La adhesin clula-clula de la epidermis es
mantenida por la unin de las protenas de la
membranas celulares y reforzada por diferentes
tipos de adhesiones intercelulares. En estos di
versos tipos de adhesiones participan diferentes
protenas especializadas como microfilamentos
de actina, filamentos intermedios (tonofi lamen
tos de queratinas), vinculinas, placoglobina, a actinina, etc.
Los desmosomas son placas epiteliales que
unen los tonofilamentos y son los que mantie
nen la resistencia mecnica de la piel y las m u
cosas. Por otro lado, las protenas desmosomales son las reconocidas por los autoanticuerpos
presentes en la m ayora de las enfermedades
ampollares. Las principales protenas que com
ponen las placas desmosomales son: desmoplaquina, desmoglena, placoglobina y desmoglobina.
Las diversas enfermedades autoinmnes que
atacan a la piel se caracterizan por la presencia
de autoanticuerpos dirigidos contra diferentes
componentes proteicos de las diversas capas de

la piel. La mayora de estas enfermedades s

conocen tambin con el nombre de enfermeda
des am pollares, siendo las ms com unes las
que se hallan bajo la denominacin de Pnfigo.
Los autoanticuerpos que se encuentran en el
suero de pacientes con enfermedades ampolla
res han sido de gran importancia para identifi
car las diferentes molculas de la piel responsa
bles de las adhesiones epiteliales clula-clula
y de las adhesiones drmicas/epidrmicas.
Enferm edades ampollares (Pnfigo)
El pnfigo (del griego pemphix, ampolla) es
una enfermedad autoinmune de la piel y mem
branas de mucosas.
Se conocen diferentes tipos de pnfigos, en
tre los cuales podemos nombrar: el P. vulgaris
(con ampollas orales y cutneas, por la presen
cia de IgG intracelular), el P. vegetans (con le
siones orales y verrugas que simulan erupcin,
por la presencia de IgG intracelular), P. foliaceus (con ampollas superficiales en piel, por la
presencia de IgG en la epidermis), el P. brasi
leo (con ampollas superficiales en piel, por
anticuerpos en la epidermis). El ms comin es
el P. vulgaris.
Posteriormente a la formacin de las ampo
llas aparece la acantolisis debida a la prdida
de la conexin entre las clulas epidrmicas de
la piel por desaparicin de puentes intracelula
res. La lesin acantoltica puede contener un
exudado inflamatorio, pero un hecho ms ca
racterstico de estas patologas es la presencia
de autoanticuerpos contra importantes sustan
cias que mantienen la estructura rgida de las
clulas de la piel. El suero de los pacientes
tambin contiene estos autoanticuerpos, cuyo
ttulo tiende a fluctuar, segn la actividad de la
enfermedad.
Los anticuerpos que aparecen en todos los ti
pos de pnfigo estn dirigidos contra antgenos
conservados del epitelio estratificado. La carac
terizacin de estos autoantgenos es muy com
pleja. Los autoanticuerpos presentes en el P.
foliaceus inmunoprecipitan un complejo polipeptdico de epidermis de 269 kD, 160 kD y 85
kD. El polipptido de 85 kD es la placoglobina,
un componente del desmosoma, que media la
adhesin celular de la epidermis. La protena
de 160 kD es la desmoglena, una glucoprote
na de transmembrana que se extiende en el in
terior del desmosoma. En el P. vulgaris, el autoanticuerpo une un autoantgeno epidrmico
de 210 kD, conformado por dos cadenas poli
peptdicas de 130 kD y 85 kD (placoglobina),
unidas por puentes disulfuros. El componente
de 130 kD es un miembro de la familia de la
caderinas, que median la adhesin clula-clula
y son Ca^+ dependiente.

Autoinmunidad
La desmoglena es el autoantgeno reconoci
do por los anticuerpos presentes en el P. foliaceus. La glucoprotena de 210 kD se halla en la
regin baja de la epidermis, sitio relacionado
con el P. vulgaris, mientras que la protena de
160 kD identificada por los anticuerpos presen
tes en el P .foliaceus se localiza en la regin al
ta de la epidermis, zona afectada en este tipo de
pnfigo.
Los anticuerpos involucrados en estas pato
logas tambin producen liberacin del activa
dor de plasmingeno a partir de las clulas epi
drmicas. Esta enzima proteoltca es capaz de
participar en los mecanismos que causan prdi
da de adhesin entre las clulas epidrmicas,
quizs por degradacin de la sustancia intrace
lular.
Una dramtica demostracin que la actividad
patognica de los autoanticuerpos es el desa
rrollo de lesiones ampollares en un nio recin
nacido, cuya madre padece de pnfigo vulgaris
activo.
La susceptibilidad de contraer algunos de los
tipos de pnfigo se halla ligada al HLA-DR4 y
al HLA-DRw6 y especficamente al HLA-DR4
variante cadena-3 (DwlO DR(3I).
5.2. Enferm edades autoinmunes
no rgano-especficas (sistmicas)

La enfermedades autoinmunes no rgano-especficas, tambin llamadas sistmicas, se ca

racterizan por la presencia de autoanticuerpos
circulantes que pueden ser patognicos o no y
estn dirigidos contra autoantgenos presentes
en todo el cuerpo, no siendo especficos de un
rgano en particular (cuadro 28-9).
La presencia de uno o ms autoanticuerpos
circu lan tes co n tra autoan tg en o s n u cleares
(ANAs) es la caracterstica de las enferm eda
des reumticas sistmicas. Este grupo de enfer
medades no presenta manifestaciones clnicas
homogneas, sino graduaciones en la variedad
y severidad de los multisistemas involucrados.
El lupus eritematoso sistmico (LES) es el pro
totipo de enfermedad autoinmune que involu
cra una variedad de rganos y tejidos, como
ser, articulaciones, piel, riones, sistem a ner
vioso central, pulmones, corazn y msculo es
queltico. Otras enfermedades de este grupo,
como la enfermedad mixta del tejido conectivo
(M CTD), sndrom e de Sjgren (SS), artritis
reum atoidea (AR) y esclerodermia (Sel), son
de un orden intermedio en el rango y variedad
de rganos involucrados. Finalmente se halla la
dermato/polimiositis, donde los rganos blanco
son piel y msculo.
Las enfermedades autoinmunes como LES,
SS, escleroderm ia y polimiositis se caracteri
zan por la presencia de anticuerpos antinuclea

583

res (ANAs). Estudios realizados m ediante la

tcnica de inm unotransferencia y clonado de
ADN han revelado que los autoantgenos rela
cionados con este multisistema de enfermeda
des autoinmunes son importantes protenas re
lacionadas con el metabolismo de cidos ribo
nucleicos, que incluyen ARNt, ADN y cofactores de la RNA polimerasa.
Entre esta gran variedad de autoantgenos in
volucrados en el reconocimiento de los autoan
ticuerpos relacionados con las enferm edades
autoinmunes sistmicas se hallan las partculas
ribonucleoproteicas (RNP) altamente conserva
das, como las SSA/Ro, SSB/La y uRNP. Su es
trecha vinculacin con enferm edades autoin
munes ha permitido un estudio profundo sobre
su naturaleza molecular y la caracterizacin de
su secuencia; esto ha permitido la identifica
cin de homologas estructurales y de secuen
cia con protenas no relacionadas, as como la
localizacin de secuencias RNP consenso, que
se han relacionado con la propiedad de estos
autoantgenos de unir ARN. Debido a que estos
motivos (estructuras repetidas) se hallan alta
mente difundidos, se ha postulado que el siste
ma inmune puede reconocer antgenos simila
res presentes en un amplio nmero de organis
mos, y mediante reactividades cruzadas ser res
ponsables del desencadenamiento autoinmune.
Como se ha podido hallar una eficiente reacti
vidad por parte de los autoanticuerpos contra
estos motivos, se ha sugerido que pueden fun
cionar como epitopes para los LT.
Clark y col. en el ao 1969 describieron por
primera vez el antgeno SSA/Ro en un paciente
con LES. Estudios posteriores, utilizando sue
ros pacientes con SS, revelaron que los mismos
eran capaces de precipitar tres antgenos dife
rentes provenientes de un extracto de linfocitos
humanos. Estos anticuerpos fueron designados
como A, B y C y con el prefijo SS, indicando
que estaban involucrados en el SS. A os ms
tarde Alspaugh y Maddison demostraron que el
Ro y SS-A eran el mismo antgeno y que no
eran especficos del SS, ya que los sueros de
pacientes con LES tambin contenan estos au
toanticuerpos, aunque con menor frecuencia.
Estos autoanticuerpos reconocen partculas ri
bonucleoproteicas pequeas, cuyo componente
proteico vara entre 50 y 150 kD. Estudios rea
lizados por diversos autores han llegado a la
conclusin de que el principal componente del
sistema Ro es un polipptido de 60 kD que se
asocia a pequeos ARN de 83-112 nucletidos.
Esta protena es comn a muchos tipos celula
res, y el anlisis de extractos de linfocitos y eri
trocitos ha perm itido identificar otra protena
de 52 kD en linfocitos y de 54 kD en eritroci
tos, ambas antignicamente diferentes, ya que
se han encontrado sueros que son capaces de

584

Inmunopatologa

reconocer una y no la otra. La disociacin de la

respuesta inmune hacia distintas protena de Ro
sugiere la posibilidad de diferentes procesos
autoinmunes en las patologas en las que se ha
llan involucrados estos autoanticuerpos.
A comienzos de la dcada del 70 Mattioli y
Reichlin observaron que el extracto citoplasmtico de timo de ternera presentaba un antge
no precipitable por el suero de un paciente con
LES, al que denom inaron La, in iciales del
nombre del paciente. Estudios posteriores de
mostraron identidad entre los antgenos SS-B y
La. Este autoantgeno es una fosfoprotena alta
mente conservada y se han descrito por lo m e
nos seis isoformas, siendo el polipptido mayoritario de 46-48 kD. Los autoanticuerpos antiLa se detectan casi exclusivamente en pacien
tes con SS y LES, aunque con mayor frecuen
cia en el SS.
En el ao 1959, Holman y col. describieron
en el suero de pacientes con LES, la presencia
de anticuerpos que reaccionaban con un antge
no nuclear diferente al ADN y ribonucleoprotenas que, aos ms tarde. Tan y Kunkel deno
m inaron Sm (iniciales del nom bre de un p a
ciente). Mattioli y Reichlin observaron que este
antgeno era lbil al tratamiento con ARNasa,
por lo tanto lo definieron como una ribonucleoprotena, que denominaron U1 RNP. Los anti
cuerpos anti-Sm reconocen pequeas partculas
ribonucleicas presentes en todas las clulas eucariotes. Una importante caracterizacin de es
te autoantgeno o sistema de autoantgenos es
el hecho de que los anticuerpos anti-Sm son ca
paces de precipitar pequeas partculas de ribonucleoprotenas diferentes (U l, U4, U5 y U6),
en cambio los anticuerpos anti-U l slo reac
cionan con la partcula nRNP U l . A su vez, ca
da una de las nRNP U est asociada a diferen
tes polipptidos, por lo que este complejo siste
ma de autoantgenos se conoce de acuerdo al
peso molecular del pptido al cual los nRNP U
estn asociados; Sm B (27 kD), SmD (13 kD),
SmE/F (un duplete de 11 kD) y SmG (menor a

10 kD). Los autoantgenos nRNP Sm fu n cio -'

nalmente estn relacionados con el splicng del
pre-ARNm.
Cada sndrome est asociado con una restric
ta variedad de ANAs, coino ser: anti-La con
SS, anti-Sm con LES, enzimas anti-sintetasas
con miositis, anti-topoisomerasa I (Sel 70) con
esclerodermia y anti-centrmero con CREST.
Debido a ello, la precisa caracterizacin de un
determinado ANA es de gran valor de diagns
tico y pronstico (cuadro 28-11 y fig. 28-7).
La inm unotransferencia (immunoblotting o
W estern-blot) es la tcnica ms utihzada en la
actualidad para determinar la especificidad de
un particular autoanticuerpo. Esta tcnica se
basa en la separacin, por eleetroforesis en gel
de acrilamida, de las diferentes protenas con
distinto peso molecular, presentes en un extrac
to celular soluble, y despus transferidas a una
m em brana de nitrocelulosa. La mem brana es
luego incubada con sueros de pacientes; de es
tar presente algn autoanticuerpo especfico, se
unir a su autoantgeno. Esta unin podr vi
sualizarse con un anticuerpo anti-y-globulina
humana marcado con una enzima. La visualiza
cin de una banda de 47 kD sugiere la presen
cia de autoanticuerpos SS-B, mientras que la
unin con una pro tena de 60 kD indica la pre
sencia de autoanticuerpos SS-A. Por medio de
las tcnicas de biologa molecular se han podi
do clo n ar algunos au to an tg en o s com o ser
RNP, Sm, SS-A, y SS-B, lo que ha permitido el
desarrollo de tcnicas mucho ms sensibles co
mo el enzimoinmunoanlisis (ELISA).
Lupus eritematoso sistmico (LES)
El LES es una enfermedad que afecta princi
palm ente a m ujeres jvenes adultas aunque
tambin se presenta en nios y ancianos de am
bos sexos.
Clnicamente, el LES se presenta con fiebre
alta, artralgia, erupciones de piel, problemas
cardacos, pulmonares y renales. Se observan

C u ad ro 28-11. Anticuerpos antinucleares y patologas autoinmunes sistmicas asociadas

A utoantgeno

E nferm edad asociada

d s -A D N

L E S (7 0 -9 0 % )

S m (S m ith ), R N P
H is to n a
S S -A (R o)
S S -B (L a)
S c i-70
C e n tr m e ro
Jo-1

L E S (3 0 % )
L E S , L E S in d u c id o p o r d ro g as
L E S , SS
L E S , SS
E s c le ro d e rm ia
E s c le r o d e rm ia
P o lio m io s itis

IFI; inm u n o flu o resc en cia ; E L IS A : e n z im o in m u n o an lisis; W B : in m u n o tran sfe ren c ia ; ID : in m u nodifusin.
ds-A D N : A D N de do b le ca dena.

Tcnica usada
C rith id ia L u c ilia e (lE t)
E L IS A
ID -W B
E L IS A -W B
ID -W B
ID , W B
ID , W B
IFI
ID

Autoinmunidad

585

Fig. 28-7. Perfiles de inm unofluorescencia ob ten id os en fren tan d o clulas H ep-2 con diferentes a u toanticu erp os. A:
p e rfil h o m o g n e o o b te n id o con un s u e ro d e L E S q u e contiene p r in c ip a lm e n te anticuerpos a n ti-A D N d e d o b le c a d e n a . B:
p e rfil d e p u n te a d o f in o /n u c le o la r, d a d o p o r a n tic u e rp o s a n ti-S c l-7 0 . C : p e rfil d e p u n te a d o g ru e s o , o b te n id o c o n a n tic u e rp o s
an ti-S m , a n ti-R N P , S S -B u o tro s. D: p e rfil p e rif ric o p ro d u c id o p o r a n tic u e rp o s p o r a n tic u e rp o s a n ti-A D N d e d o b le c a d en a
o a n tic u e rp o s a n ti-m e m b ra n a n u c le a r. E : p erfil d e p u n te a d o fin o p r o d u c id o p o r a n tic u e rp o s a n ti-S S -A , e ste p e rf il p u ed e
d a rse ta m b i n c o n o tro s a u to a n tic u e rp o s. F: p e rfil n u e le o la r, q u e c o n fre c u e n c ia se o b s e rv a c o n s u e ro d e p a c ie n te s c o n esc le ro d e rm a . T a m b i n se o b s e rv a la r e g i n n u e le o la r d e s o rg a n iz a d a d e u n a c lu la en d iv is i n .

autoanticuerpos contra distintos antgenos del

organisiTio, variaciones en el nivel de comple
mento srico, presencia de complejos inmunes,
ininunidad mediada por clulas ligeramente al
terada e importantes lesiones en distintos rga
nos.
En el cuadro 28-12 se detallan los autoanti
cuerpos ms caractersticos presentes en LES.
A nticuerpos antinucleares. Aunque no to
dos estos anticuerpos son especficos del LES,
su presencia es un factor importante en el diag
nstico diferencial de las enfermedades del te
jido conectivo.
Una tcnica muy eiTipleada en la deteccin
de los ANAs es la inmunofluorescencia indi
recta utilizando como material nuclear hepatocitos de ratn obtenidos m ediante cortes al
cristato u homogeneizado del rgano. Se ob
serv que los resultados obtenidos con el uso
de este material eran de baja especificidad y
sensibilidad, por tal motivo fue reem plazado
por clulas H ep-2 en m etafase, lnea celular
proveniente de un epitelioma humano.
Existe una clara correlacin entre la presen
cia de anticuerpos circulantes contra ADN nati
vo y glom erulonefritis de tipo lpico, ya que
cuando la afeccin renal entra en remisin, el
nivel de anticuerpos anti-ADN desciende nota
blem ente. En pacientes que padecen LES y
presentan anticuerpos anti-ADN desnaturaliza

do, slo se demostr compromiso de piel, arti

culaciones y clulas sanguneas. Por otra parte,
los pacientes con LES severo presentan gene
ralmente lesiones renales, pleuritis, pericarditis
y compromiso del sistema nervioso central; en
estos casos es poco comtin la presencia sola
mente de anticuerpos anti-ADN desnaturaliza
do. Por lo tanto, la deteccin de anticuerpos anti-ADN nativo es de gran importancia para el
pronstico de esta enfermedad. Existe una gran
variedad de tcnicas que utilizan ADN nativo,
de distinto origen, como material antignico.

C u a d ro 28-12. P rincipales autoanticuerpos

presentes en LES
1) A n tic u e r p o s a n tin u c le a re s (A A N )
a) c o n tra n u c le o p ro te n a s
b ) c o n tra c id o d e s o x irrib o n u c le ic o (A D N )
c ) c o n tra c id o r ib o n u c le ic o (A R N )
d ) c o n tr a h isto n a
e ) c o n tra a n tg e n o s n u c le a re s e x tra c ta b le s ( E N A )
2) A n tic u e rp o s c o n tra a n tg e n o s R o y La.
3) A n tic u e r p o s a n ti-Ig G y a n ti-lg A (fa c to r r e u m a to id e o ).
4) A n tic u e r p o s a n ti-c ito p la s m tie o s
5) A n tic u e rp o s a n ti-e ritro c ito s
6) A n tic u e r p o s a n ti-fa c to re s d e la c o a g u la c i n
7) A n tic u e rp o s c o n tra a n tg e n o s r g a n o -e s p e c fic o s
8) A n tic u e rp o s a n ti-c o l g e n o
9 ) A n tic u e rp o s c o n tra m e m b ra n a b a sal g lo m e ru la r (M B G )

586

Inmunopatologa

La tcnica de inm unofluorescencia indirecta,

utilizando como sustrato Crithidia lucilliae fue
introducida por Aarden y col. en 1975. El uso
de este microorganismo se fundamenta en que
posee un cinetoplasto de gran tamao, rico en
ADN nativo. Es una tcnica simple y se pens
que era especfica para anticuerpos anti-ADN
nativo. Sin embargo, Deng y col. demostraron
que ocasionalm ente anticuerpos anti-histona
pueden unirse al cinetoplasma. Estudios adicio
nales indicaron que la expresin de histona era
funcin del ciclo de vida del microorganismo y
es detectada con ms facilidad dos das despus
de la iniciacin del cultivo. Este detalle debe
tenerse presente al utilizar esta metodologa p a
ra investigar anticuerpos anti-ADN nativo. Sin
embargo hay una buena correlacin entre esta
metodologa y la tcnica de Farr cuando ios t
tulos de anticuerpo estn relativamente eleva
dos.
Otras tcnicas utilizadas para la deteccin de
anticuerpos anti-ADN nativo son la hemaglutinacin de clulas taadas, fijacin de comple
mento, contrainmunoelectroforesis, unin espe
cfica del antgeno marcado (mtodo de Farr),
etctera.
A lgunos autores observaron poca correla
cin entre ensayos utilizando tcnicas diferen
tes, en la determinacin de anticuerpos antiADN; esto se debera a que, en cada ensayo se
miden anticuerpos de distintas afinidades y a la
posibilidad de reacciones cruzadas. La princi
pal diferencia se encuentra entre ensayos de fa
se slida, como el ELISA, que detecta una am
plia gama de anticuerpos de reaccin cruzada,
y ensayos de fase lquida, como la tcnica de
Farr, que detecta principalmente anticuerpos de
alta especificidad y afinidad. A lgunas de las
reacciones cruzadas son probablem ente debi
das a la estructura polianinica del ADN que
reaccionara con protenas cargadas positiva
mente como inmunoglobulinas. Por otra parte,
es interesante observar que anticuerpos antiADN reaccionan con molculas que presentan
grupos aninicos repetidos como heparn sul
fato y dextrn sulfato. La unin con el primero
sera de inters ya que es el principal protoglicano constituyente de la membrana basal glomerular.
La deteccin de anticuerpos anti-Sm tiene
gran importancia en el diagnstico de LES ya
que este anticuerpo es considerado un m arca
dor de dicha enfermedad. Los antgenos Sm y
RNP forman parte del antgeno nuclear extractable (ENA). La deteccin de estos antgenos
se realiza mediante tcnicas de inm unoprecipi
tacin. La tcnica de inm unotransferencia ha
mejorado la identificacin y caracterizacin de
los antgenos nucleares y perm ite una defini
cin ms precisa de la especificidad de anti

cuerpos para epitopes de los antgenos RNP y

Sm.
O tros anticuerpos detectados en LES. La
presencia de anticuerpos contra antgenos Ro y
La fue demostrada en pacientes con LES y Sn
drome de Sjgren. Ambos antgenos se encuen
tran en el citoplasma y el ntcleo celular. Los
anticuerpos contra estos antgenos parecen par
ticipar en la lesin renal de algunos pacientes
con LES.
Es frecuente encontrar anticuerpos anti-lgG,
y con menor frecuencia anticuerpos que reac
cionan con otros IgS.
En la actualidad se ha comenzado el estudio
de los anticuerpos contra antgenos de la mem
brana basal glomerular (MBG). Estos anticuer
pos seran inducidos como consecuencia de la
liberacin de antgenos del glomrulo, debido a
la lesin renal producida por el depsito de
complejos inmunes. Bemstein y colaboradores
realizaron estudios en pacientes con LES, de
mostrando la relacin directa entre la presencia
de anticuerpos contra MBG y nefritis.
Niveles de complemento srico y alteracio
nes inmunolgicas. En los casos ms severos
de esta enfermedad es frecuente la aparicin de
glom erulonefritis, la que suele estar asociada
con ttulos elevados de anticuerpos anti-ADN
nativo y niveles muy disminuidos de com ple
mento srico, pudiendo estar comprometidos
C l, C4, C2 y C3. Se observ que cuando los ni
veles de complemento total se normalizan, el
C4 perm anece ligeram ente dism inuido. M e
diante antisueros marcados se detect la presen
cia de complemento en los inm unocomplejos
depositados en el glomrulo. En esta enferme
dad, el complemento se puede activar tambin
por va alterna. Por otra parte, los niveles de
complemento srico son tiles para determinar
una presunta lesin renal en ausencia de mani
festaciones de glomerulonefritis, y son de ayuda
en el control del tratamiento ya que sus niveles
tienden a normalizarse al entrar en remisin la
enfermedad. Los glomrulos afectados reaccio
nan con diversas formas de compromiso histo
lgico, que pueden abarcar fenmenos proliferativos ya sea de tipo focal o difuso.
Las lesiones producidas se extienden a las
arteriolas renales y pueden comprometer los tbulos. Ocasionalmente se observan cuerpos de
hematoxilina en las zonas de lesin. Mediante
elucin de los anticuerpos comprometidos se
determin que son especficos para ADN nati
vo y modificado y ARN. En pacientes con alte
raciones neurolgicas y altos ttulos de anti
cuerpos anti-ADN se suele encontrar disminui
do el complemento srico con degeneracin del
colgeno y proliferacin de tejido elstico en la
dermis. En las lesiones de piel se detectaron
depsitos de inmunoglobulinas.

Autoinmunidad
En un 30% de los casos se presentan ade
ms, alteraciones a nivel de articulaciones, con
artritis deformante en las manos.
Inm unidad m ediada po r clulas. Al estudiar
los receptores linfocitarios se detect disminu
cin en nmero y proporcin de linfocitos T en
LES activo, y en algunos casos fue notable
tambin una disminucin de linfocitos B. Amasaki y col sugirieron que la expresin aumenta
da del antgeno Fas (CD95) en linfocitos T na
tivos y de memoria en sangre perifrica, sera
un posible mecanismo para explicar la linfopenia observada en pacientes afectados de LES.
Artritis reumatoidea
La artritis reumatoidea (AR) es la enferme
dad autoinmune ms comn; se halla am plia
mente distribuida tanto en adultos como en ni
os. En adultos el pico de incidencia se m ani
fiesta entre los 30 y 50 aos de edad y es entre
2 a 3 veces ms com n en m ujeres que en
hombres. Es una enfermedad crnica que afec
ta principalmente las articulaciones, con infla
macin, dolor, calor y tumefaccin de las m is
mas; los casos agudos estn acompaados de
aumento de la temperatura corporal. La AR es
un claro ejem plo de enfermedad autoinmune
sistmica, y es fcilmente reconocida como tal.
En contraste a las artralgias que aparecen en el
LES, puede culminar con deformacin y des
truccin de las articulaciones. La AR no est
confinada slo a las articulaciones, ya que nor
malmente est acompaada de una variedad de
alteraciones sistmicas como, por ejemplo, la
vasculitis. La vasculitis es causada por comple
jos inmunes formados por factor reumatoideo e
IgG y puede causar daos en piel, ojos y pul
mn. El curso de la enferm edad es variable,
pudindose dar casos de rem isiones espont
neas que persisten por varios tmos. Como en la
mayora de las enfermedades autoinmunes no
existe cura para la AR. El nico rol de los m e
dicamentos es reducir la inflamacin y, por en
de, el dolor y preservar la funcin de las articu
laciones para prevenir la invalidez. Los antiin
flamatorios no-esteroides como la aspirina son
las drogas ms comunes, aunque se han utiliza
do y se continan usando tratamientos con corticoides, sales de oro, penicilamina, metotrexate, etc. con diferentes resultados. Debido a la
toxicidad de estas drogas, slo se recu rre a
ellas en casos extremos.
La artritis es el resultado de una compleja in
teraccin entre las clulas sinoviales y leucoci
tos que infiltran desde la circulacin. La causa
principal de la lesiones en las articulaciones no
es conocida, ya que no son claros los m ecanis
mos que inician la inflamacin aguda de la si
novia. Se han identificado pptidos y m olcu

587

las de adhesin en las clulas sinoviales que

producen quimiotaxis de linfocitos y monocitos
a los espacios sinoviales. Las clulas sinoviales
en proliferacin expresan molculas de clase II
del M CH y co-estim ulan m olculas que au
mentan la activacin e infiltracin de LTh, con
la consiguiente estimulacin de LB del lquido
sinovial que finalmente sintetizan y liberan in
munoglobulinas. Algunos de estos anticuerpos
producidos localmente son de tipo IgG y tienen
actividad de factor reum atoideo y unen otras
molculas de IgG y forman complejos inmunes
que se depositan en las articulaciones. Estos in
munocomplejos activan la cascada del com ple
mento, iniciando de este modo el proceso infla
matorio. Las clulas responsables de la in fla
macin liberan proteasas lisosomales, radicales
de oxgeno y prostaglandinas que producen in
juria del colgeno y la matriz del cartlago de
las articulaciones. No todos los pasos de esta
secuencia han sido rigurosamente demostrados.
Si el factor reumatoideo contribuye a la lesin
y si la sinovitis depende de la activacin de LT,
son puntos que an deben ser aclarados.
El autoanticuerpo caracterstico de esta enfer
medad es el llamado factor reumatoideo (FR).
Generalmente es de tipo IgM y reacciona con el
Fe de la IgG. Por tal motivo este autoanticuerpo
puede unirse a la IgG normal circulante y for
mar complejos IgM-IgG, depositndose en las
articulaciones. Estos inmunocomplejos pueden
activar la cascada del complemento, producien
do una inflamacin crnica de las articulacio
nes. Debido a que el factor reumatoideo se halla
presente en el suero del 80 % de los pacientes,
su deteccin es muy til para el diagnstico de
la enfermedad y se lo considera un marcador de
la enfermedad, aunque se lo ha encontrado slo
en un 5-10% en pacientes jvenes y por otro la
do tambin se lo ha encontrado en pacientes con
infecciones bacterianas o parasitarias crnicas.
Investigaciones recientes han permitido hallar,
en pacientes con artritis reumatoidea, anticuer
pos tpicos del lupus eritematoso sistmico, in
clusive anti-ADN y anticuerpos anti-histona, sin
que presenten signos de esta enfermedad. Tam
bin se han encontrado anticuerpos anti-queratina y anti-perinuclerares.
Los inmunocomplejos que producen el FR,
por la unin con la IgG causan serios proble
mas de vasculitis sistmica, que ha sido asocia
da con la expresin homocigota del antgeno
del com plejo m ayor de h istocom patibilidad
H LA -D R pl. Se ha postulado que una deficien
cia en la actividad de la galactosil transferasa
de los linfocitos puede reducir la glucosilacin
de la regin C \ de la IgG. Esta glucosilacin
deficiente podra rendir a la molcula de IgG
inmunognica y estimular la produccin de an
ticuerpos anti-Cy (es decir produccin del FR).

588

Inmunopatologa

La asociacin de la artritis reurnatoidea con

el MHC est dada con las m olculas HLADR 1, HLA-DRw6 y HLA-DR4, y con algunos
subtipos particulares en determinados grupos
tnicos. Estudios moleculares han demostrado
una fuerte relacin entre la susceptibilidad por
esta enfermedad y la molcula D R pl. Los tres
alelos conocidos de esta m olcula, que estn
asociados a la susceptibilidad, presentan una se
cuencia comn de Gln-Lys-Arg-Ala-Ala o GlnArg-Arg-Ala-Ala en la tercera regin de variabihdad de la cadena (3 (residuos 67-71). Esta re
gin puede constituir la regin de la molcula
del MHC que interacte con el TCR y por lo
tanto influenciar al LT a una particular selec
cin o reconocimiento. La tercera zona variable
de la cadena (3 de las molculas de clase II de
las ratas BB endocriadas tambin presentan una
secuencia caracterstica (motif); la inm uniza
cin de estos animales con colgeno humano
provoca una intensa respuesta inmune y artritis
severa, lo que estara demostrando la importan
cia de esta secuencia en esta regin para el de
sencadenamiento de la patologa en cuestin.
Dermatomiositis y polimiositis
Es una enferm edad que afecta a nios y
adultos; clnicamente se presenta con debilidad
muscular a veces precedida de fiebre y puede
estar afectado cualquier msculo esqueltico,
aunque los involucrados ms comnmente sue
len ser los msculos proxim ales de brazos y
piernas. Los dolores musculares, las manifesta
ciones cutneas con eritema y descamacin so
bre los nudillos de manos y pies y erupciones
papilares en la cara y prpados son caractersti
cas comunes de esta enfermedad. Se desconoce
la relacin, pero hay evidencias de carcinoma,
en aproximadamente el 20% de los adultos, an
tes o despus de la aparicin de la dermatomio
sitis.
Los autoanticuerpos presentes en el suero de
pacientes con m iositis reaccionan p rin cip al
mente con antgenos citoplasmticos, razn por
la que la tradicional determinacin de ANA en
estos pacientes es generalm ente negativa. Si
hay sospecha de miositis se deben realizar am
bos tests; ANA y ENA. Ms del 90% de pa
cientes con miositis presentan algn autoanticuerpo detectable. El autoanticuerpo ms cono
cido asociado con miositis, es el anti-Jol, que
reacciona con la enzima citoplasmtica histidil
ARNt sintetasa (HRS), enzima que cataliza la
unin de histidina a su ARNt especfico. El au
toanticuerpo anti-Jol pertenece a una fam ilia
caracterstica de autoanticuerpos, presentes en
el suero de pacientes con miositis, que reaccio
nan con diferentes ARNt sintetasas; por ejem
plo han sido detectados autoanticuerpos que

reaccionan con 5-am inoacil A RN t sintetasas,

para histdina, treonina, glicina, isoleucina y
alanina. Todos ellos slo han sido detectados
en pacientes con miositis y todos asociados con
una alta incidencia de alteraciones en pulmn.
En el suero de pacientes con miositis tam
bin pueden encontrarse autoanticuerpos contra
protenas relacionadas con factores de transla
cin, como ser anticuerpos anti-KJ, mientras
que otros autoanticuerpos parecen estar dirigi
dos contra la partcula de reconocim iento de
seales, un complejo macromolecular que diri
ge la secrecin de protenas del retculo endeplasmtico.
Autoanticuerpos especficamente asociados
con miositis son: Anti-histidil ARNt sintetasa
(Jo- 1), anti-treonil ARNt sintetasa (Pl 7), antialanil ARNt sintetasa (Pl 12), anti-glicil ARNt
sintetasa (EJ), anti-isoleucina ARNt sintetasa
(OJ), anti-Partcula de seal de reconocimiento
(SRP) y anti-Eactor de traslacin de elongacin
(KJ).
Ciertos sndromes que se superponen poseen
m arcadores especficos, por ej. los autoanti
cuerpos PM/Scl y Ku, estn asociados con la
superposicin de los sndromes miositis y escleroderm ia. La m io sitis puede acom paar
otras alteraciones del tejido conectivo, como
ser escleroderma, artritis reumatoidea, LES, SS
y sndrome mixto del tejido conectivo, pero en
estos casos la miositis es generalmente suave y
los autoanticuerpos presentes son los marcado
res del sndrome primario.
Los autoanticuerpos asociados a la miositis,
particularmente los anti-sintetasas parecen de
finir subgrupos de miositis. El 66% de pacien
tes que presentan en su suero anticuerpos antiJol son HLA-DR3+, comparados con el 22%
de los pacientes que no presentan a n ti-Jo l.
Aquellos pacientes tambin presentan altera
ciones respiratorias tpicas, artritis y fenmeno
de Raynaud (desorden circulatorio secundario
asociado a un desorden vascular primario).
Hasta tanto no haya datos acerca de los m e
canismos por los que, algunos autoanticuerpos
especficos de la miositis son patognicos para
las fibras musculares, la deteccin de estos an
ticuerpos provee informacin valiosa para el
diagnstico y pronstico de la enfermedad. El
anti-Jol en particular es importante ya que pue
de predecir el desarrollo de la enfermedad. Los
niveles de anti-Jol son independientes de los
n iv eles de IgG total y pueden d e sap arecer
cuando la enfermedad entra en remisin. Los
tradicionales ensayos de inmunodifusin slo
detectan el 25% de anti-Jol en suero de pacien
tes con m iositis, m ientras que el ensayo de
ELISA detecta el 44%.
La asociacin especfica entre miositis y au
toanticuerpos contra protenas relacionadas con

Autoinmunidad
factores de elongacin y traslacin ha generado
una serie de hiptesis relacionadas con algunos
virus y las enzim as antes m encionadas. Hay
evidencias de la estrecha relacin entre la mio
sitis y algunos enterovirus en especial infec
cin por Coxsackie B. Estos virus pueden tener
estructuras ARNt similares en su genoma. Una
hiptesis para la induccin de anticuerpos antisintetasas sugiere que puede formarse un com
plejo macromolecular de sintetasa-aminocidovirus y actuar como neoantgeno y rom per la
tolerancia a lo propio con la siguiente produc
cin de autoanticuerpos anti-sintetasa. Una se
gunda hiptesis sugiere que los anticuerpos anti-Jo 1 actan como anticuerpos antiidiotipo
para los anticuerpos anti-virus, los que podran
unirse a la enzima. Una tercera hiptesis sugie
re que las protenas virales podran mimetizar a
la enzima y los anti-Jo 1 unirse a sta.
Esclerodermia
La esclerodermia es una enfermedad que se
manifiesta por el depsito excesivamente anor
mal de colgeno en la piel. Afecta a personas
de edad media, en especial mujeres, y se pre
senta inicialmente con problemas vasculares en
la punta de los dedos de manos y pies, luego
continan en la cara, cuello, la parte superior
del trax, difundindose hacia las extrem ida
des. Se produce engrosamiento de la dermis y
el tegumento resulta invadido; tambin son fre
cuentes los cambios degenerativos con fibrosis
e inflamacin de piel, sinovia y algunos rga
nos. En ms del 50% de los pacientes el fen
meno de Raynaud precede el comienzo de la
enfermedad; cuando va asociado a calcinosis,
dismotilidad esofgica, esclerodactiha y telan
giectasia, suelen detectarse anticuerpos anticentrmero.
Los tres autoanticuerpos ms caracterizados
asociados a esclerodermia son Scl-70, anticuer

589

pos anti-centrmero y anticuerpos anti-nucleolares (cuadro 28-13). Ms del 90% de los pa

cientes con ecleroderma, presentan en el suero
anticuerpos anti nucleares.
A nticuerpos anti-Scl-70. Estos anticuerpos
son llamados as porqu reconocen una prote
na nuclear de 70 kD; actualmente se sabe que
es la enzima nuclear topoisomerasa L Aproxi
madamente el 20-50% de los pacientes con es
clerodermia presentan en el suero anticuerpos
Scl-70, cuando son detectados por el ensayo
tradicional de inm unoprecipitacin. C uando
fue utilizado el ensayo de ELISA con la topoi
somerasa purificada, la deteccin de autoanti
cuerpos se increment al 70%. Los pacientes
con escleroderm ia que presentan anticuerpos
Scl-70, tienden a tener un curso ms severo de
la enfermedad. Estos anticuerpos son raram en
te hallados en otras enfermedades, por lo tanto
su deteccin es altamente significativa.
La importancia de la identificacin de la to
poisomerasa I como autoantgeno en la esclero
dermia difusa promueve a interesantes hipte
sis. El anormal funcionamiento de esta enzima
podra incrementar la expresin de genes del
colgeno de piel, ya que aparentemente la to
poisomerasa I se une frecuentemente a cuatro
genes de colgeno fibrilar y tres de ellos estn
relacionados con la expresin del colgeno de
piel. Por lo tanto este podra ser un mecanismo
de patognesis de la enfermedad. Por otro lado,
dentro de la secuencia de la topoisom erasa I
existe un epitope de seis aminocidos sim ilar a
varias protena retrovirales, sugiriendo una mimetizacin molecular.
A nticuerpos anticentrm ero (ACA). Estos
autoanticuerpos producen un perfil caractersti
co en inm unofluorescencia indirecta p o r su
unin con la regin centromrica del crom oso
ma. L a ms fuerte asociacin de los A CA y
con ttulos ms elevados es con el fenmeno de
Raynaud. La inm unotransferencia rev ela que

C uadro 28-13. Anticuerpos antinucleares y antinucleolares en esclerodermia y mtodos ele de

teccin
Inm unofluorescencia

Inm unodifusin

N aturaleza del cmtgeno

N ucleares
G ra n u la d o d ifu s o
C e iilr m e ro /k in e to c o re
P u n te a d o fin o
P u n te a d o g ru e s o
H om ogneo
M a n ch a s

S c l-7 0

A s o c ia d o a c ro m o s o m a
( p ro te n a d e 7 0 kD )
d e n tro o f u e r a d e k in e to c o re
-

P ro b a b le m e n te c e n tro lo

N ucleolares
H om ogneo
G ru m o s
P u n te ad o

4 S -6 S A R N

P ro b a b le m e n te U3 A R N

....

590

Inmunopatologa

los sueros con ACA reconocen tres polipptidos cromosomales de 17 kD, 80 kD y 140 kD.
Los anticuerpos contra la protena de 80 kD,
llamada CENP-B estn presentes en todos los
sueros ACA positivos, mientras que aparecen
con ttulo y frecuencia baja los anticuerpos di
rigidos contra las molculas de 17 kD (CENPA )y 140kD (CENP-C).
Anticuerpos anti-nucleolares. La designa
cin de anticuerpos anti-nucleolares puede es
tar referida a diferentes antgenos nucleolares
(ADN, histonas, Sm, Scl-70 etc.); el trmino de
anticuerpos anti-nucleolares describe un grupo
heterogneo de autoanticuerpos caractersticos
de la escleroderm ia. Los ms caracterizados
son los anti-fibrilarina, anti-P M /S cl y antiARN polimerasa 1. Cada uno de ellos tiene una
asociacin clnica con diferentes subgrupos de
pacientes con esclerodermia. Anticuerpos antifibrilarina unen una protena de 34 kD rica en
dimetilarginina (fibrilarina), parte del complejo
nucleolar U3 RNP. Estos anticuerpos parecen
estar asociados con pacientes del sexo masculi
no que p resentan esclero d erm ia con lig ero
compromiso articular. Los anticuerpos contra
el complejo PM/Scl aparecen en pacientes con
esclerodermia asociada a miositis, con un com
promiso renal incrementado. Los anticuerpos
anti-ARN polmera 1 estn asociados a un pe
queo subgrupo de pacientes con escleroder
mia que envuelve rganos internos, incluyendo
desrdenes renales. La deteccin y caracteriza
cin de autoanticuerpos asociados con esclero
dermia es de importante diagnstico y prons
tico y deben ser determinados en forma tem
prana cuando los pacientes presentan una su
gestiva sintomatologa, en particular el fen
meno de Raynaud.
Sndrome Primario de Sjgren (SS)
El concepto clnico de Sndrome primario de
Sjgren es confuso, por lo tanto necesita ser
clarificado antes de hablar de los autoanticuer
pos relacionados. Se debe diagnosticar el SS
cuando no hay un claro compromiso del tejido
conectivo como ser AR, LES o esclerodermia.
El SS puede aparecer como una simple seque
dad ocular o bucal hasta un severo desorden
con infiltrado linfoctico de piel, intestino y
msculo, con incremento de incidencia de lin
fom a y vaseulitis sistm ica. Los anticuerpos
antinucleares SS-A/Ro y SS-B/La son m arca
dores caractersticos del SS primario.
Anticuerpos SS-B. Los autoanticuerpos SSB reconocen a una protena nuclear de 48 kD
(SS-B) que acta como cofactor para la ARN
polimerasa III. El antgeno est asociado tam
bin con todas los ARN transcriptos por ARN
polim erasa III, incluyendo tARNs, ARNs 5S

ribosomal y ARNs viral codificado por la ARN

polimerasa III del husped, incluyendo el virus
de Epstein-Barr 1 y 2.
La deteccin de la presencia de los anticuer
pos SS-B en los sueros de pacientes con SS pri
mario es muy variado y oscila entre el 40 y
96%. Estos autoanticuerpos tam bin fueron
descritos en una poblacin de pacientes con
SLE.
Como otros autoanticuerpos, los anti-SS-B
constituyen una variedad de anticuerpos que re
conocen diferentes molculas SS-B, algunas de
las cuales han sido mapeadas y se conocen los
sitios de unin para el anticuerpo. Recientemen
te se ha demostrado que la formacin de anti
cuerpos anti-SS-B parece estar dirigida, en un
comienzo hacia la porcin amino-terminal de la
molcula SS-B, desarrollndose finalmente una
respuesta autoinmune contra la molcula entera.
Se ha postulado que una infeccin viral podra
originar una reaccin cruzada dirigida inicial
mente hacia un simple epitope, con la posterior
diversificacin de la respuesta autoinmune.
A n ticu erpos SS-A. E xisten por lo m enos
cuatro anticuerpos que constituyen una com
pleja serie de autoanticuerpos que reaccionan
con cuatro protenas d iferentes. La tcn ica
usualmente utilizada en laboratorio para la de
teccin de estos anticuerpos, como es la doble
difusin en agar (Outcherlony) no puede distin
guir este conjunto de anticuerpos SS-A. La in
m unotransferencia con extractos solubles de
clulas nucleadas puede poner en evidencia dos
protenas SS-A de peso m olecular diferente,
una de 60 kD y otra de 53 kD. Cuando se utili
zan eritrocitos como fuente antignica los sue
ro de pacientes que presentan anticuerpos antiSS-A reconocen dos protenas de peso molecu
lar de 54 kD o 60 kD, y son antignicamente
diferentes de los antgenos SS-A provenientes
de las clulas nucleadas. En el cuadro 28-14 se
enumeran las diferentes patologas asociadas a
los antgenos SS-A y SS-B.
Bonfa y col. han mostrado que pacientes con
psicosis secundaria a LES tenan anticuerpos
anti-ribosomales, pero la mitad de los pacientes
con LES, y que formaban anticuerpos anti-ribosomales no tenan psicosis; esto claramente
demuestra que dichos anticuerpos no son sufi
cientes para producir la enfermedad. Sin em
bargo la precisa medicin de los anticuerpos
anti-ribosomales es clnicamente necesaria para
poder distinguir entre eventos psicticos no re
lacionados, psicosis inducida por drogas y lu
pus-psicosis. Estudios longitudinales de anti
cuerpos anti-ribosomales han revelado que es
tos anticuerpos aparecen antes y durante la fase
activa de la psicosis. Anticuerpos anti-ribosomales han sido detectados en el lquido espinal
de pacientes con lupus-psicosis. Otros invest-

Autoinmunidad

591

Cuadro 28-14. Asociacin de los autoanticuerpos Ro/SS-A y LaJSS-B con enfermedades autoin
munes sistmicas
Anti-Ro/SS-A

Anti-La/SS-B
%

%
D esrdenes clnicos
S n d ro m e d e S jo g re n
P rim a rio
S e c u n d a rio
LES
L E S c o n A N A n e g a tiv o
L E c u t n e o s u b a g u d o (S C L E )
su p e rp o s ic i n d e SS y S C L E
L E d isc o id e (D L E )
L E n e o n a ta l (N L E )
B lo q u e c a rd a c o n e o n a ta l
D e fic ie n c ia d e C 2 y C 4
C irro sis b ilia r p rim a ria
H e p a titis c r n ic a a c tiv a
C o n tro le s n o rm a le s

ID

ELISA

ID

E L IS A

60

95

20

90
5

20
25
62
62
100
3
90
80
80
raro
raro

0,1

10
90

32
25

100

10

50

50

10
10

0,1

ID : in m u n o d ifu si n , E L IS A : en z im o in m u n o an lisis

gadores no han hallado una relacin entre estos

anticuerpos y psicosis, pero recientes hallazgos
soportan fuertemente esta asociacin. El lupus
cerebral, es un desorden heterogneo con m ani
festaciones locales y difusas, con la probable
presencia de autoanticueipos no solo ribosomales sino de otros tipos como por ejemplo anticardiolipina. Concluyendo, los anticuerpos anti-ribosomales pueden ser de importancia para
el seguimiento de un grupo especfico de lupus
cerebral.
6. CLONADO MOLECULAR
DE A UTO A N TG EN O S
Para los ensayos de inmunodifusin se utili
zan mezclas crudas de antgenos provenientes
de tejidos (timo de conejo o bazo humano) o l
neas celulares. Estos ensayos generalmente son
de poca sensibilidad y no detectan todos los au
toanticuerpos. Autoantgenos bioqumicamente
purificados pueden estar contaminados con tra
zas de otros autoantgenos, particularm ente
cuando los mismos existen naturalmente como
complejos macromoleculares como ser RNP y
Sm o SS-A y SS-B.
En la actualidad existe ADN clonado de al
gunos de los autoantgenos ms importantes re
lacionados con escleroderm ia, miositis y SS.
Estos incluyen (U l) RNP protenas 70kD; las
protenas Sm B /B , D, E y N; el autoantgeno
de la esclerodermia. Sel 70 y centrmero B; el
autoantgeno de la miositis Jo-1 y los autoant
genos de la SS, SS-B y tres de SS-A. Estos an
tgenos clonados estn siendo utilizados en en
sayos de ELISA para deteccin de ANAs espe
cficos.

Tericamente una preparacin de un autoan

tgeno obtenido por clonacin puede garantizar
la pureza del mismo y por lo tanto eliminar fal
sos positivos. Sin embargo experiencias in d i
can que ain existen problemas no resueltos en
el uso de autoantgenos recombinantes utiliza
dos en tcnicas de ELISA. Es muy frecuente el
reconocimiento de epitopes conformacionales,
especialm ente en el caso de anticuerpos antiRNP y SS-A que reaccionan slo con antgenos
que presentan la estructura tridimensional nati
va, por lo tanto no reconocern antgenos recom binantes. En ensayos de inm unodifusin
que usan extractos crudos, estn presentes los
autoantgenos en su estado nativo, por tal m oti
vo, a pesar de ser una tcnica poco sensible, se
sigue utihzando como control de los otros m
todos.
7. T R A T A M IE N T O DE LAS
ENFERMEDADES AUTOINM UNES
La mayor parte de la investigacin bsica y
aplicada que se realiza en las enfermedades au
toinmunes est orientada a la inmunoterapia de
las mismas. La tolerancia inducida por aplica
cin del antgeno especfico puede ser utilizada
para prevenir la induccin de una enfermedad
autoinmune y para tratar un estado autoinmune
previamente establecido. Esto ha sido am plia
mente utilizado en modelos experimentales. En
ratones SJL/ y en ratas Lewis la EAE, experi
mentalmente inducida y donde se haban pro
ducido fenmenos de parlisis, pudo ser total
mente inhibida por aplicacin de esplenocitos
u n id o s a h o m o g e n a to de c o rd n e s p in a l
(MSCH) y parcialmente inhibida si los espe-

592

Inmunopatologa

nocitos se unan a la protena bsica de mielina

(MBP), ya que la remisin observada en este
ltimo caso fue temporal. Esto se podra expli
car pensando que la inhibicin se debera a la
aplicacin de MBP y que las posteriores mani
festaciones se podran deber a otros neuroantgenos tales como el PLP (poli-lipoprotena),
MAG y MOG (glucoprotenas asociadas a la
mielina). Estos seran expuestos al sistema in
mune perifrico como consecuencia del dao
de la mielina y de la apertura de la barrera hematoenceflica por las linfocitos T CD4-t-, du
rante el perodo agudo de la enfermedad. Se
puede pensar que estos son determinantes crp
ticos y que son inhibidos por el MSCH ya que
tiene MBP y los otros neuropptidos.
Un tratamiento que se est estudiando mu
cho es la induccin de resistencia a la enferme
dad por administracin de dosis subpatognicas
de clulas T autoinmunes (vacunacin con lin
focitos T). En estudios tem pranos la vacuna
cin con linfocitos T fue obtenida utilizando
linfocitos T activados que se atenuaban por
irradiacin, por presin hidrosttica o por com
puestos qumicos. Estos mtodos de atenuacin
causan cambios cuahtativos en las clulas T y
aunque se administre un gran nmero de linfo
citos T no se induce enfermedad. Se pudo ob
servar que la vacunacin con dosis bajas de lin
focitos T anti-MBP activa las clulas T antiidiotipo de ambos fenotipos: CD4+ y CD8+. E s
to tambin fue demostrado en pacientes con es
clerosis mltiple.
Una estrategia muy utilizada en el tratamien
to de enfermedades autoinmunes es la aplica
cin de anticuerpos contra determinadas citoquinas. En algunas enfermedades como la artri
tis reum atoidea hay citoquinas consideradas
pro-inflamatorias en la articulacin reum atoi
dea, entre las que se incluyen del TNE-a, IL-1,
IL-6, IL-8 y el GM-CSF. Estas citoquinas ac
tuaran en cascada y la estrategia inmunoteraputica es tratar de bloquear alguna de las citoquinas para evitar el efecto de todas ellas. Un
tratamiento muy utilizado es la aplicacin de
anticuerpos contra el T N F-a en algunos casos
asociado a anticuerpos anti-IL-10 o anti-CD4
para lograr una accin sinrgica.

B IB L IO G R A F A
1. A m a sak i Y ., K o b a y a sh i J., T a k e d a T ., O g u ra N ., Jo d o
S., N a k a b a y a s h i T ., T s u tsu m i A ., F u jis a k u A , a n d K o ire T. U p -re g u ia te d e x p re s i n o f F a s a n tig e n (C D 9 5 ) by
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o f in v itro c y to k in e p ro d u c tio n b y r h e u m a to id s y n o v ia l
tis s u e s d e m o s tra tin g d iffe re n t p a tte rn s o f m o n o n u c le a r
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D e rm a to l. 1 0 :4 3 1 -4 4 1 , 1993,

Estructura y funcin del complejo

mayor de histocompatibilidad

29

M. LEONARDO SATZ
LEONARDO FAINBOIM

Antecedentes histricos
Como hemos visto en el captulo 10, las mo. lculas de histocompatibilidad (MHC) cumplen
un papel crucial en la presentacin de antge
nos para la activacin de las clulas T. Sin em
bargo, la secuencia de sucesos que condujeron
a este descubrimiento estuvieron enmascarados
por su seudo funcin, que es la de servir co
mo barrera principal al trasplante de rganos y
tejidos.
La disponibilidad de cepas endocriadas faci
lit el rpido conocimiento del complejo mayor
de histocompatibilidad (CMH) murino o H-2.
En el caso del CMH humano, denominado sis
tema HLA, la situacin fue diferente. A partir
del descubrimiento de las molculas HLA, los
estudios de gentica de poblacin fueron los
que permitieron definir el polimorfismo del sis
tema.
El primer antgeno HLA fue descubierto en
1958. Dausset identific en el suero de un pa
ciente politransfundido, anticuerpos leucoaglutinantes, cuyo patrn de reactividad perm iti
identificar el antgeno denominado Mac. Este
antgeno corresponde al hoy conocido com o
HLA-2. En el mismo ao 1958, los laboratorios
de Payne y van Rood, comprobaron que m uje
res con em barazos miiltiples producan an ti
cuerpos contra aloantgenos del padre expresa
dos codom inantem ente por el feto. En 1963,
van Rood y van Leeuwen describen el sistema
4 , form ado por 2 alelos, el 4a y el 4b. En
1964, Payne y col. describen una serie de ant
genos denominados LA. Esta serie LA y el sis
tema 4 corresponden a los loci hoy conocidos
como HLA-A y HLA-B, respectivamente.
El paso sig u ien te que p rovoc el rp id o
avance en el conocim iento del HLA fue la

creacin de los Talleres Internacionales de H is

tocompatibilidad. En ellos, cientos de laborato
rios intercambian reactivos (clulas, anticuer
pos, etc.) y realizan estudios colaborativos con
protocolos estandarizados, que permiten identi
ficar nuevos alelos HLA. El primero de ellos se
realiz en Durham en 1964, el XI en Y okcha
ma en 1991 y se trabaja actualmente p a ra el
XII Taller, que finalizar en 1996.
Estructura y distribucin de las molculas
de histocompatibilidad
M olculas de clase I
Estructura: Tal como se escribi en el cap
tulo 10, las MHC de clase I estn constituidas
por dos cadenas, una pesada, a , unida no cova
lentemente a una cadena llamada }32Tmicroglobulina. Slo la cadena a est codificada dentro
del sistema HLA.
Productos de clase 1. En el hombre existen
tres M HC de clase I distintas, denom inadas
HLA-A, HLA-B y HLA-C, que cumplen la fun
cin de presentacin de pptidos a los linfoci
tos T CD8. Las tres se expresan sim ultnea
mente en la superficie de casi todas las clulas,
con excepcin de los glbulos rojos y el sinci
tio trofoblasto. Estas molculas poseen diferen
tes cadenas pesadas pero comparten la mism a
cadena-p2 microglobulina. Las cadenas estn
codificadas por sendos loci A, B y C localiza
dos dentro del sistema HLA (fig. 29-1).
Una de las caractersticas ms salientes de
estas molculas es su enorme polimorfismo pohlacional. Se estima que existen ms de 40 ale
los distintos para la molcula HLA-A, m s de
80 alelos diferentes para HLA -B y ms de 30
para HLA-C. Teniendo en cuenta que la expre-

592

Inmunopatologa

nocitos se unan a la protena bsica de mielina

(MBP), ya que la remisin observada en este
ltimo caso fue temporal. Esto se podra expli
car pensando que la inhibicin se debera a la
aplicacin de MBP y que las posteriores mani
festaciones se podran deber a otros neuroantgenos tales como el PLP (poli-lipoprotena),
MAG y MOG (glucoprotens asociadas a la
mielina). Estos seran expuestos al sistema in
mune perifrico como consecuencia del dao
de la mielina y de la apertura de la barrera hematoenceflica por las linfocitos T CD4-t-, du
rante el perodo agudo de la enfermedad. Se
puede pensar que estos son determinantes crp
ticos y que son inhibidos por el MSCH ya que
tiene MBP y los otros neuropptidos.
Un tratamiento que se est estudiando mu
cho es la induccin de resistencia a la enferme
dad por administracin de dosis subpatognicas
de clulas T autoinmunes (vacunacin con lin
focitos T). En estudios tem pranos la vacuna
cin con linfocitos T fue obtenida utilizando
linfocitos T activados que se atenuaban por
irradiacin, por presin hidrosttica o por com
puestos qumicos. Estos mtodos de atenuacin
causan cambios cuahtativos en las clulas T y
aunque se administre un gran nmero de linfo
citos T no se induce enfermedad. Se pudo ob
servar que la vacunacin con dosis bajas de lin
focitos T anti-MBP activa las clulas T antiidiotipo de ambos fenotipos: CD4+ y CD8+. E s
to tambin fue demostrado en pacientes con es
clerosis mltiple.
Una estrategia muy utilizada en el tratamien
to de enfermedades autoinmunes es la aplica
cin de anticuerpos contra determinadas citoquinas. En algunas enfermedades como la artri
tis reum atoidea hay citoquinas consideradas
pro-inflamatorias en la articulacin reum atoi
dea, entre las que se incluyen del TN F-a, IL-1,
IL-6, IL-8 y el GM-CSF. Estas citoquinas ac
tuaran en cascada y la estrategia inmunoteraputica es tratar de bloquear alguna de las citoquinas para evitar el efecto de todas ellas. Un
tratamiento muy utilizado es la aplicacin de
anticuerpos contra el T N F-a en algunos casos
asociado a anticuerpos anti-IL-10 o anti-CD4
para lograr una accin sinrgica.

B IB L IO G R A F A
L A m a sak i Y ., K o b a y a sh i J., T alceda T ., O g u ra N ., Jo d o
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Estructura y funcin del complejo

mayor de histocompatibilidad

29

M. LEONARDO SATZ
LEONARDO FAINBOIM

Antecedentes histricos
Como hemos visto en el captulo 10, las mo. lculas de histocompatibilidad (MHC) cumplen
un papel crucial en la presentacin de antge
nos para la activacin de las clulas T. Sin em
bargo, la secuencia de sucesos que condujeron
a este descubrimiento estuvieron enmascarados
por su seudo funcin, que es la de servir co
mo barrera principal al trasplante de rganos y
tejidos.
La disponibilidad de cepas endocriadas faci
lit el rpido conocimiento del complejo mayor
de histocompatibilidad (CMH) murino o H-2.
En el caso del CMH humano, denominado sis
tema HLA, la situacin fue diferente. A partir
del descubrimiento de las molculas HLA, los
estudios de gentica de poblacin fueron los
que permitieron definir el polimorfismo del sis
tema.
El primer antgeno HLA fue descubierto en
1958. Dausset identific en el suero de un pa
ciente politransfundido, anticuerpos leucoaglutinantes, cuyo patrn de reactividad perm iti
identificar el antgeno denominado Mac. Este
antgeno corresponde al hoy conocido com o
HLA-2. En el mismo ao 1958, los laboratorios
de Payne y van Rood, comprobaron que m uje
res con em barazos m ltiples producan an ti
cuerpos contra aloantgenos del padre expresa
dos codom inantem ente por el feto. En 1963,
van Rood y van Leeuwen describen el sistema
4 , form ado por 2 alelos, el 4a y el 4b. En
1964, Payne y col. describen una serie de ant
genos denominados LA. Esta serie LA y el sis
tema 4 corresponden a los loci hoy conocidos
como HLA-A y HLA-B, respectivamente.
El paso sig u ien te que p rovoc el rp id o
avance en el conocim iento del HLA fue la

creacin de los Talleres Internacionales de H is

tocompatibilidad. En ellos, cientos de laborato
rios intercambian reactivos (clulas, anticuer
pos, etc.) y realizan estudios colaborativos con
protocolos estandarizados, que permiten identi
ficar nuevos alelos HLA. El primero de ellos se
realiz en Durham en 1964, el XI en Yok cha
ma en 1991 y se trabaja actualmente p a ra el
XII Taller, que finalizar en 1996.
Estructura y distribucin de las molculas
de histocompatibilidad
M olculas de clase I
Estructura: Tal como se escribi en el cap
tulo 10, las MHC de clase I estn constituidas
por dos cadenas, una pesada, a , unida no cova
lentemente a una cadena llamada }32Tmicroglobulina. Slo la cadena a est codificada dentro
del sistema HLA.
Productos de clase 1. En el hombre existen
tres M HC de clase I distintas, denom inadas
HLA-A, HLA-B y HLA-C, que cumplen la fun
cin de presentacin de pptidos a los linfoci
tos T CD8. Las tres se expresan sim ultnea
mente en la superficie de casi todas las clulas,
con excepcin de los glbulos rojos y el sinci
tio trofoblasto. Estas molculas poseen diferen
tes cadenas pesadas pero comparten la mism a
cadena-p2 microglobulina. Las cadenas estn
codificadas por sendos loci A, B y C localiza
dos dentro del sistema HLA (fig. 29-1).
Una de las caractersticas ms salientes de
estas molculas es su enorme polimorfismo pohlacional. Se estima que existen ms de 40 ale
los distintos para la molcula HLA-A, m s de
80 alelos diferentes para HLA-B y ms de 30
para HLA-C. Teniendo en cuenta que la expre-

594

Inmunopatologa

Clase I

Clase I
DQ

DP

DR

>
OJ
<
CVJ

Centrmero

_J

-S-----------

CQ <
cc cr
o Q

<<

Q . DQ Q

1.000

CD < ^
I - T - LiC\j CNJ CD

<

CD <
OJ
OO

CD

2.000

Distancia (kb)
Clase I

2000

3000

H G

Telmetro
----------
4000
Distancia (kb)

F ig , 2 9 -1 . O rg a n iz a c i n g e n tic a d e l s is te m a H L A . S e in d ic a n las re g io n e s d e c la s e L II y III. E n la re g i n d e c la s e I, v e

c in o s al lo c u s H L A -A e x is te n s e u d o g e n e s d e c la s e I n o m o stra d o s . E n la r e g i n d e c la s e 111, el g e n G 7 a c o d ific a p a ra v a lilt-R N A s in te ta sa . L a c o m p le jid a d d e la r e g i n d e c la s e II (re fe rid o a g e n e s D R B ) v a ra s e g n el h a p lo tip o (v a s e fig . 2 9 -2 ).
L a s fle c h a s s o b re c a d a g e n in d ic a n la o rie n ta c i n d e tra n s c rip c i n 5 - ^ 3 .

sin de estas molculas es codominante (vale

decir se expresan simultneamente las molcu
las codificadas por el crom osom a m aterno y
paterno), el multialelismo determina que la ma
yora de los individuos sean heterocigotas y ex
hiban en la superficie celular seis productos de
clase I diferentes: dos molculas HLA-A, dos
HLA-B y dos HLA-C.
Polimorfism o. El principal mtodo que ha
permitido la identificacin de las diversas va
riantes allicas ha sido la serologa, esto es, la
identificacin en estas m olculas de epitopes
diferentes por medio de anticuerpos. Las MHC
de clase 1, independientemente del alelo o del
locus al que pertenecen, poseen una gran ho
mologa estructural. Esto determina la existen
cia de numerosos epitopes comunes en las di
versas m olculas; debido a esta reactividad
cruzada, al comienzo result difcil distinguir
los productos alhcos derivados de un mismo
locus, de los codificados por los diversos loci
A,B y C.
Los aloanticuerpos presentes en el suero de
individuos politransfundidos y en mujeres lue
go de mltiples embarazos siguen siendo utili
zados hoy para identificar a las diversas varian

tes de las molculas HLA, a las que se llama

especificidades serolgicas.
Ntese en el cuadro 29-1 que las distintas es
pecificidades serolgicas HLA-A y HLA-B son
d esig n ad as por n m eros, por ej. H LA -A 1,
HLA-B7, etc. Todas las especificidades del lo
cus HLA-C se numeran consecutivamente e in
cluyen una w para distinguirlos de los pro
ductos C2 y C4 del sistema complemento, cu
yos genes m apean dentro del sistem a HLA
(vase ms adelante).
Adems de los mtodos serolgicos, los pro
ductos alhcos de las molculas HLA pueden
ser distinguidos por otros mtodos: clones de
linfocitos T citotxicos, isolectroenfoque de las
protenas, patrones de restriccin en el ADN
(RFLP) y secuencia nucleotdica de los genes
aislados. Esto ha revelado la existencia de ale
los no distinguibles por serologa: por ejemplo
existen trece subtipos del HLA-A2, ocho va
riantes allicas del HLA-B27, etc. La determi
nacin de la secuencia nucleotdica de los res
pectivos genes demostr que las diversas va
riantes difieren entre s en unos pocos amino
cidos, lo que exphca la dificultad de distinguir
los por anticuerpos.

Estructura y funcin del complejo mayor de histocompatibilidad

La presencia de estos verdaderos nuevos ale
los HLA de clase I, indica que la serologa re
fleja la punta de un iceberg de un sistema de
mucha mayor complejidad. La posibilidad de
distinguir estos alelos por linfocitos T CD8, in
dica que se detectan diferencias en residuos que
juegan un papel importante en la funcionalidad
de estas molculas; esto tiene implicaciones cl
nicas, ya que se pueden generar respuestas in
munes indeseadas contra dichos alelos en el ca
so de trasplante de rganos. El Comit de N o
menclatura de la O.M.S. para el Sistema HLA
ha decidido asignar la categora de alelo HLA a
aquel de cuyo gen se conoce la secuencia nucleotdica. A estos verdaderos alelos se les asig
na la letra del locus correspondiente seguido de
un asterisco (ej. HLA-B*) y luego un nmero
de tres o cuatro dgitos, donde los primeros dos

595

se refieren a la especificidad serolgica original

y los otros dos al nmero de variante hallada.
Por ejemplo: HLA-B*3501 se refiere a la pri
mer variante HLA-B35 (vase cuadro 29-1).
Se conoce la secuencia aminoacdica de ms
de 130 molculas HLA de clase I distintas. To
das ellas poseen una homologa global de apro
xim adam ente el 75-99% en su secuencia. La
mayor variabilidad se observa en los dominios
1 y 2, con diferencias de 7-15 residuos de los
90 que posee cada dominio, mientras que el do
minio 3 (que interacta con la p2-microglobulina) es el ms conservado. En los dominios 1 y
2 hay 20 posiciones de gran variabilidad entre
las distintas molculas. La estructura cristalo
g rfica de los alelos H LA -A 2, H LA -A 68 y
HLA-B27, muestra que la mayor parte de estos
residuos variables estn localizados en regiones

C uadro 29-1. Designacin de los alelos HLA de clase I

Especif.
serolgica

Alelos
HLA-A
A*010l
A *0201
A*0301
A *1101
A *2301
A *2401
A *2501
A *2601
A *2901
A *3001
A *3101
A *3201
A *3301
A*3401
A *3601
A *4301
A *6 6 0 1
A *680)
A *6901
A *7401
A *8001

al
al
al
al

0102
021 3
0302
1102

al 240 3
al 2 6 0 4
al 2 9 0 2
al 3003

al 3 3 0 2
al 3 4 0 2

al 6 6 0 2
al 6 8 0 2

Al
A2
A3
AH
A 2 3 (9 )
A 2 4 (9 )
A 2 5 (1 0 )
A 2 6 (1 0 )
A 2 9 (1 9 )
A 3 0 (1 9 )
A 3 1 (1 9 )
A 3 2 (1 9 )
A 3 3 (1 9 )
A 3 4 (1 0 )
A 36
A43
A 6 6 (1 0 )
A 6 8 (2 8 )
A 6 9 (2 8 )
A 7 4 (1 9 )

A lelos
H LA -B
B *0701 al 0 7 0 4
B * 0 8 0 1 al 0 8 0 2
B * 1 3 0 l al 1 302
B*1401
B*1402
B n50I
B *1502
B *1503
B* 1 5 0 4 al 1508
B*1509
B*1510
B * 1 5 l1
B * 1 5 1 2 y 1514
B*1513
B *1801 al 1 8 0 2
B * 2 7 0 1 al 2 7 0 8
B * 3 5 0 1 al 3 5 0 8
B *3701
B *3801
B * 3 9 0 1 al 3 9 0 4
B * 4 0 0 1 al 4 0 0 6
B *4101
B*4201
B *4401 al 4 4 0 4
B*4501
B *4601
B *4701
B * 4 8 0 1 al 4 8 0 2
B *4901
B*5001
B * 5 I0 1 al 5 1 0 5
B *5201
B *5301
B *5401
B*5.501 al 5 5 0 2
B * 5 6 0 1 al 5 6 0 2
B * 5 7 0 1 al 5 7 0 2
B *5801
B *5901
B *6701
B*7301
B *7801

Especif.
serolgica
B7
B8
B13
B I4
B 6 5 (I4 )
B 6 2 (1 5 )
B 7 5 (1 5 )
B 7 2 (7 0 )
B 6 2 (I5 )
B 70
B 71
B 15
B 76(1.5)
B 7 7 (I5 )
B18

Alelos
H LA -C
C w *010l
C w *020l
C w *0301
C w *040l
C w *050l
Cw *0601
C w *0701
C w *080l
C w * l2 0 l
Cw *130l
C w * l4 0 l
C w * l5 0 1
C w * l6 0 l
C w *170l

E.specif.
sero l g ic
al
al
al
al

0102
0202
0304
0402

al
al
al
al

0602
0703
0803
1203

al 140 2
al 1504
al 160 2
.

Cwl
Cw2
Cw3
Cw4
Cw5
Cw6
Cw7
Cw8

B 27
B 35
B 37
8 3 8 (1 6 )
839
840
841
B42
8 4 4 (1 2 )
B 4 5 (1 2 )
846
847
848
8 4 9 (2 1 )
B 5 0 (2 1 )
8 5 1 (5 )
8 5 2 (5 )
853
8 5 4 (2 2 )
8 5 5 (2 2 )
8 5 6 (2 2 )
B 5 7 (1 7 )
8 5 8 (1 7 )
859
867
873
B 7801

El listad o se b asa en la ltim a p u b licac i n del C om it d e N o m en c latu ra de la Q M S para factores d e l siste m a H L A (1994) y a ig u n o s nucvos
' e s p e cificid
ific id aa d e s sero l g ic as, se indica entre parn tesis la e s p e cificid ad am plia o rig in a l.
alelos to m ad o s de la lite ratu ra m s re cien te. En las

596

Inmunopatologa

de la molcula que son crticas en la unin de

pptidos antignicos o en la interaccin con el
receptor T (ver ms adelante).
En los dominios externos (1, 2 y 3), se han
identificado 183 residuos conservados entre las
distintas m olculas HLA-A,B y C, m ientras
que slo 6 aminocidos muestran un patrn es
pecfico de cada locus: las metioninas 138 y
189 son especficas del locus A, la arginina 239
es especfica del locus B y la valina 52 y glut
m ico 183 y 268 son especficos del locus C.
Este tipo de anlisis ha perm itido tam bin la
identificacin de los residuos involucrados en
epitopes comunes a varias molculas de clase I,
como los llamados epitopes supertpicos Bw4 y
Bw6. Se demostr que los aminocidos presen
tes en las posiciones 79, 80 y 83 son crticos en
la definicin de estos dos epitopes. Bw4 y Bw6
estn presentes en todos los alelos del locus B
y en algunos alelos del locus HLA-A.

fieren entre s en slo 13 aminocidos, 6 locali

zados en el dominio 1, 6 en 2 y uno en 3. Cuan
do se comparan las estructuras tridimensionales
de estas dos molculas se observa que 10 de es
tas sustituciones estn concentradas en la base y
lados de la fosa de presentacin; por las diferen
cias de tamao y polaridad de los aminocidos,
estos cambios afectan profundamente el tipo de
pptidos que unira uno y otro alelo de clase L
Esto fue confirmado por los estudios que eluyeron y caracterizaron los pptidos unidos a los
diversos alelos HLA de clase I.
Ligandos peptdicos de las MHC de clase I
M ediante m todos bioqum icos ya se han
analizado los ligandos peptdicos de ms de
diez alelos de clase I diferentes (cuadro 29-2).
Al igual que en otras especies, las MHC extra
das de clulas no infectadas, poseen en su sitio
de unin pptidos derivados de protenas celula
res. El 80% de los pptidos eluidos son de 8-9
residuos y el 20% restante pueden ser ms lar
gos (hasta 10-12 aminocidos). Los pptidos
unidos a cada alelo HLA poseen patrones o mo
tivos estructurales conservados, que definen las
caractersticas de los residuos que interactan
firmemente con los bolsillos del sitio de presen
tacin. El cuadro 29-2 muestra los motivos es
tructurales conservados de los pptidos espec
ficos para diversas MHC clase I humanas. Con
siderando la flexibilidad que permiten ciertas

Estructura tridimensional
Como hemos visto en el captulo 10, en los
ltimos cinco aos se ha determinado la estruc
tura cristalogrfica de los alelos de clase I
H LA-A2, HLA-A68 y HLA-B27 humanos y
varios alelos murinos. Los dominios 1 y 2 se
combinan para ensamblar una estructura de tipo
fo sa acanalada, localizada en la porcin ms
externa de la molcula, y que constituye el sitio
de unin de pptidos. HLA-A2 y HLA-A68 di

Cuadro 29-2. Residuos aminoacdicos crticos hallados en pptidos especficos de ciertos alelos
HLA de clase I
PO SICI N:
A lelo de clase I:

P2

P3

H L A - A 1 (A * 0 1 0 1 )
H L A -A 2 (A * 0 2 0 1 )
H L A -A 3 (A * 0 3 0 1 )
H L A - A l l (A * 1 1 0 1 )
H L A -A 2 4 (A * 2 4 0 1 )
H L A -A 3 3 (A * 3 3 0 1 )
H L A -A 6 8 (A * 6 8 0 1 )

T /S /M
L /M

D /E

L /M /V /I
V /T /M /L /I
Y /F/W /M

H L A -B 7 (B * 0 7 0 1 )
H L A -B 2 7 (B * 2 7 0 5 )
H L A -B 3 5 (B * 3 5 0 1 )
H L A -B 3 7 (B * 3 7 0 1 )
H L A -B 5 1 (B * 5 1 0 1 )
H L A -B 5 3 (B * 5 3 0 1 )

P
R
P
D /E

R /K
L /I/V

V /L

H L A -C w 4
H L A -C w 6
H L A -C w 7
H L A -C w 3

Y /P

(C w * 0 4 0 1 )
(C w * 0 6 0 2 )
(C w * 0 7 0 2 )
(C w * 0 3 ()l)

P51P6

Y
V /L /I/A /M /T
R /K /Y /H /F /A
K /R /F I/Y
L / F /I / W
R
R /K

A /I/L
V /T

L /I/A
R /K /tV l/V /M
Y /F /W

L /I/M /F
V/L/I

Y /P
V

P9

L /I/V /M

NUIL
L/I/V
V/I/Y
F

L/F/M
L
Y
L

P l (p o sici n 1) in d ica el p rim er a m in o c id o del p p tid o y c o rresp o n d e al ex tre m o N -term inal. P9 co rresp o n d e al ex tre m o C -term in al. P ara
los alelo s in d icad o s con (*), u n 20% d e los p p tid o s elu id o s son de 10-12 am in o c id o s de lai'go; en estos ca so s, se o b serv a el m ism o residuo
esp e cfico en la P 1 0 -P 1 2 , en lu g ar d e P 9. L o s am in o c id o s se in d ican p o r el c d ig o d e una letra y lo s m arc ad o s en n eg rita se co n sid eran
re sid u o s d o m in an tes o d e an claje; los otros son a m in o c id o s m uy frecu e n tem en te h allad o s en esa p o sici n .

Estructura y funcin del complejo m ayor de histocompatibilidad

posiciones de los pptidos, resulta claro que un
alelo HLA dado tendr la capacidad de unir
mltiples pptidos (se refiere a uno por vez).
Ya hemos mencionado que estos pptidos se
ensamblan con la cadena pesada y la (32-microglobulina como un heterotrm ero, durante la
sntesis en el retculo endoplasmtico rugoso.
M olculas de clase II
E stru ctu ra . T am bin son g lucoprotenas
transmembrnicas de tipo I, constituidas por un
heterodmero, con una cadena a de 229 am i
nocidos (32-34 kD) y una p de 237 aminoci
dos (28-29 kD ), unidas no covalen tem en te
(vase cap. 10). Cada cadena posee dos dom i
nios globulares externos, con puentes disulfuro
intracatenarios en ambos dominios de la cade
na p y en el dominio ms prximo a la m em
brana en la cadena a.
Recurdese que durante su sntesis y trans
porte intracelular, el dmero a P se halla asocia
do a una cadena de 31 kD llamada cadena in
variante, (li) codificada genticamente fuera
del sistema HLA. El complejo a p li, m igra a
travs del Golgi y luego hacia endosomas, en
donde el pH cido y ciertas proteasas liberan la
cadena li y permiten la unin de pptidos gene
rados por la va exgena de procesamiento y
presentacin antignica (vase cap. 2).
Distribucin. Las molculas de clase II po
seen una distribucin tisular muy restringida,
expresndose constitutivamente en la superfi
cie de linfocitos B, monocitos, clulas dendrficas, precursores eritroides, clulas de Langer
hans, epitelio tmico, clulas de Kupffer y lin
focitos T activados. Su expresin puede indu
cirse por la accin de interfern gama en linfo
citos T, clulas NK, clulas del endotelio vas
cular, queratinocitos, melanocitos, astrocitos y
fibroblastos. Tambin se los halla en la superfi
cie de clulas tumorales, en leucemias, linfo
mas, melanomas, carcinomas renal, de pulmn,
de ovario, de vejiga, de colon y mama.
Productos de clase II. Existen varios produc
tos de clase II diferentes, que se expresan si
multneamente en la superficie celular. Todos
los individuos expresan las molculas HLA-DR,
HLA-DQ y HLA-DP, cada una de ellas consti
tuidas por un dmero: D Ra/D R p, DQa/DQP y
D Pa/D Pp. Cada cadena est codificada por un
gen respectivo en el sistema HLA, denomina
dos DRA/DRBl, D Q A l/ DQBl y D PA l/D PB l
(vase fig. 29-1). Algunos individuos expresan
adems un cuarto producto denominado DR52,
DR53 D RB51, donde la cadena DR es la m is
ma a la presente en las molculas HLA-DR y la
cadena p es producto de un gen denominado
DRB3, DRB4 DRB5, respectivamente (van
se figs. 29-1 y 29-2).

597

P o lim o rfism o . L as m olculas de cla se II

tambin son muy polimrficas. Por serologa se
identifican 14 alelos diferentes para HLA-DR
(que se numeran consecutivamente D R l, DR2,
etc.; vase cuadro 29-3), y 9 para HLA-DQ; los
productos HLA-DP (6 especificidades) se iden
tifican en reacciones de cultivo mixto linfocita
rio secundario (vase ms adelante). Aqu tam
bin los productos maternos y paternos se ex
presan codominantemente, por lo que, junto al
multialelismo del sistema, la mayora de los in
dividuos exhibe al menos seis productos de cla
se II distintos. Ms an, en determinadas oca
siones, las cadenas D Q a de origen materno (o
paterno) se asocian a las cadenas DQP de ori
gen paterno (o materno), en un fenmeno lla
mado trans-asociacin, por lo que el nm ero
de molculas superficiales diferentes puede ser
aun mayor.
A diferencia de los productos de clase I, la
homologa entre las diversas cadenas a y P de
los diferentes loci de clase II (por ej. D R vs.
DQ vs. DP ) es moderada, en el orden de un
50-65%.
Los distintos alelos HLA-DR y DQ fueron
identificados por reacciones serolgicas y defi
nidos a lo largo de once Talleres Internaciona
les. Sin embargo, estas molculas poseen tam
bin numerosos epitopes capaces de estim ular
la proliferacin de linfocitos T CD4 histoincompatibles, en un fenmeno denominado cul
tivo m ixto linfocitario (vase ms adelante).
Estos epitopes, estn presentes en las m olcu
las DR y DQ y no necesariamente son los m is
mos a los identificados por anticuerpos. La
identificacin de estos determinantes tiene gran
importancia por la funcionalidad de estas m ol
culas y obvias implicancias clnicas en el re
chazo de trasplantes. H istricam ente se ha
identificado a estos epitopes previo al a isla
miento, caracterizacin bioqumica y serolgica de las molculas de clase II y se los h a 11a. mado alelos del locus D. Hasta el presente se
han identificado unos 40 alelos diferentes. Los
estudios de aislamiento y determinacin de la
secuencia nucleotdica de los respectivos genes
demostr que se trata de sustituciones cue afec
tan la presentacin de pptidos y el reconoci
miento T. Por lo tanto, la especificidad serolgica no necesariam ente correlaciona con un
alelo del locus D. Ms aun, una misma especi
ficidad (ej. DR4) puede agrupar a varios alelos
HLA-D (ej. Dw4, DwlO, etc.). Por ello, se ha
bla de subtipos allicos, por ej. subtipos allicos del DR4. Se trata en realidad verdaderos
alelos, que no se distinguen por serologa. Los
subtipos alhcos de cadenas HLA-DRB difie
ren entre s en pocos aminocidos, lo que expli
ca en parte que los productos no sean distingui
bles por serologa; sin em bargo los residuos

598

Inmunopatologa

GENES REGION DR

DRB 6

DRA1

DR1, DR 10
DRB1

DRB 6

DRB1

DRB2

DRB3

DRB7

DRB 8

DRB5

DRA1

DR2

DR3, DR5, DR 6

DRA1

[
DRB1

DRB4

DRA1

DR4, DR7, DR9

DRA1

DRB1
DR 8

t
CADENAS:

PRODUCTOS:

DRB1

DRB4

DRB5

DR53

DR51

DRA1

t .

DR1
DR2

DR52

ETC

Fig. 29-2. R e p re se n ta c i n e s q u e m tic a d e l d ife re n te d o s a je g e n tic o D R B en d istin to s lia p lo tip o s. L a s d ista n c ia s e n tre los
g e n e s y el ta m a o d e lo s m is m o s n o e s t e n e s c a la . L o s g e n e s so m b re a d o s n o so n fim c io n a le s . L a s c a d e n a s D R |3 p ro d u c to
d e lo s g e n e s f u n c io n a le s D R B 1, D R B 3 , D R 4 y D R B 5 , se a s o c ia n c o n la m is m a c a d e n a D R a .

afectan la unin de pptidos y la interaccin

con el receptor T.
Por lo tanto, al igual que en las molculas de
clase I, la complejidad allica en las molculas
de clase II es mucho mayor que la estimada por
serologa. As por ejemplo, hoy conocemos 19
variantes del H LA -D R4, diez variantes del
DR2, etc. Como se observa en el cuadro 29-3,
actualmente se designan los alelos de cada lo
cus, con las mismas pautas que las usadas para
las MHC de clase I. Como veremos ms ade
lante, hay m todos m oleculares que pueden
usarse de rutina para identificar todos los alelos
de clase II.
En las molculas HLA-DR todas las varia
ciones polimrfieas residen en la cadena DRp.
La cadena D R a, en cambio, es esencialmente
idntica. Los cambios en la cadena DR(3 se lo
calizan en el dominio ms externo ((31), siendo
el dominio proximal de membrana mucho ms
conservado. Hasta el presente se dispone de la
secuencia aminoacdica del dominio pi de 100
alelos distintos. Se observan entre 1 y 18 susti
tuciones de aminocidos entre los diversos ale
los. Estos cambios no se distribuyen al azar si
no que aparecen concentrados en tres zonas

que han sido denominadas regiones de hipervariabilidad allica, localizadas entre los ami
nocidos 9-13, 26-33 y 61-1 A. En cada una de
estas regiones, los alelos difieren entre uno y
seis residuos. Hay adems variabilidad concen
trada en otras posiciones, pero que involucra a
uno o dos residuos solamente. Los epitopes que
estimulan a los linfocitos T en el cultivo mixto
linfocitario, se hallan fundamentalmente en las
molculas HLA-DR.
En las molculas HLA-DQ, tanto la cadena
DQA como la cadena DQB contribuyen al poHmorfismo. Se conocen hoy 11 alelos DQA y
22 alelos DQB diferentes (vase cuadro 29-3).
El polimorfismo en las molculas HLA-DP
no se identifica por mtodos serolgicos, sino
por linfocitos T que proliferan en un cultivo
mixto secundario (vase ms adelante). Se han
identificado as seis alelos. Sin embargo, el ais
lamiento y caracterizacin de genes DP(3, reve
l un mayor polimorfismo, habindose identifi
cado ms de 55 alelos diferentes, con las susti
tuciones concentradas en las regiones: 8-11,
33-36, 55-57 y 84-87. Se han identificado hasta
el presente ocho alelos para la cadena D P a
(cuadro 29-3).

Estructura y funcin del complejo mayor de histocompatibilidad

599

Cuadro 29-3. Designacin de los alelos HLA de clase II

Especif.
serolgica

A lelos
H LA -D R
D R A * 0 1 0 1 al 0 1 0 2

D R B 1 * 0 I 0 1 al
D R B 1 * I 5 0 1 al
D R B 1 * I 6 0 1 al
D R B 1*0301
D R B 1 * 0 3 0 2 al
D R B 1*0401 al
D R B 1 * 1 1 0 1 al
D R B 1*1201 al
D R B 1 * 1 3 0 1 al
D R B 1 * 1 4 0 1 al
D R B 1*0701
D R B 1*0801 al
D R B 1*0901
D R B 1 *01001

0104
1 504
1606
0304
0419
1113
1203
1313
1417
0811

DRl
D R 1 5 (2 )
D R l 6 (2 )
D R 1 7 (3 )
D R l 8 (3 )
DR4
D R l 1(5)
D R l 2 (5 )
D R 1 3 (6 )
D R l 4 (6 )
DR7
DRB
DR9
D R IO

D R B 3*0101
D R B 3 * 0 2 0 I al 0 2 0 2
D R B 3*0301

D R 52
D R 52
D R 52

D R B 4 * 0 1 0 1 al 0 1 0 3

D R 53

D R B 5 * 0 1 0 1 al 0 1 0 2
D R B 5 * 0 2 0 1 al 0 203

D R 51
D R 5I

A lelos
H LA -D Q

Especif.
serolgica

(*)

D PA 1*0101
D PA 1*0102
DPA 1*0103
D P A I* 0 1 0 4
D P A 1*0201
D P A 1*0202
D P A 1 *0301
D P A 1*0401

DQ A 1*0101
D Q A 1*0102
D Q A 1*0103
DQ A 1*0104
D Q A 1*0201
D Q A 1*0301
D Q A 1*0302
D Q A 1*0401
D Q A 1*0501
D Q A 1*0502
D Q A 1 * 0601
D Q B 1 * 0501
D Q B 1* 0 6 0 1
D Q B 1*0201
D Q B 1*0301
DQ B 1*0302
D Q B 1* 0 3 0 3
D Q B 1*0304
D Q B 1*0305
D Q B1*0401

Alelos
H LA -D P

E sp ec ifid a d es b p
a so cia d a s

al 5 0 4
al 6 0 9
al 2 0 2

D Q 5 (1 )
D Q 6 (1 )
DQ2
D Q 7 (3 )
D Q 8 (3 )
D Q 9 (3 )
D Q 7 (3 )

al 4 0 2

DQ4

D PB1*0101
D P B 1*0201 al 202
D P B 1*0301
D P B 1 * 0401 al 40 2
D P B 1*0501
D P B 1*0601
D P B 1*0801
D P B 1 * 0901
D PB1*1001
D PB1*1101
D PB1*1301
D P B I* 1 4 0 1
D P B I* 1 5 0 1
D PB1*1601
D P B 1*1701
D PB1*1801
D PB 1*190I
D P B 1*2001
D PB1*2101
D P B 1*2201
DPB1*230I
DPB1*2401
D P B 1*2501
D P B 1*2601
D P B 1*2701
D P B 1*2801
D P B 1*2901
D P B 1*3001
D PB1*3101
D P B 1 *3201
D P B I* 3 3 0 1

DPwl
DPw2
DPw3
DPw4
DPw5
DPw6

D P B 1*5501
E l listado se b asa en la ltim a p u b licac i n del C om it de N o m e n c la tu ra de la O M S para factores dei sistem a H L A (1994). E n las especifici
dades sero l g ic as, se in d ic a e n tre p arn tesis la esp e cificid ad am p lia original. (* ) L as esp e cificid ad e s D P w aso c ia d as son aq u e lla s dete rm i
nadas p o r c u ltiv o m ix to lin fo citario sec u n d ario .

E structura tridim ensional. Recientem ente

fue establecida la estructura cristalogrfica de la
molcula HLA-DRl. Los dominios a l y [31 (de
las cadenas D R a y DR(3, resp ectiv am en te)
adoptan en el espacio una estructura con una fo
sa similar a la presente en las molculas de cla
se L La diferencia ms significativa lo constitu
ye el hecho de que en las MHC de clase II, los
extremos izquierdo y derecho del sitio de
unin (que unen los extremos N y C del ppti
do, respectivam ente) estn ms abiertos y no
tan ocluidos como en las MHC de clase I. Esto
determina que las MHC de clase II pueden unir
habitualmente pptidos ms largos (en prom e

dio son de 12 a 18 aminocidos), que se extien

den por fuera de los extremos. En un anlisis
cristalogrfico de HLA-DRl unido a un pptido
viral de 13 aminocidos, se estableci que las
cadenas laterales de cinco residuos estaban hun
didas en cinco bolsillos polim rficos en la
molcula HLA-DR; en otras cinco posiciones
apuntaban hacia el solvente y por lo tanto eran
accesibles al TCR. Estas ltimas eran consis
tentes con estudios funcionales previos, donde
se h ab a evaluado la respuesta de clu las T
frente a variantes del pptido antignico.
Ligandos peptdicos de las M H C de clase
II. Tambin fueron estudiados por purificacin

600

Inmunopatologa

de las MHC de clase II y posterior eluido y se

cuenciacin de los pptidos. En clulas no in
fectadas, la mayor parte de los ligandos provie
ne de protenas de la membrana plasmtica o
de com partim entos lisosom ales, tales como
transportadores inicos, receptores hormonales,
MHC de clase I y II, proteasas lisosomales, etc.
Se trata de productos del catabolismo de prote
nas del sistema de endomembranas, procesados
por la llamada va exgena de presentacin an
tignica (vase cap. 2). A diferencia de los hgandos de MHC de clase I, los pptidos son
ms largos y de tamaos ms variables, con 1220 am inocidos en prom edio (con algunos
ejemplos de hasta 28 am inocidos de largo).
Esta variedad en su longitud hace difcil identi
ficar patrones o motivos estructunes especfi
cos. Los hallados hasta el presente (cuadro
29-4) fueron confirmados mediante ensayos de
binding de pptidos sintticos a MHC de cla
se II purificadas. Como regla general, los ppti
dos poseen menores constricciones estructura
les comparados con los de clase I; adems, se
han descrito pptidos prom iscuos que, inde
pendientemente de su estructura, pueden unirse
a varios alelos de clase II distintos.
O rganizacin gentica del sistem a HLA
El sistema HLA est localizado en el brazo
corto del cromosoma 6 en las regiones 6p21.31
6p21.33. Est limitado por los genes HLADP hacia el centrmero y los genes de clase I
hacia el telmero, con una longitud estimada
en 4 millones de nucletidos y unos 3 cM (fig.
29-2). Se lo ha dividido en regiones que contie
nen a los loci de clase I, II y III (vase ms
adelante). Se denomina haplotipo HLA al con
junto de genes presentes en esta regin del cro
mosoma 6. Debido al enorme polimorfismo del
sistema, la informacin presente en los diver
sos haplotipos vara, no slo en los alelos que

posee cada locus, sino tambin en el nmero de

genes y la distancia fsica entre los mismos.
Loci de clase I
La cadena pesada para los tres productos
HLA-A, -B y -C est codificada por sendos ge
nes localizados hacia el extremo telomrico del
sistema HLA. Los loci HLA-B y -C estn muy
prximos entre s, a una distancia estimada de
80 kb. El locus HLA-A est a su vez a unas
1000 kb del locus HLA-C. Los estudios de bio
loga molecular revelaron la presencia de otros
genes de clase I dentro del sistema HLA. Los
genes de clase I constituyen una familia multigentica, de 17-20 miembros, que poseen una
secuencia nucleotdica muy homloga entre s.
Se han caracterizado parcialmente algunos de
estos genes adicionales aunque se desconoce la
funcin biolgica de los mismos.
H LA -E est localizado a unas 900 kb de
HLA-C (orientacin telomrica), se expresa en
altos niveles en linfocitos T en reposo, eosin
filos, hnfocitos B, piel, y en menor proporcin
en hgado y placenta. HLA-H est localizado a
unas 100 kb en orientacin telomrica a HLAA y constituye un seudogen. HLA-G se locali
za a unas 150 kb de HLA-A y parece tener una
expresin restringida a placenta (clulas del ci
to trofoblasto); se sospecha que juega un papel
importante en los fenmenos inmunes que re
gulan la gestacin. HLA-E se halla a unas 200
kb de HLA-A y se expresa en niveles bajos o
moderados en linfocitos T, B, timo fetal y piel.
A diferencia de los genes HLA-A,B y C, los
genes E,F,G y H exhiben poco polimorfismo
poblacional. Vecinos a HLA-A, H, G y F, hay
al menos cinco seudogenes de clase I, Estos l
timos podran desempear un papel importante
en la evolucin de esta fam ilia m ultigentica
(vase ms adelante). A unas 50 kb en posicin
centromrica de HLA-B, se localiza un grupo

C u ad ro 29-4. Residuos aminoacdicos conservados en pptidos unidos a determinados alelos

HLA de clase II
P O SIC I N RE LA TIV A:
Pl

P4

Y /F
I /L /F /M
Y /F /W /M
F /Y
L /V
F /Y /I/M

M /L
D
sin c a rg a +
V /Q /I
F /Y

P5P6

P7

P9

ALELO :
H L A -D R 1
H L A -D R 3
H L A -D R 4
H L A -D R 5 1
H L A -D R 16
H L A -D Q 7

A /G
K /R
T /S

sin c a rg a +

L
Y /L /F
sin c a rg a

R/K
F /V /M /L /I
A /V /L /I

Y /F /M /L /V

L o s am in o c id o s se in d ican p o r el c d ig o d e una letra y los m a rc a d o s en n eg rita se co n sid eran re sid u o s d o m in an tes o de anclaje; los otros
son am in o c id o s m uy frecu e n tem en te h allad o s en esa p o sici n .

Estructura y funcin del complejo m ayor de histocompatibilidad

de genes, denominados MIC, con organizacin
gnica y homologa ancestral (20-35% a nivel
proteico) a las MHC de clase I. Se predice que
poseen una estructura espacial sim ilar a las
mismas y que eventualmente podran unir pp
tidos. Se expresan diferencialmente en fibro
blastos y clulas epiteliales y se desconoce aiin
su papel biolgico.
Organizacin y expresin de los genes H L A
de clase L Como se ha descrito en el captulo
10, un gen de clase I est constituido por siete
exones, que se corresponden con los dominios
proteicos de la cadena pesada. Se expresan
constitutivamente en casi todos los tejidos, con
niveles altos en clulas linfoides, moderados en
la mayora de las clulas y bajos en otros como
el hepatocito. El nivel de expresin puede in
crementarse por efecto de interfern (IFN) a , [3
o y. Las secuencias regulatorias de las regiones
5 flanqueantes son similares a las halladas en
otras especies.
Loci de clase III
Esta regin del sistema HLA codifica para la
expresin de molculas que no cumplen con la
funcin de presentacin antignica, aunque al
gunos de ellos intervienen en otros aspectos de
la respuesta inmune (fig. 29-1).
Hacia el centrmero, a unas 300 kb del locus
HLA-B, se hallan los genes que codifican para
dos citoquinas; TNFfi (o linfotoxina) y T N F a
(factor de necrosis tumoral), secretados en las
respuestas inflamatorias por linfocitos T y m a
crfagos, respectivam ente. Los genes m iden
unas 3 kb, estn prximos entre s y no exhiben
un im portante polimorfismo poblacional. Las
protenas poseen un 35% de homologa y se
sospecha que los genes pudieron generarse a
partir de un ancestro comn.
Hacia el centrmero se ubica luego un gen
denominado G7a que codifica para valil- tRNA
sintetasa, una molcula que no cumple funcio
nes inmunolgicas. Se hallan luego, vecino, a
este locus, los genes que codifican para p rote
nas de estrs trmico de la familia de las HSP70. Este tipo de molculas, muy conservadas
en la escala filogentica, parecen tener un papel
muy im portante en la induccin de m ecanis
mos primitivos de defensa por el sistema T.
Siguiendo hacia el centrmero, a unas 350
kb de T N Fa, se localiza el gen que codifica pa
ra C2, el segundo componente de la va clsica
del complemento y &\ factor B de la va alterna
tiva de activacin del complemento. Estas glu
coprotenas poseen actividad de serina-proteasa
(cap. 22), con una homologa del 67% entre s.
Los genes para C2 y factor B son de 18 kb y 6
kb respectivamente y estn separados por tan

601

slo 0.5 kb. Existe escaso polimorfismo en es

tos genes. Las deficiencias hereditarias de C2
parecen deberse a defectos que im p id en la
transcripcin del gen, ms que a grandes dele
ciones estructurales.
A unas 30 kb del gen para el factor B, existe
un tramo de ADN que posee los genes para C4,
el cuarto componente del sistema complemen
to. Existen dos variantes no-allicas (isotpicas)
de C4, que, segn su movilidad electrofortica
se denominan C4A (rpida) y C4B (lenta), y
que estn codificadas por sendos genes en esta
regin. Estos genes, de 22 kb para C4A y 16 kb
(o 22 kb) para C4B, son muy homlogos, con
slo 14 nucletidos (12 aminocidos) de dife
rencia entre s. Hay a su vez siete variantes alhcas para cada uno de ellos, con la presencia
tambin de alelos nulos, es decir, ausencia de
la protena, con una frecuencia del 10% para
C4A y 20% para C4B. La ausencia total de C4
es una condicin muy rara.
Los genes para C4 se alternan con dos genes
que codifican para la 27 hidroxilasa. Esta enzi
ma es una m onooxigenasa con grupo hem o,
con actividad de citocromo P450, que participa
en la biosntesis de esteroides en la co rteza
adrenal. Existen dos genes que son 98% hom
lo g o s , de 3.1 kb c a d a u n o , d e n o m in a d o s
21 CHA y 2 I0 H B . Cada uno est inm ediata
mente contiguo a cada uno de os genes para
C4. 21 OH A es un gen no funcional (seudogen).
La deficiencia de 21 OH resulta en el sndrome
de hiperplasa adrenal congnita. Esta enfer
medad est causada en algunos haplotipos por
una com pleta delecin de 210H B y C4B; en
otros, ocurre una introduccin de m utaciones
deletreas al gen 210H B por un mecanismo de
conversin gnica que transfiere tram o s de
ADN no funcionales del seudogen 21 O K A al
gen funcional 21OHB.
Loci de clase II
H a c ia el c e n tr m e ro , a unas 400 k b de
210H B , comienza la regin de clase II, donde
se hallan los genes para HLA-DR, -DQ y -DP,
con todos los genes localizados en un segmento
de 1000 kb (fig. 29-1). En primer lugar, se ha
lla el gen DRA, que codifica para la cadena
D R a. A una distancia variable de 50-150 kb si
gue lu e g o un gen llam ad o DRB3, D R B 4 o
DRB5, presentes el primero en los haplotipos
DR3, DR5 y DR6, el segundo en los haplotipos
DR4, DR7 y DR9, y el tercero en el haplotipo
DR2. El producto de estos genes, ju n to a la
m ism a cad en a D R a , gen era las m o l cu la s
HLA-DR52, DR53, o DR51, presentes en los
haplotipos correspondientes. Para DR52 se han
id en tificad o cu atro varian tes allicas, para
DR53 tres alelos, y para DR51, cinco. Se han

602

Inmunopatologa

mapeado en estas m olculas DR51, DR52 y

DR53 epitopes reconocidos por linfocitos T
(lo c u s D). Los h a p lo tip o s D R l, D R w 8 y
DRwlO parecen carecer de los respectivos ge
nes DRB3, DRB4 y DRB5 (fig. 29-2).
A raenos de 100 kb de DRB3 (o DRB4), to
dos los haplotipos (excepto DRwB) poseen un
seudogn DRB. El presente en los haplotipos
D R l, DR2 y DRwlO parece estar evolutiva
mente ms conservado entre estos tres haploti
pos. Los individuos DR4, DR7 y DR9 poseen
adems otro seudogn DRB. Finalmente, se ha
lla a continuacin el gen D R B l, el ms polimrfico del sistema (ver secuencias al final del
captulo) y el responsable de las especificida
des D R l, DR2, etc. En resumen, hay un solo
gen DRA cuyo producto es compartido por las
m o lcu las H L A -D R , H L A -D R w 52, H LA DRw53 y HLA-DRB5.
Le sigue hacia el centrmero la regin DQ,
que dista de los genes DR recin descritos a
una distancia variable de 80-240 kb,segn el
haplotipo. En primer lugar se hallan los genes
D QAI y D Q B l, que codifican para las molcu
las HLA-DQ. Como se mencion antes, ambos
genes exhiben un marcado polimorfismo. En la
misma regin, se halla otro par de genes, deno
minado DQA2 y DQB2, que no parecen tener
defectos estructurales, pero cuyos productos
an no han sido hallados. Entre ambos pares de
genes DQ, a unas 10 kb de DQA2, se ha locali
za un seudogn para una cadena beta, denomi
nado DQB3, que carece del primer dominio p l .
Hacia el centrmero, a unas 70 kb de DQB2
se halla un gen llamado DOB, cuyo ARN se ex
presa en muy bajos niveles en hnfocitos B y se
desconoce el producto proteico. A unas pocas
kb de DOB, se ha hallado recientemente una se
rie de.genes cuyos productos estn involucrados
en el procesamiento citoplsmico de antgenos
proteicos (LMF2 y LMP7) y con el transporte
de pptidos del citosol hacia el retculo endoplsmico (TAPl y TAP2) (vase cap. 2).
Hacia el centrmero, a unas 60 kb de LMP2,
se hallan los genes DMB y DMA, que poseen
una hom ologa ancestral (25-35% ) con otros
genes de clase II. Se expresan constitutivamen
te en linfocitos B y otras clulas presentadoras
de antgeno y se inducen con IFN en otros tipos
celulares. Sus productos participan en la va
exgena de presentacin antignica (cap. 2).
A 65 kb de DMA se halla el gen DNA, cuyo
producto no se conoce, aunque no parece for
mar un dmero con DOB. Este gen se halla in
mediatamente vecino a los genes de la regin
DP. En un tramo de 65 kb estn localizados
dos pares de genes: D PAI y DPB I, que codifi
can para el producto HLA-DP, y otro par de
genes llamados DPA2 y DPB2 que no son fun
cionales.

Organizacin y regulacin de la expresin

de los genes de clase IL Los genes para las ca
denas p estn constituidos por cinco exones,
que se corresponden con los dominios del pp
tido seal, p l y P2, transmembrana, intracitoplsmico y 3 no traducido. Los genes de cade
na a poseen cuatro exones, ya que la informa
cin para la porcin transmembrana e intracitoplasm tica est fusionada. Los genes poseen
una longitud aproximada de 8 kb.
Los genes de clase II se expresan en un n
mero restringido de tejidos y su expresin en
otros puede inducirse con IFNy. Los promoto
res de los genes de clase II poseen las secuen
cias responsables de esta respuesta a IFNy (cap.
10). Se han identificado al menos ocho prote
nas que se unen a estas regiones conservadas
de los genes de clase II humanos. En algunos
pacientes portadores del sndrome de los linfo
citos desnudos, que cursan con una severa
inmunodeficiencia, no existe expresin de m o
lculas HLA de clase II y la falla reside en la
falta de alguno de estos factores que regulan su
transcripcin.
Evolucin de las molculas
de histocompatibilidad
Como se mencion antes, las molculas de
clase I y de clase II exhiben un enorme poli
morfismo. Las variaciones de un alelo a otro se
concentran en determinadas regiones de la mo
lcula, especialmente involucradas en la inte
raccin con pptidos antignicos o con el recep
tor T. No son alotipos simples, como los pre
sentes en la globina por ejem plo, donde hay
cambios puntuales de am inocidos, sino que
generalmente involucran a 4-8 nucletidos pre
sentes en un tramo de ADN de 15-30 bases.
Ms aun, los tramos sustituidos no incluyen
cambios al azar, sino que revelan secuencias
presentes en el mismo sitio en otras molculas
HLA. Esto es sugestivo de la existencia de fe
nmenos tipo conversin gnica para la gene
racin de nuevos alelos. Se describieron en el
captulo 10 ejemplos para molculas murinas, y
se muestran a continuacin dos ejemplos (de
los numerosos existentes) para graficar esto:
a) Los alelo s de clase I H L A -B *2705 y
HLA-B*2702 difieren entre s por cuatro susti
tuciones en un tramo de 14 nucletidos, que
determinan cambios en los aminocidos 77, 80
y 81 de la cadena pesada. Esta secuencia pre
sente en B*2702 en esos residuos,.es idntica a
la p re s e n te en H L A -A * 2 4 0 1 y en H LA B*5801.
b) Los alelos de clase II HLA-DRB*1301 y
HLA-DRB*1401, difieren en el dominio |3l de
sus genes D R B l en 10 nucletidos. Seis de

Estructura y funcin del complejo m ayor de histocompatibilidad

ellos estn ubicados en un tramo de 14 nucle
tidos y exactamente su misma secuencia se ha
lla presente en el alelo HLA-DRB*0101.
En la conversin gnica, se copian tramos de
informacin de DNA (durante la replicacin
del mismo) a partir de genes homlogos. Los
genes que interactan pueden estar en el mismo
crom osom a o en crom osomas distintos. Para
seg u ir con el p rim er ejem p lo m en cio n ad o
antes, durante la espermatognesis en un indi
v id u o h e te r o c ig o ta H L A -B * 2 7 0 5 /H L A B*5801, se pudo haber copiado una parte de la
secuencia de B*5801 en reemplazo de la exis
tente en B*2705 entre los 14 nucletidos de los
codones 77 a 81; esto sera un ejemplo de la in
teraccin de dos genes homlogos presentes en
cromosomas distintos, que pudo haber genera
do el alelo B*2702. La interaccin pudo haber
ocurrido, tambin, entre dos genes no allicos
HLA-B*2705 y HLA-A*2401, presentes en un
mismo cromosoma.
Como consecuencia de estos mecanismos de
diversificacin, todas las molculas de un tipo
(ej. clase 1) son parecidas pero no idnticas en
tre s. Los genes no funcionales presentes en
esta familia (por ej. HLA-H, HLA-DRB2) pue
den jugar un papel im portante como donan
tes de secuencias para la diversificacin de los
genes funcionales.
Por otro lado, los diversos haplotipos poseen
diferencias en el nmero total de genes, o en la
separacin de los mismos. Esto sugiere que el
sistema sufre expansiones y contracciones por
mecanismos del tipo del cross-over desigual.
Respuesta inmune contra molculas
de histocompatibilidad
Si se trasplanta un rgano entre dos indivi
duos histoincom patibles (que poseen alelos
HLA diferentes), los linfocitos T CD4 y CD8
reconocen como extraas a las molculas HLA
del donante, producen una intensa reaccin in
flamatoria y destruyen a las clulas extraas.
Las clulas T CD4 y CD8 reconocen a las m o
lculas de clase II y clase 1 extraas, respecti
vamente. La respuesta inmune contra las MHC
extraas se denomina re.'ipuesta alogeneica. In
vivo, la respuesta incluye adems la sntesis de
anticuerpos contra las MHC ajenas {aloanticuerpos).
Esta reaccin puede evidenciarse y reprodu
cirse in vitro, en el llamado cultivo mixto linfo
citario el que, como veremos ms adelante, es
muy til para garantizar la identidad entre un
donante y un receptor previo al trasplante de
rganos. Si se mezclan en un sistema de culti
vo clulas mononucleares de sangre perifrica
de dos individuos histoincompatibles, en 5-7
das las clulas T CD4 responden con una in

603

tensa proliferacin y liberacin de mediadores

al reconocer m olculas de clase II extraas,
presentes sobre la superficie de clulas que es
timulan (linfocitos B, monocitos). Las clulas
T CD8 se activan al reconocer molculas de
clase I extraas sobre la superficie de todas las
clulas ajenas. Adems de este reconocimiento
directo de las MHC extraas por el TCR, se ha
dem ostrado que las MHC ajenas pueden ser
procesadas y presentadas (cap. 10) por M H C
propias: esto se denomina reconocimiento in
directo de aloantgenos. En ambos casos el
TCR reconoce MHC con pptidos en su sitio
de presentacin.
Tipificacin del sistema HLA
Se denomina tipificacin a la determinacin
del fen o tip o HLA que porta un individuo. La
identificacin de los alelos se realiza habitual
mente por reacciones serolgicas, fundamental
mente de citotoxicidad m.ediada por anticuer
pos y complemento. Se debe disponer de una
coleccin muy amplia de aloantisueros (obteni
dos de multparas o de individuos politransfundidos) previamente caracterizados en lo refe
rente a las especificidades HLA que ellos reco
nocen. Se han obtenido tambin numerosos an
ticuerpos monoclonales, a partir de hibridomas
murinos o humanos. Para la tipificacin de los
alelos HLA se utilizan linfocitos de sangre p e
rifrica (o de bazo o ganglios, en donantes ca
davricos) purificados por gradientes de EicollH ypaque, ya que estas clulas expresan altos
niveles de molculas HLA superficiales.
Para tipificar los alelos de clase 1, las clu
las se incuban con los antisueros en policiibetas, donde cada fosita posee un suero distinto;
luego se agrega com plem ento y, despus de
otra incubacin, se evalia la viabilidad celular
al microscopio. Si se detecta muerte en las fo
sas que contienen anticuerpos contra dos alelos
del locus A, dos alelos del locus B y dos alelos
del locus C, el individuo ser heterocigota para
las molculas de clase I. Si se detecta slo un
alelo para alguno de los loci, podr eventual
mente ser homocigota (lo que se podra verifi
car si se puede tipificar a sus padres) o portador
de un alelo contra el cual se carece de reactivos
apropiados.
P ara tipificar a las m olculas H LA -D R y
HLA-DQ tambin se realiza una citotoxicidad
mediada por anticuerpo y complemento, pero
sobre linfocitos B purificados, ya que slo re
presentan el 10-20% en sangre perifrica. A l
ternativamente, en una poblacin total se los
puede identificar al microscopio por flu o res
cencia (con un antisuero fluoresceinado anti-inm unoglobulina humana) y, sim ultneam ente,
realizar la reaccin citotxica. Por ciertas ca

604

Inmunopatologa

ractersticas propias de la tcnica, la tipifica

cin serolgica para HLA-DR tiene un margen
de error del 5 al 20%. La introduccin en ios
ltimos aos de tcnicas moleculares mejor
sustancialmente este inconveniente (vase ms
adelante).
La identificacin de los alelos del locus D
(epitopes que estimulan el cultivo mixto linfo
citario) se realiza m ediante un panel (colec
cin) pre-caracterizado de clulas homocigotas
para cada uno de los alelos conocidos de locus
D. Estas clulas (irradiadas para evitar su mitosis) se usan para estimular la proliferacin en
cultivo de los linfocitos a tipificar: respondern
ante los alelos diferentes y no respondern ante
los alelos idnticos.
Las molculas HLA-DP poseen epitopes que
estimulan dbilmente la proliferacin de linfo
citos T, por lo que se los debe preestimular in
vitro y realizar una suerte de cultivo mixto lin
focitario secundario. Aqu se debe disponer de
un panel criopreservado de linfocitos preestimulados en un cultivo mixto primario; estas c
lulas se enfrentarn a las clulas (irradiadas)
del paciente para evaluar su respuesta. Se ob
tendr un cultivo positivo en aquellas clulas
del panel que responden al mismo alelo DP que
las pre-estimul.
Ya habam os mencionado la existencia de
numerosos alelos HLA-DR que no pueden ser
distinguidos por las tcnicas de tipificacin se
rolgica (cuadro 29-3). Existen actualmente tc
nicas moleculares, basadas en la reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR), que en muchos
laboratorios ya han reemplazado a las tcnicas
serolgicas. Existen procedimientos que permi
ten realizar una tipificacin molecular de baja
resolucin, que brinda informacin equiva
lente a las especificidades serolgicas (D R l,
DR2, etc.) y que para muchas aplicaciones de
rutina (ej. estudios de histocompatibilidad para
trasplante renal) son muy adecuadas. Existen
adems, tcnicas de tipificacin molecular de
alta resolucin, que perm iten definir con
precisin qu alelos DRB posee un individuo
(ej. DRB1*1602, DRB1*1311, etc.). Estas lti
mas son tiles para estudios de histocompatibi
lidad para trasplante de mdula sea. Ntese
que una reaccin de cultivo mixto linfocitario
positiva entre dos individuos definidos por sero
loga como HLA-idnticos, se debe a la presen
cia de subtipos allicos que sern discernibles
por estas nuevas tcnicas moleculares de alta
resolucin. Por otra parte, estas tcnicas tam
bin son tiles para tipificar individuos inmunodeficientes portadores del sndrome de los linfo
citos desnudos, cuya nica posibilidad de so
brevida depende de un trasplante de m dula
sea. Tambin son tiles en medicina forense
para la tipificacin de muestras biolgicas don

de no se ha preservado la viabilidad celular, pe

ro s se dispone de ADN de las mismas.
HLA y gentica poblacional
Los diversos alelos de clase I y clase II estn
distribuidos en la poblacin con cierta frecuen
cia, que vara segn los grupos tnicos; un ale
lo muy poco frecuente en caucsicos norteame
ricanos podr ser muy comn en orientales y
viceversa. Asimismo, la identidad definida por
serologa de un alelo dado en dos individuos
pertenecientes a grupos tnicos distintos, no
necesariam ente indica la presencia de genes
idnticos; se han identificado variantes tnicas
por cultivo mixto linfocitario y por estudios de
ADN.
Para calcular en una poblacin la frecuencia
con que aparecen simultneamente un alelo de
un locus junto a otro alelo de otro locus, se
multiplican las frecuencias que cada uno de los
alelos posee individualmente. Por ejemplo, el
H LA-B8 est presente en el 15% de blancos
caucsicos y el HLA-DR3 est presente en un
20%. La proporcin de individuos que simult
neamente son HLA-B8, DR3 debiera ser: 0.15
X 0.20 = 0.03, o sea 3%. Sin em bargo, esta
combinacin se halla en un 7% de la poblacin.
En otro ejemplo, el 70% de los individuos por
tadores de HLA-B35, tambin son HLA-Cv^4.
Este fenmeno se denomina d esequilibrio de
ligam iento y refleja la existencia de loci en el
genoma que segregan juntos con ms frecuen
cia que la esperada por simple azar. Esto puede
deberse a la presencia de genes cercanos, que
por algn motivo (ventajas evolutivas?) an no
han sido separados por suficientes Crossing
overs. Cuando este desequilibrio involucra a
varios genes, uno se refiere a ellos como haplo
tipos e xten d id o s, ej. H LA-A1,B8,DR3 es un
haplotipo frecuente.
HLA y enferm edad
Se han descrito ms de 500 patologas que se
desencadenan ms frecuentem ente en indivi
duos portadores de determinados alelos HLA.
Muchas de estas patologas, aunque no todas,
involucran la participacin de respuestas inmu
nes: enfermedades infecciosas, oncolgicas o
de naturaleza autoinmune. Por ejemplo, el 95%
de los individuos que desarrollan enfermedad
celaca son HLA-DQ2, mientras que este alelo
est presente en el 35% de un a poblacin sana.
Se dice, entonces que HLA-DQ2 predispone o
da ms riesgo de padecer esta enfermedad. No
en todos los ejemplos descritos, el alelo asocia
do est presente en un porcentaje tan alto de
pacientes; se habla en estos casos de asocia
cin incompleta.

Estructura y funcin del complejo m ayor de histocompatibilidad

Es obvio que la fuerza de la asociacin de
pender de la frecuencia del alelo HLA en el
grupo de enfermos comparada con la poblacin
normal. Si se tiene en cuenta que la frecuencia
de los alelos vara segn las diversas poblacio
nes, se calcula un nmero, llamado riesgo rela
tivo (estrictamente llamado '"odds ratio), que
indica cuntas veces ms riesgo de padecer la
enferm edad poseen los portadores del alelo
respecto de los que no lo portan. Se calcula a
partir de las llamadas tablas de 2 x 2, que com
putan el nmero de pacientes y sanos poseedo
res o no del alelo en cuestin:

605

de Aspj.^, posee un efecto protector, que es do

minante, esto es un heterocigota A spV A sp
posee riesgo mnimo; asimismo el riesgo con
ferido por los alelos DQB que poseen reem pla
zado el A sp, se ejerce en forma recesiva (se
m anifiesta en hom ocigosis). Ntese que esta
asociacin slo puede estudiarse por tcnicas
de tipificacin molecular, las que se estn apli
cando para replantear muchas de las asociacio
nes descritas por serologa.
Para la inmensa mayora de las asociaciones,
se desconoce el mecanismo de accin y si son
efectivamente las MHC las involucradas en la
patognesis o si son meros marcadores genti
cos. Los mecanismos postulados incluyen:

A le lo H L A

ENFERM OS

SA NOS

R ie s g o rela tiv o

aJc
b /d

Hay algunas asociaciones con riesgo relativo

muy alto (> 20): por ejemplo la enfermedad celaca y el HLA-DQ2; la espondilitis anquilosan
te y HLA-B27; narcolepsia y HLA-DR2; diabe
tes tipo I (insulinodependiente) y ciertos alelos
HLA-DQ, etc. A veces se observan asociacio
nes negativas, es decir, la frecuencia de un alelo
est significativamente disminuida entre los pa
cientes; se los denomina alelos protectores.
Muchas de las enferm edades asociadas al
HLA son m ultifactoriales, donde hay varios
factores genticos y am bientales implicados.
Esto se observa al estudiar la incidencia de la
e n ferm ed ad en p a re ja s de h erm an o s. P o r
ejemplo, la diabetes de tipo I, afecta a ambos
herm anos H LA -idnticos en un 10% de los
casos, pero afecta a ambos herm anos si son
gemelos univitelinos en un 30-40% de los ca
sos. E sta discordancia indica que hay otros
facto res g en tico s im p lic a d o s adem s del
HLA y que tambin hay factores ambientales.
En la poblacin, una muy pequea proporcin
de los portadores de los genes de riesgo desa
rrollar la enferm edad, lo que se denom ina
baja penetrancia.
En los ltimos aos, la posibilidad de tipifi
car ms precisamente los alelos HLA, hizo reevaluar muchas de las asociaciones descritas co
mo incom pletas. Q uiz el m ejor ejem plo lo
constituye la diabetes de tipo I, histricamente
asociada a HLA-DR3 y DR4, con riesgos rela
tivos modestos, entre 4 y 6. Hoy conocemos
que la asociacin p rim aria es con el lo cu s
HLA-DQ, con alelos DQA que poseen residuo
Arg en la posicin 52 y alelos DQB que no po
seen Asp en posicin 57. La presencia en DQB

1) Genes ligados dentro del HLA. Una enfer

m edad m etablica hereditaria, la hiperplasia
suprarrenal congnita, se asocia a portadores
de HLA-B47 y se explica por la presencia en
los portadores de este alelo, de genes 2 10H B
defectuosos. Para otras patologas con base in
mune, se sospecha del papel de los genes C2,
C4, Bf, TNF, TAP, LMP, etc.
2) Alelos HLA en seleccin tmica. La idea
es que slo determinados alelos permiten una
eficiente delecin de clones autorreactivos. Su
efecto sera dom inante (se ejercera en h o
mocigosis o heterocigosis) y el caso de DQB
Asp,^ y diabetes de tipo I mencionado antes
podra ser un ejemplo. Otros alelos HLA per
mitiran la seleccin positiva de ciertos clones
autorreactivos o de clones capaces de respon
der a ciertos epitopes inm unodom inantes de
patgenos.
3) Alelos HLA en la presentacin antignica.
Se refiere a una incapacidad de ciertos alelos
de unir o presentar adecuadam ente p ptidos
microbianos, con falta de respuesta o induccin
de anergia o supresin.
4) Reaccin cruzada de MHC con antgenos
microbianos. Se han documentado homologas
de secuencia entre ciertas protenas de estrs
trmico y molculas HLA. Este mimetismo m o
lecular afectara el reconocim iento adecuado
de ciertos antgenos.
5) Reaccin cruzada de antgenos m icrobia
nos con autoantgenos. C iertos alelos H LA
unidos a pptidos m icrobianos, asem ejan la
presentacin de pptidos propios.
Hay evidencias experimentales en un solo m o
delo, de un papel directo de las MHC. Se trata de
la generacin de ratas transgnicas que expresan
los genes para HLA-B27 (cadena pesada y 32microglobulina humana), que espontneamente
desarrollan una patologa similar a las espondiloartropatas humanas. Sin duda estos modelos
animales contribuirn a un mejor conocimiento
del mecanismo de estas asociaciones.

606

Inmunopatologa

HLA Y TRA SPLA N TE

Existen diversos tipos de injertos:
a) Injerto autiogo: de y al mismo individuo,
no se produce rechazo (piel, mdula sea).
b) Injerto singeneico o islogo: entre melli
zos idnticos, tampoco se produce rechazo.
c) Injerto alogeneico; entre individuos de la
misma especie. Si el donante comparte con el
recipiente slo uno de los haplotipos (ej. padres
hijos), se llama haploidntico.
d) Injerto xenogeneico: entre individuos de
diferentes especies.

posible que la plasmafresis pueda ser una tera

pia til para evitar el rechazo hiperagudo.
II)
El rechazo agudo se debe a linfocitos T
CD4+ inductores, macrfagos y linfocitos T-citotxicos. En todas las combinaciones donantereceptor que no sean meUizos idnticos un re
chazo agudo letal comenzar a los 5-7 das del
trasplante. Se utilizan tres estrategias para com
batir el rechazo agudo;

a) Transfusin sangunea. Por alguna oscura

razn, la tran sfu si n sangunea parece que
mantiene a los linfocitos T ms tolerantes a
subsecuentes aloinjertos, de manera que el re
T rasp lan te de rin
chazo agudo es menos severo. Sin embargo, s
Los trasplantes de rin generalmente se di ta es un arma de doble filo, porque puede cau
viden en dos categoras; donante familiar vivo, sar la fo rm aci n de an ticu erp o s, dando un
o donante cadavrico no fam iliar. Todos los cross-match positivo contra el prximo donan
trasplantes de rin deben ser compatibles para te de rin e inducir un rechazo hiperagudo si
los antgenos sanguneos del grupo ABO. El el trasplante sigue su curso. En realidad, se ha
rhesus carece de importancia. El rechazo del ri sugerido que el efecto de la transfusin es un
n puede ser de tres clases; I) hiperagudo, II) artificio producido al seleccionar a todos aque
agudo y III) crnico.
llos con sistemas inmunes agresivos, inducien
do tantos anticuerpos en ellos que nunca pue
1) El rechazo hiperagudo es causado por an den ser trasplantados y no aparezcan en las es
ticuerpos preexistentes que reaccionan (gene tadsticas de seguimiento. Sin embargo, gene
ralmente) contra molculas de clase I sobre la ralmente se acepta que hay un efecto beneficio
superficie de las clulas de rin injertadas. Es so misterioso de la transfusin sangunea sobre
tos anticuerpos son el resultado de una inmuni el rechazo agudo de un aloinjerto siguiente.
zacin previa; transfusin sangunea, embarazo Hay una controversia acerca de cunta sangre
o un injerto anterior. Estos pueden ser detecta se debera dar: los norteamericanos creen que
dos, y el trasplante ser cancelado, haciendo un tanta como sea posible, los europeos piensan
cross-match entre las clulas del donante (lin que una o dos unidades son suficientes. En este
focitos) y el suero del receptor. Se mezclan las ltimo caso, el peligro de inducir la formacin
clulas y el suero durante 60 minutos, luego se de anticuerpos es muy reducido.
le agrega el com plem ento, y las clulas son
A dem s de la seleccin se han postulado
examinadas para ver si son viables despus de otros dos posibles mecanismos para explicar el
otras 2 horas, con una tcnica similar a la des misterioso efecto de la transfusin sangunea:
crita anteriormente. Se toman muestras de sue a) los linfocitos T inductores y citotxicos se
ro de los pacientes renales luego de cada trans ran activados previo al trasplante, por lo que
fusin y se guardan para cuando se realiza el seran ms vulnerables a la terapia antirrechazo
cross-match. Los niveles de anticuerpos pue y b) se activan clulas T supresoras.
den elevarse y luego caer hasta niveles no de
Se han utilizado transfusiones sanguneas del
tectables. De esta manera, el tener muestras se donante previas al trasplante de rin de do
riadas permite determinar con mayor seguridad nante vivo con, aparentemente, buenos resulta
los niveles de Acs y clulas de memoria para dos.
los aloantgenos del donante potencial.
b) Compatibilidad. 1) Donantes vivos fa m i
Si la prueba de cross-match es positiva y si liarmente relacionados. Existe una clara dife
de todas maneras se realiza el trasplante, el ri rencia en la sobrevida del injerto entre mellizos
n morir en minutos. Si la prueba con suero idnticos, o combinaciones entre donantes y re
reciente es negativa, pero con un suero viejo es ceptores que comparten 2 haplotipos, 1 haploti
positiva, el rin puede mantenerse en buenas po o ninguno, siendo los primeros los de mejor
condiciones, pero existe el riesgo de un recha pronstico. Es incierto en los trasplantes entre
zo hiperagudo levem ente demorado (algunas individuos relacionados, si los antgenos de
veces denominado rechazo acelerado) en los clase I o clase II son ms importantes, ya que
primeros tres das. Si la prueba es positiva, el no se han comparado hermanos donantes con
trasplante no se realiza; de esta manera, rara recombinaciones dentro del HLA; siempre se
vez se ve un rechazo hiperagudo. Si por alguna elige a los que comparten haplotipos enteros.
razn efectivamente se produce el trasplante es Todos estos pacientes reciben corticoides y

Estructura y funcin del complejo m ayor de histocompatibilidad

607

azatioprina, como terapia antirrecliazo, trata

Tiempo de isquemia fra (TIF): es el tiempo
miento que no alcanza a obtener los valores de entre la perfusin con fluidos fros y la cone
sobrevida de los gemelos idnticos. Si no reci xin a la sangre oxigenada caliente del recep
bieran terapia, la diferencia en la sobrevida tor, Mximo permitido para el TIF: 60 horas, si
comparada con los mellizos idnticos sera m a el TIC es corto.
yor. 2) Injerto cadavrico no relacionado. H as
ta ahora el criterio ha sido tratar de compatibi- Trasplante de corazn
lizar el donante y el receptor tanto como sea
posible, para los alelos de los loci de clase I co
Obviamente slo se realiza con donantes ca
mo los DR. Aun las mejores compatibilidades davricos, Deben ser ABO co m p atib les. La
no se comportan tan bien como lo hacen los compatibilidad HLA por lo general es im posi
donantes vivos relacionados, que comparten 2 ble que ocurra, pero el cross-match es im por
haplotipos. En la prctica, es estadsticamente tante, a causa de que puede ocurrir rechazo hiimposible compatibilizar para todos los loci en peragudo. La ciclosporina ha mejorado las ci
forma simultnea y, aun si se pudiera hacer, s fras de supervivencia.
lo las definiciones serolgicas de los alelos es
tn disponibles. Ya hemos dicho que las clu Trasplante de hgado
las T pueden encontrar, por ejemplo, diferen
cias entre dos alelos del HLA-A2 en dos indi
Slo se realiza a partir de donantes cadavri
viduos no relacionados que aparecen idnticos cos para adultos. En pediatra puede realizarse
en la tipificacin serolgica, o identificar alelos una reseccin parcial heptica de un donante fa
del locus D, que no concuerdan con los DR. miliar adulto. A unque originalmente se crea
Dada la efectividad de ciertas terapias antirre- que la compatibilidad HLA no era importante,
chazo, hay consenso en que se debe lograr al hoy hay suficientes estudios con largos perodos
menos una tipificacin de especificidades sero de supervivencia que muestran mejor evolucin
lgicas correctamente, ya sea por tcnicas se en situaciones donde se com parte dos alelos
DR, vs. un alelo y vs. ninguno. Los alelos de
rolgicas o moleculares.
c)
Teraputica antirrechazo. La teraputica clase I parecen tener menor importancia. De to
convencional es con corticoides y azatioprina. dos modos, el hgado es rechazado menos agre
Otras drogas y regmenes usados son la globu sivamente que otros rganos, pero los rechazos
lina antitimoctica, ciclofosfamida, esplenecto- afectan en forma adversa las anastomosis, por
ma, y la irradiacin linfoidea total. La ciclos lo que aqu tambin la ciclosporina es muy til.
porina A es un agente inm unosupresor alta
mente efectivo que ha mejorado todas las cifras Injertos de piel (queratinocitos)
de sobrevida al injerto. De acuerdo con algunas
publicaciones, una complicacin que acompaa
Los queratinocitos alogeneieos cultivados
a esta droga es la aparicin de linfomas espon (provenientes de donantes jvenes), injertados
tneos y otros tumores.
en lechos crnicam ente daados, a m enudo
La mayor parte de los episodios de rechazo promueven una cicatrizacin que los autoinjeragudo tienen lugar dentro de los 3 meses del tos no producen. Tambin es til en grandes
trasplante; se caracterizan por un sbito m ales quemaduras, donde la piel autloga es insufi
tar con fiebre, dolor en la zona del injerto y ciente pai'a autoinjertos. Todos los leucocitos y
brusca cada de la funcin. El tratamiento usual clulas de Langerhans (dendrticas) se pierden
es de 1 g de prednisolona; por lo general fun en el cultivo. Los queratinocitos cultivados no
ciona.
expresan molculas de clase II.
ril) Rechazo crnico. Es una cada gradual
en la funcin a lo largo de meses o aos. La
causa es incierta, pero podra deberse en parte a
tipificaciones HLA mal realizadas. No hay tra
tamiento efectivo. Hay conceptos crticos que
deben ser considerados:
Tiem po de isquem ia caliente (TIC). Es el
tiempo entre el corte de suministro de sangre
oxigenada caliente del donante y la perfusin
del rin con fluidos de perfusin fros. Este
tiempo es de alrededor de 2 minutos en donan
tes vivos y cadavricos con corazn latente. El
mximo permitido: alrededor de 30 minutos.

Injerto de crnea
En la crnea hay clulas epiteliales en la par
te externa, endoteliales (interna) y queratocitos
(fibroblastos) en el estroma. La crnea es avascular, pero los linfocitos penetran en ella, por
lo cual podra ocurrir un rechazo. En la prcti
ca, la mayor parte de los injertos no se recha
zan (no se da teraputica antirrechazo ni se
busca histocompatibilidad). Razones posibles:
muerte de algunas clulas durante el alm acena
miento; ausencia de molculas de clase II en
los queratocitos; una penetracin lenta de las
clulas defensivas del husped en un tejid o

608

Inmunopatologa

avascular. Sin embargo, algunos pacientes re

chazan injertos en forma recurrente; por lo ge
neral aquellos que tienen un lecho vascularizado para el injerto vascularizado. En estos casos,
la compatibilidad para clase II es til.
Trasplante de mdula sea
Las principales indicaciones son; 1) inmunodeficiencias congnitas; 2) anemia aplsica y 3)
reconstitucin luego de una irradiacin total del
cuerpo por leucemias u otros tumores malignos.
La compatibihdad para los grupos sanguneos
ABO y Rh no importa, lo mismo que el crossmatch serolgico, pero la compatibihdad HLA
es vital. Si el sistema inmune del husped est
intacto, como en el caso de ia aplasia de glbu
los rojos, el husped puede rechazar el injerto
(husped contra injerto). Si el sistema inmune
del husped es deficiente (la situacin usual en
leucemias, por ej.), el injerto puede rechazar al
husped: enfermedad aguda de injerto contra
husped. Esto se debe a que la m dula sea
siempre contiene un gran nmero de linfocitos T
maduros que atacarn al recipiente histoincompatible. Sin controlar esta variable, ocurren los
siguientes sucesos: rash cutneo, prdida del ca
bello, diarrea profusa, dao heptico, infeccio
nes y muerte. Actualmente se intenta la elimina
cin de los linfocitos T maduros de la mdula
sea del donante mediante Ac monoclonales di
rigidos contra molculas de diferenciacin pre
sentes exclusivamente en los hnfocitos T. Ade
ms se administra ciclosporina al receptor.
La nica combinacin rcahiiente exitosa es
la de los gem elos idnticos y herm anos que
comparten 2 haplotipos. La compatibilidad de
2 haplotipos requiere tratam ien to co n tra la
reaccin de injerto contra husped. No muchos
pacientes tienen hermanos con los que compar
ten 2 haplotipos. Si se pudiera usar un haploti
po compatible, mejorara radicalmente el pro
nstico en leucemias e inmunodeficiencias. En
caso de donantes no-relacionados (de bancos
de donantes de mdula), es crucial una correcta
tipificacin molecular de los alelos HLA.
BIBLIOGRAFA
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Inmunodeficiencias

MARTA ZELAZKO
MARA RIVAS

IN M U N O D E FIC IE N C IA S P R IM A R IA S
G eneralidades
Las in m u n o d eficien cias prim arias (ID P )
constituyen un grupo lieterogneo de enferme
dades producidas en general por defectos gen
ticos.
La frecuencia de estas afecciones es baja y
no ha sido definitivamente determinada en m u
chos pases. Estadsticas de Japn de 1981 y de
Australia de 1983, sugieren una incidencia de
1:10.000, excluyendo la deficiencia de IgA
asintomtiea. En el estudio australiano determi
nan una frecuencia de 1:103.000 para la agam
m aglobulinemia ligada al X (ALX), 1:66.000
para la inm unodeficiencia combinada severa
(IDCS), 1:83.000 para la inm unodeficiencia
comn variable (IDV) y 1:66.000 para el Sn
drome de DiGeorge.
En otros pases, como Francia, se ha seala
do un aumento en la incidencia, probablemente
por mejor diagnstico, de la IDCS, siendo su
frecuencia actual de 1:25.000 nacidos vivos.
En Latinoamrica no hay estadsticas, y en
nuestro pas se ha comenzado recientemente un
sistema de registro nacional con este fin.
Los defectos inmunolgicos en las IDP pue
den involucrar a cualquiera de los componentes
del sistema inmune: linfocitos, clulas fagocti
cas, protenas del sistema complemento. Estos
defectos producen una prdida de proteccin o
defensa contra agresiones externas causadas
por distintos microorganismos, dando lugar a la
m anifestacin clnica caracterstica de estos
sndromes, que es la exagerada susceptibilidad
al desarrollo de procesos infecciosos bacteria
nos, virales y micticos, recidivantes o crni
cos. La gravedad de los procesos infecciosos

30
depende del grado y tipo de defecto presente en
cada caso.
Es importante destacar que, siendo las IDP
enfermedades relativam ente poco frecuentes,
deben tenerse en cuenta siempre otras causas
de infeccin recidivante o crnica, com o son
las enferm edades m etablicas, desnutricin,
diabetes, las malformaciones del tracto urina
rio, del aparato respiratorio, el tratamiento con
drogas citostticas, etc. Otro hecho que debe
considerarse, ya que dificulta el diagnstico de
IDP, es la compleja relacin existente entre in
feccin e inmunidad. La infeccin puede cau
sar inmunodeficiencia y puede ser la resultante
de la misma. Muchos agentes infecciosos, par
ticularmente los virales, determinan estados de
inmunodeficiencia, difciles de diferenciar de
sndromes de IDP. El ejemplo ms claro de es
ta situacin es la infeccin por HIV en recin
nacidos o lactantes, que plantea dificultades de
diagnstico diferencial con deficiencias prim a
rias de la inmunidad celular.
Es im portante reconocer que en la dcada
del 50, cuando comenzaron a describirse estas
enfermedades, el anlisis de las alteraciones inm unolgicas halladas en estos p acientes ha
contribuido a la comprensin de muchas de las
funciones del sistema inmune normal y ha per
mitido delinear las anomalas inmunolgicas de
otras deficiencias mucho ms frecuentes como
son las secundarias a tumores, tratamientos in
munosupresores, desnutricin, etc.
En los ltimos aos la biologa molecular ha
hecho aportes fundamentales para la com pren
sin de la etiopatogenia de muchas de estas en
fermedades, a travs del estudio de dos tipos de
animales genticamente modificados:
1)
Animales transgnicos, capaces de expre
sar un producto gnico humano.

608

Inmunopatologa

avascular. Sin embargo, algunos pacientes re

chazan injertos en forma recurrente; por lo ge
neral aquellos que tienen un lecho vascularizado para el injerto vascularizado. En estos casos,
la compatibilidad para clase II es til.
Trasplante de m dula sea
Las principales indicaciones son: 1) inmunodeficiencias congnitas; 2) anemia aplsica y 3)
reconstitucin luego de una irradiacin total del
cuerpo por leucemias u otros tumores malignos.
La compatibiUdad para los grupos sanguneos
ABO y Rh no importa, lo mismo que el crossmatch serolgico, pero la compatibilidad HLA
es vital. Si el sistema inmune del husped est
intacto, como en el caso de la aplasia de glbu
los rojos, el husped puede rechazar el injerto
(husped contra injerto). Si el sistema inmune
del husped es deficiente (la situacin usual en
leucemias, por ej.), el injerto puede rechazar al
husped: enfermedad aguda de injerto contra
husped. Esto se debe a que la m dula sea
siempre contiene un gran nmero de linfocitos T
maduros que atacarn al recipiente histoincompatible. Sin controlar esta variable, ocurren los
siguientes sucesos: rash cutneo, prdida del ca
bello, diarrea profusa, dao heptico, infeccio
nes y muerte. Actualmente se intenta la elimina
cin de los linfocitos T maduros de la mdula
sea del donante mediante Ac monoclonales di
rigidos contra molculas de diferenciacin pre
sentes exclusivamente en los linfocitos T. Ade
ms se administra ciclosporina al receptor.
La nica combinacin realmente exitosa es
la de los gem elos idnticos y herm anos que
comparten 2 haplotipos. La compatibilidad de
2 haplotipos requiere tratam ien to co n tra la
reaccin de injerto contra husped. No muchos
pacientes tienen hermanos con los que compar
ten 2 haplotipos. Si se pudiera usar un haploti
po compatible, mejorara radicalmente el pro
nstico en leucemias e inmunodeficiencias. En
caso de donantes no-relacionados (de bancos
de donantes de mdula), es crucial una correcta
tipificacin molecular de los alelos HLA.
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Inmunodeficiencias

MARTA ZELAZKO
MARA RIVAS

IN M U N O D E FIC IE N C IA S PRIM A R IA S
G eneralidades
Las in m u n o d eficien cias prim arias (ID P )
constituyen un grupo lieterogneo de enferme
dades producidas en general por defectos gen
ticos.
La frecuencia de estas afecciones es baja y
no ha sido definitivamente determinada en m u
chos pases. Estadsticas de Japn de 1981 y de
Austraha de 1983, sugieren una incidencia de
1:10.000, excluyendo la deficiencia de IgA
asintomtica. En el estudio austrahano determi
nan una frecuencia de 1:103.000 para la agam
m aglobulinemia ligada al X (ALX), 1:66.000
para la inm unodeficiencia combinada severa
(IDCS), L 83.000 para la inm unodeficiencia
comn variable (IDV) y 1:66.000 para el Sn
drome de DiGeorge.
En otros pases, como Francia, se ha seala
do un aumento en la incidencia, probablemente
por mejor diagnstico, de la IDCS, siendo su
frecuencia actual de 1:25.000 nacidos vivos.
En Latinoamrica no hay estadsticas, y en
nuestro pas se ha comenzado recientemente un
sistema de registro nacional con este fin.
Los defectos inmunolgicos en las IDP pue
den involucrar a cualquiera de los componentes
del sistema inmune: linfocitos, clulas fagocti
cas, protenas del sistema complemento. Estos
defectos producen una prdida de proteccin o
defensa contra agresiones externas causadas
por distintos microorganismos, dando lugar a la
m anifestacin clnica caracterstica de estos
sndromes, que es la exagerada susceptibilidad
al desarrollo de procesos infecciosos bacteria
nos, virales y micticos, recidivantes o crni
cos. La gravedad de los procesos infecciosos

30
depende del grado y tipo de defecto presente en
cada caso.
Es importante destacar que, siendo las IDP
enfermedades relativam ente poco frecuentes,
deben tenerse en cuenta siempre otras causas
de infeccin recidivante o crnica, com o son
las enferm edades m etablicas, desnutricin,
diabetes, las malformaciones del tracto urina
rio, del aparato respiratorio, el tratamiento con
drogas citostticas, etc. Otro hecho que debe
considerarse, ya que dificulta el diagnstico de
IDP, es la compleja relacin existente entre in
feccin e inmunidad. La infeccin puede cau
sar inmunodeficiencia y puede ser la resultante
de la misma. Muchos agentes infecciosos, par
ticularmente los virales, determinan estados de
inmunodeficiencia, difciles de diferenciar de
sndromes de IDP. El ejemplo ms claro de es
ta situacin es la infeccin por HIV en recin
nacidos o lactantes, que plantea dificultades de
diagnstico diferencial con deficiencias prim a
rias de la inmunidad celular.
Es im portante reconocer que en la dcada
del 50, cuando comenzaron a describirse estas
enfermedades, el anlisis de las alteraciones inm unolgicas halladas en estos p acientes ha
contribuido a la comprensin de muchas de las
funciones del sistema inmune normal y ha per
mitido delinear las anomalas inmunolgicas de
otras deficiencias mucho ms frecuentes como
son las secundarias a tumores, tratamientos in
munosupresores, desnutricin, etc.
En los ltimos aos la biologa molecular ha
hecho aportes fundamentales para la com pren
sin de la etiopatogenia de muchas de estas en
fermedades, a travs del estudio de dos tipos de
animales genticamente modificados;
1)
Animales transgnicos, capaces de expre
sar un producto gnico humano.

610

Inmunopatologa

2)
Animales knockout, donde la precisa que de acuerdo a la hiptesis de Lyon, todas las
delacin de genes ofrece la posibilidad del an clulas somticas de las mujeres tienen un slo
cromosoma X activo; como la inactivacin del
lisis minucioso de sus funciones.
Paralelamente, los avances en el estudio del X ocurre al azar, el 50% de clulas de cada li
genoma humano y el mapeo de genes relevan naje tendr un X activo y el 50% restante el
tes, permitieron entender las bases moleculares otro. Se ha demostrado, por ejemplo, en muje
res portadoras obligadas de agammaglobuline
de diversas inmunodeficiencias.
mia, que todos sus linfocitos B tienen el cro
mosoma X normal y ninguno el que porta el
G entica
defecto; es decir que no se produjo la inactiva
La mayor parte de las IDP son hereditarias, cin al azar del X. En todas las otras clulas so
resultante de distintos defectos genticos. Hasta mticas estudiadas (linfocitos T, monocitos) se
hace pocos aos el defecto molecular y gentico encontr inactivacin al azar. Este estudio per
bsico slo se conoca para un nmero muy li miti concluir que el gen normal en el cromo
mitado de IDP [deficiencia de adenosina desa- soma X es esencial para la diferenciacin B, ya
minasa (ADA), purinonucletido fosforilasa que los precursores que inaetivaron el gen nor
(PN P), enferm edad g ran u lo m ato sa cr n ica mal y slo expresan el defectuoso, no conti
(EGC)]. En los ltimos dos aos, gracias a los nan su diferenciacin. Adems, se concluye
adelantos de la gentica y biologa molecular, se que el defecto primario est slo en el linaje B
describieron estas alteraciones en tres IDP liga y no afecta mecanismos regulatorios T, como
das al cromosoma X (ALX, inmunodeficiencia haba sido postulado por algunos autores.
con hiper IgM, IDCS ligada al X) y se ha aisla
Finalmente, estos datos explican la respuesta
do un nuevo gen denominado WASP, mutado inmune normal en portadoras del defecto.
en pacientes con sndrome de Wiskott-Aldrieh,
proponindose la alteracin de este gen como Etiologa y patogenia
responsable del sndrome. Las tcnicas de biolo
ga molecular que usan sondas para fragmentos
En lo que respecta a su etiologa, como diji
polimrficos en el ADN, han contribuido al es mos, la mayor parte de las IDP son enfermeda
tudio de familias informativas, con uno o ms des hereditarias producidas por distintos defec
miembros afectados y con ello han permitido, tos genticos.
por un lado conocer la localizacin cromosmiLa patogenia de estos variados sndrom es
ca de los genes afectados y, por otro, al diagns responde a distintos mecanismos. Mencionare
tico prenatal y de portadores. En el cuadro 30-1
mos algunos de ellos, que sern ampliados al
se mencionan algunos de estos ejemplos. T e describir cada una de las enfermedades.
niendo en cuenta que las IDP son en general en
fermedades graves para las que las conductas te
1) Defectos madurativos (vase fig. 30-1)
raputicas son escasas en la actualidad, el diag
2) Dficit enzimticos, como la deficiencia
nstico de portador y el diagnstico prenatal ad de ADA y PNP.
quieren importancia para el consejo gentico.
3) Alteraciones regulatorias, como se ha pro
Muchas de las IDP son enferm edades con puesto para la deficiencia de IgA y el sndrome
transmisin gentica ligada la sexo (agamma de hiper-IgE.
globulinem ia, IDCS, etc.). En estos casos el
4) Fallas en la activacin del linfocito T co
diagnstico de portadoras puede realizarse tam mo en el dficit de expresin de CD3y y CD3e.
bin estudiando la distribucin de los cromoso
5) A lteraciones en la produccin de linfo
mas X activos en distintos linajes celulares. Pa quinas.
ra entender este concepto, debemos recordar
6) Fallas en las vas metablicas. Ej. EGC.

C uadro 30-1. Localizacin gentica de algunas inmunodeficiencias p or sondas de ADN

Enferm edad
A g a n im a g lo b u lin e ra ia lig a d a al X

L ocalizacin gentica

Sonda ligada al defecto

X q 2 l.3 - q 2 2

DX S17

ID C S lig a d a al X

X q U - q l3

D X S159

S n d ro m e d e W is k o tt-A ld ric h

X p l 1-pl 1.3

D X S7

D e fic ie n c ia c o n h ip e r
Ig M lig a d a al X

X q 2 4 -q 2 7

D X S42

Inmunodeficiencias

611

Dficit de interieuquinas
Dficit de componentes de CD3

Di George

Serie
mieioide

Piaquetas

F ig . 3 0 -1 . L o c a liz a c i n d e lo s d e fe c to s m a d u r a tiv o s en las d ife re n te s in m u n o d e fic ie n c ia s p rim a ria s.

Manifestaciones clnicas generales

La manifestacin clnica fundamental es la
exagerada susceptibilidad a la infeccin. Los
pacientes con IDP presentan infecciones recidi
vantes y prolongadas, en general graves y com
plicadas, as como infecciones por microorga
nismos no patgenos para la poblacin normal.
Siendo stas generalm ente enferm edades
congnitas o hereditarias, se presentan con m a
yor frecuencia (60%) en lactantes o nios. El
antecedente de familiares con infecciones seve
ras o muerte temprana constituye un dato im
portante de la historia clnica. Las inmunodefi

ciencias predominantes de anticuerpos son las

ms frecuentes, constituyendo aprox.imadamente el 50% de todas las IDP. En cuanto a la
distribucin por sexo, la incidencia es m ayor
en varones, hecho que se explica por la trans
misin ligada al cromosoma X en muchas de
ellas.
El aparato respiratorio es el ms comprome
tido por los procesos infecciosos, siendo los
pacientes especialmente propensos a la sinusi
tis, otitis supuradas, bronquitis y neum ona.
Las infecciones recidivantes del parnquim a
pulmonar conducen con frecuencia al desarro
llo de bronquiectasias. Otras localizadtmes de

612

Inmunopatologa

procesos infecciosos recidivantes son la piel, el

aparato digestivo y sistema nervioso central. La
diseminacin de las infecciones puede conducir
a sepsis. Las vas urinarias se comprometen s
lo excepcionalmente en las IDP.
Los microorganismos responsables de las in
fecciones dependen del sector de la respuesta in
mune predominantemente alterado. En las inmu
nodeficiencias de anticuerpos los agentes res
ponsables suelen ser grmenes pigenos encap
sulados, extracelulares, como estreptococo, Haemofilus influenzae, estafilococo. En las deficien
cias celulares se producen infecciones por virus
(citomegalovirus, hei-pesvirus, etc.), hongos co
mo la Cndida albicans y agentes de baja pato
genicidad como el Pneumocistis carinii. En los
defectos de fagocitosis, las bacterias catalasa po
sitivas, fundamentalmente el Staphyococcus au
reus y en las deficiencias de los componentes
tardos del sistema complemento (C5-C9), los
grmenes gram negativos tipo Neisseria.
Los sntomas clnicos del tracto gastrointes
tinal, diarrea crnica y/o malabsorcin son re
lativamente frecuentes as como el retraso pondo-estatural en los nios. Otras m anifestacio
nes menos frecuentes son la hepatoesplenome
galia, derm atitis seborreica, eccema, anemia,
neutropenia. Algunos signos clnicos se presen
tan asociados a sndrom es bien definidos y
contribuyen a su diagnstico; as, por ejemplo,
se encuentra hemorragia por trombocitopenia,
y eccema en el sndrome de W iskott-Aldrich y
tetania por hipocalcem ia y cardiopata en el
sndrome de Di George y telangiectasias y ata
xia en la ataxia-telangiectasia.
La clnica de las IDP no es claramente dis
tintiva y permite slo orientar el diagnstico.
En todos los casos, el diagnstico definitivo
deber establecerse mediante procedim ientos
apropiados de laboratorio que permitan evaluar
la competencia inmunolgica.
Clasificacin de las IDP
El Comit de Expertos en Inm unodeficien
cias Primarias de la Organizacin Mundial de
la Salud (OMS, 1992) clasific a las IDP en:
A INMUNODEFICIENCIAS COMBINADAS
A l. Combinada severa (IDCS)
a) ligada al X (LX)
b) autosmica recesiva (AR)
A2. Deficiencia de ADA
A3. Deficiencia de PNP
A4. Deficiencia en la expresin de molculas
HLA clase II
A5. Disgenesia reticular
A6. Deficiencias de expresin de CD3 o CD3
A7. Deficiencia de clulas CDS

B.

IN M U N O D E FIC IE N C IA S P R E D O M I
NANTES DE ANTICUERPOS

B l. Agammaglobulinemia ligada al X (ALX)

B2. Agammaglobulinemia ligada al X con d
ficit de hormona de crecimiento
B3. Inmunodeficiencia con hiper IgM
B4. Delecin del gen de cadenas pesadas
B5. Deficiencia de cadenas kappa
B6. Deficiencia de IgA
B7. Deficiencia de subclases de IgG
B8. Inmunodeficiencia comn variable
B9. Hipogammaglobulinemia transitoria de la
infancia
C. INMUNODEFICIENCIAS ASOCIADAS A
OTRAS ANOMALAS BIEN DEFINIDAS
C 1. Sndrome de Wiskott-Aldrich
C2. Ataxia telangiectasia
C3. Sndrome de Di George
D. OTROS SNDROM ES ASOCIADOS A
INMUNODEFICIENCIA
D I. Sndrome de hiper IgE
D2. Candidiasis mucocutnea crnica
D3. Inmunodeficiencia con respuesta inadecua
da al virus de Epstein Barr.
D4. Sndromes de albinismo parcial
D5. Enanismo de miembros cortos
E. DEFECTOS EN LA FUNCIN DE LOS
FAGOCITOS
E l . Enfermedad granulomatosa crnica (EGC)
a) ligada al X
b) autosmica recesiva
E2. Deficiencia de adhesin leucocitaria
E3. Deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa en neutrfilos
E4. Deficiencia de mieloperoxldasa
E5. Deficiencia de grnulos secundarios
F. D EFIC IEN C IA S D EL SISTEM A C O M
PLEMENTO
F l.
F2.
F3.
F4.
F5.

C lq
C lr
C4
C2
C3

F6.
C5
F7.
C6
F8.
C7
F9.
C8
FIO. C9

F ll .
F12.
FI3.
F14.
F15.

C l inhibidor
Factor I
Factor H
Factor D
Properdina

Se describirn los sndromes ms importan

tes dentro de cada categora.
Inmunodeficiencia combinada severa
(IDCS)
Constituyen las enferm edades ms graves
dentro de las IDP. Se presentan en los primeros

Inmunodeficiencias
meses de vida y son un conjunto de sndromes
con transmisin gentica autosmica recesiva o
ligada al sexo. Slo la reconstitucin del siste
ma inm une m ediante trasplantes de m dula
sea perm ite la sobrevida de estos enfermos
que, de no ser tratados, mueren como conse
cuencia de infecciones severas antes del segun
do ao de vida. Los pacientes presentan fre
cuentes episodios de otitis, neumonas, infec
ciones cutneas y sepsis severas, asociadas a
diarrea incontrolable y prdida progresiva de
peso. Predominan las infecciones por agentes
micticos (candidiasis severas), virales (herpes
virus, varicella, enterovirus), parasitarios y gr
menes oportunistas.
Las IDCS son un grupo heterogneo de sn
dromes alguno de los cuales son considerados
tpicos o clsicos, porque invariablemente pre
sentan linfopenia marcada, agammaglobuline
mia y ausencia de funcin inmune humoral y
celular. Estos son:
1. IDCS autosmica recesiva (AR), conocida
como tipo Suizo, que abarca aproxim ada
mente el 25% de las IDCS clsicas.
2. IDCS ligada al X (LX), la ms frecuente,
comprende el 50% de las clsicas, caracteri
zada por ausencia de linfocitos T y valores
normales o elevados de linfocitos B.
3. D eficiencia de ADA, com prende 20-25%
del total, caracterizada por ausencia o nive
les muy bajos de linfocitos T. Los linfocitos
B pueden estar ausentes o normales.
4. Deficiencia de PNP.
5. D isgenesia reticular, sndrom e muy poco
frecuente, cjue asocia a la deficiencia inm u
ne trombocitopenia y granulocitopenia.
Los otros sndromes de IDCS, algunos re
cientemente descritos, pueden ser considerados
como atpleos, ya que pueden presentarse con
recuentos linfocitarios normales, grados varia
bles de hipogam m aglobulinem ia, en algunos
casos, valores normales y slo alteraciones fun
cionales. En las IDCS atipicas, adems, la gra

613

vedad del cuadro clnico puede ser variable aun

en varios miembros de una misma familia con
el mismo defecto molecular. En estos sndro
mes atpicos se incluyen: la deficiencia de m o
lculas del Complejo Mayor de Histocompati
bilidad (CMH) de clase II, la deficiencia de e x
presin de molculas del complejo CD3, la d e
fic ie n c ia de tiro sin a q u in asas aso ciad as al
CD3/1CR (ZAP-70), que fenotpicamente p re
senta ausencia de clulas CD8, a la que pueden
agregarse los raros casos de IDCS asociados a
enanismo de miembros cortos, as como el sn
drome de Ommen (vase ms adelante).
IDCS tpicas o clsicas. La forma autosm i
ca recesiv a (AR) es indistinguible desde el
punto de vista clnico de la LX. Existen sin
embargo diferencias inmunolgicas que perm i
ten distinguirlas (vase cuadro 30-2). En lo re
ferente al defecto gentico y molecular, se sa
be hoy t|ue el gen mutado en la LX, correspon
de al que codifica para la cadena y del IL-2R.
Esta cadena es esencial para la formacin de
un receptor de alta afinidad y la transduccin
de seales de activacin T. En los pacientes
con la form a LX se han documentado distintas
mutaciones puntuales en los exones de dicho
gen. La anomala de cadena y en estos pacien
tes explica la ausencia de respuesta T. La ca
dena Y del receptor IL~2R tambin forma parte
del IL-7R, y de otros receptores de citoquinas.
La IL-7 es crtica para los estadios tem pranos
de la diferenciacin tmica; esto explicara la
ausencia de linfocitos T maduros en este sn
drome.
En la forma AR no se conoce an el defecto
gentico bsico, pero existen evidencias que
sugieren un defecto en alguno de los com po
nentes del sistema recombinasa distintos a los
genes RAG, presumiblemente los asociados a
reparacin del ADN con particular sensibilidad
a las radiaciones ionizantes.
Estudios recientes sostienen el concepto de
que esta deficiencia es equivalente al m odelo
m u rin o de in m u n o d e fic ie n c ia c o m b in a d a
SCID. En el ratn se document el defecto

C uadro 30-2. Caractersticas Inmunolgicas diferenciales de la AR y LX

Caracter.s'tica:
Ligada al X
lin f o c ito s /m m -
C lu la s T/m m -
C lu la s B /m m
C lu la s N K /m m fu n cio n a l
R e s p u e s ta a m it g e n o s, a n tg e n o s y a lo a n tg e n o s
I n m u n o g lo b u lin a s
D e fe c to g e n tic o

Autosm ica recesiva

MD
MD 0 A
MDoA
N oE
MDo A
p a n h ip o g a m m a g lo b u lin e m ia
re c o m b in a s a ?
e n z im a s r e p a r a d o ra s A D N ?

D: dism inuido; M D : m uy d ism in u id o ; A; a u se n te ; E: elevado; N: n o rm al.

D
MDo A
NoE
A lte ra c i n
MDo A
c a d en a y I L -2 R

614

Inmunopatologa

en la recombinacin V(D)J, tanto para el recep

tor de clulas T (TCR) como para los genes de
inmunoglobulinas.
Deficiencias enzimticos. La deficiencia de
ADA y la deficiencia de PNP son formas clsi
cas de IDCS. La enzima ADA participa en el
metabolismo de las purinas y est distribuida
en todos los tejidos del organismo, con la ma
yor actividad en el timo. La deficiencia de esta
enzima determina la acumulacin de los sustra
tos y metabolitos dATP y S-adenosil-homocistena, que inhiben la proliferacin celular y sn
tesis de ADN por inhibicin de la ribonucletido reductasa (fig. 30-2). Estos metabolitos pro
ducen adems efecto txico que genera ruptu
ras cromosmicas. Se han identificado recien
temente numerosas variantes de deficiencia de
ADA, muchas de las cuales se deben a muta
ciones puntuales del gen, que dan lugar a una
forma inactiva o inestable de la enzima y for
mas clnicas moderadas o leves de la enferme
dad. Excepcionalmente se han descrito deleciones del gen en la regin cataltica de la enzima,
que producen las deficiencias clnicas ms se
veras, clsicamente descritas.
En la deficiencia de PNP se produce acumu
lacin de dGTP y la inactivacin de ribonucletido reductasa, con inhibicin de sntesis de
ADN que sera la causa de la inmunodeficien
cia. Por razones no bien conocidas, la deficien
cia es predominantemente celular con clulas B

RR

e inmunoglobulinas normales. En estos pacien

tes se observa aumento de inosina y guanosina
en plasma y de deoxiguanosina en orina.
IDCS atipicas. La deficiencias de MHC de
clase II se incluye en esta categora. Clnica
mente, es una forma grave de IDCS y los datos
actuales sugieren que la deficiencia est causa
da por defectos de genes reguladores y no es
tructurales, ocasionando un defecto en la trans
cripcin de los genes que codifican las molcu
las de clase II. La mayora de los pacientes con
este sndrome tiene una reduccin variable de
clulas CD4+. Esto sugiere la existencia de al
gn tipo de CMH clase II en el timo o bien que
la seleccin de estas clulas CD4 no es absolu
tamente dependiente de CMH clase II clsicas.
Otros sndromes de esta categora son las de
ficiencias de expresin de molculas del com
plejo CD3. Se han descrito mutaciones en los
genes para la cadena CD3y y CD3 e . Esto deter
m ina un defecto parcial en la expresin del
complejo CD3. Las molculas CD4 y CD8 se
expresan normalmente, por lo que el estudio de
fenotipo linfocitario contribuye al diagnstico
de esta entidad (valores norm ales de clulas
CD4/CD8 con valores descendidos de CD3).
La expresin clnica es variable aun en dis
tintos miembros de una misma familia, con pa
cientes graves que requieren trasplante de m
dula sea (TMO) y otros que presentan slo in
fecciones recidivantes moderadas.

ADN

ADP

RR
dGTP

dATP

dGDP.

dADP

. GDP

GMP

AMP

cido rico
RR: Ribonucleotidii-Reductasa
F ig . 3 0 -2 . P a rtic ip a c i n d e las e n z im a s A D A y P N P e n el m e ta b o lis m o d e las p u rin a s.

Inmunodeficiencias
El Sndrome de Ommen se caracteriza por
manifestaciones clnicas y de laboratorio d is
tinguibles de las otras IDCS hasta ahora descri
tas. Presentan alteraciones derm atolgicas y
diarrea severas, hepatoesplenomegalia y adenopatas, linfocitosis, eosinofilia y aumento de
IgE. Se postula que esta patologa tendra un
defecto molecular similar pero menos severo
que la IDCS-AR, ya que los pacientes presen
tan linfocitos T oligoclonales (que exhiben po
cas familias V(3). La expansin de clones T con
infiltracin en ciertos tejidos como piel e intes
tino podra ser el resultado de la especificidad
autoinmune de algunos de estos clones, en el
contexto de una seleccin tmica negativa alte
rada.
R ecientem ente se han com unicado IDCS
producidas por defectos en la transcripcin de
genes que codifican distintas citoquinas (IL-2,
IL-4, IL-5). Los estudios in vitro, sugieren que
el defecto primario sera de las protenas nu
cleares reguladoras de la expresin de dichos
genes. Se han descrito, asimismo, dficit espe
cficos en la produccin de IL-2, con ausencia
de ARNm para IL-2 por defecto en la trans
cripcin de su gen, pero con expresin normal
del IL-2R.
Deficiencias predominantes
de anticuerpos
Agammaglobulinemia ligada al X
Se presenta en varones y las manifestaciones
clnicas comienzan entre los 9 y 12 meses. El
pasaje transplacentario de anticuerpos m ater
nos confiere proteccin y evita la expresin de
la enfermedad ms tempranamente. Las infec
ciones que presentan estos pacientes incluyen:
sinusitis, otitis, bronquitis, neumonas y en oca
siones formas ms graves como meningitis y
sepsis. Las infecciones recurrentes conducen
con frecuencia a bronquiectasias e insuficiencia
respiratoria. Las infecciones por agentes virales
son bien controladas con excepcin del virus
de hepatitis y los enterovirus. Se han descrito

parlisis por vacunacin con poliovirus atenua

dos, as como infecciones severas progresivas y
fatales por echovirus en el sistem a nervioso
central. En el examen fsico se destaca la hipoplasia linftica con ausencia de tejido adenoi
deo y amigdaUno. La concentracin srica de
todas las inmunoglobulinas se encuentra fran
camente descendida. La IgG suele ser inferior a
200 mg/dl y la IgM e IgA estn ausentes. La
ausencia de linfocitos B maduros y la presencia
de clulas pre-B en mdula sea es caractersti
ca de este sndrome, indicando un freno m adu
rativo a este nivel.
El defecto gentico fue hallado en el ao
1993 y se trata de la mutacin de un gen del
crom osom a X que codifica para una tirosina
quinasa llamada atk o btk que se expresa en to
das las clulas del linaje B y mieloides pero no
en clulas T. Esta enzim a posee hom ologas
con la familia de tirosina quinasas src, con se
cuencias nicas a esta atk. Se sugiere que la atk
tiene la funcin de iniciar las seales en la c
lula preB para rearreglar las cadenas livianas,
despus que las cadenas pesadas se expresan en
la superficie.
El clonado del gen de la atk permiti corre
lacionar las variaciones moleculares especfi
cas con alteraciones fenotpicas y funcionales.
Dicha enzim a tiene un dominio N-term inal de
funcin desconocida y otro dominio quinasa
con funcin cataltica (fig. 30-3). En este lti
mo se encontraron todas las mutaciones en los
p acie n tes con ALX tpicas. Es posib le que
form as m enos severas de A LX se d e b a n a
m utaciones en las porciones no quinasa del
gen.
El descubrim iento del atk permite el d iag
nstico de ALX en pacientes sin historia fam i
liar de la enfermedad y posiblemente en el fu
turo su tratamiento con terapia gnica.
El pronstico de estos pacientes es bueno si
se hace el diagnstico precoz y se instituye el
tratam iento sustitutivo con gam m aglobulina
preventivo de las infecciones recurrentes. La
complicacin ms frecuente es la enfermedad
pulmonar crnica e insuficiencia respiratoria.

ALX
atpica

Dominio N-terminal
Funcin
desconocida

ISH3

ALX
tpica

Dominio quinasa

SH2

\ Regin de inter- \
I
;

615

accin entre
protenas

'
I

Funcin
cataltica

Fig. 30-3. Esquem a de la estructura de la btk. Las flechas sealan los puntos de mutacin conocidos.

616

Inmunopatologa

Deficiencia de inm unoglobulinas

con hiper IgM
Al igual que los pacientes con agammaglobulinemia, las infecciones pigenas del aparato
respiratorio comienzan en el 1' o 2- ao de vi
da. Se diferencian clnicamente por presentar hiperplasia del tejido linfoideo, con adenomegalias, amgdalas hipertrficas y esplenomegalia.
El hallazgo inmunolgico caracterstico es el
aumento de IgM, con valores que superan los
1.000 mg/dl y concentraciones muy bajas de
IgG, IgA e IgE. La inmunidad celular suele ser
normal, pero se encuentran casos con alteracin
numrica y funcional de las clulas T. In vitro,
las clulas de estos pacientes estimuladas con
PW M sintetizan IgM pero son incapaces de
producir IgG o IgA, sugiriendo un defecto en el
estadio de cambio de isotipo de inmunoglobuli
nas. La enfermedad es ligada al X, si bien se
han descrito algunos pacientes del sexo femeni
no como formas espordicas o adquiridas.
El gen responsable es el que codifica para el
ligando de CD40 (vase cap. 10). Esta protena
gp39, que se expresa normalmente en clulas T
activadas, es imprescindible como seal para el
cam bio isotpico de inm unoglobulinas. Este
descubrimiento permiti establecer claramente
que la deficiencia con hiper IgM es un defecto
primario T y no B como se pens siempre. Se
ha comprobado que el agregado in vitro de an
ticuerpos anti CD40 e IL-4, permite la diferen
ciacin de linfocitos B de estos pacientes, lo
que abre una posibilidad teraputica futura.
Deficiencia selectiva
de inmunoglobulina A
Es la ms frecuente de las IDP. Se caracteri
za por la variabilidad en la forma de presenta
cin y severidad clnica. La deficiencia selecti
va de IgA puede ser asintomtica y su inciden
cia en la poblacin normal es de 0,1 a 0,2%.
Este hecho puede vincularse a la existencia de
mecanismos compensatorios, tales como la sn
tesis local de IgM capaz de com binarse con
pieza secretoria en las mucosas.
Cuando la deficiencia de IgA tiene manifes
taciones clnicas, las ms frecuentes son las in
fecciones recidivantes del aparato respiratorio
y el compromiso del tracto digestivo, con dia
rrea crnica o sndrome de malabsorcin. Estas
manifestaciones son las esperables si se tiene
en cuenta que la IgA es la inm unoglobulina
fundamental de las secreciones. La deficiencia
de IgA puede asociarse adems, y presentarse,
con las manifestaciones clnicas caractersticas
de enfermedades autoinmunes (artritis reuma
toidea, lupus eritem atoso sistm ico, etc.) y
alrgicas. Los pacientes presentan con frecuen

cia anticuerpos contra protenas de la leche de

vaca y autoanticuerpos.
La mayora de los pacientes presentan m ar
cada disminucin de IgA srica (< de 5 mg/dl)
y ausencia de IgA secretoria; slo excepcional
mente se han descrito casos con IgA srica nor
mal y deficiencia de IgA secretoria. El defecto
bsico en la deficiencia de IgA no se ha aclara
do an. Sin embargo, la presencia de linfocitos
con IgA de superficie que coexpresan IgM e
IgD sugieren una falla en la diferenciacin ter
minal de estas clulas. Tambin se han descrito
alteraciones regulatorias T.
Adem s, aproxim adam ente el 20% de los
pacientes con deficiencia de IgA presentan aso
ciado, deficiencia de subclases de IgG. En pa
cientes peditricos, se ha docum entado tam
bin, deficiencia parcial o transitoria de IgA
(los valores de IgA se hallan por debajo de dos
d esv o s e st n d a r del v alo r n o rm al p ara la
edad). Es decir, que la deficiencia de IgA es en
realidad una inmunodeficiencia ms compleja
que lo que sospechbamos hace algunos aos y
podra tratarse en realidad, como proponen al
gunos investigadores, de una forma de expre
sin clnica menos grave de la IDCV que, co
mo se sabe, es una pan-hipogammaglobulinemia. Apoyan esta hiptesis el hecho de que am
bas pueden ocurrir en miembros de una misma
familia y que ambas se asocian con los mismos
haplotipos HLA, es decir, podran tener la mis
ma susceptibilidad gentica. Dentro del sistema
HLA, los genes de susceptibilidad parecen es
tar ms asociados a los genes de complemento
(C4) que a las molculas HLA clsicas.
Es importante sealar, por la relevancia cl
nica y el posible rol patognico, que un porcen
taje elevado (40-50%) de pacientes con defi
ciencia de IgA tienen anticuerpos anti-IgA cir
culantes y pueden presentar reacciones anafilcticas severas si reciben productos que con
tienen IgA. Por esta razn est contraindicada
la administracin de sangre, plasma o gammaglobulina endovenosa o intramuscular. El pro
nstico de estos enfermos es el de las enferme
dades asociadas.
Deficiencias de subclases de IgG
Se han descrito en los ltimos aos deficien
cias selectivas de subclases de IgG (IgG,, IgG^,
IgG j, IgG^) que se m anifiestan clnicam ente
con infecciones respiratorias recidivantes. En
los nios por debajo de los 15 aos predomina
la deficiencia de IgG^ y en los adultos la de
IgG,,. Los niveles de IgG total pueden ser nor
males, debido a la produccin aumentada de
las subclases no comprometidas o bien a que la
co ncentracin norm alm ente b aja de alguna
subclase (IG2, IgG3 o IgG4) no modifica signi-

Inmunodeficiencias
ficalivamente el valor total de inmunoglobuli
nas. Como dijimos anteriormente, la deficien
cia de subclases de IgG puede asociarse a defi
ciencia de IgA.
La tnica forma de establecer el diagnstico
de la deficiencia de subclases es mediante su
cuantificacin. Debemos sealar que las tcni
cas actualmente en uso no estn bien estandari
zadas, y son muy pocos los centros que cuentan
con valores normales propios. En los nios por
debajo de los 2 aos de edad, la ontogenia nor
mal del sistema inmune, hace aun ms difcil el
diagnstico de deficiencia de subclases de IgG.
Teniendo en cuenta que las diferentes subcla
ses responden preferentemente a diversos tipos
de antgenos (por ej. IgGl e IgG3 a Ags protei
cos como toxoide tetnico y diftrico; IgG2 a
Ags polisacridos como el neumococo), es im
portante evaluar la funcionalidad de los anti
cuerpos en todos los casos.
A dem s, estas deficiencias pueden variar
con el tiempo y un paciente con deficiencias de
una subclase puede agregar otra o bien cambiar
a otra subclase. Este diagnstico debe hacerse
con cautela hasta que se rena ms experiencia
que aclare los mecanismos de su produccin y
la importancia clnica de esta deficiencia.
Inm unodeficiencia com n variable (ICV)
Se incluye bajo esta denominacin no a una
sola enfermedad sino a un conjunto de sndro
mes cuya etiologa y mecanismos patognicos
no estn bien definidos. Se caracterizan por la
pan-hipogammaglobulinemia, con recuentos de
linfocitos B normales.
Clnicamente, es similar en muchos aspectos
a la agammaglobulinemia ligada al sexo. Se di
ferencia de ella fundam entalmente por el co
mienzo ms tardo de los sntomas (mayor fre
cuencia en la segunda dcada de la vida), la
distribucin igual en ambos sexos y la hiperp lasia del tejido lin ftic o (ad en o m eg alias,
amgdalas hipertrficas, esplenomegalia).

617

Si bien el defecto fundamental es la produc

cin deficiente de anticuerpos, la mitad de los
pacientes presentan adems anormalidades de
la respuesta inmune celular.
La manifestacin clnica ms frecuente es la
infeccin pigena del aparato respiratorio. Es
comn asimismo el compromiso del tracto d i
gestivo, presentando los pacientes diarrea cr
nica o sndrome de malabsorcin asociado o no
a hiperplasia nodular linfoide. Es frecuente la
infeccin del intestino con Giardia iamblia.
Los pacientes con CV suelen desarrollar e n
fermedades autoinmunes particularmente pr
pura trombocitopnica, anemia hemoltiea, ar
tritis reumatoidea y sndrome de Sjgren. En es
tos casos, si los sntomas iniciales son los de la
enfermedad autoinmune, el diagnstico de in
munodeficiencia suele ser difcil y ms tardo.
La incidencia de tumores malignos del tejido
linfoide y aparato digestivo se encuentra au
mentada. Este hecho debe tenerse en cuenta en
el seguimiento clnico de estos pacientes.
Las anormalidades inmunolgicas que carac
terizan a la inmunodeficiencia comn variable
se sealan en el cuadro 30-3; el defecto bsico
en esta IDP no est an definido. A pesar del
nmero normal de linfocitos B que presentan la
mayor parte de pacientes, stos no responden
normalmente a la estimulacin y no se diferen
cian a clulas plasmticas, sugiriendo una falla
en la diferenciacin de la progenie B. En otros
casos, la alteracin ms importante radica en el
dficit de funcin cooperadora o bien exceso
de funcin supresora T. Finalmente, la presen
cia de anticuerpos contra linfocitos B o T p u e
de estar involucrada en la patogenia de este
sndrome.
Como hemos mencionado antes para la d efi
ciencia pura de IgA, algunos individuos con
ICV muestran asociacin a determinados haplotipos FILA.
El pronstico depende en gran medida del
diagnstico temprano y tratamiento preventivo
con gam m aglobulina. Las causas de m u erte

C uadro 30-3. Estudios de laboratorio para el diagnstico diferencial de los sndromes de ID P

Niveles
inm unoglobulinas
Sndrom e
A g a m m a g lo b u lin e m ia lig a d a
al c ro m o s o m a X
I n m u n o d e fic ie n c ia c o m n
v a ria b le
H ip o g a m m a g lo b u lin e m ia
tra n s ito ria
D e fic ie n c ia s e le c tiv a d e Ig A

N linfocitos

R e sp u e sta
p r o life ra tiva
Relacin
C D 4IC D8 ' a P H A

IgG

IgM

IgA

Anticuerpos
p reexistentes

B*

T*

il

A u s e n te s

A u se n tes

ii

i i

A u s e n te s

N o i

N o i

N o i

N o i

4 a U

i i

se

^ N

N o i

N: valores n o rm ale s, i ; v alores d ism in u id o s.

linfocitos T p o r r se la s E a 4 C.

valores m a rc a d a m e n le d ism in u id o s. * L infocitos B p o r inm u n o g lo b u lin as de s u p e r tic ie ,

618

Inmunopatologa

ms frecuentes son la insuficiencia respiratoria

secundaria a enfermedad pulm onar crnica y
los tumores malignos.
Hipogammaglobulinemia transitoria
de la infancia
Este sndrome es considerado como una pro
longacin de la hipogammaglobulinemia fisiol
gica que se observa en los lactantes normales
entre los 3 y 6 meses de vida. Esta hipogamma
globulinemia es la resultante del catabolismo de
la IgG materna adquirida por pasaje transplacen
tario, no compensada an por la sntesis propia.
Los pacientes con hipogam maglobulinemia
transitoria presentan niveles descendidos de IgG
hasta los 12 a 24 meses de edad. Los niveles
normales de IgM e IgA, el nmero normal de
linfocitos B circulantes y la capacidad de res
puesta a las inmunizaciones, permiten diferen
ciarla de los otros sndromes de deficiencia pre
dominante de anticuerpos (cuadro 30-3). Esta
diferenciacin es importante ya que no est indi
cado el tratamiento sustitutivo con gammaglobuUna en la deficiencia transitoria, exceptuados
aquellos casos con infecciones severas.
INMUNODEFICIENCIAS ASOCIADAS A
OTRAS ANOMALAS BIEN DEFINIDAS
Sndrome de Wiskott-Aldrich
Sndrome hereditario, ligado al cromosoma
X, caracterizado por eccema, trombocitopenia y
otitis recidivantes. Los pacientes presentan sus
ceptibilidad aumentada a la infeccin por neu
mococo y otros grmenes encapsulados as co
mo incidencia aumentada de enfermedades lin
foproliferativas. Suele encontrarse descenso de
IgM y aumento de IgE y en algunos casos de
IgA. La respuesta inmune celular puede ser nor
mal al comienzo, sufriendo luego un deterioro
progresivo con la evolucin de la enfermedad.
Las plaquetas de estos pacientes son peque
as y los linfocitos tienen vellosidades dismi
nuidas, vistos por m icroscopia electrnica de
barrido. Asociado a estas anomalas morfolgi
cas, se detect en estas clulas un dficit en la
expresin de CD43, molcula probablemente
involucrada en la activacin de linfocitos T
(vase cap. 2, Apndice). Aunque este dficit
contribuye a la patologa, no constituye el de
fecto fundamental, ya que esta enfermedad est
ligada al X y CD43 est codificado en cromo
soma 16. En agosto de 1994 se ha aislado un
gen denominado WASP (protena del Sndro
me de W iskott Aldrich) propuesto como res
ponsable del sndrome. Este gen se encontr
mutado en tres pacientes no relacionados, por

tadores de este sndrome. C odifica para una

protena de 501 aminocidos, rica en Pro; se
postula que esta pro tena tendra un papel regulatorio de la imcin de hnfocitos y plaquetas.
Sndrome de Di George
Este sndrome se produce por un defecto en
la embriognesis del 3 y 4 arcos farngeos,
que determina hipoplasia o aplasia tmica y paratiroidea, cardiopata y facies caractersticas
(micrognatia, hipertelorismo, implantacin baja
de pabellones auriculares).La presencia en va
rios miembros de una misma familia y la pre
sencia frecuente de alteraciones cromosmicas
(fundamentalmente en el cromosoma 22) su
gieren una base gentica productora de anoma
las en la embriognesis.
El defecto tmico determina un aumento en
la susceptibilidad a infecciones micticas y vi
rales. Los casos con hipoplasia tmica y paratiroidea son ms frecuentes que los que presen
tan aplasia y se denominan: Di George parcia
les. El grado de compromiso de la respuesta in
mune celular es variable: normal, deprimida o
ausente. Las clulas B as como los niveles de
inmunoglobulinas son normales, pudiendo en
contrarse IgE elevada. Incrementos en los nive
les de IgE se han encontrado en sta y otras inm unodeficiencias con compromiso predom i
nante de la inm unidad celular. Este hallazgo
dem uestra el im portante rol regulador de las
clulas T en la biosntesis de IgE.
Ataxia telangiectasia
Es una enfermedad de herencia autosmica
recesiva caracterizada por inm unodeficiencia
progresiva de clulas T, asociada usualmente a
deficiencia de IgA e IgG2 e IgE. El ADN pre
senta marcada fragilidad, observndose traslocaciones y rupturas cromosmicas que en los
linfocitos involucra a los loci del receptor T y
de las inmunoglobulinas.
Las clulas anormalmente sensibles a las ra
diaciones ionizantes tienen alta frecuencia de
rupturas de ADN con defectos en la reparacin.
Las alteraciones del ciclo celular pueden con
ducir a rearreglos aberrantes y enfermedades
linfoproliferativas.
OTROS SNDROMES ASOCIADOS
A INMUNODEFICIENCIA
Sndrome de hiper IgE
Cursa con niveles excepcionalmente eleva
dos de IgE (2.000 a 40.000 U/ml) asociados a
infecciones estafiloccicas severas, recidivan

Inmunodeficiencias
tes y eosinofilia. Si bien el defecto bsico de
esta entidad es desconocida, se han encontrado
alteraciones en la respuesta inmune celular y la
funcin reguladora T, con dficit de la subpo
blacin T h l y predom inio de la Th2 (vase
caps. 2 y 18). Tambin se ha encontrado aso
ciacin con dficit de subclases de IgG y de
respuesta especfica a antgenos polisacridos.
Inmunodeficiencia con respuesta
inadecuada al virus de Epstein-Barr
Es una enfermedad hereditaria ligada al cro
mosoma X, conocida tambin como sndrome
de Duncan. Los individuos con este sndrome,
son varones aparentem ente sanos hasta que
contraen la infeccin con el virus de Epstein
Barr y desarrollan mononucleosis infecciosa.
La evolucin de la in fecci n es fatal en el
60-70% de los pacientes. La mayora de los
que sobreviven desarrollan, en distintos tiem
pos, linfomas B o hipogammaglobulinemia.
La caracterstica de este sndrome es la inca
pacidad de producir anticuerpos contra el ant
geno nuclear del virus (EBNA) siendo normal
la respuesta al antgeno de la cpside (UCA).
Se encuentra adems deficiencia en la respues
ta celular especfica contra el virus de EpsteinBarr y dficit de la funcin citotxica anticuer
po dependiente (ADCC). El estudio de las po
blaciones linfocitarias muestra un incremento
significativo de la poblacin CD8.
Sndromes de albinismo parcial
Comprende el Sndrome de Chediak-Higashi
y el Sndrome de Griscelli. Ambos sndromes
posee un patrn de herencia AR, con albinismo
parcial oculocutneo. En ambos la clnica se
caracteriza por infecciones pigenas frecuentes
y por presentar las llamadas crisis aceleradas
con gran compromiso sistmico, fiebre, pancitopenia, hepatoesplenomegalia por infiltracin
linfohistiocitaria y altos niveles de citoquinas
(IL-l, lE N a , TNF, IL-6) circulantes. Se postu
la una activacin macrofgica inadecuada vin
culada a la patogenia de la fase acelerada de es
tos sndromes. El sndrome de Chediak Higashi
se caracteriza por la presencia de grnulos citoplasmticos gigantes lisosomales en los neutrfilos. En ambos sndrom es se encuentra una
disminucin importante de funcin NK as co
mo de la quimiotaxis.
Deficiencias de la respuesta inmune
inespecfica
Son deficiencias poco frecuentes y constitu
yen en su conjunto aproximadamente el 20%
del total de las IDP.

619

Deficiencias del sistema complemento

Se han descrito deficiencias genticas de to
dos los componentes del sistema complemento
pero slo algunas de ellas (deficiencia de C3,
C5, C7 y C8) se asocian con una mayor sus
ceptibilidad a las infecciones y deben diferen
ciarse de otras IDP. El tipo de procesos infec
ciosos que presentan los pacientes con d e fi
ciencia de C3 es similar al que se encuentra en
las deficiencias predominantes de anticuerpos,
mientras que los pacientes con deficiencias de
componentes tardos presentan infecciones por
grmenes gram negativos del gnero Neisseria
(gonococo, meningococo). La normalidad de la
actividad hem oltica total (CH50) p erm itira
excluir prcticamente todas las deficiencias p ri
marias del sistema complemento. Estas en fer
medades se transmiten como autosmicas rece
sivas y puede detectarse al portador heterocigota porque su suero contiene el 50% de los nive
les normales del componente deficiente.
C uando el CH50 se encuentra dism inuido
deber realizarse la evaluacin de los distintos
componentes del sistema. El estudio funcional
de estos com ponentes u tiliza m eto d o lo g as
complejas realizadas slo por laboratorios alta
mente especializados.
La deficiencia del inhibidor de la C l-estearasa presenta manifestaciones clnicas bien de
finidas de edema angioneurtico. El diagnsti
co puede realizarse valorando directam ente al
inhibidor o bien a los componentes C3 y C4.
Aun en ausencia de manifestaciones clnicas se
encontrar descenso marcado de C4 con v alo
res normales de C3.
Las deficiencias de componentes tempranos
del sistema complemento, C2 y C4 tienen m a
nifestaciones clnicas similares a diversas e n
fermedades autoinmunes, especialmente lupus
eritematoso sistmico.
Deficiencias de la fagocitosis
Las deficiencias pueden ser cuantitativas
(granulocitopenias) o funcionales. Las granulocitopenias son importantes y frecuentes en las
deficiencias secundarias a enfermedades linfoprohferativas, tratamientos inmunosupresores,
etc.; o bien pueden ser el resultado de excesiva
destruccin por anticuerpos antileucocitarios.
Las neutropenias primarias, hereditarias, son en
cambio, poco frecuentes. Las deficiencias fu n
cionales incluyen una variedad de sndrom es
bien caracterizados, que se mencionan en el
cuadro 30-4.
En algunos de los sndromes la alteracin
predom inante se encuentra en la movilidad y
adherencia, con clulas fagocticas que no re s
ponden apropiadamente a los estmulos leuco-

620

Inmunopatologa

Cuadro 30-4. Defectos de la funcin de fagocitos

D esignacin

C lulas afectadas

D efecto fu n cio n a l

H erencia

E l E n fe rm e d a d g ra n u lo m a to s a
c r n ic a
a) L ig a d a al X
b) A u to s m ic a re c e s iv a

fa g o c ito s

In c a p a c id a d d e d e s tru ir los m ic ro b io s fag o c ita d o s c o n a lte ra c i n e n la p ro d u c c i n d e

a n i n su p e r x id o p o r d e fe c to d e N A D H o x id a s a

LX
AR

E 2 d e fic ie n c ia d e a d h e si n le u c o c ita rla (def. d e c a d e n a b e ta d e

L F A -1 M a c l , p . 1 5 0 ,9 5 )

f a g o c ito s
lin fo c ito s
NK

D e fe c to s d e la m o v ilid a d , a d h e re n c ia , quim io ta x is y e n d o c ito s is

AR

E 3 D e fic ie n c ia d e g lu c o s a 6 fo s f a
to d e s h id ro g e n a s a

n e u tr filo s

D e fe c to d e la a c tiv id a d m ic ro b ic id a

AR

E 4 D e fic ie n c ia d e m ie lo p e ro x id a -

fa g o c ito s

D e fe c to d e la a c tiv id a d m ic ro b ic id a

AR

E 5 D e fic ie n c ia d e g r n u lo s s e c u n
d a rio s

n e u tr filo s

D e fe c to d e la a c tiv id a d m ic ro b ic id a . A u s e n
c ia d e g r n u lo s d e la c to fe rrin a

AR

citarios. En otros, se encuentra deficiencia en la

capacidad de ingestin de microorganismos y
muerte intracelular determinada por la incapa
cidad de las clulas fagocticas para usar el ox
geno molecular y generar radicales de oxgeno
microbicidas (perxido de hidrgeno, anin su
perxido).
Enfermedad granulomatosa crnica (EGC)
C onstituye el sndrom e prototipo de d efi
ciencia de ingestin y muerte intracelular. La
manifestacin clnica fundamental es la infec
cin recidivante de piel y tejido subcutneo por
grm enes catalasa positivos {Staphylococcus
aureus, Nocardia, etc.), con la formacin de
granulomas asociados a hnfadenopatas y hepatoesplenomegalia. Comienza en la primera in
fancia y es de evolucin grave, aun con trata
miento antibitico adecuado.
Es una enfermedad hereditaria debida a de
fectos moleculares heterogneos en el sistema,
de la NADP-oxidasa (fig. 30-4). Esta enzima,
que cataliza el estallido respiratorio, est com
puesta por al menos 4 subunidades: una gluco
protena de alto PM, gp91-phox (oxidasa de los
fagocitos), y la p22-phox, ambos componentes
del citocromo b; y las subunidades p47-phox y
p67-phox, componentes citoslicos. La EGC
puede resultar de la alteracin de cualquiera de
estas subunidades, con lo que se explica la he
terogeneidad molecular y gentica de esta en
fermedad. Sobre la base de estos conocimien
tos se ha propuesto recientemente una clasifi
cacin de la EGC en 4 tipos: 1) mutaciones o
deleciones en el gen que codifica la gp91, con
herencia LX, siendo ste el ms frecuente de
los defectos (50-60% de los casos de EGC); 2)
defecto del gen que codifica p22 del citocromo
b; es de herencia AR; 3) y 4) corresponden a

deficiencias de las protenas citoslicas p47 y

p67, ambas con herencia AR.
Se ha demostrado in vitro que el lEN es ca
paz de estimular el estallido respiratorio. Los
ensayos clnicos han dem ostrado beneficios
con el uso de IFN en esta patologa.
La incapacidad de los neutrfilos de los pa
cientes de reducir el nitroazul de tetrazolio, es
un examen sencillo y ttil para su diagnstico.
Deficiencia en la expresin de protenas
de adhesin: LFA-1, C3bi, pl50-95
Esta deficiencia autosmica recesiva resulta
de un defecto en la biosntesis de una glucopro
tena de membrana de 95 Kd (cadena (3) que es
comn al receptor para complemento C3bi, al
antgeno LFAl y a la protena p 150-95. La ca
dena P se encuentra ligada por uniones covalentes a distintas cadenas a (vase cap. 11) p a
ra constituir los antgenos m encionados. Las
protenas de adhesin tienen amplia distribu
cin en distintos tipos celulares. El receptor
C3bi se expresa en neutrfilos, monocitos, m a
crfagos, eosinfilos y clulas NK. El antgeno
L F A l, en clulas B, T y NK.
Esta IDP es compleja y, si bien ha sido in
cluida por la QMS entre los defectos de fagoci
tosis (cuadro 30-4), presenta alteraciones de la
funcin linfocitaria que permiten considerarla
un sndrome de deficiencia ms amplio, de c
lulas linfocitarias y fagocticas. Los pacientes
presentan como caracterstica, el antecedente
de separacin tarda del cordn umbilical, con
onfalitis. Son frecuentes las infecciones recidi
vantes de piel, otitis, abscesos perianales y de
fectos en la cicatrizacin de heridas.
Las anomalas inmunolgicas incluyen: alte
raciones en la adherencia, quimiotaxis y fago
citosis de granulocitos y macrfagos as como

Inmunodeficiencias

621

C uadro 30-5. Estudio de la respuesta in

mune humoral

C u a d ro 30-6. Estudio de la respuesta in

mune celular

N IV E L I

N IV E L I

1. D e te rm in a c i n c u a n tita tiv a d e las in m u n o g lo b u li

n a s s ric a s Ig G , I g M , Ig A , Ig E e Ig A se cre to ria.
2. A n tic u e rp o s p re -e x is te n te s : Iso h e m a g lu tin in a s
(an ti A y B ), A n ti-e s tr e p to lis in a O (A S T O ), A n tite t n ic o , A n ti-d ift ric o .
3. R e c u e n to d e L in fo c ito s B p o r in m u n o g lo b u lin a s
d e su p e rfic ie ,
4. D e te rm in a c i n c u a n tita tiv a d e s u b c la s e s d e IgG :
l g G l ,I g G 2 , I g G 3 , Ig G 4 .

1. D e te rm in a c i n d e l v a lo r a b s o lu to d e lln fo cito s /m m ^
2. R e c u e n to d e lin fo c ito s T y su b p o b la c io n e s T p o r la
e x p re s i n d e a n tg e n o s d e d ife re n c ia c i n ( C D l ,
C D 2 , C D 3 , C D 4 , C D S , C D 3 8 ).
3. P r u e b a s d e h ip e rs e n sib ilid a d ta rd a a d is n to s a n t
g e n o s : P P D , c a n d id in a , e s tr e p to q u ln a sa -e stre p to d o rn a s a .
4. R e s p u e s ta p ro life ra tiv a in v itro a in it g e n o s (P H A ,
C o n A ).

N IV E L H
N IV E L II
1. R e s p u e s ta d e a n tic u e rp o s a la in m u n iz a c i n a c tiv a
c o n p o lis a c rid o n e u m o c c ic o .
2. P ro d u c c i n d e in m u n o g lo b u lin a s in v itro m e d ia n te
e s tim u la c i n c o n m it g e n o s (P W M ).
3. O n to g e n ia d e las c lu la s B p o r la e x p re s i n d e a n
tg e n o s d e d ife re n c ia c i n (C D 1 9 , C D 2 0 , C D 2 1 ) y
e x p re s i n d e iso tip o s d e in m u n o g lo b u lin a s.
4 . C o o p e ra c i n T -B (c o -c u ltiv o s).
5. B io p s ia rectal y /o g a n g lio n a r.

defectos en la presentacin antignica y funcio

nes citotxicas linfocitarias. La falta de expre
sin de los antgenos mencionados puede d e
tectarse por marcacin con los anticuerpos m o
noclonales: CD18 (cadena p), C D lla , CDl Ib
y C D llc . En muchos casos la expresin es par
cial, lo cual dificulta este anlisis.

1. R e s p u e s ta p ro life ra tiv a a a n tg e n o s (c a n d id in a ,
P P D ) y c lu la s a lo g e n e ic a s (C M L ).
2. D o s a je d e p ro d u c c i n d e in te rle u q u in a s : IL -1 , lL - 2 ,
In te rfe r n .
3. E s tu d io s e n z im tic o s: A D A , P N P .
4. T ip if ic a c i n H L A .
5. B io p s ia g a n g lio n a r.

mecanismos involucrados en la produccin de

los distintos sndromes de IDP y debern ser
seleccionados en cada caso.
C u a d ro 30-7. Estudio de la respuesta in
mune inespecfica
F A G O C IT O SIS

Estudios de lab o rato rio inm unolgico

p a ra el diagnstico de las ID P
La definicin de inmunocompetencia requie
re no slo del anlisis cuantitativo de los dife
rentes componentes del sistema inmune, sino
tambin de la evaluacin funcional de los m is
mos.
Es ltil considerar los estudios que permiten
evaluar la respuesta inmune humoral, celular e
inespecfica (fagocitosis y com plem ento) en
dos niveles (cuadros 30-5 a 30-7). En el primer
nivel se incluyen los estudios de screening,
sencillos y c]ue no requieren laboratorios de al
ta complejidad. Con ellos es posible en general
definir el tipo y grado de inmunodeficiencia y
orientar la conducta teraputica. En el cuadro
30-3 se muestran las diferencias en los estudios
inmunolgicos de un grupo de inmunodeficien
cias con formas de presentacin clnica simila
res que tienen, como se ver ms adelante, in
dicaciones teraputicas distintas.
Los estudios del segundo n ivel son m s
complejos, de resorte del especiahsta en su rea
lizacin e interpretacin. Algunos son im pres
cindibles para el diagnstico, como es la deter
m inacin de ADA, frente a una deficiencia
combinada severa; otros perm iten aclarar los

N IV E L I
1. D e te rm in a c i n c u a n tita tiv a y m o rfo l g ic a de g r a n u
lo c ito s y m o n o cito s.
2. E s tu d io d e m e c a n ism o s m ic ro b ic id a s o x g e n o d e
p e n d ie n te s .
a) P r u e b a d e r e d u c c i n d e l n itro a z u l d e tetraz o lio
( N B T ).
b) Q u im io lu m ln is c e n c ia .

N IV E L / /
1. E s tu d io d e la e x p re s i n d e p ro te n a s d e ad h e si n
(a n tg e n o s L F A l, C 3 b l).
2: L e u c o ta x is ,
3. A c tiv id a d b a c te ric id a.
4. E s tu d io s e n z im tic o s: m ie lo p e ro x ld a s a , g lu c o s a 6
fo s f a to d e h ld ro g e n a sa .

COM PLEM ENTO

N IV E L I
1. A c tiv id a d ltic a d e l c o m p le m e n to (C H 5 0 ).
2. D e te rm in a c i n c u a n tita tiv a d e C 3 y C 4.

N IV E L II
1. D e te rm in a c i n c u a n tita tiv a y f u n c io n a l d e to d o s lo s
c o m p o n e n te s d e c o m p le m e n to ( C l a C 9).
2. D e te rm in a c i n c u a n tita tiv a y fu n c io n a l d e in h ib id o
res.
3. C a p a c id a d de g e n e ra r fa c to re s leu c o t c tic o s .

622

Inmunopatologa
Agua oxigenada
H 0
Oxgeno

O,-,
,

F ig . 3 0 -4 . R e p re se n ta c i n e s
q u e m tic a d e lo s c o m p o n e n
tes d e la N A D P H y las a n o r
m a lid a d e s e n la E G C .

'"Oa'

; Superxido

Membrana

AR: autosmica recesiva

LX: ligada al sexo

La edad del paciente en el momento del es

tudio es una de las principales consideraciones
a tener en cuenta. Dado que la mayora de las
inmunodeficiencias se diagnostican en la infan
cia, debe recordarse que, de acuerdo a la onto
genia del sistema inmune normal, en los prime
ros aos de la vida hay deficiencias que son fi
siolgicas y transitorias.
En diagnstico temprano en las IDP es fun
damental a fin de instaurar la teraputica apro
piada antes de que se produzcan lesiones crni
cas e irreparables de rganos vitales. En este
sentido es importante sealar que la mayor par
te de los estudios m encionados en el nivel I
pueden ser realizados en sangre de cordn.
El reconocimiento de portadores sanos, co
mo hemos visto, puede hacerse actualmente en
las deficiencias de A DA, PN P, enferm edad
granulom atosa crnica, agam m aglobulinem ia
ligada al sexo, sndroine de W iskott-Aldrich, y
en alguna de ellas es posible el diagnstico pre
natal, mediante estudios realizados en cultivos
de clulas de lquido amnitico. Ambas infor
m aciones pueden ser de gran v alo r para el
diagnstico temprano y el consejo gentico.
Estudios para valorar la competencia
inmunolgica
Cuantificacin de inmunoglobulinas
Las inm unoglobulinas sricas IgG , IgM ,
IgA, por lo general se miden por inmunodifu
sin radial o mtodos turbidimtircos como la
nefelometra. La eleetroforesis e inm unoelec
troforesis no son apropiados a los fines del
diagnstico de IDP.

La IgE por su baja concentracin se mide

por mtodos de RIA o ELISA.
La concentracin srica de inm unoglobuli
nas vara con la edad, debiendo contar todo la
boratorio con valores de referencia normales
para cada grupo etario,
Las subclases de IgG se cuantifican por tc
nicas de inmunodifusin radial y ELISA. No
hay reproducibilidad entre ambos m todos,
adems los resultados pueden variar segiln se
utilicen anticuerpos monoclonales o policlona
les. Estas variaciones junto con los amplios
rangos de normalidad para esta inmunoglobuli
na, dificultan el diagnstico de deficiencia de
subclases de IgG, especialmente en los prime
ros aos de vida.
Valoracin de la produccin de anticuerpos
especficos:
La inmunidad humoral puede medirse por la
respuesta de anticuerpos a antgenos a los que
la poblacin est comnmente expuesta o si
guiendo una inmunizacin activa.
Los tests recomendados son:
1. Anticuerpos naturales: medicin de isohemaglutininas anti-A y anti-B.
2. Respuesta a inmunizaciones habituales: la
respuesta a toxoide tetnico, diftrico, polisac
ridos de neumococo y meningococo; se valora
por tcnicas de heinaglutinacin o ELISA. Se
valoran 2 muestras: la primera pre-inmunizacin y la segunda, entre los 15 y 20 das poste
riores al estmulo. El estudio puede realizarse
despus de un esquema de inmunizacin com
pleta o de la aplicacin de una dosis de refuer
zo en los previamente vacunados.

Inmunodeficiencias

623

3.
Inmunizaciones adicionales; bacterifago Determinaciones de AD A y PNP
OX 174. Es un potente y seguro antgeno, con
el que la poblacin no ha tenido contacto pre
Se realizan en general en Usados de glbulos
vio, que permite valorar respuesta primaria y rojos del paciente. Existen diversas tcnicas pe
secundaria. Dado que en nuestro pas no se dis ro todas se basan en ofrecer el sustrato (adenopone regularmente del antgeno, no existe ex sina para ADA, e inosina para PNP) y valorar
la generacin final de cido rico. Una cintica
periencia local con el mismo.
enzim tica convencional es la generalm ente
utilizada para ambas determinaciones.
Cuantificacin de linfocitos
B yT
Evaluacin del sistema fagoctico
Las clulas de sangre perifrica son cuantficadas con anticuerpos monoclonales especfi
1) Anlisis cuantitativo y estudio m orfolgi
cos para distintos antgenos celulares. Se utili co.
zan tcnicas de inmunofluorescencia directa e
2) Estudios funcionales: a) quimiotaxis
indirecta. La lectura se realiza por microscopa
b)
evaluacin del m etabolism o oxidativo:
o citometra de flujo.
NBT, quemiluminicencia, muerte intracelular.
Los linfocitos T se valoran con anticuerpos
para CD3, CD4, CD8. Para los linfocitos B se Quimiotaxis
utiliza anti-CD 19 y anti-CD20.
Iguales tcnicas se utilizan para cuantificar
El test que utiliza la cmara de Boyden es el
monocitos y clulas NK.
ms utilizado. Consiste en dos cmaras separa
das por un filtro millipore. En una de ellas se
coloca la sustancia atractante y en la otra los
Pruebas cutneas
neutrfilos separados del paciente. La m ig ra
Las pruebas de hipersensibilidad tarda cons cin especfica se compara con la migracin al
tituyen un excelente mtodo para valorar la res azar (sin quimioatractante).
puesta m ediada por linfocitos T, in vivo. El
prototipo, es la prueba de tuberculina. Se acon Test del nitroblue-tetrazolio (NBT)
seja el uso de varios antgenos purificados
(candidina, tricophyton, toxoide diftrico, etc.).
Permite valorar funcionalmente el sistema de
Consiste en la inyeccin intradrmica de 0 ,1 mi la N ADPH oxidasa en los granulocitos. C onsis
del antgeno en dilucin apropiada, seguida de te en la reduccin del NBT, a travs de esta va
la medicin del dim etro mximo de indura metablica, con la formacin de grnulos azul
cin a las 48hs.
violceos (formazn) dentro del citoplasma de
las clulas.
Estimulacin de linfocitos
in vitro (cultivo)
Muerte intracelular
Los linfocitos pueden ser activados por: a)
mitgenos como la PHA, con A, PWM. b) A n
tgenos como la PPD, candidina etc. c) Clulas
alogeneicas. d) Anticuerpos para receptores de
clulas T com prom etidos en las seales de
transduccin: CD3, CD2, etc. e) Estimulantes
de PTK e ionforos de calcio: PMA e ionomicina. La activacin T puede valorarse por: a)
Medicin de la proliferacin celular, b) Expre
sin de antgenos de activacin (CD25). c) Li
beracin de citoquinas (IL2, IL4).
Se cultiva un nmero fijo de clulas mononucleares en presencia de los diferentes estmu
los. Luego de 3 a 5-7 das se marcan con ^H-timidina y se cosechan. La incorporacin de ti
midina es proporcional a la proliferacin celu
lar. Los resultados se expresan en emp y son
comparados con controles sin estmulo (basales) y con la respuesta de clulas de individuos
normales.

La lisis intracelular de los microorganismos

fagocitados es el paso fnal de la activacin de
los polimorfonucleares en respuesta a la infec
cin.
La muerte celular puede valorarse utilizando
bacterias (estafilococo) u hongos (cndida).
La tcnica consiste en incubar bacterias opsonizadas con una suspensin de granulocitos
del paciente por distintos intervalos. Luego de
desechar las bacterias no fagocitadas, las clu
las son Usadas y las muestras resultantes incu
badas en medios de cultivos para determinar el
nmero de grmenes sobrevivientes.
T R A T A M IE N T O DE LAS ID P
La teraputica especfica de las IDP se apoya
fundamentalmente en los tratamientos sustitutivos: gammaglobulina para las deficiencias p re

624

Inmunopatologa

dominantes de anticuerpos y TMO y timo fetal

para las deficiencias combinadas y algunas de
ficiencias asociadas a otros defectos. La trans
fusin de plasma fresco puede ser til en las
deficiencias de componentes del sistema com
plemento. Los procesos infecciosos deben ser
tratados rpidam ente y con dosis apropiadas
del antibitico seleccionado segn antibiograma. El uso de antibiticos como tratam iento
profilctico no se recomienda ya que aumenta
el riesgo de infeccin con organismos resisten
tes, hongos, etc.
En todo paciente con deficiencia de la res
puesta inmune celular, las transfusiones, si son
necesarias, deben realizarse con sangre irradia
da por el riesgo de reaccin injerto contra hus
ped. Las inmunizaciones con grmenes vivos y
la BCG estn formalmente contraindicadas.

fecciosos con dosis de 300 a 500 mg/kg/mes,

que permitan mantener niveles sricos de IgG
superiores a los 400 mg/dl.
En todos los casos, las dosis de gammaglo
bulina requeridas para el tratamiento de las IDP
son elevadas. Las inoculaciones de estos vol
menes por va IM son dolorosas y constituyen
el mayor inconveniente de esta va. Los prepa
rados para uso EV permiten la inyeccin de do
sis elevadas sin inconvenientes y con buena to
lerancia del paciente.
Efectos adversos, como son las reacciones
de tipo anafilctico, se producen con poca fre
cuencia y por mecanismos no bien aclarados.
Con los preparados por va EV, la infusin len
ta reduce o elimina estos efectos. Excepcional
mente es necesario el uso de corticoides o antihistamnicos.

T ratam iento sustitutivo

con gammaglobulina

Trasplante

El tratam iento de reem plazo con gamm aglobulina ha demostrado ser beneficioso para
los pacientes con deficiencia de la inmunidad
hum oral. Son indicacin absoluta de tra ta
m iento perm anente con gam m aglobulina: la
agammaglobulinemia ligada al sexo y autos
mica recesiva, la deficiencia con hiper IgM, la
deficiencia con timoma y la inm unodeficien
cia comn variable. En la hipogam m aglobuli
nemia transitoria de la infancia, el tratamiento
sustitutivo est indicado slo en las infeccio
nes graves. La deficiencia asintom tica o aso
ciada a procesos infecciosos leves no es indi
cacin de tratamiento. En la deficiencia selec
tiva de IgA, est contraindicado el tratamiento
con gammaglobulina y en las deficiencias de
subclases de IgG, asociadas o no a deficiencia
IgA, los resultados obtenidos hasta el presente
sugieren un efecto beneficioso en la preven
cin de infecciones recidivantes del aparato
respiratorio.
Las deficiencias combinadas severas y otras
deficiencias como el sndrome de Wiskott-Aldrich, pueden beneficiarse con el reemplazo de
gammaglobulina como tratamiento auxiliar, pe
ro deben implementarse otros tratamientos para
corregir los defectos subyacentes.
Actualmente se dispone de preparaciones co
merciales de gammaglobulina para uso por va
intram uscular (IM) y endovenosa (EV). Para
ninguna de estas preparaciones se ha estableci
do an la dosis ptima de tratamiento. En gene
ral, para la va IM, la dosis mnima recomenda
da es de 100 mg/kg cada 21-25 das, conside
rando que la vida media de la IgG es de tres se
manas aproximadamente. Para la gammaglobu
lina endovenosa, trabajos recientes sugieren
mayor eficacia en la prevencin de procesos in

de

mdula sea

Una variedad de sndromes de IDP han podi

do ser reconstituidos inmunolgicainente me
diante TMO. Fundamentalmente las inmunode
ficiencias combinadas severas asociadas o no a
dficit enzimticos (ADA, PNP), el sndrome
de Wiskott-Aldrich, los defectos de expresin
de L A F l, C3bi y defectos de fagocitosis como
la enfermedad granulomatosa crnica y el sn
drome de Chediak-Higashi.
El TMO es sin duda actualm ente el trata
miento de eleccin para las inmunodeficiencias
combinadas severas, siempre que se disponga
de una dador HLA idntico. Aun con compati
bilidad slo a nivel del locus D, se han logrado
reconstituciones satisfactorias. Sin embargo, el
uso de dadores no HLA idnticos, da lugar a
una complicacin importante, la reaccin injer
to versus husped, que conduce al fracaso del
trasplante. A ctualm ente, se utilizan distintos
mtodos (aglutinaciones selectivas, separacio
nes celulares por gradientes de densidad, citotoxicidad con anticuerpos monoclonales) apli
cados in vitro a la mdula sea del dador que
permiten depurarla de las clulas T responsa
bles de la reaccin injerto versus husped, po
sibilitando el TMO de dador no compatible.
La recuperacin inmunolgica post-trasplante puede evaluarse por la m ejora clnica, la
presencia de quimerismo celular, la deteccin
de linfocitos T y B circulantes, la recuperacin
de la actividad enzim tica en los deficientes
previos, la presencia de inmunoglobulinas sri
cas, etc.
En los casos en los que el TMO es impracti
cable, resultados satisfactorios se han obtenido
en algunos casos, especialmente en el sndrome
de Di George con trasplantes de timo fetal o
epitelio tmico, y en otras deficiencias con tras
plante de hgado fetal.

Inmunodeficiencias
Ya hemos mencionado la terapia gnica para
la deficiencia de ADA. Otras deficiencias co
mo las de PNP podran ser curadas en el futuro
prximo con el mismo tratamiento.
Para las inmunodeficiencias celulares menos
severas, el tratamiento con hormonas tmicas,
interleuquina 2 y otros inmunomoduladores es
promisorio, pero se requieren ms ensayos con
trolados que confirmen su utilidad teraputica.
IN M U N O D E FIC IE N C IA S SECUNDARIAS
O ADQUIRIDAS
Son m ucho ms frecuentes que las ID P y
responden a causa que permiten agruparlas en
dos categoras fundamentales: 1) Las que son
consecuencia de distintas enfermedades capa
ces de alterar cualitativamente o cuantitativa
mente al sistem a inm une. 2) Las provocadas
por el uso de drogas citostticas e inmunosupresoras, llamadas en general, inmunodeficien
cias iatrognicas.
Inm unodeficiencia.s asociadas
a otras patologas
Una de las causas ms frecuentes de IDS en
nuestro medio y principalmente en la infancia,
es la desnutricin calrico-proteica, que deter
mina alteraciones fundamentalmente en la res
puesta inmune celular. Las inmunoglobulinas
no estn cuantitativam ente afectadas, pero la
respuesta especfica a antgenos bacterianos
suele encontrarse disminuida. Las infecciones
recidivantes son la mayor causa de morbimortalidad en estos pacientes.
Los tumores malignos en etapa avanzada y
especialmente las enfermedades linfoproliferativas y linfomas, tambin presentan inmunode
ficiencia. Las leucemias linfticas crnicas, por
ejemplo, suelen asociarse a hipogammaglobuli
nemia, dficit de la respuesta humoral e infec
ciones recidivantes por grm enes encapsulados. Los pacientes con linfoma de Hodgkin, en
cambio, presentan alteraciones de la respuesta
celular. El mecanismo productor de esta defi
ciencia no se conoce an, habindose postulado
efectos supresores por exceso de prostaglandina E y tambin, disminucin en la produccin
de IL-2.
Las enfermedades asociadas a prdida de
protenas sricas conducen a inmunodeficien
cias secundarias humorales. Ejemplos de estas
patologas son: el sndrome nefrtico y las enteropatas perdedoras de protenas. Entre estas
ltimas, vale la pena mencionar a la linfangiectacia intestinal, que produce adems de la pr
dida proteica, prdida de linfocitos T por apa
rato digestivo, provocando una inm unodefi

625

ciencia combinada, en ocasiones difcil de dife

renciar por la clnica y el laboratorio inm unol
gico, de las IDP.
Distintas infecciones, especialmente las v ira
les (sarampin, EBV, CMV) producen altera
ciones de la respuesta inmune que posibilitan el
desarrollo de infecciones por otros microorga
nismos. En el individuo normal, el compromiso
inmunolgico determinado por estas infeccio
nes es transitorio y se recupera con la convale
cencia de la enfermedad viral. Otros agentes
virales, como el HIV (virus de la inm unodefi
ciencia humana), como se indica en el captulo
27, se caracterizan por infectar a clulas del
sistema inmune y producir un deterioro progre
sivo y permanente de su funcin.
Inm unodeficiencias por drogas
Es secundaria al uso de citostticos e inm u
nosupresores para el tratam iento de tum ores
malignos, enfermedades autoinmunes o com o
prevencin del rechazo en el trasplante de r
ganos.
Las drogas utilizadas para el tratamiento del
cncer, son citotxicas para linfocitos y clulas
fagocticas (monocitos y granulocitos) maduros
y sus precursores. Por lo tanto, la quimioterapia
se acompaa siempre de un perodo de inm u
nodeficiencia con alto riesgo de morbimortalidad por infecciones. Otros inm unosupresores
son ms especficos y actan inactivando fu n
cionalmente a las clulas inmunocompetentes.
La ciclosporina A, por ejemplo produce inm u
nosupresin inhibiendo la transcripcin del gen
que codifica para la IL-2 y con ello la produc
cin de esta citoquina. Son tambin potentes
inmunosupresores los anticuerpos monoclona
les d irig id o s co n tra m o lcu las CD3, C D 7 ,
CD25, utilizados en la clnica fundam ental
mente para prevenir el rechazo de rganos en el
trasplante.
El uso de tratamientos inmunosupresores ca
da vez ms agresivos para tratar enfermedades
graves como el cncer ha dado lugar a un au
mento importante del nmero de pacientes con
inmunodeficiencias iatrognicas. Actualmente,
la posibilidad de producir citoquinas y factores
estimuladores de colonias (G-CSF, GM -CSF)
por ingeniera gentica, ha permitido su uso en
protocolos de tratamiento que tienen como ob
jetivo acortar el perodo de inmunodeficiencia
que acompaa a la quimioterapia.

B IB L IO G R A F A
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F .R o s e n (E d ). Im m u n o d e fic ie n c y . C u rre n t O p in i n in Im m u n o lo g y . V ol. 3, N o . 4 , p p . 5 2 5 -5 5 9 , 1991.
D .L .B o w e n , H .C .L a n e y A .C .F a u c i. I m m u n o lo g ic a b n o rm a litie s in th e a c q u ir e d im m u n o d e f ic ie n c y s y n d ro m e .
P ro g re s s in A lle rg y 3 7 :2 0 7 -2 2 3 , 1986.
L a p u b lic a c i n m e n su a l I m m u n o lo g y T o d a y , v o lu m e n I I ,
n m e ro s 6 al 12 c o n tie n e una s e rie d e a c tu a liz a c io n e s s o
bre la re s p u e s ta in m u n e d u ra n te la in fe c c i n p o r H IV .
S .M a t s u m o t o y c o l. P r o g r e s s in p r im a r y i m m u n o d e f i
c ie n c y . I m m u n o lo g y T o d a y , 1 3 :4 -6 , 1992.
P rim a ry I tin m u n o d e fic ie n c y D is e a s e s . R e p o r t o f a W H O
s c ie n tific g ro u p . I m m u n o d e fic ie n c y R e v ie w s 3; 1 9 5 -2 3 6 ,
1992.
A F is c h e r. P rim a ry T -c e ll im m u n o d e fic ie n c ie s . C u rr. O p .
I m m u n o l. 5; 5 6 9 -5 7 8 , 1993.
C S o n d is y c o l. n d e p e n d e n t m u ta t io n s o f th e h u m a n
C D 3 -E g e n e re s u ltin g in a T c e ll r e c e p to r/C D 3 c o m p le x
im m ui-vodeficiency. N a tu re G e n e t. 3: 7 7 -8 1 , 1993,

L H a m m a rs tro m y co l. M o le c u la r b a s is fo r h u m a n im m u
n o d e fic ie n c ie s . C u rr. O p . Im m u n o l. 5: 5 7 9 -5 8 4 , 1993.
J E m b re ts o n y c o l. M a ss iv e c o v e rt in fe c tio n o f h e lp e r T
ly m p h o c y te s a n d m a c ro p h a g e s b y H IV d u rin g th e in cu b a tio n p e rio d .o f A ID S . N a tu re 2 6 2 : 3 5 9 -3 6 2 , 1993.
R H B u c k le y . A s s e s s in g in h e r ita n c e o f a g g a m a g lo b u lin e m ia . N .B n g . J. M ed . 330: 1 5 2 6 -L 5 2 8 , 1994.
S D V o s s y c o l. S C ID , IL 2 an d IL -2 re c e p to r: e x p e rim e n ts
o f n a tu r e c o n tin u a to p o in t th e w ay. B lo o d 83: 6 2 6 -6 3 5 ,
1994.
M E E id e r y c o l. H u m a n s e v e r e c o m b in e d im m u n o d e f i
c ie n c y d u e to a d e fe c t in Z A P -7 0 , a T c e ll ty ro s in e k in a se. S c ie n c e 2 6 4 : 1 5 9 6 -1 5 9 9 , 1994.
S T s u k a d a y c o l. R o le o f B r u tto n s ty ro s in e k in a s e in im
m u n o d e fic ie n c y . C u r r O p . Im m u n o l. 6: 6 2 3 -6 3 0 , 1994.
W J L e o n a rd . T h e d e fe c tiv e g e n e in X -lin k e d S C ID e n c o d e s
a s h a re d in te rle u k in r e c e p to r su b u n it: im p lic a tio n s f o r cy tik in e p le io tro p y a n d i'e d u n d a n c y . C u rr. O p . Im m u n o l. 6:
6 3 1 -6 3 5 , 1 994.
J M J D e rry y c o l. Iso la tio n o f a n o v e l g e n e m u ta te d in W is k o tt-A ld ric h sy n d ro m e . C e ll 7 8 : 6 3 5 6 4 4 , 1994.
X W e i y c o l. V ira l d y n a m ic s in H IV -1 in fe c tio n . N a tu re
3 7 3 : 1 1 7 -1 2 1 , 1995,
D D H o y c o l. R a p id tu rn o v e r o f p la s m a v irio n s a n d C D 4
ly m p h o c y te s in H IV -1 in fe c tio n . N a tu re 3 7 3 : 1 2 3 -1 2 6 ,
1995.
TFI F ln k e l y co l, A p o p to sis o c c u rs p red o m in a n tly in b y s ta n d e r c ells and n o t in p ro d u c tiv e ly in fe c te d c ells o f H IV ind
S lV -in fe c te d ly m p h no d es. N a tu re M ed . 1: 129 -1 3 6 , 1995.

Gammopatas monoclonales

MARCO PIZZOLATO

El trmino gammopata monoclonal (GM),

descrito por Waldenstrom en 1961, implica la
aparicin en sangre u otros lquidos biolgicos
de una inm unoglobulina (Ig) constituida por
una sola clase y subclase de cadena pesada:
gamma (yl, y2, y3, y4); alfa ( a l , a l); mu (ju.l,
(x2); delta (51, 52?); pson y/o por un solo ti
po de cadena liviana (kappa o lambda). Existen
distintos sinnimos para identificar a las GM
tales como: componentes M ; discrasia plasmoctica; paraproteinemia, tan slo por nom
brar los trminos ms frecuentes.
Las Ig tienen su origen en los linfocitos B y
sobre todo en el estadio de mayor diferencia
cin de ellos, las clulas plasmticas o plasm o
citos. Si consideramos una lnea celular consti
tuida por plasmocitos agrupados en clones ce
lulares de acuerdo con la teora de la seleccin
elonal de B urnet, verem os que cada uno de
ellos dar lugar a una clase, subclase y tipo de
Ig y la gran diversidad de stas se traducir a
nivel humoral por la aparicin de la tpica zona
de elevada heterogeneidad a la electroforesis y
el correspondiente arco de precipitacin a la inmunoelectroforesis (fig. 31-1 A). Por el contra
rio, cuando se produce la proliferacin descon
trolada de un solo clon celular se evidenciar
su hipertrofia e hiperplasia con la consiguiente
hiperproduccin de la Ig especfica sintetizada
por l. En este caso, el perfil electrofortico se
caracterizar por la aparicin de una banda es
trecha caracterstica (componente M) y en la
inmunoelectroforesis se observar un arco de
precipitacin con heterogeneidad restringida
que resulta tpico de este tipo de anomalas co
nocidas como GM (fig. 31-lB).
En un principio se consider a estos com po
nentes como protenas anmalas y se les dio el
nombre de paraprotenas. Esto fue as duran

31
te largo tiempo hasta que en la dcada del 60,
gracias a los trabajos de los grupos de Porter,
Edelman y Nisonoff sobre estructura de las Igs,
se demostr fehacientemente que estos com po
nentes de tipo monoclonal no diferan en forma
estructural de las Igs normales. Es ms, a causa
de su extremada homogeneidad estructural fue
ron el sustrato pmo para los estudios sobre
dilucidacin de estructura de las distintas Igs.
La aparicin de una GM se interpreta enton
ces como el producto de la desrepresin de a
sntesis de una Ig que, en condiciones normales,
se sintetiza en muy baja cantidad, a partir de un
solo clon celular. Se trata en realidad de una al
teracin cuantitativa y no cualitativa corno se
crey en un principio al considerar a las GM
como protenas estructuralmente anmalas.
El estudio de las GM ha resultado de funda
mental importancia, no slo desde el punto de
vista estructural sino adems desde un punto de
vista fisiopatolgico, ya que ofrecen un modelo
experimental ideal y constituyen, prcticam en
te, el nico caso en que la proliferacin neoplsica de un clon celular se acompaa de la pre
sencia de una protena marcadora especfica,
secretada por el propio tumor. En este sentido,
pueden ser consideradas como un verdadero
experimento de la naturaleza y como tal per
mitieron obtener hallazgos de trascendental im-,
portancia, a lo largo de la evolucin de la in
vestigacin biomdica en este campo, tales co
mo: a) la formulacin de la hiptesis elonal de
la respuesta inmune; b) la caracterizacin de la
estructura y funcin de las Igs; c) el descubri
miento de la tcnica de hibridomas para la pro
duccin de anticuerpos monoclonales.
Desde el punto de vista clnico, las G M pue
den observarse en enfermedades m alignas co
mo ciertos trastornos linfoproliferativos o, en

626

Inmunopatologa

R o s e n F S , C o o p e r M D , W e d g w o o d R Y . T h e p rim a ry im m u n o d fic ie n c ie s , N . E n g . J. M e d . 3 1 1 : 2 3 5 -2 4 2 , 1984.

K a n to ff P W , F r e e m a n S M , A n d e r s o n W F . P r o s p e c ts f o r
g e n e th e ra p y fo r im m u n o d e fic ie n c y d ise a s e s. A n n u a l R e v ie w s o f Im m u n o lo g y , 6: 5 8 1 , 1988.
C u n n in g h a m -R a n d le s C. C lin ic a l a n d im m u n o lo g ic a n a ly sis o f 103 p a tie n ls w ith c o m m o n v a ria b le im m u n o d e fi
c ie n c y . J o f C lin ic a l Im m u n o lo g y 9: 2 2 , 1989.
Y .R o s e n s te in y c o l. C D 4 3 , a m o le c u le d e f e c tiv e in W is
k o tt-A ld ric h s y n d ro m e , b in d s IC A M -1 . N a tu re 3 5 4 : 2 3 3 2 3 5 , 1991.
F .R o s e n (E d ). Im m u n o d e fic ie n c y . C u rre n t O p in i n in Im m u n o lo g y . V ol. 3, N o . 4 , p p . 5 2 5 -5 5 9 , 1991.
D .L .B o w e n , H .C .L a n e y A .C .F a u c i. I m m u n o lo g ic a b n o rm a litie s in th e a c q u ir e d im m u n o d e f ic ie n c y s y n d ro m e .
P ro g re s s in A lle rg y 3 7 :2 0 7 -2 2 3 , 1986.
L a p u b lic a c i n m e n su a l I m m u n o lo g y T o d a y , v o lu m e n 11,
n m e ro s 6 al 12 c o n tie n e una s e rie d e a c tu a liz a c io n e s s o
bre la re s p u e s ta in m u n e d u ra n te la in fe c c i n p o r H IV .
S .M a t s u m o t o y c o l. P r o g r e s s in p r im a r y i m m u n o d e f i
c ie n c y . I m m u n o lo g y T o d a y , 1 3 :4 -6 , 1992.
P rim a ry I tin m u n o d e fic ie n c y D is e a s e s . R e p o r t o f a W H O
s c ie n tific g ro u p . I m m u n o d e fic ie n c v R e v ie w s 3: 1 9 5 -2 3 6 ,
1992.
A F is c h e r. P rim a ry T -c e ll im m u n o d e fic ie n c ie s . C u rr. O p .
I m m u n o l. 5: 5 6 9 -5 7 8 , 1993.
C S o n d is y c o l. n d e p e n d e n t m u ta t io n s o f th e h u m a n
C D 3 -E g e n e re s u ltin g in a T c e ll r e c e p to r/C D 3 c o m p le x
im m u ito d e fic ie n c y . N a tu re G e n e t. 3: 7 7 -8 1 , 1993.

L H a m m a rs tro m y co l. M o le c u la r b a s is fo r h u m a n im m u
n o d e fic ie n c ie s . C u rr. O p . Im m u n o l. 5: 5 7 9 -5 8 4 , 1993.
J E m b re ts o n y c o l. M a ss iv e c o v e rt in fe c tio n o f h e lp e r T
ly m p h o c y te s a n d m a c ro p h a g e s b y H IV d u rin g th e in cu b a tio n p e rio d .o f A ID S . N a tu re 2 6 2 : 3 5 9 -3 6 2 , 1993.
R H B u c k le y . A s s e s s in g in h e r ita n c e o f a g g a m a g lo b u lin e m ia . N .E n g . J. M ed . 330: 1 5 2 6 -L 5 2 8 , 1994.
S D V o s s y c o l. S C ID , IL 2 an d IL -2 re c e p to r: e x p e rim e n ts
o f n a tu r e c o n tin u a to p o in t th e w ay. B lo o d 83: 6 2 6 -6 3 5 ,
1994.
M E E id e r y c o l. H u m a n s e v e r e c o m b in e d im m u n o d e f i
c ie n c y d u e to a d e fe c t in Z A P -7 0 , a T c e ll ty ro s in e k in a se. S c ie n c e 2 6 4 : 1 5 9 6 -1 5 9 9 , 1994.
S T s u k a d a y c o l. R o le o f B r u tto n s ty ro s in e k in a s e in im
m u n o d e fic ie n c y . C u r r O p . Im m u n o l. 6: 6 2 3 -6 3 0 . 1994.
W J L e o n a rd . T h e d e fe c tiv e g e n e in X -lin k e d S C ID e n c o d e s
a s h a re d in te rle u k in r e c e p to r su b u n it: im p lic a tio n s fo r cy tik in e p le io tro p y a n d re d u n d a n c y . C u rr. O p . Im m u n o l. 6:
6 3 1 -6 3 5 , 1 994.
J M J D e rry y c o l. Iso la tio n o f a n o v e l g e n e m u ta te d in W is
k o tt-A ld ric h sy n d ro m e . C e ll 7 8 : 6 3 5 6 4 4 , 1994.
X W e i y c o l. V ira l d y n a m ic s in H lV -1 in fe c tio n . N a tu re
3 7 3 : 1 1 7 -1 2 1 , 1995.
D D H o y c o l. R a p id tu rn o v e r o f p la s m a v irlo n s a n d C D 4
ly m p h o c y te s in H I V -I in fe c tio n . N a tu re 3 7 3 : 1 2 3 -1 2 6 ,
1995.
T H F in k e l y co l. A p o p to sis o c c u rs p red o m in a n tly in b y s ta n d e r c ells and n o t in p ro d u c tiv e ly in fe c te d c ells o f H IV md
S lV -in fe c te d ly m p h no d es. N a tu re M ed . 1: 129 -1 3 6 , 1995.

Gammopatas monoclonales

MARCO PIZZOLATO

El trmino gammopata monoclonal (GM),

descrito por Waldenstrm en 1961, implica la
aparicin en sangre u otros lquidos biolgicos
de una inm unoglobulina (Ig) constituida por
una sola clase y subclase de cadena pesada:
gamma (yl, y2, y3, y4); alfa ( a l , a l); mu (ju.l,
(t.2); delta (51, 52?); pson y/o por un solo ti
po de cadena liviana (kappa o lambda). Existen
distintos sinnimos para identificar a las GM
tales como: componentes M ; discrasia plasmoctica; paraproteinemia, tan slo por nom
brar los trminos ms frecuentes.
Las Ig tienen su origen en los linfocitos B y
sobre todo en el estadio de mayor diferencia
cin de ellos, las clulas plasmticas o plasm o
citos. Si consideramos una lnea celular consti
tuida por plasmocitos agrupados en clones ce
lulares de acuerdo con la teora de la seleccin
clonal de B urnet, verem os que cada uno de
ellos dar lugar a una clase, subclase y tipo de
Ig y la gran diversidad de stas se traducir a
nivel humoral por la aparicin de la tpica zona
de elevada heterogeneidad a la electroforesis y
el correspondiente arco de precipitacin a la in
munoelectroforesis (fig. 31-1 A). Por el contra
rio, cuando se produce la proliferacin descon
trolada de un solo clon celular se evidenciar
su hipertrofia e hiperplasia con la consiguiente
hiperproduccin de la Ig especfica sintetizada
por l. En este caso, el perfil electrofortico se
caracterizar por la aparicin de una banda es
trecha caracterstica (componente M) y en la
inmunoelectroforesis se observar un arco de
precipitacin con heterogeneidad restringida
que resulta tpico de este tipo de anomalas co
nocidas como GM (fig. 31-lB).
En un principio se consider a estos com po
nentes como protenas anmalas y se les dio el
nombre de paraprotenas. Esto fue as duran

31
te largo tiempo hasta que en la dcada del 60,
gracias a los trabajos de los grupos de Porter,
Edelman y Nisonoff sobre estructura de las Igs,
se demostr fehacientemente que estos com po
nentes de tipo monoclonal no diferan en forma
estructural de las Igs normales. Es ms, a causa
de su extremada homogeneidad estructural fue
ron el sustrato ptimo para los estudios sobre
dilucidacin de estructura de las distintas Igs.
La aparicin de una GM se interpreta enton
ces como el producto de la desrepresin de a
sntesis de una Ig que, en condiciones normales,
se sintetiza en muy baja cantidad, a partir de un
solo clon celular. Se trata en realidad de una al
teracin cuantitativa y no cualitativa corno se
crey en un principio al considerar a las GM
como protenas estructuralmente anmalas.
El estudio de las GM ha resultado de funda
mental importancia, no slo desde el punto de
vista estructural sino adems desde un punto de
vista fisiopatolgico, ya que ofrecen un modelo
experimental ideal y constituyen, prcticam en
te, el nico caso en que la proliferacin neoplsica de un clon celular se acompaa de la pre
sencia de una protena marcadora especfica,
secretada por el propio tumor. En este sentido,
pueden ser consideradas como un verdadero
experimento de la naturaleza y como tal per
mitieron obtener hallazgos de trascendental im-,
portancia, a lo largo de la evolucin de la in
vestigacin biomdica en este campo, tales co
mo: a) la formulacin de la hiptesis clonal de
la respuesta inmune; b) la caracterizacin de la
estructura y funcin de las Igs; c) el descubri
miento de la tcnica de hibridomas para la pro
duccin de anticuerpos monoclonales.
Desde el punto de vista clnico, las G M pue
den observarse en enfermedades m alignas co
mo ciertos trastornos linfoproliferativos o, en

628

Inmunopatologa

Trastornos inmunoproliferativos

.l

&

POLICLONAL

MONOCLONAL
Fig. 31-1. E s q u e m a s o b re la s n te s is d e in m u n o g lo b u lin a s
(Ig) y la d ife re n c ia c i n e n tre su o rig e n p o lic lo n a l y m o n o
clo n a l.
A , y A j: L n e a c e lu la r d e p la s m o c ito s a g ru p a d o s en c lo n e s.
Bj y Bj! Ig p ro d u c id a s y se c re ta d a s p o r lo s d istin to s c lo n e s
d e p la s m o c ito s .
B a n d a d e e le v a d a h e te r o g e n e id a d e le c t r o f o r t ic a al
p ro te in o g ra m a d e b id o al p o lim o rf is m o m o le c u la r del
c o m p le jo in m u n o g lo b u ln ic o .
D
A rc o d e p r e c ip ita c i n a la in m u n o e le c tro f o r e s is c o
r re s p o n d ie n te a u n a p ro d u c c i n p o lic lo n a l d e Ig.
Cj! P re se n c ia d e u n g ra d ie n te M d e o rig e n m o n o c lo n a l
al fra c c io n a m ie n to e le c tro fo r tic o .
Dj! A rc o d e p re c ip ita c i n c o n la tp ic a h e te r o g e n e id a d r e s
trin g id a d e u n c o m p o n e n te M .

ausencia de ellos, constituir las GM secunda

rias o las que se ha convenido en denominar
GM idiopticas o benignas (G.M.B.) y que
ltimamente R. Kyle propone identificar como
GM de significado indeterminado (MGUS).

Las GM, tanto las malignas como las benig

nas, pertenecen al grupo de los trastornos linfoproliferativos de las clulas B. En el hombre,
estas patologas presentan cierta complejidad
sobre todo en lo que respecta al cuadro citomorfolgico y al distinto grado de proliferacin. A
pesar de estas diferencias cabra preguntarse si
responden, o no, a un mismo estmulo desenca
denante que actuara a distintos niveles de dife
renciacin de una misma lnea celular.
Los trastornos linfoproliferativos en general
pueden dividirse en dos grupos: 1) aquellos que
muestran una proliferacin progresiva de la po
blacin celular, que incluye los procesos neoplsicos malignos y 2) aquellos que luego de
un estadio de actividad linfoproliferativa se su
ceden de una fase estacionaria.
De acuerdo con esto cabra preguntarse: a) si
el proceso controlado es de naturaleza benigna
y b) si un mismo estmulo puede desencadenar
en primer lugar un estadio estacionario primario
y, en un segundo tiempo, transformarse en una
neoplasia maligna. Esto depender de dos fac
tores principales: por una parte, del tipo de c
lulas comprometidas y, adems, de los factores
que regulan su proliferacin. Actualm ente se
acepta que dentro de la categora 1) se incluye
el MM, la macroglobulinemia de Waldenstrom,
la leucemia linftica crnica y linfomas, mien
tras que en el grupo 2) se ubicara la GMB. Sin
embargo, hasta el momento no ha resultado po
sible otorgar un lugar preciso a los distintos ti
pos de enfermedad de las cadenas pesadas.
Una clasificacin clnica de las distintas GM
que responde en general a la propuesta por Michaux y Heremans (1969), y que sobre la base
de nuestra experiencia es la que goza de mayor
predicamento en la actualidad entre las distin
tas clasificaciones comunicadas en la bibliogra
fa sobre el tema, divide a las GM en tres gru
pos principales (vase cuadro 31-1).
GM MALIGNAS
M ieloma mltiple (MM)
Es una proliferacin neoplsica sistmica de
clulas plasmticas caracterizada por la infiltra
cin en forma difusa de la mdula sea (MO),
e incluso de otros rganos, y por la formacin
de tum ores seos. El diagnstico de MM se
efecta sobre la base de tres elementos princi
pales: a) una infiltracin plasmocitaria en MO
u otro rgano; b) presencia de una Ig monoclo
nal en sangre (S) u orina (O); c) presencia de
imgenes osteolticas no explicables por otras
causas, fractura o aplastamiento vertebral, u osteoporosis generalizada. Para el diagnstico de

Gammopatas monoclonales

Cuadro 31-1
1) M alignas p rim arias
a) M ie lo m a m ltip le
1. S e c re to r (Ig G , IgA , Ig D , Ig M , Ig E , c a d e n a s L )
2. N o se c re to r
3. E x tra m e d u la r ( p la s m o c ito m a so lita rio )
4. L e u c e m ia d e c lu la s p la s m tic a s
b) M a c r o g lo b u lin e m ia d e W a ld e n s tro m (Ig M )
c) E n fe rm e d a d d e la s c a d e n a s p e s a d a s (g am m a, a lfa ,
m u)
d) O tra s a fe c c io n e s m a lig n a s d e l te jid o h e m o p o y tic o
(le u c e m ia s y lin fo m a s )

2) Secundaras o asociadas
a) N e o p la sia s d e te jid o s n o p ro d u c to re s de in m u n o g lo
b u lin a s
b C irro s is h e p tic a y o tra s h e p a to p a ta s c r n ic a s
c) C o la g e n o p a ta s
d) D iv e rs o s c u a d ro s c ln ic o s q u e c u rs a n h a b itu a lm e n te
con G P

3) Idiop ticas o benignas p rim arias

a) D e te rm in a d a s g e n tic a m e n te
b) T r a n sito ria s

MM resulta imprescindible el estudio del medulograraa obtenido por aspiracin o biopsia.

La puncin se efecta habitualmente en ester
nn o cresta ilaca, pudindose reahzar incluso
en otros huesos. La proporcin de clulas plas
mticas puede oscilar entre un 10 y un 90%.
Con respecto a la m orfologa pueden encon
trarse form as m aduras, inm aduras y clulas
multinucleadas.
En el 98 a 99% de los pacientes con M M se
detecta una GM en sangre u orina. D esde el
punto de vista inmunolgico, las ms frecuen
tes son las de tipo IgG, luego las IgA, las GM
de cadenas livianas o de Bence Jones, las IgD y
una muy baja incidencia de IgE e IgM.
Las GM de cadenas livianas o de Bence Jo
nes conforman un tipo muy especia! ya que son
aquellas que se asocian con los denominados
mielomas micromoleculares. A causa del bajo
peso molecular de las cadenas vianas (22 kD),
stas filtran a travs del glomrulo, incluso en
ausencia de dao renal y, a pesar de no mostrar
GM en sangre (a excepcin de los casos con in
suficiencia renal grave), cursan en forma cons
tante con un cuadro urinario de tipo mielomatoso caracterizado por una excrecin acentuada
de fragmentos livianos de origen monoclonal,
en diversos grados de polimerizacin.
Existe un grupo de MM muy poco frecuente,
denominado no secretor, caracterizado por no
presentar GM en sangre ni en orina. En las dis
tintas casusticas no superan generalmente el
1 al 2% del total de casos. Mediante estudios de
inmunofluorescencia con antisueros monoespe
cficos anticadenas pesadas y livianas pudo de
mostrarse, en la mayor parte de estos casos, una
sntesis adecuada de la Ig monoclonal, o sea
que la alteracin estara localizada a nivel de la

629

secrecin de ella hacia el espacio extracelular.

Existe, no obstante, un muy pequeo nmero de
M.M. no productores de Ig.
Origen celular
El sustrato celular de todas estas GM es el
linfocito y especficam ente el linfocito B. El
lin fo cito proviene de una clula p recu rso ra
(stem cell) de MO la que a su vez tam bin da
origen a las series eritroide, mieloide y megacarioctica.
Si bien una clula B normal bajo estmulos
apropiados puede proliferar y diferenciarse has
ta clula plasmtica, una clula B neoplsica es
tara cap acitad a solam ente p ara p ro life ra r.
Aceptando esta hiptesis y de acuerdo con la fi
gura 31 -2, podemos demostrar que las distintas
enfermedades incluidas dentro de las GM ma
lignas poseen un sustrato celular especfico, de
acuerdo con lo propuesto por Salmn y Seligmann. Cabe hacer notar que, si bien la funcin
principal de ia clula plasmtica es la de produ
cir y secretar grandes cantidades de Ig, no me
nos importante resulta la secrecin de otros fac
tores solubles por parte de ella, tales com o el
factor activador de los osteoclastos (FAO), el
factor inhibidor de los osteoclastos (FIO) acti
vados por interleuquina 1-beta (ILl-p) y el fac
tor de necrosis tumoral beta (FNT-P) que seran
los responsables de las lesiones osteolticas en
el MM ; adems, la liberacin de mediadores
que estimulados por los linfocitos T supresores
y a travs del macrfago, provocan la inhibi
cin del proceso madurativo de los linfocitos B
con la consiguiente disminucin de las Igs nor
males, produciendo el tpico cuadro de inmunodeficiencia humoral asociado con las GM.
Etiopatogenia
Las causas que provocan la proliferacin
neoplsica de las clulas B an no estn aclara
das. N o obstante, se sabe que estim ulaciones
antignicas reiteradas pueden provocar en cier
tos casos (depende del tipo de antgeno y del
sistema inmune del receptor) un desarrollo mo
noclonal de linfocitos B. Este clon puede involucionar como en el caso de las GM transito
rias o puede transformarse en un clon maligno
bajo la accin de un agente mutagnico como
por ejemplo un oncoARN-virus o diferentes ti
pos de oncogenes (c-myc; H y Lras). En algu
nos casos pudo demostrarse que el producto de
estos clones posea actividad anticuerpo espec
fica contra ciertos Ags a los que el paciente ha
ba estado expuesto aos antes de la aparicin
de un proceso maligno, dando lugar a la hipte
sis del doble estmulo. As, por ejemplo, se de
mostr actividad antiestreptolisina de la G M en

630

Inmunopatologa

-Stem Cell
(MO)
IL6

IL6

CP
Retroalimentacin
negativa

Ig

IL1-P
FNT-p

F ig . 3 1 -2 . D ife re n c ia c i n n o rm a l d e las c lu la s B .

A breviaturas. M O : M d u la se a; L B : L in fo c ito B; A g : A n tg e n o ; Ig: In m u n o g lo b u lin a s ; F A O : F a c to r a c tiv a d o r d e lo s o s

te o c la sto s ; F IO : fa c to r in h ib id o r d e lo s o s te o b la sto s ; L I: L in fo q u in a s in m u n o rre g u la d o ra s ; IL: in te rle u q u in a s (1 ,4 ,6 ); C P :
C lu la p la s m tic a ; FNT-(3: fa c to r d e n e c ro s is tu m o ra l p

un paciente con fiebre reumtica recurrente; ac

tividad anti a^-m acroglobulina de caballo en
otro paciente que haba recibido inyecciones
sucesivas de suero de caballo hiperinmunc, tan
slo por nombrar algunos casos (fig. 31-3).
En la actualidad, sin embargo, la hiptesis
con mayor predicam ento es la que considera
que la GM responden a una alteracin en la re
gulacin del sistem a inm une vinculado a la
edad del paciente. Avala esta hiptesis la cre
ciente incidencia de G M transitorias postras
plantes, tanto renal como de mdula sea, cuya
frecuencia aumenta con la edad.
Factores predisponentes
Edad, sexo y raza. Se observa una incidencia
acentuada a partir de los 50 aos y hasta los 70
aproximadamente. Con respecto a la distribu
cin en funcin del sexo no se han observado
diferencias significativas. En un estudio realiza
do en los EE.UU., en 1971, se encontr el doble
de incidencia en la poblacin blanca con rela
cin a la negra. Esta experiencia fue vlida so
lamente para ese estudio local, no resultando
extrapolable al resto de la poblacin. En un tra
bajo realizado diez aos despus por los mis
mos investigadores, se obtuvieron resultados
opuestos a los anteriores ya que, en la actuali
dad, el MM sera la enfennedad hematolgica
maligna ms frecuente entre la poblacin negra.

Factores genticos. Existe poca informacin

con respecto a los factores genticos que po
dran intervenir en la etiologa del MM en el
hombre. Aberraciones comunes a los distintos
tipos de GM han sido relatadas, aunque el valor
de este hallazgo an hoy se discute y no se ha
logrado establecer una correlacin entre los ha
llazgos citogenticos y el estado clnico de los
pacientes. Han sido descritos varios casos de
GM en miembros de una misma familia.
Virus. A diferencia de otros tumores malig
nos del sistema linforreticular no se ha demos
trado asociacin aparente entre MM y virus.
Sobre un estudio realizado en 122 pacientes
con MM, en los que se determin el ttulo de
Ac contra el Ag del cpside del virus de Epstein Barr, no se obtuvieron resultados significa
tivos con respecto a los controles normales.
Radiaciones. Se ha demostrado una inciden
cia mayor de MM, as como de otros trastornos
linfoproliferativos en individuos expuestos a
radiaciones ionizantes, sobre todo en un estu
dio poblacional realizado en Hiroshima y Nagasaki. Asimismo, en estudios realizados en ra
dilogos se observ una incidencia mayor de
MM que la esperada.
Cuadros clnicos asociados. Procesos infec
ciosos e inflam atorios crnicos, as como tu
mores no reticulares, se observan con frecuen
cia en los antecedentes clnicos de estos pa
cientes.

Gammopatas monoclonales
F ig . 3 1 -3 E tio lo g a p r o b a
ble d e las G M .

N- clulas

R espuesta inm une normal

A breviaturas:
1 = A g = a n tg e n o
2 = M g = a g e n te m u ta g n ic o
3 = D ia g n s tic o (D ) y c o
m ie n z o d e l tr a t a m i e n
to (T)
P L : P e ro d o d e 'la te n c ia
G M : G a m m o p a ta m o n o c lo n a l

631

1012 -

700

Alteraciones humorales asociadas

Anem ia. Es una de las caractersticas del
MM. Se presenta habitualmente en el momento
del diagnstico o sobreviene durante el curso
de la enfermedad. Generalmente es de tipo norinoctico normocrmica, aunque puede ser macroctica. La anemia del MM es refractaria al
hierro, vitamina
y cido flico. Los factores
que contribuiran a provocar la anemia seran
invasin medular por parte de los plasmocitos,
aumento de la destruccin de los eritrocitos,
prdida de sangre, insuficiencia renal, factores
asociados con procesos infecciosos y con fac
tores nutricionales.
Alteracin de la hemostasia. Responde a dife
rentes causas y generalmente se observa en los
componentes monoclonales de tipo IgA e IgM y
inuy rara vez en los IgG. A pesar de que se han
descrito anticuerpos contra los distintos factores
de coagulacin en el MM, la alteracin de la h e
mostasia no sera causada por una verdadera
reaccin Ag-Ac sino que existira un impediinento en la formacin del cogulo por un fen
meno previo de gelacin, que estara provoca
do por la interferencia del componente M en
el proceso de polimerizacin de la fibrina.
Hipercalcemia. Es otro elemento caracters
tico, aunque no constante, del MM. En algunos
casos se ha descrito el shock hipercalcmico
como causa de bito en pacientes con MM. Las
lesiones osteolticas dan una tpica imagen en
sacabocado y provocan en el paciente una sintom atologa caracterstica y en muchos casos
son las responsables de fracturas patolgicas.
En lo que respecta a la destruccin sea y a
la movilizacin del calcio por las clulas mie-

T ie m p o
(d a s )

lomatosas, su posible mecanismo ha sido des

crito recientem ente. E stim ulando lin fo cito s
normales con Ag o mitgenos se observ que
liberaban una sustancia movilizadora de calcio
denominada factor activador de los osteoclastos (FAO). La actividad del FAO ha sido de
mostrada incubando hueso fetal de rata m arca
do con calcio radiactivo y el factor. Flasta el
momento se ha demostrado que el FAO no se
ra la parathormona ni dihidrocalciferol o una
prostaglandina sino que se tratara de un p o li
pptido con un peso m olecular com prendido
entre 10 y 100 kD.
Sobrenadantes de cultivos de MO de pacien
tes con MM mostraron que contienen el FAO.
Cultivos del mismo tipo con MO de pacientes
con otras heraopatas malignas o benignas no
secretan este factor. Cortes de hueso de pacien
tes con MM mostraron la presencia de osteoclastos activos en las reas de reabsorcin sea.
Uremia. Otra de las alteraciones humorales
importantes del MM la constituye el aumento de
la urea circulante que revela el grado de insufi
ciencia renal que muestran estos pacientes. La
insuficiencia renal junto con los cuadros de in
feccin generalizada es una de las causas ms
frecuentes de muerte en ios pacientes con MM.
Existen dos elementos principales que confluyen
en la produccin de la insuficiencia renal y del
denominado rin mielomatoso: la hipercal
cemia y la proteinuria de Bence Jones (BJ). La
relacin entre el metabolismo del calcio y la in
suficiencia renal es muy importante. Algunos
autores consideran a la hipercalciuria com o el
factor principal en la produccin de la insufi
ciencia renal, mientras que otros, en cambio, ad
judican a la proteinuria de BJ tal consecuencia.

632

Inmunopatologa

Inmunodepresin. O tra alteracin humoral

que acompaa al MM es la hipogammaglobuli
nemia generalizada. En los distintos tipos de
MM se observa una discreta o acentuada hipo
gammaglobulinemia que provoca el estado inmunodeficitario tpico de estos pacientes, que
padecen infecciones recurrentes y en los que
las neumonas y septicemias son frecuentemen
te el cuadro terminal de la enfermedad. Uno de
los mecanismos para explicar la hipogam m a
globulinemia sera que la proliferacin del clon
celular que sintetiza el componente M inhibi
ra el desarrollo de otros clones celulares. Zoila
y col., trabajando con plasmocitomas trasplantables, demostraron que posean un efecto inmunodepresivo sobre la respuesta prim aria y
secundaria frente a diferentes antgenos. La hi
ptesis que sostienen es que deprimiran la ma
duracin de los precursores de las clulas pro
ductoras de anticuerpos.
Macroglobulinemia
Se denomina macroglobulinemia a la presen
cia de un componente monoclonal srico de ti
po IgM. Se clasifican en primarias y secunda
rias. La macroglobulinemia primaria se conoce
tam bin com o enferm edad de W aldenstrm
(MW). Para el diagnstico de MW, adems de
la GM de tipo IgM, debe demostrarse prolifera
cin anormal de clulas atipicas de estirpe lin
foide en MO y en otros rganos del sistema reticuloendotelial.
A causa del elevado PM de la IgM, y sobre
todo cuando se encuentra en alta concentra
cin, los pacientes con macroglobulinemia sue
len presentar sndrome de hiperviscosidad co
mo cuadro asociado. La presencia de crioglobulinemia tambin es frecuente.
A diferencia de lo que ocurre en el MM, en
la MW no se observa destruccin sea.
En la mayor parte de los casos resulta muy
difcil diferenciar entre m acroglobulinem ias
primarias y secundarias. Las GM de tipo IgM
se asocian preferentem ente con MW, aunque
en menor escala suelen encontrarse en neoplasias reticulares como linfomas y leucemias (so
bre todo LLC) e incluso en un muy escaso n
mero de mielomas.
Enfermedad de las cadenas pesadas (ECP)
En estos casos, la GM es estructuralm ente
semejante al fragmento Fe de las Ig. Hasta el
momento se han descrito tres clases de ECP:
E C P tipo gam m a (y). El prim er caso fue
descrito en 1964 por Franklin y col, y los casos
publicados con posterioridad son relativamente
escasos.

Se presenta con preferencia en individuos de

sexo m asculino por encim a de ios 40 aos,
aunque tambin se han descrito casos en p a
cientes ms jvenes. Clnicamente se observan
Unfoadenopatas, hepatomegalia y esplenome
galia. Suelen presentar anemia hipocrm ica,
eosinofilia y un edema caracterstico en el pala
dar. Los episodios infecciosos son frecuentes
(pulm onas, bronquitis, etc.) y, en la m ayor
parte de los casos, constituyen la causa princi
pal de muerte de estos pacientes.
En MO se observa un incremento de clulas
plasm ticas con regular grado de atipicidad,
linfocitos y clulas reticulares. Habitualmente
no se observa compromiso seo ni renal como
sucede en el MM.
Desde el punto de vista proteico se observa
una GM estructuralm ente sem ejante al frag
mento Fe de la IgG. Por su bajo peso molecular
(53 kD) se excreta, al menos parcialmente, por
la orina. La movilidad electrofortica es de beta 2-globulina y presenta un aspecto de menor
heterogeneidad que las IgG tetrapeptdicas nor
males.
Para su deteccin inmunoqumica debe efec
tuarse la inmunoelectroforesis, primero frente a
anti-gamma y luego con anti-Fc, anti-Fab, antikappa y anti-lambda. Frente a anti-gam m a y
anti-Fc debe obtenerse un arco de precipitacin
paraproteico caracterstico, m ientras que la
reaccin con anti-Fab, anti-kappa y antilambda
debe ser negativa. Por la posible existencia de
determ inantes antignicos ocultos se reco
mienda repetir las determinaciones con los dis
tintos antisueros luego de la reduccin y alquilacin de la protena aislada.
ECP tipo alfa ( a). Fue descrita inicialmente
por Sehgman y col. Se ha comunicado hasta el
momento un m ayor nmero de casos que de
enfermedad de Franklin (tipo gamma).
El cuadro clnico se presenta como un lin
foma maligno del intestino, con fuertes dolo
res abdominales, sndrome de malabsorcin y
prdida de peso acentuada, aunque se han des
crito ECP tipo alfa sin aparente compromiso
intestinal. Generalmente no se observa linfadenopata, hepatom egalia ni esplenomegalia.
Esta enferm edad afecta en general a ind iv i
duos jvenes, incluso en edad peditrica, y
presenta una incidencia mayor en pases del
Mediterrneo.
En suero se detecta una GM a expensas de
cadenas a que no reacciona con antisueros anti-kappa ni anti-lambda. Suele presentarse en
distintos grados de polimerizacin, razn por la
cual no siempre se detecta en orina. El PM del
monmero es del orden de los 39 kD. En los
anlisis electrforticos muestran una m ovili
dad variable entre la zona alfa^ y gamma,.

Gammopatas monoclonales
ECP tipo m u (fl). Dentro de las ECP, es la
menos frecuente. La mayor parte de los casos
descritos hasta el momento, luego del primero
publicado en 1969, presentaba un cuadro clni
co de leucem ia linftica crnica con anemia,
elevada susceptibilidad a las infecciones, hepatom egalia y esplenom egalia. En MO se e n
cuentra un cuadro caracterizado por infiltracin
linfoplasmocitaria (alrededor de un 45% de lin
focitos y 25 a 30% de clulas plasmticas). Las
clulas plasm ticas suelen presentar grandes
vacuolas intracitoplasmticas.
Desde el punto de vista proteico se observa
una GM constituida por cadenas (l la que, a di
ferencia de los casos anteriores, presenta una
pronunciada heterogeneidad electrofortica y
no siempre puede detectarse mediante el sim
ple proteinograma. Presenta un PM de alrede
dor de 55 kD y tendencia acentuada a la form a
cin de agregados. Tambin, a diferencia de las
ECP de tipo gamma y alfa, en las de tipo mu
((l) se sintetizan cadenas livianas, de ah que en
la mayor parte de los casos se acompaan por
presencia de proteinuria de Bence Jones, gene
ralmente de tipo kappa. Estudios por inmunofluorescencia demostraron la sntesis intraeitoplasmtica de cadenas |J. y K dentro de una m is
ma clula con lo cual se concluye que, a dife
rencia de lo que ocurre en la ECP de tipo gam
ma y alfa, en las de tipo mu existira, ms que
un problema de dficit de sntesis de cadenas
livianas, un defecto de ensamble entre las cade
nas H y L para constituir la estructura tetrapeptdica completa.
G M SECUNDARIAS
O ASOCIADAS
Tal como muestra el cuadro 31-1, dentro de
este grupo se incluyen patologas que habitual
mente cursan con una GP y en un muy bajo n
mero de casos pueden asociarse con una GM.
En estos casos resulta fundamental precisar
el origen secundario de la GM, ya que en m u
chos de ellos puede coexistir incluso un MM u
otra GM maligna primaria con la enfermedad
de base.
Gammopata monoclonal
benigna (GMB)
Se conoce tambin como GM idioptica o
esencial (W aldenstrom, 1961). Habitualmente
se observa en individuos de edad avanzada, ge
neralmente entre los 55 y los 75 aos de edad,
que no presentan una sintomatologa atribuible
a la GM y en los que la presencia del com po
nente monoclonal aparece como la nica alte
racin humoral. Si bien no existe una diferen

633

cia cualitativa entre el MM y la GMB en cuan

to al tipo de inmunoglobulina comprometida,
ya que es semejante en ambos casos, se o bser
va en cambio una neta diferencia cuantitativa.
En el MM, sobre todo si no se trata en form a
adecuada, existe una rpida proliferacin del
clon celular con la consiguiente hiperproduc
cin del componente monoclonal; en cambio,
la caracterstica p rin cip al de la GMB es la
constancia en los niveles circulantes del C9 mponente monoclonal a travs del tiempo. E sta
es justam ente la diferencia ms importante en
tre la forma benigna donde existe una prolife
racin controlada de un clon de clulas p las
mticas con relacin a la proliferacin progre
siva de la form a m aligna. La incidencia de
GMB fue determ inada por distintos autores,
encontrndose una frecuencia variable entre el
1 al 3% en la poblacin normal por encima de
los 50 aos de edad. En virtud del distinto ori
gen de las investigaciones se descartara la in
fluencia de un posible factor geogrfico.
De acuerdo con la descripcin de distintos
autores, an no queda claro si la GMB es nece
sariamente una primera etapa del proceso de ti
po mielomatoso; es decir, si constituira o no
un estadio prem aligno. Estadsticam ente se
ha comprobado que un bajo nmero de pacien
tes portadores de una GMB desarrollan con el
tiempo un MM; no obstante, a pesar de que es
poco probable, no resultara imposible, ya que
hay autores que han descripto la eclosin de
MM en pacientes con GMB luego de m s de
18 aos de seguimiento (Kyle 1976, 1986).
Sobre la base de todos estos elementos y de
los aportados por otros autores se puede con
cluir que la GMB representara un estadio p re
maligno potencial de alto riesgo que, frente al
estmulo de distintos agentes mutagnicos, po
dra experimentar una transformacin neoplsi
ca del clon de clulas B.
No obstante, si bien la posibilidad de ex p e
rim entar una transformacin maligna estad s
ticamente es mayor para este clon que p ara la
poblacin policlonal que le dio origen, a la luz
de los conocimientos que poseemos hasta hoy
no podem os afirm ar que se trate n e c e sa ria
mente de un estadio prem aligno y ello d ep en
dera, tal como acontece en la etio lo g a de
otros procesos neoplsicos, de la interrelacin
entre el husped, sobre todo de su sistema In
munolgico, y los distintos agentes am bienta
les, naturales y sintticos, a los que se encuen
tra expuesto.
Por otra parte, se cree que esta proliferacin
controlada de clulas plasmticas normales que
constituyen la GMB estara favorecida por un
estado de inmunodeficiencia ligado a la edad.
No es casual t^ue en los distintos estudios esta
dsticos realizados en diferentes poblaciones

634

Inmunopatologa

normales se haya descrito un incremento en la

frecuencia del componente M a medida que
aumentaba el rango etario de los individuos es
tudiados. En este sentido, una de las posibles
teoras para explicar la aparicin de las GM se
ra la produccin espontnea o inducida de una
mutacin somtica, cuya incidencia sabemos
que aumenta proporcionalmente con la edad,
tanto en hum anos como en m odelos experi
mentales en ratn.
INMUNORREGULACIN
EN MM
Los problemas infecciosos son la causa prin
cipal de mortalidad en los pacientes con MM.
Si bien ello tambin sucede con otros tipos de
cnceres, y en especial en los del sistema linforreticular, el MM es el caso donde los episo
dios infecciosos son ms frecuentes y graves,
mostrando un tpico, y prcticamente linico, ca
so de dficit inmunolgico, principalmente de
la respuesta inmune humoral.
El paciente con MM muestra una tendencia
acentuada a contraer infecciones bacterianas
recurrentes, no as con respecto a virus y hon
gos. Si bien el tratamiento habitual con antibi
ticos puede ser efectivo, existe una resistencia
notable en el caso del Streptococcus pneumoniae, de ah justamente que la neumona sea la
causa principal de muerte en la mayor parte de
estos pacientes.
Estudios preliminares han permitido demos
trar que existe no slo un dficit en los niveles
de Ig circulantes, sino que incluso los pacientes
con MM presentan una produccin menor de
Ac como respuesta a la estim ulacin con Ag
habituales (vacunas: tifoidea, diftrica, neumoccica, etc.)
Otros autores, ensayando la respuesta de pa
cientes con MM al estmulo con vacuna neumoccica en relacin con controles normales, y
m idiendo los niveles de Ac antineum ococos
seis semanas despus de la inmunizacin, en
contraron que en los pacientes la respuesta es
taba deprimida en forma significativa. No obs
tante, observaron una diferencia notoria en lo
que respecta a la respuesta individual llegando
a establecer una relacin entre buena respuesta
y niveles de leucocitos mayores de 5.000/mm^
y mala respuesta en los casos con leucocitos
menores de 5.000/m m \
Con respecto a los niveles de las distintas Igs
fisiolgicas en nuestros pacientes con MM, he
mos observado una reduccin de las 3 Igs prin
cipales (IgG, IgA e IgM) en el 70% de los ca
sos, de slo 2 Igs en el 20% y, en alrededor del
10%, slo una Ig se encontraba deprim ida.
Comparando asimismo la relacin entre el dfi
cit de Igs, como parmetro que expresa el gra

do de inmunosupresin del paciente, y la gra

vedad pronstica de la enfermedad, evaluada a
travs de los correspondientes estadios clni
cos, se pudo observar que a mayor gravedad
del cuadro clnico se corresponde un marcado
grado de inmunodeficiencia.
Estudios de Spitler y col. demostraron que,
adems de los bajos niveles de Igs circulantes,
en los pacientes con MM existe una deficiencia
en la funcin de los neutrfilos, es decir que
existira tambin un compromiso de los meca
nismos inespecfcos de defensa. Esta deficien
cia en la actividad leucocitaria no sera un de
fecto intrnseco de las clulas en s, ya que resuspendiendo leucocitos normales en plasma
de pacientes se observa una disminucin de la
fagocitosis, lo cual demostrara que existe una
relacin directa entre concentracin del compo
nente M en el plasma del paciente y activi
dad leucocitaria.
En lo que respecta a la inmunidad celular se
vio que no se encuentra comprometida en MM,
lo que explicara la baja incidencia de infeccio
nes virales y fngicas en estos pacientes. En
nuestro caso, el estudio de la re.spuesta celular
se efectu a nivel clnico in vivo evaluando la
hipersensibilidad retardada mediante pruebas
cutneas. Estos resultados coinciden con los
obtenidos por otros autores mediante pruebas
in vitro de proliferacin de linfocitos perifri
cos por estmulo con Ag y mitgenos. Se ob
serv que los linfocitos perifricos de pacientes
con MM mostraban una respuesta normal al ser
estim ulados con fitohem oaglutinina o pokeweed mitgeno (PWM).
Teniendo en cuenta que en el MM no existe
una deficiencia generalizada de la respuesta in
mune sino que se encuentra especficam ente
deprimida la inmunidad humoral, en los lti
mos aos la investigacin se orient hacia los
mecanismos por los cuales se encuentra reduci
da la produccin de Ig. Existen tres m ecanis
mos principales que regulan la respuesta inmu
ne en el MM: 1) el hipercatabolismo de las Ig,
2) la presencia de clulas supresoras circulantes
derivadas de LT y 3) la red idiotpica (vase
cap. 18).
El valor del catabolismo de las IgG en p a
cientes con MM de tipo IgG se encontr dupli
cado con respecto al normal. Esto fue demos
trado aos atrs por Waldmann y Strober y se
debe a una relacin directa entre la concentra
cin de IgG y el grado de catabolismo. Los paratopes de Ac sintetizado neutralizaban epito
pes antignieos. No obstante, a pesar de que es
to explicaba los bajos niveles de las IgG poli
clonales, no servan para explicar el dficit del
resto de Igs.
Un trabajo fundamental que mostr el papel
de clulas supresoras en el mecanismo de in-

Gammopatas monoclonales
munodepresin en pacientes con MM fue reali
zado por Broder y col. en 1975. Estimulando
linfocitos de pacientes con MM con PWM, ob
tenan un bajo ndice de secrecin de Ig com
parado con los controles normales. Cuando rea
lizaban un cultivo mixto de linfocitos de MM
con linfocitos norm ales y luego estim ulaban
con PWM, la respuesta de los linfocitos norm a
les se suprima. Esto perm iti demostrar que
una o ms clulas supresoras actuaban en el
m ecanism o del inm unodepresin. E studios
posteriores permitieron establecer que se trata
ba de monocitos macrfagos. La contraprueba
se realiz, por una parte, removiendo los fago
citos mononucleares de los linfocitos perifri
cos (LP) y observando la respuesta al PWM de
los LP de pacientes con MM. Inversam ente,
agregando fagocitos mononucleares de MM a
LP de individuos normales se lograba inhibir la
respuesta al PWM.
A la luz de los conocimientos actuales, que
consideran como dubitativa la existencia de
clones celulares que cumplan exclusivamente
esa funcin, la actividad supresora observada
podra estar relacionada con la calidad de las
interleuquinas que sintetizan linfocitos y m a
crfagos, de algunas de las cuales se sabe que
pueden ejercer efecto estimulativo o supresorio segn el blanco celular sobre el que ac
tan. En el captulo 18 se exponen en form a
ms detallada estos m ecanism os de re g u la
cin.
En modelos experimentales en ratn se ob
serv que, incluso los plasmocitomas que no
producen componente M , poseen efecto inhi
bitorio en la produccin de Igs normales. La
expresin clnica de este modelo en el humano
son los denominados mielomas no secretores
que cursan generalm ente con marcada h ip o
gammaglobulinemia. De esta forma se demos
trara que los mediadores de la inmunodepre
sin seran completamente independientes del
tipo inm unolgico y de la concentracin del
componente M .
Resumiendo, podemos decir que el sndrome
de inmunodeficiencia en MM, tanto en anim a
les como en el hombre, se caracteriza por: 1)
depresin de la respuesta inmune humoral, en
especial la primaria, 2) est deprimida la res
puesta humoral tanto con Ag T-dependientes
(GR de carnero) como T-independientes (poli
sacrido de neumococo) y 3) la respuesta in
mune celular no est alterada. No obstante, San
M iguel y col. m uestran que las clulas T y
otras poblaciones celulares accesorias pueden
desempear un papel clave en la inmunorregulacin del M.M. Estos autores encontraron un
m a rcad o d e s e q u ilib rio en el c o c ie n te
CD4/CD8, tanto por un aumento de las clulas
DC8 como por descenso de las CD4.

635

En tanto que tradicionalmente se consider

la clula plasmtica (CP) como la clula term i
nal en la direnciacin del linfocito B, la cual
no participaba as como tampoco era m ay o r
mente influida por el complejo mecanismo que
regula la respuesta inmune, los nuevos conoci
m ientos en materia de inm unorregulacin en
MM permiten determinar que las clulas plas
mticas malignas son funcionalmente pluripotenciales y son capaces de deprimir la respuesta
inmune normal, pero a su vez el sistema inm u
nolgico del portador puede alterar su c re c i
miento celular y funcin. Es decir que existira
una interrelacin tal entre el tumor y la re s
puesta inm une que, m ientras a travs de sus
m ediadores hum orales y celulares el tu m o r
provocara la inmunodepresin, el sistema in
mune del paciente actuara regulando el desa
rrollo y crecimiento del propio tumor. Sabemos
desde tiempo atrs que el producto principal de
la CP, los Acs o Igs, son los encargados del
mecanismo de regulacin de su propia sntesis.
Existen, sin embargo, otros factores producidos
por el clon mahgno de CP, como el factor plasmocitoma (PC), que es una linfoquina inmunomoduladora cuya funcin sera la regulacin de
la produccin de Ig por clulas B (IL4 ?), ade
ms del interfern, que influira tam bin en
forma an no aclarada sobre la respuesta in m u
ne del paciente, y otro no relacionado con la re
gulacin de la respuesta inmune que son el fac
tor activador de los osteoclastos (FAO) y el
factor inhibidor de los blastos (FIO), que seran
los responsables de las lesiones seas caracte
rsticas del MM.
El mecanismo descrito anteriormente sobre
l regulacin del sistema inmune en MM, que
pudo dem ostrarse en el modelo experim ental
de plasmocitoma en el ratn, sera extrapolable
a lo que observamos en humanos.
EL L A B O R A T O R IO EN E L ESTU D IO
DE IN M U N O G LO BU LIN A S
M O N O C LO N A LES
La importancia clnica de las inmunoglobuli
nas monoclonales (Igm) radica en su valor co
mo marcadores tumorales.
Su identificacin, tipificacin y cuantifica
cin correcta resulta de fundamental im portan
cia en el diagnstico, pronstico y monitoreo
de los procesos malignos de las clulas B, entre
los cuales el mieloma mltiple es el ms fre
cuente.
El estudio de estas Igm en el laboratorio se
realiza siguiendo una marcha analtica descrita
en el cuadro 31 -2 y en la figura 31 -4.
La deteccin de Igm o componentes M se
realiza habitualm ente m ediante el fracciona-

636

Inmunopatologa

F ig. 31-4. Cuadro analtico bsico para la ciracterizacin

de la Ig m onoclonales.
En 1 se observa la presencia de un com ponente M ca ra c
terstico con m ovilidad electrofortica en la zona y lenta.
En 2, in m u n o ele ctro fo resis con suero an tih u m an o total
(aT) donde se observa un arco de precipitacin anm alo de
tipo IgG (flecha). En 3, se confirm a con un suero antiinm unoglobulinas (a Ig). En 4, se m uestra el proteinogram a
electrofortico de orina (OP) en relacin con el suero del
paciente (SP) con una banda hom ognea posbetaglobulinas
(proteinuria de Bence Jones). E n 5, se observa la inm unoe
lectroforesis de SP y O P con suero antikappa (a K) donde
se m uestra que las cadenas livianas, tanto del com ponente
M tetrapeptdico (IgG ) com o las libres (protena de B en
ce Jones), son de tipo kappa.

miento electrofortico de las protenas sricas

y/o urinarias en gel de agarosa o acetato de ce
lulosa. Mediante esta tcnica pueden detectarse
C uadro 31-2. Caracterizacin de Igm
Suero
- Identificacin de la Igm
- Tipificacin y confirm acin de nom onoclonalidad
- C uantificacin de la Igm
- C uantificacin de Igs norm ales y lbum inem ia
- D eterm inacin de beta, m icroglobulina
O rin a
D eterm inacin de protenas totales
- C oncentracin de orina de 24 h
-- Investigacin de protena de B ence Jones (B J)
- Tipificacin y confirm acin inm unolgica de protena
deB J
Investigacin de beta, m icroglobulina

alrededor del 95% de los casos de gammopata

monoclonal (GM). El porcentaje restante est
constituido por mielomas no secretores, cier
to nmero de mielomas micromoleculares y de
baja secrecin y por los casos de Igm ocultas
dentro de fracciones normales del electroforegrama srico. La inspeccin visual (evaluacin
cualitativa) es el mtodo recom endado para
identificar Igm, ya que la elucin o el registro
densitogrfico se prestan a interpretaciones
errneas.
Luego de la deteccin de la Igm corresponde
efectuar su tipificacin inmunolgica; es decir,
determinar la clase de cadena pesada (y, a , t , 5
o e) y el tipo de cadena liviana ( k o X) para
confirmar su origen monoclonal. Las tcnicas
utilizadas son la inmunoelectroforesis y la electroinmunofijacin (figs. 31-5, 31-6 y 31-7).
La cuantificacin de la Igm as como de las
Ig normales o fisiolgicas no slo es importan
te desde el punto de vista diagnstico, sino que
resulta imprescindible en el seguimiento de los
distintos tipos de GM para estimar evolucin, y
sobre todo respuesta teraputica en el caso de
las de origen maligno.
La cuantificacin de las Ig se realiza habi
tualmente por inmunodifusin radial. En cier
tos laboratorios de alta complejidad se utiliza la
inmunonefelometra. En el caso especfico de
la Igm se recom ienda efectuarla m ediante la
cuantificacin de la respectiva banda del pro
teinograma electrofortico, ya que los mtodos
inmunolgicos suelen sobreestimar el valor a
causa de una diferente reactividad de los anti
sueros contra las distintas subclases de Ig. Ac
tualm ente, los laboratorios que procesan un
elevado nmero de muestras complementan la
investigacin de Inmunoglobulinas (Igm) me
diante la determ inacin del cociente kappa/
lambda ( kJX) srico y/o urinario en autoanalizadores, con tcnicas inmunoturbidimtricas o
inmunonefelomtricas.
La investigacin de proteinuria de Bence Jo
nes (BJ) debe efectuarse en orina de 24 h, pre
viamente concentrada, mediante al menos un
fraccionamiento electrofortico.
En el caso de observar una banda homog
nea entre las zonas alfa^ y gamm aglobulinas
debe realizarse una inm unoelectroforesis y/o
electroinmunofijacin con antisueros anti-kappa y anti-lambda para confirmar la presencia de
protena de BJ.
En caso de obtener reaccin negativa frente
a ambas podra tratarse de beta^ microglobuli
na, protena que se sintetiza en gran cantidad
en curso de procesos linfoproliferativos y que
por su bajo peso molecular (22 kD) se excreta
por orina aun en ausencia de dao renal.
Las pruebas de termosolubilidad para la in
vestigacin de protena de BJ deben ser defini-

Gammopatas monoclonales

637

Fig. 31-5. Electroforesis e inm unofijacin con antisuero m onoespecfico antilam bda, d e orina perteneciente a un p acien te
con m ielom a de tipo m icrom olecular.
C ondiciones de trabaje. A y B fraccionam iento electrofortico sim ultneo durante 2 0 en buffer veronal; pH: 8,5;
0,05
seguido en B de inm unofijacin con 40 |-il de antisuero m onoespecfico antilam bda durante 5 minutos.
Es im portante destacar la sensibilidad, especificidad y elevada resolucin de la E lF en la identificacin de co m ponentes
m onoclonales con m ovilidad electrofortica muy sem ejante.

Hp
a.ATr

Alb Std

ita
Fig. 31-6. Patrn srico obtenido m ediante inm unoelectroforesis bidim ensional en un caso con com plicacin renal. T o m a
do de: P izzolato, M Clin C him A cta, 45: 207, 1973.
C ondiciones de trabajo: 1 |al de m uestra. Electroforesis en la prim era dim ensin 250 V; en buffer tris-glicina pH : 9 ,2 , du
rante 4 0 . Segunda dim ensin: EID en 90 con respecto a la prim era corrida, 150 |il de antisuero hum ano total d u ran te 12
horas.

638

Inmunopatologa

WM

PS

NS

TLG + IF
a ' a'

F ig . 31-7. D eterm inacin sim ultnea del tipo ininunolgico y el peso m olecular de Igs m onoclonales y sus fragm en
tos m ediante TL G -IF (gel filtracin-inm unofijacin). T o
m ado de: Pizzolato, M y col R ev A BA , 46: 11, 1982.
/ a 3: TLG (gel filtracin en capa fin a )
1. Suero de un paciente con m acroglobulinem ia de W a l
denstrom (W M ).
2. Suero de un paciente (PS) con GM de tipo IgG-K.
3. Suero norm al (NS).
4 y 5. TLG + IF (G el filtra ci n - inm unofijacin)
4. M uestra 2 con antisuero antigam m a (ay).
5. M uestra 2 con antisuero antialfa (aa).

tivamente descartadas a causa de su baja sensi

bilidad.

B IB L IO G R A F IA
A lexanian R, B alcerzak S, B o n n et J, G ehan E, H aut A,
H ew lett J y M onto R: P ro g n o stlc F acto rs in m ltip le
m yelom a. Cncer, 36: 1192, 197.5.
D urie B y Salm n S: A clinical Staging System for M lti
ple M yelom a. Cncer, 36: 842, 1975.

K yle R y Bayrd E: The M onoclonal G am m opathies, M lti

p le M y e lo m a a n d R e la te d P la s m a - C e ll D is o r d e r s .
S pringfield III, C harles C. Thom as, pp. 159, 1976.
K yle R: M onoclonal G am m opathy o f undeterm inated sig
nificance; natural hlstory o f 241 cases. Am J M ed, 64:
184, 1978.
K yle R: M yelom a and related disorders. C linics in Flematology, 11: m , 1982.
K yle, R. T he g am m opathies . Sem inars in H em atology,
Vol. 32, 1995.
K yle R y G arton I P: Laboratory m onitoring o f m yelom a
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M edical R esearch C o u n cils W orklng Party for Therapeutic Triis in L eukem ia: R eport on the first M yelom atosls
T rial. I. A naly sis o f p resen tin g featu res o f p ro g n o stic
im portance. B r J H aem at, 24: 123, 1973 y Br. J. C ncer,
48:841, 1980.
N ational C ncer Institute, C om m ittee o f the C hronic L e u
kem ia, M y elo m a T ask F orc: P roposed gu id elin es for
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O sserm ann E: Plasm a Cell D yscrasias: A current Perspective. A cta H aem at, 68: 167, 1982.
P avlovsky S, D upont J y Pizzolato M: M ielom a m ltiple.
D iagnstico, factores pronsticos y tratam iento. M ed ici
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cia en individuos aparentem ente sanos. Revista ABA, 40:
96, 1975.
Pizzolato M , B echerini I, C avagnaro F y Pavlovsky S: P a
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Pizzolato M , Goi F y S alvarezza R: linm unoflxation on
ce llu lo se acetate: An im p ro v ed screen in g m e th o d fo r
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365, 1979.
Pizzolato M , G oi F, V illa N, G asparini S y B resciani P:
D iagnstico de enferm edad de las cadenas pesadas. D es
c rip c i n de un n u ev o m to d o . R e v is ta A B A , 46: 11,
1982.
P izzolato M: Screening o f M on o clo n a l Im m un o g lo b u lin s
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Im m unochem ical T echniques P art E C oEd H V an V u
nakis y J J Langone. A cadem ic Press, N. Y. 1983, pg.

220 .
Pizzolato M y Goi F: Thin layer gel filtration im m unofi
xation: Identification o f abnorm al m olecular w eight im
m u n o g lo b u lin s or related frag m en ts. J Im m u n o l M e t
hods, 72: 91, 1984.
P izzolato, M. Vifflo J. G am m opaties esen ciale s . E n c i
clopedia Iberoam ericana de H em atologa. A . Lpez B o
rrasca y col. Ed. U n iversidad de S alam an ca (E spaa).
V ol. II, 521, 1992.
Salm n S y Seligm ann M : B -eell neoplasia in m an. Lcmcet, 2: 1230, 1974.
San M iguel, J. p., G o nzlez, M . G ascn, A. I.ym p h o id
s u b se ts and p ro g n o s tic fa cto rs in m ltip le m y e lo m a .
B lo o d 74; 379, 1989.
W a ld e n s tro m J: D ia g n o s is a n d T re a tm e n t o f M ltip le
M yelom a. N ew Y ork, G rue & Stratton, 1970.
W hicher J, C alvin J, R iches P, W arren C; T he laboratory
investigation o f paraproteinem ia. A n n CU Biochem , 24:
119, 1987.

Manifestaciones de hipersensibilidad.
Alergia

RICARDO MARGNI

Al comienzo de este libro, al hablar de inm u

nidad, decamos que la inoculacin de un ant
geno produca un efecto beneficioso pues los
anticuerpos elaborados por el husped, como
consecuencia de la penetracin de ese antgeno,
tenan la capacidad de neutralizar la accin del
agente agresor. Pero no siempre las cosas ocu
rren de esa manera ya que, segtn las caracters
ticas del antgeno, su va de penetracin, el tipo
de anticuerpo formado o las caractersticas ge
nticas del husped, puede desencadenar un
efecto desfavorable caracterizado por una m a
nifestacin de hipersensibilidad conocida con
el nombre de alergia.
Alergia fue definida originalmente por von
Pirquet como modificacin de la respuesta de
un organismo a sustancias a las cuales ha sido
precedentemente sensibilizado. Esta definicin
amplia incluye tambin la inmunidad; hoy se la
ha restringido a efecto perjudicial de hipersen
sibilidad, pero no por variaciones cuantitativas
de la sensibilidad, sino cualitativas. De esta m a
nera, se engloba dentro de alergia a toda mani
festacin de hipersensibilidad desencadenada
como consecuencia de la inoculacin de un an
tgeno y diferente de cualquier accin que el an
tgeno podra tener por s mismo. Esta defini
cin perm ite diferenciar la dism inucin del
efecto txico de una toxina diftrica, por ejem
plo, en un animal previamente inoculado con
ella (variacin cuantitativa, fenmeno de tipo
inmunitario), de un choque anafiletico desen
cadenado en un animal de experiencia reinocu
lado con albmina de huevo, como consecuen
cia de la liberacin de mediadores qumicos.
Las manifestaciones de hipersensibilidad se
agrupan en dos captulos fundamentales: el de
las manifestaciones especficas, originadas por
la penetracin de un antgeno, y el de las no es

32
pecficas. Dentro de las primeras, las llamadas
de tipo inm ediato se producen como c o n se
cuencia de la interaccin de antgenos y anti
cuerpos sricos, y las retardadas son originadas
por antgenos y clulas especficamente sensi
bilizadas (cuadro 32-1).
Si bien lo de inmediato o tardo est relacio
nado con el tiempo de aparicin del fenmeno,
en las primeras, aun cuando la formacin de los
inmunocomplejos es rpida, la expresin clni
ca puede ser tarda, como ocurre en la reaccin
de Arthus.
HIPERSENSIBILIDAD ESPECFICA
Para entender las interrelaciones entre hiper
sensibilidad e inm unidad, el ejemplo clsico
del neumococo quiz pueda aclarar m ejor las
cosas. Si se vacunan cobayos mediante varias
inoculaciones de neum ococos muertos, estos
anim ales se hacen resistentes a la infeccin
neum occica, y demuestran por lo tanto que
han adquirido inmunidad. Si a esos cobayos se
les inyecta el polisido de la cpsula d e los
neumococos, en la misma dosis con la cual es
inactivo en el cobayo normal, pero m ediante
inoculacin intravenosa, se d esencadena un
choque anafilctico. Si los cobayos tienen un
buen ttulo de anticuerpos precipitantes y se les
inocula intradrmicamente el polisido neum o
ccico, en el punto de inoculacin se producir
una necrosis por desencadenamiento de un fe
nmeno de Arthus. Si lo que se inyecta a los
cobayos por va intradrmica es la protena del
neumococo, se produce una inflamacin local
debida a una alergia retardada. Se ha elegido
para la experiencia el neumococo por las carac
tersticas de su estructura antignica, pero otras

638

Inmunopatologa

WM

PS

NS

TLG + IF
a ' a'

F ig . 31-7. D eterm inacin sim ultnea del tipo ininunolgico y el peso m olecular de Igs m onoclonales y sus fragm en
tos m ediante TL G -IF (gel filtracin-inm unofijacin). T o
m ado de: Pizzolato, M y col R ev A BA , 46: I I , 1982.
/ a 3: TLG (gel filtracin en capa fin a )
1. Suero de un paciente con m acroglobulinem ia de W a l
denstrom (W M ).
2. Suero de un paciente (PS) con GM de tipo IgG-K.
3. Suero norm al (NS).
4 y 5. TLG + IF (G el filtra ci n - inm unofijacin)
4. M uestra 2 con antisuero antigam m a (ay).
5. M uestra 2 con antisuero antialfa (aa).

tivamente descartadas a causa de su baja sensi

bilidad.

B IB L IO G R A F IA
A lexanian R, B alcerzak S, B o n n et J, G ehan E, H aut A,
H ew lett J y M onto R: P ro g n o stic F acto rs in m ltip le
m yelom a. Cncer, 36: 1192, 197.5.
D urie B y Salm n S: A clinical Staging System for M lti
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K yle R y Bayrd E: The M onoclonal G ainm opathies, M lti

p le M y e lo m a a n d R e la te d P la s m a - C e ll D is o r d e r s .
S pringfield III, C harles C. Thom as, pp. 159, 1976.
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M edical R esearch C o u n cils W orking Party for Therapeutic Triis in L eukem ia: R eport on the first M yelom atosis
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48:841, 1980.
N ational C ncer Institute, C om m ittee o f the C hronic L e u
kem ia, M y elo m a T ask F orc: P roposed gu id elin es for
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O sserm ann E: Plasm a Cell D yscrasias: A current Perspective. A cta H aem at, 68: 167, 1982.
P aviovsky S, D upont J y Pizzolato M: M ielom a m ltiple.
D iagnstico, factores pronsticos y tratam iento. M ed ici
ne, 7: 367, 1982.
Pizzolato M , Torquatti S, S toliar A, Pizzolato M C y Wi~
kinski R: P araprotenas idiopticas B enignas? In cid en
cia en individuos aparentem ente sanos. Revista ABA, 40:
96, 1975.
Pizzolato M , B echerini J, C avagnaro F y Paviovsky S: P a
rm etros pronsticos en M ielom a M ltiple. M edicina, 6:
569, 1976.
Pizzolato M , Goi F y S alvarezza R: Im m unofixation on
ce llu lo se acetate: An im p ro v ed screen in g m e th o d fo r
m onoclonal im m unoglobulins. J Im m unol M ethods, 26:
365, 1979.
Pizzolato M , G oi F, V illa N, Ga,sparini S y B resciani P:
D iagnstico de enferm edad de las cadenas pesadas. D es
c rip c i n de un n u ev o m to d o . R e v is ta A B A , 46: 11,
1982.
P izzolato M: Screening o f M on o clo n a l Im m un o g lo b u lin s
by Irnrrmnofixation o f cellulo.'ie acetate. On M ethods in
nzim ology". V ol 92, E d S P C olow iek y N O Kaplan.
Im m unochem ical T echniques P art E C oEd H V an V unakis y J J Langone. A cadem ic Press, N. Y. 1983, pg.

220 .
Pizzolato M y Goi F: Thin layer gel filtration im m unofi
xation: Identification o f abnorm al m olecular w eight im
m u n o g lo b u lin s or related frag m en ts. J Im m u n o l M e t
hods, 72: 91, 1984.
P izzolato, M. V inio J. G am m opaties esen ciale s . E n c i
clopedia Iberoam ericana de H em atologa. A . Lpez B o
rrasca y col. Ed. U n iversidad de S alam an ca (E spaa).
V ol. II, 521, 1992.
Salm n S y Seligm ann M : B -eell neoplasia in m an. Lcmcet, 2: 1230, 1974.
San M iguel, J. F., G o nzlez, M . G ascn, A. L ym phoid
s u b se ts and p ro g n o s tic fa cto rs in m ltip le m y e lo m a .
Blood, 74: 379, 1989.
W a ld e n s tro m J: D ia g n o s is a n d T re a tm e n t o f M ltip le
M yelom a. N ew Y ork, G rue & Stratton, 1970.
W hicher J, C alvin J, R iches P, W arren C: T he laboratory
investigation o f paraproteinem ia. A n n CU Biochem , 24:
119, 1987.

Manifestaciones de hipersensibilidad.
Alergia

RICARDO MARGNI

Al comienzo de este libro, al hablar de inm u

nidad, decamos que la inoculacin de un ant
geno produca un efecto beneficioso pues los
anticuerpos elaborados por el husped, como
consecuencia de la penetracin de ese antgeno,
tenan la capacidad de neutralizar la accin del
agente agresor. Pero no siempre las cosas ocu
rren de esa manera ya que, segtn las caracters
ticas del antgeno, su va de penetracin, el tipo
de anticuerpo formado o las caractersticas ge
nticas del husped, puede desencadenar un
efecto desfavorable caracterizado por una m a
nifestacin de hipersensibilidad conocida con
el nombre de alergia.
Alergia fue definida originalmente por von
Pirquet como modificacin de la respuesta de
un organismo a sustancias a las cuales ha sido
precedentemente sensibilizado. Esta definicin
amplia incluye tambin la inmunidad; hoy se la
ha restringido a efecto perjudicial de hipersen
sibilidad, pero no por variaciones cuantitativas
de la sensibilidad, sino cualitativas. De esta m a
nera, se engloba dentro de alergia a toda mani
festacin de hipersensibilidad desencadenada
como consecuencia de la inoculacin de un an
tgeno y diferente de cualquier accin que el an
tgeno podra tener por s mismo. Esta defini
cin perm ite diferenciar la dism inucin del
efecto txico de una toxina diftrica, por ejem
plo, en un animal previamente inoculado con
ella (variacin cuantitativa, fenmeno de tipo
inmunitario), de un choque anafilctico desen
cadenado en un animal de experiencia reinocu
lado con albmina de huevo, como consecuen
cia de la liberacin de mediadores qumicos.
Las manifestaciones de hipersensibilidad se
agrupan en dos captulos fundamentales: el de
las manifestaciones especficas, originadas por
la penetracin de un antgeno, y el de las no es

32
pecficas. Dentro de las primeras, las llamadas
de tipo inm ediato se producen como c o n se
cuencia de la interaccin de antgenos y anti
cuerpos sricos, y las retardadas son originadas
por antgenos y clulas especficamente sensi
bilizadas (cuadro 32-1).
Si bien lo de inmediato o tardo est relacio
nado con el tiempo de aparicin del fenmeno,
en las primeras, aun cuando la formacin de los
inmunocomplejos es rpida, la expresin clni
ca puede ser tarda, como ocurre en la reaccin
de Arthus.
HIPERSENSIBILIDAD ESPECFICA
Para entender las interrelaciones entre hiper
sensibilidad e inm unidad, el ejemplo clsico
del neumococo quiz pueda aclarar m ejor las
cosas. Si se vacunan cobayos mediante varias
inoculaciones de neum ococos muertos, estos
anim ales se hacen resistentes a la infeccin
neum occica, y demuestran por lo tanto que
han adquirido inmunidad. Si a esos cobayos se
les inyecta el polisido de la cpsula d e los
neumococos, en la misma dosis con la cual es
inactivo en el cobayo normal, pero m ediante
inoculacin intravenosa, se d esencadena un
choque anafilctico. Si los cobayos tienen un
buen ttulo de anticuerpos precipitantes y se les
inocula intradrmicamente el polisido neum o
ccico, en el punto de inoculacin se producir
una necrosis por desencadenamiento de un fe
nmeno de Arthus. Si lo que se inyecta a los
cobayos por va intradrmica es la protena del
neumococo, se produce una inflamacin local
debida a una alergia retardada. Se ha elegido
para la experiencia el neumococo por las carac
tersticas de su estructura antignica, pero otras

640

Inmunopatologa

Cuadro 32-1

Por anticuerpos
fijados a clulas
Inm ediata
(anticuerpos
sricos)

A nticuerpos hom ocitotrpicos

(espontneo)

Especfica
P or anticuerpos
circulantes

H ipersensi
bilidad
Retardada
(clulas espec
ficam ente sensi
bilizadas)

A nticuerpos 1rom ocitotrpicos

y lieterocitotr^
picos (experi
m ental)

f Fenm eno de
1 IArtiius (local)

A ctiva
A nafilaxia
Pasiva

A ctiva
{ A lergia atpica
Pasiva
A ctivo
Pasivo

T ipo tuberculnico
T ipo alergia de contacto
R echazo de hom oinjertos

' Tipo S annarelli-S chw artzm ann

G eneral

Inespecfica
A gentes fsicos

bacterias como las salm onelas, brcelas, e s

treptococos, en las que es posible separar fcil
mente los constituyentes antignicos poliosdicos y proteicos, pueden ser utilizadas ig u al
mente para desencadenar los fenm enos que
acabamos de indicar.
Esta experiencia muestra claramente que el
mismo complejo antignico puede originar un
estado de inmunidad o predisponer para reac
ciones de hipersensibilidad. Todo depende del
tiempo transcurrido entre la prim era inocula
cin y la desencadenante, de las caractersticas
del antgeno, de la va de inoculacin utilizada
y del tipo de anticuerpo interviniente. De lo
que no quedan dudas es que tanto la inmunidad
como la alergia son la resultante de la interac
cin de los antgenos con los anticuerpos o c
lulas especficainente sensibilizadas, que se
han formado como consecuencia de la estim u
lacin previa con esos antgenos.
Gell y Coombs han implementado un siste
ma para clasificar las reacciones de hipersensi
bilidad especfica, que incluye cuatro formas
reaccionantes. La clasificacin resulta til en
medicina, ya que permite encuadrar cada grupo
en un tipo particular de manifestacin de hiper
sensibilidad. No obstante, la ubicacin de un
paciente en uno u otro grupo a veces no es ta
rea fcil ya que puede haber superposicin de
fenmenos.
La reaccin de tipo I o anafilaxia es mediada
por anticuerpos citotrpicos. La IgE se une a
receptores de los mastocitos y basfilos sangu
neos y, cuando en esas condiciones interaccio
na con el antgeno, pone en marcha los m eca
nismos que llevan a la hberacin de los m edia
dores qumicos responsables del fenmeno.
La reaccin de tipo II o de eitotoxicidad an
ticuerpo dependiente, con participacin del sis

Local

tem a com plem ento o sin ella, se caracteriza

porque el anticuerpo hace de puente entre un
epitope antignico localizado en una clula
llanco, a travs de su paratope, y un linfocito
citotxico. La unin a esta clula ocurre por fi
jacin del fragmento Fe de la inmunoglobulina
a un receptor para Fe presente en la clula efec
tora.
La reaccin de tipo III coiTesponde a las inanifestaciones de hipersensibilidad que ocurren
cuando se forman complejos Ag-Ac fijadores
del complemento. La activacin de este sistema
libera pptidos (C3a, C5a) que por quimiotactismo atraen polimorfonucleares a la zona, que
fagocitan los agregados forixiados. Durante este
proceso se liberan productos que contribuyen
al dao tisular local. La reaccin tpica de este
tipo es la de Arthus.
La reaccin de tipo IV tiene lugar sin la par
ticipacin de anticuerpos. Los linfocitos T son
los responsables, dando lugar a las llam adas
reacciones de hipersensibilidad retardada, que
se consideran en el captulo 16.
ALERGIA INMEDIATA
Manifestaciones de hipersensibilidad
de tipo anafilctico
Las primeras experiencias de este tipo se de
ben a Portier y Richet, quienes trabajando con
extractos de tentculos de anmona y usando al
perro como animal receptivo, comprobaron que
las inoculaciones del material a repeticin le
producan la muerte. En un principio se crey
que era una consecuencia del cmulo de sus
tancias txicas presentes en los tentculos de
anmona. Luego pudo verse que dosis globales

Manifestaciones de hipersensibilidad
de ese material, u otros, como protenas sri
cas, albmina de huevo, etc., inoculadas en una
sola vez no producan ningn trastorno, en tan
to que la inoculacin de dosis fraccionadas del
mismo antgeno en cantidades muy pequeas y
cuya suma no llegaba a superar la dosis global
provocaba la muerte del animal. Portier y Richet designaron a ese fenm eno anafilaxia
[de ana (contrario, negativo) y phylaxia (pro
teccin)], ya que se caracterizaba por la prdida
de proteccin contra el agente agresor.
La anafilaxia, conocida tambin como reac
cin de tipo I de Gell y Coombs, al igual que la
inmunidad, puede ser de dos tipos: activa y pa
siva. La activa se caracteriza porque en ella el
animal que experimenta el choque anafilctico
ha sido sensibilizado previamente con tal fin
mediante la inoculacin de antgeno, en tanto
que en la anafilaxia pasiva el animal que expe
rimenta el choque anafilctico no ha sido sensi
bilizado con antgeno, pero se le ha inyectado,
previo al desencadenam iento del fenm eno,
suero de un animal especficamente sensibiliza
do con el antgeno que se ha de ensayar.
A

n a f il a x ia

a c t iv a

Puede tener manifestaciones generales o lo

cales.
Anafilaxia activa general
El animal presenta una serie de m anifesta
ciones de hipersensibilidad o choque anafilcti
co cuyas caractersticas pueden diferir en parte
segn la especie. Para conseguirlo es indispen
sable sensibilizar previamente al animal con el
mismo antgeno con que habr de desencade
narse el choque anafilctico.
Si a un cobayo se le inoculan 10 m g de
ovoalbmina por va subcutnea e intraperito
neal y tres semanas despus se repite la inocu
lacin (este segundo estmulo se har por va
intravenosa y con una dosis aun inferior a la
utilizada en la sensibilizacin), se consigue
provocar un choque anafilctico caracterizado
por la contractura de la musculatura lisa, sobre
todo intestinal y bronquial y una serie de fen
menos vasgenos. De acuerdo con el grado de
sensibilizacin previa, el choque anafilctico
desencadenado podr tener mayor o menor in
tensidad, y llegar en algunos casos, como con
secuencia de la exagerada contractura de la
m usculatura bronquial, a provocar la m uerte
por asfixia.
Este tipo de manifestacin de hipersensibili
dad se debe a que al inyectar la dosis sensibili
zante de antgeno se originan anticuerpos sri
cos circulantes, parte de los cuales tienen capa
cidad para fijarse a clulas especiales, entre las

641

que se encuentran los mastocitos o clulas gra

nuladas basfilas y los basfilos sanguneos.
Al inocular la segunda dosis de antgeno
(dosis desencadenante), ste reacciona con los
anticuerpos fijos, interaccin que desencadena
el mecanismo que lleva a la liberacin p o r par
te de dichas clulas de mediadores qumicos,
cuyo principal representante es la histamina, y
que son los que provocan las alteraciones a re
sultas de las cuales tendr su expresin clnica
el fenmeno anafilctico.
La intensidad del choque depende en gran
parte de la va utilizada para desencadenarlo.
La va intravenosa es mucho ms efectiva que
la subcutnea, intramuscular o intraperitoneal.
Por estas vas, el choque anafilctico general
mente no es fatal y, si ello ocurre, se produce
despus de algunas horas. La va intravenosa es
ms activa porque la formacin de los inmunocomplejos es rpida y como consecuencia de
ello la cantidad de mediadores qumicos que se
liberan es mayor para una m ism a u nidad de
tiem po. Por las otras vas el proceso es ms
lento y los compuestos vasoactivos liberados
son ms fcilmente degradados por sus inhibi
dores especficos, disminuyendo la intensidad
de su actividad farmacolgica.
Las caractersticas del choque anafilctico
difieren segn la especie animal y es conse
cuencia, principalm ente, de los m ediadores
qumicos liberados y de la ubicacin de las c
lulas fijadoras de los anticuerpos.
En el caso del cobayo, pocos minutos des
pus de la inoculacin de la dosis desencade
nante el animal se aquieta, eriza su pelo, espe
cialmente el que rodea la nariz, expande sus fo
sas nasales, hace inspiraciones violentas no se
guidas de expulsin del aire, experimenta con
v u lsio n es, se p o stra, generalm ente o rin a , y
muere si estaba muy sensibilizado. La autopsia
revela pulmones plidos, enfisem atosos, que
llenan totalm ente la cavidad to rcica como
consecuencia del aire retenido, y serosas con
gestionadas. Al iniciarse el choque anafilctico,
la presin aumenta para descender luego. Se
observan adems leucopenia, trombocitopenia
y aum ento del tiem po de coagulacin, como
consecuencia de la heparina liberada.
La sintomatologa es debida a la liberacin
de histamina por los mastocitos en zonas loca
lizadas del pulmn, en especial prximas a los
bronquiolos que al actuar produce edem a de
las membranas mucosas, aumento de secrecin
m ucosa y contractura de la m usculatura lisa,
desencadenando los fenm enos respiratorios
descritos.
El perro, que tambin libera como principal
mediador qumico histamina, presenta una sin
tomatologa diferente de la descrita en el coba
yo. A qu las m anifestaciones son hepticas.

642

Inmunopatologa

con congestin del rgano y todo el sistem a

portal, siendo las venas hepticas las que su
fren el mayor impacto como consecuencia del
choque. Hay una marcada hipotensin y hemo
rragia visceral. Al iniciare el choque anafilcti
co, que es ms tardo en aparecer y en provocar
el desenlace fatal, el animal experimenta vmi
tos, diarrea, disnea, hipotermia y finalmente el
colapso que lo lleva a la muerte.
El ratn presenta sntomas un poco diferen
tes de los descritos en el cobayo y el perro, de
bido sobre todo a que el principal m ediador
qumico liberado por este animal es serotonina,
que se encuentra en las clulas enterocromafnicas del tracto intestinal. El choque se produce
entre los 20 y 60 minutos de inoculada la dosis
desencadenante. El animal presenta cianosis,
paresia y reduccin del volum en sanguneo.
Como consecuencia de ello el hematcrito au
menta, por la extravasacin de plasma provoca
da por el incremento de la permeabilidad capi
lar desencadenada por el mediador qumico.
Otros animales, como el conejo, que liberan
histamina y serotonina, presentan sntomas pul
monares y vasculares asociados.
El choque anafilctico en el hombre, gene
ralmente es un hecho casual y se desencadena
por la inoculacin de algn antgeno al cual
previamente estaba sensibilizado. Puede ocurrir
por la inyeccin de sueros anttxicos (prote
nas sricas de caballo), antibiticos, drogas, va
cunas, etc.; sus consecuencias llegan a ser fata
les si su sensibilizacin era grande. Es tan sen
sible a este fenmeno, que se han descrito ca
sos de muerte por absorciones de pequeas dosis-antignicas al efectuar pruebas cutneas pa
ra diagnstico de alergia. El tracto respiratorio
es el ms afectado pero se comienza con pica
zn en las palmas de las manos, enrojecimiento
de la piel, y sigue edema de glotis, disnea y co
lapso. Por regla general ocurre edema obstruc
tivo del rbol respiratorio superior, seguido de
hipotensin y enfisema.
M e d ia d o r e s q u m ic o s

Forman parte de dos grupos definidos; los

"prefarmados o primarios y los sintetizados
durante el proceso o secundarios. En el pri
mer grupo estn los mediadores qumicos que
existen en las clulas como tales y cuya libera
cin no im plica una transform acin qum ica
previa. Pueden ser de accin vasgena acentua
da o nula. En este grupo se incluye la heparina,
que, si bien es un mediador qumico liberado
como con.secuencia del choque anafilctico, no
es responsable de los fenmenos vasgenos y la
contractura muscular que caracteriza a la anafi
laxia. Entre los mediadores qumicos preformados con accin vasgena hay dos aminas

primarias, la histamina y la serotonina o 5-hidroxitriptamina. Se liberan adems enzimas y

factores quimiotcticos para polimorfonucleares
neutrfilos y eosinfilos, que participan en me
canismos de regulacin homeosttica.
Los mediadores qumicos que se sintetizan,
entre los que figuran la bradiquinina y las calidinas, son polipptidos bsicos y se caracterizan
porque en el organismo slo existen como pre
cursores, y para ejercer su accin deben sufrir
una transformacin previa. Entre stos se en
cuentran tambin los leucotrienos, productos de
matabolizacin del cido araquidnico, va de
la lipoxigenasa, englobados dentro de lo que an
teriormente se designaba sustancia de reaccin
lenta (SRS-A), y las prostaglandinas provenien
tes de la metabolizacin del mismo cido graso
no saturado, va de la cicloxigenasa.
M ediadores qumicos preformados
a)
Histamina. Es un producto resultante de
la decarboxilacin de la histidina, que tiene la
p a rtic u la rid a d de p ro d u cir co n tracci n del
msculo liso, vasodilatacin y aumento de la
permeabilidad capilar. Al actuar sobre las c
lulas endoteliales de los vasos, stas se con
traen y, al exponer a la sangre zonas desnudas
de la pared vascular, aumentan la perm eabili
dad para macrom olculas. Se localiza prefe
rentemente en las clulas cebadas o m astoci
tos, presentes en el peritoneo, la pleura, en ia
piel que rodea la nariz, en la lengua, la cpsula
heptica, los pezones, y su concentracin es de
1 a 4 X 10 |J.g por clula. La heparina tambin
se encuentra en estas clulas y, cuando como
consecuencia de la desgranulacin de stas,
pior accin del choque anafilctico, se produce
liberacin de histamina, hay liberacin de he
parina. En los grnulos, la heparina y la hista
mina se encuentran combinadas a un complejo
proteico. Cuando los grnulos son expulsados
de las clulas basfilas, por un mecanismo de
intercam bio inico hay penetracin de Na+,
que da lugar a la formacin de proteinato sdi
co y liberacin de histam ina. Generalm ente,
los grnulos basfilos se vuelven amorfos y se
solubitizan. La histam ina est presente tam
bin en los basfilos sanguneos y en muy pe
queas cantidades en las plaquetas, y se calcu
la que es del orden de lO ' \xg por plaqueta.
Los pulmones del hombre y cobayo contienen
2 a 25 |0,g de histamina por gramo de rgano.
Se estima que 0,2 |.tg son suficientes para ejer
cer su actividad farmacolgica sobre los bronquiolos. La histamina es especficamente inhi
bida por los antihistam nicos, sustancias que
por su composicin qumica actan por com
peticin con la histamina sobre los receptores
de as clulas efectoras.

Manifestaciones de hipersensibilidad

643

Se conocen dos tipos distintos de receptores vidad farmacolgica (sensibilidad bronquiolar)

para histamina, los H1 y los H2. Los primeros slo ocurre a mayores dosis. Para el prim ero
intervienen en la mayor parte de los procesos son superiores a 20 |lg. Es inhibida por el cido
desencadenados por la histamina sobre el miis- lisrgico.
c) Factores quimiotcticos. Se conocen fac
culo liso y los vasos, en tanto que los segundos
participan en la puesta en marcha de los fen tores que ejercen una accin quimiotctica so
menos que aumentan la frecuencia cardaca y bre granulocitos eosinfilos (FQE-A) y neutr
filos (FQN-A). El primero de ellos es de bajo
la secrecin gstrica.
En el organismo la histamina es rpidamente peso molecular, en tanto que el segundo es de
inactivada por oxidacin, mecanismo en el que peso molecular alto. Estos factores, que estn
participa la histaminasa. La metilacin tambin preformados, son liberados por las clulas basfiJas junto con la histamina. Ejercen un tacla inactiva (fig. 32-1).
b)
Serotonina (5-hidroxitriptamina). Se ori tismo positivo sobre los granulocitos, y en el
gina a partir del triptfano, el que por accin de caso particular de FQE-A, los eosinfilos re
la triptfano monoxigenasa da lugar al 5-hidro- clutados ejercen accin fagoctica sobre los
xitriptfano. Sobre ste acta la 5-hidroxitrip- complejos Ag-Ac, a la vez que una funcin re
tfano decarboxilasa originando 5-hidroxitrip guladora. Esta tiene lugar a travs de la arilsulfatasa liberada por los eosinfilos, enzima que
tamina o serotonina (fig. 32-2).
Se caracteriza porque provoca contractura inactiva a los leucotrienos (LT). El FQE-A in
del msculo liso, vasoconstriccin y aumento duce adems un aumento de los receptores para
de la permeabilidad capilar. Se localiza princi C3b en los eosinfilos.
palmente en las plaquetas, que en el caso parti
Un factor derivado de los eosinfilos (EDI)
cular del conejo son muy ricas en esta sustan tambin se libera durante el proceso, que inter
cia. En la rata, cuyo contenido en pulmn es de fiere en la sntesis de la histamina.
d) Enzimas. Durante la desgranulacin, junto
aproximadamente 2 jig por gramo de rgano,
slo son necesarios 0,01 fig para que su accin con los factores nombrados las clulas basfifarmacolgica sobre los bronquiolos se ponga las liberan enzimas, principalmente proteasas
de manifiesto. En el hombre y en otros anim a neutras como triptasas, quimasas y carboxipeples las concentraciones son menores y su acti tidasas. El tipo y proporcin de estas enzim as

HC =

C H ,-C O O O H

HN

N H j,

\c ^
I

H istid ina

H istidina decarb o xila sa y piridoxal 6-fosfato (cotactor)

H istam ina N -M etil transferasa

- H istam inasa

HISTAMINA

Hp'

-C H ,-C H ,- N H ,

(D----- C H ^-C O O H

N,
\C '

CH,

H
N-m etil histam ina (inactiva)

cido im idazoiactico (inactivo)

Fig. 32-1. Mecanismo.s de sntesis e inactivacin de la histam ina.

644

Inmunopatologa
CHj'CH-COOH

^^CH^-CH-COOH
NH,
NH,

Triptfano m onoxigenasa

5-hidroxitriptfano
5 -hidroxitriptfano decarboxilasa

5-H idroxitriptam ina (S E R O TO N IN A)

M onoam inoxidasa

CH,-COOH

cido 5 -hidroxiindolactico (inactivo)

Fig. 32-2. M ecanism os de sntesis e inactivacin de la sertina.

liberadas depende de la localizacin del mastocito comprometido. En el hombre, las clulas

cebadas de la mucosa intestinal expresan acti
vidad de triptasa pero no de ciuimasa.
Otras enzimas contenidas en los inastocitos
son hidrolasas cidas como (3-exosaminidasa y
enzimas oxidativas, pero su rol en la reaccin
anafilctica o alrgica es desconocida.

cin en los fenmenos anafilcticos e inflama

torios.
Cuando el cido araquidnico es metaboliza
do a travs de la 5-lipoxigenasa, la accin tiene
lugar sobre el carbono 5, originndose el cido
5 -h id ro p ero x ieico satetraen o ico (5H PE TE ),
producto inestable que por reduccin'puede dar
el alcohol correspondiente o cido 5-hidroxieicosatetraenoico (5-HETE), o convertirlo por
accin de una deh id rasa en leu co trien o A^
M ediadores que se sintetizan
(LTA^). Por accin de epoxidohidrolasa, el
a)
Derivados del cido araquidnico. Desde LTA^ se convierte en el leucotrieno
(LTB^);
hace tiempo se tiene conocimiento de la exis y a su vez el LTA^ por accin de la glutatin-Stencia de una sustancia de carcter lipdico, que tra n sfe ra sa se co n v ierte en leu co trien o C^
se liberaba junto con la histamina, y que ejerca (LTC^). Por accin de y-glutamil transpeptidauna accin vasgena y contracturante del ins- sa, el LTC^ libera cido glutmico y origina el
culo liso, de aparicin ms tarda que la hista cisteinil-glicil-leucotrieno LTD^. Este leuco
mina y productora de un efecto de tnayor dura trieno puede ser escindido por varias peptidacin. Se identific como sustancia de reaccin sas liberando glicina y originando el cisteinil
lenta (SRS-A). Hoy se sabe que la SRS-A no es leucotrieno LTE^ (fig. 32-3). De los productos
una sustancia nica, sino que constituye una originados, el LTB^ constituye uno de los qui
mezcla de productos derivados del cido ara miotcticos de neutrfilos ms potentes que se
quidnico, los leueotrienos.
conoce; en tan to que LTC^, LTD^ y LTE^
El cido araquidnico, cido graso no satura (componentes de la SRS-A) inducen una acen
do con cuatro enlaces dobles, se encuentra es- tuada contractura de la musculatura lisa, en es
terificado al glicerol de los' fo sfolpidos de pecial del tejido pulmonar, siendo este efecto
membrana. En presencia de fosfolipasa A^ y
100 (LTC^) y 1000 (LTD^) veces superior al de
Ca^+ se libera y puede ser metabolizado a tra la histainina.
vs de dos vas, la de la lipoxigenasa, que en
Los leueo trien o s aparecen en cantidades
definitiva origina leueotrienos, y la de la ciclo- apreciables, sobre todo en el pulmn del coba
xigenasa que origina prostaglandinas y trombo- yo que ha sufrido un choque anafilctico. Su
xanos, productos con actividad biolgica. Leu- accin sobre el msculo liso, en especial en los
cotrienos y prostaglandinas tienen participa bronquiolos humanos, es lenta. La contractura

Manifestaciones de hipersensibiiidad

645

,C O O H
A.A
5-Lipoxigenasa
O H

/OOH

cooh

/= V 7 - X ^ ^ ^

5-H ETE

5-H P E TE

D ehidrasa

HO

H
COOH

C OOH
G luta ti n-S - Tra n sfe ra sa

C ys-G iy

G lutatin

y-glu

COOH

,
G lutm ico

yG lu ta m il
Transpe p tid asa

LTB.
G licina

C ys-G iy
y-Glutam i! tran sp ep tid asa

iGlutmico

, COOH

H "S

Fig. 32-3. M etabolizacin del cido araquidnico va de la lipoxigenasa. O btencin de leucotrienos.

se produce a los pocos minutos, pero es de ma

yor duracin que la originada por la histamina.
Tienen la capacidad de modificar la perm eabi
lidad capilar y, cuando son liberados com o
consecuencia de una reaccin anafilctica, su
eliminacin es ms tarda. Se los considera co
mo posibles responsables de la contraccin
bronquial en el caso del asina humano insensi
ble a los antihistamnicos.
Los leucotrienos producidos por la clula
blanco son inactivados por la arilsufatasa
elaborada por los tejidos locales y el infiltrado
de eosinfilos, que se origina como consecuen
cia del tactismo ejercido por el factor FQE-A
liberado simultneamente por la clulas basfilas blanco (fig. 32-4).
En pulmn se ha demostrado que los leuco
trienos son sintetizados por las clulas basfilas y por los macrfagos alveolares, descono
cindose la participacin que cada uno de los
productos sintetizados por ambas clulas tiene
en las reacciones anafilcticas.

Es interesante sealar tambin que, cuando

una meiTibrana celular es atacada por el sistema
complemento con fijacin de C5b-9, hay libe
racin de cido araquidnico. Esto estara indi
cando una posible participacin de los com po
nentes terminales del complemento en los fe
nmenos de inflamacin.
Cuando el cido araquidnico es raetaboliza
do a travs de la cicloxigenasa se origina otra
familia de compuestos, la de las prostaglandi
nas y tromboxanos, con diversas acciones bio
lgicas.
Las prostaglandinas constituyen un grupo de
cidos grasos no saturados, estrechamente rela
cionados, derivados de un coiTipuesto hipotti
co de 20 carbonos con un anillo ciclopentano
(cid o p ro stan o ico ). Los tro m b o x an o s son
compuestos no prostaglandnicos con un tomo
de oxgeno insertado en el anillo. Los m ecanis
mos que llevan a la sntesis de las diferentes
prostaglandinas y tromboxanos estn indicados
en la figura 32-5.

Inmunopatologa

Inactivacin
F ig. 32-4. Inactivacin de los leucotrienos po r la arilsiilfatasa.

cido araquidnico

COOH

F ig . 32-S. M etabolizacin del cido araquidnico va de la cicloxigenasa. O btenci

in de pro.staglandinas y trom boxanos.

Manifestaciones de fiipersensibilidad
Algunos de estos com puestos son de vida
media muy corta, como la PGIj o prostaciclina
(5 minutos a 37C); el tromboxano A^ (TXA^)
que produce agregacin de plaquetas y vaso
constriccin es inestable, tiene una vida media
inferior al minuto y se transforma en TXB^ ms
estable, pero menos activo.
En las reacciones de tipo anafilctico, los
m astocitos producen grandes cantidades de
PGDj broncoconstrictora. La PGE, puede inhi
bir la desgranulacin del mastocito, es un relajador muscular e inhibidor de la liberacin de
mediadores qumicos. Parecera que ms que
mediadores qumicos algunas de ellas fueran
potenciadoras de la accin de la histamina. T e
niendo en cuenta que hay prostaglandinas con
accin antag nica (PG D j v asoconstrictora;
PG Ej vasodilatadora), hay quienes suponen
que estos productos podran tener un papel
muy importante como reguladores. La prostaglandina PGI^, por su actividad desagregante
de plaquetas, y los tromboxanos TXA^ y TXB^,
favorecedores de la agregacin plaquetaria, po
dran ser reguladores homeostticos de la coa
gulacin sangunea.
b) Bradiquinina. Es un nonapptido compues
to por aminocidos de tipo L, que ha sido sinteti
zado (Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-ProPhe-Arg).
Al principio se obtena por accin de la trip
sina o venenos de serpientes sobre seudoglobulinas (a globulinas), experiencias stas que lle
varon a Rocha da Silva a su descubrimiento.
Existe como precursor en forma de bradiquiningeno y es liberado como bradiquinina activa
cuando los anticuerpos fijos reaccionan con sus
correspondientes antgenos. Es muy activa, y
provoca marcada contraccin de Ja musculatura
lisa, vasodilatacin y aumento de la permeabi
lidad capilar. Es destruida por peptidasas. El
plasma sanguneo, algunos tejidos y ios neutr
filos contienen quininasas, enzimas que inactivan rpidamente la bradiquinina.
c) Calidinas o plasmaquininas. Son productos
que se obtienen por accin de enzimas llamadas
calicrenas, presentes en glndulas apocrinas, so
bre las protenas plasmticas. Su actividad biol
gica es similar a la de la bradiquinina.
d) Factor de agregacin plaquetaria. Se su
pone que este factor (PAF) deriva de los lpi
dos de membrana. Es uno de los mediadores de
la anafilaxia activa en el conejo. Ha sido identi
ficado estructuralmente y sintetizado como el
acetil glicerol ter de fosforilcolina. Tambin
se ha hallado en el hombre. Este factor, adems
de producir la agregacin de plaquetas, es un
potente vasoconstrictor, inductor de contrac
cin del msculo liso y de quimiotactismo de
eosinfilos.
e) Citoquinas. Algunas citoquinas, principal
mente las sintetizadas por los linfocitos coope

647

radores del tipo TH2 parecen ser importantes

mediadores de las reacciones alrgicas, en es
pecial los componentes asociados con la fase
inflamatoria de la reaccin. Entre estas citoqui
nas se encuentran:
L-4. La que se libera 1 hora despus de la
interaccin IgE-Ag y que parecera estar conte
nida en los grnulos basfilos de los m astoci
tos. E sta citoquina estim ula a los linfocitos
TH2 e inhibe a los TFH; induce en los linbcitos B el cambio de clase de inmunoglobulina o
switch a IgE, y estimula al endotelio a produ
cir molculas de adhesin relacionadas con la
fijacin de basfilos y eosinfilos, mecanismo
muy importante sobre todo en la primera fase
de los fenmenos inflamatorios alrgicos.
TNF-a. Citoquina producida por las clulas
murinas T H l y TH2 y por las clulas cebadas
humanas localizadas en piel y en pulmn. Esta
citoquina juega un rol importante en la in fla
macin mediada por clulas cebadas, activando
a las clulas endotehales e inducindolas a ela
borar molculas de adhesin comprometidas en
el reclutamiento de polimorfonucleares neutr
filos sensibilizados con IgE, como lo son las
molculas ICAM-I y otras.
IL-5, IL-3, GM-CSF. Estas citoquinas son
activadoras de eosinfilos y basfilos y han si
do identificadas principalmente en la fase final
de la reaccin alrgica.
T odos los m ediadores qum icos d escrito s
han sido identificados en fenmenos alrgicos.
En el hom bre, la histam ina, PGD2, L T C 4 y
triptasa han sido detectados in vivo en piel,
m ucosa nasal y pulm n, despus de la fase
aguda de una reaccin Ag-IgE fijada a m astoci
tos. Es por este motivo que histamina, PG D 2 y
triptasa son considerados como marcadores ti
les de este fenmeno.
M e c a n is m o d e l a l ib e r a c i n
DE LOS MEDIADORES QUMICOS

Experiencias sobre anafilaxia pasiva h eter

loga realizadas con hbridos preparados con
hemimolculas de anticuerpos y hemimolculas de IgG normal muestran que ellos, que en
definitiva son anticuerpos univalentes, son ca
paces de desencadenar el choque anafilctico.
Con relacin al desencadenante, slo son acti
vos los antgenos y haptenos bivalentes o multivalentes, no as los haptenos m onovalentes
(fig. 32-6).
Otros tipos de experimentos demuestran que
para lograr inducir la desgranulacin del m as
tocito es indispensable ia agregacin del recep
tor de membrana para IgE (RIF ce), mecanismo
iniciador de los eventos bioqumicos responsa
bles del proceso. Ello teniendo en cuenta que
se ha conseguido la hberacin de los grnulos

648

Inmunopatologa

Ag

G rnulos que contienen

h istam ina y heparina

F ig . 32-6. Esquem atizacin de la desgranulacin de un m aslocito, con liberacin de histam ina, causada por interaccin
A g-A c. D e acuerdo a datos experim entales, es necesaria la interaccin de dos m olculas de anticuerpo con una de antgeno
p ara que la liberacin de los m ediadores qum icos tenga lugar. Los anticuerpos pueden ser univalentes. Los haptenos m o
novalentes no desencadenan el fenm eno. Resultados sim ilares se han logrado cuando el antgeno fue sustituido por an ti
cuerpo anti-IgE, anticuerpo antiidiotipo, o cuando los m astocitos interactuaron con dm eros de IgE obtenidos por m todos
qum icos o con anticuerpos anti F ce RI). Todo ello indica que el com ponente fundam ental para que se inicie la d esgranula
cin es la agregacin de los receptores para IgE (FceR l) presentes en la m em brana del m astocito. D espus de la liberacin
de los m ediadores qum icos las clulas desgranuladas no m ueren, se recuperan. Ello significa una diferencia fundam ental
con las reacciones citotxicas inducidas por otros tipos de anticuerpos.

basfilos cuando las clulas cebadas sensibili

zadas con IgE fueron puestas en contacto con
el antgeno especfico, con anticuerpo a n ti
idiotipo o con anticuerpo anti-IgE. Tambin se
ha conseguido desgranulacin si mastocitos no
sensibilizados son puestos en contacto con d
meros de IgE obtenidos por unin qumica, con
anticuerpo anti-RIFce o si los mastocitos son
tratados con ionforos de Ca^+ los que facilitan
el influjo de este ion al interior de la clula, fa
se inicial del mecanismo que lleva a la activa
cin celular. La IgE fijada puede interaccionar
tambin con leetinas como fitohem aglutinina
(PHA) o concanavalina A (Con A), va hidra
tos de carbono presentes en el Fe. Esto explica
ra algunas reacciones de tipo alrgicas a frutas
ricas en leetinas, como las frutillas, que pueden
experimentar algunas personas.
Se ha analizado el mecanismo por el cual los
inmunocomplejos fijos inician la liberacin de
los mediadores qumicos descritos.
Pocos minutos despus de la agregacin de
los RIFce se produce la activacin de una enzi
m a asociada a la membrana del mastocito, la
metiltransferasa (MT) la que induce un signifi
cativo aumento en la metilacin de los fosfol
pidos de membrana. El entrecruzamiento de los
RIFce activa una serina proesterasa en serina
esterasa, la que convierte la fosfatidilserina en
fosfatidiletanolamina (PE), la que por metila
cin forma fosfatidilcolina (PC). El acumulo de
esta enzima en la superficie de la membrana
plasmtica facilita la formacin de canales de
Ca-+, favoreciendo el influjo de Ca^+, el que tie
ne una activa participacin en la desgranula
cin celular.

El mayor influjo de Ca^" activa a la fosfoli

pasa A^ la que promueve la liberacin de cido
araquidnico a partir de los fosfolpidos de
membrana, el que segin la va enzimtica se
guida es convertido en prostaglandinas o leuco
trienos, dos potentes mediadores de la reaccin
alrgica (fig. 32-7).
El influjo de Ca^+ promueve adems el agre
gado de los microtibulos y la contraccin de
los m icrofilam entos, indispensables para la
movilizacin de los grnulos hacia la membra
na citoplasmtica.
Se ha observado que, adems de la metila
cin de fosfolpidos de membrana e influjo de
Ca^^, hay un aumento de la actividad de la adenil-ciclasa fijada a m em brana, caracterizada
por un aumento rpido de AMPc, el que a su
vez activa proteinquinasas dependientes de
A M Pc(PK A ). Estas enzim as intervienen en
procesos de fosforilacin de las protenas de
los grnulos de membrana, modificando su perme-abilidad para Ca^+ y agua, lo que facilita la
hinchazn de los grnulos y su fusin a mem
brana durante el proceso de la liberacin de
histamina por exocitosis de los grnulos.
En este proceso interviene energa, en cuya
regulacin participa el AMPc. Se ha observado
que cuando hay liberacin de histamina, en los
mastocitos disminuye el AMPc y aumenta el
GMPc.
No se conoce plenamente el mecanismo de
la transduccin de seales intracelulares en el
m astocito. Teniendo en cuenta los adelantos
logrados en este campo en otros tipos celula
res, especialm ente en el linfocito T y B, los
que parecen tener patrones comunes que se re

Manifestaciones de hipersensibilidad
piten, es opinin bastante generalizada de que
algo sim ilar debe ocurrir en la activacin de
los m astocitos. P roteinq u in asas de tiro sin a
(PKTs) participaran en la etapa inicial de la
transduccin. Al igual que en las otras clulas
estas PKTs fosforilaran y activaran fosfolipa
sa C (PLC), hecho demostrado recientemente
al analizar productos obtenidos con posteriori
dad al entrecruzam iento de RIFce. Es lgico
suponer que la fainilia de la .svc-proteinquina
sas de tirosina, que han evidenciado activa
participacin en otros tipos celulares, como los
linfocitos B y T, la tengan tambin en los m as
tocitos.
La PCL generara, a partir de PIP2, DAG (el
cjue activa PKC) e 1P3 que moviliza Ca^" intra
celular.
Todos estos eventos seran los c|ue induci
ran la sntesis de algunos productos y la des
granulacin de las clulas basfilas para que se
produzca la liberacin de los mediadores qu
micos que habrn de poner en marcha la reac
cin alrgica.
Estudios bioqumicos han permitido demos
trar la activa participacin del AMPc y GMPc
en los mecanismos que llevan a la liberacin de
histamina y otros mediadores por los mastoci
tos y basfilos, con la consecuente contraccin
de la musculatura lisa y los fenmenos vasge
nos. Se ha propuesto en tal sentido un estado
de equilibrio entre AMPc y GMPc para el m an
tenimiento de los controles homeostticos de la
activacin celular, regulado a su vez por el sis
tema nervioso simptico y parasimptico.
En la mayora de las clulas existen dos re
ceptores adrenrgicos antagnicos denomina
dos a y p, y un receptor colinrgico llamado y.
Diferentes estudios realizados sugieren que los
receptores adrenrgicos son enzimas, siendo la
ATPasa el receptor a y la adenilciclasa el p.
Catecolaminas como el isoproterenol o la epinefrina transformaran a la adenilciclasa de su
forma inactiva en activa, la que tiene capacidad
para catalizar, en presencia de Ca^+ y Mg"", la
formacin de AMPc a travs del ATP citoplasmtico. Este nucletido cclico, constituido por
cido adenlico con un grupo fosfato diesterificado en las posiciones 3 y 5 de la ribosa uni
da, se comporta como un mediador intracelular
induciendo m odificaciones de las actividades
enzimticas y de las barreras de la permeabili
dad.
La ATPasa o receptor a puede competir por
el ATP con la adenil-ciclasa en la formacin de
5 AMP inactivo. Esta desviacin del ATP pre
cursor provocara una disminucin del AMPc
celular, lo que llevara a la liberacin de hista
mina. La norepinefrina puede estim ular a la
ATPasa a form ar 5 AMP inactivo a partir de
ATP.

649

El AMPc puede ser destruido por la adenilfosfodiesterasa, con lo que se consigue un efec
to similar al anterior. Las metilxantinas (teofilina, teobromina, cafena) inhiben esta enzim a
manteniendo la concentracin de AMPc y evi
tando la liberacin de histamina.
El receptor colinrgico o receptor y parece
ser la guanilatociclasa. La enzima, que se en
cuentra en forma inactiva, al ser activada trans
forma al GTP en el nucletido cclico 3 5 monofosfato de guanosina (GMPc). El aumento en
las clulas basfilas del GMPc lleva a un au
mento en la liberacin de histamina, que puede
ser bloqueada por atropina. El GMPc es d e s
truido por la guanilfosfodiesterasa, pero esta
enzima es 10 veces menos activa que la adenilfosfodiesterasa.
Se considera que en la reaccin alrgica la
liberacin de histamina y otros mediadores est
regulada por la fluctuacin de los valores del
AMPc y GMPc. Aumento de GMPc con dism i
nucin de AMPc lleva a la liberacin de h ista
mina, ocurriendo lo contrario cuando los v alo
res se invierten (fig. 32-8).
En sntesis, la musculatura lisa y el endotelio
vascular de los tejidos sensibilizados por anti
cuerpos citotrpicos originan respuestas que
son moduladas por el sistema nervioso autno
mo. La estimulacin de un receptor colinrgico
o la administracin de acetilcolina (aumento de
GMPc y disminucin de AMPc) lleva a la co n
tractura de la musculatura lisa y aumento de la
perm eabilidad capilar por liberacin de h ista
mina, en tanto que la estimulacin de receptor
p-adrenrgico o la adininistracin de epinefrina
o isoproterenol (aumento de AM Pc) provoca
relajam iento muscular antagonizando la re a c
cin anterior.
El choque anafilctico es de corta duracin
porque norm alm ente existen en el organism o
de los animales y del hombre inhibidores de los
mediadores qumicos, que impiden su acum u
lacin.
Anafilaxia activa local
Si bien los fenmenos anafilcticos descritos
son de tipo general, la presencia de anticuerpos
fijos a clulas puede ponerse en evidencia lo
calmente. Ello puede hacerse in vitro mediante
la clsica experiencia descrita inicialmente por
Sehultz-Dale, por la tcnica de la desgranula
cin de los mastocitos o in vivo por la prueba
de la anafilaxia cutnea activa.
Mtodo de Sehultz-Dale: Si se toma un trozo
de intestino delgado (leon) o tero virgen de
cobaya sensibilizada, y previa fijacin a un
quimgrafo se lo introduce en un bao term os
tatizado que contenga una solucin salina b a
lanceada, como el lquido de Tyrode, se puede

650

Inmunopatologa

J 9 E // \ V 9E //

Histaminasa
Ariisufaltasa
Histamina
J
P/ ^

Prostaglandinas Tromboxanos
(PGD2)
(Tx)

Leuootrineos

Leucotrienos/ / /
LTB4. LTC4, / i
lt d ^ lt e / : /

1.__ ___________ / /

'

( ,

F ig . 32-7. Al interaccionar la IgE unida a la m em brana del m astocito, hay agregacin del R IFce y se activan distintos sis
tem as enzim ticos que llevan a la activacin y desgranulacin celular y secrecin de m ediadores qum icos. La activacin
de fosfolipasa C (PLC) hace que sta, al actuar sobre fosfatidil-inositoldifo sfato (PIP2), lo desdoble en diacilglieerol
(D A G ) e inocitoltrifosf'ato (IP3). ste m oviliza Ca^+ de los depsitos en el retculo endoplasm tico y activa u na proteinquinasa dependiente de Ca^+ y calm odulina (PKCa^VCaM ) la que participa en la fosforilacin de protenas. A su vez el D A G
en presencia de Ca^'^ activa una proteinquinasa de serina (PK C)* la que fosforila protenas que intervienen en la exocitosis
de los grnulos. La activacin de la adenilciclasa genera aum ento de A M Pc, el que activa una una PK dependiente de
AiVIPc (PKA ), la que fosforila protenas que tienen activa participacin en el hinchado d e los grnulos y contraccin de los
m icrofilam entos, m ecanism os stos indispensables para la fusin a m em brana y exocitosis de los grnulos. M etltransferasas (M T) m etilan fosfatidiletanolam ina (PE) originando fosfatidilcolina (PC), esencial para el influjo de Ca^* y activacin
de fosfolipasa A^ (P L A ,), la que acta sobre los fosfolpidos de m em brana originando cido araquidnico, el que puede ser
m etabolizado va de la cicloxigenasa o lipoxigenasa, originando en el prim er caso prostaglandinas (PG) y trom boxanos
(Tx), y leucotrienos (LT) en el segundo. La histam inasa y la arilsulfatasa son enzim as que inhiben en la fase fluida, des
pus de la secrecin por los m astocitos, la histam ina y los leucotrienos, respectivam ente, participando en m ecanism os de
regulacin hom eosttica. (A daptado y m odificado de K ubi, J. Im m unology . W . H. Freem an and Co. N ew Y ork, 1992.

observar una in.scripcin normal sin contractura

del msculo liso en ensayo. Si se aade una pe
quea cantidad del antgeno que sirvi para la
sensibilizacin del animal y el no es de muy al
to peso molecular, de modo que permita su r
pido pasaje a travs de la serosa, la contraccin
muscular se produce en pocos segundos. Ello
es consecuencia de la liberacin de histamina
por parte de los mastocitos del tejido conectivo
del msculo uterino o intestinal, la que provoca
la contractura muscular.
Si producida la contractura se aade una
nueva dosis de antgeno, el m sculo puede
contraerse nuevamente, pero con una intensi
dad menor, llegando a ser nula en estimulacio
nes posteriores. Se estima que ello se debe a la
saturacin de los anticuerpos fijos por parte del
antgeno. Es especfico, ya que slo se eviden

cia con el antgeno que sirvi para la sensibili

zacin del animal. No se produce dao muscu
lar, lo que puede demostrarse mediante el aa
dido al bao de pequeas cantidades de hista
m ina, las que provocarn la contractura del
msculo (fig. 32-9).
Desgranulacin de mastocitos. Es una tcni
ca bastante simple y que consiste, en lneas ge
nerales, en colocar sobre portaobjetos serosa
peritoneal de cobayos sensibilizados, la que es
cubierta con una adecuada dilucin de antge
no y mantenida a 4C durante 20-30 minutos.
Despus del lavado y fijacin, el material es
coloreado con tionina y observado al micros
copio.
Si el animal estaba sensibilizado, se observa
r un gran porcentaje de clulas basfilas des
granuladas (fig. 32-10). La liberacin de hista-

Manifestaciones de hipersensibilidad
S istem a colinrgico
o parasim ptico

651

Sistem a P-adrenrgico
o sim ptico
(receptor jj)

(receptor y)

A cetilcolina

Epinefrina

C lu la basfila
F ig. 32-8. R egulacin hom eosttica de la liberacin de m ediadores qum icos a travs del A M Pc y GMPc.

mina y lieparina por elidas clulas ocurre co

mo consecuencia de ese fenmeno y, en este
caso particular, ello ha sido posible si previa
mente ha habido una interaccin antgeno-anti
cuerpo.
Anafilaxia cutnea activa. La presencia local
de anticuerpos fijos puede demostrarse fcil
mente si se recuerda que los mediadores qum i
cos, en especial la histam ina liberada por los
inm unocom plejos, producen aum ento de la

permeabilidad capilar. Si a un animal sensibili

zado se le inyecta intradrmicamente el antge
no usado en la sensibilizacin y por va in tra
venosa solucin de azul de Evans, en el punto
de la inoculacin del antgeno aparecer entre
los 15 y 30 minutos una mancha azul. Ello se
debe a la extravasacin del colorante por au
mento local de la permeabilidad capilar produ
cida por las sustancias farmacolgicamente ac
tivas liberadas.

F ig. 32-9. Reaccin de Schultz-D ale. Intestino delgado de cobayo inm unizado con ovoalbm ina. La grfica muestra q u e
la reaccin e.s especfica (la seroalbm ina bovina no produce contractura del m sculo liso), q ue hay agotam iento de a n ti
cuerpos fijos (los estm ulos con ovoalbm ina a repeticin term inan por no contraer el trozo de intestino) y que no hay le
sin m uscular (la histam ina provoca contractura m uscular cuando el m ism o y a no responde a la ovoalbm ina).

652

Inmunopatologa
F ig . 3 2 -1 0 . M asto cito s
de la s e ro s a p e rito n e a l
de cobayo en los que se
o bservan diferentes g ra
dos de desgranuiacin.

ANAFILAXIA PASIVA

Es importante no solamente porque sirve pa

ra demostrar que la anafilaxia es mediada por
anticuerpos, sino tambin porque por este me
canismo puede estudiarse mejor la dinmica de
la reaccin, ya que los anticuerpos pueden re
gularse al ser inoculados. La anafilaxia activa
depende, en cambio, de los anticuerpos que se
formen, hecho no regulable experimentalmen
te, ya que es privativo de cada animal.
La anafilaxia pasiva puede tener una expre
sin general o local pero, en ambos casos, para
que se produzca, es indispensable que exista un
perodo de latencia entre la inoculacin de los
anticuerpos y la dosis de antgeno desencade
nante, perodo durante el cual los anticuerpos
sricos inoculados habrn de fijarse a clulas
para interaccionar luego con el correspondiente
antgeno y desencadenar un fenmeno idntico
al descrito en Anafilaxia activa.
Anafilaxia pasiva generalizada
Pueden ser homloga o heterloga, segn se
utilice para la transferencia un anim al de la
misma especie o de especie diferente. Para lo
grarla es necesario inocular al receptor suero
proveniente de un animal sensibilizado, y luego
de un perodo de latencia, suficiente como- para
que los anticuerpos se fijen a clulas, se inyecta
por va intravenosa el mismo antgeno utilizado
para sensibilizar. Si la cantidad de anticuerpos

inoculada inicialmente fue suficientemente al

ta, a los pocos minutos se desencadena un cho
que anafilctico con caractersticas similares al
que se produce en la anafilaxia activa.
El perodo de latencia vara segn la canti
dad de an ticu erp o in yectado. E x p erien cias
efectuadas en cobayos sensibilizados con anti
cuerpo antiovoalbm ina de conejo, m uestran
que, si la cantidad usada para sensibilizar es 67 mg por animal, se obtiene una respuesta posi
tiva desencadenada 30 minutos despus. Cuan
do se utilizan 750 )xg, dicho perodo se ampla
a 2 horas, y es de 5 horas si se sensibiliza con
375 |0,g de anticuerpo. Cuando las dosis utiliza
das son inferiores a los 200 p,g, la muerte de los
animales, si ocurre, nunca se produce antes de
las 48 horas. Estas experiencias son importan
tes, pues muestran que para sensibilizar correc
tamente en forma pasiva a un cobayo con anti
cuerpos heterlogos, de modo que el choque
anafilctico pueda ser desencadenado antes de
los 30 minutos de la sensibilizacin, es necesa
rio inocular dosis de anticuerpos del orden de
los 5-10 mg.
Anafilaxia pasiva local
Los tres mtodos descritos para.demostrar la
an afilaxia activa local, o sea, la tcnica de
Sehultz-Dale, la desgranulacin de los mastoci
tos y la reaccin cutnea, pueden ser emplea
dos para poner de manifiesto la anafilaxia pasi
va local. Para la tcnica de Sehultz-Dale, un

Manifestaciones de hipersensibilidad
trozo de intestino o tero de cobaya normal es
puesto en contacto previamente con una solu
cin que contiene anticuerpo. Luego se lava
con solucin Tyrode, se fija a un quimgrafo y
se procede como se indic en la anafilaxia acti
va. Para conseguir la sensibilizacin, experi
mentalmente se ha demostrado que el tiempo
de contacto no debe ser inferior a una hora.
Cuando el mtodo empleado es la desgranu
lacin de los mastocitos, la serosa peritoneal de
un animal normal es puesta en contacto durante
30 minutos a 4C con el anticuerpo en ensayo.
Despus de lavar se aade el antgeno, sigue
una nueva incubacin, lavado, fijado y teido,
para finalmente proceder a la observacin m i
croscpica a efectos de verificar la desgranula
cin. Con soluciones de anticuerpos de 50 |ig
m f' se obtienen muy buenas sensibilizaciones.
Lfno de los mtodos ms empleados para la
anafilaxia pasiva local, es la prueba de la anafi
laxia cutnea pasiva o PCA, inicialmente des
crita por Ovary. Para llevarla a cabo es necesa
rio inocular al animal receptivo (cobayo, ratn)
el anticuerpo por va intradrmica. Transcurri
do el perodo de latencia, que vara segn la
concentracin de anticuerpo y la especie ani
mal, se inyecta por va intravenosa el antgeno
mezclado con azul de Evans. La interaccin
antgeno-anticuerpo a nivel de la pared de los
capilares lleva a la liberacin de sustancias far
macolgicamente activas, que provocan altera
cin de la permeabilidad capilar. Como conse
cuencia de ello el azul de Evans extravasa, apa
reciendo 15-30 minutos despus de la inyec
cin una mancha azul en el punto de inocula
cin del anticuerpo, si la reaccin era positiva

F ig . 3 2 -1 1 . A n a fila x ia c u t n e a
pasiva (PCA). a, b y c, reacciones
positivas efectuadas con anticuer
po precipitante. A , B y C, reaccio
nes positivas efectuadas con an ti
cuerpo no precipitante (coprecipitante), a , h , c , A , B ' y C : reac
ciones negativas. Especificidad de
los anticu erpos: an tid in itro fen o l.
A ntgeno desencadenante: sero al
bm ina bovina dinitrofenolada.

653

(fig. 32-11). En experiencias realizadas en co

bayos con anticuerpos antiovoalbmina de co
nejo, se demostr que con 0,02 ).tg se consigue
la sensibilizacin a las 3 horas de contacto.
El PCA ha servido tambin para establecer
qu anticuerpos se fijan a piel y cules son las
dosis mnimas y las ptimas sensibilizantes. El
hombre, cobayo, conejo, ratn y rata elaboran
anticuerpos capaces de fijarse a piel de cobayo.
En todos los animales indicados las dosis de
anticuerpo necesarias para sensibilizar son in
feriores a 1 xg. Para otras especies animales las
dosis varan.
Un hecho cjue tambin ha sido evidenciado
con esta metodologa es la competicin e x is
tente entre la gammaglobulina anticuerpo con
capacidad para fijarse a piel y la gammaglobu
lina normal de la misma clase. Si se determina
en cobayo, por ejemplo, cul es la mnima d o
sis de anticuerpo antiovoalbm ina de conejo
(IgG) capaz de sensibilizar, efectuando p ara
ello diluciones en solucin sahna, se ve que s
tas son inferiores a las necesarias cuando se re
pite la experiencia anterior, pero efectuando las
diluciones en una solucin de IgG normal (1
mg m l ') Ello se debe a que la gammaglobuli
na normal compite con la gammaglobulina an
ticuerpo interfiriendo en los sitios de fijacin
de este ltimo. Que la gammaglobulina normal
puede fijarse se demuestra por la prueba de la
anafilaxia cutnea pasiva reversa. Si se inyec
ta un cobayo por va intradrmica con IgG n o r
mal de conejo y despus de un perodo de la
tencia se le inocula por va intravenosa suero
anti-IgG m ezclado con azul de Evans, en el
punto de inoculacin aparecer una m ancha

654

Inmunopatologa

azul. La que se fija es la IgG normal de conejo,

ya que la reaccin es positiva aunque los anti
cuerpos antigammaglobulina de conejo proce
dan de especies que elaboran anticuerpos que
no se fijan a piel de cobayo.
En la anafilaxia pasiva verdadera intervienen
anticuerpos citotrpicos segtin se fijen a clulas
homlogas o heterlogas. En cualquiera de los
dos casos es indispensable un perodo de latencia antes de la inoculacin del antgeno para
permitir la fijacin de los anticuerpos.
Se ha descrito otro tipo de m anifestacin
anafilctica, lograda por la inoculacin de com
plejos antgeno-anticuerpo, que no requiere pe
rodo de latencia. Para que sta ocurra, es nece
sario que el complejo se haya formado en lige
ro exceso de antgeno, esto es, que sea del tipo
Agj Ac^, siendo inefectivos los complejos Ag^
Ac formados en presencia de grandes cantida
des de antgeno.
Como los primeros son fijadores del comple
mento, no as los segundos, se supone que por
ese m ecanism o tenga lugar la form acin de
anafilotoxina (vase cap. 22), que provoca la li
beracin de histamina.
Dado que el mismo efecto se logra inoculan
do por va intradrmica cobayos con gammaglobulina desnaturalizada por calentam iento,
que a su vez tiene capacidad para fijar el com
plemento, se estima que la funcin de los anti
cuerpos es la de form ar con el antgeno los
agregados que fijan el complemento. Por tal
circunstancia a este fenmeno se los denomima
anafilaxia agregada o por agregados. Si bien
la expresin clnica es debida a la liberacin de
histam ina, probablem ente su m ecanism o sea
distinto del de la anafilaxia verdadera.
Es conveniente recordar que sustancias como
el ionforo de calcio, morfina, codena, el com
puesto 48/80 y otras sustancias pueden activar
directamente a los mastocitos e inducir la libe
racin de histamina. Ello se debe a que todos
esos productos causan un influjo de iones Ca^^.
Linfoquinas sintetizadas por los linfocitos T
pueden interaccionar con basfilos y liberar
histam ina. D icho facto r se id en tifica com o
HRF (histamine releasing factor). Por contacto
con antgeno, los linfocitos T pueden excretar
un factor antgeno-especfico liberador de his
tamina (TCF), que puede armar mastocitos, los
que, al contactar nuevamente al antgeno, libe
ran mediadores qumicos. Este factor slo sen
sibiliza por pocas horas, a diferencia de lo que
ocurre con IgE que lo hace por varios das.
A

n t ic u e r p o s a n a f il c t ic o s

La identidad del anticuerpo anafilctico ha

sido aclarada al comienzo de los estudios sobre
anafilaxia. Muchos de los errores cometidos se

debieron a que, especialmente en anafilaxia pa

siva, se utilizan sistemas heterlogos constitui
dos por el cobayo como animal receptivo y el
conejo como productor de anticuerpos. Y ocu
rre que de las inmunoglobulinas identificadas
en el hombre y otros animales (vase cap. 5),
que se fijan a piel homloga no se fijan a hete
rloga, y viceversa. Como consecuencia de lo
expuesto, si bien mucho de lo realizado ha ser
vido para aclarar el mecanismo de la reaccin
anafilctica, slo en los ltimos aos se ha lo
grado una informacin clara sobre el anticuer
po responsable.
Siendo la IgG una inmunoglobulina con ca
pacidad para fijarse a piel heterloga, es la res
ponsable de la anafilaxia pasiva cuando el fe
nmeno se desencadena en un animal de otra
especie. Pero en nada participa en el choque
anafilctico activo, mantenindose como anti
cuerpo circulante.
En el hombre se ha demostrado que el anti
cuerpo anafilctico es la IgE, que tambin se
encuentra presente en algunos animales como
la rata, conejo, ratn, oveja y aun en el cobayo,
del que ha sido aislado por nosotros. Esta in
munoglobulina se encuentra a muy bajas con
centraciones como anticuerpo circulante. Si
bien en el plasma sanguneo su vida media es
de 60 horas, cuando se encuentra fijada a m as
tocitos ella no es menor de dos semanas. Cuan
do los anticuerpos IgE son calentados a 56C
por 1-3 horas, conservan su capacidad para in
teraccionar con el antgeno, pero pierden su ca
pacidad para unirse a m astocitos porque el
fragmento Fe de la molcula experimenta cam
bios conformacionales que le impiden unirse al
receptor especfico. Para mayor inform acin
sobre esta inmunoglobulina vase el captulo 5.
En algunos animales como el ratn y el coba
yo existen dos tipos de IgG, las llamadas IgGl
e IgG2 o y, y
Esta ltima presenta las propie
dades biolgicas de la IgG normal, entre las que
cabe sealar su capacidad para fijarse a piel he
terloga. La IgG l, por el contrario, difiere, ya
que no fija el complemento y slo se fija a piel
homloga. Por tal motivo, hasta el momento, ha
sido considerada como un anticuerpo anafilcti
co homlogo. La IgGl es un anticuerpo que se
encuentra en cantidades apreciables en el to
rrente circulatorio y se diferencia de la IgE, o
anticuerpo reagnico, en algunos aspectos de su
comportamiento. Entre ellos merecen destacar
se la capacidad para precip itar el antgeno,
mantener su actividad despus de la reduccin
con mereaptoetanol, fijarse rpidamente a piel y
persistir en ella no ms de 48 horas.
Su capacidad para fijarse a clulas parece di
ferente ya que, si mastocitos aislados que han
sido puestos en contacto con IgG l anticuerpo
son lavados una sola vez con solucin salina.

Manifestaciones de hipersensibiiidad
se desensibilizan, cosa que no ocurre con la
IgE anticuerpo, aun despus de cinco lavados.
Parecera que los anticuerpos heterocitotrpicos (IgG de conejo) y homocitotrpicos (IgG l)
se unen al mismo receptor en los mastocitos de
cobayo. La IgG normal de conejo compite con
los anticuerpos IgG de conejo e IgGl de coba
yo, ocurriendo lo mismo con la IgG l normal de
cobayo. Ninguna de ellas inhibe la fijacin de
IgE, lo que indica que los receptores para esta
inmunoglobulina y los de la IgG son diferentes.
Hay autores que sostienen que los anticuer
pos de tipo IgG 1 slo interaccionan con la
membrana del mastocito o basfilo para desen
cadenar la liberacin de histamina, despus de
haberse unido al antgeno en la fase fluida, de
ah que puedan ser eliminados fcilmente por
lavados. En favor de ello est el hecho de que
la desgranulacin de los mastocitos por estos
anticuerpos puede conseguirse por el mtodo
directo (aadiendo primero el anticuerpo y lue
go el antgeno) o reverso (invirtiendo el orden).
Adems, para que la desgranulacin del masto
cito tenga lugar, es necesario que antgeno y
anticuerpo estn en relaciones ptimas (ligero
exceso de antgeno). Ello quiz puede deberse
a c[ue el agregado formado necesita una confi
guracin espacial determ inada para unirse al
receptor de la membrana. Si el anticuerpo es de
tipo IgE, que se fija directamente al receptor, el
aadido de exceso de antgeno o anticuerpo no
incide en los resultados.
Otro hecho que indica una sensibilizacin
diferente por los anticuerpos IgE e IgG es el
observado al aadir mastocitos normales a una
suspensin de mastocitos sensibihzados. En el
caso de los mastocitos sensibihzados por IgE el
aadido de mastocitos normales no produce au
mento de la liberacin de histamina, hecho que
ocurre, y es proporcional a la cantidad de m as
tocitos aadidos, si la sensibilizacin es por
IgG l.
C om o en el co bayo y rat n , que p o seen
IgG l, se ha demostrado tambin la presencia
de anticuerpo reagnico (IgE), queda aiin por
dilucidar cul es la verdadera funcin que la
IgGl o y, cumple en estos animales.
Las otras inmunoglobulinas conocidas, IgM,
IgA e IgD, no participan en el choque anafilc
tico ya que carecen de capacidad homocitotrpica y heterocitotrpica, que est dada por el
fragmento Fe de la inmunoglobulina. Un anli
sis comparativo de las propiedades de IgG l e
IgE se encuentra en el cuadro 32-2.
Metzger y col. han aislado y caracterizado el
receptor para IgE existente en clulas basfilas
(RIFce). Est compuesto por 3 subunidades: a
(PM 27,8 kD), cuya fraccin extracelular Nterminal de 181 residuos y 7 sitios potenciales
de glucosilacin, presenta dos dominios de 40

655

Cuadro 32-2
In m unoglobulina
P ropiedades

IgG ,

Ig E

Pe.so m olecular
C onstante de sedim entacin
T erm olabilidad (1 hora a 56 C)
Inactivacin por m ercaptoetanol
Tiem po m nim o de fijacin a la
piel
P ersistencia en piel
P ersistencia en m astocitos des
pus de varios lavados
P asaje placentario
C apacidad para precipitar el an t
geno
C oncentracin srica

150JsD
15

18.5 k D
7,8.5
+ (+)
+
24 h o ras

..
-

2-3 hora
Horas
-

+
-1-

S em an as
+
-

m g/m l

y 52 aminocidios respectivamente, con hom o

loga para los dominios de las inm unoglobuli
nas y que son los comprometidos en la unin a
los dominios CH2/CH2 de la IgE; p (PM 32
kD) que sobrepasa cuatro veces la mem brana
citoplasmtica, que es muy sensible a las enzi
mas proteolticas, y que actuara como elem en
to de unin al homodmero de cadena y. ste
tiene un PM de 9 kD y resulta de la unin de
dos cadenas y por un puente disulfuro, presen
tando estas cadenas considerable hom ologa
con la cadena ^ del componente CD3 del re
ceptor del linfocito T (RcT). Al igual que CD3
el homodmero y estara involucrado en la
transduccin de seales, las que tendran lugar
despus de la unin de la IgE a la cadena a del
RIFce (fig. 32-8).
No obstante que el hidrato de carbono cons
tituye el 30% de la masa molecular del recep
tor, parecera que este componente no intervie
ne en la unin al ligando. La unin RIFCe-IgE
es de alta afinidad (10 a 10 M ). (Para ms
detalles vase cap. 5).
El nmero de RIFce en los basfilos oscila
entre 40 x 10^ y 90 x 10^ por clula.
Se ha descrito un receptor para IgE de baja
afinidad (RlIFce) que requiere mayores canti
dades de IgE para su unin. Este receptor es es
pecfico para los dominios CH3/CH3 de IgE y
se lo conoce tam bin como CD23. H a sido
identificado en linfocitos B, macrfagos y eosi
nfilos y se considera que interviene en la re
gulacin de la sntesis de IgE.
Adems de los mastocitos y basfilos san
guneos, la presencia de repector para IgE ha
sido dem ostrada en plaquetas, m acrfagos y
granulocitos eosinfilos. En estas clulas, los
receptores serviran para que pudieran actuar
como clulas efectoras citotxicas frente a pa
rsitos sensibilizados con IgE. Esto m ostrara
que la IgE no siempre desencadena fenmenos
que pueden ser perjudiciales para el husped.

656
A

Inmunopatologa

l e r g ia a t p ic a

H asta hace muy poco tiem po, ia llam ada

alergia atpica en el hombre, con sus expresio
nes clnicas como el asma, fiebre del heno, u r
ticaria, etc., era considerada un tipo particular
de manifestacin de hipersensibilidad, que li
beraba mediadores qumicos, siendo responsa
bles de ella ciertos anticuerpos denominados
reagnicos, termolbiles, no precipitantes y
slo con capacidad para transmitir pasivamente
el fenmeno de hombre a hombre.
El descubrimiento de la IgE y su exclusiva
capacidad homocitotrpica, as como la identi
dad entre ella y los anticuerpos reagnicos, han
servido para aclarar el problema y demostrar
que la atopia no es ms que una manifestacin
anafilctica, generalmente localizada.
A los antgenos responsables de las alergias
atpicas se los designa alergenos. Los ms co
munes son los provenientes de plenes, prote
nas de los pelos, plumas, polvillo de habita
cin, etc.
La magnitud de la respuesta IgE a los alerge
nos depende de la ruta de su penetracin en el
husped y de las caractersticas genticas de s
te (vase ms adelante). El motivo por el cual
los alergenos dan respuesta a IgE en los pa
cientes atpicos, y otros tipos de respuestas in
munes en los no atpicos, es un hecho an no
totalmente clarificado.
Los alergenos ms importantes pertenecen a
cuatro grupos;
a) Alergenos areos. Forman parte de este
grupo los plenes de diferentes orgenes espo
ros de hongos, en especial los de Aspergillus y
Alternara, todos ellos con alto contenido en
glucoprotenas; y los provenientes de ectoparsitos como los Dermatophagoides, presentes en
el polvillo de habitacin. Todos estos alergenos
producen, por regla general, reacciones alrgi
cas de tipo asmtico y/o rinitis. A partir de es
tos materiales se han aislado y purificado dife
rentes alergenos, los que han demostrado ser
los responsables de la reaccin inducida por el
producto global.
b) A lergenos de origen alim entario. Una
gran variedad de alimentos como la leche, hue
vo, pescado, man, nueces, mariscos, cacao y
otros contienen alergenos capaces de inducir
reacciones de hipersensibilidad mediadas por
IgE, de tipo cutneo, gastrointestinal y aun sistmicas. Estas alergias son muy comunes en
los nios de corta edad, especialmente las indu
cidas por leche de vaca, las que generalmente
desaparecen despus de los 2-3 aos de vida.
En los adultos predominan las manifestaciones
inducidas por pescados y mariscos,
c) Alergenos provenientes de venenos de in
sectos. Los venenos de avispas, abejas y escor

piones tienen sustancias alergnicas, general

mente relacionadas con enzimas como fosfoli
pasa y hialuronidasa las que con frecuencia
presentan actividad proteoltica. Estos alerge
nos inducen reacciones locales, las que pueden
llegar a ser de carcter sistmico si son desen
cadenadas en individuos muy sensibilizados
como consecuencia de picaduras anteriores.
d)
Alergia a drogas: productos qumicos de
bajo peso molecular, actuando como haptenos,
pueden acoplarse a protenas propias del hus
ped y transformarse en antgenos, sensibilizn
dolo. Drogas como la penicilina, cefalosporina
y sulfamidas inducen con frecuencia reacciones
alrgicas, al igual que algunos anestsicos loca
les como la novocana, lo que obliga a un inte
rrogatorio previo del paciente o sometimiento a
alguna prueba cutnea especfica para conocer
su estado de sensibilizacin. La penicilina es
uno de los frmacos que con ms frecuencia in
duce alergia, habindose producido casos fata
les como consecuencia de una reaccin de hi
persensibilidad sistmica aguda, cuando fue in
yectada en individuos sensibilizados.
La alergia ectpica se caracteriza porque es
espontnea y ocurre principalmente como con
secuencia de estimulaciones en la mucosa na
sofarngea, bronquial, gstrica e intestinal.
Nuevas penetraciones de antgeno desencade
nan reacciones anafilcticas localizadas en el
rgano efector que sufre el impacto (mucosa
nasal; fiebre de heno; mucosa bronquial; asma;
piel; urticaria, etc.). Las personas normales ha
bitualm ente no sufren estas m anifestaciones
porque, aun estando sensibilizadas, poseen un
ttulo significativo de anticuerpos circulantes
de tipo IgG no homocitotrpicos, que actuando
sobre el antgeno lo bloquean e impiden la for
macin de los inmunocomplejos a nivel celu
lar, que son los liberadores de ias sustancias
vasoactivas.
Una forma de determinar si un individuo es
t sensibihzado a un antgeno es haciendo apli
caciones locales de ste, ya sea por escarifica
cin o por inoculaciones intradrmicas. Estas
pruebas deben ser efectuadas con cuidado, ya
que en personas muy sensibilizadas la respues
ta puede ser un choque anafilctico generaliza
do, con todas sus consecuencias.
Se puede trasmitir pasivamente la alergia atpica, pero en este caso, siendo el anticuerpo res
ponsable homocitotrpico, el nico receptor po
sible es el hombre. Esto no es absoluto, ya que
se ha demostrado que la piel de algunos monos
tiene capacidad para fijar la IgE humana.
La prueba de transferencia pasiva en el hom
bre se denomina de Prausnitz-Kstner o PK, y
consiste en inyectar en la piel de una persona
no sensibilizada el suero del paciente en estu
dio, inoculando el antgeno en la misma rea

Manifestaciones de hipersensibilidad
24 a 48 horas despus. Si el material inicial
mente inoculado contena anticuerpos reagnicos, se produce una ppula con eritema en el
punto de inoculacin. Una idea aproximada del
ttulo de anticuerpos puede lograrse mediante
inoculaciones de diferentes diluciones del sue
ro en ensayo, determinando cul es la mxima
dilucin que da reaccin positiva.
La desensibihzacin, especialmente por for
macin de anticuerpos de bloqueo, da buenos
resultados en la mayor parte de los casos (va
se ms adelante). Es indispensable tambin el
aislamiento del paciente de las zonas de con
tacto con los antgenos sensibilizantes (ple
nes, polvos de habitacin, plumas, medicamen
tos), a efectos de evitar la produccin de cho
ques anafilcticos localizados y nuevas sensibihzaciones.
Algunas sustancias simples, en especial m e
dicamentos y productos qumicos, pueden sen
sibilizar, ya que, si bien por s solos no tienen
capacidad inmunognica, la adquieren al com
binarse con protenas propias del individuo, las
que actan como soportes.
El asma bronquial, proceso con caractersti
cas comunes de la alergia atpica, es una forma
clnica que puede verse influida por diferentes
manifestaciones psicosomticas, las que pue
den incidir en la liberacin de mediadores qu
micos.
En el asmtico, la estimulacin cohnrgiea a
travs de la acetilcolina sobre la guanilatociclasa provoca un aumento del GMPc en las clu
las basfilas, con liberacin de histamina y leu
cotrienos y contractura de la musculatura lisa
bronquial. Este efecto es bloqueado por la atro
pina. La manifestacin asmtica puede aumen
tar aun ms por intermedio de la norepinefrina,
que al estimular los receptores a-adrenrgicos,
disminuye la concentracin de AMPc, con la
consecuente liberacin de los mediadores qu
micos. Esta accin puede ser inhibida por bloqueadores a-adrenrgicos como la fentolamina.
Cuando el isoproterenol o la epinefrina acti
van la adenilciclasa, que transforma al ATP en
AMPc, la liberacin de histamina y otros me
diadores es inhibida y la relajacin muscular se
produce. Las metilxantinas magnifican el efec
to al aumentar el AMPc por inhibicin de la
adenilfosfodiesterasa, que destruye al AMPc
con formacin de 5 AMP inactivo (fig. 32-8).
Conociendo este mecanismo de regulacin ho
meosttica a travs del AMPc y GMPc y los
agonistas y antagonistas del sistema nervioso
autnomo, es posible actuar con xito en el as
ma bronquial mediante el empleo de productos
farmacolgicos eficaces.
Se ha considerado la existencia de una pre
disposicin hereditaria a la alergia atpica, que
podra estar caracterizada principalmente por

657

una aptitud para la elaboracin exagerada de

anticuerpos localizados en la IgE.
El descubrimiento de los antgenos del siste
ma mayor de histocompatibilidad o HLA (vase
cap. 29) ha permitido comprobar asociaciones
estadsticamente significativas entre algunas en
fermedades y estos antgenos. En el caso de la
atopia existen asociaciones entre la sensibiliza
cin a algunos componentes de plenes y los
antgenos HLA de los que son portadores esas
familias. Se ha demostrado, entre otras, una aso
ciacin significativa entre personas que son por
tadoras de los antgenos HLA Dw2, B7 yA2,
A28 con los antgenos Ra5 y Ra3, respectiva
mente, procedentes del polen de hierba carmn.
Del mismo modo, entre B8, Dw3, Al y Dw3, B
con Rye I y Rye II (polen de gramneas).
Los mecanismos de regulacin de la produc
cin de IgE han sido objeto de numerosas in
vestigaciones, sobre todo si se tiene en cuenta
que la sntesis de esta inmunoglobulina gene
ralmente se desarrolla en forma independiente
de la correspondiente a las otras clases de in
m unoglobulinas. Es un hecho bien conocido
que antgenos asociados a adyuvante de Freund
completo inducen sntesis de anticuerpos IgG,
en tanto que hay aumento de la sntesis de IgE
si el antgeno se inocula mezclado con una sus
pensin de Bordetella pertussis. Hay investiga
dores que en uno y otro caso han aislado facto
res supresores o estimuladores de la sntesis de
esa inmunoglobulina.
Ishizaka y col. analizaron la produccin de
IgE en ratas infectadas previamente con Nippostrongylus brasiliensis. En los ganglios lin
fticos encontraron linfocitos T que sintetiza
ban un factor potenciador de la sntesis de IgE,
de P M 25 kD, y un factor inhibidor de la snte
sis de IgE, de PM 16 kD. El primero estaba
glucosado, tena grupos terminales y se una a
Con A. Cuando esos linfocitos fueron estimula
dos con Con A en presencia de un inhibidor de
la glucosilacin proteica (tunicamieina) y sin
este antibitico en un cultivo paralelo, encon
traron que el producto sintetizado en presencia
de tunicam ieina tena actividad supresora, no
as el control. La lipomudulina, protena cito
plasmtica inhibidora de la fosfolipasa, induce
la produccin del factor supresor. P osterior
mente los mism os investigadores aislaron un
factor inhibidor de glucosilacin (FIG), consti
tuido por un fragmento de lipomodulina fosforilada, y an factor estimulador de la glucosila
cin (FEG), que tiene caractersticas de proteasa similar a la calicrena. Teniendo en cuenta
que la calicrena y la bradiquinina activan fos
folipasa en una variedad de clulas, se puede
especular que el factor aumentara la glucosila
cin del factor de unin a las clulas B con IgE
de m em brana, a travs de la activacin de la

658

Inmunopatologa

fosfolipasa. Se estima que los linfocitos T esti

mulados producen los dos factores en pequeas
cantidades los que podran ponerse en contacto
con los linfocitos con IgE de membrana, man
teniendo el control normal de la sntesis de IgE,
que podra desnivelarse por el predominio de
uno u otro factor.
Recientemente se ha demostrado que la IL-8
y la IL-12 inhiben selectivam ente la produc
cin de IgE inducida por IL-4.
M edicin de IgE
Dados Jos niveles extremadamente bajos de
IgE srica (~ 250 ng m i '), hasta hace poco
tiempo rio se dispona de mtodos que perm i
tieran su cuantificacin, y menos aun de la IgE
con actividad especfica. Con el advenimiento
del radioinmunoanhsis ello ha sido posible, ya
que esta metodologa es capaz de detectar hasta
1 ng de anticuerpo.
Para el dosaje de IgE humana total, un anti
cuerpo anti-IgE humana se fija covalentemente
a discos de papel de filtro previamente tratados
con bromuro de ciangeno. Diluciones del sue
ro estndar y del suero a valorar son puestos en
contacto con los discos de papel, en dos series
paralelas. Luego de incubar y lavar los discos
son cubiertos con '^^IgG anti-IgE (hum ana).
Despus de incubar y lavar, se determina la ra
diactividad de los discos (combinada), usando
para ello un contador de radiaciones gamma.
Con los datos obtenidos se efectan las graficaciones y clculos correspondientes. A esta m e
todologa se la designa habitualmente con ia si
gla RIST, de) ingls radioimmunosorbent test (Para mayores detalles vase cap. 38.)
El dosaje de IgE especfico se hace fijando a
los discos de papel el correspondiente alergeno,
y ponindolos a reaccionar con diluciones del
suero que se ha de valorar. Se procede de igual
manera con un suero testigo. Despus de incu
bar y lavar se aade a cada disco ^'I-IgG antiIgE (humana), se incuba, lava, lee y cuantifica
como en el caso anterior.
Cuando lo que se dosa es la IgE especfica,
e l radioinm unoanlisis se lo designa RAST
(radioallergosorhent test).
Actualmente, y dada la sensibilidad del m
todo, los inmunoanlisis que emplean reactivos
marcados con enzimas van sustituyendo cada
vez ms el radioinmunoanlisis. Tienen la ven
taja de que se pueden realizar en cualquier la
boratorio y no se manipulan materiales radiac
tivos (cap. 37).
D

e s e n s ib il iz a c i n

Por diferentes procedimientos es posible desensibilizar tem porariam ente con respecto al

choque anafilctico. Si a un animal sensibiliza

do, en lugar de inocularle la dosis de antgeno
mnima desencadenante en una sola vez, se le
inyecta sta en forma fraccionada (1/10 de la
dosis total) y a intervalos de 20-30 minutos, el
animal no experimenta choque anafilctico. Se
considera c]ue el antgeno inoculado en estas
condiciones produce neutralizaciones parciales
del anticuerpo fijado y no llega a formar la can
tidad de inmunocomplejo necesaria para liberar
las dosis farm acolgicam ente activas de los
mediadores qumicos. Si inmediatamente des
pus se inyectan al animal dosis de antgeno
iguales o aun superiores a la mnima desenca
denante, el animal no reacciona. Parecera que
todo el anticuerpo fijo hubiese sido bloqueado
e incapacitado para reaccionar con el antgeno
ltimamente introducido.
Es posible desensibilizar tambin mediante
inoculaciones subcutneas, repetidas cada 4-5
das, de pequeas cantidades del antgeno espe
cfico, pero en este caso el mecanismo es dife
rente, ya que como consecuencia de la estimu
lacin antignica se originan anticuerpos sri
cos bloqueantes de tipo IgG. heterocitotrpicos, que al unirse al antgeno que puede pene
trar con posterioridad impiden su interaccin
con los anticuerpos fijos a clulas.
Estos resultados son ms efectivos si los an
tgenos usados son particulados o previamente
polimerizados con glutaraldehdo si son solu
bles. Par mayor informacin vase el captulo
19, anticuerpos no precipitantes o IgG asimtri
cos y las correspondientes curvas de produc
cin de anticuerpos cuando se hacen inmuniza
ciones a repeticin con antgenos que respon
den a las caractersticas sealadas.
Fenmeno de A rth u s

Es un fenmeno de hipersensibilidad que, a

diferencia de la anafilaxia, no se debe a la libe
racin de mediadores qumicos. Fue descrito
inicialmente por Arthus en 1903, quien observ
que inoculando suero de caballo por va subcu
tnea a conejos que haban sido previam ente
inmunizados con el mismo antgeno, apareca a
las pocas horas, en el punto de inoculacin, una
tumefaccin difusa, que poda llegar a la hipe
rem ia. Pueden aparecer tam bin petequias y
pequeas hemorragias. Generalmente el proce
so retrogada pero, si el ttulo de anticuerpos es
suficientemente alto, puede producirse necro
sis. Este fenmeno puede desencadenarlo cual
quier antgeno soluble capaz de engendrar la
elaboracin de anticuerpos precipitantes fijado
res del complemento.
Es un fenmeno inflamatorio; se inicia con la
aparicin de anticuerpos precipitantes y se in
tensifica con su aumento. Es especfico, ya que

Manifestaciones de hipersensibilidad
slo lo desencadena el antgeno con especifici
dad para los anticuerpos que posee el animal.
Si bien la reaccin de Arthus incluida entre
las de tipo III del Gell y Coombs generalmente
se desencadena en piel, puede producirse tam
bin en otros rganos. Es un fenmeno local en
que las lesiones hsticas se inician por la for
macin y depsito de agregados antgeno-anti
cuerpo. Los complejos ms efectivos son los
solubles que se forman en la zona de ligero ex
ceso de antgeno, con capacidad para fijar el
complemento. Como ya se ha indicado en el
captulo 22, es indispensable la formacin de
C3a y C5a, compuestos que provocan por quimiotactismo un aflujo de leucocitos, en espe
cial polimorfonucleares neutrfilos. stos en
globan los inmunocomplejos formados en los
espacios texturales y en la pared de los vasos,
degradndolos. Los leucocitos necrticos libe
ran protenas catinicas y enzimas lisosomales,
en especial catepsina D y E, que son las que
provocan focos de necrosis en la pared de los
vasos y otros procesos inflamatorios, con c
mulos de plaquetas y trombos de fibrina en las
pequeas arteriolas que rodean, provocando la
obliteracin de las mismas y en definitiva la
necrosis hstica.
Se ha podido seguir la evolucin del proceso
in vivo, especialmente en el conejo, mediante la
colocacin en la oreja de pequeas cm aras
transparentes que permiten la observacin m i
croscpica. Se ha visto que en las primeras ho
ras hay cmulo de polimorfonucleares neutrfilos y muy pocos linfocitos, macrfagos y eosi
nfilos. Despus de las 24 horas, los polinuclea
res comienzan a degenerar, aumentando la pro
porcin de macrfagos, eosinfilos y linfocitos,
los que se mantienen varios das hasta que tiene
lugar la reparacin hstica. Mediante el empleo
de antgenos o anticuerpos marcados se ha podi
do observar que los inmunocomplejos desapare
cen en su mayora a las 24-48 horas, los que son
fagocitados por los polimorfonucleares neutrfi
los y en menor proporcin por los macrfagos.
En algunas especies animales, como la rata, los
eosinfilos intervienen activamente en a fagoci
tosis. Esto hace suponer que el fenmeno de
Arthus debe participar en los mecanismos de
eliminacin de inmunocomplejos, en especial
los presentes en los vasos sanguneos.
La presencia de leucocitos es indispensable
para que la reaccin de A rthus se produzca.
Cualquier proceso que lleve a su depresin co
mo el empleo de mostaza nitrogenada y sus de
rivados o sueros antipolimorfonucleares neu
trfilos, reduce al mnimo el fenmeno.
La reaccin de Arthus puede desencadenarse
en forma pasiva. A diferencia de la anafilaxia
cutnea pasiva (PCA) no necesita perodo de
latencia. Slo los anticuerpos bivalentes lo ori

659

ginan y las dosis de los m ism os necesarias,

muy superiores a las del PCA, varan entre 30
y 60 p,g.
El Arthus pasivo puede ser directo o reverso.
En el primer caso, el antgeno es inoculado por
va intradrmica, y el anticuerpo, intravenosa.
En ambos casos, antgeno y anticuerpo pueden
ser inoculados a un mismo tiempo por tratarse
de una reaccin inicial entre antgeno y an ti
cuerpos circulantes.
Siendo un fenm eno puram ente vascular,
desencadenado por la formacin de trom bos,
los anticoagulantes como la heparina, Trom exn, etc., inhiben o disminuyen la intensidad de
la reaccin.
El Arthus pasivo difiere del PCA en que no
requiere perodo de latencia; las dosis de anti
cuerpo necesarias para desencadenar el fen
meno son superiores; la reaccin se hace evi
dente, al igual que en el fenmeno activo, entre
las 5 y 18 horas y no es inhibida por los anti
histamnicos.
R e a c c i n d e a r t h u s s is t m ic a
o ANAFILAXIA ALARGADA

Se ha observado que ia inoculacin de antge

nos a cobayos que contienen un alto ttulo de
anticuerpos especficos, no por va intravenosa
sino subcutnea, intramuscular o cualquier otra
que determine una lenta absorcin de l, produ
ce la muerte de los animales despus de 4-5 ho
ras, pero con una sintomatologa diferente de la
anafilaxia verdadera. Presentan hipotensin,
leucopenia, trombocitopenia, aumento del tiem
po de la coagulacin sangunea. En las necrop
sias no hay enfisema pulmonar. Se observa l
quido peritoneal, petequias y pequeas hemorra
gias en mucosas, serosas y pulmones y frecuen
temente grandes hemorragias en el tracto gas
trointestinal.
Este fenmeno no es inhibido por los antihistamnicos, y en los animales que lo experimen
tan se observa una disminucin del complemen
to circulante. Siendo el complemento fijado por
los anticuerpos de tipo gG2 de cobayo y no por
los de tipo igO l responsables del choque anafi
lctico, todo esto hace suponer que la llamada
anafilaxia alargada no sea ms que un fenmeno
de Arthus sistmico. Al no inocularse el antge
no por va intravenosa el choque anafilctico se
reduce al mnimo, pero ello no impide la forma
cin de inmunocomplejos entre el antgeno y
anticuerpos lgG2 capaces de desencadenar una
reaccin de Arthus generalizada.
E

n ferm ed a d del su ero

Es una enfermedad que fue descrita inicial

mente en el hombre, pero que puede lograrse

660

Inmunopatologa

experimentalmente en los animales. Se produce

cuando se inoculan altas dosis de antgeno en
una sola vez (sueros antitxicos elaborados en
animales de otras especies, protenas purifica
das concentradas). En el hombre se observa hipertermia, tumefaccin ganglionar, hipertrofia
del bazo, urticaria, dolores articulares y postra
cin. Los polinucleares neutrfilos y eosinfi
los estn aumentados y puede aparecer albumi
nuria. El complemento srico est disminuido.
Mediante el empleo de antgenos marcados
se pudo observar que, con posterioridad a la
inoculacin de la alta dosis de antgeno, los
sntomas de la enfermedad del suero se inicia
ban cuando an haba antgeno circulante, y
muy poco antes de la aparicin de anticuerpos,
y que los sntomcis desapareceran cuando no se
detectaba antgeno y los anticuerpos circulantes
estaban a alta concentracin. Todo esto indica
ba que esta enfermedad estaba relacionada con
la formacin de anticuerpos sricos, pero que
la aparicin de los sntomas clnicos no coinci
da con la aparicin de anticuerpos circulantes
libres. En realidad, la enfermedad se inicia con
la aparicin de los anticuerpos. Lo que ocurre
es que, dada la presencia de grandes cantidades
de antgeno circulante, se originan complejos
solubles. Los inm unocom plejos son norm al
mente eliminados de la circulacin por el siste
m a reticuloendotelial en correspondencia con
las caractersticas de los mismos. Los formados
en exceso de antgeno son pequeos y lenta
mente eliminados. Los elaborados en la zona
de equivalencia constituyen grandes agregados
y son rpidamente fagocitados. Lo mismo ocu
rre con los formados en la zona de exceso de
anticuerpo, pero stos no fijan el complemento.
Teniendo en cuenta esto y el hecho de la dismi
nucin de los niveles del complemento durante
la enfermedad del suero, se supone con razn
que la misma sea desencadenada por complejos
antgeno-anticuerpo form ados en la zona de
moderado exceso de antgeno.
ALERGIA RETARDADA
Este tipo de manifestacin de hipersensibili
dad, mediada por clulas, ya ha sido considera
da en detalle en el captulo 16 y en su puesta en
m archa intervienen los linfocitos T del tipo
T H l, CD4+ productores de IL-2 e INF-y.
Hipersensibilidad de tipo Jones-Mote
Cuando se inoculan antgenos proteicos apa
rece en los primeros estadios de la formacin
de los anticuerpos, y antes de que ellos estn
presentes en circulacin, un estado de sensibi
lidad capaz de dar reacciones cutneas de ex

presin tarda, similares a las observadas en la

alergia retardada verdadera. Aparentemente, es
m ediada por las clulas productoras de anti
cuerpos que aparecen tempranamente. Es tran
sitoria, se presenta a los pocos das de la ino
culacin del antgeno y se mantiene hasta la
aparicin de anticuerpos circulantes, instante
en que es reemplazada por una manifestacin
de tipo Arthus. Mientras no pueda demostrarse
que la sensibilidad de Jones-Mote es transmiti
da por clulas, no puede considerarse como
una manifestacin tarda. Difiere de la hiper
sensibilidad retardada en algunos aspectos de
la dermorreaccin y especialmente porque du
rante sta hay acumulacin de clulas plasm
ticas.
HIPERSENSIBILIDAD INESPECFICA
Se conocen algunas manifestaciones de h i
persensibilidad que, si bien desde el punto de
vista clnico de la reaccin producida se aseme
jan grandemente a las desencadenadas por al
guno de los mecanismos especficos descritos,
no pueden incluirse dentro del captulo de aler
gia por carecer de una base inmunolgica. M e
recen mencionarse el choque anafilactoideo, el
fenm eno de Sannarelli-Schw artzm ann y las
llamadas alergias fsicas.
Choque anafilactoideo. Se produce por ino
culaciones intravenosas de algunas sustancias
como la peptona, extractos de rganos (en es
pecial los pulmonares de vaca y caballo), agar,
almidn, hierro coloidal, tinta china, etc. Se lo
gra mediante inoculacin por la va indicada, y
la reaccin producida se asemeja a un choque
anafilctico agudo. Se diferencia de este lti
mo en que se produce por una nica inocula
cin del material y, adems, en que varias de
las sustancias desencadenantes no son antig
nicas.
Las investigaciones efectuadas parecen indi
car que las sustancias mencionadas inyectadas
por va intravenosa pueden provocar la libera
cin de histamina, la que al actuar sobre los va
sos y musculatura lisa produce manifestaciones
similares a las desencadenadas por el choque
anafilctico. Si bien el desencadenante de la
reaccin es el mismo producto farmacolgica
mente activo, el mecanismo que lleva a su libe
racin es diferente en ambos casos.
Fenmeno de Sannarelli-Schwartzmann. Es
te fenmeno con forma de reaccin generaliza
da, fue descrito inicialm ente por Sannerelli,
quien observ que, si inoculaba conejos con
dosis subletales de vibrin colrico y horas
despus con pequeas cantidades de colibacilos, los animales moran con una marcada ne
crosis de la mucosa intestinal.

Manifestaciones de hipersensibiiidad
Schwartzmann, unos aos despus, observ
que, si se inoculaban conejos por debajo de la
piel con un filtrado de bacilos teos, y a las 24
horas, por va intravenosa, se inyectaba el m is
mo filtrado o el procedente de otros microorga
nismos, como colibacilos y aun meningococos,
la zona de la piel inicialmente inoculada tom a
ba, entre las 2 y las 5 horas posteriores, un as
pecto purpureo, y llegaba a la necrosis algunas
horas ms tarde. En los exmenes histolgicos
se observaban necrosis textural, trombosis, ro
tura de vasos y hemorragia.
Schwartzmann pudo demostrar que este fe
nmeno hemorragparo, al que Sannarelli haba
denominado alergia hemorrgica, era inespe
cfico, ya que poda lograrse con la inoculacin
de sustancias desencadenantes de naturaleza
muy diferente de la de las usadas para la sensi
bilizacin inicial, como agar y almidn. A de
ms, no poda admitirse una base inmunolgica
similar a la del fenmeno de Arthus por cuanto

661

el tiempo transcurrido entre la primera y la se

gunda inoculacin era mnimo, lo que no poda
explicar la elaboracin de anticuerpos.
La interpretacin de este fenmeno ha p reo
cupado a los inmunlogos. Estudios de tejidos
efectuados en conejos han aportado algunos
conocimientos al respecto. La inoculacin in i
cial .del filtrado produce un cmulo local de
polimorfonucleares neutrfilos, especialm ente
en m anguito, a nivel de los pequeos vasos.
Estos polinucleares, mediante gluclisis an ae
robia, producen cantidades anormales de cido
lctico, al tiem po que lesiones histo l g icas
inaparentes comienzan a presentarse en los endoteUos de los vasos circundantes. Al hacer la
segunda inoculacin intravenosa este fenm e
no se intensifica, hay cmulo de leucocitos y
plaquetas en los vasos lesionados, y se o rig i
nan trom bos oclusivos que llevan a la rotura
de los vasos y necrosis de los tejidos, todo lo
cual configura el fenm eno descrito inicial-

C uadro 32-3. Manifestaciones de hipersensibilidad

H ipersensibilidad
inespecfica

H persensibilidad especfica
Inm ediata

R etardada
i l[JV

Tipo anafilctico

Tipo Arthus

Tipo tuberculnico

Sannarelli-Schw artzm ann

A gente resDonsable

A nticuerpos sri
cos fijos a c
lulas

A nticuerpos cir
culantes

C lulas especficam ente sensibi

lizadas. A usencia de anticuer
pos sricos

A usencia de anticuerpos
sricos y clulas e sp e c fi
cam ente sensibilizadas

A gente

A nticuerpos pre
cipitantes y no
precipitantes

Anticuerpos p re
cipitantes

C lulas sensibilizadas

A usencia de transferencia
pasiva

73

(/i

'iu ou
o
WJ'Z3
P

C obayo (y l)
Conejo (IgG )
H om bre (IgG )
V aca
Pollo

S
S
S
No
No

S
S
S
S
S

P erodo de latencia

No

n ^
_o

Causa

No

Complejos A g-A c, Accin citotxica directa e inLiberacin de

m ediadores
fijadores de 0.5,
filtracin po r clulas linfoC 6 , C7 (factor
rreticulares sensibilizadas y
qum icos (his
quim iotctico)
no sensibilizadas
tam ina y otros)

M ecanism o

Efecto

Inhibicin

Contraccin de
Lesin del endote- Necrosis
lio vascular. D e
la mu,sculatura
lisa
psito de fibrina,
plaquetas y le u
cocitos. T rom bo
sis, hem orragia,
necrosis

Lesin del endotelio v a s c u

lar. D epsito de fibrina,
plaquetas y leucocitos.
Trom bosis, hem orragia,
necrosis

A ntihistam nicos A nticoagulantes

Cortisona
(heparina)
D estruccin o re
duccin d e los
leucocitos y p la
quetas

A nticoagulantes (heparina).
D estruccin o reduccin
de los leucocitos y p la q u e
tas

662

Inmunopatologa

mente por Schwartzrnann. Para que todo esto

ocurra, es indispensable la presencia de los po
lim orfonucleares neutrfilos. Todos aquellos
frmacos capaces de producir su depresin, as
como los sueros antipolimorfonucleares neu
trfilos, disminuyen o anulan la reaccin. Los
anticoagulantes tienen tambin un efecto bene
ficioso.
Dada la comunidad antignica existente en
tre algunos antgenos bacterianos y polisidos
de naturaleza distinta, y puesto que se ha de
mostrado la frecuente presencia de anticuerpos
antimicrobianos de origen natural, en especial
contra los antgenos R de enterobacterias, sera
prudente efectuar una revisin del fenmeno.
Existiendo anticuerpos naturales, una estim u
lacin antignica podra producir una reaccin
secundaria con una concentracin de anticuer
pos suficiente para originar complejos Ag-Ac
y desencadenar un fenmeno de Arthus.
En estos momentos en que se conoce un niimero apreciable de linfoquinas, algunas de las
cuales pueden tener participacin en los fen
menos inflamatorios, y cuyos niveles se incre
mentan por estimulacin con lipopolisacridos
bacterianos (LPS), hay autores que suponen
que a la IL-1 sintetizada por los macrfagos y
muy especialmente al interfern gamma (IF-y)
sintetizado por los linfocitos T les cabra gran
parte de la responsabilidad del fenm eno de
Schwartzrnann.
Alergia fsica. Si bien numerosas personas
manifiestan tener alergia a algunos agentes fsi
cos como la luz solar, el fro, las irritaciones
mecnicas, etc., caracterizada por una urticaria
de las partes expuestas, estas manifestaciones
de hipersensibilidad en la mayor parte de los
casos no tienen una base inmunolgica como
para considerarlas alergias. Lo que ocurre es
que los agentes fsicos, al actuar sobre la piel,
provocan la liberacin de histamina u otras sus
tancias vasoactivas, como acontece en la etapa
final de la anafilaxia. Las caractersticas de am
bos fenmenos son similares, pero en su origen
difieren totalmente.
En algunas oportunidades los agentes fsicos
pueden modificar protenas corpreas las que,
al no ser reconocidas como propias, pueden
dar lugar a una reaccin anafilctica v erd a
dera.
Factores psicognicos, disturbios emociona
les, pueden provocar rubor y simular reaccio
nes alrgicas. Existen autores que consideran
que ellos son predisponentes para una reaccin
alrgica verdadera. En qu modo los factores
emocionales pueden predisponer a un indivi
duo norm al para una reaccin alrgica, o en
qu medida su correccin puede incidir en la
mejora de un alrgico, son hechos que hasta el
momento no estn bien aclarados.

El cuadro 32-3 resume las principales carac

tersticas de los fenmenos de hipersensibilidad.
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Inmunologa tumoral

33

SILVIA E. HAJOS

IN TRO D U C CI N
Los tumores malignos proliferan de una m a
nera descontrolada, invaden los tejidos norma
les, frecuentemente dan metstasis y crecen en
sitios distantes del tumor primario que les dio
origen.
A pesar de que generalmente se manifiestan
como una masa tumoral constituida por un gru
po de clulas, sta es consecuencia de una serie
de cambios producidos en una o unas pocas c
lulas normales, que han sufrido un lento proce
so de transformacin maligna. El cncer no es
restrictivo del hombre o de Jos mamferos sino
que afecta a todos los organismos multicelula
res, vegetales y animales.
Es imposible definir una clula tumoral en
trminos absolutos. Generalmente los tumores
se reconocen por su crecimiento descontrolado.
Por consiguiente, se podra decir que una clu
la tumoral difiere de una clula normal porque
es incapaz de responder a los mecanismos que
controlan el crecim iento celular. En algunos
casos, especialm ente en una etapa tem prana
luego de su transformacin, estas clulas pue
den no proliferar.
Los tumores se pueden dividir en tres grupos
en funcin de su comportamiento:
a) Tumores benignos, que pueden aparecer
en cualquier tipo de tejido, crecen localmente y
producen dao por lesin local u obstruccin.
Estos tumores no se diseminan a otros sitios
distantes.
b) Tumores in-situ, que generalmente se de
sarrollan en epitelios y son pequeos. Las clu
las presentan una morfologa caracterstica pe
ro permanecen en la capa epitelial. No produ
cen invasin de la membrana basal ni del mesnquima.

c)
Tumores malignos totalmente desarrolla
dos, que poseen una capacidad especfica para
invadir y destruir el tejido mesenquimatoso cir
cundante.
Las clulas tumorales se proveen de nutrien
tes del torrente sanguneo. Algunas producen
una sustancia denominada factor de angiognesis tumoral (TAE) que estimula el crecimiento
de los vasos sanguneos hacia el tumor. De esta
manera se favorece su crecimiento continuo.
Los nuevos capilares son fcilmente daados y
el tum or invasor puede continuar su penetra
cin. Fragmentos del tumor son vehiculizados
a travs de ia circulacin hacia ndulos linfti
cos u rganos distantes originando tumores se
cundarios o metstasis.
C arcinognesis
La carcinognesis es un proceso que tiene
lugar en etapas (cuadro 33-1). La administra
cin de un agente carcinognico no lleva a la
aparicin iniriediata de un tumor. Luego de la
etapa de iniciacin se producen una serie de
modificaciones inducidas por el carcingeno.
Las etapas siguientes pueden ser inducidas por
el carcingeno o por otras sustancias (agentes
estimulantes) que por s solas no inducen el tu
mor.
La in iciacin, que es la etapa p rim aria y
esencial en el proceso, es muy rpida, pero una
vez que se ha producido el prim er cambio la
clula modificada puede persistir quizs duran
te toda la vida del individuo. El sitio ideal para
este p rim er ev en to es el m aterial g en tico
(ADN) aunque no siempre ocurre a este nivel.
Las clulas que han sido modificadas permane
cen en un estado latente hasta que son estimu-

Inmunologa tumoral
C u ad ro 33-1. Factores que influencian, el
sarrollo tumoral
Factores
iniciadores

F actores
promotores'

C arcingenos qu- P rom otores espem icos

cficos
V irus
Factores desconociclos
R adiacin, luz
u.v.

Factores
inhibidores
Diferentes ho rm o
nas teraputicas
o fisiolgicas

Inflam acin
H orm onas

Inhibidores n o rm a
les del creci
miento
Edad, ciruga, ra
P rom otores nor
diaciones
m ales del creci
m iento

Errores de replica
cin

ladas por agentes promotores. stos no son car

cingenos per se pero inducen la divisin de
las clulas que han sido iniciadas previamente.
Muchas sustancias inducen la divisin celu
lar pero slo los promotores producirn el de
sarrollo tumoral, por consiguiente, tambin de
ber haber otros factores involucrados.
Se supone que los agprites promotores inter
fieren en el proceso de diferenciacin celular
que nonnalmente tiene lugar cuando las clulas
pasan de la etapa de clulas progenitoras en di
visin hacia clulas funcionales en reposo.
A pesar de que estos agentes prom otores
ejercen su efecto sobre las clulas, stas a su
vez debern ser sensibles a los efectos de los
factores inhibidores del crecimiento celular que
actan normalmente. De esta manera, el balan
ce entre ambos decidir su evolucin. Esto ex
plica por qu se pueden encontrar clulas preneoplsicas o aun tumores transformados que
no desarrollan y en algunos casos entran en re
gresin.
Toda la secuencia de eventos que tiene lugar
durante el proceso de formacin de un tumor es
consecuencia de cambios producidos a nivel
gentico, sin em bargo la expresin gentica
puede estar influenciada por el husped.
El descubrimiento de que los oncogenes de
virus productores de tumores estn relaciona
dos con protooncogenes que se encuentran en
clulas normales y tumorales llev a investigar
la relacin entre estos genes y el crecimiento
de las clulas normales y tumorales. Estos ge
nes han sido locahzados en ciertos crom oso
mas especficos y en algunos casos en sitios de
aberraciones cromosmicas.
A ctualm ente se especula si la in iciacin,
progresin y mantenimiento de algunos tum o
res depende de una sobre-expresin a travs de
la amplificacin gnica, de la expresin inade
cuada (por ejemplo en el tiempo incorrecto) de
genes normales, o si es necesario que existan

665

m utaciones en una regin crtica de un gen.

Una hiptesis probable sugiere que la m utacin
sera necesaria para la etapa de iniciacin pero
las otras etapas dependeran de una expresin
inadecuada o de una sobre-expresin gentica.
Se ha postulado que seran necesarias p o r lo
menos dos mutaciones diferentes para que los
tumores se puedan desarrollar. En el caso de las
predisposiciones genticas (familiares) la p ri
mera mutacin estara presente en la lnea ger
minal (esperma u vulo) y de esta forma sera
heredada. Slo se necesitara otra mutacin. En
los otros casos seran necesarias dos mutaciones
en la misma clula y, por consiguiente, las pro
babilidades de que esto ocurra son menores.
Actualmente se cree que estos cambios deben
tener lugar en el mismo sitio en cada uno de los
pares de cromosomas homlogos y en algunos
casos ya se ha identificado el cromosoma.
Una hiptesis interesante aplicable a ciertos
tumores es que los genes alterados o delecionados producen normalmente una sustancia que
suprime la expresin de los factores transfor
madores del crecimiento por otro par de genes.
De esta forma, se utiliza el trmino anti-oncogenes para denominar las secuencias de ADN
(genes) que actan como supresores de la m a
lignidad.
RESPUESTA INMUNE ANTI-TUM ORAL
La respuesta inmune inducida por antgenos
tumorales es esencialmente similar a la obteni
da con antgenos de trasplante o antgenos glucoproteicos. La activacin de los linfocitos T
(LT) implica la participacin de LT colabora
dores, LT citotxicos y LT supresores.
Los LT citotxicos reconocen al antgeno tu
moral asociado a antgenos del CMH de clase
1. Este proceso requiere la activacin de L T co
laboradores y la produccin de linfoquinas que
son fundam entales para la activacin d e los
macrfagos, clulas NK y clulas LAK (lymphocyte activated killer).
Durante este proceso se liberan fundam ental
mente las siguientes citoquinas:
a) Interleuquina I ( IL-1): esta citoquina es
indispensable para la proliferacin de los LT y
para la diferenciacin de los LB en clu las
plasmticas. Tambin es importante en la am
plificacin de las clulas NK y en la produc
cin de clulas LAK a partir de las clulas pre
cursoras. Estas ltimas son capaces de destruir
clulas de una amplia variedad de tumores.
b) Factor inhibitorio de la migracin de ma
crfagos (MIE): tiene la funcin de atraer los
macrfagos prximos al sitio donde est el tu
mor. Este factor se une a los receptores presen
tes sobre la membrana de los macrfagos y au
menta los niveles de AMP cclico intercelula

666

Inmunopatologa

res, hecho que produce la poUmerizacin de los

microtbulos y disminuye la migracin.
c) Interferones (INFs): El interfern gamma
es el inmunomodulador ms potente. Los INFs
aumentan la eitotoxicidad de las clulas NK y
aumentan la expresin de antgenos del CMH
de clase I y II sobre la superficie celular. Tam
bin producen activacin de los m acrfagos
aumentando su actividad tumoricida.
d) Linfotoxina (LT): esta linfoquina es capaz
de lisar ciertas clulas tumorales in vitro y es ci
totxica cuando se la inocula in situ en un tu
mor. No se conoce su funcin in vivo.
e) Factores quimiotcticos: reclutan clulas
fagocticas hacia el sitio tumoral.
f) Factores mitognicos; estimulan a los lin
focitos aumentando su actividad.
Funcin de los antgenos del CMH
en la inmunidad anti-tumoral
La expresin de antgenos del CMH sobre
las clulas tumorales puede ser importante para
el reconocimiento antignico y posterior des
truccin de las clulas tumorales. ste es el ca
so de los LT que son necesarios para la res
puesta anti-tumoral, ya que stos slo pueden
reconocer al antgeno dentro del contexto de
las molculas del CMH propias. Sin embargo,
no existe una correlacin entre la expresin de
estos antgenos y la inmunogenicidad de los tu
mores. Por ejemplo, los tumores metastticos,
que presumiblemente han evadido la accin del
sistema inmune, expresan dichos antgenos en
forma similar a los tumores no metastticos.
En animales endocriados la resistencia a la
induccin de neoplasmas inducida por virus tu
morales se correlaciona generalmente con cier
tos haplotipos de genes del CMFI. Por ejemplo,
algunos virus ARN de tumores murinos indu
cen tumores slo en ciertas cepas endocriadas
de ratones. Este hecho sugiere que es necesaria
la expresin de ciertos alelos del CMH para
poder inducir una respuesta inmune, la que ser
altamente especfica para una protena viral de
terminada. Si el pptido inmunodominante de
esa protena se une a un alelo particular de ant
genos de clase I, este pptido ser inmunogni
co en las cepas de ratones que expresan dicho
alelo. De esta forma, slo ciertas cepas endo
criadas de ratones sern capaces de generar una
respuesta inmune efectiva contra los tumores
que expresan ese antgeno viral.
M ecanismos efectores
en la inmunidad anti-tumoral
Los antgenos tum orales inducen una res
puesta inm une hum oral y celu la r in vivo y
ex isten vario s m ecanism o s in m u n o l g ico s

efectores capaces de lisar clulas tumorales in

vitro. Es importante determinar si alguno de es
tos mecanismos efectores es capaz de inducir
una respuesta inmune efectiva contra los tumo
res de origen espontneo. Estos m ecanism os
pueden ser:
1) Mediados por anticuerpos. Los animales
portadores de tumor son capaces de generar an
ticuerpos especficos contra los antgenos tu
morales. Los antgenos que generan estas res
puestas son protenas que no se expresan sobre
tejidos normales, por consiguiente no han indu
cido tolerancia inmunolgica.
Los pacientes con linfomas asociados al vi
rus de Epstein Barr poseen anticuerpos contra
antgenos codificados por el virus, cjue se ex
presan sobre la superficie tumoral. Ciertos pa
cientes con cncer producen anticuerpos contra
sus propios tumores que pueden ser utilizados
para realizar una tipificacin in vitro , para
identificar antgenos tumorales. Sin embargo,
no existe una evidencia clara sobre la funcin
que cumple esta respuesta inmune humoral pa
ra controlar el crecimiento del tumor.
Una gran variedad de clulas tumorales pue
den ser hsadas in vitro por mecanismos media
dos por anticuerpos. n condiciones experi
mentales generalmente los anticuerpos contra
los antgenos tumorales son generados en otras
especies animales y su actividad tumoricida es
mediada por activacin del complemento o por
e ito to x ic id a d d e p e n d ie n te de a n tic u e rp o s
(ADCC), va receptores Fe presentes en macr
fagos o en clulas NK.
2) Mediados por linfocitos T. Los linfocitos
T citotxicos (LTc) proporcionan inm unidad
anti-tumoral in vivo. En estos casos las clulas
efectoras son predom inantemente LTc CD8^,
restringidos por antgenos del CMH de clase I
y actan en forma similar a los LTc aloreactivos. Sin embargo, la participacin de estos LTc
en los mecanismos de vigilancia inmunolgica
en los tumores no inducidos por virus es cues
tionable, ya que dichos tum ores no son fre
cuentes en animales deficientes de clulas T ni
en pacientes con su respuesta celular deprimida
por efecto de drogas o por infeccin por el vi
rus HIV.
Por otra parte, los linfocitos perifricos de
pacientes con estadios avanzados de desarrollo
tumoral, incluyendo carcinomas y melanomas,
poseen LTc que son capaces de lisar explantos
de esos tumores extrados de los mismos pa
cientes. Mas an, clulas mononucleares deri
vadas de los infiltrados inflamatorios en tumo
res slidos hum anos, denominados linfocitos
infiltrantes de tumores (TILs), tambin inclu
yen LTc con capacidad de lisar el tum or del
cual provienen. Si bien esta respuesta no pare

Inmunologa tumoral
ce ser efectiva para controlar el crecimiento del
tum or, el aum ento de las respuestas de LTc
puede ser un blanco para la terapia tumoral en
un futuro.
Si bien los LT CD4+ por lo general no son
citotxicos, cumplen una funcin im portante
en la respuesta anti-tumoral ya que proveen las
citoquinas necesarias para que los LTc cum
plan con su funcin. Adems, los LT colabora
dores activados por antgenos tumorales p u e
den secretar TNF e INFy que aumentan la ex
presin de antgenos de clase I sobre la clula
tumoral hacindolos ms sensibles a la hsis por
LTc. Los tumores que expresan antgenos de
clase II podran activar directamente LT cola
boradores CD4+.
3) M ediados p o r elulas n a tu ra l-killer
(NK). Los linfocitos NK pueden ser clulas
efectoras en las respuestas inmunes naturales o
adquiridas frente a ciertos tumores. Para matar
a las clulas blanco utilizan el mismo mecanis
mo ltico que los LTc. Sin embargo, se diferen
cian de stos en que no expresan receptores pa
ra el reconocimiento antignico y son capaces
de lisar a las clulas blanco en forma irrestricta
con respecto a antgenos del CMH. Las clulas
NK son capaces de lisar tanto clulas infectadas
por virus como ciertas lneas tumorales, espe
cialmente tumores hematopoyticos in vitro.
La capacidad tum oricida de las clulas NK
puede ser aumentada por tratamiento con citoquinas, las que incluyen los interferones, factor
de necrosis tumoral (TNF), interleuquina 2 (IL2) e interleuquina 12. De esta manera, su rol en
la defensa anti-tumoral puede depender de la
presencia y estimulacin de linfocitos T y m a
crfagos, ya que son las clulas que producen
estas citoquinas.
Las clulas NK activadas por IL-2 , denomi
nadas LAK, son producidas in vitro por trata
miento de clulas perifricas o LTc de los pa
cientes portadores del tumor con una alta dosis
de IL-2. Las clulas LAK poseen una mayor
capacidad para lisar las clulas tumorales en
forma inespecfica.
4) Mediados por macrfagos. Los macrfa
gos son mediadores celulares potencialm ente
importantes en la inmunidad anti-tumoral. Su
efecto se puede demostrar in vitro ya que los
macrfagos activados Usan preferentemente c
lulas tumorales pero no clulas normales. En
forma semejante a las clulas NK, los macrfa
gos expresan receptores Fe, de esta forma unen
anticuerpos y actan sobre clulas tumorales.
Existen varios mecanismos por los cuales los
macrfagos lisan las clulas tumorales; algunos
son los m ism os que utilizan para matar m i
croorganismos, liberando enzimas lisosomales
y metabolitos oxgeno-reactivos. Los macrfa
gos activados tambin secretan citoquinas co

667

mo el TNF, con capacidad para matar clulas

tum orales pero no clulas normales. El T N F
podra actuar por 2 mecanismos diferentes:
a) La unin del TNF a sus receptores de alta
afinidad es txica para las clulas tumorales.
La toxicidad puede ser debida a la produccin
de radicales libres. Las clulas normales re s
ponden al TNF sintetizando superxido dismutasa, hecho que no haran las clulas tumorales.
b) El TNF podra producir necrosis tumoral
por activacin de ciertas respuestas del h u s
ped.
Vigilancia inmunolgica
El concepto de vigilancia inm unolgica se
origin a principios de siglo cuando Paul Ehrlich postul que las clulas tumorales se origi
naban con mucha frecuencia aunque no rm al
mente eran eliminadas por los mecanismos de
defensa del husped. Esta teora llev a tratar
de demostrar la inmunidad especfica frente a
los tum ores, los que eran trasplantados de un
animal a otro. Como los trasplantes eran recha
zados, este hecho se tom como una evidencia
de inmunidad anti-tumoral. Posteriormente se
demostr que el rechazo no era consecuencia
de una respuesta inmune contra el tumor sino
contra antgenos del complejo mayor de h isto
compatibilidad.
Medio siglo despus, Burnet utiliz el trm i
no vigilancia inmunolgica para definir un es
tado en el cual el sistema inmune celular del
husped poda reconocer y destruir clulas autlogas que expresaban marcadores no propios,
por ejem plo, clulas portadoras de antgenos
tumorales.
En la actualidad, y con el conocimiento de
que realmente los antgenos tumorales existen,
el concepto de vigilancia inmunolgica est en
discusin. Los argumentos a su favor son los
siguientes: 1) muchos tumores expresan antge
nos que inducen reacciones de rechazo, 2) los
anim ales de experim entacin o los pacientes
inm unosuprim idos son ms susceptibles de
contraer cncer, 3) la inmunodeficiencia p ro d u
cida por la edad o por factores genticos est
asociada con una mayor incidencia de ciertos
tum ores malignos, 4) la inm unoestim ulacin
aumenta la resistencia a la induccin de un tu
mor, 5) los tumores primarios generalmente es
tn infiltrados por macrfagos y linfocitos, 6)
en ocasiones se puede encontrar regresin es
pontnea de un tumor, posiblemente m ediada
por reacciones inmunolgicas, 7) los inverte
brados no rechazan aloinjertos ni presentan tu
mores, en cambio los vertebrados s lo hacen.
La m ayor evidencia de la efectividad de este
mecanismo proviene del estudio de tumores in
ducidos por virus ADN, por ejemplo poliom a y

668

Inmunopatologa

SV40. Se argum enta que esto slo refleja un

estado de inmunosupresin contra el virus, pe
ro hay hechos que indican que no es as. En el
caso del virus polioma la respuesta inmune ha
cia el virus no es necesaria ni eficaz para pro
ducir un rechazo, por el contrario, la inmuniza
cin con tumores polioma que no producen vi
rus confiere efectiva proteccin contra tra s
plantes de estos tumores. En el caso del virus
de la inm unodeficiencia hum ana (HIV), ste
infecta LT colaboradores y monocitos. Estos
dos tipos celulares son fundamentales en la ini
ciacin de la respuesta inmune y su destruccin
lleva al sndrome de inmunodeficiencia adqui
rida (SIDA). Los pacientes con SIDA presen
tan una alta incidencia de tumores, particular
mente del sistema linfoide, y frecuentem ente
desarrollan el sarcoma de Kaposi.
Es importante destacar que la vigilancia in
munolgica es slo una forma ms dentro de la
vigilancia constante del husped para evitar el
desarrollo de un tumor.
Mecanismos de escape tumoral
Los mecanismos de escape no invalidan la
vigilancia inmunolgica ya que muchos tum o
res son eliminados sin haber sido detectados.
En otras palabras, los tumores son selecciona
dos por su capacidad para evadir al sistema in
mune.
Los mecanismos de escape estn relaciona
dos con la paradoja central de la inmunologa
tumoral que se pregunta por qu los tumores
que son inm unognicos pueden evadir la va
efectora del sistema inmune. El escape tumoral
tendra lugar cuando el balance entre los facto
res que contribuyen favoreciendo el crecimien
to o la destruccin del tumor se inclina en bene
ficio del tumor. Algunos mecanismos de escape
son tan eficientes que pueden evadir no slo la
respuesta autloga sino tambin la terapia antitumoral.
Si bien muchos tumores son dbilmente in
munognicos, hay otros que son capaces de in
ducir una respuesta inmune. Todava no est
claro cmo hacen las clulas tum orales para
evadir al sistema inmune. Este proceso, que in
volucra los m ecanism os de escape tum oral,
puede ser explicado de diferentes formas:
1) La expresin de los antgenos del CMH
sobre las clulas tumorales podra estar regula
da deficientem ente y as seran incapaces de
formar complejos pptido tumoral-antgeno de
histocompatibilidad, capaces de ser reconocidos
y procesados por el sistema inmune.
2) Ciertos tumores podran ser dbilmente
inmunognicos en un husped porque ste no
expresa apropiadamente los antgenos del CMH

de clase II necesarios para activar clulas CD4+

especficas contra el tumor. La actividad de los
LTc es dependiente de las citoquinas produci
das por estos linfocitos. Si las CPA no infiltran
el tumor adecuadamente, toman y presentan el
antgeno tumoral y activan a los LT colabora
dores, no tendr lugar la correcta diferenciacin
de los LTc con actividad contra el tumor.
3) Aun en el caso de pptidos tumorales re
conocidos por los LT, la falta de coestimuladores sobre las clulas tumorales puede impedir
la activacin de los LT. Muchos tumores deri
van de tejidos que no proveen de coestimuladores para la activacin de los LT colaboradores.
Adems, la activacin de los LTc requiere la
coestimulacin de molculas como B7 que no
se expresan en las clulas tumorales. La p re
sentacin de los antgenos tumorales en ausen
cia se coestimuladores puede inducir tolerancia
perifrica o anergia clonal sobre los LT espec
ficos para el tumor.
4) Un husped puede ser to lerante h acia
ciertos antgenos tumorales porque los ha reco
nocido como propios en la etapa neonatal o
porque las clulas tumorales pueden presentar
sus antgenos en forma tolerognica, por ejem
plo en altas dosis.
5) La cintica del crecimiento tumoral po
dra permitir el establecimiento de tumores re
sistentes al sistema inmune antes de que se de
sarrolle una respuesta inm une efectiva. Este
m eca n ism o de tipo so lap ad o , d en o m in ad o
sneaking through, ha sido estudiado funda
mentalmente en modelos de trasplante de clu
las tumorales. Por ejemplo, la transferencia de
unas pocas clulas tumorales de un animal a
otro puede llevar al establecimiento de un nue
vo tumor, mientras que el trasplante de muchas
clulas tumorales del mismo tumor puede ser
rechazado. Una explicacin posible a esta con
tradiccin podra ser que bajas dosis de antge
no tumoral no seran estimulantes para el siste
ma inmune. Sin embargo, mientras tiene lugar
el crecimiento de estas clulas en el husped
podran ocurrir mutaciones en los antgenos tu
morales lo que disminuira la posibihdad de ser
reconocidas por parte del sistema inmune.
6) La inm unidad anti-tumoral podra traer
como consecuencia una seleccin de clulas tu
morales mutadas que han perdido la expresin
de protenas inmunognicas, especialmente si
estas protenas no son crticas para el fenotipo
maligno del tumor.
7) La prdida de la expresin de antgenos
tumorales de membrana por unin con el anti
cuerpo, proceso denominado modulacin anti
gnica, lleva a una resistencia contra los meca
nismos efectores de la respuesta inmune. La
modulacin antignica es producida por endocitosis o por liberacin de los complejos anti

Inmunologa tumoral
geno-anticuerpo form ados. D e esta m anera,
ciertos anticuerpos no fijadores del com ple
mento unidos a la superficie del tumor podran
proteger a las clulas tumorales del efecto de
otros anticuerpos fijadores de com plem ento
impidiendo la lisis celular.
8) Los antgenos liberados por las clulas
tumorales o complejos antgeno-anticuerpo for
mados con estos antgenos liberados fueron
postulados como factores bloqueadores que in
terferan con la respuesta inmune anti-tumoral.
Este mecanismo an es incierto pero podra in
volucrar el bloqueo de los receptores Fcy de las
clulas NK o la induccin de clulas supresoras
que disminuyen la funcin de los LT colabora
dores especficos.
9) Los antgenos tumorales de superficie po
dran estar ocultos para el sistema inmune debi
do a la presencia de molculas glucoproteicas
constituidas por mucopolisacridos que inclu
yen cido silico en su composicin. Este m e
canismo se denomina enmascaramiento antig
nico y puede ser consecuencia de una sobre-ex
presin de estas molculas por las clulas tu
morales.
10) Podra existir un estado de inmunosupresin inducido por el tumor o por agentes fsi
cos, qum icos o infecciosos que indujeron la
transformacin maligna. Este es el caso del fac
tor |3 transformante del crecimiento {transforming growth factor /J) (TGFp), que es secretado
por varios tumores y que inhibe una amplia ga
ma de funciones de linfocitos y macrfagos.
Antgenos tumorales
Los animales de experimentacin pueden ser
inmunizados con clulas tumorales y la inm u
nidad obtenida es especfica, es decir, dirigida

669

contra el tumor que ha sido utilizado para la in

munizacin y no contra otros tumores relacio
nados. E sta inm unidad puede ser transferida
pasivamente por clulas sensibilizadas y no por
anticuerpos, y est mediada por linfocitos T.
Los antgenos tumorales se pueden clasificar
en dos grandes grupos:
- A quellos que son reconocidos por L T y
pueden inducir el rechazo de tumores trasplan
tados en anim ales previam ente inm unizados
con el tum or. Estos antgenos tum orales son
protenas que han sido procesadas y presenta
das a los LT CD4+ o CD8+ en forma de ppti
dos asociados a antgenos del CMH. Algunos
de estos antgenos son propios y particulares de
determinados tumores, otros son compartidos
por varios, hrcluyen una gran variedad de pro
tenas celulares y virales que se indican en el
cuadro 33-2.
- Otros antgenos tumorales pueden ser de
tectados mediante anticuerpos, que se utilizan
para poner en evidencia la presencia de m ol
culas expresadas sobre la superficie de la clu
la. Estas molculas no necesariamente estim u
lan una respuesta inmune efectiva, pero los an
ticuerpos generados son tiles para el diagns
tico y terapia anti-tumoral.
ANTIGENOS T U M O R A LES
RECONOCIDOS POR LT
Antgenos de trasplante especficos
de tumor (TSTA)
Se han descrito numerosos antgenos de re
chazo caractersticos y particulares de cada tu
mor. No se conoce si estos antgenos estn co
dificados al azar por mltiples genes no rela-

Cuadro 33-2. Antgenos tumorales que estimulan a los L T

Antgenos de trasplante especficos de tum or inducidos
qum icam ente

No existen ejem plos a nivel m olecular

Productos de m utaciones puntuales al azar en genes no in

volucrados en la patogenia del tum or

La m utacin p 9 IA en el m astocitom a m urino

Productos de genes silenciosos que norm alm ente no .se e x

presan en individuos adultos

iVlAGE-]

Productos de oncogenes activados por m utaciones o reo r

denam ientos de genes norm ales

La protena p21ras con una m utacin puntual en el la p o s i

cin 12 , en 10% de los carcinom as hum anos
El producto p210 a partir de reordenam ientos bcr/abl, en las
leucem ias m ielognicas crnicas

Productos m utados de genes supresores de tum or

p53, en m s del 50% de tum ores hum anos

Productos de genes virales en cnceres asociados a virus

A ntgeno S V 40 T
Productos genticos del viru s de papilom a humano E 6 y E7.
Producto gentico EB N A -1, del virus de Epstein-B arr

670

Inmunopatologa

clonados, por una nica familia de genes o por

un nmero restringido de fam ilias genticas.
Las caractersticas generales de estos antgenos
de rechazo son las siguientes;
1. Son especficos para cada tumor y dife
rentes de los de otros tumores aun si comparten
el mismo tipo histolgico, inducidos en el mis
mo rgano o por el mismo carcingeno, en la
misma cepa de ratones y aun en el mismo ra
tn.
2. No se pueden poner en evidencia sobre
clulas normales singeneicas.
3. Se definen por experimentos de trasplante
(rechazo), en animales de experimentacin.
4. Se encuentran predominantemente en tu
mores inducidos por agentes fsicos o qumicos
pero tambin en algunos tumores espontneos
experimentales.
5. No se conoce si son producidos a partir de
la amplificacin clonal de antgenos preexis
tentes, por activacin de genes silenciosos o a
partir de protenas mutantes especficas del tu
mor.
La m ayora de los carcingenos fsicos o
qumicos son mutgenos por lo cual en general
se asume que los antgenos que se expresan en
tumores inducidos por carcingenos son el pro
ducto de genes mutados.

E xperim entalm ente es posible inducir un

sarcoma en un ratn pintando su piel con el
carcingeno qumico metilcolantreno. El tumor
puede ser extrado quirrgicamente y ser intro
ducido en otro ratn de la misma endocra, y el
sarcoma crecer nuevamente, pero la reinocula
cin del mismo sarcoma en el husped original
llevar al rechazo. Por otra parte, si las clulas
del sarcoma se irradian previo a su inoculacin
y se utilizan para inm unizar otro ratn de la
misma cepa, este animal rechazar un trasplan
te posterior de las clulas tumorales originales
viables (fig. 33-1). Sin embargo, no es posible
obtener proteccin contra otros tumores singeneicos similares, hecho que indica que los ant
genos especficos de trasplante son diferentes
en cada tumor. Esto se demostr tambin en los
tumores inducidos por radiacin ultravioleta.
Como los antgenos se detectan por el recha
zo de las clulas tumorales trasplantadas se los
denomina antgenos de rechazo o antgenos de
trasplante. Los experimentos de transferencia
adoptiva demuestran que el rechazo est media
do por linfocitos T citotxicos especficos.
Como se indic anteriormente, una de las ca
ractersticas de estos antgenos es su enorme
diversidad y la especificidad de la respuesta in
mune que inducen, ya que un sarcoma inducido
por metilcolantreno no inducir una respuesta
protectora contra otro sarcoma del mismo tipo.

Ratn con sarcom a MCA

inducido

Ausencia de crecimiento
tumoral (rechazo inmunlgico)

Crecimiento del
tumor

Ausencia de crecim iento

tumoral (rechazo inmunolgico)

F ig. 33-1. P or tratam iento de un ratn con m etilcolantreno se puede inducir el crecim iento de un sarcom a. Si este tum or
se exti'ae quirrgicam ente y se trasplanta en un husped singeneico volver a crecer. El ratn que fue portador dei tum or
rechazar un segundo trasplante hecho con el m ism o tum or. P or inoculacin de clulas m uertas del m ism o tum or en un
husped singeneico tam bin se puede inducir proteccin contra el desafo con clulas viables.

Inmunologa tumoral
ni siquiera en el caso de que ambos se hubieran
originado en el mismo ratn. Pese a que estos
experimentos fueron realizados hace ms de 30
aos, la naturaleza molecular de estos antge
nos es an desconocida.
En 1970 Burnet postul que la individuali
dad de los antgenos de trasplante inducidos
por carcingenos podra ser debida a la ampli
ficacin clonal de clulas que expresan un ant
geno normal particular. De acuerdo a esta hip
tesis, cada precursora de una clula normal en
el husped poseera diferentes antgenos, que
no estaran en cantidad suficiente para ser reco
nocidos por el sistema inmune, aunque podran
ser reconocidos luego de una am plificacin
clonal. Una situacin anloga podra ocurrir
cuando se produce una enfermedad maligna de
origen celular T o B. El idiotipo, presente en
muy pocas clulas normales, no inducira una
respuesta inm une en el husped pero podra
servir como antgeno blanco para clulas tumorales que portan el mismo idiotipo.
Antgenos tumorales codificados
por genes celulares mulantes
La mayor parte de los cnceres humanos son
el resultado de mutaciones producidas por car
cingenos fsicos o qumicos en genes celula
res que controlan el crecimiento normal de las
clulas. Algunas de estas mutaciones pueden
ser consecuencia de un dao en una clula nor
mal que afecta a varios genes al azar. Sin em
bargo, la mayora de las mutaciones represen
tan una desventaja para las clulas tumorales, y
las que se producen cuando se origina un tumor
son altamente seleccionadas, probablemente a
travs de un largo proceso de carcinognesis y
progresin tumoral. Algunas de estas mutacio
nes afectan secuencias de ADN lo que induce
la aparicin de protenas mutadas en el tumor.
Antgenos tumorales codificados
por genes celulares normales
Ciertos genes que estn silenciosos en clu
las normales pueden estar activados en las c
lulas malignas. En consecuencia, podran ex
presarse en el tejido equivocado, en una etapa
inadecuada e inducir una respuesta inm une.
Recientemente se ha descrito que existen LT
citotxicos que reconocen antgenos en m ela
nomas humanos y estn codificados por genes
normales que se expresan slo en las clulas
malignas. El gen MAGE-1 (antgeno de m ela
noma) fue aislado de una lnea celular obtenida
a partir de un melanoma maligno y codifica pa
ra un antgeno que es reconocido por un clon
de LT citotxicos obtenido del paciente porta
dor del melanoma. La protena MAGE-1 se ex

671

presa en el 50% de los melanomas y el 25% de

los carcinomas de mama, y no se detecta en te
jidos normales.
No se ha podido demostrar que la activacin
selectiva de genes norm ales lleve a la ex p re
sin de antgenos especficos de tumor en las
clulas tumorales, y an no existen evidencias
contundentes de que genes silenciosos norm a
les activados especficamente en clulas tum orales codifiquen para antgenos especficos de
tumor.
Antgenos tumorales codificados por
oncogenes o por genes supresores de tumor
Prcticam ente todos los tum ores expresan
genes que son utilizados para el proceso de
transformacin maligna. Algunos de estos g e
nes fueron identificados y generalmente consti
tuyen formas alteradas de genes celulares n o r
males que controlan la proliferacin y diferen
ciacin celular. Los protooncogenes pueden e s
tar alterados por mutaciones puntuales induci
das por carcingenos, por deleciones, o p o r
translocaciones cromosmicas dando origen a
los oncogenes, cuyos productos poseen activi
dad transformante. Las formas alteradas de los
protooncogenes y de los genes supresores de
tumor expresadas por los tumores pueden in d u
cir una respuesta inmune. Estas protenas son
generalm ente molculas intracelulares que se
procesan y presentan como pptidos asociados
a molculas del CMH de clase I, aunque la fa
gocitosis y la liberacin de antgenos tumorales
puede inducir una presentacin asociada a m o
lculas del CMH de clase II.
El anlisis de variantes tum- obtenidas tra
tando lneas tumorales in vitro con un mutgeno demostr que una nica mutacin puntual
en genes expresados por las clulas tumorales
puede generar antgenos de rechazo. A lgunas
de estas mutaciones provocan cambios en a l
gn aminocido, hecho que produce un im pedi
mento del pptido para unirse a molculas del
CMH de clase 1 mientras otras mutaciones p u e
den crear nuevos epitopes. De esta manera, las
m utaciones puntuales que afectan cu alq u ier
gen poseen una buena probabilidad de generar
nuevos antgenos que sern reconocidos por los
LT, hecho que puede ocurrir en ciertos tum ores
humanos.
Protenas codificadas por una mutacin
del oncogn RAS
El potencial tumorignico del protooncogn
RAS puede ser adquirido por mutaciones acti
vantes que tienen lugar en un sitio predecible y
afectan los residuos de aminocidos 12 o 61, y
menos frecuentemente, el residuo 13 de la p ro

672

Inmunopatologa

tena RAS p21. El RAS mutado puede inducir

anticuerpos especficos pero esta protena est
localizada en la membrana de la clula tumoral
y es inaccesible a estos anticuerpos. Sin embar
go, los pptidos originados por clivaje proteoltico se pueden unir a molculas del CMH de
clase II e inducir respuestas colaboradoras. Por
ejemplo, se demostr que clulas T CD4+ hu
manas reconocan una sustitucin de valina por
glicina en la posicin 12 del gen RAS, que es
una de la mutaciones ms frecuentes en cncer
humano.
Protenas codificadas por una mutacin
del gen supresor p53
Las mutaciones en el gen supresor p53 son
las ms comunes encontradas en cncer hum a
no y experimental. La protena p53 se descu
bri mediante un anticuerpo obtenido contra un
sarcoma murino y tambin con otro anticuerpo
contra antgenos del SV40. Esta protena se en
contr en una gran variedad de procesos tumorales pero no fue detectada en clulas embrio
narias adultas no malignas. Actualmente se co
noce que la protena p53, que acta como su
presora del crecimiento celular, est muy poco
expresada en clulas normales y por lo general
no es detectada, mientras que la p53 que se en
cuentra en clulas malignas representa una va
riante mutante de la p53 normal. Los pacientes
elaboran anticuerpos contra las mutantes pero
stos no afectan el curso de la enfermedad. No
se conoce an hasta qu punto las m utantes
pueden ser reconocidas por los LT.
Antgenos tumorales codificados
por virus oncognicos
Tanto los virus ARN como los ADN estn
implicados en el desarrollo de tumores experi
mentales y humanos. Este tipo de tumores con
tiene genomas provirales y generalm ente las
clulas expresan protenas codificadas por el
virus, que son sintetizadas en forma endgena
y pueden ser procesadas junto con molculas
del CMH de clase I previo a ser expresadas so
bre la superficie de la clula tumoral.
Virus ADN con capacidad tumoral
El SV40 y los polioma son virus ADN in
ductores de cncer que codifican protenas fun
cionalmente similares pero antignicamente di
ferentes, ya que son requeridas para la induc
cin y mantenimiento de la transformacin m a
ligna. Estos antgenos de origen viral son com
partidos por todos los tumores inducidos por el
mismo virus independienteniente del tejido o
especie animal. Las protenas se encuentran en

form a intracelular, predom inantemente como

antgenos nucleares, pero los genes que codifi
can para estas protenas son los requeridos para
la expresin de los antgenos de trasplante vi
rus-especfico sobre la superficie de las clulas
reconocidas por los LT citotxicos.
Los antgenos de rechazo son especficos del
tumor en el sentido de que no son expresados
por las clulas normales del husped, no son
codificados por los genes del husped y no es
tn presentes en el virin.
Hace algunos aos se postul que el gen que
codifica para los antgenos de superficie de
SV40 podra codificar tambin para el antgeno
nuclear T. Por transfeccin de porciones trun
cadas no transformadas de este gen se determi
n que los LT citotxicos restringidos por ant
genos del CMH de clase I pueden reconocer
sobre la superficie celular fragmentos procesa
dos provenientes de protenas que inicialmente
estaban localizadas intracelularmente.
Los adenovirus presentan genes tempranos,
denominados EIA y EIB, los que son transcrip
tos no slo durante los estadios tempranos de
replicacin viral sino tambin en las elulas
transformadas. En este ltimo caso estos ant
genos son requeridos para el m antenim iento
del fenotipo transformado.
Existen por lo menos 3 tipos de virus ADN
asociados al cncer humano;
- algunos miembros de la familia de los virus
papiloma estn asociados con el cncer cervi
cal.
- los virus de la hepatitis B estn asociados
con cncer primario de hgado.
- los virus de Epstein Barr se asocian con el
linfoma de Burkitt y con linfomas inmunoblsticos.
Virus ARN con capacidad tumoral
Los virus tumorales ARN de tipo exgeno o
endgeno se integran dentro del ADN del hus
ped. Durante la mayor parte de su ciclo de vida,
los virus exgenos existen y se replican en for
ma de partculas infecciosas capaces de infectar
otras clulas. Contrariamente, los virus endge
nos permanecen como provirus integrados den
tro del genoma del husped y slo producen
partculas infecciosas por efecto de radiaciones
ionizantes, carcingenos qumicos, mutgenos
o inhibidores de la sntesis de protenas.
El ADN genmico de ratones endocriados
contiene alrededor de 50 copias de secuencias
provirales relacionadas con el virus de la leuce
mia murina (MuLV). Estos provirus se pueden
dividir en 3 grandes grupos: virus ectotrpicos,
que se replican en elulas de ratn pero no en
elulas de otras especies; virus xenotrpieos,
que se replican en clulas de otras especies pe

Inmunologa tumoral
ro no en las murinas y virus politrpicos, que
se replican en ambos tipos de clulas. La dife
rencia entre estos virus est en los genes que
codifican para la glucoprotena de envoltura de
70 kD (gp70).
El virus linfotrpico T humano (HTLV-1) es
el tnico virus ARN conocido que est asociado
con un cncer humano, la leucemia T del adul
to. Sin em bargo, estos virus estn asociados
con varios tipos de cncer en animales.
ANTGENOS T U M O R A LES
D ETECTA D O S P O R A NTICUERPOS
Existen antgenos, denominados antgenos
asociados a tumor (TAA), que se expresan so
bre la superficie de diferentes clulas tumorales
y normales por lo cual generalmente no indu
cen una respuesta inmune en el husped porta
dor del tumor. Sin embargo, en algunos casos
se genera un respuesta mediada por anticuerpos
o por clulas T, que no cumple ninguna fun
cin protectora pero es til para el diagnstico
y tratamiento de ciertos tipos de cncer.
Antgenos de diferenciacin
Algunos antgenos expresados sobre las c
lulas tumorales tambin estn expresados sobre
las clulas normales en ciertos estadios de su
diferenciacin, y muchos de ellos pueden ser
considerados como marcadores de diferencia
cin. Como no son especficos del tumor se los
denomina antgenos asociados a tumor y cons
tituyen un variado grupo de glucoprotenas y
glucolpidos.
Pueden estar expresados ampliamente o en
forma restringida sobre un pequeo clon de c
lulas normales y el tiempo en que se expresan
durante el perodo de diferenciacin puede va
riar considerablem ente. Las clulas m alignas
pueden expresar estos antgenos en forma muy
aumentada en relacin a las clulas normales.
La importancia de estos marcadores de dife
renciacin radica en el hecho de que las clulas
malignas generalmente expresan alguno de los
genes caractersticos del tipo celular normal del
que se originaron, lo que puede ayudar a deter
minar el tipo celular que di origen a la patolo
ga. Por ejem plo, los tumores de linfocitos B
expresan inmunoglobulinas de superficie y las
leucemias de linfocitos T pueden ser mediadas
por LT colaboradores o supresores. Esta dife
renciacin es importante ya que los diferentes
subtipos de tumor pueden tener diferente prog
nosis y pueden ser susceptibles de diferentes
terapias. Los marcadores de diferenciacin son
tiles particularmente para clasificar los tum o
res hematopoyticos.

673

Antgenos embrionarios y fetales

Hace 50 aos se encontr que ciertas clulas
tum orales humanas expresaban antgenos que
daban reacciones cruzadas con antgenos de te
jido embrionario normal. Esto se atribuy a un
proceso de retrodiferenciacin, ya que la prdi
da de un fenotipo de diferenciacin general
mente se asocia con la aparicin de antgenos
que fueron expresados en altos niveles en clu
las fetales embrionarias. Si la reexpresin de
antgenos embrionarios tiene lugar como con
secuencia de la transformacin maligna, podra
llevar a la activacin o desrepresin de genes
que se m antienen silenciosos en las clulas
adultas, pero activos en las clulas em briona
rias y fetales. Alternativamente, los antgenos
em brionarios o fetales se expresaran en las
stem cells o clulas indiferenciadas norm ales
del tejido adulto pero no en las progenies ms
m aduras, o por lo menos no en niveles altos;
por consiguiente los tum ores representaran
una amplificacin e inmortalizacin de las stem
cells originales.
Sin embargo, no hay evidencias convincen
tes de que las clulas tumorales reexpresen an
tgenos fetales o embrionarios u otros m arcado
res de etapas tempranas de diferenciacin, co
mo consecuencia de su transformacin en clu
las malignas.
U no de los marcadores tumorales em briona
rios mejor estudiados es el antgeno carcinoembrionario (CEA). Este fue descubierto com o un
antgeno especfico de tumor en el carcinoma
de colon humano, y est presente como antge
no fetal en intestino, pncreas e hgado durante
los 6 primeros meses de la gestacin. A ctual
m ente se conoce que el CEA tambin se en
cuentra en bajos niveles en tejidos no malignos
como la mucosa de colon, pulmones y tejido
mamario.
Inicialmente se pens que el CEA podra ser
utilizado como marcador para la deteccin pre
coz de enfermedades gastrointestinales, pero se
han encontrado elevados niveles de C E A en
otras enfermedades malignas como el cncer
de pulm n y de mama.
A pesar de que los niveles sricos de CEA
no son tiles para el diagnstico preco z del
cncer, pueden ser utilizados para monitorear
los efectos de la terapia anti tumoral.
La alfa fetoprotena es otro ejemplo de una
protena embrionaria o fetal que es producida
por el hgado fetal y por clulas del saco vitelino y est presente en pequeas concentraciones
en el suero de individuos adultos normales. Se
encuentra elevada en pacientes con cncer de
hgado as como en pacientes con enferm eda
des hepticas no malignas. En forma sim ilar al
CEA, los niveles de alfa fetoprotena no pue

674

Inmunopatologa

den ser utilizados para un diagnstico precoz

del cncer. Sin embargo, se utilizan para la de
teccin del cncer de hgado primario en un es
tadio precoz y para el monitoreo de los pacien
tes luego de la terapia.
Antgenos clnales
Se expresan nicamente en unas pocas clu
las normales, posiblemente slo en el clon ce
lular a partir del cual se origin el tumor. Por
ejemplo, en el idiotipo de la inmunoglobulina
de superficie en una clula B maligna. En este
caso particular, la inmunizacin de ratones con
la protena del mieloma induce una inmunidad
de trasplante anti-idiotipo dbil contra el mie
loma que expresa ese idiotipo.
Los antgenos clnales se expresan solamen
te en idiotipos de LT y LB.
Antgenos tumorales humanos
Se han realizado num erosos intentos para
utilizar los anticuerpos para detectar neo-antgenos en tumores humanos. Una nica muta
cin en una clula puede llevar a la expresin
de un antgeno nuevo, un antgeno especfico
de tumor, que es capaz de inducir una respuesta
inmune pero de utilidad restringida, ya que ese
antgeno es individual y no se encuentra en
otros tumores.
Cuando se desarrollaron los mtodos de pro
duccin de anticuerpos monoclonales se pens
que stos proporcionaran la forma de diferen
ciar las clulas normales de las tumorales. Se
han podido producir anticuerpos monoclonales
contra un antgeno asociado al tumor en la leu
cemia linfoblstica aguda (CALLA), denomi
nado actualmente CDIO. Estos anticuerpos per
mitieron observar que algunas clulas normales
de mdula sea tambin posean este antgeno.
Posteriormente se determin que el CDIO es un
antgeno de diferenciacin que se expresa nor
m alm ente en linfocitos pre-B. Pero desde el

punto de vista de diagnstico y tratamiento el

CALLA es til. Las clulas CALLA' no se en
cuentran generalmente en mdula sea (<1%)
ni en sangre perifrica, por consiguiente, pue
den ser marcadores de enfermedad. Adems,
como el antgeno CALLA no est presente en
las clulas pluripotentes de mdula sea es po
sible eliminar las clulas CALLA' de la mdu
la sea, mediante el empleo de anticuerpos m o
noclonales dirigidos contra este antgeno, sin
daar su capacidad para regenerar el sistema
hematopoytico. Otros antgenos de diferencia
cin pueden proporcionar posibilidades simila
res.
Uno de los tumores ms estudiados, desde el
punto de vista de los antgenos que expresa, es
el melanoma. Se conocen aproximadamente 40
antgenos definidos por anticuerpos monoclo
nales en estos tum ores. Ninguno de ellos es
realmente un antgeno asociado a tumor y se
han descrito por lo menos 6 categoras diferen
tes entre ellos, las que se detallan en el cuadro
33-3.
La expresin de, por lo menos, alguno de es
tos antgenos podra influir en el com porta
miento de las clulas tumorales. Por ejemplo,
el aumento de los receptores para factores de
crecimiento puede llevar al crecim iento des
con tro lad o , y la p roduccin o d istrib u ci n
anormal de molculas de adhesin influenciar
la capacidad de las clulas para dar metstasis.
Por consiguiente, anticuerpos m onoclonales
contra estas molculas podran ser utilizados en
inmunoterapia ya que estos antgenos se expre
san en forma aumentada en las clulas tumora
les pero su expresin es mnima en clulas nor
males.
TERAPIA ANTI-TUMORAL
La terapia anti-tumoral se utiliza para esti
mular al sistema inmune contra los antgenos
tumorales. Se puede llevar a cabo de diferentes
formas:

C uadro 33-3. Distribucin y caractersticas de antgenos de meianoma

Antgenos

D istribucin y caractersticas

A ntgenos del com plejo m ayor de histocom patibilidad

L os m elanom as expresan generalm ente antgenos de clase ] y II

A ntgenos de pigm entacin

S on intracelulares, a veces poseen valor diagnstico

R eceptores para factores de crecim iento

R eceptores para EG F, T G F a , T G F P, N G F y FG F

M olculas de adhesin

Protoglicanos, glanglisidos, m olculas de adhesin asociadas a

m elanom as

Protenas de transporte

M etalotransferrina, S-100 Ca hinding protein

Protenas de la m atriz extracelular

L am inina y colgeno

Inmunologa tumoral
1) Por estimulacin activa, actuando direc
tamente sobre el sistema inmune del husped.
2) Por inmunoterapia adoptiva, transfiriendo
clulas inmunocompetentes de un individuo a
otro.
3) Utilizando inmunoterapia pasiva, por ad
ministracin de anticuerpos monoclonales con
tra antgenos especficos del tumor con el obje
to de focalizar los blancos para los agentes
citotxicos.
4) En el caso de trasplantes de mdula sea,
en pacientes leucmicos que han sido som eti
dos a radiaciones, para deplecionar la mdula
sea de clulas tumorales (autotrasplante), o de
LT maduros (trasplante alogeneico).
Estimulacin de m ecanism os efectores
Se han utilizado varios tipos de tratamiento
en la inm unoterapia de tumores ya estableci
dos. La estimulacin inespecfica con los deno
minados modificadores de la respuesta biol
gica, por ejemplo el bacilo de Calmette-Gurin (BCG), los INFs o la IL-2 han sido amplia
mente empleados. La estim ulacin con BCG
fue utilizada por su efecto estimulatorio sobre
los macrfagos y se demostr que prolonga la
sobrevida de nios con leucem ia linfoctica
aguda y de adultos con leucem ia m ieloctica
aguda. No es efectivo en el tratamiento de pa
cientes con tumores slidos pero la inoculacin
intra-lesional de BCG puede inducir una regre
sin de ciertas lesiones producidas por el melanoma. En forma similar, la inoculacin intravesical con el bacilo de Calmette-Guerin se est
utilizando con xito en el cncer de vejiga. Los
mecanismos anti-tumorales involucrados en es
ta terapia estaran mediados por LT citotxicos
e sp e c fic o s, e ito to x ic id a d n o -re stric ta p o r
CMH, liberacin de citoquinas y efectos anti
proliferativos del bacilo per se.
Inmunizacin a c t iv a
Los intentos de vacunacin en animales de
experimentacin a efectos de inducir una resis
tencia hacia el tumor han tenido poco xito y
en ciertas circunstancias, por ejemplo con tu
mores inducidos qum icam ente, la inm uniza
cin con estas clulas tumorales irradiadas pre
vio al trasplante con las clulas tumorales via
bles puede llevar a una facilitacin del creci
miento tumoral por induccin de anticuerpos
de bloqueo. En algunos casos particulares, por
ejemplo en la vacunacin con el virus de la he
patitis B, se encontr que este tratamiento re
duce la incidencia del hepatoma primario.
Actualmente se est investigando la posibili
dad de introducir ciertos genes dentro de las
clulas tumorales, hecho que las convertira en

675

ms inmunognicas y, adems, tratar de identi

ficar los antgenos reconocidos por los LT.
Se sabe que las clulas tumorales expresan
antgenos que pueden inducir respuestas m e
diadas por linfocitos T. Tambin se conoce que
las clulas tumorales son malas presentadoras
de antgenos ya que no proveen la segunda se
al necesaria para la activacin de los LT. En
la figura 33-2 se esquematizan los com ponen
tes indispensables para activar una respuesta
citotxica mediada por LT. No es suficiente
que los LT CD8+ reconozcan un pptido prove
niente de un antgeno tumoral presentado den
tro del contexto de antgenos del CMH de clase
I para que se active eficientemente la respuesta
inmune. Es necesario adems una segunda se
al dada por las linfoquinas producidas p o r LT
CD4+. Para producir linfoquinas estas clulas
necesitan reconocer grupos separados de ppti
dos antignicos presentados dentro del contex
to de molculas de clase II expresadas sobre
clulas presentadoras de antgenos tales como
los macrfagos y las clulas dendrticas. Estas
clulas endocitan los antgenos desde el exte
rior y los colocan en el compartimiento endosom al/lisosom al donde son degradados; los
pptidos resultantes se asocian a molculas de
clase II.
Actualmente se conoce que lo que caracteri
za a una clula presentadora de antgeno profe
sional es la expresin de molculas coestimulatorias, del tipo de B7, que se unen a receptores
cjue se expresan sobre las clulas T, tales como
el CD28, y esto ocurre en forma concomitante
con el reconocimiento antignico mediado por
el receptor T. Dicho reconocimiento en ausen
cia de a seal coestimulatoria puede llevar a la
anergia celular, responsable de la tolerancia
contra antgenos propios expresada en la peri
feria. Segn el esquema de la figura 33-2 la fal
ta de respuesta inmune contra un antgeno tu
moral puede ser debida no slo a la falta de an
tgenos especficos de tumor o de LT CD8+ ca
paces de reconocerlos sino tambin a un defec
to en la rama colaboradora de la respuesta in
mune, ya que sin produccin de las citoquinas
apropiadas no se producir la activacin de los
LT citotxicos.
Las citoquinas regulan la reactividad de las
clulas involucradas en la respuesta inm une y
controlan los procesos de maduracin, activa
cin y migracin de clulas que participan de
la inflamacin. Investigaciones llevadas a cabo
en modelos animales demostraron que la provi
sin local de ciertas citoquinas, realizada por
inoculacin directa o por terapia gnica, puede
inducir una fuerte respuesta inmune que puede
llegar a la inhibicin del crecimiento tumoral.
Recientemente se ha demostrado que, si se
transfectan genes que codifican para citoquinas

676

Inmunopatologa

E FEC TO C O LA B O R A TIV O

EFEC TO C ITO T X IC O
A ntgeno tum oral
con restriccin para
CIVIH-II (va exoctica/endosm ica

Clula tumoral

A ntgeno tum oral con

restriccin
CMF)-I
>11 u u i u i I para
p a l a \-/ivii
i" i
(va endoctica)
M a c r fa g o
.

v ^ ^^ A n tig e n o /

A ntg e n o/
CiVIH-clase

jfe"*' CM FI-clase i

.RCT

Linfoquinas
Linfocito T
C itotxico (Te) CD8+

Linfocito T
C olaborador (Th) CD4+

Fig. 33-2. P ara que los LT citotxicos especficos de tum or restrictos por antgenos del C M H de clase I se activen deben
recibir por lo m enos dos seales, la prim era est dada por el reconocim iento antignico m ediado por el receptor T (R CT) y
la segunda por la liberacin de linfoquinas p or los L T colaboradores, los que deben ser previam ente activados va p resen
tacin del pptido tum oral por una clula presentadora de antgeno profesional, dentro del contexto de antgenos del C M H
de clase II. Estas C PA profesionales expresan en su m em brana m olculas com o B7, capaces de enviar seales coestim ulatorias unindose a receptores (CD 28) expresados sobre los L T colaboradores.

o para sustancias coestimuladoras dentro de las

clulas tumorales, y estas clulas son reinyectadas en el husped de donde se extrajeron, se
induce una buena respuesta inmune. Por ejem
plo, cuando se transfectan los genes para IL-2,
IL-4, IL-6, IL-7, F N T a, INFy o GM -CSF en
tumores de ratn, stos regresan. En algunos
casos se acumulan infiltrados inflamatorios al
rededor de los tumores que secretan las citoquinas, y el tipo celular del infiltrado vara con
la citoquina. Esto es importante ya que en fun
cin del infiltrado celular y las citoquinas libe
radas se pueden cumplir diferentes funciones
efectoras y accesorias necesarias para una bue
na activacin de los LT aum entando las res
puestas especficas de los LT contra los antge
nos tumorales.
Se han llevado a cabo investigaciones utili
zando linfocitos infiltrantes de tum or (TILs)
provenientes de pacientes con melanoma, los
que han sido transfectados con el gen para el
F N T a y tambin para IL-2, con el objeto de
aumentar la inmunorreactividad hacia las clu
las tumorales, evitando la toxicidad que produ
ce la administracin sistmica de estas drogas.
Por transfeccin de clulas tumorales con el
gen para la IL-7 se facilita el rechazo tumoral
por un mecanismo que involucra la expansin
de LT CD8+, generacin de LT citotxicos y

generacin de clulas LAK por parte de las c

lulas CD8+ y NK. En algunos tumores los LT
CD4+ y los macrfagos podran ser importan
tes inhibiendo el crecimiento va reaccin de
hipersensibilidad retardada.
Por transfeccin del gen que codifica para la
molcula coestimulatoria B7 se puede obtener
una respuesta anti-tumoral mucho ms efecti
va. Las clulas tumorales que expresan B7 son
rechazadas en el husped singeneico mientras
que las clulas tumorales originales no lo son.
Adems, la expresin de B7 en las clulas tu
morales induce inmunidad hacia las clulas tu
morales originales inoculadas en otro sitio dis
tante del inicial.
La identificacin de genes que codifican p a
ra antgenos especficos de tumor reconocidos
por LT citotxicos proporcion las bases para
la introduccin de grandes cantidades de ant
geno en las clulas tumorales, uniendo los ge
nes que codifican para los antgenos con pro
motores activos, transfectando estas construc
ciones (constructs) en las clulas tum orales
del husped u otros tipos celulares in vivo y
reintroduciendo las clulas transfectadas en el
paciente. Alternativamente, las vacunas de v i
rus vaccinia recombinantes con insertos de ge
nes de antgenos tumorales pueden ser utiliza
das para aum entar la expresin de antgenos

Inmunologa tumoral
tum orales en el paciente. P or otra parte, los
antgenos tum orales com partidos por varios
tumores, como el MAGE-1 en los melanomas
o la protena ras m utada en la posicin 12,
pueden ser potencialm ente buenos inm unge
nos. Utilizando la reaccin en cadena de la po
limerasa (PCR) es posible determinar si un p a
ciente expresa un antgeno tumoral por detec
cin del gen mutado, y se podra emplear la ti
pificacin de antgenos del CMH para eviden
ciar si un paciente puede expresar molculas
que se unen al pptido inm unodominante de
ese antgeno.
In m u n o terap ia pasiva
Se estn utilizando variados y diferentes m
todos en la terapia con anticuerpos con el fin de
inducir una regresin tumoral o prevenir su re
currencia. Los ms utilizados son:
1) Anticuerpos anti-idiotipo. Han sido utili
zados en el tratamiento de linfomas B que ex
presan inmunoglobulinas de superficie con es
pecificidad frente a idiotipos particulares. El
idiotipo sera un antgeno tum oral altam ente
especfico, ya que se expresa slo en el clon de
clulas B neoplsicas y no en otras clulas. La
unin del anticuerpo anti-idiotipo, capaz de ac
tivar el com plemento o la citotoxicidad anticuerpo-dependiente (ADCC) producira la des
truccin de las clulas tumorales. Sin embargo,
este tratamiento no siempre acta en forma sa
tisfactoria.
2) A nticuerpos dirigidos contra receptores
de factores de crecimiento (receptor de lL-2).
Han sido utilizados en terapia experimental en
linfomas T humanos incluidos las leucemias y
linfomas asociados al virus HIV. Esta terapia
se basa en el hecho de que la IL-2 estimulara
el crecimiento de las clulas tumorales que ex
presan el receptor de IL-2. Los anticuerpos anti-receptor podran modular o bloquear dichos
receptores, de esta manera se impedira la acti
vacin celular. A lternativam ente, estos an ti
cuerpos m onoclonales podran producir lisis
mediada por complemento de las clulas tumorales que expresan el receptor de lL-2. La tera
pia con anticuerpos anti receptor de IL-2 no es
especfica y podra llegar a producir inmunosupresin ya que tambin actuara sobre los LT
norm ales activados transform ndolos en nofuncionales.
3) Anticuerpos especficos para un producto
inducido por un oncogn. Estos seran poten
cialmente capaces de inhibir el crecimiento tu
moral si el producto del oncogen fuera esencial
para el fenotipo transform ado. A nticuerpos
monoclonales contra la protena de superficie
inducida por el oncogn nen inducen la rever

677

sin del fenotipo nen-transformado a no-trans

formado in vitro y los mismos anticuerpos son
capaces de inhibir el crecimiento del tum or en
ratones.
4) Anticuerpos anti-tumor copulados a toxi
nas o drogas. Ciertas toxinas, por ejemplo rici
no o la toxina diftrica, son potentes inhibido
res de la sntesis proteica. Unidos covalente
mente a anticuerpos monoclonales pueden ser
utilizados en nfimas dosis y pueden ser dirigi
dos hacia el blanco deseado (la clula tumoral),
actuando como inm unotoxinas: Este m ism o
principio puede ser utilizado con ciertas drogas
antineoplsicas o con radioistopos con accin
citocida que podran actuar unidos covalente
mente a anticuerpos especficos. Estas m etodo
logas requieren de dos requisitos para que la
terapia resulte exitosa: a) la especificidad del
anticuerpo debe ser tal que sea capaz de unirse
slo a clulas tumorales pero no normales. Co
mo ya ha sido descrito previam ente, esto es
muy difcil de lograr; b) es difcil de prever y
asegurar que el anticuerpo llegar realmente en
una concentracin suficiente a la clula blanco
antes de ser eliminado por las clulas fagocticas a travs de sus receptores Fe. Si esto suce
de se reduce la efectividad de la terapia aunque
la utilizacin de (F ab )^ conjugado a toxinas
puede minimizar este problema.
5) Anticuerpos heteroconjugados. En este ca
so, un anticuerpo especfico hacia un antgeno
tumoral se une covalentemente a otro anticuerpo
con especificidad contra una protena de superfi
cie presente en una clula efectora citotxica,
por ejemplo NK o linfocitos T citolticos ( LTc).
Estos heteroconjugados favorecen la unin de
dichas clulas hacia las clulas tumorales blanco
apropiadas, por ejemplo un anticuerpo anti-CD3
unido a un anticuerpo contra una protena de su
perficie del tumor favorecer la lisis de las clu
las tumorales mediadas por LTc.
6) Conjugados de anticuerpos y hormonas.
Pueden ser utilizados para dirigir LTc hacia las
clulas tumorales que expresan receptores para
dicha hormona. Por ejemplo anticuerpos antiCD3 unidos a la hormona estimulante de melanocitos aumentan la destruccin in vivo , m e
diada por LTc, de clulas de melanoma hum a
no con receptores para la hormona.
7) Deplecin in vitro de clulas tum orales
de mdula sea por lisis mediada por anticuer
pos y complemento. Este tratamiento se utiliza
en pacientes con linfoma B que reciben un tras
plante antologo de mdula sea. En estos casos
se toman clulas de mdula sea del paciente y
se somete a ste a una dosis de radiacin y qui
mioterapia para destruir sus clulas tumorales.
Por supuesto, tambin son destruidas las clu
las norm ales del individuo. La m dula sea
previamente removida es tratada con anticuer

678

Inmunopatologa

pos monoclonaJes contra los antgenos norma zar para para dirigir una clula o un ligando ha-
les de LB que tambin se expresan en las clu cia la clula tumoral, o para incrementar la es
las del linfoma. Posteriormente se aade com pecificidad y afinidad de interaccin de una c
plem ento para producir la lisis de todas esas lula con su molcula blanco.
clulas. La mdula sea, que de esta manera
fue purgada de las clulas tumorales, se rein- Inmunoterapia celular adoptiva
yecta en el paciente para reconstituir su sistema
hematopoytico destruido por la radiacin y la
Implica la transferencia de clulas en cultivo
quimioterapia.
que pueden reaccionar contra el tumor cuando
8)
Actualmente se estn comenzando a utili son inoculadas en el husped. Esto puede lle
zar nuevas molculas obtenidas por tecnologa varse a cabo de dos formas:
del ADN recombinante. Los anticuerpos huma
nizados y quimricos se utilizan en pruebas cl
a)
Utilizando la terapia con clulas killer ac
nicas y las cadenas Fv de ciertos anticuerpos se tivadas por citoquinas. Este mtodo tiene por
estn evaluando en modelos anim ales. F rag objeto la generacin in vitro de clulas LAK, lo
mentos de cadenas de IgG se pueden fusionar o que se logra por cultivo de leucocitos perifri
conjugar a diferentes molculas de manera tal cos tomados del paciente con tumor en presen
de obtener nuevas funciones efectoras, tal co cia de altas dosis de IL-2. Las clulas LAK ge
mo se esquematiza en la figura 33-3. Es posible neradas (originadas principalmente a partir de
crear m olculas con doble especificidad por las clulas NK) se reinyectan en el paciente.
unin de dos sitios Fv, las que se pueden utili Este tratamiento administrado junto con IL-2

F(ab)2

F ig . 33-3. E sq u em atizaci n de la
e stru ctu ra co m p leta de una m o l
c u la d e Ig G y s u s f r a g m e n to s
F (ab )2, Fab y Fv, lo que es p o si
b le obtener por m todos qum icos
o por recom binacin. Por estos m
todos pueden obtenerse m olculas
b iv a le n t e s b ie s p e c f ic a s |l g G ,
F (ab )2], capaces de unirse al ant
geno tum oral por uno de los sitios
d e c o m b in a c i n y p o r el o tro a
reactivo,s adecuados com o drogas,
to x in as, en zim as, rad io n u cleid o s,
c ito q u in a s , p a r a q u e e je r z a n su
efecto directo sobre la clula tum oral. Estos reactiv o s pueden u nirse
tam bin a fragm entos F ab y Fv por
m to d o s q u m ico s, co n stitu y en d o
reactivos biesp ecfico s en los que
los fragm entos derivados de la m o
l c u la a n tic u e rp o son b iv a le n te s
pero slo tienen un sitio de co m b i
nacin para cada ligando

Inmunologa tumoral

679

tuvo mucho xito en la regresin de tumores los factores estimulantes de colonias granuloslidos en ratones. En seres humanos se est cticos (G-CSF). Se utihzan en inmunoterapia
utilizando actualmente en los casos de tumores contra el cncer si bien no actan aumentando
la respuesta inm une contra los tum ores. Ac
metastticos avanzados.
b)
Mediante terapia con linfocitos infiltra tualm ente, y en form a experim ental, se est
dos en el tumor. La finalidad es la generacin tratando de transfectar las clulas tum orales in
de clulas LAK a partir de clulas mononuclea vitro con los genes de diferentes citoquinas pa
res tomadas del infiltrado inflamatorio que est ra luego trasplantar estas clulas en anim ales
prximo a los tumores slidos. De esta manera portadores del tumor. De esta manera se logra
se enriquece la poblacin de linfocitos TILs la produccin de las citoquinas especficamen
que incluyen a las clulas NK y a los LTc que te en el sitio donde est creciendo el tumor.
son clulas asesinas inespecficas. Este trata Esto se llev a cabo con genes de IL-2, IL-4 e
miento se realiza administrado junto con altas INFy. En todos los casos se logr la inhibicin
dosis de IL-2 y est siendo utilizado actual del crecimiento tumoral. Todava no puede ser
utilizado en humanos porque los resultados ob
mente en seres humanos.
tenidos, si bien alentadores, son muy prelim i
nares.
Terapia con citoquinas
En resumen, los agentes m odificadores de
Esta terapia se fundam enta en el hecho de las respuestas biolgicas pueden ser utilizados
que las citoquinas poseen la capacidad de acti para activar macrfagos y clulas NK. Los an
var las clulas que participan de la respuesta ticuerpos monoclonales dirigidos contra ant
genos tumorales bivalentes o biespecficos y
inmune. Las ms utilizadas son las siguientes;
IL-2. Administrada en altas dosis se utiliza unidos a drogas citotxicas o toxinas tambin
sola o junto con inm unoterapia celular adopti pueden ser buenas armas contra el tum or. Al
va. Este tratamiento es efectivo en inducir re tern ativ am en te, con ju g ad o s de an ticu erp o s
gresin tum oral en 20-40% de pacientes con asociados a enzimas inoculadas en el sitio de
melanoma y carcinoma renal. Presumiblemen crecimiento tumoral podran actuar sobre pre
te la IL-2 acta activando clulas NK y/o LTc cursores de ciertas drogas las que, adm inistra
induciendo la aparicin de clulas LAK in vi das en forma sistmica, producen la liberacin
vo. E ste tr a ta m ie n to p u e d e tra e r e fe c to s del compuesto activo en el sitio correcto y ne
secundarios, fiebre, edema pulmonar, etc. y es cesario.
Es an muy difcil conocer cul o cules de
to es producto de la activacin de otros linfoci
tos los que, a su vez, liberan TNE, INFy y lin- los m todos em pleados tendr ms xito. El
hecho real es que se dispone de una am plia se
fotoxina.
TNF. Se utiliz en pacientes con carcinomas rie de estrategias para contrarrestar el creci
avanzados. Si bien posee un gran efecto anti- miento tumoral. El futuro aclarar cul ser el
turnoral in vitro, produce un efecto txico en mejor tratamiento, segn el tipo de patologa, a
utilizar en la inmunoterapia del cncer.
las dosis necesarias requeridas in vivo.
IN F a. Es producido por leucocitos. Posee
efectos anti-proliferativos in vitro, incrementa
el potencial ltico de las clulas NK y aumenta B IB L IO G R A F A
la expresin de antgenos del CMH de clase I A bbas A .K .. Lichtm an A .H . and P ober LS. (1993). Cellu^
en diferentes tipos celulares. Se lo utiliz y se
lar an d M o lecu lar Im m u n o lo g y . W .B . S au n d ers Comobtuvieron 10-15% de regresiones en carcino
pany. 3rd. Edition.
mas renales, melanomas y sarcoma de Kaposi, B o o n , T ., C ero ttin i, J.C ., V an d en E y n d e, B ., V a n der
B ruggen, P. and V an Pe, A. (1994) Tum or an tig en s re40-50% en linfomas y 80-90% en la leucemia
c o g n ized by T lym pbocytes. A nnu. Rev. Im m u n o l. 12,
vellosa (tumor de tipo B), en la que se lo utiliza
337-365.
actualm ente como citoquina que produce un B urnet, F.M . (1970). T h e concept o f im m u n o lo g ical surveillance. Progress in Exp. T um or Res. 13, 1-27.
efecto confiable.
INFy. Se lo utiliz para el tratamiento de tu Franks, L.M , and Teich, N.M. (1991). Introduction to the.
C ellu lar and M olecular
mores slidos y hem atopoyticos sin m ucho
B io lo g y o f C n c er, 2 n d . E d itio n , O x fo rd U niv er.sity
xito. Se pens que su efecto activante sobre
Press.
los macrfagos y las clulas NK, as como su G eorge, A .J.T., Spooner, R.A. and Epenetos, A .A . (1994).
A pplications of
capacidad para aumentar la expresin de ant
m o n o c lo n al an tib o d ies in clin ic al oncology. Im m u n o l.
genos del CMH favorecera su capacidad para
T oday, 15,559-561.
hacer ms efectiva la inmunidad anti-tumoral H erlyn,M . and K oprow ski, H. (1988). M elanom a antigens:
im m unological and biological characterization an d clini
pero esto no fue as.
cal significance. A nnual Rev. of Im m unol. 6, 283 -3 0 8 .
Factores de crecim iento hem atopoyticos. Jack
so n , A .M . and .lam es, K. (1994). U n d erstan d in g the
Estos incluyen los factores estimulantes de co
m o st successful im m unotherapy fo r cncer. T h e Immulonias granulocito-macrofgicos (GM-CSF) y
nologi.st, 2/6, 208-214.

680

Inmunopatologa

K le in , G ., S jo g re n , H ., K lein E. an d H e lls tro m , K .E.

(1960). D emon,stration o f resistance against m ethylcholanthrene-induced .sarcomas in the prim ary autochtonoiis
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A w ard Lecture. Int. J. C ncer 57, 623-627.
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3rd. Edition.
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te d ly m p h o c y te s. A n n u a l R ev . o f Im m u n o l. 4 , 6 8 1 710.
S c h r e i b e r ,H ., W a rd P .L ., R o w le y D .A . a n d S tr a u s s
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Tonaka, K. Y oshioka T., B ierberich,C . and Jay,G . (1988).
The role o f the m ajor histocom patibility com plex class I
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U rban, J.L. and Schreiber, Fl. (1992). T um or A ntigens. A n
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T oday 14, 253-259.
W aterfield, M .D . (1989). G row th factors. B ritish M edical
Bulletin 45, 541-553.

Inmunologa
de la reproduccin

34

RICARDO MARGNI
ILEANA MALAN BOREL

INTRODUCCION
Los mecanismos que conducen a que el feto,
considerado como un injerto alogeneico, no sea
rechazado por su madre, no estn totalm ente
esclarecidos. Se han propuesto varias hiptesis,
apoyadas en investigaciones cientficas. Los
avances en los ltimos aos de las tcnicas de
biologa molecular y de anticuerpos monoclo
nales, contribuyeron a esclarecer ciertos meca
nismos inm unolgicos involucrados en la re
produccin.
M edewar, en un principio, propuso que el
xito de la preez se deba a que el tero era un
sitio privilegiado, en donde cualquiera sea el
tejido implantado no se produce rechazo. Ms
adelante, y conociendo la importancia que los
antgenos del CMH tienen sobre el rechazo de
injertos, se atribuy a que la placenta, al estar
desprovista de estos antgenos, actuara como
una barrera antignicamente neutra entre el feto
y la madre. Con el avance de las investigacio
nes se postul que durante la preez se produce
una inm unosupresin no especfica local, es
decir, en la unidad feto-placentaria y una inm u
nosupresin no especfica sistmica.
En los rechazos de injertos alogeneicos hu
manos, los linfocitos T desempean una fun
cin importante tanto en el reconocimiento de
los antgenos no propios, como en la citolisis y
destruccin de las clulas que exponen a estos
antgenos. El feto est protegido contra el efec
to de estas clulas citotxicas; los mecanismos
involucrados en este fenmeno sern analiza
dos ms adelante.
El sistema inmune de la madre desempea un
rol fundamental en el mantenimiento de la ges
tacin, existiendo adems una estrecha relacin
entre este sistema y el endocrino. Una buena re

lacin entre ambos, junto con factores placentarios y factores sricos producidos durante la
preez habrn de llevar al xito de la misma.
En el presente captulo, todo cuanto se espe
cule sobre sistema inmune, rganos co m p ro
m etidos y productos sintetizados durante la
preez, est referido a humanos. Cuando se tra
te de otros vertebrados se los identificar espe
cficamente.
PLACENTA
Durante el primer perodo de su desarrollo,
el embrin extrae directamente del endometrio
las sustancias nutritivas y el oxgeno que nece
sita. A medida que se desarrolla, este tipo de
intercambio con el organismo materno se hace
insuficiente. A las nuevas exigencias nutricias
y respiratorias del embrin, responde la form a
cin de un nuevo rgano: la placenta. En la
mujer, sta se desarrolla gradualmente durante
los tres primeros meses de gestacin y al final
del tercer mes est completamente formada.
F orm acin de la placenta
La formacin de la placenta se puede dividir
en dos perodos: a) prevelloso y b) velloso.
a) En el perodo prevelloso el huevo fecunda
do llega al tero donde se implanta en el estadio
de blastocito. El disco embrionario se orienta
hacia la parte profunda del endometrio; una es
pesa capa de trofoblastos lo separa de las clu
las deciduales. Una vez producida la im planta
cin el trofoblasto se diferencia en sincitiotrofo
blasto primitivo, formado por una espesa masa
citoplasm tica sin lmites intercelulares. Este
sincitio emite brotes que, por accin de enzimas

680

Inmunopatologa

K le in , G ., S jo g re n , H ., K lein E. an d H e lls tro m , K .E.

(1960). D em onstration o f resistance against m ethylcholanthrene-induced sarcom as in the prim ary autochtonoiis
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A w ard Lecture. Int. J. C ncer 57, 623-627.
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te d ly m p h o c y te s. A n n u a l R ev . o f Im m u n o l. 4 , 6 8 1 710.
S c h r e i b e r ,H ., W a rd P .L ., R o w le y D .A . a n d S tr a u s s
H .J.(I988). U nique tum or-specific antigens. A nnual Rev.
o f Im m unol. 6 ,3 5 9 -3 8 0 .
Tonaka, K. Y oshioka T., B ierberich,C . and Jay,G . (1988).
The role o f the m ajor histocom patibility com plex class I
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Im m unol. 6, 359-380.
U rban, J.L. and Schreiber, H. (1992). T um or A ntigens. A n
nual Rev, o f Im m unol. 10, 617-644.
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W aterfield, M ,D , (1989), G row th factors, B ritish M edical
Bulletin 45, 541-553,

Inmunologa
de la reproduccin

34

RICARDO MARGNI
ILEANA MALAN BOREL

INTRODUCCION
Los mecanismos que conducen a que el feto,
considerado como un injerto alogeneico, no sea
rechazado por su madre, no estn totalm ente
esclarecidos. Se han propuesto varias hiptesis,
apoyadas en investigaciones cientficas. Los
avances en los ltimos aos de las tcnicas de
biologa molecular y de anticuerpos monoclo
nales, contribuyeron a esclarecer ciertos meca
nismos inm unolgicos involucrados en la re
produccin.
M edewar, en un principio, propuso que el
xito de la preez se deba a que el tero era un
sitio privilegiado, en donde cualquiera sea el
tejido implantado no se produce rechazo. Ms
adelante, y conociendo la importancia que los
antgenos del CMH tienen sobre el rechazo de
injertos, se atribuy a que la placenta, al estar
desprovista de estos antgenos, actuara como
una barrera antignicamente neutra entre el feto
y la madre. Con el avance de las investigacio
nes se postul que durante la preez se produce
una inm unosupresin no especfica local, es
decir, en la unidad feto-placentaria y una inm u
nosupresin no especfica sistmica.
En los rechazos de injertos alogeneicos hu
manos, los linfocitos T desempean una fun
cin importante tanto en el reconocimiento de
los antgenos no propios, como en la citolisis y
destruccin de las clulas que exponen a estos
antgenos. El feto est protegido contra el efec
to de estas clulas citotxicas; los mecanismos
involucrados en este fenmeno sern analiza
dos ms adelante.
El sistema inmune de la madre desempea un
rol fundamental en el mantenimiento de la ges
tacin, existiendo adems una estrecha relacin
entre este sistema y el endocrino. Una buena re

lacin entre ambos, junto con factores placentaros y factores sricos producidos durante la
preez habrn de llevar al xito de la misma.
En el presente captulo, todo cuanto se espe
cule sobre sistema inmune, rganos co m p ro
m etidos y productos sintetizados durante la
preez, est referido a humanos. Cuando se tra
te de otros vertebrados se los identificar espe
cficamente.
PLACENTA
Durante el primer perodo de su desarrollo,
el embrin extrae directamente del endometrio
las sustancias nutritivas y el oxgeno que nece
sita. A medida que se desarrolla, este tipo de
intercambio con el organismo materno se hace
insuficiente. A las nuevas exigencias nutricias
y respiratorias del embrin, responde la form a
cin de un nuevo rgano: la placenta. En la
mujer, sta se desarrolla gradualmente durante
los tres primeros meses de gestacin y al final
del tercer mes est completamente formada.
F orm acin de la placenta
La formacin de la placenta se puede dividir
en dos perodos: a) prevelloso y b) velloso.
a) En el perodo prevelloso el huevo fecunda
do llega al tero donde se implanta en el estadio
de blastocito. El disco embrionario se orienta
hacia la parte profunda del endometrio; una es
pesa capa de trofoblastos lo separa de las clu
las deciduales. Una vez producida la im planta
cin el trofoblasto se diferencia en snctiotrofoblasto primitivo, formado por una espesa masa
citoplasm tica sin lmites intercelulares. Este
sincitio emite brotes que, por accin de enzimas

682

Inmunopatologa

citolticas, destruyen a las clulas deciduales que

Los troncos principales (vellosidades de 1er
los rodean liberando sustancias nutricias para el orden) se subdividen en vellosidades de 2- y de
embrin (glucgeno, lpidos, prtidos, etc). El 3' orden. El conjunto de las ramificaciones de
otro producto de diferenciacin es el citotrofo- rivadas de cada vellosidad de 1er orden consti
hlasto primitivo, situado en la vecindad de la tuyen un cotiledn placentario, separados entre
cavidad corinica y constituido por una capa de s por tabiques que se originan en la decidua.
clulas polidricas. El origen del sincitio y del Cada una de las vellosidades est formada por
citotrofoblasto no se conocen.
un estroma de tejido conectivo, por el que cir
Ms adelante aparecen, en el sincitiotrofo- cula una arteriola y una vnula procedentes de
blasto, numerosas vacuolas o lagunas separa la arteria y de la vena umbilical del feto, y por
das por trabculas formando las cavidades la un revestimiento de sincitiotrofoblastos.
bernticas. Esta capa va perforando los capila
La parte materna de la placenta es la decidua
res del endometrio hasta alcanzar las arteriolas basal, la que en su parte superficial es compac
y las vnulas que lo recorren, penetrando as la ta y en su parte profunda esponjosa debido a la
sangre materna en los espacios [acunares. La presencia de glndulas y vasos venosos. Duran
verdadera circulacin de la sangre por las lagu te el parto la decidua se desprende de la pared
nas trofoblsticas se inicia en la tercera sema uterina (fig. 34-2).
na, cuando las arterias espiraladas del endome
Si se secciona la placenta se puede observar
trio son perforadas. En esta etapa el huevo ha hacia la superficie fetal la placa corial cubierta
penetrado en el endometrio ms profundamente por el lquido amnitico y hacia la superficie
y se completa la anidacin.
materna la placa basal formada por la decidua
b) El perodo velloso se inicia a partir del da y por el epitelio de sincitiotrofoblastos. Entre
13 con una intensa actividad proliferativa del ambas placas se encuentra el espacio interve
trofoblasto. Las trabculas del sincitio toman lloso (fig. 34-2 y 34-3).
un aspecto velloso y hay penetracin de clulas
La placenta ejerce innumerables funciones,
citotrofoblsticas, formndose las vellosidades las que se adaptan a la tarea que aquella debe
primarias. stas, al evolucionar se transforman desarrollar para lograr el mantenimiento del fe
en troncos vellosos que darn origen a los coti to en el tero materno. A travs de la placenta
ledones fetales. Los cotiledones estn formados la sangre venosa del feto cede el COj a la san
por un centro conjuntivo vascular rodeado por gre m aterna y se provee nuevam ente de O^.
un epitelio de citotrofoblastos o capa profunda Tambin hay pasaje de ciertas sustancias nutri
y por un epitelio de sincitiotrofoblastos o capa cias tales como agua, azcares, grasas, amino
superficial.
cidos, sales, vitaminas, etc, fundamentales para
El lugar de implantacin ocupa slo una par la nutricin fetal. La placenta constituye, ade
te del endometrio; a esta zona durante la preez ms, una barrera de proteccin para determina
se la denomina decidua.
dos microrganismos patgenos que pueden en
contrarse en la sangre materna. Por el contra
rio, ciertos virus como los del sarampin, vari
Estructura y funcin
cela y viruela atraviesan la placenta, quedando
La .placenta humana es de tipo hemocorial, el feto expuesto a los mismos.
esto significa que las clulas trofoblsticas es
La placenta humana y de algunos vertebrados
tn en contacto directo con la sangre materna.
permite el pasaje de anticuerpos producidos por
En un embarazo de trmino, la placenta hu el sistema inmune de la madre. En el hombre
mana, cuando est completamente desarrollada los anticuerpos de tipo IgG son los que atravie
es de tipo circular, esponjosa, con un dimetro san la placenta otorgando proteccin fetal, ya
de alrededor de 20 cm, un espesor de 2 cm y su que el feto todava no es capaz de producirlos.
peso oscila entre 500 y 600 g. El cordn umbi
La placenta secreta varias hormonas como
lical se inserta en la cara que enfrenta al feto y son la gonadotrofina corinica, estrgenos,
por transparencia se pueden ver los vasos san progesterona, las que son volcadas al torrente
guneos distribuidos en forma de estrella a par circulatorio materno. La placenta secreta tam
tir de su punto de insercin (fig. 34-1).
bin factores moduladores de la respuesta in
E st constituida por una parte fetal y una mune a los que se les atribuye una funcin pri
parte materna. La parte feta! est formada por mordial en el mantenimiento del feto en el te
las vellosidades crlales que se han desarrolla ro materno.
do y ramificado. Hay dos tipos de vellosidades,
A partir del 7 mes de gestacin la actividad
las fija s que profundizan en la decidua y cuya de la placenta va disminuyendo, la altura de las
funcin sera la de anclar la placenta a la pa vellosidades es menor, el corion degenera en
red uterina, y las libres, ms numerosas, estn algunos puntos y entre el corion y la decidua se
en contacto directo con la sangre materna en van formando depsitos fibrosos. A este proce
las lagunas sanguneas.
so se lo denomina senescencia de la placenta,

Inmunologa de la reproduccin
que anuncia el cese de las funciones placentaria
que terminarn con el parto.
Clulas trofoblsticas: expresin antignica
El feto no se encuentra en contacto directo
con la madre, son las clulas trofoblsticas las
que lo hacen, formando lo que se denomina in
terfase materno-fetal. En ella existen dos reas
de contacto: el sincitiotrofoblasto y el citotro
foblasto. Los sincitiotrofoblastos son las clu
las que recubren las vellosidades corinicas y
por tal razn constituyen la mayor interfase en
tre la madre y el feto, ya que las vellosidades
estn baadas por la sangre materna. Estas c
lulas en los roedores se denominan trofoblastos
labernticos. Los citotrofoblastos invaden a la
decidua endometrial y es aqu donde se ponen
en contacto con las clulas maternas. En los
roedores a estas clulas se las denomina espongiotrofoblastos.
La expresin de los diferentes antgenos en la
placenta ha sido ampliamente estudiada. Dado
que la preez se asemeja a un trasplante aloge
neico, e! mayor nfasis ha sido puesto en una
serie de antgenos codificados por el CMH, res
ponsables de los rechazos de injertos. Con el ob
jeto de ayudar a comprender cmo pueden coe
xistir madre y feto, siendo ambos genticamente
diferentes, es que se han realizado estudios in
munolgicos y moleculares para analizar la ex
presin de los genes que codifican para los ant
genos del HLA de clase I y de clase II en las di
ferentes poblaciones de clulas trofoblsticas.
La regulacin en la expresin de los antgenos
HLA a nivel placentario sera uno de los hechos
ms importantes para el xito de la preez.
Los antgenos HLA clase 1 y clase II clsicos,
indispensables para el desarrollo de la respuesta
inmune humoral y celular, estn ausentes en los
sincitios y en los citotrofoblastos. En el ratn,
las clulas labernticas no expresan molculas
de clase I, mientras que los espongiotrofoblastos
pueden expresar antgenos de clase I (H-2K, H2D) y en algunas cepas se ha encontrado la ex
presin de los antgenos H-2L. Se supone que
estos antgenos, al estar presentes en las clulas
trofoblsticas, actuaran como un inmunoadsor
bente uniendo las molculas de anticuerpos anti
paternos formados en la madre los que se degra
daran ms rpidamente. En la rata la situacin
es semejante a la del ratn, salvo que en los es
pongiotrofoblastos se ha demostrado la expre
sin de un sistema antignico denominado Pal y
Pa2 (pregnancy associated).
En el hombre, los citotrofoblastos expresan
un antgeno denominado HLA-G. Este fue pri
m eram ente identificado como una m olcula
HLA de clase I clsica (A,B,C) ya que reaccio
naba con el anticuerpo monoclonal W6/32. E s

683

te anticuerpo reacciona con una porcin co n

servada de las molculas de clase I clsicas. A
pesar de esta expresin aloantignica los trofo
blastos, in vitro, y por razones no establecidas,
no son destruidos por clulas citotxicas ni por
lisis mediada por complemento. A causa de e s
tos hechos se considera que cum pliran u n a
funcin importante en la proteccin del feto en
el tero materno. Existen diversas sustancias,
tales como INE-y, IL-4, 5-azycytidina (5 Azac)
que tienen la capacidad de inducir la expresin
de los antgenos HLA-II clsicos sobre las c
lulas trofoblsticas. El lEN-y lo hace, por ejem
plo, sobre los espongiotrofoblastos del ratn y
la 5-Azac sobre las clulas labernticas. Otras
sustancias como la a-fetoprotena, son capaces
de inhibir la induccin ejercida por el INE-y so
bre la expresin de esos antgenos.
En 1978 Eaulk y col. observaron la expre
sin en clulas trofoblsticas de un antgeno,
posteriormente descrito en linfocitos por otros
investigadores. A este antgeno se lo denomin
TLX (Trophoblast lymphocytes cross-reactive
antigens). Es un antgeno heterogneo en su
peso molecular (55-65 kD) segn provenga de
diferentes lneas celulares y de distintas prepa
raciones de trofoblastos. Los trofoblastos y lin
focitos de un mismo individuo expresan el m is
mo epitope antignico. Trabajos recientes han
demostracTo que este antgeno es sinnimo de
CD46. Esta protena es un cofactor de mem bra
na capaz de unirse a C3b y C4b y facilitar la
inactivacin de stos por la protena I del siste
ma complemento. De esta manera CD46 ejer
cera un efecto protector del trofoblasto evitan
do un ataque inmunolgico.
Al antgeno TLX se le asigna adems u n
efecto protector de las clulas trofoblsticas.
Estos antgenos estimularan a la madre a una
respuesta inmune beneficiosa para el desarrollo
de la placenta. Se postula adems la formacin
de un anticuerpo anti-idiotipo; un equilibrio e n
tre la relacin anti-TLX y su anti-idiotipo sera
beneficioso para el xito de la preez. Su a u
sencia llevara al aborto. En esta hiptesis se
basa el tratamiento que a ciertas pacientes que
presentan abortos recurrentes de etiologa d es
conocida se les hace inyectndoles una suspen
sin de linfocitos provenientes de su pareja,
con el fin de lograr embarazos que lleguen a fe
liz trmino.
Expresin de protenas relacionadas
con la regulacin del sistema complemento
Las clulas trofoblsticas expresan ciertas
sustancias que modulan la activacin del co m
plemento: la protena cofactor de membrana
(MCP, identificada actualmente como sinni
mo de CD46, TLX, arriba descrita) y el factor

684

Inmunopatologa

_ Vasos
sanguneos

F ig . 34-1. L a placenta vi.sta desde la cara fetal (Tom ada de

E n ciclopedia C onsulta Edit. C odex, 1965.)

acelerador del decaimiento (DAF) modulan la

activacin de C3 de la cascada del complemen
to, acelerando la inactivacin de la actividad
funcional de C3-convertasa de la va clsica y
de C3bBb de la va alterna. Estas protenas han
sido bien identificadas. Las caractersticas del
MCP (CD46) ya han sido indicadas. El DAF es
una glucoprotena sim ple de PM 74 kD. La
funcin de estas protenas sera la de proteger a
la placenta de un ataque inmunolgico media
do por complemento.
Antgenos relacionados
con los grupos sanguneos
Los antgenos relacionados con el sistema
ABO no estaran expresados sobre las clulas

trofoblsticas humanas. Se ha localizado un an

tgeno sialyl-Le* en los citotrofoblastos. Fue
detectado con dos anticuerpos monoclonales,
uno dirigido contra los hidratos de carbono fucosilados y el otro contra los hidratos de carbo
no sialilados de la cadena precursora de los
grupos sanguneos tipo 1 y tipo 2. Los sincitiotrofoblastos, clulas que recubren las vellosida
des corinicas, no reaccionan con ninguno de
estos dos anticuerpos.
Durante el desarrollo embrionario hay expre
sin de algunos antgenos carbohidratados. Es
tos podran estar involucrados en el reconoci
miento clula-clula e incrementar la sialidacin
de glucoconjugados de superficie, mecanismo
que en las clulas tumorales le confiere resisten
cia a su lisis por las clulas NK. Sera muy inte
resante determinar si estos antgenos tienen al
guna funcin semejante en la interaccin que se
produce entre clulas trofoblsticas y clulas de
la decidua. De ser as, su presencia en las clu
las trofoblsticas sera importante para el mante
nimiento de la integridad placentaria.
DECIDUA
La decidua es un tejido membranoso consti
tuido por la mucosa uterina que se forma du
rante la gestacin y que es expulsada luego del
parto. En la decidua humana y de ratn se ha
evidenciado una gran variedad de clulas. En
tre ellas los macrfagos CD14+, los que expre
san antgenos CMF clase II que les confiere
una funcin inmunolgica importante, actuan-

nI

Espacio
E
: intervelloso
inte

J
lasal

F ig. 34-2. Estructura y circulacin placentaria (T om ada de E nciclopedia C onsulta Edit. C odex, 1965.)

Inmunologa de la reproduccin

685

F ig . 34-3. C o rte transversal de placenta:

ubicacin de ias clulas trofoblsticas.

do como clulas presentadoras de antgenos a cin de la lL-2, interfiriendo con los receptores
los linfocitos T. En el tejido decidual estn en para dicha interleuquina. El desarrollo de esta
contacto con los citotrofoblastos placentarios. poblacin de pequeos linfocitos requiere de
Los macrfagos normalmente estn presentes ciertas seales hormonales, as como tambin
en el estrom a endom etrial duran te el ciclo de factores solubles secretados por los trofomenstrual, aumentando su nmero al comenzar blastos. Al factor soluble secretado por los p e
queos linfocitos presentes en la decidua m uri
la preez.
Los linfocitos T forman parte tambin de las na se lo ha relacionado con TGE-P^ (Transforclulas del estroma uterino, presentando la m a ming growth factor (32 ). Su presencia est re
yora receptores T C R (a/p); una baja propor lacionada con una preez normal, ya que, si su
cin presenta receptores TCR( y/5). Los linfoci actividad es dbil se producen abortos. jEste
tos T CD3+, CD8* podran participar en meca efecto ha sido corroborado con experiencias
realizadas in vivo inyectando a la madre un an
nismos de supresin.
En el estroma decidua! humano existe una ticuerpo monoclonal anti-TGF-p^. Hasta el m o
poblacin de leucocitos con caractersticas de mento no se conoce cual es el linaje de estos
gran linfocito (LGL). En el primer trimestre de pequeos linfocitos.
la gestacin stos forman la mayor parte de las
clulas deciduales (75%), no presentan caracte
rsticas de linfocitos T ni de hnfocitos B, pero IM PLA N T A C I N
s presentan actividad NK. Expresan el marca
dor de superficie CD 56 y son CD2+, C D 3%
La im plantacin de los blastos en el tero
C D l6", no presentando receptores para Fe. Es materno es regulada por una serie de mecanis
tas clulas seran las responsables de la produc mos endocrinos e inmunolgicos estrechamen
cin de factores de crecimiento. La actividad te relacionados, que llevaran al xito de la im
NK que presentan les otorgara un rol im por plantacin del huevo fecundado.
tante en la gestacin controlando la invasin
En el momento de la implantacin las clu
las endometriales sufren diferenciacin y proli
del trofoblasto en el tejido uterino.
Se ha demostrado que la decidua, tanto hu feracin. Todo esto es controlado por una serie
mana como de ratn, expresa capacidad inmu- de sustancias tales como hormonas esteroideas
nosupresora. En el humano no se han identifi ovricas, histamina, prostaglandinas, leucotrie
cado an las clulas responsables de este efec nos y factor activador de plaquetas (PAF), las
to. En el ratn esto se atribuye a una poblacin que contribuyen a la transformacin celular, es
de pequeos linfocitos que presentan grnulos decir, a la formacin de la decidua endom e
citoplasmticos. Clark y col. han demostrado trial. Estas sustancias son secretadas por los te
que estas clulas o no estaban presentes o, si lo jidos endometriales del tero. En el endometrio
estaban, lo hacan en muy baja proporcin en humano se secretan factores supresores depen
dos m odelos m urinos que presentan un alto dientes de la progesterona, que atenan la lingrado de resorcin fetal. Estos investigadores foproliferacin producida por los mitgenos o
han identificado adems un factor soluble, se los aloantgenos.
En los program as de fertilizacin in vitro
cretado por dichas clulas, que actuara b lo
queando la respuesta de los linfocitos T a la ac que se realizan en humanos, sobrenadantes de

686

Inmunopatologa

cultivos tie embriones presentan, como en el

caso anterior, la misma actividad inmunosupresora, existiendo una estrecha correlacin entre
la presencia de este efecto y el xito de la im
plantacin.
Imakawa y col. han encontrado una sustan
cia bioqumicamente activa denominada prote
na de trofoblasto (TP-1) en ovinos y en bovi
nos, que guarda una estrecha relacin con el
IFN -a. Dicha protena presenta efecto anti viral
y tiene la propiedad de inhibir la respuesta de
linfocitos a mitgenos y a IL-2, por lo que se le
atribuye una activa participacin en el control
de la respuesta inmune materna a los aloantgenos embrionarios.
Otra de las protenas encontradas es la |3-lactoglobuhna (PLG/PP14), secretada por las c
lulas del epitelio glandular del endometrio, con
efecto inmunosupresor sobre la actividad de las
clulas NK. Por este mecanismo el embrin es
tara protegido del ataque por las clulas NK
maternas durante el perodo de pre-implantacin.
Las clulas del estroma endometrial produ
cen INF-P 2, IL-6 en respuesta a IL-1, TNF e
IFN-y, efecto que es suprimido por la accin
de los estrgenos. La IL-1 estimula la produc
cin de prostaglandina E-2 (PG-E2) en el teji
do endometrial, y como sta tiene un potente
efecto inm unosupresor, el hecho de haberse
encontrado niveles elevados de IL-1 en el en
dometrio luego de la implantacin, hace que se
le atribuya una funcin regulatoria. La IL-1
tendra otro efecto, como es el de inhibir la decidualizacin de las clulas del estroma endo
metrial humano inducida por la progesterona.
Si clulas endometriales son cultivadas, duran
te dos semanas, con 10 * M de progesterona, se
transforman en clulas deciduales productoras
de prostaglandina, fenm eno que es inhibido
por el aadido de IL-1. No se comprende exac
tamente cul es el rol de la IL-1 en el endome
trio, pero podra pensarse que la infertilidad
causada por una inflamacin endometrial, po
dra deberse a un incremento de la secrecin
de, esta molcula por parte de los macrfagos
uterinos activados.
En el perodo de implantacin, se le ha asig
nado un posible rol en el desarrollo de la pla
centa, al factor estimulador de colonias de ma
crfagos (M-CSF). Si bien este factor se en
cuentra presente en cultivos de clulas epitelia
les y de clulas del estroma, la adicin de pro
gesterona slo estimula la produccin del mis
mo por las clulas del estroma. En el endome
trio, M-CSF podra actuar en la diferenciacin
y maduracin de los macrfagos tisulares y de
las clulas endometriales, como as tambin en
el d e sarro llo p la c e n ta rio en el p e ro d o de
preimplante.

RESPU ESTA INMUNE ESPECFICA

Y NO ESPECFICA
Las investigaciones realizadas hasta el pre
sente confirman que el sistema inmunolgico
de la madre desempea un rol fundamental en
el mantenimiento fetal. La regulacin de la res
puesta inmune materna se llevara a cabo me
diante dos mecanismos: uno especfico y otro
inespecfico. Los mecanismos especficos esta
ran m ediados por anticuerpos y por clulas
sensibilizadas, en tanto que mecanismos supresores locales y sistmicos lo haran en forma
inespecfica.
Mecanismos inespecficos
Los mecanism os supresores locales seran
debidos a factores locales no especficos inhibi
dores de la respuesta celular. Esta actividad po
dra estar mediada, entre otros, por TGF-p se
cretado por clulas presentes en la decidua. Los
sobrenadantes de cultivos de clulas placentarias suprimen la respuesta mitognica y alognica de linfocitos estimulados en cultivo mixto,
inhibiendo adems la actividad de las clulas
NK. No se conoce exactamente la naturaleza de
estos factores, pero se sabe que rompen los me
canismos de adhesin clula-clula esenciales
para el desarrollo de una respuesta inmune.
Los mecanismos supresores sistmicos esta
ran mediados por factores derivados de la pla
centa y de la decidua que alcanzan la circula
cin materna, entre los que se encuentran hor
monas y glucoprotens asociadas a la preez
(a^-PAG y P,-PSE), las que inhiben la funcio
nalidad del Unfocito T y de las clulas NK. Su
origen es atribuido a la placenta por habrselas
encontrado en varios sueros retroplacentales al
comienzo de la preez, para ir desapareciendo
a lo largo de la misma. Es probable que stas
sean eliminadas antes de entrar a la circulacin,
lo que hace que con frecuencia no se las detec
te en el suero materno o slo lo sean en bajas
concentraciones.
Mecanismos especficos
Los sincitiotrofoblastos vellosos estn en
contacto directo con la sangre materna y los ci
totrofoblastos presentes en la decidua lo hacen
con las clulas maternas. Estas seran las reas
ms importantes en donde los linfocitos mater
nos pueden ser sensibilizados por las clulas
trofoblsticas. En la interfase entre la madre y
el feto se realiza el pasaje de clulas a la circu
lacin materna llevando, de esta manera, ant
genos hacia otros lugares del sistema inmunolgico de la madre donde podra ocurrir una
respuesta inmune.

Inmunologa de la reproduccin
En la vena uterina de algunas mujeres emba
razadas se han encontrado sincitiotrofoblastos
y citotrofoblastos. No se conoce el motivo del
desprendimiento de estas clulas de la placenta
y su posterior pasaje a la circulacin materna.
En sta se han detectado durante el parto y en
algunos casos durante el embarazo, clulas ro
jas fetales.
El tipo de respuesta inmune que la madre de
sarrolla durante la preez dependera de la na
turaleza de los antgenos expresados por las c
lulas placentarias y por los tejidos fetales que
estn en contacto con las clulas inmunocom
petentes maternas.
Respuesta a antgenos HLA paternos
No obstante que los antgenos HLA clsicos
no estn presentes sobre las clulas trofoblsti
cas, la madre puede estar expuesta a antgenos
paternos expresados en clulas fetales, desarro
llndose de esta manera anticuerpos dirigidos
hacia dichos antgenos. Esta sensibilizacin po
dra deberse al pasaje de leucocitos fetales,
HLA+, a la circulacin materna, debido a una
ruptura accidental de la continuidad de las ve
llosidades corinicas. Se han detectado an ti
cuerpos citotxicos anti-HLA paternos en un
15% de mujeres que transcurren con un primer
embarazo normal, elevndose este porcentaje
al 60% en el caso de mujeres multparas. Estos
anticuerpos no son capaces de fijar com ple
mento; su presencia no pondra en peligro la
integridad del feto.
Respuesta a antgenos no pertenecientes
al sistema HLA clsicos
Durante el embarazo hay una respuesta in
mune hacia diferentes antgenos, los que pue
den ser molculas especficas de la placenta o
del feto, aloantgenos presentes en tejidos placentales y tejidos fetales, los que pueden ser
expresados, o no, por los tejidos somticos del
adulto. Existe, adems, una serie de antgenos
expresados por las clulas trofoblsticas y por
los linfocitos, tales como TLX y HLA-G. En
estos casos los anticuerpos producidos pueden
ser detectados cuando se usa como antgenos
(clula blanco) los linfocitos paternos.
Existen otros antgenos denominados antge
nos de histocompatibilidad menores definidos
por tcnicas celulares y por injertos, pero no
por serologa. Durante el embarazo no se han
detectado anticuerpos con esa especificidad.
Produccin de anticuerpos facilitantes
Trabajos sobre tumores realizados en la d
cada del 60, demostraron la presencia de anti

687

cuerpos que se unen especficamente a los ant

genos presentes en clulas tumorales, ocultn
dolos del sistema inmune del husped y evitan
do, de esta manera, su eventual rechazo. A e s
tos anticuerpos se los denomin/ac77ae.s d e
bido a que, al impedir la destruccin del tum or
por un mecanismo inmune de tipo celular, faci
litan su crecimiento. Se presume que un m eca
nismo de tipo similar podra tener lugar durante
la gestacin. En efecto, en el suero de mujeres
embarazadas se encontr una IgG que bloquea
especficamente la respuesta inmune celular de
la madre hacia los antgenos paternos y hacia
los antgenos presentes en la placenta. Este tipo
de anticuerpo no fue detectado en mujeres que
presentan abortos recurrentes.
Anticuerpos IgG asimtricos
A com ienzos de 1970 pudim os dem ostrar
que toda respuesta inmune que cursa con p ro
duccin de anticuerpos de la clase IgG, precipi
tantes, fijadores del complemento, depuradores
de antgenos, est acompaada por otra pobla
cin de anticuerpos, de la clase IgG, de lo s
mismos isotipos que los precipitantes y que tie
nen un comportamiento inmunoqumieo y b io
lgico totalm ente diferente. P ara estos a n ti
cuerpos, descritos en detalle en el captulo 19,
hemos propuesto el nombre de anticuerpos IgG
asimtricos y es como se los conoce en la lite
ratura. La designacin proviene del hecho de
que estas molculas de IgG tienen insertado un
oligosacrido en slo uno de sus Fab, originan
do este hecho una asimetra molecular. El o li
gosacrido ms representativo es de alto conte
nido en maosa (high mamiose type), con c a
pacidad de unirse a la lectina concanavalina A,
a diferencia de lo que ocurre con los oligosac ridos que se encuentran en el Fe, donde predo
minan los que tienen restos de galactosa y c i
do silico. Esto hace que de la poblacin total
de molculas de anticuerpos IgG, slo los a si
mtricos se fijan a Con A. Este hecho ha p e r
mitido, adems, poder demostrar que en to d a
poblacin de IgG "no especfica aislada de un
suero normal, el 10-15% de las molculas son
de tipo asimtrico. Este es un hecho extensivo
a todos los vertebrados y que afecta a las dife
rentes subclases de IgG que se elaboran.
Estas molculas son consecuencia de un fe
nmeno de origen postraduccional, no son e la
boradas por clulas distintas, ya que, como lo
hemos demostrado empleando cultivos de h i
bridomas, son sintetizados por el mismo clon
celular. Los mecanismos que pueden ser re s
ponsables de este hecho han sido discutidos en
el captulo 19.
El resto oligosacardico, responsable de la
asim etra, interfiere en la funcionalidad d el

588

Inmunopatologa

fragmento Fab al que afecta. A consecuencia

de ello este Fab no puede unirse a grandes ligandos y la molcula de IgG funciona como
anticuerpo bloqueante, univalente, protector
del agente agresor y no deJ husped. Al no for
mar agregados, debido a su univalencia funcio
nal, no pueden poner en marcha mecanismos
efectores de la respuesta inmune como precipi
tacin por formacin de complejos adecuados,
fijacin del complemento y depuracin antig
nica, entre otros.
En condiciones normales la inoculacin de
antgenos solubles en pocas dosis o en dosis re
petidas por perodos prolongados, inducen en
todos los casos respuestas en las que los anti
cuerpos IgG asimtricos slo llegan al 10-15%
de la poblacin total de anticuerpos produci
dos. Los antgenos particulados, inoculados en
forma repetida, inducen respuestas en las que
los anticuerpos asim tricos pueden llegar a
constituir hasta el 70% del total. Dado que la
afinidad por el ligando de los anticuerpos IgG
normales y la de los asimtricos es la misma
(son sintetizados por el mismo clon celular), un
suero que los contenga se comportar de mane
ra diferente segin sus proporciones, ya que en
este caso la competicin ser por masa de anti
cuerpo. E stud ios efectuad o s m u estran que
cuando en una m ezcla de anticuerpos de la
misma especificidad, la proporcin de anticuer
po asimtrico es del 20%, o menor, esa concen
tracin no modifica el comportamiento del an
ticuerpo precipitante normal pero, si esa pro
porcin aumenta, dicha actividad disminuye y
para mezclas en las que la proporcin de anti
cuerpo asimtrico es del 70-80%, la actividad
del anticuerpo normal no se expresa. Esto hace
que los sueros inmunes, que contienen alta pro
porcin de anticuerpo IgG asimtrico, se com
porten como univalentes, bloqueantes, protec
tores del agente agresor y no del husped. Esta
situacin es la que hemos podido observar en
infecciones crnicas, que son fenmenos de la
naturaleza que cursan con estimulaciones a re
peticin por antgenos particulados. En estos
casos los anticuerpos asimtricos, al proteger al
microrganismo o parsito, contribuyen a poten
ciar la cronicidad (vase cap. 19).
Dado el particular comportamiento de estos
anticuerpos, hemos investigado si podran tener
alguna participacin en la proteccin del feto
en el tero materno. Hemos podido demostrar
que la proporcin de molculas IgG asimtri
cas, que en el suero de mujeres no gestantes es
del 10-15%, se duplica en las em barazadas.
Cuando analizamos las molculas de IgG eluidas de placentas previamente lavadas con solu
cin salina y tratadas luego con buffer diso
ciante (Glicina-HCI 0,1 M, pH 3 o KCl 4 M),
entre el 40-60% de esas molculas eran asim

tricas. Cuando se investig la actividad anti-antgenos paternos, usando linfocitos como clu
las blanco , pudim os dem ostrar que el 7080% tenan actividad, en tanto que de las IgG
normales o simtricas slo el 7% reaccionaban
con los linfocitos paternos. Teniendo en cuenta
la competicin que existe entre molculas nor
males y asimtricas, y la proporcin con activi
dad anti-antgenos paternos en ambas poblacio
nes de IgG, es lgico presum ir que los anti
cuerpos IgG asimtricos deben jugar un papel
importante en la proteccin del feto en el tero
de la madre.
Cuando se analizaron los sueros de mujeres
embarazadas, que contenan 30% de molculas
asimtricas, slo el 2% de stas tenan activi
dad anti-paterno, lo que est indicando que la
induccin de asimetra molecular es un fen
meno general, que debe afectar a la mayora de
las clulas sintetizadoras de inmunoglobulina,
y no solamente a aquellas comprometidas con
la sntesis de anticuerpos antipaternos. Todos
los fenmenos descritos son bien evidentes en
las multparas, siendo por el contrario muy di
fciles de evidenciar en prim paras. Es muy
probable que ello est relacionado con las reestimulaciones en las multparas y con la sensibi
lidad de los mtodos de deteccin usados. En
efecto, teniendo en cuenta el volum en de la
placenta hum ana (20x10x2 cm) y el tam ao
promedio de las clulas (10 |J- de dimetro) que
la constituyen, la misma estara compuesta por
aproximadamente 2 x 10^ clulas. Si se admite
como valor promedio que el nmero de epito
pes por clula es lO*, su nmero total sera 2 x
10. Si la concentracin de anticuerpo fuera
aproximadamente 1,5 ng/ml (10"M ) sera muy
difcil de detectarlos por los mtodos serolgicos de diagnstico. No obstante, si a esa con
centracin molar se la multiplica por el nmero
de Avogadro (6,2 x 10^^) se obtiene el nmero
de molculas por litro de sangre, en este caso 6
X 10'^, nmero muy superior al total de epito
pes que sera necesario bloquear para lograr un
efecto beneficioso.
Por otra parte, no debe olvidarse que de los
mtodos serolgicos usados con fines de diag
nstico, algunos son de interaccin prim aria
(ELISA, radioinmunoanlisis, inm unofluores
cencia) en tanto que otros, como la inmunoprecipitacin, hemaglutinacin, fijacin del com
plemento, son de interaccin secundaria (van
se caps. 8 y 9). En una mezcla de anticuerpos
IgG precipitantes normales y asimtricos, todos
ellos sern puestos en evidencia si se usa una
reaccin de interaccin primaria pues slo uno
de los sitios de combinacin del anticuerpo o
Fab interacciona con el ligando. En cambio, si
se usan reacciones de interaccin secundaria, en
las que la agregacin es fundamental y para que

Inmunologa de la reproduccin
ella ocurra deben participar los dos Fab de la
molcula, slo sern puestos en evidencia los
anticuerpos normales, no as los asimtricos.
s muy importante el conocimiento de este
hecho. Se considera como una muy probable
causa del aborto recurrente la aparicin de anti
cuerpos normales capaces de interaccionar con
los antgenos paternos y poner en marcha reac
ciones de agresin, a diferencia de lo que ocu
rre con los anticuerpos asim tricos que blo
quean al antgeno y lo protegen de los mecanis
mos agresores de la inmunidad humoral y celu
lar. El hacer una buena evaluacin diferencial
de la respuesta inmune que se ha originado po
dra ser de mucha utilidad para una mejor eva
luacin diagnstica y pronstica.
Flay quienes utilizan, en el tratamiento pre
ventivo del aborto recurrente, inoculaciones re
petidas de suspensiones de leucocitos de origen
paterno. M uy probablemente este tratamiento
lleve, por ser una inoculacin repetida de ant
genos particulados, a la induccin de la sntesis
de anticuerpos IgG asimtricos, supliendo de
esta m anera alguna falla del mecanismo res
ponsable de la regulacin de este fenmeno.
Si bien no caben dudas de la importancia de
los anticuerpos asimtricos, el interrogante sur
ge sobre cules son los mecanismos que llevan
a su sntesis preferencial durante la preez. So
bre este particular, investigaciones desarrolla
das por nosotros han permitido demostrar que
la placenta, mediante factores que sintetiza, es
la responsable de la regulacin de la calidad de
los anticuerpos que se elaboran. Utilizando co
mo reactivo diferentes hibridomas con distintas
especificidades, que sintetizan bajas proporcio
nes de anticuerpos asim tricos de las clases
IgG l e IgG2b, hemos comprobado que el aa
dido a los cultivos de hibridomas del sobrena
dante de cultivos placentarios vara la calidad
del anticuerpo sintetizado, haciendo que se in
cremente la proporcin de anticuerpos asim
tricos. Ello ocurre cuando el sobrenadante es
aadido al hibridom a en la proporcin 5-8%,
producindose un efecto inhibitorio de la snte
sis de anticuerpos totales cuando esas propor
ciones superan al 20%.
Estas experiencias ponen en evidencia que la
placenta secreta factores capaces de modular la
calidad del anticuerpo que se elabora. Constitui
ra un mecanismo fisiolgico normal de la pre
ez, el que hara que la respuesta inmune de la
madre contra los antgenos paternos se desviara
hacia la produccin de anticuerpos protectores
de esos antgenos, protegindolos del efecto
agresor que pudieran inducir los anticuerpos
precipitantes normales, a la vez que bloquearan
los mecanismos de la inmunidad celular.
Se ha podido determinar que la accin regu
ladora de los factores placentarios es un fen

meno general, que afecta a todo el sistema in

mune. Hemos demostrado que cuando se in o
culan ratas vrgenes y ratas preadas con an t
genos convencionales (ovoalbmina), la p ro
porcin de anticuerpos asimtricos sintetizados
por ambos grupos es diferente. En las ratas v r
genes la relacin anticuerpo asim trico/anti
cuerpo norm al es 15/85, en tanto que en las
preadas esa relacin en los anticuerpos an ti
ovoalbmina sintetizados es 30-35/70-65. V a
lores sim ilares a estos ltim os se o b tien en
cu an d o ra tas v rg en e s son in o cu lad a s c o n
ovoalbm ina e inyectadas sim ultneam ente,
por v a intraperitoneal, con sobrenadante de
cultivos de placenta.
Estos resultados indican que factores secre
tados por la placenta, cuyo aislamiento, purifi
cacin e identificacin estamos intentando en
estos momentos en nuestros laboratorios, p u e
den m odular la calidad de respuesta inm une.
Los anticuerpos inducidos ejercen un p o d e r
protector de los antgenos hacia los que estn
dirigidos. Se han iniciado estudios en los que
se procurar determinar si, como consecuencia
de este efecto, su uso podra ser beneficioso en
el tratamiento de algunas enfermedades autoin
munes y en la facilitacin del implante de rga
nos y tejidos alogeneicos.
Un efecto similar al de los sobrenadantes de
cultivos de placenta lo hemos encontrado en
los provenientes de cultivos de linfocitos de
embarazadas, que expresan receptores citoslicos para progesterona, cuando son pulsados
con la hormona. Estos sobrenadantes constitu
yen el material del que Szekeres-Bartho aisl el
factor que ha demostrado efecto supresor sobre
linfocitos T citotxicos y clulas NK.
Una reflexin final cabe sobre la sntesis de
anticuerpos asimtricos por las mujeres gestan
tes. Siendo estos anticuerpos protectores d el
antgeno, incapaces de mediar reacciones b io
lgicas que lleven a la destruccin del agente
agresor, habr de resultar beneficioso, en to
dos los casos, vacunar a la madre con la finali
dad de transferirle al feto una inmunidad h u
moral pasiva congnita, que no habr de ser
precisamente de la calidad deseada?
Respuesta inmune hacia el trofoblasto,
mediada p or clulas
La inmunidad celular requiere de la interac
cin de linfocitos T y de macrfagos, ambos
presentes en la decidua en el prim er trimestre
de gestacin. A pesar de que el trofoblasto no
expresa antgenos HLA clase II, es posible que
antgenos del trofoblasto sean presentados al
linfocito T por macrfagos deciduales y de esta
manera estimular la formacin de linfocitos T
c ito t x ico s esp ecfico s para el tro fo b lasto .

690

Inmunopatologa

Membranas de sincitiotrofoblasto provenientes

de placentas autlogas no estimulan la respues
ta proliferativa en linfocitos maternos. Los ci
totrofoblastos tampoco estim ulan a linfocitos
en cultivo mixto de linfocitos, lo que sugiere
que a diferencia de los antgenos HLA-clase 1,
los antgenos HLA-G (presentes en los citotro
foblastos) seran incapaces de generar clulas T
citotxicas.
Importancia de la respuesta inmune
materna para el xito de la preez
Normalmente se presentan un niimero bajo
de abortos espontneos que pueden ser detecta
dos clnicamente (10-15%). Existen los llama
dos abortos recurrentes, as denom inados a
aquellos producidos ms de tres veces en una
paciente y que transcurren antes de la semana
20 de gestacin. La frecuencia con que apare
cen es de 1 en 300 mujeres gestantes, su etiolo
ga es desconocida pero se lo asocia a proble
mas endocrinos y a anormalidades anatmicas.
Los inmunlogos han propuesto varios meca
nismos para encontrar una explicacin al xito
de la preez. En todos ellos se involucra la for
macin de anticuerpos, por el sistema inmune
de la madre, dirigidos contra antgenos paternos
a efectos de protegerlos y asegurar el manteni
miento fetal. En estos mecanismos participa
ran: a) la formacin en la madre de anticuerpos
citotxicos con actividad anti-iinfocitos pater
nos, b) la sntesis de anticuerpos facilitantes o
bloqueantes y de molculas IgG asimtricas con
actividad especfica, capaces de bloquear ant
genos paternos e inhibir el cultivo mixto de lin
focitos, c) la produccin de anticuerpos antiTLX. En las parejas que no comparten este an
tgeno y que presentan embarazos de trmino,
se ha demostrado la presencia de anticuerpos
anti-TLX, los que tendran por funcin blo
quear a dichos antgenos e impedir que sean el
blancode agresin por los componentes nor
males de una respuesta materna. Se ha observa
do que las abortadoras comparten con su pareja
los antgenos TLX y no presentan anticuerpos
contra ste. Es por ello que hay autores que su
ponen que los antgenos TLX podran tener al
guna participacin en los mecanismos que regu
lan la proteccin del feto en el itero materno.
Corno ya se indicara, se ha ensayado con algtin xito, en los casos de abortos a repeticin,
la inoculacin de suspensiones de linfocitos
provenientes del padre, la que puede revertir la
situacin, haciendo que el embarazo llegue a
trmino. La mayora de los autores consideran
que ello sera debido a la induccin previa en la
madre de una respuesta inmune con formacin
de anticuerpos protectores contra los antgenos
paternos; los anticuerpos IgG asimtricos po

dran tener participacin en este hecho. Otros

autores, en cambio, estiman que ello sera con
secuencia de un fenmeno inespecfico media
do por citoquinas que aparecen por cualquier
estmulo antignico, y no necesariamente por
antgenos de origen paterno.
Muy interesantes son los resultados experi
mentales de Clark y Chaouat, quienes han estu
diado en profundidad un modelo murino que
p re s e n ta un alto g rad o de re s o rc i n fe ta l
(CBA/j X DBA/2). Si hembras CBA/j (H2-k)
son apareadas con machos de la cepa DBA/2
(H2d), se produce la preez pero con un alto
grado de resorcin fetal (30%). Este porcentaje
disminuye considerablemente si a las hembras
C B A /j, antes de ser apareadas con m achos
DBA/2 se las inoculas con: a) clulas esplnicas provenientes de ratones BALB/c (H-2d), b)
suero de ratones CBA/j previamente inmuniza
dos con clulas de BALB/c, c) si se las aparea
con ratones BALB/c.
Se podra pensar que el efecto que tienen las
inoculaciones linfocitarias sobre la resorcin
pudiera ser debido a la produccin de anticuer
pos anti-H-2d, as como tambin a un efecto in
flamatorio. Este efecto estimulara la produc
cin de citoquinas y de factores de crecimiento
que estimularan el desarrollo placentario, evi
tando as los abortos. Esto ltimo estara avala
do por el hecho de que, si a las hembras slo se
les inyecta adyuvante de Freund completo an
tes de aparearlas con los machos, el porcentaje
de resorcin tambin se ve reducido.
FACTORES INMUNOMODULADORES
SECRETADOS POR EL TROFOBLASTO
Tanto el feto como la placenta expresan una
variedad de antgenos, entre los que se encuen
tran los antgenos del complejo mayor de histo
compatibilidad no clsicos (HLA-G), antgeno
TLX, antgenos oncofetales, antgenos espec
ficos de tejidos, contra los cuales la madre po
dra reaccionar generando una respuesta inm u
ne y producir por lo tanto el rechazo del feto.
Esto afortunadam ente no sucede. A pesar de
que en el suero de la madre se pueden encon
trar anticuerpos especficos y linfocitos sensibi
lizados para alguno de ellos, la sobrevida de la
unidad feto-placentaria no se ve comprometida.
Los diferentes mecanismos propuestos para
encontrar una respuesta a esta incgnita son los
siguientes:
1. La placenta formara una barrera fisiolgica
evitando el pasaje de clulas maternas y de
clulas fetales.
2. A dsorcin de anticuerpos citotxicos por
clulas expresadas en la placenta.

Inmunologa de la reproduccin
3. Falta de expresin de antgenos del C M tF
clase I y clase II clsicos, por las clulas tro
foblsticas.
4. La expresin de los antgenos HLA-G.
5. La produccin de anticuerpos facilitantes.
6. La produccin de anticuerpos asimtricos
de la clase IgG.
7. La induccin de una supresin local y sistmica de la respuesta inmune materna.
8. La suceptibilidad daada de los trofoblastos
a las clulas NK y a las CTL (clulas ki
ller activadas por linfoquinas).
9. Una inmunorregulacin local debida a los
productos celulares secretados por la nterfase materno-fetal, que incluyen trofoblas
tos, clulas deciduales y linfocitos presentes
en el endometrio.
Un nmero elevado de factores asociados al
trofoblasto han sido propuestos como agentes
inmunomoduladores involucrados en la sobre
vida de la unidad feto-materna, posiblemente
inhibiendo el efecto de eitotoxicidad T aiogeneica hacia los aloantgenos expresados en el
trofoblasto. Estos factores pueden ser clasifica
dos en dos categoras; I) factores inmunosupresores, II) factores inmunoestimuladores.
I. Factores inmunosupresores:
Extractos obtenidos de sincitiotrofoblastos
tienen un efecto inmunosupresor sobre la res
puesta proliferativa que ejercen distintos mit
genos, como la concanavalina A (Con A) y fitohemaglutinina (PHA), sobre linfocitos y clulas
alogeneicas en los cultivos mixtos de linfocitos.
Sobrenadantes de cultivos de trofoblastos pro
venientes de placentas normales generaron in
vitro una poblacin de linfocitos supresores, a
los que generalmente se considera responsables
de la tolerancia inmunolgica. Estos sobrena
dantes reducen tambin la actividad de las clu
las NK contra clulas blanco K562. Efectos
similares fueron encontrados en roedores.
Extractos placentarios retardaron, en ratn, el
rechazo de un injerto tumoral alogeneico. An
lisis serolgicos mostraron que estos extractos
causaban una disminucin en la produccin de
anticuerpos fijadores de complemento como lo
es la IgG2 y un incremento en los anticuerpos
anafilcticos (IgGl). Estos extractos indujeron
una desviacin en la respuesta contra aloantge
nos, as como tambin un aumento en la pro
duccin de anticuerpos y clulas supresoras, fa
voreciendo de este modo la sobrevida del feto.
A partir de cultivos de clulas de coriocarcinoma humano se identific un complejo protei
co de PM 150-200 kD que inhibe la transfor
macin linfocitaria producida por la PHA y por
el toxoide tetnico. Parecera que estos factores

691

slo suprimen la funcin proliferativa de clu

las inm unocompetentes sin afectar su activ a
cin ni su diferenciacin. Estos factores seran
semejantes a los derivados de los trofoblastos
humanos.
Factores inmunosupresores
no especficos
a)
Hormonas. Las hormonas esteroideas se
incrementan durante la gestacin e influyen en
la reactividad inmunolgica. Estas hormonas,
producidas inicialmente por el cuerpo lteo ba
jo el estmulo de la gonadotrofina corinica y a
partir del 7 mes por la placenta, desempean
una importante funcin en el mantenimiento de
la gestacin. La progesterona acta inhibiendo
las contracciones del miometrio, bloquea la ac
tividad de la colagenasa uterina, m odifica la
actividad de las enzimas proteolticas y afecta
adems a la respuesta inmune. Hay evidencias
de que altas concentraciones de progesterona
son capaces de prolongar la sobrevida de un in
jerto de piel xenogeneico y alogeneico, habin
dose logrado adems prolongar la sobrevida de
clulas tumorales xenogeneicas en el tero de
un hmster aplicando un tratamiento con pro
gesterona. Si ste es suspendido aparece inm e
diatamente el rechazo.
Tanto los estrgenos como la progesterona
suprimen in vivo e in vitro, las reacciones in
munes. La progesterona inhibe la incorpora
cin de 3H-timidina por los linfocitos estim ula
dos con PHA; este efecto se produce al iniciar
se el cultivo, lo que indicara que esta horm ona
inhibe el proceso de activacin inicial de la mitognesis de las clulas T. La progesterona en
combinacin con la prostaglandina E (PGE) (la
que aumenta en el endometrio y en la decidua)
tiene un efecto sinergstico sobre la respuesta
mitognica de linfocitos perifricos humanos.
Los niveles de las hormonas esteroideas en
suero y en placenta no son suficientes com o
para ejercer un efecto directo sobre los' linfoci
tos. El nivel de estas hormonas en el tero y en
la interfase materno-fetal es mayor que en san
gre perifrica, por lo que cada una de ellas po
dra regular desde all la respuesta inmune. N i
veles elevados de estas hormonas en la vecin
dad de la placenta participaran en la sobrevida
fetal, actuando como un factor inmunosupresor
local no especfico. Se podra pensar tam bin
que estas hormonas puedan afectar indirecta
mente a la respuesta inmune, induciendo la sn
tesis de protenas o glucoprotenas con propie
dades inmunosupresoras, como as tam bin la
produccin tmica de clulas o factores inm unorreguladores.
La gonadotrofina corinica humana (hCG )
es una glucoprotena de PM 46 kD producida

692

Inmunopatologa

durante la gestacin por los sincitiotrofoblas timocitos murinos dependiente de IL-1. Estos
tos. Esta horm ona es capaz de inhibir la res factores bloquean la capacidad de la IL-I de es
puesta linfocitaria a la PHA, como tambin la timular la proliferacin linfocitaria, inhibiendo
respuesta de clulas alogeneicas. No presenta adems, en humanos, la mitognesis de los lin
efectos citotxicos sobre los linfocitos. En un focitos T de sangre perifrica sin afectar la sn
comienzo se pens que la inoculacin de esta tesis de IL-2.
hormona prolongaba la sobrevida de un injerto
de piel y disminua la incidencia de enferme II- Factores inmunoestimuladores
dad injerto-husped. Experiencias posteriores
dem ostraron que ese efecto era debido a un
Las clulas placentarias tienen la capacidad
contaminante presente en las muestras ensaya de secretar diferentes factores solubles con ac
das, proveniente de la orina, a partir de la cual tividad inmunestimuladora, favoreciendo el de
se hacan las purificaciones. Esta sustancia fue sarrollo de tejido placentario. Entre ellos pode
identificada y se la denomin Urom odulin, mos citar a algunas citoquinas que actan sobre
con capacidad para bloquear eventos tem pra la diferenciacin celular, como son la IL-1 y la
nos en la proliferacin de clulas T y de regular IL-6, a los factores estimuladores de colonias
la actividad de la IL-1.
GM-CSF y M-CSF, al TNF (factor de necrosis
b)
Protenas y glucoprotens. Existe una tumoral), interfern (INF).
La IL-1 y la IL-6 son glucoprotens de PM
serie de protenas y glucoprotens de origen
placentario, cuyas propiedades biolgicas toda 17 kD y 26 kD, respectivamente, que presentan
va se encuentran en estudio, a las que se les mltiples actividades biolgicas. La IL-1 acta
induciendo la secrecin de IL-6 en diferentes
atribuye actividad inmunosupresora.
- a^-glucoprotena asociada a la preez (a^- sistema celulares, entre ellos fibroblastos, clu
PAG). Su PM es 360 a 380 kD. Su efecto in las endoteliales y clulas endometriales. Estas
munosupresor es preferentemente sobre la res interleuquinas son producidas por los trofoblas
tos y regulan la secrecin de hCG por dichas
puesta mediada por linfocitos T.
- Pj-glucoprotena especfica de la preez clulas.
(Pi-PSG). Es sintetizada tambin por el sinciEl T N F -a ha sido detectado en sobrenadan
tiotrofoblasto y alcanza su mxima concentra tes de tejidos placentarios y deciduales, as co
cin al final de la preez. Su PM es 90 kD. Se mo tambin en lquido amnitico. Si a las clu
encuentra en muy baja concentracin en el sue las trofoblsticas se las estimula con T N F -a e
ro materno, por lo que se sugiere que su efecto IL-1, hay aumento de IL-6 y por ende un au
supresor sea efectuado localmente, en la inter mento en la secrecin de hCG, lo que indica
fase materno-fetal.
que dichos factores regularan los niveles de
- Protena A plasmtica asociada a la preez secrecin de IL-6 por esas clulas.
(PAPP-A). Es una macroglobulina de PM 750
Se ha determinado la presencia de IN F -a likD, sintetizada por el trofoblasto.
k e sobre las clulas trofoblsticas. Teniendo
- Protena placental 14 (PP14). Fue aislada en cuenta que las clulas placentarias presentan
de placenta y tiene una estructura similar a las receptores especficos para IN F-a, se considera
otras protenas asociadas a la preez.
que el IN F -a like funcionara como regula
Estas sustancias presentan un potente efecto dor fisiolgico de los procesos celulares de la
inm unosupresor sobre la proliferacin celular placenta, participando de esta manera en la re
inducida por aloantgenos o por mitgenos y gulacin de la proliferacin de tejidos previa
m ente estim ulados por los factores de creci
sobre el cultivo mixto de linfocitos. La PPM
presenta adems un efecto inhibitorio sobre la miento.
El factor M-CSF, originalmente identificado
secrecin de IL-1 y sobre la produccin de IL2 por linfocitos estimulados con PHA.
como factor de crecim iento hem atopoytieo,
- F actor transform ante del crecim ien to -p
indispensable para la proliferacin, diferencia
(TGF-p, transforming growth factor). Es un cin y sobrevida de las clulas mononucleares,
polipptido multifuncional de PM 25 kD, com fue identificado en el tero y su nivel aumenta
l.OOO veces durante la gestacin. Fue detectado
puesto de 2 subunidades de 12,5 kD cada una.
Es producido por clulas neoplsicas, por clu en placenta de rata y en el tracto reproductivo
las hematopoyticas y por clulas asociadas a de ratones preados. Recientemente se demos
los rganos de la reproduccin. En efecto, las tr la expresin de un gen para el factor Mclulas placentarias, las clulas deciduales y las CSF en placenta y decidua, lo que indicara la
clulas granulosas del ovario producen este posible regulacin, por parte de este factor, del
factor. Su accin es muy similar a los factores crecimiento y diferenciacin de las clulas en
inmunosupresores derivados de los cultivos de la interfase materno-fetal.
trofoblastos. Tanto el TGF-P, como su homlo
Como dijramos anteriormente, la placenta
go el TGF-p 2 suprimen la proliferacin de los secreta factores que modulan in vivo e in vitro

Inmunologa de la reproduccin
la calidad y cantidad de la sntesis de anticuer
pos. Estos factores, inducen una sntesis preferencial de anticuerpos IgG asimtricos los que,
dado su particular comportamiento biolgico,
contribuiran al mantenimiento de la unidad fe
to-placentaria.
FACTORES LINFOCITARIOS
M O D U LA D O R ES DE LA RESPUESTA
INM UNE
Adems de los factores placentarios citados
anteriorm ente existen factores linfocitarios
moduladores de la respuesta inmune.
Szekeres-Bartho y col. demostraron que lin
focitos CD8+ provenientes de mujeres embara
zadas presentan receptores para progesterona
(PRs). El porcentaje de linfocitos PRs positi
vos aumenta a lo largo de las gestas que trans
curren normalmente mientras que abortos es
pontneos o abortos recurrentes van asociados
a una alteracin en el nmero de dichos linfo
citos.
El estudio y caracterizacin de estos recep
tores demostraron que es una protena de PM
80-100 kD formada por 3 dominios: la regin
N-terminal, la regin central rica en cistena y
la regin C-terminal. El dominio central es el
responsable de la unin del receptor al ADN,
el dominio C-terminal es la estructura de unin
de la horm ona con funciones de traslocacin
nuclear y el N-terminal contiene los determi
nantes antignieos. La mayora de los anticuer
pos estn dirigidos contra esta regin proteica.
Los linfocitos CD8+ de mujeres em baraza
das que presentan PRs, en presencia de la hor
mona secretan un factor con propiedades moduladoras de la respuesta inmune. Este factor
es una protena de 34 kD con capacidad para
inhibir la lisis mediada por clulas NK, de in
hibir la proliferacin de cultivo mixto de linfo
citos y de generar clulas con fenotipo y fun
ciones supresoras. Esta protena aparece en el
suero de mujeres que transcurren con embara
zos normales; su nivel dism inuye considera
blemente si hay abortos o amenazas de abor
tos. Esto indicara una estrecha relacin entre
esta protena y el xito de la gestacin.
Es posible inducir la expresin de PRs+ en
poblaciones linfoideas por estim ulacin con
m itgenos o por accin de aloantgenos. Se
han detectado clulas PRs+ en pacientes politransfundidos y en aquellos que fueron someti
dos a trasplantes hepticos.
Este factor no solo tiene efecto modulador
in vitro de la respuesta inmune, sino que pre
senta in vivo efecto antiabortivo. Si sobrena
dante de linfocitos de ratones preados estim u
lados con progesterona se inyecta en ratones

693

que presentan un alto grado de resorcin fetal,

como es la cruza CBA/2 x DBA/j, se observa
una disminucin en el grado de resorcin. Este
efecto no se logra si los linfocitos provienen
de ratones vrgenes. Un efecto contrario puede
observarse si a ratones preados norm ales se
les administra bloqueantes de los PRs com o es
el RU486, de manera que la hormona no pueda
actuar y por ende no se pueda secretar el factor
modulador.
Trabajos realizados en nuestros laboratorios
han demostrado que el sobrenadante de cultivo
de clulas linfoides provenientes de bazo de
ratas, obtenidos al da 10 de preez alogeneica
(W istar X Fischer) modulan in vitro la produc
cin de anticuerpos IgG l anti-DNP simtrico
y asim trico por clulas de hibridom a. E ste
efecto no se m anifiesta si los leucocitos son
previam ente incubados con progesterona. El
aadido de 5% de sobrenadante leucocitario a
las clulas del hibridoma produjeron un in cre
mento del 70%, respecto del control, en la se
crecin de molculas Ig G l asimtricas, y un
aum ento del 10% en la produccin to tal de
Ig G l. Si el sobrenadante provena de leucoci
tos previamente incubados eon la hormona, las
clulas de hibridom a redujeron la sntesis de
IgG l anti-DNP asimtricas en un 9% y en un
18% la produccin total de molculas de an ti
cuerpo.
Los resultados expuestos, provenientes de
experiencias in vivo e in vitro, indican que la
placenta y los linfocitos de hembras preadas
secretan factores que increm entan la p ro p o r
cin de molculas IgG asimtricas, las que, d a
do su co m portam iento b io l g ico p a rtic u la r
(bloqueante), si expresan actividad anti-antgenos paternos participaran activamente en los
mecanismos de proteccin del feto durante la
preez.
Por otra parte, se podra presum ir que la
progesterona, al actuar sobre los PRs citoslicos presentes en las clulas linfoideas, pondra
en marcha un mecanismo modulador de la sn
tesis de molculas simtricas y asimtricas in
ducida por los linfocitos de las hembras p re a
das.
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METODOLOGAS

IV

Mtodos utilizados para la identificacin

y cuantificacin de antgenos y anticuerpos

RICARDO MARGNI

PRECIPITACIN
CUALITATIVA
Precipitacin en medios lquidos
Puede hacerse mezclando volmenes igua
les de las soluciones de antgeno y anticuerpo.
La aparicin de turbidez indica reaccin posi
tiva.
No obstante, el mtodo ms utilizado es el
del anillo, basado en la reaccin interfsica que
se produce cuando en un pequeo tubo se colo
can sucesivamente, y evitando que se mezclen,
las soluciones de antgenos y anticuerpos que
se corresponden. Es conveniente, para evitar
redisoluciones, que los reactivos se encuentren
en concentraciones equivalentes.

de tubos 0,2 mi del suero precipitante, aadien

do luego por las paredes 0,2 mi del material a
investigar en diluciones 1:1, 1:2, 1:5 y 1:10.
Dejar en bao de agua a 37C durante una hora
y observar si en alguno de ellos aparece un p re
cipitado anular blanco.
2. Cuando se desea identificar un antgeno:
colocar en una serie de tubos 0,2 mi de los d is
tintos sueros precipitantes, aadiendo luego por
las paredes 0,2 mi del material sospechoso. In
cubar a 37C durante una hora e investigar la
aparicin de anillo blanco en alguno de ellos.
El tubo que d reaccin positiva indicar co
rrespondencia entre el antgeno y el respectivo
anticuerpo.
En todos los casos es indispensable colocar
tubos testigos con solucin salina y cada uno
de los reactivos (fig. 9-1).

M aterial necesario
a) Sueros precipitantes, clarificados por cen
trifugacin.
b) Antgenos: si estn en solucin, se em
plean como tales. Si fueran productos insolu
bles sospechosos de contener antgenos solu
bles, se los trata con solucin salina fosfatada
para solubilizar. Centrifugar para clarificar.
c) Solucin salina fosfatada: solucin de clo
ruro de sodio 0,15 M, fosfatos 0,01 M, pH 7,2.
d) Tubos de 5 X 0,3 cm.
e) Pipetas Pasteur.
f) Gradillas; bao termostatizado; centrfuga.

Precipitacin en medios gelosados

IN M U N O D IF U S I N

1.
din)'

Precipitacin en tubos (mtodo de Ou-

Material necesario

a) Agar purificado para uso inmunolgico al

1% en solucin de cloruro de sodio 0,15 M y
0,01% de Merthiolate.
b) Agar al 0,5% en el mismo 'diluyente.
c) Antgenos a estudiar.
d) Sueros precipitantes o anticuerpos p u rifi
Mtodo
cados correspondientes.
1.
Cuando se desea saber si un antgeno d e e) Pipetas de 1 mi.
terminado est presente: colocar en una serie
f) Tubos de 5 X 0,5 cm.

698

Metodologas

Mtodo
En pequeos tubos de hem lisis m ezclar
partes iguales de agar al 1% fundido y enfriado
a 50C y suero precipitante. Transferir 1 mi de
la mezcla al tubo de reaccin, enfriando rpida
m ente para que solidifique. Inm ediatam ente
despus aadir 0,5 mi de agar al 0,5% fundido
y enfriado a 50"C, y luego de la solidificacin
agregarle 1 mi de una mezcla en partes iguales
de agar al 1% y antgeno.
Despus de la solidificacin, los tubos, con
venientemente tapados para evitar evaporacio
nes, son dejados a temperatura ambiente 24-48
horas para la lectura de los resultados (figs. 9-8
y 9-9).
2. Precipitacin en placas (Mtodo de Ouehterlony)^
Material necesario
a) Agar purificado al 1,5%, en solucin de
cloruro de sodio 0,15 M y 0,01% de M erthiola
te o agarosa al 0,8%.
b) Sueros precipitantes.
c) Soluciones de antgenos a estudiar.
d) Placas de Petri o portaobjetos.
e) Pipetas de 1 mi y 10 mi.
f) Pipetas Pasteur.
g) Sacabocados o matrices especiales para
la confeccin de los orificios sobre el gel de
agar.
Mtodo
En caja de Petri estril se vierten 15 mi de
agar fundido y enfriado a 50C. Se deja solidi
ficar y se confeccionan los orificios de 5 mm
de dimetro, que deben distar 1 cm entre s. Si
se usaran portaobjetos, se aade a cada uno 2,5
mi de agar, y la distancia entre los orificios, de
2,5 mm de dimetro, debe ser de 5 mm.
Segn los sistemas que se desee anahzar as
ser la distribucin de los antgenos y antisue
ros en los orificios de las placas de agar con
feccionadas (figs. 9-10, 9-11 y 9-12).
Las lecturas de los resultados se efectan a
las 24-72 horas; las placas o portaobjetos se
mantienen en cmaras hmedas.
Si interesa conservar los resultados, puede
colo rerselo s previa d esecaci n , segn las
instrucciones indicadas en inmunoelectrofore
sis.
Para obtener buenas reacciones de precipita
cin eo geles, tanto en tubos como en placas,
los reactivos deben ser utilizados en diluciones
ptimas para evitar la solubilizacin de los pre
cipitados por exceso de reactivos, en especial
de antgeno.

In

m u n o e l e c t r o f o r e s is

^''*

M aterial necesario
a) Agar purificado para inmunoelectrofore
sis. Existen en el comercio agares elaborados
que renen las condiciones de pureza necesa
rias para su uso (Agar Difeo, Ion Agar, Agar
Noble, etc.). En caso contrario, el agar debe ser
sometido a lavado y precipitaciones alcohlicas
para eliminarle todas aquellas sustancias que
pudieran interferir en la reaccin.
Con el agar se prepara una solucin acuosa
al 2,5%, que en el momento del uso, previa fu
sin, se mezcla con partes iguales del buffer
usado para la eleetroforesis.
Puede usarse agarosa a la concentracin fi
nal del 0,8%. En este gel los fenmenos electroendosmticos estn minimizados, hecho que
debe tenerse en cuenta en la interpretacin de
los resultados.
b) Buffer para eleetroforesis: se prepara disol
viendo 11 g de Veronal sdico en 900 mi de
agua destilada. Se aade luego HClN hasta pH
8,4 (aproximadamente 16 mi), y se completa
con agua hasta un litro. Su fuerza inica es 0,05.
c) Portaobjetos desengrasados. Para evitar
cjue el agar o la agarosa se desprenda de los
portaobjetos, conviene pretratarlos cubrindo
los con una pequea pelcula de agar al I % en
NaCl 0,15 M o agarosa al 0,5% en el mismo
diluyente. Los portaobjetos desengrasados cu
biertos con una delgada capa de gel, bien ex
tendida sobre la superficie con un hisopo, son
secados en estufa a 50C. Una vez secos se los
envuelve en papel de aluminio y se los conser
va en heladera hasta el momento de ser usados.
Los geles preparados sobre estos portaobjetos
quedan adheridos y no se desprenden.
d) Matrices para confeccionar los orificios
de siembra y las canaletas de precipitacin.
e) Pipetas Pasteur.
f) Pipetas graduadas en lam bdas para las
siembras de las muestras.
g) Cubas para las corridas electroforticas.
h) Fuente de poder estabilizada capaz de su
ministrar una tensin de 0-400 voltios y 0-50
miliamperios.
i) Solucin salina para lavado: cloruro de so
dio 0,15 M.
j) Soluciones colorantes: existen varias, sien
do recomendables las siguientes protenas:
I) Fucsina c id a ..............................
Alcohol 96..................................
Agua destilada............................
cido actico...............................
II) Negro am ido................................
Acido actico................................
Agua destilada..............................

0,5 g
250
200
50
100
20
980

mi
mi
mi
mg
mi
mi

Mtodos utilizados para ia identificacin y cuantificacin de antgenos

Para coloraciones de glucoprotens, Upoprotenas o sustancias con actividad especfica,
pueden emplearse otros mtodos de tincin.
k) Decolorantes: se utiliza cido actico al
25% en metano) al 50%.
Mtodo
Se preparan las placas y se aaden 2,5 mi de
la m ezcla agar-buffer por cada portaobjeto.
Mediante la aplicacin de las matrices corres
pondientes se confeccionan los esquemas ade
cuados. Se colocan las placas en los soportes y
con pequeos trozos de papel de filtro embebi
dos en buffer se efectan los puentes que unen
las placas con las cubas. Se colocan las m ues
tras a analizar en los orificios de siembra y, he
chas las conexiones, se pone en funcionamien
to la fuente de poder, aplicando una corriente
de aproximadamente 6 v/cm. Con 75 minutos
de corrida se consigue una buena separacin
electrofortica.
Luego de esto, se separan las placas, se eli
mina el agar de las canaletas en las que se colo
ca el inmunosuero y se las deja en cmara h
meda por 24-48 horas para que la precipitacin
entre los antgenos y anticuerpos se produzca.
Para conservar los resultados las placas pue
den ser directamente fotografiadas o secadas y
coloreadas para su conservacin. En este caso,
estas placas deben ser previamente lavadas por
inmersin en solucin salina, donde se las deja
24-48 horas, con recambios cada 12 horas. El
lavado es necesario para eliminar la protena no
precipitada. Luego de lavadas, se cubren las
placas con un trozo de papel de filtro hmedo y
se dejan a tem peratura ambiente hasta seque
dad. Se retira el papel y se las sumerge en la
solucin colorante (15 minutos para la I y una
hora para la II). El exceso de colorante se eli
mina por inmersin en la solucin decolorante
y se procede luego al secado, que puede acele
rarse colocndolas en una estufa a 50C (figs.
9-15, 9-16 y $-17).
CUANTITATIVA
Valoracin de anticuerjpospor curva
de precipitacin

Cua n d o

e l a n tg e n o n o c o n tie n e n itr g e n o

(P O L I S I D O S M I C R O B IA N O S )^

d) Suero a valorar clarificado por centrifuga

cin, adicionado a EDTA 7 mg m i '.
e) Solucin del posido especfico (500 |j,g
m i '), clarificada por centrifugacin.
f) Solucin de hidrxido de sodio 0,1 N.
g) Bao termostatizado, gradillas, centrfuga,
refrigeradora.
h) Espectrofotmetro,
M todo
La valoracin se efecta en tubos de hem li
sis de acuerdo con el siguiente esquema:

T ubo

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Suero
Antgeno aadido
precipi- ~
tante (mi)
(mi)
(Mg)

0,5
0,5
0,5
0,5
0.5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5

0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50

S o lu ci n
sa lina
(m i)

25
50
75
100
125
150
175
200
225
250

0,45
0,40
0,35
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05

In c u b a r ' e n b a o d e a g u a a 37C d u r a n te 1
hora, y 24 horas a 4 C en refrigeradora.
Centrifugar, volcar los sobrenadantes y lavar
los precipitados tres veces con solucin salina
tamponada. Finalmente, escurrir los tubos por
inversin sobre papel de filtro, disolviendo los
precipitados en 2 mi de NaOH 0,1 N. Leer al
espectrofotm etro a 280 nm. Las DO ledas,
multiplicadas por 2 (dilucin) y por el factor
correspondiente a la inmunoglobulina de la es
pecie animal que se analiza (10/E '*,^,^), dan
los valores del contenido proteico (anticuerpo)
de cada tubo. Con ellos se confecciona la curva
de precipitacin y se grafican mg de anticuerpo
en el precipitado (0,5 mi de suero) versus |J,g de
antgeno aadido, lo que permite determinar el
ttulo de los anticuerpos. La figura 9-3 y el cua
dro 9-1 corresponden a una valoracin de anti
cuerpos antipolisido neumoccico tipo III.
Los factores de conversin de inmunoglobu
linas de diferentes especies anim ales se en
cuentran en el Apndice III.
C

u a n d o e l a n t g e n o e s u n a e r o t e n a

C O M P L E J A (O V O A L B M IN A , S E R O A L B M IN A
B O V IN A , E T C ./

M aterial necesario
a) Tubos de hemlisis.
b) Pipetas de I mi, 2 mi y 5 mi.
c) Solucin salina tamponada (cloruro de so
dio 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,2).

699

M aterial necesario
a) Tubos de hemlisis.
b) Tubos de 5 X 0,3 cm
c) Pipetas de 1 mi, 2 mi y 5 mi.

700

' Metodologas

d) Pipetas Pasteur.
e) Solucin salina tamponada (cloruro de so
dio 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,2).
f) Suero a valorar clarificado por centrifuga
cin, adicionado a EDTA 7 mg m h .
g) Solucin del antgeno especfico (500
|j,g-ml-l) clarificado por centrifugacin.
h) Solucin de hidrxido de sodio 0 ,1 N.
i) Bao termostatizado, gradillas, centrfuga,
refrigeradora.
j) Espectrofotmetro.
Mtodo
Se efecta en tubos de hemlisis utilizando
el esquem a indicado en el m todo anterior.
Terminada la incubacin de 24 horas a 4C, los
tubos se centrifugan y se separan los sobrena
dantes de los precipitados. Con los precipitados
se procede del mismo modo indicado anterior
mente, y se determina el contenido proteico de
cada tubo (anticuerpo y antgeno). Con cada
sobrenadante se efectan precipitaciones zona
les por el mtodo del anillo descrito, frente a
antgeno y anticuerpo, a efectos de establecer
la zona de equivalencia (tubo en el que la pre
cipitacin sea negativa para ambos). Estableci
do ello, al contenido proteico total del tubo, de
terminado por espectrofotometra, se le resta la
protena antignica aadida ya conocida, y di
cha diferencia corresponder a la protena anti
cuerpo contenida en 0,5 ml de suero.
Para la conversin de la DO en mg de prote
na se utilizan los factores correspondientes a
las respectivas inm unoglobulinas, dado que
siendo las relaciones Ac/Ag aproximadamente
10 a 1, la protena antignica influye muy poco
en los resultados (cuadro 9-3).
C u a n d o e l a n t g e n o e s u n a p r o t e n a
M ARCADA CON UN HAPTENO CUYA MXIMA
ABSORCIN BSPBCTROFOTOMTRICA
SE PRODUCE A UNA LONGITUD DE ONDA
DISTINTA DE 280 NM (PROTENAS MARCADAS
CON DINITROFENOL, CIDO SULFANLICO, ETC.)

Para la descricin del mtodo se tomar co

mo ejemplo un suero de conejo obtenido por
inmunizacin con gammaglobulina humana dinitrofenolada (HGG-DNP) y como antgeno,
albm ina bo v in a m arcada con d in itro fen o l
(BSA-DNP), ya que interesa valorar anticuer
pos antidinitrofenol (a-DNP).
Material necesario
a) Tubos de hemlisis.
b) Pipetas de 1 ml, 2 m l y 5 ml.
c) Solucin salina tamponada (cloruro de so
dio 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,2).

d) Suero a valorar clarificado por centrifuga

cin, al que se le aaden 7 mg m h de EDTA
para evitar la coprecipitacin del complemento.
e) Solucin de BSA-DNP (500 |ig m h )D ebe contener no menos de 30 grupos DNP
por mol de BSA. Para su preparacin, vase el
captulo 44.
Considerando que el antgeno incorpora pro
tena al precipitado, para calcular la protena
anticuerpo es necesario determinar el factor de
correccin del antgeno a usar. Para ello se pre
paran cuatro diluciones del mismo en solucin
salina tamponada, que contengan 100, 200, 300
y 400 |Tg m l l a s que se mezclan con un vo
lumen igual de NaOH 0,1 N. Se deja 15 minu
tos en reposo para estabilizar y se lee al espec
trofotmetro a 280 nm y 360 nm. Los resulta
dos obtenidos se grafican y con ellos se deter
mina el factor de correccin. La figura 35-1 co
rresponde a una determinacin experimental.
f) Solucin de hidrxido de sodio 0,1 N.
g) Bao termostatizado, gradillas, centrfuga,
refrigeradora.
h) Espectrofotmetro.
Mtodo
La valoracin se efecta en tubos de hemli
sis siguiendo el mismo esquema indicado para
antgenos proteicos complejos (ovoalbmina,
seroalbmina bovina, etc.). Los precipitados,
una vez disueltos en 2 ml de NaOH 0,1 N, son
ledos en el espectrofotm etro determ inando
las DO a 280 nm y 360 nm. A las DO medidas
a 280 nm se les sustrae el valor que resulta de
multiplicar la DO a 360 nm por el factor de coiTeccin (protena del antgeno). La DO a 280
nm resultante, m ultiplicada por el factor de
conversin correspondiente (A pndice III),
perm itir conocer los miligramos de protena
anticuerpo en el precipitado de cada tubo. Con
ellos se confecciona la curva de precipitacin y
se determina la concentracin de anticuerpo s
rico (fig. 9-4 y cuadro 9-2). Con las lecturas de
DO a 360 nm se calcula el antgeno presente en
cada tubo, lo que a su vez permite establecer
las relaciones Ac/Ag. stas sirven de control
ya que en la zona de equivalencia (m xim a,
precipitacin del anticuerpo) dicha relacin es
aproximadamente 10.
Valoracin de anticuerpos por floculacin
Este mtodo se utiliza cuando el antisuero a
valorar es de origen equino (suero antidiftrico,
suero antitetnico, etc.). Como ya se ha indica
do, en estos casos el precipitado que se deposi
ta en forma de flculos es soluble en exceso de
anticuerpo y de antgeno, y la zona de precipi
tacin es ms estrecha (fig. 9-7).

Mtodos utilizados para la identificacin y cuantificacin de antgenos

701

Se tomar como ejemplo la valoracin de un

suero antidiftrico (mtodo de Ramn).
M aterial necesario
a) Tubos de hemlisis.
b) Pipetas de 1 mi, 2 mi y 5 mi.
c) T oxoide diftrico. Se utiliza un toxoide
estabilizad o valorado en L f (vase cap. 4).
Conviene diluirlo a 100 L f mL'.
d) Suero antidiftrico a valorar clarificado
por centrifugacin. Si no se tiene idea aproxi
mada del ttulo, conviene hacer la valoracin
por duplicado, usando en una serie suero sin di
luir y en la otra suero 1:5.
e) Solucin salina tamponada (cloruro de so
dio 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,2).
f) Bao termostatizado, gradillas, centrfuga.
Mtodo
En una serie de tubos colocar cantidades fi
jas de toxoide y cantidades crecientes de anti
suero. Completar al mismo volumen con solu
cin salina tamponada, mezclar para homoge
neizar e incubar en bao de agua a 45C hasta
floculacin del primer tubo. Calcular el ttulo
de suero analizado (cuadro 35-1).
ste contendr 100 L f de antitoxina, ya que
la floculacin ocurre en aquel tubo en que ant
geno y anticuerpo se encuentran en la zona de
equivalencia. Si el tubo en que aparece la flo
culacin inicial hubiese sido el N 4, el ttulo
del suero sera 100/0,4 = 250 L f mL.
Valoracin de antgenos
por inmunodifusin radial
M aterial necesario
a) Agar purificado para uso en inmunodifu
sin. Con l se prepara una solucin al 2% en
buffer de Veronal sdico pH 8,4 (el indicado
en inmunoelectroforesis, adicionado con 0,01%
de Merthiolate).
b) Antisueros especficos.
c) Antgenos patrones.
d) Placas de vidrio de 3 x 10 cm o similares.
En casos especiales pueden usarse portaobjetos.
e) Pipetas de 2 il, 1 mi y 5 mi.
f) Sacabocados de 2 mm de dimetro o ma-

|ig DNP - BSA/ml

Fig. 35-1.

G rfica que perm ite d eterm inar con cu n ta p ro

tena contribuye el antgeno en los precipitados A g-A c. C o
rresponde a albm ina bovina dinitrofenolada (D N P-B SA ).

trices especiales para la confeccin de los o rifi

cios sobre las placas de agar.
Mtodo
A adir 5-10% del antisuero especfico al
agar fundido y enfriado a 50C, procurando que
la m ezcla sea lo ms hom ognea posible (la
cantidad de antisuero a usar depende del conte
nido en anticuerpos del que conste). Inm ediata
mente cubrir la placa con una cantidad d e la
m ezcla capaz de producir una capa de gel de
1 mm de espesor y dejar en reposo hasta solidi
ficacin. Mediante el empleo del sacabocados
efectuar sobre el gel una serie de orificios, los
que deben estar situados a distancias co n v e
nientes para evitar interferencias. Se necesita
un orificio para la muestra a valorar y cuatro a
cinco orificios para las distintas concentracio
nes del antgeno patrn, las que habrn de u tili
zarse para la elaboracin de la curva.
En un orificio de la placa se colocan 2 ^ I de
la solucin antignica a valorar, o dilucin co n
veniente. En los orificios restantes son coloca
dos 2 |i! de las diluciones del antgeno patrn
(idntico al que se valora). Las placas se m an
tienen a temperatura ambiente, en cmaras h
medas, hasta que el halo de precipitacin no
aumente.
La evaluacin de los resultados se hace m e
diante la determinacin del dimetro de los h a

Cuadro 35-1
Tubos

Suero antidiftrico
Toxoide diftrico (100 L f m i-')
Solucin salina

0,1
1

0,2
1
0,8

0,3

0,5

0,5

0,8
1
0,2

0,9

0,9

0,6
1

0,7

1
0,7

0,5

0,5

0,4

0,3

Incubar a 45 h asta floculacin de! p rim er tubo

' Los v o l m en es in d icad o s c o rresp o n d e n a m i.

1
0,1

JO

1
1
_

702

Metodologas

los de precipitacin. Puede efectuarse sobre el

material fresco o previa desecacin y lavado de
manera similar a la indicada para inmunoelec
troforesis.
L a m edida directa de los dim etros de los
halos de precipitacin es un mtodo poco sen
sible. Resulta ms conveniente utilizar una am
pliadora fotogrfica. Colocando las placas en la
ranura donde se ubican los negativos, es posi
ble ampliar los halos convenientemente y me
dirlos sobre papel milimetrado. Con los valores
obtenidos se calculan los r^.
Graficando los valores de r^ versus las res
pectivas concentraciones del antgeno patrn, se
obtiene la curva que permitir calcular la con
centracin antignica de la muestra analizada.
Si se hubiese valorado una solucin de alb
mina bovina, y con un dilucin de la solucin
de 1:100 se hubiese obtenido un r^ de 10 mm^,
tomando como valores los de la curva patrn
de la figura 9-13 la concentracin de albmina
bovina sera 0,6 x 100 = 60 mg m L.

g) Bao termostatizado, gradillas, centrfu

ga, refrigeradora.
h) Espectrofotmetro.
Mtodo

Utilizando el mtodo indicado en Valoracin

de anticuerpos por curva de precipitacin, de
terminar cul es la dosis de antgeno que pro
duce la mxima precipitacin (zona de equiva
lencia), usando para ello volmenes fijos de 0,5
mi de suero de conejo antidinitrofenol y canti
dades crecientes de seroalbmina bovina dini
trofenoiada.
Conocido ello, en una serie de tubos colocar;
0,5 mi de suero antidinitrofenol y cantidades
crecientes de hapteno (0,05 a 0,35 mi), comple
tando todos los tubos a 0,85 mi con solucin
salina tamponada. Incubar 1 hora a 37C en ba
o de agua. Aadir luego a cada tubo la canti
dad de antgeno correspondiente a la zona de
equivalencia e incubar 1 hora a 37"C y 24 horas
a 4C (cuadro 35-2).
Centrifugar, volcar los sobrenadantes y lavar
Inhibicin de precipitacin por haptenos "
los precipitados tres veces con solucin salina
Teniendo en cuenta que la reversibilidad de tamponada. Aadir a cada tubo 2 mi de NaOH
la reaccin entre el hapteno y el anticuerpo es 0,1 N y despus de 15 minutos leer las DO a
ms manifiesta, aproximadamente cinco veces 280 nm. Considerando como 100% de precipi
superior, que la correspondiente entre anticuer tacin (0% de inhibicin la lectura del tubo
po y antgeno, constituye ste un dato importan N8), calcular sobre la base de las lecturas ob
te que no debe olvidarse cuando se hacen clcu tenidas en los otros tubos los correspondientes
porcentajes de inhibicin.
los tericos previos para estos tipos de ensayos.
Se tomar como ejemplo suero de conejo anAl realizar el grfico del porcentaje de inhi
tidinitrofenol, obtenido por inm unizacin con bicin versus |i,g de hapteno aadido, puede
gammaglobulina humana dinitrofenoiada.
elaborarse la correspondiente curva (fig. 9-6),
Conviene incluir como testigos un tubo con
un sistema Ag-Ac distinto del reactivo (en este
M aterial necesario
caso ovoalbmina-antiovoalbmina) y otro con
a) Anticuerpo: suero de conejo antidinitro- el mismo sistema y el hapteno en estudio para
fenol conteniendo aproximadamente 3 a 4 mg descartar el poder inhibitorio inespecfico que
m i ' de anticuerpo.
ste pudiera tener.
b) Antgeno: seroalbmina bovina dinitrofe
E lectroforesis, inmunoelectroforesi
noiada al 0 ,1% en solucin salina tamponada.
c) Hapteno especfico: solucin de dinitro se inm unodifusin rad ial cuan titativ a
en acetato de celulosa**
fenol 0,001 M en solucin salina tamponada.
d) Solucin salina tam ponada; cloruro de
E l e c t r o f o t r e s is
sodio 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,2.
e) Tubos de hemlisis.
El acetato de celulosa como soporte de corri
f) Pipetas de 1 mi y 10 mi.
da tiene mayor poder resolutivo que el papel.
Cuadro 35-2
Tubos
A ntisuero
H apteno (0,001 M)
S olucin salina
A ntgeno (dosis ptim a)

0,5
0,05
0,30
0,5

0,10

0,5
0,15

0,20

0,25

0,20

0,5

'

0,5

0,5
0,5
0,5
0,25
0,30
0,15
0,10
0,05
Incubar a 37C durante una hor a
0,5
0,5
0,5
0,5
Incubar 1 hora a 37'C y 18 horas a 4"C

" L o s v o l m en es in dicados co rresp o n d e n a m i.

7
0,5
0,35 .

8
0,5
-

0,35

0,5

0,5

Mtodos utilizados para la identificacin y cuantificacin de antgenos

703

g) Lquido de elucin: cido actico al 80%

en agua destilada (v/v).
h) Cubeta para eleetroforesis: con puente so
porte de 11 cm y 8,5 cm. Resulta muy iitil el
modelo 2 PAC/5 (Chemetron).
i) Fuente de poder estabilizada capaz de su
ministrar 0-400 voltios y 0-50 mA.
j) Dispositivo para las siembras.

locada en la cuba. En estas condiciones el tiem

po de corrida ptimo es de 55 minutos.
e) Despus del fraccionamiento proteico, su
mergir las tiras en la solucin colorante durante
5 m inutos, y decolorar luego con la solucin
decolorante. Normalmente, con tres recambios
se consigue una buena decoloracin de las p ar
tes libres de protenas.
f) Si se desea hacer cuantificacin, puede lo
grarse por densitometra o elucin. En este iltimo caso cortar las fracciones proteicas, co lo
carlas en tubos de ensayo y disolverlas en un
volumen fijo de cido actico a f 80%. Leer en
el esp ectro fo t m etro a 620 nm . Usar co m o
blanco un trozo de la tira de acetato de celulosa
procesada, que no contenga protenas, disuelta
en cido actico al 80%.
Los clculos de los porcentajes de las distin
tas fracciones proteicas de la muestra se hacen
relacionando directamente las DO (620 nm). Si
se conoce la concentracin proteica de la m ues
tra analizada, los porcentajes hallados pueden
transformarse en valores absolutos.
La cuantificacin de las fracciones puede ha
cerse tambin mediante el empleo de un densitmetro adecuado.
g) Si las corridas electroforticas efectuadas
son para estudios cualitativos, conviene transparentizar el material. Para ello, las tiras decolora
das segin se indic en e) son deshidratadas por
inmersin en metanol durante 30 segundos, de
inmediato se las coloca en la solucin de trans
parencia durante 60 segundos, agitando m anual
mente. Retirarlas y colocarlas sobre una placa
de vidrio limpia; eliminar el exceso de lquido
de transparencia. Llevar a estufa a 60C o poner
la placa de vidrio bajo una lmpara de rayos in
frarrojos hasta completar la transparentizacin.
Dejar a temperatura ambiente hasta la prdida
completa de la humedad (figs. 9-17 y 35-2).

Mtodo

1 N M U N O E I.E C T R O F O R E S L S

Puede usrselo tambin con muy buenos resul

tados para inmunoelectroforesis. El acetato de
celulosa gelatinizado (C ellogel de Chemetron, Miln) es recomendable.
M aterial necesario
a) Tiras de acetato de celulosa (Cellogel 2,5
X 17 cm).
b) Buffer Veronal-Veronal sdico:
Veronal sdico
Veronal
Agua destilada hasta
Ajustar a pH 8,6

10,30 g
1,34 g
1.000
mi

c) Solucin colorante:
Amidoschwartz 10 B
Metanol
Agua destilada
Acido actico glacial

0,5
35
45
10

mg
mi
mi
mi

d) Solucin decolorante: cido actico al 5%

en agua.
e) Bao deshidratante: metanol puro.
f) Bao de transparencia:
Metanol
Acido actico
Glicerina

87 mi
12 mi
I mi

a) Las tiras de acetato de celulosa, que se

conservan sumergidas en metanol al 40%, de
ben ser lavadas previamente con solucin buf
fer para eliminar todo vestigio de alcohol que
pudiera desnaturalizar las protenas.
b) Sacar las tiras del buffer y secarlas entre
dos hojas de papel de filtro. Extenderlas sobre
el soporte (puente de 11 cm), con la superficie
absorbente hacia arriba.
c) Utilizando un sembrador adecuado, depo
sitar a 2,5 cm del extremo catdico 3,5 |ll de la
muestra a analizar. La concentracin proteica
debe ser ajustada a 50-70 mg mL si se trata
de una mezcla de sustancias. Para productos
puros, 10-30 mg mL*.
d) Facer pasar una corriente de 200 V fijos y
2,5 mA por cada tira de acetato de celulosa co-

M aterial necesario
a) Micropipetas de 2,5 y 25 [J,!.
b) Solucin salina: cloruro de sodio 0,15 M.
c) Plantilla gua para depsito de las m u es
tras a analizar y los antisueros.
d) Antisueros especficos.
e) El resto de material necesario es el indica
do en eleetroforesis en acetato de celulosa.
Mtodo
C olocar las tiras lavadas con buffer en el
puente soporte de 8,5 cm. De acuerdo con los
esquemas indicados en la figura 35-3, sem brar
2,5 |ll de muestra a analizar. Efectuar el xaccionamiento proteico en las condiciones indica-

704

Metodologas
que la lnea de depsito sea lo ms fina posible
y guarde las relaciones de distancia indicadas.
Colocado el antisuero se cortan los extremos
de las tiras de acetato de celulosa (para evitar
que contacten con el lquido de la cmara de
difusin) y se las deja en su interior para que
actie como cmara hiimeda. El tiempo de difu
sin no debe ser superior a 18-24 horas. Finahzado ste, retirar las tiras de la cmara htimeda
y lavarlas con solucin salina durante dos ho
ras, agitando, con el objeto de eliminar el exce
so de antisuero y protenas que no han precipi
tado. Durante esta operacin conviene recam
biar 3-4 veces la solucin de lavado.
Colorear y transparentizar como se indic en
electroforesis (fig. 9-17).
C u a n t if ic a c i n d e p r o t e n a s
POR INMUNODIFUSIN RADIAL
EN ACETATO DE CELULOSA

El principio del mtodo es el descrito para

inmunodifusin radial en agar.
F ig . 3S-2. Electroforesis en acetato de celulosa de tres sue
ro s de pacientes con m ielom a. Las inm unoglobulinas son
IgG m onoclonales con diferente carga neta, de ah su dis
tinta m ovilidad electrofortica.

das anteriormente (200 V, 2,5 mA por tira, 55

minutos de corrida).
Finalizado ei fraccionamiento, dejar las tiras
sobre el puente soporte y, empleando la planti
lla gua o una reglilla, depositar con una pipeta
de 25 |0,1 el antisuero especfico. La cantidad
depende del ttulo de anticuerpos del antisuero.
Generalmente son necesarios 50 jl (2 pipetas);
para ello colocar 25 |xl y, cuando se hayan ab
sorbido, colocar los otros 25 jal. Es importante

M aterial y mtodo
a) Tiras de acetato de celulosa; resultan muy
titiles para estas determinaciones las de Cellogel, 5,7 X 14 cm. Previo a su uso deben ser la
vadas con buffer de veronal sdico (veronal s
dico 8,24 g, agua destilada hasta 1.000 ml; pH
9,2).
Se las seca entre dos hojas de papel de filtro
y se las coloca en un bastidor con la superficie
absorbente hacia arriba. Existen en el comercio
cmaras de inm unodifusin con tensores que
permiten fijar los extremos de las tiras.
b) Plantilla de siembra, con perforaciones de
igual dimetro, para el depsito de las muestras
a valorar.

2 mm

\
(-)

50 ni antisuero

c
O 2.5 ni Ag
-f
2mm
3 mm
C

50 |xl antisuero

5mm ] ^ 2 ,5 hI Ag
25 M
-l antisuero

(+)

........................ 1

F ig . 35-3. El esquem a A se utiliza cuando se desea com parar dos antgenos. El esquem a B, para com parar antisueros.

Mtodos utilizados para la identificacin y cuantificacin de antgenos

c) El inmunosuero precipitante debe ser uti
lizado a dilucin conveniente para conseguir la
mxima precipitacin. Con 200 |il se cubre la
superficie de la tira, distribuyndolos unifor
memente. Los esparcidores volumtricos DC/6
(Chemetron) facilitan esta tarea.
Tapar la cmara de difusin y dejar 24 horas
para conseguir una buena estabilizacin de la
tira. Para evitar que se seque conviene sellar la
cmara con cinta Durex.
d) Transcurrido el tiempo indicado, sacar la
tapa de la cmara de inmunodifusin y dejarla
descubierta durante 2-3 minutos para que la tira
pierda una parte del lquido de saturacin y se
absorban con facilidad las muestras a valorar,
que se depositarn sobre su superficie. Para
ello sacar la cubierta, y a travs de los agujeros
de la plantilla de siem bra depositar, con una
micropipeta o microjeringa, 1 )il de cada una
de las diluciones de la protena patrn y de las
muestras a valorar.
e) Retirar las tiras de la cmara de inmunodi
fusin y colocarlas individualmente entre dos
vidrios de 10 x 20 cm; cerrar los bordes con
cinta Durex. Colocar en cmara hmeda bien
nivelada y dejar 48 horas.
f) Retirar las tiras, lavarlas con solucin sali
na durante una hora, agitando constantemente.
Recambiar el lquido de lavado cuatro a cinco
veces durante ese perodo.
Colorear durante 3 minutos con solucin de
Amidoschwartz al 0,5% en metanol-agua-cido
actico y decolorar como se indic en electro
foresis.
g) La lectura de los resultados, la prepara
cin de la curva de calibracin y los clculos se
efectan de igual manera que la indicada en in
munodifusin radial en agar.
E l e c t r o in m u n o d jf u s i n
(R O C K E T E L E C T R O F O R E S IS )^

Es un mtodo muy usado para el dosaje de

algunas protenas sricas; sus fundamentos han
sido ya descritos en el captulo 9.
Puede ser desarrollada sobre placas de gel de
agarosa conteniendo el correspondiente an ti
suero o en tiras de acetato de celulosa, prefe
rentemente Cellogel, impregnadas con el inm u
nosuero. Se describir la metodologa que utili
za este ltimo soporte.
M ateriales necesarios
a) Tiras de Cellogel de 5,7 x 14 cm.
b) Equipo com pleto para electroforesis en
acetato de celulosa.
c) Micropipetas de 1 |il.
d) Distribuidor volumtrico DC/6.
e) Antisueros monoespecficos.

705

f) Soluciones patrones de antgenos.

g) Solucin buffer de veronal sdico 0,04 M,
pH 9,2 (8,24 g htro->).
h) Solucin de lavado: NaCl 0,15 M.
i) Solucin colorante: azul brillante de Coomasie al 2,5% en metanol-cido actico-agua
(5:1:5).
j) Solucin decolorante; metanol-cido actico-agua (5:1:5).
Mtodo
Sumergir las tiras de acetato de celulosa en
la solucin buffer por 10 minutos, retirarlas, es
currirlas sobre dos hojas de papel de filtro y ex
tenderlas sobre el puente de 8,5 cm de la cm a
ra electrofortica. Dejar 2-3 minutos para que
las tiras se vuelvan ms absorbentes.
A continuacin, empleando micropipetas de
1 il, se siembran las diferentes concentraciones
de antgeno patrn y las muestras de suero d es
conocidas en las que ese antgeno se quiere v a
lorar. Las muestras se siembran a 1 cm de d is
tancia del ctodo y separadas entre s por 0,8
cm. Para visualizar mejor la zona de la siembra
es recomendable colorear las muestras con azul
de bromofenol.
Inm ediatam ente despus, esparcir, con el
distribuidor volum trico, el antisuero co n v e
nientemente diluido en buffer (3 |il/cm^ de su
perficie), hasta conseguir una buena d istribu
cin y absorcin del antsuero.
La cantidad total de antisuero a usar, as c o
mo su dilucin, dependen del ttulo de a n ti
cuerpos. Generalmente se usan 150 |il de d ilu
cin 1:2.
A continuacin se hace pasar la corriente
elctrica, que ser de 120 volts durante 75-90
minutos cuando se valora albmina, y durante
tiempos mayores (120-180 minutos) para las
fracciones con movilidad beta.
Finalizada la corrida, las tiras se lavan con
solucin de NaCl 0,15 M durante 30 minutos,
agitando perm anentem ente, con el objeto de
eliminar las protenas no precipitadas.
Se introducen las tiras en solucin colorante
por 5-10 minutos y luego se decoloran hasta la
perfecta visualizacin de los picos de precipita
cin (fig. 9-19).
La medida de la altura de los picos se e fe c
ta con un vernier o una regla de buena c a li
dad, considerando como punto base el centro
de la siembra. Con los valores obtenidos con
las diferentes concentraciones del antgeno p a
trn (los picos mximos no deben ser inferio
res a 4 cm de alto) se construye una grfica, la
cual perm ite calcular por interpolacin, tal c o
mo se describiera en inmunodifusin radial, la
concentracin antignica de la muestra an ali
zada.

706

Metodologas

INMUNOFUACIN'*

I"

Los fundam entos del m todo ya han sido

descritos en el captulo 9.
M aterial necesario
a) Tiras de acetato de celulosa, preferente
mente desecado no gelatinizado, de 150 X 78
mm, porque requiere menor cantidad de inmu
nosuero para el revelado y menos muestra para
el anlisis.
b) Antisueros monoespecficos (para el estu
dio de inmunoglobulinas: anti-y, anti-ji, anti-a,
anti-5, anti-e, anti-K y anti-?^).
c) Cuba electrofortica y fuente de poder.
d) Nigrosina, Ponceau S, azul brillante de
Coomassie R-250.
Mtodo
a) La protena a inmunofijar debe ser previa
mente diluida en el buffer de corrida de modo
que su concentracin final oscile entre 5 y 20
mg%. En casos particulares en que interese ob
tener una banda de precipitacin ms intensa,
sobre todo cuando se analizan sueros patolgi
cos, stos deben ser diluidos de modo que la
concentracin proteica del producto a investi
gar oscile entre 50 y 100 mg%.
b) E fectuar la eleetroforesis convencional
sobre acetato de celulosa, haciendo siembras
con un m ultiaplicador de m anera de obtener
varias corridas de la misma muestra.
El buffer a usar es el de Veronal 0,06 M, pH
8,6 y la corrida debe hacerse con una corriente
constante de 0,4 mA/cm de ancho de la tira.
c) El inm unosuero a usar debe ser diluido
convenientemente en el buffer de Veronal de
corrida adicionado con polietilenglicol 6.000 al
4%. La dilucin debe ser tal que permita una
buena precipitacin del antgeno, lo que se
consigue cuando Ag y Ac estn en zona de
equivalencia. No debe olvidarse que el exceso
de Ag da lugar a la formacin de complejos so
lubles, hecho que es ms manifiesto cuando los
inmunosueros fueron obtenidos por inmuniza
cin de caballos y ovejas. Estos inconvenientes
estn minimizados si los antisueros provienen
de conejos o cabras.
Los antisueros diluidos 1:10 a 1:2 de su con
centracin origina] deben ser previamente fil
trados por m em branas porosas para retener
cualquier protena agregada que pudieran con
tener, ya que su presencia dara lugar a un
fondo en los preparados teidos.
d) Inmediatamente despus de la electroforesis, la tira de acetato de celulosa se corta en
fragmentos, de modo que cada uno de ellos co
rresponda a una corrida. Uno de los fragmentos

es procesado para su teido en la forma habi

tual indicada para eleetroforesis en acetato de
celulosa, con Ponceau S al 0,2% en cido trieloroactico al 3% o con Nigrosina al 0,1%, se
gn el caso.
El resto de los fragmentos es introducido en
recipientes planos especiales que contienen los
diferentes inm unosueros m onoespecficos, o
apoyados sobre soportes son recubiertos con
aqullos. Despus de 5 minutos, las tiras de
acetato de celulosa son lavadas con el buffer de
corrida, adicionado con 0,1% de Tritn X-100,
y con solucin salina. Inmediatamente despus
son coloreadas como en el caso anterior, usan
do Ponceau S si el inmunosuero empleado fue
previamente diluido 1:2, o Nigrosina si la dilu
cin fue 1:10. Muy buenos resultados se obtie
nen tambin tiiendo eon azul brillante de Coo
massie R-250 al 0,25% en metanol-agua-cido
actico (5:5:1 en volmenes).
Por comparacin de los fragmentos de aceta
to de celulosa correspondientes a la corrida no
inm unoprecipitada y a las que reaccionaron
con los inm unosueros, puede establecerse la
identidad del componente sospechoso.
V a l o r a c i n s im u l t n e a e n s u e r o d e o v e ja
D E a n t i c u e r p o s U B IC A D O S EN LA S ER A C C IO N E S
in m u n o g l o b u l n ic a s I g

GI

(yl)

IgG2 (y2)

Puede lograrse por com binacin de adsor

cin en zona de equivalencia y eleetroforesis
en acetato de celulosa.
M aterial necesario
a) El descrito para valoracin de anticuerpos
totales por precipitacin cuantitativa.
b) El indicado en eleetroforesis en acetato de
celulosa.
Mtodo
1. Valoracin de protenas totales. Se hace
p o r c u a lq u ie ra de los m to d o s c o n o c id o s
(Biuret, Lowry, etc.). Puede efectuarse tam
bin por lec tu ra e sp ectro fo to m trica. P ara
ello, diluir el suero convenientemente (1/75 a
1/100) y leer absorcin a 280 nm. M ultipli
cando el valor de la DO leda por 0,83 se ob
tiene la concentracin proteica del suero en
mg m \-'. El valor 0,83 resulta de lO/E
co
rrespondiente a un suero normal de oveja cu
yo contenido proteico fue determinado previa
mente por Kjeldahl.
2. Valoracin de anticuerpos totales. Se ob
tiene por curva de precipitacin de acuerdo con
el mtodo ya descrito. Es necesario determinar
el ttulo de anticuerpos y en especial la zona de
equivalencia (concentracin de antgeno que

Mtodos utilizados para la identificacin y cuantificacin de antgenos

707

produce la mxima precipitacin). Si se trata antgeno aadido. Ello se consigue aplicando la

de anticuerpos contra determinantes antigni siguiente ecuacin:
cos definidos (DNP), se hace por lectura espec
IgG% X protenas totales del suero (mg m k ') x F
trofotomtrica a la longitud de onda correspon
= mg m l'
Too
d ie n te . C u an d o so n a n tg e n o s c o m p le jo s
(ovoalbmina), se efecta reaccin zonal con en la cjue IgG = IgG l o IgG2, y E = 1 + v o lu
los sobrenadantes de los tubos de precipitacin, men de antgeno aadido por mi de suero.
frente a anticuerpo y antgeno, estableciendo en
La protena del antgeno aadido no interfie
cul de ellos no existe exceso de ninguno de re porque es incorporada a la concentracin co
rrespondiente a la zona de equivalencia y en
los reactivos.
3.
Valoracin de anticuerpos ubicados en esas condiciones es prcticamente eliminada en
las fracciones globulnicas y\ y yZ. Se hace el precipitado.
por electroforesis en acetato de celulosa. Es
La concentracin de los anticuerpos u b ica
necesario efectuar dos determinaciones: la pri dos en las fracciones inmunoglobulinas Ig G l e
mera correspondiente al suero inmune total, y IgG2 se calculan sustrayendo a las valoracio
la segunda, al mismo suero previamente adsor nes de IgG l e lgG2 en mg ml'^' del suero no
bido con el antgeno especfico en la zona de adsorbido, las obtenidas respectivamente en la
equivalencia. Para ello, a 1 mi de suero aadir valoracin del suero despus de la adsorcin
le la cantidad de antgeno determinada en b. con el antgeno especfico.
Dejar en contacto durante una hora a 37C y
24 horas a 4C. Puede hacerse tambin por inAGLUTINACIN
m unoadsorcin, usando el inm unoadsorbente
especfico (antgeno polim erizado o unido a
CUALITATIVA
saphorosa).
En el sobrenadante de centrifugacin, ai Ensayos de identificacin
igual que en el suero inmune sin adsorber, va de microorganismos
lorar protenas totales en la forma indicada e
inmunoglobulinas IgG l e lgC2 por electrofore M aterial necesario
sis en acetato de celulosa. Para ello, una vez
efectuada la corrida y antes de la coloracin,
a) Un cultivo en medio slido de la bacteria
cortar las tiras en los valles correspondientes a a tipificar.
las fracciones IgG l e IgG2 (fig. 35-4). Cada
b) Antisueros anti bacterianos de distinta es
fraccin inmunoglobulnica se disuelve en 3 mi pecificidad.
de cido actico al 80% (v/v) y el resto de la ti
c) Placas de Petri.
ra en 9 mi. Leer las DO a 620 nm. Con estos
d) Mango de Kole con hilo de platino o niresultados, y despus de haber hecho las co crn.
e) Solucin salina tamponada: cloruro de so
rrecciones teniendo en cuenta los volmenes de
disolucin de los fragmentos de la tira de ace dio 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,2.
tato de celulosa, pueden calcularse las concen
f) Tubos de hemlisis.
traciones por ciento de IgG l e IgG2.
g) Pipetas de 0,1 mi.
En el caso del suero sin adsorcin, esos valo
h) Pipetas Pasteur.
res pueden transform arse en mg mi ' c o
i) Varillas de vidrio para agitar.
nociendo la concentracin proteica total del
suero.
Mtodo
Para calcular IgG l e IgG2 en el suero adsor
bido, es necesario hacer las correcciones por
Suspender el cultivo microbiano en solucin
variacin de volumen como consecuencia del salina tamponada, procurando que sea lo ms

Fig. 35-4. E lectro fo re sis en acetato

de celulosa de suero de oveja. Las l
neas de puntos m arcan las zonas don
de deben efectuarse los cortes para la
separacin de IgG l e Ig 0 2 a efectos
de su cuantificacin.

igG2

708

Metodologas

densa posible (no menos de 20.000 millones de

bacterias por ml). En placa de Petri colocar
0,03 ml de cada uno de los antisueros y 0,03 de
solucin salina tamponada (testigo), de modo
que estn a distancias prudenciales para evitar
mezclas. Aadirles una gota ( 0,03 ml) de la
suspensin bacteriana y mezclar para homogeneizar. Agitar la placa por rotacin manual du
rante 3 minutos y observar.
La aparicin de aglutinacin indicar corres
pondencia entre antgeno y antisuero (fig. 9-23).
Ensayos de tipificacin de antgenos
hemticos
S is t e m a

AB/0

Mtodo
Colocar sobre la placa de reaccin una gota
de suero anti-D y aadirle igual volum en de
sangre. Mezclar y observar si aparece aglutina
cin. No conviene prolongar los tiem pos de
lectura (mximo 3-5 minutos).
2. Prueba en tubos con sueros anti-C, anti-D,
anti-E, anti-c y anti-e (para determinar el fe
notipo y el probable genotipo)

M aterial necesario
a) Placa de reaccin.
b) Palillos de madera para mezclar.
c) Sangre total obtenida directam ente del
pulpejo del dedo, sangre oxalatada, citratada o
heparinizada.
d) Sueros hemoclasificadores ant-A y antiB.
Mtodo
Colocar en la placa de reaccin una gota de
suero anti-A y otra de anti-B. A adir a cada
una de ellas un volumen de sangre total aproxi
madam ente igual a 1/3 del correspondiente a
antisueros. Mezclar y, manteniendo la placa a
tem p eratu ra am biente, o b serv ar si aparece
aglutinacin.
Los resultados se interpretan de la siguiente
manera:
Aglutinacin con
G rupo sanguneo

b) Palillos de madera para mezclar.

c) Sangre total obtenida directam ente del
pulpejo del dedo; sangre oxalatada, citratada o
heparinizada.
d) Suero anti-D para pruebas en placa.

Suero anti-A

Suero anti-B

AB

M aterial necesario
a) Suspensin de hemates al 2%; se prepa
ran a esa concentracin en su propio suero o
plasma.
b) Sueros anti-D, anti-C, anti-E, anti-c y anti-e para pruebas en tubo.
c) Tubos de hemhsis pequeos.
d) Pipetas de 1 ml y 5 ml.
e) Pipetas Pasteur.
f) Bao termostatizado regulado a 37C.
g) Centrfuga.
Mtodo
En una serie de cinco tubos colocar, respec
tivamente, una gota de cada antisuero. Aadir a
todos ellos una gota de la suspensin de hema
tes, mezclar por agitacin e incubar a 37C du
rante 15 minutos. Centrifugar a 1.000 rpm du
rante un minuto. Por agitacin muy suave de
los tubos, determinar en cules se ha producido
aglutinacin.
CUANTITATIVA

S is t e m a R h

1. Prueba en placas con suero anti-D (para

determinar si el individuo es Rh positivo).*'

Valoracin por el mtodo rpido

de aglutinacin en placas*^
M aterial necesario

M aterial necesario

a) Antgeno: suspensin microbiana de apro

a)
Placa de reaccin: teniendo en cuenta que ximadamente 10" (100.000 millones) de bacte
los anticuerpos anti-Rh interaccionan mejor en rias por mililitro, en solucin de cloruro de so
caliente, es muy til em plear como placa de dio al 12%.
reaccin una botella de cara plana llena de agua
Generalmente se adicionan colorantes, como
calentada a 45-50C.
el cristal violeta que, adems de actuar como

Mtodos utilizados para la identificacin y cuantificacin de antgenos

bacteriostticos, facilitan la lectura de los resul
tados.
b) Suero a valorar.
c) Pipetas de 0,2 mi y 1 mi.
d) Aglutinoscopio.
Mtodo

709

AGLUTINACIN CON ANTGENOS

SOLUBLES UNIDOS A SOPORTES
INERTES
Cuando se emplean hemates como
soporte
P o r f i j a c i n d i r e c t a (s i e l a n t g e n o
ES U N h i d r a t o d e C A R B O N O )'^

Sobre la placa de vidrio del aglutinoscopio,

colocar 0,08 mi, 0,04 mi, 0,02 mi, 0,01 mi y
0,005 mi del suero a valorar. Aadir, 0,03 mi
del an tg en o a to d o s ello s, m ezclar y le e r
los resultados entre los 3 y 5 minutos. El ttu
lo estar dado por la mxima dilucin agluti
nante.
P ara las cantidades indicadas los ttu lo s
aglutinantes son, respectivamente, 1:25, 1:50,
1:100 y 1:400. Cuando el ttulo de los anticuer
pos es muy elevado (aglutinacin de todas las
diluciones), debe usarse suero 1:2 o 1:4, multi
plicando el ttulo obtenido por la dilucin para
expresar el valor final.

Valoracin por aglutinacin

lenta en tubos
M aterial necesario
a) Antgeno: suspensin bacteriana en solu
cin salina tamponada a la concentracin de 5
X lO (5.000 millones) por mililitro.
b) Solucin salina tamponada: cloruro de so
dio 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,2.
c) Pipetas de 1 y 5 mi.
d) Tubos de hemlisis.
e) Bao termostatizado regulado a 37C, gra
dillas.
Mtodo
En una serie de tubos, colocar 0,5 mi de so
lucin salina tamponada. Al primero de la se
rie, aadirle 0,5 mi del suero a valorar, m ez
clar, extraer 0,5 mi de la mezcla y transferirla
al segundo; 0,5 mi de sta transferirla al terce
ro, y as sucesivamente. El ltimo tubo lleva
slo solucin salina como control. A adir a
todos los tubos 0,5 mi de suspensin antigni
ca e incubar a 37C durante 2 horas. Leer los
resultados. El ttulo estar dado por la mxima
dilucin capaz de dar aglutinacin visible.
En los casos de urgencia pueden acelerarse
los resultados incubando durante 15 minutos
a 37C y centrifugando luego a 3.000 rpm du
rante 5 m inutos. Previa agitacin suave, d e
term inar cul es la m xim a dilucin ag lu ti
nante.

El mtodo es muy utilizado en la investiga

cin de anticuerpos contra lipopolisacridos
bacterianos y antgenos poliosdicos diversos.
M aterial necesario
a) Antgenos: se emplean productos purifica
dos. En el caso de los lipopolisacridos b acte
rianos se los obtiene a partir de bacterias trata
das con fenol-agua a 65-68C y precipitacin
posterior con alcohol, segn las especificacio
nes dadas en el captulo 43. La concentracin
antignica ptim a debe determ inarse ex p e ri
mentalmente en cada caso.
b) Suero a valorar: previo a su uso se lo ca
lienta a 56C durante 30 minutos y se lo adsor
be durante una hora a tem peratura am biente
con un 10% de hemates lavados para elim inar
anticuerpos heterfilos.
c) Glbulos rojos de carnero: se utiliza una
suspensin al 2% en cloruro de sodio 0,15 M,
fosfato 0,01 M, pH 7,2. Para su preparacin y
v alo raci n se sigue el m todo indicado en
Complemento (cap. 22).
d) Sensibilizacin de los hemates: se m ez
clan volmenes iguales de la solucin antigni
ca y glbulos rojos al 2%. Despus de 30 m i
nutos de contacto a 37C se centrifuga, se lavan
los hemates dos veces con solucin salina tam
ponada y se suspenden al 1% en el mismo d ilu
yente.
e) Tubos de hemlisis.
f) Pipetas de 0,1 mi, 1 mi y 5 mi.
g) Bao termostatizado, gradillas, centrfu
ga.
Mtodo
En una serie de tubos pequeos, colocar 0,5
mi de diluciones crecientes del suero a valorar
y aadir a cada uno de ellos 0,5 mi de glbulos
rojos sensibilizados con el antgeno poliosdico. Incubar a 37C durante una hora y dejar a
temperatura ambiente hasta el da siguiente. Se
examinan los tubos y se determina cul es la
m xim a dilucin con capacidad aglutinante.
Para ello se sigue el criterio indicado en h emoaglutinacin pasiva de Boyden.
Es necesario incluir siempre testigos consti
tuidos por glbulos rojos no sensibilizados y

710

Metodologas

suero a analizar, y glbulos rojos sensibilizados

frente a sueros negativos y de positividad cono
cida.
P o r s e n s ib il iz a c i n p r e v ia
(A N T G E N O S PR O T E IC O S)

1. Hemoaglutinacin pasiva de Boyden'^-'''

M aterial necesario
a) Antgeno: debe emplearse la concentra
cin ptima en cada caso, que vara entre 1 y 5
mg de protena por mi.
b) Suero a valorar: previo a su uso debe ser
calentado a 56C durante 30 minutos y adsorbi
do con hemates lavados no sensibilizados para
eliminar anticuerpos heterfilos. Para ello, aa
dirle un 10% del paquete globular e incubar a
temperatura ambiente durante una hora, clarifi
cando por centrifugacin.
c) Solucin buffer de pH 7,2:
Cloruro de sodio 0,15 M ..................... 500 mi
Fosfato monopotsico 0,15 M ........... 120 mi
Fosfato disdico 0 ,15 M ..................... 380 mi
d) Solucin buffer de pH 6,4:
Cloruro de sodio 0 ,15 M ..................... 500 mi
Fosfato monopotsico 0,15 M ........... 339 mi
Fosfato disdico 0,15 M ..................... 161 mi
e) Solucin salina: cloruro de sodio 0,15 M.
f) Glbulos rojos lavados al 2,5%: normal
mente se emplean los de carnero.
La sangre obtenida por puncin venosa se
m ezcla con solucin de A lsever y en el m o
mento del uso se lava tres veces con 10 vol
menes de solucin salina y se diluye al 2,5% en
buffer de pH 7,2. Para su valoracin se emplea
el mtodo indicado en Complemento (cap. 22).
g) Solucin de tanino: se prepara al 1% en
agua destilada. Se conserva bien en heladera,
debiendo desechrsela si contiene precipitados.
El tanino a usar debe ser de muy buena calidad.
Para la reaccin se usa una dilucin 1:20.000
en solucin salina, la que se prepara a partir de
la solucin madre.
h) Taado de los hemates: mezclar volme
nes iguales de glbulos rojos al 2,5% y tanino
1:20.000. Incubar a 37C durante 10 minutos y
centrifugar a 2.000 rpm durante 5 m inutos.
Volcar el sobrenadante y lavar con un volumen
igual de solucin buffer de pH 7,2, efectuando
luego un lavado con solucin salina. Resuspen
der en ella hasta volumen original.
i) Sensibilizacin de los hemates: a 2 mi de
glbulos rojos taados agregar 8 mi de solu

cin buffer de pFI 6,4 y 2 mi de antgeno. Mez

clar y dejar a temperatura ambiente 10 minu
tos. Centrifugar y lavar dos veces con 4 mi de
suero normal de conejo al 1% en solucin sali
na, llevando finalm ente el sedimento a 2 mi
con el mismo diluyente.
Sim ultneam ente se prepara la suspensin
testigo de glbulos rojos taados siguiendo el
procedimiento anterior, pero reemplazando el
antgeno por solucin salina.
Nota: para algunos antgenos, como el toxoide tetnico, por ejemplo, se consiguen mejores
suspensiones aglutinantes si para el taado de
los eritrocitos se usa una dilucin 1:40.000.
Mtodo
Siendo la reaccin altam ente sensible, el
suero a valorar debe ser diluido en forma con
veniente.
En una serie de tubos colocar 0,5 mi del sue
ro a valorar diluido en razn 2, utilizando suero
normal de conejo al 1% en solucin salina co
mo diluyente. Aadir a todos los tubos 0,05 mi
de glbulos rojos taados y sensibilizados al
2,5%. Incluir dos tubos testigos que contengan
0,5 mi de la primera y las ltimas diluciones
del suero a valorar, respectivamente, a los que
se les aade 0,05 mi de glbulos rojos taados
no sensibilizados al 2,5%.
Agitar y dejar a temperatura ambiente efec
tuando la lectura entre las 3 y 24 horas.
Puede facilitarse la lectura con la ayuda de
un espejo cncavo. Conviene incluir tubos con
trol con sueros positivos y negativos.
La figura 9-26 muestra los fondos de los tu
bos de reaccin, en los que pueden verse distin
tos grados de hemoaglutinacin.
2. Hemoaglutinacin pasiva previa sensibiliza
cin con tricloruro de cromo (CrCl)''^
El material y el instrumental necesarios son
los indicados en los otros mtodos de hemoa
glutinacin.
a)
Sensibilizacin de glbulos rojos: se em
plean glbulos rojos humanos del grupo O, Rh
negativo, o hemates de pollo, los que, previo
lavado por tres veces, son suspendidos en solu
cin de NaCl 0,15 M. Antes de su uso se sepa
ran los glbulos rojos por centrifugacin.
A un volumen de NaCl 0,15 M aadirle y
mezclar un volumen de la solucin del antge
no proteico (0,5-3 mg.ml *) y un volumen del
paquete de los glbulos rojos lavados. Aadir
luego 2 volm enes de una dilucin 1/50 en
NaCl 0,15 M de una solucin madre de CrClj
(CrClj 6H,0 al 1% en agua destilada). Agitar

Mtodos utilizados para la identificacin y cuantificacin de antgenos

711

intensamente 5-15 minutos. Aadir 20-40 vo lucin salina fosfatada aadirles 0,1 mi de una
lmenes de NaCl 0,15 M, centrifugar, lavar 3 suspensin de glbulos rojos de carnero al 50% ,
veces con la m ism a solucin y suspender al previamente lavados y suspendidos en el mismo
2%.
diluyente. Agregar 1 ml de bencidina bis-diazoSi los iiemates as sensibilizados dieran au- tizada diluida 1:30 en solucin salina fosfatada
toaglutinacin en solucin salina, significa que y m antener la mezcla a temperatura ambiente
el tratamiento con CrClj ha sido excesivo. Para durante 15 minutos. Centrifugar 5 m inutos a
1.500 rpm, volcar el sobrenadante y lavar los
una buena sensibilizacin se necesita exceso de
antgeno; de ah que dicha concentracin y el glbulos rojos dos veces con solucin salina
tiempo de tratamiento con CrClj deben ser re tamponada. Suspender en 2,5 ml de la m ism a
gulados en cada caso, dentro de los rangos se solucin adicionada de 1% de suero normal de
conejo. Se obtiene de este modo una suspensin
alados.
b)
Suero a analizar (calentado 30 minutos a de glbulos rojos sensibilizados al 2%.
56C): previa dilucin 1:10, se lo mezcla con
c) Suero a valorar: luego de un calentamien
igual volumen de glbulos rojos lavados e in to a 56C durante 30 minutos se lo adsorbe con
cuba una hora a 37C. Se separan los glbulos glbulos rojos para eUminar anticuerpos hetepor centrifugacin y el sobrenadante, libre de rfilos.
cualquier heteroaglutinina natural antihemate,
d) Solucin salina tamponada: cloruro de so
es el que se utiliza en los ensayos.
dio 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,2.
e) Tubos de hemlisis.
f) Pipetas de 0,1 ml, 1 ml y 10 ml.
Mtodo
g) Bao termostatizado, gradillas, centrfuga.
En una serie de tubos de hemlisis colocar
0.5 ml de diluciones seriadas en razn 2, del Mtodo
suero a valorar. Aadirles 0,05 ml de glbulos
rojos sensibilizados con el antgeno especfico
La reaccin se hace mezclando 0,5 ml de d i
y dejar a tem peratura am biente 10 m inutos.
luciones seriadas del suero a valorar y 0,05 mi
Centrifugar un minuto a 1.000 rpm y leer los de la suspensin de glbulos rojos sensibiliza
resultados como en los mtodos ya descritos.
dos.
Los resultados se leen a las 18 horas de p e r
manecer los tubos a temperatura ambiente.
P o r f ija c i n d ir e c t a o in d ir e c t a
D E A N T G E N O A G L B U L O S R O JO S M ED IA N T E
u n io n e s

CO VA LEN TES

1. Mtodo de la hencidina his-diazotizada^'

La hencidina tratada con cido nitroso da un
bis-diazo capaz de copularse simultneamente
con un antgeno y restos reactivos de la mem
brana de los eritrocitos.
M aterial necesario
a) Bencidina bis-diazotizada: disolver 0,23 g
de bencidina en 45 ml de HCl 0,2 N y enfriar en
bao de hielo. Separadamente, disolver 0,175 g
de NaNOj en 5 ml de agua destilada y enfriar
del mismo modo. En un perodo de aproxima
damente un minuto, aadir, con agitacin cons
tante, la solucin de nitrito de sodio sobre la
bencidina. M antener la mezcla en el bao de
hielo durante 30 minutos, agitando cada 5 m i
nutos. Para dar por terminada la reaccin con
viene investigar la ausencia de nitrito libre con
reactivo de ioduro de potasio-almidn.
La bencidina bis-diazotizada se conserva a
- 2 0 C; es conveniente repartir el material en
ampollas y almacenarlo hasta su uso.
b) Sensibilizacin de los glbulos rojos: a 3
ml de solucin antignica (1 a 3 m g-m l) en so

2. Mtodo del difluordinitrobencem/'-

Se utiliza para la investigacin de anticuer
pos antidinitrofenol. La marcacin de los h e
mates con difluordinitrobenceno se hace sobre
los residuos lisina de la membrana celular.
M aterial necesario
a) Solucin buffer-EDTA pH 7,5: se deben
disolver 17 g de EDTA disdico en 300 ml de
agua destilada, ajustar a pH 7,5 con NaOH N
( 45 ml) y aadir luego NaCl 0,15 M h asta
completar un litro.
b) Solucin buffer-EDTA pH 8,4: disolver
1,7 g de EDTA disdico y 5 g de glucosa en 80
ml de agua destilada. A justar a pH 8,4 con
NaOH N y completar a 100 ml con agua d esti
lada.
c) Glbulos rojos de carnero, conejo o h u
manos marcados con DNP: lavar los hemates
3-5 veces con buffer-EDTA pH 7,5 y suspen
derlos al 10% en el mismo buffer.
D isolver 1-3 di flor 4-6 dinitrobenceno al
2% en acetona y por cada 0,15 ml aadirle 1 ml
de buffer-EDTA pH 8,4. Inmediatamente, a un
volumen de ste aadirle, gota a gota y agitan
do, la mitad del volumen de glbulos rojos al

712

Metodologas

10%. Dejar a 37C durante 15 minutos e inte

rrumpir la reaccin por aadido de 6 volme
nes de buffer-EDTA pH 7,5. Centrifugar, lavar
tres veces con el mismo buffer y completar a
un volumen cinco veces superior al de glbulos
rojos inicialmente usado. De este modo se tiene
una suspensin final de glbulos rojos dinitrofenolados al 2%.
Si no se dispone de difluordinitrobenceno
para la marcacin, puede usarse fluordinitrobenceno. Como aqu la reaccin es ms lenta,
para conseguir buenos resultados el buffer ED
TA pH 7,5 a utilizar durante la marcacin debe
prepararse con NaCl 0,3 M. Para la interrup
cin de la reaccin y los lavados debe usarse
buffer-EDTA pH 7,5 preparado con NaCl 0,15
M. Pueden usarse tambin glbulos rojos trinitrofenolados, los que se preparan de la siguien
te manera; con el paquete de glbulos rojos
previamente lavado con buffer de fosfatos 0,1
M.pH 7,8, preparar una suspensin el 5% (v/v)
en el mismo buffer.
Preparar una solucin de trinitrofenil sulfo
nato de sodio (TNB) de 3 mg mi ' en buffer
de fosfatos 0,1 M. pH 7,8.
A un volumen de la suspensin de glbulos
rojos aadir, gota a gota y agitando m anual
m ente, un volum en igual de TNB. D ejar en
agitacin rotatoria por 1 hora a tem peratura
ambiente. Lavar los glbulos rojos trinitrofenolados con NaCl 0,15 M, fosfatos 0,01 M, pH
7,2 y suspender en el mismo buffer.
d) Suero a valorar: previo a su uso se lo ca
lienta a 56"C durante 30 minutos y se adsorbe
con glbulos rojos no marcados para eliminar
anticuerpos antihemates naturales que pudie
ran existir.
e) Tubos de hemhsis.
f) Pipetas de 0,1 mi, 1 mi y 10 mi.
g) Bao termostatizado, gradillas, centrfuga.
Mtodo
A 0,5 mi de diluciones seriadas del suero a
valorar, aadir 0,05 mi de glbulos rojos dinitrofenolados, incubar 15 minutos a 37C y de
jar a temperatura ambiente hasta el da siguien
te. La lectura de los resultados se efecta en la
forma ya indicada.
3. Mtodo del glutaraldehdo'^^'^'^^
M aterial necesario
a) Glbulos rojos de carnero lavados no m e
nos de tres veces con buffer de fosfatos 0,15
M , pH 7,2. Separar el paquete globular por
centrifugacin.
b) Dializar la protena antignica a fijar a los
eritrocitos contra buffer de fosfatos 0,15 M, pH

7,2 y ajustar a la concentracin adecuada (1-2

mg mL')c)
A 10 mi de esta solucin, aadir 0,4 mi
del paquete de glbulos rojos de carnero, mez
clar para homogeneizar y adicionar la cantidad
ptima de glutaraldehdo al 2,5% en agua (0,52
mi). Continuar agitando durante 1 hora, lavar
las clulas tres veces con el buffer de fosfatos
indicado (10 mi cada vez) y suspender final
mente en 5 mi del mismo buffer que contiene
1% de suero normal de conejo o seroalbmina
bovina.
Reaccin. Con el suero a analizar, efectuar
d iluciones seriadas usando com o diluyente
NaCl 0,15 M fosfatos 0,01 M, pH 7,2, aadido
de 1% de suero normal de conejo o seroalb
mina bovina. A 0,5 mi de cada dilucin aadir
0,05 mi de glbulos rojos sensibilizados, mez
clar por agitacin y dejar a 4C por toda una
noche. Leer los resultados.
H e M O A G L U T IN A C I N p a s i v a PA R A A N T G E N O S
PR O T E IC O S Y PO L IO SD IC O S U S A N D O G L B U L O S
R O JO S E S T A B IL IZ A D O S C O N A L D E H ID O S^'

Glbulos rojos de carnero, pollo o conejo,

estabilizados con aldehido frmico o pirvico,
pueden fijar directamente antgenos proteicos o
hidrocarbonados y ser utilizados para reaccio
nes de hem oaglutinacin. Para los antgenos
proteicos los mejores son los glbulos rojos de
carnero estabilizados con aldehido frmico y,
para los hidrocarbonados, los de conejo estabi
lizados sucesivamente con aldehido pirvico y
frmico.
Estos glbulos rojos as sensibilizados, con
servados en heladera, se mantienen tiles por
cinco semanas.
Estabilizacin de glbulos rojos
de carnero con aldehido frm ico
Se emplean glbulos lavados, suspendidos al
8% en buffer de fosfatos 0,11 M, pH 7,2. A un
volumen de formol (aldehido frmico al 40%)
al 7,5% en buffer de fosfatos 0,11 M, pH 7,2,
se le aade con agitacin continua un volumen
de glbulos rojos al 8%. Se mantiene la agita
cin (agitador magntico) durante 17 horas a
temperatura ambiente (20C) y luego se centri
fuga y lava cinco veces con buffer de fosfatos.
Se filtra por gasa y se lo suspende al 10% en
buffer de fosfatos 0,11 M. Se conserva a 4C.
Sensibilizacin, con antgenos proteicos,
de glbulos rojos estabilizados con aldehido
frm ico
Se suspende 0,1 mi del paquete globular en 9
mi de buffer de acetato 0,1 M, pH 5 y se le

Mtodos utilizados para la identificacin y cuantificacin de antgenos

aade 1 mi de solucin de antgeno (0,5-3 mgmi). El buffer a utilizar debe ser de un pH pr
ximo al punto isoelctrico de la protena. El in
dicado es el recomendado para ovoalbtimina o
albminas sricas. Se los mantiene en agitacin
durante 2 horas, se los lava cinco veces y sus
pende al 1% en buffer de fosfatos 0,11 M, pH
7,2.
Estabilizacin de glbulos rojos de conejo
con aldehido pirvico y frm ico
Glbulos rojos de conejo son estabilizados
con aldehido pirvico al 3% (ajustado a pH
7,2 con NaOH) de manera similar a la indica
da para aldehido frm ico. Finalmente se los
suspende al 8% en buffer de fosfatos 0,11 M,
pH 7,2. A un volum en de los mism os se le
aade un volumen de aldehido frmico al 3%
(formol al 7,5% ) en buffer de fosfatos y se
agita 17 horas a 20-24C. Se filtra por gasa y
se los suspende al 10% en buffer de fosfatos
0,11 M, pH 7,2.
Sensibilizacin, con antgenos
hidrocarbonados, de glbulos rojos
de conejo estabilizados con aldehido
pirvico y frm ico
Se suspende 0,1 mi del paquete globular en 9
mi de buffer de fosfatos 0,11 M, pH 7,2 y se
aade 1 mi de la solucin de antgeno (10-300
)ig mf*)- Se agita durante una hora, se lava
cinco veces y se suspende al 1% en buffer de
fosfatos 0,11 M, pH 7,2.
Reaccin: Puede hacerse en placas con con
cavidades o en tubos. Para la reaccin se efec
tan diluciones seriadas del suero en fosfato
0,11 M, pH 7,2, adicionado con 0,1% de gelati
na y 0,5% de albm ina (conejo o humana) o
1% de suero normal. Si se efectuara en placas,
en cada concavidad se colocan 25 |U,1 de las di
luciones sricas e igual volum en de glbulos
rojos sensibilizados. Si se hace en tubos, los
volmenes son 0,5 mi. Se agita tres veces con
intervalos de 10 minutos y se deja a temperatu
ra ambiente durante 16-20 horas. Las lecturas
se hacen de manera similar a las ya indicadas.
Nota: Los glbulos rojos formolizados, obte
nidos de acuerdo con las indicaciones dadas en
el mtodo precedente, pueden ser utilizados pa
ra la preparacin de glbulos rojos sensibiliza
dos por la bencidina bisdiazotizada o el difluordinitrobenceno, tal como si fueran glbulos ro
jos frescos. En, el caso de sensibilizacin por
tanino, ste debe usarse en una dilucin de
1:2.000 en lugar de 1:20.000.
Tienen la ventaja de conservarse estables va
rias semanas y no Usarse en soluciones hipotnicas.

713

Cuando se emplean bacterias como

soporte^^
En algunas oportunidades pueden emplearse
bacterias como soportes, en sustitucin de h e
mates, para reacciones de aglutinacin pasiva.
Una de las ms utilizadas es el Micrococcus lysodeikticus, y el mtodo de fijacin de los ant
genos, es el de la carbodiim ida hidrosoluble.
Este mtodo da buenos resultados para diferen
tes tipos de antgenos como los toxoides, alb
minas, gammaglobulina, etc.
M aterial necesario
a) M icrococcus lysodeikticus: la masa m i
crobiana necesaria se obtiene por cultivo de
una cepa controlada, en agar peptonado e n ri
quecido con 5% de extracto de levadura. D es
pus de 48 horas de incubacin a 37C las bac
terias se suspenden en solucin salina fosfatada
y se las calienta a 60C durante 1 hora; reptase
el calentam iento al da siguiente. Hechos los
controles de esterilidad, se procede a centrifu
gar y lavar por tres veces el sedimento m icro
biano, usando para ello solucin salina fosfata
da, suspendiendo finalmente al 80% en el m is
mo diluyente.
b) Sensibilizacin de las bacterias; a 1 mi de
la suspensin bacteriana al 80% se aaden 6,6
m i de la so lu c i n p ro te ic a an tig n ic a (1 5
mg-mf^ en solucin salina fosfatada) y 5 mi de
clorhidrato de l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiim ida al 10%; se m antiene la m ezcla
con agitacin constante 14 a 16 horas, a 4C.
Se lavan las bacterias dos veces con Na^EDTA
al 2% en solucin salina fosfatada y se las su s
pende al 5% en solucin salina.
c) Suspensin microbiana control; se prepara
en las m ism as c o n d ic io n e s e sp e c ific a d a s
en b), pero sustituyendo los 6,6 mi de solucin
proteica antignica por solucin salina fo sfa
tada.
d) Coloracin de las bacterias; para facilitar
la visualizacin, las bacterias sensibilizadas
pueden teirse por el aadido de azul de metileno al 4% en solucin salina fosfatada (0,05
mi por cada mi de suspensin bacteriana). C o
mo conservador puede aadirse azida sdica al
0,1%. Debe conservrsela a 4C.
e) Suero por valorar; previo calentamiento a
56C durante 30 m inutos, adsorberlo con la
suspensin m icrobiana no sensibilizada p a ra
elim inarle cualquier anticuerpo inespecfico
que pudiera contener.
f) Solucin salina fosfatada; NaCl 0,15 M ,
fosfatos 0,01 M, pH 7,2.
g) A glutinoscopio o placas p ara aglutina-

714

Metodologas

Mtodo

M ateriales necesarios

E n la p la c a d el a g iu tin o s c o p io c o lo c a r
0,03 ml de las diluciones seriadas del suero por
valorar que contiene los anticuerpos especfi
cos para el antgeno fijado a las bacterias y
0,03 ml de la suspensin de bacterias sensibili
zadas.
Colocar como control, 0,03 ml de la primera
dilucin de suero y 0,03 ml de la suspensin
microbiana no sensibilizada.
Mezclar con una varilla de vidrio o monda
dientes y determinar directamente, entre los 2 y
4 minutos, si hay aglutinacin.

a) E ritrocitos de carnero: se preparan de

acuerdo a las indicaciones dadas en el captulo
22. Su concentracin final depende del sistema
hemoltico a preparar.
b) H emolisina anticarnero: los mtodos de
preparacin y titulacin ya han sido indicados
en el captulo 22.
c) Complemento: se utiliza una mezcla de
sueros frescos de cobayo. Los mtodos de va
loracin en unidades 50 y 100% hemolticas y
las recomendaciones para su conservacin fue
ron especificadas en el captulo 22.
d) Buffer Veronal-salino: se emplea el reco
mendado por Mayer (captulo 22).
e) Solucin frenadora de la hemlisis: citrato
de sodio al 4% en solucin de cloruro de sodio
0.15 M, mantenida en bao de hielo para ser
agregada helada.
f) Antgenos; deben ser titulados previamen
te a su uso. Para ello se efectan reacciones
con diferentes diluciones de l, respetando las
dosis de antgeno indicadas para el sistema. Se
considera como ptima para la reaccin aquella
que d el mximo de sensibilidad y especifici
dad cuando se la ensaya frente al anticuerpo es
pecfico y a otros no relacionados.
g) Sueros a examinar: deben ser frescos y
mantenidos en heladera no ms de 48 horas. En
caso de que deban conservarse ms tiempo, pa
ra evitar que se vuelvan anticomplementarios
por agregacin de gammaglobulina o contami
naciones, se les aade 0,1% de cistena o glici
na y 0,01% de Merthiolate, que no interfieren
en la prueba. Antes de su uso deben ser calen
tados a 56C durante 30 minutos.
h) Tubos de hemlisis.
i) Pipetas de 1 ml y 5 ml.
j) Gradillas, baos termostatizados, centrfu
ga, refrigeradora.
k) Espectrofotmetro.

Cuando se emplean sustancias inertes

como soportes
O tras sustancias distintas de los hem ates
han sido utilizadas para la fijacin de antge
nos. Eiguran entre ellas las partculas de bentonita de dimetro conveniente seleccionadas por
centrifugacin diferencial, las partculas de co
lodin y las de ltex (poiiestireno) de 0,21 a
0,81 jl de dimetro.
De todas ellas, la ms usada es el ltex de
poiiestireno, el que suspendido al 1% en solu
cin sahna boratada de pH 8,2 (partes iguales
de NaCl 0,3 M y cido brico 0,1 M ajustado a
pH 8,2 con NaOH), glicina 0,1 M ajustada a
pH 8,2 con NaOH 0,1 N u otras soluciones estabilizadoras, puede fijar antgenos en su super
ficie por sim ple contacto, a tem peraturas y
tiempos variables. Las concentraciones antig
nicas y las condiciones de fijacin deben esta
blecerse experimentalm ente en cada caso. Se
consiguen buenas fijaciones entre los 35C y
los 50C; los tiempos varan con la temperatura
empleada.
Con las partculas sensibilizadas se hacen
reacciones en placas, m ezclando volm enes
iguales (aproximadamente 0,05 ml) de ellas y
del suero a analizar. Las lecturas se efectan a
los 3-5 minutos y la positividad se establece
por la aparicin de grumos. El mtodo puede
hacerse cuantitativo si se utilizan distintas dilu
ciones del suero.
F IJA C I N
DEL COMPLEMENTO
Pueden emplearse sistemas con lecturas fina
les del 50 a 100% de hemlisis, los que a su
vez pueden ser cualitativos o cuantitativos.
Como varios de los reactivos a utilizar son
comunes a los diferentes sistemas, se describi
rn en conjunto los materiales necesarios y lue
go los mtodos para cada reaccin.

1. Reaccin cualitativa con lectura del 100%

de hemlisis
Tubos

0,1

0,1

0,1

_
-

0,1

0,1

Id r

Id r

0,5

0,5
0,5
0,5
0,5
Incubar 1 hora a 37C
0,5
0,5
0,5
0,5

S uero a analizar
Suero a analizar
diluido 1:5
A ntgeno
Com plem ento
diluido 1:30*
B uffer c.s.p.

0,1

S istem a hem ollico **

0,5

0,1

0,1

Idr

Idr

Idr
0,5
0,5

Incubar 30 m inutos a 37C

L ectura de los resultados

dr= dosis de reaccin obtenida en la titulacin (100% hem ojtica)

E l siste m a a em p le a r est co n stitu id o p o r g l b u lo s ro jo s al 2% y
2DHioo/m de h em o lisin a , m ez clad o s en p arte s iguales.
El v o lu m en d e ios re activ o s est ex p resad a en m l.

Mtodos utilizados para la identificacin y cuantificacin de antgenos

715

Interpretacin
Tubo I

O
O

O
50
75

25
50
75

% de lisis

R esultado

Tubo 2

++
+

100

100
100

100

Los tubos 1 y 2 son de reaccin. Los tubos 3, 4 y 6 (100% de hemlisis) y el tubo 5 (0% de h e
mhsis) son testigos.
2. Reaccin cuantitativa con lectura del 100% de hemlisis
Tubos
Suero a analizar 1:1
Suero a analizar 1:5
Suero a analizar 1:10
Suero a analizar 1:20
Suero a analizar 1:40
Suero a analizar 1:80
Suero a analizar 1:160
A ntgeno
C om plem ento diluido 1:30
B uffer c.s.p.

0,1

Id r
0,5

0,1
Id r
0,5

0,1
Idr
0,5

0,1
Idr
0,5

Sistem a hem oltico

0,5

0,5

0,5

0,5

0,1

0,1

10

II

0,1

0,1

0,1
0,1

0,1

0,1
0,1

0,1

0,1

0,1

Id r
Idr
Id r
0,5
0,5
0,5
Incubar 1 hora a 37C
0,5
0,5
0,5
L ectura de los resultados

0,1

0,1
Idr
0,5

Id r
0,5

0,5

Id r
0 ,5

0,5

0,5

0,5

0,5

El v o lu m en d e los re ac v o s e s t e x p resad o en m i.

Los tubos 1 a 7 son de reaccin, y los tubos

8 a 11, controles.
Las dosis reactiva (dr) de complemento y el
sistema hemolteo a emplear son los ya indica
dos en la reaccin cualitativa.
El ttulo estar dado por la mxima dilucin
capaz de inhibir la hemlisis en forma parcial o
total. Si se expresa el resultado en unidades, s
tas correspondern a la inversa de la dilucin
que produce el efecto deseado (unidades/0,1
mi).
Leer las DO en el espeetofotm etro a 565

nm, calculando los porcentajes de hemlisis en

cada tubo y usando como testigos tubos que
corresponden al O y 100% de hemlisis, prepa
rados por el agregado de 1 mi de buffer y 1 mi
de agua destilada, respectivamente, a 1 mi de
sistem a hem oltico. Producido el lacado, se
aade a ambos tubos 2 mi de citrato de sodio
helado.
El sistema hemoltico a emplear en la reac
cin se prepara mezclando partes iguales de
glbulos rojos de carnero al 5% y 5 DHj,/ml de
hemolisina.

3. Reaccin cualitativa con lectura del 50% de hemlisis

Tubos

A ntgeno diluido segn titulo

Suero a analizar 1:1
Suero a analizar 1:5
C om plem ento 3CH,(, en 0,2 m i
Com plem ento 2 C H 5,, en 0,2 mi
Com plem ento 4CH,,| en 0,2 mi
B uffer V eronaLsalina

0,1
0,1

0,1

0,1

...

...

0,1

0,1

0,1

0,1
0,1

0,2

0,1
0,2

0,2

0,2

0,2

--

0,2
0,6

0,8

Sistem a hem oltico

Citrato de sodio al 4% helado

0,6

0,6

0,7
0,7
0,6
Incubar 18 horas a 4 C y 15 m inutos a 37C

Incubar 30 m inutos a 37C

Centrifugar a 3.500 rpm durante 5 m inutos y esperar el sobrenadante

El volum en de los re activ o s es t ex p resad o en m i.

716

Metodologas

Interpretacin
Tubos

% de hem lisis

0
12

0
0
0-12
12-25
25-50
50 a > 50

50
50
50
50
50
50

12-25
25-50
50 a > 50
50 a > 50

a
a
a
a
a
a

> 50
> 50
> 50
>50
> 50
> 50

50
50
50
50
50
50

4. Reaccin cuantitativa con lectura del 50%

de hemlisis (cuadro A)
Separar los sobrenadantes y leer en el espec
trofotmetro las DO a 565 nm; calcular el por
centaje de hem lisis en cada tubo y emplear
para ello los tubos 13 (0% de lisis) y 14 (100%
de lisis). Los tubos 9, 10,11 y 12 son testigos.
U tilizando cualquiera de los mtodos des
critos al ocuparnos de la valoracin de com
plem entos en unidades 50% hemolticas, cal
cular cul es la dilucin del suero que da 50%
de hem lisis. Su inversa corresponde a las
unidades de anticuerpo por mililitro.
Aplicando la ecuacin de von Krough a este
sistema reactivo, el valor de 1/n = 0,2. Con l
se ha calculado el cuadro 35-3, que correspon
de a los valores de 1 (1-x) para los diferentes
porcentajes de hemhsis, ya que lo que se mide
es consumo de complemento. Siempre que las
condiciones de la reaccin no se modifiquen ni
varen, se la puede usar para calcular las dosis

a
a
a
a
a
a

> 50
> 50
> 50
> 50
> 50
>50

50
50
50
50
50
50

a
a
a
a
a
a

> 50
> 50
> 50
>50
> 50
> 50

Positividad

>50
>50
>50
>50
>50
>50

0
0
0
0
0
0

++++
+++
-H+

reactivas 50% hemolticas. Para ello multipli

car la dilucin del suero que ms se aproxima a
50% de lisis por el factor correspondiente. Su
inversa constituye el nmero de unidades reac
tivas de anticuerpo por 0,1 mi.
Para las condiciones indicadas en la reac
cin, 3CH,g de complemento constituye la do
sis ptima.
5. R e a c c i n de fija c i n d e c o m p le m e n to
en placas
Materiales necesarios
a) Sueros a examinar inactivados por calen
tamiento a 56C por 30 minutos.
b) Sueros controles positivos y negativos,
inactivados.
c) Glbulos rojos de carnero al 2,8%, segn
se indic en el captulo 22.
d) H em olisina valorada en placas frente a
glbulos rojos al 2,8%.

C u ad ro A. Reaccin cuantitativa con lectura del 50% de hemlisis

T uhos
A ntgeno diluido
segn ttulo
Suero 1:1
Suero 1:2
Suero 1:4
Suero 1:8
Suero 1:16
Suero 1:32
Suero i :64
Suero 1:128
Com plem ento
3 C H 5 en 0,2 mi
C om plem ento
2CH,,, en 0,2 mi
C om plem ento
4CHj(, en 0,2 mi
BuTer V eronal-salina
A gua destilada
Sistem a hem oltico
C itrato de sodio al 4%
helado

3
0,1

0,1

0,1

5
0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

10

II

0,1

0,1

12

13

14

0,1

0,1

0,1

0,1
0,1
0,1

0,1
0,1
0,1

0,1

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2
0,2
0,2

0,6

0,6

0,6

0,6

0,6

0,6

0,6

0,6

0,7

0,7

0,7

0,7

0,9
0,9

Incubar 18 horas a 4C y 1.5 m inutos a 37C

1
1
1
1
1
1
Incubar a 37C durante 30 m inutos

C entrifugar a 3500 rpm durante 5 m inutos

Mtodos utilizados para la identificacin y cuantificacin de antgenos

Cuadro 35-4. Estndares de porcentaje de lisis

Cuadro 35-3
- ---------------------% de lisis

Factor

% de lisis

F actor

10

1,36
1,33
1,30
1,28
1,26
1,24
1,20
1,16
1,12
1,08
1,04

55
60
65
70
75
80
82
84

0,96
0,92
0,87
0,82
0,75

12
14
16
18

20
25
30
35
40
45
50

0,68

90

Solucin
de hem oglobina
(ml)

H em lisis

0,65
0,61
0,57
0,51
0,45

86
88

717

Eritrocitos
a l 0,28% (m l)

0
10
20

0,0
0,1
0,2

LO
0.9

30
40
50
60
70
80
90

0,3
0,4
0,5

0.7

100

1,0

0.8
0.6
0,5
0,4
0.3

0,6
0,7

0,8

0,2
0,1
0,0

0,9

L os eritro cito s al 0,28% se p re p ara n m ez clan d o 1 volum en de g l

bulos ro jo s al 2 ,8 % (su sp e n si n estndar) y 9 v o l m en es de b u ff e r
d iluyente.
L a so lu ci n d e h e m o g lo b in a se p re p ara m ez clan d o 1 m l d e g l b u
los rojos d e ca rn ero al 2 ,8 % , b ien h o m o g en e iz ad o s con 7 v o l m e
nes d e a g u a d estilada, A g itar h asta que los eritro cito s estn lisa d o s .
A a d ir lu eg o 2 m l d e b u ffer d e d ilu ci n y m ezclar.

e) Sistema hemoltico. Mezclar partes igua

les de glbulos rojos al 2,8% y hemoUsina (2
dmh por ml ').
f) Diluyente. Es el mismo que se utiliza para
el macromtodo.
g) Antgeno, usado a la dilucin ptima, pre
via valoracin en placas.
h) C om plem ento. Suero fresco de cobayo
valorado en placas frente al sistema hemoltico
indicado. Las dosis 5 CH^g deben estar conteni
das en 50 |0,1. Las dosis de complemento 2,5
CHjg y 1,25 CH jq se preparan diluyendo la do
sis 5 CHjg a 1:2 y 1:4 en buffer diluyente, res
pectivamente.

llar la reaccin de fijacin de complemento en

placas, se indican en la figura 35-5.
M edicin de la capacidad fijadora
de complemento, usando glbulos
rojos marcados con ^Cr
M ateriales necesarios

Mtodo

a) Glbulos rojos de carnero marcados con

Cr. Para ello los eritrocitos son lavados con
buffer de Mayer (vase cap. 22) y resuspendidos

Las cantidades y la distribucin de los reacti

vos, as como los pasos a seguir para desarroDilucin
de suero
~

1:16

1:32

1:64

1:128

1:256

5
C H ,,

2,5 . U25
CH,,, GH,,

Reaccin

Suero descon.
Antgeno
5C H j,

25
25
50

25
25
50

25
25
50

25
25 .
50

25
25
50

25
25
50

25
25
50

25
25
5()

25
25
50

A ntgeno
Diluyente
Com plem ento

Control

Suero descon.
Diluyente
5CH,

25
25
50

25
25
50

25
25
50

25
25
50

25
25
50

25
25
50

25
25
50

25
25
50

25
25
50

Suero desc. 1:8 Control

Diluyente
suero d esc.
Com plem ento

Reaccin

Suero posil.
Antgeno
5CH3

25
25
50

25
25
50

25
25
50

25
25
50

25
25
50

25
25
50

25
25
50

25
25
50

25
25
50

Suero posit. 1;8 Controi

suero p osit.
Diluyente
Com plem ento

Control

Suero positiv.
Diluyente
5CH,

25
25
50

25
25
50

25
25
50

25
25
50

25
25
50

25
25
50

50
50

50
50

50
50

Diluyente
Com plem ento

Control
diluyente

Reaccin

Suero negal.
Antgeno
5 C H ,,

25
25
50

25
25
50

25
25
50

25
25
50

25
25
50

25
25
50

100

Diluyente

Control
Sistem a
hemol.

Conlrol

Suero negativo
D iluyente
5 C H ,,

25
25
50

25
25
50

25
25
50

25
25
50

25
25
50

25
25
50

Testigo
positivo

Testigo
negativo
L

1:8

Control
antgeno

F ig. 35-5. Los volm enes de los reactivos estn expresados en |i.l. A gitar e incubar a 4C por 15-18 horas. Aadir a to d o s
los pocilios 25 |0.1 del sistem a hem oltico (volm enes iguales de eritrocitos de carnero al 2,8% y dosis ptim a de h e m o lisi
na). C ubrir la placa con tira plstica transparente e incubar a 37C durante 30 m inutos. R etirar. C olocar en cada uno de c in
co pocilios, 25 |il de los controles de O, 30, 50, 80 y 100% de lisis, preparados segn el cuadro 35-4. C entrifugar si se di.spone de centrfuga apropiada o dejar en heladera 2-3 horas hasta que las clulas sedim enten. Leer los resultados por c o m
paracin con los testigos de porcentaje de lisis. Para que los resultados de la reaccin sean vlleos, los controles de 5 CLIj,,
y 2,5 CH 51, y 1,25 CHj,j deben dar los correspondientes grados de lisis.

718

Metodologas

al 50% en el mismo buffer. A 0,2 mi de la sus

pensin de hemates se le aaden 50-100 |0,Ci de
^'Cr (Na/'CrO^) en solucin salina. La suspen
sin se incuba 1 hora a 37C con agitacin fre
cuente. Las clulas se lavan 4-5 veces con 20-30
volmenes de buffer de Mayer. El sobrenadante
del ltimo lavado no debe tener radiactividad
medible. Ajustar la suspensin celular a 2 X 10*
eritrocitos por mi. La marca incorporada no de
be ser inferior a 2.000 c.p.m. para la cantidad de
eritrocitos a usar por tubo de reaccin.
b) Hemolisina. Se la emplea a la dilucin 2
ACH|,,.ml"', determinada segn se indic en el
captulo 22.
Mtodo
I

Tubox
A ntgeno
A ntisuero 1:50
A ntisuero 1:100
A ntisuero 1:200
C om plem ento
D iluyente

0,25 0,25 0,25 0,25

0,25
0,25
0,25
0,25
0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
0,25 0,25 0,25 0,50 0,50 0,75

1,0

hicubar a 37C por I hora

S istem a
hem oltico*

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Incubar a 37C por 30 m inutos

* El s iste m a h e m o ltic o usad o estl co n stitu id o p o r u n a m ez cla de
p a rte s iguales d e eritro cito s d e ca rn ero y h em o lisin a en las c o n c e n
tra c io n e s in d ic a d o s . E l v o lu m en d e lo s re a c tiv o s e s t e x p re s a d o
en m i.

c) Complemento. Se utiliza suero fresco de

cobayo diluido convenientemente de modo que
1 CH|pg est contenida en 0,25 m. La determi
nacin de las unidades CH,pg se efecta como
se indic en el captulo 22.
d) Antgeno. Se lo diluye de manera tal que
contenga 10-15 ag.ml'.
e) El suero a valorar, previamente inactivado
a 56C por 30 mirmtos, se lo diluye 1:50, 1:100
y 1:200.
f) Diluyente. Buffer de M ayer (vase cap.
22 ).

Finalizada la incubacin, los tubos son cen

trifugados y se procede a medir la radiactividad
en 0,75 mi de cada uno de los tubos y en los se
dimentos de todos ellos, previa eliminacin del
resto de sobrenadante. Para la lectura de los re
sultados se utiUza un contador de radiaciones
gamma. Los tubos 1, 2 y 3 son de reaccin, y
los restantes son controles.
El porcentaje de ^'Cr liberado en los tubos de
reaccin, representante de la capacidad fijadora
de complemento, se calcula como sigue:
%

AX 2
5 iC r= -----------A +B

100

Siendo A, radiactividad del sobrenadante, y

B, radioactividad del sedimento. Un 100% de
lisis en los tres tubos significa reaccin negati
va.
IN V ESTIG A C I N D E A N TIC U ER PO S
ANTI RH INCOMPLETOS
Por dilucin en medio albuminoideo^"
M aterial necesario
a) Glbulos rojos del grupo 0-Rh positivos
(D o de la especificidad deseada) al 4% en
NaCl 0,15 M adicionado con 15% de albmina
bovina. Lavar los glbulos tres veces eon 10
volmenes de NaCl 0,15 M. Decantar el sobre
nadante, medir 0,05 mi del paquete globular y
aadir 1,2 mi de NaCl 0,15 M con 15% de al
bmina bovina.
b) Diluyente: albm ina bovina al 20% en
NaCl 0,15 M.
c) Suero a valorar.
d) Tubos de hemlisis pequeos.
e) Pipetas de 0,01,1 mi y 5 mi.
f) Gradillas, bao termostatizado, centrfuga.
Mtodo
En una serie de tubos, colocar 0,1 mf de di
luciones crecientes en razn 2, del suero a va
lorar en albmina bovina al 20%. Aadir a to
dos los tubos 0,1 mi de la suspensin de glbu
los rojos al 4% e incubar una hora a 37C. Cen
trifugar un minuto a 1.000 rpm. Determinar el
ttulo estableciendo cul es la mxima dilucin
aglutinante, previa agitacin suave del sedi
mento globular.
Deben incluirse en la reaccin tubos testigos
con sueros positivos y negativos.
Por modificacin previa de la superficie
de los hemates por accin enzimtica^f
M aterial necesario
a) Glbulos rojos 0-Rh positivos (D o de la
especificidad deseada) tripsinados: se emplea
una suspensin al 4% en NaCl 0,15 M. Para la
tripsinizacin, a un volumen de glbulos rojos
lavados tres veces con solucin salina se le
aade un volum en y m edio de solucin de
tripsina (solucin salina 10 mi, tripsina cristatizada 10 mg, fosfato disdico 1/15 M 2 mi,
fosfato monopotsico 1/15 M 0,05 mi). Se in
cuba en bao de agua a 37C, con agitacin
peridica, durante 10-15 m inutos. Luego se
lavan con solucin salina y se los suspende en
ella al 4%.

Mtodos utilizados para la identificacin y cuantificacin de antgenos

b) Solucin salina: NaCl 0,15 M.
c) Tubos de hemlisis.
d) Pipetas de 0,1 mi, 1 mi y 10 mi.
e) Bao termostatizado, gradillas, centrfuga.

719

El ttulo estar dado por la m xim a dilucin

aglutinante.

Por bloqueo^*
Mtodo
Cualitativo. En un tubo de hemlisis colocar
0,2 mi del suero a analizar y 0,1 mi de la sus
pensin de glbulos rojos tripsinados. Dejar en
reposo 5-10 minutos a temperatura ambiente y
centrifugar a 1.000 rpm durante 1 minuto. D es
prender suavemente el botn celular y determi
nar la presencia de aglutinacin.
C uantitativo. R epetir el m todo anterior,
usando diluciones seriadas del suero a analizar.
El ttulo estar dado por la mxima dilucin
aglutinante.
Por la prueba de Coombs indirecta
M aterial necesario

M aterial necesario
a) Suero a analizar.
b) Glbulos rojos 0-Rh positivos (D o de la
especificidad deseada). Se utiliza una suspen
sin al 2% en solucin sahna.
c) Solucin salina: NaCl 0,15 M.
d) Suero aglutinante anti-Rh: usar un suero
de buen poder aglutinante, de tipo salino, espe
cfico para los glbulos rojos empleados en la
prueba.
e) Tubos de hemlisis.
f) Pipetas de 0,2 mi, 1 mi y 10 mi.
g) Bao termostatizado, gradillas, centrfuga.

Mtodo

a) Glbulos rojos 0-Rh positivos (D o de la

especificidad deseada). Con los mismos, previo
lavado, se orepara una suspensin al 1% en
NaCl 0,15 M.
b) Diluyente: Na C1 0,15 M.
c) Suero de Coombs (suero de conejo anti
globulina humana).
d) Tubos de hemlisis.
e) Pipetas de ] mi y 5 mi.
f) Bao termostatizado, gradillas, centrfuga.

1. Cualitativo: a dos tubos de hemlisis (n- 1

y n- 2) aadir 0 ,1 mi de la suspensin globular.
Al tubo n 1 agregarle 0 ,1 mi del suero a inves
tigar y al tubo n 2, 0,1 mi de solucin salina.
Mezclar e incubar en bao de agua a 37C d u
rante una hora. Centrifugar a 1.000 rpm duran
te 1 minuto. Volcar el sobrenadante y agitar el
sedimento. Si no hay aglutinacin, aadir a c a
da tubo 0,1 mi del suej-o aglutinante, mezclar e
incubar a 37C durante una hora.
La lectura de los resultados se efecta de
Mtodo
manera similar a la indicada en os otros m to
1.
Cualitativo: el esquema de la reaccin es dos descriptos. Ausencia de aglutinacin en el
tubo n 1 y aglutinacin en el tubo n 2 (testi
el siguiente:
go) indica presencia de anticuerpos bloquean
tes. Aglutinacin en ambos tubos expresa re
2
sultado negativo.
/
T uhos
2. Cuantitativo: se repite el ensayo anterior,
G lbulos rojos al 1% (mi)
0,1
0,1
usando diluciones seriadas del suero a valorar.
Suero a valorar (mi)
0,2
El ttulo estar dado por la mxima dilucin ca
N aC I 0,15 M (mi)
0,2
paz de inhibir aglutinacin.
Incubar una hora a 37C, centrifugar y lavar DETECCIN DE ANTICUERPOS
no menos de tres veces con 20 volmenes de CONTRA ANTGENO NUCLEAR
NaCl 0,15 M para eliminar las protenas no an EXTRACTARLE (ENA)
ticuerpos inespecficamente adheridas. Volcar
Se sigue esencialmente la tcnica de hem oa
los sobrenadantes y aadir a cada tubo 0,1 mi
de suero de Coombs. Incubar a 31C durante 15 glutinacin pasiva de Boyden con la siguientes
minutos, centrifugar y determinar si hay agluti variantes.
nacin.
El tubo 1 es el de reaccin, y el 2, el de con M aterial necesario
trol. Aglutinacin en el tubo 1 indica presencia
a)
Antgeno: extracto salino de timo de co n e
de anticuerpos incompletos.
2.
Cuantitativo: repetir el ensayo anterior, jo. La concentracin ptima es 1 mg de prote
usando diluciones seriadas del suero a valorar. na por mi.

720

Metodologas

b) Suero a valorar: previo a su uso debe ser

calentado a 56C durante 30 minutos.
c), d) y e) Igual a la tcnica original.
f) Glbulos rojos lavados al 4%. Se emplean
glbulos rojos humanos, grupo O, Rh negativo.
g) Igual a la tcnica original.
h) Taado de los hemates: mezclar voMmenes iguales de glbulos rojos lavados al 4% y
cido tnico al 1:20.000. Incubar 30 minutos a
temperatura ambiente y 30 minutos a 4C. La
var 3 veces con solucin de buffer pH 7,2. Resuspender luego hasta volumen original.
i) Sensibilizacin de los hemates: mezclar
volmenes iguales de glbulos rojos taados y
solucin antignica. Mezclar y dejar a tem pe
ratura ambiente durante una hora. Centrifugar
y lavar una vez con solucin buffer de pH 7,2
y dos veces con suero normal de conejo al 2%
en solucin salina, llevando parcialm ente el
sedim ento a volum en original con el mismo
diluyente. Dividir el volumen total de la sus
pensin de glbulos rojos en partes iguales. A
una de ellas se le agrega una solucin de RNasa a razn de 1 mg por cada mi de suspensin
de glbulos rojos y se coloca 30 m inutos a
37C.
M todo
Se realizan dos series de diluciones por cada
suero en estudio. En cada orificio de la microplaca se colocan 50 )ll del suero a valorar dilui
do en razn 2, utilizando suero normal de cone
jo al 2% en solucin salina como diluyente. Se
aaden a todos los orificios de una serie 25 |J,1
de glbulos rojos taados y sensibilizados y a
los de la otra serie los glbulos rojos taados,
sensibilizados y tratados con RNasa. Se inclu
yen orificios testigo que contienen la primera y
la ltima dilucin de cada suero en estudio a
los que se les aaden 25 il de glbulos rojos
taados, no sensibilizados; adems, orificios
donde se colocan 50 |ll de diluyente y glbulos

Toxina tetnica
al 1 p o r m il (mi)

0,21
0,22
0,23
0,24
0,2-5
0,26
0,27

Antitoxina
tetnica
patrn
0,1 U Alm l (mi)

1
1
1
1
1
]
I

rojos taados y sensibilizados tratados o no con

RNasa.
Se contina igual que en la tcnica original.
Interpretacin
Si las dos series de sueros a los que se les
agregaron glbulos rojos taados y sensibiliza
dos con RNasa y sin ella tienen igual ttulo, la
positividad es debida solamente a anticuerpos
contra antgeno Sm. Si la positividad se en
cuentra nicamente en la serie donde se coloca
ron las clulas sin tratar, los anticuerpos estn
dirigidos contra antgeno RNP solamente. Si
por el contrario, la reduccin del ttulo en la se
gunda serie no es total, habr presencia de anti
cuerpos contra ambos antgenos.
VALORACIN DE ANTITOXINAS
POR NEUTRALIZACIN
Se describir como modelo la valoracin de
antitoxina tetnica.
M aterial necesario
a)
Toxina valorada: las instituciones oficia
les proveen antitoxinas patrones para la valora
cin de toxinas, dada la poca estabilidad de s
tas. Para ello se hace una dilucin conveniente
de la toxina en solucin salina, la que es mez
clada en diferentes dosis con una cantidad co
nocida de antitoxina (en este caso 0,1 UA),
com pletando a un volum en final de 2,5 mi.
Despus de 45 minutos de reposo a temperatu
ra ambiente se inoculan cobayos de 300 20 g
de peso.
La dosis de toxina tetnica a utilizar en futu
ras valoraciones de antitoxina es la que mezcla
da con 0,1 UA m ata al cobayo en 96 horas
(vase cap. 3).
A continuacin se transcribe como ejemplo
un protocolo de valoracin de toxina tetnica:

O bservaciones
Solucin salina
(mi)

Cobayos
(peso en g)

1,28
1,28
1,27
1,26
1,25
1,24
1,23

285
300
310
295
290
305
295

H oras
24

48

72

0
0
0

0
0

It
It
t
t

0: au se n cia de ttanos; It; ligero ttanos; t: ttan o s; m t: m u ch o ttan o s; +; m u erte d el anim al.

It
t
t
t
mt

It
t
t
mt
+
+

96

Ttulo
de la
toxina
(mg)

0
It
t
mt
+

0,25

Mtodos utilizados para la identificacin y cuantificacin de antgenos

721

. O bservaciones
Antitoxina tetnica
a valorar
( l m l dilucin)

1:6.000
1:7.000
1 :8.000
1:9.000
1 :10.000
1: 11.000
1 : 12.000

T oxina patrn
(1:1.000)
(d. test 0,2.5 ml)
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25

Solucin salina
(ml)'

Cobayos
(pe.m en g)

1,25
1,25
1,25
1,25
1,25
1,25
1,25

305
310
295
280
295
300
285

T tu lo
U A /m l

H oras
48

72

0
0
0

0
0

0
0

0
0

It
It
t
t
mt

It
t
t
mt
+

t
t
mt
+

It
It
t
t

96

24

1.100

b)
Cobayos de 300 20 g de peso, sanos y suspende al 0,5% en la misma solucin. E sta
concentracin puede variar segn las tcnicas y
bien alimentados..
los virus a identificar.
e) Solucin salina: NaCl 0,15 M.
b) L quido hem oaglutinante: proviene de
d) Tubos cnicos anchos y cortos (20 x 40
medios de cultivo, lquido amnitico, lquido
mm) para la mezcla de la toxina y antitoxina.
alantoideo de embriones de pollo infectados,
e) Pipetas de 1 ml, 2 ml y 5 ml.
etctera.
f) Jeringas hipodrmicas 5 ml, agujas 25/6.
c) Tubos de hemlisis.
d) Pipetas de 1 ml.
Mtodo de valoracin
e) Solucin salina fosfatada: NaCl 0,15 M,
Es similar al indicado para la valoracin de fosfatos 0,01 M, pH 7,2.
toxina, con la diferencia que lo desconocido, en
este caso, es la antitoxina (vase cuadro, arri Mtodo
ba).
Preparar con el lquido hemoaglutinante d i
luciones que van de 1:20 a 1:5.120, usando so
lucin salina fosfatada como diluyente. R epar
HEMOAGLUTINACIN POR VIRUS
tir las diluciones en una serie de tubos de h e
Y NEUTRALIZACIN
mlisis a razn de 0,5 ml por tubo. Aadir a to
DE HEM OAGLUTINACIN
dos los tubos 0,5 ml de la suspensin de hem a
N um erosos virus tienen la propiedad de tes, agitar y dejar a temperatura ambiente por
aglutinar hemates sobre los que se han fijado. 90 minutos.
El ttulo hemoaglutinante estar dado po r la
Asimismo, los sueros que contienen anticuer
pos antivirales inhiben especficamente la he- mxima dilucin aglutinante.
moaglutinacin.
Los dos fenmenos, son de uso corriente en Inhibicin de hemoaglutinacin
virologa. El primero, para detectar la presencia
de un virus en un medio de cultivo, y el segun M aterial necesario
do, para establecer un diagnstico serolgico
a) Suero a analizar. Para eliminar inhibidores
en el caso de una infeccin viral generadora de
inespecficos conviene calentar a 58C durante
anticuerpos especficos.
20-30 minutos.
b) Lquido hemoaglutinante.
Hemoaglutinacin
c) Suspensin de hemates al 0,5%
d) Tubos de hemlisis.
M aterial necesario
e) Pipetas de 1 ml.
a) Glbulos rojos: el poder aglutinante de un f) Solucin salina tamponada.
virus no se manifiesta sobre todos los glbulos
rojos, sino sobre los de determinadas especies. Mtodo
El virus de la influenza aglutina los glbulos
Efectuar diluciones seriadas del suero a an a
rojos de pollo y humanos grupo 0; el de las pa
peras, los de pollo, cobayo, camero y humanos; lizar en volmenes de 0,25 ml, usando como di
el de la poliom ielitis, los hum anos, etc. Su luyente solucin salina fosfatada. Aadir a cada
uno de los tubos 0,25 ml de lquido hemoagluteleccin depender del virus a investigar.
Se los obtiene por puncin venosa o carda nante (4 unidades/0,25 ml). Mezclar, dejar en
contacto 15 minutos y aadirles 0,5 ml de sus
ca, y se los recoge en solucin de Alsever.
Para su uso se los lava v arias veces con pensin de hemates al 0,5%. Dejar a tem pera
NaCl 0,15 M, fosfatos 0,01 M, pH 7,2 y se los tura ambiente 1 hora y leer los resultados.

722

Metodologas

El ttulo estar dado por la ms alta dilucin

del suero capaz de inhibir la hemoaglutinacin.

tos aparecern los sntomas del shock anafilctico.

A nafilaxia local

ANAFILAXIA (ANTICUERPOS
CITOTRPICOS)

A nafilaxia generalizada

l . Anafilaxia cutnea

M aterial necesario

c t iv a

M aterial necesario
a) A ntgeno sensibilizante: se u tilizar el
ms apropiado. Es muy recomendable para fi
nes demostrativos la ovoalbmina purificada.
b) Solucin salina: NaCl 0,15 M.
c) Jeringas hipodrm icas de 1 mi y agujas
25/ 6 para inoculaciones subcutneas e intraperitoneales y 15/3 para inoculaciones intraveno
sas.
d) Tubos de ensayo, pipetas de 1 mi, 2 mi y
5 mi.
e) Cobayos. Son recomendables los albinos
de la raza Hatey, de 300 g de peso, por su ma
yor sensibilidad para este tipo de ensayos.
Mtodo
Preparar una solucin de antgeno en solu
cin salina (50 mg.ml) e inocular a cada coba
yo 0,5 mi por va subcutnea y 0,5 mi por va
intraperitoneal. Tres semanas despus, desen
cadenar, inoculando por va intravenosa, 1 mi
de solucin antignica al 5%. Si el animal esta
ba suficientemente sensibilizado, presentar a
los pocos m inutos los sntom as del shock
anafiletico (vase cap. 32).
Las venas ms fcilmente abordables son las
de las patas delanteras y traseras y la del pene.
Con los debidos cuidados, la inoculacin puede
hacerse tambin por va intracardaca.
P

a s iv a

M aterial necesario
a) Suero sanguneo proveniente de un animal
activamente inmunizado.
b) Cobayos no inmunizados.
c) Los restantes materiales indicados en ana
filaxia activa generalizada.
Mtodo
Inocular los cobayos, por va intravenosa,
con 1-2 mi del suero inmune. Por la misma va
inocular 12-18 horas despus, 1 mi (10 mg.ml)
de la m ism a solucin antignica usada para
sensibilizar al animal dador. A los pocos minu

c t iv a

a) Animal activamente inmunizado (cobayo,

ratn).
b) Antgeno: solucin al 0,01-0,02% en solu
cin salina.
c) Solucin salina; NaCl 0,15 M.
d) Solucin colorante; azul de Evans al 0,51% en solucin salina.
e) Jeringas tipo tuberculina y agujas 15/5 pa
ra las inoculaciones intradrmicas y 15/3 para
las endovenosas.
Mtodo
Rasurar los animales en la parte dorsal, pro
curando no producir lesiones, las que inciden
desfavorablemente en los resultados al producir
extravasaciones no especficas del colorante.
Inocular por va intradrmica, en la zona ra
surada, 0,1 mi de la solucin antignica. A una
distancia no inferior a los 2 cm, inocular 0,1 mi
de solucin salina como control. Inm ediata
mente despus, inocular por va intravenosa 0,5
mi de la solucin colorante.
Si la reaccin es positiva, entre los 15-30 m i
nutos, en el punto de inoculacin del antgeno
aparecer una mancha azul cuya intensidad y
tamao dependern del grado de sensibiliza
cin del animal.
La mejor manera de leer la reaccin es sacri
ficar al animal, quitarle la piel rasurada y ob
servarla por transiluminacin. En estos casos se
pueden m edir muy bien los dimetros de las
manchas del colorante, lo que permitir expre
sar los resultados en cruces segn dicho dime
tro, a saber;
Dimetro del. halo (cm)

Grado de positividad

0,5
1
1,5
2
m s de 2

+
++
+ ++
++++

-f

2. Des granulacin de los mastocitos^^

M aterial necesario
a)
Animal activamente inmunizado (cobayo,
ratn).

Mtodos utilizados para la identificacin y cuantificacin de antgenos

b) Antgeno: solucin al 0,01-0,02% en soluein salina.
c) Soluein salina: N aCl 0,15 M, fosfatos
0,01 M, pH 7,2.
d) Solucin fijadora: alcohol metlico 50 mi,
agua 50 mi, cido actico 3 mi.
e) Solucin colorante: tionina acuosa al 1%.
f) Portaobjetos: placas de Petri.
g) Pipetas de 1 mi y 5 mi.
h) Pipetas Pasteur.
i) Microscopio.
Mtodo
Sacrificar los animales; con la mayor pulcri
tud separar la serosa peritoneal y adosarla a los
portaobjetos, los que son colocados en una pla
ca de Petri. Cubrirlos con la solucin antigni
ca y mantenerlos de preferencia a 4C durante
20-30 minutos. V olcar el antgeno, lavar con
solucin salina tamponada y cubrir con el fija
dor, previamente enfriado a 4C. Se lo deja ac
tuar durante 30 minutos, se lava con solucin
salina tamponada y finalmente se cubre eon el
colorante durante 3 minutos. Se lava, se seca y
se observa al microscopio.
Deben incluirse siempre testigos sin antge
no.
El resultado se expresa en p o rcentaje de
mastocitos desgranulados, el que debe estable
cerse co m o p ro m e d io de no m en o s de
2.0003.000 clulas contadas (fig. 32-10 cap.
32).
P a s iv a

1. Anafilaxia cutnea^^
M aterial necesario
a) Suero sanguneo proveniente de un animal
activamente inmunizado.
b) Cobayos no inmunizados.
c) Solucin de antgeno al 0,2% en solucin
salina.
d) El mismo material indicado en anafilaxia
cutnea activa.
Mtodo
Rasurar los cobayos en la parte dorsal e ino
cularles 0,1 mi de diluciones del suero en ensa
yo. Tres horas despus, inocular por va intra
venosa 1 mi de una mezcla en partes iguales de
solucin antignica y colorante. A los 15-30
m inutos leer los resultados, procediendo de
igual modo al indicado en anafilaxia cutnea
activa (fig. 32-11, cap.32).

723

2. Desgranulacin de los mastocitos

M aterial necesario
a) Suero sanguneo proveniente de un anim al
activamente inmunizado.
b) Cobayos no inmunizados.
c) El mismo material indicado en desgranu
lacin activa de mastocitos.
M todo
Los portaobjetos conteniendo la serosa p eri
toneal, preparados segn las indicaciones espe
cficas en el mtodo activo, se cubren con dilu
ciones del suero a ensayar. Se los deja en con
tacto 30 minutos, se lava con solucin salina
tamponada y se los cubre con el antgeno, con
tinuando luego con la metodologa indicada al
hablar de desgranulaein activa.
Es necesario incluir testigos de suero, antge
no y solucin salina.
IN M U N O FLU O RESC EN C IA ^M aterial necesario
a)
Antisueros marcados con el fluorocromo
(isotioeianato de fuorescena). Separar la frac
cin globulnica del suero inmune por precipi
tacin con un volumen igual de solucin satu
rada de sulfato de amonio. Conviene aadir la
solucin salina sobre el suero, en un tiempo de
2 a 3 minutos, con mantenimiento constante de
la agitacin durante una hora, mediante el em
pleo de un agitador magntico. Centrifugar a
5.000 rpm durante 30 minutos, desechar el so
brenadante y redisolver el precipitado en agua
destilada, en un volumen igual a la mitad ini
cial. Reprecipitar con sulfato de amonio y d i
solver el precipitado en iguales condiciones a
las indicadas en la primera precipitacin. C olo
car el precipitado en un tubo de celofn y d iali
zar frente a solucin salina tam ponada h asta
reaccin negativa de sulfatos en el lquido de
dilisis, usando solucin de cloruro de bario al
5% como reactivo indicador. La dihsis debe
hacerse a 4C, con agitacin constante (agita
dor magntico), recambiando la solucin salina
cada 4 horas.
Finalizada la dilisis, se valoran las protenas
totales por cualquiera de los mtodos con o ci
dos. Flallado este valor, se determina la canti
dad de isotioeianato de fluorescena a utilizar,
la que debe estar en relacin de 0,02 mg a 0,03
mg por ing de protena.
Para la marcacin se diluye la solucin p ro
teica en solucin salina tam ponada hasta una
concentracin de 20 a 30 m g.m f' y se lleva a

724

Metodologas

pH 9-9,5 con buffer de carbonato de sodio 0,5 fra. Agregar a la suspensin de tejido filtrado
M (partes iguales de carbonato de sodio 0,5 M 4 voMmenes de acetona fra, agitar en agitador
y bicarbonato de sodio 0,5 M). Las globulinas m agntico y centrifugar luego 10 m inutos a
colocadas en un vaso de precipitacin son lle 2.000 rpm. Filtrar por Buchner cubierto con pa
vadas a heladera (4C) y se las agita con agita pel de filtro embebido en acetona y lavar el te
dor magntico. Se aade la fluorescena en pe jido retenido con varios volmenes de acetona
queas cantidades, no efectuando nuevos agre fra. Decantar el sobrenadante y repetir el lava
gados hasta disolucin del anterior, operacin do con acetona otras cuatro veces. El material,
que lleva de 3 a 4 horas. La agitacin debe con al que se le ha eliminado el mximo de acetona
por aspiracin, es colocado en cajas de Petri o
tinuar toda la noche.
Otra manera de efectuar el marcado es colo recipientes similares y secado en estufa a 37C.
car la solucin de IgG en una bolsita de celofn Si fuera necesario se lo puede triturar en morte
para dilisis e introducirla en un recipiente con ro hasta transformarlo en polvo fino. Se lo con
la cantidad adecuada de isotiocianato de fluo serva en heladera en frascos oscuros.
rescena disuelta en el buffer de marcacin. Se
O tra m anera de resolver el problem a, que
agita con agitador magntico a 4C durante 18 perm ite obtener IgG conjugada con diferente
horas. El produv-co de marcacin, contenido en nmero de molculas de isotiocianato de fluo
la bolsa de dilisis, resulta ms hom ognea rescena, libres a su vez de IgG no conjugada,
mente marcado que en el caso anterior.
es el siguiente. Dializar el producto de conjuga
La eliminacin de la fluorescena no conju cin frente a buffer de fosfatos 0,01 M, pH 7,6.
gada puede hacerse dializando la solucin de El producto as obtenido se pasa por columna
globulinas frente a solucin salina tamponada o de D EA E-celulosa equilibrada con el mismo
filtrando por Sephadex G-25, En este caso una buffer. A esa molaridad eluye la IgG no conju
colum na de 1 X 30 cm que contenga 5 g de gada, la que de estar presente podra competir
Sephadex resulta til para la purificacin de por masa y actuar como bloqueante. Por elucio
5-8 mi de solucin conjugada. Como eluyente nes escalonadas con buffer de fosfatos 0,05 M,
se usa solucin salina tamponada.
0,1 M y 0,2 M se obtienen poblaciones de IgG
Todo conjugado debe ser evaluado antes de que han fijado diferentes nmeros de molculas
su uso para determinar la intensidad de la tin de isotiocianato de fluorescena, ya que esta
cin especfica y la presencia y la cantidad de molcula aumenta la carga positiva del produc
fondo o tincin inespecfica. Ello se determina to de conjugacin. Cada pico eluido es concenm ediante reacciones de inm unofluorescencia , trado y analizado en cuanto a su capacidad de
frente a patrones conocidos.
unin al antgeno y a su tincin inespecfica.
Un exceso de tincin inespecfica puede re
Los eluidos con buffer de la ms alta molari
solverse a veces por simple dilucin de conju dad corresponden a m olculas de IgG m uy
gado. En otras, es necesario adsorber con polvo marcadas con la sustancia fluorescente y pre
de tejidos, generalmente de hgado. La canti sentan una tincin basal ms elevada. Los reac
dad a utilizar es aproximadamente 100 mg por tivos ms eficientes generalmente son los que
mi de conjugado a adsorber. La adsorcin se eluyen con fosfatos 0,05 M, pH 7,6.
hace a 4-5C durante una hora, y despus se se
c) Solucin tamponada: NaCl 0,15 M, fosfa
para el sobrenadante por centrifugacin. Gene tos 0,01 M ,p H 7 ,2 .
ralm ente con dos adsorciones se consigue el
d) Glicerina tamponada; a 9 partes de glice
efecto deseado.
rina neutra aadirle 1 parte de solucin salina
b)
Polvo de tejido para adsorciones. Colocar tamponada llevada a pH 9 con carbonato de so
una determinada cantidad de rgano (hgado de dio 0,5 M.
ratones) en una licuadora y aadirle un volu
e) M icroscopio para las lecturas: existen
men igual de agua destilada enfriada a 4C. Tri equipos especiales. No obstante, puede ser usa
turar durante 5 minutos, centrifugar y volcar el do un microscopio comn que posea condensa
sobrenadante. Repetir la operacin dos o tres dor de fondo oscuro y lrnpara de luz ultravio
veces para eliminar hemoglobina. Trasvasar a leta para la iluminacin. Esta debe contar con
un vaso de precipitacin, colocarlo sobre un filtros excitadores que dejen pasar solamente la
agitador magntico previa introduccin de la luz ultravioleta deseada, y el microscopio debe
barra de agitacin y aadirle cuatro volmenes tener un filtro de bloqueo que impida la llegada
de acetona fra. Agitar 5 minutos. Trasvasar a del exceso de luz al ojo del observador.
tubos de centrfuga y centrifugar 10 minutos a
2.000 rpm. D ecantar el sobrenadante, aadir Mtodo
solucin salina tamponada, mezclar y centrifu
gar. Repetir la operacin 3-4 veces hasta que el
1. Directo.
lquido sobrenadante sea claro. Filtrar por do
En este caso se emplea el anticuerpo espec
ble gasa y lavar el residuo con solucin salina fico marcado con el fluorocromo.

Mtodos utilizados para la identificacin y cuantificacin de antgenos

Sobre portaobjetos limpios y desengrasados
liacer las im presiones del material a analizar,
dejando secar a temperatura ambiente (aproxi
m adam ente 30 m inutos). Introducirlos en un
vaso de Coplin con acetona fra y dejarlos en
heladera por un tiempo que puede variar entre
1 y 4 horas segn el material a fijar.
Para la tincin, escurrir los portaobjetos y
dejar que tomen la temperatura ambiente. Cu
brirlos con el anticuerpo marcado con el fluo
rocromo, previamente diluido segn su ttulo y
dejarlos en cmara hmeda 30-60 min a 37C.
Lavar con abundante solucin salina tampona
da para eliminar el uorocromo no fijado, en
juagar rpidam ente con agua destilada, dejar
escurrir y secar.
Para la observacin m icroscpica, m ontar
previamente con glicerina tamponada.
2. Indirecto
Para el mtodo directo es necesario marcar
cada anticuerpo especfico. En el indirecto se
hace actuar anticuerpo sin marca sobre el ant
geno y sobre el complejo formado antigammaglobulina (contra la gammaglobulina de la es
pecie animal de la que proviene el anticuerpo
sin marca) conjugada con isotiocianato de fluo
rescena. Tiene la ventaja de no necesitar un
anticuerpo marcado para cada antgeno.
Las impresiones del material antignico so
bre los portaobjetos se preparan de manera si
milar al mtodo directo. Se cubren con el anti
cuerpo no marcado y se dejan en cmara hm e
da a 37C durante 30-60 minutos. Se lavan con
solucin salina tam ponada; se cubren con la
antigammaglobulina marcada con isotiocianato
y se dejan en cmara hmeda 30-60 minutos a
37"C. Se lavan con abudante solucin salina
tamponada y se enjuagan con agua destilada.
Se dejan escurrir y secar y, previamente a la
observacin microscpica, se los monta en gli
cerina tamponada (fig. 8-8, cap. 8).
INMUNOENZIMOLOGA..^)
Esta metodologa puede usarse para analizar
cortes de tejidos o improntas celulares, de un
modo similar al que se hace por inmunofluo
rescencia. Tiene la ventaja de que utiliza m i
croscopa ptica comn.
Puede usarse tambin para investigar y dosar
antgenos y anticuerpos previamente fijados a
placas de poiiestireno.
En este apartado slo se describir el mtodo
usado para estudios de cortes histolgicos, ya
que las otras aplicaciones del enzim oinm unoensayo, o ELISA, se describen en detalle en
el captulo 38.

725

M aterial necesario
a) Inm unosuero m arcado con peroxidasa.
Los del comercio resultan tiles.
b) Buffer Tris-HCl 0,05 M, pH 7,6.
c)
0.1'^0 en el buffer indicado en b).
d) Irprontas con el antgeno (cortes de teji
dos, clulas, etc.) especfico para los anticuer
pos a investigar.
e) Suero a analizar.
f) Microscopio ptico comn.
Mtodo
a) Cubrir las improntas con el suero a anaUzar e incubar a 37C por 15 minutos, en cm ara
hmeda.
b) Lavar y cubrir con antiinm unoglobulina
m arcada con peroxidasa, convenientemente di
luida (1:10 a 1:50), e incubar a 37C durante 15
minutos.
c) Lavar y cubrir con 1 ml del siguiente reac
tivo:
3,3 diaminobencidina. HCl
5 mg
Buffer Tris-HCl 0,05 M, pH 7,6
9 ml
im l
(preparar la mezcla en el momento de usar)
Mantener a temperatura ambiente durante 20
minutos, lavar, secar y observar al microscopio.
Los antgenos que han reaccionado con el
correspondiente anticuerpo y la antiinmunoglo
bulina marcada con peroxidasa toman colora
cin pardusca.
Los sueros marcados con peroxidasa pueden
ser antiinmunoglobulinas totales o m onoespe
cficos.
DETECCIN DE COMPLEJOS
INMUNES
1. Dosaje de complejos inmunes usando fa cto r
reumatoideo 19S monoclonal
El mtodo se funda en la interaccin que tie
ne lugar entre el factor reumatoideo IgM 19 S
monoclonal y la IgG agregada. Si se utiliza fac
tor reumatoideo marcado con
se lo puede
hacer com petir con factor 19 S fro y de esa
manera llegar a determinar la IgG agregada (inmunocomplejo).
M aterial necesario
a) Buffer de unin: Tris HCl 0,075 M, E D
TA.N a, 0,01 M, seroalbm ina bovina al 1%,
pH 7,4."
b) IgG agregada: disolver 600 mg de IgG
comercial en 30 ml de solucin salina tam po-

726

Metodologas

nada (SST), pH 7,4. Calentar a 63C por 20 m i bos y determinar las cpm en contador de radia
nutos y centrifugar a 145.000 x g a 4C durante ciones gamma.
1 hora. Suspender los sedimentos en 10 mi de
Las muestras se analizan por duplicado.
SST y homogeneizar con un homogeneizador
Deben incluirse los siguientes controles: 1)
de tejidos. Centrifugar a 600 x g durante 15 mi buffer de unin solo, sin muestra ni IgG agre
nutos a 4C, separar el sobrenadante y guardar gada y ^I.FRm. Mide la unin no especfica,
lo en alcuotas a -70C. Cuando se lo va a usar, que debe ser descontada de todos los tubos de
descongelar y centrifugar a 600 x g por 15 mi reaccin; 2) IgG-Sepharosa y '^T.FRm. Deter
nutos. Cuantificar los agregados del sobrena mina 100% de unin.
dante midiendo la concentracin proteica por el
El porcentaje de inhibicin se calcula como
mtodo de Lowry.
sigue
c) IgG-Sepharosa: vase Fijacin de prote
Cpm 100% de unin - cpm de la m uestra
nas a Sepharosa activada con CNBr (cap. 41).
% inhibicin --------------------------------------------------------- x 100
d) Factor reumatoideo purificado (FRm): se
cpm 100% de unin
lo asla de pacientes con enfermedades linfoproliferativas (artritis reumatoidea) o criogloLos resultados, comparados con la curva de
bulinemias.
calibracin obtenida con diferentes concentra
Si el factor reumatoideo es una crioglobuli- ciones de IgG agregada, perm ite expresar la
na, se separa sta del suero por enfriamiento a concentracin de los com plejos inm unes en
4C durante 24 horas. Se centrifuga, se lava concentraciones equivalentes de IgG agregada.
eon SST y se la disocia con buffer de acetato
0,1 M, pH 4. Si la unin fuera muy fuerte usar 2. Determinacin de complejos inmunes fija
glicina-FlCl 0,1 M, pFl3. Filtrar por columna
dores de complemento p o r su interaccin
de Sephadex G-200 estabilizado con el mismo
con clulas Raji
buffer. E lu ir con el b u ffer de diso ciaci n .
El factor reum atoideo eluye con el volum en
Las clulas Raji son una lnea celular linfode exclusin (vase cap. 41). Los tubos que blastoide hum ana cultivada, derivadas de un
contienen el FRm se juntan y dializan contra linfoma de Burkitt. Los complejos inmunes que
SST,
fijan el complemento se unen a los receptores
Si
el factor reumatoideo no es una crioglobu- de C lq , C3b y C3d que tienen esas clulas. Co
lina, se lo asla por cromatografa de afinidad mo carecen de receptores Fe, los complejos fi
usando una columna de IgG-Sepharosa. Previo jados pueden detectarse eon un suero antigamlavado de la colum na con SST, se disocia el maglobulina.
FRm por tratamiento con glicina-HCl 0,1 M,
pH3, procediendo de inmediato a su neutraliza Material necesario
cin con Tris y dilisis posterior frente a SST.
Se lo conserva a -70C.
a) Medio esencial de Eagle: los cultivos de
e) IgG radiomarcada con
vase el cap clulas R aji se m antienen en el laboratorio
tulo 41.
por pasaje en medio esencial de Eagle suplementado.
La composicin de este medio es la siguien
Mtodo
te: L-arginina 17,4 mg; L-cistina 6,0 mg; L-hisEn dos tubos de plstico de 10 x 75 mm co tidina 3,2 mg; L-isoleucina 26,2 mg; Lleucina
locar, respectivam ente, 0,1 mi de buffer de
13,1 mg; L -lisina 18,2 mg; L -m etionina 7,5
unin y 0,1 mi de m uestra a ensayar diluida mg; L-fenilalanina 8,3 mg; L-treonina 11,9 mg;
1:10. En otra serie de tubos, colocar 0,1 de IgG L-triptfano 2 mg; L-tirosina 18 mg; L-valina
agregada a la concentracin de 200, 100, 50,
11,7 mg; L-glutam ina 146 mg; colina 1 mg;
25, 12 y 6 )i,g.mf' para confeccionar la curva cido nicotnico 1 mg; cido pantotnico 1 mg;
de calibracin.
piridoxal 1 mg; riboflavina 0,1 mg; tiamina 1
Aadir 0,1 mi de ^q.pRm (2 ag.mf; activi mg; inositol 1 mg; biotina 1 mg; cido fhco l
dad especfica 0 ,1 jiCi.mg^*)mg; glucosa 2.000 mg; NaCl 8.000 mg; KCl
Mezclar en mezclador Vortex y aadir 0,25 400 mg; CaCl^ 140 mg; M g S o ,.7 H p 100 mg;
mi de una suspensin de Ig G -S ep h aro sa al M g C L . H p 100 mg; N a,H P 0 ,.2 H 2 0 60 mg;
1,25%. Aadir 0,55 mi de buffer de unin, ta KHjPO^ 60 mg; NaHCOj 350 mg; rojo fenol
par los tubos e incubar a temperatura ambiente, 20 mg; penicilina 0,5 mg; agua destilada hasta
por 18 horas, con rotacin.
1 litro.
Centrifugar los tubos tapados a 200 x g du
b) Suero de conejo anti-IgG humana: se ob
rante 2 minutos, quitar los tapones y aspirar los tiene como se indica en el captulo 37. La frac
sobrenadantes. Lavar tres veces con NaCl 0,4 cin IgG del suero se marea en
por el m
M, EDTA 0,1 M, pH 7,4. Volver a tapar los tu todo de la cloramina T (cap. 33). Se la diluye a

Mtodos utilizados para la identificacin y cuantificacin de antgenos

1 mg.mf*; actividad especfica alrededor de 3 x
10^ cpm.|i,g^'.
Mtodo
Clulas Raji de 72 horas de cultivo (2x10'
clulas en 200 |J,1 de medio) se transfieren a tu
bos plsticos cnicos de 1,5 ml (Eppendorf).
Aadir 1 ml de m edio mnim o de Eagle sin
Ca^t ni Mg^+ y centrifugar a 800 x g durante 8
miriutos. Aspirar los sobrenadantes y resuspen
der las clulas en 50 |0,1 del mismo medio. Aa
dirles 25 |al del suero a ensayar diluido 1:4 en
NaCl 0,15 M e incubar a 37"C por 45 minutos,
agitando manualmente cada 5-10. Lavar las c
lulas tres veces con el medio de Eagle. Despus
del ltimo lavado aadir la anti-IgG hum ana
marcada con
y dejar reaccionar a 4C por
30 minutos, agitando cada 5 minutos. La antiIgG debe usarse a la dilucin ptima, previa
m ente determ inada, usando como diluyente
medio mnimo de Eagle adicionado de albmi
na humana al 1%.
Despus de la incubacin se lavan las clulas
tres veces, se elimina el sobrenadante y se de
termina la radioactividad del sedimento en un
contador de radiaciones gamma.
Deben incluirse testigos de medio de cultivo
y clulas Raji, sin la muestra a anahzar, para
determ inar la captacin inesp ecfica de ra
dioactividad por las clulas Raji.
Se calcula el porcentaje de radioactividad re
tenida siguiendo el procedimiento indicado en
valoracin de inmunocomplejos con ^I.FRm.
Con el dato obtenido, utilizando una curva de
calibracin preparada de igual manera que la
indicada para la muestra en anlisis, pero utili
zando en este caso cantidades variables de IgG
agregada mezcladas con suero humano normal
diluido 1:2 (fuente de complemento), se deter
mina la concentracin de inmunocomplejos ex
presados como IgG agregada.
3. D eterm inacin de com plejos inmunes p o r
precipitacin con polietilenglicol (PEG)
El PEG es un polmero no cargado, soluble
en agua que aadido a un suero produce la
precipitacin de protenas sin que stas expe
rimenten desnaturalizacin. Esta precipitacin
es en cierto modo dependiente de la concen
tracin y el peso m olecular de las protenas
presentes, las cuales en condiciones normales
no p recipitan con concen tracio n es de PEG
6.000 inferiores al 4%. Los complejos inm u
nes, dado el mayor peso molecular, son precipitables con PEG al 3% concentracin final.
El mtodo, si bien prctico, presenta errores
ya que todo agregado existente en el suero por
valorar en el que no participan las inm unoglo

727

bulinas - o componentes proteicos de muy alto

peso m olecular com o las m acro g lo b u lin as-,
algunos componentes del sistema com plem en
to o productos que participan en los fenm e
nos de la inflamacin, pueden ser precipitados
por PEG al 3%. No obstante ello, es un m to
do que an se sigue utilizando en los exm e
nes rutinarios.
M aterial necesario
a) Polietilenglicol (PEG) 6.000 (Mr 6.000)
al 6% en SST. Antes de usar filtrar por papel
de filtro W hatman N 1.
b) NaCl 0,15 M, fosfatos 0,01 M . pH 7,4.
M todo
Mezclar volmenes iguales de suero a anali
zar y PEG 6.000 al 6%. Incubar 1 hora a AC.
Centrifugar a 1.000 x g a 4C en centrfuga
refrigerada, por 20 minutos.
Rem over el sobrenadante y lavar el precipi
tado con PEG 6.000 al 3% en SST.
La valoracin del precipitado obtenido p u e
de hacerse por mtodos nefelomtricos o redisolvindolo en NaOH 0,1 N y midiendo la ab
sorbancia a 280 nm. Si se multiplica la D 0 2 8 0
x E l'tm de la IgG humana (12,3) x factor de
dilucin se obtiene el valor que permite ex p re
sar la concentracin de inm unocomplejos co
mo IgG.
4. Valoracin de complejos inmunes p or f i ja
cin a eritrocitos de pollo
El mtodo se basa en la capacidad que tienen
los eritrocitos de los diferentes vertebrados de
fijar, por intermedio de un receptor especfico,
el fragmento Fe de IgG agregado bajo la form a
de complejo Ag-Ac. Los glbulos rojos hum a
nos no tienen receptores para Fe en su superfi
cie y slo los exponen despus de tripsinizacin.
Para el desarrollo del mtodo los eritrocitos
a usar sern los de pollo.
M aterial necesario
a) G lbulos rojos de p o llo obtenidos de
sangre heparinizada. Antes de su uso se los la
va 5 veces con NaCl 0,15 M.
b) Suero a analizar. Debe ser previam ente
calentado a 56C durante 30 minutos y cen tri
fugado a 10.000 rpm durante 15 minutos.
c) Suero anti-IgG hum ana. Se lo ob tien e
por inoculacin de IgG en conejos, de acuerdo
con los planes de inmunizacin indicados en el
captulo 45. Antes de su uso se lo adsorbe con
glbulos de pollo.

728

Metodologas

M todo
En una serie de tubos de hemlisis, se colo
can 0,2 mi de diluciones crecientes, en razn 2,
del suero a analizar y 0,05 mi de glbulos rojos
de pollo al 1%. Despus de incubar a 4C du
rante 18 horas, observar los tubos para estable
cer si hubo aglutinacin directa. Los tubos no
algutinados lavarlos con NaCl 0,15 M e inves
tigar si tienen fijados com plejos A g-Ac m e
diante reaccin de Coombs con suero anti-lgG.
El ttulo, en valores relativos, se expresa por
la inversa de la mxima dilucin del suero ca
paz de dar una reaccin de Coombs positiva
cuando previamente ha sido incubado a 4C du
rante 18 horas.
Por este mtodo se puede detectar hasta 1 (ig
de complejo inmune (expresado como Ac en el
complejo), cuando los complejos existentes en
el suero estn en la relacin M/M Ac/Ag = 3,8
o ligeramente superior. Los complejos forma
dos en marcado exceso de Ag (relacin M/M
Ac/Ag = L8 o menor) no se fijan en los eritro
citos.
Cuando hay alta concentracin de com ple
jos, especialmente los formados por anticuer
pos precipitantes, suele observarse aglutinacin
directa de los eritrocitos.
BIBLIOGRAFIA
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Metodologas para la evaluacin

de las clulas inmunocompetentes

CLAUDIA MONGINl
CLAUDIA WALDNER

IN T R O D U C C I N
El estudio del sistema inmune es de funda
mental importancia ya que posibilita el enten
dimiento y el control de varias enfermedades
autoinmunes y de aquellas que directa o indi
rectam ente afectan la respuesta inmune. Las
metodologas descritas en este captulo estn
dirigidas, a investigar las funciones inmunes en
individuos normales y en pacientes con enfer
medades congnitas o adquiridas. Adems, los
protocolos pueden ser aplicados al estudio de
procesos infecciosos o de envejecimiento del
sistema inmune, no slo en seres humanos, si
no tambin en modelos experimentales.
La importancia de la evaluacin funcional se
fundamenta en el uso creciente de estas tcni
cas en el diagnstico y en el monitoreo de pa
cientes eon cncer, SIDA, enfermedades au
toinmunes y de aquellos que recibirn un tras
plante de rganos. Adems, la utilizacin de
agentes inmunomoduladores en la prctica cl
nica y de modificadores de la respuesta biol
gica en experimentos clnicos, hacen necesario
el empleo de tcnicas confiables para el segui
miento de las funciones del sistema inmune. En
la actualidad, es posible medir un amplio es
pectro de parmetros funcionales que van des
de la activacin, la proliferacin, la sntesis de
sustancias inmunomoduladoras hasta la funcio
nalidad de las clulas efectoras. La mayora de
las disfunciones del sistema inmune se tradu
cen en la falta o depresin en uno o ms de ps. tos parmetros.
En la rama humoral de la respuesta inmune,
mediada por linfocitos B, la produccin de anti
cuerpos inducida por inmunizacin o sensibili

36
zacin con un determinado antgeno, y la poste
rior medicin de los anticuerpos por ensayos
cualitativos y cuantitativos, proveen inform a
cin acerca de la respuesta de los linfocitos B
como el resultado final de un ntiniero de eventos
celulares independientes pero inteiTelacionados.
En la ram a celular de la respuesta inm une
m ediada por linfocitos T se realizan, com o
pruebas funcionales, ensayos in vitro que son
relativamente simples y de fcil reproducibili
dad. Sin embargo, stos no son indicativos de
la suma de los fenmenos complejos observa
dos en un individuo ya que utilizan poblaciones
aisladas de linfocitos o subpoblaciones de clu
las purificadas. Por el contrario, la prueba cut
nea de hipersensibilidad retardada es el nico
ensayo in vivo de la funcin de las clulas in
m unocom petentes y puede proveer in fo rm a
cin valorable acerca del estado inmune en su
totalidad.
La caracterizacin fenotpica de las clulas
inmunes, as como la determinacin del nm e
ro de stas, a menudo no ofrece informacin
acerca de su actividad, porque el fenotipo celu
lar frecuentem ente no se correlaciona con la
funcionalidad de las clulas.
El personal involucrado en la ejecucin de
las tcnicas aplicadas en la evaluacin de la in
munidad celular, no slo deber estar capacita
do para trabajar en las condiciones de esterili
dad requeridas e indispensables para el cultivo
de clulas, sino tambin estar familiarizado con
las normas de bioseguridad. Es por ello que en
primer lugar se detallan una serie de conceptos
bsicos que deber conocer todo operador an
tes de realizar las tcnicas que se describen a
continuacin.

728

Metodologas

M todo
En una serie de tubos de iiemlisis, se colo
can 0,2 ml de diluciones crecientes, en razn 2,
del suero a analizar y 0,05 ml de glbulos rojos
de pollo al 1%. Despus de incubar a 4C du
rante 18 horas, observar los tubos para estable
cer si hubo aglutinacin directa. Los tubos no
algutinados lavarlos con NaCl 0,15 M e inves
tigar si tienen fijados com plejos A g-Ac m e
diante reaccin de Coombs con suero anti-IgG.
El ttulo, en valores relativos, se expresa por
la inversa de la mxima dilucin del suero ca
paz de dar una reaccin de Coombs positiva
cuando previamente ha sido incubado a 4C du
rante 18 horas.
Por este mtodo se puede detectar hasta 1 (ig
de complejo inmune (expresado como Ac en el
complejo), cuando los complejos existentes en
el suero estn en la relacin M/M Ac/Ag = 3,8
o ligeramente superior. Los complejos forma
dos en marcado exceso de Ag (relacin M/M
Ac/Ag = 1,8 o menor) no se fijan en los eritro
citos.
Cuando hay alta concentracin de com ple
jos, especialmente los formados por anticuer
pos precipitantes, suele observarse aglutinacin
directa de los eritrocitos.
BIBLIOGRAFIA
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Metodologas para la evaluacin

de las clulas inmunocompetentes

CLAUDIA MONGINl
CLAUDIA WALDNER

IN T R O D U C C I N
El estudio del sistema inmune es de funda
mental importancia ya que posibilita el enten
dimiento y el control de varias enfermedades
autoinmunes y de aquellas que directa o indi
rectam ente afectan la respuesta inmune. Las
metodologas descritas en este captulo estn
dirigidas, a investigar las funciones inmunes en
individuos normales y en pacientes con enfer
medades congnitas o adquiridas. Adems, los
protocolos pueden ser aplicados al estudio de
procesos infecciosos o de envejecimiento del
sistema inmune, no slo en seres humanos, si
no tambin en modelos experimentales.
La importancia de la evaluacin funcional se
fundamenta en el uso creciente de estas tcni
cas en el diagnstico y en el monitoreo de pa
cientes con cncer, SIDA, enfermedades au
toinmunes y de aquellos que recibirn un tras
plante de rganos. Adems, la utilizacin de
agentes inmunomoduladores en la prctica cl
nica y de modificadores de la respuesta biol
gica en experimentos clnicos, hacen necesario
el empleo de tcnicas confiables para el segui
miento de las funciones del sistema inmune. En
la actualidad, es posible medir un amplio es
pectro de parmetros funcionales que van des
de la activacin, la proliferacin, la sntesis de
sustancias inmunomoduladoras hasta la funcio
nalidad de las clulas efectoras. La mayora de
las disfunciones del sistema inmune se tradu
cen en la falta o depresin en uno o ms de ps. tos parmetros.
En la rama humoral de la respuesta inmune,
mediada por linfocitos B, la produccin de anti
cuerpos inducida por inmunizacin o sensibili

36
zacin con un determinado antgeno, y la poste
rior medicin de los anticuerpos por ensayos
cualitativos y cuantitativos, proveen inform a
cin acerca de la respuesta de los linfocitos B
como el resultado final de un ntmero de eventos
celulares independientes pero inteiTelacionados.
En la ram a celular de la respuesta inm une
m ediada por linfocitos T se realizan, com o
pruebas funcionales, ensayos in vitro que son
relativamente simples y de fcil reproducibili
dad. Sin embargo, stos no son indicativos de
la suma de los fenmenos complejos observa
dos en un individuo ya que utilizan poblaciones
aisladas de linfocitos o subpoblaciones de clu
las purificadas. Por el contrario, la prueba cut
nea de hipersensibilidad retardada es el nico
ensayo in vivo de la funcin de las clulas in
m unocom petentes y puede proveer in fo rm a
cin valorable acerca del estado inmune en su
totalidad.
La caracterizacin fenotpica de las clulas
inmunes, as como la determinacin del nm e
ro de stas, a menudo no ofrece informacin
acerca de su actividad, porque el fenotipo celu
lar frecuentem ente no se correlaciona con la
funcionalidad de las clulas.
El personal involucrado en la ejecucin de
las tcnicas aplicadas en la evaluacin de la in
munidad celular, no slo deber estar capacita
do para trabajar en las condiciones de esterili
dad requeridas e indispensables para el cultivo
de clulas, sino tambin estar familiarizado con
las normas de bioseguridad. Es por ello que en
primer lugar se detallan una serie de conceptos
bsicos que deber conocer todo operador an
tes de realizar las tcnicas que se describen a
continuacin.

730

Metodologas

1. C O N SID ER A CIO N ES DE
B IO SEG U R ID A D PARA
TRABAJAR CON MATERIAL
DE ORIGEN HUMANO SUSCEPTIBLE
DE ESTAR INFECTADO
El primer paso para trabajar eon material de
origen humano es considerar cada muestra eon
la que se trabaja como posiblemente infectada
y por lo tanto potencialmente peligrosa. Es por
ello que el personal que llevar a cabo los ex
perimentos con muestras humanas debe estar
entrenado en el manipuleo de muestras conta
minadas eon agentes patgenos. En este senti
do el profesional a cargo deber instruir al per
sonal acerca de los procedim ientos y de los
m ateriales apropiados para trab ajar con las
muestras as como los pasos a seguir para pro
cesar los desechos provenientes del material
posiblemente contaminado. A tal efecto, exis
ten publicaciones editadas por organismos sa
nitarios nacionales e internacionales (Biosafety
in M icrobiological and Biom edical laboratories. NIH Publication #, 88-8395, U.S.; Normas
de bioseguridad. VIH, el virus de la inmunodeficiencia adquirida humana. Ministerio de Sa
lud y Accin Social Secretara de Salud, Bue
nos Aires) en donde figuran la determinacin
precisa de reas de trabajo, normas de trabajo
p ara evitar la infeccin del o p erad o r y los
agentes qumicos y fsicos a emplearse en la
decontaminacin.
A continuacin se enum eran una serie de
normas bsicas a seguir en el laboratorio donde
se procesan muestras de origen humano. Estas
reglas estn destinadas primordialmente a pro
teger al operador y a todas aquellas personas
que, de una u otra forma, estarn en contacto
con dichas muestras.
Normas de proteccin del operador
y manipulacin del material
1. El operador debe utilizar guantes descartables. Si existe riesgo de salpicaduras deber
utilizar anteojos y barbijo.
2. Se debe evitar pipetear cualquier material de
riesgo eon la boca, para ello se debe recurrir
a los pipeteadores manuales o automticos.
3. No se debe fumar, comer ni beber en los si
tios en donde se maneja material de riesgo.
Asimismo no se debe apoyar comidas ni be
bidas sobre las mesadas de trabajo.
4. Se debe evitar el uso de elementos punzan
tes y cortantes en la manipulacin del mate
rial.
5. Las agujas no deben ser dobladas ni coloca
das en el capuchn. Estas sern colocadas
en recipientes de plstico resistente, sella
dos.

6. Debe evitarse el material de vidrio para la

manipulacin de la sangre, por este motivo
debe ser transportada y/o centrifugada en tu
bos de material plstico con tapa a rosca.
Decontaminacin del material
1. El material de vidrio o plstico deber ser
colocado inm ediatamente despus del uso
en una solucin de lavandina extempornea
al 10% y permanecer en remojo durante 1824 h.
2. El material descartable contaminado, as co
mo los cogulos, cultivos y otros materiales
que puedan ser de riesgo debern ser incine
rados. Para ello debern ser colocados en re
cipientes de plstico eon tapas y depositarse
en contenedores especiales, destinados para
tal fin y correctamente rotulados.
3. Las agujas ya utilizadas sern incineradas
previo a su descarte.
4. Las mesadas de trabajo debern ser deconta
minadas antes y despus de realizar el traba
jo. Con esta finalidad se pueden utilizar al
cohol al 70, lavandina al 10% u otro desin
fectante apropiado.
2. AISLAMIENTO DE POBLACIONES
CELULARES IN M U N O C O M PE T EN T ES
Antes de realizar una purificacin o el enri
quecimiento de poblaciones celulares inmunocompetentes se deben considerar varios aspec
tos: el rgano donde existe el mayor porcentaje
de las clulas de inters, la accesibiUdad de di
cho rgano (en general cuando se trabaja con
seres humanos se utiliza sangre perifrica), la
menor contaminacin con otras clulas, etc. Es
por ello que resulta de gran importancia recor
dar la distribucin de las clulas pertenecientes
al sistema inmune en la sangre y en los tejidos
linfticos secundarios (cuadro 36-1).
2.1. AISLAM IENTO DE CLULAS
M ONONUCLEARES HUMANAS
A PARTIR D E SANGRE PERIFRICA
POR MEDIO D E GRADIENTES
En la mayora de las tcnicas empleadas para
el estudio de las clulas inmunocompetentes es
ventajoso trabajar con las clulas mononuclea
res sin la contam inacin que representan los
eritrocitos y los granulocitos. A diferencia de
lo que ocurre con los eritrocitos, cuya presen
cia no representa mayor problema, los granulo
citos liberan sustancias txicas y por lo tanto es
conveniente proceder a su separacin. Si bien
los ndulos linfticos, las amgdalas y el bazo
poseen una baja proporcin de granulocitos y

M etodologas para la evaluacin d e la s clu las in m u n ocom peten tes

731

Cuadro 36-1. Distribucin de las poblaciones linfocitarias en los diferentes compartimientos

P orcentaje del total de lirifocitos

Tipo celular

B azo

N odulos
linfticos

Sangre
perifrica

CM H clase 11;
Inm unoglobulina

40-45

20-25

10-15

colaboradores

CD 3^
CD4+; C D 8 ^

50-60

50-60

50-60

citotxicos

CD 3^
CD4 ; C D 8+

10-15

15-20

20-25

Receptor Fcy
(CD16)

~ 10

F unciones

Linfocitos B

Linfocitos T

N atural killer

M arcadores
fenotpicos

pueden ser utilizados directamente, la muestra

de eleccin para obtener clulas mononucleares
de seres humanos es, sin lugar a dudas, la san
gre perifrica por su accesibilidad.

2.1.1. Separacin de clulas mononucleares

mediante gradientes con Ficoll-Hypaque
El mtodo de eleccin para el aislamiento de
las clulas m ononucleares a partir de sangre
entera fue descrito originai'i mente por Boyum
(Boyum, 1968) y consiste en la separacin de
las clulas a travs de un gradiente de FicollHypaque. El Ficoll es un polisacrido que pro
duce la aglutinacin de los eritrocitos logrando
que stos sedimenten ms rpidamente y el Hypaque es una sustancia densa que, diluida apro
piadamente, confiere a la mezcla la densidad
requerida para la separacin.
El aislamiento de las clulas mononucleares
se realiza teniendo en cuenta la diferencia de
densidades que existe entre los elementos de la
sangre. Los eritrocitos y los granulocitos p o
seen una densidad mayor que 1.077 g/ml y por
lo tanto se ubicarn por debajo de la capa del
gradiente de esa densidad, mientras que los mo
nocitos, los linfocitos y las plaquetas, al ser m e
nos densos, flotarn por encima (fig. 36-1). Las
plaquetas sern separadas de las clulas mononucleares por medio de lavados sucesivos o por
centrifugacin a travs de un gradiente de suero
fetal bovino, que permite que las clulas mononucleares lo penetren pero no las plaquetas.

Materiales
- Sangre heparinizada (5U de heparina sdica/ml de sangre).
- Solucin salina tamponada (SST). Ver apn
dice al final del captulo.
Solucin de Hanks libre de Ca+* y Mg+^, a
temperatura ambiente. Ver apndice al final
del captulo.

~ 10

Solucin de Ficoll-H ypaque. Preparar una

solucin de densidad 1,077 g/ml, agregando
64.0 g de Ficoll (PM: 400.000; Sigma cat.
n E4375); 99.0 g de diatrizoato sdico (Sig
ma cat.n S4506) y 0.7 g de NaCl para 1 li
tro de solucin. Filtrar a travs de una m em
brana esterilizante de 0,22 [Xm y conservar a
4C. Alternativamente se puede adquirir la
so lu ci n de F ico ll-H ypa qu e de d en sid ad
1,077 g/1 (Sigma, Histopaque 1077-1 o P har
macia 17-0840-02).
- Suero fetal bovino (SFB), descomplementa
do a 56C durante 30 minutos.
M edio RPMI completo adicionado con un
10% de SFB. Vase apndice al final del ca
ptulo.
- Tubos cnicos de plstico para centrfuga de
15 o 50 mi.

Mtodo
1. Diluir la sangre agregando un volum en de
SST que deber estar a temperatura am bien
te. Alternativamente, en los casos en que in
terese separar previamente el plasma, centri
fugar la sangre a 900 x g, a temperatura am
biente, durante 10 minutos. Posteriormente
recoger las clulas ubicadas en la interfase
entre los eritrocitos y el plasma y resuspenderlas en 2 partes de SST.
2. Agregar cuidadosamente la solucin de F i
coll-Hypaque por debajo de la suspensin
celular, o bien a un tubo que contiene la so
lucin de Ficoll-Hypaque agregar la sangre
diluida por la parte superior con extrem o
cuidado. La proporcin de Ficoll-Hypaque
usada depender de los volmenes de traba
jo: para un tubo de 15 mi se dispensarn
3 mi de Ficoll-Hypaque cada 7 mi de sangre
diluida. Cuando se trabaja en tubos de 50 mi
se agregarn 10 mi de F icoll-H ypaque y
40 mi de sangre diluida.

732

Metodologas

Centrifugacin

Plasma diluido

Clulas
mononucleares
Ficoll-Hypaque

Clulas
polimorfonucleares
Glbulos rojos

F ig. 36-1. Esquem a de la distribucin de los elem entos de la sangre en un gradiente de Ficoll-H ypaque.

3. Centrifugar entre 20 y 30 minutos, a 900 x

g y sin usar el freno de la centrfuga. Los
gradientes son dependientes de la temperatu
ra, es por ello que se deber mantener la mis
ma entre 18 y 20C durante la centrifugacin.
4. Recoger la capa de clulas mononucleares
que se encuentra en la interfase entre el Fcoll-H ypaque y el plasm a (fig. 36-1) cui
dando de no arrastrar los eritrocitos que se
encuentran en la parte inferior. Transferir
las clulas a un nuevo tubo en el que se han
dispensado 2 a 3 voMmenes de solucin de
Hanks por cada volumen de capa de clulas.
5. Lavar las clulas tres veces con exceso de
solucin de Hanks.
6. Resuspender las clulas en medio RPMI com
pleto. Contar y determinar la viabilidad celu
lar por el mtodo de exclusin del azul tripn.
2.1.2. Separacin de granulocitos, clulas
mononucleares y linfoblasos a partir de
sangre perifrica o de cultivos celulares.
Gradientes de Percoll
Para determ inadas experiencias es conve
niente separar las poblaciones celulares de la
sangre o aislar clulas estimuladas (linfoblastos), de clulas no estiinuladas provenientes de
cultivos celulares. En estos casos, la separacin
a travs de un gradiente discontinuo de polyvinilpirrolidona, conocido com ercialm ente con
el nombre de Percoll, ofrece un mtodo senci
llo y rpido. Usando esta tcnica es posible ob
tener los granulocitos en la interfase de la capa
correspondiente a una densidad de 1.083, las
clulas mononucleares en la de 1.077 y los eri
trocitos, que se ubican en el fondo del tubo. Por
otra parte, los linfoblastos se separan de las c
lulas sin activar por su diferencia de densidad.

los primeros flotarn por encima de la capa co

rrespondiente a una densidad 1.065 y las clu
las sin activar lo harn sobre la capa de 1.077.
Materiales
- Sangre heparinizada (5U de heparina sdica/m l de sangre) o una suspensin celular
con linfocitos estimulados por medio de m i
tgenos. Vase punto 2.4.
- Percoll (Pharmacia, Uppsala, Suecia)
- Solucin salina tamponada (SST lOx), para
ajustar la isotonicidad de la solucin de Per
coll.
- M edio RPMI completo. Vase apndice al
final del captulo.
- Solucin salina tamponada (SST). Ver apn
dice al final del captulo.
- Tubos de centrfuga de 15 o 50 ml.
- Pipetas Pasteur.
Mtodo
1. Preparar una solucin isotnica de Percoll a
partir de la solucin stock de Percoll, agre
gando 1 volumen de SST lOx por cada 10
volmenes de solucin final (para preparar
100 ml de solucin isotnica de P ercoll
agregar 10 ml de SST lOX y 90 ml de la so
lucin stock de Percoll). Esta solucin de
Percoll posee una densidad aproximada de
1,12 g/ml.
2. Mezclar la solucin de Percoll con SST de
forma tal de obtener la soluciones de dife
rentes porcentajes. P ara la separacin de
granulocitos y de clulas mononucleares se
req u ieren so lu cion es de P erco ll al 70%
(densidad de 1.083) y al 60% (densidad de
1.077) mientras que para separar linfocitos

Metodologas para la evaluacin de las clulas Inmunocompetentes

3.

4.

5.
6.

activados (linfoblastos) de clulas sin acti

var se utiliza una solucin de Percoll al 50%
(1,065) y otra al 60%.
Dispensar 3 mi de Percoll al 70% en un tu
bo de centrfuga de 15 mi y sembrar, por en
cima, 3 mi de Percoll al 60%, evitando resuspender las capas. Por ltim o agregar,
cuidadosamente, 8 mi de sangre diluida al
medio con SST.
En el caso de la separacin de los linfo
blastos se preparar un gradiente discontinuo
con una capa inferior de Percoll al 60% y
una superior de Percoll al 50%. Por sobre
sta colocar la suspensin celulai- de blastos
(las clulas en el medio de cultivo donde se
las estimul durante 48-72 h con el mitgeno
ad e c u a d o . R e fe rirs e al p u n to 2 .4 p a ra
la descripcin de cmo obtener linfoblastos).
Centrifugar el gradiente a temperatura am
biente durante 20 minutos, a 900 x g. Sepa
rar las clulas m ononucleares que se e n
cuentran por encima de la capa de Percoll al
60% y posteriormente los granulocitos de la
interfase del Percoll 70%.
Los linfoblastos se ubicarn en la interfase
superior (sobre la capa de Percoll 50%) y
las clulas sin activar flotarn sobre la capa
de P ercoll 60% (fig. 36-2). Para el aisla
miento de clulas activadas solamente, se
puede preparar un gradiente con P erco ll
60% y recuperar la fraccin celular obtenida
en la parte superior del mismo.
Lavar tres veces las clulas con exceso de
SST.
R esuspender las clulas en medio R PM I
completo. Contar y determinar la viabilidad
celular por el mtodo de exclusin del azul
tripn.

2.2. ENRIQUECIMIENTO EN
POBLACIONES LINFOCITARIAS
POR PASAJE A TRAVS DE COLUMNAS
DE LANA DE NYLON
El aislam iento de poblaciones linfocitarias
es generalmente un requisito previo para su es
tudio fenotpico o funcional. Los monocitos,
junto con los linfocitos B, constituyen un 25%
de la poblacin mononuclear. Es por ello que
para algunas determinaciones es necesario se
parar la poblacin Iinfocitaria T de la B, como
es el caso en la tipificacin de HLA de clase II
o al realizar un cross m atch especfico para
linfocitos T y linfocitos B, previo a un tras
plante.
Uno de los mtodos clsicos de enriqueci
miento de poblaciones linfocitarias utilizando
colum nas de nylon, fue descrito o rig in aria
mente por Julius y colaboradores (Julius y col.,
1973). Los linfocitos B y las clulas accesorias

733

Plasma diluido
Blastos, monocitos, NK
1.065
Linfocitos
1.077
Granulocitos
1.090
Eritrocitos
F ig. 36-2. E.squema de la di.stribucin de los elem en to s de
la sangre y de linfoblastos en un g radiente de Percoll.

como los macrfagos se adhieren preferente

mente a la lana de nylon mientras que los lin
focitos T no se adhieren o lo hacen pobrem en
te y se recogen directamente. Los linfocitos B
y los macrfagos pueden ser eluidos a co n ti
nuacin por medio de agitacin. La tcnica de
la lana de nylon es la ms usada para el enri
quecimiento en linfocitos T a partir de las c
lulas mononucleares obtenidas de un gradiente
de Ficoll-H ypaque. La ventaja que p o see es
que no requiere de anticuerpos o complemento
y es el mtodo de eleccin en aquellas ocasio
nes en las que se quiere separar linfocitos B y
linfocitos T en gran cantidad a partir de bazo o
ndulos linfticos. Por otra parte, debe co n si
derarse que las poblaciones celulares aisladas
no son tan puras como las que se purifican por
procedimientos especficos, como la elim in a
cin de poblaciones por medio de la citotoxici
dad mediada por anticuerpos y complemento o
m todos de inmunoplaqueo o panning.
M ateriales
- Lana de nylon esterilizada (vase apndice al
final del captulo).
- Jeringas de 10 o 20 mi.
- M edio RPMI adicionado con 5% de SFB,
RPMI-5 (vase apndice al final del captulo).
- Agujas 19-G.
- Tubos cnicos de plstico de 50 mi.
- Suspensin de clulas mononucleares o b te
nidas de sangre perifrica por medio de un
gradiente de Ficoll-Hypaque o esplenocitos,
M todo
1. A rm ar una colum na de lan a de nylon de
acuerdo a la metodologa especificada en el

734

Metodologas

apndice. (El tamao de la columna depen

der de la cantidad de clulas a sembrar:
p ara sep arar h asta 1,5 x 10* clu las se
aconseja usar una columna de 12 mi empa
cada con 0,8-1,0 g de lana de nylon. Para
cantidades entre 1,5 y 3,0 x 10* clulas se
prefiere usar una columna de 20 mi con 1,6
a 2 g de lana de nylon, usando en ambos ca
sos 15 a 20 mi de medio de cultivo para
eluir las clulas).
2. Calentar el medio de cultivo a 37C y man
tenerlo en estas condiciones a lo largo del
procedimiento.
3. Impregnar la lana de nylon con medio RPMl-5 tratando de elim inar las burbujas de
aire atrapadas y compactar la columna con
una pipeta estril. Cerrar la parte superior de
la colum na con parafilm y la inferior con
una llave de tres vas y ana aguja de 19-G.
Colocar la columna a 37C durante 30 mi
nutos, en una estufa gaseada con 5% de
CO,.
4. Ajustar la suspensin celular libre de glbu
los rojos a una densidad de 7,5 x 10 cl/ml
en RPMI-5.
5. Eluir la columna completamente y sembrar
en la parte superior la suspensin celular.
Dejar drenar todo el medio y adicionar entre
0,5 y 1 mi de medio a 37C. Cerrar la llave
de tres vas y agregar 2 o 3 mi de medio.
Cerrar la parte superior de la columna con
parafilm.
6. incubar la colum na durante 45 minutos a
37C en estufa gaseada con 5% de CO 2.
7. L lenar la colum na con m edio RPM I-5 a
37"C. Abrir la llave de tres vas e inmediata
mente recuperar las clulas no adherentes
(linfocitos T) eluidas en un tubo cnico de
50 mi. Agregar medio RPMl-5 adicional y
recoger las clulas de los primeros 15 mi de
medio eluidos a travs de la columna.
8. Para obtener las clulas adherentes (linfoci
tos B y macrfagos) agitar enrgicamente la
columna con una varilla de vidrio estril du
rante 1 minuto y eluirlas rpidam ente con
20 mi de medio, en otro tubo cnico.
9. Centrifugar las clulas 10 minutos a 200 x
g. Resuspender en la concentracin adecua
da y determinar la viabilidad celular por el
mtodo de exclusin dei azul tripn.
Generalmente se recupera un 80 a un 90%
de linfocitos T contaminados con un 10 a 20%
de linfocitos B y macrfagos.
2.3. P U R IF IC A C I N D E L IN F O C IT O S B,
LIN F O C ITO S T Y SU BP O BLA C IO N E S T
El mtodo de inmunoplaqueo o panning, la
purificacin por seleccin negativa mediante la
citotoxicidad especfica dependiente de anti-

Cuadro 36-2. Marcadores de superficie de las

clulas inmunocompetentes y de sus principa
les contaminantes
Tipo celular
Linfocitos T colaboradores
Linfocitos T citotxicos
Linfocitos B
N atural killer
M onocitos
G lbulos rojos

M arcador de superficie
CD4
CD8
CD20
Inm unoglobulinas
CD 16
CD14
C D Il
glicoforinas

cuerpo-complemento y la tcijica de aislamien

to con partculas magnticas, ms recientemen
te desarrollada, se fundamentan en la separa
cin de las clulas de inters de aquellas no de
seadas en base al reconocimiento de antgenos
p re se n te s en la m em b ran a c e lu la r (cu ad ro
36-2), por parte de anticuerpos especficos.
La separacin celular puede ser por selec
cin negativa cuando la poblacin que se desea
purificar carece del antgeno especfico en su
membrana. Por el contrario, en la seleccin po
sitiva se aislar la poblacin que expresa el
marcador de inters.
A continuacin se detallan los marcadores
de superficie de las principales clases de clu
las inmunocompetentes y de las clulas conta
minantes.
2.3.1. Aislamiento de linfocitos por medio
de lisis especfica mediada por anticuerpocomplemento
La citotoxicidad dependiente de anticuerpocomplemento es una tcnica utilizada, general
mente, para depletar una poblacin heterog
nea de clulas en donde una subpoblacin es
reconocida especficamente por un anticuerpo
dirigido hacia un antgeno de la superficie celu
lar. Este complejo antgeno-anticuerpo form a
do en presencia de complemento lleva a la lisis.
Puede ser utilizada como un paso preliminar de
seleccin negativa o para eliminar clulas con
taminantes de una poblacin celular enriqueci
da en una determ inada clase de clulas. Este
protocolo presenta la ventaja de originar una
poblacin celular que no ha sido m anipulada
por uniones antgeno anticuerpo y sus desven
tajas son la prdida de la poblacin celular que
se une al anticuerpo y el requerimiento de que
el anticuerpo utilizado sea fijador de com ple
mento.
A continuacin se detalla la tcnica de puri
ficacin de la subpoblacin de linfocitos T co
laboradores (CD4+) por lisis especfica de la
subpoblacin citotxica (CD8+).

Metodologas para la evaluacin de las clulas inmunocompetentes

Materiales
- M edio RPM I com pleto suplem entado con
SFB al 1%, RPMI-1 (vase apndice al final
del captulo).
- Complemento de conejo con baja linfotoxicidad.
- Suspensin de linfocitos T.
- Anticuerpos monoclonales anti-CD8.
- Tubos de centrfuga cnicos de plstico de
15 mi.
Mtodo
1. Determinar de antemano la dilucin del an
ticuerpo a utilizar por inmunofluorescencia
o por citometra de flujo, asimismo, la con
centracin ptima de complemento que pro
duce la mxima citotoxicidad especfica y la
mnima citotoxicidad no-especfica.
2. En un tubo de centrfuga agregar una sus
pensin de 1 X 10* - 1 X 10 clulas y cen
trifugar 10 minutos a 18-20C y 400 x g.
Descartar el sobrenadante y resuspender las
clulas en la dilucin apropiada de anticuer
po.
3. Colocar las clulas en un bao de hielo du
rante 30 minutos. Centrifugar 10 minutos a
4C y a 400 x g. Descartar el sobrenadante.
4. Resuspender las clulas en una concentra
cin de 1 X 10'' cl/m l de la dilucin del
com plem ento en R PM I-1. Incubar 1 h a
37C. Examinar una alcuota de la suspen
sin celular para determinar la lisis celular.
Si el tratamiento no hubiese resultado total
mente efectivo repetir la incubacin con el
anticuerpo y el complemento.
5. Frenar la lisis agregando a la suspensin ce
lular 10 mi de medio RPMI fro. Centrifugar
10 minutos a 4C y 400 x g. Lavar 2 veces y
resuspender las clulas en medio R PM l-1.
6. Determinar la viabilidad y el porcentaje de
citotoxicidad segn la siguiente frmula:
(N cl. no v ia b le s )'
% de citotoxicidad (C D 8"^) = -

X 100

(N cl. viables +
N cl. no viables)

7. Eliminar la clulas no viables por medio de

un gradiente de Ficoll-Hypaque recuperan
do las clulas viables que se encuentran en
la interfase superior (las clulas no viables
se ubicarn en el fondo del tubo).
2.3.2. Aislamiento de linfocitos
por el mtodo de inmunoplaqueo
o panning
La tcnica de plaqueo en un comienzo fue
desarrollada para la separacin de los linfocitos

735

B de los linfocitos T (Mage y col., 1977; Wysocki & Sato, 1978; Mage et al. 1981). Puede
ser utilizada ya sea como mtodo positivo o ne
gativo de seleccin celular. La pureza de las
poblaciones celulares obtenidas es comparable
con aquellas derivadas del citmetro de flujo.
Adems, esta metodologa es superior a la tc
nica de lisis por complemento ya que la pobla
cin no seleccionada puede ser recuperada.
En la tcnica de plaqueo directa (fig. 36-3a),
las clulas son separadas usando placas de po
liestireno sensibilizadas con anticucipos espe
cficos unidos al plstico por medio de uniones
no-covalentes. A continuacin, las clulas que
poseen en su superficie el antgeno determina
do se unen a los anticuerpos especficos, m ien
tras que las clulas que no los poseen son recu
peradas por medio de lavados. Las clulas uni
das pueden a su vez ser obtenidas cambiando
las condiciones de la reaccin: por el agregado
de m ed io con a lta c o n c en trac i n p ro te ic a
(SFB) o por tratamientos mecnicos. L a des
ventaja de necesitar grandes cantidades de .anti
cuerpo purificado indujo al desarrollo de la tc
nica de plaqueo indirecta.
El mtodo de plaqueo indirecto consiste en
el tratam iento de las clulas con aiticuerpos,
generalmente monoclonales, que reconocen es
pecficamente a los marcadores de las clulas.
A la suspensin celular as tratada, se la incuba
en placas previamente sensibilizadas con una
anti-gamma globuhna especfica para la espe
cie utilizada para reconocer a las clulas. Las
clulas que poseen en su superficie el anticuer
po monoclonal sern fijadas a la placa quedan
do libre la subpoblacin que no fue reconocida.
A continuacin se describe, a modo de ejem
plo, la purificacin de linfocitos T CD4+ y de
linfocitos CD8+ por medio de la tcnica de pla
queo indirecta (fig. 36-3b).
M ateriales
- Anti-gamma globuhna de ratn purificada y
adsorbida contra iminunoglobulina hum ana.
- Anticuerpos monoclonales murinos especfi
cos para la poblacin celular a purificar (anti
CD8).
- Solucin salina tamponada (SST). Ver apn
dice al final del captulo.
- Tris-Cl 0.05 M, pH: 9,5.
- Suspensin enriquecida en linfocitos T por
lana de nyln.
- SST adicionada con 5% y 1% de SFB (SST5 o SST -1).
- M edio RPMI completo. Ver apndice al fi
nal del captulo.
~ Placas de Petri de plstico estriles de 15 x
100 mm.
- Tubos cnicos de 15 mi.

736

Metodologas
AgA g-

Placas sensibilizadas con

anticuerpo especfico
para su marcador
de superficie diferencial

Seleccin positiva

Ag+

F ig . 36-3a. E squem a del fu n d am en

to de la tcnica de inm unoplaqueo d i
recta (Panning directo).

Seleccin negativa

Ag+

fyy'P
M todo
1. A una placa de Petri adicionar 10 ml del antisuero anti-gamma globulina de ratn dilui
do adecuadam ente (aproxim adam ente 10
|Xg/ml) en Tris-Cl 0,05 M, pH; 9,5. Incubar

durante 40 minutos a temperatura ambiente

o 24 h a 4C. (Las placas as sensibilizadas
pueden ser conservadas durante 2 semanas
a4C).
2. En un tubo de centrfuga agregar 2-3 x 10
clulas y centrifugar a 400 x g durante 10

Clulas- anticuerpo monoclonal

especfico para un m arcador de
superficie determinado
Placas sensibilizadas
con anti-gama globulina

Seleccin positiva

Seleccin negativa

F ig . 36 -3 b . E squem a del fundam ento

d e la tcn ica de inm unoplaqueo in d i
recta {Panning indirecto).

Metodologas para la evaluacin de las clulas inmunocompetentes

3.
4.
5.

6.

7.

8.

9.
10.

minutos a 4C. Descartar el sobrenadante

y resuspender las clulas con la dilucin
del anticuerpo especfico (anti CD8) deter
minada de antemano por medio de una inmunofluorescencia o por citometra de fl u
jo. Colocar las clulas en hielo por 30 mi
nutos.
Agregar 5 mi de SST-5 y centrifugar 10 mi
nutos a 400 X g en fro y lavar con SST-5.
Resuspender las clulas en 3 mi de SST-5.
Rem over la solucin del antisuero de la
placa de Petri usando una pipeta estril y
lavar tres veces con 10 mi de SST-5 agi
tando suavemente cada vez. (El antisuero
recuperado puede ser reutilizado.)
Retirar completamente el lquido de lavado
de la placa de Petri e inmediatamente agre
gar la suspensin celular. A gitar suave
mente e incubar durante 1 h a 4C (a los 30
minutos, agitar suavemente durante 30 se
gundos).
R ecoger por aspiracin la suspensin de
clulas que no se han unido. Lavar 2 veces
con 7 mi de SST-1, o hasta haber retirado
todas las clulas no adheridas.
Todos los pasos detallados en este punto
deben ser realizados suavemente, colocan
do la pipeta sobre un lado de la placa, de
m anera tal de no desprender las clulas
unidas especficamente (CDS*^).
Despegar las clulas adheridas con una es
ptula ad hoc o bien pipeteando enrgica
mente 15 mi de SST-1. Examinar la placa
en un microscopio invertido y colocar las
clulas obtenidas en otro tubo de 15 mi.
Centrifugar los tubos con las clulas adhe
rentes y el de las clulas no adherentes a
4C, durante 10 minutos a 400 x g.
Resuspender en medio RPMI y determinar
el grado de pureza por medio de inmunofluorescencia o citometra de flujo. Si se
requiere un mayor grado de pureza repetir
el procedimiento a partir del paso 3.

2.3.3. Purifcacin de clulas por medio

de tcnicas inmunomagnticas
La purificacin de poblaciones y subpobla
ciones celulares por mtodos inmunomagnticos, a partir de una muestra heterognea, ha si
do desarrollada am pliam ente en los ltim os
aos debido al grado de pureza de las muestras
obtenidas (comparable al mtodo de citometra
de flujo), la reproducibilidad y la facilidad del
manejo de muestras pequeas o grandes.
Esta metodologa se fundamenta en una se
paracin fsica en un campo magntico, de las
clulas unidas a un anticuerpo especfico que
se encuentra adherido a microesferas magnti
cas de poliestireno.

737

Al igual que en la tcnica de plaqueo, se

puede realizar una seleccin positiva o negati
va de las clulas. En el caso de la inmunoseparacin positiva, la separacin de las partculas
m agnticas de las clulas es muy trabajosa,
m ientras que la seleccin negativa ofrece un
p ro ced im ien to muy sen cillo p ara p u rific a r
grandes cantidades de clulas, por lo que se la
prefiere. Adems, uno o ms anticuerpos nionoclonales pueden ser adheridos a las m icroes
feras para la separacin simultnea de varias
poblaciones celulares contaminantes.
Aislamiento inmunomagntico de linfocitos T
p o r seleccin negativa
M ateriales
- Clulas mononucleares separadas a partir de
sangre perifrica por medio de un gradiente
de Ficoll-Hypaque; o suspensin celular de
bazo, de nodulos linfticos, de tumores o de
fluido peritoneal.
- Anticuerpos monoclonales especficos para
linfocitos B (CD20), monocitos (CD14), c
lulas NK (CD16) y glbulos rojos (anti-glicoforinas). (Vase cuadro 36-2.)
- Solucin de Hanks libre de Ca++,
adi
cionada con 10% de SFB y buffer H EPES
10 mM (Hanks-10),
~ Microesferas magnticas recubiertas con anti
IgG de ratn obtenido en cabra (aproximada
mente 7 microesferas por clula blanco; Dynabeds M-450, Dynal 11005 y 1 1006),
- Aparato para la separacin magntica (Dynal
MPCI 12001 o Advanced Magnetic 41025).
- Tubos de polipropileno de 15 mi.
Mtodo
Importante: todos los pasos a seguir debe
rn ser realizados a 4C para minimizar fen
menos de capping y el desprendimiento de los
anticuerpos de la membrana celular.
1. D eterm inar la concentracin saturante de
anticuerpos monoclonales por medio de inm unofluorescencia o citom etra de flu jo .
Generalmente se logra con una concentra
cin de 1 |ig/ml.
2. Resuspender las clulas en una concentra
cin de 2 X 10 cl/ml de H anks-10.
3. Agregar 1 mi de la solucin de la mezcla de
anticuerpos cada 10 mi de suspensin celu
lar. Incubar 30 minutos a 4C con agitacin
continua (6 a 10 rpm) para evitar que las c
lulas sedimenten.
4. Lavar 2 veces las clulas con Hanks-10 cen
trifugando en fro a 150 x g, durante 10 m i
nutos. Resuspender las clulas en 10 mi de

738

5.

6.
7.

8.

Metodologas

Hanks- IO fro y transferirlas a un tubo nue

vo.
A gregar 4 x 10 m icroesferas (Im l de la
suspensin comercial) para 2 x 10 clulas
mononucleares totales y lavar con Hanks10. Colocar el tubo de forma de orientar las
partculas en una cara del tubo y aspirar el
medio con una pipeta colocada en el fondo
del tubo. Repetir la operacin y resuspender
las microesferas en 1 ml de H anks-10.
Agregar la suspensin de microesferas a la
suspensin celular y agitar suavemente (6 a
10 rpm) 1 h a 4C.
Separar las clulas marcadas con los anti
cuerpos monoclonales unidos a las microes
feras m agnticas colocando el tubo en un
campo magntico. Despus de 5 minutos,
transferir las clulas no marcadas a un tubo
nuevo y repetir el procedimiento. Contai' las
clulas y resuspenderlas en H an k s-10 en
una concentracin de 2 x 10 cl/ml.
Repetir los pasos 4 a 7 en los casos en que
se requiera un mayor grado de pureza.

2.4. O BTE N C I N D E L IN F O B L A ST O S
M ateriales
- Suspensin de esplenocitos o de clulas mononucleares.
M edio RPM I com pleto suplem entado con
SFB al 10% (vase apndice al final del ca
ptulo).
- Frascos de cultivo de 75 cm^ (T75).
- Solucin de PHA o Con A para linfocitos T
y solucin de Staphyococcus A Cowan 1 pa
ra linfocitos B (vase cuadro 36-5).
NOTA: todos los reactivos y materiales que
estn en contacto con las clulas debern estar
en condiciones de esterilidad y el operador de
ber seguir los procedimientos empleados para
el cultivo de clulas.
M todo
1. Ajustar la suspensin celular en 5,0 x 10'
cl/m l en m edio R P M I-10. A d icio n ar la
concentracin del mitgeno que estimula a
la poblacin linfocitaria en form a ptima,
previamente determinada por medio de un
ensayo linfoproliferativo.
2. Incubar las clulas a 37C en estufa gaseada
con 5% de CO^, durante 48-72 h.
3. Centrifugar las clulas a 900 x g durante 5
minutos.
4. R esuspender las clulas en m edio RPM I
completo. Contar y determinar la viabilidad
celular por el mtodo de exclusin del azul
tripn.

OBTENCIN D E ESPLENOCITOS
M U R IN O S
2 .5 .

M ateriales
- Ratones de una cepa determinada, entre 6 se
manas y 6 meses de edad.
- Alcohol 70.
- Solucin de Hanks o medio de cultivo RPMI
co m pleto suplem entado con 5% de SFB
(vase apndice al final del captulo).
~ Malla de acero inoxidable o de nylon de 200
|jm .

- Material de ciruga estril.

M todo
1. Sacrificar los ratones por dislocacin cer
vical o inhalacin de CO^.
2. C olocarlos en posicin dorsal sobre una
plantilla de diseccin.
3. Rociarlos con alcohol 70.
4. Practicar la incisin adecuada para poner
en descubierto el bazo, abriendo la cavidad
peritoneal desde abajo h acia la cabeza.
(Vase fig. 36-4.)
5. Cortar el bazo con pinza y tijera estril en
varios pedazos. Colocarlo en una placa de
Petri y lavarlo con medio de cultivo.
6. Colocarlo sobre una malla de acero inoxi
dable y triturarlo en fragmentos pequeos
con una tijera de punta curva. Preparar un
homogeneizado celular en medio de culti
vo, por disgregacin sobre la malla. Lavar
la malla varias veces con medio de cultivo
para desprender las clulas que hayan que
dado adheridas.
7. Recoger la suspensin celular filtrada por
la malla con una pipeta Pasteur y colocarla
en un tubo cnico.
8. Dejar reposar 5-6 minutos para que sedi
menten los grumos.
9. Centrifugar el sobrenadante a 200 x g du
rante 10 minutos.
10. Descartar el sobrenadante y lavar el sedi
mento celular con medio de cultivo.
11. Resuspender las clulas en el medio ade
cuado.
Se recuperan aproximadamente 5-15 x 10
clulas por bazo.
N O TA : En general es aconsejable lisar los
glbulos rojos presentes en una suspensin de
esplenocitos por medio de las metodologas de
talladas en el apndice antes de ajustar la con
centracin celular. No obstante, existen contro
versias acerca de la conveniencia de eliminar
los glbulos rojos contaminantes presentes en
la suspensin de esplenocitos cuando se reali
zan pruebas funcionales.

Metodologas para la evaluacin de las clulas inmunocompetentes

739

F ig. 36-4. Esquem a de la distribu

cin de los rganos del ratn.

Nodulo linftico axilar

Nodulo linftico axilar lateral
Hgado
Bazo
- Estmago
Rin
_ Ndulo linftico
inguinal superficial

Intestinof

Nodulo linftico
mesentrico

Ndulo linftico poplteo

2.6. OBTENCIN D E CLULAS

GANGLIONARES MURINAS
Materiales
- Ratones de una cepa determinada, entre 6 se
manas y 6 meses de edad.
- Alcohol 70.
- Solucin de Hanks o medio de cultivo RPMI
com pleto suplem entad o con 5% de SFB
(vase apndice al final del captulo).
- Malla de acero inoxidable o de nylon de 200
|im.
- Material de ciruga estril.
M todo
1. Sacrificar los ratones por dislocacin cervi
cal o inhalacin de CO^.
2. C olocarlos en posicin dorsal sobre una
plantilla de diseccin.
3. Rociarlos con alcohol 70.
4. Poner en descubierto los ganglios de la zona
popltea, inguinal o axilar y seccionarlos
con pinza y tijera (fig. 36-4).
5. Transferirlos a una placa de Petri, lavar con
medio de cultivo y extirpar cualquier resto
de tejido extrao que pudiera estar adosado
a los ganglios.
6. Lavar nuevamente con medio de cultivo y
proceder a la fragmentacin, el homogeneizado y la separacin de las clulas como se
indic para el bazo.
Se recuperan aproximadam ente 5-10 x 10^
clulas por ganglio.
2.7. OBTENCIN D E TIMOCITOS
MURINOS
M ateriales
- Ratones de una cepa determinada, entre 3 y
6 semanas de edad.

~ Alcohol 70.
- Solucin de Hanks o medio de cultivo RPM I
co m p leto suplem entado con 5% de SFB
(vase apndice al final del captulo).
- M alla de acero inoxidable o de nylon de 200
am.
- Material de ciruga estril.
M todo
1. En las preparaciones de timocitos debe ex
cluirse a las clulas provenientes de la san
gre. Para evitar esta contaminacin, sangrar
los animales a blanco a travs def plexo retroorbital. Normalmente el ratn muere co
mo consecuencia de esta maniobra. Si as no
ocurre, sacrificarlo por inhalacin con CO^
y no por dislocacin cervical pues ello p ro
duce muerte de clulas en el rea tniica.
2. C olocar al ratn en posicin dorsal sobre
una plantilla de diseccin.
3. Realizar una incisin, con ] mza y tijera, en
la piel del cuello previamente i ociada con
alcohol 70.
4. Con cuidado poner en descubierto el tim o,
extirparlo y colocarlo en una cpsula de P e
tri .
5. Ehminar nodulos linfticos y vasos, lavar el
timo con medio de cultivo y luego disgre
garlo en una malla de acero inoxidable.
6. Recoger la suspensin de clulas con pipeta
Pasteur y colocarlas en un tubo cnico.
7. D ejar reposar 5-6 minutos para que se d i
menten los grumos.
8. Centrifugar el sobrenadante a 200 x g d u
rante 10 minutos.
9. D escartar el sobrenadante y lavar el se d i
mento celular con medio de cultivo.
10. Resuspender las clulas en el medio ade
cuado.
Para la obtencin de timocitos es convenien
te usar ratones de 3 a 6 semanas ya que los an i

740

Metodologas

males de mayor edad dan menores rendimien

tos. Se obtienen aproximadamente 10-30 x 10'
timocitos por animal.

- Placas de Petri de plstico de 100 mm de

dimetro,
~ SST-EDTA 0,02%.

2.8. OBTENCIN D E MACRFAGOS

Y MONOCITOS

Mtodo

1.
2.8.1.
Obtencin de macrfagos peritonea
les de rat n : cuando se quieren obtener macr
fagos peritoneales murinos es conveniente esti
mular en el animal la produccin de los mis- 2.
3.
Materiales
- Ratones de una cepa determinada.
- Medio tioglicolato (Difeo), envejecido en la
heladera por 2 a 3 meses.
- Solucin de Hanks (vase apndice al final
del captulo).
- Alcohol de 70.
- Materia] de ciruga estril.
Mtodo
1. Inocular ratones intraperitonealm ente con
medio de tioglicolato envejecido. Por cada
ratn inocular 2-3 mi.
2. Recoger las clulas peritoneales, previa ino
culacin de 5 mi de solucin de Hanks, cua
tro das despus de la estimulacin con tio
glicolato.
Puede procederse tambin, sacrificando al
animal por dislocacin cervical, fijando lue
go al ratn en una plantilla de diseccin.
Frotar el abdomen con alcohol de 70, in
yectar intraperitonealm ente 5 mi de solu
cin de Hanks y m asajear suavem ente el
rea abdominal. Efectuar Un corte en la piel
correspondiente a la zona peritoneal baja y
recoger la suspensin celular con pipeta
Pasteur.
3. Centrifugar las clulas a 200 X g durante 10
minutos y lavarlas una o dos veces con solu
cin de Hanks.
El rendimiento es de 3-4,5 x 10 clulas por
ratn.
2.8.2, Separacin de monocitos-macrfagos
por adherencia al plstico
Materiales
- Clulas mononucleares aisladas por FicollHypaque o macrfagos murinos obtenidos
por estimulacin con tioglicolato,
- Solucin salina tam ponada (SST) (vase
apndice al final del captulo).
RPMI completo (vase apndice al final del
captulo).

4.

5.

6.
al

Ajustar las clulas, aisladas de sangre por el

mtodo de Ficoll-HypaCjue o las provenien
tes del exudado peritoneal, a 2 x 10 cl/ml
en RPMI.
Aadir 10 mi de la suspensin celular en las
placas de Petri.
M antener las placas en incubacin a 37C
en estufa gaseada con 5% de CO^, durante
60 minutos.
Agitar las placas vigorosamente en forma
manual, evitando derram ar el fluido, para
separar los linfocitos no adherentes. Descar
tar el medio que contiene las clulas no ad
heridas. Lavar 2 veces con medio y agregar
10 mi de RPMI completo.
Por este procedimiento, los linfocitos quedan
en suspensin mientras que los macrfagos
permanecen adheridos al fondo de la placa.
Para remover las clulas adheridas a la pla
ca, adicionar SST-EDTA 0,02% fro. Dejar
10 minutos y despegar las clulas golpeando
enrgicamente la base de la placa. Transferir
las clulas a un tubo cnico de 15 mi y cen
trifugar las clulas a 300 x g durante 10 mi
nutos.
Resuspender las clulas obtenidas en RPMI.
La pureza conseguida generalmente excede
90%.

3. CARACTERIZACIN FENOTPICA
DE LAS CLULAS QUE PARTICIPAN
EN LA RESPU ESTA INMUNE. SU
UTILIDAD EN EL DIAGNSTICO
DE ENFERMEDADES
La determinacin del nmero de linfocitos
es uno de los mtodos utilizados de rutina para
el m onitoreo inm unolgico de pacientes con
deficiencias en su inmunidad celular. Por ejem
plo: en personas afectadas por el virus de la inm unodeficiencia adquirida (HIV) decrece el
porcentaje de linfocitos T CD4+. El anlisis fenotpico de las clulas mononucleares de san
gre perifrica incluye marcadores para monoci
tos, clulas NK, linfocitos T, linfocitos B y
marcadores de activacin T como por ejemplo:
CD25 (receptor para IL-2) o HLA-Dr.
Hace ya ms de IO aos, se realiz la primer
mesa de trabajo internacional sobre antgenos
de diferenciacin de leucocitos humanos y sur
gi una nomenclatura nueva para designar ti
pos y subtipos de clulas. Se establecieron una
serie de grupos denom inados CD, del ingls

Metodologas para la evaluacin de las clulas inmunocompetentes

clusters de diferenciacin para definir antge
nos celulares (vase cap. 2). Los antgenos su
perficiales forman parte del fenotipo de una c
lula. Aunque esta nomenclatura se emple ori
ginariamente para designcir antgenos de leuco
citos humanos luego se extendi su uso a otros
dpos celulares y especies. En el cuadro 36-3 se
enumeran marcadores de los linfocitos T y de
los linfocitos B.
Actualmente, con el advenimiento de los an
ticuerpos monoclonales marcados con fluorocromos y del clasificador electrnico de clulas
activado por fluorescencia (FACS), han ido de
jndose de lado otras metodologas como las
rosetas, para la determinacin del nmero y del
fenotipo de los hnfocitos.
3.1. LIN F O C IT O S F O R M A D O R E S
D E R O SE T A S E SP O N T N E A S
CON E R IT R O C IT O S D E C ARN ERO
(R O SE TA S E)
Los linfocitos T humanos tienen receptores
para eritrocitos de cai'nero, denominados CD2.
Cuando se m ezclan clulas mononucleares y
glbulos rojos de camero, stos se unen a los
linfocitos T portadores de los receptores CD2
formando rosetas, llamadas rosetas E. Es por
ello que una de las maneras de identificar a los
linfocitos T ha sido por su capacidad de unir
glbulos rojos de carnero y formar rosetas.

741

Esta metodologa ha sido reemplazada por la

deteccin del receptor CD2 utilizando anticuer
pos monoclonales. Sin embargo, an se utiliza
para el aislamiento de linfocitos T a partir de
clulas mononucleares. Las rosetas de linfocitos T y glbulos rojos de carnero se separan de
otras clulas mononucleares por centrifugacin
en un gradiente de Ficoll-Hypaque. Luego se
aslan las clulas T de los glbulos rojos unidos
en las rosetas por lisis hipotnica.
A continuacin se detallar la tcnica de fo r
macin de rosetas E para la deteccin de lin fo
citos T.
M ateriales
- Suspensin de mononucleares de sangre p e
rifrica en RPMI-10 (1 x 10 cl/ml),
- Glbulos rojos de carnero suspendidos en el
medio Alsever.
- M edio de cultivo RPMI suplementado con
SFB al 10%, RPMLIO. (Vase apndice al
final del captulo.)
~ Solucin de Hanks. (Vase apndice al final
del captulo.)
- SFB inactvado I h a 56C.
M todo
1. Lavar los glbulos rojos de carnero con so
lucin de Hanks, mezclando 1 volumen de

C u ad ro 36-3. Principales marcadores de superficie de los linfocitos T y B

Linfocitos T
M olcula
de superficie/m arcador

Linfocitos B

Fim cin

M olcula
de superficie/m arcador

Fu ion

TC R (ap )*
TC R (y8)*

R eceptor antignico
R eceptor antignico

Inm unoglobulina*
M olculas del CM H
clase II

R eceptor antignico
Interaccin de LT h y LB

CD2* ( T ll,L F A - 2 ),
receptor p ara glbu
los rojo,s de carnero
[en hum anos]

M olcula de adhesin, activacin

de clulas T

C D 10 (C A LLA )

E ndopeptidasas asociada a m em
brana (enkefalinasa)

CD 3* (T3, Leu-4)

M olcula que form a parte del

com plejo del TCR

C D 1 9 (B 4 )*

A ctivacin o regulacin de lin fo

citos B

CD4* (T4, Leu-3,

L 3T4 [en ratnj)

M olcula de adhesin (CMH cla

se 11) y transduccin de seales

C D 2 0 (B 1 )*

A ctivacin o regulacin de lin fo

citos B

C D 8 * (T 8, Leu-2,
Lyt-2 [en ratn])

M olcula de adhesin (CM H cla

se 1) y transduccin de seales

CD22*

A dhesin celular y activacin de

LB

C D 28* (Tp44)

M olcula eoestim ul adora en la ac

tivacin del LT

CD40*

A ctivacin de LB inducida por

contacto con LT h

CD35

R eceptor de C3b

CD35

R eceptor de C3b

^ M arcad o r e s p e cfico
** C D 2, p re sen te tam b in en N K ;

C D 4, p re sen te tam bin en m o n o c ito s y m ac r fa g o s hu m an o s.

742

2.

3.
4.
5.

Metodologas

glbulos rojos y 9 volmenes del diluyente.

Centrifugar a 1000 x g durante 10 minutos.
Repetir el procedimiento cinco veces. Resuspender el sedim ento g lobular en una
concentracin al 2% v/v en RPM I-10.
Mezclar 0,25 mi de la suspensin de eritro
citos con 0,25 mi de la suspensin de mononucleares e incubar en bao de agua a 37C
por 15 minutos.
Centrifugar a 200 x g durante 5 minutos pa
ra favorecer el contacto entre los glbulos
rojos y los linfocitos.
Incubar a 4C entre 2 a 16 h.
R esuspender suavem ente y determ inar el
nmero absoluto de rosetas E colocando go
tas de la suspensin en una cmara de Neubauer. Observar al microscopio a 400 X.

Se consideran linfocitos T, form adores de

rosetas E, a todas aquellas clulas que tienen
adheridas a su superficie 3 o ms eritrocitos. Se
calcula el porcentaje determinando el nmero
total de clulas presentes y el de aquellas que
formaron rosetas.
Una modificacin de esta tcnica fue utiliza
da para identificar o separar subpoblaciones de
linfocitos. Algunos linfocitos T y linfocitos B
tienen receptores para Fe de inmunoglobulinas
y/o receptores para C3b del complemento. Es
tos linfocitos son capaces de unirse, a travs de
estos receptores, a eritrocitos recubiertos con
anticuerpos especficos para un antgeno del
glbulo rojo o a glbulos rojos sensibilizados
con hemolisina en presencia de una fuente de
complemento deficiente en C,, formando rose
tas. El receptor para Fe se expresa en la mem
brana de muchas clulas incluyendo, linfocitos
B, linfocitos T (pequea subpoblacin), mono
citos, macrfagos, granulocitos, plaquetas y c
lulas NK mientras que el receptor para C3b es
t presente en eritrocitos, neutrfilos, macrfa
gos, eosinfilos, linfocitos T, linfocitos B y c
lulas dendrticas foliculares. Si bien la metodo
loga es similar a la formacin de rosetas E, es
tas tcnicas son inespecficas para identificar
linfocitos T o linfocitos B y han sido totalmen
te dejadas de lado para tal fin.
3.2. IN M U N O F LU O R ESC E N C IA
Los anticuerpos especficos para los antge
nos presentes en los linfocitos humanos, son
reactivos indispensables para la identificacin
de estas clulas. En la dcada del 60, se desa
rrollaron metodologas sencillas para la marca
cin de protenas con reactivos fluorescentes,
uno de los fluorocromos ms comnmente uti
liz a d o es el is o tio c ia n a to de flu o re sc e n a
(FITC). Mediante las tcnicas de inmunofluorescencia, que se detallan en el captulo 35, se

pueden identificar clulas en suspensin o en

cortes fijos de tejidos, disponiendo de un m i
croscopio de luz ultravioleta. Los resultados se
expresan en forma cualitativa o semicuantitativa como porcentaje de clulas positivas expre
sando un determinado antgeno.
3.3. C ITO M E TRA D E FLUJO.
SU U TILID AD E N LA D ETE C C I N
D E L F EN O TIP O C ELU LAR, LA
C L A SIF IC A C I N D E C LU LAS
Y E L A N L IS IS D E L A D N
La tecnologa de los clasificadores de clulas
activados por fluorescencia se desarroll en la
dcada del 70 con el propsito de disponer de
mtodos cuantitativos y para facilitar los estu
dios de poblaciones de linfocitos que podran
ser identificados y clasificados sobre la base de
la expresin de un antgeno determinado pre
sente en la membrana de la clula, y luego ca
racterizados funcionalmente.
La determinacin del nmero y la capacidad
funcional de los leucocitos de sangre perifrica
de un individuo reflejan el estado ntegro de la
inm unidad. Los linfocitos expresan diversos
marcadores de superficie que pueden ser iden
tificados por anticuerpos monoclonales, anti
sueros policlonales o monoespecficos. El uso
de anticuerpos monoclonales junto con la cito
metra de flujo permite definir el fenotipo celu
lar de linfocitos discrim inando no slo entre
linfocitos T, linfocitos B y clulas NK sino
tambin entre subgrupos de estas poblaciones.
La citometra de flujo para determinar sub
poblaciones de linfocitos humanos ha comen
zado a ser muy til en el diagnstico y prons
tico de diversas situaciones clnicas, como el
trasp lan te de rganos y de m dula sea, el
diagnstico de leucemias y linfomas y la eva
luacin de inmunodeficiencias. Esta metodolo
ga ha desplazado a las tcnicas de inmunojluorescencia en la prctica clnica por ser ms
confiable, reproducible y sensible que la deter
minacin por microscopa.
Los citmetros de flujo son instrumentos que
analizan rpidamente clulas individuales m ar
cadas con fluorocromos que fluyen a gran velo
cidad en un medio lquido por delante de una
fuente de excitacin. Cada clula se evala se
gn diversas caractersticas: forma, tam ao,
composicin antignica y bioqumica. Esta m e
todologa perm ite la identificacin de subpo
blaciones pequeas en mezclas complejas de
clulas por sus caractersticas de alta precisin
y sensibilidad. Una propiedad im portante de
estos aparatos consiste en poder discriminar la
fluorescencia de los fluorocromos que emiten a
diversas longitudes de onda. De esta forma, va
rios marcadores presentes en la membrana de

Metodologas para a evaluacin de las clulas inmunocompetentes

una clula (por ejemplo en linfocitos T: CD3,
CD8) pueden ser detectados simultneamente
mediante el empleo de anticuerpos especficos
conjugados a distintos fluorocromos, anti CD3
conjugado a FITC, anti CD8 conjugado a PE
(vanse figs. 36-5b y 36-6).
La citofluorom etra tam bin puede separar
subpoblaciones de clulas de acuerdo a las ca
ractersticas medidas. Las clulas que emiten
seales fluorescentes predeterminadas pueden
ser desviadas d iferencialm en te por cam pos
electromagnticos cuya intensidad y direccin
vara de acuerdo a la intensidad de la seal de
la fluorescencia medida. De esta forma, se pue
den aislar poblaciones celulares en base al anti
cuerpo, conjugado a un fluorocromo, unido a la
superficie celular, obtenindose las clulas se
paradas en tubos colectores. Los instrumentos
capaces de ealizar este tipo de clasificacin
electrnica de clulas se denominan clasifica
dores de clulas activados por fluorescencia,
conocidos por su denominacin en ingls fluorescence-activated cell sorter (FACS).
Un citm etro de flujo analiza electrnica
mente las seales generadas por clulas u otras
partculas simples homogneamente suspendi
das cuando fluyen por delante de una fuente de
luz. El flujo con la muestra que contiene las c
lulas es introducido bajo presin a travs de
otro flujo de lquido, denominado vaina, que
puede ser agua o solucin salina isotnica. De
esta forma, las partculas se alinean y pasan a
travs de la fuente de luz en hilera. La fuente de
luz, que es generalmente un haz de lser, pro
vee la longitud de onda especfica. La presencia
de una clula en el camino del lser dispersa luz
en todas las direcciones y excita a los fluorocro
mos unidos a cada clula. Esta interaccin per
mite diversas mediciones de importancia biol
gica en las clulas. (Vase fig. 36-5.)
Cuando una clula interacciona con el rayo
lser, la luz dispersada es medida por detecto
res orientados en forma ortogonal (SS) o frontal
(FS) a la luz incidente (fig, 36-5a). Estos detec
tores no son sensibles a la fluorescencia y se
utilizan para discrim inar clulas (marcadas o
no con fluorescencia) del detrito celular. Los
parmetros medidos por estos detectores se co
nocen por su denominacin en ingls, forw ard
scatter (FS) y side scatter (SS). Cuando se es
tudian leucocitos, el FS indica el tamao celu
lar mientras que el SS se correlaciona con el
contenido celular de grnulos.
Otros detectores miden emisin de fluores
cencia de una longitud de onda determ inada
por medio de filtros pticos instalados en el
frente de los tubos fotomultiplicadores (vase
fig. 36-5a),
En un citmetro de flujo, la luz dispersada
en un ngulo de 90 y la emitida por los fluoro

743

cromos conjugados a los anticuerpos unidos a

las clulas son detectadas por un sistema amphficador denominado tubos fotomultiplicado
res. Estos convierten la luz emitida en seales
electrnicas que luego son transform adas y
analizadas por una computadora que producir
los grficos caractersticos.
^
3.3.1. Deteccin de antgenos de linfocitos
humanos por citometra de flujo
Una de las principales aphcaciones de la ci
tometra de flujo es la determinacin del fenoti
po de leucocitos circulantes y la tipificacin de
leucemias o linfomas (vase Aplicaciones d e la
Inmunogentica al diagnstico de leucemias y
linfomas, desarrollado en el Anexo de este ca
ptulo). El protocolo que se describir fue d ise
ado para estudiar clulas humanas de sangre
perifrica por citometra de flujo.
M ateriales
- Sangre perifrica entera, obtenida con an ti
coagulante (EDTA o Heparina) y recogida
en condiciones de esterilidad.
- Anticuerpos monoclonales marcados con un
fluorocromo.
- Solucin para Usar glbulos rojos de T risCloruro de amonio (vase apndice al final
del captulo) o H^O destilada estril.
- SST (solucin salina tamponada) contenien
do 0,1 % de azida (vase apndice al final del
captulo).
- Solucin fijadora, paraformaldehdo 1% en
SST.
- Tubos de centrfuga con fondo cncavo, 12
X 75 mm (Falcon # 2052).
N O T A : todos los reactivos y las m uestras
debern estar en condicin de esterilidad.
Mtodo
1. Para cada muestra, mezclar en tubos de cen
trfuga de 12 X 75 mm, 100 0,1 de sangre en
tera anticoagulada y 5-20 |xl de los anticuer
pos monoclonales marcados.
2. Homogeneizar e incubar a temperatura am
biente 15 a 20 minutos en la oscuridad.
3. Lisar los glbulos rojos con 2 mi de so lu
cin de lisis. Agitar en un vortex e incubar 5
minutos en la oscuridad.
4. Centrifugar a 200 x g, 5 minutos a 4C y as
pirar el sobrenadante.
5. Agregar 2 mi de SST conteniendo 0,1% de
azida en cada tubo de reaccin y agitar con
un vortex. Centrifugar a 300 x g, 10 m in u
tos a 4C. Aspirar el sobrenadante y repetir
el lavado.

744

Metodologas
Detector
de luz naranja
Detector
de luz roja

Detector
de luz
verde>

Detector de luz
dispersada
ortogonalmente

Fuente
de rayo
lser

Cubeta
de
cuarzo
Detector de luz
incidente frontal
(FS)
Fig. 36-5a. Esquem a de los com ponentes de un citm etro de flujo.

6. Para fijar las clulas, resuspender cada sedi

mento celular en un volumen final de 0 ,1 ml
con paraformaldehdo al 1% en SST azida,
pH 7,4. Antes del anlisis por citometra,
agregar SST estril llevando a un volumen
final entre 0,6 y 1,0 ml.
7. Guardar las muestras en la oscuridad a 4C
(hasta 7 das) o analizarlas directamente en
el citmetro de flujo.
Controles
- Clulas que no fueron marcadas para deter
minar la autofluorescencia.
~ En el caso de una tcnica de marcacin di
recta, se realiza un control con un anticuerpo
conjugado irrelevante del mismo isotipo para
determinar unin inespecfica,
~ En las tcnicas de marcacin indirecta, se
tratan las clulas con un anticuerpo irrele
vante del mismo isotipo y como segundo an
ticuerpo, el conjugado utilizado en la reac
cin.
Estos controles son indispensables y opcio

nalmente se puede realizar un control positivo

(por ejemplo; clulas normales, clulas de l
neas caracterizadas).
Representacin grfica de los resultados
Los datos obtenidos en el anlisis de pobla
ciones celulares a travs de un citofluormetro
se pueden representar en diversas formas, gr
ficos de puntos o de contornos e histogramas,
entre otros (fig. 36-6).
En las figuras 36-6 a y 36-6b, se representan
grficam en te los parm etros obtenidos por
FACS, correspondientes al tamao y al conte
nido de grnulos de las distintas poblaciones
celulares presentes en una m aestra de sangre
p erifrica hum ana norm al. Estos parm etros
fueron representados por grficos de puntos
(fig. 36-6a) o de contornos (fig, 36-6b).
En las figuras 36-6c-f, se grafican los datos
obtenidos al analizar la expresin de uno o ms
marcadores fenotpicos de superficie en la mis
ma poblacin celular (figs. 36-6c y 6d y 36-6e
y 6f, respectivamente).

Metodologas para la evaluacin de las clulas inmunocompetentes

745

F ig . 3 6 -5 b . D istrib u c i n de
las clu las p ara ser an a liz a
das en un citm etro de flujo.

Rayo
lser

C onsideraciones generales
- Fluorocromos utilizados: en el cuadro 36-4
se indican la absorcin y emisin mxima de
los fluorocromos ms comnmente utiliza
dos.
- Autofluorescencia: es el resultado de la luz
emitida por materiales intracelulares excita
dos naturalmente a la longitud de onda utili
zada para excitar a los fluorocromos unidos
a las clulas. La mayor fuente de aiitofluo-

rescencia son clulas hematopoyticas que

se excitan a 488 nm y tienen un pico m x i
mo de emisin cercano a 560 nm, que in ter
fiere en las mediciones de FITC y R-PE.
Muestra a analizar: la muestra de eleccin
para el estudio de clulas mononucleares h u
manas es sangre entera anticoagulada y p o s
terior lisis de los eritrocitos, siguiendo la
metodologa descrita anteriormente. Cuando
se trabaja con clulas de m dula sea, es
aconsejable realizar una separaciJi en g ra
dientes de Ficoll-Hypaque.

Cuadro 36-4. Emisin y absorcin mxima de los principales fluorocromos utilizados en citom e
tra de flujo
Fluorocromo.':

A bsorcin m xim a (nm)

E m isin mxima (nm )

A) Fluorocrom os para conjugar anticuerpos

Isotiocianato de fluorescena (FITC)
F icoeritrina B (B-PE)
F icoeritrina R (R-PE)
R ojo T exas (TXR)
A loficocianina (APC)
F icocianina C (CPC)
Rojo 613
Peridinin C lorophyll (PerCP)

495
545/565
488/545/565
595
650
620
488/565/595
470

525 (verde)
575 (naranja)
578 (naranja)
62 0 (rojo)
660 (rojo)
648 (rojo)
613 (rojo)
680 (rojo)

340/530
345/530
492

620 (rojo)
605
520

B) Fluorocrom os para cidos nucleicos

Y oduro de propidio (Pl)
B rom uro de etidio (EB)
N aranja de acridina

746

Metodologas

~~ Tcnicas de m arcaci n : pueden utilizarse

metodologas del tipo directa o indirecta, ex
plicadas en las tcnicas de inm unofluores
cencia (cap. 35).
- F ijacin: este tratamiento es optativo y se
realiza cuando las clulas no se analizan el
mismo da de la marcacin. Permite que la
muestra se pueda guardar por 5 a 7 das sin
una prdida considerable de la fluorescencia.
- V aloracin de anticuerpos: la concentra
cin ptima de anticuerpo se determina rea
lizando una titulacin del mismo frente a c
lulas conocidas positivas y se elige la con
centracin que produce la mxima respuesta.
La titulacin es importante ya que una canti
dad subsaturante puede disminuir el porcen
taje de positividad mientras que un exceso
de anticuerpos puede resultar en aglutinacin
de las clulas y aum entar la fluorescencia
in e sp e c fic a . C o n sid eran d o que en cad a
muestra a analizar hay aproximadamente 1 x
JO clu las, se agreg arn en tre 2,5 a 10
)j,g/ml de un anticuerpo monoclonal o 40 a
100 |ig/ml de anticuerpos polielonales para
alcanzar la concentracin saturante.
Como las m olculas de IgG se pueden
unir a los receptores para Fe, expresados en
la superficie de diversos tipos celulares, in
dependientemente de su especificidad anti
gnica, es aconsejable utilizar anticuerpos
preparados con fragm entos Fab o F (ab )j.
Otra forma para reducir las uniones inespe
cficas a los receptores de Fe, es bloquear
los sitios de unin con un exceso de suero.
3.3.2. Clasificacin de clulas
La separacin de clulas en citm etros de
flujo involucra el anlisis y la clasificacin de
clulas individuales.
El uso de esta metodologa est limitado por
el nmero total de clulas a separar. Conside
rando que la velocidad de anlisis y de clasifi
cacin de clulas es de aproximadamente 5.000
cl/segundo, no es conveniente utilizarla para
obtener altas concentraciones de subpoblacio
nes celulares (por ej., 2 x 10). Los mtodos al
ternativos de separacin de clulas, inmunopla
queo, inmunomagnticos y deplecin mediada
por complemento y anticuerpo, detallados ante
riormente, tienen las ventajas de ser simples en
su procedim iento, producir un m ayor rendi
miento y lograr una pureza equivalente al clasi
ficador electrnico de clulas.
3.3.3. Anlisis del ADN y del ciclo celular
por citometra de flujo
El contenido de ADN de los ncleos celula
res refleja el com plem ento de crom osom as

(CR) o ploida y la fase del ciclo celular en la

que se encuentran las clulas en estudio. Las
clulas que proliferan atraviesan distintas fases
del ciclo celular, las que fueron designadas
G|, S (sntesis), G^ y M (mitosis). En las etapas
de G^^ y G |, las clulas contienen una copia
simple del ADN (2 CR). Dentro de una pobla
cin de clulas en un determinado tiempo, la
mayora permanece sin dividirse, quiescentes o
en Go (vase fig. 36-7) y preparndose para la
sntesis del ADN (G,). Cuando las clulas co
mienzan a proliferar entran en la fase S, duran
te la cual se sintetizar un duplicado del ADN.
En la etapa G^ las clulas contienen dos grupos
de cromosomas (4 CR). La fase M termina con
la divisin celular y cada clula contiene una
cantidad normal de cromosomas (2 CR), deno
minado euploida o diploida. Las clulas que
contienen cantidades anormales de ADN, au
m entado o dism inuido, se identifican como
aneuploides. En general, las poblaciones celu
lares aneuploides as como tambin las pobla
ciones diploides pero con un alto grado proliferativo (SG 2/M) se correlacionan con un prons
tico peor en diversas enfermedades malignas.
Lfna de las aplicaciones clnicas importantes
del anlisis por citometra de flujo es la evalua
cin del contenido celular del ADN para deter
minar ploida y frecuencia de clulas en las dis
tintas fases del ciclo celular. El contenido del
ADN de una clula se estima por la unin estequiom trica de un fluorocrom o al ADN nu
clear. De esta manera, las clulas que estn en
G , tendrn una cantidad doble del ADN y fluo
rocromo que las clulas en G^. Esta metodolo
ga se aplica en el diagnstico de leucemias en
seres humanos.
Para la determinacin del ADN y del ciclo
celular por citofluorom etra, en el protocolo
que se describir, las clulas en suspensin
son fijadas con etanol y se marcan con yoduro
de propidio. ste se intercala dentro de la do
ble cadena de los cidos nucleicos y puede ser
excitado por un rayo lser de 488 nm, utiliza
do comnmente en los citmetros de flujo. Se
u tiliz a la en zim a A R N asa que d e g rad a al
ARN para que el yoduro de propidio slo pue
da unirse a la doble cadena del ADN intrace
lu la r. L a unin del yo d u ro de p ro p id io al
ADN incrementa la fluorescencia alrededor de
50 veces.
El yoduro de propidio emite a 620 nm y por
lo tanto, puede ser discriminada de la emisin
de la fluorescencia del FITC (520 nm) en los
citmetros de flujo. Esta propiedad permite co
rrelacionar el contenido de ADN con la expre
sin de un antgeno celular de superficie utili
zando yoduro de propidio y un anticuerpo con
jugado con FITC para marcar las clulas que
sern analizadas.

Metodologas para la evaluacin de las clulas inmunocompetentes

M ateriales
- Clulas creciendo en suspensin o monocapa, de sangre perifrica o de mdula sea.
- Buffer muestra (glucosa al 0.1% en SST, fil
trar por 0,22 |am y guardar a 4C).
Medio RPMI completo adicionado con SFB
al 10%, R PM I-10 (vase apndice al final
del cap.).
^ Etanol al 70 a 0C.
- Solucin madre de yoduro de propidio de 1
mg/ml (100 mg de Pl guardado en desecador
en 100 mi de H^O, filtrar por 0,22 |am, con
servar a 4C protegida de la luz). El yoduro
de propidio es un carcingeno potencial, y se
deben tomar precauciones en su manipuleo.
- Solucin de trabajo de yoduro de propidio:
0.5 mi de la solucin madre de yoduro de
propidio, 1000 unidades Kunitz de ARNasa
(100 U /m l concentracin final), 10 mi de
buffer muestra. Realizar la mezcla en el mo
mento de usarla,
- Tubos de centrfuga de 15 x 75 mm.
M todo
1. Centrifugar las clulas en suspensin a 400
X g, a 4C durante 10 minutos. Descartar el
sobrenadante y resuspender las clulas en
10 a 12 mi de buffer muestra, lavar dos ve
ces repitiendo el procedimiento y contar el
nmero de clulas.
A lternativam ente, las clulas podran ser
tratadas previamente con anticuerpos mono
clonales para la deteccin de un antgeno
superficial. Se aconseja utilizar como fluorocromo el FITC.
2. Ajustar la concentracin a 1-3 x 10* cl/ml
diluidas en buffer muestra dependiendo del
citmetro de flujo. Pipetear 1 mi de la sus
pensin celular en tubos de centrfuga.
3. Centrifugar las clulas a 400 x g durante 10
minutos, a 4C. D escartar el sobrenadante
con cuidado sin tocar el sedimento celular.
4. Agitar en vortex vigorosamente durante 10
segundos. Continuar la agitacin en vortex
y adicionar 1 mi de etanol al 70 fro, gota a
gota, sobre el sedimento. Tapar los tubos y
dejar las muestras fijndose en etanol, toda
la noche a 4C, para lograr una resolucin
mxima del ADN celular.
Las clulas que han sido fijadas en etanol
son estables por aos a 4C. Las muestras fi
jadas pueden ser marcadas despus de 18 a
24 h.
5. Preparar la solucin de trabajo de yoduro de
propidio.
6. Agitar la muestra en un vortex. Centrifugar 5
minutos, a alta velocidad (por ej. 2.000 x g).

747

D escartar el etanol sin tocar el sedimento.

Verificar que haya un sedimento visible. En
el caso contrario, volver a centrifugar a m a
yor velocidad hasta que sea visible.
7. Agitar en un vortex para resuspender las c
lulas en el etanol residual. Adicionar 1 mi
de solucin de yoduro de propidio en cada
tubo y agitar cuidadosamente. Incubar las
muestras a temperatura ambiente durante un
tiempo superior a 30 minutos.
Una agitacin suave puede acelerar el proce
so de marcacin y asegurar la degradacin
de la doble cadena del ARN. La ARNasa es
activa en etanol.
8. A nalizar las muestras en un citm etro de
flujo dentro de las 24 h.
En la fig. 36-7, se muestra el histograma co
rrespondiente al anlisis del ciclo celular de c
lulas mononucleares obtenidas de sangre p e ri
frica humana. Del grfico surge que la m ayo
ra de las clulas se encuentran en la fase G .
4. ESTU D IO DE LAS
C A R A C T E R STIC A S IN M U N O L G IC A S
BSICAS DE LAS CLULAS QUE
PARTICIPAN DE LA RESPUESTA
INMUNE. PRUEBAS FUNCIONALES
IN VITRO
4.1. E V A L U A C I N D E LA A C T IV A C I N
L IN E O C IT A R IA
La activacin de los linfocitos, mediada p o r
un antgeno o un estimulante policlonal, es un
proceso caracterizado por una cascada com ple
ja de eventos bioqumicos y moleculares que
com ienza con la generacin de los segundos
mensajeros y culmina con la proliferacin y el
desarrollo de funciones efectoras. Los eventos
tempranos de esta cascada incluyen la activa
cin de tirosina quinasas, la hidrlisis de fosfo
lpidos de membrana, el aumento de la activi
dad de la Protena quinasa C (PKC) e in cre
mento del Ca^+ intracitoplasmtico. Fastos s e
gundos mensajeros estimulan la transcripcin
de los genes requeridos para la proliferacin y
las funciones efectoras de las clulas.
Diversos ensayos permiten la evaluacin de
eventos tempranos de la activacin celular, ta
les como, aumento en la concentracin de Ca^+
intracelular (Kammer, 1992), activacin de la
PKC (Kraft y col., 1982; LePeuch y col,; 1983)
que ocurren en minutos o la sntesis de IL-2 y
la expresin del IL-2R producidas a las 24 h o
ras. La deteccin de lL-2, se describir en el
punto 4.4.2.1 de este captulo.

748

Metodologas
5 0 % Log

T
P o lim o rfo n u cle a re s

M o n o cito s

CO

x: c <
a)'0 3

d
o

0) T
R Vi
8 o13 ''

-L in focito s

C/3
200
400
600
800
1000
FSC-H/FSC-Height Tamao Celular

(Do
0
I:
la '

w
M

P o lim o rfo - /' n u cle a re s

M o n o c ito s
\ L in fo cito s

O ^ 0
400
600^^"5cr 1000
FSC-H/FSC-Height Tamao Celular

11 :/1/A007/FL1 -H/CD4 FITC

S>.

FI1-H/CD4 FITC

10=*

lO-*

LL

FI1-H/CD3 FITC->

FI1-H/CD3 FITC

i
F ig . 36-6. Representacin grfica de los parm etros obtenidos al analizar una suspensin celuhu- en un citm etro de flujo,
a y b . G rficos de puntos y contornos que representan el contenido de grnulos y el tam ao celular, SSC y FSC resp ecti
vam ente, de clulas provenientes de una m uestra de sangre perifrica hum ana, c y d. G rfico de puntos e histogram a co
rrespondientes a la expresin del m arcador CD 4 en las clulas provenientes de una m uestra d e sangre perifrica hum ana, e
y f. G rficos de puntos y de contornos correspondientes a la expresin de los inarcadores CD3 y C D 8 , determ inados si
m ultneam ente en las clulas provenientes de una m uestra de Sctngre perifrica hum ana. (Estos grficos fueron gentilm ente
cedidos por la bioqum ica A na E scalada y el doctor A rgim iro R. Surez.)

Metodologas para la evaluacin de las clulas inmunocompetentes

749

Contenido de ADN celular

400

600

F ig. 36-7. H istogram a correspondiente al contenido del A D N de u n a poblaci n de clulas m ononucleares humanas. (G r
fico gentilm ente cedido p or la bioqum ica A na Escalada y el doctor A rgim iro R. Surez).

4.2. E V A L U A C I N D E LA
P R O L IF E R A C I N LIN F O C IT A R IA
I N VITRO
La interaccin entre el receptor de membra
na de un linfocito y su ligando especfico de
sencadena seales de activacin intracelulares,
que en la mayora de los casos llevan a la divi
sin celular. La capacidad de los linfocitos para
responder in vitro a un estmulo es la respuesta
ms simple y conveniente de ser evaluada en
investigacin y en estudios clnicos.
La respuesta proliferativa puede incluir a las
poblaciones linfocitarias T, B o ambas. Una lis
ta parcial de los ligandos que pueden iniciar la
divisin celular de los linfocitos incluye a: los
mitgenos extrados de plantas (fitohemaglutinina, PHA; concanavalina A, Con A y el mitgeno de la fitolaca, PWM), productos bacteria
nos {Staphylococcus aureus Cowan 1), antge
nos ubicuos que activan a linfocitos de mem o
ria {Candida albicans, toxoide tetnico, etc),
linfocitos alogeneicos, citoquinas y anticuerpos
m onoclonales especficos para receptores de
superficie (CD3 o CD2). En el cuadro 36-5 se
enumeran los activadores ms comunes de los
linfocitos humanos y los rangos de dosis en
que se utilizan.
Los mitgenos PHA y Con A son capaces de
estimular a los linfocitos T maduros incluidos
los CD4 y CD8 (a/p) y tambin los CD3+(y/6).

Estas lectinas se unen a la porcin de azcares

de las glucoprotenas expresadas en la superfi
cie de las clulas T y de las clulas presentado
ras de antgeno conduciendo a la activacin p o
liclonal de los linfocitos. Los linfocitos T aisla
dos no responden al estmulo antignico o mitognico ya que necesitan la presencia de clu
las presentadoras de antgeno.
La estimulacin de las clulas mononuclea
res de sangre perifrica mediada por el PW M
es una m-'dida de la funcionalidad de los lin fo
citos T y de la sensibilidad de los linfocitos B.
Los linfocitos B puros.no responden al PW M
porque necesitan que los linfocitos T activados
secreten linfoquinas para poder diferenciarse
en clulas plasmticas.
Las enterotoxinas de los Staphylococcus son
mitgenos potentes para los linfocitos T y el
Staphylococcus aureus Cowan 1, es un estim u
lante de los linfocitos B.
El lipopolisacrido (LPS) es un mitgeno de
linfocitos B pero no posee un efecto mitognico importante sobre los linfocitos B humanos.
En un ensayo de proliferacin podra m edir
se el nmero de clulas generadas y sobrevi
vientes en el cultivo luego de un determinado
estmulo, usando un colorante vital y por o b
servacin posterior de las clulas en el m icros
copio ptico. Considerando que esta m etodo
loga es muy laboriosa, en la prctica se estim a
la proliferacin por la determinacin de la in-

Metodologas

750

Cuadro 36-5. Activadores de linfocitos humanos

Activador

Tipo celular

Blanco ele activacin

Rango de dosis

A ntgenos
T oxoide tetnico
PPD

LT
LT

TCR
TC R

I a 20 |j,g/ml
I a 10 |j,g/nil

LT
LT
LB
LT yLB

CD 2. C D 3-TC R
C D 2, C D 3-T C R
Inm unoglobulina de superficie

1a

LT
LT

TCR
TCR

1:1 a L IO E /R *
1:1 a 1:10 E/R*

LB y LT

Canales inicos

0,5 pM

LB yLT

PK C

0,5 a IO ng/m l

LT
LB

C D 3-TC R
Inm unoglobulina de superficie

D eterm inar la dosis

10 a 50 |j,g/ffll

LT y LB
LT yLB
LB

Cadenas p /y d e l 1L-2R
IL-4R
BCG R-R

1 a 100 U/ml
1 a 100 U/ml
10% concentracin final

M itgenos
PHA
C on A
Staph A C ow an I
PW M

10 |j,g/ml
l a iO

l:I 0^al : 105

dilucin final 1:100 dilucin final

CJ ulas
A logcneicas no LT
A ntologas no LT
lo n foros
lonom icina
steres de forbol
PM A
A nticuerpos
A nti-C D 3
A nti-IgM
Linfoquinas
lL -2
IL-4
B C G F (factor de creci
m iento de LB)

* N m ero de clulas c s tim u la d o ra s/n m er de c la la s re sp o n d ed o ra s.

corporacin de timidina tritiada al ADN de las

clulas cultivadas, proceso que est general
mente relacionado con cambios en el nmero
de clulas.
En este captulo se describirn microensayos
para evaluar la respuesta de clulas m ononu
cleares, inducida por estimulacin con mitge
nos de plantas, clulas alogeneicas o antgenos
ubicuos, usando la incorporacin de timidina
tritiada como una medida de la proliferacin
celular. Los mitgenos son estimulantes del ti
po policlonal y transforman a la mayora de los
linfocitos de individuos normales, independien
tem ente de una inm unizacin previa. Por el
contrario, los antgenos son estimulantes espe
cficos de linfocitos provenientes de donantes
sensibilizados y, consecuentemente, activan a
un menor nmero de linfocitos.
En las meodologas que se detallarn, se uti
lizan clulas mononucleares de sangre perifrica
humana, como fuente de clulas efectoras de la
inmunidad celular. Cuando se realizan estos en
sayos con fines experimentales, se utilizan, por

lo general, suspensiones celulares del bazo de

un animal, por ejemplo, esplenocitos murinos.
4.2.1. Proliferacin in vitro de clulas
mononucleares inducida por un mitgeno
Esta metodologa permite medir la respuesta
de las clulas mononucleares, aisladas de san
gre perifrica obtenida de diferentes donantes,
frente a distintas concentraciones del mitgeno
PHA, que estimula principalmente la prolifera
cin de linfocitos T. El protocolo puede ser
modificado para ser usado con una variedad de
estimulantes polielonales (cuadro 36-5).
M ateriales
- Suspensin de clulas mononucleares aisla^
das de sangre perifrica por un gradiente de
Ficoll-Hypaque.
- Medio de cultivo RPMI completo suplemen
tado con 5% de SFB, RPMl-5 (vase apndi
ce al final del captulo).

Metodologas para a evaluacin de las clulas inmunocompetentes

751

- Solucin madre de PHA (1 mg/ml) en RPMI5. Se guarda en alcuotas a -20'>C.

- Suero fetal bovino (SFB), inactivado a 56C,
30 minutos, previamente ensayado para des
cartar la presencia de LPS contaminante que
podra inducir una estimulacin basal.
- M icroplacas de cultivo de 96 orificios con
fondo en U.
- Metil timidina tritiada ([^H] TdR, ImCi/ml,
6,7 Ci/mmol; Du Pont NEN, # NET-027).
- Papel de fibra de vidrio.
- Cosechador de clulas.
~ Contador de centelleo lquido del tipo |3.

gre entera se correlaciona con una mejor repre

sentacin de las condiciones in vivo, ya que no
se m odifica la distribucin de los elem entos
humorales y celulares.
El procedim iento es igual al descrito an te
riormente, excepto que la m uestra se prepara
diluyendo la sangre heparinizada 1:5 en medio
de cultivo (RPMI 1640), sin agregarle suero
exgeno. Se siembran 100 xl de dicha suspen
sin celular en cada pocilio de una placa de 96.

N OTA: todos los reactivos y materiales que

estn en contacto con las clulas debern estar
en condiciones de esterilidad y el operador de
ber seguir los procedimientos empleados para
el cultivo de clulas.

La reaccin de cultivo mixto linfocitario es

una medida de la capacidad de los linfocitos T
de un individuo de reconocer diferencias en
antgenos alogeneicos, principalmente de clase
11, expresados en los linfocitos B y en los m o
nocitos de otro individuo. En esta reaccin se
evala la proliferacin de los linfocitos en re s
puesta a la estim ulacin de clulas m ononu
cleares alogeneicas tratadas con mitomicina C
o irradiadas, para evitar la proliferacin de e s
tas ltimas.
A pesar de que esta reaccin ha sido a m e
nudo utilizada en la evaluacin de la inm uni
dad celular, l;i utilidad ms im portante es en
los estudios de compatibilidad de donantes p a
ra trasplantes, particularmente en los de m du
la sea.

Mtodo
1. Contar las clulas mononucleares de sangre
perifrica y ajustar la concentracin de la
suspensin celular a 1 x 10* clulas/ml en
RPML5.
2. Sembrar 1 x 10' clulas (100 }il de la sus
pensin celular previamente homogeneizada) en cada uno de los pocilios de la placa
de 96 orificios. Para cada condicin experi
mental realizar cuadruplicados.
3. Diluir la solucin madre de PHA en concen
traciones de 2, 5, 10 y 20 |ag/ml. Las dilu
ciones se hacen con RPM L5 y se agregan
100 1J,1 de cada una por pocilio, obtenindo
se concentraciones finales de PHA en los
cultivos de 1, 2,5, 5 y 10 |ag/ml respectiva
mente. Realizar controles de proliferacin
basal, cultivando el mismo niimero de clu
las respondedoras en presencia de RPMI-5.
4. Incubar a 37"C, en una estufa de cultivo ga
seada con atmsfera de 5% de CO^, durante
48 o 72 h.
5. En las ltim as 4 a 24 h agregar 1 |0,Ci de
[3H]-TdR en cada orificio. Luego de ia in
cubacin, cosechar las clulas y posterior
mente proceder a la medicin de la radiacti
vidad incorporada, siguiendo las metodolo
gas detalladas en el apndice.
En una serie de experiencias es importante
respetar el tiempo del pulso de [^H]-TdR pa
ra obtener resultados comparables.
Existen diversas ventajas en el uso de sangre
entera en ensayos de proliferacin respecto del
uso de clulas aisladas. Una de las ms impor
tantes es que se requiere un mnimo volumen
de sangre (0,1 mi); esto puede ser crtico en
personas muy enfermas, en nios o cuando se
realiza un estudio longitudinal. El uso de san

4.2.2. Reaccin de cultivo mixto linfocitario

unidireccional

M ateriales
- Medio de cultivo RPMI completo suplemen
tado con SFB al 5%, RPMI-5. Vase apndi
ce al final del captulo.
- Suspensin de clulas respondedoras (clu
las mononucleares de sangre perifrica).
- Suspensin de clulas estimuladoras aloge
neicas (clulas mononucleares de sangre p e
rifrica).
- Suspensin de clulas estimuladoras antolo
gas (clulas mononucleares de sangre perif
rica).
~ Solucin de M itom icina C, 0.5 mg/ml en
RPMI-5. Esta solucin debe mantenerse p ro
tegida de la luz. Alternativamente, las clu
las pueden ser irradiadas con una dosis de
2000-3000 rads de radiacin y.
- M icroplacas de cultivo de 96 orificios con
fondo en U.
- Metil timidina tritiada ([^H] TdR, Im Ci/ml,
6.7 Ci/mmol; Du Pont NEN, # NET-027).
- Papel de fibra de vidrio.
- Cosechador de clulas.
- Contador de centelleo lquido del tipo p.
N O TA : todos los reactivos y materiales que
estn en contacto con las clulas debern estar

752

Metodologas

en condiciones de esterilidad y el operador de

ber seguir los procedimientos empleados para
el cultivo de clulas.
Mtodo
1. Contar las clulas mononucleares y ajustar
en una concentracin de 1 x 10'> clulas/ml
en RPMI-5.
2. Con el propsito de inhibir la proliferacin
celular, tratar a las clulas mononucleares
e stim u lad o ras, a lo g e n e ic a s y au t lo g a s
(control), con mitoinocina C o con irradia
cin.
Tratamiento con mitomocina C: a la sus
pensin de clulas a tratar, se le agrega mitomicina C en una concentracin final de 25
|ig/ml y se incuba 30 minutos en estufa de
^ cultivo a 37C, 5% de CO^ en la oscuridad.
Luego, se lavan las clulas tratadas 3 veces
con R PM I-10 para remover los restos de la
droga, centrifugando a 400 x g, durante
5-10 minutos, preferentemente en centrfuga
refrigerada. Entre cada lavado, las clulas se
incuban 5 minutos a 37C.
Irradiacin: 2000-3000 rads (el tiempo
de exposicin a la radiacin depender del
equipo utilizado como fuente de radiacin).
Es importante, determinar la viabilidad ce
lular posteriorm ente a estos tratam ientos,
ya que las clulas deben perm anecer via
bles.
3. Dispensar 100 |0,1 de clulas respondedoras
por orificio (1 x 10^ clulas/pocilio). Reali
zar cuadruplicados para cada condicin ex
perimental.
4. A gregar 100 jal de clulas estim uladoras
alogeneicas o 100 |i.l de clulas autlogas
previamente tratadas (1 x 10'* clulas/poci
lio), en los pocilios correspondientes que
contienen las clulas respondedoras. El con
trol de proliferacin basal se realiza agre
gando 100 il de RPMI-5 a las clulas res
pondedoras. Adems, se debe controlar que
las clulas hayan recibido una irradiacin
adecuada y no proliferen. Para ello, sembrar
100 |u,l de estas clulas en presencia de 100
[il de RPMI-5.
5. Incubar a 37C, 5 a 7 das en estufa de culti
vo gaseada con 5% de CO^.
6. En las ltimas 4 a 24 h agregar 1 aCi de
I^H j-TdR en cada orificio. Luego de la incu
bacin, cosechar las clulas y posteriormen
te proceder a !a medicin de la radiactividad
incorporada, siguiendo las metodologas de
talladas en el apndice.
En una serie de experiencias es im portante
respetar el tiempo del. pulso de pHJ-TdR para
obtener resultados comparables.

4.2.3. Proliferacin de linfocitos inducida

por estimulacin antignica
Este protocolo se desarroll para m edir la
proliferacin de los linfocitos T en respuesta a
un antgeno especfico. En este, caso, se utiliza
el toxoide tetnico porque es un antgeno para
el cual la mayora de la poblacin est sensibi
lizada y evala la respuesta inmune de memo
ria. Esta tcnica sirve de modelo pudiendo ser
modificada para analizar la respuesta prolifera
tiva de linfocitos T frente a otras protenas o
polisacridos antignieos.
Materiales
- Clulas m ononucleares aisladas de sangre
del paciente. Alternativamente, podra utili
zarse una suspensin de linfocitos T purifi
cados adicionados con clulas autlogas pre
sentadoras de antgeno (monocitos-macrfa
gos).
Solucin de toxoide tetnico, 1 mg/ml.
Los m ateriales necesarios son los mismos
que se mencionaron para la proliferacin por
mitgenos o en el Cultivo mixto linfocitario.
NOTA: todos los reactivos y materiales que
estn en contacto con las clulas debern estar
en condiciones de esterilidad y el operador de
ber seguir los procedimientos empleados para
el cultivo de clulas.
Mtodo
1. Ajustar la concentracin de las clulas res
pondedoras (clulas mononucleares o linfo
citos T purificados) a 1 x 10 clulas/ml en
RPMI-5. En el caso de trabajar con linfoci
tos T purificados, tratar a las clulas presen
tadoras de antgeno con m itom icina C o
irradiacin y llevar a una concentracin a 2
X 105 clulas/ml.
2. Colocar 150 al de la suspensin de clulas
mononucleares en cada pocilio. Si se utili
zan linfocitos T puros, sem brar 100 jal de
estas clulas y 50 xl de la suspensin de c
lulas presentadoras en cada pocilio.
3. Siguiendo el protocolo de la reaccin, colo
car 50 jo.1 de cada dilucin de la solucin de
toxoide tetnico en cada orificio y por cua
druplicado. Las concentraciones finales del
toxoide tetnico sern de O, 1, 5, 10 y 20
ug/ml, entonces se debern dispensar 50 jiJ
de RPMI-5 y 50 jal de cada una de las con
centraciones del toxoide tetnico, 4, 20, 40
y 80 jig/ml respectivamente.
4. Incubar entre 5 a 8 das en estufa de cultivo
gaseada con 5% de CO, a 37C, Para cada

Metodologas para la evaluacin de las clulas inmunocompetentes

753

C on canavalina A (^g /m l)
F ig . 3 6 -8 . R e s p u e s ta lin f o p ro life r a tiv a d e c lu la s m o n o n u c le a re s h u m a n a s en r e s p u e s ta a d iv e rs a s c o n c e n tr a c io n e s de
c o n c a n a v a lin a A.

antgeno se debe establecer el tiempo (das)

en donde el pico proliferativo sea mayor.
5. En las ltim as 4 a 24 h agregar ] |j,Ci de
[^HJ-TdR en cada orificio. Luego de la incu
bacin, cosechar las clulas y posteriormen
te proceder a la medicin de la radiactividad
incorporada, siguiendo las metodologas de
talladas en el apndice.
En una serie de experiencias es importante
respetar el tiempo del pulso de pH]-TdR pa
ra obtener resultados comparables.
4.2.4. Expresin e interpretacin
de los resultados
Existen diversos criterios sobre la mejor m a
nera de expresar los datos de un ensayo de pro
liferacin. Cuando se utiliza la incorporacin
de [^HJ-TdR como medida de la proliferacin,
la forma ms comn es calcular el promedio de
las cuentas por minuto (cpm) para cada condi
cin experimental, por ejemplo, cpm promedio
de los cultivos estimulados menos cpm prom e
dio de los cultivos control, sin tratar. Otra m a
nera frecuentemente utilizada es calcular el n
dice de estimulacin como el cociente entre las
cpm de las clulas estimuladas y las cpm de las
clulas control, no estim uladas. Este ltim o
mtodo tiene un ineoveniente, las clulas no
estimuladas pueden variar considerablemente
las cpm incorporadas (proliferacin basal) y
afectar al ndice de estimulacin. Calcular las
cpm promedio y el desvo estndar para cada
condicin experim ental o para el control. El
desvo estndar de las rplicas debe ser menor
al 15%.

En este tipo de ensayos es indisp en sab le

comparar la respuesta de los linfocitos d e los
pacientes con la de donantes normales.
in la figura 36-8 se grafica la respuesta proliferativa de clulas mononucleares de sangre
perifrica humana, estimuladas in vitro con dis
tintas concentraciones de Con A. Esta curva
dosis-respuesta es un ejemplo tpico de u n a es
timulacin mitognica.
A manera de ejemplo, en el cuadro 36-6 se
muestran los resultados correspondientes a un
cultivo mixto linfocitario realizado para elegir
al donante para un trasplante de mdula sea.
4.3. E V A L U A C I N D E LA
FUNCIONALIDAD CELULAR POR
MEDIO D E REAC C l O M S D E
CITOXICIDAD M l D \D i POR CLULAS
4.3.1. Ensayos para evaluar la funcin
citotxica mediada por linfocitos T
La eitotoxicidad o lisis mediada por linfocitos T requiere de la interaccin del R eceptor T
con pptidos antignicos unidos a m olculas
del Complejo M ayor de H istocom patibilidad
(CMH) presentes en las clulas blanco. E sta in
teraccin desencadena la lisis celular a travs
de la liberacin de grnulos que contienen en
zimas proteolticas. Este mecanismo efector es
de fundamental importancia en la respuesta in
mune dirigida hacia tumores, trasplantes y vi
rus. La mayora de las clulas efectoras citotxicas son linfocitos T CD8+ especficos que re
conocen a los antgenos presentados en el con
texto de las molculas del CMH de clase L Sin

754

Metodologas

Cuadro 36-6. Cultivo mixto linfocitario

Estimuladoras"

Respondedoras

P a c ie n te

P aciente

M adre

Padre

Hei'mano 1

H erm ano 2

D onante no
relacicMado

303 + 104

27890 + 3345

35674 3267

2 1 4 5 6 + 2343:

319 1 6 2

37658 2343

40111 3 1 2 0

13375+1999

125672015

33432 3789

26574 + 2378

10301 + 6 9 2

41500 3954

M a d re

1 2 3 4 5 1 047

22285

P a d re

169 8 9 2 0 0 5

2 5 6 7 5 1078

H e rm a n o 1

28887 3 2 7 8

2 0 5 4 6 1879

26998 2367

24908 >1768

39003 4 0 0 9

H e rm a n o 2

423+105

2 0 7 8 6 + 1 457

34789 3699

42549 3987

,2 8 9 7 8

53406 + 5123

27567 3109

37568 3654

52309 4 9 9 7

42346 + 3560

44376 2 6 5 4

302 1 4 4

D o n a n te rio r e la c io n a d o

678 + 309

3 0 3 + 156

Las c lu la s m ononucleares; estim u la d o ra s sep a rad a s p o r F ico ll-H y p a q u e fu e ro n iirad ad as.

E t pac ien te y el h erm a n o 2 son m u tu a m e n te jio re s p o n d e d o re s ,.n o e stim u la d o re s, in d ican d o q u e e x iste c o m p a tib ilid a d a nivel de an tg en o s
del H L A . E stos datos unidos con los dalos d e la tip ific ac i n sero l g ic a, in d icarn q u e el herm a n o 2 es un exc elen te d o n an te para el p ac ien te,
m ien tras q u e el h erm a n o I no lo es. C ad a uno d e los in d iv id u o s n o re sp o n d i a las clulas estim u la d o ra s antologas.

embargo, se demostr que existen, en menor

proporcin, poblaciones de linfocitos T CD4+
citotxicos, que efectan el reconocimiento an
tignico a travs de las molculas del CMH de
clase II.
El primer paso de una determinacin de citotoxicidad comprende la generacin de los lin
focitos T citotxicos especficos. Estos pueden
encontrarse pre-estim ulados en el husped o
debern ser sensibilizados in vivo o in vitro.
En sangre perifrica los linfocitos T citotxi
cos no pueden ser detectados sin una sensibihzacin previa, a menos que el individuo se en
cuentre en el perodo de actividad de una infec
cin viral. Cuando se quiere medir la reactivi
dad de los linfocitos T citotxicos generalmen
te es necesario estimular a las clulas efectoras
in vitro pre-incubando clulas mononucleares
en presencia de antgenos especficos. Para ello
se co-cultivan las clulas m ononucleares de
sangre perifrica, durante 5 a 7 das, con ant
genos solubles o con clulas que expresan los
antgenos de inters, previam ente irradiadas.
Los linfocitos T citotxicos especficos genera
dos se cosechan al final de los cultivos.
La tcnica ms frecuentemente empleada pa
ra determinar citotoxicidad utiliza la liberacin
de '''C r por la clula blanco. Las clulas efectoras son puestas en contacto con las clulas
blanco marcadas radiactivamente con ^Cr, du
rante un perodo de incubacin de 4h. La ra
diactividad liberada es directamente proporcio
nal a la lisis celular.
Si bien la liberacin de ^'Cr es un procedi
miento ampliamente utilizado para detectar ci
totoxicidad, en los ltimos aos se han desarro
llado mtodos colorimtricos (vase apndice
al final del captulo), fluorimtricos y ms re

cientemente por quimioluminiscencia, tendien

tes a reem plazar el material radiactivo y au
mentar la sensibilidad.
M ateriales
- Clulas efectoras: generalmente se utilizan
clulas mononucleares obtenidas por centri
fugacin de sangre perifrica a travs de un
gradiente de Ficoll-Hypaque o clulas de un
homogenato de bazo con fines experimenta
les. Las clulas mononucleares pueden estar
previamente activadas para ejercer citotoxi
cidad, es decir linfocitos T citotxicos pre
formados con una cierta especificidad (anti
viral, alogeneica, etc). Alternativamente, las
clulas mononucleares que se utilizarn co
mo efectoras citotxicas, pueden ser genera
das in vitro.
Generacin de linfocitos T
citotxicos in vitro
1. Mezclar 1 x 10 clulas blanco, estimulado
ras, tratadas con mitomicina C o irradiadas,
con 1 X 10 clulas respondedoras en un
frasco de cultivo T75 con un volumen de 20
mi de RPMLIO.
La relacin ptima de clulas respondedo
ras/clulas estimuladoras (R/E) utilizada pa
ra la generacin de clulas efectoras citot
xicas puede variar en cada caso. Es aconse
jable preestablecerla probando con distintas
proporciones entre 10:1 hasta 1:1 de R/E.
2. Incubar las clulas a 37C durante 6 das, en
una estufa gaseada con 5% de CO^ para ge
nerar los linfocitos T citotxicos especficos.
3. Lavar las clulas con RPMl-lO.

Metodologas para la evaluacin de las clulas inmunocompetentes

755

4. Determinar la viabilidad celular y resuspen

derlas en la concentracin reciuerida. Esta
suspensin se utiliza como fuente de clulas
efectoras citotxicas.
~ C lulas blanco: la eleccin de las mismas
depender de la funcin efectora a medir y
de su disponibilidad. En la eleccin de una
clula blanco, se deben tener en cuenta las
siguientes caractersticas, la capacidad para
ser lisadas por las clulas efectoras, la capa
cidad para procesar antgeno in vitro, la m a
yor facilidad para incorporar y retener la
marca y la expresin de antgenos del CMH
de clase I y II.
a. clulas blanco para lirifocitos T citotxicos con reactividad antiviral: podran
utilizarse fibroblastos, la lnea celular BLCL, que son linfocitos B humanos in
m ortalizados por el virus Epstein-B arr
(EBV), linfocitos activados por m itge
nos o m acrfagos alveolares. En todos
los casos las clulas debern provenir de
donantes autlogos. Las clulas blanco
se pueden infectar con el virus, transfectar con un gen viral especfico o sensibi
lizar con un pptido inm unodom inante
viral.
b. clulas blanco alogeneicas: son de utili
dad para definir la especificidad en ant
genos de HLA en una respuesta de linfo
citos T citotxicos (medicin de los nive
les de aloreactividad despus de una sen
sibilizacin contra antgenos del CMH en
un trasplante de rganos). Como clulas
blanco pueden usarse blastos (clulas m o
nonucleares estim uladas por un m itge
no, PHA). A lternativam ente, se pueden
inmortalizar linfocitos B de un paciente o
donante, tratando a las clulas m ononu
cleares de sangre perifrica con ciclosporina y un cultivo de EBV.

Mtodo

- M icroplacas de cultivo de 96 pocilios con

fondo en U.
~ M edio RPMI com pleto suplem entdo con
5% y 10% de SFB , R P M l-5 y R PM I-IO
(vase apndice al final del captulo).
- Solucin salina tam ponada adicionada con
5% de SFB (SST-5) (vase apndice al final
del captulo).
- ImCi/ml de Na 2'^'CrO^ (Amersham, NEN).
- Cosechador de sobrenadantes semi-automtico (optativo).
- Contador para radiacin p o y.

1. Lavar las clulas efectoras y ajustar la d en

sidad celular segn la concentracin final
que se agregar en las placas. Para una rela
cin de clulas efectoras a clulas blanco de
50:1, se necesitarn 125.000 clulas efectoras por cada 2.500 clulas blanco. Conside
rando un volumen final de reaccin de 100
|i.l por pocilio, se preparar una suspensin
de clulas efectoras de 2.5 x lO^ml. G ene
ralm ente en un ensayo de eitotoxicidad se
establecen varias relaciones de clulas efec
toras a clulas blanco, entre 50:1 y 1:1, para
determinar cul es la ms conveniente.
2. Sem brar en una placa de 96 pocilios con
fondo en U, 50 pl de las diferentes co n
centraciones de clulas efectoras y luego 50
pl de la suspensin de clulas blanco en ca
da uno de los pocilios. Los controles de li

NOTA: todos los reactivos y materiales que

estn en contacto con las clulas debern estar
en condiciones de esterilidad y el operador de
ber seguir los procedimientos empleados para
el cultivo de clulas.

a. Marcacin de las clulas blanco

1. Las clulas blanco debern encontrarse en
fase log de crecimiento, debido a que las c
lulas en proliferacin activa toman m ejor el
crom ato y co n sig u ien tem en te se m arcan
mejor.
2. Centrifugar la suspensin celular a 400 x g,
10 minutos de forma de obtener 1-2 x 10'
clulas blanco en el sedimento. Descartar el
sobrenadante y elim inar cualquier exceso
del mismo drenando sobre una toallita de
papel.
3. Resuspender en 0,25 ml de cromato de so
dio marcado. Incubar las clulas durante 45
minutos (no ms de 60 minutos, para evitar
la liberacin espontnea de marca) a 37C
con agitacin suave (4-6 rpm) y protegidas
con una pantalla de plomo. En el caso de te
ner fragilidad celular adicionar SFB en una
concentracin final entre 10-20%.
4. Lavar 3 veces las clulas con SST-5 calen
tado a 37C.
5. Resuspender las clulas marcadas radioacti
vamente en medio RPMI-5 en una concentra
cin adecuada para llevar a cabo el ensayo.
Por ejemplo, si se usan 2.500 clulas blanco
en un volumen de 50 |i,l, ajustar las clulas
en 50.000/ml, Mantener la suspensin en la
estufa para evitar la lisis espontnea. Si la
preparacin de la reaccin llevara ms de 1
h, efectuar un lavado previo de las clulas
marcadas antes de su uso y ajustar la concen
tracin nuevamente. Determinar la incorpo
racin de 5>Cr, contando una alcuota de la
suspensin celular en un contador [3 o y.
b. M edicin de la actividad citotxica.
Ensayo de liberacin de 'Cr

756

Metodologas

beracin espontnea de la marca se efectua

rn colocando 50 |J,1 de las clulas blanco y
50 |ji de medio, por pocilio. Efectuar cada
determ inacin por triplicado. E stab lecer
controles de liberacin mxima de radioac
tivo sembrando 50 |il de las clulas blanco y
50 p,I de HCl IN o de una solucin de Tri
tn X-100 al 5%.
3. Centrifugar las placas a 500 x g por 1 minu
to e incubarlas a 37C durante 4 h en estufa
gaseada con un 5% de CO^. (En algunas
ocasiones el perodo de incubacin puede
extenderse hasta 24 h aunque el mecanismo
efector es, en la mayora de los casos, ms
eficiente durante las primeras 2-4 h.)
4. Agregar 10'' iil de RPMI-5 fro en cada uno
de los pocilios. Centrifugar nuevamente las
placas a 500 x g durante 5 minutos a 4C.
Recoger 100 0,1 del sobrenadante, con mu
cho cuidado, de manera de evitar resuspen
der el sedimento. Colocar los sobrenadantes
en viales apropiados para poder ser ledos
en un contador y o [3, en este ltimo caso de
ber agregarse lquido de centelleo (vase
apndice al final del captulo).
5. Calcular el porcentaje de lisis especfica de
acuerdo a la siguiente frmula:
lisis es-

e x p e rim e n ta le s - c p m e s p o n t n e a s)

100
p e c fic a

(cpm m x im a s - c p m e s p o n t n e a s)

Nota: la lisis espontnea no deber superar.

el 20% de la liberacin mxima.
En algunas ocasiones es conveniente expre
sar los resultados como unidades lticas (UL),
correspondientes a un determinado porcentaje
de lisis, frecuentemente se utiliza el 30% o el
50%. Para ello se grafica el porcentaje de lisis
en funcin de la relacin de clulas efectoras a
clulas blanco, e interpolando en la curva por
el 50% de lisis se lee la relacin correspondien
te de clulas efectoras a blanco y se establecen
las unidades lticas en forma arbitraria, calcu
lando 100/clulas efectoras interpoladas. Como
se muestra en el grfico 36-9, para la poblacin
B las UL50 son 4 (100/25).
4.3.2 P ru eb as para determinar citotoxicidad
de clulas natural killer (NK)
Las clulas NK forman parte de la inmuni
dad natural y median reacciones de citotoxici
dad sin requerir de una .sensibilizacin previa,
ni poseen especificidad antignica ni restric
cin por molculas del CMH, los cuales son
prerrequisitos de los linfocitos T citotxicos.
La actividad NK en los seres humanos se mide,
generalmente, en ensayos de liberacin de -'Cr
de 4 h utilizando como clulas blanco a las c
lulas tumorales K562 humanas.
Cuando se quiere evaluar la actividad NK en
sistemas murinos, generalmente se utiliza una

F ig . 3 6 -9 . G r fic o c o rre s p o n d ie n te a la c u rv a d e c ito to x ic id a d e s p e c fic a d e d o s p o b la c io n e s c e lu la re s (A ) y (B ) e n f u n

c i n d e la re la c i n d e c lu la s e fe c to ra s a c lu la s b la n c o . E n el m is m o se m u e s tra la d e te rm in a c i n d e las U L 5 0 p a ra c ad a
u n a d e la s p o b la c io n e s.

Metodologas para la evaluacin de las clulas Inmunocompetentes

suspensin celular de bazo. Como clulas blan
co suelen emplearse las clulas de la lnea Yac1, que provienen de un linfoma murino induci
do por el virus Moloney (ATCC).
M ateriales
~ Clulas efectoras: clulas mononucleares de
sangre perifrica humana separadas en gra
dientes de Ficoll-Hypaque, preferentemente
frescas. Para evaluar la actividad de NK, es
conveniente usar las clulas el mismo da de
la obtencin. Las clulas mononucleares se
pueden guardar en medio completo con SFB
(5-10%), por un perodo de tiempo no mayor
de 18 h a 4C para evitar prdidas de la acti
vidad citotxica de las clulas NK:
- Clulas blanco: obtenidas de una lnea esta
blecida a partir de clulas de un paciente con
una eritroleucemia crnica en crisis blstica
(K562), Esta lnea celular es deficiente en la
expresin de antgenos del CMH de clase I y
clase U.
N OTA: todos los reactivos y materiales que
estn en contacto con las clulas debern estar
en condiciones de esterilidad y el operador de
ber seguir los procedimientos empleados pai'a
el cultivo de clulas.
Mtodo
La marcacin de las clulas blanco con ^'Cr,
se realiza como se describe para las clulas
blanco de hnfocitos T citotxicos (vase tem
1-5 de marcacin de clulas blanco del punto
4.3.1). El ensayo de liberacin de -''C r de 4 h,
es sim ilar al detallado anteriormente, para la
evaluacin de linfocitos T citotxicos.

757

4.3.3. Reaccin de citotoxicidad celular

dependiente de anticuerpo (CCDA)
La citotoxicidad celular dependiente de anti
cuerpo (CCDA) es un mecanismo inmunolgi
co efector citotxico que es dependiente de la
interaccin cooperativa de elementos efectores
humorales y celulares. Depende de la presencia
de clulas efectoras que tienen receptores, ge
neralmente para Fcy, y de anticuerpos capaces
de unirse especficamente a los epitopes antig
nicos expresados en la superficie de una clula
blanco. La interaccin entre las clulas efectoras y las clulas reconocidas por los anticuer
pos resulta en citolisis (vase fig. 36-10). Este
ensayo evala la capacidad de las clulas efec
toras inmunocompetentes o la actividad de un
anticuerpo especfico para mediar CCDA.
Este tipo de reaccin es mediada principal
m ente por clulas NK que expresan receptor
para Fe. Otras clulas como los monocitos, gra
nulocitos y cierta .subpoblacin de linfocitos T,
son tambin efectoras en las reacciones de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo.
Clnicamente, el ensayo de CCDA es til en
la evaluacin funcional de clulas efectoras in
munocom petentes, por ejemplo, en pacientes
con cncer en tratamiento inmunolgico.
O tra aplicacin im portante de la C CD A es
en la evaluacin de anticuerpos contra aloantgenos, clulas tumorales o virus. La CCD A se
utiliza para estudiar ios sueros de los pacientes
que recibirn un trasplante o que cursan un re
chazo de injerto y en individuos que cursan una
infeccin viral.
A continuacin se describe un mtodo para
m edir actividad efectora de CCDA en clulas
mononucleares de sangre perifrica empleando
clulas blanco marcadas con -''Cr.

R g . 3 6 -1 0 . E s q u e m a del m e c a n ism o d e la r e a c c i n d e C C D A m e d ia d a p o r c lu la s e fe c to ra s c ito t x ic a s N K y a n tic u e r

p o s e s p e c fic o s p a ra d e te rm in a n te s a n tig n ic o s p r e s e n te s s o b re la s c lu la s b lan c o .

758

Metodologas

Si bien la liberacin de 'Cr es un procedi

miento ampliamente utilizado para detectar ci
totoxicidad, en los ltimos aos se han desarro
llado mtodos colorimtricos (vase apndice
al final del captulo), fluorimtricos y ms re
cientemente por quimioluminiscencia, tendien
tes a reem plazar el m aterial radiactivo y au
mentar la sensibilidad.

3. A una de las alcuotas de clulas blanco

agregarle la dilucin del antisuero de cone
jo, calentado a 56C durante 1 h. Agregar
200 |i.Ci de Na^'^'CrO^ a cada una de las al
cuotas. Incubar a 37C durante 30 minutos.
4, Lavar las clulas tres veces y resuspender
en una concentracin de I X 10- cl/ml en
medio de cultivo RPMLIO.

Materiales

b. Medicin de la actividad de CCDA.

Ensayo de liberacin de Cr

- Medio de cultivo RPMI suplementado con

SFB al 10%, RPMLIO con HEPES 25mM.
- Clulas efectoras, mononucleares de sangre
perifrica suspendidas en RPMI-10. Podran
utilizarse tambin otros tipos de clulas, sus
pensin de ndulos linfticos o de clulas de
bazo.
- Clulas blanco marcadas con ^'Cr, recubier
tas o no con anticuerpo.
Las clulas blanco utilizadas en este tipo de
ensayos de CCD A deberan ten er las s i
guientes caractersticas: facilidad para ser
cultivadas, alta actividad especfica y bajos
niveles de liberacin espontnea de la marca
incorporada. Entre las clulas ms com n
mente usadas en los ensayos de CCDA, se
encuentran las clulas Chang, Raj (clulas
de linfoma de Burkitt) y P815 (clulas de un
mastocitoma murino).
- Tritn X-100 al 5% v/v.
- Placas de 96 orificios con fondo en U .
- Tubos de centrfuga de 15 mi.
- Antisuero de conejo especfico contra las c
lulas blanco. La fuente de anticuerpos es un
factor para ser considerado, los anticuerpos
de conejo tienen buena actividad en los ensa
yos de CCDA.
- Im C i/m l de N a/>CrO , (250-500 m C i/m g,
Amersham).
~ Cosechador de sobrenadantes semi-automtico (optativo).
- Contador para radiacin p o y.
NOTA: todos los reactivos y materiales que
estn en contacto con las clulas debern estar
en condiciones de esterilidad y el operador de
ber seguir los procedimientos empleados para
el cultivo de clulas.
Mtodo

1. Preparar una suspensin de 1 x 10 cl/ml

efectoras mononucleares. Hacer diluciones
seriadas (1:2, 1:4 y 1:8) a partir de la sus
pensin original.
2. Sembrar por sextuplicado, 100 |il de cada
una de las diferentes concentraciones de c
lulas efectoras.
3. P ara cada d ilucin de clulas efectoras,
agregar 100 |al de clulas blanco no recu
biertas con el anticuerpo, en tres de los po
cilios y colocar 100 |j,l de las clulas blanco
recubiertas con el anticuerpo, en los tres po
cilios restantes.
4. Realizar controles de mxima liberacin de
la marca, agregando a 100 )il de las clulas
blanco tratadas con el anticuerpo, 100 jil de
Tritn X-100 al 5%. Repetir el mismo pro
cedimiento con las clulas blanco no trata
das con el anticuerpo.
5. Realizar controles de liberacin espontnea
de la marca, agregando a 100 pl de las clu
las blanco tratadas con el anticuerpo, 100 pl
de R PM LIO . R epetir el m ism o p ro ce d i
miento con las clulas blanco no tratadas
con el anticuerpo.
6. Cubrir las placas y centrifugar a 55 x g du
rante 2 minutos a temperatura ainbiente. In
cubar entre 4 h a 18 h en una estufa de culti
vo en atmsfera de 5% de COj.
7. Centrifugar las microplacas a 550 x g a tem
peratura ambiente durante 5 minutos y cose
char los sobrenadantes en viales, uthzando
una pipeta multicanal o un cosechador semiautomtico.
8. Determinar la radiactividad de los sobrena
dantes usando un contador de radiacin y o
p. Calcular el% de lisis segn la siguiente
frmula:
[cp m e x p e rim e n ta le s - c p m e s p o n t n e a s]

a.
blanco

Sensibilizacin y marcacin de las clulas

% lisis

= ------------------------------------------------------------- ^ X 100
[cp m m x im a s - c p m e s p o n t n e a s]

1. Se utilizan entre 1-5 x 10 clulas por mar cpm experimentales: cpm del sobrenadante de
cacin,
las clulas efectoras y las clulas blanco,
2. Lavar las clulas tres veces con RPMLIO. cpm mximas: cpm del sobrenadante de las c
Antes del ltimo lavado separar las clulas lulas blanco m s Tritn.
en dos alcuotas iguales. Centrifugar a 550 x , cpm espontneas: cpm del sobrenadante de las
g, 10 minutos y descartar el sobrenadante.
clulas blanco ms medio de cultivo.

Metodologas para la evaluacin de las clulas inmunocompetentes

El porcentaje de Jisis especfica debe calcu
larse para las clulas blanco recubiertas y para
lelamente para las clulas no recubiertas por
anticuerpos. El porcentaje de CCDA se calcula
restando al porcentaje de lisis especfica de las
clulas recubiertas con anticuerpos, el porcen
taje de lisis encontrado para las clulas blanco
sin recubrir.
4.4. ESTUDIO D E LA FUNCIONALIDAD
DE LOS LINFOCITOS B Y T A TRAVS
DE LA PRODUCCIN DE SUSTANCIAS
BIOACTIVAS SECRETADAS POR ELLOS
4.4.1. Funcionalidad de linfocitos B
Una de las maneras de determinar la funcio
nalidad de los linfocitos B es a travs de la me
dicin de inmunoglobulinas secretadas en "res
puesta a un antgeno determinado. Si bien stas
metodologas son muy sencillas el resultado re
fleja una serie de mecanismos celulares com
plejos que involucran no slo a los linfocitos B
sino tambin su interrelacin con varios tipos
celulares como las clulas accesorias y los lin
focitos T colaboradores.
La sntesis de anticuerpos puede ser medida
como la sumatoria de las inmunoglobulinas se
cretadas en respuesta a un antgeno y por lo
tanto, en este caso se mide la cantidad de inm u
noglobulinas que se acumulan en un sobrena
dante de cultivo de linfocitos o en el suero de
un individuo inmunizado. Alternativamente, si
se analiza la clula que est secretando el anti
cuerpo, adems de los anticuerpos producidos
se determina el nmero de linfocitos B en una
poblacin que secreta la inmunoglobulina con
una determinada especir^idad y de un isotipo
particular. Para el primer objetivo, las metodo
logas ms empleadas son el enzimoinmunoensayo (ELISA) y el radioinm unoensayo (RIA)
que fueron detallados en los captulos 38 y 39.
Por otra parte, la identificacin de los linfocitos
B estimulados in vitro especficamente u obte
nidos a partir de animales inmunizados con un
antgeno determinado puede llevarse a cabo a
travs de la tcnica clsica e form acin de
placas de hemlisis o por medio del ELISPOT.
Estas tcnicas son tiles para determinar la ci
ntica de produccin de inm unoglobulinas,
particularmente en aquellas situaciones asocia
das con un cambio rpido del nmero de clu
las secretoras de los anticuerpos.
4.4.1.1. Medida de la sntesis
de inmunoglobulinas polielonales
por medio de la tcnica de formacin
de placas de hemlisis
La tcnica de formacin de placas de hem o

759

lisis se fundamenta en la lisis de los eritrocitos

al ser reconocidos por los anticuerpos especfi
cos, secretados por las clulas presentes en la
placa, en presencia de complemento. El antge
no puede ser una protena del eritrocito o una
molcula covalentemente unida a la superficie
del glbulo rojo que sirve de indicador de la
reaccin. Los anticuerpos son sintetizados por
las clulas secretoras de inmunoglobulinas que
se estn evaluando, las cuales son mezcladas
con la suspensin de eritrocitos en un medio
semi-slido que las inmoviliza logrando favo
recer el contacto entre los anticuerpos y los an
tg en o s presentes en los glbulos ro jo s. El
complejo inmune especfico al unir el com ple
mento agregado, inducir la hsis de los eritro
citos que se manifestar como placas de hem
lisis (rea de lisis que bordea a las clulas se
cretoras de anticuerpos). Cada placa de hem li
sis formada corresponder a una clula secreto
ra de anticuerpos. Esta tcnica es sumamente
sensible y puede ser realizada en forma directa,
indirecta o reversa de acuerdo al objetivo de la
medicin.
Tcnica de formacin de placas de hemlisis
directa (fig. 36-1 la): Esta tcnica es til para
detectar IgM especfica, las dems inm unoglo
bulinas fijadoras de complemento no pueden
ser determinadas debido a las condiciones en
las que se lleva a cabo el ensayo. Las clulas
secretan IgM especfica que migra por difusin
en el medio semi-slido y al reconocer al ant
geno especfico en la superficie del eritrocito,
se une a l. Este puede ser un antgeno eritrocitario o una protena covalentemente u n id a al
glbulo rojo, como fue indicado en el captulo
35 para la hemaglutinacin pasiva. Los com
plejos inmunes formados en la superficie de los
eritrocitos fijan complemento, el cual produce
la hsis de aquellos eritrocitos circundantes a los
linfocitos B, originando las placas de lisis.
Tcnica de formacin de placas de hemlisis
indirecta (fig. 36-1 Ib): Las clulas secretoras
sintetizan inmunoglobulinas especficas que al
difundir se unen a su antgeno presente sobre el
eritrocito. Como para la fijacin de co m p le
mento se requieren dos molculas de IgG cer
canas y en esta situacin difcilmente se logra,
para poder detectar las IgG se agrega un anti
cuerpo anti-IgG m onoespecfico y lu e g o el
complemento. La hemlisis de los eritrocitos
indicar la liberacin de IgG y de IgM p o r par
te de los diferentes linfocitos B.
Asimismo esta metodologa resulta de utili
dad para poder detectar linfocitos B secretores
de inmunoglobulinas con especificidad para un
determinado antgeno, no fijadoras de com ple
mento.
Tcnica de formacin de placas de hemlisis
reversa (fig. 36-1 le): Esta variante metodol-

760

Metodologas

*"%

C om plem ento

. .

\
H E M O LIS IS

IgM especfica

F ig . 3 6 - l l a . E s q u e m a d e l fu n d a m e n to d e la t c n ic a d e fo rm a c i n d e p la c a s d e h e m o lisis d ire c ta .

gica es utilizada para detectar la produccin de

inmunoglobulinas totales y no anticuerpos es
pecficos, como ocurre en las tcnicas explica
das precedentemente. En este caso los eritroci
tos pueden ser sensibilizados con Protena A,
que tiene la propiedad de fijar la regin Fe de
las inmunoglobulinas, o con anticuerpos antiinmunoglobulinas. Aunque la mejor sensibili
zacin de los glbulos rojos se logra tratando
en un primer paso a los eritrocitos con Protena
A y luego con IgG con actividad anti inmunoglobulina de la especie que se quiere determi
nar. Las anticuerpos liberados por los linfocitos
B se unen a los glbulos rojos sensibilizados y

los complejos as formados unen complemento

y ocasionan la lisis de los eritrocitos.
A continuacin se detalla la tcnica de fo r
macin de placas de hemlisis directa.
Materiales
~ Placas de Petri de 10 cm de dimetro descar
tables.
- Agar purificado (agar noble) o agarosa.
Solucin salina fosfatada de Dulbecco (va
se el apndice al final del captulo).
- Solucin de Gey (vase el apndice al final
del captulo).

anti-lgG

H EM O LISIS

IgG especfica
C om plem ento

F ig . 3 6 - l l b . E squem a del fundam ento de la tcnica de form acin de placas de hem lisis indirecta.

Metodologas para la evaluacin de las clulas inmunocompetentes

anti-Ig

761

C om plem ento

H E M O LIS IS

Inm unoglobulinas

F ig . 3 6 - l l c . E s q u e m a d e l fu n d a m e n to d e la t c n ic a d e fo rm a c i n d e p la c a s d e h e m o lisis rev e rsa .

- Eritrocitos de carnero (sensibilizados con an

tgenos especficos o sin sensibilizar) al 20%
en solucin de Gey.
- Clulas mononucleares, esplenocitos o linfo
citos purificados.
Suero de cobayo, fresco o liofilizado. Es
conveniente adsorberlo con 1 mi de sed i
mento de eritrocitos de carnero durante 20
minutos en bario de hielo, para eliminar anti
cuerpos contaminantes.
- Tubos de plstico de 15 y 50 mi.
-- Tubos de ensayo.
NOTA: todos los reactivos y materiales que
estn en contacto con las clulas debern estar
en condiciones de esterilidad y el operador de
ber seguir los procedimientos empleados para
el cultivo de clulas.
Mtodo
1. Verter sobre la placa de Petri 5 mi de una
solucin de agar o agarosa estril, al 1,2%
en solucin salina fosfatada de D ulbecco,
fundida y enfriada a 50C. A gitar suave
mente en forma rotativa, sobre una superfi
cie nivelada y dejar sohdificar. (Estas placas
as preparadas pueden guardarse a 4C, du
rante varios das).
2. Preparar con anterioridad, agar o agarosa al
0,6% en solucin de Gey. Repartir en al
cuotas de 2 mi en tubos de ensayo y esterili
zar en autoclave. Fundir en bao de agua
hirviente 1 tubo por cada placa y mantener a
40-42C (agar) o a 46-48>C (agarosa). R eti
rar y aadir 0,1 mi de la suspensin de eri
trocitos e inmediatamente 0,1 mi de la dilu
cin (2 X 10 clulas/m l) de las clulas a
analizar. Agitar y verter rpidamente en la

placa de Petri que ya tiene la capa inferior.

Homogeneizar por rotacin y dejar solidifi
car.
3. Incubar a 37C durante 90-120 m inutos y
agregar, uniformemente sobre toda la super
ficie, 1 mi de complemento de cobayo dilui
do 1:10 en solucin de Gey. Incubar durante
60 minutos.
4. C ontar las placas de hem olisis form adas,
con lupa estereoscpica o microscopio y re
ferirlas al nmero de clulas sembradas. (Si
las placas no pueden ser ledas de inmediato
fijar los eritrocitos con una solucin de glu
taraldehdo al 0,25%.)
Las clulas que sintetizan anticuerpos del
isotipo IgG frecuentem ente no dan placas de
hemlisis. Ello es debido a que el nimero de
molculas elaboradas no es suficiente para sen
sibilizar adecuadamente a los eritrocitos, cosa
c]ue s ocurre con la IgM, como consecuencia
de su estructura m olecular. Para determ inar
otras inmunoglobulinas, excepto la IgM, se de
sarroll el mtodo indirecto de formacin de
placas de hemhsis. Esta tcnica, se realiza de
manera similar al ensayo directo, con la varian
te de que antes de aadir los glbulos rojos al
agar o a la agarosa fundida, se agrega una dilu
cin del suero anti-gammaglobulina monoespecfico. Este ensayo mide las clulas formadoras
de placa totales (CFPtotales): las clulas for
madoras de placas para la inmunoglobulina en
estudio (CFPespecficas) y las directas (Ig M,
CFPdirectas). Simultneamente debe realizarse
un ensayo directo para determinar las C FPdi
rectas. La diferencia entre ambos valores deter
mina el nmero de CFPespecficas del ensayo.
CFPespecficas = CFPtotales - CFPdirectas

762

Metodologas

4.4.I.2. Medida de la sntesis

de inmunoglobulinas por medio de la tcnica
de plaqueo inm unoenzim tico o E L IS P O T
La tcnica del plaqueo inmunoenzimtico o
ELISPOT, utilizada para la deteccin de las c
lulas productoras de anticuerpos de una deter
minada especificidad, es un ensayo desarrolla
do en los aos 80 que ofrece una alternativa
ms sencilla y verstil a la deteccin de linfoci
tos B secretores de anticuerpos, por medio de
la formacin de placas de hemlisis. A su vez
permite el anlisis de poblaciones celulares que
sintetizan anticuerpos dirigidos hacia dos ant
genos diferentes. Asim ism o, resulta de gran
utilidad para la determinacin de clulas secre
toras de anticuerpos en tejidos como el intesti
nal o el pulmonar en donde el aislamiento de
linfocitos es de gran dificultad.
El ELISPOT se lleva a cabo en tres pasos, la
sensibilizacin de la fase slida (generalmente
nitrocelulosa o placas de poliestireno) con el
antgeno, la incubacin de las placas con las
clulas secretoras de anticuerpo y la deteccin
del complejo antgeno-anticuerpo formado en
la zona de secrecin de anticuerpos, por medio
de una tcnica inmunoenzimtica (fig. 36-12).
Materiales
Solucin de antgeno en SST.
- Clulas secretoras de anticuerpos presentes
en la capa de clulas mononucleares aisladas
de sangre perifrica o en esplenocitos.
- Anti-gammaglobulina de la especie en estu
dio conjugada con peroxidasa (0,5 - 5 fig/ml
en SST/Tween).
- SST adicionada con 5% de SFB (SST-5) o
BSA al 1% en SST.
- M edio IMDM adicionado con 5% de SFB
(IMDM -5) o RPM I-10. (Vase apndice al
final del captulo.)
- SST adicionada con 0,005% de Tween 20
(SST/Tween).
^ Sustrato para la enzima utilizada preparado
en una solucin de agarosa. Disolver 50 mg
de 1,4-p-fenilendiamina (PPD, Sigma) en 2
mi de metanol. Momentos antes de ser utili
zado agregar 50 il de H,02 al 30% y 100 mi
de agarosa al 1% en SST calentada a 46C.
Este sustrato produce manchas de color ma
rrn.
Placas de poliestireno de 96 pocilios (alter
nativamente se pueden utilizar placas de 6, 24,
48 o 96 pocilios y Placas de Petri).
NOTA: todos los reactivos y materiales que
estn en contacto con las clulas debern estar
en condiciones de esterilidad y el operador de
ber seguir los procedimientos empleados para
el cultivo de clulas.

Mtodo
1. Sensibilizar las placas de poliestireno con
una dilucin del antgeno en SST. (La dilu
cin ptima del antgeno deber ser deter
m inada de antemano utilizando diferentes
concentraciones de antgeno y esplenocitos
sensibiUzados. Generalmente se utiliza una
concentracin antignica entre 10 y 200
|i,g/ml.) Incubar 18 h a 4C o 2 h a 37C. Las
placas se pueden guardar a 4C por varias
semanas.
2. Descartar el sobrenadante. Lavar tres veces
con SST y drenar el exceso de lquido sobre
una toallita de papel. Bloquear la placa con
SST-5 incubando 30 minutos a 37C.
3. Descartar el sobrenadante drenando la placa
sobre una toallita de papel y agregar 200 )J,1/
pocilio de las diferentes concentraciones de
la suspensin celular en IMDM-5 (entre 10'*
y lO' clulas/ml). Incubar durante 3, 4 o 18
h a 37C en estufa gaseada con 5% de CO^.
4. Recuperar las clulas para posteriores ensa
yos o descartarlas y lavar las placas con
SST/Tween.
5. Adicionar 100 |il del anticuerpo conjugado.
Incubar 2 h a temperatura ambiente o 18 h a
4C (en cmara hmeda).
6. Lavar las placas tres veces con SST/Tween
y el ltimo lavado con SST.
7. Descartar el sobrenadante y drenar cuidado
samente cualquier exceso de solucin de la
vado.
8. Agregar 50 (xl de la solucin de sustrato por
pocilio. Mantener las placas en una superfi
cie horizontal nivelada y controlar el desa
rrollo de las manchas de color que aparece
rn dentro de los 5 a 10 minutos,
9. Las clulas productoras de anticuerpos se
identifican por la aparicin de m anchas de
color marrn. Contar las manchas formadas
en un microscopio con un aumento de 10 o
30X.
La inm unizacin parenteral con antgenos
proteicos induce por lo general, entre 50 y 500
manchas/ lO* clulas totales despus del 6 da
de la primera inoculacin del antgeno. Cada
m ancha representa una nica clula secretora
de anticuerpo,
4.4.2. Funcionalidad de linfocitos T.
Deteccin de la produccin de citoquinas
por E L IS A o por ensayos biolgicos
La identificacin de las citoquinas y de los
productos solubles de la activacin inmune, es
una de las maneras de evaluar la frmeipnalidad
de las clulas inmunocompetentes. Estos m ar
cadores presentes en el suero reflejan la activi

Metodologas para la evaluacin de las clulas Inmunocompetentes

dad de todas las clulas inmunes del cuerpo. Es
por este motivo que la medicin de estas sus
tancias provee informacin acerca del estado
inmune de un individuo.
El factor inhibitorio de la migracin de los
m onocitos-fagocitos (MIE) es producido por
linfocitos T activados y fue una de las primeras
citoquinas identificadas in vitro por su capaci
dad de inhibir la movilidad de los macrfagos.
Si bien esta metodologa ha sido muy utilizada
anteriormente, la identificacin bioqumica y el
significado biolgico del MIE no han sido an
aclarados, y en la actualidad ha sido reem pla
zada por ensayos para la deteccin de linfoqui
nas, tales como IL-2 o interfern y.
Entre los productos de activacin que actual
mente se pueden determinar mencionaremos: P
2-microglobulina, receptor soluble de IL-2 (an
tgeno Tac), molculas solubles de CD4 y CD8
as como anticuerpos. Estas protenas son los
productos finales de una serie de procesos celu
lares y, por lo tanto, los niveles incrementados
en el suero indican un aumento en su produc
cin y la activacin de estos sistemas celulares.
Diversos marcadores estn elevados en cier
tas enfermedades, infecciones por microbios,
rechazo de injertos, desrdenes autoinmunes o
en enfermedades malignas de clulas linfoides
y su determinacin es una medida de la activi
dad de la enfermedad pero no es un marcador
especfico de diagnstico.
Las metodologas que pueden ser utilizadas
para la medicin de las citoquinas, principales
mediadores celulares involucrados en la re s
puesta inmune, incluyen el enzimoinmunoensayo (ELISA), el ELISPOT y bioensayos. El enzimoinmunoensayo tiene miltiples ventajas, alto
grado de especificidad, fcil ejecucin y no re
quiere del cultivo de tejidos o de radiactividad.
Dentro de las desventajas del mtodo se desta
can, la menor sensibilidad en comparacin con
los ensayos biolgicos y el hecho de que se
pueden detectar protenas con reactividad in
munolgica pero que no tengan actividad bio
lgica. Por el contrario los bioensayos se ca
racterizan por ser ms sensibles que el ELISA y
por detectar protenas biolgicamente activas.
El principal problema en este tipo de ensayos
es que se puede valorar la actividad de ms de
una citoquina. Cuando dos o ms citoquinas es
tn presentes pueden producir interacciones sinrgicas o antagnicas que llevan a posibles re
sultados falsos. Este inconveniente puede ser
subsanado empleando anticuerpos monoclona
les especficos para neutralizar la actividad de
las citoquinas contam inantes. C onsiderando
que los bioensayos detectan las citoquinas fun
cionalm ente m ientras que los enzim oinm unoensayos en form a estructural, en la actuali
dad se aconseja el uso de ambos tipos de m eto

763

dologas para la deteccin de una determinada

citoquina.
A continuacin se describirn metodologas
para la determinacin de IL-2 e interfern.
4.4.2.I. Medicin de IL-2
El mtodo tradicional para la deteccin de
IL-2 en muestras de suero o de sobrenadantes
de cultivo de linfocitos humanos, es un bioensayo que utihza las clulas CTLL-2. Esta lnea
celular murina derivada de clulas de bazo esti
muladas por clulas alogeneicas se propaga in
vitro dependiendo de la IL-2 (Gillis & Smith,
1977). Este ensayo consiste bsicamente en de
terminar la proliferacin in vitro de las clulas
CTLL-2 en presencia de las muestras a exam i
nar o de diferentes concentraciones de IL-2 hu
m ana usada como estndar. Posteriormente, se
calculan las unidades de interleuquina corres
pondientes a la muestra por comparacin con
los estndares. Este mtodo es laborioso y est
sujeto a los posibles efectos de otros inmunomoduladores presentes en la muestra (por ej.,
otras citoquinas, prostaglandinas E, etc).
Deteccin de IL-2 usando
las clulas CTLL-2
La metodologa utilizada en este caso se ba
sa en las tcnicas de proliferacin descritas an
teriormente.
NOTA; todos los reactivos y materiales que
estn en contacto con las clulas debern estar
en condiciones de esterilidad y el operador de
ber seguir los procedimientos empleados para
el cultivo de clulas.
M todo
1. Colocar 100 |J.I de cada dilucin de IL-2 (es
tndares) o de las muestras, por cuadrupli
cado, en una placa de cultivo de 96 orificios
de fondo en U. Incluir un control negativo
con RPM I-10.
En el caso de las muestras provenientes de
los sobrenadantes de cultivo, realizar dilu
ciones desde 1:1, 1:2 y 1:4 hasta que dism i
nuya la mxima actividad proliferativa. Si
se utilizan sueros humanos, stos deben ser
diluidos ya que los sueros normales contie
nen inhibidores que pueden afectar a este ti
po de ensayo.
2. U tilizar las clulas CTLL-2 despus de 2
das del ltimo agregado de medio de culti
vo. Lavar 3 veces las clulas con SST. Cen
trifugarlas 10 minutos a 335 x g a 4C y resuspender el sedimento en 1 ml de SST lle
vando luego a 50 ml de SST; repetir este
procedimiento 3 veces.

764

Metodologas

C lulas secretoras
y no secretoras
de Ac especfico

Placas se nsibilizadas
con Ag especfico

A
Anti-Ig conjugada
con peroxidasa

Incubacin

Lavado

Sustrato especfico

F ig . 3 6 -1 2 . E s q u e m a d e lo s p a s o s d e la t c n ic a d e ELSPO T.

3. Contar las clulas y ajustar la concentracin

a 5 X 10*cl/ml en R PM I-10 completo.
4. Sembrar 100 il de las clulas en cada poci
lio de la microplaca. Incubar las placas du
rante 28 h a 37C en estufa de cultivo gasea
da con 5% de CO^.
5. En las ltimas 8 h, agregar 1 (iCi de [^H]TdR en cada orificio. Luego de la incuba
cin, cosechar las clulas y posteriormente,
proceder a la medicin de la radiactividad
incorporada, siguiendo las metodologas de
talladas en el apndice.
6. Para el clculo de la concentracin de la
lL-2 presente en las muestras se pueden rea
lizar diferentes procesamientos de los datos.
En los diferentes tipos de grficos se corre
laciona la sntesis del ADN con la concen
tracin de los estndares.

Determinacin de IL-2 por E L ISA

La determ inacin especfica de citoquinas
por ELISA, en este caso de la IL-2, se funda
menta en un ensayo de doble anticuerpo, tipo
sandwich. Es un enzimoinmunoensayo en fase
slida donde se utiliza un anticuerpo monoclo
nal especfico and IL-2 para capturar esta inter
leuquina presente en la muestra o en el estn
dar. Despus de lavar el material no unido, se
agrega un anticuerpo policlonal que se une a la
IL-2 capturada. Luego de los lavados, se agre
ga un anticuerpo, conjugado a una enzima, con
especificidad para reconocer al segundo anti
cuerpo. En el caso de la deteccin de IL-2 en
muestras de origen humano, los niveles encon
trados son muy bajos. Por este motvo, es con
veniente desarrollar metodologas para aumen

Metodologas para la evaluacin de las clulas inmunocompetentes

tar considerablemente la sensibilidad de la de
terminacin, por ejemplo, utilizai' el sistema de
biotina-estreptoavidina.

765

plifica la seal de deteccin. La cuantificacin

se realiza por medicin espectrofotomtrica de
la conversin del sustrato en un producto cromognico.

4A.2.2. M edicin de Interfern y

La produccin in vitro de IFN y por clulas
mononucleares de sangre perifrica en respues
ta a una estimulacin por antgenos o mitge
nos, es un mtodo muy efectivo para evaluar la
funcionalidad de los linfocitos T. Un defecto
en la sntesis in vitro del interfern o de otras
citoquinas est asociado con diversas enferme
dades del sistema inmune, autoinmunidad, in
munodeficiencias, malignidades linfoides e in
fecciones con ciertos virus.
Los linfocitos T son las clulas responsables
de la sntesis del interfern y (IFN y) en res
puesta a estmulos especficos, como los ant
genos, o inespecficos, como los m itgenos,
anticuerpos anti-linfocitos o IL-2. A pesar que
los interferones a, |3 y y poseen todos la capaci
dad de inhibir la replicacin viral, son antigni
camente diferentes. Debido a esta caractersti
ca, se pueden utilizar anticuerpos para la iden
tificacin de estas protenas por inhibicin de
la actividad antiviral o por ensayos inmunol
gicos como el ELISA o el RIA. Los interferones
se pueden medir en el suero de pacientes infec
tados con el virus de la inmunodeficiencia ad
quirida o con desrdenes autoinmunes.
Los ensayos biolgicos para evaluar la pro
duccin de los interferones miden el grado con
que stos inhiben el crecimiento viral: inhibi
cin de la produccin del virus, inhibicin del
efecto citoptico inducido por el virus, inhibi
cin de la formacin de placas virales, inhibi
cin de la formacin de antgenos virales o in
hibicin de la produccin de cidos nucleicos
virales. Bsicam ente estos ensayos requieren
de la incubacin de las clulas con el interfe
rn, remocin del interfern, infeccin de las
clulas con el virus y medicin de la reduccin
del crecimiento viral dentro de las clulas in
fectadas, m ediada por el IFN (Hooks & Detrick, 1992).
Los inmunoensayos tienen la ventaja de ser
especficos, realizarse ms rpidamente y son
de utilidad para el monitoreo simultneo de nu
merosas muestras. De todas maneras no pueden
reem plazar com pletam ente a los bioensayos
que detectan molculas biolgicamente activas.
El enzimoinmunoensayo especfico, para la
cuantificacin de IFN y es similar al descrito
para la IL-2. El IFN es capturado del fluido
biolgico por un anticuerpo monoclonal espe
cfico pegado a una fase slida y luego es de
tectado usando un suero policlonal anti-IFN y.
El agregado de un anticuerpo policlonal antiinmunoglobulina conjugado a una enzima, am

5. PRUEBAS FU N C IO N A LES PARA

EVALUAR LA INM UNIDAD MEDIADA
POR CLULAS IN VIVO
La hipersensibilidad retardada (HR) es una
respuesta inmune mediada por clulas, que se
manifiesta como una reaccin inflamatoria, en
la cual el ltimo efector es el macrfago. Este
tipo de inmunidad mediada por clulas, princi
palmente por linfocitos T y macrfagos, es par
te de los mecanismos de defensa contra bacte
rias intracitoplasmticas que no pueden ser eli
minadas por los macrfagos no activados. Para
poder eliminarlas se necesita aumentar la fun
cin microbicida de los macrfagos y esto se
logra por las citoquinas producidas por los lin
focitos T activados.
Las protenas antignicas o haptenos qumi
cam ente reactivos, pueden d esen cad en ar el
mismo tipo de reaccin de hipersensibilidad re
tardada que los microbios, pudiendo causar in
juria tisular. En este caso, cuando el antgeno
no es un patgeno, la reaccin de hipersensibi
lidad retardada producir injuria sin causar una
funcin protectora.
S .L P R U E B A S C U T N E A S D E
H IP E R SE N SIB IL ID A D R ETA R D A D A
A pesar de que se han desarrollado num ero
sos ensayos in vitro para medir la actividad de
los linfocitos T, stos no evalan n ecesaria
mente las mismas clulas que median hipersen
sibilidad retardada ni consideran las influencias
de los eventos regulatorios ciue influencian la
funcin in vivo de los linfocitos T. Por lo tanto,
las respuestas cutneas de hipersensibilidad re
tardada representan una importante fuente de
informacin relacionada con la actividad de los
linfocitos T in vivo. En la clnica, las pruebas
cutneas son de valor en la evaluacin total de
la inmunocompetencia.
Estas reacciones se dividen en dos fases, la
de sensibilizacin con un antgeno especfico y
la del desafo de la respuesta de hipersensibili
dad retardada, que se desarrolla generalmente
entre 6 a 14 das despus de la sensibilizacin.
Esta prueba se realiza fcilmente en seres hu
manos y cobayos, mientras que en ratones es
ms difcil de inducir este tipo de respuesta. La
reaccin de hipersensibilidad retardada ocurre
en el sitio de inoculacin del antgeno que ge
neralmente es la piel, de all que a este tipo de
ensayo se lo conoce como prueba de hipersen-

766

Metodologas

sibilidad retardada cutnea (HRC). Histolgi

camente se caracteriza por una induracin pro
ducida por clulas mononucleares y un nmero
limitado de polimorfonucleares.
La inyeccin intradrm ica de un antgeno
puede inducir una o ms de los tres tipos de
reacciones cutneas en humanos, que se descri
ben a continuacin.
a) una roncha y reaccin eruptiva con un pi
co de aparicin entre 15-20 minutos despus
de la inyeccin del antgeno, relacionado con
la presencia en la piel de IgE especfica para
ese antgeno. Esta reaccin se conoce como
alergia.
b) una reaccin vascular local llam ada de
Arthus con un pico entre 12-24 horas y es el re
sultado de la interaccin del antgeno y del an
ticuerpo fijador de complemento en el sitio de
la inyeccin.
c) una reaccin de hipersensibihdad retarda
da, dependiente de hnfocitos T y macrfagos,
caracterizada por eritema e induracin en el si
tio de la inyeccin, con un pico de intensidad
entre las 24 y 48 h.
Ciertos antgenos son llamados ubicuos ya
que la mayora de los individuos estn sensibi
lizados con ellos. Entre los ms comnmente
utilizados en las pruebas cutneas, mencionare
mos: Candida albicans, Trichophyton, protena
purificada derivada de tuberculina (PPD), to
xoide tetnico, Coccidioidin. Cuando se utili
zan en una prueba cutnea, uno o ms de estos
antgenos comunes, la reaccin de hipersensi
bilidad se debe a un fenmeno de memoria in
munolgica. Si una persona no responde a nin
gn antgeno comn intradrm ico dando una
reaccin de hipersensibilidad retardada, mani
fiesta un estado de anergia.
La hipersensibilidad por contacto es otra ma
nifestacin de hipersensibilidad retardada cut
nea y se puede evocar por una exposicin epi
drmica prolongada a un antgeno, que podra
ser una macromolcula exgena o un hapteno
conjugado a protenas de la piel (por ejemplo:
Dinitro cloro benceno). La sensibilizacin por
co n tacto y p o sterio r d esafo con el m ism o
neoantgeno permite evaluar la respuesta inmu
ne primaria y de memoria.
Respuestas drmicas positivas generalmente
se correlacionan con los resultados de pruebas
in vitro incluyendo respuestas proliferativas de
linfocitos y medicin de la produccin de citoquinas.
Las pruebas de hipersensibilidad retardada
cutnea son tiles en la evaluacin de pacientes
con sndromes de inm unodeficiencias prim a
rias o adquiridas. Este tipo de pruebas han sido
usadas para evaluar los resultados de inmunoterapias en enfermedades malignas, para moni-

torear el curso de ciertas enfermedades o en el

diagnstico de enfermedades infecciosas.
Rutinariamente existen dos mtodos disponi
bles como pruebas de hipersensibilidad retarda
da cutnea. El mtodo clsico se relaciona con
la inyeccin intradrmica de un antgeno (reac
cin tpica de tuberculina) y la sensibilizacin
por contacto, que se diferencian entre s por la
manera en que se origina la respuesta. En la
sensibilidad por contacto, las etapas de sensibi
lizacin y del desafo involucran aplicaciones
de un hapteno qumicamente reactivo que m o
difica molculas autlogas en la piel resultando
en un reclutamiento y activacin de los linfoci
tos T especficos en el sitio involucrado.
5.1.1. Prueba cutnea de hipersensibilidad
retardada para un nico antgeno (Prueba
de tuberculina)
Materiales
- Aguja de tamao 27-6 (hipodrmica).
- Jeringa de tuberculina.
- Protena purificada derivada de tuberculina
(PPD), 0,1 mi (5 U de tuberculina) o de otro
antgeno microbiano que se quiera estudiar.
Mtodo
1. Inyectar intradrmicamente en el antebrazo
una aguja biselada (27-6) unida a una jerin
ga de tuberculina que contenga 0,1 mi de
PPD. Usar la punta de la aguja para elevar
la piel y manternerla plana mientras la aguja
va entrando. Evitar una inyeccin subcut
nea.
2. Sim ultneam ente a la aplicacin de la in
yeccin, se desarrollar una ampolla de 6 a
10 mm.
3. Luego de 24 o 48 h, u opcionalmente 72 h,
medir el dimetro mayor de la induracin y
el eritema.
Los grados de la reaccin se establecen de la
siguiente forma:

O BSER VAC I N

G RAD O D E
P O SITIVID AD

E r ite m a > d e 10 m m e in d u ra c i n d e ] -5 m m
In d u ra c i n > 10 m m
In d u ra c i n 11 -2 0 m m
In d u ra c i n > 2 0 m m

++
++++

L a p re se n c ia d e slo un erite m a n o indica re acc i n po.siliva.

El mismo procedim iento se realiza con un

mayor nmero de antgenos (6 por lo menos)
para determinar posibles defectos en la inmuni
dad celular.

Metodologas para la evaluacin de las clulas inmunocompetentes

5.1.2. Prueba cutnea mltiple
de hipersensibilidad retardada
Los ensayos de hipersensibilidad retardada
cutnea que utilizan un panel de antgenos co
munes se realizan cuando se quiere evaluar a
pacientes en quienes se sospechan defectos en
la inmunidad, por ejemplo: en individuos con
infecciones severas y recurrentes o infecciones
con microorganismos no comunes y en pacien
tes que padecen enfermedades malignas como
parmetro de valor pronstico.
El test mltiple es una tcnica estandarizada
en la que se usa un aplicador plstico con pin
zas que liberan simaltneamente 7 antgenos y
un control, cuando se presiona sobre la piel.
Esta prueba denom inada m ultitest evala la
reactividad frente a los siguientes antgenos:
Candida albicans, Trichophyton rnentagrophytes, Proteus mirabilis, Tuberculina Vieja (mez
cla de protenas, polisacridos, lpidos y cidos
nucleicos, parcial o totalm ente desnaturaliza
dos provenientes de un cultivo de Mycobacterium tuberculosis envejecido), Estreptococus
del grupo C, Toxoide diftrico, Toxoide tetni
co y glicerina como control.
Este tipo de ensayo fue estandarizado para
realizarse en la piel del antebrazo en adultos o
en la espalda para nios.

acetona en concentraciones de 2.000 y 50

fXg/0,1 ml para las dosis sensibilizante y con
trol, respectivam ente. E stas soluciones se
guardan en botellas oscuras y se deben usar
dentro de las dos primeras semanas.
M todo
1. Luego de limpiar la piel con acetona, aplicar
0,1 ml de cada dosis en sitios separados en
la parte superior del brazo, utilizando un
anillo de 2 cm de dimetro. Dejar evaporar
con ayuda de un secador de cabello. C ubrir
los sitios con vendas y dejar por 24 h.
2. Transcurrida una semana, observar la p re
sencia de un eritema en el sitio de la reac
cin. Un resultado positivo indica el desa
rrollo de una reaccin de hipersensibilidad
retardada.
3. De no observarse un eritema aplicar la dosis
de desafo antignico o desencadenarite. En
el da 14 posterior a la aplicacin de la dosis
inicial aplicar 50 jig/ml de la solucin de
DNCB y leer la reaccin a las 24 y 48 h.
Los grados de la reaccin se establecen de la
siguiente forma:
O B SE R V A C I N

5.1.3. Prueba de hipersensibilidad

por contacto
La hipersensibilidad por contacto es un ensa
yo in vivo que evala la inmunidad m ediada
por clulas. En esta prueba, se exponen las c
lulas de la epidermis a un hapteno exgeno y se
desencadena una reaccin de hipersensibilidad
retardada que puede ser medida y cuantificada.
Las clulas de Langerhans que son las clulas
presentadoras del antgeno inician la sensibili
zacin presentndole el hapteno a los linfocitos
T CD4, los cuales secretan linfoquinas y reclu
tan otras clulas en el sitio de la reaccin.
5.I.3.I. Prueba del Dinitro Cloro
Benceno (DNCB)
El D NC B es uno de Jos agentes qum icos
utilizados en las reacciones de hipersensibili
dad por contacto, es altamente sensibilizante y
puede causar reacciones necrticas severas. Es
por este motivo que se lo utiliza en pacientes
donde se sospecha anergia, y slo cuando las
pruebas cutneas con los antgenos com unes
dieron negativas.
Materiales
~ DNCB (agente sensib ilizan te) diluido en

767

E r ite m a y /o in d u ra e i n e n un re a m e n o r
a la m ita d del sitio d e p ru e b a
M a y o r in d u ra c i n
V e s ic u la c i n
U lc e ra c i n

G RAD O D E
P O SIT IV ID A D

+
++
J-++
++++

En el caso supuesto de encontrarse en la p ri

mera etapa de la reaccin, slo un eritema en el
sitio sensibilizante, la reaccin es de g rado
mientras que un eritema en ambos sitios,
control y sensibilizante, es grado +-1-+-1-.
5.I.3.2. Reacciones de dermatitis
por contacto
Los mdicos alergistas y dermatlogos em
plean comnmente la Prueba del parche para
detectar reacciones de hipersensibilidad retar
dada causadas por sustancias que se piensa que
son las responsables de las reacciones de der
matitis por contacto.
Mtodo
1. Aplicar el alergeno en la piel, en una con
centracin no irritante y cubrir el rea con
un apsito.
2. Pasadas las 48 h, quitar el apsito y obser
var .la presencia de reaccin inflamatoria en
el sitio de aplicacin del antgeno.

768

Metodologas

5.1.4. Interpretacin de las pruebas

de hipersensibilidad retardada cutnea

3. Calcular nmero de clulas de la siguiente

manera:

La estandarizacin de los antgenos que se

utilizan en los reactivos comerciales disponi
bles, para pruebas de hipersensibilidad retarda
da cutnea, es insuficiente o no existe y, entoQces, la comparacin entre estudios es difi
cultosa.
Los materiales utilizados se preparan por di
lucin a partir del m aterial stock com ercial.
Con el propsito de realizar una buena inter
pretacin de los resultados, las diluciones de
cada nuevo lote deberan ser probadas por su
reactividad y potencia en voluntarios normales.
Es im portante establecer la concentracin
adecuada de antgeno a ser utilizada en estos
ensayos. Cuando se utilizan concentraciones
demasiado altas de la sustancia a probar, pue
den ocurrir reacciones falsas positivas. Las
reacciones falsas negativas pueden deberse a
concentraciones demasiado bajas.
Las diluciones de los antgenos se deben pre
parar en el momento ya que podran perder ac
tividad por adsorcin de protenas a la superfi
cie del frasco de vidrio o por aceleracin de la
descomposicin de las protenas en las solucio
nes diluidas.
En los individuos que estn muy sensibiliza
dos pueden ocurrir reacciones locales severas.
En ciertas personas las pruebas de hipersensibi
lidad retardada cutnea pueden causar necrosis
drmica y el tratamiento indicado en estos ca
sos sera dar corticoides orales o parenterales
segn la severidad del caso.
Los recin nacidos menores de 6 semanas de
vida, rara vez dan respuestas de hipersensibili
dad retardada, y luego la respuesta depende de
la exposicin antignica. P or ejem plo, una
reaccin de hipersensibilidad retardada cutnea
positiva para los toxoides diftrico y tetnico,
generalmente se desarrolla dentro del primer
mes posterior a la prim era inm unizacin con
esos antgenos.

N m e ro p ro m e d io

C lu la s to ta le s

d e c lu la s

e n los c u a tro c u a d ra n te

APENDICE
1.
Determinacin del nmero
y de la viabilidad celular
1. Hacer una dilucin adecuada de las clulas
en SST (depender de la densidad original
de cada tipo celular).
2. Colocar una gota de la suspensin celular en
una cmara de Neubauer y contar el nmero
de clulas por observacin en un microsco
pio ptico. Contar cada uno de los cuatro
cuadrantes de la cmara, sumarlos y sacar el
nmero promedio de clulas.

0,1 m ra^ (v o l. d e
c a d a c u a d ra n te )

N m e ro to ta l d e
c lu la s p o r m i
(cl/cm ^)

[N m e ro p ro m e d io
d e c lu la s]
=

X d ilu c i n X

10^

0,1 m m '

4. Para ajustar una suspensin celular a una

densidad determinada, aplicar la siguiente
ecuacin;
Vi

Ci = Vf

Cf

Vf
Vi = -

Cf

Ci
2. Determinacin de la viabilidad celular
por el mtodo de exclusin del azul tripn
Para determinar el nmero de clulas viables
presentes en una suspensin se utiliza la tcni
ca de exclusin de un colorante. Este mtodo
se fundamenta en la capacidad de excluir cier
tos colorantes como el azul tripn, la eosina o
el propidio, por parte de las clulas vivas que
poseen m em branas celulares intactas. Por el
contrario, las clulas muertas son penetradas
por el colorante y se tien. Para ello, se mezcla
una suspensin celular con el colorante y luego
se examina en el microscopio para determinar
si las clulas tomaron o excluyeron al coloran
te. En el caso de usar azul tripn, una clula
viable tendr el citoplasma refringente mientras
que una clula no viable tendr el citoplasma
azul.
1. Resuspender el sedimento celular en SST o
medio completo sin SFB.
Las protenas del suero se colorean con azul
tripn y pueden causar resultados errneos
2. Mezclar una parte de la solucin de azul tri
pn al 0,4% con una parte de la suspensin
celular. Incubar la m ezcla alrededor de 3
minutos a temperatura ambiente.
Las clulas se deben contar dentro de los 3 a
5 minutos de realizada la mezcla con el azul
tripn, ya que perodos ms largos de incu
bacin podran conducir a la muerte celular
y reducir el nmero de clulas viables,
3. Cargar una gota de la mezcla de las clulas
y del colorante en una cmara de Neubauer
y colocarla en un microscopio.

Metodologas para la evaluacin de las clulas inmunocompetentes

4. Contar separadamente las clulas no colo
readas (viables) y las coloreadas (no via
bles). Para obtener el nmero total de clulas
viables por mi, multiplicar por 2 el nmero
total de clulas viables (factor de dilucin
por el azul tripn), ver punto 1 del apndice.
5. Calcular el porcentaje de clulas viables se
gn la siguiente frmula:
Nmero de cl.
viables por mi
>de clulas viables =

100

Nmero total
de clulas por mi
3. M todos para Usar glbulos rojos
1. Por lisis hipotnica: a un volumen del sedi
mento celular aadir un volumen de agua
destilada, hom ogeneizar con una pipeta.
Despus de exponer las clulas al shock hipotnico durante 15 segundos aadir rpida
mente medio de cultivo o SST 2X. Hom o
geneizar y centrifugar a 200 X g durante 10
m inutos y lavar las clulas sedim entadas
con medio o SST.
2. Por lisis con solucin tam ponada de TrisCloruro de amonio. Para preparar la solu
cin de trabajo de Tris-Cloruro de amonio
ver su preparacin al final de captulo. Para
producir la hsis de los glbulos rojos conta
minantes, centrifugar las clulas y agregarle
1 ral de buffer Tris-NH^Cl pH 7.2. Agitar a
temperatura ambiente por 2 minutos. Prote
ger las clulas agregando SFB y centrifugar
a 300 X g durante 10 minutos. Si la lisis de
los eritrocitos no fue completa repetir el tra
tamiento. Lavar las clulas dos veces con
SST antes de usar.

769

2. Retornar la inicroplaca a la estufa de culti

vo, e incubar por 4 a 24 h adicionales.
La duracin del perodo de marcacin debe
ser determ inada em pricam ente para cada
cultivo. Un perodo de marcacin de toda la
noche (18 a 24 h) es conveniente y m inim i
za los efectos de la sntesis asincrnica del
ADN por los hnfocitos.
3. Recoger los cultivos sobre papel de fibra de
vidrio utilizando un cosechador de clulas.
Aspirar las clulas y lavar varias veces con
agua para lisar las clulas y tran sferir el
ADN al papel permitiendo que se elim ine la
[^H]-TdR no incorporada,
4. Secar los papeles en estufa a 37C o en mi
croondas, y posteriorm ente, colocar cada
uno en un vial de centelleo lquido.
5. Eluir la pHJ-TdR incorporada con el lquido
de centelleo (vase al final de este captulo).
Contar la radiactividad incorporada (cpm) en
un contador de centelleo lquido del tipo p,
5. Cuantificacin de la sntesis de ADN
u sando el ensayo colorimtrico de MTT
Para la determ inacin colorim trica d e la
sntesis del ADN se utiliza la sal de tetrazolio
[3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromuro] (MTT), que al ser clivada por
las mitocondrias activas, vira del color amarillo
a un producto (formazan) soluble en HCl-isopropanol que es de color azul y puede ser de
tectado en un lector de policubetas a 570 nm
(Mosmann, 1983), Este ensayo provee un m
todo simple para detectar clulas vivas crecien
do, sin el uso de radiactividad.
M ateriales

4. Marcacin de clulas con timidina

tritiada para la determinacin de la
proliferacin celular en microplacas

Materiales

M todo

1 |aCi/m] de [^H] metil timidina ([^H] TdR,

6.7 Ci/mmol; Du Pont NEN, # NET-027).
- Medio RPMI completo sin suero.
- Papel de fibra de vidrio.
- Aparato cosechador de clulas manual o semiautomtico (NUNC, SKATRON).

1. Disolver el MTT en SST (solucin stock de

5 mg/ml). Filtrar para esterilizar y elim inar
los residuos insolubles.
2. Adicionar 10 )il de la solucin de MTT/SST
en cada pocilio (conteniendo 100 xl de clu
las). Incubar las clulas a 37C, en la estufa
g asead a con 5% de CO, durante 4 h. El
M TT reemplaza a la pH]-TdR,
3. Adicionar 100 \x\ de HCl 0,04 N en isopro
panol en cada pocilio. Pipetear tres o cuatro
veces para disolver los cristales azules oscu
ros. Dejar las placas unos minutos a tem pe
ratura ambiente hasta que los cristales se solubilicen.

Mtodo
1. Agregar 1 iCi de [^Hl-TdR por pocilio, di
luyendo 1:20 la solucin de Im C i/m l de
[^H] metil timidina con RPMI completo sin
SFB. Colocar 20 |J,1 de esta dilucin de [H]TdR en cada pocilio de la microplaca.

MTT (Sigma#M-2128).
HCl 0,04 N en isopropanol.
Filtros de 0,22 |U,m.
Lector de microplacas con filtro de 570 nm.

770

Metodologas

4. Leer las placas en el lector de microplacas

utilizando un filtro de 570 nm. El color es
estable unas pocas horas a temperatura am
biente.

- MgCI^ 0,5 mM
- MgSO, 0,6 mM
- D-glucosa 5,6 mM
Agregar agua destilada hasta completar un litro
y ajustar el pH a 7,4.

Soluciones tam ponadas y reactivos qum icos

Lquido de centelleo
- 5 g de 2,5- difeniloxazol (PPO)
- 0,3 g de 1,4-bis [-2-(5-feniloxazolil)]-benceno (POPOP)
- 2 ml de cido actico glacial
Llevar a 1 litro con tolueno y agitar durante 1
h. Este reactivo debe ser usado dentro de los 6
meses y guardarse en un frasco oscuro.
Medio de cultivo IM D M completo: es el medio
de Dulbecco modificado por Lscoves
L-glutamina 2mM
~ 2-Mercaptoetanol 50 |iM
- Estreptomicina 160p,g/ml
- Penicilina 100 U/ml
Al medio MDM completo suplementado con
5% de suero, descomplementado por calenta
miento a 56C durante 30 min, se lo cita como
IMDM-5.
Medio de cultivo RPM I completo
- RPMI 1640
~ L-glutamina 2 mM
- 2-Mercaptoetanol 50 jiM
- NaCOjH 2 g/l
- Estreptomicina 160 [tg/ml
- Penicilina 100 U/ml
Al medio as preparado se lo denomina com
pleto. Cuando al medio RPMI 1640 completo
se lo suplementa con 10% de SEB u otro suero,
descom plem entado por calentam iento a 56C
durante 30 min, se lo cita como RPMl-lO.
Solucin salina tamponada (SST)
~ N a C I9 g (1 5 4 m M )
^ Na^HPO, 1,15 g (anhidro) (8,1 mM)
- N a H 2 P 0 ,0,23 g (anhidro) (1,9 mM)
Agregar agua destilada hasta 900 ml y ajustar a
pH 7.2-7.4 utilizando N aOH IN o HCl IN.
Adicionar agua hasta 1 litro.
Solucin de Hanks
-

NaCl 137 mM
KCl 5.4 mM
Na^HPO^ 0,3 mM
KHjPO, 0,4 mM
NaHCOj 4,2 mM
CaCL 1,3 mM

Solucin para lisar glbulos rojos (Solucin

tamponada de Tris-Cloruro de amonio)
Solucin tamponada stock
- N H p 0,16 M (8,3 g/l)
- Tris 0,17 M, disolver 20,6 g de Tris en 900
ml de agua destilada, ajustar a pH 7,65 con
HCl IN. Completar a 1000 ml.
Solucin tamponada de trabajo
9 0 m ld e N H 4 C I0 ,1 6 M
- 10 m id e Tris 0,17 M ,p H 7,65.
- Ajustar a pH 7,2 con HCl IN.
-

Solucin de Gey
- S o lu c i n I. N aC l 35 g; K Cl 1,85 g;
N a2H PO ,.l2 H ,0 .5 g; K H ,P 0 , 0,119 g;
glucosa 5 g; rojo fenol 0,05 g; agua destilada
hasta 1 litro.
^ Solucin II. MgCIj. 6 H p 0,42 g; M gSO,
7 H 2O 0,14 g; CaClj 0,34 g; agua destilada
hasta 1 0 0 ml.
- Solucin III. NaHCOj 2,25 g; agua destilada
hasta 1 0 0 ml.
Esterilizar en autoclave cada una de estas solu
ciones. En el momento de usar, mezclar 20 ml
de la solucin I, 5 ml de la solucin II, 5 ml de
la solucin III y 70 ml de agua destilada estril.
Solucin salina fosfatada de Dulbecco
- S o lu c i n I. N aC l 4 0 ,4 5 g; K C l 1,45 g;
KH^PO, 1,45 g; Na^HPO, 5,49 g; agua desti
lada hasta 400 ml.
- Solucin II. CaClj 0,95 g; agua destilada
hasta 50 ml.
~ Solucin III. M gCl 2 0,95 g; agua destilada
hasta 50 ml.
Esterilizar en autoclave cada una de estas solu
ciones. En el momento de usar, mezclar 80 ml
de la solucin I, 10 ml de la solucin II, 10 ml
de la solucin III y 900 ml de agua destilada
estril.
Preparacin de la columna de lana de nylon
Este protocolo describe la preparacin de la la
na de nylon para el enriquecimiento en linfoci
tos T.

Metodologas para la evaluacin de las clulas inmunocompetentes

Material
~
-

HCl al 1%.
Lana de nylon (nueva o reciclada).
Guantes de amianto.
Jeringa descartable de 12 a 20 ml.

Mtodo
1. Colocar la lana de nylon en un vaso de pre
cipitado de 4 litros. Saturar con un volumen
en exceso de HCl al 1%.
2. Hervir 5 a 10 minutos para remover conta
minantes.
Las burbujas de aire formadas como conse
cuencia de la ebullicin son atrapadas deba
jo de la lana de nylon lo que resulta en m o
vimientos violentos del recipiente. Usar los
guantes para mantenerlo firme.
3. Dejar enfriar y luego descartar el lquido.
Exprimir la lana de nylon para liberar el l
quido atrapado y lavar con agua. Repetir al
menos 10 veces para extraer todo el HCl
(controlar de llegar a pH neutro).
4. Secar la lana de nylon a tem peratura am
biente y pesar la cantidad apropiada.
5. Peinar la lana de nylon con un cepillo hasta
que no tenga nudos y triplique su volumen.
6. Remover el mbolo de la jeringa y usarlo
para colocar la lana de nylon dentro de la
jeringa. Insertar el mbolo para para com
pactar la lana de nylon. Presionar firm e
mente.
7. A u to c la v a r las c o lu m n a s 15 m in u to s a
110C.
Las columnas de lana de nylon esterilizadas
se pueden guardar durante meses a tempera
tura ambiente.

771

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B ib liografa de consulta
B IB L IO G R A FIA
B io s a fe ty in M ic ro b io lo g ic a l a n d B io m e d ic a l la b o ra to rie s .
H e a lth a n d t tu m a n S e r v ic e s P u b lic a c i n # ( N I H ) , 8 8 8 3 9 5 , U .S . G o v e r n m e n t P r in t in g O f f ic e , W a s h in g to n
D .C .

M a n u a l o f c lin ic a l la b o ra to ry im m u n o lo g y , 4 th ed, A m e r i
c a m S o c ie ty fo r M ic ro b io lo g y , C o n w a y d e M a c a rio , E ,,
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ANEXO
Aplicaciones de ia inmunogentica
al diagnstico de leucemias y linfomas

M. LEONARDO SATZ
M. ROSA PADRS
NORA HALPERIN
LEONARDO FAINBOIM

IN T R O D U C C I N
El desarrollo de la tecnologa para la produc
cin de anticuerpos monoclonales (AcM) (cap.
37) ha permitido en los ltimos aos una mejor
comprensin de los procesos de maduracin de
los leucocitos. Habamos visto en los captulos
anteriores (5 y 6) que, durante la diferenciacin
linfocitaria B en la mdula sea y T en el timo,
los distintos estadios de maduracin se caracte
rizan por la expresin diferencial de un conjun
to de molculas en la superficie celular y por
reordenamientos en los genes de inmunoglobu
linas y receptor T. Asimismo, existen numero
sas molculas de superficie celular (CD), que
son especficas de la serie mieloide, eritroctica
y plaquetaria (vanse ms detalles en el Anexo
listado CD, Apndice Cap. 2).
Las leucemias y los linfomas constituyen un
grupo de enfermedades caracterizadas por una
proliferacin maligna de las clulas presentes
en la sangre, mdula sea, ganglios linfticos o
bazo. La patologa puede afectar cualquiera de
los tipos celulares presentes en dichos tejidos:
clulas de la serie eritroctica, mielomonoctica
o linfocitaria B y T. La correcta identificacin
del tipo celular involucrado resulta crucial tan
to para el avance en la comprensin de la bio
loga y la patognesis de estos tumores como
para predecir el pronstico y decidir el correcto
tratamiento de cada uno de ellos.
El diagnstico habitual surge de una serie de
pautas entre las cuales la clnica, la morfologa
de las clulas al microscopio ptico y la expre
sin de enzimas especficas de linajes, son las
ms tiles. Las clulas malignas constituyen un
clon que se ha expandido a partir de una clula
que se ha detenido en su maduracin normal y

se replica desreguladamente, a partir del proce

so de leuceraizacin. La disponibilidad de
una coleccin de AcM dirigidos contra los di
versos CD leucocitarios, perm ite contar con
una herramienta complementaria para identifi
car el linaje celular involucrado en la patologa.
Bsicam ente, m ediante tcnicas de inm unomarcacin (vase ms adelante), se cuantifican
los porcentajes de clulas reactivas contra cada
AcM . T eniendo en cuenta el porcen taje de
blastos (o clulas con morfologa anmala) en
la muestra, el porcentaje de clulas positivas
para un marcador dado y los valores habitual
mente normales para ese marcador en ese teji
do, se establece el linaje afectado. En muchos
casos, la tipificacin de la leucemia se realiza
con los elementos diagnsticos mencionados
antes; otras veces, la definicin del subtipo in
munolgico es decisiva en la distincin de las
leucemias mieloides de las hnfoides, para las
cuales hay diferencias en el pronstico y el tra
tamiento.
Tipificacin de leucemias
y linfomas
De acuerdo al grado de maduracin de la c
lula afectada y a una serie de caractersticas cl
nicas, las patologas se agrupan en agudas y
crnicas, y podrn afectar en ambos casos a las
series B, T o mielomonoctica.
Leucemias agudas
En el cuadro 36-7 se muestran los fenotipos
que caracterizan a las leucemias agudas, con
dos o tres AcM especficos para cada linaje hematopoytico, B, T y mieloide.

Metodologas para la evaluacin de las clulas inmunocompetentes

C u ad ro 36-7. Clasificacin inmunolgica de
las leucemias agudas
A ntgenos de
diferenciacin

LLA-B'^'^

L L A -T

C D IO
C D I9
CD 22*
CD3
CD5
CD7
C D 13
C D 33
aM PO *

LM A

-/+

773

inmaduras slo expresan HLA-DR, CD34 y la

enzima TdT. Luego adquieren CD19 (LLA-nulas) y luego el CDIO (LLA-comunes).
La frecuencia de los distintos subtipos de
LLA en la poblacin de la Capital Federal y
Gran Buenos Aires en el perodo 1983-1986
fue la siguiente: LLA comn, 73,9%, LLA nu
la, 11,7%; LLA-T, 13,4%; LLA indiferenciadas, 3%, y LLA-B, 0,84% (experiencia de los
autores, sobre la base de ms de 250 casos es
tudiados). Estos resultados son similares a los
observados en otros centros europeos con p o
blacin caueasoide.

Exprejiin citoplsm ica.

** L L A -B te m p ra n a (C D 1 0 -), co m n (C D IO ) y pre-B (m u-cito)

L EU C EM IA S LIN FO B L STIC A S
A G U D A ST
LEUCEMIAS LINFOBLASTICAS
AGUDAS (LLA)
Los primeros marcadores utilizados para di
ferenciar los subtipos de LLA, fueron el recep
tor para los GRC (rosetas E), que identificaban
a las LLA-T, y las Igs de superficie (slg) que
identificaban a las llamadas LLA-B. Posterior
mente se describieron antisueros contra el Ag
de diferenciacin CDIO (anti-CALLA), que
reaccionan con las clulas de un 70% de las
LLA, con pronstico ms favorable que las an
teriores. Originalmente, a las de este subgrtipo
de LLA se las denomin comunes (por su fre
cuencia) y se les asign un linaje no T, no B.
Posteriormente, con la definicin de otros mar
cadores de linaje celular (HLA-DR, p. ej.), la
observacin de un pequeo porcentaje de clu
las normales en mdula sea con igual fenotipo,
y la deteccin de reordenamientos en los genes
de Igs en estas clulas, se concluy que las
LLA no T-no B, constituyen clulas del linaje
B, en estadios tempranos de diferenciacin.
Ms recientemente, la identificacin de nue
vos marcadores de diferenciacin de la serie B
permiti definir nuevos subtipos de LLA: des
de los estadios ms indifereneiados hasta los
ms maduros (cuadro 36-8). Las clulas ms

Como dijimos antes, las LLA-T representan

alrededor de un 15% de las LLA. El m arcador
ms til para detectar una LLA-T es el CD7 ya
que est presente en la mayora de los tim oci
tos y clulas T y ausente en las LLA de estirpe
B. El cuadro 36-9 muestra la clasificacin de
las LLA-T de acuerdo al nivel de diferencia
cin tm ica. El grupo I incluye a las clulas
ms inmaduras, que expresan CD2 (rosetas E)
CD5 y CD7. En este estadio las clulas ya han
reordenado los genes T-beta y pueden tener o
no T-alfa reordenado (vase cap. 7 y ms ade
lante en este cap.).
El grupo II expresa, adems, CDI, C D 4 y
CD8 sobre la misma clula y un 25% de los ca
sos expresa tambin CD3. Las clulas han reo r
denado y expresan T-beta.
El grupo III representa los timocitos m adu
ros y linfocitos T perifricos, los cuales c a re
cen de C D l, expresan CD3 junto a CD4 en al
gunos casos o a CD8 en otros; poseen reordenados y expresan T-alfa.
Leucemias mieloides agudas (LMA)
Se han descrito AcM que reconocen m arca
dores presentes en clulas de estirpe mieloide
maduras e inmaduras, pero ninguno de ellos es

C uadro 36-8. Fenotipos principales que caracterizan a los subtipos de LLA de linaje B
Antgenos
de diferenciacin
CD 34
H L A -D R
CD 19
C D IO
CD 20
m u c ito p .
s lg
TdT

In d if
+
+

Nula
-v

+
+

Com n
- /+
+
+
+

p re-B

....

+
r
+
f
-

- /+

....

- /+

' B

_
+
-f
...

-r
--

774

Metodologas

C uadro 36-9. Clasificacin de las LLA-T

A ntgenos de diferenciacin
CD7

CD5

CD2

CD3

CD4

CD8

CDI

G ru p o I

+ (7 5 )

G ru p o 11

+ (2 5 )

G ru p o III

+ /-*

+ /-*

* N o p re sen ta ex p resi n s im u ltn e a de C D 4 y C D 8 co m o en el g ru p o 11.

Se indica en tre p arn tesis el p o rc en taje d e casos positivos.

especfico de clulas leucmicas; sin embargo,

la presencia de CD34 junto con los anterior
mente mencionados indica que estamos en pre
sencia de un proceso leucm ico. El cuadro
36-10 muestra los fenotipos inmunolgicos de
las LMA segtin la clasificacin de la FAB. Hay
gran variacin en la expresin de estos marca
dores en distintas leucemias. Por otra parte, no
hay una correlacin entre la expresin de deter
minados marcadores y las patologas clasifica
das segn la FAB. Usualmente se incluye un
marcador pan-mieloide que reconoce tanto pre
cursores de granulocitos como precursores de
monocitos, como el CD13 o CD33, para el pri
mer anlisis de una leucemia aguda de estirpe
desconocida.
La LMA-MO es un ejemplo tpico de la ne
cesidad de evaluar el inmunofenotipo para lle
gar a un correcto diagnstico, ya que en ella la
m orfologa de los blastos se asem eja a una
LLA y este estadio es negativo para la citoqumica mieloide.
Leucem ias bifenotpicas agudas
Se han descrito casos en los que la misma
clula blstica coexpresa marcadores indicati
vos de linajes celulares diferentes. Esto puede
deberse a la presencia de una leucemia bifenotpiica aguda (LBA) que afectan a clulas em
brionarias multipotentes, con una diferencia
cin genotpica y fenotpica multilineal; alter
nativam ente, puede tratarse se una leucem ia
aguda mieloide, B o T, en las cuales las clulas
expresan aberrantemente algn marcador adiC u a d ro 36-10. Fenotipos inm unolgicos de
las LMA
Estadio de la EAB
M 0 ,M 1 , M 2
M3
M 4, M 5
M6
M7

Fenotipo inm unolgico

G D I 3, C D 3 3 , C D 3 4 , M P O , H L A -D R
C D 1 3 , C D 3 3 ,M P O
C D 1 3 , C D 3 3 , G D 1 4 , C D 6 8 , H L A -D R
C D 3 3 , a n ti-g lic o fo rin a A
C D 3 3 ,C D 4 1 ,C D 4 2 , C D 61

cional. Para distinguir ambas situaciones el Dr.

Catovsky propuso un sistema de scores (cuadro
36-11), en cual la presencia de ciertos marca
dores tiene mayor peso para definir una LBA.
As, por ejemplo, si una LA con marcadores
mieloides expresa adems CD22 citoplsmico
y CDIO o CD19, el score ser de 3 y la leuce
mia se define con bifenotpica; si slo expresa
CDIO o CD I9 como marcador fuera de linaje,
el score ser de 1 y, por lo tanto, no ser bife
notpica sino simplemente una LMA.
Desrdenes linfoproliferativos
de la serie B madura
Se caracterizan por la proliferacin clonal de
clulas con fenotipo maduro y comprenden la
leucemia linftica crnica (LLC-B), leucemia
prolinfoctica (LPL), leucemia a clulas vello
sas o tricoleucemia (LCV), mieloma mltiple
(M M ), m acroglobulinem ia de W aldenstrm
(MW) y linfomas (LE). El cuadro 36-12 resu
me los marcadores inmunolgicos que caracte
rizan a estas patologas.
Las clulas de las LLC-B expresan recepto
res para eritrocitos de ratn e Igs de superficie;
la clonalidad se demuestra por la expresin de
un solo tipo de cadena liviana, ya sea kappa a
lambda, sobre la superficie celular. La densi
dad de expresin de las Igs de superficie es m e
nor, sin embargo, que la presente en otras pato
logas, como los linfomas linfocticos y leuce
mias prolinfocticas. Las LLC-B expresan tam
bin el antgeno CD5, tpico de la serie T. Se
lo encuentra normalmente en una pequea sub
poblacin celular en los ganglios linfticos. E s
tudios de ontogenia han demostrado que repre
senta la prim era poblacin que coloniza los
ganglios linfticos y dara origen al resto de la
poblacin B en ellos, que luego pierden este
marcador. Identificara entonces a las clulas
en transicin entre la mdula sea y el ganglio.
Las clulas de las LLC-B poseen sus genes
de cadena pesada y liviana reordenados y un
10% de los casos presentan* tambin reordena
mientos de T-beta (vase ms adelante).

Metodologas para la evaluacin de las clulas inmunocompetentes

775

Cuadro 36-11. Sistema de scores para distinguir la leucemia bifenotpica aguda

Puntos

Linaje

2
1
0,5

cC d 2 2
C D IO
CD 19
TdT

cC D 3
CD2
CD 5
TdT
CD7

M
M PO*
C D 13
C D 33
C D l) b ,c
C D l 4 /5

c, C ito p lsm ica .

* D e m o stra ci n d e M P O p o r cu a lq u ie r m todo.
El scorc del m a rc a d o r fu e ra d e lin aje ce lu la r deb e ra ser > 2 p ara d ia g n o s tic a r q u e la leu c em ia ag u d a en cuestin es bifenotpica.

C uadro 36-12. Fenotipo inmunolgico de las enfermedades linfoproliferativas de la serie B m.adura

M arcador
R o se ta s M
sig
C D 19, C D 20
CD5
C D 21
C D IO
C D 25
P C A -I
PC -1
C D 38

LLC -B

LPL

++
-/+

LF

I.C V

-/+
++

-/+
++

M M /M W

-/+
-/+

-/+

-/+

Las clulas de los desrdenes malignos de la

serie B expresan tambin marcadores tpicos de
clulas B: HLA-DR, CD19, CD20, excepto en
el miel orna mltiple y en la macroglobulinemia
de W aldenstrSm , que afectan a plasm ocitos.
Estos ltimos expresan, adems, CD38, PC A l
y PCI.
Desrdenes linfoproliferativos crnicos
de la serie T
El fenotipo de estas patologas corresponde a
clulas postmicas, es decir, siempre son nega
tivas para TdT y C D l, este ltimo expresado
frecuentemente en linfomas linfoblsticos T y
en un subtipo de LLA-T. El cuadro 36-13 resu
me el fenotipo inm unolgico de estas patolo
gas, til en su clasificacin y diagnstico: leu

cem ia linftica crnica T (LLA-T), leucem ia

prolinfoctica crnica T (LPL-T), leucemia-linfoma T del adulto (LLTA) y linfoma cutneo
de clulas T (LCCT). La naturaleza elonal de
estas patologas se puede evidenciar por reo r
denam ientos de los genes T -beta y T -g am a
(vase ms adelante).
Con excepcin de la LLC-T, todas las pato
logas se caracterizan por la proliferacin de
clulas T CD4+. Existe, sin embargo, una h ete
rogeneidad funcional: las clulas de las L CC T
y LPL-T se comportan in vitro como coopera
doras, mientras que las clulas de las LLTA ac
tan como potentes supresores de la diferencia
cin B. No se sabe si esto refleja la afeccin de
' dos o ms subpoblaciones T CD4 diferentes, o
alteraciones funcionales como consecuencia de
la patologa.

C uadro 36-13. Fenotipo inmunolgico de las patologas malignas de clulas T maduras

M arcador
CD5
CD3
CD4
CD8
CD2
CD7
C D 25

L L C -T

_
+
-

+
+
-

L P L ^T

LLTA

LC C T

+
+
+

+
+
+

+
+
+

+
+

776

Metodologas

Las clulas malignas de las LCCT se carac

terizan por su ncleo cerebriforme. En las mi
cosis fungoides estas clulas aparecen en la
piel y son CD7+, mientras que en el sndrome
de Szary estn en sangre p e rifrica y son
CDT.
La LLTA es una patologa asociada frecuen
tem ente, aunque no siempre, a un retrovirus
humano llamado HTLV-L Se presenta en Ja
pn, Caribe y EE. UU. Las clulas son de feno
tipo cooperador y expresan adems la cadena
beta (p55) del receptor para la lL-2 (CD25).
Luego de 24-48 horas en cultivo, estas clulas
expresan en el citoplasma las protenas virales
pl9 y p24.
Las clulas CD8+ de algunas LLC-T exhiben
funcin de ADCC y rara vez actan como efec
tores supresores o NK. Algunos casos de LLCT coexpresan CD4 y C D ll o CD8 y C D Il, y
son de peor pronstico que las de fenotipo ms
comn, CD8, CD3.

Procedimiento experimental
La deteccin de los antgenos de membrana
se realiza por inmunofluorescencia (lE) directa
o indirecta. Generalmente se realiza IF directa
para la deteccin de Igs de superficie, mientras
que los marcadores de diferenciacin reconoci
dos por AcM murinos se detectan por IF indi
recta.
La estrategia diagnstica para una muestra
con diagnstico presuntivo de leucemia aguda,
involucra una prim era evaluacin de los si
guientes marcadores; HLA-DR, CD7, Igs de
s u p e rfic ie , C D IO , C D 2 0 , C D 1 9 , C D 33 y
C D I4. Si el porcentaje de clulas CD7^ suma
do al nmero de blastos leucmicos es mayor
de 100, indicar la presencia de una leucemia
aguda T y se evalan los siguientes marcado
res: CD2, CD5, CD8, CD4, CD3, CDL
Para las leucemias crnicas, una primera in
vestigacin incluye: H LA -D R, CD7, CDIO

F ig . 3 6 -1 3 . G r fic o s d e d o b le flu o re s c e n c ia o b te n id o s p o r a n lis is d e c ito m e tra d e flu jo , (a ) G r fic o d e d o t p lo t, d o n d e

la s o rd e n a d a s p o s e e n u n a e s c a la lo g a r tm ic a d e in te n s id a d r e la tiv a d e f lu o re sc e n c ia (F L 2 ) p a ra el m a rc a d o r C D 1 9 y las
a b s c is a s u n a e s c a la s im ila r p a ra F L l (C D IO ). El o p e ra d o r d e fin e lo s c u a d ra n te s te n ie n d o e n c u e n ta lo s v a lo re s b a s a le s d e
flu o re sc e n c ia , (b ) G r fic o d e c o n to rn o s d e la s m is m a s c lu la s, (c) A n lis is d e l % d e c lu la s p re s e n te s e n c a d a c u a d ra n te :
U L (su p e rio r iz q u ie rd o ), U R ( su p e rio r d e re c h o ), L I. (in f e rio r iz q u ie rd o ) y L R (in fe rio r d e re c h o ). S e in d ic a ta m b i n el n
m e ro d e c lu la s r e g is tra d a s en c a d a c u a d ra n te (ev e n ts ), y el p o r c e n ta je d e las m is m a s s o b re el to ta l d e c lu la s p a s a d a s p o r
e l a p a ra to o s o b re un g ru p o d e clula.s (g a te d ) p r e -s e le c c io n a d a s p o r el o p e ra d o r, en b a s e a u n p a r m e tro (p .e j. ta m a o :
b ia s to s le u c m ic o s ). T a m b i n se re g is tra la in te n s id a d m e d ia d e flu o re s c e n c ia p a ra c a d a m a rc a d o r (X m e a n y Y m ea n ).

Metodologas para a evaluacin de las clulas inmunocompetentes

CD3, CD33, Igs de superficie, CD20, CD5. De
ser positivos CD3 o CD7, se identifican las
subpoblaciones T CD4, CD8, C D l. Si las Ig de
superficie son positivas, se detecta la monoclo
nalidad kappa/lambda.
A SPEC T O S T EC N IC O S
Se obtiene la m uestra (sangre perifrica o
m dula sea) con heparina. Es conveniente
procesarla a la brevedad, aunque puede perm a
necer hasta 24 horas a tem peratura ambiente
con una leve disminucin de la viabilidad ce
lular. Se diluye la muestra a la mitad o a la ter
cera parte (si el recuento leucocitario superior
es 25.000/mm^), con solucin salina tampona
da (PBS). Las clulas mononucleares se obtie
nen por centrifugacin de 10 ml de la muestra
diluida sobre 3 ml de Eicoll-Hypaque, 20-30
min a 400 x g. Se obtienen ]as clulas mononucleares de la interfase y se lavan tres veces
con PBS. Se cuenta el nmero de clulas/ml y
se ajusta la concentracin a lO^/ml. Para IF in
directa, se centrifugan 10 clulas a 300 g por
5 min y se descarta el sobrenadante. Se resus
pende el sedimento celular y se agrega el AcM
(volumen y dilucin indicadas por el fabrican
te y previa titulacin en el laboratorio). Se in
cuban las clulas 30 min a 4"C. Luego se lavan

777

las clulas dos veces con PBS conteniendo

0 ,1% seroalbmina bovina y 0,1% azida sdi
ca. Al sedimento celular resuspendido se agre
ga el segundo anticuerpo: F (ab)2 anti-inmunoglobulina de ratn (cabra) conjugado con
isotio cian ato de fluorescena. Se incuba 30
min a 4"C, y se lava 2-3 veces con PBS suplem entado como antes. Si se dispone de A cM
conjugados con fluorocromos, se puede re ali
zar IFD.
Anlisis: si el resultado ser determinado por
microscopa de fluorescencia, despus del lti
mo lavado se resuspende el sedimento celular
en un mnimo volumen de PBS (0,1 ml) y se
observa entre portaobjeto y cubreobjeto con
m icroscopio de epifluorescencia. Se cuentan
200 clulas y se registra el porcentaje de clu
las fluorescentes. La intensidad de la fluores
cencia es propiedad del nmero de molculas
presentes por clula y de la afinidad del Ac por
su epitope. Por ello, es variable y se requiere, de
gran entrenamiento del operador para las d eter
minaciones. Por lo general el uso de un segun
do anticuerpo, como fraccin F(ab)2, evita fal
sos positivos. Hay numerosas leucemias (sobre
todo de estirpe mieloide) que poseen receptores
con alta afinidad para el fragmento Fe de las
Igs y el uso de un segundo Ac como Ig total
origina falsos positivos; para ello es necesario
siempre incubar un blanco control de clulas

V 3 :2 2 8 3 0 0 3 /F L 1 -/F lu o re sc e n c e O ne Height
C a d e n a L. Lam bda- % To tal= 13,19
M ean = 108.96

102

1Q3

F ig . 3 6 -1 4 . G r fic o s d e h is to g ra m a s d e flu o re sc e n c ia o b te n id o s p o r c ito m e tr a d e flu jo . L a s a b scisa s s e a la n en e s c a la lo gu'tm ica ia in te n s id a d r e la tiv a d e f lu o re sc e n c ia p a ra la p re s e n c ia d e c a d e n a s liv ia n a s k a p p a (a) y la m b d a (b ). L as o r d e n a
das re fle ja n el n m e ro re la tiv o d e c lu la s a n a liz ad a s. E l o p e ra d o r d e fin e , se g n la f lu o re sc e n c ia b a s a l, a p a rtir d e q u in
te n s id a d se c o n s id e ra r p o s itiv a la m u e s tra (in d ic ad o c o n u n a ln e a h o riz o n ta l n e g ra ), (c) a m b o s h isto g ra m a s de ( a ) y ( b )
re s u m id o s e n u n g r fic o trid im e n s io n a l.

778

Metodologas

con el segundo Ac solamente. Estos blancos

deben ser inferiores al 5%.
Actualmente, muchos centros especiahzados
determinan el porcentaje de clulas positivas
por citometra de flujo (CF). Esta tcnica per
mite medir simultneamente numerosos par
metros celulares; (a) tam ao celular relativo
{forward scatter)\ (b) com plejidad celular y
granularidad del citoplasma (side scatter)\ in
tensidad de fluorescencia relativa (F L l, FL2,
pueden representar, por ejemplo, dos fluorocro
mos diferentes). La CF permite identificar c
lulas patolgicas aun cuando estn presentes en
muy pequeo porcentaje. Luego de incubadas
con los AcM, las clulas se resuspenden en 1
mi de PBS para ser anahzadas por CF inmedia
tam ente. T am bin pueden resuspenderse en
PBS conteniendo fijadores, lo que permite con
servarlas en la oscuridad a 4C y leerlas das
despus.
Las figuras 36-13 y 36-14 muestran ejemplos
de cmo se grafican los resultados obtenidos.
La figura 13 a (grfico de dot plot) y 13b
(contour plot) muestra dos formas de graficar
la presencia de clulas que co-expresan CDIO
(en E LI) y CD19 (FL2), que corresponden a
una LLA comn. La figura 13c registra el por
centaje de clulas positivas en cada uno de los
cuatro cuadrantes en que se ha dividido la figu
ra 13a; UL (upper left) cuadrante superior iz
quierdo, que contiene las clulas positivas para
EL2 (CD19) pero negativas para FL l (CDIO)
posee 8,5% de las clulas analizadas. UR; (up
per right) cuadrante superior derecho, que po
see las clulas positivas para ambos marcadores
y registra un 64% de dobles positivas. LL se re
fie re al cu ad ran te de las d o b les n eg ativ as
(25.48%) y LR al que registra las clulas positi
vas para FLl y negativas para FL2 (1.92%). La
figura 36-14 muestra otra forma de graficar re
sultados obtenidos por CF. Se trata de histogramas que poseen en el eje de las abscisas la in
tensidad de fluorescencia y en las ordenadas, el
nmero de clulas. Son tiles para analizar c
lulas teidas slo con un fluorocromo. La figura
2 grfica resultados obtenidos con una LLC-B,
donde las clulas fueron marcadas con un Ac
anti-cadenas livianas kappa y anti-cadenas li
vianas lambda. La figura 14a muestra que ms
del 86% de las clulas analizadas son positivas
para kappa (con intensidad media relativa de
119) y slo el 13,19% es positivo para lambda
(fig. 14b). Esta distribucin indica un exceso
clonal de kappa en esta LLC-B.
Reordenamientos genticos
como complemento diagnstico
La demostracin de la presencia de una po
blacin celular monoclonal resulta crucial para

distinguir una proliferacin benigna de una m a

ligna. En ms del 95% de los casos, la conjun
cin del diagnstico clnico, hematolgico e in
m unolgico perm ite la correcta clasificacin
del tipo celular comprometido. En el 3-5% res
tante el anlisis no es concluyente. Por un lado
es frecuente la existencia de un gran nmero de
clulas normales junto con las clulas neoplsicas en el tejido analizado, y en patologas que
afectan a clulas maduras ser imposible dis
tinguir las clulas afectadas. Lo mismo sucede
en una mdula sea: no es posible distinguir
clulas normales y un pequeo porcentaje de
clulas malignas. Por otro lado, algunas neoplasias se caracterizan por clulas con propie
dades de membranas alteradas que unen ines
pecficamente AcM dirigidos contra marcado
res especficos de diversos linajes o realmente
exhiben marcadores de dos linajes (leucemias
bifenotpicas). En la actualidad, la biologa m o
lecular presenta una herramienta de diagnstico
complementaria para la correcta tipificacin de
estos casos dudosos.
En los captulos 6 y 7 se han descrito los
procesos genticos involucrados para el ensam
blado de genes activos para la biosntesis de la
inmunoglobulinas (Igs) y del receptor T (recT).
Obsrvese en la figura 36-15 que durante los
procesos de reordenamiento gentico se produ
cen cambios en los sitios reconocidos por de
terminadas nucleasas de restriccin, alrededor
de los genes involucrados. Mediante la utiliza
cin de genes clonados del recT y de las Igs
com o sondas m o lecu lares en la tcn ica de
Southern, es posible analizar el ADN extrado
de las clulas tumorales y determinar la confi
guracin germinal o reordenada de los mismos
(fig. 34-16). Una expansin monoclonal de c
lulas B o T constituye la progenie de una sola
clula original. Esta poblacin puede ser identi
ficad a m ediante el an lisis m o lecu lar, aun
cuando est presente en proporciones tan bajas
como un 5% en un tejido dado. Los linfocitos
presentes en un tejido normal presentarn, cada
uno de ellos, un reordenamiento caracterstico
propio, pero el pequeo nmero de clulas de
cada clon que contribuye con su DNA al total
no permite detectar la banda especfica de cada
clon por la sensibilidad de esta tcnica.
Para estudiar el ADN por estos procedimien
tos, se requieren un mnimo de 2 x 107 clulas.
El ADN purificado de estas clulas se digiere
con enzimas de restriccin, se fracciona en ge
les horizontales de agarosa y luego de la elec
troforesis se transfiere a membranas de nitroce
lulosa o nylon. Dichas membranas se incuban
(hibridan) con una sonda de ADN correspon
diente a estos genes de Igs o rec T, marcada
con radioistopos (^^P) u otros mtodos enzi
mticos. Los fragmentos que posen secuencias

Metodologas para la evaluacin de las clulas inmunocompetentes

779

16 kb
BamHI

Bam H I*
Fam ilia de genes
de cadena pesada
S ondas
13 kb

(Lnea germ inal)

B am H I*
Fam ilia de genes
de ca de n a liviana Kappa

BamHI

i J.

Sonda
Fig. 36-15. D u ra n te la m a d u ra c i n Iin fo c ita ria se p ro d u c e n reo rd e n a m ie n to .s g e n tic o s q u e a p ro x im a n u n gen v a ria b le (V)
p r x im o a u n g e n
(en lo s g e n e s d e c a d e n a liv ia n a ) y u n g e n V d e c a d e n a p e s a d a p r x im a a u n g e n D h y a u n g e n Jj^. E n
to d o s e s to s s u c e s o s se p ie r d e n fra g m e n to s d e A D N , y c o n e llo s se p ie rd e n sitio s d e r e c o n o c im ie n to d e c ie rta s n u c le a s a s de
re,striccin. E n la fig u ra , lo s sitio s in d ic a d o s con el a s te r is c o (* ), p r x im o s a lo s g e n e s J, s o n lo s q u e in v a ria b le m e n te d e s a
p a re c e n p o r lo s re o rd e n a m ie n to s . E n c o n s e c u e n c ia , lo s fra g m e n to s g e n m ic o s d e te c ta d o s p o r las s o n d a s d e g en es c o n s ta n
tes, c a m b ia n d e ta m a o re s p e c to d e la ln e a g e rm in al.

homologas a la sorvda utilizada se detectan por

au to rrad io g rafa. D esde la obtencin de la
m uestra hasta la visualizacin de los resulta
dos, el procedimiento lleva un mnimo de 3-5
das. Para la estirpe B se utilizan genes clona
dos correspondientes a C-mu y JH de las cade
nas pesadas de Igs, y
para las cadenas livia

nas de las Igs. Para la estirpe T se utilizan son

das correspondientes a los genes T-beta y Tgamma. Por la organizacin genmica peculiar
que poseen los genes T-alfa (una extensa fam i
lia J-alfa dispuesta a lo largo de ms de 60 kb
de A D N ), es sum am ente d ifcil d eterm in ar
reordenamientos en esta familia usando com o

Fig. 36-16. E je m p lo s re p re s e n ta tiv o s d e re o rd e n a m ie n to s d e lo s g e n e s d e in m u n o g lo b u lin a s en p a to lo g a s lin fo p ro f e ra tiv a s . S e d ir ig i a p r o x im a d a m e n te 10 p g d e A D N p u r if ic a d o d e la s c lu la s le u c m ic a s , co n la e n z im a d e r e s t r i c c i n

B a m H I, y se la a n a liz p o r la t c n ic a d e S o u th e rn . C o m o s o n d a se u tiliz un fra g m e n to g e n m ic o d e 1,3 kb c o r r e s p o n
d ie n te al g e n Cfi. L a f le c h a in d ic a la p o s ic i n d e u n a b a n d a d e 17 k b , c o rre s p o n d ie n te al fra g m e n to d e ln e a g e rm in a l. L a s
mue.stra.s in d ic a d a s i, c y / , s lo m u e s tra n ei fra g m e n to g e rm in a !. L a s m u e s tra s d y e m u e s tra n la p r e s e n c ia de u n a le l o en
c o n fig u ra c i n g e rm in a l y u n o re o rd e n a d o . L a m u e s tra b s e a la la p r e s e n c ia d e a m b o s a le lo s re o rd e n a d o s .

780

Metodologas

sonda el gen C-alfa: un resultado negativo no

excluye reordenamientos.
IN T E PR E T A C IO N
D E LOS RESULTADOS
En las leucemias agudas de linaje B inmadu
ro, las LEA nulas (C D l9+ HLA-DR+, TdT+)
pueden exhibir sus genes de cadenas pesadas
de Igs en configuracin germinal o reordenados. En las LEA comunes (CD10+), todos los
casos poseen los genes de cadena pesada reordenados, mientras que alrededor de un 40% ex
hibe reordenados los genes de cadena liviana.
Hasta un 20% de las LEA comunes pueden po
seer reordenados los genes T,B- Las clulas B
de patologas de estirpes ms maduras (LLA-B,
linfomas, tricoleucemias, mielomas), exhiben
siempre reordenados o delecionados los genes
de cadena pesada y liviana de Igs y raenos del
10% de los casos muestran T-beta reordenados.
Por otra parte, las eucemias T agudas po
seen clulas que han reordenado genes T-beta y
T-gama, y slo las de extirpe ms madura reordenan y expresan T-alfa. Hasta un 10% de los
casos pueden exhibir, adems, reordenados los
genes C-mu, aunque en ningn caso se ha ob
servado reordenamiento de genes de cadena hviana de inmunoglobulinas. En muy raras oca

siones se han observado reordenam ientos en

clulas de estirpe mieloide. Se desconoce el
significado de los reordenamientos genticos
fuera de linaje; si pueden ocurrir en clulas
normales o si constituyen aberraciones caracte
rsticas de clulas leucmicas. A pesar de esto,
la determinacin de reordenamientos genticos
constituye una metodologa de estudio comple
m entaria para el diagnstico en estas patolo
gas.

B IB L IO G R A FA
W K n a p p , H S tro b e , O M a jd ic . F lo w c y to m e tric a n a ly s is
o f ceJI s u r f a c e a n d i n tr a c e l lu l a r a n tig e n s in le u k e m ia
d ia g n o s is . C y to m e try 18: 1 8 7 -1 9 8 , 1994.
R V e n d itti y c o l. M in im a lly d iff e re n tia te d a c u te m y e lo id
le u k e m ia (A M L -M O ): c y to c h e m ic a l, im m u n o p h e n o ty p ic
a n d c y to g e n e tic a n a ly s is o f 19 c a se s. B ritish J H e m a to lo g y 8 8 : 7 8 4 -7 9 3 , 1994
A M a c e d o y co l. C a ra c te riz a c i n fe n o tp ic a d e la d ife r e n
c ia c i n m ie lo id e n o rm a l. S a n g re 39: 2 7 7 -2 8 2 , 1994.
D C a to v s k y , E M a tu te s . L a c la s ific a c i n d e la l e u c e m ia
a g u d a . R e v is ta L a tn o a in e r ic a n a d e la E u ro p e a n S c h o o l
o f O n c o lo g y . S u p p l. 2; 1 6 -2 1 , 1993.
G D ig u ie ro , a n d th e F re n c h c o o p e ra tiv e g ro u p o n CLI,.. B cell c h ro n ic ly m p h o c y tic le u k e m ia : p re s e n t s ta tu s a n d fu tu re d ire c tio n s . B lo o d 78: 1 9 0 1 -1 9 1 4 , 1991.
G B F o g h e t. C h ro n ic ly m p h o c y tic le u k e m ia : a n u p d a te d rev iew . J. C lin . O n c o l. 12: 1 9 7 4 -1 9 9 0 , 1994.
L W D ia m o n d y co l. A k n o w le d g e b a s e d s y ste n i fo r th e in te r p r e t a ti o n o f f lo w c y to m e tr y d a ta in l e u k e m ia s a n d
ly m p h o m a s. C y to m e try 17: 2 6 6 -2 7 3 , 1994.

Hibridomas y anticuerpos
monoclonales

FERNANDO ALBERTO GOLDBAUM

CARLOS ALBERTO FOSSATI

HIBRIDOMAS Y ANTICUERPOS
M O N O C LO N A LES
Consideraciones generales
Ante el estmulo con un inmungeno, un ani
mal responde produciendo una gran variedad de
anticuerpos dirigidos contra diferentes compo
nentes del antgeno inoculado (polipptidos, po
lisacridos, etc.) y contra los distintos determi
nantes antignieos (epitopes) de cada uno de
esos componentes. Cada determinante antigni
co, a su vez, podr ser reconocido por ms de
un anticuerpo, con diferentes afinidades.
El conjunto de los anticuerpos producidos,
secretados hacia el suero del animal inmuniza
do, constituye el antisuero. Un antisuero es,
pues, una mezcla heterognea de anticuerpos
capaces de reaccionar con el antgeno.
Dada la naturaleza dinmica del sistema in
mune, la composicin del antisuero est some
tida a un cambio continuo en el animal inmuni
zado, lo cual sumado a las diferencias indivi
duales entre animales, hace que dicha mezcla
sea, adems de heterognea, irreproducible.
La tbora de la seleccin clonal, presentada
por Burnet en 1959, propone que cada clula
produce slo un anticuerpo en respuesta a su
estimulacin, teora en la que subyace, por lo
tanto, la idea de monoelonalidad. Esta idea per
miti com prender la naturaleza del m ielom a
mltiple, enfermedad debida a la proliferacin
de un clon celular en el que todas las clulas
producen la misma inmunoglobulina. La paraprotena del suero de pacientes de esta enfer
medad fue la primera fuente de inmunoglobuli
nas monoclonales.
En 1972, Potter pudo inducir la formacin
de mielomas en ratones, lo que permiti dispo

37
ner de lneas celulares productoras de anticuer
pos qumicamente homogneos, algunos de los
cuales reaccionan con antgenos ambientales.
Los mielomas inducidos pueden ser transplan
tados in vivo y adaptados a crecer in vitro. Sin
embargo, y lamentablemente, en general no es
posible la induccin de mielomas antgeno-especficos.
A lgunos investigadores intentaron obtener
anticuerpos homogneos mediante la transfor
macin de linfocitos B con virus tales com o
Epstein-Barr, SV40 y Moloney, lo que perm i
ti el establecimiento de algunas lneas produc
toras de anticuerpos especficos que, sin em
bargo, secretan muy pequeas cantidades de
anticuerpo.
Se intent tambin la inmortalizacin y el
clonado de clulas productoras de anticuerpos
mediante la proliferacin in vivo. La tcnica
desarrollada por Askonas y W illiamson co n
siste en obtener trozos de bazo de animales in
munizados que contengan en promedio una so
la clula productora de anticuerpos contra el
antgeno inmunizante; cada uno de esos trozos
es luego transferido a un husped irradiado
conjuntamente eon el antgeno; tras sucesivos
pasajes se va enriqueciendo el nuevo husped
con el clon elegido y se logran preparaciones
monoclonales. Sin embargo, no ha sido p o si
ble una verdadera inmortalizacin con ese m
todo.
Est claro, entonces, que para disponer de
una solucin que contenga un solo anticuerpo,
y siempre el mismo, es necesario lograr la p ro
liferacin de una sola clula productora de a n ti
cuerpos.
La m ejor manera de hacerlo es fusionar la
clula productora de anticuerpos especficos
para ef antgeno deseado con una clula que

780

Metodologas

sonda el gen C-alfa: un resultado negativo no

excluye reordenamientos.
IN T E PR E T A C IO N
D E LOS RESULTADOS
En las leucemias agudas de linaje B inmadu
ro, las LLA nulas (CD19+ HLA-DR+, TdT+)
pueden exhibir sus genes de cadenas pesadas
de Igs en configuracin germinal o reordena
dos. En las LLA comunes (CD10+), todos los
casos poseen los genes de cadena pesada reor
denados, mientras que alrededor de un 40% ex
hibe reordenados los genes de cadena liviana.
Hasta un 20% de las LLA comunes pueden po
seer reordenados los genes T,B. Las clulas B
de patologas de estirpes ms maduras (LLA-B,
linfomas, tricoleucemias, mielomas), exhiben
siempre reordenados o delecionados los genes
de cadena pesada y liviana de Igs y raenos del
10% de los casos muestran T-beta reordenados.
Por otra parte, las eucemias T agudas po
seen clulas que han reordenado genes T-beta y
T-gama, y slo las de extirpe ms madura reordenan y expresan T-alfa. Hasta un 10% de los
casos pueden exhibir, adems, reordenados los
genes C-mu, aunque en ningn caso se ha ob
servado reordenamiento de genes de cadena hviana de inmunoglobulinas. En muy raras oca

siones se han observado reordenam ientos en

clulas de estirpe mieloide. Se desconoce el
significado de los reordenamientos genticos
fuera de linaje; si pueden ocurrir en clulas
normales o si constituyen aberraciones caracte
rsticas de clulas leucmicas. A pesar de esto,
la determinacin de reordenamientos genticos
constituye una metodologa de estudio comple
m entaria para el diagnstico en estas patolo
gas.

B IB L IO G R A FA
W K n a p p , H S tro b e , O M a jd ic . F lo w c y to m e tric a n a ly s is
o f ceJI s u rt'a c e a n d i n tr a c e l lu l a r a n tig e n s in le u le m ia
d ia g n o s is . C y to n ie try 18: 1 8 7 -1 9 8 , 1994.
R V e n d itti y c o l. M in im a lly d iff e re n tia te d a c u te m y e lo id
le u k e m ia (AM L-M O)-. c y to c h e m ic a l, im m u n o p h e n o ty p ic
a n d c y to g e n e tic a n a ly s is o f 19 c a se s. B ritish J H e m a to lo g y 8 8 : 7 8 4 -7 9 3 , 1994
A M a c e d o y co l. C a ra c te riz a c i n fe n o tp ic a d e la d ife r e n
c ia c i n m ie lo id e n o rm a l. S a n g re 39: 2 7 7 -2 8 2 , 1994.
D C a to v s k y , E M a tu te s . L a c la s ific a c i n d e la l e u c e m ia
a g u d a . R e v is ta L a tin o a m e r ic a n a d e la E u ro p e a n S c h o o l
o f O n c o lo g y . S u p p l. 2; K > 2 1 , 1993.
G D ig u ie ro , a n d th e F re n c h c o o p e ra tiv e g ro u p o n C L L . B cell c h ro n ic ly m p h o c y tic le u k e m ia : p re s e n t s ta tu s a n d fu tu re d ire c tio n s . B lo o d 78: 1 9 0 1 -1 9 1 4 , 1991.
G B F o g h e t. C h ro n ic ly m p h o c y tic le u k e m ia : a n u p d a te d rev iew . J. C lin . O n c o l. 12: 1 9 7 4 -1 9 9 0 , 1994.
L W D ia m o n d y co l. A k n o w le d g e b a s e d sy ste m fo r th e in te r p r e t a ti o n o f f lo w c y to m e tr y d a ta in l e u k e m ia s a n d
ly m p h o m a s. C y to m e try 17: 2 6 6 -2 7 3 , 1994.

Hibridomas y anticuerpos
monoclonales

FERNANDO ALBERTO GOLDBAUM

CARLOS ALBERTO FOSSATI

HIBRIDOMAS Y ANTICUERPOS
M O N O C LO N A LES
Consideraciones generales
Ante el estmulo con un inraungeno, un ani
mal responde produciendo una gran variedad de
anticuerpos dirigidos contra diferentes compo
nentes del antgeno inoculado (polipptidos, po
lisacridos, etc.) y contra los distintos determi
nantes antignicos (epitopes) de cada uno de
esos componentes. Cada determinante antigni
co, a su vez, podr ser reconocido por ms de
un anticuerpo, con diferentes afinidades.
El conjunto de los anticuerpos producidos,
secretados hacia el suero del animal inmuniza
do, constituye el antisuero. Un antisuero es,
pues, una mezcla heterognea de anticuerpos
capaces de reaccionar con el antgeno.
Dada la naturaleza dinmica del sistema in
mune, la composicin del antisuero est some
tida a un cambio continuo en el animal inmuni
zado, lo cual sumado a las diferencias indivi
duales entre animales, hace que dicha mezcla
sea, adems de heterognea, irreproducible.
La tora de la seleccin elonal, presentada
por Burnet en 1959, propone que cada clula
produce slo un anticuerpo en respuesta a su
estimulacin, teora en la que subyace, por lo
tanto, la idea de monoclonalidad. Esta idea per
miti com prender la naturaleza del m ielom a
mltiple, enfermedad debida a la proliferacin
de un clon celular en el que todas las clulas
producen la misma inmunoglobulina. La paraprotena del suero de pacientes de esta enfer
medad fue la primera fuente de inmunoglobuli
nas monoclonales.
En 1972, Potter pudo inducir la formacin
de mielomas en ratones, lo que permiti dispo

37
ner de lneas celulares productoras de anticuer
pos qumicamente homogneos, algunos de los
cuales reaccionan con antgenos ambientales.
Los mielomas inducidos pueden ser transplan
tados in vivo y adaptados a crecer in vitro. Sin
embargo, y lamentablemente, en general no es
posible la induccin de mielomas antgeno-especficos.
A lgunos investigadores intentaron obtener
anticuerpos homogneos mediante la transfor
macin de linfocitos B con virus tales com o
Epstein-Barr, SV40 y Moloney, lo que perm i
ti el establecimiento de algunas lneas produc
toras de anticuerpos especficos que, sin em
bargo, secretan muy pequeas cantidades de
anticuerpo.
Se intent tambin la inmortalizacin y el
clonado de clulas productoras de anticuerpos
mediante la proliferacin in vivo. La tcnica
desarrollada por Askonas y W illiamson co n
siste en obtener trozos de bazo de animales in
munizados que contengan en promedio una so
la clula productora de anticuerpos contra el
antgeno inmunizante; cada uno de esos trozos
es luego transferido a un husped irradiado
conjuntamente con el antgeno; tras sucesivos
pasajes se va enriqueciendo el nuevo husped
con el clon elegido y se logran preparaciones
monoclonales. Sin embargo, no ha sido p o si
ble una verdadera inmortalizacin con ese m
todo.
Est claro, entonces, que para disponer de
una solucin que contenga un solo anticuerpo,
y siempre el mismo, es necesario lograr la p ro
liferacin de una sola clula productora de anti
cuerpos.
La m ejor manera de hacerlo es fusionar la
clula productora de anticuerpos especficos
para e antgeno deseado con una clula que

782

Metodologas

posea ilimitada capacidad de divisin; de este

modo la clula fusionada ser capaz de vivir en
cultivo, dividirse y producir anticuerpos. El
aislamiento y la expansin de uno de tales clo
nes celulares, en el que todas las clulas produ
cen el mismo anticuerpo, constituye una fuente
inm ortal de inm unoglobulinas qum icam ente
homogneas denominadas anticuerpos mono
clonales (AcMo) (fig. 37-1).
En 1975, Kher y Milstein desarrollaron la
tcnica de hibridizacin de clulas somticas
(hibridomas), que permite el establecimiento y
la inm ortalizacin de clulas productoras de
anticuerpos monoclonales. Por el desarrollo de
esta metodologa, en 1984 les fue otorgado el
premio Nobel de Medicina.
Teora y aspectos generales
de la produccin de hibridomas
La fusin entre clulas somticas fue obser
vada por primera vez hacia fines del siglo pasa
do, y el primer aislamiento de una clula som
tica hbrida se produjo a principios de la dca
da de 1960. El desarrollo de medios selectivos
por Littiefieid y el uso de nuevos agentes de fu
sin aumentaron la frecuencia de formacin de
hbrido y facilitaron su produccin.
El origen de los hibridomas productores de
anticuerpos se remonta a los intentos realizados
para estudiar la expresin gentica y la regula
cin de la produccin de inmunoglobulinas en
clulas de mieloma, lo que permiti la realiza
cin de im portantes observ acio n es para el
afianzamiento de esta metodologa, entre ellas:
a) el hbrido celular no presenta exclusin allica, o sea que la fusin de clulas productoras
de anticuerpos lleva a la expresin de ambas
inmunoglobuhnas parentales, lo que conduce a
la formacin de molculas hbridas por asocia
cin al azar de las cadenas pesadas entre s y de
stas con las livianas; b) no se producen nue
vas cadenas de inmunoglobulinas, lo que sugi
ri estabilidad en la expresin de inm unoglo
bulinas y control independiente de la expresin
de los genes de ambas clulas parentales y c)
una variante de mieloma que no expresa cade
nas livianas ni pesadas no suprime en el hbri
do la produccin de la inmunoglobulina codifi
cada por la otra clula parental.
Esta clase de trabajos culminaron con los ex
perimentos de Kohler y Milstein, quienes fue
ron capaces de fusionar clulas normales de ba
zo de ratones inm unizados con eritrocitos de
carnero, con una lnea de mieloma y pudieron
aislar un hbrido celular secretor de anticuerpos
especficos para el antgeno inmunizante. Ese
hibridoma creca continuamente in vitro y se
cretaba grandes cantidades de anticuerpo qu
micamente homogneo al medio de cultivo o al

suero, y/o ascitis cuando creca in vivo como

tumor trasplantado.
Clula de mieloma y mtodo de seleccin
La clula parental responsable de la prolife
racin del hibridoma es de una lnea de mielo
ma. Son clulas aneuploides, capaces de vivir y
chvidirse in vitro y fueron seleccionadas por ser
defectivas en la enzima hipoxantil-guanil-fosforribosil-transferasa (HGPRT); defecto enzi
mtico necesario para la seleccin post-fusional. La HGPRTasa es una enzima que utiliza
guanina o hipoxantina para producir purinas, lo
que permite la reutilizacin de las bases cuando
la sntesis de novo se ve interrum pida, por
ejemplo, por antagonistas del cido flico -c o
mo la aminopterina-, que bloquean la sntesis
de purinas y de timidina. La adicin de timidi
na (T) al medio le permite a la clula sintetizar
TMP (timidina monofosfato) va timidina quinasa (TK), pero al no poder sintetizar bases pricas la clula muere aun en presencia de del
precursor hipoxantina (H). (fig. 37-2).
El medio selectivo (HAT) consiste en enri
quecer el medio de cultivo celular con hipoxan
tina y timidina, con el agregado de aminopterina (A) como inhibidor de la sntesis de novo.
En presencia de aminopterina slo podrn so
brevivir aquellas clulas que expresan HGPRT,
como los hibridomas. Las de mieloma morirn
y las de bazo no desarrollan en cultivo.
La selecci n de m u lan tes d e fe ctiv o s en
HGPRT involucra mutagnesis de la lnea ce
lular por exposicin a un agente txico anlogo
a la base normal (8-azoguanina para HGPRT o
bromodeoxiuridina para TK), y posterior clo
nado de las poblaciones seleccionadas.
Clulas seleccionadas de esta forma podran
eventualmente revertir y reexpresar la enzima,
por lo que es aconsejable desarrollar el mielo
ma en presencia del anlogo txico o controlar
peridicamente que las clulas mueran en pre
sencia de HAT.
Algunas de las lneas de mieloma habitualmente utilizadas en la produccin de hibridomas producen y secretan cadenas de inmunoglobulinas.
En la clula hbrida se coexpresan las cade
nas codificadas por cada clula parental. Dos
cadenas pesadas se combinan con dos cadenas
livianas para formar las diferentes inmunoglo
bulinas; esta asociacin no es enteramente al
azar puesto que la asociacin homologa es ms
frecuente que la heterloga y no se detectan
asociaciones entre cadenas de distinto isotipo
(fig. 37-3).
La fusin de clulas somticas conduce a la
formacin de un hbrido celular (heterocarion).
Inicialmente, el heterocarion es una clula mu-

Hibrdomas y anticuerpos monoclonales

tinucleada (2 a 5 ncleos separados). Posterior
mente, durante la divisin celular, se desintegra
la membrana nuclear y se forma un solo ncleo
que contiene los cromosomas de ambas clulas
parentales. En este estadio las clulas son ines
tables y a medida que se dividen pierden algu
nos cromosomas de una o ambas clulas origi
nales, hasta que se logra la estabilidad celular.
O casionalm ente la p rd id a de crom osom as
puede incluir algn cromosoma esencial para la
vida de la clula y conducirla a la muerte. Por
otro lado, esta prdida puede conducir a que un
h ib rid o m a que o rig in alm e n te expresa, p o r
ejemplo, cuatro cadenas diferentes, deje de ex
presar alguna de ellas y, eventualmente, pierda
la expresin de todas las cadenas. La prdida
afecta principalm ente a los cromosomas que
codifican para cadenas pesadas (fig. 37-4).
En virtud de lo precedentemente detallado,
queda claro que lo ms conveniente es utilizar
para la fusin, clulas de una lnea de mieloma
no productor de cadenas de inmunoglobulinas.
En estas condiciones, los hibrdomas slo po
drn producir la inm unoglobulina codificada
por el linfocito B fusionado. Actualmente las
lneas no secretoras, por ejemplo la NSO, son
las ms utilizadas para la produccin de hibridomas murinos.
Inmunizacin
Se han probado muchos esquemas de inm u
nizacin y diferentes protocolos mostraron ser
mejores para algunos antgenos que para otros.
En general, para los inmungenos buenos prc
ticamente cualquier protocolo induce una ade
cuada generacin de anticuerpos y, en definiti
va, de anticuerpos monoclonales tiles. Dado
que la frecuencia de hibrdomas de la especifi
cidad deseada est aproximadamente relaciona
da al nmero de clulas productoras de anti
cuerpos en el momento de la fusin, los inm u
ngenos dbiles no sern buenos generadores
de anticuerpos monoclonales. Una manera bas
tante efectiva de aumentar la inmunogenicidad
de esos antgenos, es conjugarlos a protenas
portadoras muy inmunognicas (p.ej., KLH).
Un protocolo simple y generalmente efectivo
es inocular intraperitonealmente 50-100 (ig de
antgeno soluble en adjuvante de Freund com
pleto, determinar el ttulo de anticuerpos 4 se
manas despus, dejar bajar el nivel de anticuer
pos y reestim ular peridicam ente, finalmente
inocular unos 50 ^g de antgeno en solucin fi
siolgica por va intravenosa 3 das antes de la
fusin. Cuando se dispone de muy bajas canti
dades de antgenos particulados se puede recu
rrir a la inoculacin intraesplnica, la que tam
bin da buenos resultados con antgenos solu
bles. Existen, adems, mtodos de inm uniza

783

cin in vitro que han resultado efectivos para la

produccin de anticuerpos monoclonales.
Fusin
Se puede aseverar que desde la descripcin
de K ohler y M ilstein, quienes usaron v iru s
Sendai com o fusgeno, no se han producido
modificaciones sustanciales al protocolo origi
nal de fusin. En la actualidad, la mayora de
los laboratorios utilizan polientilenglicol (PEG)
como agente fusionante.
La fusin es realizada 3 o 4 das despus de
la ltima inoculacin del antgeno, momento de
mxima presencia de blastos en el bazo. El ren
dimiento habitual es de 2.000 a 5.000 hbridos
por cada 10* clulas de bazo.
Si
bien no se conoce con exactitud el m eca
nismo de accin del PEG, se ha verificado la
necesidad del contacto celular directo entre las
clulas a fusionar donde el PEG parece prom o
ver su unin. Algunos autores sugieren que las
impurezas del PEG son los verdaderos estim u
ladores de la fusin. La mxima frecuencia se
logra con PEG al 40-50% (peso/vol); a e sta
concentracin no se puede detectar agua fsica
mente libre en el medio. El agua fsicamente li
bre disminuye a medida que aumenta la c o n
centracin de PEG, lo que tambin aumenta la
osmolaridad, inconveniente que puede ser re
vertido por el agregado de dim etilsulfxido
(DMSO). Sin embargo el DM SO aumenta la
frecuencia de fusin de tres clulas o ms, d is
minuyendo la eficiencia de produccin de hibridomas viables.
Las clulas blastoides -e n activa divisin-,
son las que fusionan ms eficientemente. L a
mayor eficiencia parece ser debida a la expre
sin de ciertas caractersticas p osfusionales
ms que a una mayor frecuencia de fusin. Si
la clula que fusiona no se encuentra en estado
blastoide su ncleo no estar en divisin m ittica al mismo tiempo que el ncleo de la clula
mielomatosa, y resultar en una poblacin que
contendr un ncleo extra, silencioso. La fu
sin correcta ser aquella producida entre una
clula linfoide y una de mieloma. Aun as los
ncleos podrn dividirse asincrnicam ente y
dar lugar a poblaciones celulares abortivas.
La fusin del mieloma con otros tipos celu
lares no B no dan lugar, en las condiciones h a
bituales de produccin de AcMo, a la form a
cin de hibrdomas.
Cultivo de hibrdom as
En el cultivo de hibrdomas la calidad de los
componentes del medio de cultivo debe ser p
tima, para favorecer la divisin celular y la p ro
duccin- y secrecin de anticuerpos.

784

Metodologas
Anti-1
Syero

Antgeno

I
PEG

Clulas de
mieloma
(HGPRT)

F ig . 3 7 -1 . A n tic u e rp o s m o n o c lo n a le s y a n tis u e ro s c o n v e n c io n a le s

El crecimiento celular est muy influido por

la concentracin de clulas presentes en el cul
tivo; fuera de ciertos valores el crecim iento
puede verse interrumpido. El lmite inferior de
concentracin de clulas com patible con un

buen crecimiento celular puede establecerse en

aproximadamente 10'* cel m f , y el superior
en 10, lmites que son aplicables a la mayora
de las lneas celulares. Uno de los elementos
involucrados en el establecimiento de un lmite

F ig. 37-2. M etabolism o de bases pricas. H G PRT: hipoxantil guanil fosforibosil transferasa.

Hibridomas y anticuerpos monoclonales

785

o
o

,,,,,
'- _ y

O
O

- e | o

Fig. 37-3. D ia g ra m a d e s e g re g a c i n d e c a d e n a s de in m u n o g lo b u lin a s. H y M, ca d e n a s p e s a d a s y K y L, c a d en a s liv ia n a s

d e las in m u n o g lo b u lin a s d e l e s p le n o c ito y d e la c lu la s d e m ie lo m a , re s p e c tiv a m e n te .

F ig. 37-4. D ivisiones m itticas posfusionales. El esquem a incluye slo algunas de las posibles divisiones incorrectas.

786

Metodologas

superior es la competencia por los nutrientes.

En el inferior se destaca la necesidad de deter
m inada cantidad de factores de crecim iento
producidos por clulas en divisin, tales como
monoquinas, linfoquinas, interleuquinas e in
termediarios mctablicos.
Algunos autores utilizan clulas alimentadoras para m ejorar las condiciones de cultivo,
esas clulas, tales como macrfagos, timocitos
o clula de bazo irradiadas, son de escaso cre
cimiento pero proveen nutrientes y factores que
enriquecen el medio, permitiendo as el mante
nimiento y crecimiento de clulas en baja con
centracin.
Otra manera de sostener el crecimiento celu
lar en esas condiciones es agregar al cultivo un
medio gastado proveniente del cultivo en
crecimiento exponencial de clulas no secreto
ras de anticuerpos.
Otro componente fundamental en el cultivo
de hibridomas es la calidad del suero bovino
fetal utilizado. En la actualidad se dispone de
medios que no requieren el agregado de suero,
especialmente formulados para facilitar la puri
ficacin de los AcMo.
La mayora de los hibridomas se dividen ca
da 8-12 horas; de este modo, los lm ites de
crecimiento celular antes mencionados adm i
ten un incremento de 100 veces en la concen
tracin celular, lo que permite el cultivo por 2
a 4 das sin necesidad de efectuar cambios de
medio.
Monitoreo de la produccin de anticuerpos
monoclonales
La deteccin de anticuerpos especficos en el
medio de cultivo donde crecen los hibridomas
es uno de los puntos crticos, si no el ms im
portante, en la estrategia de produccin de anti
cuerpos monoclonales.
Las tcnicas a utilizar deben ser de alta sen
sibilidad como para detectar .tg mi"', ser rpi
das para evitar la atencin de cultivos intiles y
deberan, adems, brindar informacin acerca
de la utilidad del anticuerpo con respecto a los
fines para los cuales se los produce.
En ese sentido los mtodos ms usuales y
tiles son, en trminos generales, los radioinmunomtricos y enzimoinmunomtricos, aglu
tinacin pasiva e inmunofluorescencia, los que
son descritos en detalle en otros captulos de
este libro.
C lonado
En los cultivos en que se detectan anticuer
pos contra el antgeno de trabajo, pueden coe
xistir varios hibridomas. Uno o ms de ellos se
rn productores de anticuerpos de inters mien

tras que otros podrn secretar anticuerpos irre

levantes para el sistema, o ser no secretores de'
anticuerpos. Puede, entonces, tratarse de un
cultivo policlonal, por lo que resulta indispen
sable proceder a su clonado.
El clonado debe realizarse tan pronto como
sea posible para evitar que los otros hibrido
mas, o variantes del que se pretende establecer,
crezcan ms rpido y eliminen a los producto
res de anticuerpos deseadas.
Para ello se puede recurrir bsicamente a dos
mtodos: clonado en agar blando o dilucin en
medio lquido.
El primero consiste en cultivar,sobre agar semislido clulas aisladas, las que al crecer da
rn origen a una colonia donde todas las clu
las derivan de una misma clula aticestral. Las
colonias pueden ser individualmente repicadas
a medio lquido y all expandidas.
El segundo se fundamenta en la realizacin
de diluciones de la poblacin original, de ma
nera de obtener, con una cierta probabilidad es
tadstica, cultivos que contengan una sola clu
la, que al crecer dar origen al clon correspon
diente.
Algunas clulas del clon podran perder un
cromosoma o ms, pero permanecer viables y
continuar dividindose, con lo cual el cultivo
se transformara en biclonal o aun multiclonal.
La prdida de produccin de anticuerpos de
una lnea originalmente buena productora sue
le deberse a biclonalidad con una no produc
tora.
En la figura 37-5 puede observarse un esque
ma de la metodologa para la obtencin de hi
bridomas.
Produccin de AcMo
L a p roduccin de grandes can tid ad es de
AcMo se puede realizar tanto in vivo como in
vitro.
tn vivo, como ya se mencion, se aprovecha
la propiedad tumoral del hibiridoma para culti
varlo en un husped adecuado (habitualmente
isognico con la lnea celular); esto posibilita la
obtencin de cantidades im portantes de anti
cuerpo (1-15 mg ml-1), a partir del lquido asctico o del suero del animal portador del tu
mor.
In vitro, los anticuerpos son obtenidos del
sobrenadante de los cultivos, lo que permite la
produccin del anticuerpo monoclonal relativa
mente diluido (0,01-0,5 mg m f')- Si bien los
mtodos de produccin escapan a los alcances
de este libro, se mencionan a continuacin los
ms comnm ente usados: en la produccin a
escala de laboratorio se utilizan sistemas esta
cionarios o rotativos (roller)-, a escala de labo
ratorio e industrial existen numerosos mtodos

Hibrdomas y anticuerpos monocionaies

y sistemas tales como crecimiento de clulas en
suspensin, matrices fluidizadas, reactores de
fermentacin, cultivo sobre microcarriers; asi
mismo, pueden cultivarse clulas m antenidas
en sistemas de membranas, holow fibers, o en
matrices cermicas.
Purificacin de AcMo
Sea cual fuere el sistema de produccin utili
zado, el AcM o se obtiene contam inado con
otras protenas y componentes del m edio de
cultivo o de los fluidos biolgicos. En algunas
aplicaciones, la purificacin de los anticuerpos
se hace indispensable.
Los dos factores fundamentales en la elec
cin del mtodo de purificacin son: el uso al
cual el anticuerpo est destinado y la fuente de
obtencin del mismo.
El objetivo del esquema metodolgico elegi
do es purificar o concentrar la especie molecu
lar en consideracin, a un grado tal que se
mantengan en la preparacin final, las propie
dades o actividades deseadas mientras se elimi
nan los contaminantes indeseables.
En trminos generales, el esquema de purifi
cacin de anticuerpos monoclonales involucra
tres pasos:
1. Preparacin de la muestra. El mtodo que se
aplique en este paso debe ser com patible
con los aplicables al paso siguiente. Las tc
nicas ms utilizadas incluyen precipitacin
salina, clarificacin e intercambio de buffer
de trabajo (dilisis).
2. P urificacin principal. Los m todos ms
aplicados son los de cromatografa de afini
dad y cromatografa de intercambio inico.
3. Purificacin posterior. Suele aplicarse para
elim inar im purezas menores y preparar la
muestra para su almacenamiento. Las ms
frecuentemente usadas son filtracin en gel,
crom atoenfocado y cromatografa de inte
raccin hidrofbica.
Cabe destacarse que, si bien el esquema an
terior es de aplicacin general, se puede lograr
la purificacin de un anticuerpo m onoclonal
en un solo paso. En nuestra experiencia, la
precipitacin salina con SO^(NH4)2, seguida
por cromatografa de intercambio inico (espe
cialmente por EPLC), ha resultado de gran uti
lidad para obtener preparaciones de alta pure
za. Por otra parte, hem os logrado p u rifica r
gG 1 a partir de lquido asctico en un solo pa
so de purificacin mediante cromatoenfocado
y de lgG3 por precipitacin en buffer de baja
fuerza inica.
La metodologa antes mencionada est deta
llada en otros captulos de este libro.

787

Diferencias entre anticuerpos m onoclonales

y policlonales
Las principales diferencias entre los anti
cuerpos monoclonales y los antisueros (anti
cuerpos policlonales) derivan, bsicamente, de
que los primeros, por ser qumicamente homo
gneos, poseen las propiedades individuales de
la protena anticuerpo que lo compone, mien
tras que el antisuero tiene propiedades que son
promedio entre las de sus componentes.
La estabilidad podra constituir una desven
taja para los AcMo, ya que algunos de ellos se
inactivan rpidamente a temperatura ambiente
o no resisten la descongelacin o liofilizacin.
Tambin los hay sensibles a ciertos pH extre
mos y otros que pueden perder integridad o
reactividad al ser marcados enzimtica o isot
picamente.
Sin embargo, estos inconvenientes no son tan
frecuentes y pueden, adems, ser salvados fcil
mente mediante un anlisis que permita detectar
aquellos AcMo que cumplen con las condicio
nes predeterminadas para su utilizacin.
El anti suero, en cambio, no se ve afectado en
el campo de la estabilidad, ya que como conse
cuencia de su heterogeneidad slo una pequea
proporcin de sus componentes podr ser sen
sible a un tratamiento dado, lo que mayormente
no incidir en sus propiedades promedio.
La avidez de un antisuero es otra propiedad
promedio entre la de todos los anticuerpos que
la componen. Es suficiente que un porcentaje
muy pequeo de los anticuerpos presentes sea
de alta afinidad o avidez para que el conjunto
se comporte de esa forma. Los anticuerpos mo
noclonales, en cambio, respondern a las carac
tersticas fisicoqum icas de su nico com po
nente, el que poseer, o no, las propiedades que
de l se necesitan. Aqu, nuevamente un buen
m todo de seleccin perm itir es aislamiento
de los AcMo deseados.
Reactividad secundara. En general, los Ac
Mo no pueden ser utilizados para tcnicas de
precipitacin puesto que no pueden formarse
complejos precipitantes cuando se utilizan anti
cuerpos homogneos con antgenos m onova
lentes o bivalentes.
En cambio, los anticuerpos monoclonales s
producen complejos precipitantes cuando reac
cionan con antgenos con epitopes repetitivos.
Los anticuerpos antihapteno dan reacciones de
p recip itaci n aJ reaccio n ar con conjugados
hapteno-protena debido al carcter multiepitpico de las protenas conjugadas. Puede tam
bin lograrse la precipitacin mediante mezclas
de dos AcMo dirigidos contra determinantes
antignicos ubicados en diferentes cadenas de
un a.ntgeno o aun contra epitopes diferentes de
una misma cadena.

788

Metodologas

Culi0 ctalas
fiileiRa(HQPRT|-

CiiilBi de bazo
ratn Ifimunlzado

Fusin

Seleccin en HAT
Ensayot de
i l anticuerpos

Cultivos positivos
Clonado
Congelacin

# C lo n positivos
Reclonado

eterizacin de clones
y seleccin de variantes

Produccin
Fig. 3 7 -5 . E s q u e m a e x p e rim e n ta l d e la o b te n c i n d e h ib rid o m a s .

Especificidad. Todas las molculas de una

poblacin de anticuerpos monoclonales tienen
la misma especificidad debido a que poseen la
misma regin variable. Esta uniformidad ofre
ce la ventaja de que no existirn diferencias de
especificidad entre las distintas partidas de AcMo, como sucede con los antisueros conven
cionales.
La gran homogeneidad de estos anticuerpos
permite anlisis que no son posibles con anti
sueros debido a las reacciones cruzadas que es
tos presentan.
Los AcMo pueden exhibir reactividad cruza
da, la que en ese caso, es caracterstica de todas
las molculas y por ende no puede ser elimina
da por adsorcin sin eliminar toda la actividad
anticuerpo. La reactividad cruzada de los A c
Mo puede deberse a reacciones con un mismo
determinante antignico sobre diferentes mol
culas; a reactividad con estructuras qum ica
mente relacionadas; a reaccin con molculas
evolutivamente relacionadas o a estructuras no
relacionadas que incidentalm ente posean es
tructuras parecidas. En el caso de mezclas de
AcMo pueden darse efectos sinrgicos que mo
difiquen su reactividad.
A plicaciones
La homogeneidad y monoespecificidad de los
anticuerpos monoclonales los convierte en reac
tivos y herramientas de eleccin para una gran

variedad de propsitos, tanto para su uso in vitro

como in vivo, especialmente en el campo de los
productos teraputicos y de diagnstico.
Veamos algunas pocas de las reas donde la
aplicacin de anticuerpos monoclonales ha sido
y es de fundamental importancia.
Purificacin de protenas
Se pueden producir anticuerpos monoclona
les contra componentes minoritarios de m ez
clas complejas de protenas con slo disponer
de un mtodo de screening que permita de
tectar anticuerpos contra el antgeno deseado,
seleccionarlo y producirlo para su utilizacin
en procedimientos de purificacin, por ejem
plo, cromatografa de afinidad. De esta forma
se puede reducir a un paso la purificacin de
componentes que, de otra forma, requeran va
rios pasos de cromatografa, frecuentemente de
bajo rendimiento.
Ideiitificacin y aislamiento de clulas,
subpoblaciones y clones celulares
Es posible obtener anticuerpos monoclona
les contra antgenos de membrana que repre
senten a determinadas poblaciones o estadios
de diferenciacin celular que permitan su iden
tific ac i n , por ejem p lo , lin fo c ito s CD4+ o
CD8+. Tambin es posible detectar protenas
de membrana exclusivas de ciertos clones de

Hibridomas y anticuerpos monoclonales

linfocitos. Esos anticuerpos, denominados an
ticuerpos clonotpicos han resuhado de gran
importancia en la identificacin y caracteriza
cin de clulas T.
Deteccin de tumores
La produccin de anticuerpos monoclonales
contra protenas presentes en membrana de c
lulas tumorales pero ausentes (o expresadas en
muy baja densidad) en clulas normales, p er
mite su utilizacin para detectar la presencia de
esas clulas en un tejido u rgano o para elimi
narlas.
El uso de AcMo para la deteccin de tum o
res presenta un inmenso potencial. En efecto, la
presencia desde ciertos antgenos servira para
el diagnstico temprano. Por otra parte, anti
cuerpos marcados con radioligandos han sido
empleados para localizar tuinores primarios o
focos metastsicos en los pacientes mediante
tcnica de imgenes (scanning) de radiois
topos o por resonancia magntica nuclear.
Pueden tambin, provocar especficamente
la muerte de clulas tumorales, de forma direc
ta por lisis mediada por complemento o hacerlo
por medio de conjugacin a una toxina letal o
un radioistopo adecuado para transformar el
anticuerpo en una Inmunotoxina. Se pueden
usar toxinas de diversos orgenes, tales como
Shigella, diftrica, colrica, ricina, etc. Estas
toxinas estn formadas por 2 componentes polipeptdicos, uno portador de la accin txica y
el otro responsable de unirse a receptores celu
lares. El segundo resulta inofensivo en ausen
cia del primero. La inmunotoxina se puede pre
parar ligando la subunidad txica al anticuerpo
de manera de dirigir la toxicidad solamente ha
cia la clula blanco.
Aplicaciones bsicas
Slo mediante la cristalizacin de AcMo y
de sus complejos inmunes, ha sido posible es
tablecer con alta resolucin la estructura tridi
mensional del anticuerpo y los complejos y es
tudiar las modificaciones estructurales causa
das por mutaciones puntuales.
Resultaron fundamentales, tambin, en el es
tudio de la diversidad de los anticuerpos. As,
el anlisis de la secuencia de las regiones varia
bles de AcMo, expresadas contra un determina
do antgeno en respuesta primaria y secundaria,
fue fundamental para comprender el fenmeno
de mutacin somtica y la maduracin de la
respuesta inmune.
El estudio de anticuerpos monoclonales antiidiotpicos, permiti la diseccin de las re
giones variables de esos anticuerpos y el estu
dio de sus propiedades biolgicas.

789

Anticuerpos catalticos
La unin de un anticuerpo a su antgeno tie
ne algunas caractersticas similares a la unin
de una enzima a su sustrato. Las interacciones
son no covalentes, de alta especificidad y fre
cuentemente de alta afinidad.
El anticuerpo no altera al antgeno mientras
que la enzim a cataliza una m odificacin del
sustrato, para ello la enzima utiliza la energa
de unin para estabilizar el estado de transicin
del sustrato, reduciendo as la energa de acti
vacin para la m odificacin del sustrato. La
unin del anticuerpo puede congelar los gra
dos de libertad rotacional y translacional de un
sustrato, favoreciendo energticamente la reac
cin. De tal m anera, un anticuerpo dirig id o
contra un anlogo estable de un componente de
transicin de una determinada reaccin qum i
ca, podra actuar como enzima, catalizando la
reaccin.
El descubrimiento de tales anticuerpos cata
lticos abre un inmenso panorama de aplicacio
nes. Los anticuerpos pueden ser fabricados
especficamente para determinada aplicacin,
producidos a bajo costo y purificados fcilm en
te. Adems, se pueden obtener anticuerpos para
catalizar reacciones qumicas para las cuales no
existen enzimas.
OTROS HIBRIDOMAS
Hibridomas hbridos (iiibridomas
biespecficos) o heteroconjugados
Como ya vimos, si la clula de mieloma ex
presa cadena liviana y pesada, el hibridom a
puede expresar esas cadenas junto con las del
esplenocito. Si el mieloma fusionante es a su
vez un hibridoma productor de un anticuerpo
de determinada especificidad, la clula hbrida
producida por fusin con un linfocito B podr
fabricar molculas que expresen en un F ab el
sitio de combinacin del hibridoma parental y
en el otro brazo el sitio de combinacin del an
ticuerpo codificado por el linfocito B.
M ediante esta estrategia, Milstein y Cuello
fueron capaces de producir anticuerpos m ono
clonales biespecficos, dirigidos sim ultnea
m ente contra peroxidasa y som astotatina, lo
que les permiti la realizacin de estudios inmunohistoqumicos de deteccin tisular de la
hormona en un solo paso.
Uno de esos sistemas consiste en fusionar
clulas parentales deficientes en HGPRT, pero
que expresan TK, con otras defectivas en TK
pero que expresan HGPRT,, o a la fusin de c
lulas sensibles a HAT pero resistentes a uabana, co otras resistentes a HAT y sensibles a

790

Metodologas

uabana. En ambos casos las clulas hbridas

sern capaces de crecer en medio HAT mien
tras que las parentales no podrn hacerlo.
Hibridomas humanos
El uso de los Ac Mo en la teraputica huma
na es uno de los campos de aplicacin clnica
ms importantes en medicina.
La inyeccin de anticuerpos monoclonales
murinos con fines teraputicos en hum anos,
provoca la formacin de anticuerpos humanos
anti-anticuerpos de ratn (HAMA). Esta res
puesta conduce a una disminucin de la efecti
vidad del tratamiento con las sucesivas inocu
laciones, debido a un aumento en la velocidad
de clearence del agente teraputico y al blo
queo de la unin del anticuerpo a su antgeno.
Tambin puede generar reacciones de hipersensibiUdad.
Como consecuencia, la generacin de anti
cuerpos monoclonales humanos constituye un
campo'de gran inters. Por ello se han desarro
llado diversas estrategias para la produccin de
hibridomas humanos tales como: fusin de c
lulas humanas con mielomas de ratn; hibridi
zacin de clulas linfoides humanas con mielomas humanos; transformacin de linfocitos por
infeccin con virus de Epstein-B arr para in
mortalizar clulas productoras de anticuerpos y
la produccin de anticuerpos con caractersti
cas humanas generados por manipulacin ge
ntica por aplicacin de tcnicas de ingeniera
gentica.
H eter ohibridoms
La primera de esas estrategias, hibridizacin
interespecies (heterohibridomas), resulta ser de
escasa utilidad debido a que habitualmente los
hibridomas son inestables y se produce una r
pida segregacin de cromosomas con prdida
preferencia! de cromosomas humanos. No obs
tante se han descrito heterohibridomas estables.
Hibridomas humano-humano
La produccin de este tipo de hibridom as
presenta importantes dificultades entre las que
se pueden destacar: a) las clulas B perifricas
humanas (nicas de fcil obtencin) no son una
buena fuente de clulas productoras de anti
cuerpos, por lo que se est trabajando intensa
mente en el desarrollo de mtodos de inmuni
zacin in vitro; b) la produccin de clulas hu
manas sensibilizadas para la fusin no pueden
ser, en muchos casos, obtenidas por inmuniza
cin; c) las clulas de mieloma humano, en ge
neral, no se adaptan fcilmente al cultivo in vi
tro por largos perodos y continan secretando

sus propios anticuerpos; d) la induccin de mu

taciones para permitir la seleccin por HAT in
crementa la inestabilidad de estas clulas y e)
los hibridomas suelen producir anticuerpos s
lo en bajas cantidades.
Transformacin por virus de Epstein-Barr
Los linfocitos B humanos pueden ser trans
form ados con virus de E pstein-B arr (EVB).
Cuando los linfocitos son cultivados con el an
tgeno en presencia de EVB, algunas de las c
lulas B adquieren la capacidad de crecimiento
inmortal mientras continan produciendo el an
ticuerpo deseado. Por clonado de estas clulas
transformadas es posible obtener anticuerpos
monoclonales humanos.
Frecuentemente las lneas celulares obteni
das resultan ser pobres productoras de anticuerpos.
Anticuerpos quimricos y humanizacin
de anticuerpos
Una estrategia alternativa consiste en elimi
nar las regiones xenogeneicas del anticuerpo
monoclonal murino y reemplazarlas por estruc
turas humanas. Combinando la tecnologa de
AcMo con la ingeniera gentica se ha logrado
introducir en inmunoglobulinas humanas Va re
gin variable de anticuerpos monoclonales es
pecficos derivados de ratn, para producir de
este modo anticuerpos humanos contra el an
tgeno para el cual se inmuniz originalmente
el animal. Estos anticuerpos, denominados an
ticuerpos quimricos, estn formados por los
dominios Vj^ y V^^ murinos insertados en genes
CH y CL humanos. Son mucho menos inmunognicos en humanos que los anticuerpos muri
nos a pesar de mantener su capacidad de gene
rar respuesta anti idiotpica, respuesta que pue
de evitarse o disminuirse utilizando, en las su
cesivas inyecciones, anticuerpos quimricos de
igual especificidad pero conteniendo diferentes
isotipos.
U na form a de lograr una hum anizacin
ms completa de los anticuerpos murinos sera
in je rta r slo las reg io n es determ inantes de
complementariedad (CDR) en anticuerpos hu
manos. Por esta va se ha logrado construir an
ticuerpos contra una gran variedad de antge
nos potencialmente importantes en la salud hu
mana.
Expresin recombinante de fragmentos
de inmunoglobulinas
La expresin recombinante surgi como una
estrategia alternativa para inmortalizar clones
especficos y producir in vitro grandes cantida

Hibrdomas y anticuerpos monoclonales

des de fragmentos de anticuerpos monoclona
les. El husped elegido para los primeros inten
tos fue Escherchia coli, dadas sus ventajas ta
les como su rpido crecimiento y la disponibili
dad de muchos y diferentes vectores para el
clonado y la posterior expresin. El crecimien
to de E.coli es barato y puede ser realizado en
escala industrial con equipamiento mucho ms
simple que el requerido para la fermentacin de
clulas eucariontes. Adems presenta la ventaja
de proveer una fcil ruta para la modificacin
de los fragmentos por ingeniera gentica.
La mayor dificultad encontrada en el desa
rrollo de esta tecnologa fue la utilizacin de
sistemas de secrecin adecuados. Los primeros
intentos para producir fragmentos de inmunoglobulinas como cuerpos de inclusin intrace
lulares no fueron fructferos, dado que los pro
cedimientos de solubilizacin de los cuerpos de
inclusin, adems de tediosos, producen una
importante prdida de la actividad anticuerpo.
E sa d ific u lta d fu e so rte a d a a p a rtir del
informe, en 1988, del uso de vectores para la
secrecin de estas protenas dentro del espacio
periplsmico de la bacteria. Dicho ambiente es
favorable para el correcto plegamiento de do
minios de inmunoglobulinas, dado su carcter
oxidante, que permite la formacin del puente
disulfuro interno que es imprescindible para el
correcto plegam iento de los dominios v aria
bles. Ello facilita la secrecin del fragmento en
forma soluble, ya sea en el espacio periplsmi
co de la bacteria o en el sobrenadante de culti
vo. Este fenmeno se produce si las clulas son
inducidas por prolongados perodos, en dicho
caso la acumulacin de protena en el espacio
periplsmico junto con la lisis bacteriana pro
ducen la salida parcial del fragmento al sobre
nadante de cultivo.
De esta m anera fue posible expresar frag
mentos Fab, lo que se logr coexpresando bajo
la regulacin del mismo promotor los fragmen
tos CH,-Vjj de la cadena pesada y la cadena li
viana en el espacio periplsmico de la bacteria.
El rendimiento de estos sistemas de expresin
va de 0.5 a 5 mg/litro de cultivo.
Paralelamente surgi la necesidad de produ
cir fragmentos con actividad anticuerpo de m e
nor tamao, fundamentalmente, para mejorar la
penetrabilidad en los tejidos de fragmentos de
inm unoglobulinas potencialm ente utilizables
en tratamiento de tumores o en diagnstico por
imgenes en diversas patologas, as como para
simplificar los estudios estructurales de la inte
raccin antgeno-anticuerpo. Ello motiv la ex
presin de fragmentos E^, consistentes en heterodmeros formados por los dominios V y V ,.
Dicho heterodmero tiene esencialmente igual
constante de afinidad por el antgeno corres
pondiente que el anticuerpo del que proviene;

791

su PM es de aproxim adam ente 25 kD, y sus

componentes estn asociados en forma no co
valente.
La estabilidad del heterodm ero es p arcial
mente dependiente de la secuencia aminoacdi
ca de las regiones determ inantes de com plementariedad (CDRs), ya que estos aminocidos
participan en contactos V h^ l- Esto hace que
determinados fragmentos Fy sean muy poco es
tables como dmeros, lo que se vuelve crtico a
bajas concentraciones. P ara solucionar este
problema se dise, basado en la estructura tri
dimensional de varios Fabs y E^s, un pptido
de 15 aminocidos de composicin (Gly^Serjj
que acta de puente entre el residuo carboxiterminal de VH y el residuo N-terminal de VL.
Dicho pptido cumple la funcin de unir covalentemente los dos dominios sin alterar la es
tructura del sitio de combinacin. La estructura
resultante se denomina scF^ (Single chain
o
Fy unicatenario), tiene alta estabilidad y con
serva en general la afinidad por el antgeno,
aunque la flexibilidad que le confiere el p pti
do de unin provoca que se produzcan fenm e
nos de dimerizacin o polimerizacin parcial.
Los fragmentos Fy y scFy son expresados de
igual manera que los fragmentos recombinantes Fab, alcanzndose rendimientos que van de
0.5 a 10 mg/litro de cultivo, siendo menores en
el caso de scFVs. En todos los casos la purifi
cacin es realizada mediante cromatografa de
afinidad (fig. 37-6).
Amplificacin de ADN de dominios
variables de inmunoglobulinas
L a reacc i n en cad en a de la p o lim e ra sa
(PCR) (vase cap. 40) ha sido ampliamente u ti
lizada para el clonado de los genes que codifi
can para los fragmentos variables de inmunoglobulinas. Esta tcnica permite rpida y sim
plem ente amplificar varios millones de veces
esos genes mediante el uso de primers dege
nerados.
Un primer (Pr.) degenerado implica que di
ferentes nucletidos pueden ser encontrados en
una posicin particular en la secuencia del Pr.,
esto significa que el Pr. obtenido del sintetizador de ADN es en realidad una mezcla de va
rios Prs., con diferencias en la secuencia oligonucleotdica en una o ms posiciones. E stos
Prs. son diseados en base a secuencias conser
vadas de los extremos amino y carboxi-termina! de los fragmentos variables de las cadenas
pesada y liviana. En las posiciones donde no se
observa am inocidos conservados estos Prs.
contienen secuencias degeneradas, las que son
obtenidas agregando en esas posiciones m ez
clas de,las 4 bases nucleotdicas. Adems estos
Prs. introducen en los extrem os de los frag-

792

Metodologas
H ibridom a o linfocito B

Purificacin de AR N m

AAA A A
AR N m C adenas Pesada y Liviana

T ra nscriptasa reversa

AAAAA
TT T T T

ADN catenario

Prim ers de
Inm unoglobulinas

.lLm m

CH,

CH,

CH,

V,

.M

C.

Jj^PCR

Tstf AWiiTZi^'V-'y.

Vh

V,

F ig . 3 7 -6 . E s q u e m a e x p e rim e n ta l d e la o b te n c i n d e g e n e s q u e c o d ific a n p a ra lo s fra g m e n to s v a ria b le s d e in m u n o g lo b u

lin as.

mentos amplificados sitios de restriccin especficos. Esos sitios son utilizados para el posterior clonado de los fragm entos en diferentes
vectores mediante el uso de enzimas de restriccin (fig. 37-7).

La amplificacin puede realizarse a partir de

ARN mensajero proveniente de un hibridoma
secretor de un anticuerpo monoclonal. En di
cho caso se conoce de antemano la especificidad del anticuerpo, y se lo clona para obtener

Hibridomas y anticuerpos monoclonales

PstI

BstEII

PstI

BstEII

793

SacI

SacI

Xhol

i
CH,

BstEII

SacI

Xhol
I

w
Linker

V,

Tag

F ig . 3 7 -7 . D ia g ra m a d e v e c to re s u tiliz a d o s p a ra la e x p re s i n y s e c r e c i n d e fra g m e n to s d e in m u n o g lo b u lin a s. a ) F r a g

m e n to s F V ; b ) F ra g m e n to s F a b y c ) sc F v . C rcu lo lle n o : p ro m o to r la c z . R e c t n g u lo lle n o : ld e r P e lB p a ra la s e c r e c i n perip l sm ic a ; L in k e r: g e n p a ra el p p tid o d e u n i n e n tr e V H y V L . T a g : s e c u e n c ia n u c le o tfd ic a q u e c o d ific a p a ra u n p p tid o
u tiliz a d o p a ra la in m u n o d e te c c i n d e scF v .

SU secuencia nucleotdica y a travs de ella la

secuencia aminoacdica. Adems dichos clones
pueden ser utilizados para la expresin del
fragmento Fv del anticuerpo en sistemas procariontes o eucariontes. En este caso se parte de
un material enriquecido en copias del ARNm
especfico (ya que el hibridoma secreta en cul
tivo grandes cantidades del anticuerpo m ono
clonal). Los Prs. utilizados deben ser lo sufi
cientemente diversos como para amplificar los
fragmentos Vj, y V, del anticuerpo.
Esta metodologa ha servido tambin de base
al desarrollo de bibliotecas de expresin de
fragmentos variables de anticuerpos. En este
caso el grado de degeneracin de los Prs. utili
zados debe ser muy alta, a fin de am plificar
idealmente a todos los componentes de una po
blacin policlonal.
Fragmentos de anticuerpos y biblioteca
genmica combinatoria
Otro enfoque para solucionar las dificultades
en la produccin de anticuerpos monoclonales
hum anos , hace uso de otras estrategias de
manipulacin gentica, tal como la expresin y
seleccin de molculas de anticuerpos en bac
terifagos.
Brevemente, el ARNm de clulas B hum a
nas se convierte en ADNc y los genes de anti
cuerpos (o de sus fragmentos) se expanden por
PCR. Luego se fabrican constructos en los que
se permite la combinacin al azar de los genes
para cadenas H y L, en tndem con el gen de
un bacterifago. Esta biblioteca combinatoria
contiene una enorm e cantidad de pares H-L

que codifican para un inm enso repertorio de

anticuerpos, expresados como protenas de fu
sin en la superficie del fago. La gran cantidad
de fagos producidos por infeccin en E .coli,
pueden ser seleccionados en base a su afinidad
por el antgeno unido a una fase sUda. L os fa
gos deseados pueden ser fcilmente clonados y
el anticuerpo producido masivamente.
Tambin se han establecido bibliotecas com
binatorias a partir de ARNm, expandiendo ge
nes V,:,, V k y VX por PCR y posterior recom bi
nacin para formar constructos scF^, fusiona
dos al fago.
Se han obtenido as fragmentos especficos
para una variedad de antgenos. Con esta estra
tegia ha sido posible, tambin, producir frag
mentos Fab.
E ste tipo de estrategia tiene la ventaja que
permite el manejo de un niimero de especifici
dades muy superior al que se puede manipular
por procedimientos de screening y produce
in vitro, un fenmeno de seleccin parecido a
la maduracin de la respuesta in vivo.
El uso de fragmentos recombinantes de anti
cuerpos humanos ofrece varias ventajas sobre
los anticuerpos hum anizados . Entre otras:
son escencialmente humanos por lo que no ge
nerarn anticuerpos HAMA; el bajo costo de
produccin permite su utilizacin fuera de los
propsitos acadmicos; no requiere inm uniza
cin y rene mejores condiciones farmacocinticas para su uso teraputico.
Adems, los fragmentos se pueden clonar en
vectores de expresin que los fusionen a prote
nas, diferentes de las inmunoglobulinas, de im
portancia funcional, tales como toxinas, enzi

794

Metodologas

mas u hormonas. Esto permitir su utizacin

para el direccionamiento especfico de drogas o
toxinas hacia sus blancos.
Recientemente se ha logrado la produccin
de anticuerpos humanos especficos en respues
ta a la estimulacin antignica de ratones mani
pulados genticamente. Esto se logr insertando
elementos de los loci de cadenas pesadas y ca
denas livianas hum anas en ratones (ratones
transgnicos) en los que se elimin la produc
cin de cadenas H y L endgenas (ratones
knockout). Los ratones as modificados pue
den ser utilizados para producir anticuerpos hu
m anos contra antgenos hum anos y tam bin
empleados para la produccin de hibridom as
secretores de anticuerpos humanos. Estos ani
males pueden expresar una extensa diversifica
cin de anticuerpos y permitir la obtencin de
anticuerpos de buena afinidad. De acuerdo al
manipuleo gentico al que son sometidos pue
d en , ta m b i n p ro d u c ir cam b io de is o tip o
(switch de clase). Este hecho es importante
porque es conocido que anticuerpos de la mis
ma especificidad pueden tener diferentes efec
tos (por ejemplo: teraputico) dependiendo del
isotipo al que pertenecen.

bacterium transfiere ADN a la clula de la plan

ta donde se integra a su genoma. Luego se rege
neraron plantas que expresaban, individualmen
te, cadena pesada o cadena liviana. Las plantas
fueron luego cruzadas sexualmente para expre
sar la inmunoglobulina entera.
Los anticuerpos, obtenidos por purificacin a
partir de un homogeneizado de hojas, mantuvie
ron la reactividad y afinidad por su antgeno es
pecfico.
La produccin de anticuerpos en plantas abre
nuevas posibilidades tanto para la investigacin
bsica cuanto para la produccin en gran escala
a bajo costo. No obstante para su aplicacin
masiva, es necesario realizar una gran cantidad
de estudios previos, tales como el de la compo
sicin de carbohidratos, prolelisis, inmunogenicidad, propiedades funcionales, etctera.
PARTE EXPERIMENTAL
1.

Medios de cultivo y soluciones

Hasta aqu hemos presentado hibridotnas, ge

nerados por fusin de clulas de mieloma con
linfocitos B, capaces de producir anticuerpos.
Las clulas T pueden producir hibridomas
por fusin con clulas T neoplsicas denomina
das, tmoma, de manera equivalente a la descri
ta para clulas B.
En lugar de secretar anticuerpos, los hibrido
mas T poseen otras propiedades tales como se
crecin de linfoquinas o expresin de receptor T
especfico para un dado complejo Ag-CMH. Se
han obtenido tambin, hibridomas T con caracte
rsticas de T helper, supresores o citotxicos. Sin
embargo su uso no se ha extendido por diversas
razones inherentes al sistema y fundamentalmen
te porque se han desarrollado mtodos prcticos
de cultivo y clonado de linfocitos T.

a. Medios bsicos: los medios ms comnmen

te usados, de entre los muchos disponibles,
son: RPMI 1640. DMEM (Dulbeccos modified Egles mdium) e IMDM (Iscoves Modified Dulbeccos Mdium). Estos son me
dios bsicos que requieren ser suplementados para las distintas etapas del cultivo (pue
den contener o no C 0 jNa 2, 2 g/l).
b. Medio libre de suero: medio bsico con el
agregado de l-glutamina 3,5 x 10"^ M, piruvato sdico 1,75 x lOf M, penicilina 100 UI
m f', estreptomicina 100 g mf*. Algunos au
tores adicionan 2-mercaptoetanol 5 x 10 M,
anfotericina B 2,2 mg/1, entre otros.
c. Medio 10%: 900 ml de medio libre de suero
ms 100 ml de suero bovino fetal.
d. Medio 20%: 900 ml de medio libre de suero
ms 200 ml de suero bovino fetal.
e. M edio HT: m edio 20% ms h ipoxantina
4 X 10M y timidina 1,6 x 10-^M.
f. M edio HAT: medio HT ms aminopterina
4 x lO m

Anticuerpos producidos en plantas

M edio de congelacin

En los ltimos aos, el desarrollo de plantas

transgnicas ha alcanzado un grado tal de desa
rrollo que se puede dirigir la expresin de pro
tenas extraas tanto a un rgano de eleccin
com o a un com partim iento subcelular. Entre
ellas, se destaca la produccin de anticuerpos.
Para ello, cADN codificantes para cadenas
pesada y liviana, preparado a partir de un hibri
doma, fueron insertados en Agrobacterium tumefaciens, bacteria de probada utilidad para la
transformacin de clulas vegetales. El Agro-

Suero bovino fetal con 10% de dimetilsulfxido

(DMSO).

Hibridomas a clulas T

Solucin de agente fusgeno

P o lietilen g lico l (PEG ) 1500 50% peso/vol,
1 vol; GKN 1 vol.
GKN puede ser reemplazado por medio bsico;
algunos autores recom iendan el agregado de
DMSO al 5% final. Se puede utilizar PEG de
otros pesos moleculares.

Hibrdomas y anticuerpos monoclonales

Buffer GKN
Cloruro de sodio 8 g; CIK 0,4 g; fosfato disdico 2 H p 1,77 g; PO.H^Na 2 H p 0,69 g; G lu
cosa 2 g; rojo fenol 0,01 g; agua csp 1 litro.
Este buffer es recomendable para el lavado
de las clulas, especialm ente cuando se usa
PEG.
2. Clulas que se deben usar en la fusin
Clulas de bazo
Sacrificar el animal y extraer aspticamente
el bazo, colocarlo en un recipiente con medio
de cultivo solo o con 3% de suero (o en GKN),
R esuspender las clulas linfoides. Para esto
existen varios mtodos, aunque nosotros opta
mos por el homogeneizador de Potter pues per
mite obtener buenas suspensiones en forma r
pida y con buen rendimiento. Dejar sedimentar
los agregados celulares por 5 minutos o filtrar
por tamiz de 60-80 mallas por cm^.
Lavar las clulas 3 veces por centrifugacin
a 300-400 xg, 5 min a temperatura ambiente y
contar las clulas viables mediante la prueba de
exclusin del colorante con Azul tripn. A lgu
nos autores aconsejan lisar los eritrocitos antes
del recuento.
Clulas de mieloma
Cosechar clulas que se encuentren en fase
exponencial de crecim iento. Las clulas de
mieloma son fcilmente despegadas de la su
perficie mediante aspiracin-expulsin con pi
peta Pasteur. Para realizar la fusin, la viabihdad no debe ser menor del 80%.

795

nes adecuadas, las que varan segn el mieloma

utilizado entre 10:1 y 1:1. Centrifugar a 400 xg
5 min. Eliminar completamente el sobrenadan
te, succionando con pipeta Pasteur para evitar
la dilucin del PEG.
Colocar el tubo en un bao de agua a 37C
(resulta muy cmodo usar como recipiente para
el agua un vaso de precipitados de 250 mi) y
agregar 1 mi de PEG precalentado a 37C, agi
tando suavemente por rotacin del tubo y suave
vaivn de la pipeta, durante 1 minuto. En este
tiempo puede observarse la aglutinacin de c
lulas.
C o n tin u ar agitando durante otro m in u to .
Agregar 2 mi de medio sin suero (o GKN) du
rante 2 min, siempre con agitacin suave. A gre
gar otros 10 mi lentamente durante 6 minutos.
Centrifugar (5min, 400 xg), eliminar el so
brenadante, lavar y resuspender las clulas en
50 mi de medio selectivo (HAT). Distribuir en
no menos de 6 placas de 24 fosas y completar a
1 mi por fosa con el mismo medio (se pueden
usar placas de 96 fosas a razn de 100 (il/fosa).
Incubar en estufa de atm sfera controlada
con 5-10% de CO^ segn el medio utilizado y
95% de humedad.
A los 5 das aproximadamente puede com en
zar a observarse el crecimiento de las clulas
hbridas; al da 7 agregar 1 mi ms de m edio
selectivo.
Si
se utilizan clulas ahmentadoras, stas d e
bern ser incorporadas a la placa de cultivo 2448 horas antes de la fusin.
Se debe alim entar peridicam ente, d escar
tando 1 mi de sobrenadante y renovndolo por
1 mi de medio fresco. Despus de 2 o 3 sem a
nas, reemplazar el HAT por HT.
Otros mtodos de fusin

Clulas alimentadoras
Una de las clulas alim entadoras ms fre
cuentemente utihzadas son los macrfagos de
exudado peritoneal. Para su obtencin, inyectar
8-10 mi de buffer GKN intraperitonealmente y
retirar el lquido despus de 1-2 minutos. Lue
go lavar las clulas blancas, de las que aproxi
madamente el 75% son macrfagos, resuspen
der en HAT y distribuir en los pocilios de culti
vo a razn de aproximadamente 10^ clulas en
cada uno, 24 horas antes de la fusin. Se pue
den utilizar tambin timocitos e inclusive es
plenocitos.
Mtodo
Fusin de clulas en suspensin
Mezclar en un tubo cnico de 50 mi, las c
lulas de bazo con las de mieloma en proporcio

Existen otros mtodos de fusin, com o el

que tiene lugar sobre membranas filtrantes, v a
riantes que incluyen electrofusin y varias m o
dificaciones del protocolo descrito, que h an
mostrado ser efectivas.
2. Deteccin de anticuerpos
en el sobrenadante de cultivo
Los ensayos con sobrenadantes se realizan
cuando los cultivos alcanzan aproximadamente
70% de confluencia y despus de 2 o 3 das sin
recambio de medio.
Los m todos ms com nm ente em pleados
son: enzimoinmunomtodos, radioinm unom todos, inmunofluorescencia indirecta, aglutina
cin directa o indirecta, lisis complemento-de
pendiente, deteccin de clulas productoras de
anticuerpos (Jeme), mtodos descritos en d eta
lle en otros captulos de este libro.

796

Metodologas

3. Clonado
Por dilucin lmite
Este mtodo est especialmente indicado pa
ra cuando se obtienen pocos cultivos positivos.
Una forma de hacerlo es sembrando, en las
tres primeras filas de una placa de 96 pocilios,
un promedio de 5 'clulas por fosa, en las tres
filas siguientes 1 clula por fosa y 0,5 clulas
por fosa en las dos filas restantes.
Para ello conviene preparar 4,6 ml de una sus
pensin conteniendo 230 clulas hbridas viables
por ml en medio de cultiv con 20% SBF y dis
pensar 100 ^tl en cada una de las 36 primeras fo
sas. Al mililitro restante agregarle 4 ml de medio
y sembrar otras 36 fosas. A la suspensin rema
nente adicionarle 1 ml de medio y sembrar las
ltimas 24 fosas. Tambin pueden ser utilizadas
otras variantes de esta distribucin.
Incubar, tratando de no moverlas, por lo me
nos durante 7 das, observar al microscopio in
vertido y marcar las fosas en las que crezca un
solo clon. Los cultivos deben ser realimentados
alrededor de los das 7 y 14 con unos 100 |il de
medio. Cuando se alcance un crecimiento con
fluente, se debe tomar sobrenadante para el en
sayo de anticuerpos.
Los cultivos que conteniendo originalmente
un solo clon en crecimiento resulten positivos,
p u ed en ser e x p a n d id o s, m ie n tra s que los
biclonales o pohclonales pueden ser reclonados.
Clonado en agar semislido
Preparar una capa de agar base al 0,5% en
m edio 20% (un volum en de m edio 2X con
20% de suero fetal ms 1 volumen de agar al
1 % en agua), colocando 15 ml por placa de Petri de 10 cm de dimetro (disminuir apropiada
mente para placas de m enor tam ao) y dejar
solidificar.
Hacer distintas diluciones celulares (de 100
a 50.000 por mililitro) en tubos con medio 20%
de suero mantenidos a 40-42C y agregarles 1
volumen (1 ml) de agar 0,5% preparado en la
forma indicada arriba, mezclar y distribuir cui
dadosamente sobre la capa base.
Dejar soUdificar e incubar a 37C en incuba
dor de COj. A los 4-5 das pueden observarse
colonias microscpicas que pueden ser transfe
ridas a medio lquido en policubetas. El uso de
clulas alimentadoras es conveniente en este
paso. Norm alm ente es suficiente con repicar
una veintena de clones de cada hbrido. El repi
que se realiza con pipeta fina, Pasteur o capilar,
observando al m icroscopio invertido con el
menor aumento.
Tras 13-15 das de cultivo en agar los clones
son observables a simple vista.

Las clulas repicadas se dejan crecer lo sufi

ciente para el ensayo de los sobrenadantes.
El reclonado es aconsejable a fin de asegurar
la monoclonalidad, cualquiera que sea el mto
do utilizado.
4. Expansin de clones positivos
Los clones en crecim iento sem iconfluente
que dan reaccin positiva son expandidos gra
dualm ente, observando los lm ites de creci
miento ya mencionados, hasta alcanzar el gra
do de expansin deseado.
5. Congelacin de clulas
Centrifugar 10-10 clulas a 400 xg a 4C,
durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante y
resuspender en 1 ml de medio de congelacin;
transferir a vial de congelacin y colocarlos en
una caja de telgopor con paredes de por lo m e
nos 1 cm de espesor. Colocar en congelador de
-70C durante 24-48 horas y luego transferir
directamente a tanque de nitrgeno lquido.
Es conveniente congelar por lo menos 3 via
les de cada hibridoma.
6. Descongelacin de clulas
Descongelar tan rpidamente como se pueda
agitando el vial en bao de agua a 37"C; trans
ferir las clulas a un tubo con medio contenien
do 10% de suero, a 4C. Centrifugar, resuspen
der en medio para cultivo (20% es aconsejable
en este estadio) y transferir a 6-12 fosas de una
placa de 24 pocilios, o a frasco de cultivo de
25 cm^ de superficie.
7. Produccin de lquido asctico
Cosechar clulas de un cultivo con buen cre
cimiento, lavarlas varias veces y resuspender
en GKN e inyectar intraperitonealmente 0,5 ml
conteniendo 2 X 10*> clulas, en ratones isognicos previamente inoculados (1-9 semanas an
tes) por esa misma va con 0,5 ml de pristane
(tetrametilpentadecano).
El lquido acumulado es drenado por pun
cin peritoneal (usualm ente alrededor de 10
das luego de la inoculacin) y repetir el proce
dimiento cada 2 o 3 das hasta el sacrificio o
muerte del animal.
En lugar de ratones isognicos se pueden uti
lizar animales alognicos inmunosuprimidos.
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ELISA

38

NORBERTO W. ZWIRNER

C O N C EPT O S BSICOS
Los enzim oinm unoanlisis (EIA) o ELISA
(Enzym e-Linked Iram uno Sorbent A ssay),
descritos hace 25 aos, se basan en dos fen
menos biolgicos importantes:
1. la elevada especificidad de los anticuerpos
(Ac);
2. la alta actividad de algunas enzimas usadas
en este tipo de ensayos, lo que perm ite la
am plificacin de la seal generada por la
muestra.
Independientemente de los esquemas experi
mentales empleados, los EIA comprenden dos
etapas generales;
1 . la reaccin de un inmunorreactante con un

antgeno (Ag) o anticuerpo (Ac);

2 . la deteccin de ese inm unorreactante m e
diante la utiUzacin de un conjugado enzi
mtico.
La sencillez de los ELIA, sumada a la po
tencialidad de los anticuerpos m onoclonales
(AcMo), hace que da a da se vayan imponien
do sobre mtodos tales como aquellos basados
en la utilizacin de un trazador radiactivo (radioinmunoanlisis -RIA-), un trazador emisor
de luz (quim iolum iniscencia) o un trazador
fluorescente (fluorografa). La gran ventaja del
ELISA sobre los-otros mtodos reside en que
no requiere un equipamiento demasiado sofisti
cado para su implementacin en el laboratorio.
Adems, los reactivos empleados son de una
vida media muy alta (en el caso del RIA, un
trazador radiactivo marcado con iodo tiene una
vida media de 60 das, mientras que un conju

gado enzimtico usado en ELISA suele conser

varse en buen estado durante aos) y no se co
rre el riesgo de contaminacin producida por el
manipuleo de istopos radiactivos.
Antes de comenzar con la descripcin de los
EIA ms comunes es importante definir dos pa
rmetros ampliamente usados:
SENSIBILIDAD es el cambio en la respues
ta (dR) por cada cambio de la cantidad de reactante (dC). En un grfico de dosis-respuesta en
EIA (fig. 38-1), la sensibilidad es la pendiente
de la curva en un punto determinado. Debido a
que las curvas dosis-respuesta de los EIA en
g e n e ra l son sig m o id e a s, la s e n s ib ilid a d
(dl^dC ) no es constante. LIMITE DE DETEC
CION es la mnima cantidad de inmunorreac
tante que puede detectar el sistema.
De acuerdo a los parmetros definidos en el.
prrafo anterior, la curva roja de la figura 38-1
corresponde a un sistema con una sensibilidad
mayor que la curva azul. A pesar de ello, sta
tiene un lmite de deteccin menor que la curva
roja.
C lasificacin de los enzim oinm unoanlisis:
Los enzim oinm unoanlisis pueden clasifi
carse en:
a. EIA homogneos;
b. EIA heterogneos.
Los primeros se realizan exclusivamente en
fase lquida, mientras que en los segundos se
em plea un soporte slido para inm ovilizar a
uno de los inmunorreactantes. Por cuestiones
de sencillez y aplicabilidad general, slo nos
dedicaremos al estudio de los EIA heterog-

ELISA
Los ElA heterogneos pueden clasificarse en
dos tipos:
L enzim oinm unoanlisis de amplificacin
de actividad; y
2. enzimoinmunoanlisis de modulacin de
actividad.
En los enzim oinmunoanlisis de amplifica
cin de actividad o no competitivos (fig. 382a), se em plea un gran exceso del inm unorreactante con el objeto de obtener una seal
mxima debida a la presencia del compuesto a
ser dosado. De acuerdo a la ley de accin de
masas, un exceso de inmunorreactante permite
detectar niveles muy bajos del analito que se
quiere determinar. Estos ELISA se subdividen
de acuerdo a la molcula inmovilizada en la fa
se slida. La inmovilizacin del Ag para detec
tar Ac es un sistema que tiene una alta detectabilidad debido a que varias molculas del con
jugado enzimtico, que en este caso son Ac anti-Ig marcados con la enzima, pueden unirse a
cada molcula de Ac que reaccion con el Ag
inm ovilizado. Este efecto se traduce en una
gran amplificacin de la seal. Mediante la uti
lizacin de mtodos de puenteo inmunolgico (con Ac anti-Ig) o no inmunolgico (con el
sistema avidina-biotna o protena A) es posi
ble aumentar an ms la detectabilidad. En ge
neral, estos sistemas se denominan ELISA de
amplificacin.
Otro sistema de amplificacin de actividad
es el ELISA de captura, en el que se inmovili
za un Ac (Ac de captura), se captura Ag y se
revela su presencia con un conjugado enzim
tico anti-Ag. Este sistem a se emplea para la
cuantificacin de Ag o para la deteccin de Ac
contra el Ag capturado. En general, es desea
ble que el conjugado enzimtico y el Ac inm o
vilizado provengan de la misma especie para
evitar interferencias en el sistem a originadas
por reaccin cruzada del conjugado con el Ac
de captura.
En enzimoinmunoanlisis de modulacin de
actividad o competitivos (fig. 38-2b) se modula
la actividad del conjugado enzimtico por com
peticin con el analito. Menores cantidades del
conjugado enzimtico permiten obtener una detectabilidad mayor, ya que pequeas cantidades
del competidor tienen un gran impacto sobre la
actividad enzimtica detectada en la fase slida.
Existen dos diseos generales de ensayos de
modulacin de actividad: en uno de ellos, el li
gando m arcado con enzim a y el ligando sin
marcar que se quiere dosar se- incuban simult
neamente en el sistema; en el otro diseo, el li
gando no marcado a ser dosado se incuba en una
primera etapa y en una segunda etapa se incuba
con e! ligando marcado enzimticamente, el que

799

reaccionar con los sitios no ocupados por el li^

gando que reaccion en la primera etapa.
Independientemente de estos dos diseos g e
nerales, en ELISA de modulacin de actividad
se puede inmovilizar el Ae en la fase slida y
agregar el Ag marcado con la enzima (fig. 383a). Se observar una disminucin de la activi
dad enzim tica a medida que se compite con
cantidades crecientes de Ag libre presente en
una solucin patrn de Ag o en una m uestra
problema, siendo la concentracin de producto
coloreado formado inversamente proporcional
a la concentracin de Ag libre.
Alternativamente (fig. 38-3b) es posible in
m ovilizar el Ag y usar Ac anti-Ag m arcados
con enzima. En este caso se realiza una com pe
ticin de la unin de estos Ac al Ag inm ovili
zado, por medio de Ag libre presente en una
solucin patrn o en una m uestra problem a.
Como consecuencia de esta competicin, la ac
tividad enzimtica deteetable disminuye a m e
dida que se emplean concentraciones crecientes
de Ag libre.
Una tercera variante (fig. 38-3c) es usar el
sistema descrito en el prrafo anterior con la
diferencia de que se emplea un Ac anti-Ag sin
m arca en zim tica y en una etap a sig u ien te
agregar un conjugado anti-Ig marcado con la
enzima. Este ensayo es de modulacin y am pli
ficacin de actividad y tiene la ventaja de que
permite aumentar la detectabilidad del sistema.
En todos los ensayos inmunoenzimtieos en
fase slida, independiente de las numerosas es
trategias existentes, se pueden distinguir 3 eta
pas:
1. inmovilizacin del inmunorreactante (A c o
Ag) en la fase slida:
2. incubacin con la muestra de modo que sta
reaccione con el inmunorreactante inm ovili
zado:
3. amplificacin o modulacin por medio de la
utilizacin de un conjugado enzimtico (es
ta etapa puede en realidad ser de mas de un
paso).
Sistemas alternativos de reconocimiento:
1. Sistema A vidina-biotina
La avidina es una protena de la clara de
huevo y la estreptavidina es una protena p ro
ducida por ciertas levaduras. Ambas se caracte
riz a n p o r su e le v a d a a fin id a d por b io tin a
(K^ = 10*5 ]y-i) Debido a que la biotina es fcilinente acoplable a distintas protenas (entre
ellas, Ac y enzimas) por unin covalente sin
afectar su actividad biolgica, se han desarro
llado mtodos inmunoenzimtieos basados en
la interaccin avidina-biotna (fig. 38-4).

800

Metodologas

C u ad ro 38-1. Protena A de Staphilococcus aureus (cepa Cowan I) y reactividad

con inmunoglobulinas de distintas especies
Especie

sotipo

A finidad

++++

H um ano

IgG ,
IgG a
Ig G ,
IgG ^
IgG ,

+
++++

R a t n
F ig . 38-1. C urvas dosis (C ) - respuestas (R) tpicas obte
nidas en ensayos inniunoenzim ticos. S e p u e d e observu-

R a ta

La biotinil acin se produce por reaccin del

grupo carboxilo de la biotina con grupos -NH^
de residuos de lisina de las protenas. En gene
ral se preparan steres de liotina con grupos
qumicos separadores (spacers) que permiten
que el residuo de biotina quede en una zona ex
terna de la molcula, accesible para la reaccin
posterior con la avidina.

Es una protena de la pared de Staphococcus aureus (cepa Cowan I) que tiene alta afini
dad (K = 10* M ) por fragmentos Fe de algu-

Ig G ,
IgG ,.,
Ig G a
Ig G ,,

unido a fase slida

Inm unorreactante 2

+++

+++

+ /-

O v e ja
C a b ra

C a b a llo

++

C e rd o

++-f

C o n e jo

++++

nos isotipos de las inmunoglobulinas, los que

se detallan en el cuadro 38-1. Tiene 4 sitios de
unin pero usualmente slo reaccionan dos. Es
tas propiedades permitieron el desarrollo de di-

sm
m

i>
c
"am
mm
m
i )
m
[% *
' Inm unorreactante 1

++++

IgGj

q u e la curvii ro ja tie n e u n a m a y o r sen .sib ilid ad en la z o n a de

m a y o r p e n d ie n te (d R /d C ) q u e la c u rv a az u l. P o r su p a rte ,
s ta tie n e u n lm ite d e d e te c c i n m e n o r q u e la c u rv a ro ja.

2. Protena A

IgG 2.
lg G ,

+-I--I-+

Inm unorreactante unido a fase slida

Inm unorreactante com petidor

co n ju g a d o
enzim tico

C onjugado enzim tico

b
Fig. 38-2. C lasificacin general de los ensayos inn iu n oen zim ticos heterogneos, a) E L ISA de am plificacin de a c
tividad. E n e s te tip o d e e n s a y o s , u n e x c e s o d e l in m u n o r re a c ta n te 2 (az u l) r e a c c io n a c o n el in m u n o rre a c ta n te 1 in m o v iliz a
d o en la fa s e s lid a (ro jo ). L u e g o d e la e ta p a d e la v a d o , el in m u n o rre a c ta n te 2 q u e re a c c io n se p o n e e n e v id e n c ia al e n
fre n ta rlo c o n u n e x c e s o del c o n ju g a d o e n z im tic o (v e rd e y ro sa ), b. E L ISA de m odulacin de actividad. E n e s te tip o d e
e n s a y o s , el in m u n o rre a c ta n te c o m p e tid o r (a z u l) y el c o n ju g a d o e n z im tic o (az u l y ro sa ) c o m p ite n p o r la u n i n al i n m u n o
rre a c ta n te in m o v iliz a d o e n la fa s e s lid a (ro jo ).

ELISA

801

'%f

Anticuerpo de captura

A ntgeno a ser capturado

A ntgeno unido a fase slida

A ntg e n o com pe tid o r soluble

%
% C onjugado anticuerpo-enzinia

C onjugado antgeno-enzirm a

Fig. 38 -3. V arian tes d el E L IS A d e m od ulacin de

actividad, a) E L ISA de com peticin usando A g m a r
cado con enzim a. E n e s te e n s a y o se ia c e u n a c o m p e ti

c i n e n tre el A g p re s e n te en u n a so lu c i n p atr n o e n
u n a m u e s tra p ro b le m a (ro jo ) y el A g m in e a d o c o n u n a
e n z im a (ro jo y v e rd e ) p o r el A c in m o v iliz a d o en la fa s e
s lid a (a z u l), b) E LISA de com peticin usando A c es
p ecficos m arcad os con en zim a. E n e s ta v a ria n te se
re a liz a u n a c o m p e tic i n e n tre el A g in m o v iliz a d o en la
fa s e s lid a (ro jo ) y A g en fa s e liq u id a (y a se a en u n a s o
lu c i n p a tr n o e n u n a m u e s tra p ro b le m a ; ro jo ) c o n A c
e s p e c fic o s d e A g m a rc a d o s c o n e n z im a (azul y ro sa ),

V,

' .i

<

c) FX ISA de com peticin usando A c especficos sin

m arca enzim tica. E s ta v a ria n te es s e m e ja n te a la a n
te rio r c o n la d ife re n c ia d e q u e los A c e sp e c fic o s (a z u l)
q u e re a c c io n a ro n c o n el A g in m o v iliz a d o en la fa s e s
lid a (ro jo ) se re v e la n e n u n a e ta p a p o s te rio r m e d ia n te la
u tiliz a c i n d e u n c o n ju g a d o e n z im tic o a n ti-in m u n o g lo b u lin a s e s p e c ie -e s p e c fic o (v io le ta y ro sa ).

i,

'

-V '

' 4'
V_

m*

1
*-

A .,

S__ /

*
^

/
m m
-

I iJ
Fig. 38-4. E n sayo inm u n oen zim tico m ediante la u ti
lizacin d el sistem a a vid in a -b iotin a. E l i n m u n o r re a c
ta n te 2 (a z u l) m a rc a d o c o n b io tin a (v io le ta ) re a c c io n a en
u n a p rim e ra e ta p a c o n el in m u n o r re a c ta n te 1 in m o v iliz a
do en la fa s e s lid a (ro jo ). P o s te rio rm e n te , el s is te m a se
re v e la m e d ia n te la u tiliz a c i n d e u n c o itju g a d o de a v id in a
c o n e n z im a (v e rd e y ro sa ).

, Inm unorreactante 1
unido a fa se slida

' Biotina

'<
Inm unorreactante 2

Inm unorreactante 2
Im a rc a d o con b io tin a

'i> C onjugado
O avidina-enzim a

802

Metodologas

C uadro 38-2. Requisitos que deben reunir

las enzimas para ser utilizadas en ensayos
inmunoenzimtieos
1. D e b e n se r e s ta b le s d u ra n te su a im a c e n a m ie n to , y a
se a lib re s o c o n ju g a d a s .
2. D e b e n se r d e f c il p re p a ra c i n , o b te n e rs e c o n e le
v a d a p u r e z a y b a jo c o sto .
3. L a a c d v id a d e n z im tic a d e b e se r a lta , y a se a c o m o
e n z im a lib re o c o m o e n z im a c o n ju g a d a .
4. L a a c tiv id a d e n z im tic a d e b e s e r f c ilm e n te d e te c tab le .
5. D e b e n se r c o m p a tib le s c o n la s c o n d ic io n e s d e l e n
sa y o (pH , fu e rz a i n ic a , c o m p o s ic i n d e lo s b u f
fe rs , etc.).
6. D e b e n p o s e e r g ru p o s q u m ic o s r e a c d v o s p a ra la
c o n ju g a c i n .
7. D e b e n s e r f c ilm e n te c o n ju g a b le s a a n tic u e rp o s u
o tro s s is te m a s d e d e te c c i n .
8. L a e n z im a del c o n ju g a d o n o d e b e e s ta r p re s e n te en
el c o m p o n e n te q u e se fija r a la fa s e s lid a .

mezclas de sustratos y compuestos cromogni

cos, los que deben reunir ciertos requisitos
(cuadro 38-3).
En general, los tiempos de incubacin con
los sustratos varan entre 10 y 30 minutos, por
lo que en EIA no se miden velocidades inicia
les de la actividad enzimtica. Las reacciones
enzim a-sustrato se detienen por agregado de
cidos o bases, los que producen un efecto batocrmico o hipsocrmico del mximo de ab
sorbancia, con el consiguiente aum ento del
coeficiente de extincin molar.
1. Peroxidasa
Las p ero x id a sa s son h em o p ro ten as que
transfieren hidrgeno desde un donante (DH)
al HjOj. La reaccin catalizada puede escribir
se como
2 DH + H ,0 , ^ 2 H ,0 + 2 D

versos tipos de ensayos inm unoenzim tieos

eon protena A (fig. 38-5).
E nzim as utilizadas en ensayos
inm unoenzim tieos
Toda enzima a ser utilizada en ensayos inmunoenzimticos debe reunir ciertos requisi
tos, los que se mencionan en el cuadro 38-2.
Los factores mencionados en el cuadro 38-2
hacen que la peroxidasa y la fosfatasa alcalina
sean las dos enzimas ms ampliamente utiliza
das en estos ensayos, a pesar de que la fosfata
sa alcalina es una enzima que tiene tendencia a
la polimerizacin, lo que dificulta el proceso de
conjugacin. Desde hace unos aos se ha di
fundido el uso de la ureasa debido a una serie
de caractersticas que se comentan ms adelan
te. Otras enzimas usadas en EIA son p-galactosidasa y glucosa-oxidasa.
Por otra parte, para la etapa del revelado del
ELISA se emplean sustratos crom ognicos o

C u ad ro 38-3. Condiciones que deben reu

nir los sustratos o compuestos cromogni
cos para ser utilizadas en ensayos inmunoenzimticos
1. D e b e n se r s o lu b le s en a g u a , in c o lo ro s, in o d o ro s y
n o t x ic o s.
2. E l p ro d u c to f o rm a d o d e b e p o s e e r u n a lto c o e fic ie n
te d e e x tin c i n m o la r, c o n u n m x im o d e a b s o rb a n
c ia e n tre 4 0 0 y 6 0 0 nm .
3. D e b e n se r e s ta b le s al a lm a c e n a m ie n to y lu e g o d e la
d e te n c i n d e la re a c c i n e n z im tic a .
4 . N o d e b e n se r fo to s e n s ib le s.
5. D e b e h a b e r u n a m p lio ra n g o d e lin e a lid a d e n tre el
c o lo r fo rm a d o y la c o n c e n tra c i n d e e n z im a .

(1)

La peroxidasa ms utilizada en enzimoinmunoensayos se obtiene del rabanito (horseradish

peroxidase o HRP), con un alto contenido en
hidratos de carbono, lo que facilita la reaccin
de conjugacin a anticuerpos. Es una enzima
sensible a la azida sdica (se inhibe con con
centraciones superiores a lO'^M), compuesto
habitualmente utihzado en diversas soluciones
diluyentes de los EIA.
En la etapa de revelado de los EIA se suelen
utilizar donantes de H de tal manera que el cromgeno o producto formado (D en la ecuacin
1) sea soluble y cuantificable por espectrofotom etra. Entre estos donantes de H podem os
mencionar el 2,2-azino-di-(3-etil-benzotiazohna)-6-sulfonato de diamonio (ABTS), que es
incoloro, con un mximo de absorbancia a 340
nm, mientras que el producto oxidado formado
tene un mximo de absorbancia a 414 nm.
Un crom geno am pliam ente utilizad o en
ELISA es la 3-metif-2-benzotiazolinona hidrazona (MBTH), que una vez oxidado reacciona
con el cid o 3 -(d im e tila m in o ) b e n z o ic o
(DMAB) produciendo un acoplamiento oxidativo. A s se forma una indamina catinica de
color azul-prpura y con un mximo de absor
cin a 590 nm. Este sistema de deteccin tiene
una elevada detectabilidad y la ventaja de que
es uno de los pocos que utifizan cromgenos
no carcinognicos. Sin embargo, en determina
dos casos, el MBTH-DMAB tiende a dar colo
res basales altos.
Otro cromgeno muy usado es la oro-fenilendiamina (OPD) o 1,2-bencenodiamina. Su
producto oxidado coloreado tienen mximo de
absorbancia a 492 nm. Tiene la ventaja de ser
un cromgeno que permite tener una detectabi
lidad elevada. Sin embargo, es un compuesto

ELISA
carcinognico, en determinados sistemas tiende
a dar coloracin basal significativa y es foto
sensible, por lo que hay que almacenarlo en la
oscuridad y prepararlo en el momento de usar.
Sustratos menos empleados son el cido 5-amino-saliclico, el 3-amino-9-etilearbazol, la ortodanisidina y la oro-toluidina.
2. Fosfatasa alcalina
Las fosfatasas alcalinas utilizadas en E lA se
aslan a partir de intestino bovino o de Escherichia coli. Estas enzimas hidrolizan una amplia
gama de steres de fosfatos, tales como las de
alcoholes prim arios, secundarios, fenoles y
aminas, tienen un pH ptimo alcalino (por lo
que se emplean buffers a base de dietanolamina con pH cercano a 9) y requieren de M g y
Zn como cofactores. El sustrato ms am plia
mente usado para la fosfatasa alcalina en los
EIA es el para-nitrofenilfosfato (p-NPP). Tiene
la ventaja de sufrir un bajo nivel de hidrlisis
espontnea, es soluble en soluciones acuosas y
su producto de hidrlisis (p-nitrofenol) absorbe
intensamente a 405 nm.
3. Ureas a
Es una enzim a que se est em pleando en
ElA para establecer el punto final de una titula
cin por determinacin visual. La reaccin ca
talizada por la enzim a es la hidrlisis de la
urea, con formacin de CO^ y NHj. La activi
dad enzimtica de la ureasa produce un cambio
de pH en el medio que, en presencia de prpura
de bromocresol, se visualiza como un viraje del
color de) indicador de amarillo a prpura, por
lo que no se requiere de un espectrofotmetro
para cuantificar la actividad enzim tica. Sin
embargo, debido a la inestabilidad de la ureasa,
su uso es restringido.

803

Cuadro 38-4. Caractersticas de un buen

conjugado enzimtico
1. D e b e te n e r u n a c o m p o s ic i n d e fin id a y h o m o g n e a .
2. D e b e o b te n e rs e sin p rd id a d e la a c tiv id a d e n z im
t ic a d e b id o al p r o c e s o d e c o n ju g a c i n ,
3. D e b e s e r a lta m e n te e s ta b le al a lm a c e n a m ie n to p o r
p e ro d o s p ro lo n g a d o s ,
4. D e d e s e r e c o n m ic o , r p id o y fcil d e p rep a ra r,
5. E l p ro c e d im ie n to d e c o n ju g a c i n d e b e c o n d u c ir a
u n a lto re n d im ie n to e n c o n ju g a d o y un b a jo r e n d i
m ie n to en h o m o p o lm e ro s d e A c y /o en zim a.
6. E l p ro c e d im ie n to d e s e p a ra c i n d e l c o n ju g a d o d e
las e s p e c ie s n o m a rc a d o s (A c y e n z im a ) d eb e s e r
s e n c illo .

obtener conjugados con una relacin enzima:anticuerpo lo ms alta posible, sin que se vea afec
tada la actividad enzimtica ni la capacidad de
unin del anticuerpo o antgeno marcados.
Existen dos mtodos generales de conjuga
cin. El primero comprende una conjugacin
qumica con formacin de uniones covalentes
entre la enzima y el anticuerpo, ya sea entre las
cadenas polipeptdicas de ambos reactantes o
entre las cadenas laterales de oligosacridos (si
los reactantes son glucoprotenas).
El segundo mtodo de conjugacin se d eno
mina conjugacin inmunolgica (fig. 38-6) y se
basa en la reaccin de un anticuerpo anti-enzima y la enzima sin afectar la actividad catalti
ca de la misma. E ste com plejo enzim a-anticuerpo es luego ligado al anticuerpo que reac
cion con su Ag (unido a fase slida) por m e
dio de anticuerpos anti-inmunoglobulinas esp e
cie-especficas. Este mtodo de conjugacin
slo se emplea en ensayos de amplificacin de
actividad y tiene una detectabilidad unas 100
veces superior a la obtenida mediante la utiliza
cin de conjugados qumicos.
I. Conjugacin qumica

Preparacin de conjugados enzimticos

En la prctica es posible preparar conjuga
dos enzimticos de anticuerpos o de antgenos.
Independientem en te de la m olcula que se
marque con la enzima, un buen conjugado debe
reunir una serie de caractersticas, las que se
detallan en el cuadro 38-4
En realidad, ninguno de los procedimientos
de conjugacin actualmente existentes permite
obtener un conjugado con todas esas caracters
ticas. Por ello, hay que seleccionar muy bien el
procedim iento de conjugacin, teniendo en
cuenta, entre otros factores, las caractersticas
de la enzima que se desea conjugar.
Dado que los EIA tienen como objetivo gene
ral la amplificacin de la seal generada por el
componente que se desea dosar, es importante

La intencin de los mtodos de conjugacin

qumica es lograr un conjugado con una re la
cin enzima-anticuerpo elevada, para lo cual se
parte de altas concentraciones de los reactantes,
lo que en muchos casos conduce a la formacin
de polm eros y agregados inactivos desde el
punto de vista inmunolgico y enzimtico. El
problema de la presencia de estos polmeros es
que compiten por el Ag reconocido por el an ti
cuerpo que se us para la preparacin del co n
jugado cuando se realiza el ensayo inmunoenzimtico. Por otro lado, concentraciones de en
zima y anticuerpo bajas tienden a favorecer la
reaccin de conjugacin intramolecular por so
bre la conjugacin intermolecular. Como co n
secuencia, se obtiene un producto de menor ca
lidad.

804

Metodologas

t i

'H

J_

...

>*

; i

1 ^
1 Protena A

Fig. 38-5. Protena A de Sta p h ilo co ccu s a u reu s (ce

pa C owan I) en ensayos inm unoenzim ticos. a) P or
inm ovilizacin de protena A en la fase slida. E s te
tip o d e e n s a y o s p e rm ite c a p tu ra r e s p e c fic a m e n te d is
tin ta s in m u n o g lo b u lin a s s ric a s p o r su p o rc i n F e ( ro
jo ) p a ra lu e g o ca p tu rir A g (az u l) y r e v e la r su p re s e n c ia
m e d ia n te la u tiliz a c i n d e A c e s p e c fic o s m a rc a d o s c o n
e n z im a (v e rd e y ro sa ), b) P or em pleo de protena A
m arcad a con en zim a com o tra za d o r. E s te t ip o d e
E L IS A p e rm ite r e v e la r la p re s e n c ia d e A c e s p e c fic o s
(a z u l) d e A g in m o v iliz a d o en la fase s lid a (ro jo ).

C onjugado protena A -enzim a

Con el objeto de favorecer las interacciones

enzima-anticuerpo y minimizar las interaccio
nes enzima-enzima y anticuerpo-anticuerpo, el
pH del buffer usado durante la conjugacin
es de importancia crucial. Debe estar entre el pl
de la enzima y del anticuerpo, ya que de esa
manera ambos reactantes tienen cargas opues
tas y las molculas de enzima y anticuerpo se
atraern entre s, favoreciendo la reaccin de
conjugacin.

Los agentes qumicos que permiten la unin

del anticuerpo a la enzima son agentes homobifuncionales (en los que los grupos qum icos
reactivos son iguales) o heterobifuncionales (en
los que los grupos qumicos reactivos son dis
tintos).
Los procedimientos de conjugacin qumica
se pueden realizar en una o dos etapas. En el
primer caso se hace reaccionar directamente el
Ac con la enzima, utilizando diversos agentes

ELISA

A nticuerpo
anti-enzim a

805

Enzim a
C om p lejo enzim aantl-enzim a

T
Ac unido
al A g en
fase slida

A c de
puenteo

C om plejo enzim aanti-enzim a

Fig. 38-6. C onjugacin in m u n olgica y utilizacin d el conjugado en ensayos inm u n oen zim ticos. E n u n a p r im e r a
e ta p a se fo rm a n los c o m p le jo s e n z im a -a n ti-e n z ira a p o r re a c c i n e n tre la e n z im a (a m a rillo ) y A c e s p e c fic o s (az u l)' P o s t e
rio rm e n te , e s to s c o m p le jo s so n u tiliz a d o s p a ra r e v e la r la p r e s e n c ia d e A c e s p e c fic o s (a z u l) d e u n A g in m o v iliz a d o e n la
f a s e s lid a (v e rd e ) p o r fo rm a c i n d e p u e n te co n A c a n ti- in m u n o g lo b u lin a s e s p e c ie -e s p e c fic a s (ro jo ).

qumicos bifuncionales. Estos mtodos tienden

a generar un elevado porcentaje de homopolmeros, por lo que los mtodos que se realizan
en dos etapas resultan mas apropiados. En s
tos se activa una de las macromolculas (en ge
neral, la enzima) hacindola reaccionar con el
agente bifuncional. En una segunda fase la en
zima activada se conjuga al anticuerpo. Si bien
existen numerosos reactivos qumicos usados
en este tipo de conjugaciones, se utiliza habi
tualmente el glutaraldehdo y el periodato de
sodio.
El glutaraldehdo es el agente qumico homobifuncional ms ampliamente usado para es
te tipo de conjugaciones. Reacciona en forma
irreversible con los grupos e-NH2 de las lisinas
de las protenas, lo que se ve favorecido a pH
superiores a 7. Existen numerosos protocolos
que varan en la concentracin de glutaraldeh
do empleada, el tiempo y la temperatura de in
cubacin.
La conjugacin se puede realizar en un paso
(ins apropiado para unir fosfatasa alcalina a
anticuerpos) o en dos pasos (ms apropiado p a
ra unir peroxidasa a IgG o a fragmentos Fab).
La conjugacin en dos etapas presenta la venta
ja de que se trabaja en condiciones ms contro
ladas y se genera menor cantidad de productos
no deseados (tales como conjugados Ac-Ac),
ya que se realiza una primera reaccin de la en

zima con el glutaraldehdo, se elimina el exce

so de glutaraldehdo y se enfrenta la enzima ac
tivada con el Ac para permitir la unin de am
bos reactivos.
El uso de agentes heterobifuncionales tiene
la ventaja de que permite realizar la reaccin de
conjugacin en forma secuencial y en co n d i
ciones ms controladas, ya que cada grupo qu
mico reactivo reacciona con la macromolcula
en condiciones diferentes. En general, se em
plean derivados de la maleiimida, pero los co n
jugados obtenidos no son tan estables como los
obtenidos por otros mtodos.
La conjugacin qumica con periodato de so
dio es ltil para la conjugacin de glucoprotenas en general y ampliamente empleado para la
unin de peroxidasa a IgG. Este mtodo produ
ce un conjugado con un rendimiento 3 a 4 ve
ces superior y una detectabilidad 5 veces su p e
rior a la obtenida por conjugacin con glutaral
dehdo. Sin embargo, cierto porcentaje de la
enzim a se inactiva. En este mtodo, los re s i
duos hidrocardonados de la enzima se oxidan
inicialmente con m-NalO^, produciendo grupos
aldehido y carboxilo. Los primeros forman lu e
go una base de Schiff con grupos e-NH^ libres
no protonados de la IgG (o de protena A,
es
que se conjuga esta protena) y por reduccin
con NaBH^ se estabilizan los aductos am inocarbonilo formados. Este mtodo optim izado

806

Metodologas

pernite conjugar hasta un 90% de la peroxida

sa y se conserva un 90% de la actividad enziintica. La mayora de las molculas de IgG se
conjugan con una molcula de peroxidasa, pero
un bajo nmero de molculas de conjugado po
seen una relacin enzim a:anticuerpo de 2 o
ms. La etapa final del proceso de conjugacin
qumica comprende la separacin de la enzima
y del anticuerpo no conjugados. Esto se logra
por precipitacin con (NH^^^SO^ al 33% de sa
turacin (con lo que se separa la peroxidasa li
bre), cro m ato g rafa de in terca m b io inico
(DEAE-celulosa) y crom atografa de afinidad
por columnas con concanavalina A inmoviliza
da en hi matriz slida (con lo que se separa la
IgG libre de las molculas del conjugado, el
que es especficamente retenido en la columna
y posteriormente eluido).
2. Conjugacin inmunolgica
Debido a que en la mayora de los casos, la
actividad de las enzim as no se altera por su
unin a un Ac, es posible formar complejos in
munes enzima-anti-enzima y utilizarlos como
trazador en reacciones inmunoenzimticas (fig.
38.6). Ello se logra mediante un puenteo entre
el complejo inmune enzim a-anti-enzim a y la
inm unoglobulina a revelar, por medio de Ac
anti-inmunoglobulinas especie-especficos. E s
te mtodo presenta la ventaja de evitar la habi
tual inactivacin de las m olculas de enzima
y/o de anticuerpo durante los procesos de con
jugacin qumica, reduce la coloracin basal y
aumenta la detectabilidad.
En lneas generales, existen dos metodolo
gas para la utilizacin de conjugados inmunolgicos. En una de ellas, se adiciona en forma
secuencial el Ac anti-inmunoglobulinas, el Ac
anti-enzima y la enzima. Este esquema de tra
bajo presenta la desventaja de que se debe tra
bajar con los Ac anti-enzima purificados por
inmunoafinidad ya que, si se utUiza suero ente
ro, la fraccin y-globulina entera o la IgG total
anti-enzima habr una elevada reactividad de
los Ac anti-inmunoglobulinas con y-globulina
espuria (no especfica para la enzima).
En la otra metodologa, los Ac anti-enzima
reaccionan con la enzima, formando los com
plejos antes de ser utilizados en el ensayo y
presenta la ventaja de no requerir la purifica
cin de los Ac especficos de enzima para su
realizacin. Esta segunda m etodologa se ha
optimizado para la deteccin de inmunoglobu
linas de distintas especies con peroxidasa (m
todo peroxidasa-anti-peroxidasa o PAP) o
con fosfatasa alcalina (mtodo fosfatasa alcalina-anti-fosfatasa alcalina o APAAP). Para el
caso del PAP, los complejos peroxidasa-antiperoxidasa se preparan incubando una relacin

ptima de suero especfico y enzima. El preci

pitado (complejos inmunes) se separa por cen
trifugacin, se lava y se redisuelve por leve aci
dificacin y adicin de un exceso de enzima,
de modo de formar complejos inmunes solu
bles en exceso de Ag, los que se pueden alma
cenar durante aos a -20C en glicerol al 50%.
T am bin se han desarrollado m todos de
puenteo inmunolgico mediante la utilizacin
de AcMo anti-enzima, pero debido a que stos
en su mayora reconocen epitopes no repetidos
sobre la molcula de la enzima, el tamao de
los complejos formados es pequeo y no se al
canza una detectabilidad tan elevada como en
el caso del uso de sueros policlonales anti-enzi
ma.
Inmovilizacin de inmunorreactantes
en fase slida
La facilidad con que es posible separar el Ac
(o Ag) unido del libre (por simple aspiracin o
decantacin) cuando el complejo Ag-Ac est
inm ovilizado en fase slida ha contribuido a
aumentar la popularidad de los ElA. Sin em
bargo, las superficies a ser utilizadas en este ti
po de ensayos deben reunir ciertas caractersti
cas, tales como la alta capacidad de unin de
inmunorreactantes (fases slidas con una rela
cin superficie/volum en elevada), deben ser
capaces de inmovilizar diversos inm unorreac
tantes, debe producirse una desorcin mnima y
desnaturalizacin despreciable de la molcula
inmoviUzada durante los ensayos.
Si
bien existen numerosos soportes slidos
utilizados en EIA, tales como agarosa, celulo
sa, dextrn, vidrio, nitrocelulosa, etc., se ha im
puesto el uso de distintos plsticos debido a la
facilidad de operacin con este material. La
forma de las superficies plsticas para ELISA
es variable: esferas, discos, tubos o placas (policubetas) de fondo plano, en U o en V. Los
plsticos que han resultado mas aptos para la
fabricacin de placas de ELISA son el poliestireno y el cloruro de polivinilo (PVC). El poli
propileno ha resultado igualmente til para la
fabricacin de tubos para ELISA. Sin embargo,
la utilizacin de tubos en EIA presenta la des
ventaja de que requiere volm enes relativ a
mente grandes de muestras para las incubacio
nes (aproximadamente 1 mi). Adems, la utili
zacin de policubetas de poliestireno o PVC ha
facilitado la automatizacin de las tcnicas, ya
que se dispone hoy en da de equipos que reahzan lavados, dispensado de reactivos y lecturas
de absorbancias directamente en las placas, lo ,
que representa una enorme simplificacin de la
tcnica.
La inm ovilizacin del inmunorreactante en
fase slida puede ser covalente o no covalente.

ELISA
La primera se emplea generalmente en los ca
sos en los que la inmovilizacin por simple ad
sorcin no es eficiente (ya sea porque el inm u
norreactante no se adsorbe bien o porque se de
so rb e d u ra n te las e ta p a s p o s te rio re s del
ELISA). Para el caso de la unin no covalente,
la naturaleza de la interaccin inmunorreactante-plstico es principalmente hidrofbica y de
pende de la carga del inmunorreactante. Existe
cierto grado de desorcin a lo largo del ensayo,
la que debe ser minimizada. Por ello es necesa
rio usar el inmunorreactante a una concentra
cin apropiada y lavar en forma intensiva luego
de cada etapa del EIA. La adsorcin a la fase
slida se puede describir de acuerdo con la
ecuacin de Langmuir, propuesta para describir
la adsorcin de una monocapa de gas sobre un
shdo:
1/m = 1/b -I- l/(bKc)

(2)

donde m es la cantidad de inm unorreactante

adsorbida a la fase slida, b es la mxima can
tidad de inmunorreactante que puede adsorber
se al plstico, K es la constante de afinidad del
inmunorreactante por la superficie slida y c es
la concentracin de inm unorreactante en fase
lquida. Mediante esta ecuacin es posible cal
cular la constante de afinidad K a partir de da
tos experimentales.
Debido a la naturaleza de la interaccin entre
el inmunorreactante y la fase slida es posible
que ciertos antgenos se inmovilicen preferencialmente por determinadas regiones de la mo
lcula (porciones hidrofbicas). De este modo
existe la posibilidad de que algunos epitopes
queden ocultos o enm ascarados, con lo que
pueden surgir dos inconvenientes. Por un lado
puede ocurrir que esos epitopes no puedan ser
detectados por Ac especficos. Por otro lado, es
posible que no puedan evidenciarse Ac espec
ficos contra esos epitopes en sueros a analizar.
Para el caso de la inmovilizacin de Ac de
captura, se ha demostrado que slo de un 3 a
10% de los sitios de unin permanecen funcio
nales luego de la adsorcin pasiva al pohestireno, segn se inm ovilicen Ac monoclonales o
polielonales. Si la inm ovilizacin del Ac de
captura se realiza mediante la utilizacin de Ac
anti-inmunoglobulinas unidos a la fase slida
o, si se inmovilizan Ac mareados con biotina
por unin a avidina adsorbida a la fase slida,
se preserva ms de un 70% de los paratopes del
Ac de captura. As, hay evidencias de que la
adsorcin al poiiestireno produce gran desnatu
ralizacin de algunas macromolculas inm ovi
lizadas, con la consiguiente prdida de su funcionahdad. Para el caso de la adsorcin pasiva
de Ac polielonales se ha detectado tambin una
prdida de la avidez.

807

La m xim a cantidad de inm unorreactante

que se puede adsorber a la fase slida se d eno
mina capacidad de saturacin de la placa.
Por debajo de este valor hay una relacin lineal
entre la concentracin de inmunorreactante en
fase lquida y la cantidad de ste que se adsor
be a la fase slida (ver ecuacin 2). Ese valor
est en el orden de 1 a 10 |ig/ml para una am
plia variedad de Ag y Ac, siendo independiente
del peso molecular del inmunorreactante. Sin
embargo, el porcentaje de inmunorreactante fi
jado a la fase slida es variable y propio para
cada uno. Por encima de ese valor de satura
cin comienza a observarse adsorcin en multicapas, lo que puede interferir en etapas poste
riores del EIA. En el caso de la inmovilizacin
de mezclas antignicas a concentraciones que
estn por encima de la capacidad de saturacin
de la placa pueden manifestarse fenmenos de
com petencia entre las molculas de Ag de la
mezcla por los sitios de la placa, que son los li
mitantes en la interaccin.
En la prctica se dispone de dos mtodos para
calcular la capacidad de saturacin de la placa.
Uno de estos mtodos consiste en adsorber dis
tintas concentraciones de un Ag marcado con un
istopo radiactivo y medir la radiactividad en
las fosas de la placa luego de la etapa de adsor
cin. El otro mtodo consiste en adsorber distin
tas concentraciones de un Ag no marcado y, en
una etapa posterior, adsorber una cantidad cons
tante y saturante de peroxidasa a los sitios no
ocupados (mtodo de la saturacin con peroxi
dasa). La actividad enzimtica detectada ser in
versamente proporcional a la cantidad de Ag in
movilizado. Este mtodo tiene la ventaja de que
no requiere el empleo de istopos radiactivos.
De acuerdo a las caractersticas de a d so r
cin, es posible distinguir dos clases de placas:
las que poseen una baja capacidad de unin de
Ag y las que poseen una alta capacidad de
unin de Ag.
Los factores ms importantes en el proceso
de adsorcin de inmunorreactantes a fases sli
das son la temperatura, el tiempo, el pH y la
concentracin. En general, el proceso de unin
a fase slida se realiza incubando toda la noche
a 4C o una hora a 37C. La concentracin p ti
ma para la sensibilizacin de placas de ELISA
est entre 1 y 10 |ig/ml para Ag o Ac puros o
10 a 100 ng/ml para mezclas antignicas co m
plejas. Los inmunorreactantes se diluyen h a b i
tualmente en una solucin isotnica tamponada
de N aCl 0,15M y fosfatos 0 ,0 IM , pH = 7,4
(PBS) o en un buffer carbonato de sodio - b i
carbonato de sodio 0,1M, pH = 9,6. Debido a la
naturaleza de la interaccin, la presencia de d e
tergentes no-inicos o inicos en la solucin
del inmunoiTeactante a unir a la fase slida in
terfiere en la etapa de unin a la misma.

808

Metodologas

En determinados casos se hace necesaria la

unin covalente de ciertos inmunorreactantes a
las fases slidas plsticas. Tal es el caso de la
unin de ADN nativo, haptenos, oligopptidos
pequeos o Ag que se unen con muy baja afini
dad al plstico. El pretratamiento del plstico
con glutaraldehdo permite la unin covalente
de Ag con grupos amino libres. La inmovihzacin de componentes con alta afinidad por el
plstico, marcados con molculas que hagan
puenteo, es un artificio que permite la inmovili
zacin de Ag que se unen con muy baja afini
dad a la superficie slida. Estas molculas que
hacen el puenteo son las mismas que se utilizan
para el acoplamiento covalente de las enzimas a
los Ac. El ADN nativo se inmoviliza por pretra
tamiento del plstico con sustancias policatinicas, tales como la protamina o la polilisina.
Tambin es posible inmovilizar clulas ente
ras, para lo que se realiza un pretratamiento de
las placas de ELISA con polilisina, Ac, leetinas
o glutaraldehdo.
Ensayos inmunoenzimticos cuantitativos
En este tipo de ensayos, uno de los inmuno
rreactantes est inmovilizado en la fase slida.
En una etapa siguiente se agrega la muestra con
lo que el componente a analizar es retenido.
Posteriormente ste reacciona con el inmuno
rreactante especfico marcado con una enzima.
La medida de la actividad enzimtica ser una
m edida de la actividad o co n centracin del
componente de la muestra retenido por el inmu
norreactante e inmovilizado en la fase slida.
En cualquiera de sus variantes, la etapa de
lavado es crtica para separar el componente
especficamente unido al inmunorreactante in
movilizado en la fase slida, de componentes
que pueden reaccionar en forma no especfica.
En general, las soluciones de lavado son sali
nas isotnicas tamponadas suplementadas con
un detergente no inico (como Tween 20 al
0,05%), lo que favorece la eliminacin de esos
componentes inespecficamente retenidos. Los
volmenes de incubacin en general son de 50
a 200 lal.
Debido a que despus de la etapa de sensibi
lizacin de la fase slida (ya sea con Ag o con
Ac) persisten sitios de unin al plstico no ocu
pados, es necesario bloquear estos sitios con
protenas ajenas al sistema. De otro modo, los
inmunorreactantes que se emplearn en etapas
posteriores podrn unirse a estos sitios, produ
ciendo resultados falsamente positivos. Con es
te fin se emplean seroalbmina bovina, sueros
de animales de diversas especies (caballo, ca
bra, oveja, etc.) o leche en polvo descremada,
preparadas en solucin salina isotnica tampo
nada. Si bien la leche descremada al 3% es la

solucin de bloqueo ms econmica y su uso

se ha difundido ampliamente, hay dos situacio
nes en las que no es posible su em pleo: a)
cuando se est utilizando un sistem a Ag-Ac
donde el Ag es algn componente de la leche
(por ejemplo, al evaluar la respuesta inmune en
pacientes alrgicos a diversos componentes de
la leche), y b) cuando se est evaluando el cur
so de una respuesta inmune en sueros bovinos,
ya que un sistema de este tipo se revelar al
e m p le a r un c o n ju g a d o e n z im tic o de Ac
anti-inmunoglobulinas bovinas, el que podra
reaccionar con las inmunoglobulinas bovinas
de la leche utilizada como bloqueante y que se
han inmovilizado en la fase slida.
En las etapas posteriores del ELISA existe el
riesgo de que algunas molculas del inm uno
rreactante (un Ag, un Ac o el conjugado enzi
mtico) se unan en forma no especfica a algn
componente inmovilizado en la fase slida. Es
to producira resultados falsamente positivos en
el ensayo. Para evitar este efecto se diluye cada
inmunorreactante en presencia de un gran exce
so (0,1-1%) de una protena ajena al sistema
con el objeto de que compita con el inm uno
rreactante por esos sitios de unin no especfi
ca. En general, se emplean las mismas prote
nas que se emplearon durante la etapa de blo
queo. Adems, y con el mismo fin, a estas so
luciones diluyentes suele agregrseles un deter
g en te no i n ic o , sien d o m s e m p lead o el
Tween 20 al 0,05%.
El tiempo y temperatura ptimos de incuba
cin con cualquiera de los inmunorreactantes
debe establecerse en forma emprica. En gene
ral se incuba entre una y tres horas a tempera
tura am biente o a 37C en cm ara hm eda,
aunque en estas condiciones suele detectarse
una mayor actividad enzimtica en las fosas la
terales de las placas de ELISA (efecto b o r
de), producto del gradiente de temperatura ge
nerado en la placa cuando se la lleva de tempe
ratura ambiente a 37C, sumado al efecto acele
rador de la velocidad de reaccin que produce
el aumento de temperatura. Algunos autores re
comiendan el precalentamiento a 37C de las
soluciones a ser usadas con el objeto de mini
mizar este efecto borde.
La dilucin ptima de conjugado enzimtico
a ser empleada debe determinarse por titula
cin previa. Para el caso de un conjugado antiinmunoglobulinas marcado con enzima, es po
sible inm ovilizar el Ag (inmunoglobulinas) e
incubar con diluciones seriadas de ese conjuga
do. Una vez revelado el sistema, se elegir la
m ayor dilucin que genere una absorbancia
mxima (saturante) con la intencin de usar, en
el ensayo posterior, una cantidad de conjugado
en exceso y que ste no sea el limitante en la
reaccin.

ELISA
Un problema habitual en ELISA diseados
para la determinacin de Ac es la reactividad
cruzada que presentan las inmunoglobulinas de
distintas especies. Esto puede solucionarse me
diante el uso de anticuerpos monoclonales, m e
diante el uso de antisueros especficos de espe
cie (previamente adsorbidos con inmunoglobu
linas de las especies que pueden producir inter
ferencia en el ensayo) o por otros mtodos. En
tre stos hay que destacar la posibilidad de em
plear Ac policlonales anti-inm unoglobulinas
(conjugados enzim ticam ente) preincubados
con suero (o inmunoglobulinas) de la especie
con las que se desea que el conjugado no reac
cione, de modo de reahzar una competicin/in
hibicin de los Ac de reactividad cruzada que
forman parte de la poblacin de molculas de
Ac que integran el conjugado.
Ya se mencion que los EIA cuantitativos
pueden clasificarse en EIA no competitivos y
EIA competitivos y que en ambos casos pue
den inmovilizarse tanto el Ag como el Ac. En
los EIA no competitivos el conjugado enzim
tico debe emplearse en exceso con el objeto de
lograr una detectabilidad mxima. C ontraria
mente, en los EIA competitivos el conjugado
enzim tico (o el Ac que luego ser revelado
con un conjugado anti-inmunoglobulinas usado
en exceso) debe ser limitante en la reaccin,
pero debe usarse una dilucin tal que en ausen
cia de competidor el sistema produzca una ab
sorbancia cercana al mximo (generalmente se
elige la dilucin que genera un 90% de la ab
sorbancia mxima). Esto asegura en la prctica
un rango mximo de deteccin del competidor.
1. Enzimoinmunoensayos no competitivos
con Ag inmovilizado en fa se slida
En esta clase de ensayos se pueden distinguir
tres tipos de mtodos, ordenados por aplicabilidad general y detectabilidad creciente: a) mto
dos directos; b) mtodos indirectos; c) mtodos
por puenteo.
Los mtodos directos presentan la desventaja
de que debe disponerse de un conjugado enzi
mtico para cada Ag que se desea detectar. Es
una metodologa poco empleada, salvo para los
casos de titulacin de conjugados anti-inmuno
globulinas, donde se inmovilizan las inmunoglobulinas especficas contra las cuales reac
ciona el conjugado y se incuba con diluciones
seriadas de ste. Este mtodo puede describirse
de la siguiente manera:
A r -i- Ac-E

Ae-Ac-E

donde |
la fase slida y Ae-E son Ac antiAg marcados con enzima.

809

Los mtodos indirectos consisten en la in

movilizacin de Ag, reaccin con Ac especfi
cos y posterior revelado con un conjugado antiinmunoglobulinas especie-especfico. La reac
cin se produce en dos etapas, que se pueden
describir como:
J

- Ag -h Ac,

-A g -A c , -f- Ac 2-E

-A g-A c,
- A g-Ac|-Ac,-E

donde Ac, son los Ac especficos de Ag de la

muestra que se est analizando y Ac^-E son Ac
anti-inmunoglobulinas de la especie 1, m arca
dos con enzima. Estos mtodos son g en eral
mente empleados para la titulacin de Ac espe
cficos en sueros de distintas especies. Tienen
una detectabilidad unas 10 veces superior a la
de los mtodos directos y una ventaja im por
tante es que el mismo conjugado puede em
plearse para la deteccin de Ac en sueros de la
misma especie contra un niimero muy grande
de Ag.
Los mtodos por puenteo emplean conjuga
dos inmunolgicos (como es el caso de la p ero
xidasa-anti-peroxidasa o PAP), la reaccin en
tre biotina y avidina o lectinas. El PAP requiere
del empleo de un Ac que haga el puenteo entre
el Ae anti-enzima y el Ac que reaccion con el
Ag y que se encuentra sobre la fase slida. La
reaccin de la PAP se produce en dos etapas,
que se pueden describir como:
A g -I- A c ,

-A g -A c , + A c2 + P A P -

A g -A c,

A g ^ A c i-A c ,~ P A P

donde Ac, es el Ac especfico de Ag presente

en la m uestra (sueros) que se desea analizar,
ACj es el Ac que reconoce al Ac, y al complejo
peroxidasa-anti-peroxidasa (PAP). Como p u e
de observarse, el Ac, y el Ac anti-peroxidasa
del complejo PAP deben provenir de la m ism a
especie. Adems, el Ac^ debe emplearse en ex
ceso, de modo de permitir que uno de sus sitios
de combinacin reaccione con el Ac, y el otro
sitio de combinacin lo haga con el complejo
PAP. Este mtodo tiene una detectabilidad su
perior al mtodo indirecto. Tambin se han d e
sarrollado sistemas de ELISA similares al PAP,
pero donde se ha reem plazado el empleo del
Ac anti-inm unoglobulinas (Ac^) por protena
A, aprovechando la presencia de varios sitios
de unin de inmunoglobulinas en esta protena,
lo que le permite efectuar el puenteo.
Otra variante de este tipo de mtodos consis
te en emplear el sistema avidina-biotna, en un
ELISA que lleva tres etapas:

810

Metodologas

A g + A ci

Ag-A C] + A c 2 - b io tin a ^

H H A g -A ci

A g - A c ,-A c 2 -b io tiiia

Luego de esta etapa, se pueden realizar dis

tintas variantes de ELISA de captura. Algunas
de ellas se pueden esquematizar de la siguiente
manera:
Variante 1:

~ A g - A c i~ A c 2 -b io tin a + a v id in a + E -b io tin a

AcrAg-Ac2-E

A c p A g + A c 2 -E

A g -A c I"A c 2 -b io ti n a -a v id in a -b io tin a -E

donde Ac, es el Ac especfico de Ag de la

muestra (suero) y Ac^ son Ac anti-inmunoglobulinas de la especie !, marcados con biotina.
Alternativamente, es posible revelar el sistema
empleando un conjugado avidina - enzima en
lugar de usar avidina libre y enzima marcada
con biotina.
Este mtodo tiene una detectabilidad similar
y aplicabilidad ms general que el mtodo de la
PAP debido a que no hay restriccin de espe
cie. La preparacin previa de los com plejos
avidina-biotina-enzim a perm ite increm entar
aun ms (entre 20 y 100 veces) la detectabili
dad del sistema respecto del mtodo indirecto.
2. Enzimoinmunoensayos no competitivos
con Ac inmovilizado en fa se slida
Estos ensayos Inmunoenzimticos reciben el
nom bre genrico de E LISA de captura. En
principio, es posible inmovilizar tanto inmunoglobulinas enteras como fragm entos E(ab) o
F (a b ) (Ac de cap tu ra) con el objeto de
cuantificar Ag en diversas muestras. Tambin
es posible emplear este sistema para la titula
cin de Ac especficos en sueros. Existen nu
merosas variantes de este mtodo, aunque se
gn la clase de ELISA de captura habrn cues
tiones especficas y limitaciones que deben ser
consideradas. La primera y principal es el re
quisito de que cualquier Ac anti-inmunoglobu
linas (ya sea marcado enzimticamente o no)
que se emplee en estos sistemas no debe reac
cionar con el Ac inmovilizado en la fase slida,
ya que eso traera aparejada una reactividad ba
sal muy elevada. En algunos casos esto se con
sigue empleando Ac de captura provenientes'
de la misma especie que los Ac que componen
el conjugado enzimtico, aunque una alternati
va que se va imponiendo da a da es el uso de
Ac monoclonales que reconocen inmunoglobu
linas de una sola especie.
Las distintas variantes de los ELISA de cap
tura comparten la primera etapa que es la cap
tura del Ag a partir de una mezcla antignica
compleja (exti'accin inmune). Esta etapa se
puede esquematizar de la siguiente manera:
A ci + A g ^

A c i-A g

Variante 2:

-A C ]-A g + A c 2 -

Aci-Ag-Ac2 + AC3-E -

A c i- A g - A c j

- Ac,-Ag-Ac2-Ac3-E

Variante 3:
-F(ab)2^Ag + Ac2-4

F(ab)2-Ag-Ac2

- F ( a b ) ,- A g - A c 2 + p ro te n a A + A c ,-E - F ( a b )2 -A g -A c2 -p ro ten a A -A c j-E

Variante 4:

-A crA g +Acj

Ac,-Ag-Ac2

AC]"Ag-Ac2 + Ac3 + AC4-E F(ab)2-Ag-Ac2-Ac3-Ac4-E

Variante 5:
A c j-A g + A c 2 -b io tin a -

A c i-A g - A c 2 -b io tin a

A c p A g -A c 2 -b io tin a + a v id in a + E ~ b io tin a -

A c I-A g - A c 2 b io tin a -a v id in a -b io tin a -E

Variante 6:
A c ,-A g + A c 2

Aci-Ag-Ac2

A c |- A g - A c 2 + A c 3 -b io tin a
A c ,-A g -A c 2 " A c 3 -b io tin a

A c r A g -A c 2 - A c i- b io tin a + a v id in a + E -b io tin a A c i-A g - A c 2 - A c 3 -b io n a -a v id in a -b io tin a -E

En la variante 2, ACj-E es el conjugado enzi

mtico de Ac anti-inmunoglobulinas de la es
pecie 2 que no debe reaccionar con el ACj. En
la variante 3, ACj-E es un complejo enzima-anti-enzima y la protena A hace de puente entre
estos Ac y el Ac^. Debido al empleo de prote
na A (que reacciona con las porciones Fe de las
inmunoglobulinas) en este tipo de sistemas de
ben emplearse fragmentos F(ab) o F(ab)^ co
mo Ac de captura. Para la variante 4 existen

ELISA

811

dos alternativas. En una de ellas, Ac^-E es un una solucin patrn) por el Ac inmovilizado en
complejo enzima-anti-enzima, el que es puen- la fase slida. La reaccin puede esquematizar
teado con el Ac^ por medio del ACj (anti-inmu- se de la siguiente manera:
noglobulinas de la especie de la que vienen los
- A c + Ag + Ag-E
A c-A g o [ m - A c-A g -E
Acj y Ac^). En la otra alternativa, Ac^ son Ac
anti-inmunoglobulinas de la especie de la que
viene el Ac^ y Ac^-E es el conjugado enzimti
La reaccin puede realizarse en una etapa
co de Ac anti-inmunoglobulinas de la especie (incubacin simultnea de Ag y Ag-E) o en dos
de la que viene el Ac,. La variante 6 se asemeja etapas secuenciales. En este caso, en la primera
bastante a la variante 4, con la diferencia de etapa se incuba con el Ag libre y, en la segun
que el ACj se encuentra marcado con biotina y da, se incuba con el Ag-E. Este mtodo tiene
que el conjugado enzimtico en lugar de ser un una detectabilidad superior al mtodo que se
Ac anti-inmunoglobulinas de la especie de la realiza en una sola etapa.
Estos ELISA revelan la presencia de Ag li
que viene el Ac^ es un conjugado inmunolgi
co avidina-biotina-enzima. Tanto en esta va bre como una cada en la absorbancia respecto
riante, como en la variante 5, es posible revelar del control que se incuba sin Ag libre (dosis
el sistema empleando un conjugado avidina - cero).
enzima en lugar de usar avidina libre y enzima
marcada con biotina.
4. Enzimoinmunoanlisis competitivos
Los sistemas de ELISA de captura tienen con A g inmovilizado en fase slida
gran utilidad para la deteccin de Ac de distin
tas clases y subclases especficos de Ag. En la
Esta metodologa se basa en la inhibicin de
prctica este mtodo se aplica para la determi la reactividad de un conjugado enzimtico Acnacin de IgM especfica (fig. 38-7), lo que es E Ag-especfico con Ag inmovilizado en la fa
particularmente litil para diferenciar infeccio se slida, por Ag libre presente en la muestra
nes agudas de crnicas. No es conveniente ha (o en una solucin patrn). La reaccin puede
cer la determinacin de IgM por ELISA indi esquematizarse de la siguiente manera:
recto con Ag inmovilizado debido a la mayor
concentracin y afinidad de la IgG srica espe
A g-A c-E +
- A g + A g ir
cfica de Ag, lo que bloquea la reactividad de
+ A g m u c s tra O |jjj|j|j| A g + A g n iu e stra " A C- E
la IgM y en una titulacin por ELISA de ampli
ficacin producira resultados subvaluados. El
sistema desarrollado para la determinacin de
La actividad enzimtica detectada en fase s
IgM especfica (o de Ac de distintas clases o lida es inversamente proporcional a la cantidad
subclases) consiste en inmovihzar Ac anti-cla- de Ag presente en la muestra o solucin patrn.
se o subclase de la inmunoglobulina que se de Esta metodologa, al igual que para el caso del
sea determinar. Esto permite capturar todas las ELISA competitivo con Ac inmovilizado en fa
inmunoglobulinas sricas de esa clase o subcla se slida, puede realizarse en una etapa (incuba
se del suero problema. Posteriormente el siste cin simultnea de Ag libre y Ac-E) o en dos
ma se enfrenta contra el Ag especfico. Si en el etapas secuenciales. En este caso, en la primera
suero haban Ac Ag-especficos de la clase o etapa se incuba el Ag libre con el Ac-E y en la
subclase, el Ag ser capturado. Finalmente, s segunda etapa se incuba esa mezcla de reaccin
lo resta poner en evidencia la presencia del Ag con el Ag inmovilizado en la fase slida. ,
capturado en la fase slida, para lo que se em
Debido a que para este tipo de ELISA debera
plea alguno de los mtodos discutidos en prra disponerse de un conjugado Ac-E especfico pa
fos anteriores (utilizacin de Ag marcado, reac ra cada Ag que se quiera cuantificar, se ha desacin posterior del Ag capturado con Ac Ag-es- rrollado una variante que permite utilizar conju
pecficos marcados con enzima, etc.).
gados Ac-E anti-inmunoglobulinas especie-especficas para cuantificar diversos Ag. El esque
ma general de esta variante es el siguiente:
3. Enzimoinmunoanlisis competitivos
con Ac inmovilizado en fase slida

Los enzimoinmunoanlisis competitivos (ya

sea por inmovilizacin de Ac o por inmoviliza
cin de Ag) tienen por objeto la cuantificacin
de Ag.
Los enzimoinmunoanlisis competitivos con
Ac inmovilizado en fase slida se fundamentan
en la competicin entre el Ag marcado con en
zima y el Ag libre presente en la muestra (o en

- - - A g + A g m u c stra + A C i -

Ag-AC|

+ A g in u e s tr a

A g + A g n iu e s tr a - A C |

A g-Aci + A c 2-E > H H A g-A ci-A c 2-E

donde Ac, es el Ac especfico de Ag y Ac^-E es

el conjugado anti-inmunoglobulinas de la espe
cie 1 narcado con enzima.

812

Metodologas

Anti-lgM
inmobilizado
en fase slida

Fig. 38-7. D eteccin de IgM esp e

cfica de A g p or E L ISA de cap tu
ra. En este en say o , se c a p tu ra la
IgM srica total (m arrn) m ediante
la utilizacin de Ac anti-IgM inm o
v iliza d o s en la fase s lid a (azul).
P o ste rio rm e n te la Ig M e s p e c fic a
captura el Ag (verde) y finalm ente
se revela su presencia por alguno de
los m todos discutidos en pginas
anteriores.

IgM srica
IgM srica

Revelado del
sistema con un
Ac anti-Ag
marcado con
enzima

Incubacin con Ag

Nuevamente, la existencia de Ag libre se

manifestar como una cada en la absorbancia
respecto del control incubado sin Ag libre
(dosis cero).
Procesamiento de datos y expresin de
resultados en ensayos inmunoenzimtieos
1.

Clculo del ttulo de un suero

Los resultados de los ELISA pueden expre

sarse de dos formas. Por un lado es posible in
formar la concentracicSn (molar, mg mb, etc.)
de un Ag por comparacin e interpolacin en la
zona de mayor pendiente (sensibilidad) de una
curva de calibracin hecha con una solucin de

concentracin conocida de Ag; por otro lado se

puede informar la actividad de un suero en uni
dades arbitrarias. Esto se debe a que no es posi
ble informar el ttulo de un suero en mg m i'
de Ac especficos debido a la heterogeneidad
de clases, subclases y afinidades de los Ac que
componen los sueros. Este problema se presen
ta tambin si se ciuiere comparar la reactividad
del suero con la reactividad de un suero patrn
en un determinado ensayo, ya que ambos pre
sentarn una curva dosis-respuesta propia.
El problema del procesamiento de resultados
en ELISA se presenta entonces con el clculo
del ttulo de Ac st;icos especficos. En los p
rrafos siguientes se comentan algunos aspectos
relacionados a este problema.
Existen varios mtodos para calcular el ttulo
de sueros; cada uno presenta una serie de ven
tajas y desventajas. Los ms ampliamente utili
zados:
a) el mtodo de titulacin a punto final;
b) la medida de la absorbancia de un suero a
dilucin sitnple, y
c) el clculo del ttulo de un suero en unida
des arbitrarias por comparacin con un suero
patrn.
a) Titulacin a punto fin a l

Fig. 38-8. C lculo del ttulo de un suero por titulacin

a p un to final. Se puede observar que el ttulo del suero
depende del criterio elegido para calcularlo. Si se elige co
m o ttulo la dilucin del suero que produce una absorban
cia igual al 50% de la absorbancia rnxim a del sistem a se
ob tien e un valor (ttulo A) que ser diferente del obtenido
si se elige com o ttulo la dilucin del suero que produce
una absorbancia de 0,2 (ttulo B).

El mtodo de titulacin a punto final consis

te en analizar el suero problema en diluciones
seriadas en razn 2. Si se grafica la absorbancia
en funcin del logaritmo de la inversa de la di
lucin del suero se obtendr una curva sigmoi
dea. Si se elige una determinada absorbancia se
podr calcular la dilucin de suero que produce

ELISA

DO
1
0,8 +

0,6

0 ,4

0,2

. 2*
log [titu lo ]

Fig. 38-9. C lculo del ttu lo de un suero por m edida de

la absorbancia a dilucin sim ple. Si se grafica la absor
bancia de una dilucin pre-establecida de sueros negativos
y positivos en funcin del logaritm o del ttulo (por titula
cin a punto final) de esos sueros (puntos azules) se obten
dr una curva sigm oidea (rojo) com o la de la figura. A s se
podr calcular el ttulo de un suero problem a como si se lo
hubiese titulado a punto final, por interpolacin en la curva
de la absorbancia de ese suero ensayado a dilucin simple.

dicha absorbancia y este valor podr ser toma

do como el ttulo de ese suero (fig. 38-8). El
problema est en elegir ese valor de absorban
cia. Algunos autores eligen como ttulo la dilu
cin de suero que produce una absorbancia
igual al doble de la absorbancia producida por
el control incubado sin suero. Otros autores eli
gen una absorbancia de 0,5 como valor para es
tablecer el ttulo de un suero, mientras que
otros prefieren elegir como ttulo la dilucin de
suero que produce un 50% de la absorbancia
mxima. Como es fcil de imaginar, estos cri
terios brindarn ttulos que no sern compara
bles entre s. Lo importante es fijar un criterio
de trabajo y respetarlo, de modo de poder com
parar ttulos de sueros a lo largo del tiempo. El
mtodo de la titulacin a punto final presenta la
ventaja de que se analiza la curva de titulacin
de cada suero. Esto permite obtener el ttulo de
sueros ya sean de bajo o de alto ttulo. Sin em
bargo, es un mtodo laborioso y costoso, por lo
que en muchos casos se prefiere el intodo de
la medida de la absorbancia a dilucin simple.
b) Medida de la absorbancia a dilucin simple

El mtodo de la absorbancia a dilucin sim

ple consiste en tomar como ttulo la absorban
cia del suero a una dilucin fija, elegida previa
mente. Si bien es un mtodo sencillo y ms eco
nmico que el anterior, presenta la desventaja
de no ser til para discriminar entre sueros de
bajo ttulo (porque la absorbancia est demasia
do cercana a la obtenida en ausencia de Ac) ni
para discriminar entre sueros de alto ttulo (por
que la absorbancia est cercana al mximo de
saturacin del sistema, en muchos casos limita
dos por la capacidad del lector de policubetas).

813

Existe un mtodo alternativo que permite

calcular el ttulo de un suero analizndolo a di
lucin simple. Para ello se construyen curvas
dosis-respuesta de un gran nmero de sueros
(desde negativos hasta positivos altos) o de un
suero patrn altamente positivo y diluciones
del mismo en sero negativo. Se calcula el ttu
lo de cada uno por el mtodo de la titulacin a
punto final. Luego se determina la absorbancia
de cada suero a una dilucin simple (por ejem
plo, 1/1000). Se obtendr para cada suero, pa
res de valores (ttulo; absorbancia a dilucin
simple). Si se grafica esa absorbancia (en las
ordenadas) en funcin del logaritmo del ttulo
(en las abscisas) se obtendr una curva sigmoi
dea (fig. 38-9). Posteriormente se podr anali
zar cualquier nuevo suero a la dilucin simple
elegida y, por interpolacin en esta curva sig
moidea, calcular su ttulo. Este mtodo presen
ta la ventaja de que se podr calcular el ttulo
de un suero analizndolo a dilucin simple. Sin
embargo, presenta la desventaja de que se asu
me un paralelismo entre las curvas de titulacin
de los diferentes sueros, lo que en la prctica
pocas veees ocurre. Adems, el mtodo es til
slo en las zonas donde la curva sigmoidea tie
ne mayor pendiente, si bien existen artificios
matemticos para expandir el rango til de la
curva (por ejemplo, aplicando la funcin logit).
c) Ttulo de un suero en unidades arbitrarias
p or comparacin con un suero patrn

El mtodo de titulacin y comparacin con

un suero patrn consiste en titular el suero pro
blema y un suero patrn, al que arbitrariamente
se le asigna una determinada cantidad de uni
dades ml * como actividad de Ac. Partiendo
de la base de que una misma absorbancia es
producida por cantidades equivalentes de Ac,
ser posible calcular la cantidad de unidades
m l' del suero problema por comparacin con
el suero standard (fig. 38-10). Ese valor de ab
sorbancia para realizar la comparacin debe
caer en la zona de mayor pendiente de las cur
vas de titulacin de los sueros. En caso de no
disponerse de un suero patrn ser posible to
mar como estndar una mezcla (pool) de sue
ros positivos, a la que se le asigna una determi
nada cantidad de unidades m l'. Este mtodo
presenta la desventaja de que, para que sea po
sible comparar el comportamiento de los sue
ros, stos deben originar curvas de titulacin
paralelas. Sin embargo, esta situacin se da po
cas veees en la prctica.
2. Clculo del valor de corte
Un elemento esencial en todo ELISA cuanti
tativo es establecer el valor de discriminacin

814

Metodologas

entre una muestra positiva y una muestra nega

tiva. Este valor se denomina valor de corte o
cut'Off y es independiente del mtodo usado
para el clculo del ttulo del suero.
En todo ELISA, los sueros negativos mues
tran una comportamiento que se asemeja a una
distribucin normal, pero presentan un sesgo
positivo o tendencia a producir valores de ab
sorbancia o ttulos mas altos que los esperados
si siguieran una distribucin normal (vase fig.
38-11).
Debido a este comportamiento, y desde un
punto de vista matemtico, el uso de parme
tros que surgen de muestras que siguen tal dis
tribucin no es formalmente correcto en este ti
po de ELISA. Sin embargo, el desvo estndar
es un parmetro ampliamente utilizado en di
versos ELISA para establecer el valor de corte
y puede calcularse como:
D S= J i : ( x . - m ) ^
n- 1
donde n es el nmero de sueros negativos ana
lizados, m es el media aritmtica y x es la
reactividad de cada suero.
El anlisis de las muestras por duplicado o
triplicado mejora la confiabilidad del DS obte
nido pero la distribucin de la reactividad de
los sueros negativos no cambia, al igual que
ese sesgo positivo antes mencionado.
Para el caso de un nmero bajo de muestras
negativas, la distribucin que se aplica habi
tualmente es la distribucin t, la que presenta
un rea mayor en las colas de la curva de distri
bucin.
Otro aspecto a tener en cuenta cuando se rea
lizan ensayos serolgicos en general y ELISA
en particular es la confiabilidad de un resulta
do, ya sea positivo o negativo. Esta confiabili
dad depende de la prevalencia del Ag o Ac en
la poblacin. Para aclarar esto es necesario de
finir dos parmetros: el ndice de detectabilidad
para muestras positivas [ID(-i-)] y el ndice de
detectabilidad para muestras negativas [ID(-)].
El ID(-i-) es la medida de la habilidad del ensa
yo de mostrar como positiva a una muestra que
realmente es positiva (tambin conocido como
sensibilidad, trmino que no debe confundir
se con la sensibilidad del ensayo -definida
anteriormente-); por otra parte, el ID(-) es la
medida de la habilidad del ensayo de mostrar
como negativa a una muestra que realmente es
negativa (tambin conocido como especifici
dad). En trminos matemticos se pueden es
cribir como
positivos en el ensayo
S ensibilidad o ID(-r ) =

positivos en el ensayo
+ falsos negativos

100

negativos en el ensayo
Especificidad o ID (-) = -------------------------------------- x 100
negativos en el ensayo
+ falsos positivos

donde los positivos en el ensayo son las mues

tras positivas que el ensayo detecta como posi
tivas, los falsos negativos son las muestras que
en realidad son positivas pero que el ensayo
muestra como negativas, los negativos en el
ensayo son las muestras negativas que el ensa
yo detecta como negativas y los falsos positi
vos son las muestras que en realidad son nega
tivas pero que el ensayo detecta como positi
vas. Por supuesto, para poder calcular estos pa
rmetros es necesario disponer de un lote de
muestras positivas y negativas conocidas.
La confiabilidad en la positividad [C(-i-)J o
valor predictivo es la probabilidad de que una
muestra que el ensayo detecta como positiva
sea realmente positiva. Del mismo modo, la
confiabilidad en la negatividad [C(-)] es la probabiUdad de que una muestra que el ensayo de
tecta como negativa sea realmente negativa. En
trminos matemticos, se pueden escribir como
positivos en el ensayo

C(+) =

100

100

positivos en el ensayo + falsos positivos

negativos en el ensayo

C(-) =
negativos en el ensayo + falsos negativos

Para ver el impacto de la prevalencia (nme

ro de individuos positivos por cada 100 indivi
duos) sobre estos parmetros, veamos dos si
tuaciones tericas donde los ID(-t-) e ID(--) son
del 90% y la prevalencia es del 2% en un caso
y del 30% en el otro. En el primer caso, una
prevalencia del 2% significa que de cada 1000
m.uestras, 20 son positivas. Sin embargo, con
unos ID del 90%, el ensayo slo detecta a 18
como positivas (2 son falsos negativos) y a 882
como negativas (98 son falsos positivos). De
todos los positivos detectados con el ensayo,
slo 18 son realmente positivos. Esto hace que
la C(+) sea del 15,5%. Para las muestras nega
tivas tenemos que de las 884 (882 + 2) detecta
das como tales, slo 882 lo son realmente, lo
que hace que la C(-) sea del 99,8%. Para el ca
so de una prevalencia del 30% la C(-i-) aumenta
enormemente a 79,4%, mientras que la C(-)
cae levemente a 95,5%.
El valor de corte del sistema debe ser tal que
minimic los resultados falsos, ya sean positi
vos o negativos. En muchos casos existe una
zona de solapamiento en la distribucin de la
reactividad de sueros positivos (los de bajo t
tulo) y negativos, en donde no puede estable
cerse con certeza si una muestra que cae en esa
zona de la distribucin es positiva o negativa
(fig. 38-12). En estos casos se elegir un valor

ELISA

de corte de manera tal de tener ms falsos posi

tivos o falsos negativos, segn qu tipo de error
produzca consecuencias menos graves.
Si se analiza un gran nmero de muestras, se
puede establecer el valor de corte como la reac
tividad media de los sueros negativos -i- 2 o 3
DS. Si paralelamente se analiza la reactividad
de una muestra positiva standard y/o una mues
tra negativa standard, ser posible expresar el
valor de corte como un porcentaje de la reacti
vidad de estas muestras standard. De este mo
do, en ensayos subsiguientes se podr calcular
el valor de corte analizando nicamente la
reactividad de estas muestras patrones y multi
plicando por un factor obtenido aplicando la si
guiente frmula:

ve = VCn

A,

X
Ao

donde VC es el valor de corte para el da que

se realiza el ensayo, VCq es el valor de corte
calculado el da que se analiz un gran nmero
de muestras negativas, A^ es la absorbancia del
standard el da que se realiza el ensayo y Ag es
la absorbancia del estndar el da que se calcu
l el valor de corte por anlisis de la reactivi
dad de un gran nmero de muestras negativas.
La relacin VCo/A,, es el factor que habitual
mente proveen los fabricantes de reactivos co
merciales de ELISA para el clculo del valor
de corte.
Este mtodo de clculo del valor de corte
permitir ahorrar tiempo y dinero, adems de
evitar las variaciones interensayo en los ELI
SA.
Distintas modalidades del ELISA
Se han desarrollado distintas modalidades
del ELISA. Entre ellas, las ms importantes
son las siguientes:
1. TERELISA.
2. GEDELISA.
3. DIG-ELISA.
1. TERELISA
El TERELISA consiste en un ELISA con
vencional realizado en placas de Terasaki, pla
cas habitualmente usadas para la tipificacin de
alelos del complejo mayor de histocompatibili
dad por microcitotoxicidad en placa y que son
ms pequeas que las placas de plstico disea
das para ELISA. La ventaja que presenta este
sistema por sobre los ELISA descritos en p
rrafos anteriores es que requiere volmenes

815

muy pequeos de los distintos inmunorreactan

tes. En general, en el TERELISA se emplean
volmenes del orden de los 10 |al por pocilio, a
diferencia de los ELISA convencionales, donde
se emplea entre 50 y 200 |J,I por pocilio. Sin
embargo, este sistema presenta la desventaja de
que no se han diseado espectrofotmetros
(lectores de policubetas) aptos para leer la ab
sorbancia en estas placas, por lo que la lectura
debe realizai'se a simple vista. Esto ha dificul
tado la difusin y empleo masivo de este tipo
se sistemas.
2. GEDELISA
El GEDELISA es otra modalidad del ELISA
donde en una primera etapa se realiza una sepa
racin de una mezcla antignica por electrofo
resis en geles de pohacrilamida en presencia de
dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE). A conti
nuacin se eluye el antgeno o los antgenos de
inters, para lo cual el gel se corta en tiras de
unos pocos milmetros de espesor, las que se
incuban con solucin fisiolgica durante tmo o
dos das a 4C. Este procedimiento tiene por
objeto permitir la solubilizacin de los antge
nos en la solucin fisiolgica. Seguidamente,
estos antgenos se emplean para la sensibiliza
cin de placas de poliestireno y se prosigue con
el ELISA tal cual se describi en piTafos ante
riores. Este sistema permite detectar Ac contra
determinados componentes de una mezcla anti
gnica compleja separada por SDS-PAGE. Sin
embargo, la presencia del SDS provoca la des
naturalizacin de los antgenos separados, de
modo que no se podrn evidenciar Ac contra
algunos epitopes que se vieron afectados por el
tratamiento con SDS. Adems, el remanente
del detergente que queda en la solucin del an
tgeno extrado del gel es capaz de interferir en
la etapa de sensibilizacin de la fase slida
(vase Inmovilizacin de inmunorreactantes
en fase slida).
3. DIG-ELISA
En el DIG-ELISA (diffusion-in-gel enzyme-linked immunosorbent assay) se realiza
una cuantificacin de anticuerpos especficos
mediante la medicin de su habilidad de formar
un gradiente de difusin sobre una superficie
de poliestireno sensibilizada con el antgeno
respectivo. La reaccin Ag-Ac se visualiza en
una etapa posterior por empleo de un conjuga
do enzimtico anti-inmunoglobulinas especieespecfico.
En el DIG-ELISA se sensibiliza una placa de
Petri cn el antgeno en estudio. Luego de lavar

816

Metodologas

DO

a n a d M l^iw neiito

'

log dii
Fig. 38-10. C lculo del ttulo de un .suero por com p ara
cin con un suero p atrn . Si se dispone de un suero pa
trn (curva azul) ser posible calcular el ttulo de un suero
problem a (curva roja) en unidades arbitran'as/m l por com
paracin de las curvas de titulacin de am bos sueros.

e] exceso de antgeno no unido, se cubre la pla

ca con una capa de agar, en la que se practican
orificios a modo de pocilios. En estos pocilios
se siembra la solucin con el anticuerpo, se de
ja difundir, se elimina el agar y se cubre toda la
placa con el conjugado enzimtico. Luego de
esta incubacin, se lava el exceso de conjugado
y se cubre la placa con agarosa que contiene la
solucin de sustrato. AI cabo de cierto tiempo
se desarrollar el color producido por la activi
dad enzimtica unida a la placa. El dimetro de
los halos de color formados ser proporcional
al logaritmo de la concentracin de anticuerpo
que haba en la muestra.
El DIG-ELISA presenta la ventaja de que no
se requiere de un lector de policubetas para una
cuantificacin de la reaccin antgeno-anticuerpo, ya que se mide la velocidad de difusin de
estos anticuerpos en el agar. Sin embargo, la
complejidad operacional de estos sistemas
conspira contra su implementacin en la deter
minacin de anticuei*pos especficos en el labo
ratorio de serologa diagnstica.
Fwaieiwa

^ ^ o p o s ttv o

A is o fte w a

Fig. 38-11. G rfico de frecuencia en funcin del intervalo de absorbancias de sueros negativos. Se m uestra la
curva de distribucin y el sesgo positivo (rosa) caracters
tico de la distribucin de absorbancias de sueros negativos
y la curva de di.stribucin norm al (verde) que se obtendra
si los sueros negativos .siguieran dicha distribucin.

Fig. 38-12. G rfico de frecuencia en funcin d el interva

lo de ab so rb a n cia s de sueros n eg a tiv o s y positivo.s. Se
puede observar que hay un solapam ieiito de las distribucio
nes de sueros positivos (rojo) y negativos (azul), lo que p ro
voca una incertidum bre en la clasificacin d e un suero co
m o positivo o negativo si su absorbancia cae en la zona de
solapanriento.

Dot-blot
El Dot-blot es un mtodo inmunoenzimtico
en el que se inmoviliza un inmunorreactante en
una fase slida compuesta por vm papel. Exis
ten varios tipos de papeles empleados en este
tipo de reacciones. Todos ellos presentan la
atractividad de que sirven para inmovilizar
cantidades muy pequeiias de inmunorreactante.
Muchas de las consideraciones que se comen
taron para ELISA son vlidas para el Dot-blot.
El Dot-blot es una tcnica ampliamente em
pleada para realizar el anlisis de sobrenadantes de cultivo de hibridomas (screening) o
para analizar la reactividad de un suero o anti
cuerpo purificado contra un panel de antgenos
diferentes.
Mediante el empleo de distintos tipos de pa
peles es posible inmovilizar protenas, cidos
nucleicos, membranas celulares, fracciones y
organoides subcelulares y hasta clulas enteras.
En los prximos prrafos se harn algunos co
mentarios acerca de la inmovilizacin de pro
tenas en papel.
El papel de filtro activado con bromuro de
ciangeno ha sido ampliamente empleado para
la- unin covalente de protenas a la fase slida.
Este tipo de sistemas es muy usado para la in
movilizacin de alrgenos con el objeto de de
tectar la presencia de anticuerpos especficos
en sueros de pacientes alrgicos atpicos.
Sin embargo, el papel ms ampliamente em
pleado para la inmovilizacin de protenas es la
nitrocelulosa. La unin es no covalente y la in
teraccin hidrofbica parece ser la que gobier
na el proceso de interaccin protena-nitrocelulosa. Esto hace que la presencia de detergentes
en la solucin de protena interfiera el proceso
de unin. A pesar de esto, es posible inmovili

ELISA

zar antgenos proteicos en solucin de deter

gentes, particularmente no-inicos (tales como
Tritn X-100, Tween 80) y a una concentra
cin inferior al 0,01%.
Una ventaja que presenta la inmovilizacin
de protenas en nitrocelulosa es que la unin es
cuantitativa hasta cubrir la capacidad de satura
cin del papel. Las protenas inmovilizadas
pueden revelarse por tincin directa con colo
rantes tales como el negro amido, el azul de
Coomassie o el Ponceau-S.
Sin embargo, en la reaccin de Dot-blot se
realizan incubaciones con anticuerpos especfi
cos y el sistema se revela mediante el empleo
de un conjugado enzimtico. Antes de efectuar
la incubacin con cualquier anticuerpo es nece
sario bloquear los sitios de unin a la nitrocelu
losa libres. Para ello se emplean soluciones ta
les como las empleadas en ensayos de ELISA.
El bloqueo puede realizarse con leche descre
m ada al 0,5% d ilu id a en PBS o en N aCl
0,15M, TrisHCl 0,05M, pH 7,4 (TBS), durante
30 minutos a 37C. Los anticuerpos (sueros,
sobrenadantes de cultivo de hibridomas, lqui
dos ascticos de anticuerpos monoclonales o
anticuerpos purificados) y el conjugado enzi
mtico se diluyen en soluciones proteicas, sien
do la ms empleada la solucin de leche des
cremada al 0,5% en PBS o TBS. Los lavados
se realizan con PBS o TBS y en general se evi
ta el empleo de detergentes en estas soluciones
con el objeto de evitar el despegado del Ag in
movilizado en la nitrocelulosa. En caso de em
plearse un conjugado enzimtico de peroxidasa
es necesario utilizar diluyentes y soluciones de
lavado a base de TBS, ya que el fosfato del
PBS interfiere en la etapa del revelado.
Los sustratos que se emplean en Dot-blot, a
diferencia de los empleados en ELISA, generan
un producto insoluble que se deposita sobre la
nitrocelulosa en los sitios donde se localiza la
actividad enzimtica. Para el caso de la peroxi
dasa, los sustratos pueden ser el 4-cloro-l-naftol o la diaminobencidina. El primero genera
un producto azul oscuro que tiene un muy buen
contraste para casos en los que sea necesario
fotografiar el Dot-blot. La diaminobencidina,
por su parte, genera un producto marrn que no
tiene un contraste tan elevado para fotografa
pero que tiene una detectabilidad superior al
4-cloro-l-naftol. Para el caso del empleo de
conjugados enzimticos a base de fosfatasa se
emplea como sustrato una mezcla de 4-nitrobluetetrazolium (NBT) y 5-bromo-4-cloro-3indolilfosfato (BCIP), que generan un producto
insoluble azul oscuro.
La actividad enzimtica se detiene por lava
do de la nitrocelulosa con agua destilada. Una
vez lavada, es posible secar la nitrocelulosa al
aire y guardarla entre papeles de filtro durante

817

mucho tiempo sin que se altere la visualizacin

de los resultados.
A diferencia del ELISA, la lectura del Dotblot es visual y por lo tanto no sirve para reah
zar cuantificaciones. Sin embargo, se pueden
realizar lecturas densitomtricas (se requiere de
densitmetros de reflexin) de la membrana de
nitrocelulosa revelada y, si cada punto (dot) tie
ne la misma rea, tomar la altura de los puntos
como medida de la reactividad del anticuerpo.
Parte experimental
1. Clculo de la capacidad de saturacin
de placas de ELISA p o r el mtodo
de la peroxidasa

Sensibilizar placas de ELISA con 100 )J,1 de di

luciones seriadas de una solucin de OVA u
otro antgeno, desde 0,1 )0 .g/ml h asta 10
|ig/ml, diluida en un buffer carbonato-bicarbonato lOOmM pH ==9,2-9,4.
Incubar durante 18 horas a 4C.
Lavar 3 veces con PBS.
Incubar 3 horas a 37C con 100 p,l/pocillo de
una solucin de peroxidasa de 100 jig m l'\
Lavar 3 veces con PBS suplementado con
0,05% de Tween 20 (PBS-T).
Incubar con 100 }.il/pocillo de una solucin de
o-fenilendiamina de 1 mg/ml en un buffer
de cido ctrico y fosfatos 0,1M pH = 5 y
H^O^ al 30% (1 il m i'), durante 30 minutos
en la oscuridad.
Detener la reaccin por agregado de 25 jj.1 de
H,SO^ 4N a cada pocilio.
Leer la densidad ptica a 490 nm en un lector
de policubetas.
Graficar la densidad ptica en funcin del loga
ritmo de la inversa de la concentracin de
OVA y calcular la concentracin necesaria
para saturar la placa.
2. Marcacin de anticuerpos
con peroxidasa

Dialisar una solucin del anticuerpo a marcar

(aproximadamente 5 mg/ml) contra buffer
de carbonato-bicarbonato sdico lOOmM pH
= 9,2 durante 18 horas a 4C.
Disolver 2,5 mg de peroxidasa (de buena cali
dad) en 0,25 mi de NaHCOj lOOmM en un
tubo de vidrio.
Agregar 0,25 mi de NalO^ (p.a.) 12mM.
Incubar 2 horas a temperatura ambiente en os
curidad.
Mezclar la solucin del anticuerpo dialisado
con la peroxidasa y agregar una sexta parte
(peso/volymen) de Sephadex G-25 seco con
el objeto de reducir el volumen de reaccin a
la mitad.

818

Metodologas

Incubar 3 horas a temperatura ambiente en la

oscuridad.
Agregar 1/20 en volumen de una solucin re
cin preparada de NaBH^ (5 mg mh' en
NaOH 0,lmM).
Incubar 30 minutos a 4C.
Agregar 1/10 en volumen de la solucin de
NaBH,.
Incubar 1 hora a 4C.
Separacin de la peroxidasa libre y del Ac no
conjugado:
Precipitar con (NH^) SO^ al 50% de saturacin
(precipitan la IgG ubre y la IgG conjugada a
peroxidasa).
Incubar 1 hora y centrifugar durante 15 minu
tos a .OOOxg. Desechar el sobrenadante.
Lavar el precipitado con (NH^j^SO^ al 50% de
saturacin. Desechar el sobrenadante.
Equilibrar el sedimento con una solucin de
fosfatos 0,1M, NaCl 0,1M, pH = 7,2 o con un
buffer de acetato sdico O,IM, NaCl IM,
CaCl^ ImM, MgCl^ ImM, MnCl^ ImM, pH =
6 por dilisis o por pasaje por una columna de
Sephadex G-25.
Realizar una cromatografa de afinidad con
Sepharosa-Concanavalina A, con lo que la
IgG libre eluye con el frente y se retiene el
conjugado. Monitorear el proceso por lectura
de la absorbancia a 280nm.
Eluir la columna con una solucin de a-metil
mansido 10 a lOOmM en fosfatos 0,1M,
NaCl 0,1M, pH = 7,2 o en acetato sdico
0,1M, NaCl IM, CaCL ImM, MgCL ImM,
MnCl^ ImM, pH = 6.
Agregar un volumen de glicerina neutralizada
y guardar en congeladora de -18C.
Titular por ELISA frente al antgeno especfico
para comprobar la actividad del conjugado.
3. ELISA de amplificacin (indirecto)
para la titulacin de sueros

Se describe un ELISA para la titulacin de an

ticuerpos anti-ovoalbmina (OVA) en sueros
de conejos inmunizados con OVA.
Sensibilizar placas de ELISA con 100 |al de
una solucin de OVA de 1 |xg/ml (100 ng de
OVA/fosa), diluida en un buffer carbonatobicarbonato lOOmM pH = 9,2-9,4.
Incubar durante 18 horas a 4C.
Lavar 3 veces con PBS suplem entado con
Tween 20 al 0,05% (PBS-T).
Bloquear la placa por incubacin con 250
al/fosa de una solucin de leche descremada
al 3% preparada en solucin fisiolgica tam
ponada (PBS) durante Ihora a 37C.
Lavar 3 veces con PBS-T.
Realizar diluciones seriadas en razn 2 del sue
ro de conejo anti-OVA a analizar, en un volu
men de 100 |J,l/fosa. Utihzar como diluyente

una solucin de leche descremada al 1% en

PBS-T.
Incubar 1 hora a 37C.
Lavar 3 veces con PBS-T.
Incubar con 100 |j,l/fosa de la dilucin apropia
da del conjugado anti globuhnas de conejo
marcado con peroxidasa, diluido en una solu
cin de leche descremada al 1% en PBS-T,
durante 1 hora a 37C.
Lavar 3 veces con PBS-T.
Incubar con 100 |il/fosa de una solucin de ofenilendiamina de Img/ml en un buffer de
cido ctrico y fosfatos 0,1M pH = 5 y H^Oj
al 30% (l|il/ml), durante 30 minutos en la os
curidad.
Detener la reaccin por agregado de 25 )ll de
HjSO^ 4N a cada pocilio.
Leer la densidad ptica a 490 nm en un lector
de policubetas.
Graficar la densidad ptica en funcin del loga
ritmo de la inversa de la dilucin de suero de
conejo analizado y calcular el ttulo.
4. ELISA de captura

Sensibilizar placas de poliestireno de alta capa

cidad de unin con el anticuerpo de captura
purificado, durante 18 horas a 4C a razn de
2|ag por pocilio (50|i,l/pocillo), diluido en
PBS.
Lavar 3 veces con PBS-T.
Bloquear la placa por incubacin con 200|al/fosa de una solucin de leche descremada al 3%
en PBS durante 1 hora a 37C.
Lavar 3 veces con PBS-T.
Capturar el antgeno especfico a partir de la
fraccin antignica diluida en leche descre
mada al 1% en PBS, por incubacin durante
1 hora a 37C a razn de 50 |i/fosa. Dejar un
grupo de pocilios sin antgeno capturado co
mo control del ensayo.
Lavar 3 veces con PBS-T.
Incubar durante 30 minutos a temperatura am
biente y a razn de 50 il/ fosa con una dilu
cin apropiada (por ejemplo, 1/500) de los
sueros a analizar. Diluir los sueros en leche
descremada al 1% en PBS.
Lavar 3 veces con PBS-T.
Incubar durante 30 minutos a temperatura am
biente y a razn de 50 \iV fosa con una dilu
cin apropiada de anticuerpos anti-inmunoglobulinas e.specie-especficos marcados con
peroxidasa, diluidos en leche descremada al
1% en PBS.
Lavar 3 veces con PBS-T.
Incubar con 50 |il/fosa de una solucin de o-fenilendiamina de 1mg/ml en un buffer de
cido ctrico y fosfatos 0,1M pH = 5 y H^O^
al 30% (1 )il/ml), durante 30 minutos en la
oscuridad.

ELISA

Detener la reaccin por agregado de 25 |xl de

HjSO^ 4N a cada pocilio.
Leer la densidad ptica a 490 nm en un lector
de policubetas.
Graficar la diferencia entre la absorbancia pro
ducida por cada suero en la fosa con Ag y la
absorbancia producida por el mismo suero en
la fosa sin Ag.
5. ELISA de modulacin de actividad
para la cuantificacin de antgeno
Se describe un ELISA para la cuantificacin de
ovoalbmina (OVA) en diversas muestras.
Sensibilizar placas de ELISA con 100 jil de
una solucin de OVA de 1 |ig ml (100 ng
de OVA/fosa), diluida en un buffer carbo
nato-bicarbonato lOOmM pH = 9,2-9,4.
Incubar durante 18 horas a 4C.
Lavar 3 veces con PBS-T.
Bloquear la placa por incubacin con 250
|il/fosa de una solucin de leche descremada
al 3% en PBS durante Ihora a 37"C.
Lavar 3 veces con PBS-T.
En un volumen de 50 |xl/fosa, realizar dilucio
nes seriadas en razn 2 de una solucin pa
trn de concentracin conocida de OVA, par
tiendo de una concentracin de 10 |ig m f .
Utilizar como diluyente una solucin de leche
descremada al 1% en PBS-T. Paralelamente,
realizar otra serie de diluciones de la/s muestra/s problema. Dejar una fosa sin OVA solu
ble ni muestra, que corresponder al 0% de
inhibicin.
Agregar a cada fosa 50 )il del doble de la dilu
cin del suero de conejo anti-OVA que pro
dujo una absorbancia igual al 90% de la ab
sorbancia mxima producida por ese suero,
diluido en leche descremada al 1% en PBS.
Incubar 1 hora a 37C,
Lavar 3 veces con PBS-T.
Incubar con 100 |J,l/fosa de la dilucin apropia
da del conjugado anti-y-globulinas de conejo
mai'cado con peroxidasa, diluido en una solu
cin de leche descremada al 1% en PBS-T,
durante 1 hora a 37C.
Lavar 3 veces con PBS-T.
Incubar con 100 |J,l/fosa de una solucin de ofenilendi amina de Img ml * en un buffer
de cido ctrico y fosfatos 0,1M pH = 5 y
H^Oj al 30% (1 }il m l'), durante 30 minutos
en la oscuridad.
Detener la reaccin por agregado de 25|J,1 de
HjSO,^ 4N a cada pocilio.
Leer la densidad ptica a 490nm en un lector
de policubetas.
Calcular el porcentaje de inhibicin producido
por cada dosis de OVA soluble, tomando como
0% de inhibicin la absorbancia obtenida en la
fosa incubada sin inhibidor (OVA soluble).

819

Graficar dicho porcentaje en funcin del loga

ritmo de la concentracin de OVA de la solu
cin patrn. Por interpolacin del porcentaje
de inhibicin producido por una muestra pro
blema se podr calcular la concentracin de
OVA en la misma.
6. Anlisis de la distribucin de reactividad
de sueros normales y clculo del valor
de corte

Se describe un ELISA de amplificacin para el

anlisis de la distribucin de reactividades de
sueros humanos normales a dilucin simple y
clculo del valor de corte del sistema frente a
un sobrenadante de 45.000xg de epimastigotes
de Trypanosoma cruzi lisados (fraccin F45).
Sensibilizar placas de ELISA con 100 |al de la
fraccin F45, a razn de 10 ag m f, diluida
en un buffer carbonato-bicarbonato lOOmM
pH = 9,2-9,4.
Incubar durante 18 horas a 4C.
Lavar 3 veces con PBS-T.
Bloquear la placa por incubacin con 250|al/fosa de una solucin de leche descremada al 3%
preparada en solucin fisiolgica tamponada
(PBS) durante 1 hora a 37<>C.
Lavar 3 veces con PBS suplem entado con
Tween 20 al 0,05% (PBS-T).
Realizar diluciones (1/500 o 1/1000) de al me
nos 30 sueros humanos normales y al menos
un suero de paciente chagsico (control posi
tivo). Utilizar como diluyente una solucin de
leche descremada al 1% en PBS-T. En cada
fosa debe quedar un volumen de 100 | i l .
Incubar 1 hora a 37C.
Lavar 3 veces con PBS-T.
Incubar con 100 |al/fosa de la dilucin apropia
da del conjugado anti-y-globulinas humanas
marcado con peroxidasa, diluido en una solu
cin de leche descremada al 1% en PBS-T,
durante 1 hora a 37C.
Lavar 3 veces con PBS-T.
Incubar con 100 |il/fosa de una solucin de ofenilendiamina de 1 mg m f en un buffer
de cido ctrico y fosfatos 0,1M pH = 5 y
HjOj al 30% (1 |al m f ), durante 30 minutos
en la oscuridad.
Detener la reaccin por agregado de 25 |J,1 de
HjSO^ 4N a cada pocilio.
Leer la densidad ptica a 490nm en un lector
de policubetas.
Agrupar las absorbancias de los sueros en in
tervalos de densidad ptica y graficar la fre
cuencia de cada intervalo en funcin del in
tervalo.
Paralelamente calcular la absorbancia media
(m) de los sueros negativos y el desvo estn
dar (a^ |). Con estos parmetros calcular el va
lor de corte del sistema como m + 2 o 3
,.

820

Metodologas

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Inmunoanlisis radiomtrcos

EDGARDO POSKUS

INTRODUCCIN
Los inmunoanlisis radiomtricos compren
den un conjunto de tcnicas en las cuales las
molculas implicadas como reactivos inmunoqumicos se hallan marcadas radiactivamente.
Como gua general puede considerarse que la
determinacin de los antgenos se efecta con
anticuerpos especficos como reactivos y que,
inversamente, la deteccin de anticuerpos espe
cficos se realiza con los correspondientes ant
genos. Tambin como modelo general puede
decirse que los reactivos de esos sistemas ana
lticos son los que estn marcados con un radionucleido, aunque como se ver principal
mente en el radioinmunoanlisis, las tcnicas
basadas en reacciones de competencia pueden
disearse de modo que se marca el mismo tipo
de molcula (se emplea, por ejemplo, antgeno
puro marcado para medir el antgeno fro que
se haha en muestras desconocidas y luego ara
bos interactan con los anticuerpos especfi
cos).
En la inmunologa moderna, tras unas cuatro
dcadas de aplicacin de estos recursos analti
cos, se ha verificado una fuerte competencia
metodolgica. Los principios inmunoenzimticos y los anlisis basados en quimioluminiscencia han disputado ltimamente el campo de
aplicacin con el radioinmunoensayo y sus su
cedneos. Hoy en da la eleccin de un mtodo
de anlisis aplicado a la inmunologa, o valin
dose de recursos que ella brinda, es un tema
complejo. Existen muchos factores que deciden
esa eleccin: los econmicos, los de seguridad
operativa, los de accesibiUdad, etc. Pero, si se
sopesan tambin las cuestiones referidas a re
producibilidad, exactitud y sensibilidad, debe
admitirse que no existen mtodos ideales y sus-

39
titutivos de los otros. En ese contexto las radio
metras han cedido posiciones, aunque conser
van un nmero de especificaciones de uso que,
en ciertos casos, las torna como la mejor op
cin disponible.
Dado que el radioinmunoensayo, o radioin
munoanlisis, es la tcnica radiomtrica proto
tipo y la que efectu el mayor impacto histri
co relativo, comenzaremos a partir de ella la
descripcin de los mtodos radiomtricos de
base inmunolgica.
RADIOINMUNOENSAYO
El desarrollo del radioinmunoensayo {radioimmunoassay, RIA) comienza en 1956 de
forma un tanto desapercibida, con los trabajos
de Yalow y Berson sobre el metabolismo de la
insulina. Esos autores hallaron que la cantidad
de insulina marcada con tomos de iodo radiac
tivo que se una a una fraccin de globulinas de
individuos diabticos (luego reconocida como
anticuerpos), se relacionaba con la concentra
cin de insulina fra existente. Tal observacin
constituy la base de la deteccin de esa hor
mona plasmtica y del posterior desarrollo de
todos los mtodos radioinmunolgicos de satu
racin y desplazamiento. A partir de las prime
ras publicaciones en 1959 y 1960 que descri
bieron explcitamente la determinacin de insu
lina plasmtica sin previa extraccin, result
ampliamente reconocido que el RIA era un m
todo ventajoso. Entre sus cualidades se hallan
la alta sensibilidad, su comparativa sencillez
respecto de los mtodos biolgicos usados en
endocrinologa, y su versatilidad para aplicarlo
a muestras de pequeos volmenes y en gran
des series. Esas propiedades lo convierten en

820

Metodologas

BIBLIOGRAFA
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Inmunoanlisis radiomtrcos

EDGARDO POSKUS

INTRODUCCIN
Los inmunoanlisis radiomtrcos compren
den un conjunto de tcnicas en las cuales las
molculas implicadas como reactivos inmunoqumicos se hallan marcadas radiactivamente.
Como gua general puede considerarse que la
determinacin de los antgenos se efecta con
anticuerpos especficos como reactivos y que,
inversamente, la deteccin de anticuerpos espe
cficos se realiza con los correspondientes ant
genos. Tambin como modelo general puede
decirse que los reactivos de esos sistemas ana
lticos son los que estn marcados con un radionucleido, aunque como se ver principal
mente en el radioinmunoanlisis, las tcnicas
basadas en reacciones de competencia pueden
disearse de modo que se marca el mismo tipo
de molcula (se emplea, por ejemplo, antgeno
puro marcado para medir el antgeno fro que
se haUa en muestras desconocidas y luego ara
bos interactan con los anticuerpos especfi
cos).
En la inmunologa moderna, tras unas cuatro
dcadas de aplicacin de estos recursos analti
cos, se ha verificado una fuerte competencia
metodolgica. Los principios inmunoenzimti
cos y los anlisis basados en quimioluminis
cencia han disputado ltimamente el campo de
aplicacin con el radioinmunoensayo y sus su
cedneos, Hoy en da la eleccin de un mtodo
de anlisis aplicado a la inmunologa, o valin
dose de recursos que ella brinda, es un tema
complejo. Existen muchos factores que deciden
esa eleccin: los econmicos, los de seguridad
operativa, los de accesibilidad, etc, Pero, si se
sopesan tambin las cuestiones referidas a reproducibilidad, exactitud y sensibilidad, debe
admitirse que no existen mtodos ideales y sus-

39
titutivos de los otros. En ese contexto las radio
metras han cedido posiciones, aunque conser
van un nmero de especificaciones de uso que,
en ciertos casos, las torna como la mejor op
cin disponible.
Dado que el radioinmunoensayo, o radioin
munoanlisis, es la tcnica radiomtrica proto
tipo y la que efectu el mayor impacto histri
co relativo, comenzaremos a partir de ella la
descripcin de los mtodos radiomtrcos de
base inmunolgica.
RADIOINMUNOENSAYO
El desarrollo del radioinmunoensayo {radioimmunoassay, RIA) comienza en 1956 de
forma un tanto desapercibida, con los trabajos
de Yalow y Berson sobre el metabolismo de la
insulina. Esos autores hallaron que la cantidad
de insulina marcada con tomos de iodo radiac
tivo que se una a una fraccin de globulinas de
individuos diabticos (luego reconocida como
anticuerpos), se relacionaba con la concentra
cin de insulina fra existente. Tal observacin
constituy la base de la deteccin de esa hor
mona plasmtica y del posterior desarrollo de
todos los mtodos radioinmunolgicos de satu
racin y desplazamiento. A partir de las prime
ras publicaciones en 1959 y 1960 que descri
bieron explcitamente la determinacin de insu
lina plasmtica sin previa extraccin, result
ampliamente reconocido que el RIA era un m
todo ventajoso. Entre sus cualidades se hallan
la alta sensibilidad, su comparativa sencillez
respecto de los mtodos biolgicos usados en
endocrinologa, y su versatiUdad para aplicarlo
a muestras de pequeos volmenes y en gran
des series. Esas propiedades lo convierten en

822

Metodologas

uno de los mtodos analticos de base inmunolgica de mayor importancia, con proyecciones
en medicina, veterinaria y en reas no mdicas
interesadas en la deteccin de muy bajas con
centraciones de compuestos orgnicos. Las va
riantes metodolgicas acumuladas ltimamente
hacen que no exista un RIA en particular, sino
un conjunto de procedimientos basados en un
principio general que describiremos a continua
cin.

SECUENCIA EXPERIMENTAL DEL RIA

Una vez cubierta la etapa de los requeri
mientos (obtencin de antisueros, preparacin
de los trazadores, seleccin de los mtodos se
parativos, etc.) para la ejecucin de un RA se
efectan dos ensayos fundamentales: 1) la titu
lacin del antsuero, y 2) el ensayo de despla
zamiento o RIA propiamente dicho.
Ensayo de titulacin o curva de calibracin

PRINCIPIO GENERAL
La base del RIA consiste en la inhibicin
competitiva de la unin de un antgeno radiac
tivo (trazador) a su anticuerpo especfico por
parte del antgeno no marcado. El sistema radioinmunolgico descrito puede esquemati
zarse como una interaccin reversible combi
nada;
A g*

Ac-A g*

Ag

A c-A g

Ac

( 1)

donde Ac representa el anticuerpo especfico;

Ag* es el antgeno marcado (trazador) libre;
Ag es el antgeno libre no marcado de las solu
ciones patrones o de las muestras desconoci
das; Ac-Ag* es el complejo soluble entre el
anticuerpo y el antgeno marcado, y Ac-Ag
es e! complejo soluble con el antgeno no mar
cado.
El proceso obedece a la ley de accin de ma
sas y, adems la distribucin del trazador den
tro del antgeno total es indiscriminable por
medio del anticuerpo de modo que, cuanto ma
yor sea la cantidad de antgeno no marcado
presente, menor ser la cantidad de trazador
que se une al anticuerpo. Bajo este principio se
puede determinar la concentracin del antgeno
en muestras complejas de fluidos biolgicos
con suficiente sensibilidad y especificidad si se
cumplen los siguientes requisitos: 1) el traza
dor es altamente radiactivo y por lo tanto puede
colocarse en concentraciones infinitesimales,
pero cuantificables, y 2) el anticuerpo es alta
mente especfico, posee muy alta afinidad y se
halla en muy baja concentracin. La justifica
cin terica y el ajuste de las condiciones expe
rimentales en relacin a esos postulados se
enuncian formalmente ms adelante.
Para efectuar las determinaciones que si
guen, adems de optimizar la calidad y la con
centracin de los componentes del sistema, es
necesario aplicar algn mtodo que permita se
parar y medir el trazador libre y el trazador uni
do. Todas esas operaciones se realizan segn
un diseo general cuya secuencia se da a conti
nuacin.

En esta etapa se efecta un ajuste emprico

de la concentracin de los anticuerpos especfi
cos actuantes en el test. En la figura 39-1 se
muestra un esquema del ensayo y la seleccin
final de la dilucin del antsuero para condicio
nes especificadas. En este caso se utiliz polietlenglicol (PEG) como agente separativo del
antgeno en sus formas libre, f* (del vocablo
ingls universalmente adoptado, free) y unida,
b* (de bound). El PEG al 12,5% de concentra
cin final y en fro, precipita casi exclusiva
mente las inmunoglobulinas, estn libres o uni
das a antgenos. Otros sistemas y recursos se
parativos tambin son aplicables segn vere
mos en la parte final de Requerimientos. Me
diante la representacin grfica de alguna de
las variables con que suele expresarse la res
puesta (la ms sencilla es la actvidad de los
precipitados), en funcin de la dilucin del an
tisuero, puede seleccionarse un valor apropia
do. Segn se ver en la explicacin terica,
puede optarse por aquella dilucin que cause
aproximadamente un 50% de unin del antge
no radiactivo (fig. 39-1).
Ensayo de desplazamiento
Este etapa consiste en la elaboracin de una
curva patrn, empleando una dilucin fija del
antisuero segn se mencion en la etapa de titu
lacin, frente a una serie de concentraciones co
nocidas del antgeno fro. Obviamente el traza
dor y los otros componentes y condiciones del
sistema no se modifican respecto de la etapa de
titulacin. En la figura 39-2 se muestra el es
quema general de un ensayo modelo. Luego del
procesamiento de la informacin (cuadro 39-1)
es factible calcular la concentracin de mues
tras desconocidas mediante la interpolacin de
las respuestas dentro de los mismos rangos.
Una mejor visualizacin de lo mencionado
antes se obtiene redefiniendo los componentes
de los equilibrios presentados en (1) como sigue:
A c-Ag*

A g*

(b*)

(f*)
Ac
(Q)

(2 )
Ag

(i)

A c-A g

(b)

Inmunoanlisis radiomtricos
TuboN

R EACC IO N

823

T R A Z A D O R 0,1 ml (10 cpm)

D ILU Y E N TE 0,1 ml
A N TIS U E R O 0,1 ml
Dilucin

IN C U BAC I N

1/103

1/2x10^

-1/1 OV 1/103

CT

SU E R O
C O N TR O L
NO IN M U NE

4C, 1-5 das

37C, 2-18 horas

------T u bos N 1 - Y -

SEPAR AC I N

P olletilengllcol
(PEG 6000) 1 5 % .................... 1,5 ml (4C)
A gitacin
C entrifugacin
sepa ra cin y conteo

SN

=>P
10

G R A FIC A C I N
b*
(cpm X 1Cr^)

1/1Q3

1 / 10 1/ 10 = 1/106

Dilucin del antisuero

)
Fig. 39-1. C urva de titulacin del antisuero o de calibracin para la seleccin de la dilucin apropiada en los ensayos p o s
teriores del R IA (en el m odelo: 1/2,5 x 10^; expresada com o dilucin final ser tres veces m ayor).
CT: control de cuentas totales adicionadas en todos los tubos. Las condiciones de incubacin sealadas representan a l
gunas de las variantes ms usads. El PEG acta com o agente de separacin pues precipita las inm unoglobulinas lib res y
las unidas al antgeno. T am bin existen otros mtodos separativos.
La form a de la curva en el m bito de las diluciones bajas y la unin incom pleta del trazador se deben a diversos facto res
que no se analizarn aqu. L os ensayos esquem atizados suelen realizarse po r duplicado o triplicado.

donde Q representa el anticuerpo libre o, ixts

precisamente, el sitio ligante para un anti
cuerpo considerado como univalente; f* repre
senta el trazador libre; b* es el trazador unido
al anticuerpo; f es el antgeno fro libre, y b es
el antgeno fro unido. Luego la curva patrn o
estndar que refleja la relacin bsica dosisrespuesta del RIA puede trazarse, por ejemplo,
representando b* u otras formas derivadas, en
funcin de la concentracin de antgeno fro
adicionado (cuadro 39-1 y fig. 39-3 A-D). En
particular la relacin b*/f* es muy utilizada y
ventajosa. Ese cociente puede obtenerse direc
tamente de las actividades (cuentas por minuto)
determinadas para cada fase luego de separado
el antgeno libre del unido. Pero, como adems
se parte del supuesto de que el anticuerpo no

distingue entre el antgeno genuino y el marca

do, la distribucin de antgeno fro libre y uni
do tambin es la misma (b*/f* = b/f). Vemos,
entonces, que en general el cociente definido
por la concentracin del antgeno total unido
(B) y la correspondiente al antgeno total libre
(FX resulta ponderado idealmente por este m e
dio. Por ende, se puede prescindir, al confec
cionar las escalas, de toda referencia a la po
blacin de m olculas m arcadas. Esto es,
b*/f* = B/F.
En la prctica se han aplicado numerosas va
riantes para la representacin grfica de las res
puestas medidas y de ellas hap surgido diferen
tes tipos de curvas patrones, incluso otras ro
presentes en 1a figura 39-3. La representacin
grfica de cualquiera de esas variantes suele

824

Metodologas

REACCION

T ubo N=

10

TRAZADOR 0,1 mi (10 cpm)

ANTISUERO 0,1 mi (1/2,5 x lO^^)
ANTGENO 0,1 mi
conc. final
(ng/0,3 mi)

INCUBACION

0,026

0,052

0,833

MD

CT

4C, 1-5 das

37C, 2-18 horas
-Tubos Ns 1 - 9-

SEPARACIN

Polietilenglicol
(PEG 6000) 1 5 % ...................1,5 mi (4C)
Agitacin
Centrifugacin,
separacin y conteo

PROCESAMIENTO V ase cuadro 39-1

F ig . 39-2. E squem a del desarrollo experim ental de un RIA para insulina. La dilucin del antisuero em pleado es la hallada
p reviam ente en un ensayo de titulacin (fig. 39-1).
antgeno en gran exceso para control de la unin inespecfica. A veces suele incluirse en su lugar un control com o el
del tubo y en la figura 39-1.
M D: m uestra desconocida. CT: control de cuentas totales adicionadas en todos los tubos. Las condiciones de incubacin
son las m ism as escogidas para la titulacin. Los ensayos esquem atizados suelen realizarse por duplicado o triplicado.

Cuadro 39-1. Valores correspondientes al RIA ni >delo para insulina desarrollado en la figura
39-2
E xpresiones de los datos

Tubo
N"

1
2
3
4
5

6
7

8
9

10

D osis de
antgeno
(ng/0.3 mi)

0
0,026
0,052
0,104
0,208
0,417
0,833
oo
MD
CT

Respuesta
b* (cpm)

Bo

1,00

1,00

0,15

0,90
0,80
0,60
0,40
0,30

0,82
0,67
0,43
0,25
0,18

0,10

0,20

0,11

0,03
0,35

0,06
0,70

0,03
0,54

5.000 (b *)
4.500
4.000
3.000

0,50
0,45
0,40
0,30

2.000

0,20

1.500

1.000
300 U N E
3.500
10.000 (T)

b^ : cuentas p ro m ed io d e d u p licad o s o trip lic ad o s un id o s a an ticu e rp o s. P o r re s u lta r p ro p o rcio n ales a las co n c en ra cio n es d ei an tg en o un id o
(B ) en las ex p resio n es re la tiv a s a p a rec e d ire c ta m e n te este sm bolo,
an tg en o en g ra n exceso.
U N E : unin n o esp e cfica . E se v alo r tam b in p u e d e su strae rse a todos los dato s d e b* antes d e e fectu a r los clculos.

Inmunoanlisis radiomtricos
B
T
0,5

B__
B

825

b*
(cpm X 103)

0,4

0,3

0,2
0,1

Dosis (insulina, ng/0,3 ml)

Dosis (insulina, ng/0,3 ml)

Dosis (insulina, ng/0,3 ml)

F ig. 39-3. Curvas estndar obtenidas del R IA m odelo para insulina (datos en cuadro 39-1). La concentracin de an tg en o
en la m uestra desconocida puede estim arse por interpolacin segn se indica en los grficos. Las lneas cortadas p aralela s
al eje de abscisas indican la unin no especfica. A, B, C, D son distintas form as de expresin grfica. N tese que en C y D
las dosis se representan en escala geom trica, equivalente a una escala aritm tica de log [Ag]

dar resultados aceptables; sin embargo las cur

vas hiperblicas de los datos sin transforma
cin previa (fig. 39-3 A y B) pueden generar di
ficultades para interpolar con exactitud valores
extremos de concentracin del antgeno en
muestras desconocidas. Si la variable indepen
diente se grafica sobre el eje de abscisas como
el log de la concentracin, y la variable depen
diente (en forma directa o en alguna de sus
transformaciones) se representa linealmente en
ordenadas, se obtienen curvas sigmoidales
(fig. 39-3 C, D).
Otros procedimientos de transformacin de
ambas variables se emplean para la rectifica

cin de la curva estndar. Entre los ms em

pleados se halla la transformacin logit-log,
donde el logit de la variable y se define segn:
logit y = In

1- y

para y = B/Bo,
logit B /Bo = In

B /B o
1 - B /B o

donde B/Bo se obtiene como se indica en el

cuadro 39-1, aunque previamente suele dedu
cirse la unin inespecfica y se calculan los co
cientes corregidos (B/Bo)^.

826

Metodologas

D o sis
(n g /0 ,3 m l) \

0 ,9 9

0 ,0 2 6
0 ,0 5 2
0 ,1 0 4
0 ,2 0 8
0 ,4 1 7
0 ,8 3 3
MD

\
J ,

0 ,8 9
0 ,7 9
0 ,5 7
0 ,3 6
0 ,2 6
0 ,1 5
0 ,6 8

F ig. 39-4. Transform acin log it-lo g de la c u rv a est n d ar.

La recta ajustada a los puntos
experim entales puede ob ten er
se con ca lcu la d o ras sen cillas
program adas p ara efectuar re
g re s io n e s lin e a le s o c o n un
procesador y graficador en l
n ea con el c o n ta d o r g am m a.
Los valores representados c o
rresponden a los datos del cu a
dro 39-1 luego de co rrecci n
por la unin no especfica (re
cu ad ro inserto). La escala de
ordenadas de la izquierda y la
escala de abscisas son las h a
lladas en cartas lo g it-lo g im
presas. Los datos en ese caso
in g re s a n sin p r o c e s a m ie n to
previo.

\B ,

2 ,0 9
1 ,3 2
0 ,2 8
0 ,5 8
1 ,0 5
1 ,7 3
0 ,7 5

0 ,0 5
0 ,0 4
0 ,0 3

0,02
10 ^
D o sis (n g /0 ,3 mi)

En pocos casos se obtiene una rectificacin

semejante a la ideal. En los contadores y auto
mticos provistos de un procesador programa
do para esos clculos, o mediante ordenadores
en lnea o independientes, puede obtenerse un
grfico con la recta de ajuste optimizado y sus
parmetros estadsticos.
En la fig. 39-4 se muestra un ejemplo de rec-
tificacin de la curva estndar luego de la
transformacin logit-log. Las desviaciones de
la linealidad observadas se deben a errores ex
perimentales. Las ms notorias suelen darse en
los rangos extremos de concentracin de ant
geno.
Clculos de los parmetros
de la interaccin primaria
Los procesamientos hasta aqu indicados
conducen ordinariamente al clculo de la con
centracin del antgeno en muestras desconoci
das. Este es el objetivo esencial y rutinario de
los RIAs como procedimientos de difundida
aplicacin, por ejemplo en analtica clnica. Sin
embargo, con otros propsitos de investigacin
bsica puede requerirse la estimacin de las

10-0

afinidades y la capacidad de unin de los anti

cuerpos involucrados, as como una expresin
formal de la reactividad cruzada de antgenos
alternativos en el ensayo, etc. Para todo ello se
requiere tratar previamente con cierta profundi
dad la teora bsica del RIA, de la cual es posi
ble calcular luego con cierta aproximacin los
valores de esos parmetros. Como se ver, esa
informacin tambin surge a partir de las cur
vas de desplazamiento.
TEORA MATEMTICA DEL RIA
La teora bsica del RIA ha sido desarrollada
fundamentalmente para el diseo racionalizado
de los procedimientos, para evaluar la cah dad y
la capacidad analtica y para la interpretacin
de los resultados, todo lo cual implica poder
medir la afinidad y la concentracin de los an
ticuerpos en el ensayo. Por ello, para el trata
miento de este tema necesariamente deben re
visarse los principios bsicos de la interaccin
primaria antgeno-anticuerpo.
Algunas de las ecuaciones fundamentales
dadas en el captulo 8 vuelven a presentarse,

Inmunoanlisis radiomtrcos

aunque ahora como variantes especialmente

adaptadas a esta metodologa. Asimismo, las
representaciones grficas han sido efectuadas
en los sistemas de coordenadas ms propicios,
de modo de destacar ciertos efectos e implica
ciones de las curvas dosis-respuesta y derivar
las predicciones tericas ms relevantes.
Inicialmente consideraremos en algn deta
lle el modelo ms sencillo de RIA y analizare
mos sus propiedades. Luego trataremos en cier
ta extensin algunos modelos ms complejos y
cercanos a las situaciones reales.

827

En el equilibrio y de acuerdo a la ley de ac

cin de masas de primer orden tenemos cue:
[b*
K* = -

(5)

1^2

[f*:i Q]
ib]

K=

[fj [Q]

^ 2

( 6)

donde K* y K representan las constantes de

afinidad. En virtud de la suposicin 3 del mo
delo bsico K* = K. La concentracin total de
antgeno unido ya haba sido simbolizada antes
como B, la cual est dada entonces por:

A. El modelo bsico

B = [b*| + [b]

(7)

El modelo ms sencillo posible de RIA con

tiene un nmero de restricciones o postulados
que se enumeran a continuacin:

En forma similar, la concentracin total de

antgeno libre, F, est dada por:

1, Tanto el antgeno como el anticuerpo son

especies qumicas homogneas y univalentes,
2, La interaccin antgeno-anticuerpo obe
dece a la ley de accin de masas de primer or
den (con una cintica qumica de segundo or
den) sin que existan otros fenmenos alostricos o cooperativos,
3, El antgeno marcado radiactivamente
(trazador) es indistinguible del antgeno inmodificado, desde el punto de vista de su inmunorreactividad.
4, La condicin final considerada luego de
la reaccin antgeno-anticuerpo es la del equili
brio,
5, Las formas libres y unida del trazador son
idealmente separables, sin perturbaciones del
equilibrio y finalmente son medibles con exac
titud.

Luego, la relacin de antgeno unido a libre

ya mencionada, B/F, puede expresarse segn:

Aunque muchas de esas imposiciones no se

alcanzan en las situaciones experimentales rea
les, el tratamiento que sigue provee una razo
nable aproximacin a los sistemas de RIA apli
cados habitualmente. Luego, en forma progre
siva iremos considerando las situaciones de in
cumplimiento simple o combinado de esos pos
tulados.
Para cada una de las interacciones represen
tadas en (2) podemos escribir:
f* +

Q z >
k,

f + Q

F = [f-M + [ f l

(8 )

[b*]

[b]

|f*]

[f]

(9)
F

De (6) y (9) obtenemos.

B
K = --------F [Q]

( 10)

Adems, podemos definir la concentracin

total de antgeno marcado. A*, como:
A*

= [f*| +

[b * ]

( 1)

y la de antgeno fro. A, como:

A = m + [bj

( 12 )

Finalmente, la concentracin de antgeno to

tal, A j se define como:
A,,, =

A*

( i3)

Por otro lado, definimos la concentracin to

tal de anticuerpo, q, como:
q = [Q]-H [b*] + |b l

(14)

Luego, de acuerdo a (7) tenemos que:

q = [Q] + B

(15)

Combinando (10) y (15) y reordenando, ob

tenemos;

b*

(16)

(4)

donde k, y k, simbolizan las constantes cinti

cas de asociacin, y k, y k^, las constantes ci
nticas de disociacin.

El grfico de Scatchard

La ecuacin (16) indica que existe una rela

cin lineal entre la relacin B/F y la concentra
cin del antgeno unido, B. Esta rectificacin
de la ley de accin de masas de primer orden

828

Metodologas

En la figura 39-5 se muestra un ensayo de

desplazamiento efectuado con un sistema antgeno-anticuerpo para el cual se cumplen con
suficiente aproximacin los postulados del
modelo bsico. En particular, el empleo de un
anticuerpo monoclonal decide que el grfico
de Scatchard obtenido sea lineal (representa
cin incluida en la misma fig. 39-5). La recta
obtenida tiene una pendiente de -K e intercep
ta las abscisas en un valor de B igual a la con
centracin de sitios totales de anticuerpo, q.
En general, se requiere una medida indepen
diente de la concentracin de anticuerpos,
[Ac], para obtener mediante el cociente q/[Ac]
la valencia del anticuerpo en cuestin. Recor
demos al respecto que puede obtenerse otra
forma de la ecuacin de Scatchard segn la
relacin:

1.5

1,0

= K ( n - r )

0,5

-J-

J-

Dosis (hGH, ng/0,5 ml)

F ig . 39 -5 . A n lisis de d esp la zam ien to p ara el antgeno
hG H (horm ona de crecim iento hum ana) y un anticuerpo
m onoclonal especfico (Q A 68). El trazador em pleado fue
' I-hG H. (): m edia de ios puntos experim entales. El gr
fico m enor insertado corresponde a un anlisis de S cat
ch ard cuya pendiente es igual a 2,5 x 10 M ' y correspon
de a -K . La proyeccin que intercepta las abscisas perm ite
calcular la concentracin de sitios ligantes, totales (q) en el
sistem a. D e ese dato y de la dilucin del fluido asctico en
q u e se h allaba el anticuerpo Q A 68 se pudo hallar la capa
cidad de unin. A dem s, a nartir de K y q y de los otros
p arm etros fijados para el ensayo pudieron calcularse los
valores de las resp u estis p m c u q u ie r valor de la dosis.
Esos valores tericos ti ish d ad o s nuevam ente al grfico de
desplazam iento (o) m uestran la coherencia del tratam iento

fue originalmente des

ida por Scatchard,
en 1949, para describir las interacciones entre
protenas y pequeas molculas. Posteriormen
te fue aplicada al RIA por Berson y Yalow.
La ecuacin (16) constituye la forma ms
simple y compacta para expresar la evolucin
de la relacin B/F como una respuesta variable
en el RIA.

(17)

donde r se define como el nmero de sitios de

anticuerpo ocupados por el antgeno (B/[Ac]),
n se define como el nmero total de sitios li
gantes por molcula de anticuerpo y c equivale
a la concentracin del ligando libre que noso
tros aqu simbolizamos como F.
Segn la ecuacin (17), de la pendiente de
un grfico de r/c = f (r) tambin se obtiene -K,
pero de la interseccin con las abscisas se ha
lla n. O sea que, tanto a partir de la ecuacin
(16) como de la (17), se requiere conocer la
concentracin de anticuerpo total por un pro
cedimiento separado. La diferencia radica en
que a partir de la ecuacin (16) puede prescindirse de esta determinacin si slo se desea
medir K y la concentracin de anticuerpos, ya
sea en el ensayo (q) o en el fluido original sin
diluir (concentracin total original o capacidad
de unin, en trminos del antgeno total que
potencialmente se puede ligar). El valor de n
en muchos casos no es objeto de clculo si se
trata de una clase de inmunoglobulina nor
mal (n = 2 para IgG e IgA y 5 o 10 para
IgM). En estos casos, q y [Ac] total se interconvierten fcilmente. Pero, si en cambio se
trata de definir la valencia de anticuerpos asi
mtricos (p. ej., los definidos como coprecipi
tantes), donde obviamente n no puede presu
ponerse, entonces, es imposible soslayar la de
terminacin de [Ac] totales para luego calcular
n con la ecuacin (16) o (17) indistintamente.
Esa equivalencia puede formalizarse reempla
zando F por c en la ecuacin (16) y dividin
dola por [Ac] total. De ese modo, llegamos a
la ecuacin (17). Una ventaja para normalizar
los datos en trminos de r/c ha sido sugerida
cuando los ensayos de interaccin primaria
se hacen variando la concentracin de anti
cuerpo.

Inmunoanlisis radiomtricos
E l clculo de B

829

(T + D)

A* + A =

( 21 )

PM x V

Las concentraciones suelen estar expresadas

en moles por litro, consecuentemente los valo
res de K quedarn expresados en litros por mol
(M"'). Si se emplea otra escala de concentracio
nes, por ejemplo para q y B en la ecuacin
(16), se ve que se produce un cambio recproco
en las unidades de K. Para obtener los valores
de B en un grfico como el de la figura 39-5
debemos considerar los datos de las dosis de
antgeno adicionado (variable independiente) y
adems los valores de las respectivas respues
tas. Se puede hallar una expresin de B en fun
cin de la concentracin del antgeno total,
y de B/F a partir de las ecuaciones (7), (8) y
(11)-(13), de donde primero se deduce que;
B + F = A,,

09)

ExA E

Si se combinan las ecuaciones (21) y (22), se

tiene la relacin buscada para calcular la con
centracin del antgeno total en moles por litro:
A^ = A* + A =

10-6

y finalmente se llega a:

(22)

T = 4,54 X 10^-2

(18)

Luego, despejando F y dividiendo por B se

obtiene:
A^ - 1

Pero, a su vez, T en la prctica puede expre

sarse en trminos de otras unidades. Estas son
la actividad colocada (a) en cpm, la eficiencia
del contador (E) expresada en porcentaje (la
cual convierte las cpm en desintegraciones por
minuto, dpm) y la actividad especfica (AE), la
cual suele expresarse en |aCi/|J.g. Considerando
que un Ci es igual a 2,2 x 10'^ dpm y requirindose la conversin de las unidades de trazador
en nanogramos finales, se puede deducir otro
factor de conversin igual a 4,54 x 1 0 De es
te modo, la expresin explcita de T en nano
gramos ser:

= ---------------------

PM x V

/
,
( 4 ,5 4 x 1 0 - ^
y

a
\
----------- + D 1
E X AE
)

(23)

( 20)

En forma anloga se deduce para F:

F =

A
(20)
+ 1
F

La ecuacin (20) permite calcular B en con

centracin molar cuando A.j, ingresa en las mis
mas unidades, ya que F/B es el cociente adimensional que se obtiene de la determinacin
de actividades segn la ecuacin (9). Sin em
bargo, en la prctica resulta ms til obtener
una expresin equivalente a la (20), donde las
concentraciones se convierten a las unidades
moles por litro a partir de otras unidades de uso
habitual en el RIA. Por ejemplo, en la curva de
desplazamiento de la figura 39-5, la concentra
cin del antgeno se expresa en ng/volumen de
reaccin; luego resulta til ingresar en la ecua
cin (20) el dato de dosis, D, directamente en
nanogramos. El factor que permite esa conver
sin es lO'VPM X V, donde PM representa el
peso molecular del antgeno y V el volumen de
reaccin expresado en mililitros. Como en vir
tud de la relacin (13) A^ puede desdoblarse en
los componentes marcado y fro (A* y A), ese
factor permitir calcular inclusive A* si tam
bin la cantidad de trazador, T, se da en nano
gramos.
Entonces, utilizando el factor comn de con
versin, tenemos que:

Obviamente, si V, a, E, AE y D en forma in
dividual o combinada se dan en otras unidades,
debern ajustarse los factores de conversin
respectivos.
Al reemplazar el numerador de la ecuacin
(20) por su equivalente en la (23), puede hallar
se 13 en moles/litro. Ese fue el procedimiento
seguido para calcular los valores de B en el
grfico de Scatchard de la figura 39-5 a partir
de los datos de la curva de desplazamiento.
Revisin de conceptos para definir el nivel
de antgeno trazador

Las transformaciones hasta aqu sealadas no

significan solamente una ventaja para operar en
los clculos de B en concentraciones molares.
Adems, para la deduccin de la ecuacin (23)
se ha introducido el concepto de actividad espe
cfica del trazador, como un relacin entre la
actividad y la m a p de la molcula marcada.
Ese valor constituye una especificacin relativa
al nmero y la calidad de tomos del nucleido
con que se ha modificado el antgeno.
Los conceptos bsicos de radioqumica per
miten deducir una expresin compacta para el
clculo de la actividad especfica terica de un
trazador preparado mediante la incorporacin
de n tomos de nucleidos radiactivos. En parti
cular, para n = 1 se tiene que:
AE =

1,88

PM

IQii

(24)

830

Metodologas

donde
ss el perodo de semidesintegracin
del istopo radiactivo expresado en minutos.
La AE resulta expresada entonces en [iCi/jig.
Las unidades de tiempo pueden seleccionarse
para los distintos tipos de nucleidos segn su
estabilidad. As, por ejemplo, para el
cuyo
t /2 es de unos 60 das, el factor de la ecuacin
(24) se convierte en 1,30 x 10*. Por lo tanto,
expresando t,^j en das, la AE surge tambin en
|iCi/|Xg. Otros factores pueden convertir esos
datos en Ci/|imol, lo que representa otras uni
dades de AE de uso comn.
Las tcnicas de marcacin que permiten ob
tener distintos valores de AE sern menciona
das ms adelante cuando se trate el tema de los
requerimientos del RIA. Pero en este punto es
ms importante definir cul es el reflejo de la
AE en las propiedades de un trazador. Para ello
reconsideraremos un experimento de titulacin
como el de la figura 39-1, donde slo se coloca
el trazador y el antgeno fro no interviene. En
este caso, la ecuacin (23) nicamente incluir
el primer sumando. Se ve, entonces, que para
una actividad apropiada en el ensayo (p. ej.,
a ~ 10*cpm) la concentracin del trazador, A*,
guarda una relacin inversa con la AE. Cuando
la AE presenta un nivel relativamente alto (que
luego indicaremos en forma ms precisa), por
virtud del nucleido seleccionado y el grado de
incorporacin (ecuacin 24), A* presentar un
valor relativamente bajo. Ello repercutir en un
valor correspondientemente bajo de B segn la
ecuacin (20) y, por ltimo, en la (16), reorde
nada segn la relacin:
(1 6 )

Ahora resulta evidente que cuando B sea su

ficientemente bajo respecto de q, podr igno
rrselo, resultando:
-^ ^ K q

(25)

Ese valor inicial de B/F tambin es designa

do como (B/F)g.
Esa consideracin que pudo introducirse in
mediatamente despus de definir la ecuacin
(16), gana ahora un significado formal ms
contundente, ya que es la cantidad relativa del
trazador empleado la que puede causar que la
respuesta (B/F) sea funcin slo de la afinidad
y de la concentracin de los sitios ligantes
(K.q). La afinidad viene determinada por facto
res moleculares del paratope y del epitope, que
condicionan el nivel energtico de la interac
cin. Ello a su vez es consecuencia, por parte
del anticuerpo, de factores inscriptos en la in
munogentica del organismo que produjo tal
variante de anticuerpo. Con ello se intenta de
cir que el diseador de un RIA podr manio

brar con ese parmetro slo en trminos de la

seleccin apropiada del anticuerpo dentro de
un repertorio disponible. Pero q, s es un par
metro modulable, el cual puede ajustarse tenta
tivamente en un experimento de titulacin co
mo el de la figura 39-1 o, en casos menos fre
cuentes, conocida la concentracin por mto
dos independientes, puede colocarse en los en
sayos directamente en el rango de concentra
ciones que darn una unin del trazador de un
50%. Obsrvese que segn la ecuacin (25)
cuando B/F=l, q=l/K. Eso implica que, utili
zando un trazador de AE suficientemente alta,
un RIA puede ajustarse a una relacin (B/F)^ =
1 (respuesta inicial o valor de los ceros)
cuando la concentracin de sitios iguala la in
versa de la constante de equilibrio de asocia
cin. Ello no implica que esa situacin sea la
ptima para todos los fines analticos; sin em
bargo, es conceptualmente importante y otorga
una adecuada referencia en el momento de ge
nerar en forma racional un RIA optimizado.
Tambin es importante el papel del trazador
para decidir el lmite de deteccin del anlisis.
Esa situacin y otras, en las que la concentra
cin del trazador (o del antgeno en general) no
es insignificante respecto de q, se analizan en
la parte siguiente.
Anlisis de curvas dosis-respuesta

Las deducciones efectuadas hasta aqu nos

llevaron a la ecuacin ms simple posible (la
de Scatchard) para describir la evolucin de la
respuesta en el RIA en trminos de la variable
B/F. Sin embargo, an no presentamos formal
mente la evolucin de la variable B/F respecto
de la dosis de antgeno total. Esto es, no deduji
mos an la funcin que describe la curva de
desplazamiento. En este punto tambin debe
mos hacer un retorno a temas anteriores de la
secuencia para reconsiderarlos ms profunda
mente.
Como punto de partida consideremos que la
ecuacin (16) relaciona B/F con los parmetros
K,q y con la variable dependiente B. Pero ya
conocemos que B puede expresarse a su vez en
trminos de A,, (ecuacin 20). Sin embargo, es
ta ltima ecuacin tambin incluye la variable
B/F. Si reemplazamos entonces B en (16) por
su equivalente en (20) obtenemos luego de su
cesivos reordenamientos una ecuacin de B/F
en trminos de todas las variables implicadas:
/ B \2

+ [K (A,. - q) + i] - K q = O

(26)

Esta ecuacin cuadrtica ha sido deducida

por distintos autores siguiendo diversas vas.
Constituye la llave de todas las relaciones do

Inmunoanlisis radiomtricos

sis-respuesta en los ensayos de un anticuerpo

y un antgeno. Como la relacin B/F puede
expresarse en funcin de A*, A, q y K, es facti
ble generar toda la diversidad de curvas dosisrespuesta que se desee cambiando una o ms
de esas variables a la vez. Para ello basta con
asignar los valores de las variables, conservan
do la coherencia en la unidades. Por ejemplo,
A*, A y q en moles/litro y K en litros/mol.
Luego, por practicidad pueden tabularse los
coeficientes a, b y c de la ecuacin (26) para
cada condicin propuesta.
Los coeficientes de la variable en cada su
mando son:
a= 1
b = K (A ,,~q) + l
c = -K q
La solucin de la ecuacin puede hallarse se
gn la expresin tpica:
JL =

-b

^ r h T T '^ i c

2a

Ese algoritmo puede aplicarse a todos los da

tos tabulados (preferentemente con el auxilio
de una calculadora manual programable o de
un ordenador), y finalmente obtener los grfi
cos de desplazamiento simulados. En la figura
39-6 se muestra un modelo numrico para ilus
trar en qu proporcin se hallan todos los com
ponentes del sistema antgeno-anticuerpo para
una condicin inicial fija (K y q establecidos) y
dosis variables de trazador y de antgeno fro.
Observando atentamente la figura 39-6 con
cluimos que para q = l/K el antgeno marcado
cumple aceptablemente su funcin trazadora
hasta valores de concentracin vecinos a O, I K
(punto 3). Eso demuestra que no existe ventaja
en reducir la traza debajo de esa cota por medio
de un incremento de la AE o de una disminu
cin de la actividad aplicada. Fijada esa con
centracin del trazador, una dosis igual del an
tgeno fro disminuye poco la respuesta (punto
4), y probablemente en los casos reales no sea
discriminable de la anterior debido a la disper
sin de los valores experimentales. Cuando el
antgeno total iguala a l/K, y por ende en este
caso a q, la respuesta ha sufrido una variacin
franca (punto 5), cercana al punto medio del
rango. Finalmente, cuando la concentracin del
antgeno supera 10 veces el caso anterior, la
respuesta ha sufrido casi su mxima evolucin.
Aqu se ha cubierto prcticamente todo el ran
go til de ese RIA y nos hallamos cerca del
mbito de la unin inespecfica.
Si bien esta propuesta es suficientemente
ilustrativa a los fines didcticos, en la prctica
resulta ms til aplicar una forma explcita de
la ecuacin (26). Esto es, podemos retomar la

831

ecuacin (23) para calcular A,,, en trminos de

los datos directos de los protocolos analticos
(PM, V, a, E, AE y D), tal como se hizo para
B, y luego introducirlos ya normalizados en la
(26). En la figura 39-7 se ofrece una serie de
grficos en los que se han alterado los parme
tros en forma aislada o combinada. El simple
anlisis visual permite predecir qu consecuen
cias tendran tales cambios en los ensayos res
pecto de una situacin de referencia. De un
modo anlogo se ha deducido la curva terica
de la figura 39-5. En este caso q se ha calcula
do previamente de modo de ajustar el valor de
(B/F)q al experimental. Eso se logr mediante
un reordenamiento de la ecuacin (26) que per
mite despejar esa variable. Luego, proponiendo
las dosis, D, se calcularon las respectivas rela
ciones B/F por el procedimiento habitual.

Criterios de evaluacin del RIA

En general se considera que un RIA presenta
una buena curva cuando el ensayo arroja alta
exactitud, precisin y sensibilidad. Segn los
objetivos que se persigan en cada caso analtico
se har una diferente eleccin del sistema de
coordenadas y tambin diferir el criterio de
evaluacin. Varios son los parmetros que se
han usado para tales evaluaciones. Entre ellos
se incluyen: 1) la pendiente: en general cuanto
ms empinada sea la curva, mejor resultar el
ensayo, aunque la dispersin de los puntos ex
perimentales, concordantemente, tambin ser
mayor. 2) La interseccin en el eje de ordena
das, (B/F)^: ya se explic que este punto puede
condicionarse slo por la influencia de K y q
cuando el trazador es infinitesimal. Tambin
puede manipularse tal condicin para otras si
tuaciones mediante la orientacin de una ecua
cin como la (26). Siempre es deseable que se
parta de un valor apropiadamente alto. 3) Dosis
media del rango: se refiere a la dosis de antge
no que modifica la respuesta a un valor igual a
la mitad de su magnitud inicial. Este valor tam
bin se puede obtener de la interseccin en x de
la curva construida en un grfico logit-log. En
ese punto el logit B/Bo es cero y corresponde a
B/Bo = 0,5. 4) Coeficiente lambda: se lo define
en cada punto de la curva dosis-respuesta como
la pendiente en ese punto dividida por la des
viacin estndar calculada por la dispersin de
la respuesta en tal punto. Fls un parmetro esta
dstico que pondera la desviacin estndar o el
coeficiente de variacin de la respuesta estima
da para una muestra desconocida en ese punto.
5) Dosis mnima detectable: este parmetro es
de capital importancia ya que muchas veces re
sulta crtico en biologa detectar metabolitos,
hormonas o factores presentes en nfimas canti-

832

Metodologas

1,0

-------- 4

k = IQi M-'

0,8

0,6
0 ,4

0,2
O

10 -

10 - ' 2

10-1

10-10

dades en los fluidos bajo investigacin. La do

sis mnima deteetable ha sido denida como la
menor concentracin de antgeno fro, la cual,
cuando se adiciona a una solucin carente de
l, produce un cambio significativo en la varia
ble que expresa la respuesta. Normalmente se
realizan rplicas de todos los puntos de la cur
va patrn, incluidos los controles sin antgeno
fro (ceros). Luego se calcula la media (X) y la
desviacin estndar (DE) de las respuestas ex
perimentales en cada punto. Para los ceros se
sustrae del valor medio el valor equivalente a 3
veces la desviacin estndar y se lo proyecta
hacia la curva dosis-respuesta, El valor corres
pondiente a ese punto en las abscisas determina
la dosis mnima deteetable. Como se advierte,
ese parmetro est muy influenciado por la pre
cisin, reflejando la variacin causada por las
micropipetas y dispensadores y los propios
operadores. El control de la precisin puede
hacerse construyendo una curva o un perfil de
precisin a lo largo de la curva estndar. En or
denadas suele representarse el coeficiente de
variacin (CV % = DE x 100/X). La curva ob
tenida habitualmente tiene la forma de U.
Segn las recomendaciones de R. P. Ekins,

10-9

F ig . 39 -6 . C u rv a de d esp lazam ien to te rica

para un R IA ideal realizado con un anticuerpo
hom ogneo. L a tabla inferior ilustra encolum nadam ente la proporcin d e m olculas totales,
com binadas y libres de cada tipo (los valores
ta b u la d o s r e p r e s e n t a n c o n c e n tr a c io n e s
M X 10'^ en nm eros integrales por sim plici
dad) y finalm ente la relacin B /F calculada.
A ju stad o el v alo r d e q a 1/K las relacio n e s
B /F se dedujeron em pleando la ecuacin (26)
para cada dosis propuesta. P untos 1-3: traza
dor (A*) igual a 0,002/K , 0,01/K y 0,1/K , res
pectivam ente. P unto 4: trazador igual a 0,1/K
m s igual dosis d e antgeno fro (A). P untos
5-6: trazador igual a 0,1/K m s antgeno frl^o
hasta antgeno total igual a 1/K y 10/K, re s
pectivam ente.

cuando se fija la concentracin de anticuerpos

al valor 3/K y la concentracin del trazador a
4/K, se obtiene la menor dosis deteetable posi
ble. En ese caso, adems se predice que las cur
vas se iniciarn con un mismo valor de B/F = 1
para cualquier K propuesta. Tambin se deduce
que, si slo existe el error de conteo, esa rela
cin de K, q y trazador provee el mejor coefi
ciente lambda para los ceros.
El trm ino sensibilidad, frecuentem ente
mencionado en el rea del RIA, ha generado al
guna controversia respecto de la definicin ms
apropiada. Nosotros aqu podemos definirla
tanto en trminos de la dosis mnima deteetable
como de la pendiente de la curva estndar do
sis-respuesta. Esta asimilacin es vlida si se
supone que el error experimental no cambia
cuando logra aumentarse la pendiente de un en
sayo y entonces esto se traduce en una reduc
cin de la dosis mnima deteetable. El siguiente
ejemplo concreto puede servir para clarificar el
concepto: supongamos que la pendiente de una
curva dosis-respuesta conduce a un cambio del
10% en la respuesta para una dosis de xpg, y
que el error estadstico en la determinacin es
del 10%. Entonces la cantidad mnima detecta-

Inmunoanlisis radiomtrcos

833

T
A E = 3 0 0 n C i/jig
a = 5 .000 cpm
E = 70 %

K=10'M -\ K=109M-'
K=10"M-' \q = 10-IVI \q = 10-9M
\ q = 10 -"M

0,01

0,1

10

D o sis (insulina, ng/ml)

F ig . 39-7. C urvas de desplazam iento sim uladas em pleando las ecuaciones (23) y (26). E n A , B y C se vari un p arm etro
a la vez. E n D se variaron K y q recprocam ente de m odo que K, = 1/q.. E n las curvas cuyo (B/F)^, es m en o r que 1 el tra z a
dor ya ejerce un efecto de autodesplazam iento. Para el m odelo seleccionado (insulina) las flecnas indican a m odo d e re
ferencia los valores ms frecuentem ente em pleados. Las dosis aqu se refieren slo a insulina fra. El trazador es ' I-in su lina, por lo cual scgin la ecuacin (24) 1 tom o de ' I p o r m olcula corresponde a ~ 380 H.Ci/|j.g.

ble estar en el orden de xpg. Si la pendiente

puede mejorarse y alcanza un valor 10 veces
ms alto (100% de cambio en la respuesta para
la misma cantidad), entonces, para el mismo
error supuesto en las determinaciones anterio
res, la cantidad mnima detectable ser x/10 pg.

nales de referencia y el sometimiento a progra

mas regionales de control constituyen medidas
adicionales para mejorar las prestaciones de los
RIAs.

Control de calidad en el RIA

Hasta aqu slo tratamos los aspectos teri

cos del RIA bajo los postulados del modelo b
sico, uno de los cuales (nmero 4) supona que
el estado final alcanzado era el de equilibrio.
Ahora bien, si los reactivos de un ensayo no se
agregan simultneamente y las incubaciones se
interrumpen antes de alcanzado el equilibrio,
entonces las consecuencias sern diferentes se
gn las especificaciones seguidas. Si bien se ha
desarrollado una teora matemtica que predice
la cintica del RIA, nos limitaremos en este
punto a mencionar que uno de los recursos ms
empleados dentro de estas variantes es el de la
adicin demorada del trazador. Consiste en adi
cionar anticuerpos y antgeno fro en los tubos

Para los laboratorios que ejecutan rutinaria

mente los RIAs con distintos fines, es necesa
rio documentar la exactitud y precisin de los
anlisis, de modo de controlar las propiedades
y la estabilidad de los mtodos aplicados. En el
rea de los anlisis clnicos, por ejemplo, esto
contribuye a la reduccin de los mbitos difu
sos que separan los valores normales de los pa
tolgicos. La aplicacin de mtodos estadsti
cos y la confeccin de cartas de control permi
ten reconocer si una determinacin se halla o
no dentro de los lmites de las especificaciones
establecidas. El empleo de patrones internacio

B. Ensayos en preequilibrio

834

Metodologas

de reaccin y luego incubar hasta que se alcan

ce el equilibrio, o un estado cercano a l. Final
mente, se agrega el trazador y se comienza a
tomar el tiempo de esta segunda incubacin.
Luego de un lapso preestablecido por un test
empricamente controlado, la reaccin se detie
ne con la ejecucin de la etapa separativa. Los
resultados esperados de un ensayo ptimo arro
jarn un valor de (B/F)^ o (B/T) casi igual al
de un test normal, pero a bajas dosis, la curva
del ensayo de preequilibrio exhibir una ma
yor pendiente que la convencional. Adems,
tanto el rango de trabajo como la dosis media
de ese rango mostrarn un desplazamiento ha
cia la regin de dosis bajas. Todo ello significa
un aumento en la sensibilidad del ensayo cuan
do no existen otros factores que aumentan la
dispersin de los datos respecto de un RIA nor
mal.

res, parece no producirse con los anticuerpos.

Dicho en otros trminos, en la mayora de los
casos no hay evidencias de que la ocupacin de
un paratope disminuya la afinidad del otro en
la misma molcula por un efecto alostrico
(postulado nmero 2 del modelo bsico).
La base formal para analizar el modelo de
dos o ms anticuerpos surge de considerar una
de las ecuaciones, como la (10), para cada uno
de ellos, reexpresndola en trminos de q - B
en lugar de [QJ, resolviendo para cada B:
K iq F

1 + K F

Entonces para la suma de concentraciones.

B Z y en particular para m = 2 :
i= l
K ,q ,F

K ^ q .F

1 -l-K, F

1 -l-K, F

(29)

B =

C. RIAs con multicomponentes

El siguiente nivel de complejidad que trata
remos es el ms habitual, o sea el de los siste
mas en que intervienen mezclas de anticuerpos
de variada afinidad por el antgeno. Tal es el
caso de los sueros inmunes y tambin el de los
anticuerpos fraccionados y rotulados como
monoespecficos por reaccionar especfica
mente contra un solo epitope del antgeno.
Adems, la heterogeneidad del antgeno en
otros casos tambin causa problemas de conta
minacin, de reactividad cruzada o de inespecificidad.
A los fines didcticos slo consideraremos
en esta parte los modelos referidos a un antge
no frente a dos o ms anticuerpos en el test y al
de dos antgenos frente a un anticuerpo, con re
ferencias a una generalizacin para los sistemas
polielonales. Todos estos casos se inscriben
dentro de los modelos ms cercanos a los rea
les, y representan, por ende, a los RIAs habi
tuales que no cumplen con el postulado nmero
1 del modelo bsico.
Heterogeneidad en la afinidad

En general los anticuerpos sricos causan

curvas de Scatchard francamente contrastantes
respecto de las mostradas por los anticuerpos
homogneos. Mientras que en estos ltimos se
obtiene una recta (vase el caso de un anticuer
po monoclonal en la figura 39-5), los anticuer
pos heterogneos causan grficos curvados
(fig. 39-8). Los antisueros, por representar un
sistema heterogneo de anticuerpos, suelen ex
hibir tpicos grficos de Scatchard con concavi
dad hacia arriba. Ese fenmeno, tambin po
tencialmente adjudicable a una cooperatividad
negativa, como la descrita para ciertos recepto

(28)

Si dividimos por F tenemos otra forma equi

valente en trminos de la relacin B/F:
(30)
F

1 + K |F

l+ K jF

Tanto en la ecuacin (29) coino en la (30) F

puede ser reemplazado en funcin de A Para
la ecuacin (29), utilizando la relacin (13), F =
A-j, - B, y luego, reordenando la variable B sur
ge una ecuacin cbica. Para ingresar a la ecua
cin (30), F se calcula utilizando la relacin
(20). Luego tenemos una expresin de B/F
tambin en trminos de A^, y de los parmetros
de afinidad y concentracin, como se haba he
cho para m = 1 (ecuacin 26). Slo que su ex
presin reordenada para B/F genera una ecua
cin aun ms compleja. Por ende, una solucin
ms conveniente para resolver las ecuaciones
(29) o (30) es el empleo de programas de com
putacin, donde K,, qj,
y q^ ingresan como
aproximaciones obtenidas de las tangentes gr
ficas (fig. 39-8) y se ajustan luego mediante
mtodos iterativos. Otros sistemas de procesa
miento de datos prescinden de tales valores
aproximados y calculan directamente los cuatro
parmetros con los datos experimentales.
Si la mezcla de anticuerpos es ms compleja
que la seiialada, entonces el tratamiento analti
co hasta aqu efectuado no ser estrictamente
aplicable. Tal es el caso de muchos sistemas
constituidos por un antisuero y, como agravan
te, por un antgeno suficientemente voluminoso
como para permitir interacciones independien
tes y no interactuantes con dos o ms epitopes
a la vez. Ai respecto es ilustrativo mencionar
que macromolculas globulares a partir de PM
5-6 KDa (p. ej., la de insulina) ya presentan ra
dios de Stokes suficientemente importantes co-

Inmunoanlisis radiomtricos
F ig . 39-8. G rfico de S catchard curvib'neo producido por u na m ezcla de dos anticuerpos con diferentes afinidades. Ei anlisis es estrictam ente aplicable
a un sistem a de un antgeno y dos anticuerpos raon o c io n a le s e s p e c fic o s c o n tra el m ism o epitope
(com parar con el sistem a anlogo ms sencillo de la
fig. 39-5). L a curva es una hiprbola cuyas tangen
tes g rficam ente trazadas con los puntos extremos
(lneas continuas) perm iten la estim acin algo ine
xacta de las afinidades de cada anticuerpo. Por la
in tersecci n de las ab scisa s se p uede apreciar la
concentracin total de sitios de anticuerpos (no se
discrim in a la contribucin de cada sum ando). Un
an lisis m s e la b o ra d o , u tiliz a n d o el m todo de
G auss-N ew ton de regresin no lineal pesada para el
ajuste de los datos experim entales, perm ite calcular
los cuatro parm etros KjQiKjqj. Con ellos es posi
ble trazar las asntotas (lneas cortadas). Estas rectas
corresponden a los grficos de Scatchard de los dos
com ponentes en que se descom pone la hiprbola.

F
K^q^+K^q,

2,0
K iq,

K, =
q, =
K, =
q2 =
R =

835

6 , 9 x 1 0 'M^'
2 , 6 x 10^ IVI
9 , 5 x 10M-i
3 , 0 x 1 0 ' M
6 ,4 x 1 0 M

1.0

^ 1+^2

K jq j

mo para admitir la interaccin simultnea con

dos inmunoglobulinas especficas. La forma
cin de complejos cclicos (Ac,, Ac^): 2Ag
conduce a un incremento de la afinidad aparen
te con deformacin de los grficos de Scat
chard. sa es la base de un RIA cooperativo
que utiliza dos anticuerpos monoclonales apro
piados a la vez.
A pesar de todo lo comentado, es frecuente
hallar en la bibliografa conectada al tema, re
ferencias a tratamientos para dos componen
tes aplicados a sistemas de anticuerpos poli
clonales contra antgenos proteicos. Es discuti
ble si tal aproximacin es lcita o no (incumpli
miento de los postulados nmeros 1 y 2 del
modelo bsico) en cada caso en particular.
Afinidades promedio

Del grfico de Scatchard curvilneo pueden

obtenerse grficamente dos tipos de afinidades
promedio. La ms ampliamente usada es la
constante intrnseca promedio, Ko. En realidad,
refleja con mayor exactitud el valor de la me
diana que el valor denominado promedio pe
sado de la afinidad, K. Mientras este ltimo
valor se calcula contemplando la concentracin
m
y la afinidad conjuntamente (X Kq/q^^^j,j),
i= 1
el de Ko se obtiene calculando la pendiente de
la tangente en el punto de la curva donde B =
qi^^i,j/2. De este modo, la Ko resulta ms difcil
de obtener grficamente que la constante pro
medio pesado, ya que sta surge simplemente
del cociente entre los puntos de interseccin de
la curva en ambos ejes (fig. 39-8).
Segn se analiza en la teora general de la in
teraccin primaria antgeno-anticuerpo (cap. 8),
para los antisueros heterogneos puede calcu
larse un ndice de heterogeneidad y un valor de

0,1

0,2

0 ,3

i (h G H , nM )

afinidad promedio mediante el grfico de Sips.

En este caso, la constante apreciada es Ko.
Heterogeneidad en el antgeno

El RIA ha sido una herramienta importante

para estudiar no slo los antgenos genuinos,
relacionables a los inmungenos, sino otros es
tructuralmente vinculados y que exhiben una
reactividad cruzada frente a los mismos anti
cuerpos. Este fenmeno, muy tempranamente
descrito en inmunologa, puede ser explotado
con fines analticos. Con anterioridad deben re
conocerse sus dos variantes condicionadas por:
1) la estructura naoleculav de ios antgenos, y 2)
el grado de heterogeneidad de los anticuerpos.
El caso ms sencillo es el de un anticuerpo
homogneo reaccionando alternativamente con
dos antgenos. Podra incluirse dentro de este
modelo hasta el propio sistema comn de un
solo antgeno y su trazador, donde este ltimo,
debido a la modificacin qumica sufrida puede
unirse al anticuerpo con menor afinidad que el
antgeno inmodificado (incumplimiento del
postulado nmero 3 del modelo bsico). Siem
pre y cuando el grado de deterioro de esa inte
raccin no determine la inutilidad del trazador,
no habr otras consecuencias en cuanto a la
exactitud de los anlisis, aunque s en el clcu
lo de la afinidad. En efecto, fue tempranamente
reconocido en la historia del desarrollo del RIA
que su validez para ponderar antgenos depen
de de la idntica inmunorreactividad del estn
dar y de los desconocidos (o sea sus propieda
des para competir con la unin del trazador) y
no depende en cambio de la similitud en la in
munorreactividad del trazador respecto del es
tndar o de los desconocidos. Pero en esta sec
cin analizaremos otro tipo de experimento que
suele darse en la prctica del RIA: la determi
nacin de un antgeno no homlogo competi
dor, A2, en un ensayo realizado en principio

836

Metodologas

con un anticuerpo homogneo anti-A, (induci

do por un inmungeno A,) y un trazador A,*
presente en concentracin infinitesimal. Luego
nos referiremos al caso de un antisuero hetero
gneo frente a los mismos antgenos.
Antes de entrar en los aspectos formales que
describen estos modelos, debemos justificar en
qu situaciones de la prctica radioinmunoanaltica no se cumple el postulado nmero 1 del
modelo bsico, ahora por causa del antgeno.
El antgeno A^ puede presentar reactividad
cruzada frente a ese anticuerpo anti-A, por cau
sa de dos mecanismos diferentes: a) el epitope
de
no es idntico al de A l porque comparte
slo una fraccin de los grupos funcionales;
b) los grupos funcionales son enteramente
idnticos en A, y A^, pero en este ltimo la es
tructura espacial presenta una conformacin un
tanto alterada. El caso a se da tpicamente en
los antgenos proteicos que constituyen las lla
madas familias de protenas filogenticamente
relacionadas y que presentan mutaciones a ni
vel de uno o ms residuos aminoacdicos. Tal
es el caso de varias hormonas polipeptdicas
que, segn ias distintas especies animales, re
sultan altamente homologas. Por ejemplo, la
insulina porcina difiere solamente en un resi
duo respecto de la humana. Si al obtener anti
cuerpos monoclonales inducidos por la insulina
porcina, el epitope involucrado incluye ese re
siduo, puede ocurrir que la reactividad cruzada
con la insulina humana sea algo menor (con
otros monoclonales, la reaccin puede ser idn
tica o nula). En ese caso, un RIA aplicando in
sulina porcina trazadora puede permitir no slo
la determinacin de la hormona humana sino
que es factible determinar su constante de afi
nidad. Adems, es innecesario efectuar los es
fuerzos para generar un trazador de insulina
humana o incluso para obtener anticuerpos mo^
nocionales va ese inmungeno.
Otra situacin dentro del caso a, donde pue
den verse involucrados dos antgenos relacio
nados, es la de su coexistencia natural en un
mismo fluido biolgico. Tal es el caso de la
hormona de crecimiento hipofisaria (hGH) y
del lactgeno placentario (hGS) en el suero de
embarazadas. Ambas hormonas dan reactividad
frente a antisueros especficos o ante algunos
anticuerpos monoclonales inducidos por cual
quiera de ellas. La determinacin especfica de
hGH en presencia de niveles considerables de
hCS (hasta 10^ veces mayores) presenta un pro
blema analtico que se considera a la luz de los
modelos tericos de competicin que se vern
seguidamente.
El caso b se da tpicamente en los antgenos
macromoleculares desnaturalizados o que per
dieron su conformacin nativa por hallarse es
cindidos a un nivel que no involucra los epito

pes, pero que causan su alteracin topogrfica

indirecta. so puede ocurrir durante las etapas
preparativas, de purificacin, o de almacena
miento de macromolculas algo inestables y
que luego se estudian mediante RIA como con
trol de calidad. Tambin surgen cambios du
rante la ruptura o la sntesis de antgenos pro
teicos sometidos a estudio de restriccin de
epitopes.
Base terica del modelo anticuerpo
homogneo-tmzador homlogoantgeno competidor

En la figura 39-9A se muestran esquemtica

mente, a los fines comparativos, las curvas de
desplazamiento obtenidas en forma separada
para el antgeno homlogo A l (ensayo nor
mal) y para el antgeno competidor A^, em
pleando el mismo trazador ideal, A,*, en am
bos experimentos.
El simbolismo que utilizaremos aqu conser
va en lo posible las formas ya utilizadas e in
corpora las del competidor, segn el siguiente
listado:
q : concentracin total de sitios de anticuer
pos
[Q] : concentracin de sitios de anticuerpos
libres
A l : concentracin de antgeno fro
A l* : concentracin del trazador
[fl*] y [bi*] : concentracin del trazador libre y unido,
respectivam ente
A 2 : concentracin del antgeno com petidor
[fa] y [b2] : concentracin del antgeno com petidor
libre y unido, respectivam ente
B
[bi*] : relacin de las concentraciones de radiac=
tividad unida/libre m edidas
F
[fl*] :
: constante de asociacin para A]
K ^2 constante de asociacin para A 2

En este modelo se cumplen dos reacciones

de equilibrio simultneamente:

(31)

Q +
f,*

b *

Puesto que [Q] = q - [b,*] - [b^], segn la

ley de accin de masas puede expresarse una
relacin para cada equilibrio:
[ b i* ]
K a, =

(3 2 )
[ f i* ] ( q - ~ [ b ,* ] - [ b j)

K .,=

[bzl
(3 3 )
[ f J (q - [b ,* l - [bj])

Inmunoanlisis radiomtricos

837

En el punto medio del rango de ordenadas

(fig. 39-9) se cumple a partir de (34) y (25)
que:

K ., ( q ^ [ b , * ] ^ [ b j ) =

t
X -

K A iq
(3 6 )

Resolviendo la ecuacin (36) para [bj*], y

sustituyendo en la ecuacin (34), tenemos que:

T
'

( 7).

Dosis (log)
de A ,O A ,

( 1 - K a i [f,* ]) = [ b j

(3 7 )

Luego, resolviendo la ecuacin (36) para q,

y sustituyendo en la ecuacin (33), tenemos
que:
[b,]

Trazador = A *

K a2 [ b J =

(3 8 )

q/2

Combinando las ecuaciones (37) y (38) obte

nemos:
Ka2 = ^
[2]

( 1 - K a , [fj* ])

(3 9 )

Por lltimo, de las ecuaciones (38) y (39) lle

gamos a que:
de A, o
F ig . 39-9. A, R IA esquem tico para el inraungeno, A l,
y para un antgeno con reactividad cruzada, Aj, en un sis
tem a de anticuerpos hom ogneos. D e los valores de absci
sas en los puntos m edios de) rango de respuestas se p u e
den obtener relaciones en trm inos de
y
B, R IA
esquem tico para los m ism os antgenos ixente a dos h ipo
tticos sueros heterogneos. En un caso los anticuerpos d i
fieren en sus afinidades determ inando una curva no p ara
lela (reactividad cruzada de tipo 1), E n el otro caso, la h e
terogeneidad se refiere a la especificidad por ios epitopes.
En la curva de A^ para el suero con reactividad cruzada de
tipo 2 slo intervienen ios anticuerpos dirigidos hacia ep i
topes com partidos por A, y A ,. El resto slo reacciona es
pecficam ente con A, y su trazador.

La ecuacin (32) puede reordenarse de modo

que resulte una expresin de B/F = [b,*J/[fj*]
en funcin de [b,*] o de [f *]:

An

( l- K .,

[b,*]

Ka , ( q ^ f b j )

[fi

1 + K a , [f,*]

(3 4 )

(3 5 )

Luego se cumple que, para la condicin en

que tanto A, como A^ tienden a cero, B/F al
canza un valor lmite igual que el definido para
la ecuacin (25) del modelo bsico:

(25)

(4 0 )

Esta ecuacin nos demuestra que para B/F =

(B/F)(/2, la concentracin del antgeno compe
tidor puede ser funcin slo de q y
con la
condicin de que [f,*] sea insignificante res
pecto de l/K .,, luego K^ [f,*] es 1 y puede
ignorarse el ultimo factor de la ecuacin (40),
con lo que se obtiene:
Al -- -

(4 1 )

Adems, por una va mucho ms sencilla,

para el modelo simple donde Aj = O y sustitu
yendo en la ecuacin (26) B/F por el valor del
punto medio, (B/F)p/2 =

[b,*:i
= K a , ( q - [ b ,* : | - [ b J )

[f,*])

Al

tenemos que:

(4 2 )

Como se advierte, las ecuaciones (41) y (42)

son muy semejantes y permiten relacionar, en
los puntos de (B/F)y2 de cada curva de despla
zamiento, los valores de dosis con las respecti
vas constantes de afinidad para un mismo y de
finido valor de q.
En la figura 39-9A se destacan las proyeccio
nes de esos valores en el eje de las abscisas (x e
y para A y A^, respectivamente). Como esta
mos comparando dos experimentos paralelos

838

Metodologas

con un mismo valor de q, despejando q/2 en las

ecuaciones (41) y (42) e igualndolas, tenemos
que:

sarios (pero no suficiente) para demostrar iden

tidad radioinmunoanaltica entre un estndar de
referencia y la muestra problema: el paralelis
mo de sus curvas de desplazamiento frente a un
I
I
Ao - A , = ------------ --------(4 3 )
suero policlonal especfico.
La reactividad cruzada de tipo 2 puede ocu
O sea que, determinando el valor de
por rrir solamente si se da la llamada heterogenei
los procedimientos ya descritos, el valor de
dad de especificidad para diferentes determi
puede obtenerse de la ecuacin (43), donde
- nantes. En este caso hay slo una fraccin de
A, representa la diferencia entre las dosis y y x .
anticuerpos dentro del antisuero heterogneo
Si bien la pendiente de la curva para A2 en que puede reaccionar con el competidor A^.
ese punto es menor que la de Al (analticamen Luego el antgeno A^ no podr causar un des
te puede demostrarse que la diferencia se debe plazamiento completo como el A,, a ningn va
a las distintas afinidades), en una escala loga lor de dosis (fig. 39-9/?). Nuevamente aqu po
rtmica de abscisas resultan paralelas. Adems, demos aplicar el concepto de especificidad co
el competidor A^ puede lograr el total desplaza mo lo hicimos antes, slo que para este caso
miento del trazador a concentraciones propor definiremos un suero como especfico para el
cionalmente mayores que las de A,. Esas carac antgeno A, cuando slo una mnima fraccin
tersticas son propias de los llamados antgenos de sus anticuerpos pueda reaccionar contra A^.
con reactividad cruzada verdadera o de tipo 1. Por ejemplo, si slo el 1% de los anticuerpos
En los sistemas con anticuerpos monoclonales anti-A| (sin mencionarse las afinidades) reac
es la nica clase de inmunorreactividad cruza ciona con un epitope compartido por A^, puede
da factible, a diferencia de lo que puede ocurrir decirse entonces que el antisuero es 100 veces
con los sueros heterogneos, segn veremos.
ms especfico para A, que para A,^. Un RIA
Adems, si definimos la especificidad como elaborado en estas condiciones arrojara una
una propiedad en cierto sentido inversa a la de recta paralela al eje de las abscisas, sin indicar
reactividad cruzada, podemos considerar que desplazamiento perceptible para el antgeno A
un anticuerpo homogneo ser especfico hacia
su antgeno homlogo A,, en presencia de un
contaminante A^, cuando la relacin
RIA HETERLOGO
sea suficientemente elevada. Se ha considerado
que un valor > 10^ es aceptable en los casos co
En los casos anteriores los anticuerpos y el
munes para discriminar A, de A^. Para otras si trazador pertenecan a un sistema homlogo,
tuaciones extremas (como la ya sealada para esto es, el anticuerpo monoclonal o el antisuero
las hormonas sricas hGH y hCS que coexisten se haban inducido en una especie animal me
en el embarazo en relacin ~ 1:10^), ese ndice diante un inmungeno A, y el trazador tambin
debe ser aun mayor si se desea determinar con se preparaba con el mismo antgeno (A,*). En
un anticuerpo monoclonal especfico el pri cambio, ahora definiremos como RIA hetermer antgeno sin la interferencia del segundo.
logo aquel en el cual el trazador se sustituye
por el del antgeno no idntico, A^*, y el des
plazamiento se efecta con A^. Este modelo ha
Reactividad cruzada con anticuerpos
sido propuesto en ciertos casos en que tal com
heterogneos
binacin permite obviar dificultades de especi
Hay dos tipos de heterogeneidad en pobla ficidad mostradas por el RIA normal u hom
ciones de anticuerpos heterogneos: 1) respecto logo. El caso ms tpico es el del sistema FSH
de afinidades, y 2) respecto de la especificidad (hormona foliculoestimulante): anti-ESH, don
por los determinantes. Si los anticuerpos son de estos ltimos sueros suelen exhibir reactivi
especficos por un nico determinante pero he dad cruzada con otras glicoprotenas presentes
terogneos en afinidad, estamos en presencia en la misma especie, tal como la hCG (gonado
de un caso de reactividad cruzada de tipo 1. Sin trofina corinica). Los procedimientos de ab
embargo, las curvas de desplazamiento no re sorcin de los sueros con hCG para lograr una
sultarn paralelas (fig. 39-9B). En ese modelo adecuada especificidad no suelen dejar sufi
el tratamiento formal es bastante complejo y cientes anticuerpos de alta afinidad y realmente
puede concluirse que no ser vlido comparar especficos para FSH. Eso probablemente se
afinidades relativas en los puntos de (B/E)(/2. debe a que las regiones moleculares crticas pa
De un RIA en estas condiciones a lo sumo pue ra la funcin hormonal de FSH son relativa
de obtenerse una idea cualitativa con respecto a mente menos inmunognicas que las regiones
que la constante de afinidad promedio del com homlogas con otras hormonas glicoproteicas
petidor A, es menor que la del antgeno A l. En de la familia. Cuando se aplica un RIA hetereste principio se basa uno de los criterios nece logo con un trazador de igual hormona pero de

Inmunoanlisis radiomtrcos

otra especie, se est seleccionando la poblacin

de anticuerpos de especificidad requerida. Se
espera en ese caso que los anticuerpos exhiban
tambin una afinidad suficientemente alta por
el trazador, aunque por otro lado deba emplear
se una concentracin de suero mayor que para
el RIA homlogo. Por ejemplo, un RIA para
FSH humana empleando suero anti-FSH ovina
y FSH humana marcada puede resultar tan es
pecfico y sensible como un RIA homlogo
ideal. La unin de la FSH humana a los anti
cuerpos involucrados puede ser tan buena o
mejor que la del trazador y por ende la curva
de desplazamiento no sufrir disminucin en la
pendiente asociada a cambios a la sensibilidad.
D E T E R M IN A C I N D E A N TIC U ER PO S

839

ra la masa de insulina en unidades de actividad

biolgica (lU = 41,67 |j.g). Luego es factible
determinar la magnitud de la respuesta inmune
humoral especfica hacia la insulina de la tera
pia sustitutiva en los diabticos, en trminos de
BC y expresada en U de insulina fijables por li
tro de plasma. Esta magnitud es ms fcilmente
interpretable por los mdicos diabetlogos para
estimar la relacin entre la dosis de insuhna ad
ministrada y la cantidad de anticuerpos poten
cialmente secuestrantes de la hormona que el
valor de q total, ya que ste representa un dato
emprico de concentracin molar de sitios en el
tubo del RIA.
Utilizacin del ensayo de unin
de radioligando (RBA)

Los mtodos radiomtrcos para la determi

nacin de anticuerpos son varios. En esta sec
cin nos ocuparemos del RIA en fase fluida
clsico y de otras variantes relacionadas.

Cuando los sueros poseen muy bajas con

centraciones de anticuerpos especficos hacia
un antgeno macromolecular soluble y bien ca
racterizado, puede utilizarse para la determina
cin rpida de esos anticuerpos el llamado test
de unin de radioligando o RBA (del ingls,

Utilizacin del RIA

Radiobinding Assay).

En los RIAs el componente que se determina

habitualmente es el antgeno. No obstante, en
ciertas ocasiones el objetivo analtico principal
es la determinacin de los anticuerpos especfi
cos para un antgeno en especial. Determinar
los anticuerpos estrictamente significa ponde
rar tanto los valores de concentracin como los
de afinidad. Pero en situaciones prcticas de la
boratorio de inmunologa muchas veces basta
con tener una idea globalizada de la potencia
de un suero, lo cual significa sencillamente te
ner un ttulo que incluye el producto de ambos
tipos de parmetros. Ese dato emerge directa
mente de la primera etapa del desarrollo de un
RIA, como es la curva de calibracin, segn vi
mos al comienzo. En cambio a veces puede re
querirse la determinacin de la concentracin
total de anticuerpos especficos en un volumen
determinado de suero, lo cual debe derivarse
del valor de q o Xqi molares calculados de un
ensayo de desplazamiento y del anlisis de
Scatchard o sus equivalentes. Esta va conduce
en realidad a la concentracin de los sitios de
unin, segn vimos, y de acuerdo al valor de la
valencia (conocida o supuesta) se llega a la
concentracin de los anticuerpos. En ciertas
circunstancias las convenciones utilizadas exi
gen la transformacin de los datos de q o q to
tal en trminos del antgeno unido. Tal es el ca
so de la determinacin de los anticuerpos antiinsulina por radiometra, utilizando como uni
dad de expresin la capacidad de unin, o BC
(de Binding Capacity). En estos casos adems
se requiere conocer el factor de conversin pa

El RBA consiste en un ensayo de fase fluida

en el cual se enfrentan los sueros, en una dilu
cin convencional orientada por las necesida
des, con una dosis fija de antgeno marcado ra
diactivamente. Luego de la incubacin, hasta
alcanzar un estado cercano al de equilibrio, se
procede a la separacin de la marca unida y la
marca libre por los medios habituales. El mto
do ms empleado es la precipitacin de los an
ticuerpos y de los complejos inmunes con PEG
al 12,5%.
Este tipo de ensayo radiomtrico as conce
bido posee un diseo idntico al de la primera
etapa del RIA (curva de calibracin), aunque se
ejecuta con una nica dilucin fija del suero.
Es por ello que ocasionalmente se lo ha deno
minado como RIA, en lugar de RBA. Es
conveniente, no obstante, mantener la distin
cin de nomenclatura entre ambos mtodos, ya
que el primero sirve en general para la determi
nacin de antgenos y en cambio el segundo se
aplica para medir anticuerpos.
En el RBA la expresin final de los resulta
dos se efecta en trminos de porcentaje de
marca unida, lo cual representa una unidad re
lativa, dependiente de las condiciones experi
mentales. En cambio, cuando se recurre al RIA
para la determinacin de anticuerpos especfi
cos, por tratarse de un ensayo e saturacin con
antgeno, las unidades de expresin son absolu
tas e independientes de las condiciones experi
mentales.
FJ anlisis terico del RBA y su verificacin
experimental permiten conocer la relacin exis
tente entre la unin porcentual especfica del

840

Metodologas

trazador (B%) y la concentracin de este lti

mo. Ese anlisis terico puede simplificarse si
lo asimilamos al del RIA, en particular comen
zando de las curvas dosis-respuesta en trmi
nos de B/F en funcin de concentracin de an
tgeno. Recordemos que la ecuacin que des
cribe esa relacin para anticuerpos homog
neos es la (26). L,uego resta hallar una forma de
conversin entre B/F y el B%, la cual se obtie
ne de las siguientes relaciones: B% -f- F% = 100
y B%/F% = B/F. Combinndolas y despejando
B% se obtiene la siguiente expresin:

(44)

la cual es semejante a la (20), donde el antge

no se expresa en %.
A partir de la ecuacin (44) podemos obte
ner curvas de desplazamiento donde B/F es
reemplazado por el B% y su expresin grfica
es como de la figura 39-3 C. Otra forma de ob
tener estas curvas, ms directa y aplicable aun
a sistemas heterogneos de anticuerpos, parte
de la ecuacin (29) resuelta para B como se ex
plic en ese punto y luego convirtiendo su va
lor en B%.
Si volvemos a la bsqueda de la relacin en
tre el B% y la concentracin del trazador, vemos
que sta se halla comprendida en la relacin ge
neral entre el B% y la concentracin de antgeno
(est o no marcado). Por lo tanto podemos
reemplazar antgeno fro de las abscisas por an
tgeno marcado e incluso invertir el sentido de
la escala para expresar con mayor conveniencia
la evolucin de la AE para una actividad cons
tante del trazador cargado en los tests.
En la figura 39-10 se muestran las curvas del
B% en funcin de la AE del trazador para dos
sueros con diferente nivel de anticuerpos espe
cficos. Se observa que, cuando la AE aumenta
(y por lo tanto desciende la concentracin de
antgeno marcado para una carga de actividad

AE (iiCi/,ug)

100
B% mx

100
B% = - -----+ 1

constante), el B% evoluciona sigmoidalmente.

Por lo dicho anteriormente, se espera que este
tipo de representacin sea la imagen invertida
de la curva de desplazamiento y que se alcance
un valor plateau cuando el antgeno marcado
tienda a concentracin cero (o su equivalente:
cuando la AE alcance cierto valor ptimo).
El valor lmite de la unin porcentual del tra
zador (B%mx.) puede obtenerse de la ecuacin
(44) donde B/F se sustituye por su equivalente
para antgeno infinitesimal, Kq (ecuacin 25):
i

(45)

-L + 1
B

Se observa que, en efecto, para una AE sufi

cientemente alta (en general la que resulta de la
incorporacin de un tomo de
por molcula
de antgeno), el B%mx. no resulta funcin de
la concentracin del antgeno y slo depende
de la concentracin y afinidad del anticuerpo.
Para sistemas polielonales Kq se reemplaza en
la misma ecuacin (45) por 2 Kiqi.
A diferencia de otras situaciones, donde el
analito se detecta con mxima eficiencia utili
zando un exceso del reactivo (como en el RIA,
donde se satura a los anticuerpos con antgeno
para determinar su concentracin absoluta), en
el RBA se requiere un infinitsimo del reactivo
(el trazador) para lograr la mxima seal por
centual relativa. Este concepto tiene otra deri
vacin: los clculos de capacidad de unin
(BC) no son factibles a partir del RBA (todo
intento de clculo de unin a partir del B%
arrojar datos seudoabsolutos y de magnitud
muy inferior a la real).
Otra aplicacin de la ecuacin (45) es que a
parr de ella se puede deducir cul es el efecto
de cambiar la concentracin del suero en el test
(o sea la concentracin de anticuerpos especfi
cos). Para el sistema ms sencillo de un anti
cuerpo monoclonal, se deduce que la relacin
no es hneal. Esto es, si por ejemplo duphcamos
la concentracin de anticuerpo en el RBA

F ig . 39-10. Efecto en el R B A de
la A E d el tra z a d o r (a d ic io n a d o
c o n u n a a c tiv id a d c o n s ta n te de
10.000 cpm ) sobre la seal B % ,
re p re s e n ta d a p a ra dos su ero s de
alto nivel (suero I) y de bajo nivel
(suero 2) de anticuerpos antiinsulina.

Inmunoanlisis radiomtricos

(q pasara a ser 2q), la unin porcentual del tra

zador puede no resultar duplicada (B% resulta
ra distinto de 2B%). En realidad se puede veri
ficar que si el B% inicial es cercano a cero, el
incremento de q, n veces, repercute en la unin
de tal modo que se alcanza el valor nB%. En
cambio, si el B% inicial es cercano a 100% el
incremento de q es nulo, lo cual resulta lgico
por la saturacin alcanzada por la seal del B%
desde el inicio. Entre esos dos extremos se dan
todas las situaciones intermedias.
Una consecuencia prctica de este estudio
terico es qe en el monitoreo de anticuerpos
en muy bajo nivel, como en ciertos perodos de
las enfermedades autoinmunes en que se ras
trean autoanticuerpos hacia antgenos bien ca
racterizados, deben utilizarse protocolos de
RBA con la mnima dilucin posible del suero.
Adems, deben efectuarse incubaciones a baja
temperatura, para favorecer la mejor expresin
de la afinidad (el mayor valor posible de K) y
durante el tiempo necesario para permitir que
se alcance un estado cercano al equilibrio (va
rios das, segn los casos, para que el B% sea
el mximo posible). Sin embargo, el incremen
to, de la concentracin relativa del suero en el
ensayo debe balancearse en la prctica con el
aumento progresivo de la unin inespecfica.
Este inconveniente puede sortearse de todos
modos con la inclusin de ensayos de control,
confeccionados con sueros normales.
A pesar de tratarse de un ensayo de equili
brio en fase lquida, donde por ende no inter
vienen efectos de amplificacin de la avidez
como veremos ms adelante, el RBA ha sido
indicado como el mtodo de eleccin para mo
nitorear ciertos autoanticuerpos. El enzimoinmunoanlisis, que exhibe ventajas en otros sis
temas de deteccin, ha demostrado menor pre
cisin y sensibilidad en estos casos. Al menos
cuando los anticuerpos son de afinidad mode
radamente alta (en respuestas maduras contra
antgenos macromoleculares), el RBA resulta
ms apropiado que los mtodos enzimticos al
ternativos.
Utilizacin del ensayo de titulacin
Otra forma de medir por radiometra los anti
cuerpos especficos es la denominada titula
cin. En realidad, no la consideraremos como
una verdadera variante metodolgica puesto que
su principio es idntico al de la etapa de calibra
cin del RIA (una serie de diluciones del suero
incubadas con la traza constante) o al del RBA
con varias diluciones. El ttulo se define luego
como aquella dilucin del suero que alcanza una
unin convencional (generalmente B% = 50;
vase la fig. 39-1) o, menos frecuentemente, una
unin especfica mnima arbitraria.

841

A partir de todo lo discutido precedentemen

te debemos enfatizar que el ttulo de un suero
es una funcin combinada de las concentracio
nes y afinidades de todos sus anticuerpos espe
cficos. Si no se dispone de esos parmetros,
determinables independientemente, no se pue
de inferir solamente a partir del ttulo si un sue
ro dado es apropiado o no para determinados
usos (por ej., para aplicarlo en un RIA de alta
sensibilidad). Tampoco es un parmetro total
mente vlido para la comparacin de dos sue
ros con una misma especificidad.
RIAs en sistemas bifsicos
(RIAs en fase slida)
Una de las razones por las que han sido con
cebidos los RIAs en fase slida (RIA-ES) fue
la de facilitar la separacin de las fracciones li
bre y unida. El modelo ms sencillo consta de
una matriz slida (dextranos, celulosa, vidrio,
papel, plsticos) a la cual se han adsorbido o
unido qumicamente los anticuerpos especfi
cos. Esta superficie activada se dispone en ge
neral en forma de pequeas esferas, discos o
simplemente es la cara interna del propio tubo
de reaccin. En la figura 39-1 lA se muestra un
esquema de la disposicin de los componentes
del sistema y de las operaciones sucesivas en un
RIA-ES realizado en tubos plsticos. La separa
cin de la marca unida a los anticuerpos de
aquella que se halla libre en la solucin se reali
za, sin adiciones ni centrifugaciones, por medio
de simple decantacin o aspiracin de la mezcla
de reaccin. Luego se cuenta la actividad unida
a los tubos secos. Las ventajas de esta metodo
loga son: la simplicidad, la rapidez, la omisin
de etapas separativas sometidas al riesgo de
error, el ahorro de reactivos y la susceptibilidad
de automatizacin. Las desventajas de estos
mtodos son el comparativamente alto consumo
de antisuero y la variacin en las propiedades
adsortivas de una misma sustancia entre las dis
tintas partidas (aunque provengan de un mismo
proveedor). Muchas veces, este ltimo inconve
niente se ha sorteado modificando la etapa de
unin del anticuerpo al soporte mediante la
aplicacin de films de otros polmeros o a tra
vs de la unin covalente de las inmunoglobuli
nas a los plsticos con reactivos como el gluta
raldehdo o las carbodiimidas hidrosolubles.
Los RIAs-ES se han optimizado ajustando
empricamente no slo las condiciones de fija
cin de los anticuerpos sino las de aquellas
otras etapas crticas que constituyen el diseo
bsico: los lavados de exceso de antisuero, la
cobertura de las superficies activadas con otras
protenas inertes, la reaccin inmunoqumica
propiamente dicha y los lavados finales antes
de contar.

842

Metodologas

Los aspectos tericos relacionados con estos

sistemas bifsicos de interaccin han contem
plado ciertos efectos de incremento en la afini
dad aparente. Sobre todo en aquellos modelos
donde se ha fijado el antgeno a la matriz sli
da, aparecen fenmenos de unin por puntos
mltiples con anticuerpos que normalmente
tambin son,bivalentes o multivalentes. Esas
interacciones definidas como monogmicas
conducen a uniones de carcter casi irreversi
ble. Otro fenmeno que se suma al anterior est
relacionado con la alta concentracin efectiva
local de sitios dispuestos en la superficie, com
parado con el mismo nmero de sitios dispues
tos en solucin. Esta situacin es observable
aun con antgenos monovalentes frente a frag
mentos Fab, tambin univalentes. Las conse
cuencias de no respetar el principio bsico por
el que los reactivos del sistema deberan estar
libremente distribuidos en solucin, son las
previsibles segn otros modelos tericos que
no analizaremos aqu. Slo debemos considerar
que en estos casos los fenmenos de retencin
ejercidos por la alta concentracin local de si
tios de unin pueden conducir a errneas inter
pretaciones sobre los parmetros de interaccin
que intentan medirse.
Variante del RIA-FS
Una serie de variantes radioinmunoanalticas
en fase slida han sido desarrolladas con dife
rentes propsitos en el curso de las ltimas dos
dcadas. Ello ha causado cierta confusin en la
nomenclatura e incluso ha complicado el pano
rama, pues esas variantes siguen pautas teri
cas, prcticas y de optimizacin que difieren
respecto de las correspondientes al RIA clsi
co.
Dentro de esas variantes hay un grupo de
mtodos que han sido designados genricamen
te como inmunorradiomtricos y cuyo proto
tipo es el ensayo inmunorradiomtrico de dos
sitios, o simplemente IRMA (de Immunoradiometric assay). El objetivo de este procedi
miento es el uso de anticuerpos especficos so
bre una fase slida para extraer el antgeno de
fluidos de donde se los purifica y concentra.
Mientras el antgeno permanece unido, un se
gundo anticuerpo marcado se une a otro sitio
sobre el antgeno. As pueden efectuarse deter
minaciones del antgeno en funcin de la canti
dad de anticuerpo marcado que se ha unido. Si
los dos anticuerpos son diferentes, se aumenta
considerablemente la especificidad del sistema.
Otros procedimientos se basan en acoples suce
sivos de este tipo y han sido designados con
juntamente tcnicas en sandwich. Segn la
variante empleada, si se fija primero el antge
no o el anticuerpo, o si se intenta detectar uno u

otro, cambian los nombres. Por ejemplo, si tan

to los antgenos como los anticuerpos se detec
tan a travs de un anticuerpo antiinmunoglobulina marcado, se los denomina mtodos indi
rectos.
Estos son los principios que se usan para la
deteccin de inmunoglobulina E y de alrgenos
en el diagnstico de alergias atpicas. Los tests
denominados PRIST y RAST, respectiva
mente, se esquematizan en la figura 39-115 y
39-1IC. En estos casos los ensayos se optimi
zan empricamente y las dosis se expresan co
mo unidades relativas de IgE respecto de estn
dares internacionales de referencia.
Adems de los RIAs-FS basados en el prin
cipio de los dos sitios del antgeno, existen
otros modelos de concepcin semejante (anti
cuerpo adsorbido a una matriz: antgeno: anti
cuerpo) pero que funcionan de manera distinta.
Eso ocurre cuando se dan las siguientes restric
ciones: 1) con antgenos macromoleculares y
antisueros heterogneos, cuando tanto los anti
cuerpos en la fase slida como los de la fase l
quida reaccionan contra una misma rea anti
gnica, o sea contra un mismo epitope o contra
dos epitopes muy vecinos y excluyentes para
interaccionar simultneamente con dos anti
cuerpos. Esta situacin no es frecuente. 2)
Cuando el antgeno es de pequeas dimensio
nes respecto de las reas paratopes, de modo
que la situacin anterior es la nica opcin. 3)
Cuando en forma independiente del antgeno,
intervienen dos anticuerpos homogneos selec
cionados (un mismo anticuerpo monoclonal o
dos de tipo excluyen te).
En todos esos casos, si la molcula marcada
es el antgeno, la unin de aqulla a la fase s
lida por medio del anticuerpo adsorbido puede
disminuirse competitivamente por la presencia
del anticuerpo en la fase lquida. Este recurso
puede explotarse para la determinacin de los
anticuerpos en la solucin, ya que su potencia
inhibitoria (determinada conjuntamente por
concentraciones y afinidades) puede estimarse
en relacin inversa a la marca que subsiste en
los tubos luego de la aspiracin de sus conteni
dos.
REQUERIMIENTOS
Los requerimientos bsicos del RIA en su
versin clsica son el anticuerpo especfico, el
antgeno marcado, el antgeno fro patrn y los
componentes de la etapa separativa. Muchas de
las especificaciones que deben cumplir estos
elementos para lograr un RIA optimizado sur
gieron durante la discusin terica precedente.
Nos limitaremos entonces a describir somera
mente las fuentes, las formas alternativas de los

Inmunoanlisis radiomtrcos
F ig . 39-1 1. A , esq u em a del
procedim iento RIA -FS en tu
bos plsticos desechables. B,
p rin cip io del m todo P R IS T
(d el in g l s : p a p e r d is k rad lo Iw m u o so rh e n t test) p ara
la determ inacin de IgE total.
C , p r in c ip io d e l m to d o
PR A S T o R A ST {paper disk
radioallergosorhent test) para
la determ inacin de IgE espe
cficas.

Calibracin de la adsorcin

trazador ()
Antgeno (o)
(Patrn
desconoc.)

843

Aspiracin,
lavado

IgE
O

Disco de
papeleen
Anti-lgE
unida

Suero
1 /2 -1 /1 0

Incubacin
lavado

Adicin de
'^'^l-Anti-lgE

Incubacin
lavado,
conteo

IgE
E s p e ^ ^ a j-^

O
E I3

Disco
Inespecfica
de papel
con alergeno
Suero
unido

componentes y a recapitular sus propiedades

descollantes.
Los anticuerpos especficos
En el sentido ms amplio, la sustancia ligan
te especfica puede pertenecer a un sistema no
inmune. Por ejemplo, puede tratarse de un re
ceptor celular, de un transportador plasmtico
de hormonas, de una enzima, etc. En ese caso,
en lugar de antgeno el ligando puede cambiar
de nombre (p, ej,, sustrato) y el ensayo tambin
(radioensayo competitivo). Limitndonos al
ejemplo tpico del RIA, las macromolculas li
gantes son las inmunoglobulinas especficas in
ducidas por uno o ms antgenos en animales
de experimentacin. Los programas de inmuni
zacin se aplican a diferentes especies anima
les, a veces seleccionadas por las diferencias
estructurales conocidas del antgeno respecto
de los componentes propios, si se es el caso.
El inmungeno puede administrarse emulsio
nado con adyuvante de Freund directamente, o
previa conjugacin a un soporte que incremen
ta sus propiedades estimulantes.

Adicin de
'25|-Anti-lgE

Los regmenes de inmunizacin varan bas

tante segn las distintas recomendaciones, pe
ro en general emplean la inyeccin subcutnea
de las emulsiones en multisitios de patas y lo
mo de los animales. En lo posible se usan lotes
con un buen nmero de animales. Los interva
los de inyeccin suelen ser de 2 a 3 semanas.
El adyuvante de Freund completo suele em
plearse slo en la primera inyeccin, luego se
usa el incompleto.
Las dosis de inmungenos suelen ser sufi
cientemente bajas. Por ejemplo, para hormo
nas proteicas alrededor de 10-100 |.ig por vez y
por animal. Eso est motivado por la necesi
dad de inducir selectivamente los clones de
linfocitos productores de anticuerpos especfi
cos de alta afinidad. Cantidades superiores a
1 mg pueden inducir, adems de posibles fen
menos de tolerancia o parlisis inmune segn
los casos, una induccin de anticuerpos de ba
ja afinidad.
Luego de perodos de no inoculacin (3-6
meses) suelen hacerse reinmunizaciones con
efectos notables en los ttulos de anticuerpos.
Mediante sangras exploratorias y ensayos con

844

Metodologas

trazadores radiactivos pueden controlarse los

ttulos peridicamente. El criterio final de se
leccin de los sueros ser, segn se discuti
ampliamente, el de un ensayo para la afinidad.
ste puede ser poco elaborado, observndose
empricamente la dosis mnima detectada, rela
cionada con la pendiente inicial de la curva de
desplazamiento. Con estos ensayos puede indi
carse el descarte de los animales (sueros con
baja afinidad) o la prosecucin de las inmuni
zaciones (sueros con apropiada afinidad pero
bajos ttulos). Muchos sueros suelen usarse en
diluciones finales de 10'^-10', por lo cual pue
den conservarse sin diluir congelados, o en di
luciones de reserva (-1/1.000) efectuadas con
sueros no reactivos al 1-2% y con conservado
res (timerosal 1/5.000). De este modo se pre
servan los anticuerpos diluidos de la adsorcin
a los tubos de plstico o vidrio.
Tambin pueden usarse anticuerpos purifi
cados parcialmente por precipitacin de las in
munoglobulinas o especficamente por croma
tografa de afinidad. Sin embargo, algunas
ventajas respecto de la homogeneidad de los
anticuerpos, contabilizando slo la especifici
dad, se dan en los anticuerpos monoclonales
surgidos de la tecnologa de los hibrdomas.
Por otro lado, si se considera la afinidad apa
rente, relacionada a la sensibilidad de los
RAs, los sistemas que combinan dos anticuer
pos monoclonales apropiados o sueros policlo
nales, pueden presentar sensibles ventajas, se
gn se mencion.
Los antgenos marcados
Como se ha analizado exhaustivamente, el
trazador como componente crtico del RIA
consiste en una cantidad minscula del antge
no radiactivamente marcado. Se recomienda la
adicin de aproximadamente 10.000 cuentas
por minuto (error estadstico de conteo del
1%). El porcentaje de error de conteo se obtie
ne de la relacin: error% = 100/Vcuentas. As,
para los puntos de la curva donde las cuentas
han descendido a 1.000 cpm, el error es del
3,2%. Si se comparan esas magnitudes con los
errores de pipeteo, separacin, etc., se observa
que los errores estadsticos debidos al conteo
son de mnima influencia. De este modo se per
mite la deteccin del antgeno marcado en el
nivel de los picogramos en la etapa final del
ensayo. En los trazadores marcados para los fi
nes del RIA se ha incorporado un nucleido que
espontneamente emite partculas o radiacin
electromagntica, cambiando la composicin
de su ncleo (radionucleido). Son muy pocos
los elementos radiactivos naturales (^'C, K,
^^'Ra), de modo que los radionucleidos de inte
rs son preparados artificialmente por irradia

cin. De todos ellos, los ms tiles para el RIA

son los istopos del iodo, *^^I y ^*1, aunque en
particular el primero presenta especiales venta
jas, segn comentaremos.
Otros istopos ocasionalmente usados son
los siguientes: ^'Se, ^Co (vitamina B^^) y '^T e.
Para RIAs de algunos esteroides se ha emplea
do Tritio (^H), el cual no provoca los cambios
estructurales que ocasiona la marcacin con
'251. El Tritio (t|/2 , 12,25 aos) y el '^C (1,^^
5.736 aos) son emisores 3 (electrones); con
ellos se alcanzan menores actividades especfi
cas y deben ser contados en un contador de
centelleo lquido, lo cual representa alguna des
ventaja respecto de los istopos que se cuentan
en contadores gamma. Precisamente, el
es
el istopo de eleccin en muchos casos por
presentar alta actividad especfica en conjun
cin con su carcter de emisor de rayos gamma
de baja energa. Adems, otra ventaja radica en
la relativa simplicidad con la que se incorpora
a residuos de tirosina e histidina en pptidos y
protenas. El '^'I que goza de las mismas pro
piedades qumicas fue el istopo de eleccin en
los primeros aos del RIA. Tericamente, el
^'I otorgara una mayor actividad especfica a
las molculas a las que se incorpora respecto
del
segn se deduce de los valores de t,^
(8,07 das y 60,14 das, respectivamente) apli
cados en la ecuacin (24). Pero ocurre que el
'^I suele proveerse con una pureza del 15-30%
(el resto es '^I) en comparacin con la del
que es cercana al 100%. Adems, en los conta
dores gamma comunes la eficiencia para el '^*1
es menos de la mitad respecto de la del
(7075%). Todo ello hace que para la misma con
centracin molar de ambos istopos las cuentas
ledas sean aproximadamente del mismo orden.
Adems, el '^'I junto a la emisin gamma pro
duce una fuerte emisin beta que causa ms r
pidamente un dao por radiacin a los materia
les biolgicos.
Por todas esas razones, el
resulta el isto
po ms conveniente. A pesar de ello, deben
considerarse ciertos fenmenos inherentes a la
marcacin con ese istopo y, en cierta medida,
los vinculados al grado de incorporacin a las
molculas de antgeno. stos son: 1) la dismi
nucin de la inmunorreactividad debida a la
catstrofe por decaimiento. La energa libera
da es suficiente como para efectuar escisiones
moleculares; 2) el dao ocasionado al antgeno
durante la marcacin y purificacin (dao de
preparacin) y 3) el dao producido durante la
reaccin inmunoqumica en medios con prote
nas plasmticas (dao de incubacin). Este lti
mo es causado por enzimas proteolticas sobre
los trazadores susceptibles.
El principio de marcacin con
(iodacin) se basa en la oxidacin de
por me

Inmunoanlisis radiomtricos

dio de oxidantes apropiados.* Probablemente

se genera iodo atmico con la siguiente trans
formacin a iones iodonio ('^^1''). El agente oxi
dante ms conocido es la Cloramina-T, intro
ducida por Hunter y Greenwood en 1962, la
cual genera cido hipocloroso. Por su inestabi
lidad sus soluciones deben prepararse a ltimo
momento. Junto con la sustitucin electroflica
del iodo en los anillos de tirosina, o a veces de
histidina, se puede producir la oxidacin de re
siduos de cistena y de metionina por parte de
ese enrgico oxidante. El empleo de protocolos
de Cloramina-T limitante permite disminuir
las oxidaciones indeseadas. Los cambios conformacionales que pueden generarse en el ant
geno son entonces debidos al iodo y a las posi
bles reacciones paralelas, si stas no son mini
mizadas. Suele emplearse un agente reductor
para detener la reaccin. El ms comnmente
usado es el metabisulfito de sodio.
El iodo se incorpora a pH ptimo (7-7,8) en
las tirosinas (posicin 2 o 2 y 6) y a pH 8,4-9
en las histidinas. Cuando el residuo modificado
es en particular el de un hapteno, el incremento
del tamao molecular puede ser considerable,
ya que el iodo posee un volumen semejante al
del anillo bencnico. Un diiododerivado triphcar entonces el volumen del grupo original.
Adems, el oxhidrilo fenlico es ms disociable por el efecto de disminucin de su pKa. Es
tos efectos pueden resultar crticos para las mo
lculas pequeas como la de los esteroides. El
resultado final observable podra ser un cambio
apreciable en la afinidad de los anticuerpos ha
cia el trazador respecto del antgeno inmodificado.
A pesar de los inconvenientes mencionados,
la cloramina-T es el oxidante ms usado por su
simplicidad. Otros mtodos oxidativos emplean
lactoperoxidasa con adicin directa de HjOj o
con produccin enzimtica (glucosa oxidada/
P-D glucosa), u oxidantes como el iodogen,
etc. Para pptidos o antgenos no peptdicos
que no poseen residuos tirosilo o histidilo se ha
empleado el reactivo de Bolton y Hunter. Este

* H ay que tener en cuenta que para la utilizacin de is to

pos radiactivos deben seguirse las norm as oficiales que re
gulan su em pleo. En especial para la preparacin de com
puestos radioiodados se requieren adecuadas instalaciones,
equipam iento y la participacin de personal habilitado. Ei
principal problem a del
constituye la volatilidad de su
form a elem ental, sobre todo en las soluciones cidas. La
glndula tiroides resulta la principal captadora luego de su
inspiracin accidental. Se deben tom ar especiales precau
ciones en la etapa de extraccin del Na'^^l (en m edio alca
lino) y d urante la oxidacin. Luego no existen m ayores
riesgos en la m anipulacin de las cantidades habituales en
el RIA . El em pleo de los kits com erciales im plica el uso
de actividades bajas en todo m om ento, las cuales pueden
m aniobrarse con razonable seguridad.

845

reactivo se marca previamente con I y luego

luego se conjuga a los antgenos a travs de
grupos amino de este ltimo.
Luego de la marcacin es casi siempre nece
sario purificar los antgenos marcados de los
productos de reaccin y de las molculas daa
das, Los mtodos ms empleados son los de fil
tracin en Sephadex, los basados en adsorcin
(columnas de celulosa) y los electroforticos.
Ultimamente se han desarrollado mtodos muy
refinados basados en electroforesis en geles
discontinuos o multifsicos de poliacrilamida,
en intercambio inico y en cromatografa lqui
da de alta resolucin (HPLC de fase reversa).
Con ellos se logra para ciertos antgenos protei
cos la preparacin de monoiododerivados ho
mogneos (un solo residuo tirosilo modificado
e identificable). Los ejemplos ms sobresalien
tes son los de trazadores homogneos de la in
sulina: mono ^^l-insulina modificada en su re
siduo tirosilo nmero 14 o nmero 19 de la ca
dena polipeptdica A (designados A14 y
A19, respectivamente) o nmero 26 de la ca
dena B (B26).
Estos trazadores poseen varias ventajas, entre
las cuales se destacan: 1) propiedades inmunoqumicas inalteradas o al menos uniformes; 2)
gran estabilidad (ms de 6 meses de vida til);
y 3) declinacin conocida de la actividad espe
cfica a travs del tiempo. Este tipo de trazador
se prepara incorporando iiiicialmente relaciones
bajas de
por molcula de antgeno (-0,1
tomo/molcula), que se logra mediante el ex
ceso relativo del antgeno respecto del
Luego, la etapa de purificacin elimina no slo
los componentes intiles de la reaccin, sino
que separa las molculas no marcadas y las for
mas iodadas entre s. Entre estas ltimas estn
las monoiodadas en distintas posiciones (que
presentan diferencias sutiles en su conducta i
nica) y cantidades bajas de diiodo y poliiodo
derivados. Los monoiodo derivados poseen te
ricamente la alta actividad especfica inicial que
prev la ecuacin (24). Obsrvese que la activi
dad especfica inicial de la mezcla de reaccin
era 10 veces menor (mtodo subestequiomtrico). Si esos productos se purifican slo por fil
tracin en geles, resultan heterogneos y su ac
tividad especfica calculada es la del promedio
(adems representa un valor relativo bajo). Co
mo ya se analiz, eso puede tener consecuen
cias negativas en la sensibilidad de los ensayos.
En cambio, sern trazadores estables, pues la
baja incidencia de diiodo derivados generar
pocas molculas daadas y radiactivas. stas
son causadas por la desintegracin de uno de
los tomos y la persistencia muy probable de la
marca debida al otro tomo.
Si se intenta elevar desde el inicio la activi
dad especfica por la incorporacin de un to

846

Metodologas

mo de ' I por molcula (mtodo estequio mtri

co) se obtendr ese valor en promedio con una
distribucin estadsdca de molculas hiperiodadas y otras menos iodadas y fras. Estos traza
dores son tiles desde el punto de vista de la
sensibilidad en los RIAs, pero resultan inesta
bles y muestran elevado dao a los pocos das
de guardados, aun a ~~20'C y diluidos. Los monoiodo derivados exhiben ambas propiedades a
la vez: alta .actividad especfica y alta estabihdad, dos caractersticas que se contraponen en
los trazadores convencionales o clsicos.
De todo lo mencionado surge que es necesa
rio efectuar controles de cahdad sobre los tra
zadores. Los ms comunes son: 1) el test de
unin a anticuerpos en diluciones conocidas de
estos ltimos (establecidas mediante calibra
ciones con trazadores anteriores); 2) el test de
dao por radilisis por mtodos electroforticos o cromatogrficos, y 3) la determinacin de
la actividad especfica por tcnicas de autodesplazamiento. Estas a veces incluyen el control
de correccin por la mxima inrnunorreactividad real, puesto que parte de la marca puede
estar incorporada a molculas no antignicas.
Puede obtenerse una medida de la eficiencia
de la marcacin y una estimacin aproximada
de la actividad especfica por mtodos directos
y sencillos cuando se purifica la mezcla de
marcacin mediante columnas de Sephadex.
En esos casos se integran los valores de activi
dad en el pico correspondiente a la protena (x)
y se hace lo propio con el pico correspondiente
a la fraccin de ioduro no incorporada (y). El
clculo de eficiencia se hace a partir de la rela
cin x/(x + y) y el de la actividad especfica
promedio se obtiene de la relacin x/masa de
protena marcada. En ese caso, x se expresa
usualmente en jO,Ci y ia masa en |ag.
Los patrones de antgeno fro
Se recuerda que para validar los procedi
mientos radioinmunoanalticos los antgenos de
los estndares deben ser inmunoqumicamente
idnticos a los de las muestras desconocidas.
En cambio, no se requiere su identidad qumica
o en trminos de potencia biolgica. Para los
fines comparativos es necesario que los distin
tos laboratorios posean preparaciones de refe
rencia comunes y accesibles al uso general.
Cuando esos casos no se dan, debe contarse al
menos con muestras de concentracin conocida
para evaluar las soluciones desconocidas.
La estabilidad y las especificaciones para la
conservacin de cada tipo de sustancia patrn
deben seguirse segn las recomendaciones que
se difunden. En cambio, es un requisito genera
lizado el empleo de protenas inertes o deter
gentes no inicos para prevenir la adsorcin de

los antgenos patrones. En efecto, debido a las

altas diluciones de las soluciones patrones en
stock (20 ng/ml-1 |J,g/ml), y diluidas aun ms
durante los ensayos, se producira su firme ad
sorcin a los recipientes y tubos de vidrio o
plstico.
Tcnicas separativas
En muy raras ocasiones la separacin de los
antgenos libre y unido se logra directamente
por precipitacin espontnea de los inmunocomplejos durante una simple centrifugacin.
Esto ha sido mencionado por ejemplo para el
antgeno australiano debido a sus dimensiones
y concentracin en los ensayos. En el caso de
antgenos ms pequeos o diluidos, como
acontece para las hormonas plasmticas, los
complejos inmunes permanecen en solucin.
Por ende, se han desarrollado una serie de tc
nicas separativas basadas en distintos princi
pios y ejecutados segn diferentes variantes.
En el cuadro 39-2 se compendian las tcnicas
aplicadas comnmente. Las ms frecuentes son
las tcnicas de carbn (Norit A), las de polieti
lenglicol, las de fijacin de anticuerpos a fase
slida y las de dole anticuerpo (precipitacin
de los complejos inmunes por un antianticuer
po). Las ventajas y hmitaciones de cada una de
ellas no son tan definidas como para favorecer
a una en particular.
Respecto de esta etapa final de los RIAs
puede comentarse que es factible contar una o
ambas fases. En general, se recomienda contar
slo una de ellas por razones de practicidad y
sin hacer concesiones apreciables a la precisin
de las medidas. Puede aconsejarse contar, por
ejemplo, la fraccin unida cuando sta repre
senta menos del 50% de la actividad total. Para
los trazadores con emisin beta se prefiere con
tar los sobrenadantes (marca unida o libre, in
distintamente), pues los precipitados son difir
cultosos de suspender o disolver en los fluidos
de centelleo.
OTRAS TECNICAS RADIOMETRICAS
Marcacin nietablica de protenas
e inmunoprecipitacin
La marcacin metablica de protenas segui
da de la inmunoprecipitacin especfica es un
mtodo de considerable utilidad en varios cam
pos de la biologa experimental, por lo cual ha
remos una somera descripcin de esa estrategia.
La marcacin metablica comprende la sus
titucin de tomos naturales, frecuentemente
de las protenas, por istopos radiactivos que se
incorporan durante la biosntesis natural. El

Inmunoanlisis radiomtricos

847

Cuadro 39-2. Tcnicas empleadas en radioinmunoensayo para la separacin del antgeno en sus
formas lbre y unida a anticuerpos
A ntgeno
Variante

P rincipio
P recipitacin de com
plejos antgeno-anti
cuerpo

Libre

Unido

D oble anticuerpo
Polietilenglicol
S olventes orognicos

-alco h o l
-d io x a n o

Sobrenadantes

Precipitados

Precipitados

S obrenadantes

Fase lquida

Fase slida

Precipitacin salina
A dsorcin de antgeno
libre a m ateriales s
lidos

Carbn

- S in tratam iento
-R ec u b ierto con dextrano, alb
m in a ficoll, etc.

C elulosa

-P o lv o
<

-P a p e l

S ilicatos

T ubos

-C o lu m n a

-T a lc o
l - c id o silcico y silicatos
-A n i n ic as
-C ati n ic as

R esinas intercam biadoras

A dsorcin o unin co
valente de anticuer
pos a polm eros

-C rom atoelectro foresis

-T iras de adsor
cin

P lacas (policubetas)

-P o lie stiren o
-P o lip ro p ilen o
-P o iie tilen o
-P l stic o s varios

Partculas

j
t

-T e fl n
-S ep h ad ex
-B en to n ita

D iscos

J
1

-T e fl n
-P o lip ro p ilen o

A ntisuero polim erizado

Separaciones varias

T am ices m oleculares
Eleetroforesis en papel

precursor ms comn para estas marcaciones

es el aminocido metionina, al cual se le coloca
radiactivo, en lugar del istopo normal. El
^-S es un emisor (3 con un perodo de semidesintegracin de 87,5 das.
El cultivo de clulas eucariontes o procariontes (modificadas genticamente, para la ex
presin de una protena seleccionada) en un
medio libre de metionina al cual se le agrega el
aminocido radiactivo conduce a la marcacin
de las protenas. Ajustando las variables de es
tas incubaciones (AE del aminocido, concen
tracin, tiempo de incubacin), se regula la ac
tividad de los productos finales marcados.
Luego de una etapa preparativa, que incluye
la lisis celular y la separacin de las protenas
solubles, los productos marcados se ensayan

frente a los anticuerpos especficos directamen

te o luego de una purificacin. Este ltimo paso
es el que se conoce en general como inmunoprecipitacin. Las formas de separacin de los
inmunocomplejos formados comprenden una
vai'iedad de procedimientos. Los principios ge
nerales incluyen variantes en fase fluida (seme
jantes al RBA), y detecciones efectuadas en fa
se slida tras procedimientos electroforticos y
autoradiogrficos. En este ltimo caso adems
se pueden obtener datos estructurales del ant
geno, como su peso molecular.
Mediante estos procedimientos de marcacin
radiactiva e inmunoprecipitacin se han estu
diado, de manera relativamente sencilla, tanto
antgenos como anticuerpos provenientes de
mezclas complejas.

848

Metodologas

APNDICE
Tcnicas modelo para un RIA de protenas
(insulina):
1. Marcacin con ^^I.
2. RA en fase lquida.
3. RIA en fase slida.
Marcacin con
Mtodo estequiomtrico (incorporacin
de 0,2-] tomos de ^^1por molcula de prote
na) con cloramina-T limitante.
Este mtodo conduce a la obtencin de tra
zadores de actividad especfica relativamente
alta (para la insulina aproximadamente 80-380
xCi/jig), pero que muestran apreciable radilisis luego de conservarse una o dos semanas,
aun en forma diluida y a -20C. Por esa razn,
luego de esos perodos puede requerirse la re
purificacin mediante cromatografa en colum
nas de Sephadex.
Procedimiento: utilizar un tubo de vidrio (ti
po hemlisis) siliconado y agregar sucesivamen
te las siguientes soluciones: 10 jil de buffer fos
fato de sodio 0,5 M, pH 7,4 (BF); 2,5 ^1 de una
solucin de reserva de insulina de 1 mg/ml, co
rrespondiente a 2,5 [ig de la hormona. La solu
cin de reserva se prepara con insulina porcina
altamente purificada, 1 mg, disuelta en 100 jxl
de HCl 0,01 N, diluida a 1 mg/ml por la adicin
de 200 |al de NaOH 0,01 N y 700 |xl de BF;
1 mCi (37 MBq) de Na'^^I (normalmente disuel
to en NaOH 0,1 N); 5 |il de cloramina-T de 30
|Lig/ml en BF preparada recientemente (menos
de 15 minutos). Se agita con suavidad la mez
cla, evitando proyecciones, durante 1 minuto. A
modo de orientacin puede efectuarse un con
trol de incorporacin de
segn lo indica J.
Roth (vase la bibliografa recomendada). Este
procedimiento, o el resultado de una marcacin
preliminar, pueden sugerir la necesidad de ajus
tar empricamente las cantidades de cloramina-T
a adicionar. Finalmente, agregar a la mezcla de
reaccin 0,5 mi de una solucin de seroalbmi
na bovina (SAB) de 1 mg/ml en BF 1:17.
Aplicar la solucin a una columna (aproxi
madamente de 0,9 X 60 cm) de Sephadex G-50
equilibrada y eluida con BF 1:17/SAB. El flujo
se ajusta a 10-15 ml/h y se recogen fracciones
de 0,5 mi. Para los ensayos de RIA se utiliza el
pico que eluye generalmente en una zona inter
media entre el pico de los agregados (volumen
de exclusin, Vo) y el pico de
no incorpo
rado (volumen de inclusin total, Vo -t- Vi).

* El procedim iento debe ser realizado por personal autori

zado y bajo las norm as e infraestructura recom endadas p a
ra el m anipuleo de
en el orden de los m ilicuries.

Mtodo subestequiomtrico (<0,2 tomos

de ^^-7p o r molcula de protena)

Este mtodo intenta obtener mayor propor

cin relativa de mono-^I-derivados a expensas
de una reduccin de la actividad especfica pro
medio alcanzable (para la insulina, aproxima
damente 10-50 xCi/)ig), lo que conduce a una
preparacin de trazador de buena estabilidad a
la radilisis y por ende puede usarse por pero
dos prolongados (1-2 meses). En caso de ser
preciso puede incrementarse la actividad espe
cfica (hasta aproximadamente 380 |aCi/|Xg, co
rrespondiente a 1 tomo de '^^I por molcula de
insulina) mediante un procedimiento especial
de purificacin al final de la marcacin que eli
mina la insulina fra. Vase por ejemplo la re
ferencia de S. Linde y col. en la bibliografa re
comendada. Este tipo de trazadores monoiodados y homogneos puede utilizarse 6 meses o
ms sin detectarse una radilisis importante.
Procedimiento: en un tubo como el descrito
para el mtodo anterior, adicionar sucesiva
mente; 10 )xl de la solucin de reserva de insu
lina de 1 mg/ml, correspondiente a 10 |j.g de in
sulina; 1 mCi de Na'^4 disuelto en la solucin
alcalina de origen; 10 )il de cloramina-T de
0,88 mg/ml en BF. La mezcla de reaccin se
agita suavemente durante 45 segundos y se adi
cionan 5 |li1 de m etabisulfito de sodio de
4,8 mg/ml en BF.
Los pasos sucesivos del ensayo de incorpo
racin, de adicin de la SAB y de purificacin
en columna de Sephadex, son los mismos sea
lados para el procedimiento anterior. Si en
cambio se opta por la purificacin de la mezcla
de marcacin mediante geles multifsicos de
poliacrilamida, por intercambio inico, o por
tcnicas de HPLC, la muestra ingresa directa
mente en esos sistemas sin la adicin de SAB.
Este agente protector de la adsorcin del traza
dor a los recipientes se agrega al final.
RIA en fase lquida
Incubaciones

El siguiente procedimiento para el RIA de

insulina se basa en la tcnica propuesta por
Yalow y Berson. En el cuadro 39-3 se ofrece
un protocolo del ensayo. Conviene utilizar micropipetas y dispensadores de precisin con
trolada.
La dilucin apropiada del anti suero utilizado
(B/F~l) se puede obtener de un ensayo preli
minar en idnticas condiciones, donde se inclu
yen tubos con d iluciones seriadas desde
1:1.000 hasta 1:512.000 (razn 1:2).
Obviamente, este ensayo slo incluye el tra
zador y no el patrn de insulina fra.

849

Inmunoanlisis radiomtricos

Cuadro 39-3. Protocolo modelo para un RIA de insulina en fase lquida. Los ensayos se efectan
por duplicado o triplicado

Tubos
N

3
4
5

6
7

8
9
10

D iluyente'
Jil

300
299
298
297
296
296
290
180
260

220

C ontrol de unin inespecfica

11

Suero desconocido
C ontrol de suero desconocido
C ontrol de cuentas totales

12

200

13
14

300

"h-lns^
patrn
(12,4 ng/m l)
m

Antisuero'^
(l/x )
il

'^-'Lp-lns"
( W - l f f > cp m )
' ll

100

100

1
2

100
100

100
100

3
4
5

100

100
100
100

10

20
40
80
300-^
Insulina en
anlisis (suero
desconocido)
1000
100"

100
100
100

100

100
100
100
100

100
100
100

100

100
100
100

100

' D iluyente; b u ffe r barbital 0 ,0 2 M , p H 8,6, su p lem en tad o con su e ro norm al d e co b a y o 1% y s e ro alb m in a h u m an a 0 ,25% .
^ Patrn;- in su lin a h u m an a a ltam e n te purificada (e st n d ar de re fe re n c ia ) dilu id a a p a rtir d e una so lu ci n sto ck de 0,1 fig /n il con d ilu y en te. L a
s erie apH cada d e b e ad o p ta rse a ca d a suero segtn su afinidad.
^ A ntisuero; d ilu ci n stock 1;] .000 en d ilu y en te y m erthiolate (l;5 ,0 0 t)), d ilu id a p a ra u s o segn e n sa y o p revio h asta u n i n de ~ 50% d e l tra
zador.
Trazador; in su lin a p o rc in a m arc ad a . Segn el antisuero utilizado s e re co m ien d a u n a c o n c en tra ci n d e 2- iOO pg/m l,
^ C ontrol d e u n i n in esp ec fica: d eb e v erificarse que se ad ic io n a u n g ran ex ceso d e an tg en o o b te n in d o se el m x im o d esp laz am ien to p o s i
ble. P uede u s a rs e un p atrn m s c o n c en tra d o en ese punto.
'' S ueros desc o n o cid o s; se e n sa y an en dilu cio n es finales de l; 10 h a s ta l;50.

Los tubos con las mezclas de reaccin se in

cuban a 4C durante 3-5 das. Tambin es usual
la incubacin a 37C durante una noche.
Separacin de las marcas libre
y unida (carbn)

Los .siguientes tratamientos se aplican a to

dos los tubos indicados en el cuadro 39-3, ex
cepto para el control nmero 14.
Si se sigue un procedimiento de separacin
con adsorbentes, antes de su adicin se coloca
suficiente cantidad de suero normal a todos los
tubos de los patrones como para igualar la con
centracin presente en las muestras desconoci
das.
La separacin con carbn no recubierto (Norit grado A) se efecta con 0,2 ml de una sus
pensin de 100 mg/ml en buffer barbital 0,02
M, pH 8,6. La cantidad de carbn agregada a
cada tubo corresponde a 20 mg. Conviene eje
cutar estas operaciones en bao de hielo y utili
zando un agitador Vortex para suspender la
mezcla de cada tubo durante unos segundos.
Luego se centrifugan los tubos a 3.000 rpm, a
4C, durante 15-20 minutos.
Los sobrenadantes pueden descartarse o pa
sarse a otra serie de tubos numerados. De este
modo, puede optarse por contar slo los preci
pitados con la marca libre adsorbida, los sobre
nadantes con la marca unida, o ambos tubos.

Empleo de carbn recubierto

(carbn-dextrano)

El comportamiento del carbn solo o recu

bierto para lograr la adsorcin selectiva de pp
tidos no es bien conocido y ha originado cier
tos conflictos de opinin. Algunos autores in
terpretan que la adsorcin parcial, indeseada,
de complejos antgeno-anticuerpo puede ser in
hibida por un tratamiento del carbn con mol
culas de tamao adecuado. De este modo, recu
briendo los poros del carbn de gran tamao y
no los de pequeo dimetro, se lograra una ad
sorcin selectiva del antgeno en cuestin sin
captar los inmunocomplejos. Otros autores no
han avalado esta argumentacin por no hallar
diferencias entre carbn intacto o recubierto.
D todos modos es bastante frecuente efectuar
un tratamiento con dextrano del modo que si
gue: se prepara una suspensin de carbn al
5% en buffer fosfato de sodio 0,03 M, pH 7,4 y
se mezcla con partes iguales de dextrano (PM
promedio 80 KD) al 0,75% en el mismo buffer.
Luego se .aplica a los tubos del ensayo en las
proporciones antes indicadas para el carbn sin
tratamiento.
RIA en fase slida(en tubos plsticos)
Las etapas experimentales incluyen la si
guiente sucesin: 1) calibracin de la adsorcin

850

Metodologas

de antisuero a los tubos de reaccin; 2) prepa

racin de un lote grande de tubos calibrados, y
3) ensayos de desplazamiento con patrones y
desconocidos.
Calibracin de la adsorcin de antisuero
a los tubos de reaccin

Se pueden utilizar tubos plsticos desechables de poliestireno, polipropileno, etc. Es con

veniente que sean pequeos (aproximadamente
6 X 20 mm) de fondo U o cnico.
Se coloca 200 |il de antisuero anti-p-insulina
diluido en buffer cido brico-borato de sodio
0,013 M, pH 8 (BB) en una serie de tubos nu
merados cubriendo las diluciones 1:1.000 a
1:64.000 (razn 1:2). Se incluye un control de
suero normal de cobayo 1:1.000 en BB. Nor
malmente este protocolo se sigue por duplicado
o triplicado.
Se incuba a 37C durante una noche (17 ho
ras) en una cmara hmeda hermtica. Tam
bin puede optarse por incubaciones de 2 ho
ras. Luego se aspira el contenido de los tubos y
se los lava y recubre con 400 )il de una solu
cin de buffer fosfato de sodio 0,05 M, pH 7,4,
NaCl 0,15 M, N3Na 0,01%, Tween 20 0,05%
(PBST). Este tratamiento para recubrir los si
tios de adsorcin remanentes del soporte puede
mejorarse si se repite la operacin anterior con
PBST y luego mediante una exposicin de los

tubos (15 minutos) con 200 |al del mismo

PBST, suplementado con 20% de suero huma
no norm al tratad o con exceso de carbn
(PBST, SHN-C). Luego de la aspiracin del
contenido de los tubos se realiza la siguiente
etapa de incubacin con el trazador.
A todos los tubos se les agrega 100 )xl de la
solucin PBST, SHN-C y 100 |i,l de una solucin
del trazador '^^I-p-Insulina en el diluyente PBST
(aproximadamente 5.000 cpm, actividad espec
fica 100-380 jxCi/ixg). Se incluyen dos tubos ex
tra, no tratados, a los que se aplica slo 100 |al
del trazador como control de cuentas totales.
La serie completa de tubos se incuba durante
17 horas a 37C en cmara hmeda hermtica.
Luego, todos los tubos, excepto los controles
de cuentas totales, se aspiran y se lavan dos ve
ces con 400 |xl de agua destilada, a 4C, Final
mente se cuentan durante 1 minuto.
Realizando un grfico de la unin del traza
dor en funcin de la dilucin del antisuero se
facilita el clculo de aquella dilucin que efec
ta aproximadamente el 50% de captacin del
antgeno.
Preparacin de un lote grande
de tubos calibrados

Una vez seleccionada la dilucin apropiada

del antisuero se puede activar un lote importan
te de tubos en las mismas condiciones origina

Cuadro 39-4. Protocolo modelo para un RIA de insulina en fase slida. Los ensayos se efectan
por duplicado o triplicado. Las incubaciones y las operaciones siguientes se realizan igual a lo
indicado para la etapa final del ensayo de calibracin
Tubos
(A ctivados con
antisuero)
N

1
2
3
4
5

D iluyente
PBST, SH N -C
ni

100

6
7

h -ln s patrn
en PBST, SH N -C
(iiH '/0 0 fil)

10
D iluyente
PB ST

0,31
0,62
1,25
2,50
5,0
10,0
20,0
40,0
80,0
Insulina en anlisis
(suero desconoci
do) |Xl

'^^-p-Ins
(5.000 cpm, A E =
100-380 n Ci/fig)
ni

100
100
100
100
100
100
100
100
100
100

S uero desconocido
C ontrol de suero desconocido

11
12"

80
80
D iluyente
P B ST, SHN -C

20
20

100
100

C ontrol de unin inespecfica

C ontrol de cuentas totales

13"
143

100

100
100

L a ca n tid a d de in su lin a se d a d irec tam en te en u n id ad e s in te rn a c io n a le s (1 u U = 41,67 pg).

2 T u b o s tratados con suero n o rm al d e cobayo.
^ T u b o n o tratado.

Inmunoanlisis radiomtricos

les. El nmero de tubos a procesar contemplar

los requerimientos analticos del laboratorio
durante perodos suficientemente prolongados.
Esto puede hacerse as dado que la estabilidad
de los anticuerpos adsorbidos es muy buena
cuando se los conserva a -20C en recipientes
bien tapados.
Ensayos de desplazamiento
con patrones y desconocidos

En el cuadro 39-4 se muestra un protocolo

modelo para el RIA en fase slida de insulina.
Tal como se indic para el RIA en fase lquida,
la serie de tubos con antgeno patrn debe ajus
tarse segn las caractersticas del antisuero em
pleado.
La graficacin de los resultados y el procesa
miento de los datos puede efectuarse como se
mencion durante el desarrollo de este captulo.
B IB L IO G R A FA

851

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Metodologas bsicas en biologa molecular.

Tcnicas de hibridizaein y reaccin
en cadena de la polimerasa (PCR)

GLORIA E. CERROME
LAURA MORELLI

TCNICAS BSICAS DE BIOLOGA

MOLECULAR
Se puede considerar que el nacimiento de la
Biologa Molecular ocurri en 1953 cuando
Watson y Crick publicaron el modelo de la es
tructura en doble hlice del ADN. Desde en
tonces se ha producido una verdadera revolu
cin molecular debido al desarrollo de la tecno
loga de ADN recombinante, un conjunto de
tcnicas rpidas y sensibles para la manipula
cin del ADN, ARN y protenas que llevaron a
una explosin de actividades en todos los as
pectos de la gentica humana tanto en la inves
tigacin como en la clnica.
En el curso de estos cuarenta aos se ha de
sarrollado un arsenal metodolgico, que nos
permite en la actualidad comprender los meca
nismos implicados en la expresin normal de
los genes, la deteccin directa de las mutacio
nes moleculares responsables de las enferme
dades hereditarias y la produccin de protenas
de inters mdico y bioqumico.
En principio todas las enfermedades genti
cas pueden ser analizadas en trminos molecu
lares y algunas de ellas ser eventualmente trata
das y/o curadas debido a la identificacin mo
lecular precisa de los defectos en el ADN y sus
consecuencias metablicas. Existen adems
muchas enfermedades no heredadas asociadas
a cambios en el ADN de clulas somticas co
mo ocurre generalmente en los cnceres ; y se
han encontrado evidencias crecientes de que
variaciones en los rearreglos del ADN que
acompaan la diferenciacin del sistema inmu
ne tienen efecto en la susceptibilidad de los in
dividuos a diversos tipos de tumores o infec
ciones virales.

40
El ADN (cido desoxirribonucleico) que se
encuentra en el ncleo de todas las clulas de
un organismo lleva la informacin para la sn
tesis de todos los ARN (cidos ribonucleicos),
algunos de los cuales codifican para la sntesis
de las protenas de una clula. Recin en 1953
Watson y Crick proponen un modelo para la
estructura del ADN el cual indica que est for
mado por dos cadenas de polinucletidos heli
coidales con giro a la derecha dispuestas en do
ble hlice alrededor de un eje central en forma
de antiparalelas es decir que siguen direcciones
opuestas. Los nucletidos tienen una composi
cin similar; todos ellos poseen un anillo de un
azcar biolgico (desoxirribosa) un grupo fos
fato y una base nitrogenada que en nmero de
cuatro (adenina, citosina, timina y guanina) es
la que otorga la variacin a los correspondien
tes nucletidos. Estos se polimerizan por unio
nes fosfodister disponindose las bases nitro
genadas en el interior de la hlice en forma per
pendicular al eje helicoidal y las dos cadenas se
mantienen unidas por puentes de hidrgeno en
tre las bases A y T (2 uniones) y entre C y G (3
uniones) (fig. 40-1).
Los cromosomas estn conformados por nu
merosos y ordenados plegamientos de ADN
combinado con ciertas protenas. Cada cromo
soma tiene un determinado nmero de secuen
cias denominadas genes que codifican para la
sntesis de protenas. Cada clula humana con
tiene aproximadamente 3 x 10 pares de bases
que en conjunto constituyen su genoma; la in
formacin as almacenada se transmite de ge
neracin en generacin dando origen a nuevos
individuos con cai-actersticas similares a las de
sus progenitores. Se considera que el 10 % del
genoma est ocupado por genes que codifican

Metodologas bsicas en biologa molecular

/'

Grupo fosfato

Adenina

853

Guanina
Azcar biolgico

OH

OH

dGTP

dATP
Unin de dATP a dGTP

l/.

ADN polimerasa

OH
Fig. 40-1. U nin entre nucletidos. C ada uno de los nucletidos (dA T P y dG TP) tienen un grupo OH unido al C3 y un
grupo trifosfato unido al C5. Cuando los 2 nucletidos se unen por accin de la A D N polim erasa se fo rm a una unin fo sfodiester y se libera pirofosfato.

protenas el resto est constituido por ADN no

codificante, como el ADN repetitivo sin fun
cin conocida, el ADN centromrico o el ADN
telomrico.
Existen mtodos que permiten aislar el ADN
celular para poder estudiarlo. Este puede ser
purificado a partir de cualquier tejido u rgano
debido a que la informacin gnica es la misma
en todas las clulas de un organismo. General
mente se utiliza sangre perifrica debido a la
facilidad en la obtencin de. la muestra ya que
es un procedimiento no cruento.
En el caso del estudio de ARN mensajeros
que constituyen los componentes centrales de
la expresin de genes en organismos eucariotas
y procariotas es necesario elegir el tejido para
proceder a la purificacin.
La Biologa Molecular nos ofrece varias he
rramientas y tcnicas para el estudio de los ci
dos nucleicos. Considerando el gran tamao
del genoma eucaritico (3x10 pares de bases),
es necesario contar con mtodos que nos per
mitan aislar un gen para su estudio.
El clonado molecular permite aislar un ni
co fragmento discreto de ADN de una pobla
cin de genes, purificar el segmento a homoge
neidad y la obtencin de millones de copias del
mismo en forma pura para anlisis qumicos,
biolgicos y genticos.
Consiste en cortar fragmentos de ADN por
medio de endonucleasas de restriccin (enzi

mas que reconocen secuencias especficas del

ADN y lo chvan) y unirlo a vectores e introdu
cirlos en bacterias para que stas lo repliquen
junto a su genoma. As se puede obtener una
biblioteca genmica que comprenda la colec
cin de todas las secuencias contenidas en el
genoma en forma estable a partir de la cual se
puede aislar una determinada secuencia de
ADN en forma pura. Tambin es posible cons
truir bibliotecas de ADN complementario que
son colecciones en las que estn representados
todos los ARN mensajeros bajo la forma de
ADN complementario o copia (ADNc) de un
tipo celular dado (tejido) en forma estable.
Es una metodologa laboriosa donde se de
ben cumphr tres grandes pasos: 1) la eleccin y
preparacin del material gentico a clonar, que
puede ser ADN genmico o ADN complemen
tario, 2) el clonado (construccin de las biblio
tecas) y 3) la identificacin y aislamiento de recombinantes para su estudio.
Ensayos de hibridizacin
Existen tcnicas basadas en la hibridizacin
molecular que permiten analizar fragmentos de
ADN. Para su correcta interpretacin es nece
sario aclarar ciertos conceptos bsicos:
En condiciones fisiolgicas, las dos hebras
de la doble hlice no pueden separarse espont
neamente. Pero cuando stas son expuestas a

854

Metodologas

temperaturas cercanas a 100C o a condiciones

de pH extremas se separan, se desnaturalizan
en los dos componentes simple cadena. Las dos
cadenas complementarias pueden recombinarse
entre s para formar la doble hlice nativa cuan
do son llevadas a temperaturas menores. La renaturalizacin o hibridizaein es muy espec
fica y produce doble hlice slo cuando las dos
cadenas son exactamente complementarias u
homologas, si bien a temperaturas menos exi
gentes o astringentes (ms bajas) pueden hibridizar molculas no totalmente complemen
tarias. Este trmino astringencia seala si las
condiciones de hibridizaein son favorables o
no para que se establezca la unin puente de hi
drgeno.
Cunta homologa se necesita para que dos
hebras permanezcan hibridizadas? Si bien es
importante el porcentaje de homologa, una
variable importante es la localizacin dentro
de la secuencia; pares de bases adyacentes se
mantienen unidas ms fuertemente que el mis
mo ntmero disperso a lo largo de la secuencia
de ADN. Las hebras hibridizadas con bajo ni
vel de homologa (alrededor del 10 %) tienden
a disociarse o desnaturalizarse rpidamente en
la mayora de las condiciones. Con un 50 % de
homologa la unin depender de las condicio
nes de reaccin dado que los puentes de hidr
geno son el pegamento que mantiene unidas a
las cadenas; diversos reactivos qumicos (por
ejemplo la formamida) y las condiciones de
reaccin (temperatura, presencia de sales etc.)
influyen en la misma. Trabajando en condicio
nes de reaccin exigentes o de alta astringen
cia slo hibridizan las molculas muy homlogas.
Se llama temperatura de melting o de
fusin (Tm) a la correspondiente al punto me
dio de la curva de desnaturalizacin del ADN,
es decir, aquella a la cual la relacin entre las
hebras de ADN hibridizadas/desnaturalizadas
en la reaccin es 0,5. Tm puede ser modificada
segn las condiciones de reaccin: aumenta
con el contenido de GC, con la astringencia sa
lina (concentracin de sales monovalentes
M), con la longitud de la cadena ms corta
del dplex (n) y disminuye con la concentra
cin de agentes desnaturalizantes de la doble
hlice, como la formamida.
Es posible calcular la Tm de un hbrido de
acuerdo a:
Tm=81,5 C + 16,6 log M -h 0,41 (%G+C) - 500/n - 0,61 (% formamida)
Cuando se hacen experimentos de hibridizacin, se puede controlar el porcentaje de homo
loga necesaria para que se formen hbridos
ajustando las condiciones de la reaccin, sien

do astringentes (exigentes) cuando las condi

ciones se acerquen ms al Tm del ADN en es
tudio.
A travs de las tcnicas de Biologa Molecu
lar es posible identificar una secuencia deter
minada de cidos nucleicos en una muestra por
hibridizaein a una secuencia de ADN o ARN
conocida. Generalmente la hebra conocida se
encuentra marcada y se conoce como sonda
o probe. Los procedimientos de marcacin
habituales incluyen radionucleidos
^^S,
o
marcas no isotpicas que se detectan por fluo
rescencia o colorimetra. La hebra no marcada
en la muestra a analizar es homloga de la son
da y se conoce como blanco o target. La
presencia e intensidad de la seal hibridizada
ser funcin del grado de homologa entre
blanco y sonda, la concentracin de blanco, las
condiciones de astringencia y la actividad espe
cfica de la sonda marcada.
Existen diversas tcnicas de hibridizaein
molecular. Una variante es extraer el ADN ge
nmico o el ARN de una muestra, desnaturali
zarlo e inmovilizarlo en un soporte slido para
hibridizarlo con una sonda marcada. General
mente la inmovilizacin se realiza en filtros de
nitrocelulosa o nylon depositando la muestra
en orificios que delimitan un punto y con la
ayuda de un sistema de vaco, de all la expre
sin dot hibridization (fig. 40-2).
Con el descubrimiento de las enzimas de res
triccin, en la dcada de 1970, se abri un nue
vo panorama en el estudio de secuencias espe
cficas. Estas endonucleasas de restriccin fue
ron aisladas de bacterias, reconocen secuencias
de 4 a 6 pares de bases de ADN y lo clivan en
sitios especficos dentro de ellas.
Las enzimas de restriccin fueron utilizadas
por E. M. Southern cuando desarroll una tc
nica revolucionaria que lleva su nom bre,
Southern blot. Es una de las herramientas
ms importantes y de mayor difusin para el
estudio de la estructura de genes ya que permi
te la localizacin de una secuencia de ADN en
particular.
El ADN a anahzar es digerido con enzimas
de restriccin generando una serie de fragmen
tos que son separados electroforticamente en
geles de agarosa o poliacrilamida de acuerdo a
su tamao. Luego son desnaturalizados para
obtenerlos en forma de simple cadena y trans
feridos a un filtro o soporte slido mediante un
flujo de buffer que eluye el ADN del gel hacia
el filtro sobre el que es inmortalizado conser
vando el mismo orden de pesos moleculares; es
decir, que se obtiene una rplica del ADN del
gel en el filtro mantenindose las mismas posi
ciones relativas.
La hibridizaein con sondas de ADN o ARN
marcados, especficas para el gen en estudio

Metodologas bsicas en biologa molecular

permite la identificacin de bandas que indican

el nmero y el tamao de fragmentos que son
complementarios. Es posible as construir un
mapa del gen, conformado por las posiciones de
los sitios de restriccin, el cual se puede utilizar
para comparar con el mapa obtenido a partir de
otras muestras permitiendo, por ejemplo, la de
teccin de rearreglos dentro del gen en estudio.
La tcnica de Southern blot ha sido muy im
portante para la deteccin de grandes delecio
nes o rearreglos encontrados en varias enferme
dades humanas, para comprender las recombi
naciones genmicas que dan origen a los anti
cuerpos y los receptores de las clulas T y para
la deteccin de oncogenes modificados.
Al igual que en el caso del dot blot las
sondas utilizadas pueden ser de ARN purifica
do, un cADN clonado o un oligonucletido sin
ttico y los resultados son analizados luego de
una radioautografa del filtro hibridizado (fig.
40-2).
Northern blot es una tcnica utihzada para
analizar ARN. En este caso se purifica ARN
total o poli (A) ARN, se fracciona de acuerdo a
su tamao en geles de agarosa, se transfiere a
soportes slidos como se indic anteriormente
y se detectan las molculas de ARN mediante
sondas apropiadas. Este procedimiento tan sim
ple puede indicar en qu tejidos o tipos celula
res se expresa un gen en particular o ios facto
res que regulan su expresin.
En las tcnicas de anlisis de ADN, los teji
dos se destruyen imposibilitando cualquier co
rrelacin histolgica, es por ello que se idearon
otras tcnicas de hibridizacin in situ, don
de el ADN no se extrae, sino que se mantiene
la clula intacta y all se une la sonda. Es posi
ble determinar la ubicacin cromosmica de un
gen, por hibridizacin in situ de un extendido
cromosmico, con una sonda en estudio. Tam
bin sta tcnica sirve para detectar virus inte
grados en un genoma.
Existe otra tcnica de hibridizacin in situ,
touch blot, que consiste en hacer repetidos
toques con tejidos que se sospecha estn infec
tados con un determinado parsito sobre un so
porte slido, en el que se realiza directamente
la hibridizacin con una sonda correspondiente
al parsito en estudio (previa desnaturalizacin
de la muestra).
La diferencia ms importante es el nivel de
deteccin entre estas metodologas, por ejem
plo, slo una copia de virus sobre un total de
100 clulas es suficiente para ser detectada por
Southern blot mientras que son necesarias 20
copias por clula para la deteccin in situ.
Esta disparidad se debe a varias razones, por un
lado es ms difcil para la sonda encontrar el
blanco puesto que debe atravesar el laberinto
de las protenas nucleares y cidos nucleicos

855

comparado con el ADN desnudo pegado al fil

tro en dot o Southern blot. Por otra parte
los mtodos de extraccin y purificacin de
ADN confieren un efecto de concentracin de
secuencias no comunes de ADN.
Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
En los ltimos 10 aos la metodologa de
Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)
se convirti en una herramienta bsica y esen
cial tanto en los laboratorios de investigacin
como en la clnica. La tcnica de PCR fue de
sarrollada por Kary M ullis a mediados de
1980, revolucionando la gentica molecular en
virtud de su velocidad, sensibilidad, especifici
dad y simplicidad, constituyendo una nueva
aproximacin para el estudio de genes,
En el hombre el mayor problema en el anli
sis de genes est en la complejidad del genoma
humano que comprende alrededor de 100.000
genes. La gentica molecular provee muchas
tcnicas para soslayar este problema, pero mu
chas de ellas demandan demasiado tiempo e in
cluyen clonado y otros mtodos para detectar
una secuencia de ADN especfica. La PCR
cambi esto ya que permite producir gran can
tidad de copias de ADN de una secuencia de
terminada sin necesidad de clonar.
La ventaja principal es la capacidad de la
reaccin para amplificar muy pequeas canti
dades de material hasta un milln de veces,
produciendo suficiente producto para analizar.
El ADN o ARN que se quiere amplificar no ne
cesita estar extremadamente purificado, debido
a la especificidad de la reaccin, que restringe
la actividad de la polimerasa a una determinada
secuencia blanco. Su desarrollo rpido y de re
lativamente bajo costo permite su aplicacin a
gran nmero de muestras.
La PCR explota situaciones de la replicacin
del ADN. La ADN polimerasa usa ADN sim
ple cadena como templado o molde para la
sntesis de una nueva cadena complementaria,
requiriendo adems una pequea seccin de
ADN doble cadena para iniciar la sntesis
[Primer (Pr) o cebador].
El principio en que se basa la PCR es la am
plificacin enzimtica de fragmentos de ADN
flanqueados por dos Prs oligonucleotdicos que
hibridizan con hebras opuestas de la secuencia
target. Ciclos repetidos de desnaturalizacin
trmica del templado, acoplamiento de los Prs
a su secuencia complementaria y extensin de
los mismos con una ADN pohmerasa, resultan
en la amplificacin de un segmento de ADN
con un tamao definido por la distancia entre
los extremos 5 de los Prs de PCR (fig. 40-3).
Para realizar una PCR se necesitan por lo
menos os siguientes reactivos: A) muestras de

856

Metodologas
Slot b lo f

El ADN extrado se aplica sobre

un filtro mediante un sistema de vaco

jo

0 0 0
Placa cribada conectada al vaco

Hibridizacin y posterior
deteccin del ADN

Fig. 40-2. A nlisis por h i

b r id iz a c i n en filtr o s . El
A D N ex trado de clu las o
tejidos se ap lica a un filtro
(slot o dot blot) o se tran s
f ie r e d e s d e u n g e l a u n a
m em brana luego de separar
se e l e c tr o f o r tic a m e n t e
(S o u th e rn b lo t). L a in f o r
m a ci n ac e rc a d el ta m a o
del A D N target es evidente
en Southern blot pero no as
en slot blot.

Muestras positivas

Southern hibridization

El ADN extrado se separa

mediante electroforesis

Las muestras de ADN se

transfieren a un filtro

Hibridizacin y posterior
deteccin de AON

20kb
- 8kb
3kb

ADN doble cadena, B) buffer con iones Mg, C) biopsias de carcinomas cervicales embebidas
la ADN polimerasa, D) los cuatro nucletidos en parafina por ms de 40 aos e inclusive se
o dNTP (dATP, dTTP, dCTP y dGTP) y E) Prs ha logrado analizar por PCR material obtenido
especficos para el target que se quiere am de momias egipcias.
plificar.
A partir de una gota de sangre sembrada en
A)
La muestra para PCR puede ser ADN tarjetas de papel se puedo realizar la deteccin
simple o doble cadena, ARN. En el caso de neonatal de fenilcetonuria en muestras conser
partir de ARN ya sea total o poliadelinado, se vadas durante muchos aos. Es posible extraer
prepara ADNc previa a la PCR. Normalmente hasta 1 mg de ADN, cantidad ms que sufi
se utilizan concentraciones menores a nanogra- ciente para poder hacer anlisis por PCR de ge
mos en el caso de templados clonados o meno nes responsables de enfermedades hereditarias.
res a un microgramo para ADN genmico. La
B) La composicin ms comn del buffer
PCR est diseada para amplificar simplemen que se utiliza en la reaccin es la siguiente, en
te una molcula de templado. En estos casos una concentracin lOx, siendo necesario diluir
se deben tener extremos cuidados para evitar lo 1/10 en el momento del uso:
las contaminaciones biolgicas a travs de he
rramientas de trabajo o del operador, debido a
100 mM de Tris - HCl pH 8,3
que muy pequeas cantidades de material con
500 mM de KCl
taminante pueden traer serias consecuencias.
15 mM de MgCl^
Por ello es esencial que se realicen controles
0,1 % ( P/V ) de gelatina
negativos de cada reaccin de PCR ya que pue
den revelar la presencia de ADN contaminante
La concentracin final de MgCl2 puede ser
variada en la mezcla de reaccin, generalmente
en los reactivos.
Debido a que el ADN es un material muy en el orden de 0.5 a 5 mM. Los iones Mg^+ for
noble es posible amplificar muestras conserva man un complejo soluble con los dNTP, que es
das durante largos perodos. Por ejemplo, se ha esencial para la incorporacin de los nucleti
detectado ADN del virus papiloma humano en dos; adems estimulan la actividad de la poh-

Metodologas bsicas en biologa molecular

Fig. 40-3. R eaccin en cad en a
d e la p olim erasa. La figura ilus
tra los diferentes m ecanism os de
la re a c c i n . D e s n a tu ra liz a c i n
de ADN target de doble cadena,
h ib rid iz a c i n de los p rim e rs y
sntesis de ADN.

A-T-G-C-C-T-A-G-G-T-A-A-T-C-G-C-A-G-T-T
T-A-C-G-G-A-T-C-C-A-T-T-A-G-C-G-T-C-A-A

857

ADN bicatenario
5

3
A-T-G-C-GPrimer A

G-G-T-G-A-A

Primer B

Desnaturaiizain, hibridizacin y sntesis de ADN

3
A-T-G-C-C-T-A-G-G-T-A-A-T-C-G-C-A-G-T-T
^ ________ T-C-C-A-T-T-A-G-C-G-T-C-A-A-

Direccin de la sntesis

Direccin de ia sntesis
5

A-T-G-C-C-T-A-G-G-T-A-A-T-C-G ------------
T-A-C-G-G-A-T-C-C-A-T-T-A-G-C-G-T-C-A-T
3

merasa e incrementan el Tm de la interaccin molculas de ADN, y tolera los calentamientos

templado/Pr. La concentracin de MgC12, pue repetidos a 95C realizados durante el proceso
de tener una consecuencia dramtica en la efec de amplificacin. Actualmente existen varias
enzimas termoestables obtenidas por ingeniera
tividad y el rendimiento de la PCR.
C)
La enzima ADN polimerasa cataliza la gentica de mayor pureza y reproducibilidad.
D) Es necesario utilizar deoxirribonucletipolimerizacin de nucletidos en direccin 5a
3 a partir de los Prs que utiliza como cebado dos dNTP de alta pureza, los cuales son provis
res. Para que ocurra la polimerizacin es nece tos comercialmente en soluciones stock indivi
sario que exista un rea de transicin entre la duales o en mezclas de los cuatro nucletidos.
doble cadena y la simple hebra, de manera que La concentracin que se utiliza usualmente es
la enzima ocupe ese lugar y use la simple hebra de 100 m)a, debiendo ser ajustada em prica
parental como molde (fig. 40-4). Por lo tanto, mente para cada reaccin de PCR.
Existen nucletidos modificados que pueden
como se trabaja con ADN bicatenario, el prxi
mo paso es desnaturalizar la muestra. Esto se ser incorporados con distintos fines, por ejem
plo, la incorporacin de nucletidos marcados
logra aumentando la temperatura a 94-95C.
Cmo soporta la enzima una temperatura radiactivamente permite la localizacin de los
tan extrema? De hecho, el avance ms signifi productos de PCR por radioautografa. As es
cativo en la optimizacin de la tcnica de PCR posible realizar, por ejemplo, secuenciacin di
ha sido el aislamiento de enzimas termorresis- recta, anlisis de polimorfismos de conforma
tentes capaces de ser biolgicamente activas a cin en simple cadena, ensayos de proteccin o
temperaturas de desnaturalizacin del ADN. La footprinting. Tambin se pueden adicionar
fuente de donde se obtiene cominmente es una grupos fluorescentes o biotina, que permiten la
bacteria, Thermus aquaticus (de all el nombre deteccin no isotpica del producto de amplifi
de Taq, ADN, polimerasa) que habita en aguas cacin.
E) Los Prs son secuencias cortas, de entre 20
calientes y fue aislada por primera vez en el
Parque Nacional de Yellowstone (EE.UU). Esto y 30 nucletidos simple cadena, que son com
no significa que la enzima sea indestructible, si plementarios a los extremos de una determina
no que soporta hasta cinco minutos a 95C , que da secuencia templado (quedando sus extremos
es el tiempo necesario para desnaturalizar las 3 sealndose entre s).

858

Metodologas
ADN target de doble cadena

A)

5-

_3

E)
Hebras de tamao
va ria b le ^

Separacin de las hebras

y unin de los primers
B)

5L

Separacin de las hebras

y unin de los primers

.3

' Primer 1

Primer 2 m
3

F)

3.

" 5
C)

Extensin de los primers

G)
Separacin de las hebras
y unin de los primers
D)

_ 5

Nuevos primers
_

Fragmentos deseados

_ 3 ,

Extensin de los primers

Multiplicacin del
proceso
Fig. 40-4. D iferentes p asos de la P C R . Paso A ) S eparacin de las hebras de A D N bicatenario. Paso B) U nin d e los p ri
m ers. Paso C) Sntesis de las nuevas cadenas. Paso D ) S eparacin de las hebras y unin de los prim ers. Paso E) Extensin
d e los prim ers y sntesis de hebras de tam ao variable. Paso F) Separacin de las hebras y uitin d e los nuevos prim ers,
Paso G ) Extensin de los prim ers y sntesis de hebras del tam ao deseado.

Los juegos de Prs se disean a partir del an

lisis de la secuencia que se quiere amplificar,
para ello existe abundante literatura que detalla
la secuencia parcial, y a veces total, de oncogenes, virus, etc. El par de oligonucletidos nece
sario para amplificar un determinado fragmento
de ADN debe contener, en lo posible, el mismo
ntmero de bases, evitando aquellas secuencias
que poseen estructura secundaria. Adems no
deben ser complementarios entre s en sus extre
mos 3, ni intramolecularmente. Esta precaucin
puede reducir la incidencia de formacin de dmeros de Prs, que es un artefacto de la tcnica.
La distancia entre los Prs cuando hibridizan
con el ADN generalmente es menor que 10 kilobases o k b . (lkb=1.000 pares de bases), si bien
se observa una disminucin en la eficiencia de
sntesis para regiones que exceden las 3 kb.
Para algunas aplicaciones los Prs pueden no
ser exactamente complementarios al templado.
Por ejemplo en el caso de mutagnesis dirigida
por PCR una(s) base(s) mutada est usualmen
te localizada en el centro del oligonucletido.
Un parmetro importante a tener en cuenta
en la seleccin de los Prs es la Tm. sta puede
ser calculada para un Pr en particular usando
una serie de ecuaciones como la presentada an

teriormente y para cada reaccin es preferible

disear juegos de Prs en los que ambos tengan
una Tm similar.
Existen programas computados, para ayudar
en el diseo de Prs (OLIGO TM, Pr detective),
que calculan la estabilidad del diiplex de ADN
y analizan las zonas de complementariedad
dentro de la secuencia y posibles estructuras
secundarias que se deben evitar.
Las temperaturas de apareamiento de Prs
con el templado estn relacionadas con la
Tm pero sta slo es una referencia para co
menzar la experimentacin. Es necesario deter
minar empricamente cul es la temperatura
ptima de la reaccin de apareamiento, eligien
do aquella en la que se obtiene una amplifica
cin ms especfica.
Durante el desarrollo de la tcnica de PCR
un punto importante fue la posibilidad de auto
matizar los ciclos de temperatura a travs de cicladores termales, que constan de bloques tr
micos programables, de manera de permitir un
control adecuado y reproducible de la tempera
tura en todas las reacciones. Los parmetros
del ciclado en cuanto a temperatura y tiempo
son crticos para alcanzar el xito en la amplifi
cacin de productos de PCR.

Metodologas bsicas en biologa molecular

Cmo se llega a obtener un producto de

amplificacin o amplcii? Para ello se prepa
ra la mezcla de reaccin con el ADN en estu
dio, los Prs oligonucleotdicos especficos, el
buffer de reaccin con su correspondiente con
centracin de MgC12 la enzima ADN polime
rasa y los cuatro dNTP precursores.
El primer paso es la desnaturalizacin del
ADN por medio del calentamiento de la mezcla
de reaccin a 94C por 5 minutos. De esta ma
nera se obtienen cadenas simples que sern el
templado para los Prs. Luego se disminuye la
temperatura para permitir el apareamiento de
los Prs a sus secuencias complementarias, ge
nerando los templados adecuados para la ADN
polimerasa. La temperatura se lleva ahora a
72C, ptima para que la Taq polimerasa co
mience la sntesis incorporando nucletidos y
extendiendo los Prs en direccin 5a 3. En el
siguiente ciclo la temperatura se lleva a 94C
slo por 30 segundos para que se separen la
nueva cadena sintetizada y el molde original
(fig. 40-4b). Estas hebras simple cadena consti
tuyen templados para una nueva ronda de snte
sis de ADN a travs de ciclos que comprenden
el calentamiento para separar cadenas aparea
miento de Prs y sntesis de nuevas hebras.
El Pr producto de extensin resulta de la sn
tesis sobre el templado original, por lo tanto no
tiene una longitud diferencial debido a que la
ADN poUmerasa continuar sintetizando ADN
hasta que sea interrumpida por el comienzo de
un nuevo ciclo. El producto del segundo ciclo
de extensin tambin tiene un tamao indeter
minado; en el tercer ciclo se sintetizan fragmen
tos de la secuencia target que tienen ya una lon
gitud definida correspondiente a la distancia que
separa ambos Prs en el templado original. Lue
go, a partir del cuarto ciclo la secuencia es am
plificada exponencialmente (fig. 40-4).
Por lo tanto, al final de n ciclos, la reac
cin contiene tericamente un mximo de 2"

859

C uadro 40-1. Amplificacin por PCR de fragm c n io s d e A D N

tic ciclos
doble c(i<lcna

V/7i(rV).5

de ini<lail(is uii vei

1
2

0
0

4
.s

'

16
32
64
12H

9
10
1i
12
.

14
1?
16
17

4096

IS

65536
131072
262144
524288
1048576
2097152
4I94.504
8388608

19
20
21
22

2?
24
25
26
27
2S

29
?()

16777216
33544432
67108864
.^4217728

268435456

.31

536870912

32

1073741824

molculas doble cadena que son copias de la

secuencia de ADN entre los dos Prs. General
mente la reaccin se realiza por 30 a 40 ciclos.
Es as que luego de 32 ciclos, por ejemplo, te
ricamente se podran producir 1.073.741.824
copias de una sola molcula original. El nimero de molculas target amplificadas en rela
cin a los ciclos aplicados se presenta en el

Desnaturalizacin de la muestrapara separar cadenas

94-95 C, 5

Apareamiento de Prs
a la simple cadena
37 a 65 C, 30"

Desnaturalizacin para
separar cadenas
a 95 C, 30"

F ig .4 0 -4 b

Sntesis de nuevas cadenas

por Tap Polimerasa
72 C, 1 a 5

860

Metodologas

cuadro 40-1. La reaccin no es 100% eficiente

por lo cpe la prctica de rutina es amplificar
entre 100 y 500 nanogramos para que pueda
ser visualizado en geles de agarosa o acrilamida teidos con bromuro de etdio, si bien teri
camente se podra amplificar hasta 0,01 pg.
Se ha desarrollado el diagnstico prenatal de
enfermedades hereditarias a travs del estudio
por PCR, de pequeas muestras de ADN obte
nidas por amniocentesis o puncin de vellosi
dades corinicas.
Qu ocurre si los Pr no slo encuentran a la
secuencia target o a veces equivocan la se
cuencia a unir? Lamentablemente, los Pr pue
den unirse a secuencias no-target, surgiendo
como consecuencia el problema de la especifi
cidad de la reaccin. Para contestar esto debe
ramos conocer con qu frecuencia se encuen
tra, en un ADN no-target, una secuencia de
aproximadamente 20 bp exactamente comple
mentaria a la del Pr. En realidad ste es un
evento muy poco frecuente. Pero si ello llegara
a ocurrir, existe otro mecanismo que protege a
la ampUficacin no especfica; la helara resul
tante debe poseer una regin complementaria y
altamente homologa a la secuencia del otro Pr
porque de lo contrario no se lograra una am
plificacin geomtrica de la secuencia target.
Debemos tener en cuenta tambin que el extre
mo 3del Pr podra aparearse en esa base y, por
lo tanto, originar un sitio de iniciacin para la
sntesis de ADN. Esto se conoce como mispriming. Otra cosa que puede ocurrir con los
Pr es que se unan entre ellos (Pr oligomer),
evento que resulta altamente improbable consi
derando la concentracin de Pr en la mezcla de
reaccin.
De acuerdo a lo planteado a nivel terico se
pueden obtener tres tipos de informacin a par
tir del anlisis de productos especficos de
PCR;
a) deteccin en el blanco de la secuencia espe
rada y sus posibles alteraciones.
b) cuantificacin del rendimiento de la reac
cin de PCR para determinar las cantidades
absolutas o relativas del blanco de ADN o
ARN original.
c) anlisis de la secuencia amplificada por hibridizacin con sondas o por secuenciacin
directa del producto.
Metodologa

I. Preparacin de la muestra
Se han descrito diversos protocolos para la
obtencin de cidos nucleicos. Los ms prcti
cos no apuntan a una purificacin extensiva de
las preparaciones sino que son extracciones lo

suficientemente limpias como para ser usadas

en PCR. Debido a la extrema sensibilidad de la
tcnica es imprescindible limitar el problema
de las contaminaciones.
La experiencia en el laboratorio ha enseado
que el utilizar un conjunto de pipetas exclusi
vas para la reaccin, manipular las enzimas en
reas separadas y nunca preparar soluciones
stock disminuye efectivamente el grado de
contaminacin. No es indispensable usar tips
con algodones o realizar las reaccin bajo cam
pana estril. Como regla general es convenien
te utilizar material autoclavado o estril (tubos,
tips, soluciones, etc.). El uso de guantes ayu
da a evitar las contaminaciones con nucleasas y
cidos nucleicos y productos de PCR del ope
rador. Todos los procedimientos deben reali
zarse evitando la contam inacin entre las
muestras o del equipamiento del laboratorio,
A. Preparacin de ADN genmico a partir
de hisopados clnicos;
Este protocolo se dise para aislar ADN de
muestras genitales pero puede emplearse con
cualquier tipo o cultivo celular que se obtenga
fcilmente por abrasin. El hisopo se sumerge
en un tubo de 15 mi con 2 mi de SST/antibiticos (NaCl 0,15 M; buffer fosfatos 0,01 M; pe
n icilina 0,06 mg/m l y estreptom icina 0 , 1
mg/ml). Las muestras pueden quedar a tempe
ratura ambiente o refrigerarse si no se procesan
en el da. Se centrifuga a 2000-3000 rpm du
rante 2 minutos y el precipitado se lava con
1 mi de TE (Tris ImM, EDTA 10 mM) si es
que presenta rastros de sangre. Se repiten los
lavados tantas veces como sea necesario hasta
obtener un precipitado limpio, el cual se resuspende en 4 mi de buffer de lisis (TE/Tween
0,5%/proteinasa K 100()j,g mi) incubndose a
55C durante 1 hora. Se inactiva la proteinasa
K por calentamiento a 95C, 10 minutos.
B. Preparacin de ADN genmico a partir
de tejido;
El procedimiento incluye un paso de chsociacin utilizando homogenizador manual o mec
nico (dependiendo de las caractersticas del te
jido) a fin de reducir el tejido a una suspensin
lo ms homognea posible. Si los tejidos se en
cuentran incluidos en parafina se deben desparafinar (la parafina inhibe la amplificacin).
Para ello se realizan 2 extracciones seriadas de
un minuto cada una en xileno (desparafinante)
y en etanol 95 % (elimina al xileno). La mues
tra se seca, se resuspende en agua, se hierve 5
minutos y luego se realiza el tratamiento con
200 p.g de proteinasa K.
C. Preparacin de ADN genmico a partir
de linfocitos de sangre perifrica;

Metodologas bsicas en biologa molecular

861

Fig. 40-5. A m pU ficacin de A D N gen m ic o p o r P C R . E le c tro fo re sis en

gel de agarosa de los productos d e am
p lific a c i n con P rs esp ecfico s para:
dos exones del gen CFTR (afectado en
enferm edad fibroqustica) y m a rc a d o
res de pesos m oleculares.

El fraccionamiento celular puede realizarse

mediante el empleo de gradientes de Ficoll-Hypaque o bien aislando el buffy-coat (capa de
linfocitos ubicada entre el paquete globular ro
jo y el plasma, iuego de una centrifugacin a
baja velocidad). Estas clulas se lavan en dos
volmenes de SST y se les aade el buffer de
lisis (100 (il por cada 5.000 clulas), se incuba
a 56C durante 45 minutos y se calienta a 95C
10 minutos para inactivar a la proteinasa K.
D. Utilizacin de sangre entera:
Mezclar 50 |il de sangre entera anteoagulada con EDTA con 0,5 ml de TE en un tubo de
1,5 ml, se centrifuga 10 segundos a 13.000 xg,
se resuspende el sedimento celular en 100 )0 .1 de
buffer de lisis de glbulos blancos y se incuba
como ya se describi. Usar 10 al por cada reac
cin de PCR. Un recuento de glbulos blancos
en sangre normal oscila en 5.000 clulas il,
por lo que 50 |il de sangre contienen 250.000 o
ms clulas nucleadas.
Es importante aclarar que en los procesos de
extraccin de ADN se pueden utilizar deter
gentes compatibles con la Taq polimerasa co
mo el Laureth 12 o el Tween 20 al 0,5%. El
NP40 debe usarse con cuidado puesto que inhi
be a la Taq polimerasa cuando se usa al 0,1%.
El SDS no puede usarse con ninguna polimera
sa a pesar que completa excelentemente la ac
cin de la proteinasa K.
La proteinasa K es de eleccin para la diges
tin de ncleos o clulas enteras a fin de liberar
ADN y ARN para que sean accesibles a la ac
cin de la polimerasa. Tiene la ventaja de ser
termoestable entre los 50C y 60"C y fcilmen
te inactivable a 95C.
2. Preparacin de la mezcla
de reaccin
Puesto que las muestras de ADN pueden
contener inhibidores de la reaccin (sangre,
quelantes del Mg, exceso de Mg) y dado que es
una tcnica extremadamente sensible es siem
pre recomendable diluir la muestra 1/10 o 1/20
en el volumen final de la reaccin. La concen
tracin adecuada de Mg es aproximadamente 1

mM y de Pr 0,5 )0 ,M si bien, como se coment

previamente, es necesario determinar- emprica
mente la mejor concentracin de cada uno para
la reaccin.
3. Diseo de los ciclos
Todos comienzan con un paso de desnaturali
zacin seguido, en la mayora de los casos, por
el apareamiento de los Pr, extensin (sntesis de
la nueva cadena) y, de nuevo, desnaturaliza
cin. Los protocolos convencionales indican
temperaturas entre 93 y 95C para la desnatura
lizacin, entre 37C y 65C por 1-2 minutos pa
ra el apareamiento y aproximadamente 72C
por 1-2 minutos para la extensin. Existen pro
tocolos ms sencillos que otros y slo la propia
experiencia del operador servir para introducir
modificaciones al protocolo original ajustndo
lo a las necesidades particulares del laboratorio.
Para asegurar que la mezcla de reaccin al
cance la temperatura deseada en el menor tiem
po posible es indispensable utilizar tubos de
paredes ultra finas de 0,5 ml y cubrir la mezcla
final con aceite mineral, a fin de evitar su eva
poracin.
Se encuentran disponibles en el comercio
kits que incluyen enzimas, nucletidos y buf
fer listos para utilizar en las diluciones reco
mendadas. Una vez lista la mezcla de reaccin
se calienta el bloque del termociclador a 94C y
se colocan las muestras. Se da curso a los ci
clos (25-40) y una vez finahzados se conserva
ban las muestras a 4C.
4. Deteccin de los productos
amplificados
El mtodo ms simple para visualizar un
producto de amplificacin consiste en realizar
electroforesis de una alcuota de la PCR en ge
les de agarosa o poliacrilamida. Mediante la
tincin con bromuro de etidio, un colorante
fluorescente que se intercala entre las bases del
ADN, es posible observar el producto de am
plificacin por medio de transiluminacin ul
travioleta. El gel puede ser fotografiado para
obtener un documento permanente del experi

862

Metodologas

ment. Para determinar el tamao exacto del

amplicn se utilizan marcadores de pesos mo
leculares en el gel (fig. 40-5).
Una alternativa para visualizar las bandas de
ADN es la tincin de los geles con plata lo cual
permite la visualizacin directa del mismo sin
transiluminacin UV.
Para productos de peso molecular pequeo o
para la deteccin de pequeas diferencias de ta
maos, se pueden usai" geles de poliacrilamida
no desnaturalizantes o geles desnaturalizantes
de secuencia. Sin embargo el tamao no puede
considerarse como nico criterio de amplifica
cin especfica. Puede ocurrir tambin que la
eficiencia de la reaccin no fuera ptima y que
el producto final estuviera en concentraciones
al lmite de la deteccin con el bromuro de etidio (aproximadamente 50 ng de ADN). Es por
esto que a veces se emplean las tcnicas de hibridizacin descritas anteriormente, cuya sensi
bilidad es del orden de 0,1 pg de DNA, para la
confirmacin de la identidad de un producto de
PCR utilizando sondas especficas radiactivas o
no. Estos mtodos aumentan la sensibilidad de

Secuencia target

la deteccin comparados con la tincin con

bromuro de etidio y adems confirman la am
plificacin del producto esperado. Es posible
utilizar sondas oligonucleotdicas para la detec
cin de los productos de PCR las que general
mente se marcan con ^^P por incubacin con
g32p _
y ^ 4 polinucletido quinasa. Tam
bin pueden realizarse marcaciones no isotpi
cas utilizando colorantes fluorescentes, digoxigenina, peroxidasa de rbano picante [horseradish peroxidase) o fosfatasa alcalina.
Alternativamente, los productos de PCR
pueden marcarse durante la reaccin de ampli
ficacin por la adicin de nucletidos o Prs ra
diactivos (^T), o bien marcados con biotina o
fosfatasa alcalina siguindose los correspon
dientes protocolos de deteccin.
Es posible tambin detectar los productos de
amplificacin, a travs de hibridizaciones alelo
especficas, utilizando Prs diseados especial
mente para analizar m utaciones puntuales
(ASO),
La sensibilidad y especificidad de la amplifi
cacin, tanto de ADN como de ARN (ADNc),

Secuencia no-target

Productos de PCR
con el primer juegb de primers

Agregado del segundo juego de

primers complementarios a
secuencias internas especficas

Los primers internos no se unen

a la secuencia no-target por lo
tanto no la amplifican

La secuencia target es amplificada

usando primers internos

F ig. 40-6. Prs n ested aum entan la especificidad de la PC R . A partir de la secuencia blanco a estudiai-, se disean dos
ju eg o s de Prs, uno de los cuales son internos a la regin am plificada por el prim er par . Los productos d e la prim er PCR
(Pr rosados) incluyen secuencias blanco y otras no deseadas. U na alcuota de la p rim er reaccin es am plificada con un se
gundo ju e g o de Prs internos (Pr grises). Solo se am plifican los fragm entos que son com plem entarios al segundo juego de
Prs.

Metodologas bsicas en biologa molecular

puede ser sumamente aumentada mediante el

mtodo de nested PCR (PCR interna o anidada).
El fragmento de ADN producido por PCR puede
ser reamplifieado con nuevos Prs, internos a la
secuencia amplificada, llamados Prs nested o
internos. Esta tcnica elimina los productos de
amplificacin inespecfica, debido a que stos no
sern complementarios de los nuevos Prs y, por
lo tanto, no servirn como templado para una se
gunda amplificacin (fig. 40-6).
5. Optimizacin de la PCR
Desde que el mtodo fue inventado se han
desarrollado en la optimizacin de la tcnica
sustanciales mejoras, como el empleo de enzi
mas termoestables y la automatizacin. Induda
blemente ningn protocolo nico puede ser
aplicado a todas las situaciones.
Los problemas con los que el operador se
encuentra habitualmente son: productos no detectables, bajo rendimiento del producto desea
do, la presencia de background no especfico
debido a mis-priming o mis-extension de
los Pr, la dimerizacin de los Pr y las mutacio
nes o heterogeneidad debida a errores en la in
corporacin de las bases.
Para una eficiente optimizacin de la tcnica
el parmetro a considerar sobre los protocolos
estndar es la concentracin de los reactivos a
utilizar. Lo sugerido es:

863

]. ADN target: debe oscilar entre 100.000 y

1.000.000 de molculas. Un (|_Lg de ADN
genmico de simple cadena, 10 ng de leva
duras o 1 (.ig de E. coli equivalen a 300.000
molculas target.
2. Pr: 20 pmoles de cada uno es lo recomenda
ble.
3. Buffer de reaccin: generalmente se utiliza
uno 20 mM de Tris/CIH pH 8,3; 1,5 mM
MgCl; 25 mM Kcl dependiendo defa marca
comercial de la enzima.
4. dNTP: 50 |aM de cada uno; habitualmente
se preparan a una concentracin final 10
mM y se conservan a -20C. La estabilidad
de los dNTP es aproximadamente del 50%
luego de 50 ciclos. Los 4 dNTP deben usar
se a concentraciones equivalentes para mi
nimizar errores de incorporacin.
5. Taq polimerasa: oscila entre 1-2 unidades
por cada 100|.il. Si la concentracin es muy
alta aparece background de los productos
no especficos y si es muy baja se produce
una cantidad insuficiente del producto de
seado.
Habitualmente se desnaturaliza la muestra 5
minutos a 94C y se realizan entre 25 y 40 ci
clos con el siguiente perfil de temperatura: de
naturalizacin 94/30 segundos, apareamiento
de los Pr 55C! 30 segundos, extensin 72C/un
minuto. Los ciclos se terminan con una exten-

Sntesis target especfica

- Regin target
Taq
polimerasa

T
3

G
5

-Pr1

Sntesis de target especfica (mispriming)

-Regin target
Taq
polimerasa

J A

T T

-P rt

Ollgomerizacln de Pr

F ig . 4 0 -7 . P o s ib il id a d e s de
a p a rea m ien to de los p rim ers.
U nin ta rg e t especfica, ta r
g e t no especfica y o ligom erizacin.

Taq
polimerasa

P r2
T
A

P r2

c T T

A
T

G
"s

____

Taq
polimerasa

-------
-P r 1

864

Metodologas
HSN

i * *

5728
5589

i:,

T val

!cy s
Ggly

C ata
G
A

Agio
A
C thr
A
A
Cpro

Fig. 40-8. Secu en ciacin p or P C R de un fragm ento del

gen de tiroglobulina, que presenta 138 pares de bases delecionadas (indicadas entre las flechas).

sin final a 72C por 5 minutos. La reaccin se

detiene enfriando a 4C y/o por agregado de
EDTA 10 mM.
Existe un procedimiento diseado para inhi
bir considerablemente la sntesis de ADN no
especfico, el que se conoce como hot-start
PCR. Ya se ha mencionado que la sntesis de
ADN est predeterminada por los Pr y se co
ment tambin que stos no siempre se unen al
ADN target sino que pueden hacerlo entre
ellos o bien hibridizar con secuencias no 100%
homologas. Es importante reforzar la idea que
la Taq polimerasa es extremadamente eficiente
y slo necesita que los Pr se unan a hebras no
apareadas para que comience la sntesis de
ADN. La fase limitante de la reaccin no es la
actividad enzimtica sino la tem^peratura y
tiempo de apareamiento de los Pr. stos tienen
tres posibilidades de unin; 1) hibridizar el
ADN target con el 100% de homologa; 2)
hibridizar con zonas no-target sin homologa
completa; 3) hibridizar entre ellos (vase fig.
40-7).

Al comenzar la PCR la temperatura se incre

menta hasta 94C a una velocidad de un grado
por segundo, todo el ADN se encuentra como
simple hebra y es imposible que hibridice. Ma
nejando el concepto de Tm se podran disear
diversas cinticas de hibridizacin de acuerdo a
las tres posibilidades descritas anteriormente.
En un modelo ideal, entre la temperatura am
biente y los 55C, el Tm debera ser mximo
para la unin de los Pr al ADN target y mni
mo para la unin de los Pr a secuencias no target o entre s.
El concepto de hot start PCR es simple; no
permitir a los Pr la oportunidad de unirse a una
hebra de ADN hasta que se haya alcanzado la
temperatura crtica que sea desfavorable para
las rutas no especficas. Una modificacin al
protocolo habitual es aadir la Taq polimerasa
una vez que la mezcla de reaccin haya llegado
a los 80C. De este modo se aumenta la especi
ficidad y la sensibilidad de la PCR.
El protocolo manual para realizar una hotstart PCR es incorporar los Pr y/o la Taq y/o
el Mg una vez que la mezcla llega a 80C.
Aunque este procedimiento no es difcil, resul
ta engorroso si se trabaja con un gran nmero
de muestras. Existen modificaciones qumicas
en la hot- start PCR que aumentan la especi
ficidad como, por ejemplo, separar la muestra
de reaccin que contiene los Pr de la Taq por
medio de una capa de cera. La cera funde a los
80C permitiendo que la enzima se mezcle con
los otros reactivos y la cera funcione luego co
mo barrera para evitar la evaporacin. Otra
forma es incorporar a la mezcla protenas que
se unan al ADN y, como resultado de la unin,
se desestabiliza la doble hebra proporcionando
un sustrato para la amplificacin. Se han des
crito y caracterizado 2 protenas, la derivada
del gen 32 del bacterifago T4 y la SSB deri
vada de E. coi. Estas protenas se unen al
ADN a temperatura ambiente disminuyendo
obviamente el Tm del fragmento de ADN es
pecfico. Por lo tanto la unin Pr-ADN no es
pecfico que posea la menor cantidad de puen
tes H ser ms suceptible de ser destruida que
la unin Pr-ADN especfica que posee gran
cantidad de puentes H.
Aplicaciones de la tcnica

La gran versatilidad de la reaccin de PCR

constituye una herramienta muy poderosa para
el anlisis de genes. Existen mltiples aplica
ciones, entre ellas;
Secuenciacin directa de fragmentos de
ADN. Es posible determinar por PCR la se
cuencia nucleotdica de un blanco sin necesi
dad de recurrir al clonado (fig. 40-8).

Metodologas bsicas en biologa molecular

18q21

t(14;18)

(a)

14q32

(c)

(b)

Fig. 40-9. D eteccin de clu las cancergenas por PC R . En linfom as foliculares existe un rearreglo entre los c ro m o so
mas 14 y 18. P arte del locus para cadenas pesadas de inm unoglobulinas JH en el crom osom a 14q32 es traslocado al lo cu s
para el oncogen BCL2 del crom osom a 18q21. Se disearon Prs que se aparean a los sitios 5 y 3 de ruptura de los c ro m o
som as 18 y 14 respectivam ente, b) la traslocacin t (1 4 ;I8 ) (q32;21) perm ite que los Prs se apareen ju ntos en la m ism a
m olcula de A D N doble cadena. Cuando se am plifica A D N de pacientes que llevan la traslocacin, se genera un frag m en
to de PCR de aproxim adam ente 300 pb que com prende la zona de unin de am bos crom osom as, este fragm ento de P C R es
perfectam ente difereneiable de los fragm entos de tam ao variable obtenidos por am plificacin de cada uno de los c ro m o
som as analizados (a y c).

Anlisis de genes. A travs de ste mtodo

es posible estudiar la estructura gnica; la
identificacin molecular precisa de un deter
minado gen, de sus defectos, rearreglos o deleciones. En inmunologa e inmunoparasitologa resulta muy ttil para el estudio de los
genes de las inmunoglobulinas, sustancias
del complemento, antgenos de histocompati
bilidad, etctera.
Anlisis de mutaciones. Permite analizar la
presencia de mutaciones moleculares conoci
das responsables de enfermedades heredita
rias o de tumores. Conocer la naturaleza de
las inutaciones en un paciente es importante
para el diagnstico y la terapia de la enfer
medad. Algunos cnceres se originan como
resultado de traslocaciones que envuelven
genes conocidos. En linfomas foliculares
existe una traslocacin entre los cromosomas
14 y 18. Utilizando stas mutaciones como
marcadores se pueden detectar clulas cance
rgenas por Southern blot convencional si es
tn presentes en una de cada 100 clulas nor
males. Por lo tanto, un paciente puede ser
juzgado como libre del cncer por este mto
do pero puede seguir conservando un ntmero
significativo de clulas enfermas. En contras
te, la PCR es capaz de detectar hasta 1 clula
cancergena entre 10'> normales proveyendo

un indicador muy sensible para el mdico onclogo (fig. 40-9).

Fig. 40-10. a. P edigr de una fam ilia en la que se an aliz el

gen de la p globina por m edio de la am plificacin de A D N
genm ico con Prs especficos para el intrn 1 del gen d e P
globina (zona de m utaciones m s frecuentes), b. R adioautografa correspo n d ien te a la h ib ridizaein de los p ro d u cto s
de P C R con A SO mutado. c. R adio au to g rafa co rre s p o n
diente a la hibridizaein de los productos de PCR con A S O
normal.

866

Metodologas
XJ1.1 p87

I
i

500

J.Bir

1000

1500

2000

F ig . 40-11. P C R m u ltip lex. En u n a m ism a reaccin .se

am plifica con 9 juegos de Prs sim ultneam ente y lo.s pro
ductos de PCR son separados en geles de agarosa y tei
dos con brom uro de etidio. El p aciente 1 no tiene deleciones para ninguna de las regiones analizadas, m ientras que
el paciente 4 presenta una gran delecin de 1000 pb. Los
otros pacientes presentan deleciones de tam ao variable.
M: m arcador de peso m olecular. N : control negativo.

Es posible, por ejemplo, estudiar la presen

cia de mutaciones puntuales en un gen respon
sable de una determinada enfermedad gentica.
Para ello se amplifica por PCR un fragmento
del gen que se quiere analizar, se realiza un dot
blot y luego se hibridiza con dos sondas marca
das: por un lado con un oligonucletido com
plementario a la secuencia normal y por el otro
con un oligonucletido que detecta la mutacin
conocida. De esta manera se realiza una hibridizacin con sondas alelo especficas o ASO
que permiten la deteccin de mutaciones pun
tuales (fig. 40-10).
Recientemente se ha desarrollado la tcnica
reversa que permite analizar varias secuencias
en un solo ensayo. En este caso los distintos
ohgonucletidos son unidos a una membrana y
el material del paciente amplificado por PCR
con dNTP marcado es usado como sonda que

se une a sus secuencias complementarias. Exis

te un kit comercial para determinar alelos del
A ntgeno M ayor de H isto co m p atib ilid ad
(HLA).
Debido a que se puede realizar una co-amplificacin de varias secuencias en una misma
reaccin de PCR se desarroll el mtodo de
multiplex. Este mtodo permite el anlisis ge
ntico de varios fragmentos de ADN de un gen
al mismo tiempo, a travs de la combinacin de
distintos juegos de Prs. As es posible estudiar
un determinado gen mediante la amplificacin
de varios exones en una sola reaccin; de ma
nera de poder determinar, por ejemplo, grandes
deleciones.
Es el caso del estudio de la Distrofia Muscu
lar de Duchnne mediante una PCR multiplex.
Se disearon Prs para amplificar 9 regiones del
gen de la Distrofina que son las ms frecuente
mente delecionadas en sta enfermedad (fig.
40-11).
Deteccin de una amplia gama de organis
mos. La PCR es utilizada para monitorear in
fecciones bacterianas o virales. Convencio
nalmente los mtodos de diagnstico estn
basados en el crecimiento en cultivo de los
organismos o en la deteccin de su presencia
con anticuerpos. Las dificultades que presen
tan se deben a que se requieren varias sema
nas para el diagnstico en el primer caso y
que existe la posibihdad de reacciones cruza
das en el segundo. La PCR permite detectar
con alta especificidad y sensibilidad pocas
clulas infectadas dentro de una gran pobla
cin de clulas no infectadas.
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METODOS
INMUNOQUMICOS

Mtodos cromatogrficos de fase

lquido-slido (LSC) aplicados
a la purificacin de protenas

JULIANA LEONI
IRINA MATHOV
LEOPOLDO F. ABDON

1. CROMATOGRAFIA.
PRINCIPIOS GENERALES

La caracterstica que distingue a los mtodos

cromatogrficos de otros mtodos ^sicos y qu
micos de separacin, es la presencia de dos fa
ses mutuamente no miscibles (una mvil y otra
estacionaria) que se hallan en contacto. Una
muestra introducida en la fase mvil es trans
portada a lo largo de la columna, que contiene
una fase estacionaria homogneamente distri
buida. Los diferentes componentes de la mues
tra experimentan repetidas interacciones entre
la fase mvil y la estacionaria. Al final del pro
ceso, los componentes separados eluirn en or
den creciente de interaccin con la fase estacio
naria. El componente que menos interacta (el
menos retenido) eluir primero, el retenido ms
fuertemente eluir ltimo. El reparto entre las
fases aprovecha las diferencias entre las propie
dades fisicoqumicas de cada uno de los com
ponentes de una muestra dada. Una separacin
ptima entre dos componentes de una muestra
se obtiene cuando el pico que eluye en segundo
trmino es lo suficientemente retenido como
para impedir su superposicin con el pico que
eluy en primer trmino.
La columna de separacin es el centro del
cromatgrafo ya que proporciona una gran ver
satilidad para los distintos tipos de anlisis. Es
ta caracterstica, debida a las posibilidades de
seleccin de materiales para las fases mvil y
estacionaria, permite separar molculas que di
fieren muy poco en sus propiedades fisicoqu
micas. En un sentido amplio, la distribucin de
un soluto entre las fases mvil y estacionaria es
el resultado del balance de fuerzas entre las
molculas del soluto y las molculas de cada
fase.

41
La resolucin cromatogrfica de macromolculas biolgicas, en todos los casos excepto en
la cromatografa por exclusin molecular, es un
proceso mediado por la adsorcin diferencial
de solutos a la superficie del material de empa
quetamiento de la columna. La optimizacin de
una separacin cromatogrfica depende funda
mentalmente de dicha adsorcin.
Las macromolculas biolgicas difieren en
sus caractersticas fisicoqumicas: tamao, for
ma, carga, hidrofobicidad y arreglo de sus gru
pos funcionales dentro de su estructura tridi
mensional. Es lgico, por lo tanto, que los m
todos cromatogrficos ms comunes para el
fraccionamiento de estas molculas sean: cro
matografa por exclusin molecular (discrimi
nacin por tamao y forma), cromatografa por
intercambio inico (discriminacin por carga),
cromatografa por interaccin hidrolobica (su
perficie hidrofbica), cromatografa en fase re
versa (hidrofobicidad total), cromatografa de
afinidad por inmovilizacin de metales (histidinas accesibles en la superficie), y cromatogra
fa de afinidad (distribucin de aminocidos es
pecficos en la superficie de las protenas).
1.1. Clasificacin
de los Mtodos Cromatogrficos
Los mtodos cromatogrficos se clasifican
de acuerdo a las caractersticas fsicas de las fa
ses mvil y estacionaria.
La fase mvil puede ser un gas o un lquido,
mientras cjue la fase estacionaria puede ser un
lquido o un slido. Cuando la separacin invo
lucra un reparto simple entre dos fases lquidas
no miscibles, una mvil y la otra estacionaria,
el procedo se llama cromatografa lquido-lqui
do (LLC). Cuando la fase estacionaria es un s-

870

Mtodos inmunoqumicos

Cuadro 41-1. Clasificacin de los mtodos cromatogrficos

C rom atografa de lquidos

Crom atografa de gases

G as-Lquido
(GLC)

G as-Slido
(G SC)

liclo y participan fuerzas fsicas de retencin la

crom atografa se denom ina lquido-slido
(LSC). Debido a la orientacin de este libro,
nos abocaremos solamente al anlisis de la cro
matografa lquido-slido, ya que es la croma
tografa ms utilizada para la separacin de
biomoleulas de importancia inmunolgica.
En base a las caraeterstieas de la fase slida
que se desea utilizar, en funcin de las propie
dades fisicoqumicas de la muestra, la LSC se
divide en no adsortiva y adsortiva. La primera
incluye la de exclusin molecular y dentro de
la segunda podemos encontrar las siguientes
variantes: de intercambio inico, de afinidad,
de cromatoenfoque, de fase reversa, y de hidro
fobicidad (cuadro 41-1).
2. CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN
(FILTRACIN POR GELES)
2.1. Funcjamentos
Dentro de las tcnicas eromatogrficas em
pleadas para la purificacin de protenas, la fil
tracin por geles es la nica en la que el frac
cionamiento se fundamenta en el tamao y for
ma de las protenas.
La filtracin por geles utiliza como soporte
cromatogrfico esferas con poros de diferente
tamao. Una columna construida con esta ma
triz tendr dos volmenes medibles, el volu
men externo (Vo), constituido por el lquido in
tersticial, y el interno (Vi) que es el volumen
de las esferas a los que los solutos y solventes
pueden acceder cuando se introducen dentro de
aqullas a travs de sus poros. Las molculas
que no pueden acceder al Vi, debido a que su
tamao es mayor al del los poros, slo se equi
librarn en el Vo, mientras que las de menor ta
mao se equilibrarn en ambos volmenes.
Cuando una mezcla proteica, disuelta en un pe
queo volumen, es aplicada a una columna con
estas caractersticas, filtrar a travs de la mis
ma. Las protenas de mayor peso molecular
eluirn con el Vo y por lo tanto eluirn prime

Jquido-lquido
(LLC)

Lquido-slido
(LSC)
No adsortiva

Adsortiva

Exclusin

Intercam bio inico

Crom atoenfoque
A finidad
Fase reversa
H idrofobicidad

ro, mientras que las de menor tamao, que pue

den acceder al Vi, eluirn ms tardamente de
pendiendo de su tamao y por lo tanto eluirn
en un volumen de elucin (Ve) determinado
(figs. 41-1 y 41-2).
En una cromatografa de filtracin por geles
se debe tener en cuenta el dimetro de los po
ros de las esferas, el volumen interno de las
mismas y el dimetro hidrodinmico de las mo
lculas proteicas que se desean separar. Este
ltimo se define como el volumen esfrico que
presenta una protena en solucin. Molculas
cuyo dimetro hidrodinmico es menor que el
promedio del dimetro de los poros de las esfe
ras del gel, tendrn acceso a todo el volumen
interno de la matriz, o sea, al volumen total de
la columna (Vt). Protenas cuyo dimetro hi
drodinmico sea comparable al promedio del
dimetro del poro tendrn acceso a parte del
volumen interno, que se describe como el volu
men de elucin (Ve). Protenas cuyo dimetro
hidrodinmico sea mayor que el promedio del
dimetro del poro no sern capaces de acceder
al Vi, por lo tanto eluirn con el Vo de la co-

ooo
oo
ooo
oo

oo
ooo
o o

ooo
oo
0.00
oo

Q Partcula de gel filtrante

Soluto de alto peso molecular

Soluto de bajo peso molecular

Fig. 41-1. Esquem atizacin de la filtracin por geles. So
lutos de m ayor tam ao que el poro del gel no pueden acce
der al interior de la esfera. Solutos de m enor tam ao que
los poros penetran dentro del gel.

Mtodos cromatogrfeos de fase lquido-slido

Vt-Vo
Fig. 41-2. R epresentacin esquem tica del Vo, Vi = V t-V o
y Vt de una colum na de exclusin m olecular.

lumna. El orden de elucin de una mezcla de

protenas, cuando es aplicada a una columna de
exclusin molecular, es inversamente propor
cional al dimetro hidrodinmico de aqullas.
Esta discusin slo puede ser aplicada a mez
clas proteicas, ya que se asume que la mayora
de ellas adoptan una estructura globular. M ol
culas no globulares eluirn en un volumen in
correcto, si se las compara con protenas de pe
so molecular similar. ste es el caso de mol
culas del tipo de los polisacridos. Un perfil de
elucin obtenido por crom atografa de exclu
sin molecular se ilustra en la figura 41-3.
El volum en de elucin para molculas ex
cluidas se designa como Vo (void) y representa
el volumen externo de la matriz. El volumen de
elucin para molculas totalmente incluidas se
denomina Vt y es igual a Vo + Vi, es decir, la
sumatoria del voluinen externo y el volumen in-

871

temo de las esferas. Volilmenes de elucin in

termedios entre estos valores son designados Ve
y estarn situados en los voliimenes comprendi
dos entre el Vo y Vo+Vi y ello depender del
Kd o coeficiente de distribucin del soluto.
El Kd se define como la relacin entre las
concentraciones de un soluto que puede distri
buirse entre el Vo y el Vo -i- Vt. Para las sustan
cias de mayor peso molecular, que no pueden
penetrar dentro de las partculas del gel, el valor
de su Kd ser igual a O (cero), mientras que p a
ra molculas muy pequeas dicho valor ser de
1 (uno); entre ambos valores se sitiian sustan
cias de pesos moleculares intermedios. Tenien
do en cuenta el Kd, el Ve de un soluto ser:
Ve = Vo + Kd Vi
Si dos solutos de diferente peso m olecular
forman parte de una misma solucin, sus vol
menes de elucin dependern de sus correspon
dientes Kd. Aqu debemos introducir el c o n
cepto de volumen de separacin (Vs), que es el
volumen que separa el frente de la curva de
ambas sustancias (fig. 41-3). Si los dos solutos
presentes en la solucin tienen valores de K d
y Kd respectivamente, sus volmenes de elu
cin sern:
V e = Vo Vi K d (1)
Ve = Vo -I- Vi Kd
Vs = V e ^ Ve = (Vo -t- Vi
Vs = V i ( K d - K d)

K d) - (Vo -t- Vi K d)

De acuerdo a lo expresado, para la correcta

separacin de dos solutos, el volumen de m ues
tra a sembrar en una columna, multiplicado por
el volumen de dilucin que sufre la misma d u
rante la elucin, no podr ser superior al V s
(vase en la seccin 2.3).
Cuando se trata de la separacin de dos sus
tancias cuyos valores de Kd = 1 y Kd = O, el
Vs = Vi, se puede calcular fcilmente el tam a
o de la columna a utilizar. Esto es lo que ocu
rre generalmente cuando se desea desalar una
muestra empleando geles de poro pequeo, co
mo es el caso del Sephadex G-25. Como el v a
lor de Vi es aproximadamente igual al 50% del
Vt, el volumen de la muestra a filtrar no podr
ser superior a la mitad del volumen de gel co n
tenido en la colum na. No o curre lo m ism o
cuando los valores de Kd son prximos. Si de
la ecuacin (1) se despeja el valor de Kd:
Kd = V e - V o / V i o
Kd = Ve - Vo / Vs

Fig. 41-3. R epresentacin del volum en de separacin (Vs)

de dos solutos que eluyen a travs de una colum na de ex
clusin m olecular. El grfico indica que el volum en de la
m uestra, luego de sufrir la dilucin dentro de la colum na,
en ningtin caso puede ser superior al Vs.

Debido a que, en la filtracin por geles, el

volumen que ocupa la fase estacionaria es igual
a Vi, luego el Vs no podr ser superior a dicho

872

Mtodos inmunoqumicos

volumen. Como el Kd est relacionado con la

fraccin de volumen de la fase estacionaria dis
ponible para la difusin de un determinado so
luto, en la prctica, dicho volumen as definido
no es fcil de determinar. Por lo tanto es ms
conveniente sustituir al Vi por Vt-Vo, lo que
permite obtener:
Kav = Ve-Vo/Vt-Vo
El valor Kav representa la fraccin del volu
men que ocupa la fase estacionaria disponible
para la difusin de un determinado soluto. Te
niendo en cuenta que, a diferencia del Vi, el
valor de Vt -Vo no incluye el volumen de la
matriz formadora del gel que es inaccesible a
todas las molculas del soluto, el Kav no es un
verdadero coeficiente de particin, aunque el
volumen que ocupa la matriz es despreciable.
No obstante, es un valor experim entalm ente
til y, adems, para cada gel existe una rela
cin constante Kav/Kd que es independiente de
la naturaleza del soluto o sus concentraciones.
Cuando se emplean columnas empaquetadas
con geles filtrantes se puede calcular fcilmen
te su Vt y su Vo, lo que permite determinar los
Ve de los diferentes solutos. Con esos valores
se pueden calcular los correspondientes Kav.
La representacin grfica del coeficiente de
particin en funcin al logaritmo del peso mo
lecular se muestra en las figuras 41-4A y 414B. Como puede observarse, la separacin de
protenas a partir de una mezcla, aplicando cro
matografa por geles filtrantes, ser ptima en
tre valores de Kav 0,2 y 0,8 ya que slo dentro
de ese rango se observa una pendiente; por lo

tanto, todas aquellas molculas que eluyen en el

Vo o en el Vt no podrn ser separadas entre s.
Por todo lo dicho se desprende que no todas
las protenas contenidas en una mezcla pueden
ser separadas por este mtodo, ya que ello de
pende exclusivamente de su peso molecular. La
separacin ptima de dos o ms protenas de
una mezcla se obtiene cuanto ms alejados se
hallen los valores de sus pesos moleculares.
Cuando se requiere la separacin de molculas
de tamao similar es necesario recurrir a otros
mtodos cromatogrficos ms efectivos (vase
ms adelante).
2.2. M atrices
Las propiedades de las matrices ms utiliza
das, tanto en cromatografa convencional como
en la de alta resolucin (cromatografa lquida
de alta presin/resolucin y cromatografa l
quida de alta resolucin para pptidos/protenas: HPLC y FPLC), se detallan en los cuadros
41-2 al 41-5.
Las diferentes matrices comerciales que se
utilizan en la crom atografa convencional se
distinguen por su relativo bajo costo, aunque el
flujo y resolucin alcanzados son tambin ba
jos. Estas matrices se comercializan en suspen
sin o en polvo, lo que depende de las caracte
rsticas de cada matriz, siendo necesaria para su
empaquetamiento una columna de tamao con
veniente en relacin al volumen de la muestra.
Los valores del flujo (ml/h) que deben apli
carse a cada gel normalmente se obtienen mul
tiplicando el flujo lineal listado en el cuadro
41-3, por el rea de la columna expresada en

C u ad ro 41-2. Matrices ms utilizadas en LSC no adsortiva

E stalnlidad
N om bre

M arca

C om posicin *

Presentacin

pH

Temp. C'C)

4-13

1-30
10-80

D im etro ele
las partculas
(lm)

E n c ro m a to g ra fa convencional
Bio~Gel A
Bio-G el P
Sephacyl HR
Sephadex G
Sepharosa
U ltrogel A

Bio-Rad
AG
Bio-Rad
PA
Pharm acia
DX /PA
Pharm acia
DX
Pharm acia
AG
IBF
AG
E n c ro m a to g ra fa d e a lta reso lu c i n (H P L C y F P L C )

Suspensin
Polvo
Suspensin
Polvo
Suspensin
Suspensin

Protein Pak
Shodex Showa
Superse
SynC hropak
Zorbax
TSK -SW

Colum na
Colum na
Colum na
C olum na
C olum na
C olum na

W aters
Denko
Pharm acia
SynChron
D upont
T oyo-Soda

s
AG
S

s
s

emp.
emp.
emp.
emp.
emp.
emp.

2-10
2-10

1-100
1-100

4-10
3-10

1-40
2-36

2-8

1-90
10-45
4-40
1-60

2-13

3-7,5
1-14
2-7
3-8,5
3-7,5

1-100
1-45

40-300
40-300
25-75
20-300
45-200
60-140

10
9
10-13
5-10
4-6
10-13

* L o s sig u ien tes sm b o lo s son u sados para in d icar la c o m p o sici n q u m ic a d e la m atriz; A G , e n tre cru zam ien lo de ag a ro sa; P A , entrecruzam ie n to de poliacrila m id a ; D X , e n tre cru zam ien lo de dex tra n o ; D X /D A , co p o lm ero de alil-d ex tran o y bisacrila m id a ; A G /P A , m ezcla de ag a
ro sa y p o liacrilam ida; S, Slica.

Mtodos cromatogrficos de fase lquido-slido

873

Volumen (ml)

Fig. 41-4. R epresentacin de la resolucin de una

m atriz de exclusin m olecular. En (A) se ilustra
un perfil de elucin. El com ponente 1 no penetra
dentro de la m atriz y eluye con el Vo de la colum
na; el com ponente 2 penetra parcialm ente dentro
d e la m atriz, eluyendo en un determ inado Ve; el
com ponente 3 es incluido totalm ente dentro de la
m atriz, eluyendo en el V t de la colum na. (B ) ilus
tra la relacin sigm oidal entre el Kav y el logarit
mo del peso m olecular de los com ponentes. Como
se puede o bservar, las m olculas que eluyen en
V o y el V t no pueden ser separados.

20

60

40

80

Peso molecular (10^')

cm^. Una columna puede ser empaquetada con

un flujo aproximadamente cinco veees mayor
al usado durante la corrida cromatogrfica.
Las matrices para cromatografa de alta reso
lucin se distinguen por su mayor resolucin y
rapidez, aunque su costo es mayor (ver ms
adelante). Las matrices para cromatografa de
alta resolucin usualmente se comercializan en
columnas ya empaquetadas, debido a que de
ben ser armadas a altas presiones. Las colum
nas analticas ms pequeas son de alrededor
de 8 X 300 mm y permiten el sembrado de po
cos mg de protenas, operando a un flujo de
aproximadamente Iml/min. Las columnas ms
largas se utilizan para fines preparativos y son
de aproximadamente de 20 x 300 mm y perm i
ten la siembra de hasta 100 mg de protena. Las

muestras no pueden tener una concentracin

proteica superior a 50 mg/ml y deben ser clari
ficadas por centrifugacin o filtracin antes de
ser aplicadas a la columna para prevenir que el
material insoluble pueda retardar el flujo de la
misma.
2.2.1. Propiedades fisicoqum icas
y estabilidad de las matrices
I.
S e p h a d e x . E sta m atriz, fab ricad a p o r
Pharmacia, es preparada por entrecruzamiento
de dextrano por epicloridrina. El alto contenido
de grupos oxhidrilos hace que el gel sea alta
mente hidroflico. Los diferentes tipos -G de
Sephadex difieren en el grado de entrecruza
m iento y se denom inan G -10, G-15, G -2 5 ,

C uadro 41-3. Parmetros de las matrices en polvo

N om bre
Bio-G el

Sephadex

Cdigo
P-60
P -100
P -200
P -300
G -50
G-lOO
G -150
G -200

Rango de
fraccionam iem o
(kD)
3-60
5-100
30-200
60-400
2-30
4-150
5-300
5-600

V olum en del
g el hidratado
(m l/g)

Tiem po de
hidratacin (h)
20"C

14
15
29
36

4
4
4
4
3
72
72
72

10
18
25
35

90C

1
1
1
1
1
5
5
5

Flujo lineal
(em/h)"-'
5
5
4
3
5
5
3

L os valores lista d o s co rresp o n d e n a esferas de m alla m ediana.

El flujo lineal in d icad o , es el a p ro p ia d o p a ra u n a ptim a re so lu c i n cro m a to g rfic a. E l volum en del flu jo en m l/h se o b tien e m u ltip lic a n d o
el flujo lineal p o r el rea de la co lu m n a en cm^.

874

Mtodos inmunoqumicos

Cuadro 41-4. Parmetros de las matrices en suspensin

Nom bre

Cdigo

Bio-G el

R ango de fraccionam iento

(lDa)

Flujo Lineal"
(cm/h)

<10-500
10-1500
10-5000
5-600
10-1500
20-8000
10-4000
25-2400
55-9000
5-79
10-130
20-350

18
18

A -0,5 m
A - l,5 r a
A~5 m
S -200 HR
S-300 HR
S -400 HR
C L - 6B
A6
A4
A cA 54
A cA 44
A cA 34
A cA 22

Sephacryl

Sepharosa
U krogel

18
15
15
15
18
5
4
45
45
4
25

100-1200

" El flu jo lineal in dicado, es el ap ro p ia d o p a ra una p tim a resolucin cro m a to g rfie a. El vo lu m en del flujo en m l/h se o b tien e m u ltip iiean d o
el flujo lineal p o r el d im etro d e u n a co lu m n a en cm^.

G-50, G-75, G-lOO, G-150 y G-200 a medida

que dicho entrecruzamiento disminuye, lo que
im plica que los poros de las esferas sern cada
vez mayores. En ello se basa el diferente rango
de fraccionamiento de cada uno de los tipos G.
Las esferas de los Sephadex con alto grado de
entrecruzam iento (G-10, G-15, G-25, G-50 y
G-75) son ms rgidas y pueden aplicarse flujos
rpidos, sin correr riesgo de un eiupaquetamiento excesivo que im phcara finalmente un
flujo sumamente lento. Las esferas con un gra
do de entrecruzamiento menor (G-lOO, G-150
y G-200), son menos rgidas y por ende el flujo
del solvente debe ser ms lento (cuadro 41-3).
Los Sephadex, dependiendo del tamao de las
esferas, se denominan grueso, mediano y fino y
en algunos casos, superfino. El tam ao de la
partcula no influye demasiado en su rango de
fraccionamiento pero s en la resolucin, por lo
tanto se aconseja la utilizacin del tipo G grado

fino. El tipo G superfino slo se usa para cro

matografa en capa delgada (TLC) ya que, en
cromatografa en columna, el flujo sera dema
siado lento. En el cuadro 41-6 se detallan las
caractersticas ms importantes de los diferen
tes tipos de Sephadex.
El Sephadex contiene, aunque pocos, grupos
carboxilos, lo que hace que un solvente de baja
fuerza inica pueda causar interacciones no de
seadas entre la muestra y la matriz. Por lo tanto
sustancias con carga neta positiva podrn ser
retardadas, mientras que aquellas con carga ne
ta negativa eluirn en un Ye menor. Estos efec
tos pueden ser eliminados con el uso de solven
tes con una fuerza inica superior a 0,02 M.
Los rangos de fraccionamiento de cada uno
de los tipos de Sephadex no son modificados
por los diferentes solventes crom atogrficos,
pero un fraccionam iento puede no coincidir
con lo esperado si se usan sales o detergentes

C u ad ro 41-5. Parmetros de las columnas pre-empaquetadas

N om bre

Cdigo

P oro dim etro

(nm )

D im etro largo
(mm)

Protein Pak

60
125
300
W S 802,5
W S 803
W S 804

50
125
300
150
300
500

7 ,8 x 3 0 0

12
6

Shodex

Superosa
SynChropak

TSK

Zorbax

60

8 X

300

60

100

100
300
500
125
250
500
150
300

1-20
2-80
10-500
4-1,50
10-700

10-2000
10x300

300
5000
G 2000SW
G 3000SW
G 4000SW
G F-250
G F-450

R ango
de fra ccio n a m ien to

7,8

300

7 ,5 x 3 0 0

9,4

250

1-300
5-5000
5-30
5-130
15-800
30-2000
5-60
1-300
5-1000
4-500
5-900

Mtodos cromatogrficos de fase iquido-slido

875

Cuadro 41-6. Caractersticas de los diferentes tipos de Sephadex

Tipo
Sephadex G -IO
Sephadex G -15
Sephadex G-25
grueso
medio
fino
Sephadex G-50
grueso
m edio
fino
superfino
Sephadex G-75
fino
superfino
Sephadex G-lOO
fino
superfino
Sephadex G -150
fino
superfino
Sephadex G -200
fino
superfino

D im etro
de la partcula (/Jmj

A gua em bebida
(m l/g)

Volumen, de lecho
(tnl'/g)

Volum en externo
Rango d e
(Vo)
fra ccionam iento (IcDa)
0,9
0,9

40-120
40-120

1.5

2-3
2,5-3,5

0,7
1,5

100-300
50-150
20-80

2.5
2.5
2.5

4-6
4-6
4-6

1-5

100-300
50-150
20-80
10-40

5
5
5
5

9-11
9 -H
9-11
9-11

1.5-30
1.5-30
1.5-30
1.5-30

L5
1-5

40-120
10-40

7.5
7.5

12-15
12-15

3-80
3-70

40-120
' 10-40

10
10

15-20
15-20

4-150
4-100

40-120
10-40

15
15

20-30
18-32

5-300
5-150

40-120
10-40

20

20

30-40
' 20-25

5-600
5-250

que alteren la eonformaein de las sustancias a

separar. Los tipos de Sephadex G-IO y G-15
pueden ser utilizados en solventes orgnicos
como dim etilsulfxido o dim etilform am ida.
Mezclas de agua con baja concentracin de al
cohol pueden ser usadas en los Sephadex tipo
G-10, G-15. G-25 y G-50. Los solventes org
nicos, aunque no daen la matriz del gel, pue
den modificar su grado de humectacin, por lo
tanto en estos casos se recomienda el uso de
Sepharosa CL (vase ms adelante).
El Sephadex es insoluble en todos los sol
ventes; es estable en agua, soluciones salinas,
solventes orgnicos y soluciones de cidos y
lcalis dbiles. Soluciones altam ente cidas
pueden hidrolizar las uniones glucosdicas de
la matriz; no obstante, el tratamiento con HCl
0,1 N durante 1-2 horas no produce efectos detectables. Los agentes oxidantes pueden alterar
su matriz.
Todos los tipos de Sephadex se comerciali
zan en polvo, por lo tanto antes de su uso de
ben ser adecuadamente hidratados. El tiempo
para una perfecta hidratacin, como se indica
en el cuadro 41-3, vara con la temperatura.
El Sephadex hidratado a pH neutro puede ser
esterilizado a 120C durante 30 minutos. Si se
lo conserva empaquetado en columnas puede
incorporarse al solvente un bacteriosttico co
mo aldhedo frmico al 5% , butanol al 20%, o
azida sdica al 0,05%.
II . S ep h a cryl. E ste gel es fabricado por
Pharmacia y se prepara mediante el entrecru
zam iento de m olculas de alil-dextrano con

N ,N -metilen bisacrilamida unidas covalente

mente.
El dim etro de las esferas oscila entre 40105 |0,m con un promedio de 70 |im, C om o en
el caso del Sephadex, el diferente grado de en
trecruzam iento producir diferentes tip o s de
Sephacryl, por ejemplo, S-200, S-300, S-400,
S-500 y S-1000, por ende el rango de fraccio
nam iento ser diferente en cada caso (vase
cuadro 41-4). El Sephacryl usualmente es utili
zado en solventes acuosos, ya que los orgni
cos pueden alterar el tamao de los poros. Es
insoluble en todos los solventes y puede ser
usado en un rango de pH que oscile entre 3 y
11, ya que a un pH inferior a 3 las cadenas de
dextrano pueden ser hidrolizadas; el Sephacryl
tratado con NaOH 0,2 M durante 100 horas a
temperatura ambiente no presenta alteraciones
en sus caractersticas. Puede ser usado en sol
ventes que contengan SDS y en solventes de
alta densidad como clorhidrato de guanidina 6
M. Puede ser autoclavado en buffer de pH 7 a
120C.
Dada su estructura qum ica las esferas del
Sephacryl son muy rgidas, por lo tanto colum
nas muy altas siguen manteniendo un buen flu
jo, a diferencia de lo que ocurre con los Sepha
dex de similar rango de fraccionamiento.
Debido a la alta densidad de la matriz y por
p resen tar algunos grupos carboxilos, el S e
phacryl puede presentar problemas de adsor
cin similares al Sephadex, por lo tanto no de
be ser usado con solventes de fuerza inica me
nor de 0,05 M.

876

Mtodos inmunoqumicos

IH .
Sepharosa. Es una m atriz tambin fa Sepharosa es desulfatada por hidrlisis alcali
bricada por Pharmacia y se prepara a partir de na, rindiendo un gel con muy bajos grupos io
agarosa, la que debe ser previamente purifica nizados. Como en el caso de la Sepharosa,
da con el objeto de eliminar los polisacridos existen tres tipos de Sepharosa CL: CL-2B,
con carga. El gel se forma cuando se enfra la CL-4B y CL-6B.
solucin de agarosa previam ente calentada.
La Sepharosa CL puede ser usada en un ran
Existen tres tipos de Sepharosa: 2B, 4B y 6B go de pH que va de 3 a 14. Su estructura es
(2, 4 y 6 indican los porcentajes de agarosa uti- muy similar a la del Sephadex, pero las fibras
lizcidos en cada caso). El rango de fracciona que forman el gel son mucho ms rgidas. Por
m iento dism inuye a m edida que aum enta el tal motivo se lo puede someter a mayor presin
porcentaje de agarosa usada en la preparacin y as obtener un flujo ms rpido sin modificar
del gel (vase cuadro 41-4). Es estable en agua las caractersticas del gel y la resolucin de la
y soluciones salinas, dentro un rango de pH de cromatografa. As mismo, el volumen de hu
4-9 y en ausencia de agentes oxidantes. Debi mectacin con solventes orgnicos no es dife
do a la presencia de un azcar poco comn, el rente al volumen de humectacin con solventes
3,6-anhidro-L-galactosa, la Sepharosa es alta acuosos. Puede ser esterilizada por autoclavado
m ente resistente a la degradacin enzimtica. a 120C sin cambios aparentes en su estructura.
Si se somete a tem peraturas superiores a los La Sepharosa CI^ es el gel que menos efectos
49C, puede ser irreversiblemente daada, por de adsorcin presenta.
lo tanto slo puede ser esterilizada mediante
La Sepharosa CL es el gel de eleccin para
tratamiento qumico, por ejemplo con dietilpi- ser utilizado en cromatografa de afinidad (va
rocarbonato.
se ms adelante).
La extraordinaria apertura de la trama de la
V.
Ultrogel AcA. Estas matrices son fabrica
Sepharosa permite que sta sea utilizada para das por IBF por entrecruzamiento de poliacrila
el fraccionam iento de protenas de alto peso mida y agarosa. Debido a la rigidez de las part
molecular, de hasta 40.000 kD para la sepharo culas, las cromatografas realizadas con este gel
sa 2B. Pero la ausencia de estndares de tan al pueden ser de un flujo relativamente alto sin
to peso impide la confeccin de una curva es perder resolucin (vase cuadro 41-7). La con
tndar para la correcta caracterizacin de los centracin de poliacrilam ida y agarosa en las
pesos moleculares de las diferentes protenas a esferas de Lfltrogel varan de acuerdo a cada ti
separar.
po, la AcA34 por ejemplo, contiene 3% de po
L a Sepharosa contiene, aunque pocos, gru liacrilamida (Ac) y 4% de agarosa (A). Debido
pos sulfato y carboxilos que pueden causar, a a su composicin qumica estos geles pueden
b aja fuerza inica, la adsorcin de protenas ser usados tnicamente entre 2C y 36C, por la
bsicas. Este efecto puede ser eliminado utili tanto no pueden ser esterilizados por autoclava
zando solventes de fuerza inica superior a do. El Ultrogel es estable entre pH 3 y 10, de
0,02 M.
bindose utilizar solventes de un pH dentro de
IV.
Sepharosa CL. La Sepharosa CE se pre este rango. Altas concentraciones de agentes
para haciendo reaccionar Sepharosa con 2,3- desnaturalizantes, como clorhidrato de guanididibromopropanol en condiciones fuertem ente na y urea pueden alterar la matriz del gel, sin
alcalinas, produciendo un entrecruzamiento del embargo el clorhidrato de guanidina puede ser
gel que aumenta extraordinariamente su estabi usado hasta una concentracin 2 M. Los deter
lidad qumica, pero manteniendo la porosidad gentes como SDS y Tritn X-100 no producen
del gel original. Luego del entrecruzamiento, la cambios aparentes en la matriz, aunque dentro

C u ad ro 41-7. C'aractersticas de los diferentes tipos de Ultrogel y Trisacryl

Nom bre
T rysacryl GF 05
Trisacryl G F 2000
U ltrogel A cA 202
U ltrogel A cA 54
U ltrogel A cA 44
U ltrogel A cA 34
U ltrogel A cA 22
U ltrogel A 6
U ltrogel A 4
U ltrogel A 2

R ango de
fraccionam iento
(kOa)

0 , 2 -2 ,5
10-15.000
1-15
5-70
10-130
20-350
100- 1.200
24-2.400
55-9.000
120-23.000

Lm ite de
exclusin
(kDa)
3

20.000
22
90

200
750
3.000
4.000

20.000
50.000

Tamao de la
partcula
(im)
40-80
40-80
60-140
60-140
60-140
60-140
60-140
60-140
60-140
60-140

Resolucin
(plaos/m )

Flujo lineal
(cm /h)

2500
2500
5000

4-4,5

2000
2000
2000
2000
2000
2000
2000

10
4-4,5
4-4,5
4-4,5
4-4,5
2,5
5
4
3

Mtodos cromatogrficos de fase iquido-slido

de los diferentes tipos de Ultrogeles, los ms
estables son AcA 54, AcA 202 y A6.
VI.
Trisacryl. Estos geles, manufacturados
por !BF, se diferencian del resto de las matrices
utilizadas en este tipo de cromatografa en que
son totalmente sintticas, por lo tanto son ms
resistentes a la contaminacin microbiana. Los
geles de Trisacryl son altamente hidroflicos
por la presencia de amidas secundarias y gru
pos alcohlicos prim arios. Son insolubles en
todos los solventes comnmente usados en cro
matografa lquida. Son qumicamente inertes y
resistentes a los agentes desnaturalizantes co
mo urea 8 M y clorhidrato de guanidina 6 M, y
a detergentes tipo Tritn X-100 y SDS. El Tri
sacryl es particularmente resistente a la hidrli
sis cida y a las altas temperaturas, por lo tanto
puede ser esterilizado por autoclavado.
Las caractersticas crom atogrficas de los
dos tipos de Trisacryl que se comercializan se
hallan en el cuadro 41-7.
VIL B io-G el P. Esta matriz, preparada por
BioRad a base de poliacrilamida, es extremada
mente hidroflica y casi libre de cargas. Sus
partculas son sumamente homogneas y son
com patibles con cidos orgnicos diluidos,
urea 8 M, clorhidrato de guanidina 6 M, agen
tes caotrpicos y detergentes. Para evitar posi
bles efectos de adsorcin, se recomienda utili
zar solventes con una fuerza inica superior a
0,05 M. Solventes orgnicos m iscihles con
agua pueden ser usados hasta un 20% V/V, sin
que las condiciones del gel se alteren. El pH de
los solventes para uso crom atogrfico puede
variar entre 2 y 10, pudindose trabajar en un
rango de temperatura entre 4 y 80C. Los BioGel P pueden ser autoclavados en soluciones
buffer de pH 5,5-6,5. Como los Sephadex, los
diferentes tipos de Bio-Gel P se comercializan

877

en polvo, por lo tanto, tambin deben ser co

rrectamente humectados antes del armado de la
columna. El tiempo de humectacin y tem pera
tura para los tipo de Bio-Gel P ms usados se
hallan en el cuadro 41-3.
VIH . Bio-G el A. Esta matriz, tambin prepa
rada por BioRad, est constituida por agarosa
altamente purificada. Provee geles estables y el
volumen del lecho no cambia en gran m edida
con el em pleo de soluciones salinas de alta
concentracin y algunos solventes orgnicos
como dioxano o metanol. Puede ser usada en
un rango de pH 4-13. La temperatura a la que
puede operarse es de 2 a 30C. A temperaturas
mayores pierde consistencia y la congelacin
colapsa su estructura.
Las caractersticas de los Bio-Gel P y BioGel A ms importantes y su rango de fraccio
namiento se detallan en el cuadro 41-8.

2.3. Preparacin de la muestra

Las muestras no pueden tener una concentra
cin proteica superior a 50 mg/ml. Deben ser
clarificadas por centrifugacin para elim inar
todo material insoluble que pueda disminuir el
flujo de la columna y fundamentalmente conta
minar la matriz de la misma.
Con el objeto de optimizar la resolucin crom atogrfica es necesario conocer el volumen
de muestra a sembrar en relacin al volumen
de gel. Esta relacin se establece sobre la base
de clculos experimentales previos, entre ellos
el grado de dilucin que experimenta en la co
lumna un soluto de alto peso molecular. U na
sustancia muy usada con tal fin es el azul de
dextrano 2.000, colorante de peso m olecular
aproximadamente de 2 x 10'^ kDa. Para ello se
siembra un pequeo volumen de colorante en

C uadro 41-8. Caractersticas ms significativas de los distintos tipos de Bio-Gel P y Bio-Gel A

Producto
Bio-G el
Bio-G el
Bio-G el
Bio-G el
B io-G el
Bio-G el
Bio-G el
Bio-G el
B io-G el
B io-G el
Bio-G el
B io-G el
B io-G el
B io-G el
B io-G el
Bio-G el
B io-G el

P GDG
P-2
P-4
P -6
P-10
P-30
P-60
P-100
P-150
P-200
P-300
A 0,5 m
A 1,5 m
A5m
A 15 m
A 50 m
A 150 m

D im etro de la partcula
hidratada (.Un)
90-180
40-80
80-1-50
150-300
150-300
150-300
150-300
150-300
150-300
150-300
150-300
150-300
150-300
150-300
150-300
150-300
150-300

R ango de fraccionam ieiito

(kD a)

1-6
0 , 1-1
0, 8- 1,8
1-6
1,5-20
2,5-40
3-60
5-100
15-150
30-200
60-400
10-500
10-1.500
10-5.000
40-15.000
100-50.000
100-150.000

Volumen de lecho hidratado

(m l/g)
1
3,5
5
7
9

11
14
15
18
25
30

878

Mtodos inmunoqumicos

la columna, que luego es eluido. Si se utilizan

geles cuyo lmite de exclusin est por debajo
del peso molecular del colorante, el volumen
de solvente que eluye hasta la aparicin de co
lor corresponder al volumen muerto de la co
lumna, o sea aquel en el que no habr elucin
de protenas, y el colorante eluir en con el Vo
de la columna. La relacin entre el lquido co
loreado eluido y el volumen sembrado corres
ponde a la dilucin que sufre la muestra. Este
valor es muy im portante ya que, si se utiliza
una columna cuyo volumen es inferior a la di
lucin que sufre la muestra durante el proceso
crom atogrfico, la resolucin de los com po
nentes no ser ptima. No todos los geles dilu
yen una muestra en la mism a relacin por lo
tanto este valor debe calcularse previamente al
uso del gel de inters. En el caso de Sephadex
G -150/200 es aproximadamente 20.

2.4. Solventes cromatogrficos

Los solventes usados en la cromatografa de
exclusin molecular deben reunir las siguientes
condiciones: a) el pH debe ser compatible con
las propiedades fisicoqumicas de la matriz del
gel; b) la fuerza inica debe ser lo suficiente
mente elevada como para impedir la adsorcin
inespecfica del soluto a la matriz por interac
ciones electrostticas o uniones Van der Waals,
y depender de las caractersticas de cada gel.
Como la mayora de las protenas son estables
en soluciones salinas, el solvente generalmente
utilizado es solucin salina tamponada (NaCl
0,15 M, llevada a pH 7.5 con bujfer de fostato
de sodio).
La mayora de las protenas son estables a
tem peratura ambiente y slo requieren bajas
temperaturas con el objeto de reducir la hidrli
sis catalizada por algunas enzimas proteolticas
presentes en la muestra. Por lo general se utili
za azida sdica 0,02%, lo que evita tambin la
contaminacin de la matriz.

2.5. Problemas comunes a la cromatografa

de exclusin molecular
Para obtener una correcta resolucin se deben
tener en cuenta los posibles problemas que pue
den surgir durante la corrida cromatogrfica:

rendir picos en forma de meseta, por lo que la

muestra corre el riesgo de ser eluida en un vo
lumen mayor, y la resolucin ser menor. El
uso de partculas de menor tamao o de un gel
de rango ms limitado pueden mejorar la reso
lucin.
2. Flujo lento. Esto puede deberse a la con
tam inacin del filtro o de m uestras no bien
centrifugadas que contengan partculas en sus
pensin. La utilizacin de partculas muy finas,
com o el caso de los S ephadex G -25, G-50,
G-75, G-lOO, G-150 y G-200 superfinos no son
recomendados para ser utilizados en columna
ya que el flujo que se obtiene es muy lento, el
grado ms recomendado es el fino. Los geles
una vez utilizados, si se desea mantenerlos em
paquetados, deben lavarse en flujo reverso con
agentes solubilizantes, como detergentes no i
nicos.
3. P icos de fo rm a no deseada. La causa
principal es la incorrecta aplicacin de la mues
tra. Para verificar la calidad de la aphcacin, la
muestra puede ser sembrada con un colorante
inerte como azul de dextrano o dicromato de
potasio. Si la corrida presenta un frente irregu
lar, las molculas de la muestra eluirn en pi
cos asimtricos. Las colas de los picos gene
ralmente son el resultado de adsorciones entre
las protenas de la m uestra y la matriz. Este
problem a puede solucionarse aum entando la
molaridad de la sal del solvente o utihzando sa
les liotrpicas como perclorato de potasio. En
el caso de la cromatografa de alta resolucin
(HPLC o FPLC), las colas pueden deberse a
una prdida de la slica de la matriz, situacin
que requiere el cambio de la columna. Picos en
forma de meseta pueden ser el resultado de un
equilibrio dinmico entre diferentes estados de
polimerizacin de la protena. Cambios en el
pH, tem peratura o solvente crom atogrfico
puede llevar el equilibrio a un nico estado de
polimerizacin.
4. Elucin de la protena en un Ve inco
rrecto. Puede ocurrir por adsorcin de la pro
tena a la matriz del gel y eluir en un Ve no es
perado o directamente eluir en el Vt de la co
lumna. Puede aadirse al solvente un detergen
te no inico que no absorba a 280 nm o, si la
estabilidad de la matriz y de la misma protena
lo perm ite, usar clorhidrato de guanidina o
urea.

1.
M ala resolucin. ste es un problem a
comn a la cromatografa por exclusin mole 2.6. Aplicaciones de la cromatografa
cular, ya que es inherente al mtodo. Sin em de exclusin molecular
bargo, cambios en algunos parmetros operacionales pueden mejorar la resolucin. El flujo
Las aplicaciones ms comunes de la croma
y la resolucin son inversamente proporciona-. tografa de exclusin molecular son:
les, por lo tanto una disminucin del flujo pue
de m ejorar la resolucin; pero un flujo muy
1.
Desalado de solutos. En este caso se uti
lento puede producir difusin de la muestra y lizan geles cuyo tamao de poro es pequeo.

Mtodos cromatogrficos de fase lquido-slido

Por tal motivo, las protenas no tendrn acceso
al Vi de la matriz, eluyendo con el Vo de la co
lumna y s lo harn las sales que se desean eli
minar, eluyendo con el Vt de la columna. Las
matrices ms utilizadas son los tipos de Sepha
dex G-10, G-15 y G-25, Trisacryl GF05 y los
Bio-gel P-2 y P-4.
2. Caracterizacin de pesos moleculares.
Dentro de los mtodos cromatogrficos, la cro
matografa de exclusin molecular es el nico
que permite calcular el peso molecular de una
protena dada. Para ello son necesarias prote
nas de peso molecular conocido, que se disuel
ven en un pequeo volumen de solvente y lue
go se siembran en la columna seleccionada. De
acuerdo al volumen de elucin de cada protena
estandar se calcula el Kav y se confecciona una
grfica representado el Kav versus el logaritmo
de cada uno de los pesos moleculares, como se
indica en la figura 41-4B.
3. Separacin de solutos de pesos molecula
res diferentes. Es necesario recordar que en este
tipo de cromatografa ningn soluto es retenido
por ]a matriz, por lo tanto la resolucin de este
mtodo cromatogrfico es poco eficiente.
Para optimizar la resolucin de una muestra
se debe tener en cuenta:
a) El peso molecular de la sustancia que se
desea purificar debe ser, por lo menos, la mitad o
el doble del resto de las molculas de la mezcla.
b) El rango de fraccionamiento del tipo de
matriz a utilizar depender del peso molecular
del soluto de inters, cuyo valor debe hallarse
en el punto medio del rango de fraccionamiento
de la matriz seleccionada.
c) Si se utiliza una matriz en polvo, tipo Se
phadex o Bio-gel P, se debe humectar previa
mente durante el tiem po adecuado para cada
matriz y luego empaquetar la columna.
En estos casos se debe conocer el volumen
de humectacin/peso en g de polvo, dato que
trae el envase de cada matriz. Para el armado de
la columna, la matriz debe estar suspendida en
un exceso de volumen y a medida que el gel de
canta se debe eliminar el sobrenadante, tenien
do la precaucin de que el gel no forme interfases. Durante todo el tiempo se debe trabajar a la
misma temperatura, de lo contrario se coire el
riesgo de que se produzcan burbujas dentro de
la columna, en este caso se proceder a su nue
vo armado. Para m inim izar este problema es
importante degasear previamente los solventes.
d) Como se ver ms adelante, a mayor n
mero de platos tericos, mejor ser la resolu
cin del cromatograma, por lo tanto la columna
deber ser alta y de poco dimetro, por ejemplo
Icm de dimetro por Im de altura.
e) Como se explic ms arriba, toda muestra
sufre una dilucin que depender del tipo cada

879

F ig . 4 1 -5 . R e p re s e n ta c i n d e la s e p a ra c i n d e Ig G y a lb
m in a h u m a n a s a tr a v s d e u n a c o lu i r in a d e S e p h a d e x
G -2 0 0 .

matriz. El Vi de la columna nunca deber ser

inferior a dicho volumen; en general, para una
in x im a re so lu ci n se u tiliz a una re la c i n
100:1 (V /V ) de colum na con respecto a la
muestra.
En la figura 41-5 se muestra la separacin de
IgG de albmina, mediante el uso de una co
lumna de Sephadex G-200.
3. C R O M A T O G R A FIA
DE IN T ER C A M B IO I N IC O
Y C R O M A T O E N FO C A D O
Las separaciones obtenidas por estas m eto
dologas se basan en las caractersticas de carga
de las diferentes biomolculas en solucin. D e
bido a que la mayora de las biomolculas co n
sisten en subunidades con carga, por ejem plo
aminocidos, sacridos y nucletidos, estas tc
nicas son aplicables a una am plia gam a de
muestras.
La clave de la resolucin obtenida est dada
por la selectividad, determ inada por un gran
nmero de variables. En cromatografa de in
tercambio inico y cromatoenfocado, la selecti
vidad se basa en las caractersticas fisicoqumi
cas del solvente y de las mismas biomolculas
que van a ser separadas. La utilizacin de di
chas variables ofrece innumerables posibilida
des para resolver los problemas de la separa
cin y purificacin.
3.1. C rom atografa de intercam bio
inico

3.1.1. Fundamentos
La cromatografa de intercambio inico tra
baja m ediante la unin de biom olculas con

880

Mtodos inmunoqumicos
F ig . 4 1 -6 . In te r a c c i n e n tre ,
la re s in a in te rc a m b ia d o ra (en
el e je m p lo , u n a re s in a d e in
te rc a m b io a n i n ic o ) y la b io m o l c u la . L a in te r a c c i n se
r o m p e m e d ia n te el a g re g a d o
d e io n e s sa lin o s.

Intercambio aninico
(ej, DEAE)

O '

una carga determinada a una matriz estaciona

ria de carga opuesta (fig. 4]-6). La fuerza de
dicha unin puede ser modificada variando la
concentracin salina y el pH de la solucin
lampn (buffer) utilizada como eluyente.
La separacin de sustancias por resinas de
intercambio inico se consigue por un m eca
nismo de adsorcin reversible. Consiste en la
fijacin inicial a una resina estabilizada de las
sustancias a fijar o unir, seguida de su rem o
cin. Si las sustancias fijadas tienen diferentes
propiedades elctricas, mediante la variacin
del pH o la fuerza inica del eluyente se conse
guir que cada una de ellas eluya por separado.
Las sustancias se unen a resinas de intercambio
inico cuando tienen carga opuesta a la de los
iones fijos de la resina siendo esta unin de ti
po electrosttico y reversible.

3.1.2. Matrices 31 solventes

La matriz puede estar constituida por silicato
de aluminio, resinas sintticas, polisacridos
como la celulosa y el dextrano, etc., y la natu
raleza de los grupos cargados es la que deterrnina el tipo y la fuerza del ion intercambiador.
Dentro del grupo de resinas de intercambio catinico, las que contienen grupos carboxilos se
denominan de intercambio catinico dbiles, y
las que contienen grupos sulfnicos, fuertes.
Lo mismo ocurre con las resinas de intercam
bio aninico: aquellas que contienen grupos
cargados constituidos por derivados diaminados alifticos o aromticos se comportan como
intercam biadores dbiles, y como fuertes las
que contienen aminogrupos cuaternarios (cua
dro 41-9).

C uadro 41-9. Tipos de resinas celulsicas de intercambio inico

D esignacin
A E (a m in o e til-)
D E A E (d ie tila m in o e til-)
T E A E (trie tila m in o e til-)
G E (g u a n id o e ti)-)
C M (c a rb o x im e til-)
S M (su lfa m e li)-)
S E (su lfo e til-)

Form a inica
-0
-0
-0
-0

Tipo

C H 2 -C H j N H ,+ '
C H - C H N H (C2H ,)2*
C H -C H N C jH ,) ," H N+
C H -C H N H -C = N H
-0 CH C O -0 C H S O ,
- 0 C H -C H S O ,

2
2
2
2
2
2

2
2
2
2
2

2
2

A m n ic a
A n i n ie a
A n i n ie a
A n i n ie a
C a ti n ic a
C a ti n ic a
C a ti n ic a

Mtodos cromatogrficos de fase lquido-slido

La medida de la cantidad de iones contrarios
que puede intercam biar una resina constituye
su capacidad, la que depender del nmero de
grupos cargados que la resina posea. La capaci
dad inica total estar dada por la cantidad de
grupos cargados y potencialm ente cargados,
mientras que la capacidad medible es la deter
minada experimentalmente y depende de la ac
cesibilidad de los grupos funcionales, de la
fuerza inica, pH y tem peratura del eluyente,
de la naturaleza de los iones contrarios, etc. Pa
ra las diferentes resinas su capacidad viene in
dicada en el envase y est expresada en mEq/g
o en los mg de una protena determinada capa
ces de ser fijados por Ig de resina.
Un intercambiador inico fuerte es aquel que
no muestra variaciones en su capacidad inter
cambiadora de iones (por ej. mmoles C f unidos
por mi de gel) con un cambio de pH, ni posee
la habilidad de tomar o ceder protones con las
variaciones de pH. En cambio, un intercambia
dor inico dbil vara su capacidad de inter
cambiar iones con los cambios del pH.
La eleccin correcta de la resina, en especial
en lo que se refiere al grupo funcional, depen
der de la carga neta de la sustancia a separar.
Cuando sta tiene un solo tipo de grupo carga

881

do, ser fcil elegir una resina aniniea o cati

nica segn las caractersticas de dicho grupo.
En las sustancias anfotricas, que poseen gru
pos cargados positivos y negativos, su carga
neta depender del pH, pudiendo unirse, segn
el pH del medio, a resinas aninicas o catinicas. En su punto isoelctrico (pl), su carga neta
ser cero y no se fijar a ningn tipo de resina
intercambiadora. Como las protenas son su s
tancias que responden a estas caractersticas,
tienen capacidad para fijarse a resinas de am
bos tipos y podrn ser eluidas con soluciones
de determinado pH segn el caso. Lo nico que
limita la eleccin es la desnaturalizacin que
estas protenas podran sufrir en las condicio
nes de trabajo (fig. 41-7).
Las resinas pueden ser activadas en form a de
H+ u OH;. El uso de una resina aniniea o ca
tinica depende de la carga neta de la protena
al pH del buffer a utilizar. Este debe ser tal que
perm ita la m ayor disociacin de los grupos
reactivos de la resina, de modo tal que su capa
cidad de adsorcin sea mxima. Las resinas de
intercam bio aninico interactan con m olcu
las cargadas negativamente, mientras que las
de intercambio catinico interactan con m ol
culas cargadas positivamente.

a) intercambiador catinico,
pH 3,0

b) intercambiador catinico,
pH 5,0

c) intercambiador aninico,
pH 11,0

A280

A280

A280

Intercambiador

pH

F ig . 4 1 -7 . C u rv a s d e titu ia c i n d e tre s p ro te n a s d is tin ta s y su s e p a ra c i n p o r c ro m a to g ra fa d e in te r c a m b io i n ic o . L a s z o

n a s re c u a d r a d a s in d ic a n d n d e u tiliz a r la s d istin ta s re s in a s .

882

Mtodos inmunoqumicos

Las resinas ms empleadas en el laboratorio

de inmunoqumica son la Dietilaminoetil Celu
lo sa (D E A E ) y la C arbo x i M etil C elu lo sa
(CMC), intercam biadoras dbiles, que deben
ser activadas previam ente a su uso. Existen
tambin resinas de intercambio inico que no
requieren activacin previa (D E AE-Sepharo
sa, D E A E -Sephadex G25, D E A E -Sephadex
G 50, D E A E -S e p h a c e ll). A lg u n as de stas
combinan la separacin por intercambio inico
con el efecto de tamiz molecular. Para el labo
ratorio de inmunoqumica que disponga de un
equipo de FPLC, las resinas mas empleadas
son las QSepharosa y la S-Sepharosa (inter
cam biadores fuertes), de P harm acia (vase
ms adelante).
La carga neta de una protena vara con el
pH, por lo que ste puede modificarse para su
elucin segn que la protena se encuentre fija
da a una resina intercambiadora aninica o catinica. Si se encuentra fijada a una resina catinica (donde los grupos intercambiables po
seen carga positiva) para conseguir su elucin
la variacin del pH debe ir de su pK 1 al punto
isoelctrico, y en el caso de que estuviera fijada
a una resina aninica (grupos intercambiables
con carga negativa), desde su p K 2 al punto
isoelctrico. El grado de diferencia entre las
curvas de titulacin de dos protenas indica qu
posibilidad existe de que dichas protenas pue
dan ser separadas por crom atografa de inter
cambio inico (fig. 41-7).

La elucin de una protena fijada a una resi

na intercambiadora puede conseguirse tambin
por variacin de la fuerza inica del eluyente.
A fuerzas inicas bajas la competicin por los
grupos cargados de la resina es mnima, au
mentando a medida que la fuerza inica crece,
con lo que se consigue reducir la interaccin
entre la resina y la muestra fijada, producin
dose su elucin. En la separacin de mezclas
de protenas que no difieren mucho en su carga
neta, el empleo combinado de variaciones de
pH y fuerza inica permite obtener una mejor
resolucin.
Los gradientes de elucin, ya sea de pH o de
fuerza inica, pueden realizarse en forma conti
nua o en saltos (vase Metodologa).
3.2. Cromatoenfocado

3.2.1. Fundam entos

El cromatoenfocado es una tcnica analtica
o preparativa empleada para separar biomol
eulas de acuerdo a su punto isoelctrico'(pl).
En un gradiente de pH descendente, una es
pecie molecular existir en tres estados de car
ga: negativo, neutro y positivo. La esencia del
cromatoenfocado es que las molculas indivi
duales cambian constantem ente su estado de
carga a medida que se desarrolla el gradiente
de pH (fig. 41-8). Esto produce un efecto de

Eluyente
es rpido

F i g . 4 1 - 8 . C i c lo q u e r e s u l t a r e n u n
e fe c to d e e n fo q u e d u ra n te el c ro m a to e n
f o c a d o . L a s m o l c u la s q u e se e n c u e n
tra n re tra s a d a s m ig ra n m s r p id a m e n te
q u e las d e l fre n te d e e lu c i n , p ro d u c ie n
d o u n e s tr e c h a m ie n to d e la s b a n d a s d e
e lu c i n s e g n lo s d ife re n te s p u n to s i s o e
lc tric o s.

Mtodos cromatogrficos de fase lquido-slido

enfocado, favorecido por el flujo del eluyente,
cuya velocidad es mayor que el desarrollo del
gradiente de pH. Las m olculas que se van
cargando positivam ente son repelidas de la
matriz (que tiene carga positiva) y son llevadas
rpidamente al frente de la zona de la muestra.
En este desplazamiento al frente de la muestra,
las molculas encuentran un incremento en el
pH. Esto lleva a las molculas sucesivamente
de su form a positiva a la neutralidad y a su
forma negativa. Cuando las molculas se car
gan negativamente, son retenidas por interac
cin con la matriz, quedando nuevamente re
trasadas en el flujo. Este intercambio de m ol
culas entre el frente y la cola de la muestra re
sulta en un continuo estrecham iento de esta
zona hasta que la muestra eluye de la columna.
En este momento, el pH del efluente de la co
lumna es aproximadam ente el pl del com po
nente de inters.
3.2.2. Matrices y solventes
Los geles comnmente usados son Polybuff e r in te rc a m b ia d o r P B E 94 y M ono P, de
Pharmacia. Este ltimo gel est sustituido con
varias aminas terciarias y cuaternarias, y se utihza con mejores resultados cuando los com po
nentes de la muestra tienen carga negativa. Los
buffers de elucin ms comunes son el Polybujfer 96 y el Polybujf'er 74 (Pharmacia) que
contienen numerosas sustancias anfotricas de
diferentes valores de pKa. Para obtener g ra
dientes lineales de pKa durante la elucin de la
columna se debe ajustar el pH del Polybujfer a
uno ligeramente inferior al de la colunrna preequilibrada.
Componentes cuyos pl difieren hasta 0,02
unidades de pH pueden ser separados. Se pue
den utilizar intervalos amphos de pH (9-6, 7-4,
etc.) para screening de las muestras, e inter
valos ms estrechos, de 0,5 a 2 unidades de pH
para obtener altas resoluciones.

883

de modo de eliminar la mayor cantidad posible

de lquido y resuspender la resina hmeda en
500 mi de HCl 0,5 N. Previa agitacin, filtrar
nuevamente por Buchner y lavar con agua des
tilada hasta neutralidad. Suspender en el buffer
a usar en la elucin, pero con una molaridad
5-10 veces superior, agitar, mantener en co n
tacto 10-15 minutos y filtrar por Buchner. L a
var con agua destilada y suspender luego en el
buffer de elucin, efectuando cinco recambios
con intervalos de 30 minutos, manteniendo la
agitacin. Introducir la resina activada en la co
lumna cromatogrfiea y pasar a travs de ella
su buffer de elucin hasta que su pH y su con
ductividad igualen a las del eluido. Esta ltim a
operacin puede hacerse por agitacin d e la
mezcla en recipientes adecuados.
3.3.2. Obtencin de gradientes continuos
de elucin
Para lograr un gradiente de elucin, de m ola
ridad o pH, puede usarse un dispositivo de va
sos comunicantes. En el recipiente A se coloca
el buffer de menor molaridad o pH, segn el
caso, y en el B, el de mayor molaridad o pH, en
volmenes iguales. A medida que fluya buffer
del recipiente A por la tubuladura de salida h a
cia la columna, pasar buffer del recipiente B a
travs de la tubuladura comunicante hasta n ive
lar volmenes. Si mediante un agitador se ase
gura la mezcla del contenido del recipiente A,
en l se producir una variacin constante y
progresiva de la molaridad o el pH.
En el caso de trabajar con un equipo tipo
FPLC, el gradiente se regula automticamente.
El tipo de gradiente es programable, de manera
que se puede establecer el tiempo en el que de
be aumentarse el porcentaje del buffer de m a
yor molaridad.
4. C R O M A T O G R A F A D E A F IN ID A D

3.3. M etodologa

4.1. Fundamentos

3.3.1. Activacin de resinas

de intercambio inico

La purificacin por cromatografa de afin i

dad es una de las tcnicas ms poderosas para
el aislam iento de protenas. Consiste en una
cromatografa de adsorcin en la que se apro
vecha la especificidad de interacciones biolgi
cas entre protenas aisladas, como lo es la inte
raccin antgeno-anticuerpo, enzima-inhibidor,
hormona-receptor, lectina-hidrato de carbono,
etc. M ediante la insolubilizacin de uno de los
reactivos se consigue una sustancia fijadora in
soluble con afinidad biolgica para la sustancia
a ser purificada. Es requisito indispensable que
el componente insolubilizado retenga su cap a
cidad de unin especfica.

Para el caso de las resinas tipo D EAE o

CMC, se debe proceder a su activacin previa
mente a su uso mediante el siguiente procedi
miento: colocar en un vaso de precipitacin 1015 g de resina y aadirle 500 mf de NaOH 0,5
N + NaCl 0,5 M. Agitar con agitador magnti
co durante 20-30 minutos, decantar el sobrena
dante y resuspender en 500 mi de NaCl. Agitar
nuevamente y eliminar el sobrenadante; repetir
el procedimiento hasta obtener un pH neutro.
Filtrar- por Buchner sobre papel de filtro grueso

884

Mtodos inmunoqumicos

La purificacin por cromatografa de afini

dad puede ser dividida en tres pasos principa
les: 1) preparacin de la m atriz fijadora; 2)
unin de la sustancia a purificar a la matriz fi
jadora; 3) elucin de la sustancia a purificar.
En el primer paso, se fija el ligante (anticuer
pos monoclonales o policlonales, o antgenos
segn el caso) en forma covalente a una matriz
insoluble. Luego de la preparacin de la matriz,
se realiza la unin no covalente de la sustancia
a purificar (ligando), y las m acrom olculas
contaminantes se eliminan por lavado. En un
tercer paso, la interaccin ligando-ligante (por
ejemplo, antgeno-anticuerpo) se rompe tratn
dolos con condiciones a veces drsticas, produ
cindose la elucin de la sustancia a purificar.
Los factores que contribuyen al xito de una
purificacin por afinidad son varios. Los tres
ms importantes son la concentracin relativa
inicial de la sustancia a purificar, la afinidad
del ligando por el ligante (ej.: anticuerpo por el
antgeno), y la facilidad con que la interaccin
puede ser desplazada,
La concentracin relativa de la sustancia a
ser purificada es el punto ms im portante a
considerar para determinar la pureza del pro
ducto final. El grado de purificacin obtenible
es limitado, y el uso de columnas de afinidad
tiene algunos problemas de inespecificidad. Si
el producto a crom atografiar se encuentra en
muy bajas proporciones en la muestra, esta me
todologa debe ser acompaada de pasos pre
vios de enriquecimiento.
Debido al carcter de este libro, esta metodo
loga se enfocar hacia la separacin de antge
nos o anticuerpos. La afinidad del anticuerpo

por el antgeno debe ser tambin considerada,

ya que determinar la cantidad de antgeno que
puede ser obtenida de una muestra. Para anti
cuerpos de alta afinidad (Ka >10** M^), un buen
resultado puede ser obtenido en menos de una
hora. Aun en altas concentraciones de anticuer
po, si estos son de baja afinidad (Ka < 10^M'),
nunca se podr remover todo el antgeno de la
muestra, la unin del antgeno ser dificultosa, y
se perder parte de lo unido durante los lavados.
El tercer factor que influenciar el resultado
de una purificacin por afinidad es la facilidad
relativa con que un antgeno pueda ser eluido.
El anticuerpo ideal a ser utilizado en cromato
grafa de afinidad es aquel que posea una alta
afinidad por el antgeno y cuya unin pueda ser
revertida por mtodos suaves y simples como
por ejemplo, una variacin en el pH, en la fuer
za inica, o por competencia. Las condiciones
de elucin no debern afectar las propiedades
biolgicas de la sustancia que se desea purificar.
4.2. M atrices y solventes

La naturaleza de la matriz a la que se fijan

los ligandos es muy importante, ya que en las
condiciones experim entales debe ser fsica y
qumicamente estable, no debe actuar como ta
miz molecular y adems debe asegurar un buen
flujo durante la elucin.
Existen numerosas matrices comerciales dis
ponibles en su forma activada o sin activar para
ser utilizadas como soporte para el anticuerpo o
antgeno especfico (cuadro 41-10). Asimismo,
el inmunoadsorbente puede ser preparado en el
laboratorio mediante la insolubilizacin de pro-

C uadro 41-10. Algunas matrices aptas para su activacin

Matriz.

E stabilidad qum ica

Rango
depH

R ango de
Grupos de
tem peratura copulacin

A ctivadores

Ejem plos
comercicdes

A g a ro s a

M a la . E v ita r a g e n te s c a o tr p ic o s , e x p o s ic i n p r o lo n
g a d a a u re a o g u a n id in a

4 -1 0

4 - 3 0 C

-O H

B ro m u ro d e c ia n geno
C a rb o n ild iim id a z o l

C ross-linked

B u e n a . E v ita r e x p o s ic i n
p ro lo n g a d a a a g e n te s c a o tr p ic o s

3 -1 4

4-1 2 0 C

-O H

B ro m u ro d e c ia n geno
C a rb o n ild iim id a z o l
C lo ru ro d e to silo

E x c e le n te . lc a lis fu e rte s
c o n v ie rte n las a m id a s en
c a rb o x ilo s
M a la . E v ita r a g e n te s c a o tr p ic o s , e x p o s ic i n p r o lo n
g a d a a u re a o g u a n id in a

2 -1 0

4 - 1 2 0 C

-N H j

G lu ta ra ld e h d o

B io -G e l P (B io Rad)

4 -1 0

4-30C

-O H
-N H j

U ltra g e l A c A
(IB F )

<1-11

- 2 0 - l 2 G C

-O H

B ro m u ro d e c ia n geno
C a rb o n ild iim id a z o l
G lu ta ra ld e h d o
B ro m u ro d e c ia n geno
C a rb o n ild iim id a z o l
C lo ru ro d e to silo

a g a ro sa

P o lia c rila m id a

C o p o lm e ro s
d e p o lia c ri
la m id a y
a g a ro s a
P o lia c rlic o

E x c e le n te . lc a lis fu e rte s
c o n v ie rte n la s a m id a s en
c a rb o x ilo s

B io -G e l A (B io Rad)
S e p h a ro s a (P h a r
m a c ia )
U ltra g e l A (IB E )
S e p h a ro s a C L
(P h a rm a c ia )

T ris a c ry l (IB F )

Mtodos cromatogrficos de fase iquido-siido

885

Cuadro 41-11. M todos de copulacin de anticuerpos a matrices

M todo
Protena A

M atrices activadas

A nticuerpos activados

Variantes
U nin directa
U nin m ediante anticuerpos anti-lg
C arbonildiim idazol
B rom uro de ciangeno
Glutaraldelido
H idrox i succinim ida
Cloruro de tosilo
Carbodiim idas
A gentes condensantes
G lutaraldehdo
P eriodato

A nticuerpo biotiniiado
M atriz estreptoavidina

G rupo
A nticuerpo copulante en el
orientado?
anticuerpo

No
No
No
No
No
No
No
No
S

-NH^
-NHj

No

-N H ,

tenas, por ejemplo mediante el empleo de glu

taraldehdo (vase Metodologa).
Existen numerosos mtodos que pueden ser
utilizados para unir covalentemente anticuer
pos a una matriz de fase slida que pueden ser
divididos en tres clases: 1) geles de protena
A/G; 2) geles activados; 3) anticuerpos activa
dos. Los mtodos ms titiles son aquellos que
utilizan matrices que ya han sido modificadas
para que contengan reactivos secundarios que
unan especficamente a los anticuerpos. Una de
las matrices ms utilizadas es la de protena A
del estafilococo. sta une especficamente el
Fe de los anticuerpos, y luego de la unin del
anticuerpo se estabiliza por cross-linking o en
trecruzamiento con un reactivo de unin bil\mcional. El segundo tipo de mtodo directamente
une el Ac a una resina activada, por ejemplo
Sepharosa CL 4B activada con CNBr. El tercer
mtodo de unin consiste en activar en primer
lugar al anticuerpo, colocando el grupo reacti
vo en el anticuerpo soluble, para unirlo a la
matriz insoluble. Los diferentes mtodos de co
pulacin se resumen en el cuadro 41-11.
En cuanto a los solventes empleados, depen
dern del mtodo a utilizar. En general, se pue
de decir que el solvente empleado para la fija
cin del ligando difiere en su pH o concentra
cin salina del que se utiliza para su elucin.
4.2.1. Unin de anticuerpos a geles
de protena A/G para la separacin
de antgenos
Dentro de las utilizadas para la purificacin
por cromatografa de afinidad, las matrices de
protena A/anticuerpo son una de las ms ver
stiles. Las columnas son fciles de preparar, y

Ventajas

D esventajas

B uena orientacin C aro

Fcil

S
S

-NHj
~ N H ,, ~SH
- N H j,- C O O H
-N H ,
A zicar

Econm ico
El anticuerpo p u ed e
resultar d aado
D isponibles en
fo rm a com ercial
en la unin. M tltiples pasos p a ra
activar y u n ir
E conm ico
El anticurpo p u e d e
resultar d aado
en la unin. M l
tiples pasos p a ra
activar y unir
U nin en solucin C aro

debido a que las molculas de anticuerpo se

unen por el Fe, el sitio de combinacin con el
antgeno se encuentra orientado correctamente.
Los anticuerpos pueden ser unidos directa
mente a la protena A, o ser unidos mediante
un interm ediario (un anticuerpo anti-inmunoglobulina). Aquellos anticuerpos cuyo Fe posea
alta afinidad por la protena A pueden ser uni
dos directam ente; aquellos con baja afinidad
requieren del interm ediario. U na vez que los
anticuerpos se han unido a la protena A, deben
ser entrecruzados covalentemente a la m atriz
con cualquier reactivo bifuncional. El ms u ti
lizado es el dim etilpimelim idato (DMP), que
tiene la ventaja de su bajo costo y fcil manejo.
Los dos grupos del DMP se unen a aminos li
bres, por lo que anticuerpos con grupos aminos
libres en el sitio de coml3nacin con el antge
no no pueden ser unidos mediante este tipo de
reactivos. Otros grupos bifuncionales de d ife
rentes largos pueden ser utilizados para el en
trecruzamiento.
Debido a que la protena A posee diferente
afinidad para las inmunoglobulinas de distintas
especies, clases y subclases, podra no ser p o si
ble unir una alta concentracin de cualquier an
ticuerpo a matrices de protena A. Esto podra
ser subsanado utilizando matrices de protena
G del estreptococo, utilizando un anticuerpo in
term ediario, o ajustando las condiciones de
unin a la matriz (como sera el caso de unin
de IgG, de ratn). Las columnas de protena G
se preparan de manera idntica a las de prote
na A, pero tienen distinta afinidad por las dis
tintas subclases de inm unoglobulinas, segin
puede verse en el cuadro 41-12.
Una precaucin que debe ser observada es
que, si la muestra de antgeno a purificar con-

886

Mtodos inmunoqumicos

C u a d ro 41-12. A finidad de la protena A/G

por anticuerpos de distintas especies
Especie
H um ano
C aballo
V aca
Cerdo
O veja
C abra
C onejo
Pollo
H m ster
Cobayo
R ata
Ratn

A finidad
p o r protena A

A finidad
p o r protena G

++++
++

++++
++++
++++
+++
++
++

+++
+/-

+
++++

++
++

+ /~

++

tiene anticuerpos de mamferos, estos sern se

parados junto con el antgeno.
4.2.2. Inmunoadsorbentes preparados
con Sepharosa
Es posible ligar covalentemente a las distin
tas Sepharosas comerciales toda clase de pro
tenas y sustancias que contengan grupos aminos primarios. El mtodo empleado para acti
var una de las Sepharosas comerciales, la Sep h a ro sa CL 4B, es m edian te el em pleo de
CNBr. Si bien el mecanismo de reaccin con el
CNBr y la Sepharosa no es bien conocido, se
presume que es debido a la formacin de iminocarbonatos acclicos y cclicos. stos, al
reaccionar con los aminogrupos primarios de
las protenas ligantes, originan uniones covalenles, las que aseguran una unin estable.
Existen en el comercio derivados de la Se
pharosa 4B, conocidos con los nom bres de
A U -Sepharosa 4B y CH -Sepharosa 4B, que
contienen grupos aminos y carboxilos libres,
respectivamente. Ello permite que ligantes con
grupos carboxilos o am inos, segn el caso,
puedan ser unidos a la matriz insoluble, utili
zando para ello la formacin de una unin peptdica mediante el empleo de carbodiimidas.
Los productos comerciales tienen adems la
ventaja de que los grupos amino y carboxilos
estn separados de la matriz por cadenas de 6
tomos de carbono (brazos espaciadores), lo
que aumenta la capacidad fijadora del imnunoadsorbente. Esta mayor separacin entre li
gante y matriz elimina algunos impedimentos
estricos que pueden ocurrir cuando aqul se
une directam ente a la matriz insoluble, espe
cialmente si son sustancias polianinicas.
Para la purificacin de protenas de mayor o
menor PM se usan Sepharosas con distinto gra
do de cross-lnking o entrecruzamiento.

4.2.3. Columnas de afinidad preparadas

con anticuerpos activados
Los anticuerpos purificados pueden ser acti
vados por tratamiento con reactivos bifuncionales, con uno de los grupos unido al anticuer
po y el otro libre para unirse a la matriz insoluble. Los reactivos comnmente usados para la
unin indirecta son: carbodiimidas solubles en
agua, agentes condensantes usados para la sn
tesis de pptidos (como la N-etoxicarbonil-2etoxi-1,2- dihidroquinolina), glutaraldehdo o
periodato. Luego de la activacin pueden ser
unidos a las distintas matrices insolubles. Las
protenas activadas con carbodiimidas o agen
tes condensantes se unirn a cido carboxlico,
mientras que las activadas con glutaraldehdo o
periodato se unirn a aminas.
La principal ventaja que ofrece esta metodo
loga es que permite la eleccin de una amplia
variedad de geles con diferentes espaciadores,
coinbinaciones que pueden ser importantes o
esenciales para purificaciones especficas. La
nica excepcin son los anticuerpos activados
con periodato.
4.2.4. Cromatografa de afinidad
con lectinas
La utilizacin de lectinas como reactivos p a
ra la purificacin de fracciones de glucoprotenas o para la caracterizacin de los azcares
terminales de distintas sustancias hidrocarbonadas comenz a popularizarse a principios de
la dcada del 80. Las lectinas son protenas
provenientes de plantas, aunque existen ejem
plos de lectinas provenientes de otras fuentes,
que tienen la caracterstica de unirse con distin
ta afinidad a determinadas secuencias de hidra
tos de carbono, ms especficamente a los az
cares terminales. El grado de afinidad vara se
gn el tipo de unin entre los monosacridos,
pero se puede decir que en general la afinidad
es alta para su secuencia especfica de hidrato
de carbono. La desorcin de las lectinas se rea
liza siempre por competencia con el azcar es
pecfico y, como el volumen requerido para la
desorcin es pequeo, ocurre una concentra
cin de la glucoprotena que se quiere purifi
car. Se debe tener en cuenta, sin embargo, que
la cromatografa de afinidad con lectinas rara
mente es suficiente para la purificacin de una
g lu co p ro ten a determ in ad a, y que debe ser
acompaada de procesos previos de enriqueci
miento.
Lectinas con diferente afinidad pueden ad
quirirse insolubilizadas por unin a Sepharosa
y conjugadas a enziinas, para ser utilizadas pa
ra cromatografa de afinidad o para deteccin
de azcares terminales.

Mtodos cromatogrficos de fase lquido-slido

887

Cuadro 41-13. Algunos reactivos de elucin utilizados en cromatografa de afinidad

Reactivo

Soluciones sugeridas

100 m M trietilam ina, pH 11,5

100 m M fosfato cido, pH 12,5
Bajo pH
100 m M glicina, pH 2,5
100 m M glicina pH 1,8
5 M LiC 1, 10 mM fosfato pH 7,2
A lta cc de sal
3,5 M gCl^ 10 m M fosfato pH 7,2
D etergen 1:es i 1% SDS
1% D O C
nicos
A gentes diso 2 M urea
8 M urea
ciantes
2 m guanidina
A gentes caotr- 3 M tiocianato
picos
Solventes o rg 10 % dioxano
nicos
50% etilenglicol, pH 11,5
50% etilenglicol, pH 8,0
A gua
A lto pH

Solucin de Lavado
10 m M fosfato,
10 m M fosfato,
10 m M fosfato,
10 m M fosfato,
10 m M fosfato,
10 m M fosfato,
solucin neutra
solucin neutra
solucin neutra
solucin neutra
solucin neutra
solucin neutra
solucin
solucin
solucin
solucin

4.3. Solventes
El solvente a ser utilizado para la elucin de
la protena fijada a una colum na de afinidad
depender del sistema empleado. En el cuadro
41-13 se muestran algunos de los solventes re
comendados.
4.4. M etodologa
4.4.1. Obtencin de inmunoadsorbentes
po r insolubilizacin de protenas
Un mtodo muy utilizado es la polimeriza
cin de protenas con glutaraldehdo, la cual se
facilita trabajando a pH prximo al punto isoe
lctrico de la protena. Para albtjminas es reco
mendable el buffer aceto/actico 0,2 M, pH 5,0
y para gamaglobulinas, buffer de fosfato 0,2 M,
pH 7,0.
Para la polimerizacin, colocar en un vaso
de precipitacin los mililitros de protena a pro
cesar (solucin de 40 mg/ml en el buffer co
rrespondiente). Aadir glutaraldehdo al 2,5%
en el mismo buffer con agitacin constante, en
un volumen igual al 20% de la solucin protei
ca. Dejar a 4C durante 24 horas hasta comple
tar la gelificacin. Formado el gel, se rom pe
con un homogeneizador de tejidos, se lo lava
varias veces con solucin salina, con buffer de
disociacin, y finalmente con la solucin en la
que se solubilizar el producto a adsorber.
Para preparar las columnas de adsorcin y
con el objeto de evitar el empaste, es conve
niente m ezclar el inm unoadsorbente con una
pequea cantidad de Sephadex G-25, polvo de
vidrio u otro material inerte. La adsorcin pue
de hacerse tambin por agitacin en un vaso de

neutra
neutra
neutra
neutra

pH
pH
pH
pH
pH
pH

8,-0
8,0

6,8
6,8
7,2
7,2

Solucin
de recoleccin
1/20 vol IM
1/20 vol IM
1/20 vol IM
1/20 vol IM
N inguno
N inguno
N inguno
N inguno
N inguno
Ninguno
N inguno
N inguno
N inguno
N inguno
N inguno
N inguno

fosfato
fosfato
fosfato
fosfato

pH
pH
pH
pFI

R eu tiliza ci n

6,8 F recuente
6,8 O casional
8,0 Frecuente
8,0 O casional
F recuente
F recuente
No
A lguna
O casional
No
A lguna
A lguna
F recuente
F recuente
F recuente
F recuente

precipitados, al igual que una cromatografa de

intercambio inico.
Teniendo en cuenta que durante la polim eri
zacin slo quedan expuestos aproxiinadamente un 10% de los determinantes antignicos de
la protena, cuando se hagan clculos de n ece
sidades de antgeno para una determinada can
tidad de anticuerpos a adsorber, stas deben
ser 10 veces superiores a las correspondientes
a la zona de eciuivalencia determinada por cu r
va de precipitacin. Como en medios lquidos
para la mayora de las protenas antignicas de
pesos moleculares 50-200 kD, la relacin p ti
ma mg Ac/mg Ag es aproximadamente 10, si
estn polimerizadas, dicha relacin no debe ser
superior a 1.
Las protenas p o lim erizadas pueden fija r
grupos qumicos, como dinitrobenceno (DNP),
sulfanil-azo, p-aminobenzoico, etc., y adquirir
especificidad para ellos.
Los inmunoadsorbentes preparados con p ro
tenas polimerizadas, previa desecacin por liofilizacin y pulverizacin por trituracin en
mortero de vidrio, pueden conservarse en reci
piente cerrado, a 4C. Antes de su uso, deben
humectarse convenientemente.
4.4.2. Unin del anticuerpo especfico
a matrices de protena A en form a directa
Esta tcnica puede ser em pleada para unir
anticuerpos monoclonales murinos de las sub
clases IgG2a, IgG2b e IgG3 y anticuerpos p o li
clonales de ratn, conejo, humano, caballo, bu
rro, cerdo, cobayo, perro o vaca.
1.
Unin del anticuerpo a la protena A. Los
anticuerpos con alta afinidad por la protena A

888

Mtodos inmunoqumicos

pueden ser unidos desde suero, sobrenadante

de cultivo, ascitis o soluciones purificadas. Si
es fundamental conocer la concentraci(5n exac
ta de anticuerpo unido, ste debe ser purificado
previo a su uso. Unir 2 mg de anticuerpo por
ml de gel humectado. Si se utilizan anticuerpos
con baja afinidad, utilizar concentraciones ma
yores. Mezclar la solucin de anticuerpo con el
gel en un vaso de precipitado con agitacin
suave durante una hora a temperatura ambien
te. No utilizar una columna en este paso.
2. Lavar el gel dos veces con 10 volmenes
de borato de sodio 0,2 M pH 9,0 por centrifu
gacin a 3000g durante 5 minutos.
3. Resuspender el gel en 10 volmenes del
mismo bujfer de lavado. Guardar el equivalente
a 10 (xl de gel. Agregar DMP (dimetilpimelimi
dato) en droga slida para llevar a una concen
tracin final de 20 mM (el pH de la solucin de
reaccin debe ser mayor de 8,3).
4. Incubar durante 30 minutos a temperatura
ambiente en un agitador. Guardar el equivalen
te a 10 |J,1 de gel.
5. La reaccin se detiene por lavado del gel
en etanolamina 0,2 M pH 8,0. Incubar durante
dos horas a temperatura ambiente con agitacin
suave en el mismo buffer.
6. Luego del lavado final resuspender el gel
en buffer fosfato/salino adicionado de 0,01%
de mertiolate o azida sdica.
7. C ontrolar la eficiencia de la unin por
SDS-PAGE al 10% en condiciones reductoras,
hirviendo las muestras reservadas en su m o
mento en buffer muestra. Correr el equivalente
de Ifil de la muestra tomada en el punto 3 y 9
jj,l de la muestra tomada en el punto 4.

1. Unir el anticuerpo con especificidad antiinm unoglobulina al gel. Si los anticuerpos a

unir no fueron purificados previamente, saturar
el gel de p ro ten a A (aproxim adam ente 20
mg/ml). Si el anticuerpo a unir fue previamente
purificado por afinidad, emplear 2 mg/ml.
2. Agregar el anticuerpo especfico en exce
so, ya que la recuperacin final del mismo esta
r dada por la cantidad de anticuerpo anti-inmunoglobulina que se haya unido en el primer
paso. Mezclar en un vaso de precipitados e in
cubar durante una hora a temperatura ambiente
con agitacin suave. Este paso puede realizarse
en columna, ya que se trabaja en exceso de an
ticuerpo.
Los siguientes pasos son iguales a los ya in
dicados anteriormente (2 a 7) para la unin di
recta del anticuerpo.
4.4.4. Activacin de Sepharosa CL- 4B
con CNBr

Precaucin: sta tcnica debe ser realizada

bajo campana con extractor de aire y en un am
biente bien ventilado, ya que el CNBr es extre
madamente txico.
Lavar 30 ml de Sepharosa 4B con agua des
tilada y resuspenderla hasta un volumen final
de 50 ml. Enfriar en bao de hielo y bajo cam
pana con extractor aadir un volumen igual,
e n fria d o , de C N B r en agu a d e s tila d a (50
mg/ml). Mantener el pH a 11-11,5 por aadido
de NaOH 2N; controlando perm anentem ente
con pH-metro. La reaccin se ha completado
cuando el pH se mantiene constante sin aadi
do de nuevas cantidades de lcali. Las partcu
Si el anticuerpo que se desea unir es de la las de Sepharosa activada se lavan con agua
subclase IgG, de ratn, se deben observar las destilada fra, usando un filtro de vidrio poroso,
siguientes modificaciones:
y luego con buffer fro de carbonato/bicarbona
to o borato 0,1 M pH 8,3, conteniendo NaCl
1.
Ajustar el pH de la solucin de anticuer 0,5 M.
po a pH 9,0. Medir el volumen y agregar ClNa
para ajustar la concentracin a 3 M. Controlar 4.4.5. Fijacin de ligante a Sepharosa
el pH y volver a ajustar de ser necesario. Unir 4B activada con CNBr
el anticuerpo al gel. En estas condiciones, la
protena A unir aproximadamente 2-5 mg de
Este gel puede ser adquirido ya activado, o
anticuerpo por ml d gel.
activarse segn se indic ms arriba.
Los pasos siguientes son iguales a los ya in
dicados para otros isotipos, con la salvedad de
1. Separar el gel de Sepharosa activada por
que el buffer de lavado del punto 2 consiste en centrifugacin y aadirle un volumen igual de
borato de sodio 50 mM, NaCl 3 M pH 9,0.
b u ffe r c a rb o n a to /b ic a rb o n a to 0 , 1M pH
8,3/NaCl 0,5 M conteniendo 5-10 mg de pro
tena a fijar por cada 1 ml de gel. Mezclar por
4.4.3. Unin del anticuerpo especfico
agitacin en un rotor durante 2 horas a tempe
mediante el empleo de un anticuerpo
ratura am biente o durante toda una noche a
intermediario
4C. No debe usarse agitador magntico.
Anticuerpos de cualquier fuente (suero, asci
2. Centrifugar, lavar con el mismo buffer y
tis, sobrenadante de cultivo, etc) pueden ser luego con glicina 0,2 M, pH 8,5 durante 2 ho
unidos mediante esta metodologa.
ras, con el objeto de bloquear los grupos acti

Mtodos cromatogrficos de fase lquido-slido

889

vos residuales. Otra alternativa es suspender el aconsejable toda una noche en la refrigeradora
o a temperatura ambiente.
gel durante dos horas en buffer de Tris pH 8,0.
El producto final deber ser lavado alter
3.
Centrifugar, lavar con el buffer de fija 3.
cin, luego con buffer acetato 0,1 M pH 4, con nativamente con buffer de pH alto y bajo, como
teniendo NaCl 0,5 M, seguido de buffer de fija se d escrib i en Sepharosa 4B activada con
cin. El conjugado de Sepharosa/pmtena- est CNBr. Si para la fijacin se us m ezcla de
agua y solvente orgnico, sta debe emplearse
en condiciones de ser usado para la adsorcin.
para el lavado final del producto. Lavar luego
Puede conservrselo a 4C.
Mediante ensayos piloto, utilizando alcuotas con agua destilada y finalmente con el buffer a
de Sepharosa 4B activada con CNBr y cantida usar en la cromatografa de afinidad.
des variables de protena, puede establecerse
Para la conservacin del inm unoadsorbente
cul es la concentracin ptim a de sta para
conseguir el mximo de fijacin en las condicio es recomendable un buffer neutro o de pH lige
nes ya indicadas. Determinando la concentra ramente cido, adicionado de NaCl IM, y una
cin proteica de los sobrenadantes por lectura de tem peratura de 4C. C onviene incorporar un
la DO a 280 nm, en comparacin con los valo agente bacteriosttico.
res de la solucin proteica inicial, pueden calcu
larse los correspondientes porcentajes de unin.
4.4.7. Fijacin y elucin de anticuerpos
en la cromatografa de afinidad
4.4.6. Fijacin de ligantes a AH-Sepharosa
La fijacin de los anticuerpos puede hacerse:
4B y CH-Sepharosa 4B
a) por mezcla en recipiente adecuado del inm u
La cantidad requerida de polvo de AH-Sep- noadsorbente con el antisuero, agitando con
harosa 4B o CH-Sepharosa 4B se mezcla con agitador magntico durante dos horas a 4C, o
NaCl 0,5M y agita durante 15 minutos, filtran b) haciendo pasar el suero por una colum na
do luego por medio de filtro de vidrio poroso. crom atogrfiea arm ada con el inm unoadsor
Se continan los lavados con la misma solu bente. Antes de la fijacin del ligando, el inm u
cin (aproximadamente 200 mi por gramo de noadsorbente debe ser estabilizado con buffer
material seco) y luego con agua destilada ajus de fosfatos 0,1M pH7, NaCl 0,25-0,5 M, ad i
tada a pH 4,5 (aproximadamente 50 mi por gra cionado de Tween 20 al 1% para reducir las ad
sorciones protena-protena no especficas.
mo de Sepharosa).
Conviene diluir el producto a cromatografiar
La carbodiim ina a usar en la fijacin debe
ser soluble en agua, siendo una de las ms em en partes iguales con un buffer similar al ante
pleadas el clorihidrato de N -etil-N -(3-dimeti- rior pero de doble concentracin.
laminopropil) carbodiimina. Para la reaccin,
U na vez term inada la adsorcin el in m u
es aconsejable carbodiimina a la concentracin noadsorbente debe ser lavado con solucin sa
final de 10 mg por mi de gel.
lina fosfatada hasta que los sobrenadantes o
La fijacin del ligante a la matriz se efecta eluidos no den lecturas de DO a 280 nm, con el
en agua destilada ajustada a pH 4,5-6. Si el li objeto de asegurar la eliminacin de cualquier
gante no es soluble en agua, puede ser aadido protena no fijada especficamente.
La elucin de los anticuerpos puede hacerse
dioxano purificado o etilenglicol hasta concen
tracin final del 50% a la solucin de fijacin. con buffer glicina-HCl 0,1M pH 2,9, solucio
En estos casos es conveniente controlar el pH nes de NaCl 2M o NaSCN 4M, o soluciones de
con papel indicador pues los solventes orgni los correspondientes haptenos a concentracin
cos pueden daar los electrodos.
0,1M pH 7,4. Ein todos los casos las soluciones
de anticuerpos eluidas deben ser dialisadas en
1. Disolver el ligante en la solucin de fija solucin salina fosfatada, efectuando num ero
cin controlando el pH. La concentracin de sos recambios. El producto de dilisis debe ser
aqul debe ser en exceso respecto de la concen centrifugado a lO.OOOg para eliminar la p rote
tracin de grupos reactivos de la matriz. Aadir na desnaturalizada y luego ha de ser co n v e
la solucin de ligante al gel (una relacin lqui- nientemente concentrado.
do/gel de 2:1 permite una adecuada agitacin)
ajustando el pH entre 4,5 y 6.
5. CROMATOGRAFA
2. Aadir la carbodiimida en polvo, por p e POR INTERACCIN HIDROFBICA
queas cantidades, o disuelta en agua a pH 4,5, Y EN FASE REVERSA
mezclando por agitacin. El pH de la mezcla
reactiva decrece durante la primera hora, sien 5.1. Fundamentos
do necesario ajustarlo por el aadido de peque
Las interacciones hidrofbicas son un fen
as cantidades de solucin diluida de NaOH.
El tiempo de reaccin depende del sistema. Es meno de gran significancia biolgica siendo

890

Mtodos inmunoqumicos

una de las principales fuerzas que estabilizan la

estructura tridimensional de las protenas. Las
interacciones de este tipo participan en el man
tenimiento de la estructura de la bicapa lipdica
en las membranas biolgicas y en las uniones
antgeno-anticuerpo y enzima-sustrato.
La hidrofobicidad puede definirse como la
repulsin entre un com puesto no polar y un
medio polar como podra ser el agua. Las inte
racciones hidrofbicas no constituyen uniones
de grupos hidrofbicos entre s, sino que estas
interacciones son forzadas sobre compuestos
no polares por el medio polar que los rodea.
Podemos decir, entonces, que son las molcu
las del agua las que fuerzan las interacciones
hidrofbicas entre molculas no polares disuel
tas en una solucin acuosa. Si varisem os la
composicin de la solucin acuosa disolviendo
en sta sales o solventes orgnicos, las interac
ciones hidrofbicas se veran afectadas de algln modo. Las sales, al disolverse en agua,
producen una disminucin de la capa de solvatacin que rodea a las molculas en solucin;
de esta forma, se produce una disminucin de
las interacciones hidroflicas lo que favorece la
interaccin hidrofbica. Los solventes orgni
cos producen una modificacin de la constante
dielctrica del medio acuoso, lo que tambin
llevar a una disminucin de la capa de solvataci n acuosa de las m olculas siendo sta
reemplazada por molculas del solvente org
nico.
Debemos tener en cuenta que todas las biomolculas tienen un cierto grado de carcter hidrofbico. Este grado de hidrofobicidad depen
de de la secuencia aminoacdica primaria de la
protena o pptido; ciertos aminocidos son hi

drofbicos como el triptfano y la fenilalanina

entre otros. Por otra parte, las interacciones hi
drofbicas estabilizan las estructuras terciaria y
cuaternaria de las protenas existiendo muchos
aminocidos hidrofbicos expuestos en la su
perficie lo que le dar el grado de hidrofobici
dad a una protena en su estado nativo. La ca
pacidad de una protena de producir una inte
raccin hidrofbica en el estado nativo depen
de de los sitios hidrofbicos en su superficie; y
estos sitios hidrofbicos dependen de una es
tructura terciaria y cuaternaria intacta. Esto de
be ser distinguido de la hidrofobicidad intrnse
ca de la protena la cual depende solamente de
su estructura primaria. En conclusin, cuando
se use la hidrofobicidad como base para la se
paracin de protenas, se deben tener en cuenta
los caracteres de hidrofobicidad de la protena
que surgen de la estructura terciaria y cuaterna
ria y aquellos que surgen de su estructura pri
maria.
5.2. C ro m ato g rafa p o r interaccin
hidrofbica (H IC)
Este mtodo cromatogrfico permite la sepa
racin de biomolculas aprovechando su dife
rente grado de hidrofobicidad. Es til para el
fraccionamiento de protenas solubles en agua,
as como de protenas lipoflicas, y ofrece una
opcin para la separacin de AcMo, suponien
do que los mismos sean estables a altas con
centraciones salinas. Todas las inmunoglobuli
nas presentan un cierto grado de hidrofobicidad
que vara dentro de las distintas subclases.
Esta tcnica hace uso de la presencia de si
tios hidrofbicos expuestos en la superficie de

l:-:n:-3cc:on n.crofoica -orrjstie'.T

Matriz

OH

: .-....... ^

Sitio
hidrofbieo

OH

OH

F ig. 41-9. Interaccin hidrofbica verdadera. L a

protena Pj , con un sitio Irdrofbico expuesto, se
u n ir al lig an d o liid ro f b ic o , m ien tra s q ue la
protena P , sin sitio hidrofbico expuesto, no
podr hacerlo.

Mtodos cromatogrficos de fase lquido-slido

las protenas, que resultan en diferentes grados
de interaccin hidrofbica con una matriz no
cargada que contiene grupos hidrofbicos co
mo alquilos, fenilos o aminoalquilos.
La cromatografa por interaccin hidrofbica
puede dividirse en dos grupos: la cromatogra
fa hidrofbica verdadera y la cromatografa
hidrofbica anfiflica . La prim era categora
contiene aquellas separaciones que dependen
slo de la presencia de un residuo hidrofbico
inm ovilizado y la segunda, aquellos mtodos
separativos que dependen tanto un residuo hi
drofbico como de uno hidroflico (general
mente inico) inmovilizados en una matriz.
En el caso de la crom atografa hidrofbica
verdadera, si se aplica una protena (P) que no
expone grupos hidrofbicos en su superficie a
una matriz con grupos alquilos, no se producir
ningn tipo de unin, mientras que una prote
na (Pj), con regiones hidrofbicas expuestas, s
se unir a ella (fig. 41-9). No obstante, como
las interacciones hidrofbicas son dbiles, tal
protena se unira muy dbilmente o aun sera
slo retardada en Ja crom atografa. Como la
unin hidrofbica se incrementa con el aumen
to de la fuerza inica, la unin de esta protena
al sustituyente hidrofbico podr aumentarse
optimizando la concentracin salina del solven
te cromatogrfico. A partir de ello, la elucin

de las protenas se har disminuyendo la fuerza

inica del bujfer de elucin.
Por otra parte, protenas con su sitio hidrof
bico rodeado por cargas negativas se unirn d
bilmente a grupos alquilos pero podrn unirse
fuertem ente a grupos am inoalquilos pues se
vern envueltas fuerzas inicas e hidrofbicas
en el proceso de adsorcin producindose una
interaccin compuesta . En presencia de altas
concentraciones salinas, la protena se unir
fuertem ente como resultado de la interaccin
hidrofbica; pero a baja fuerza inica, donde la
interaccin hidrofbica es dbil, la adsorcin
ser debido a la atraccin inica entre la p rote
na y la matriz cargada. Este es un ejemplo de
cromatografa hidrofbica anfiflica (vase fig.
41-10). En este caso, la elucin de la protena
ser difcil a menos que se haga a valores de
pH muy altos (donde la protena no ser esta
ble) o bien por elucin con una solucin acuosa
de alta fuerza inica y con una polaridad dism i
nuida con un solvente orgnico.
Un tercer tipo de interaccin hidrofbica es
la llamda cromatografa charge transfer o n 7t en )a cual el ligando alquil-hidrofbico es
reemplazado por un ligando aromtico, prefe
rentemente conteniendo un sustituyente atractor de electrones como la fenil-agarosa o la dinitrofenil-agarosa.

Matriz

- O - C - N - C 3H ,

N aC l + EtiengB osI

C1
Matriz
F ig. 41-10. Interaccin h id ro f
bica anfiflica. U na p ro ten a con
su sitio hidrofbico ro d ead o por
cargas negativas se u n ir fu erte
m ente a una m atriz sustituida con
un g rupo a m in o alq u iio . L a e lu
cin se h a r con una m e zcla de
una solucin acuosa de alta fuer
za inica con un solvente orgni
co que d ism inuya la polaridad del
solvente crom atogrfico.

891

NH,
- O - C - N - C 3H ,
H

Na

892

Mtodos inmunoqumicos

5.2.1. Matrices
Afortunadamente, a pesar de que los meca
nismos de las interacciones hidrofbicas son
complicados, las tcnicas cromatogrficas ba
sadas en las interacciones hidrofbicas son sen
cillas.
Las matrices utilizadas en la cromatografa
convencional (sin presin externa) son geles
hidroflicos como la agarosa o la Sepharosa
sustituidos con grupos no polares de cadena
corta como alquilos, aminoalquilos o fenilos.
En los sistemas de alta resolucin como HPLC
se utilizan matrices de slice sustituidas con
grupos fenilos o alquilos; en cambio, en los
sistem as tam bin de alta re so lu c i n com o
FPLC se utilizan matrices de Phenyl o AlkylSuperosa.
Ante la eleccin de un gel para la separacin
de una protena no caracterizada, la mejor op
cin para comenzar es generalmente una resina
fenil-sustituida, pues las protenas fuertemente
hidrofbicas no sern fcilmente eluidas de re
sinas altam ente hidrofbicas como las octilsustituidas. La hidrofobicidad del ligando fenilo es intermedia entre grupos n-butilo y n-pentilo y se unir a aminocidos aromticos a tra
vs de interacciones ti - t. Resinas octil-sustituidas como la octyl-Sepharosa CL-4B puede
ser usada para protenas dbilm ente hidrof
bicas.
La unin de las protenas al gel est influen
ciada por:

fuerza inica, para disminuir la interaccin i

nica, y con su polaridad disminuida mediante
un solvente orgnico para desfavorecer la inte
raccin hidrofbica.
La mayora de las estrategias de elucin son
no desnaturalizantes. El uso de por ejem plo
solventes que dism inuyen la polaridad es, a
menudo, el ltimo recurso usado para la elu
cin de protenas unidas muy fuertemente pues
este mtodo frecuentemente es desnaturalizante
de protenas.

5.3. Cromatografa en fase reversa (RFC)

La RPC es otra de las tcnicas cromatogrfi
cas basadas en las interacciones hidrofbicas
entre una matriz sustituida y la molcula a se
parar. Su aplicacin en sistemas de alta resolu
cin como HPLC es muy importante pues per
mite el estudio analtico de mezclas proteicas.
No ocurre lo mismo en sistemas de FPLC don
de se busca una alta recuperacin de la activi
dad biolgica que no puede lograrse con la uti
lizacin de la RPC (vase Sistemas de alta re
solucin).
La cromatografa en fase reversa o inversa
surge como mtodo inverso a la cromatografa
en fase normal. En un principio, la diferencia
cin entre los mtodos fue hecho en base a la
polaridad de la fase mvil. Los sistemas de fase
normal son aquellos en los cuales la matriz es
slice y la fase mvil un solvente no polar co
mo el hexano (vase Sistemas de HPLC en fase
normal). La RPC utiliza una matriz hidrofbica
de slice sustituida usualmente con un grupo
funcional hidrofbico y una fase mvil ms po
lar que la fase estacionaria, frecuentem ente
parcial o totalmente acuosa. Las sustancias po
lares corren en la fase mvil y eluyen primero.
Conforme aumente el carcter hidrofbico de
los compuestos, la retencin ser mayor.

1. La hidrofobicidad del ligando: como vi

mos anteriormente la phenyl-Sepharosa CL-4B
es menos hidrofbica que la octyl-Sepharosa
CL-4B.
2. La fuerza inica del buffer: aquellas sales
que producen precipitacin salina {salting out)
como el S 0 ^(NH^)2 favorecen la unin de las
protenas a los ligandos hidrofbicos. La unin
a octyl- y phenyl-Sepharosa CL-4B es prctica
m ente im posible a m enos que se usen altas
concentraciones de sales. La concentracin sa
lina debe ser ligeramente inferior a la usada pa
ra el salting out.
3. Temperatura; se ha notado que la fuerza
de unin hidrofbica se reduce en un 20-30%
cuando la tem peratura dism inuye de 20C a
4C.

5.3.1. Matrices

5.2.2. Solventes cromatogrficos

5.3.2. Solventes cromatogrficos

A partir de lo descrito anteriormente, la elu

cin de la protena de la matriz podr hacerse
disminuyendo la concentracin de iones en el
buffer (gradiente negativo), dism inuyendo la
temperatura, o bien en el caso de una interac
cin anfiflica, utilizando un solvente de alta

La elucin de las molculas de la fase esta

cionaria se realiza con una mezcla agua/solven
te orgnico. Una buena selectividad en la RPC
se alcanza mediante la manipulacin de la fase
mvil. En la RPC de protenas el solvente en
que se siembra la m uestra consiste en una solu

Las matrices utilizadas como relleno en co

lumnas para HPLC son derivados sustituidos
de slice (grupos alquilsilanos). El largo de ca
dena ms efectivo para protenas es de C^ (4
carbonos) a Cg, mientras que las cadenas ms
largas (C^ a C,g) son generalmente usadas para
pptidos pequeos.

Mtodos cromatogrficos de fase lquido-slido

893

cin acuosa cida, mientras que el solvente de

elucin lo constituye un solvente orgnico.
El componente acuoso cido de la fase mvil
contribuye a la retencin mediante; (1) su in
fluencia sobre el estado inico de la protena,
(2) el control de la ionizacin de los grupos silanol de la superficie del soporte, (3) la forma
cin de pares inicos entre los residuos de su
perficie de la protena y el cido y (4) su in
fluencia sobre la desnaturalizacin de la prote
na. Por lo tanto, el pH de la fase mvil regula
los estados de ionizacin de la protena y de los
grupos silanol de superficie. Ciertos cidos hi
d ro f b ico s com o el cido triflu o ro a c tic o
(TEA) aumentan la hidrofobicidad de las pro
tenas mediante la formacin de pares inicos y
de esta forma se ve favorecida la retencin de
la misma.
Los cidos son usados en la fase mvil para
incrementar tanto la recuperacin como la reso
lucin de muchas protenas. El TEA es el cido
ms popularm ente usado debido a que es un
buen agente solubilizante; no obstante, la sepa
racin de protenas de membrana u otras pro
tenas hidrofbicas requieren la utilizacin de
otros cidos como el cido frmico en concen
traciones entre 5 a 80%.
Los solventes ms usados como componente
orgnico de la fase mvil son acetonitrilo, m e
tanol, etanol y propanol. La eleccin del com
ponente orgnico se basa en la solubilidad .de
los solutos y en la viscosidad del solvente. D u
rante el proceso de elucin la solubilidad de la
protena puede convertirse en un problema si se
produce la precipitacin de la misma; en estos
casos, es en general el 2-propanol el solvente de
eleccin. La importancia de la viscosidad de la
fase mvil aumenta cuando se trabaja a altas
presiones, pues el lmite de presin permitido
podra ser excedido con una aumento de la vis
cosidad del solvente cromatogrfico. El m eta
nol y el acetonitrilo son solventes populares
porque tienen baja viscosidad y son fciles de
conseguir con excelente pureza. Los solventes
de fuerza intermedia entre estos solventes y el
agua se obtienen normalmente preparando m ez
clas. En este tipo de cromatografa los gradien
tes se generan con la disminucin continua en
la polaridad del eluyente durante la separacin,
por ejemplo aumentando gradualmente el con
tenido de solvente orgnico en las m ezclas
(H 2 0 -TFA)/Metanol o (H 2 0 -TFA)/Acetonitrilo.

interacciones entre molculas hidrofbicas de

una muestra y un grupo hidrofbico insoluble e
inm ovilizado (matriz). Como vimos anterior
mente, estas tcnicas crom atogrficas surgen
con la aplicacin de sistemas de alta resolucin
como HPLC y FPLC (vase ms adelante). En
forma general la RPC es aplicada en HPLC y la
HIC es u sad a co m n m en te en sistem as de
FPLC.
Es de utilidad conocer las diferencias bsicas
entre HIC y RPC. En la interaccin hidrofbica
la m atriz es hidroflica y est sustituida con
grupos no polares de cadena corta como fenilos
u octilos. La fase mvil es usualmente una so
lucin acuosa salina. En cromatografa en fase
reversa la matriz es slice sustituida con largas
cadena de n-alquilos, comtnmente Cg (octilsilil) o C,g (octadecilsilil). La m atriz es m enos
polar que la fase mvil la cual generalm ente
est constituida por una mezcla de agua y un
modificador orgnico menos polar. Las separa
ciones en HIC son usualmente hechas en solu
ciones acuosas salinas, las cuales brindan un
medio no desnaturalizante. Las separaciones en
cromatografa en fase reversa son generalmente
realizadas en mezclas de agua y solventes org
nicos, los cuales generan a menudo condicio
nes desnaturalizantes.
Estos dos mtodos explotan las diferentes
fuentes de hidrofobicidad de las protenas. La
HIC depende de los grupos hidrofbicos de su
perficie pues se lleva acabo en condiciones que
permiten mantener la integridad de la molcula
proteica. La RPC depende de la hidrofobicidad
intrnseca de la protena y se realiza bajo co n
diciones que hacen que esta exponga casi todos
los grupos hidrofbicos hacia la matriz.

5.4. Diferencias entre Cromatografa

por interaccin hidrofbica
y Cromatografa en fase reversa

La crom atografa lquida de alta p resi n ,

identificada comnmente con la sigla en ingls
HPLC (H igh Presure or Perform ance L iq u id
Chromatography) es uno de los recursos anal
ticos ms apreciados y difundidos para la p u ri
ficacin y caracterizacin de todo tipo de su s
tancias. Las ventajas principales son la v eloci

La cromatografa por interaccin hidrofbica

(HIC) y la cromatografa en fase reversa (RPC)
son mtodos separativos basados ambos en las

6 . CROMATOGRAFAS LQUIDAS
DE ALTA RESOLUCIN
Con el avance tecnolgico, las tcnicas cro
m atogrficas han sido perfeccionadas, tan to
desde el punto de vista de la eficiencia del m
todo como en la rapidez. Dependiendo del tipo
de soluto que se quiera separar y/o caracterizar,
se pueden diferenciar dos tipos de cromatogra
fas lquidas de alta resolucin: HPLC y FPLC.

6.1. Cromatografa lquida

de alta presin: HPLC

894

Mtodos inmunoqumicos

Bombas de
aita presin

Detector

Registrador

Controlador de gradiente

F ig. 41-11. Esquem a bsico de un equipo de HPLC.

dad de anlisis, alta sensibilidad y resolucin,

resultados cuantitativos y factibilidad de auto
matizacin. En general la EIPLC es utilizada
para la caracterizacin y/o separacin de solu
tos, donde el solvente usado y la alta presin
del equipo no altera la conformacin tridimen
sional y por ende la actividad biolgica de la
molcula en estudio. Para la separacin de macromolculas, donde las condiciones operativas
pueden modificar la conformacin de la mol
cula y por lo tanto la actividad biolgica de la
misma (anticuerpos, enzimas, citoquinas, etc),
es conveniente la utilizacin de la FPLC. Sin
embargo algunos mtodos de HPLC pueden ser
aplicados para este tipo de protenas sin el ries
go de desnaturalizacin de la molcula.
El principio general de la HPLC no difiere
del enunciado para la cromatografa convencio
nal en sus diferentes variantes. La muestra en
estudio se di.stribuye en dos fases, una estacio
naria y otra mvil, de modo tal que cada uno de
los componentes de una mezcla son selectiva
mente retenidos por la fase estacionaria. La di
ferencia principal de los sistemas de HPLC ra
dica en el empleo de columnas de dimetro re
ducido y rellenas de materiales pulverulentos
especiales y de un instrumental ms sofisticado
para su operacin. En la dcada del 60 fue in
troducido el prim er materia] de em paqueta
miento: era un gel de carbohidratos de partcu
las inferiores a 50 |j,m.
Los avances en la instrumentacin, la snte
sis de nuevos materiales y tecnologa de empa
quetamiento, que se pvodujern durante la d
cada del 70 permitieron la preparacin de co
lumnas con un gel de menor dimetro de part
cula (5-10 |j,m), lo que permiti avanzar en la

resolucin y en la rapidez. R esum iendo: la

HPLC no es ms que el resultado del avance
tecnolgico, tanto en la teora operacional co
mo en la fabricacin de los sistemas cromatogrficos. Los sistemas de HPLC para la separa
cin de macromolculas biolgicas se diferen
cian fundamentalmente de la antigua cromato
grafa por tres motivos; a) Las partculas pue
den soportar presiones mucho ms elevadas, b)
Su tamao ha podido disminuirse ms de 10
veces, aumentando de esta manera la cintica
de adsorcin-desorcin, c) El tiempo de la co
rrida cromatogrfica ha disminuido entre 10 a
60 veces, debido a la alta presin que puede
aplicarse a estas columnas. De hecho, el lqui
do puede ser forzado a travs de la columna a
una velocidad y presin controladas por medio
de bombas de alta presin, la muestra es intro
ducida en una estrecha tubuladura y mientras
que el sistema opera bajo presin, el efluente
de la columna puede ser monitoreado mediante
la aplicacin de espectrofotmetros de alta sen
sibilidad y finalmente recolectado; simultnea
mente un graficador representa el cromatograma (fig. 41-11).
6.1.1. Mtodos cromatogrficos utilizados
en H PLC
Los principios bsicos de los mtodos cro
matogrficos utilizados en HPLC son los mis
mos que para la cromatografa convencional, a
diferencia de algunas metodologas que se han
desarrollado para ser aplicadas en las cromato
grafas de alta resolucin, como ser la cromato
grafa de fase normal y cromatografa de fase
reversa.

Mtodos cromatogrficos de fase lquido-slido

La cromatografa de fase normal utiliza una
fase estacionaria polar (generalmente hidroflica) y una fese mvil menos polar. La cromato
grafa de fase reversa utiliza una fase estacio
naria con un enlace hidrofbico, generalmente
un grupo funcional octadecilo (C,g) u octilo
(Cjj) y una fase m vil polar, frecuentem ente
parcial o totalmente acuosa (vase en FPLC).
La cromatografa de pares de iones es otro
mtodo desarrollado en funcin de las tcnicas
erom atogrficas de alta resolucin. Su m eca
nismo exacto no ha sido establecido claramen
te. En primer lugar se postula que la molcula
del soluto forma un par inico con el contrac
cin de la fase mvil. Este par inico se reparte
dentro de la fase estacionaria lipoflica. El se
gundo mecanismo postulado es que el contrac
cin se reparte en la fase estacionaria, o es
cargado durante el empaquetado de la fase
reversa enlazada, con su grupo inico orientado
hacia la superficie. En base a estos postulados
puede ocurrir que: a) el material a cromatogra
fiar sea atrado por el hidrocarburo unido a la
matriz de manera similar a lo que ocurre en fa
se reversa o b) puede interaccionar a modo de
intercambio inico.
En el cuadro 41-14 se detallan los mtodos
utilizados en HPLC, sus caractersticas y las
columnas usadas en cada caso.

895

6.1.2. Instrum entacin del sistema HPLC

Para la obtencin de una efectiva resolucin
en la utilizacin de un mtodo cromatogrfico
por HPLC, es importante tener en cuenta los si
guientes parmetros;
1. En primer lugar se debe conocer el fu n
cionamiento cada uno de los componentes m s
importantes de un equipo de HPLC. En la figu
ra 41-11 se ha esquem atizado un equipo de
HPLC.
2. En base a las caractersticas del soluto
que se desea caracterizar y/o separar, es nece
saria una correcta seleccin de la colum na y
por ende del mtodo cromatogrfico y del sol
vente a utilizar.
3. Los problemas que pueden surgir durante
el desarrollo del mtodo seleccionado.
Un equipo de HPLC est compuesto por:
a. Sistem a de bombas. Como el fundam ento
de este mtodo es la aplicacin de altas p re
siones, el sistema de bombas es un com po
n ente v ital de to d o eq u ip o m oderno d e
HPLC. Los requisitos esenciales son los si
guientes: I) El material de las bombas debe
ser qumicamente resistente a toda fase m-

C uadro 41-14. Caractersticas ce los mtodos p o r HPLC

M todo/D escripcinJC olum na
F ase N orm al
Fase m vil: m ezclas de solventes orgnicos
Colum nas: ciano, diol, am ino, slice

E jem p lo de la utilizacin del m todo

B uen m todo cuando fase reversa o pares d e iones son in efecti

vos. M todo de eleccin para m uestras hidroflicas que no se
disuelven bien en agui/ m ezclas orgnicas y p ara m ezclas d e
ism eros y para escala preparativa (con colum nas de slice)

Pares de iones
Fase m vil: agua/solventes orgnicos, un buffer co
mo control de pFI y un reactivo con un par de iones
Colum nas: C l 8 , C 8, ciano

B uen mtodo para com puestos inicos o ionizables, especial

m ente bases o cationes

F a se reversa
Fase m vil: agua/solventes orgnicos
Colum nas: C I 8, C 8, fenil, trim etilsilil, ciano

M todo de eleccin p ara com puestos no ionizados que se d isu el

ven en agUi/solventes orgnicos

C rom atografa de exclusin m olecular

Fase mvil: utiliza siem pre solventes acuosos
Colum nas: fase-diol sintticos
C rom atografa de in tercam b io in ico
Fase mvil: solventes acuosos con un buffer de iones
para control de pH.

Colum nas: intercam bio inico o catinico

C rom atografa de in teraccin hidrofbica'
Fase m vil: soluciones salinas
C olum nas: sim ilares a las de fase reversa pero mucho
m enos hidrofbicas

M todo de eleccin para separar m olculas de alto peso m o lecu

lar, com o protenas y polm eros. Se utiliza p ara calcular pesos
m oleculares
M todo de eleccin para separar m ezclas de protenas, cidos
nucleicos y com puestos relacionados

S e utiliza para separar mezclas de protenas

T odas las c o lu m n as a q u m e n c io n a d a s, excepto las de exclusin m o le c u la r son em p a q u e ta d a s con p artc u la s de slice a las que se le a c o p l
e esp a ciad o r c o rresp o n d ien te ,
^ P ara la .separacin d e p ro te n a s y de otras m o lcu la s b iolgicas, d o n d e la actividad b io l g ic a es fu n d a m e n tal, se re co m ien d an los m ism o s
m todos p ero a p lica d o s en F P L C .

896

Mtodos inmunoqumicos

vil utilizada. A lgunos equ ip o s antiguos de

H PLC tenan bom bas construidas con acero
inoxidable que podan ser atacadas por solven
tes altamente cidos. En la actualidad los mate
riales de eleccin son el titanio y plstico de al
ta resistencia. Los sistemas con bombas cons
truidas con estos materiales son generalmente
ms caros que los construidos con acero inoxi
dable, pero su vida media es mayor y los resul
tados ms confiables; por otra parte su mayor
duracin hace que el mayor costo sea justifica
do. II) El HPLC requiere generalmente el uso
de dos bombas, por tal motivo se debe tener en
cuenta las variaciones de presin en cada una
de ellas. Una variacin de presin de ms del
1% puede causar una diferencia de 12 segun
dos en el tiempo de retencin en una corrida de
20 minutos. III) Debido al pequeo dimetro
de las partculas de las columnas y la viscosi
dad de los solventes, las bombas deben produ
cir una presin de por lo menos de 400 atm.
Como puede observarse en la ecuacin.
ISOvLri (l-e)2/dp2e2
la presin {P^) requerida para forzar un lquido
a travs de la columna es funcin del flujo de
la fase mvil (v), del dimetro de las partculas
(dp), de la longitud de la colum na (L), de la
viscosidad de la fase mvil (ti), de la presin
inicial (Pg) y de la porosidad interparticular (e).
IV) Los solventes deben estar libres de conta
minantes que puedan absorber la longitud de
onda de trabajo, por lo tanto se debe a utilizar
so lv e n te s de alto g rad o de p u re z a (g rad o
HPLC). Por otra parte, pulsaciones de presin
en el envo del solvente pueden causar flujos
discontinuos a travs de la columna y detecto
res. Estas pulsaciones de presin tambin pue
den daar el material de empaque de la colum
na. V) Debido a que generalmente se trabaja
con gradiente de solventes y que la velocidad
de la fase mvil puede variar desde 10 |il/min

hasta 10 ml/min, se debe tener la precaucin de

realizar una buena mezcla de los solventes. Los
diferentes tipos de sistemas de bombas ms co
munes y sus caractersticas principales se deta
llan en el cuadro 41-15.
b - Amortiguador de los pulsos de presin.
El sistema de bombas que produce pulsos de
flujo discontinuo requiere algn tipo de amorti
guador de estos pulsos. Se conocen dos tipos
de amortiguadores de pulso. Uno de ellos in
corpora un tubo flexible sellado, dentro de un
contenedor con lquido comprimible. Cuando
se produce un pulso de flujo, ste es amortigua
do por el tubo que se expande y la energa es
absorbida por el medio. Otro sistema de amor
tiguacin de pulsos usa un tubo chato de acero
inoxidable de 1-3 m de largo que se expande
cuando recibe el pulso de presin. La desventa
ja de este ltimo es que proporciona un volu
men m uerto dem asiado grande y los pulsos
continuos pueden resq u eb rajar el m aterial.
Amortiguadores de pulso electrnicos son mu
cho ms efectivos, rindiendo un correcto flujo
continuo.
c - Sistema para la mezcla de los solventes.
La mayora de los mtodos para la separacin
de solutos, utiliza gradientes de diferentes sol
ventes. La funcin del mezclador es la mezcla
de estos solventes sin que se produzcan modifi
caciones en el gradiente. Se fabrican dos tipos
de mezcladores, uno dinmico y otro esttico.
El dinmico usa una barra magntica dentro de
un recipiente, donde se produce la mezcla por
agitacin m ecnica de ambos solventes. Este
mezclador es el ms verstil, pero tiene la des
ventaja de un volumen muerto de 1-3 mi dentro
del sistema de bombas. El mezclador esttico
consiste en un recipiente lleno de un material
inerte que simula una columna cromatogrfiea
de muy baja eficiencia, produciendo bandas an
chas de difusin, las que permiten la mezcla de
los solventes. En efecto, este mtodo de mez
clado se basa en la difusin del solvente. La

C uadro 41-15. Caractersticas generales de los sistemas de bombas

Tipo de bomlya

Ventajas

D esventajas

Jeringa

N o produce pulsaciones en el flujo

La com presin del lquido altera el flujo

U tiliza grandes volm enes

Pistn recproco

P erm ite un rpido cam bio de solvente.

B ueno para elucin con gradientes
Perm ite gran rango de flujo (0,1-10 m l/m in)

F alla del sellado de los pistones. Produce pulsaciones

en el flujo

D iafragm a

B ajos pulsos. B ueno p ara gradientes

continuos. Presin constante. M uy bajos
pulsos en el flujo. Pre.sin constairte,
Econtnico. Correcto rango de flujo
D urable

G ran volum en m uerto. N o eficiente para gradientes r

pidos. Costo elevado. Presin basal de la colum na,
viscosidad d e la fase m vil y tem peratura deben
m antenerse constantes. Lim itado sum inistro de sol
ventes. Trabaja a presiones no m ayores de 2000 psi.
Inconvenientes en eluciones con gradientes

Mtodos cromatogrficos de fase iquido-slido

ventaja del m ezclador esttico es que puede
m ezclar pequeos volmenes, pero solventes
altamente viscosos son pobremente mezclados.
d -D etectores. El avance tecnolgico del
HPLC se vio obstaculizado por la falta de de
tectores adecuados. El detector ideal es aquel
que cumple los siguientes requisitos: alta sensi
bilidad, estabilidad, lectura continua y respues
ta universal. Es al da de hoy que an no existe
uii detector que cumpla con todos estos requisi
tos. Sin embargo, al evaluar la eleccin de un
determinado detector en funcin a las caracte
rsticas fisicoqumicas de las sustancias que se
desea analizar, se debern tener en cuenta las
siguientes propiedades generales:
1. Respuesta. Puede ser general, de acuerdo
a la capacidad que tenga el detector de generar
una seal con todo tipo de muestra o con una
en particular.
2. Sensibilidad. Se puede definir la sensibi
lidad de un detector como la relacin entre la
seal generada y la cantidad de muestra que
produce dicha seal. E sta seal no indica la
cantidad m nim a detectable, puesto que sta
puede estar lim itada por el ruido de base del
instrumento.
3. Ruido. Es la variacin de seal que puede
detectar el instrumento que no es debida a la
muestra; puede ser producida por fallas electr
nicas, variaciones de flujo o temperatura, fluc
tuaciones en el voltaje, burbujas de aire disuel
tas en el solvente, etc. Por lo tanto un detector
muy sensible, pero muy ruidoso puede ser m e
nos til que uno poco sensible, pero con un ni
vel de ruido ms bajo.
4. Linealidad. Es la relacin entre la seal
generada por el detector y la concentracin de
la muestra. Esta relacin debe ser lineal.
5. Estabilidad. Un buen detector debe ser
poco sensible a los cambio de temperatura y a
la variacin de flujo. En la actualidad, los de
tectores ms comunes son los que miden; ndi
ce de refraccin, fluorescencia, espectrometra
de masa y luz ultravioleta. Los detectores para
luz visible-UV son los ms utilizados. Los de
tectores de diodo son particularmente atracti
vos, ya que pueden examinar el espectro desde
200 hasta 600 nm en menos de un segundo.
e - Columnas. La cromatografa de fase re
versa es la ms utilizada en HPLC. La fase m
vil inicial (comnmente denominado buffer A)
es dbil y generalmente consiste en soluciones
de cidos altamente diluidos como por ejemplo
el cido trifluoractico al 0,1 % (TEA), m ien
tras que la fase mvil eluyente es un solvente
orgnico como ser metanol, 2-propanol o ace
tonitrilo (comnmente denominado buffer B).
Puesto que la muestra, disuelta en la fase mvil

897

dbil, es inyectada dentro de la columna, rete

nida por la matriz de la mism a y desplazada
por el solvente orgnico, lo que depende de la
correcta eleccin de los bujf'ers y del gradiente
aplicado, el pico obtenido deber ser estrecho.
Debido a los solventes utilizados no se re co
mienda este mtodo para la separacin de pro
tenas, cuando se desea mantener la actividad
biolgica de las mismas. El HPLC es un p ode
roso mtodo analtico para pptidos y m olcu
las pequeas. La fase estacionaria ms utilizada
son derivados alquilsilanos de slice. El largo
de las cadenas sustituyentes para protenas son
de un rango corto (C^ a Cg), mientras que para
pptidos y pequeas molculas son ms largas
(Cj a C,g). Para la separacin de protenas tam
bin se utilizan macroporos derivados de pohestireno-divinilbenceno.
El material de empaque para las columnas de
cromatografa de exclusin molecular debe ser
neutro e hidroflieo para minimizar todo efecto
de adsorcin. Un mtodo es fabricar m atrices
con alto grado de entrecruzamiento, mecnica
mente estables. Con este fin se han usado aga
rosa y dextranos, pero el proceso de entrecruza
miento generalmente introduce grupos hidrof
bicos; incluso con estas m atrices no pueden
emplearse presiones muy elevadas (no ms de
30 atm). Los macroporos de slice a los que se
les une polmeros orgnicos son las m atrices
ms efectivas.
Las columnas ms utilizadas en los diferen
tes mtodos de HPLC y sus caractersticas ms
im portantes se hallan resumidas en el cuadro
41-16.
De acuerdo al mtodo seleccionado y por en
de la columna a utilizar, es fundamental el tipo
de solvente a emplear. Las fases mviles id ea
les para HPLC son aquellas que no daan los
sistemas de bombas. No deben emplearse su s
tancias que puedan absorber al UV. Todos los
solventes, (inclusive H^O deionizada o bidestilada), buffers, cidos o bases para ajustar el pH,
deben ser altamente purificados. Todas las so
luciones deben ser pasadas a travs de filtros
de 0,45 |am para rem over toda partcula que
pueda daar la columna; los solventes deben
ser previam ente degaseados, ya que m nim as
burbujas pueden alterar severamente la lnea de
base del cromatograma. La fase mvil depende
de la co lu m n a seleccio n ad a. En el c u a d ro
41-16 se detallan, de acuerdo al tipo de colum
na, las caractersticas de las fases mviles reco
mendadas para cada caso.
6.1.3. Caractersticas del soluto
que se desea analizar y/o separar
Antes de seleccionar un mtodo cromatogr
fico por HPLC es necesario conocer las carac-

898

Mtodos inmunoqumicos

C u ad ro 41-16. Caractersticas de las columnas ms usadas en los diferentes mtodos por

HPLC
Colum na
F a se norm al
C N - (ciano)
O H - (diol)
N H ,- (am ino)
S lice

D escripcin

G rado de polaridad ptim o cuando ste es el m todo de eleccin

M s polar que la CNA itam ente polar, m enos estable
Econm ica, m enos conveniente

F ase reversa y p ares de iones

C 1 8 ( c ta d e s iliiO D S )
C 8 (octil-)
C 3 ,C 4
C -I (trim etil-silil, TiVIS)
Fenil
CN NH2-

A lto poder de retencin. L a ms utilizada

S im ilar a la C 18, m enor poder de retencin
M enor poder de retencin. C olum na de eleccin para pptidos y protenas
M enor poder de retencin, m enos estable
M oderado poder de retencin
M oderado poder de retencin. U tilizada en fase reserva y norinal
P oder de retencin dbil. U tilizada para carbohidratos. M enos estable

Poliestireno

E stable con fase mvil en pH 1-3

E xclusin m olecular
S lice
S lice silanizada
O H - (diol)
Poiiestireno

A dsortiva
M enos adsortiva, gran com patibilidad con los solventes utilizados
U tilizada con solventes orgnicos
M enos estable, utilizada con solventes acuosos
U tilizada con solventes orgnicos, incom patible con solventes polares

Intercam b io inico
C on uniones qum icas a la m atriz
Poiiestireno

M enos estable y reproducible

M enos eficiente, m s estable, ms repoducible

tersticas de la muestra a analizar y/o separar.

El xito de la separacin depende de esto, y los
puntos principales que hay que tener en cuenta
son los siguientes:
1. La informacin sobre la muestra define el
xito de la separacin
2. La muestra necesita un tratamiento pre
vio a la separacin cromatogrfica?
3. Eleccin del detector
4. Seleccin del mtodo cromatogrfico, pa
ra luego estimar las mejores condiciones de co
rrida.
5. Optimizacin de las condiciones de sepa
racin
Por otro lado, el xito de una separacin cro
matogrfica incluye la-respuesta de las siguien
tes preguntas:
1. Se desea analizar la muestra o colectarla?
2. Se conocen las caractersticas de todos
los componentes de la muestra?
3. Se desea resolver todos los componentes
de la muestra o uno en particular?
4. Si se desea realizar un anlisis cuantita
tivo de la muestra, qu precisin se necesita?
5. Es necesario ms de un procedimiento
cromatogrfico?

6.1.4. Problemas que pueden surgir durante

el desarrollo del mtodo seleccionado
1. Problemas con la lnea de base. En las
separaciones isocrticas generalmente es posi
ble obtener una lnea de base plana sin falsos
picos ni otros disturbios. En las separaciones
con gradientes, una lnea de base plana, por
diversas razones, es ms difcil de obtener.
Por lo tanto es imperioso realizar, previa in
yeccin de la m uestra, una corrida blanco
para tener la seguridad de una correcta lnea
de base. Los falsos picos pueden deberse a
impurezas que son absorbidas a la mism a lon
g itud de onda de trabajo, contenidas en los
solventes. El uso de solventes de alto grado de
p u re z a p u ed e m im in iz ar esto s p ro b lem as.
T am bin es comn observar artefactos si se
utiliza el detector a una muy alta sensibilidad
y una longitud de onda demasiado baja. Por lo
tanto la corrida blanco debe realizarse bajo las
mismas condiciones que se utilizarn durante
la separacin de la m uestra. Un increm ento
demasiado pronunciado de la lnea de base a
medida que se incrementa el solvente B, pue
de deberse a una diferente absorbancia del
mismo con respecto al solvente A. Por lo tan
to hay que controlar que ambos solventes ten
gan la misma absorbancia.

Mtodos croma togrficos de fase lquido-slido

899

C uadro 41-17. Materiales ms utilizados para la produccin de la fase estacionaria qum ica
mente unida
N om bre

Grupo unido

Soporte

M icropacck CH
Lichrosorb R P-18
B ondapack C - 18
ODS-Silx-1
Zorbax ODS
Portasil O D S '2
Lichrosorb R P -8
Zorbax C -8
|i B ondapack Phenyl
Lichrosorb R P-2
C yano Silx-I
H, B ondapack CN
A m ino Silx-I
B ondapack NH^
Bondapack carbohidrato
Z orbax N H,
|j, B ondapack cido graso
B ondapack C18/Corasi!

O ctadecilo
O ctadecilo
O ctadecilo
O ctadecilo
O ctadecilo
O ctadecilo
Octilo
O ctilo
Fenilo
13imetilo
Nitrilo
Nitrilo
A m ino
A m ino
Am ino
A m ino
H idrocarburo
O ctadecilo

Lichrosorb
Lichrosorb
[i Porasil
S iix-I
Zorbax-Sil
Portasil
Lichrosorb
Zorbax-Sii
(.t Porasil
Lichrosorb
Silx-I
l Porasil
Silx-I
|j, Porasil
H Porasil
Zorbax-Sil
|l Porasil
Corasil

2.
R esolucin de los picos de inters. La
eleccin de una correcta fase mvil y de un
gradiente apropiado es lo que ms influye en
resolucin de una muestra, teniendo en cuenta
que la colum na a utilizar es la apropiada. El
cuadro 41-17 muestra los materiales ms utili
zados para la produccin de la fase estacionaria
y el cuadro 41-18 m uestra la influencia del
cainbio de algunos solventes sobre resolucin
de una muestra.
6.1.5. Aplicaciones de la cromatografa
lquida de alta presin
La gran versatilidad de la cromatografa l
quida de alta presin permite purificar y carac
terizar un sinnmero de sustancias de caracte

Tamao
de partcu la (Im)

10
5-10

10
15

6
10
5-10

6
10
5-10
15

10
15

10
10
6
10
37-50

Marca
V arian A erograph
E. M erck
W aters
Perkin Elm er
D upont
H ew lett Packard
E. M erck
D upont
W aters
E. M erck
Perkin Ehner
W aters
Perkin Elm er
W aters
W aters
D upont
W aters
W aters

rsticas fisicoqum icas totalm ente diferentes,

como ser;
a) C om puestos inicos, com o a m in o ci
d os, sa le s in o rg n ic a s , c id o s o rg n ic o s,
etctera.
b) Compuestos de alto peso molecular, co
mo polm eros, hidrocarburos p o linucleares,
productos naturales, etc.
c) Compuestos termolbiles y no voltiles,
como vitaminas, pesticidas, esteroides, plastificantes, drogas y una gran variedad de produc
tos farmacuticos.
d) Separacin de pptidos provenientes del
clivaje enzimtico o qumico de protenas para
ser analizada su secuencia por microsecuenciacin.

C u ad ro 41-18. Influencia de las caractersticas de la fa se mvil en la resolucin de una

muestra
Variable

Cc>mentarios

Solvente orgnico

En fase reversa, un cam bio de m etanol por acetonitrilo o tetrahidrofurano

(THE), puede aum entar la resolucin. Cam bios sim ilares pueden realizarse
en fase norm al, usando cloruro d e m etileno, m etil-t-butil-eter (M TB E) o ace
tonitrilo.

pH de la fase mvil

Para m uestras que contienen cidos o bases, un cam bio en el pH puede mejorar
la resolucin.

Fuerza inica del .solvente

U n cam bio en la fuerza inica puede significar un im portante cam bio en la re

solucin de la m uestra, tanto en fase reversa com o en fase norm al o pares de
iones. Es un buen sistem a para optim izar la resolucin de una corrida crom atogrfica.

Tem peratura

L a tem peratura pu ed e variarse entre 0 y 70C. Sin em bargo tem peraturas entre
25 y 60C son las m.s com unes. G eneralm ente no se usan variaciones de
tem peratura para optim izar las condiciones de una corrida crom atogrfiea.

900

Mtodos inmunoqumicos

Debido a que los contenidos de este texto

son fundamentalmente inmunolgicos tom are
mos como ejemplo la purificacin de pptidos
provenientes del clivaje enzim tico del frag
mento Fd de una inmunoglobulina.
Cuando se desea conocer la secuencia de
aminocidos de una inmunoglobulina es nece
sario realizar previamente la separacin y frag
mentacin de ambas cadenas. El equipo auto
mtico de secuenciacin de aminocidos puede
procesar y por lo tanto dar informacin de no
ms de 40 aminocidos, en consecuencia, es
imprescindible trabajar con pptidos no mayo
res a ese tamao.
Los pasos a seguir para la obtencin de una
secuencia de aminocidos de una inm unoglo
bulina son los siguientes;
1. Obtencin del fragm en to Fab. Para la
obtencin del fragmento Fab se puede utilizar
la digestin con tripsina y luego separacin de
los fragm entos obtenidos m ediante crom ato
grafa de exclusin molecular.
2. A islam iento de la cadena L y el fr a g
mento Fd. El fragmento Fab es parcialmente
reducido con ditiotreitol 10 mM en un buffer
de 10 mM de Tris-HCl pH 8,2. Luego de 1 ho
ra a temperatura ambiente se procede a la alquilacin con cido iodoactico a una concen
tracin de 22 mM con el aadido de '^C cido
iodoactico como trazador. La muestra es de
salada mediante el pasaje por una columna de
Sephadex G-25, estabilizada previam ente en
cido actico IM . El material obtenido final
m ente se liofiliza. Luego se disuelve en tri
fluoractico (TFA) 0,1% y se inyecta a una co
lum na de HPLC de fase reversa C18, usando
un gradiente discontinuo de acetonitrilo en
TFA 0.1%. El perfil de elucin de la cadena li
v ia n a y del frag m en to Fd y el c o n tro l de

T ie m p o (m in.)

pureza por SDS-PAGE se muestran en la figu

ra 41-12.
3.
Clivaje enzimtico y purificacin de los
pptidos obtenidos. Una vez separado el frag
mento Fd de la cadena liviana se procede a su
clivaje enzimtico. La eleccin de la enzima a
utilizar depende del conocimiento que se tiene
respecto a la com posicin de am inocidos.
C ualquiera que sea la enzim a a utilizar hay
que tener en cuenta que debe ser de un alto
grado de pureza, y se las identifica como grado
HPLC.
En este caso se seleccion Lisina-C (Lys-C)
Endoproteinasa, enzima que d iv a uniones LysX dejando la Lys como aminocido C-terminal.
Luego de la digestin, los pptidos fueron se
parados por pasaje a travs de una columna de
fase reversa C,g, usando un gradiente linear de
0-66% de acetonitrilo en TFA 0.1%. En la fi
gura 41-12A se muestra el perfil de separacin.
La composicin de aminocidos de cada uno
de los picos revel que el pico K6 contena un
pptido de gran tamao y con alto contenido de
asparagina (Asn), por lo tanto se digiri nueva
mente. La figura 41-12B muestra el pico K6 di
gerido con Asn-N, endoproteinasa que d iv a
uniones X-Asn y corrido en las mismas condi
ciones que en el caso anterior.

6.2. FPLC (Fast Protein, Peptide

and Polynucleotid Liquid Chromatography)
El FPLC (desarrollado p osteriorm ente al
HPLC) es un sistema de purificacin de alta re
solucin compatible con sustancias biolgicas.
Este sistema desarrollado por Pharmacia traba
ja a presiones inferiores (10-20 atmsferas) a
las utilizadas en los sistemas de HPLC lo que
perm ite optim izar las condiciones de trabajo

F ig . 4 1 - 1 2 A . S e p a r a c i n p o r
H PLC de la cadena liviana y dei
fragm ento Fd de u na inm unoglo
b u lin a . L a c a d e n a liv ia n a y el
fragm ento Fd fueron separados a
partir del fragm ento F ab p arcial
m ente reducido, p o r pasaje a tra
vs de u n a co lu m n a de fase re
versa Cjg, usando un gradiente de
elu ci n disco n tin u o , ( ) % d e
bu ffer B. L a figura interior repre
senta el SD S-PA G E de los picos
o b te n id o s , c o m p a ra d o s c o n el
Fab y los estndares de peso m o
lecular (M ). (Tom ado d e Leoni y
col. T h e prim ary structure o f the
F ab fragm ent o f a protein K A U ,
a m onoclonal im m unoglobulin M
co id a g g lu tin in . J. B io l. C h e m
266: 2836-2842, 1991).

Mtodos cromatogrficos de fase lquido-slido

901

Tiempo (min)

F ig . 41-12B . S eparacin por H PL C d e los pptidos d el fragm ento F d Kiego d e la d igestin con Endoproteinasa L y s-C .
Los pptidos fueron separados usando una colum na C |j de fase reversa, con gradiente linear de 0-66% de acetonltrilo en
0.1% de T F A .( ) gradiente de buffer B; * pptidos radiactivos; la figura interior m uestra la separacin de los p p tid o s
resultantes del clivaje del pptido K5, po r accin de la Endoproteinasa A sn-N , utilizando las m ism as condiciones. (T o m a
do de Leoni y col. The priraary structureof the Fab fragm ent o f a protein K A U , a m onoclonal im m unoglobulin M coid agglutinin, J. B iol. C hem 266; 2836-2842, 1991).

para mantener la actividad biolgica e integri

dad estructural de las biomoleulas.
Este sistem a puede ser aplicado a tcnicas
erom atogrficas convencionales como la cro
matografa de intercambio inico, la filtracin
por geles, la cromatografa de afinidad y el cro
matoenfocado y a tcnicas que fueron desarro
lladas a partir de estos sistemas como la croma
tografa por interaccin hidrofbica y en fase
reversa.
Los sistem as de FPLC fueron diseados y
desarrollados especficamente para la separa
cin de molculas biolgicas y presentan algu
nas ventajas con las tcnicas eromatogrficas
tradicionales y de alta perform ance (HPLC).
Algunas de esas ventajas son;

trabajo en estos sistemas permite utilizar m ate

riales ms resistentes a la corrosin como c o
lumnas de vidrio o tubuladuras plsticas, a di
ferencia de los accesorios generalmente de ace
ro, necesarios para las presiones a la que se d e
be trabajar en sistemas de HPLC. Estos siste
mas son compatibles con buffers salinos y to
dos los materiales en contacto con el eluyente
son totalmente resistentes a la corrosin por sa
les, alto o bajo pH y a un amplio espectro de
solventes orgnicos. Esto es debido a que los
extractos biolgicos son invariablem ente d i
sueltos en este tipo de soluciones para preser
var su actividad biolgica y estructura.

Alta recuperacin de la actividad biolgica

Compatibilidad con buffers salinos y solven
tes orgnicos
Alta velocidad, alta resolucin, alta capacidad
Escala analtica y preparativa.

Los sistemas de alta resolucin emplean re

sinas con partculas de dimetro muy pequeo
(3-15 |im ) lo que sumado a la baja difusin y la
presin empleada le permite obtener cromatogramas con alto poder resolutivo.
La m ay o ra de las m atrices u tilizadas en
FPLC son a base de agarosa como la Sepharosa
o la Superosa. La utilizacin de estas resinas es

En la figura 41-13 puede verse un equipo de

FPLC fabricado por Pharmacia. La presin de

6.2.1. Matrices utilizadas en FPLC

902

Mtodos inmunoqumicos

d l* E

*fc.
(7 ),

F ig . 41-13. Equipo de F P L C (Pliirmacia): (1) graficador, (2) colector de fracciones, (3) colum nas, (4) m ezclador, (5) d e
tector U .V., ( 6) bom bas, (7) program ador.

posible debido a que la presin de trabajo del

sistem a no es excesivam ente alta como para
que se produzca un apelmazamiento de la ma
triz. No ocurre lo mismo con los sistemas de
HPLC donde las presiones usadas son mucho
mayores por lo que se requerirn matrices ms
resistentes a base de slice.
Las Monobeads son partculas de polmeros
hidroflicos monodispersos para cromatografa
de alta velocidad y alta resolucin. La estructu
ra de estas resinas permite cromatografas alta
mente resolutivas a bajas presiones debido a
que la gran uniformidad en su tamao facilita
el empaquetamiento del gel. La empresa Phar
macia ofrece en el comercio columnas preempaquetadas para uso analtico como la Mono Q
(intercam biador aninico fuerte, con aminas
cuaternarias como grupo funcional), M ono S
(intercam biador catinico fuerte, con grupos
sulfnicos). M ono P (usada en crom atoenfoque, con aminas terciarias y cuaternarias como
grupos funcionales) y la aliiyl- o phenyl-Superosa (usada en la cromatografa por interaccin
hiodrofbica).
Tambin pueden obtenerse en el comercio
resinas derivadas de la agarosa utilizadas para
el empaquetamiento de columnas, generalmen

te en escala preparativa, como la Q-Sepharosa

y la S-Sepharosa usadas en crom atografa de
intercambio inico y la P-Sepharosa usada en
cromatoenfocado. Esto representa una ventaja
con los sistemas de HPLC donde las columnas
se adquieren nicam ente preempaquetadas lo
que eleva los costos con respecto a las colum
nas armadas en el laboratorio.
En la cromatografa de exclusin molecular
se utilizan columnas con matrices de Supero
sa. Se debe tener en cuenta que los sistemas de
FPLC no han resultado de gran utilidad en este
tipo de cromatografa dado que no se ha obser
vado un aum ento considerable en la reso lu
cin, principalm ente para m olculas de alto
peso molecular como las protenas. Esto hace
que la cromatografa convencional, en el caso
de filtracin por geles sea, en general, de elec
cin.
La cromatografa en fase reversa no es tan
utihzada en estos sistemas como en HPLC. D e
bido a la naturaleza de los solventes, esta tcni
ca cromatogrfiea es aplicada a protenas cuan
do la prdida de su actividad biolgica no es
importante. Los geles usados en FPLC son el
ProRPC en el caso de protenas y el Pep RPC
para pptidos de menor tamao.

Mtodos cromatogrficos de fase lquido-slido

6.2.2. Aplicaciones del FPLC
Este sistema se utiliza principalmente para la
purificacin de biomolculas en donde el man
tenimiento de la actividad biolgica de la m is
ma es muy importante (enzimas, inmunoglobu
linas, etc).
La p u rific a c i n de A cM o co n stitu y e un
ejemplo claro de la aplicacin de esta metodo
loga. Una de las tcnicas cromatogrficas ms
utilizadas en los sistemas de FPLC para la puri
ficacin de AcMo es la cromatografa de inter
cambio inico la que, en general, ofrece una
separacin rpida y de alta calidad. Es difcil
recomendar un procedimiento general de puri
ficacin, pues los AcMo poseen distintos pun
tos isoelctricos, aun aquellos de una m ism a
subclase de inmunoglobulina.
La cromatografa de intercambio aninico se
utiliza frecuentemente, particularmente en los
casos en que la muestra consiste en lquido asctco (LAT). La estrategia general consiste en
aprovechar la diferencia entre el punto isoelc
trico (pl) de los AcMo (generalmente entre 6.0
y 8.5) y el pl de los principales contaminantes
del LAT como la albmina y la transferrina (pl
= 4.7-5.0). De esta manera, el AcMo es reteni
do dbilmente mientras que los contaminantes
son fuertem ente retenidos. El gradiente em
pleado para la elucin se elegir de manera tal
que el AcMo eluya libre de contaminantes en
primer lugar.
La utilizacin de colum nas de alta resolu
cin para cromatografas de intercambio ani
nico {Mono Q) requiere una preparacin de la
muestra muy rigurosa, eliminando toda partcu
la por filtracin y rem oviendo contaminantes
que pudieran coagular como lpidos, lipoprote-

nas, etc.; as mismo, es im portante el lavado

peridico de las columnas para lograr una m a
yor vida til de la misma.
La figura 41-14 m uestra el perfil crom atogrfico de purificacin de un AcMo de isotipo
IgGj a partir de una muestra de lquido asctico
(LAT) previamente precipitada con S0 4 (NFI^)2
al 50% de saturacin, utilizando una colum na
Mono Q.
En muchos de los LAT analizados se obser
va que no toda la transferrina eluye de acuerdo
a su pl, probablemente debido a que la transfe
rrina eluye formando un complejo con la inm u
noglobulina. Para disminuir la formacin de es
tos complejos, la precipitacin salina se realiza
durante 2 horas en fro y no durante una noche,
como es realizada comnmente; de esta form a
es posible ehminar gran cantidad de albmina
y una cantidad apreciable de transferrina del
LAT en estudio.

7. E V A LU A C I N D E LO S P E R F IL E S
CROMATOGRFICOS: RESOLUCIN
El resultado de una separacin cromatogrfi
ca es a menudo expresado como la resolucin,
es decir, la separacin entre los picos de in te
rs. La resolucin (Rs) es determinada a partir
del cromatograma como se muestra en la figura
41-15.
La resolucin entre dos picos se define m ate
mticamente como la relacin entre la distancia
entre los picos mximos (V^-Vj) y el promedio
d el a n c h o de la b a se de lo s dos p ic o s
{'W^+'W^/2). Los volm enes de elucin y los
anchos de los picos deben ser medidos con las
mismas unidades para as obtener un valor de
resolucin adimensional.

0.2

100

IgG,

F ig . 4 1 - 1 4 . P e r f il d e
e lu c i n d e un A cM o
m urino del isotipo IgG I ,
por crom atografa de in
te rc a m b io a n i n ico , de
u n a c o lu m n a M o n o Q
H R /5 5 ( P iia r m a c ia ) ,
B u ffer A: T ris /C IH 20
niM , pH 8,5; B u ffer B:
buffer A + N aC l !M , p ll
8 ,5 . M u e s tr a ; 100 |il
L A T + 100 Lil de buffer
A. Flujo: 1 ml/m in.

i A

T ran sferrina

20

/ Albmin

,/

A /

; 46
Tiempo{min)

%B

904

Mtodos inmunoqumicos
F ig . 41-15. D ete rm in a
c i n d e la R e s o lu c i n
(Rs) entre dos picos.

V,-V,
(W^ + W j / 2

Volumen

w.

Rs es lina verdadera medida de la eficiencia

de una separacin crom atogrfica y es usada
para determinar si es necesaria una mejor opti
m izacin del proceso. Si Rs = 1,0, se asume
que el pico presenta aproximadamente un 98%
de pureza lo que surge a partir de la integracin
de las correspondientes reas. De la misma for
ma, si Rs = 1,5 la pureza ser del 100% (fig.
41-16).
Matemticamente Rs es proporcional al pro
ducto de selectividad (a), eficiencia (N) y ca
pacidad (k) de la columna cromatogrfica (1).
(a - 1)
R s = 1/4 ---------

(V)

(1 + k )

( 1)

La selectividad define la capacidad del m

todo crom atogrfico de distinguir dos picos
(distancia entre picos) mientras que la eficien
cia est relacionada con el ancho y el rea de
los picos, lo que se debe al fenmeno de difu
sin dentro de la columna (fig. 41-17).
Del anlisis de la ecuacin (1) podemos de
ducir que una buena selectividad es ms impor
tante que una alta eficiencia.
Tericamente, la eficiencia se expresa como:
N = L/HEPT
definiendo HEPT como la altura equivalente de
un plato terico, y L como el largo de la co
lumna.
La altura de un plato terico depende del ta
mao de las partculas de gel. Cuanto menor
sea el tamao de sta, menor ser la altura de
un plato terico y de esta forma ser mayor la

eficiencia, lo que llevar a una mayor resolu

cin.
Por otra parte la eficiencia depende tambin
del flujo de la columna. En la cromatografa de
exclusin molecular, un flujo muy lento har
que las molculas tengan ms tiempo para di
fundir dentro de la columna lo que producir
una disminucin de la eficiencia. Por otra par
te, un flujo muy alto no permitir que las mol
culas entren en las partculas del gel, lo que
disminuir la eficiencia. Luego existe un flujo
ptimo donde la eficiencia ser mxima.
Experimentalmente, la eficiencia se calcula a
partir del cromatograma segn la ecuacin (2):
( 2)

donde
es el ancho del pico a la mitad de su
altura.
La capacidad es una constante que est rela
cionada con el poder de retencin de la matriz
cromatogrfica. Una matriz con un alto factor
de capacidad har que los componentes sean
altamente retrasados. En la crom atografa de
exclusin molecular todos los picos aparecen
entre el V el V-i-Vj, luego la capacidad de este
mtodo cromatogrfico es baja. En cambio en
las tcnicas adsortivas los picos pueden apare
cer ms all del V^+Vj siendo la capacidad de
estos mtodos mayor.
Este factor no debe ser confundido con la
capacidad de siembra de la columna la cual
es expresada como mg de muestra/ml de resina
en el caso de las tcnicas adsortivas o en volu
men de muestra/ml de resina en el caso de tc
nicas no adsortivas.

Mtodos cromatogrficos de fase lquido-slido

905

Buena selectividaci
- Aita eficiencia

e
o

- Baja eiciencia

2%B

Volumen

2%A
Mala sslectlvldad

.... - Alta ef'ciencis

R= 1.5
-Baja eficiencia

-1 0 0 % A

-1 0 0 %

Volumen

Volumen

F ig . 41-16. R esultados de separaciones crom atogrficas

con diferentes resoluciones.

F ig. 41-17. Efecto de la selectividad y eficiencia en la r e

solucin.

B IB L IO G R A F A

4. A ntibodies. A Laboratory M anual. E d H arlow y D av id

Lae. C oid Spring H arbor Laboratory, 1988.
5. A ffinity C hrom atography. B ioselectiv e A d so rp tio n on
Inert M atrix. W illiam H . Sw iten. (P.D . Elving y J.D .
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6. FPLC Ion B xchange and C hrom atofocusing. P rin cip ies
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7. Inm unologa e Inm unoqum ica. 4a. edicin. R. A. M a r
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1. M todos instrum entales de anlisis. W illard, H.; M errit,

L. Jr. y S ettie, F. Jr. G rupo E ditorial Iberoam ericana,
1991.
2. M ethos in Enzym ology. V ol 182. Editado por M urray
P. D eutscher. A cadem ic P ress Inc., 1990.
3. Practical H PL C m ethods developm ent. Lloyd R. Snyder, lo se p h L. G lajch y Joseph 1. K irkland. W iley-Interscience P ublication, 1988.

Eleetroforesis en gel de poliacrilamida;

isoelectroenfocado; inmunotransferencia
(immunoblotting)

RICARDO MARGNI
EMILIO L. MALCHIODI
MNICA G. CHIARAMONTE

ELECTROFORESIS EN GEL
DE POLIACRILAMIDA
Es un mtodo analtico de alto poder resolu
tivo que com bina la m igracin en un campo
elctrico y el tamizado molecular a travs de
un gel de corrida.
El poro del gel desempea un papel funda
mental. En algunos geles, como los de agarosa,
los poros son suficientem ente grandes como
para no retener a la mayora de las molculas
proteicas que migran, por lo que aqu la separa
cin depender fundamentalmente de la carga
neta de stas. Adems, dado que se trata de un
producto natural, sus poros no son hom og
neos. En el caso de los geles de poliacrilamida
pueden conseguirse poros de diferentes dime
tros segn las condiciones de la polim eriza
cin; como consecuencia, para un gel de deter
minado poro, el tamao molecular y la carga
neta sern los factores determinantes de la se
paracin de las molculas de una mezcla.
Los geles de poliacrilam ida resultan de la
polimerizacin en largas cadenas de la acrilamida monomrica (CH^ = CH CO NH^) y
de su entrecruzam iento por interm edio de la
N,N-metilenbisacrilaTiida (CH, = CH CO
NH CH^ ^ NH CO CH = CH^), co
rrientemente designada bisacrilamida. El poro
del gel formado depender de las concentracio
nes relativas de ambos reactivos durante la po
limerizacin.
La polimerizacin de la acrilamida necesita
de un iniciador del proceso. Los ms comn
mente usados son el persulfato de amonio y la
riboflavina. Se aade, adems, como acelera
dor, N ,N ,N ,N -tetram etiletilendiam ina (TE
MED). En el sistema persulfato de amonio-TEMED, este ltimo cataliza la formacin de ra

42
dicales libres a partir del persulfato, lo que en
definitiva inicia la polimerizacin. En este me
canismo interviene la base libre TEMED, por
lo que la acidificacin retarda la polim eriza
cin. Cuando se usa riboflavina, para que la
polimerizacin se inicie se requiere luz; sta,
origina radicales libres al fotodescomponer la
riboflavina.
El oxgeno inhibe la polimerizacin; ello ha
ce que los reactivos a emplear deban ser pre
viamente desgasificados.
El tamao del poro del gel decrece a medida
que la concentracin de acrilam ida total au
menta. Para una determinada concentracin de
acrilamida monomrica, el tamao del poro de
pender del entrecruzamiento producido.
Experimental mente, la eleetroforesis en gel
de poliacrilamida puede efectuarse en tubos o
en placas. En el primer caso se utiliza un ciUndro de gel para cada muestra a analizar mien
tras que cuando se emplean placas, pueden co
rrerse en form a sim ultnea, en una sola de
ellas, varias muestras. Este procedimiento re
sulta til para separar protenas de una mezcla,
las que pueden ser aisladas por simple cortado
del gel y posterior elucin. Si bien las cantida
des recuperadas son pequeas, muchas veces
son suficientes para el anlisis de algunas de
sus propiedades o para usarlas como inmungenos.
La eleetroforesis en geles de poliacrilamida
puede desarrollarse tambin usando soluciones
buffer que contienen sustancias disociantes, en
especial detergentes inicos. Una de las ms
usadas es el dodecilsulfato de sodio (SDS). Las
protenas a analizar son hervidas a 100C en
presencia de un exceso de SDS y 2-mercaptoetanol. En esas condiciones el tiol rom pe los
puentes disu lfu ro que pudieran e x istir y el

Electroforesis en gel de poliacrilamida

agente desnaturalizante hace que la protena se
desdoble en sus polipptidos constitutivos, los
que fijan SDS en una relacin constante (1,4 g
de SDS por g de polipptido). A causa de ello
la carga intrnseca del pptido se hace insignifi
cante ante el exceso de carga negativa del SDS;
como consecuencia, la carga de todas las mol
culas ser prcticamente idntica. Su desplaza
miento en un campo elctrico, en el que el so
porte de corrida es un gel de determinada poro
sidad, depender exclusivamente de su tamao
molecular. Este mtodo, conocido como elec
troforesis en gel de pohacrilamida en presencia
de SDS o SDS-PAGE, permite, por compara
cin con sustancias de peso molecular conoci
do que han sido corridas simultneamente, de
terminar el peso molecular relativo de los pro
ductos en anlisis. Se lo utiliza en forma rutina
ria con tal finalidad, y para ello slo son nece
sarias nfimas cantidades de muestra.
La electroforesis en gel de poliacrilam ida
puede desarrollarse usando sistem as b u ffer
continuos o discontinuos. En el primer caso,
los iones que constituyen el buffer durante todo
el recorrido de la muestra (gel, reservorios) son
los mismos y el pH es constante. En algunas si
tuaciones slo puede variar la concentracin
inica en los vasos de contencin o reservorios.
Cuando se usan estos sistemas, las muestras a
analizar se siembran directamente en el gel de
resolucin. En los sistem as discontinuos, el
buffer de los geles y el de los reservorios de los
electrodos son diferentes. Normalmente los pH
de ambas soluciones buffer son tambin distin
tos. I^as muestras a analizar se siembran en un
gel de poro grueso (gel de paso rpido, apilamiento o stacking) en buffer Tris-HCl, pH 6,8,
al que se ha hecho polimerizar por sobre el gel
de corrida (pH 8,8). El buffer del recipiente
que contiene el ctodo es Tris-ghcina pH 8,3.
E llo perm ite que volm enes apreciables de
muestras diluidas de protenas puedan ser ana
lizadas, ya que al ser sembrados en un gel de
este tipo en el que los iones y el pH de los buf
fer son diferentes, las molculas se desplazarn
a travs del gel y se concentrarn en una zona
estrecha, en el lmite correspondiente al gel de
corrida, previo a su separacin en ste.
Al pH del gel de apilamiento, o stacking, y
de la m uestra (pH 6,8), la glicina que forma
parte del buffer del reservorio catdico est
muy poco disociada ya que ste es prximo a
su pKa, por lo que su movilidad en el campo
elctrico ser reducida. Los iones cloruro, en
cambio, a ese pH tendrn una movilidad mayor
dado su grado de disociacin y la movilidad de
las protenas ocupar una posicin intermedia.
Cuando se aplique un voltaje los iones cloruro
migrarn alejndose de la ghcina, dejando tras
de ellos una zona de menor conductividad. C o

907

mo ella es inversamente proporcional al campo

de fuerza, esta zona genera un gradiente de vol
taje mayor que acelera la migracin hacia ella
de la glicina, la que se aproxim a a los iones
cloruro, crendose un estado de uniformidad en
el que los productos de movilidad y gradiente
de pH de ambos iones es igual. stos se m u e
ven ahora a la misma velocidad, con un estre
cho lmite de separacin entre ellos. M ientras
se desplazan a travs de la muestra y del gel de
stacking, un gradiente de bajo voltaje se mueve
antes que ellos y otro de alto voltaje, despus.
Cualquier protena que se mueva por delante de
la banda inica es rpidamente atrapada ya que
su movilidad es menor a la de los iones cloru
ro, pero mayor que la de la glicina. Como co n
secuencia es concentrada en una delgada ban
da. Las diferentes protenas se irn apilando
unas sobre otras en una banda delgada por d e
trs de los iones cloruro y por delante de la g li
cina, acumulndose finalmente en el lmite del
gel de resolucin. En ese momento, al aum en
tar el pH (gel de resolucin: pH 8,8) la glicina
incrementa su disociacin y su movilidad efec
tiva sobrepasa a la protena y migra junto a los
iones cloruro. Al mismo tiempo, al disminuir el
tamao del poro del gel, las molculas protei
cas se m ovilizarn en una zona uniforme de
gradiente de voltaje y pH pero con un despla
zamiento regulado por sus respectivas cargas y
tamaos moleculares, lo que hace posible la se
paracin de diferentes especies m oleculares
dentro de una m ezcla. En el caso del SD SPAGE, la carga neta de las diferentes m olcu
las es prcticamente la misma por lo que la se
paracin ser slo por tamao molecular.
Existen otros sistemas de electroforesis en
ausencia de SDS. En este caso, el sistema est
diseado de tal forma que se mantienen la co n
formacin nativa de las protenas, las interac
ciones entre sus subunidades y su actividad
biolgica. La separacin de las protenas en e s
tado nativo ocurre de acuerdo al tamao y la
carga intrnseca. Uno de los inconvenientes ra
dica en que la determinacin del peso m olecu
lar slo es vlida si los patrones de peso m ole
cular usados tienen la misma conformacin, el
mismo grado de hidratacin y el mismo volu
men parcial especfico, con lo que este sistema
no ser el de eleccin si se quiere determinar el
peso molecular de una protena en particular.
La resolucin de una m ezcla de protenas
que puede lograrse utilizando geles de pohacri
lamida puede ser mejorada por varios factores:
el uso de pequeas cantidades de muestra, el
uso de sistemas de buffers discontinuos y la re
mocin de altas concentraciones de iones de las
muestras.
La separacin est influida por el pH del gel
(solo en el caso de electroforesis de protenas

908

Mtodos inmunoqumicos

nativas) y por la concentracin del gel. Esta

concentracin debe ser tal que no se produzca
una total exclusin del gel o que las protenas
migren con el frente de corrida.
En el caso de una m ezcla heterognea de
protenas la concentracin elegida del gel de
resolucin ser aquella que produzca un ade
cuado perfil de todos los componentes de inte
rs.
Es importante destacar que la relacin entre
el log,Q del peso molecular y la movilidad rela
tiva de las protenas es lineal en un rango limi
tado de peso molecular. Como regla general
para SDS-PAGE la relacin se mantiene en los
siguientes rangos: 15% acrilamida para 12-45
kD; 10% acrilamida para 15-70; 5% acrilami
da, 60-200 kD.
Una alternativa para el anlisis inicial de una
mezcla de protenas por SDS-PAGE es utilizar
geles de resolucin en gradiente, en los cuales
la concentracin de acrilamida aumenta, con la
disminucin consecuente del tamao de poro,
en la direccin de la migracin elctrica. Esto
permite, por un lado, el fraccionamiento en un
rango de peso molecular ms amplio del que se
logra con una concentracin uniforme y, ade
ms, el empleo de un gradiente en el tamao
del poro provoca una mayor agudeza y defini
cin de las bandas durante la migracin. Los
gradientes lineales ms comnmente utilizados
para un anhsis inicial por SDS-PAGE son de
5-20% o 6-18%.
PARTE EXPERIMENTAL (para el mtodo
discontinuo desarrollado a pH alto)
R eactivos
1. Purificacin de drogas
Las drogas comerciales acrilamida, bisacrila
mida y dodecilsulfato de sodio (SDS) pueden
ser repurificadas antes de su uso, si fuera nece
sario.
a) Acrilamida. Disolver 70 g de acrilamida
en 1 litro de cloroformo calentado a 50C. Fil
trar en caliente y recristalizar a -2 0 C. Separar
los cristales por filtracin al vaco en Buchner,
lavar con cloroformo fro y secar al vaco.
Nota: cuando se trabaje con las manos acri
lam ida o bisacrilamida, deben usarse guantes
descartables pues son neurotxicas. La acrila
mida polimerizada no es txica.
b) Bisacrilamida. Disolver 10 g en 1 litro de
acetona calentada a 50C, filtrar en caliente y
recristalizar a 20C. filtrar y lavar con aceto
na fra; secar al vaco.
c) SDS. Disolver 200 g de SDS en 3 litros

de etanol hirviendo; filtrar en caliente y recris

talizar a 4C. Separar los cristales por filtra
cin, lavar con etanol y secar.
2. Soluciones de reserva
a) Acrilamida-bi.mcrilam.ida (30:0,8).
Acrilamida ............................................ 30 g
B isacrilam ida........................................ 0,8 g
Agua destilada c s p ...............................100 mi
Disolver, filtrar y conservar en frasco oscuro a
4C.
b) TEMED. Conservar a 4C.
c) Persulfato de amonio al 1,5%. Conviene
preparar pequeos volm enes (10 mi) en el
momento de usar.
d) SDS al 10%. Se prepara una solucin al
10% en agua (P/V). Conservada a 4C es esta
ble varias semanas. No conviene preparar gran
des volm enes. C om o a bajas tem peraturas
cristaliza, es necesario calentar a 37C antes de
su uso.
e) B u ffe r p a ra g el de apilam iento, p o ro
grueso o stacidng. Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8.
Disolver 6 g de Tris en 40 mi de agua desti
lada y llevar a pFI 6,8 con HCl 1 N (+48 mi).
Completar a 100 mi con agua, filtrar y conser
var a 4C.
f) Buffer para gel de resolucin. Tris-HCl 3
M, pH 8,8
Disolver 36,6 g de Tris en 48 mi de HCl 1 N.
Ajustar pH y llevar a 100 mi con agua destila
da. Filtrar y conservar a 4C.
g) Buffer para los reservorios. Tris 0,25 Mghcina 1,92 M, pH 8,3.
Disolver 3,03 g de Tris y 14,4 g de glicina
en 60 mi de agua destilada. Ajustar a pH si fue
ra necesario. Completar a 100 mi, m ezclar y
conservar a 4C. Si el buffer va a ser usado en
SDS-PAGE, aadirle 1% de SDS.
h) Geles de poro grueso para apilam.iento
(stacking) y de resolucin. El gel de poro grue
so es el mismo en todos los casos. El gel de re
solucin puede tener diferentes concentracio
nes de acrilamida-bisacrilamida, lo que signifi
ca geles de poros diferentes, en el cuadro 42-1
estn indicadas las cantidades de los diferentes
reactivos a mezclar para lograr los geles desea
dos.
i) Solucin fijadora. A gua-m etanol-cido
actico (5:5:2).
j) S o lu c i n c o lo ra n te. C o o m assie B lue
R250 al 0,1%, disuelto en solucin fijadora.
k) Solucin decolorante. Resulta til la si
guiente mezcla:
Isopropanol............................................. 12,5 mi
cido actico .......................................... 10 mi
Agua destilada c s p ................................. 100 mi

Eleetroforesis en gel de poliacrilamida

909

C u ad ro 42-1. Mililitros de reactivos de reserva necesarios para preparar el gel de apilamiento

(stacldng) diferentes geles de resolucin

Solucin de reserva

G eles de resolucin
(concentracin fin a l en % de acrilam ida)

Gel de
apilam iento
(stacking)

A crilam ida-bisacril am ida (30:0,8)

B uffer para gel de apilam iento
(stacking)
B uffer para gel de resolucin
P ersulfato de am onio al 1,5%
A gua destilada
TE M E D

2,5

11,5
0,015

V olum en final (mi)

20

20

17,5

15

20,0

17,5

15,0

3.75
1,5
4.75
0,015

3,75
1,5
7,25
0,015

3.75
1,5
9.75 _
0,015

12,5

10

7,5

12,5

10,0

7,5

3,75
1,5
12,25 .
0,015

3,75
1,5
14,75
0,015

3,75
1,5
17,25
0,015

1,5
19,75
0 ,0 1 5

30

30

30

30

5,0

5.0

1.0

30

30

30

C u an d o se d ese e h a c e r S D S -P A G E , a a d ir a los com ponentes in d ic a d o s 0 ,2 m i d e S D S al i 0% ai gel d e a p ilam ien to (sta kin g ) y 0,3 m ] a lo s
g eles de re so lu c i n , los que sern desc o n ta d o s d el volum en d e ag u a a a a d ir in d icad o e n el cuadro.
C om o co n se cu en c ia de las d ilu cio n es, las co n c entraciones fin ale s do las diferen tes so lu cio n es b u ffer s ern las siguientes: a) en el gel d e a p ilaraiento: T iis-H C l 0 ,125 ]VI, p H 6,8; b ) en el gel d e resolucin: T ris -H C l 0,375 JVI, pH 8,8. La solucin d e re serv a del b u ffe r d e los re s e rv o rios se dilu y e 1:10 e n agua d estilad a para su uso, p o r lo que la co n c e n tra c i n d u ra n te la co rrid a ser T ris 0,025 M , g licin a 0 ,1 9 2 M, pH 8,3

3. Preparacin de la muestra para

SDS-PAGE
La muestra debe ser procesada previamente
a su anlisis, para lo cual ser mezclada con un
volumen igual de Tris-HCl 0,125 M, pH 6,8,
conteniendo 4% de SDS, .10% de 2-mercaptoetanol, 20% de sacarosa y 0,002% de azul de
bromofenol. Inmediatamente despus se la c a
lienta en bao de agua hirviente por 3 minutos
para desnaturalizar los componentes proteicos
de la muestra y se la deja enfriar a temperatura
ambiente antes de usar.
Como no siempre se hace tratamiento de la
muestra con 2-mercaptoetanol, es recomenda
ble proceder de la siguiente manera. Disolver
0,1512 g de Tris en 4 mi de agua destilada y
llevar a pH 6,8 con HCl 1 N. Aadir 0,4 g de
SDS, disolver, aadir 2 g de sacarosa, disolver
y completar a 9 mi. Aadirle 0,1 mi de una so
lucin de 2 mg de azul de bromofenol disueltos
en 1 mi de agua destilada. Conservar a 4C. Si
se desea incorporar el agente reduccin 2-mer
captoetanol, se aaden 50 jal de ste a 0,5 mi de
muestra a analizar, mezclados con igual volu
men de la solucin buffer indicada. En caso
contrario se elimina el 2-mercaptoetanol y la
solucin b u ffer se m ezcla con un volum en
igual de la muestra a analizar. En ambos casos,
previo a la siembra, la mezcla es hervida por 3
m inutos y enfriada luego a tem peratura am
biente.
Si la corrida en SDS-PAGE va a ser desarro
llada junto con patrones de comparacin de pe
sos moleculares conocidos con el objeto de de
terminar los PM relativos de las muestras en
anlisis, aqullos deben ser previamente proce
sados de la misma manera que lo fueron stas.

La cantidad de muestra a sembrar es im por

tante, dado que un exceso puede llevar a una
distorsin de las bandas de esa calle y de las
calles adyacentes en el caso de geles en placa,
mientras que una cantidad en defecto puede lle
var a que componentes en pequeas cantidades
no puedan ser detectados. Por lo tanto es co n
veniente probar varias concentraciones de la
muestra a anaUzar para determinar cul es la
correcta. En general en el caso de una m ezcla
compleja 50-100 |Tg es suficiente para un buen
anlisis. Respecto al volum en sembrado, d e
pender del sistema empleado; en un sistem a
continuo es deseable un volumen tan pequeo
como sea posible para una mejor resolucin.
En cambio en el caso de sistemas discontinuos,
el em pleo de un gel de apilam iento (gel de
stacking) hace que nos independicemos del v o
lumen, excepto por la capacidad de la calle.
Previo a la aplicacin en el gel es importante
eliminar por centrifugacin, cualquier material
insoluble, de lo contrario podra producirse una
especie de chorreado durante la corrida electrofortica.
4. Eleetroforesis
La eleetroforesis en gel de poliacrilamida y
la SDS-PAGE pueden desarrollarse en peque
os cilindros o en placas. En las figuras 42-1;
42-2; 42-3; 42-4; 42-5 y 42-6 pueden observar
se las caractersticas correspondientes a lo s
equipos usados en ambos casos y resultados
obtenidos en las corridas.
/. Eleetroforesis en tubos cilindricos. G ene
ralmente los equipos tienen capacidad para 8
tubos cilindricos de 80 mm de alto y 5 mm de

910

Mtodos inmunoqumicos
F ig . 4 2 - 1 . E sq u e m a .s d e
e le c tr o f o r e s is en g e le s d e
p o li a c r i la m i d a , A . a y b ,
cubas de corrida, con buffer;
c, e le c tr o d o s d e p la tin o o
carbn; d, tubos de corrida.
B, repre.sentacin esquem
tica d e electroforesis en gel
de p o liacrilam id a en placa.
1. Gel de poliacrilam ida pa
ra el ap ilad o o s ta ck in g de
las p rotenas de la m uestra.
2, G el de resolucin. 3 y 4.
R e se rv o rio s q u e co n tien en
las soluciones buffer. 5 y 6 .
Electrodos.

B
dimetro interno. Para conseguir despus de las
.corridas electroforticas un buen desprendi
miento del gel, los cilindros de vidrio deben ser
previam ente siliconados. Para ello, preparar
una solucin de silicona en isopropanol-tolueno (10:90) con la que se llenan los tubos previa
obturacin de uno de sus extremos usando parafilm o cualquier dispositivo adecuado. Dejar
en contacto unos minutos, volcar la solucin,
desobturar los tubos y ponerlos en estufa a
50C para eliminar los restos de solventes.
El volumen de gel de poro grueso y de reso
lucin a preparar depende del nmero de tubos.
Establecida la cantidad mezclar todos los reac
tivos indicados en el cuadro 42-1, excepto el
TEMED. Desairear por aspiracin con vaco, y

slo al fin a liz a r la o p e ra c i n se a ad e el

TEMED el cual se incorpora por agitacin sua
ve. El gel as preparado est en condiciones de
ser usado.
Para el llenado de los tubos de vidrio con los
geles, obturar su extremo inferior y mantener
los en posicin vertical. Para tubos de 80 mm
de alto introducir gel de resolucin hasta 65
mm de altura, utilizando pipeta Pasteur y evi
tando inclusin de burbujas de aire. Para evitar
la formacin de menisco cubrir el gel con agua,
con cuidado, sin mezclar. Dejar gelificar a tem-

F ig . 42-2. Fotografa del equipo usado p ara electroforesis

en gel de p oliacrilam ida en tubo.

F ig. 42-3. Fotografa de una corrida electrofortica en gel

de poliacrilam ida en tubo.

Electroforesis en gel de poliacrilamida

F ig . 42 -4. A , esq u em a del equipo
p ara electroforesis en gel de p o lia
crilam ida en placa; B y B , vidrios
usados para el arm ado de las placas
de gel de poliacrilam ida; C y C , se
paradores de acrlico para los bordes
la terales e in fe rio r; D , p e in e p ara
elaborar las cam aritas de siem bra, y
E , sujetadores metlicos.

911

- 12,8 cm-

-19cm -

1 cm

-18cm 11,5 cm

0,5 cm 0,7 cm

fc - " 1 8 5 c m ^ ^ ^ ^ 5
peratura am biente evitando vibraciones, que
pueden alterar la calidad de los poros. Si la co
rrida electrofortica no se realiza el mismo da,
conservar los tubos en cmara hmeda.
Producida la gelificacin, volcar el agua por
inversin y aadir una capa de 5-10 mm de es
pesor de gel de poro grueso; cubrir con agua y
dejar gelificar como en el paso anterior. Inm e
diatamente despus se arma el equipo y se co
nectan los tubos con el gel.
La cantidad de muestra a sembrar puede os
cilar entre O-100 |J,1, dependiendo ello de la
concentracin de los diferentes componentes
presentes. Entre 1 y 10 |ig pueden ser bien de
tectados, considerndose 100 |ig en total, una
cantidad aceptable cuando se trata de una m ez
cla compleja. Efectuada la siembra, se comple
ta el llenado de los tubos con buffer del reservorio (solucin de reserva diluida 1:10 en agua
destilada). Ambos reservorios, el superior y el
inferior, en los que se hacen penetrar los extre
mos inferiores de los tubos, son llenados con el
buffer correspondiente (diluido 1:10). Inmedia
tamente despus se conectan los electrodos a la
fuente de poder (ctodo: reservorio superior, y

nodo: reservorio inferior). La intensidad de

corriente debe ser de 4 mA por tubo durante el
empaquetamiento de las protenas en el gel de
apilamiento o stacking y de 6 mA cuando se
desplazan en el gel de resolucin. La corrida se
da por fin alizad a cuando el colorante lib re
(azul de bromofenol), que en las condiciones
de la corrida se desplaza por delante de las p ro
tenas, llega al extremo inferior del tubo. Para
las condiciones especificadas, el tiempo de co
rrida es ele 2-2,5 horas.
Se desarm a el aparato y se procede a d es
prender el gel contenido en los cilindros de v i
drio. Ello se consigue con un mandril adecua
do, operando debajo del agua en un recipiente
apropiado, para evitar que el gel se rompa. El
desprendimiento se ve facilitado si los tubos de
vidrio fueron previamente siliconados. Los ci
lindros de gel se transfieren a tubos de 120x10
mm con solucin fijadora, la que luego de 30
minutos es sustituida por solucin colorante.
Despus de 8-10 horas de tincin se procede a
decolorar para eliminar el colorante no retenido
por los componentes de la muestra analizada.
Se efectan varios recambios del decolorante.

912

Mtodos inmunoqumicos
En el comercio existen equipos especiales
que permiten cuantificar por densitometra los
diferentes componentes sometidos a anlisis.
Dada su mayor laboriosidad, actualmente el
uso de la eleetroforesis en tubos cilindricos est
restringido a los fines preparativos, cuando se
desea aislar y recuperar del gel algunas de las
protenas sometidas a la separacin electrofortica, ya sea por elucin con agua destilada o
por eectroelucin. Los geles cilindricos tienen
capacidad para sembrar mayores voMmenes de
muestras, por lo cual son mejores para estos fi
nes.
La eleetroforesis empleando geles cilindri
cos es actualmente ms utilizada en las tcnicas
de eleetroforesis en 2 dimensiones, donde la
mezcla de protenas se separa en una primera
dimensin segin sus pL en un gel cilindrico
(en general un tubo capilar), el cual se adosa
luego a un gel en placa para realizar otra sepa
racin electrofortica en una segunda dimen-

F ig . 42-5. Fotografa del equipo usado para eleetroforesis

en gel de acrilam ida en placa.

dndose por finalizada la operacin cuando se

observen las bandas proteicas bien teidas, li
bres de colorante de fondo.

m m

"-.

F ig . 42-6. Fotografa de corridas electroforticas en placas

correspondientes a Usados de diferentes especies de E nte
robacterias.

II.
Eectroforesis en placas. Los elementos
necesarios para esta clase de eleetroforesis
son:
a) Geles y soluciones buffer: los indicados
para eleetroforesis en tubos.
b) Placas de vidrio: su formato depende del
aparato. Las utilizadas normalmente son de 20
cm X 1 5 cm. Una de ellas posee una escotadu
ra, que le permite al gel ponerse en contacto
con el buffer del reservorio superior. Para deta
lles vanse figuras 42-15, 42-4 y 42-5.
e)
Separadores: pequeas lminas de acrlico de 1 cm de ancho y de largo tal que permi
tan cubrir el perm etro correspondiente a las
partes laterales e inferior de las placas. El espe
sor de los separadores (1-1,8 mm) ser el que
determinar el espesor del gel.
d) Sembrador: para construir en el gel de
poro grueso o apilamiento las pequeas fosas
que habrn de contener las muestras a sembrar,
se utiliza el dispositivo en forma de peine indi
cado en la figura 42-4.
e) Sujetadores metlicos: son indispensables
para mantener unidas las placas de vidrio que
conforman la cmara plana que contiene el gel
y para el mantenim iento de ste en contacto
con los reservorios catdicos y andico.
f) Reservorios: existen diferentes modelos.
El de las figuras 42-4 y 42-5, es usado en nues
tros laboratorios y est construido en placas de
acrlico de 4 mm de espesor.
Armado del equipo y corrida electrofortica.
C olocar sobre una superficie lisa y nivelada
una de las placas de vidrio, haciendo deslizar
por los bordes laterales e inferior una banda fi-

Electroforesis en gel de poliacrilamida

913

kD

kD

116----97,4-----

11697,4^

6 6 ----

4 5 ----2 9 -----

45-

m
IJ

l!

29-

Fig. 42-7. Sepai-acin por SD S-PA G E de distintos estadios de Trypanosom a cruzi. A . G el de resolucin al 10% de acrilam ida-bisacrilam ida. a. Patrones de peso m olecular; b. tripom astigotes m etacclicos; c. am astigotes; d . tripom astigotes sa n
guneos; e. epim astigotes. B. G el de resolucin al 7,5% de acrilam ida-bisacrilam ida. a. Patrones de peso m olecular; b -f.
tripom astigotes obtenidos luego de diferentes das de cultivo. La tincin se realiz con C oom assie B lue R2,)0. A la iz
quierda se indica la m asa m olecular relativa en kD de los patrones de peso m olecular.

liforme de agar (2,5% en agua) fundido en ba

o de agua liirviente. Apoyar sobre ella los se
paradores de modo de formar un marco con el
borde inferior y los laterales. Distribuir agar
sobre los separadores, de manera igual a la des
crita, apoyando inm ediatam ente la otra placa
de vidrio, presionando y fijando con los sujeta
dores metlicos.
Gelificado el agar, probar, mediante llenado
con agua, que la cmara formada no tiene pr
didas. Escurrir el agua y llenar con gel de reso
lucin hasta una altura de 15 cm. Cubrir con
agua y dejar gelificar. Producida la gelificacin, volcar el agua y cubrir con gel de poro
grueso o apilam iento, introduciendo en l el
sembrador, de modo que al gelificar se formen
las pequeas camaritas de siembra. Dejar geli
ficar, retirar el sembrador y el separador corres
pondiente a la parte inferior de las placas, de
modo que cuando sean introducidas en el reser
vorio correspondiente, el gel pueda ponerse en
contacto con el buffer de corrida. A rm ar el
equipo haciendo que la placa que presenta la
escotadura se conecte con el reservorio supe
rior. Conviene colocar entre ambos una junta
de goma o plstico para asegurar un buen con
tacto y al presionar evitar prdidas de buffer.
Introducir la parte inferior de la placa en el re
servorio andico y fijar adecuadamente.
Introducir las diferentes muestras en cada
una de las camaritas de siembra, completando
su llenado con buffer para los reservorios (so
lucin de reserva diluida 1:10 en agua destila
da). Llenar los reservorios con el mismo buffer
y conectar los electrodos con la fuente de po

der. Para una placa de 15 cm x 15 cm x 1,8

mm se aplica una corriente de 32 mA cuando la
muestra se desplaza en el gel de poro grueso o
apilamiento, y de 45 mA cuando lo hace en el
gel de resolucin.
Como en el caso de la electroforesis en tu
bos, la posicin del colorante en la placa ser la
que indicar cundo la corrida se dar por con
cluida. Finalizada sta desarmar el equipo, reti
rar la placa de gel y, colocndola en una cuba
de vidrio adecuada, proceder a la fijacin, la
coloracin y la decoloracin, de igual m anera
que la indicada en electroforesis en tubos.
Una de las ventajas ms importantes de los
geles en placa es que varias muestras, incluidos
los marcadores de PM, pueden ser corridos en
las mismas condiciones en un solo gel y por lo
tanto los patrones de bandas son directamente
comparables, hecho que no se cumple en el ca
so del sistema que utiliza geles cilindricos, ya
que mnimas diferencias en la eficiencia de po
limerizacin, largo del gel y dimetro hace que
los geles cilindricos, aun de las mismas m ues
tras, raram ente sean idnticos (figs. 4 2 -6 y
42-7). Existen otras ventajas adicionales com o
por ejemplo: el uso de geles en placas perm ite
una mejor disipacin del calor, disminuyendo
la distorsin de las bandas, la forma de los g e
les hace ms fcil la densitometra y fotografa
y pueden secarse para guardarse o para hacer
autorradiografa.
A ctualmente varias firmas comerciales han
diseado aparatos que permiten desarrollar la
electroforesis en geles de p oliacrilam ida en
placas de dim ensiones ms pequeas. E sto s

914

Mtodos inmunoqumicos

nuevos sistemas de mini-geles perm iten un

anlisis ms rpido de muestras de protenas o
cidos nucleicos y que pueden ser desarrolla
dos en la mitad o el tercio del tiempo empleado
en los sistemas convencionales, mantenindose
una resolucin comparable. Estos nuevos siste
mas estn diseados de manera tal que pueden
realizarse al mismo tiempo dos geles en placas,
analizndose hasta 30 muestras diferentes.
En cuanto a las dimensiones de las placas de
vidrio, depende de la marca comercial pero en
general tienen apro x im ad am en te 8,3 cm x
10,2 cm con un tamao de gel de 7 cm x 8 cm.
Por lo tanto, el volumen de reactivos para un
gel de este tamao es considerablemente me
nor, con la consiguiente reduccin en los costos
de cada corrida. De acuerdo al espesor del gel,
que se ajusta segn los separadores utilizados
(de 0,5 mm a 1,5 mm), los volmenes pueden ir
desde 2,8 a 8,4 mi. La cantidad de muestra a
sembrar tambin ser menor (desde 5 a 50 ^il),
dependiendo de la concentracin disponible.

Coloracin por Coomassie Blue

Este colorante permite detectar de 0,2 a 0,5
|j.g de cualquier protena en una banda fina. Da
do que el colorante est preparado en una solu
cin conteniendo cido actico, la fijacin de
las protenas y su coloracin ocurren en el mis
mo momento.

Coloraciones alternativas
a) Tinci'arentica.
La coloracin\on Coomassie Blue no es su
ficientemente sen^ble para detectar protenas
en trazas o bajas doncentraciones. Como alter
nativa la coloracin con plata permite la detec
ci n de p ro te n a s en el ra n g o de lo s ng
(2-10 ng).
La tcnica descrita por Merril y col., emplea
da en nuestro laboratorio es la siguiente:
1. Colocar el gel en un recipiente contenien
do una solucin al 50% de metano! y 12% de
cido actico por un tiempo mnimo de 20 mi
nutos para la fijacin de las protenas (puede
dejarse toda la noche).
2. El exceso de SDS del gel es removido por
3 lavados de 10 min cada uno, con agitacin,
con una solucin al 10% de etanol y 5% de ci
do actico.
3. A g re g a r u n a so lu c i n d e 0 ,0 0 3 4 M
KjCrO^ y 0,0032 N cido ntrico e incubar du
rante 5 min.
4.Realizar 4 lavados con H^O destilada, de
30 seg cada uno, con agitacin.
. 5. Agregar una solucin de 0,012 M de ni
trato de plata e incubar durante 30 min (para

aumentar la sensibilidad se recomienda que los

primeros 5 min el gel se exponga a una luz in
tensa y uniforme).
6.
Enjuagar rpidam ente 2 veces con una
solucin desarrolladora conteniendo 0,28 M de
carbonato de sodio y 0,5 ml/1 de formol y luego
dejar incubando en esta solucin hasta que las
bandas adquieran una tonalidad marrn amari
llenta. La tincin de fondo aum enta con el
tiempo, por lo que la operacin debe interrum
pirse en el m om ento adecuado, m ediante el
agregado de 1% AcH.
Los volmenes a utilizar de todas estas solu
ciones depender del tamao del gel, para el
caso de geles de 7 cm x 9 cm, sern suficientes
100-150 mi de cada una de las soluciones para
cubrirlo perfectamente.
Nota: Se debe trabajar con guantes descartables para evitar impregnaciones exgenas del
gel. Los recipientes a usar deben estar bien lim
pios y enjuagados con agua destilada.
B) Tincin con reactivo de Sciiiff-cido p e
ridico (PAS). Algunas glucoprotens con alto
contenido en hidratos de carbono no fijan ade
cuadamente el Coomassie Blue. En estos casos,
0 cuando interese establecer la presencia de
glucoprotens, puede realizarse una reaccin
de PAS. El mtodo usado en nuestros laborato
rios es el que sigue.
1. Las protenas separadas en el gel de poliacrilamina son fijadas por inmersin en solucin
de etanol al 40% y cido actico al 5% en agua
destilada, durante 18 horas, efectuando cam
bios peridicos de la solucin.
2. Transferir a una solucin de cido peridi
co al 0,7% durante 2-3 horas.
3. Tratar con solucin de m etabisulfito de
sodio al 0,2% en cido actico al 5%, durante
2-3 horas, con un recambio luego de los prime
ros 30 minutos.
' 4. Incubar con reactivo de Schiff 12 a 18 ho
ras y guardar los geles a 4C, en el mismo reac
tivo y en la oscuridad.
Se recom ienda registrar los resultados por
fotografiado, inm ediatamente despus de ter
minada la coloracin.
5.
Se puede intensificar el color por transfe
rencia a una solucin de metabisulfito de pota
sio al 0,2% en cido actico al 5%. Despus de
2 horas de permanencia de los geles en la solu
cin, la coloracin de las bandas se hace ms
intensa.
Preparacin del reactivo de Schiff. Disolver
2,5 g de fucsina bsica en 200 mi de agua des
tilada caliente; enfriar y agregar 50 mi de HCl
1 N y 4,25 g de metabisulfito de sodio, comple
tando 500 mi con agua. Agitar hasta la decolo
racin.

Eleetroforesis en gel de poliacrilamida

915

D e t e r m in a c i n d e p e s o s m o l e c u l a r e s
R E L A T IV O S M E D IA N T E E L E C T R O F O R E S IS
EN G E L D E P O L IA C R IL A M ID A E N P L A C A

Si se corren en diferentes calles de una m is

ma placa pptidos de pesos moleculares cono
cidos que previamente fueron hervidos 3 m inu
tos en presencia de SDS y 2-mercaptoetanol y
sustancias cuyo PM se desconoce, previamente
sometidas al mismo tratamiento, es posible co
nocer los pesos moleculares relativos (M r) de
esas sustancias o las de sus pptidos constituti
vos. Ello puede hacerse determinando la m ovi
lidad relativa de la protena que interesa m i
dindola con referencia a una protena estndar
o a un colorante trazador. Generalmente se ha
ce respecto del colorante marcador que norm al
mente se incorpora al gel.
M ovilidad
relativa (Rf)

D istancia m igrada por la p ro ten a

D istancia m igrada por el co lo ran te

Si se determina el R f de diferentes pptidos

de PM conocido, con los datos obtenidos es po
sible graficar log PM versus Rf. Conociendo el
Rf de una sustancia en anlisis, puede calcular
se su PM relativo o M r por interpolacin en la
curva (fig. 42-8).
Las sustancias de referencia ms usadas fi
guran en el cuadro 42-2.
F ig. 42-8. D eterm inacin de pesos m oleculares relativos
(M r) por eleetroforesis en gel de acrilam ida en placas. C a
lles: a, patrones de pesos m oleculares conocidos; b. IgG ; c,
albm ina; d , IgG reducida y alquilada (cadenas H y L); e,
suero hum ano norm al.

Poner en contacto con carbn activado pre

viamente lavado con cido clorhdrico y agua.
Eliminar el carbn por centrifugacin, ya que
el uso de papel de filtro (por ser celulosa) colo
rea la solucin. Filtrar por lana de vidrio, de
biendo quedar el filtrado incoloro.
Conservar a 4C en frascos oscuros.
Secado de los geles
Luego de la corrida electrofortica los geles
pueden conservarse por tiem po indefinido a
travs del secado de los mismos. Este procedi
miento es posible con geles de un espesor no
mayor a 1,5 mm.
Existen aparatos diseados para tal fin, de
forma tal que se aplica calor al gel y al mismo
tiempo vaco, para evitar la rotura irreversible
del mismo. Para evitar que el gel reduzca su ta
mao, ste se coloca sobre un papel de filtro y
sobre el gel un papel de celofn. Dependiendo
el espesor del gel este procedimiento puede lle
var aproximadamente de 2 a 4 horas.

C u ad ro 4-2. Pesos moleculares de p olippti

dos estndar

Polippdo
Cadena pesada de m ioslna (m sculo de conejo)
Subunidad P de ARN polim erasa (E. col)
p-galactosidada (E. col)
F oslrilasa a (m sculo de conejo)
Seroalbm ina bovina
C atalasa (hgado de bovino)
Piruvatoquinasa (m sculo de conejo)
G lutam atodehidrogenasa (hgado bovino)
F um arasa (hgado de cerdo)
O voalbm ina
Enolasa (m sculo de conejo)
A lcoholdeshidrogenasa (hgado de caballo)
A ldolasa (m sculo de conejo)
Subunidad de ARN polim erasa (. coli)
L actatodeshidrogenasa (corazn de cerdo)
Pepsina
A nhidrasa carbnica
Q uim otripsingeno A
T ripsina
Inhibidor d e tripsina (soybeun)
IVIioglobina (corazn de caballo)
a-lactoalbm in a (leche bovina)
Lisozim a (clara de huevo)
C itocrom o c

P e so
m o lec u la r
(lD)

212
155
130
92

68
57,5
5 7 ,2
53
4 8 ,5
43
42
41
40
39
36
35,5
29
2 5 ,7
24
2 0 ,!
16,95
14,4
14,3
11,7

N ota; to d o s los p roductos ind.icados p u ed e n adquirirse c o in c rc ia lm enlc.

916

Mtodos inmunoqumicos

Para calcular PM conviene hacer dos corri

das en geles de diferente porosidad. En ambos
casos los resultados deben ser eoincidentes.
En el mercado existen mezclas de protenas,
ya listas para usar, de masa molecular relativa
conocida, en un rango de alto o bajo peso mo
lecular, eligindose la ms conveniente, lo que
depende de la concentracin de gel de resolu
cin que vaya a utilizarse y de las protenas de
inters analizadas. Se encuentran disponibles
tambin marcadores preteidos, lo cual permite
ir evaluando la corrida electrofortica a medida
que va ocurriendo. Hay tam bin otro tipo de
mezclas denominadas rainbow (arco iris) o
caleidoscopio, donde los marcadores constituti
vos estn preteidos con diferentes colores ca
da uno, lo que permite una identificacin rpi
da de los mismos, evitndose malas interpreta
ciones de las bandas obtenidas.
ISO E L E C T R O E N FO C A D O
El isoelectroenfocado es una tcnica de se
paracin por electroforesis muy usada en el
anlisis de protenas, la que es desarrollada en
un gradiente de pH establecido entre dos elec
trodos y estabilizado por anfolitos transporta
dores. Mediante esta tcnica las protenas migran hasta alinearse en la zona del gradiente de
pH correspondiente a su punto isoelctrico (pl).
Aqu la protena no posee carga neta y la mi
gracin cesa. Es una tcnica de alto poder reso
lutivo; pueden separarse componentes que di
fieren en 0,001 unidades de pH.
Los anfolitos usados para isoelectroenfocado
deben ser sustancias con una gran capacidad
buffer. Ello significa que estas sustancias son
las que deben establecer las caractersticas del
pH de un gradiente, aun en presencia de altas
concentraciones de sustancias que se compor
tan como anfolitos, como lo son las protenas.
Cuando un anfolito se halla a un pH superior
al de su pl, est cargado negativamente, y su
carga ser positiva en caso contrario. En un
campo elctrico con pH variable migrar hasta
la zona correspondiente a su punto isoelctrico,
donde se concentrar. Para que una sustancia
funcione como un buen anfolito debe poseer
cierta capacidad buffer en su pl. Para ello, sus
pKj y pKj deben estar lo ms prximos posible
y pl-pK no deben diferir en ms de 0,5 unida
des. Debe formar, adems, un pequeo plateau
de pH alrededor de su mxima concentracin.
Si se dispone de una mezcla de anfolitos con pl
prximos que responden a esas caractersticas,
se originar un gradiente de pH.
Las protenas, por ser anfotricas, migrarn
y se focalizarn de la misma manera, alinen
dose en sus correspondientes pl.

Diferentes sustancias han sido experimenta

das como anfolitos. Aminocidos, polipptidos
sintticos y protenas hidrolizadas no han dado
resultados aceptables. Pharmacia ha consegui
do elaborar mezclas d e productos que funcio
nan muy bien con esa finalidad y que abarcan
diferentes rangos de pH. Se los conoce comer
cialmente con el nombre de Pharmalyte y se
obtienen por copohmerizacin de aminas selec
cionadas con epiclorhidrina. El producto se ca
racteriza por no contener zonas de reducido po
der buffer o pobre conductividad, hecho obser
vado en otros anfolitos.
Si bien las protenas y los anfolitos son sus
tancias anfotricas, las primeras, por su mayor
tamao, tienen un coeficiente de difusin me
nor. Adems, la capacidad buffer de las prote
nas, por unidad de peso, es menor. Esto signifi
ca que, si ambos productos estn presentes en
cantidades similares, el gradiente de pH ser
determinado por el anfolito, prcticamente sin
modificaciones debidas a la accin buffer de la
protena. Como consecuencia de sus mayores
coeficientes de difusin y zonas de sobreposicin, resulta prcticam ente imposible separar
dos anfolitos con pl prximos, cosa que se lo
gra con protenas.
Inicialmente el isoelectroenfocado se desa
rroll en medio lquido en gradiente de sacaro
sa. Actualmente se prefieren los medios gelificados como la agarosa o el gel de poliaerilamida, siendo ste el de preferencia.
Para ensayos analticos los geles de agarosa
y de poliacrilam ida en bajas concentraciones
(3%), son buenas matrices para realizar el isoelectroenfoque, dado que no constituyen un me
dio tamizador, por lo tanto el tamao molecular
de las protenas no ser un factor determinante
de la movilidad al someterse a un campo elc
trico. La agarosa tiene la ventaja de tener poros
grandes pero tambin la desventaja de que pue
de tener grados variados de cargas negativas
residuales de grupos sulfatos. Por esa razn, los
geles de poliacrilamida son los geles de elec
cin.
Las muestras de protenas para isoelectroenfoque deben estar libres de material insoluble y
de sales, por lo tanto, previo a su aplicacin las
muestras deben desalificarse, dializarse contra
agua destilada, o contra una solucin al 2% de
anfolitos o al I % de glicina.
PARTE EXPERIMENTAL
El isoelectroenfoque con poliacrilamida co
mo gel puede hacerse en cilindros o placas. A
continuacin se describe la metodologa y los
m ateriales necesarios para realizar iso elec
troenfoque en mini-geles.

Electroforesis en gel de poliacrilamida

Con este sistema el gel se pone en contacto
(en form a invertida) directam ente sobre los
electrodos de grafito conectados directamente
al nodo y al ctodo. El gel tiene un tamao de
125 X 65 X 0,4 mm
a) Reactivos
1. Solucin de reserva de poliacrilamida.
24,25% P/V acrilamida
0,75% P/V bisacrilamida
Esta solucin puede almacenarse a 4C y a
resguardo de la luz durante 1 mes.
2. Riboflavina 0,1% P/V.
3. Persulfato de amonio 10% P/V (preparar
en el momento)
4. Glicerol 25% P/V.
5. TEMED
Se prepara la solucin de po liacrilam ida
conteniendo los anfolitos de la siguiente forma.
HjO destilada ...........................................
Sol. reserva de poliacrilamida ..............
Glicerol .....................................................
Anfolitos (40% en H^O destilada).........

5,5
2,0
2,0
0,5

mi
mi
mi
mi

Esta mezcla se desairea durante 5 minutos y

luego se agrega la solucin iniciadora conte
niendo:
Persulfato de amonio (10% P /V ) ........... 70 |iJ
Riboflavina (0,1% P /V ) .......................... 50 |al
TEMED ..................................................... 5 |J,1
Luego esta mezcla se coloca rpidamente en
el aparato diseado para el ensamblado del gel
y se irradia con una fuente de luz fluorescente
durante 45 minutos para permitir la polimeriza
cin dado que en este caso la luz acta como

C uadro 42-3. Soluciones de electrlitos reco

mendadas para usar con Pharmalyte cuando el
electroenfocado se realiza en geles cilindricos
Pharm alyte
Intervalo
de p H
2,5 - 5
4 ^ 6,5
5 -8
6,5 - 9

8 - 10,5
3 - 10

Solucin
nodo (+)

Solucin
ctodo f - j

A cido am inoactico
0,01 M
A cido glutm ico (DL)
0,01 M
A cido glutm ico (DL)
0,01 M
H EPES*
0,01 M
HEPES*
0,01 M
A cido im idoactico
0,01 M

HEPES*
0,01 M
H istidina
0,01 iVI
Etanolam ina
0,01 M
Etanolam ina
0,01 M
Etilendiam ina
0,01 M
Etilendiam ina
0,01 M

cido N -2 h id ro x iclil p ip e ra z in a -N -2-etanesulfnico.

917

C u ad ro 42-4. Soluciones de electrlitos reco

mendadas para usar con Pharmalyte cuando el
electroenfocado se hace en geles en placas
Pharm alyte
Intervalo
de p H
2 ,5 - 5
4 - 6,5
5 -8
6 ,5 - 9

8 - 10,5
3 - 10

Solucin
nodo (+ )

Solucin
ctodo {)

H jS O .O .l M

L,-histidina 0,2 M
0 N aO H 0,1 M
L -histidina 0 ,2 M

cido glutm ico (DL)

0,04 M
A cido glutm ico (DI^)
0,04 M
H EPES*
0,25 M
H EPES*
0,25 M
A cido asprtico (I5L)
0,04 M

N aO H 1 M
NaOH 1 M
NaOH 1 M
NaOH 1 M

cido N -2 h id ro x iclil p ip era /,in a -N -2-ctanesulf()nico,

catalizador de la reaccin. Como el gel es de

0,4 mm de espesor se arma sobre una m em bra
na especial denominada Gel Bond.
La aplicacin de las muestras es ms conve
niente utilizando sem bradores especiales que
permiten sembrar cantidades de 0,5 a 2 |a,l; se
deja difundir durante 5 minutos y el gel se co
loca directamente sobre los electrodos en fo r
ma invertida.
b) Soluciones buffer para los reservorios. En
el cuadro 42-3 estn indicadas las soluciones
andicas y catdicas a usar cuando el isoelectroenfocado se hace en tubos cilindricos. En el
cuadro 42-4 estn indicadas las soluciones a
usar cuando la electroforesis se hace en placas
de 1 mm de espesor.
c) C ondiciones de corrida. El enfoque se
realiza a voltaje constante que se va aumentan
do en forma gradual. Se comienza con 15 m i
nutos a 100 voltios, luego se aumenta a 200
voltios por 15 minutos y finalmente se aumenta
a 450 voltios durante 60 minutos adicionales.
Finalizada la corrida se desarma el equipo,
se seca el gel (adherido al Gel Bond) a 37C
y luego se colorea en la forma indicada p ara
SDS-PAGE.
IN M U N O TR A N SFER EN C IA
(Im m unoblotting)
La transferencia de componentes separados
por electroforesis en un medio soporte gelificado, como la agarosa, a otro en el que los p ro
ductos transferidos pudieran dar una unin fir
me con el soporte, como lo son las membranas
de nitrato de celulosa, fue descrita inicialmente
por Southern para hbridos de ARN-ADN. En
este caso la transferencia se hace por sim ple

918

Mtodos inmunoqumicos

contacto del gel de agarosa, en el que se ha rea

lizado la separacin electro fo rtica, con la
membrana de nitrato de celulosa. Los produc
tos fijados a ella se identifican por tincin di
recta.
Poco tiempo despus fue descrita, para sus
tancias antignicas, una tcnica similar a la an
terior en la que los componentes de una mezcla
son separados por SDS-PAGE, y la transferen
cia a las membranas de nitrato de celulosa tiene
lugar mediante el paso de corriente elctrica, a
pH alto. Como consecuencia, las m olculas
proteicas se movilizan y contactan con la mem
brana de nitrato de celulosa, donde se fijan. Las
molculas antignicas transferidas son identifi
cadas por interaccin con anticuerpos especfi
cos. Los complejos Ac-Ag formados pueden
ser identificados desarrollando sobre el com
p le jo fo rm ad o u na re a c c i n c o lo re a d a de
ELISA (fig. 42-9). La identificacin de antge
nos en la forma descrita ha sido denominada
inm unotransferencia o immunoblotting segtin
la literatura inglesa.
Un mtodo para la transferencia por difusin
consiste en crear un flujo de solvente desde el
gel a travs de la membrana por capilaridad.
Esto se logra poniendo la membrana sobre el
gel y sobre sta papel de filtro y una pila de

kD

131
-1 2 5
116
\ 1 1

51
1 45
43
b

F ig . 42-9. Reactividad por im m unoblotting de sueros de

pacientes chagsicos y leishm anisicos frente a epim astig o tes de T ry panosom a cruzi sep arad o s p or S D S -P A G E
con geles de resolucin al 7,5% de acrilam ida-bisacrilam ida. [a-cj. Sueros de pacientes leishm anisicos; d-g. Sueros
de pacientes chagsicos. En este caso se em ple un conju
gado ant-y globulina hum ana-peroxidasa y H , 02 -4 -Cl, 1naftol com o sustrato/crom geno. A la derecha se indica la
m asa relativa (en kD ) de los antgenos caractersticos reco
nocidos por los pacientes chagsicos.

toallas de papel absorbente, as, el buffer atra

viesa la membrana hacia las toallas de papel.
Estos mtodos de difusin son ms eficientes
con geles de agarosa, que tienen poros grandes
y no est limitado el movimiento de molculas
grandes. Con este procedimiento una transfe
rencia eficiente se realiza en tiempos de 90 min
a 2 horas, aunque puede dejarse toda la noche
sin inconvenientes.
Los geles de poliacrilamida, tanto en condi
ciones nativas como disociantes, tienen poros
ms pequeos, lo c]ue limita el movimiento de
molculas ms grandes, por lo tanto la transfe
rencia por capilaridad no es eficiente. La trans
ferencia del gel a la membrana en este ltimo
caso se lleva a cabo mediante el paso de co
rriente elctrica.
En cuanto a las membranas empleadas hay
de varios tipos aunque la de nitrocelulosa es la
ms utihzada. El mecanismo de unin a la ni
trocelulosa es debido fundamentalmente a inte
racciones del tipo hidrofbico. Las membranas
de nitrocelulosa de un tamao de poro de 0,45
|0.m es la ms empleada para la mayora de los
propsitos, aunque polipptidos de bajo PM
pueden pasar sin unirse, lo que puede ser solu
cionado con m em branas de 0,1 |im de poro.
Una desventaja de la nitrocelulosa es su baja
capacidad de unin, cerca de 80 |ag/cm^.
Hay otro tipo de m em branas disponibles,
como las catinicas de nylon (por ej,, Z eta
Probe'^, Bio-Rad), que son ms resistentes y
no se rompen al secarse, lo que ocurre con la
n itro celu lo sa. E stas m em branas tien en una
mayor capacidad de unin de protenas (hasta
500 Jg/cm^), aunque esto es dependiente de la
concentracin. Sin embargo, esta alta capaci
dad de unin se vuelve una desventaja ya que
estas m em b ran as tien d en a un ir p ro te n a s
inespecficamente, lo que resulta en altas se
ales de fondo, aun luego del bloqueo con
protenas inertes.
En cuanto a los buffers para la transferencia,
el ms utihzado contiene 25 mM tris, 192 mM
ghcina, pH = 8,3. El agregado de metanol pre
viene el hinchamiento del gel durante la trans
ferencia y aumenta la unin de las protenas a
la membrana, aunque reduce la eficiencia de
elucin de las protenas del gel.
Si las molculas transferidas van a ser identi
ficadas con un antisuero, un anticuerpo mono
clonal o alguna otra sonda es importante blo
quear los sitios libres de la membrana para evi
tar uniones inespecficas de estas sondas. Los
bloqueantes utilizados dependen del tipo de
membrana y de la sensibilidad del sistema em
pleado. Es importante recordar que estos blo
queantes no deben tener reactividad cruzada
con ninguno de los reactivos utilizados en las
etapas posteriores.

Electroforesis en gel de poliacrilamida

En general puede emplearse cualquier tipo
de protena o mezcla de protenas que resulten
inertes en el sistema. Por ser barata y accesible,
la leche descremada es muy utilizada, adems
se obtienen bajas seales de fondo. Una con
centracin adecuada sera de 0,5%. Se ha com
probado que concentraciones mayores (1-3%)
pueden producir un mayor despegado de las
protenas unidas a la membrana. Los detergen
tes no-inicos pueden tambin utilizarse como
bloqueantes, pero su mayor desventaja consiste
en que producen una considerable prdida de
protenas y las seales de fondo tienden a ser
ms altas. En el caso de utilizar membranas catinicas (p. ej., Zeta Probe'^) dada su mayor ca
pacidad de unin, se necesitan condiciones ms
estrictas para el bloqueo, con concentraciones
ms altas del bloqueante y tiempos y tempera
tura de incubacin mayores.
Las protenas transferidas son comnmente
analizadas con Ac especficos, polielonales o
monoclonales. En el caso de Ac polielonales
pueden utilizarse como antisueros o como Ac
purificados; esto ltimo es aconsejable en el
caso de que existan problemas de unin inespeefica. Adems puede utilizarse cualquier otra
sonda que se una especficamente a las molcu
las en estudio, por ejemplo: leetinas para detec
tar glucoprotenas, hormonas para la deteccin
de receptores, etc. El 1 Ac o sonda puede estar
marcado directamente o no, en este caso debe
usarse un
Ac o sonda marcado.
Este 1 Ac o sonda debe diluirse en la mis
ma solucin utilizada para el bloqueo, para pre
venir adsorciones inespecficas a la membrana.
En cuanto a los conjugados enzimticos usa
dos como 2*' Ac o sonda, las enzimas ms uti
lizadas son la peroxidasa del rbano picante o
fosfatasa alcalina. Los cromgenos en estos ca
sos son 4-C l-l-naftol y nitro tetrazolium blue
(NBT), respectivamente. El primero es consi
derado no carcinognico y da bajas seales de
fondo sin prdida de la sensibiUdad. Estos cro
mgenos dan productos insolubles que precipi
tan en el sitio de produccin y permanecen uni
dos a la membrana.
Las ventajas de los conjugados enzimticos
son la facilidad de manejo y almacenamiento y
el rpido desarrollo de color. La sensibilidad
est en el rango de 0 ,1 a 10 ng de antgeno por
banda, dependiendo del sistema.
Recientemente surgi como alternativa a las
sustancias cromognicas, el uso de luminol; es
te compuesto se oxida a un producto luminis
cente con emisin de protones que son detecta
dos por exposicin a una pelcula de rayos X y
se desarrolla como una autorradiografa. Los
tiempos de exposicin son muy cortos (1 seg a
10 min) y existe la posibilidad de hacer varias
exposiciones de una misma transferencia. Este

919

mtodo, adems, es aproximadamente 3 veces

ms sensible que el uso de sustancias eromognicas, y combina la rapidez y seguridad de los
sistemas enzimticos con la sensibilidad de los
radioistopos.
Para evaluar la transferencia a la membrana
es aconsejable hacer una tincin no especfica
de las protenas luego de la transferencia. Los
colorantes que pueden em plearse son: negro
amido, fast green, Coomassie Blue. Todos es
tos colorantes son irreversibles y la membrana
no puede utilizarse para identificar a las m ol
culas adsorbidas a ella con reactivos especfi
cos. En cambio el colorante Ponceau S tiene la
propiedad de teir en forma reversible, por lo
tanto, puede utilizarse para ver la eficiencia de
la transferencia y realizarse luego la reaccin
inmunoenzimtica, dado que durante la incuba
cin con la solucin de bloqueo se produce la
decoloracin. Esto permite identificar las d is
tintas calles transferidas, para poder cortar en
forma separada cada una de las calles si se d e
sea incubar con distintos Ac o sondas.
PARTE EXPERIMENTAL
El m todo de inm unotransferencia que se
describir es el que se utiliza en nuestros lab o
ratorios; emplea el desarrollo de un ELISA p a
ra la identificacin de los antgenos. Por l p u e
den detectarse hasta 10 ng de antgeno trab a
jando en condiciones adecuadas.
Reactivos
a) Medio de transferencia. Tris 25 mM, gli
cina 0,193 M, m etanol 20% (v/v), pH 8,35.
Conservar a 4C.
b) Solucin TBS. Tris 0,05 M, NaCl 0,15 M,
pH 7,4 (ajustar con HCl IN). Conservar a 4C.
c) Solucin TBS-L. Solucin TBS adiciona
da de 0,5% de leche descremada en polvo.
d) Sueros inmunes, especficos contra las
protenas en estudio.
e) Conjugado enzim tico. Suero antigam maglobulina de la especie animal a la que p e r
tenece el anticuerpo usado en d, conjugado con
peroxidasa.
f) Sustrato para la reaccin de ELISA. El
usado es el siguiente:
4. cloro naftol al 0,3% en
m etanol............................................ 1 volumen
Agua oxigenada (H^O^..................0,004
al 3 0 % )............................................ volmenes
T B S ...................................................5 volmenes
g) Nitrato de celulosa. Membranas de 0,45
pm de espesor.

920

Mtodos inmunoqumicos

-17, 4 cm

O O O O O O O O O

ooooooooo
ooooooooo
ooooooooo
ooooooooo
ooooooooo
ooooooooo
ooooooooo
ooooooooo
It^ o o o o o o o o

F ig . 4 2 -1 0 . E s q u e m a d el
equipo usado p ara inm unotra n s f e r e n c ia . A , c u b a d e
tra n sfe re n c ia ela b o ra d a en
acrlico. En las ranuras a y
a se insertan las placas B,
h ac ien d o un san d w ich con
los scotch-brite C, los p a
peles de filtro, la m em brana
de n itrato de ce lu lo sa y el
gel de poliacrilam ida (vase
texto); en las ranuras b y b
se in s e rta n las p la c a s q u e
contienen los electrodos de
platino. B, placas de acrli
co, p erforadas, usadas para
la contencin. C , esponjinas
s in t tic a s p o ro sas, p lan as.
L as q u e m e jo r se ad a p tan
son las com ercialm ente co
n o c id a s con el n o m b re d e
scotch-brite . D, electrodo
d e p la tin o u n ifo rm e m e n te
d istribuido sobre una placa
sim ilar a la B.

6 o iT0-0'-e--(:;xQj

l - L X O - Q - ^ ^ O ^ C y 'O
O T > t : > 0 - 0 - 0 - 0 - Q X )
J J ^ D - .0 - 0 - 0 - 0 - - ty 'C r S
D T ? 't) - 0 - O ^ O - O - O _ _ Q
C K jX ) - '0 - 0 '< y x T C f ^

uxyty-o~&-&QxxD

o o o CXO-^GKK^rO*
12 cm

Nota: Las membranas de riitrato de celulosa

deben ser manipuladas con guantes descartables para evitar contaminaciones con protenas
extraas.

17, 4 cm

Equipos
a) Para SDS-PAGE. Se emplean el equipo y
los reactivos indicados en el tpico correspon
diente.
b) Para la transferencia. Sus d iferentes
com ponentes estn indicados en ias figuras
42-10 y 42-11.

Modo operativo

F ig . 42-11. F otografa del equipo usado para inm unotrans

ferencia.

a) T reinta m inutos antes de term inado el

SDS-PAGE, se pone la membrana de nitrato de
celulosa, de igual tamao que la placa de gel de
poliacrilamida donde se ha efectuado la separa
cin electrofortica de los componentes de la
mezcla, en medio de transferencia.
b) Colocar 2-3 papeles de filtro del mismo
tamao que la membrana de nitrato de celulosa
en 300 mi de medio de transferencia, utilizan
do para ello un recipiente de vidrio de fondo
plano.
c) Retirar el gel de poliacrilamida del equi
po en el que se ha desarrollado el SDS-PAGE y

Eleetroforesis en gel de poliacrilamida

colocarlo sobre los papeles de filtro en el reci
piente que los contiene. Encuadrarlo y despus
de 15 minutos retirar el conjunto del medio pa
ra transferencia. Equilibrar el gel en el buffer
de transferencia tiene como finalidad facilitar
la remocin de las sales y detergentes del buf
fer de corrida. Si las sales no se remueven efi
cientemente podran aumentar la conductividad
del buffer de transferencia y como consecuen
cia aum entara el calor generado durante la
transferencia.
d) Colocar los papeles de filtro y el gel so
bre el scotch-brite (del mismo tamao que
aqullos), con el gel hacia arriba.
e) M ojar la superficie del gel con 10 mi de
medio de transferencia y colocar sobre ste la
membrana de nitrato de celulosa, previamente
escurrida, comenzando por un extremo y evi
tando la form acin de burbujas de aire. La
presencia de burbujas de aire puede evitar o
bloquear la transferencia de molculas en esa
zona.
f) Colocar 2-3 papeles de filtro de igual ta
mao a los anteriores, mojados en medio de
transferencia, sobre la membrana de nitrato de
celulosa.
g) U b ic a r po r e n c im a de e llo s la Otra
scotch-brite , con una esquina cortada para
saber que se es el lado donde se encuentra la
membrana de nitrato de celulosa.
h) Colocar las placas soportes de acrlico
perforado a ambos lados de las scotch-brite e
introducir el conjunto dentro de la cuba, en la
ranura de contencin, y llenar con el medio de
transferencia.
Nota: la membrana de nitrato de celulosa de
be quedar ubicada en la regin andica.
i) Se incorporan a la cuba las placas con los
electrodos, se los conecta a la fuente de poder y
se hace pasar la corriente elctrica.
Para el ec]uipo de la figura 42-9, las condi
ciones de corrida son 200-400 mA, con un vol
taje aproximado de 60 voltios. El tiempo puede
oscilar entre 1,5-3 horas a 4"C.
j) Terminada la corrida, desarmar el equipo,
retirar la membrana, colocarla en un recipiente
adecuado y agregarle una solucin al 0,2% de
Ponceau S en cido tricloroactico 0,3%, en un
volumen tal que cubra totalmente la membrana.
Incubar 5-7 minutos a tem peratura ambiente.
Enjuagar con agua destilada hasta que se obser
ven claramente las bandas, cortar la calle co
rrespondiente a los patrones de peso molecular
y conservarlos. Si fuera necesario cortar las di
ferentes calles e identificarlas para poder luego
realizar la reaccin inm unoenzim tica sobre
ellas.
k) Los grupos reactivos libres de nitrato de
celulosa se bloquean con solucin de TBS-L
durante 30 min a 37C.

921

Esta operacin es indispensable para evitar

fijaciones inespecficas de los antisueros en las
operaciones siguientes.
1) Lavar con solucin l BS durante 5 m inu
tos.
m) Diluir adecuadamente en TBS-L el suero
que contiene los anticuerpos especficos contra
las protenas en anlisis e incubar la membrana
de nitrato de celulosa con esta dilucin, durante
2-3 horas, a temperatura ambiente, con agita
cin suave.
n) Terminada la incubacin, eliminar la so
lucin de anticuerpo y lavar 4 veces, durante
15 minutos cada vez, con TES.
o) Incubar con la dilucin conveniente del
conjugado an tigam m aglobulina-peroxidasa,
procediendo de igual manera que la indicada
en m.
p) Repetir el paso n.
q) Aadir solucin de sustrato para la reac
cin de ELISA, dejar en contacto 15 minutos y
lavar con agua.
r) Conviene registrar los resultados por fo to
grafiado, inmediatamente terminada la colora
cin y cuando la membrana de nitrato de celu
losa todava est hmeda (opaca). Se obtiene
mayor nitidez.

Sistema automatizado
En el ao 1986 se dise un sistema autom a
tizado para el anlisis de protenas, pptidos y
cidos nucleicos. Este aparato denominado co
mercialmente Phast system (Pharmacia), p er
mite un anlisis rpido, con alta resolucin y
reproducibilidad.
Este sistema consiste en:
a) una unidad de separacin con capacidad
para correr dos geles simultneamente y que
mantiene controlada la tem peratura en form a
uniforme por un sistema de refrigeracin elc
trica;
b) una fuente de poder con capacidad de
hasta 2000 voltios, lo que p erm ite re a liz a r
SDS-PAGE, PAGE nativo, isoelectroenfoque,
geles en dos dimensiones, transferencias, etc.;
c) un m icroprocesador que controla todos
los parmetros, pudindose almacenar distintos
programas de trabajo;
d) una unidad desarrolladora que permite la
autom atizacin de los pasos de coloracin y
decoloracin, lo que otorga mayor velocidad y
reproducibilidad;
e) una unidad de transferencia, que u tiliza
un mtodo semi-seco de transferencia de p ro
tenas a membranas, aumentndose la rapidez
del proceso y m anteniendo la rep ro d u cib ili
dad.

922

Mtodos inmunoqumicos

El mtodo cuenta con la posibilidad de dis

poner de geles preformados, para distintas va
riedades de tcnicas electroforticas, es decir,
SDS-PAGE (geles homogneos y en gradien
te), PAGE nativo, lEF, geles en 2 D, lo que re
duce considerablemente los tiempos al no tener
que prepararlos. Luego de todo el proceso, es
tos geles se secan rpidamente, sin sufrir nin
guna rotura o distorsin de las bandas. Este sis
tema utiliza adems geles embebidos con los
buffers para la corrida, lo que evita el gasto de
grandes volmenes de buffers.
Los tiempos necesarios para todo el procedi
miento seran aproximadamente los siguientes:
- 20-60 minutos para la separacin electrofortica;
- 30 minutos para la coloracin por Coomassie
B lue o 60 m inutos para la coloracin con
plata;
- 10-30 minutos para la transferencia a mem
branas.
- 10-20 minutos para el anlisis de imgenes
de alta resolucin.

La automatizacin de todo el sistema incluye

la aplicacin de la muestra, el control de los
voltajes y/o la corriente aplicados, la colora
cin y decoloracin, el anlisis de las imgenes
y el informe de los resultados.

B IB L IO G R A F A
H am es, B. D., 1981. En: Gel electrophoresis: a practical
approach. H am es B. D ., R ick w o o d Eds. L o n d o n , IR L
Press.
Isoelectrjc focusing. Principies and M ethods. Editado por
Pharm acia Fine Cliem ical, Suecia, 1982.
IVlerril, C. R., G oldm an, D,, Sedm an, S, A. & Ebert, M. H.
1981. U ltrasensitive stain for proteins in polyacrilam ide
gesl show s reg io n al v ariations in ce reb ro sp in al fluids.
.Science 2)1: 1437.
O F arrell P. H ., 1975. H ig h reso lu tio n tw o~dim ensional
electrophoresis o f proteins. J. Biol. Chem . 250: 4007.
Righetti, P.O. 1983. En: Isoeiectric focusing: theory, methodology and ap p licatio n s. S. V\^ork & R. El. B urdon,
eds. Elsevier Science Publishers B. V. Am sterdam .
Stott, D. I. 1989. Im m unoblotting and dot blotting. J. 1ramunol. M ethods. 119: 153.
Tow bin, H., Staehelin T & Gordon, J. 1979. Electrophoretic transfer o f proteins from polyacrilam ide gels to nitroceilulose sheets: procedures and som e applications Proc.
N ati. A cad. Sci. 76: 4350.

Antgenos bacterianos

RICARDO MARGNI

Las bacterias son procariotas y se diferen

cian de las clulas eucariotas de los grandes or
ganism os por carecer de mem brana nuclear,
aparato mittico, mitocondrias y retieuloendoplasmtico visible. Tienen una estructura su
perficial ms compleja que las clulas animales
pues por fuera de la membrana citoplasmtica
se encuentra una pared celular rgida, la que les
permite soportar mejor las condiciones adver
sas del medio ambiente que las rodea. La com
posicin de la pared celular es distinta en las
bacterias grampositivas y en las gramnegativas
y tiene una estructura que, por su antigenicidad, les confiere especificidad en cada caso. En
la figura 43-1 se m uestra la estructura esque
mtica de una bacteria prototipo.
Los flagelos, ms delgados que las cilias de
las clulas de los vertebrados, tienen una es
tructura espiralada con un estrangulamiento en
la regin prxima a su fijacin a un corpisculo
basal situado por debajo de la membrana cito
plasmtica. Estn constituidos por una prote
na homognea llamada flagelina, de peso mo
lecular 40 kD, que ha sido muy usada en estu
dios sobre induccin de respuesta inmune y to
lerancia.
La cpsula es una estructura de consistencia
gelatinosa, que rodea la pared celular y a la que
puede estar ms o menos adherida. Son polisacridos simples (exopolisacridos) que tienen
secuencias repetidas de dos o tres aztcares. En
algunas bacterias el material capsular se solubiliza directamente en los medios de cultivos l
quidos, mientras que en otras permanece adhe
rido. Son haptenos com plejos o antgenos y,
como tales, sirven para diferenciar tipos dentro
de una especie.
La pared celular puede ser evidenciada por
plasmlisis. La estructura es diferente en las

43
bacterias grampositivas y en las gramnegativas.
En las primeras (vase fig. 43-2) es relativa
mente densa; por hidrlisis se liberan algunos
aminocidos D y L, adems de algunos azca
res, entre ellos el cido murmico, que es el 30-lactil ter de la glucosamina. El ordenamien
to de esa estructura, llamada glucopptido o
mucopptido, puede verse en la figura 43-3.
El glucopptido constituido de la capa basal
de la pared celular est recubierto en m uchas
de las bacterias gram positivas por derivados
del cido teichoico, un polmero de polialcoholes (ribitol o glicerol) ligados entre s por u n io
nes fosfo-dister y unidos al glucopptido por
covalencia. Son determinantes antignieos que
le confieren especificidad a numerosas especies
bacterianas.
La pared celular de las bacterias gramnegati
vas es ms delgada que la de las grampositivas,
pero ms compleja (fig. 43-4). Por encima del
glucopptido hay lipopolisacridos que requie
ren Ca^+ para su estabilidad. Parecen no estar
unidos covalentem ente al glucopptido. Son
los responsables, por intermedio del polisacrido, de la especificidad de especie y ellos han
permitido diferenciar a las enterobacterias en
grupos qumicos.
La pared celular de las bacterias cido-resistentes es rica en lpidos, algunos de los cuales,
como los micsidos, son levemente antignicos, y otros, como los fosfolpidos y los glucolpidos de trealosa (factor de acordonamiento),
funcionan como haptenos. La cera D, insaponificable, soluble en cloroformo, es un pptidoglucolpido que contiene D-aminocidos. A c
ta como adyuvante y favorece la respuesta de
inmunidad celular.
Las bacterias grampositivas tratadas con lisozima pierden su pared celular y se transfor-

922

Mtodos inmunoqumicos

El mtodo cuenta con la posibilidad de dis

poner de geles preformados, para distintas va
riedades de tcnicas electroforticas, es decir,
SDS-PAGE (geles homogneos y en gradien
te), PAGE nativo, lEF, geles en 2 D, lo que re
duce considerablemente los tiempos al no tener
que prepararlos. Luego de todo el proceso, es
tos geles se secan rpidamente, sin sufrir nin
guna rotura o distorsin de las bandas. Este sis
tema utiliza adems geles embebidos con los
buffers para la corrida, lo que evita el gasto de
grandes volmenes de buffers.
Los tiempos necesarios para todo el procedi
miento seran aproximadamente los siguientes:
- 20-60 minutos para la separacin electrofortica;
- 30 minutos para la coloracin por Coomassie
B lue o 60 m inutos para la coloracin con
plata;
- 10-30 minutos para la transferencia a mem
branas.
- 10-20 minutos para el anlisis de imgenes
de alta resolucin.

La automatizacin de todo el sistema incluye

la aplicacin de la muestra, el control de los
voltajes y/o la corriente aplicados, la colora
cin y decoloracin, el anlisis de las imgenes
y el informe de los resultados.

B IB L IO G R A F A
H am es, B. D., 1981. En: Gel electrophoresis: a practical
approach. H am es B. D ., R ick w o o d Eds. L o n d o n , IR L
Press.
Isoelectrjc focusing. Principies and M ethods. Editado por
Pharm acia Fine Cliem ical, Suecia, 1982.
IVlerril, C. R., G oldm an, D,, Sedm an, S, A. & Ebert, M. H.
1981. U ltrasensitive stain for proteins in polyacrilam ide
gesl show s reg io n al v ariations in ce reb ro sp in al fluids.
.Science 2)1: 1437.
O F arrell P. H ., 1975. H ig h reso lu tio n tw o~dim ensional
electrophoresis o f proteins. J. Biol. Chem . 250: 4007.
Righetti, P.O. 1983. En: Isoeiectric focusing: theory, methodology and ap p licatio n s. S. V\^ork & R. El. B urdon,
eds. Elsevier Science Publishers B. V. Am sterdam .
Stott, D. I. 1989. Im m unoblotting and dot blotting. J. 1ramunol. M ethods. 119: 153.
Tow bin, H., Staehelin T & Gordon, J. 1979. Electrophoretic transfer o f proteins from polyacrilam ide gels to nitroceilulose sheets: procedures and som e applications Proc.
N ati. A cad. Sci. 76: 4350.

Antgenos bacterianos

RICARDO MARGNI

Las bacterias son procariotas y se diferen

cian de las clulas eucariotas de los grandes or
ganism os por carecer de mem brana nuclear,
aparato mittico, mitocondrias y reticuloendoplasmtico visible. Tienen una estructura su
perficial ms compleja que las clulas animales
pues por fuera de la membrana citoplasmtica
se encuentra una pared celular rgida, la que les
permite soportar mejor las condiciones adver
sas del medio ambiente que las rodea. La com
posicin de la pared celular es distinta en las
bacterias grampositivas y en las gramnegativas
y tiene una estructura que, por su antigenicidad, les confiere especificidad en cada caso. En
la figura 43-1 se m uestra la estructura esque
mtica de una bacteria prototipo.
Los flagelos, ms delgados que las cilias de
las clulas de los vertebrados, tienen una es
tructura espiralada con un estrangulamiento en
la regin prxima a su fijacin a un corpisculo
basal situado por debajo de la membrana cito
plasmtica. Estn constituidos por una prote
na homognea llamada flagelina, de peso mo
lecular 40 kD, que ha sido muy usada en estu
dios sobre induccin de respuesta inmune y to
lerancia.
La cpsula es una estructura de consistencia
gelatinosa, que rodea la pared celular y a la que
puede estar ms o menos adherida. Son polisacridos simples (exopolisacridos) que tienen
secuencias repetidas de dos o tres aztcares. En
algunas bacterias el material capsular se solubiliza directamente en los medios de cultivos l
quidos, mientras que en otras permanece adhe
rido. Son haptenos com plejos o antgenos y,
como tales, sirven para diferenciar tipos dentro
de una especie.
La pared celular puede ser evidenciada por
plasmlisis. La estructura es diferente en las

43
bacterias grampositivas y en las gramnegativas.
En las primeras (vase fig. 43-2) es relativa
mente densa; por hidrlisis se liberan algunos
aminocidos D y L, adems de algunos azca
res, entre ellos el cido murmico, que es el 30-lactil ter de la glucosamina. El ordenamien
to de esa estructura, llamada glucopptido o
mucopptido, puede verse en la figura 43-3.
El glucopptido constituido de la capa basal
de la pared celular est recubierto en m uchas
de las bacterias gram positivas por derivados
del cido teichoico, un polmero de polialcoholes (ribitol o glicerol) ligados entre s por u n io
nes fosfo-dister y unidos al glucopptido por
covalencia. Son determinantes antignicos que
le confieren especificidad a numerosas especies
bacterianas.
La pared celular de las bacterias gramnegati
vas es ms delgada que la de las grampositivas,
pero ms compleja (fig. 43-4). Por encima del
glucopptido hay lipopolisacridos que requie
ren Ca^+ para su estabilidad. Parecen no estar
unidos covalentem ente al glucopptido. Son
los responsables, por intermedio del polisacrido, de la especificidad de especie y ellos han
permitido diferenciar a las enterobacterias en
grupos qumicos.
La pared celular de las bacterias cido-resistentes es rica en lpidos, algunos de los cuales,
como los micsidos, son levemente antigni
cos, y otros, como los fosfolpidos y los glucolpidos de trealosa (factor de acordonamiento),
funcionan como haptenos. La cera D, insaponificable, soluble en cloroformo, es un pptidoglucolpido que contiene D-aminocidos. A c
ta como adyuvante y favorece la respuesta de
inmunidad celular.
Las bacterias grampositivas tratadas con lisozima pierden su pared celular y se transfor-

924

Mtodos inmunoqumicos

Ribosomas

totalmente su pared celular y se transforman en

esferoplastos de ios que, por lisis hipotnica o
por tratamiento con lipasa o desoxicolato, es
posible separar m em brana citoplasm tica y
componentes endocelulares. Los esferoplastos
pueden obtenerse tambin cuitivando ias bacte
rias en presencia de penicilina, un inhibidor de
la sntesis de la pared celular.
Algunas bacterias son productoras de exotoxinas, las cuales, transformadas en el laborato
rio en toxoides, como el diftrico y el tetnico,
se usan como vacunas en el hombre.

cido nucleico

A ISL A M IEN T O Y SEPA R A CI N

DE A NTG EN OS BACTERIA N OS
F ig. 43-1. E structura de una bacteria prototipo.

O btencin de cultivos

man en protoplastos, a partir de los cuales por

ruptura osmtica es posible obtener membrana
citoplasm tica y com ponentes endocelulares
(pohsomas, cromosomas, ADN, etc.) para estu
diar su comportamiento antignico. Las bacte
rias gramnegativas no se comportan en forma
similar. Algunas de ellas, sensibles, no pierden

Para el aislamiento y la purificacin de antgenos bacterianos son necesarias grandes ma

sas de microorganism os. Ello puede lograrse
mediante cultivos en medios slidos y lquidos,
y su eleccin depende de la bacteria en estudio.
Los medios deben ser preferentemente sintti
cos, de modo que las contaminaciones con pro
tenas complejas sean mnimas.

cido lipoproteico

Polisacrido

Polipptido^^
dientrecruzado

Fosfatidii
glucolpidos
(

j Protenas

Fosfolpidos

Glucolpidos

Fig. 43-2. P ared celular de bacterias gram positivas.

Antgenos bacterianos
F ig . 43-3. E structura
e s q u e m tic a de g lu
co p p tid o (m u co p p
tido). Ac. M ur: cido
m u rm ico (3 -0 -lac til
s te r d e g lu c o s a m i
na). N A cG ; N -acetil
glucosam ina.

Ac

Mur

NAcG

Ac

(Glicina) 5

(Glicina) 5

TETRAPPTIDO

Los cultivos en medios lquidos pueden ser

estticos y agitados. El rendim iento para un
microorganismo sin muchas exigencias nutri
cias, como es una enterobacteria, es de aproxi
madamente 1 mg de bacteria seca por 1 mi de
cultivo de 18 horas. En cultivos agitados estos
re s u lta d o s p u ed en d u p lic a rse . P ara o tro s
(B. pertussis), las relaciones sobre desarrollo y
rendimiento en cultivo agitado y esttico son
mayores.

Mur -----------NAcG -------

TETRAPPTIDO

TETRAPEPTIDO

Ac Mur-

925

-NAcG-

Ac

Mur

-N A cG -

TETRAPEPTIDO

A veces, con el objeto de lograr antgenos li

bres de protenas del medio de cultivo, y siem
pre que los metabolitos indispensables para el
desarrollo sean dializables, las bacterias son
cultivadas dentro de sacos de celofn que con
tienen soluciones glucosadas e introducidas
dentro de un medio de cultivo lquido. Es ste
un artificio muy til para la obtencin de exotoxinas bacterianas que, al no dializar, perm ane
cen retenidas en el interior del saco de celofn.

Lipopolisacrido

Doprotenas

Poiisacrido

' Polipptidos
dientrecruzados

S U
E)
-D
E i5

0) Q.
Fosfolpidos

F ig. 43-4. P ared celular de bacterias gram negativas. +, cationes libres. cationes ligados,
aniones libres, , an io n es
ligados. ES, enzim as superficiales, EPA, enzim as periplasm ticas, PE, protenas estructurales de la m em brana citoplasm tica. EE, protenas enzim ticas y estructurales de la capa externa. EP, enzim as de la m em brana citoplasm tica relacionadas
con !a sntesis de m acrom olculas de ia pared celular. EC, enzim as de m em brana citoplasm tica cuya funcin es d irig ir
reacciones intracitoplasm ticas.

926

Mtodos inmunoqumicos

En la mayora de los casos los antgenos bac

terianos se obtienen de suspensiones de bacte
rias muertas, libres de medio de cultivo, del
cual han sido separadas por centrifugacin. Con
tal objeto los cultivos son calentados a 60C du
rante 1 hora o tratados con Merthiolate al 0,01 0,02%. El mtodo a usar depende de las carac
tersticas del antgeno que se desea purificar.
Las toxinas generalmente son transformadas
en toxoides por el aadido del formol al 6 por
mil. En aquellos casos que sea necesario purifi
car toxinas activas, as como bacterias vivas, de
be procederse con todos los cuidados necesarios.
Antes de la separacin y la purificacin de
antgenos provenientes de masas bacterianas es
necesario tener la seguridad de que ellas res
ponden a una poblacin pura y que no estn
contaminadas con otras bacterias u hongos.

Antgenos exocelulares
Es frecuente tener que purificar exotoxinas y
enzimas sintetizadas por bacterias. El material
de origen lo constituyen en estos casos filtrados
estriles de cultivos en medios lquidos donde
ha proliferado el microorganismo productor.
Los mtodos de purificacin pueden ser va
rios, pero los ms usados son la precipitacin
con sulfato de amonio y el empleo de resinas
de intercambio inico.
a) Cuando se usa la precipitacin salina y no
se tiene conocimiento de la concentracin pti
ma de sulfato de amonio para la precipitacin
del producto deseado, es necesario hacer ensa
yos de aproxim acin m ezclando volm enes
iguales del filtrado de cultivo y cantidades va
riables de sal de modo de lograr distintos gra
dos de saturacin. Los precipitados obtenidos
son analizados para determinar su actividad y
se elegir la ms conveniente. Por regla gene
ral, estos precipitados son redisueltos y repreci
pitados dos o tres veces con el objeto de lograr
un producto de mayor pureza. La eliminacin
del sulfato de amonio residual se hace por dili
sis o filtracin por columna de Sephadex G-25.
b) Si el mtodo de purificacin elegido es el
de las resinas de intercambio inico, el produc
to a cromatografiar generalmente es concentra
do por precipitacin salina previa, y la resina a
usar ser eatiniea o aniniea segn la carga
neta de la pro tena al pH en que se encuentre.
En el captulo 41 se encontrarn todos los deta
lles referentes a esta metodologa y el criterio a
seguir en cada caso.

bacteria cuyos flagelos se quieren aislar e incu

bar a 37C durante 24 horas. Repetir la opera
cin, tomando para la inoculacin material pro
veniente del otro extremo del tubo en U en el
que originalmente se efectu la siembra. Por
este procedimiento se consigue seleccionar las
bacterias ms mviles.
Con el material anterior, sembrar botellas de
Povitsky que contienen agar nutricio al 1,25%
e incubar a 37"C. Cuando las bacterias estn en
su fase final de crecimiento logartmico o ini
cial de la fase estacionaria, cosecharlas, sus
penderlas en NaCl 0,15 M, centrifugarlas 45
minutos a 3.500-6.000 g y lavarlas dos veces
con agua destilada, centrifugando en las condi
ciones anteriores.
b) S uspender el sedim ento b acteriano en
agua destilada (30-60 mg m f') y agitar duran
te 10 minutos, a temperatura ambiente, en un
agitador rotatorio. Eliminar las bacterias des
flageladas por centrifugacin a 3.300 g durante
30 minutos. Separar el sobrenadante y centrifu
gar a 16.000 g durante 15-20 minutos, de modo
de eliminar las clulas restantes y residuos ce
lulares. Del sobrenadante de centrifugacin se
separan los flagelos centrifugando a 40.000 g
durante 2-3 horas.
El sedimento obtenido (flagelos), suspendido
en agua destilada, se conserva en la refrigera
dora.
c) Para obtener la flagelina por disociacin y
reagregacin a pH neutro, la suspensin de fla
gelos es acidificada con 1/20 de su volumen de
HCl IN y se la deja a temperatura ambiente por
30 minutos. Se centrifuga la mezcla en una ultracentrfuga a 80.000 g durante 1 hora, se se
para el sobrenadante y se lo n eutraliza con
NaOH IN. Se le aaden 2 volmenes de solu
cin saturada de sulfato de amonio y se lo deja
a tem peratura ambiente durante 16 horas. Se
centrifuga a 20.000 g durante 15 minutos, se
elimina el sobrenadante y el sedimento es dializado para eliminar el sulfato de amonio resi
dual. Es conveniente conservar liofilizada la
flagelina as obtenida.

Exopolisacridos
Exopolisacridos que se solubilizan
directamente en los medios de cultivo
lquidos (tipo Klebsiella aero genes f

a) Las bacterias cultivadas en medio lquido

son separadas por centrifugacin. Cuando se
trata de exopolisacridos viscosos, la centrifu
gacin no debe ser inferior a 25.000 x g duran
Aislamiento de flagelos bacterianos
te 2-3 horas.
y obtencin de lagelina
b) Verter el sobrenadante sobre 2-3 volme
a)
En uno de los extremos de un tubo en U nes de acetona enfriada a -20C y mezclar rpi
que contiene agar nutricio al 0,3%, sembrar la damente con varilla de vidrio. El polisacrido,

Antgenos bacterianos

927

como masa fibrosa, normalmente se adhiere a

la varilla. Se lo separa de la acetona y .se lo
conserva por desecacin al vaco.
c)
Al polisacrido as obtenido se lo purifica
por desproteinizacin. Para ello, disolverlo al
0,5% en una solucin que contenga 4% de ace
tato de sodio y 2% de cido actico. Aadirle
20% de cloroformo y 4% de butanol y agitar
vigorosam ente durante 30 minutos. Dejar en
embudo de separacin hasta que de la solucin
turbia se separen las fases orgnica y acuosa.
Separar esta ltima y repetir la operacin 2 o 3
veces con el objeto de eliminar la totalidad de
la protena contaminante. Centrifugar la solu
cin y dializarla contra agua. Conservar liofilizado el polisacrido as obtenido.

Solucin III: (2 mi por cada 100 mi de medio)

0,0075 g
Biotina
5 mg
Acido nicotnico
5 mg
Piridoxina
5 mg
Rivoflavina
25 mg
Pantotenato de calcio
50 mg
Sulfato de adenina
50 mg
Uracilo
50 mg
Cloruro de colina
Asparagina
500 mg
Agua destilada c.s.p.
100 m i
Esterilizar por filtracin

Polisacridos neumoccicos^

Solucin y.- (para 100 mi de medio)

Solucin IV: (2,5 mi por cada 100 mi de medio)

L-glutamina
1,25 g
Agua destilada c.s.p.
50 m i

Los polisacridos neumoccicos son neutros 0,10 g de NaHCOj seco se colocan en tubo de
en su mayora. No obstante, algunos son lcali- ensayo y esterilizan por autoclavado durante
10 min. Disolverlos en 5 mi de agua estril y
lbiles (tipo 1 y V) o cidos (tipo VIII). Ello sig
nifica que el mtodo de purificacin a emplear aadirle luego 0,10 mi de cido tiogliclico al
10% en agua, esterilizado por calentamiento en
depender de las caractersticas del polisacrido.
El mtodo que se describir es aplicable a bao de agua a ebullicin durante 10 min. E sta
solucin es inestable y debe ser preparada en el
los polisacridos neutros.
a)
La pureza del polisacrido obtenido de momento de su uso.
pende en gran parte del medio de cultivo utili
El m edio de cultivo se prepara m ezclando
zado para el desarrollo microbiano. El empleo aspticamente las soluciones /, II, III y IV, las
de medios totalmente dializables elimina la po que pueden conservarse en refrigeradora. L a
sibilidad de contaminaciones del producto final solucin V se incorpora al medio, previamente
con polisacridos de ese origen. Existen m e a la inoculacin de ste con la bacteria.
b)
algunos polisacridos neumoccicos tie
dios de cultivos preparados por firmas comer
ciales que responden a esas caractersticas. R e nen grupos acetilos y otras uniones lbiles. Ello
sulta muy recomendable el medio sinttico in significa que para la obtencin de productos
dicado por M. J. How(3), cuya composicin es biolgicam ente activos no deben em plearse
la siguiente:
cidos o lcalis fuertes y tem peraturas altas.
Todas las operaciones deben efectuarse en c
Solucin I: (para 100 mi de medio)
mara fra a 2-4C y en forma continuada p ara
Hidrolizado de casena
2
g
reducir al mnimo el tiempo de procesamiento.
L-cistena
0,015 g
Para la purificacin se utilizan cultivos de
L-triptfano
0,02 g
12 horas de incubacin a 37C, en los que es
K 2H P04.3H 20
0,65 g
necesario determinar pureza por una coloracin
Fenolsulfonftalena 0,2%
0,25 mi
de Gram. La esterilizacin se consigue con fe
Agua destilada c.s.p.
50
mi
nol al 1% durante 18 horas a temperatura am
Ajustar a pH 7,8 y esterihzar por autoclavado biente. Los subcultivos efectuados con este m a
durante 10 min.
terial deben ser negativos.
Previo pasaje por una centrfuga Sharples, el
Solucin II: (para 100 mi de medio)
lquido de centrifugacin que contiene los p o li
D-glucosa
1;25 g
sacridos, es concentrado 10-20 veces por ulSolucin de minerales
0,10 mi
trafiltracin a travs de un ultrafiltro preparado
Agua destilada c.s.p.
37
mi
por inmersin de una buja filtrante en solucin
Esterilizar por autoclavado durante 10 min.
actica de Parlodion (nitrocelulosa) al 4,5% .
La solucin de minerales contiene:
Pueden utilizarse tambin membranas filtrantes
M gS04.7H 20
50
g
de poro adecuado, de las comnmente em plea
E eS04.7H 20
0,50 g
das para la concentracin de orina. La presen
Z nS 04.7H 20
0,08 g
cia de polisacridos en el ultrafiltrado se pone
M nS04.4H 20
0,036 g
en evidencia con sueros antineumoccicos es
HCl concentrado
15
mi
pecficos. En algunos casos, para facilitar la deAgua destilada c.s.p.
100 mi
capsulacin, los cultivos bacterianos son calen

928

Mtodos inmunoqumicos

tados a 100"C, 10 minutos a pH neutro, antes

de la eentrifugacin.
El ultrafiltrado se centrifuga a 2.500 rpm, a
0"C, varias horas, para eliminar el mximo de
turbidez. Se separa el sobrenadante y el preci
pitado es lavado con agua hasta que los lavados
no den reacciones con el suero antineumoccico especfico. Los lquidos de lavado y el so
brenadante de centrifugacin se mezclan y se
les aade solucin saturada de acetato de sodio
ajustada a pH 6,05, hasta que su concentracin
sea del 5%. Se enfra a 0C y agitando conti
nuamente se le aade el volumen correspon
diente de alcohol de 95 previamente enfriado a
0C. El volumen de alcohol a adicionar, que
generalmente es 1 a 1,5 volmenes de ultrafiltrado, se determina experimentalraente en pe
queas porciones y corresponde a la cantidad
necesaria para precipitar todo el poiisacrido
presente.
La mayor parte del sobrenadante puede ser
eliminada por sifonado; el resto es centrifuga
do, y el precipitado, disuelto en agua hasta con
centracin final del 5%. Im purezas de restos
celulares pueden eliminarse mediante el agre
gado de un volumen igual de alcohol sin aceta
to de sodio. El precipitado es separado por cen
trifugacin a 15.000-20.000 rpm, a4"C durante
1 hora. Se lo lava con agua hasta reaccin ne
gativa con antisuero especfico y los lquidos
de lavado son mezclados con el sobrenadante
de centrifugacin. Se los enfra a 2-4C y se
aade, agitando, 0,5 volmenes de una mezcla
enfriada de cloroformo y n-butanol (5:1) para
eliminar las protenas desnaturalizadas. La ope
racin debe efectuarse en cmara fra, con agi
taciones interrumpidas durante 30 minutos, pa
ra evitar el calentam ien to . Se cen trifu g a a
2.000 rpm 1 hora a 4C y el sobrenadante claro
se separa por sifonado. La emulsin residual se
lava con agua, previa agitacin, y se centrifuga.
El lquido sobrenadante es mezclado con el an
terior y el total es sometido a una nueva purifi
cacin con cloroformo y n-butanol. Las purifi
caciones deben repetirse hasta que no se forme
emulsin.
La purificacin final se hace aadiendo solu
cin saturada de acetato de sodio ajustada a pH
6,05 hasta que la concentracin en sal sea del
5% y precipitando con alcohol de 95 como se
indic anteriormente. Despus de varias repre
cipitaciones alcohlicas conviene efectuar una
ltim a purificacin por filtracin a travs de
Sephadex, DEAE-Sephadex o CM -Sephadex,
segn las circunstancias.

preferible obtenerlos de paredes celulares libres

de otros antgenos intracelulares. Preparaciones
purificadas de stas pueden lograrse a partir de
bacterias rotas por diferentes procedimientos.
Rotura de bacterias
a) Por trituracin, con abrasivos. Masa bac
teriana (50 mg mi") previamente enfriada es
mezclada con igual volumen de arena fina y tri
turada manualmente en mortero de vidrio duran
te 15-20 minutos. Por este procedim iento se
consigue la rotura de un nmero apreciable de
bacterias y tiene la ventaja de que los compo
nentes antignieos, aun los lbiles, no se alteren.
b) Ultrasonidos. Para ello son necesarios
sonicadores comerciales. Muchas bacterias son
resistentes a la rotura por este procedimiento.
c) Presin con prensa neumtica. Es un m
todo til para pequeas cantidades de bacterias.
En este sentido la prensa de Hughes resulta
muy til. Las bacterias congeladas son forzadas
bajo presin a pasar a una segunda cmara a
travs de un pequeo orificio, lo que hace que
por expansin se produzca la rotura. La figura
42-6 (cap. 42) muestra la eleetroforesis en pla
ca de gel de poliacrilam ida (PAGE-SDS) de
extractos de diferentes especies de enterobacte
rias.
d) Congelacin y descongelacin. Suspen
siones bacterianas densas son congeladas a
-70C con mezclas de nieve carbnica y aceto
na y descongeladas bruscamente por introduc
cin en bao de agua a 55C. Repitiendo varias
veces la operacin se consigue romper las bac
terias.
e) Desintegracin mecnica. Por agitacin
en agitador mecnico de suspensiones bacteria
nas densas, con bolillas de vidrio o de acero, se
consigue rotura bacteriana y liberacin de pa
red celular.

Separacin de la pared celular

Las paredes celulares pueden separarse del

resto del material bacteriano por centrifugacin
diferencial o mediante gradiente de eentrifuga
cin.
a)
Centrifugacin diferencial. Dados los ta
maos de las diferentes bacterias, no pueden
darse velocidades definidas en trminos gene
rales. No obstante, centrifugaciones de 2.5003.000 X g durante 15 minutos permiten rem o
ver las bacterias no desintegradas, y centrifuga
ciones de 8.000-12.000 x g durante 30 minutos
logran sedimentar paredes celulares. Los pro
ductos as obtenidos estn ligeramente conta
Pared celular
minados, y debern ser repurificados si es que
Si
bien algunos antgenos de pared celular como material de trabajo se necesita un pro
pueden obtenerse de bacterias desecadas, es ducto puro.

Antgenos bacterianos

929

b)
Gradiente de centrifugacin. Los m to duo, se le aaden 15 mi de Cetavin (bromuro
dos corrientes que utilizan gradientes de saca de cetil-trimetl-amonio) al 2% en agua. Se agi
rosa (10-40%) son adecuados y permiten la se ta la mezcla a temperatura ambiente durante 15
paracin de bacterias enteras y pared celular. m inutos y se centrifuga 20 minutos a 3.000
Este mtodo generalmente se usa en repurifica rpm para eliminar el ARN precipitado. Se liofi
ciones de preparaciones obtenidas por centrifu liza el sobrenadante, se redisuelve en 50-60 mi
gacin diferencial.
de NaCl 0,5 M y precipitan los lipopolisacri
dos por agregado de cinco volmenes de etanol. Se deja a 4C durante 2 horas, se centrifu
L ipopolisacridos bacterianos''
ga y redisuelve en un volumen conveniente de
agua destilada.
Obtencin de lipopolisacridos
El lipopolisacrido as obtenido representa
a) Bacterias gramnegativas (Escherchia ca aproximadam ente el 2% del peso seco de las
li, salm onelas, shigelas, etc.) se cultivan en bacterias procesadas.
agar nutricio a 37C durante 24 horas. Se aade
NaCl 0,15 M, se suspenden los microorganis Separacin del polisacrido
mos y se centrifuga 15 minutos a 5.000 rpm. Se
hacen tres lavados con acetona y se extiende la
Preparar una solucin del lipopolisacrido
pasta microbiana en capa fina para que seque. (10 mg m !') en cido actico al 1% y calentar
Por trituracin en un molino de bola u otro dis a I00C durante 30 m inutos para hidrolizar.
positivo debe procurarse obtener un polvo lo Centrifugar luego a 500 g para separar el lpido
ms fino y homogneo posible, pasndolo por A insoluble y dializar el sobrenadante con agua
un tam iz adecuado si fuera necesario, con el destilada, en refrigeradora, durante 48 horas,
objeto de eliminar los restos de agar que pudie Liofilizar.
ra contener.
b) Se suspenden 10 g de bacterias desecadas cido teichoico
o pared celular en 175 mi de agua calentada a
65-68C y se les aade igual volumen de fenol
Preparar una suspensin de pared celular al
al 90% previamente calentado a la misma tem 2,5% en cido tricloroactico al 10%, M ante
peratura, agitando con fuerza. La m ezcla se ner la suspensin a 4C durante 70 horas, agi
mantiene a 65C durante 10-15 minutos, se la tando, Separar el insoluble centrifugando a
enfra a 10C en bao de hielo y se centrifuga a 5.000 X g por 30 minutos y lavar el sedimento
3.000 rpm por 45 minutos. Se obtiene una capa con pequeas cantidades de cido tricloroacti
acuosa, una fenlica y una tercera de residuo co al 10%). El sobrenadante de centrifugacin y
insoluble. Se separa la capa acuosa y se la re los lquidos de lavado se unen y mezclan con
serva. La capa fenlica y el residuo insoluble igual volumen de ter etlico, agitando vigoro
son extrados nuevamente con 175 mi de agua samente, La fase acuosa es separada y el trata
caliente, tal como se indic anteriormente. Se miento con ter se repite dos veces ms. L a so
mezclan los extractos acuosos y se los dializa lucin acuosa de la ltima extraccin es liofili
frente a agua destilada para eliminar los restos zada y redisuelta en cido tricloroactico al
de fenol y sustancias de origen bacteriano de 10% (aproximadamente 100 mi por cada gra
bajo peso molecular. La solucin opalescente mo de pared celular inicial) y el cido teichoico
que contiene el lipopolisacrido y cido ribo es precipitado por el aadido de 2 volmenes
nucleico se concentra a presin reducida, a 35- de alcohol fro.
40C, hasta un volumen de 50 mi, y se centrifu
El precipitado se separa por centrifugacin,
ga luego para eliminar residuos insolubles. El se lava con alcohol, ter y luego se lo liofiliza.
sobrenadamente se liofiliza.
c) El extracto crudo liofilizado se disuelve M em b ra n a citoplasmtica:6,7
al 3% en agua d estila d a y se c en trifu g a a
80.000 X g durante 6-8 horas. El sedimento,
Su aislamiento es simple en aquellos casos
previa eliminacin del sobrenadante, se redi- en que las bacterias grampositivas o gram nega
suelve en agua d estila d a y se cen trifu g a a tivas son sensibles a la accin de la lisozima,
105.000 X g durante 3 horas. Se repite esta ope que ataca la pared celular. En el caso de las
racin dos o tres veces, se redisuelve finalmen bacterias gramnegativas, las membranas de los
te el sedimento en la menor cantidad posible de esferoplastos formados estn contaminadas con
agua destilada, y se procede luego a su liofili- restos de pared celular. Para las bacterias no
zacin.
sensibles a la lisozima, los esferoplastos pue
den lograrse cultivando las bacterias en presen
Al liofihzado disuelto en agua destilada en la cia de penicilina, que inhibe la biosntesis de la
proporcin de 150 mi por cada gramo de resi pared celular, A partir de los protoplastos y es-

930

Mtodos inmunoqumicos

feroplastos, por lisis con agua destilada, es po Obtencin de antgenos bacterianos libres
sible separar las membranas.
de contaminacin por lipopolisacrido (LPS)
Cuando se trata de bacterias grampositivas, a
cultivos bacterianos jvenes se los lava y sus
La membrana externa de bacterias gramne
pende en buffer de fosfato 0,03 M, pH 7 que gativas est constituida principalmente por li
contenga sacarosa 0,2 M, y se les aade lisozi- popolisacrido (LPS), fosfolpidos y protenas
ma (0,5 mg mi ) Se deja actuar la enzima a (OMPs). El LPS, que constituye el antgeno
37C 10-30 minutos, y se controlan al micros dominante de superficie, est formado por 3 re
copio los protoplastos form ados. C uando la giones, unidas covalentemente entre s: lpido
conversin es total se los separa por centrifuga A, Core y antgeno O (fig. 43-5).
cin a 5.000 X g por 20 minutos. El sedimento
Esta estructura corresponde al LPS de cepas
es agitado con agua destilada y luego centrifu lisas , ya que el de las cepas rugosas carece
gado a 10.000 X g durante 15 m inutos. La de antgeno O.
El antgeno O , constituido por unidades
membranas as separadas son lavadas una vez
repetitivas de oligosacridos, es la porcin anticon NaCl 1 M y luego con agua destilada.
Si
las bacterias son gramnegativas, los m i gnicamente dominante del LPS. La existencia
croorganismos lavados son suspendidos en buf de homologas e incluso identidad molecular
fer Tris-HCl 0,03 M, pH 8, EDTA 0,0007 M y entre antgenos O de distintas especies bacte
lisozima (17 |j,g m i '). Despus de 10-30 mi rianas determ ina la aparicin de reactividad
nutos de incubacin se controlan los esfero- cruzada por anticuerpos anti-LPS. Es por ello
plastos formados y se contina como en el caso que, a los fines de un diagnstico especfico,
anterior.
resulta deseable detectar anticuerpos a compo
nentes bacterianos distintos del EPS, siendo
preciso entonces eliminarlo de las preparacio
Componentes intracelulares
nes antignicas a utilizar.
La separacin entre componentes intracelu
A tal fin han sido utilizados diversos proto
lares particulados y solubles se hace por centri colos experimentales. El ms sencillo lo consti
fugacin diferencial, a partir del material resi tuye la cromatografa de afinidad con polimixidual proveniente de la separacin de membra na B unida a matrizinerte (agarosa o Sepharonas celulares. Generalmente se hacen centrifu sa). La polimixina es un pptido que se acopla
gaciones a 25.000, 50.000 y 100.000 x g. Los a la matriz por su porcin lipofbica, dejando
productos solubles quedan en el ltimo sobre expuesta su porcin lipoflica. Al poner en con
nadante y los particulados en los sedimentos de tacto este reactivo con el lisado bacteriano que
centrifugacin.
contiene LPS, ste se une a la polimixina a tra
Los diferentes com ponentes intracelulares vs del lpido A, quedando retenido. El resto de
son separados por diversas m etodologas, en los componentes bacterianos eluyen en confor
especial cromatografa de diferentes tipos.
macin nativa, libres de EPS.**

Medio ambiente

Lpido A

Core

Antgeno O

LPS

4,8-dideoxy-formamido-D-manosa

Fosfoetanolamida

# Otros azcares

O Giucosamina

cidos grasos
Fosfolpidos

Fig. 43-5. E,structura del lipopolisacrido (LPS) bacteriano.

Antgenos bacterianos
Este mtodo se aplica con xito para extraer
el LPS de diversas bacterias gram negativas.
Sin embargo, no ha dado resultado con bacte
rias del gnero Brucella. El LPS de Brucella
difiere del de otras bacterias gram negativas,
principalmente a nivel del lpido A y del esque
leto hidrocarbonado. Como consecuencia, la
polimixina B no se une a este LPS y no se la
puede utilizar para eliminarlo de los extractos
bacterianos.'* Si bien se ha propuesto como al
ternativa la extraccin del LPS con cloroformo-ter de petrleo-fenol, este procedimiento
genera desnaturalizacin de las protenas.
A fin de obtener un extracto proteico de Brucela en condiciones nativas y libre de LPS,
Goldbaum y col. han utihzado con xito la cro
matografa de afinidad con un anticuerpo monoelonal antl-LPS acoplado a Sepharosa 4 B
El protocolo experimental que han seguido es
el siguiente.
Las bacterias, m uertas por adicin de formaldedo, son resuspendidas en buffer TrisH C l pH 8,0 y sometidas a 5 ciclos de extrusin
en una prensa X a -26C. Luego de agregar al
lisado DNAasa y RNAasa 1% P/V, las envoltu
ras celulares se separan por centrifugacin a
360.000 xg durante 2 horas. El sobrenadante,
constituido por la fraccin citoplasm tica de
Brucella, contiene LPS contaminante en una
concentracin aproximada de 10 mg m f. P a
ra ehminarlo, la fraccin citoplasmtica se po
ne en contacto toda la noche con un volumen
igual de Sepharosa 4B a la cual se le ha acopla
do un anticuerpo monoclonal anti-LPS de B ru
cella, especialmente preparado. Luego de cen
trifugar, el sobrenadante es sometido a una se
gunda inm unoadsorein en iguales condicio
nes. El sobrenadante de la segunda inmunoadsorcin conserva las protenas de la fraccin ci
toplasmtica, pero su contenido en LPS se re

931

duce 1000 veces respecto de la fraccin sin ad

sorber. El bajo contenido de LPS de este ex
tracto no interfiere en la deteccin de anticuer
pos anti-protenas de Brucella por mtodos de
ELISA e Immunoblotting.
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Antgenos proteicos

RICARDO MARGNI

Para la purificacin de antgenos proteicos

los mtodos utilizados son los que se emplean
com nm ente en el fraccionam iento proteico,
tales como cristalizacin, precipitacin salina,
cromatografa de intercambio inico, electroforesis preparativa, etc. Generalmente se los em
plea en forma combinada.
En este captulo se describir la purificacin
de algunos antgenos tipo, usando diferentes
metodologas, y los mtodos corrientes para in
troducir nuevos determinantes antignicos en
m olculas soportes. Para mayor informacin
sobre los mtodos cromatogrficos usados va
se cap. 41.
PURIFICACIN DE AN TG EN O S
PROTEICOS
A islam iento y purificacin de ovoalbiim ina'
De las claras de huevo puede obtenerse, por
precipitacin con sulfato de sodio seguida de
crom atografa en CM -celulosa, ovoalbm ina
de alto grado de pureza. Para ello se debe pro
ceder de la siguiente manera:
Diluir las claras de huevo, previamente hom ogeneizadas, con igual volum en de agua.
Aadir, con agitacin suave, un volumen igual
de sulfato de spdio al 36,7% (m antenido a
37C para evitar su cristalizacin). Continuar
la agitacin durante i 5 minutos. Despus de
2-3 horas de reposo, separar por filtracin o
centrifugacin el precipitado de globulinas for
mado.
Aadir al filtrado, gota a gota, con agitacin
constante, H^SO^ 0,2N hasta pH 4,6-4,8. Si
apareciera algn precipitado, tratar de redisol-

44
verlo por el aadido de una mnima cantidad de
agua. Agitando continuam ente agregar solu
cin saturada de sulfato de sodio, gota a gota y
de modo que el extremo de la pipeta est por
debajo de la superficie libre del lquido. Se
contina la adicin hasta opalescencia persis
tente. En ese instante se suspende el aadido de
sal, pero se contina con la agitacin hasta que
la cristalizacin de la protena sea evidente.
Dejar en reposo 24-48 horas.
Todo el proceso debe efectuarse a una tem
peratura no inferior a 20C.
El producto cristalizado se separa por filtra
cin o centrifugacin y se redisuelve en un vo
lumen de agua igual a la mitad del volum en
original de las claras de huevo. La recristaliza
cin se lleva a cabo, previa correccin del pH a
4,6-4,8, agregando gota a gota y agitando un
volumen de solucin saturada de sulfato de so
dio igual al volumen de agua empleado en la
redisolucin del precipitado.
Se repite la recristalizacin dos veces ms,
al final de las cuales el precipitado se dializa
contra buffer de acetato 0,015 M, pH 5. Term i
nada la dilisis, se lo pasa por una columna de
CM-celulosa estabilizada con el mismo buffer.
Como eluyentes se usan soluciones de NaCl
0,05 M y 0 ,15 M en el buffer de acetato indi
cado.
Las protenas que eluyen con la solucin ini
cial constituyen las impurezas y la que lo hace
con el segundo es ovoalbmina pura. Si este pi
co proteico estuviera impuro, reciclarlo por
CM -celulosa usando como eluyente buffer de
acetato 0,2 M, pH 5 y un gradiente de NaCl
(inicial 0,05 M, final 0,2 M). La ovoalbmina
eluye pura a una molaridad de ClNa que vara
entre 0,08 y 0,09.

Antgenos proteicos

Purificacin de lisozima^
Homogeneizar las claras de huevo por agita
cin en una licuadora, aadir NaCl slido hasta
lograr la concentracin del 5%, agitando nue
vam ente, y ajustar a pH 9 con solucin de
N aO H . D e ja r la m e z c la en re frig e ra d o ra
(0-4C) durante una noche y aadir luego unos
cristales de NaCl. La cristalizacin se produce
lentamente en 4 a 7 das. Los cristales se sepa
ran por centrifugacin y se disuelven en buffer
de acetato 0,05 M, pH 4,5. La mucina contami
nante, que se insolubiliza en estas condiciones,
se elimina por centrifugacin. El sobrenadante
es ajustado a pH 9, se le adiciona NaCl slido
hasta concentracin del 5% y se lo deja en re
poso varios das para que cristalice.
Repetir las recristalizaciones las veces nece
sarias hasta obtener lisozima antignicamente
pura. Generalmente, con tres recristalizaciones
se obtiene un producto con un grado de pureza
superior al 99,5%.
Purificacin de seroalbmina bovina

tena de Bence Jones se dializa contra agua de

grifo durante 24 horas, filtrando luego para eli
minar los residuos insolubles.
b) Ajustar a pH 5,5 con cido actico 6 N y
luego precipitar con sulfato de amonio (co n
centracin final 75% de saturacin). S eparar
los precipitados por centrifugacin y dializarlos c o n tra N aCl 0,15 M, fo sfato s 0,01 M,
pH 7,2. repetir la precipitacin tres veces.
c) Concentrar a volumen conveniente y fil
trar por columna de Sephadex G-100. Separar
el pico de elucin que corresponde a un peso
molecular de 20.000-40.000 y, previa concen
tracin, analizarlo por inm unoelectroforesis,
usando como reactivos precipitantes suero an
tihumano, anti-Fcy, anti-Fcja, anti-Fca, anti-K
y anti-A,. La protena de Bence Jones no d eb e
r dar bandas de precipitacin con los diferen
tes sueros anti-Fc y s con los anticad en as
Ko X.

La inmunoprecipitacin con suero antihuma

no servir para establecer el grado de pureza de
la protena aislada. Si estuviera contam inada
con otras protenas sricas deber hacerse una
repurificacin por cromatografa en DEAE-celutosa, usando como eluyente un gradiente con
tinuo de fosfatos (0,005 M/0,2 M, pH 7,2). Los
diferentes picos proteicos del eluido sern ana
lizados en la forma antes indicada.
En las condiciones de elucin que se han se
alado, la protena de Bence Jones eluye al co
mienzo.

Filtrar suero bovino por Sephadex G-75. Eli

minar la fraccin proteica que eluye con el fren
te y recoger el pico proteico siguiente. Esta frac
cin tiene un alto contenido en seroalbmina bo
vina (Para detalles sobre filtracin por geles
vase cap. 41). Concentrarla por cualquiera de
los mtodos disponibles, dializar contra buffer
de acetato 0,02 M, pH 4,5 y cromatografiar por
CM-celulosa, eluyendo con un gradiente consti
tuido por el buffer anterior (inicial) y NaCl 0,4
M en buffer de acetato 0,02 M, pH 5,6 (final).
El mayor pico proteico de la elucin correspon
de a la fraccin albmina,
Dializar contra NaCl 0,15 M, fosfatos 0,01
M, pH 7,6 y conservar congelada o en refrige
radora, previo aadido de conservador.
El mismo procedimiento puede usarse para
purificar albmina humana, de caballo, conejo,
oveja, cobayo y otros vertebrados. Las condi
ciones de elucin dependern del pH y carga
neta de cada una de ella.

INTRODUCCIN DE NUEVOS
DETERMINANTES ANTIGNICOS
EN SOPORTES PROTEICOS

Purificacin de gammaglobulina

Preparacin de DNP-SAB

Los diferentes mtodos para aislar y purifi

car inmunoglobulinas normales se describen en
el captulo 45 (Purificacin de anticuerpos por
mtodos inespecficos).
Aislamiento y purificacin de protena
de Bence Jones*
Materiales y mtodo
a) La muestra de orina que contiene la pro

933

Preparacin de albmina bovina

dinitrofenoiada (DNP-SAB)y determinacin
del nmero de grupos dinitrofenol (DNP)
por molcula de albmina bovina (ESA)
Puede hacerse por tratamiento de la protena
con flor-dinitrobenceno o dinitrobenceno sulfonato de sodio.

M t o d o d e f l o r - d i n i t r o b e n c e n o '*

Incorporar la cantidad de protena a m arcar

(solucin de albmina bovina al 1% en N aCl
0,15 M adicionado de 0,25% de carbonato de
sodio) en un vaso de precipitacin introducido
en bao de hielo. Colocar el todo en un agita
dor m agntico y ponerlo en funcionam iento.
Aadir gota a gota 0,015 mi de solucin de
flor 2-4 dinitrobenceno por cada mi de so lu
cin de albmina, (La solucin de flor 2-4 di-

934

Mtodos inmunoqumicos

nitrobenceno es al 10% en dioxano. Siendo el

derivado dinitrofenolado lquido a temperatura
ambiente y su densidad 1,8, la solucin al 10%
se prepara disolviendo 0,55 mi del mismo en
9,45 mi de dioxano. La cantidad de flor 2-4
dinitrobenceno a aadir corresponde al 15%
del peso de la protena a marcar.) Mantener la
agitacin 30 minutos y dejar en la refrigeradora
durante toda una noche. Dializar contra NaCI
0,15 M hasta la eliminacin del flor 2-4 dini
trobenceno no combinado.
Terminada la dilisis se mide el volumen fi
nal y se calcula, sobre la base de la cantidad
inicial de protena, la concentracin de DNPBSA en mg m f'.
M t o d o d e l 2 - 4 d in it r o b e n c e n o

SULFONATO DE SODIO^

Disolver en agua cantidades iguales de pro

tena y carbonato de sodio de modo de obtener
una solucin que contenga 20 mg mf* de cada
uno. Aadir una cantidad igual de sal sdica de
2-4 dinitrobenceno sulfonato y mantener la so
lucin a temperatura ambiente o a 37C, agitan
do, el tiempo necesario para lograr la sustitu
cin deseada. Con 24 horas a 37C se consigue
muy buena sustitucin. Durante esta operacin
conviene cubrir el recipiente de reaccin con
papel de aluminio. Finalizada la reaccin, el
derivado dinitrofenolado se elimina por dilisis
contra NaCl 0,15 M, filtracin por Sephadex
G-25 o pasaje por columna de resina intercam
biadora aninica como Dowex 1 x 8 o IRA400, eluyendo con NaCl 0,15 M, fosfatos 0,01
M, pH 7,6.
Se conserva congelada o en refrigeradora a
4C, siendo conveniente preservarla de la luz.
El mtodo descrito es aplicable a cualquier
protena que tenga restos lisina, ya que el grupo
amino libre en posicin g de sta es el que ac
ta como principal fijador del DNP.
Clculo del nmero de grupos DNP
p o r molcula de BSA
Se determina por el cociente moles DNP/moles BSA. Para ello se prepara una solucin de
DNP-BSA de 200 (ig m f y se determina por
lectura espectrofotom trica la DO a 360 nm.
Con este dato se calculan los moles DNP por la
relacin DO (360 nm)/l 4.900 (14.900 =
del dinitrofenol).
Para la misma concentracin antignica y en
conocimiento del peso molecular de la SAB =
69 kD, se calcula el nmero de moles por la re
lacin |ig SAB/69 kD.
Con los datos obtenidos se calcula el nmero
de grupos DNP que contiene cada molcula de
SAB.

Ejemplo:
DNP-SBA = 200 |ig/ml
DO (360 nm) = 1,290
Moles DNP = 1,290/14.900 = 0,0000865
Moles BSA = 0,2/59,000 = 0,00000289
Grupos DNP/molcula SAB =
= 0,0000865/0,00000289 = 29,9
Copulacin a protenas
de compuestos de diazonio*
A pH alcalino, las sales de diazonio se fijan
al cadenas laterales de las molculas proteicas,
y el nmero de moles de sal fijada est en rela
cin directa con el nmero de molculas de tirosina, histdina y lisina presentes en la mol
cula de protena soporte. El mecanismo de fija
cin ya ha sido indicado en el captulo 3.
Se describir como ejem plo la fijacin de
cido p-aminobenzoico y gammaglobulina hu
mana.
Preparacin de la sal de diazonio
Disolver 40 mg de cido p-aminobenzoico en
2 mi de HCI 1 N y enfriar en bao de hielo.
Aadir gota a gota una solucin de NaNO, libre
en agua (14 mg m f'), previamente enfriada.
D espus de cada adicin agitar la m ezcla
con agitador magntico, por 30 segundos. El fi
nal de la reaccin se determina al verificar m e
diante papel de ioduro de almidn la presencia
de HNO^ (color azul). Se necesitan aproxima
damente 1,5 mi de solucin de nitrito.
Copulacin
Disolver 1 g de gammaglobulina humana en
20 mi de NaCl 0,13 M, cido brico 0,16 M y
NaOH para llevar a pH 9. El vaso de precipita
cin que contiene la solucin se introduce en
un cristalizador, se lo rodea de hielo y se colo
ca sobre un agitador magntico. Sobre la protena fra y agitando se aade gota a gota la sal
de diazonio, pero con el cuidado de ajustar el
pH a 9-9,5 con NaOH despus de cada adicin.
Continuar la agitacin en forma lenta durante 1
hora y mantener el pH entre 9 y 9,5.
El producto obtenido es luego dializado en
fro contra buffer de fosfatos 0 ,1 M, pH 7,6 du
rante una semana y luego contra NaCl 0,15 M,
fosfatos 0,01 M, pH 7,6. La dihsis puede susti
tuirse por filtracin a travs de Sephadex G-25,
eluyendo con NaCl 0,15 M, fosfatos 0,001 M,
pH 7,6. Se lo conserva congelado o en refrige
radora, previo aadido de un conservador.
Si la protena a la que se ha copulado la sal
de diazonio intensifica su color con el tiempo,
ello es debido a la disociacin de esta ltima, la

Antgenos proteicos
que debe ser eliminada por dilisis o filtracin
por Sephadex G-25.
Fijacin de pequeos pptidos a protenas
m ediante carbodiimidas
El mecanismo de la unin protena-protena
por intermedio de las earbodiimidas ya ha sido
descrito en el captulo 3.
El mtodo que se describir ser el de fija
cin de angiotensina a seroalbmina de cone
jo, usando la l-etil-3-(3-dim etil aminopropil)
carbodiimida. HCl como intermediario.
A 5 mg de seroalbmina de conejo y 10 mg
de (I-asparagina, 5-valina)-angiotensina d i
sueltos en 1,5 m de N aCl 0,15 M, fosfatos
0,01 M, pH 7,6 aadirle 150 mg de carbodiimi
da disueltos en 0,2 mi de agua y dejar a tem pe
ratura ambiente I a 12 horas. La aparicin de
un precipitado coloidal indica el final de la
reaccin y la eleccin del tiempo de contacto
de la mezcla. Cuando ello no ocurre se la deja
en esas condiciones toda una noche. Transcu
rrido este tiempo, o despus de la aparicin del
precipitado, la m ezcla se dializa contra agua
destilada durante 48 horas. Conservar congela
da o liofilizada.
Obtencin de membranas celulares
y liberacin de protenas unidas
a membranas*
M em branas celulares: se describirn dos
mtodos, uno referido a la liberacin de m em
branas de clulas de diferentes rganos, y el
otro de clulas obtenidas de cultivos celulares.
Obtencin de membranas celulares
a partir de rganos
El mtodo que se describe corresponde a la
obtencin de membranas de clulas de cerebro
de ratas. Tcnicas similares se usan para la ob
tencin de membranas de clulas de hgado.
Los animales se sacrifican por decapitacin,
se extraen los cerebros y se los congela a -20C
por 24 horas. Despus de descongelar, los cere
bros son homogeneizados con una mezcla de 3
volmenes de Hepes mM y 1 volumen de ED
TA mM, pH 7,4. El procesado se hace a 4C,
por 30 minutos, con la ayuda de un homogeneizador de tejidos. El homogenado se centrifuga
a 48.000 xg durante 10 minutos. El sedimento
es resuspendido nuevam ente en la solucin
buffer Hepes-EDTA, homogeneizado y centri
fugado como se indic arriba, repitiendo este
proceso cinco veces. El homogenado se conge
la a -20C y se lo mantiene a esa temperatura
1-3 das. Despus de descongelar las membra
nas son nuevamente homogeneizados y centri

935

fugadas por tres veces, usando en este caso H e

pes mM, sin EDTA. Las membranas son final
mente congeladas a -2 0 C, previa suspensin
al 20% P /V y c o n se rv a d a s h a sta su u s o a
-20C . Las m em branas deben ser usadas no
ms all de 3 semanas posteriores a su obten
cin.
Las membranas as purificadas son aptas pa
ra estudios bioqumicos y para ser usadas como
inmimgenos, especialmente para la obtencin
de sueros poliespecficos o anticuerpos monoclonales contra algunos de sus componentes.
Obtencin de membranas a partir
de cultivos celulares
Cultivos celulares en monocapa se lavan dos
veces con buffer Tris-H Cl 50 mM adicionado
del inhibidor de enzimas proteolticas fenil-metil-su lfo n il fluoruro (PM SF) 1 mM, pH 7,5
(Buffer A). Mediante el uso de un homogeneizador se las hom ogeneiza convenientem ente.
El material se distribuye en tubos de vidrio de
12 X 75 mm y se lo centrifuga a 800 xg durante
1 minuto, a 4C. El sobrenadante es centrifuga
do a 13.100 xg, a 4C, durante 20 minutos para
separar las membranas. Para conservarlas m an
tenerlas a - 7 0 C.
Liberacin de las protenas fijadas
a membranas
Si in teresa lib erar las protenas fija d a s a
membranas, se las solubiliza por agitacin en
buffer A conteniendo 1% de NP-40, durante 1
h o ra a 4 C, s e g u id a de c e n tr if u g a c i n a
100.000 xg en ultracentrfuga. El sobrenadante
conteniendo las m em branas solubilizadas se
conserva a -70C.
Para la separacin de las diferentes protenas
se emplean distintos procedimientos: crom ato
grafa de intercambio inico, cromatografa de
afinidad, cromatografa lquida de alta presin
(HPLC) u otros, procedimientos estos descritos
en el captulo 41.
En algunas oportunidades, especialmente p a
ra el aislamiento de receptores, se marca isot
picamente al ligando especfico y se lo hace interaccionar con la clula que expresa el recep
tor. Esta es luego sometida a disrupcin com o
se indic anteriormente, y el complejo ligandoreceptor aislado por inmunoadsorcin es diso
ciado, procedindose al aislamiento de la p ro
tena no radiactiva (receptor), de la radiactiva
(ligando).
A^ofl.- D eterg en tes com o T ritn X -1 0 0 y
CHAPS 3-[(3-cholam idopropyl)- D im ethylam onioJ-1 propane sulfonate, suelen u sa rse
tam b in para la lib eraci n de p roten as de
membranas celulares.

936

Mtodos inmunoqumicos

B IB L IO G R A FA

6 . N isonoff, A: En: M ethods in im m unology an im m uno-

1. K ekw ick, R A; C annan, R K: B iochem J, 30: 227. (M o

dificado en nuestros laboratorios), 1936.
2. A lderton, G; Fevold, J: J B iol Chem, 164: 1, 1946.
3. M argni, R A; Leoni, 1: N o publicado.
3bis. M argni, R A: Acerbo, E O; Heer, E E; Rajos, S E;
Clinic C him ica Acta, 28: 451, 1970.
4. Russell Little, J; Eisen, H N: En: M ethods in irnmunology an d im m im ochem istry. W illiam , C A y Chase, M
W (eds.), vol 1, p. 128. A cadem ic Press. N. York, 1967.
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8 . C ow aI, R. C ., H erz, J., G o ld s te in , .1. L ., E sser, V .,
Brow n, M. S. Low density lipoprotein receptor-related
pro te in m ediales u p tak e o f ch o lestero l esters deriv ad
from apoprolein E-enriched lipoproteinas Proc. Nati.
A c a d Sci. USA, 86 : 5810, 1989.
9. W right, B. A., Tyler, G. A O Brien, R C aporale, E.
H ., R o sem b iat, M . Im ra u n o p re c ip ita tio n o f the p ara th y ro id h o rm o n e r e c e p to r B io c h e m is tr y , 84: 26,
1987.

Preparacin de sueros inmunes

y purificacin de anticuerpos

RICARDO MARGNI

OBTENCION DE INMUNOSUEROS
Dos hechos fundamentales deben ser tenidos
en cuenta por quien quiera preparar inmunosueros: 1) es necesario inocular varios animales
con el m ism o inm ungeno, ya que todos no
responden de la misma manera y ello permite
seleccionar los mejores; 2) ser pacientes. M u
chas veces, animales que inicialmente no son
buenos respondedores, producen al final, si se
los estimula con dosis adecuadas de antgenos
e inyecciones suficientemente espaciadas, anti
sueros aceptables.

Preparacin de sueros aglutinantes

Suspensiones microbianas
para inocular
Los microorganismos deben ser previamente
identificados y analizados para determinar su
grado de pureza. Las suspensiones microbianas
a preparar conviene que procedan en lo posible
de cultivos en medios slidos, pues la evolu
cin de la fase Usa (L) a la fase rugosa (R) es
menos manifiesta en estos medios que en los l
quidos.
M

todo

Placas de Petri, que contienen el medio de

cultivo slido ms apto para el desarrollo del
microorganismo en estudio, son sembradas con
ste de acuerdo a la metodologa bacteriolgica
corriente. Despus del tiempo de incubacin
necesario (24-48 horas, segn el microorganis
mo) la ptina m icrobiana es suspendida en
NaCl, 0,15 M formulado al 0,7%. Se deja el
tiempo necesario hasta la m uerte de los m i

45
croorganism os, determ inado por ausencia de
desarrollo en los subcultivos. Se centrifuga, se
vuelca el sobrenadante y se lava el sedimento
microbiano tres veces con NaCl 0,15 M adicio
nado de M erthiolate al 0,01%. Finalm ente se
prepara una suspensin de 5 x ] Obacterias por
mi, utilizando para ello cualquiera de los m to
dos nefelomtricos conocidos.
Esta suspensin se conserva en la refrigera
dora por lai'go tiempo y resulta muy til para la
inmunizacin de los animales.
Obtencin de sueros aglutinantes
El animal de eleccin es el conejo. Los ani
males son inoculados por va intravenosa con
intervalos de 5 a 7 das. Se comienza con 0,5
mi de suspensin bacteriana (5 x 10"* b a c te
rias m f ) para continuar con 1 mi, 1,5 mi, 2,0
mi, 2,5 mi y 2,5 mi. Una semana despus se
sangran los animales. Al suero obtenido se le
aade azida sdica al 0,2% como conservador
y, previa determinacin de su ttulo (vase cap.
35), se lo envasa en ampollas o frascos ampolla
segn las necesidades.
Cuando se desee obtener grandes cantidades
de sueros aglutinantes, el animal a inocular se
r el caballo. Semanalmente, por va intraveno
sa, se le inyectarn 5 mi de suspensin b acte
riana. El nmero de estmulos vara entre 7 y
10 y el ptimo de la respuesta se determinar
por sangras exploradoras.
Pueden inocularse tambin con buenos resul
tados cabras y ovejas. En estos casos los vol
menes de suspensin bacteriana a inocular ser
de 2 mi por estmulo.
De manera similar a la indicada se preparan
los sueros aglutinantes con especificidad para
eritrocitos, leucocitos y otros tipos celulares.

936

Mtodos inmunoqumicos

B IB L IO G R A F A

6 . N isonoff, A: En: M ethods in im m unology an im m uno-

1. K ekw ick, R A; C annan, R K: B iochem J, 30: 227. (M o

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A c a d Sci. USA, 86 : 5810, 1989.
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H ., R o sem b lat, M . Im ra u n o p re c ip ita tio n o f the p ara th y ro id h o rm o n e r e c e p to r B io c h e m is tr y , 84: 26,
1987.

Preparacin de sueros inmunes

y purificacin de anticuerpos

RICARDO MARGNI

OBTENCION DE INMUNOSUEROS
Dos hechos fundamentales deben ser tenidos
en cuenta por quien quiera preparar inmunosueros: 1) es necesario inocular varios animales
con el m ism o inm ungeno, ya que todos no
responden de la misma manera y ello permite
seleccionar los mejores; 2) ser pacientes. M u
chas veces, animales que inicialmente no son
buenos respondedores, producen al final, si se
los estimula con dosis adecuadas de antgenos
e inyecciones suficientemente espaciadas, anti
sueros aceptables.

Preparacin de sueros aglutinantes

Suspensiones microbianas
para inocular
Los microorganismos deben ser previamente
identificados y analizados para determinar su
grado de pureza. Las suspensiones microbianas
a preparar conviene que procedan en lo posible
de cultivos en medios slidos, pues la evolu
cin de la fase hsa (L) a la fase rugosa (R) es
menos manifiesta en estos medios que en los l
quidos.
M

todo

Placas de Petri, que contienen el medio de

cultivo slido ms apto para el desarrollo del
microorganismo en estudio, son sembradas con
ste de acuerdo a la metodologa bacteriolgica
corriente. Despus del tiempo de incubacin
necesario (24-48 horas, segn el microorganis
mo) la ptina m icrobiana es suspendida en
NaCl, 0,15 M formulado al 0,7%. Se deja el
tiempo necesario hasta la m uerte de los m i

45
croorganism os, determ inado por ausencia de
desarrollo en los subcultivos. Se centrifuga, se
vuelca el sobrenadante y se lava el sedimento
microbiano tres veces con NaCl 0,15 M adicio
nado de M erthiolate al 0,01%. Finalm ente se
prepara una suspensin de 5 x ] Obacterias por
mi, utilizando para ello cualquiera de los m to
dos nefelomtricos conocidos.
Esta suspensin se conserva en la refrigera
dora por lai'go tiempo y resulta muy til para la
inmunizacin de los animales.
Obtencin de sueros aglutinantes
El animal de eleccin es el conejo. Los ani
males son inoculados por va intravenosa con
intervalos de 5 a 7 das. Se comienza con 0,5
mi de suspensin bacteriana (5 x 10"^ b a c te
rias r a l ) para continuar con 1 mi, 1,5 mi, 2,0
mi, 2,5 mi y 2,5 mi. Una semana despus se
sangran los animales. Al suero obtenido se le
aade azida sdica al 0,2% como conservador
y, previa determinacin de su ttulo (vase cap.
35), se lo envasa en ampollas o frascos ampolla
segn las necesidades.
Cuando se desee obtener grandes cantidades
de sueros aglutinantes, el animal a inocular se
r el caballo. Semanalmente, por va intraveno
sa, se le inyectarn 5 mi de suspensin b acte
riana. El nmero de estmulos vara entre 7 y
10 y el ptimo de la respuesta se determinar
por sangras exploradoras.
Pueden inocularse tambin con buenos resul
tados cabras y ovejas. En estos casos los vol
menes de suspensin bacteriana a inocular ser
de 2 mi por estmulo.
De manera similar a la indicada se preparan
los sueros aglutinantes con especificidad para
eritrocitos, leucocitos y otros tipos celulares.

938

Mtodos inmunoqumicos

Sueros precipitantes
El animal de eleccin depende de las dispo
nibilidades de antgeno, de las caractersticas
de ste y los fines de la preparacin. Pueden
usarse: conejo, rata, cobayo, cabra, oveja, caba
llo, etc.
Conejo: mezclar 1 mi de antgeno (1 mg m f
y 1 mi de adyuvante de Freund completo, procu
rando obtener una emulsin estable. Inocular 1
mi de la mezcla en cada una de las caras inter
nas de las patas traseras. Una semana despus,
preparar una mezcla similar a la anterior e ino
cular cuatro dosis de 0,5 mi a lo largo de la co
lumna vertebral. A las tres semanas repetir una
inoculacin igual a la primera, y entre 6 y 10
das despus sangrar a los animales.
Las sangras pueden hacerse por puncin
cardaca o a travs de la vena marginal de la
oreja, previo frotado con xilol.
Cabra: el procedimiento es similar al indica
do para el conejo, con la diferencia de que por
vez se inoculan 4 mi de una mezcla en partes
iguales de antgeno (2-5 m g .m f) y adyuvante
de Freund completo y los animales son sangra
dos por la vena yugular.
Oveja: se sigue el procedim iento indicado
para la cabra.
Cobayo: se emplea el mtodo descrito para
el conejo, pero usando antgeno a la concentra
cin de 0,5 mg m i ', que es m ezclado con
igual volumen de adyuvante de Freund com
pleto. Se hacen por vez dos inoculaciones de
0,5 mi.
Rata: se usa antgeno a 250-500 [ig por mi.
El mtodo y los volmenes de inoculacin son
los indicados para el cobayo.
Cuando los antgenos no tienen buen poder
inm unognico, generalm ente no se consigue
una respuesta adecuada con los planes de in
munizacin indicados. En esos casos, dejar los
animales en reposo por 2-3 meses y luego ino
cularlos con la misma dosis de antgeno usada
inicialmente, pero en esta oportunidad mezcla
da con adyuvante de Freund incom pleto (sin
M. tuberculosis), haciendo varias inoculaciones
subcutneas de 0,5 mi cada una en diferentes
partes del dorso del animal, a uno y otro lado
de la columna vertebral. Sangrar 8-10 das des
pus. Si los ttulos no fueran, an los deseados,
efectuar 3 semanas despus una nueva reinocu
lacin de reestmulo similar a la anterior, san
grando a los 6-8 das.
Si los antgenos para los que se quiere obte
ner anticuerpos especficos son pptidos peque
os, conviene fijarlos covalentem ente a dos
molculas portadoras diferentes, como seroal
bmina bovina (SAB) y hemocianina de can
grejo (KLH). En estos casos se inoculan los
animales (preferentemente conejos) con peque

as dosis del primer conjugado (250-300 |j,g)

mezclados con adyuvante de Freund completo.
Las inoculaciones se hacen en varias zonas del
dorso del animal, repartidas en pequeos voltimenes (0,2-0,3 mi) y se repiten una vez por
mes. Cuando en el suero del animal comienzan
a detectarse anticuerpos, se usa el segundo con
jugado como inmungeno. Muy frecuentemen
te, el cam bio de soporte induce un m arcado
efecto reestimulativo con un apreciable aumen
to de los anticuerpos circulantes especficos pa
ra el antgeno pequeo.
En oportunidades interesa preparar sueros
con anticuerpos de muy alta afinidad (Ko = 10'
a 10'^ M^'), especialm ente cuando van a ser
usados en el desarrollo de RIA o ELISA. En es
tos casos los anim ales deben ser inyectados
subcutneamente, en forma simultnea en va
rias partes del dorso, con un inculo total de 1020 |ig de antgeno mezclados con adyuvante de
Freund completo. Despus de 6 semanas de re
poso se los reestimula de manera similar a la
anterior, pero usando en este caso adyuvante de
Freund incompleto. Si los ttulos no fueran ade
cuados se dejan los animales en reposo por 3-4
meses y se repite una estimulacin igual a la
anterior. Los animales son sangrados 6-8 das
despus.
Sueros hemolticos (vase cap. 22)
Obtencin de sueros monoespecficos
Los sueros aglutinantes y precipitantes pre
parados en la forma indicada son en su mayora
pohespecficos pues los antgenos usados gene
ralmente poseen ms de un determinante antignico. Para transformarlos en m onoespecfi
cos es necesario adsorberlos con suspensiones
o soluciones antignicas, segn el caso, que
contengan los determinantes antignicos espe
cficos para los anticuerpos que se quieren eli
minar y carezcan de aquel cuyos anticuerpos se
deseen conservar en el suero.
Si los antgenos son particulados, las adsor
ciones del suero se hacen a tem peratura am
biente durante 18 horas con suspensiones anti
gnicas lo ms concentradas posible, hasta que
los sobrenadantes den negativas las reacciones
de aglutinacin. Cuando para obtener sueros
monoespecficos resulte indispensable adsorber
con ms de un tipo de suspensin antignica,
las adsorciones se hacen en forma sucesiva.
Para transform ar un suero precipitante en
monoespecfico, la cantidad de antgeno adsor
bente a aadir se determina por curva de preci
pitacin (cap. 35). La cantidad de antgeno co
rrespondiente a la zona de equivalencia y cal
culada sobre la base de ese dato para el volu
men de suero a adsorber, se mezcla con el mis

Preparacin de sueros inmunes y purificacin de anticuerpos

mo, se incuba a 37C 1 liora y 18 horas a 4C,
separando el sobrenadante por centrifugacin.
Las adsorciones tambin pueden hacerse con
inmunoadsorbentes (cap. 41), sea por pasaje a
travs de columna o por agitacin con aqullos.
P U R IFIC A C I N D E A N TIC U ER PO S
Mtodos inespecfcos
Permiten obtener inmunoglobulinas totales
(inmunes y no inmunes) purificadas. La separa
cin del anticuerpo de las inm unoglobulinas
restantes slo puede hacerse mediante mtodos
especficos.
Precipitacin salina
S ulfa to

d e a m o n io '

A 1 volumen de suero aadirle, agitando, 1

volum en de solucin saturada de sulfato de
amonio: 760 g de (NH^j^SO^, disueltos en un
litro de agua destilada; ajustar a pH 7. La pro
tena precipitada es separada por centrifugacin
durante 30 minutos a 5.000 rpm y disuelta en
agua hasta un volumen igual a la mitad del ini
cial. Adicionarle 1 volumen de solucin de sul
fato de amonio preparada mezclando 2/3 de so
lucin saturada de la sal y 1/3 de agua destila
da; centrifugar. R edisolver el precipitado en
agua y repetir la operacin anterior cuatro a
cinco veces.
El precipitado obtenido despus de la liltima
precipitacin es dializado contra NaCl 0,15 M
o la solucin buffer deseada, hasta eliminacin
total del sulfato de amonio. La dilisis puede
sustituirse por filtracin a travs de Sephadex
G-25 o G-50 equilibrado previamente con el
mismo buffer.
Su lfa to

d e s o d io

Al suero previamente dializado contra fosfa

to 0,01 M, pH 8, se le a d ic io n a n 18 g de
Na^SO,^ por cada 100 mi, agitando hasta disolu
cin de la sal aadida. El precipitado se disuel
ve en el mismo buffer hasta un volumen igual
al 40% del inicial, clarificando por centrifuga
cin. Por cada 100 mi aadirle 12 g de Na^SO^,
agitando. El precipitado formado, separado por
centrifugacin, es disuelto en el buffer de fos
fatos hasta un volumen igual al 20% del suero
original y reprecipitado por el aadido de 12 g
de Na^SO^ por cada 100 mi. El sulfato de sodio
residual puede eliminarse por dilisis del preci
pitado o redisolucin en NaCl 0,15 M y filtra
cin por Sephadex G-25.

939

Precipitacin alcohlica^
El mtodo permite obtener IgG purificada, a
la vez que mezcla de IgM e IgA libres de otras
protenas sricas.
El suero se diluye 1:3 en agua destilada, se
enfra a 0C y se ajusta a pH 7,7. Agitando con
tinuamente se aade alcohol de 50 enfriado a
-20C, hasta obtener una concentracin final en
etanol del 20%. La temperatura de la m ezcla en
esos momentos oscila alrededor de los -5C .
La mayor parte de las inmunoglobulinas p reci
pitan en esas condiciones y se las separa por
centrifugacin a 10.000 rpm, durante 30 m inu
tos a ~5C.
Disolver el precipitado en NaCl 0,02 M en
friado a 0C y ajustar el pH a 5,1 con cido
actico 0,05 M, manteniendo la temperatura in
dicada. En esas condiciones IgM e IgA precipi
tan (II), en tanto que la IgG queda en el sobre
nadante (I).
IgG

PURIFICADA

A justar el sobrenadante (I) a pH 7,4 con

N a2H P 04 0,5 M enfriado a 0C y aadirle al
cohol de 50 enfriado a -20C hasta una con
centracin final en etanol del 25%, m antenien
do la temperatura de -5C. La IgG precipita en
esas condiciones y se la puede separar por cen
trifugacin a 10.000 rpm unos 30 m inutos a
-5C. El precipitado obtenido es disuelto en
NaCl 0,15 M y se le aade 0,2% de glicina co
mo estabilizador o se liofiliza. Si se lo conser
va en so lu ci n es re co m en d ab le a d ic io n a r
0,01% de Merthiolate y mantenerlo en la refri
geradora. Para inoculaciones debe ser p revia
mente filtrado a travs de membranas esterili
zantes.
M e z c la d e

IgM

IgA

El precipitado (II) se disuelve en agua desti

lada enfriada a 0C, y manteniendo la tem pera
tura se ajusta a pH 5,1 con cido actico 0,05
M. El precipitado se elimina por centrifugacin
a esa temperatura y el sobrenadante se ajusta al
pH 5,5 con Na jHPO^ 0,1 M, llevando la fuerza
inica de la mezcla a 0,01-0,0075. Aadir eta
nol al 50% enfriado a -20"C hasta concentra
cin final del 10%, manteniendo la temperatura
entre -2C y - 3 C durante la operacin. El pre
cipitado formado, que contiene IgM e IgA, se
separa por centrifugacin a 10.000 rpm durante
30 minutos a temperatura de 2C. Al igual que
la IgG, se las puede conservar en solucin o
liofilizadas.

940

Mtodos inmunoqumicos

Purificacin de IgG p o r precipitacin

en presencia de cido caprlico*
Diluir l volumen de suero o ascitis con 4 vo
lmenes de buffer acetato 0,06 M, pH 4, y el pH
de la muestra se ajusta a 4,5 con NaOH 0,1 N.
Por cada ral de muestra diluida, aadir lenta
m ente, gota a gota, con agitacin continua,
0,25 jil de cido caprlico. Agitar la solucin
por otros 30 minutos y separar luego el mate
rial insoluble (albmina y otras protenas dis
tintas de IgG) por centrifugacin a 10.000 xg
durante 30 minutos.
Si fuera necesario, filtrar por malla de nailon
(mesh 125 |0,m) para remover partculas muy fi
nas. Mezclar 10 partes del sobrenadante con 1
parte de NaCl 1,5 M, fosfatos 0,1 M, pH 7,2.
Ajustar a pH 7,4 con NaOH 1 N.
(Todas las operaciones sealadas pueden lle
varse a cabo a temperatura ambiente. De aqu
en ms debe trabajarse a 4C).
Al sobrenadante corregido, enfriado a 4 C,
se le aade sulfato de amonio (0,277 g por cada
mi de muestra, para conseguir 45% de satura
cin). Agitar 30 minutos y separar la IgG por
centrifugacin a 5.000 xg durante 15 minutos.
Se descarta el sobrenadante y el sedimiento
se suspende en NaCl 0,15 M, fosfatos 0,01 M,
pH 7,2, en un volumen equivalente a 1/10 del
correspondiente al original de suero o ascits.
Dializar contra 50-100 volmenes de NaCl
0,15 M, fosfatos 0,01 M, pH 7,2.
La muestra dializada se calienta a 50-55C
por 20 minutos y centrifuga a 5.000 xg durante
20 minutos. Si es necesario, se concentra la
muestra por ultrafiltracin (Amicn, membrana
PM-30) y se conserva a -20"C.
Nota: si el suero fuese lipmico, conviene
tratar el sobrenadante de la precipitacin con
cido caprlico con Amberlita XAD-2 (previa
mente lavada con metanol y agua) en la pro
porcin de 1 g de resina por cada 10 mi del so
brenadante de 10.000 Xg. Agitar 15 minutos a
temperatura ambiente y eliminar la resina, lpidos e impurezas por filtracin por malla de nai
lon (mesh 250 |am).

Purificacin de IgG por cromatografa

de afinidad usando Protena A-Sepharosa'*
Por este procedim iento puede purificarse
IgG humana a partir de suero, e IgG de ratn.
En el caso de anticuerpos monoclonales de ori
gen murino, el material a procesar puede ser l
quido asctico o sobrenadante de cultivos de hibridomas.
Las muestras a purificar deben ser previa
mente clarificadas por centrifugacin a 20.000
xg, a 4C durante 30 minutos. Determinar en el
sobrenadante la concentracin de IgG m f .

empleando para ello cualquiera de los mtodos

conocidos (inmunonefelometrfa, ELISA, etc.).
En el caso de sueros o lquidos de ascitis, di
luirlos LIO con N aCl 0,15 M, fosfatos 0,01 M
(SSF), pH 8, antes de cromatografiar.
Preparar la columna de Protena A-Sepharosa CL-4B hidratada (Pharmacia LKB) y equili
brar con SSF, pH8. La cantidad de resina a usar
es de 1 mi por cada 5 mg de IgG de ratn u 8
mg de IgG hum ana. Introducir la m uestra a
cromatografiar por la parte superior de la co
lumna, y cuando ha penetrado totalmente en la
resina, proceder al lavado exhaustivo de sta
con SSF, pH 8, hasta que la DO del lquido de
elucin corresponda al valor basal.
Eluir con cido ctrico 0,1 M ajustado con
NaOH al pH adecuado gG humana: pH 4,5;
IgG de ratn - IgG I : pH 6,5 - IgG2a: pH 4,5 lgG2b e IgG3: pH3).
Teniendo en cuenta que el pH cido puede
desnaturalizar las inmunoglobulinas eluidas, es
conveniente colocar en los tubos del colector de
fracciones donde es recogido el producto de elu
cin, 50 |0,1 de Tris 2M por cada mi de eluido.
Agrupar el contenido de los tubos cuyas DO
hayan dem ostrado que contienen protena y
dializar frente a SSF, pH 7,3.
Conservar las muestras a 4C y determinar
su pureza por SDS-PAGE.
La columna usada puede recuperarse por la
vados sucesivos con SSF, pH 7,3 conservndo
la a 4'C.

Purificacin por cromatografa de afinidad

con protena G-Sepharosa
Este es un mtodo til y rpido para la puri
ficacin de IgG humana y de rata. No es reco
mendable para purificar las IgG de ratn, pues
su desorcin de la resina resulta dificultosa.
La capacidad de fijacin de protena G-Sepharosa es superior a la de protena A-Sepharosa; 1 ral de resina puede fijar O mg de inmunoglobulina.
El protocolo de trabajo es similar al indicado
para protena A-Sepharosa, pero como en este
caso el mtodo no est estandarizado, es con
veniente hacer un ensayo previo en pequea es
cala, utilizando un gradiente de pH, para esta
blecer cul es el adecuado para la desorcin de
la inmunoglobulina fijada.
Purificacin de IgG, IgA e IgM
p o r cromatografa en DEAE-celulosa
y filtracin p o r geles '
Los mtodos para la activacin de las resinas
intercambiadoras y la preparacin de los geles
filtrantes ya han sido indicados en forma por
menorizada en el captulo 41.

Preparacin de sueros inmunes y purificacin de anticuerpos

P

u r if ic a c i n

DE I g G

Se hace por separacin crom atogrfica en

columnas de DEAE-celulosa, ya sea partiendo
de productos parcialmente purificados por pre
cipitacin salina o alcohlica o directam ente
del suero.
La capacidad de adsorcin de las diferentes
resinas comerciales no es la misma; no obstan
te, por cada gram o puede crom atografiarse
1 mi de suero. Cuando se trata de productos
purificados, la relacin es aproxim adam ente
100 mg de protena por gramo de resina.
Para la purificacin de IgG el suero o pro
ducto a cromatografiar se dializa previamente
contra buffer de fosfatos 0,01 M, pH 8 en for
ma completa. La columna se equilibra con el
mismo buffer, debindose controlar para ello la
conductividad del efluente, que ha de ser igual
a la del buffer inicial.
Preparada la columna cromatogrfica conve
nientemente, se coloca en ella el suero dializado. Cuando ste se ha incorporado totalmente
en la resina se aaden unos pocos mi del buffer
y luego se establece la conexin con el reci
piente que lo contiene, de modo que pueda
continuar el flujo. El eluido se recoge en un co
lector automtico de fracciones, en un volumen
de 3 mi por tubo, en tanto se vigila la aparicin
de protenas por lecturas al espectrofotmetro
de las DO a 280 nm. El pico proteico que eluye
a la m olaridad indicada est constituido por
IgG con un alto grado de pureza.
P

u r if ic a c i n d e

Ig A

Despus de haber eluido la IgG en una cro

matografa de suero por DEAE-celulosa, es po
sible obtener IgA aumentando progresivamente
la concentracin molar del buffer mediante un
gradiente. A molaridad 0,03-0,035 eluye un pi
co proteico de IgA, que generalmente contiene
contam inantes. P or reciclado del mismo en
DEAE-celulosa, y eluyendo con gradiente de
buffer de fosfatos, inicial 0,01 M, pH 8 y final
0,1 M, pH 6,5, es posible obtener IgA pura.
P u rific a c i n d e

IgM

Si la concentracin srica de IgM es grande,

se la puede precipitar por dilucin 1:10 en agua
boricada (cido brico al 7 por mil en agua des
tilada). Por dilucin en ClNa 0,15 M y repreci
pitaciones se obtiene un producto con cierto
grado de pureza, que puede ser repurificado por
filtracin a travs de Sephadex G-200, utilizan
do com o elu y en te b u ffer de b o rato clo ru ro
0,2 M, pH 8. Utilizando una columna de 3 x
100 cm es posible filtrar 5-7 mi de muestra y
obtener una buena separacin de IgM.

941

Obtencin de la IgA secretoria

y componente secretorio^
IgA

SECRETORIA

La IgA secretoria humana se asla del suero

de calostro, que se obtiene a partir de una m ez
cla de c alo stro s n orm ales. Se c e n trifu g a a
20.000 rpm durante 2 horas para rem over las
grasas y luego se lleva a pH 4,6 con cido ac
tico 1 N para precipitar la casena, que es eli
minada por centrifugacin a 10.000 rpm duran
te 20 minutos.
Se determina el contenido proteico del suero
de calostro y se lo cromatografa por una co
lumna de DEAE-celulosa (3 x 30 cm por cada
3 g de protena de la muestra), eluyendo con
buffer de fosfatos 0,01 M, pH 7,6. (La columna
debe ser previamente estabilizada con el m is
mo buffer y la muestra a cromatografiar, dializada contra buffer de fosfatos 0,01 M, pH 7,6.)
La fraccin eluida en esas condiciones es eli
minada o reservada para aislar el componente
secretorio (S) libre, si as se lo desea. Se hace
pasar luego buffer de fosfatos 0,1 M, pH 6,4, y
la fraccin eluida (aproximadamente 0,5 g de
protena) es crom atografiada en una colum na
de CM-celulosa (2 x 25 cm), eluyendo con un
gradiente linear de buffer actico-acetato 0,005
(300 mi) y 0,5 M (300 mi), pH 5.
En las fracciones que eluyen se investiga IgA
por doble inmunodifusin, usando para ello un
suero anti-lgA. Todas las fracciones que dan
reaccin positiva son juntadas y concentradas
hasta un volumen de aproximadamente 5 mi,
dializadas contra buffer Tris-HCl 0,05 M, pH 8,
que contiene NaCl I M, y filtradas por una co
lumna de Sephadex (G-200 (2,8 x 100 cm), elu
yendo con el mismo buffer. La fraccin corres
pondiente al primer pico de elucin, que contie
ne la IgA secretoria, es concentrada a 5 mi y recrom atografiada en la misma columna de Se
phadex. El primer pico de elucin es dializado
exhaustivamente contra agua destilada y liofilizado. Si se lo va a conservar congelado convie
ne dializar contra solucin sahna tamponada.
C o m pon en te

s e c r e t o r io

Se lo puede obtener del eluido con buffer de

fosfatos 0,01 M, pH 7,6 proveniente de la cro
matografa en DEAE-celulosa del suero de ca
lostro, como se indicara anteriorm ente, o de
IgA secretoria reducida y alquilada. El prim er
procedimiento es el menos complicado y p ro
vee un producto aceptable.
La primera fraccin que eluye con fosfatos
0,01 M, pH 7,6, cuando se cromatografa por
DEAE-celulosa suero de calostro, contiene la
mayor parte del componente secretorio libre.

942

Mtodos inmunoqumicos

Para su aislamiento y purificacin se aaden

27 g de sulfato de amonio por cada 100 mi de
eluido, ajustado a pH 7,6. Se elimina el precipi
tado por centrifugacin a 10.000 rpm durante
15 min, y el sobrenadante (aproximadamente
500 mg de protena), previa dilisis contra buf
fer actico-acetato 0,005 M, pH 5, es introduci
do en una co lu m n a de C M -c e lu lo sa (2 x
25 cm) equilibrada con el mismo buffer. Apli
car un gradiente de elucin linear entre 0,005
M (300 mi) y 0,5 M (300 mi) de buffer acticoacetato, pH 5. Las fracciones eluidas que con
tienen componente secretorio, identificadas por
doble inmunodifusin con inmunosuero espec
fico, se juntan y concentran a 5 rnl, se dializan
contra buffer Tris-HCl 0,05 M, pH 8, que con
tiene NaCl 1 M y se filtran por colum na de
Sephadex G-200 (2,8 x 100 cm) eluyendo con
el mismo buffer a una velocidad de 20 ml/hora.
Midiendo la absorbancia a 280 nm se detectan
dos picos proteicos, el segundo de los cuales es
componente secretorio. Se lo vuelve a filtrar
por la misma columna, en las condiciones ante
riormente indicadas, se lo dializa contra agua
destilada y liofiliza.
Mtodos especficos
Cuando el antgeno es una protena compleja
El anticuerpo es precipitado del suero inm u
ne por aadido de antgeno en cantidad corres
pondiente a la zona de equivalencia (cap. 35,
Precipitacin cuantitativa). Se lava el precipita
do tres veces con NaCl 0,15 M, y se lo disocia
luego con buffer de glicina-HCl 0,1 M, pH 3.
Se centrifuga y el sobrenadante se filtra por
una columna de Sephadex G-200 estabilizada
con el mismo buffer. En el eluido aparecen tres
picos proteicos, el primero correspondiente a
complejos solubles Ag-Ac, el segundo a anti
cuerpo puro y el tercero al antgeno (fig. 45-1).
La fraccin proteica anticuerpo se dializa con
tra NaCl 0,15 M, fosfatos 0,01 M, pH 8 y se
centrifuga para elim inar la inm unoglobulina
desnaturalizada por el tratamiento cido. El so
brenadante constituye exclusivamente anticuer
po con especificidad para el antgeno usado iniciaimente en la precipitacin.
Los anticuerpos contra antgenos proteicos
pueden purificarse tambin por crom atografa
de afinidad, fijando los antgenos a soportes
inertes e insolubilizndolos por polimerizacin
(vase captulo 41).
Cuando el anticuerpo tiene especificidad
para un hapteno definido^
Se tomar como ejemplo purificacin de an
ticuerpo antidinitrofenol (anti-DNP).

Tubos
Fig. 45-1. Filtracin por colum na de Sephadex G -200 del
pro d u cto de d iso ciaci n del co m p lejo o v o alb m in a -an tioalbm ina, por tratam iento con buffer de glicina-H C I 0,1

M. pH 3.

La precipitacin en zona de equivalencia se

hace como en el caso anterior. La disociacin
del precipitado se logra con dinitrofenol 0,1 M
en NaCl 0,15 M, fosfatos 0,01 M, pH 8, aa
diendo 1 mi por cada 10 mg de anticuerpo pre
cipitado. Al sobrenadante de centrifugacin se
lo pasa por una columna constituida por un vo
lumen de DEAE-celulosa igual al de la solu
cin a cromatografiar, y tres voMmene.s de Do
wex 1 X 8 o Amberlita IRA-400. La columna
se arma de modo que la Amberlita o el Dowex
queden en la parte inferior. Se la estabiliza con
NaCl 0,15 M, fosfatos 0,01 M, pH 8, utilizando
el mismo buffer para la elucin.
Si la precipitacin se hizo con DNP-BSA
(seroalbtimina bovina dinitrofenolada) al diso
ciar con dinitrofenol (DNP-OH) quedan en el
sobrenadante DNP-BSA, anticuerpo anti-DNP,
anti-DNP-DNP-OH y DNP-OH. La DNP-BSA
en las condiciones de la elucin tjueda retenida
en la DEAE-celulosa y el DNP-OH libre se fija
a la Amberlita o Dowex, al igual que el que se
libere del complejo anti-DNP-DNP-OH a me
dida que se desplace el equilibrio por fijacin
de DNP-OH libre. El anticuerpo eluye sin con
taminantes.
Anticuerpos antipolisacridos'^
Los anticuerpos de este tipo, en especial los
antineumoccicos, pueden se purificados por
precipitacin en zona de equivalencia y rediso
lucin en NaCl al 15%.
Para ello los anticuerpos son precipitados del
suero por aadido de la dosis de antgeno co
rrespondiente a la zona de equivalencia. La
precipitacin se hace 1 hora a 37C y 24 horas
a 4C. El precipitado se lava 4-5 veces con
NaCl 0,15 M helado y luego se suspende en

Preparacin de sueros inmunes y purificacin de anticuerpos

NaCl al 15%, colocando el tubo en bao de
agua a 37C durante 1 hora. El volum en de
NaCl a usar es aproximadamente la tercera par
te del volumen inicial del suero inmune. El so
brenadante se separa por centrifugacin y el
precipitado se lava con NaCl al 15%. Los so
brenadantes se juntan, dializan contra NaCl
0,15 M y centrifugan para eliminar impurezas,
el sobrenadante constituye el anticuerpo purifi
cado.
Purificacin de anticuerpos anti-Rh
Puede lograrse por diferentes procedimien
tos:
a) Elucin p o r calentamiento.'^ Lavar tres
veces con NaCl 0,15 M glbulos rojos hum a
nos del grupo O, con especificidad antignica
para el anticuerpo anti-Rh que se quiere aislar.
Aadir al paquete de glbulos 15-20 volimenes del suero que contiene los anticuerpos e in
cubar 1-2 horas a 37C. Lavar tres veces con
NaCl 0,15 M y suspender los glbulos en tres
voltmenes del mismo. Calentar a 56C durante
5 minutos y centrifugar a esa temperatura. El
sobrenadante contiene anticuerpos que pueden
ser repurificados por cromatografa en DEAEcelulosa. (Total de anticuerpo recuperado: 3540%.)
b) P or tratam iento con solventes no p o la
res.'' Lavar los glbulos rojos que tienen fija
dos los anticuerpos anti-Rh y suspenderlos al
50% en solucin salina. Aadirles igual volu
men de ter etlico y mezclar por inversin du
rante 1 minuto. La capa superior (ter) y la me
dia (estroma desnaturalizado) son eliminadas.
La capa inferior que contiene la hemoglobina y
el eluato es calentada a 37C durante 15 minu
tos para eliminar el ter residual y luego centri
fugada para clarificar.
El anticuerpo as obtenido resulta altamente
impurificado por hemoglobina y otros compo
nentes hemtcos. Si el producto va a ser utili
zado en estudios fisicoqumicos o inm unoqu
micos, el anticuerpo (IgG) debe ser repurificado por cromatografa en DEAE-celulosa.
El anticuerpo que se recupera por este proce
dimiento oscila entre el 40 y 70%.
c) Por acidificacin.'^ Uno de los mtodos
ms recomendables para la obtencin del estro
ma a usar en la purificacin de los anticuerpos
anti-Rh es el que utiliza digitonina. El adsor
bente obtenido en esas condiciones est libre de
protenas plasmticas contaminantes. Para ello,
aadir a 10 mi de glbulos rojos ORh+ al 10%,
enfriados, 0,5 mi de digitonina (5 mg m i ' en
NaCl al 0,9% ), La lisis ocurre en m enos de
1 minuto, la que va seguida de agregacin del
estroma. Centrifugar a 35,000 x g durante 30
minutos a 4C y lavar varias veces con solucin

943

salina hasta la eliminacin de la hemoglobina.

El estroma as obtenido sedimenta rpido y se
dispersa muy bien.
Para el aislamiento y la purificacin de los
anticuerpos anti-Rh poner el estroma en con
tacto con el suero inmune, mantenerlo al 37C
por 30-60 minutos, invirtiendo el tubo de tanto
en tanto para facilitar la adsorcin de los anti
cuerpos, centrifugar y lavar el sedimento con
solucin salina. D isociar con buffer glicinaHCl 0,1 M, pH 3 y dializar contra b u ffer de
fosfatos pH 7,3.
La purificacin puede hacerse tambin fijan
do los anticuerpos a los eritrocitos, tratndolos
luego con digitonina y eluyendo en la form a ya
indicada. Se recupera aproximadamente el 80%
de los anticuerpos.
Purificacin de anticuerpos mediante
el empleo de inmunoadsorbentes'^ '^
El inmunoadsorbente a emplear depende del
anticuerpo a purificar. Para los antihaptenos o
contra protenas complejas, los obtenidos por
polimerizacin con glutaraldehdo ya descritos
dan m uy buenos resu ltad o s. Pueden usarse
tam b in otros tip o s de in m un oad sorben tes
(cap. 41, Cromatografa de afinidad).
Pasar por la columna con inmunoadsorbente
el suero inmune. Lavar con NaCl 0,15 M hasta
ausencia de protenas detectables por lectura
espectrofotomtrica de las DO a 280 nm. La di
sociacin se hace con buffer de glicina-HCl,
pH 3 o hapteno 0,1 M, como ya se indic en
mtodos especficos de purificacin, y se pro
cede luego a la separacin final en Sephadex
G-200 o columnas de intercambio inico, segtn el caso.
AISLAMIENTO Y PURIFICACIN
DE IgG2 E IgG l DE OVEJA's
El aislamiento y purificacin de los anticuer
pos IgG 2 e IgG l en conjunto se h a c en por
cu alquiera de los m todos ya indicados. Su
eleccin depende del antgeno utilizado en la
inmunizacin.
La separacin de IgG2 e IgG l se realiza por
crom atografa en DEAE-celulosa estabilizada
con b u ffer de fo sfato s 0,01 M, pH 7 ,6 . La
muestra a cromatografiar, previa dilisis com
pleta en el mismo buffer, es introducida en la
colum na. La elucin se inicia con b u ffer de
fosfatos 0,01 M, pH 7,6, hasta eliminacin del
prim er pico proteico determinado por lectura
espectrofotomtrica de la DO a 280 nm , y se
contina luego con buffer de fosfatos 0,1 M,
pH 7,6 hasta eliminacin del segundo pico. La
recoleccin de las muestras se efecta con un

iciuuut inmunoQUimicos
colector automtico de fracciones, y se aconse
jan volmenes de 2-3 mi por tubo.
A molaridad 0,01 eluye IgG2, y a molaridad
0,03 eluye IgG l.
A ISLA M IEN TO Y PU R IF IC A C I N
DE L O SA N T IC U ER PO S A NTI-D NP
ELA BORA DO S P O R E L COBAYO'^'
Los anticuerpos anti-DNP se aslan por pre
cipitacin en zona de equivalencia o por pasaje
a travs de una columna de inmunoadsorbente,
como ya se indicara. Los anticuerpos purifica
dos se concentran por ultrafiltracin a un volu
men de 5 mi y pasan por columna de Sephadex
G-200 (2,8 X 95 cm). El primer pico proteico,
c)ue eluye entre los 80-130 mi de flujo es IgM
anti DNP. El resto del eluido se concentra, se
dializa en buffer de fosfatos 0,01 M, pH 7,6 y
se crom atografa por D EA E-celulosa. A esa
molaridad eluye un pico proteico (1). Se aplica
luego un gradiente de fosfatos 0,01/0,3 M, pH
7,6. Eluyen dos fracciones a 0,03-0,04 M (11) y
0,12 M (III). Reciclando el pico (I) en DEAEc e lu lo s a con un g ra d ie n te de fo s fa to s
0,003/0,015 M, pH 7,6 se obtienen tres picos
proteicos c]ue eluyen a 0,003-0,004 M, 0,006 M
y 0,008 M. Los tres tienen caractersticas fsico-cjumicas y comportam iento inmunolgico
de IgG2, pero el que eluye en tercer trmino no
da anafilaxia cutnea pasiva (PCA) en el ratn.
Recromatografiando el pico (II) por DEAEcelulosa con gradiente de fosfatos 0,01/0,08 M,
pH 7,6, se obtienen dos picos proteicos que
eluyen a 0,015-0,02 M y 0,03-0,04 M, re.spectivamente. El que eluye en prim er trm ino es
IgA y el otro es IgG 1.
El pico proteico (III), que eluye a 0,12 M, es
IgE.
AISLAMIENTO Y PURIFICACION
DE IgGa, IgGb e IgG c DE CABALLO'"
Los anticuerpos se aslan y purifican a partir
del suero inmune de acuerdo con el m todo
que ms convenga segn su especificidad. Los

anticuerpos purificados se cromatografan por

DEAE-celulosa equilibrada con buffer de fos
fatos 0,003 M, pH 8, y se eluye con el mismo
buffer hasta recoger toda la protena no reteda (pico 1). Se hace pasar luego buffer de fosfa
tos 0,005 M, pH 8, hasta elucin de una nueva
fraccin proteica (pico II). Se equilibra la co
lumna con buffer de fosfatos 0,02 M, pH 8, y
luego se hace pasar un gradiente de elucin
constituido por el mismo buffer como inicial y
NaCl 0,5 M com o final. A m olaridad 0,023
eluye un nuevo pico proteico (pico III).
De los tres picos aislados, el (I) es IgGa, el
(II) IgGb y el (III) IgGc.
B IB L IO G R A F A
1. K endall, F E: C oid Spring H arb o r Sym p Q u a n t Biol,
6: 376, 1938.
2. K ekw ick, R A: Biochem J, 34: 1248, 1940.
3. Cohn, E .1; Strong, L E; H ughes, W L; M ulford, D
A shw orth, J N; M eliii, A; T a y lo r, H L: i A m Chem
Soc, 68: 459, 1946.
4. Me Kinney, M M ; Perkinson, A: A simple, non-chrom a to g rap h ic p ro c e d u re to p u rify im m u n o g lo b u lin s
from serum and ascitis fluid. J Im m unol M ethods, 96:
271. 1987.
4bis. C u rre n t P ro to c o ls in Im m u n o lo g y V o l. 2, (2 -8 ),
1993.
5. Fahey, S 1/. Terry, E W : En: H andhook o f experim ental
imm unology. Vol 1 Im m unochem istry. W eir, D M (ed),
C a p ? . B lackw ell Sci. Publ. O xford, 1973.
6 . K obayashi, K: Im m unochem istry, 8: 785, 1971
7. K ierszenbaum , F; D andliker, W B: Im m unochem istry,
5: 75, 1968.
8 . Eisen, H N; C ray, W: Russel Little, J; Sim s, S S. En:
M eth o d s in im m u n o lo g y a nd im m u n o ch em istry. W i
lliam , C A y C hase, M W (eds), vol I, p. 353. A cad e
m ic Press. N. Y ork, 1967.
9. Kabat, E A: K abat cmd M a y e rs experim ental im m unochem lstry, p. 781. Charle.s C Thontas. Spvingfield. US,
1961.
10. Landsteinev, K; M iller, C P: J Exp M ed, 42: 853, 1925.
11. R ubn, H: J Clin Path 16:10, 1963.
12. Kochvva, S, R osenfeld, R E: 7 Im m unol 92: 682, 1964.
13. A vram eas, S; T ernynck, T: Im m unochem istry, 6: 53,
1969.
14. M arg n i, R A ; B in ag h i, R A: Im m u n o lo g y, 22: 557,
1972,
15. M argni, R A; P az. C B; C o rd al, M E: Im n u n o ch emistry, 13: 209, 1976.
16. M argni, R A; Hajos, S E: R ev A so c Bioquim Argent.
46: 1, 1976.
17. Cordal, M E; M argni, R A: Im m unochem istry, I I : 765,
1974.

Fraccionamiento
de inmunoglobulinas

RICARDO MARGNI

MTODOS ENZIMTICOS
El empleo de enzimas proteolticas, tales co
mo papana, tripsina, pepsina, etc., ha perm iti
do obtener fragmentos de las distintas inmunoglobulinas, que han resultado de mucha utili
dad para establecer ia ubicacin de los sitios
activos correspondientes a las diferentes fun
ciones que estas molculas cumplen. En condi
ciones normales las enzimas citadas no produ
cen ataques mltiples, sino separacin de los
pptidos F(ab)2, Fab, Fe y fragmentos de ste.
Ello es debido a que como consecuencia de la
estructura particular de estas molculas, slo
son accesibles a la accin de las enzimas la re
gin de la bisagra donde se encuentran los
puentes S-S, intercadenas H-H y el fragmento
Fe, Esta accin se magnifica cuando se ejerce
sobre pptidos provenientes de degradaciones
previas de la molcula entera.
Los mtodos que a continuacin se descri
ben corresponden a fraccionamiento de inm u
noglobulinas humanas.
Fraccionamiento papanico''^
Disolver 300 mg de IgG y 3 mg de papana
cristalizada (relacin enzima-sustrato 1;100) en
20 mi de buffer de fosfatos 0,1 M, pH 7. Aadir
cistena y EDTANa2 hasta concentracin 0,01
M y 0,002 M, respectivamente, para activar la
enzima. Incubar a 37C 4 horas (si se desea ob
tener Fe' la incubacin debe prolongarse a 16
horas). La actividad de la enzima puede dete
nerse dializando contra agua destilada con agi
tacin constante durante 48 horas, o aadiendo
N-edImaleimida 0,05 M. Dializar contra buffer
de fosfatos 0,005 M, pH 7,8, e introducir en una
colum na (2 x 50 cm ) que contiene 10 g de

DEAE-celulosa, eluyendo con un gradiente ob

tenido con 500 mi de buffer de fosfatos 0,005
M, pH 7,8 (inicial), y 500 mi de buffer de fosfa
tos 0,5 M, pH 7,8 (final). Recoger fracciones de
2-3 mi en tubos, utilizando un colector autom
tico de fracciones. Ubicar los picos de elucin
por lectura espectrofotomtrica de las DO a 280
nm. El pico que eluye en primer trmino corres
ponde a Fab y el segundo a Fe.
Se obtienen productos ms puros si se com
bina la filtracin por Sephadex G-lOO y )a cro
matografa por DEAE-celulosa. Para ello al di
gesto papanico se lo pasa por columna de Se
phadex, usando como eluyente NaCi 0,15 M.
Eluyen tres picos proteicos: el primero de ellos
es IgG no digerida; el segundo, mezcla de Fab y
Fe, y el tercero, pequeos pptidos. El segundo
pico es el que se cromatografa por DEAE-celu
losa en la forma ya indicada (figs. 5-7 y 5-8).
No todas las subclases de IgG hum ana se
comportan de igual manera frente a la papana.
Cuando se usa la enzima no activada con cis
tena, slo las IgG l e IgG3 son olivadas, m os
trndose resistentes las gG2 e IgG4. En pre
sencia de cistena, la lgG2 es relativamente re
sistente al tratam iento papanico de 4 horas,
siendo en cambio sensible la IgG4. E n estas
condiciones experim entales la IgG3 es muy
sensible a la accin de la enzima, siendo reco
mendable, en los casos en que se analicen p ro -,
tenas de mieloma de este tipo, no extender las
incubaciones ms all de 2 horas (preferente
mente 1 hora).
La IgA, en las condiciones de clivaje descri
tas para IgG es demasiado sensible a la accin
de la enzima, obtenindose fragmentos Fe que
han perdido algunos determinantes antignieos
presentes en las cadenas H, por degradacin
parcial del Fe. En condiciones ms suaves de

iciuuut inmunoQUimicos
colector automtico de fracciones, y se aconse
jan volmenes de 2-3 mi por tubo.
A moiaridad 0,01 eluye IgG2, y a molaridad
0,03 eluye IgG l.
A ISLA M IEN TO Y PU R IF IC A C I N
DE L O SA N T IC U ER PO S A NTI-D NP
ELA BORA DO S P O R E L COBAYO'^'
Los anticuerpos anti-DNP se aslan por pre
cipitacin en zona de equivalencia o por pasaje
a travs de una columna de inmunoadsorbente,
como ya se indicara. Los anticuerpos purifica
dos se concentran por ultrafiltracin a un volu
men de 5 mi y pasan por columna de Sephadex
G-200 (2,8 X 95 cm). El primer pico proteico,
que eluye entre los 80-130 mi de flujo es gM
anti DNP. El resto del eluido se concentra, se
dializa en buffer de fosfatos 0,01 M, pH 7,6 y
se crom atografa por D EA E-celulosa. A esa
molaridad eluye un pico proteico (1). Se aplica
luego un gradiente de fosfatos 0,01/0,3 M, pH
7,6. Eluyen dos fracciones a 0,03-0,04 M (11) y
0,12 M (II). Reciclando el pico (I) en DEAEc e lu lo s a con un g ra d ie n te de fo s fa to s
0,003/0,015 M, pH 7,6 se obtienen tres picos
proteicos que eluyen a 0,003-0,004 M, 0,006 M
y 0,008 M. Los tres tienen caractersticas fsi
co-qumicas y comportam iento inmunolgico
de IgG2, pero el que eluye en tercer trmino no
da anafilaxia cutnea pasiva (PCA) en el ratn.
Recromatografiando el pico (11) por DEAEcelulosa con gradiente de fosfatos 0,01/0,08 M,
pH 7,6, se obtienen dos picos proteicos que
eluyen a 0,015-0,02 M y 0,03-0,04 M, respecti
vamente. El que eluye en prim er trm ino es
IgA y el otro es IgG 1.
El pico proteico (III), que eluye a 0,12 M, es
IgE.
AISLAMIENTO Y PURIFICACION
DE IgGa, IgGb e IgG c DE CABALLO'"
Los anticuerpos se aslan y purifican a partir
del suero inmune de acuerdo con el m todo
que ms convenga segn su especificidad. Los

anticuerpos purificados se cromatografan por

DEAE-celulosa equilibrada con buffer de fos
fatos 0,003 M, pH 8, y se eluye con el mismo
buffer hasta recoger toda la protena no reteda (pico 1). Se hace pasar luego buffer de fosfa
tos 0,005 M, pH 8, hasta elucin de una nueva
fraccin proteica (pico II). Se equilibra la co
lumna con buTer de fosfatos 0,02 M, pH 8, y
luego se hace pasar un gradiente de elucin
constituido por el mismo buffer como inicial y
NaCl 0,5 M com o final. A m olaridad 0,023
eluye un nuevo pico proteico (pico III).
De los tres picos aislados, el (I) es IgGa, el
(II) IgGb y el (III) IgGc.
B IB L IO G R A F A
1. K endall, F E: C oid Spring H arb o r Sym p Q u a n t Biol,
6: 376, 1938.
2. K ekw ick, R A: Biochem J, 34: 1248, 1940.
3. Cohn, E .1; Strong, t. E; H ughes, W L; M ulford, D
A shw orth, J N; M eliii, A; T a y lo r, H L: i A m Chem
Soc, 68: 459, i 946.
4. Me Kinney, M M ; Perkinson, A: A simple, non-chrom a to g rap h ic p ro c e d u re to p u rify im m u n o g lo b u lin s
from serum and ascitis fluid. J Im m unol M ethods, 96:
271, 1987.
4bis. C u rre n t P ro to c o ls in im m u n o lo g y V o l. 2, (2 -8 ),
1993.
5. Eahey, 1/. Terry, E W : En: H andhook o f experim ental
imm unology. Vol 1 m m unochem istry. W eir, D M (ed),
C a p ? . B lackw ell Sci. Publ. O xford, 1973.
6 . K obayashi, K: Im m unochem istry, 8: 785, 1971
7. K ierszenbaum , F; D andliker, W B: Im m unochem istry,
5: 75, 1968.
8 . Eisen, H N; C ray, W: Russel Little, J; Sim s, S S. En:
M eth o d s in im m u n o lo g y a nd im m u n o ch em istry. W i
lliam , C A y C hase, M W (eds), vol I, p. 353. A cad e
m ic Press. N. Y ork, 1967.
9. Kabat, E A: K abat cmd M a y e rs experim ental im m unochem lstty, p. 781. Charle.s C Thotnas. Springfield. US,
1961.
10. Landsteinev, K; M iller, C P: J Exp M ed, 42: 853, 1925.
11. R ubin, H: J Clin Path 16:10, 1963.
12. Kochvva, S, R osenfeld, R E: 7 Im m unol 92: 682, 1964.
13. A vram eas, S; T ernynck, T: Im m unochem istry, 6: 53,
1969.
14. IVIargni, R A ; B in ag h i, R A: Im m u n o lo g y, 22: 557,
1972,
15. M argni, R A; P az. C B; C o rd al, M E: Im m unoche-'
mistry, 13: 209, 1976.
16. M argni, R A; Hajos, S E: R ev A so c Bioquim Argent.
46: 1, 1976.
17. Cordal, M E; M argni, R A: Im m unochem istry, I I : 765,
1974.

Fraccionamiento
de inmunoglobulinas

RICARDO MARGNI

MTODOS ENZIMTICOS
El empleo de enzimas proteolticas, tales co
mo papana, tripsina, pepsina, etc., ha perm iti
do obtener fragmentos de las distintas inmunoglobulinas, que han resultado de mucha utili
dad para establecer ia ubicacin de los sitios
activos correspondientes a las diferentes fun
ciones que estas molculas cumplen. En condi
ciones normales las enzimas citadas no produ
cen ataques mltiples, sino separacin de los
pptidos F(ab)2, Fab, Fe y fragmentos de ste.
Ello es debido a que como consecuencia de la
estructura particular de estas molculas, slo
son accesibles a la accin de las enzimas la re
gin de la bisagra donde se encuentran los
puentes S-S, intercadenas H-H y el fragmento
Fe, Esta accin se magnifica cuando se ejerce
sobre pptidos provenientes de degradaciones
previas de la molcula entera.
Los mtodos que a continuacin se descri
ben corresponden a fraccionamiento de inm u
noglobulinas humanas.
Fraccionamiento papanico''^
Disolver 300 mg de IgG y 3 mg de papana
cristalizada (relacin enzima-sustrato 1;100) en
20 mi de buffer de fosfatos 0,1 M, pH 7. Aadir
cistena y EDTANa2 hasta concentracin 0,01
M y 0,002 M, respectivamente, para activar la
enzima. Incubar a 37C 4 horas (si se desea ob
tener Fe' la incubacin debe prolongarse a 16
horas). La actividad de la enzima puede dete
nerse dializando contra agua destilada con agi
tacin constante durante 48 horas, o aadiendo
N-edImaleimida 0,05 M. Dializar contra buffer
de fosfatos 0,005 M, pH 7,8, e introducir en una
colum na (2 x 50 cm ) que contiene 10 g de

DEAE-celulosa, eluyendo con un gradiente ob

tenido con 500 mi de buffer de fosfatos 0,005
M, pH 7,8 (inicial), y 500 mi de buffer de fosfa
tos 0,5 M, pH 7,8 (final). Recoger fracciones de
2-3 mi en tubos, utilizando un colector autom
tico de fracciones. Ubicar los picos de elucin
por lectura espectrofotomtrica de las DO a 280
nm. El pico que eluye en primer trmino corres
ponde a Fab y el segundo a Fe.
Se obtienen productos ms puros si se com
bina la filtracin por Sephadex G-lOO y )a cro
matografa por DEAE-celulosa. Para ello al di
gesto papanico se lo pasa por columna de Se
phadex, usando como eluyente NaCi 0,15 M.
Eluyen tres picos proteicos: el primero de ellos
es IgG no digerida; el segundo, mezcla de Fab y
Fe, y el tercero, pequeos pptidos. El segundo
pico es el que se cromatografa por DEAE-celu
losa en la forma ya indicada (figs. 5-7 y 5-8).
No todas las subclases de IgG hum ana se
comportan de igual manera frente a la papana.
Cuando se usa la enzima no activada con cis
tena, slo las IgG l e IgG3 son olivadas, m os
trndose resistentes las gG2 e IgG4. En pre
sencia de cistena, la lgG2 es relativamente re
sistente al tratam iento papanico de 4 horas,
siendo en cambio sensible la IgG4. E n estas
condiciones experim entales la IgG3 es muy
sensible a la accin de la enzima, siendo reco
mendable, en los casos en que se analicen p ro -,
tenas de mieloma de este tipo, no extender las
incubaciones ms all de 2 horas (preferente
mente 1 hora).
La IgA, en las condiciones de clivaje descri
tas para IgG es demasiado sensible a la accin
de la enzima, obtenindose fragmentos Fe que
han perdido algunos determinantes antignieos
presentes en las cadenas H, por degradacin
parcial del Fe. En condiciones ms suaves de

946

Mtodos inmunoqumicos

digestin es posible obtener fragmentos ade

cuados.
De la IgM parcialmente reducida (IgMs, 7S)
por tratamiento papanico durante 16 horas es
posible obtener un fragmento similar al Fab de
IgG, al que se lo designa Ms pap I. Si la diges
tin se hace con papana activada con cistena,
a 37C durante 45 minutos, se obtiene un frag
mento Ms pap III similar al fragmento Fe.
Con tiempos de digestin menores que los
usados para IgG, es posible obtener fragmentos
Fab y Fe de gD.
Si la IgE se digiere con papana durante 1
hora, aproximadamente 1/3 de ella no se cliva,
pero si el tratamiento se prolonga se obtienen
fragmentos Fe y Fe,
Para la obtencin de los fragmentos Fab y Fe
de conejo, las condiciones para su separacin
varan; sta tiene lugar en CM-celulosa.
La digestin se efecta en las mismas condi
ciones que las indicadas para IgG humana (4
horas a 37C) y, una vez detenida la actividad
enzimtica, el digesto papanico se dializa con
tra buffer de acetato de sodio 0,01 M, pH 5,5.
Se lo introduce en una columna de CM-celulo
sa (50 X 2 cm) estabilizada con el mismo buffer
y se hace pasar 200 mi de ste. Se aplica luego
un gradiente de acetato de sodio 0,01 a 0,9 M,
pH 5,5. Los eluidos son recogidos en volme
nes de 5 mi y su concentracin proteica se de
termina por lectura de la absorbancia a 280 nm.
El pico que eluye a 0 ,0 1 M (pico 1) y el que
eluye en primer trmino despus de aplicar el
gradiente (pico II), constituyen Fab; el pico
proteico que eluye en tercer trmino (pico III)
es Fe. El fragmento Fe as obtenido puede ser
cristalizado y recristalizado dializndolo, pri
mero en cido actico 0,02 M y luego contra
buffer de fosfato 0,02 M, pH 7, a 2C.
Fraccionamiento trptico^
Por tratamiento de la IgG contripina se ob
tienen los fragmentos Fab (t) y Fe (t) similares
a los logrados por digestin papanica.
A 100 mg de IgG disueltos en 10 mi de buf
fer de fosfatos 0,1 M, pH 7,6, se les aade 1
mg de tripsina cristalizada y se incuba a 37C
durante 72 horas. La accin de la enzim a es
frenada por el aadido de inhibidor de tripsina
PMSF. La adicin de cistena favorece el clivaje, probablemente por cambios conformacionales en la m olcula de inm unoglobulina. Los
fragmentos Fab (t) y Fe (t) obtenidos se sepa
ran en la forma ya indicada en tratamiento papanico.
De la IgM es posible obtener, por tratamien
to trptico a alta temperatura, Fab|j, y Fc5|J,. De
este ltimo, por reduccin con thioles se logra
el Fcp,. Para ello IgM purificada (6 mg m f en

Tris 0,05 M-CaC12 0,01 M, pH 8) se digiere

con tripsina cristalizada en la relacin enzima/
protena 1:25, 1 hora a 56C. La tripsina se di
suelve en un pequeo volumen de HCl 0,001
N-NaCl 0,05 M, pH 3, previo el aadido a la
solucin proteica. Ello es necesario por la poca
solubilidad de la tripsina cristalizada a pH 8.
La digestin es frenada con inhibidor de tripsi
na PMSF, aadido lentamente en un exceso del
100%. La cantidad a aadir se disuelve previa
mente en isopropanol al 10%, que no interfiere
la reaccin. El digesto se filtra por Sephadex
G-lOO estabilizado con el buffer de digestin,
el cual se usa como eluyente. Se obtienen tres
picos: el primero es Fc5|a; el segundo, Fab(i, y
el tercero, pequeos pptidos.
Si la digestin trptica de IgM se hace en
presencia de NaCl 0,5 M, el tiempo de diges
tin se eleva a 4 horas.
Fraccionamiento ppsico'
Por tratamiento ppsico de IgG se obtiene un
pptido de PM 100 kD, el F(ab)2, que contie
ne los dos sitios de combinacin de la molcu
la, y pequeos pptidos en su mayora dializa
bles, siendo el mayor de ellos el pF c.
Dializar la IgG purificada en buffer de aceta
to 0,1 M, pH 4,5, y ajustar la concentracin de
5 m g .m f. A 10 mi aadirle 1 mg de pepsina
cristalizada disueltos en un pequeo volumen
del mismo buffer e incubar a 37C durante 18
horas. Adicionar 0,8 m,l de buffer de fosfatos
0,5 M, pH 7, ajustar a pH 7,7 con solucin di
luida de NaOH para inactivar la enzima y diali
zar contra buffer de borato-cloruro 0,1 M, pH
8. Dializar luego contra NajSO^ al 12,5%; re
mover por centrifugacin el precipitado forma
do. Dializar el sobrenadante contra N a2S04 al
18%, separar el precipitado, disolverlo en agua
destilada y dializarlo contra N a C l, 0,15 M,
fosfatos 0,01 M, pH 7,6. Filtrar por Sephadex
G-200; desechar el primer pico proteico, cons
tituido por IgG no digerida, y reservar el se
gundo, que est constituido por F(ab)2. Si el
producto filtrado tuviera como impurezas Fab
y pFc, eluyen en tercer trmino.
Si lo que interesa es obtener p F c, la IgG
normal debe ser tratada en las condiciones indi
cadas y despus de la digestin filtrada por
Sephadex G-150. El pico proteico que eluye
despus de F(ab)2 es pFc. Si se tratara de inmunoglobulinas de mielomas, las condiciones
varan segn la subclase de IgG. En estos casos
los tiempos de digestin ptimos son de 24 ho
ras (IgG l), 6 horas (IgG2), 1 hora (IgG3) y 2
horas (IgG4).
Cuando la IgM es sometida a digestin ppsiea el pptido mayor obtenido es el Fabp. de
caractersticas muy similares al Fab|i logrado

Fraccionamiento de inmunoglobulinas
por digestin papanica. Para ello, disolver 100
mg de IgM en 10 mi de buffer acetato 0,01 M,
pH 4,5, aadirle 2 mg de pepsina cristalizada e
incubar a 37C durante 24 horas, frenando la
accin de la enzima por el aadido de Tris sli
do hasta ajustar a pH 8. Filtrar por Sephadex
G-200, usando como eluyente buffer de fosfa
tos 0,1 M, pH 7,6. El pico proteico que eluye
en primer trmino contiene el fragmento Fabja,
y el restante, pequeos pptidos.
Para la IgA normal las condiciones de diges
tin son las siguientes: relacin inmunoglobulina/enzim a 1:50; buffer de digestin acetato
0,01 M, pH 4,f; tiempo de digestin 20-24 ho
ras. El producto de digestin se filtra por Se
phadex G-200; sepranse tres picos proteicos;
el primero, ms pequeo, contiene IgA no di
gerida; el segundo es F(ab)2 y el ltimo son
pequeos pptidos.
C uando se trata de IgA m onoclonales las
condiciones varan segn la subclase de IgA a
la que pertenecen.
La IgA secretoria es mucho ms resistente
que la IgA srica a la digestin ppsica, en es
pecial durante la primera hora del ataque enzimtico.
Obtencin del fragmento Fd de IgG
Para la obtencin del fragmento Fd es nece
sario aislar y purificar el correspondiente frag
mento F(ab)2.
A 1 mi de F(ab)2 (7 m g.m l-l) en NaCl 0,2
M, TRIS-FICl 10 mM, pH 8,2, aadirle ditiotreitol hasta concentracin 10 mM y mantener
a temperatura ambiente por 30 minutos. Alqui
lar con iodoacetamida 22 mM por 1 hora a 0C.
Filtrar por columna de Sephadex G-100 (1,5 x
90 cm) equilibrada con N aCl 25 mM, cido
actico 1 M. Fd dimeriza y puede ser separado
de las cadenas L monomricas. Antes de usar
el fragmento Fd debe ser dializado exhaustiva
mente contra acetato de sodio 4 mM, pH 5,4.
Si se desea usar las cadenas L, stas deben ser
previam ente dializadas contra N aCl 0,15 M,
fosfatos 0,01 M, pH 7,6.
O btencin de fragmentos F (a b )2, Fab
y Fe de diferentes clases
de inmunoglobulinas de ratn*
Hasta hace poco tiempo no era mucho lo que
se saba sobre el comportamiento de las dife
rentes clases de inm unoglobulinas de ratn,
cuando eran sometidas a digestin papanica,
ppsica o trptica. El advenimiento de los anti
cuerpos monoclonales ha facilitado esos estu
dios. Los resultados obtenidos han puesto en
evidencia que el comportamiento de las dife
rentes clases de IgG no es el mismo, y que en

947

algunos casos los productos de digestin difie

ren de los logrados en otras especies animales.
Dado el uso masivo de estos anticuerpos en los
momentos actuales, sern considerados en par
ticular.
Digestin papanica de Ig G l
Los fragmentos resultantes de la digestin
son F (ab)2 y Fe.
La IgG l a digerir (1-10 mg. rn f) debe estar
en buffer de acetato 0,1 M, pH 5,5, adicionado
con EDTA 0,003 M. Si la inmunoglobulina es
tuviese solubilizada en un buffer de baja m ola
ridad, adicionarle buffer de acetato 1 M, pH 5,5
hasta llevar a 0,1 M y ajustar a ese pH con ci
do actico 1 M si fuese necesario.
La papana a usar, de alta pureza, debe estar
preactivada, para lo cual una cantidad igual al
doble de la requerida para la digestin es m ez
clada por agitacin con 0,5 mi de b u ffer de
acetato 0,1 M, pH 5,5, adicionado de ED TA
0,0003 M y cistena 0,05 M. Se incuba la m ez
cla a 37C por 30 minutos y se la aplica a una
pequea columna de 10 x 1 cm de Sephadex
G-25 superfino equilibrada con buffer de aceta
to 0,1 M, EDTA 0,003 M, pH 5,5. La elucin
se hace a temperatura ambiente, con el mismo
buffer. Se recogen pequeos volmenes (1 mi)
y se determina su concentracin proteica m i
diendo la absorbancia a 280 nm (coeficiente de
extincin de la papana E*jg = 2,5). La papana
eluye con el volumen de exclusin.
La papana as activada es mezclada con la
solucin de IgGl en una relacin 1:20 (P/P), en
un tubo con tapa de rosca e incubada en bao
de agua a 37C. El tiempo correcto de incuba
cin debe ser establecido en un ensayo previo,
tom ando fracciones del digerido a diferentes
perodos, inactivando la enzima con iodoaceta
mida y anahzando los productos de digestin
por SDS-PAGE o HPLC, con patrones de refe
rencia.
D espus de incubar la IgG l con la papana
por el tiempo ptimo predeterminado, inactivar
la enzima por aadido de iodoacetamida 0,1 M
hasta concentracin final 0,025 M. El pH es
ajustado a 7,5 con T ris-H C l, 3,5 M, pH 8,6.
Despus de mantener a temperatura am biente
por 30 minutos para que la papana se inactive
completamente, el digerido es dializado exhaus
tivamente (relacin de volmenes 1:100) contra
buffer Tris-H Cl 0,005 M, pH 7,5, por 24-36
horas a 4C, con tres recambios de bufer.
El producto de dilisis, es cromatografiacio a
4C en una pequea columna de DEAE-celulosa estabilizada con el buffer usado para la dili
sis. Eluir con el mismo buffer, recoger peque
as fracciones (3-5 mi), leer la absorbancia a
280 nm. Teniendo en cuenta que se trata de

948

Mtodos inmunoqumicos

IgG l monoclonales, no todos los F(ab)2 obte

nidos se comportan de la misma manera. Algu
nos de ellos eluyen en el volumen de exclusin
y otros no. Cuando las lecturas de
sean
negativas, aplicar un gradiente lineal de NaCl
de O a 0,1 M en el mismo buffer y continuar
con la recoleccin de fracciones de eluido, has
ta DO^g,, = 0. En ese momento aphcar a la co
lum na N aC l 0,5 M en el b u ffe r T ris-H C l
0,005 M, pH 7,5. Recoger las fracciones elui
das. Si el E(ab)2 no hubiese eluido con el vo
lumen de exclusin, lo hace como primer pico
despus de aplicar el gradiente de N aC l, segui
do por IgG no digerida y finalm ente por Fe,
con buena separacin entre los picos.
P ara la obtencin d el fra g m e n to Fab, al
fragmento F(ab)2 obtenido por digestin papanica, previam ente dializado contra buffer
Tris-H Cl 0,1 M, pH 7,5, se le aade cistena
solubilizada en el mismo buffer hasta concen
tracin final 0,01 M. Incubar a 37C por 2 ho
ras. Adicionar iodoacetamida hasta concentra
cin final 0,15 M e incubar a temperatura am
biente 30 m inutos. L a separaci n del Fab,
F(ab)2 no reducido y otros reactivos se hace
por columna de Sephadex G-lOO, de volumen
adecuado al de a muestra a filtrar. El F(ab)2
que no fue reducido en las condiciones del en
sayo eluye en primer trmino, hacindolo en
segundo lugar el Fab.
Digestin ppsica de Ig G l
El producto obtenido es F (ab)2. No todas
las IgG l monoclonales de ratn son digeridas
con igual intensidad; no obstante, entre los pH
3,5 y 4 los rendim ientos son buenos, siendo
ms manifiestos a los pH ms bajos. Ello puede
estar limitado por la estabilidad de la protena
en esas condiciones.
Para obtener F(ab)2 de Ig G l, llevar sta a
1-10 m g .m l' en buffer de citrato 0,1 M, pH
3,5. Aadirle pepsina cristalizada (1 mg.ml *
disuelta en el mismo buffer) en cantidad sufi
ciente para lograr una relacin final enzimasustrato (P/P) de 1:40, Incubar a 37C hasta de
gradacin total de IgG l (aproximadamente 18
horas). El exceso de incubacin mayormente
no modifica los resultados, como ha sido de
mostrado con digestos incubados hasta por 48
horas. Finalizada la incubacin, frenar la ac
cin de la pepsina llevando el pH a 7-7,5 con
Tris-HCl 3 M, pH 8,6. Si durante el proceso
aparece algn precipitado, se lo elim ina por
centrifugacin a 10.000 xg durante 30 minutos.
Dializar exhaustivamente contra solucin sali
na tam ponada para elim inar productos de di
gestin dializables. La calidad final del produc
to obtenido puede mejorarse por cromatografa
en DEAE-celulosa o filtracin por Sephadex.

En este caso el producto a elegir depende del

tamao molecular de los contaminantes que se
desee eliminar.
Digestin de IgGZb
Esta inmunoglobulina es muy sensible a las
proteasas y resulta prcticam ente im posible
obtener F (ab)2. Por digestin con pepsina a
pH 4,5-5, por 8 horas, en las condiciones indi
cadas para IgGl se obtiene el fragmento Fab/c,
que est constituido por un Fab unido al frag
mento Fe.
Digestin de Ig 0 2 a
Su sensibilidad a las enzimas proteolticas
ocupa un lugar intermedio entre IgG l e IgG2b.
Cuando es digerida con pepsina en la relacin
enzima-protena 1:40, a pH 4,1 por 8 horas a
37"C, aproximadamente el 60% de la lgG2a se
convierte en F(ab)2. Si el tiempo de incuba
cin aumenta, el porcentaje de inmunoglobuli
na degradada es mayor, pero en este caso el
producto final es una mezcla de F(ab)2 y Fab.
En cualquiera de los casos la separacin de los
productos obtenidos debe hacerse por cromato
grafa en DEAE-celulosa o filtracin por geles,
como se indic para IgG 1.
Nota: Considerando que IgG2a a IgG2b se
unen a protena A de estafilococo, la ehminacin de cualquiera de estas dos inmunoglobuli
nas de diferentes digestos puede intentarse por
cromatografa de afinidad con Sepharosa-protena A.
Digestin de IgGS con pepsina
P o r d ig e s ti n p p sic a p u e d e o b te n e rse
F(ab)2 a partir de IgG3 de ratn. En este caso
particular se ha observado que los mejores re
sultados (mayor actividad anticuerpo del pro
ducto original, con menor actividad asociada a
la IgG original) se logran con incubaciones a
37C de corta duracin (15-30 minutos).
Para ello se dializa la lgG 3 contra buffer
acetato 0,1 M, pH 4,5. Si despus de dializar
durante toda una noche el pH fuera superior al
indicado, llevarlo a ese valor con cido actico
2 M. Aadir pepsina cristalizada disuelta en un
pequeo volumen del mismo buffer, hasta lo
grar una relacin enzima-sustrato de 1:33. In
cubar 15-30 minutos a 37C e inactivar la pep
sina llevando a pH 8 con NaOFl 0,5 N. Anahzar el grado de digestin obtenido y proceder
luego a la purificacin del fragmento F(ab)2
por cromatografa en DEAE-celulosa o filtra
cin por Sephadex G-150 o G-200, ya que los
productos a separar son lgG3 y F(ab)2 en pro
porciones bastantes similares

Fraccionamiento de inmunoglobulinas

949

Degradacin enzimtica
de IgM

OBTENCIN DE IgM
M ONOM RICAdgM s, 7S)

La respuesta enzimtica de las IgM murinas

a distintos tratamientos enzimticos difiere de
la observada en otras especies animales.
Cuando la IgM en buffer de acetato 0,1 M,
cloruro de sodio 0,2 M, pH 4,6 es digerida con
pepsina en la relacin enzima-protena 1:100, a
37C por 4 horas, se obtiene F(ab)2 y peque
as cantidades de Fab, que pueden ser separa
dos de la IgM residual por filtracin por geles.
Cuando la incubacin se extiende a 8 horas, se
incrementa la produccin de Fab.
La digestin de IgM con tripsina en caliente
da lugar a la produccin de F(ab)2 y Fab. Pa
ra ello, dializar la IgM con buffer Tris-FICl
0,1 M, CaCI^ 0,01 M, N aCl 0,2 M, pH 8,3, y
aadirle tripsina cristalizada para lograr una
relacin enzim a-sustrato de 1:100. Incubar a
55C por una hora, frenar la actividad enzim
tica con el inhibidor de tripsina PMSF y filtrar
el digesto por Sephadex G-150, estabilizado
con el buffer de digestin. El primer pico de
elucin, correspondiente al volumen de exclu
sin, es IgM no digerida, y los picos de elu
cin siguientes son F(ab)2 y Fab, respectiva
mente.

Por tratamiento de IgM (19S) con mercaptoetanol y posterior alquilacin con iodoaceta
m ida es p o sib le o b te n er IgM m o n o m rica
(IgMs) con coeficiente de sedimentacin 7S.
Mtodo
IgM, I9S (30 mg X m f en NaCl 0,5 M , bo
rato 0,05 M y tris-fosfato 0,3 M, pH 8) se redu
cen con 2-mercaptoetanol 0,2 M^ durante 2 ho
ras a temperatura ambiente. Luego se enfra en
bao de hielo y se alquila aadiendo iodoaceta
mida en buffer Tris-fosfato 3 M, pH 8, en un
exceso de 10% con respecto al agente reductor.
Despus de 30 minutos el exceso de reactivos
se elimina por dilisis.
Como control conviene realizar un anlisis
inmunoelectrofortico, y si en l se observara
adems de IgMs de desplazamiento catdico
una banda de precipitacin correspondiente a
IgM 19S, la separacin de ambas se hace por
filtracin a travs de Sephadex G-200. El pico
proteico que eluye en segundo trmino corres
ponde a IgMs.
OBTENCIN DE H EM IM O LC U LA S

MTODOS QUMICOS
Obtencin de pptidos L y
Por reduccin con tioles y filtracin por ge
les es posible separar los pptidos L y H consti
tutivos de las inmunoglobuUnas.
En el caso de la IgG, proceder de la siguien
te manera: disolver 200 mg de IgG en 5 mi de
buffer Tris HCl 0,5 M, pH 8,2, y aadirle igual
volumen de 2-mercaptoetanol 0,2 M preparado
en el mismo buffer. M antener a tem peratura
am biente durante I hora, enfriar en bao de
hielo y aadir 6 mi de iodoacetamida 0,2 M en
el buffer ya indicado, previamente enfriado a
0C. Mantener en bao de hielo 1 hora, dializar
luego en fro y agitar contra 100 volmenes de
agua destilada fra, efectuando tres recambios
con intervalos de 2 horas. Dializar contra 250
volmenes de cido propinico 1 N y filtrar
por Sephadex G-lOO previamente estabilizado
con la misma solucin cida. El pico que eluye
primero corresponde a las cadenas pesadas (H),
y el segundo, a las cadenas livianas (L) (fig.
5-9, cap. 5).
A p a rtir de IgA m o n o m ric a e IgM 7S
(IgMs) es posible separar, por el mtodo indi
cado, cadenas L y H. El mismo procedimiento
resulta til cuando las inmunoglobulinas en es
tudio son IgD o IgE.

Por tratamiento de IgG con mercaptoetanolamina, alquilacin posterior y acidificacin es

posible obtener hemimolculas, las que vuel
ven a recombinarse al azar si el producto obte
nido es dializado a pH 8.
Mtodo
Dializar 4 mi de IgG (3 mg x m i') en buffer
de acetato 0,1 M, pH 5 y aadirle mercaptoetanolamina hasta concentracin final 0,1 M. In
cubar I hora a 37C en atmsfera de nitrgeno
seguida de dilisis en NaCl 0,025 M, pH 2,9,
durante 18 horas. En estas condiciones, la ma
yor parte de las molculas se transforman en
hemimolculas constituidas por una cadena L y
una cadena H.
Si el producto as obtenido se dializa luego
contra NaCl 0,15 M, fosfatos 0,01 M, pH 7,6,
en condiciones atmosfricas normales durante
48 horas, las hem im olculas se recom binan
al azar, originando m olculas com pletas de
IgG.
Cuando esta operacin se hace con m olcu
las de IgG asimtricas, correspondientes a anti
cuerpos coprecipitantes, aproxim adam ente el
16-18% de las molculas de recombinacin se
comportan como anticuerpo precipitante, ello
se debe a que aquellos anticuerpos tienen un si-

950

Mtodos inmunoqumicos

to de combinacin de alta afinidad y otro de

baja afinidad por molcula (vase cap. 19).
PREPARACIN Y AISLAMIENTO
DE HBRIDOS'^
Es posible en el laboratorio obtener anticuer
pos con dos sitios de combinacin de diferentes
especificidad por molcula, lo que se consigue
por recom binacin de hem im olculas prove
nientes de anticuerpos con especificidad distin
ta. Como ejemplo se describir la obtencin de
molculas de gG con especificidad para ovoalbmina y DNP.
Mtodo
Purificar IgG de conejo antiovoalbmina y
anti DNP por los mtodos descritos en el cap
tulo 45. Obtener de cada uno de ellos hemimo
lculas de acuei'do al m todo anteriorm ente
descrito. Mezclar partes iguales de ambos pro
ductos y dializar contra NaCl 0,15 M, fosfatos
0,01 M, pH 7,6, en condiciones atmosfricas
normales, durante 48 horas.
Para separar el hbrido, pasar la mezcla as
obtenida por una columna de inmunoadsorben
te con especificidad para los anticuerpos antio
voalbmina, donde quedarn retenidas las mo
lculas de IgG antiovoalbmina y las de hbri
do. Lavar con NaCl 0,15 M hasta eliminacin
de protenas, disociar con buffer de glicina-HCI
0,1 M, pH 3, dializar el eluido contra NaCl
0,15 M, fosfatos 0,01 M, pH 7,6 y etiminar la

protena desnaturalizada por centrifugacin.

Pasar el sobrenadante por una columna de in
munoadsorbente con especificidad para los an
ticuerpos anti-DNP, la que retendr a las mol
culas del hbrido. La separacin y aislamiento
de estos anticuerpos se hacen con dinitrofenol
y crom atografa por D EA E -celulosa e IRA400, en la forma ya indicada (cap. 45).
Para otros aspectos relacionados con la ob
tencin de hbridos vase captulo 37.

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APNDICES

Apndice I

RICARDO MARGNI

PREPARACIN DE ADYUVANTES

Gel de fosfato de aluminio^

Gel de hidrxido de aluminio'

Disolver 85 g de alumbre de potasio en 600

mi de agua destilada y 68,5 g de Na 3P 0 4 12H20
en otros 600 mi de agua. Verter ambas solucio
nes en 2,1 litros de agua destilada, agitando. De
jar sedimentar y separar el lquido sobrenadante
de modo que el volumen final sea aproximada
m ente 800 mi. A justar el pH a 6,5, calen tar
1 hora a vapor fluente (100C) e inmediatamente
a 120C 45 minutos. El pH desciende aproxima
damente a 5,8. Dejar enfriar y aadir M erthiola
te al 0,01% como conservador.
El gel de fosfato de aluminio as preparado
contiene unos 20 mg m f' de fosfato de alumi-

D isolver 192 g de alum bre de amonio en

agua recientemente destilada, de modo de obte
ner un volum en total de 375 mi. Calentar la
mezcla a ebullicin para disolver el alumbre y
dejar enfriar lentam ente a bao de Mara, de
modo que la tem peratura final de la solucin
sea 58-60C.
Al mismo tiempo, preparar en un recipiente
de 2,5 litros, provisto de agitador lento, una so
lucin que contenga 55 g de sulfato de amonio
en 1,5 litros de agua destilada. Calentar a 64C
y aadirle 250 mi de una solucin de amonaco
en 1,5 litros de agua destilada. Calentar a 64C
y aadirle 250 mi de una solucin de amonaco
al 10% (P/V). Cuando la temperatura de la solu
cin es de 58-60C, aadirle la solucin de
alumbre de amonio, que tambin debe estar a
esa temperatura. A gitar la mezcla durante 10
minutos y verterla en un recipiente que conten
ga 1 litro de agua destilada adicionada de 8,6 mi
de amonaco al 10% (P/V). Se forman de inm e
diato flculos grandes que sedimentan rpida
mente, los que pueden separarse por centrifuga
cin. Repetir esta operacin dos veces.
Suspender el sedimento en 3,5 litros de agua
destilada, agitar 15 minutos y centrifugar. Repe
tir la operacin tres veces. Despus de la ltima
centrifugacin, colocar el sedimento en re c i
piente adecuado y calentar en autoclave hasta
que la temperatura llegue a 121C. Dejar en re
poso una semana, separar el agua de exudacin,
aadir Merthiolate al 0,01 % y conservar el gel
convenientemente. Contiene unos 17 mg mi
de xido de aluminio.
En las operaciones indicadas es necesario
usar agua recientemente destilada, pues si sta
contiene COj disuelto, la preparacin del gel de
Al (0H)3 presenta dificultades.

Adyuvante de Freund completo

Bayol F o vaselina lquida de alto
grado de pureza
Arlacel A purificado
Mycobacterium tuberculosis muertos
por calor

90 mi
10 mi
100 mg

Mezclar el Bayol F y el Arlacel en caliente.

En un mortero colocar los bacilos tuberculosos e
incorporarlos a la m ezcla oleosa m ediante el
aadido de pequeas cantidades de sta en forma
sucesiva hasta completar el volumen total. Re
partir en ampollas de 2 mi, 5 mi y 10 mi, y este
rilizar en autoclave a H 5 C durante 30 minutos.
Si se lo prepara sin bacilos de Koch se lo de
nomina adyuvante de Freund incompleto.
Bacterias tratadas con cido actico a IOO"C
Para protenas no muy inmunognicas y de
las que slo se dispone de pequeas cantidades,
resulta de utilidad usar como adyuvante salmonelas tratadas con cido actico en caliente. Los
grupos hidrfobos que exponen las bacterias as

954

Apndices

tratadas fijan no covalentemente molculas pro

teicas. El mtodo ha sido tam bin empleado
con xito en la adsorcin de glucolpidos.
Para la preparacin de algunos inmunosueros, especialmente en la inmunizacin de cone
jos para la obtencin de sueros a emplear en
ensayos de ELISA y RIA, el mtodo da buenos
resultados cuando los animales son inyectados
con 100-200 |ig de antgeno, por va endoveno
sa, los das 1, 7 y 21 y sangrados 8-10 das des
pus.
a) Preparacin de las bacterias. Se utilizan
salmonelas, siendo una de las ms empleadas
la Salmonella minnesota.
Cultivos de la bacteria en medio slido son
suspendidos en solucin de NaCl 0 ,15 M adi
cionado de fenol al 0,5%. Despus de 3 das se
efecttian controles para determ inar la muerte
bacteriana. La suspensin de bacterias muertas
es centrifugada y la masa bacteriana, previo la
vado con agua, es desecada por liofilizacin.
Lavar 10 g de masa bacteriana desecada con
200 mi de NaCl 0,15 M, cido actico al 5%.
Suspender en 200 mi de NaCl 0,15 M, cido
actico al 1%, agitar y centrifugar, eliminando
el sobrenadante. Repetir la operacin y, final
mente, suspender la masa bacteriana en el mis
mo diluyente. Incubar a 100C por 1 hora y
luego lavar las bacterias 3 veces con NaCl 0,15
M y 3 veces con agua destilada. Liofilizar y
conservar a 4C.
b) Adsorcin de los antgenos. Preparar una
solucin de 100-200 |lg de antgeno en agua.
Por otra parte suspender homogneamente liofilizado de Salmonella sp en agua, en la pro
porcin de 1 mg por mi. Mezclar la solucin de
antgeno y suspensin bacteriana en cantidades
tales que la proporcin de la masa proteica y de
bacterias desecadas sea 1 a 5. Colocar la mez
cla en un recipiente adecuado y desecar por
evaporacin rotatoria. Los complejos formados
se resuspenden en solucin salina tamponada
hasta alcanzar la concentracin proteica ade
cuada por dosis inmunizante.
PR EPA R A C I N D E ISCOMs^
Protocolo I
Incorporacin de protenas integrales
de membrana
Puede usarse extractos de membranas o pro
tenas purificadas obtenidas de los mismos. El
mtodo de obtencin se encuentra descrito en
el captulo 44.
1. Disolver 1-2 mg de protena purificada o su
equivalente de extracto de membrana en 10

2.
3.

4.

5.
6.

mi de Mega 10 (Sigma) (Decanoil-N-metilglucamida).

Adicionar 2 mg de Quil A (Iscotec) (con
centracin final 1 mg/ml).
Por cada 1 mi de solucin antgeno/Quil A
aadir 50 (ti de la siguiente mezcla lipdica.
a) D isolver 2 g de M ega 10 en 10 mi de
ag u a d e s tila d a (c o n c e n tra c i n fin al
20%). El Mega 10 puede ser sustituido
por octil-glucsido.
b) Aadir 100 mg de fosfatidilcona disuel
tos en 1 mi de cloroformo a 100 mg de
colesterol disueltos en 1 mi de clorofor
mo (concentracin final de cada lpido
50 mg m i).
c) Mezclar la solucin b) con la solucin a).
Transferir la mezcla a tubo de dilisis y dia
lizar convenientemente a 20C contra 5 li
tros de Tris HCl 50 mM, pH 8,5 adicionado
de M erthiolate a 0,001%. La dilisis dura
aproximadamente 3 das, con recambios del
buffer cada 12 horas, tiempo necesario para
buena formacin de ISCOMs. Las caracte
rsticas de stos puede determinarse por mi
croscopa electrnica.
Remover el Merthiolate por dilisis frente a
SSB (N ac 0,15 M, fosfatos 0,01 M, pH
7,4) a 4C por 20 horas.
Esterilizar el material por filtracin a travs
de membranas de 0,22 p,m.

Protocolo II
Construccin de ISCOMs conteniendo
protenas modificadas p o r tratamiento
con cido palmtico
1. Tratamiento con cido palmtico de protenas
no hidrofbicas a usar como inmungeno.
a) Disolver 10 mg de protena en 1 mi de
buffer de dilucin [buffer de carbonato
50 mM, pH 9, adicionado de 5% (p/v) de
deoxicolato de sodio y 10% (v/v) de dimetilsulfxido] y dializar toda una noche a
4C, contra buffer de dilucin. [Dado que
para unir covalentemente el cido palmti
co a la protena se usa N-(palmitoiloxi)
succinim ida y que en este proceso de
unin intervienen grupos aminos prima
rios de la protena, principalmente lisina,
el buffer de dilucin no debe tener grupos
aminos libres como Tris, dietilam ina o
am inocidos, los que interfieren en la
reaccin de unin del cido palmtico.]
b) Diluir la protena dializada en buffer de
dilucin hasta concentracin final de 0,5
mg mf*.
c) Preparar una solucin de NPS Sigma (Npalmitoiloxi succinimida) disolviendo 10
mg en 1 mi de dimetilsulfxido.

Apndice I
d) A 5 mi de la solucin proteica aadir 78
|il de NPS, en alcuotas de 10 )il, agitan
do despus de cada adicin.
e) In cu b ar la m ezcla en bao de agua a
37C por 20 horas, con agitacin cons
tante.
f) Detener la reaccin adicionando 1 mi de
Tris H Cl IM, pH 8,5 (concentracin fi
nal ~ 10 mM) e incubar a 37C por 30
minutos.
g) Aplicar la protena palmitada a una co
lum na de Sephadex G-100 de 1,5 x 130
cm, equilibrada con Tris-N aDoc (Tris
H C l 50 mM, pH 8,5, adicionado de 0 ,15
% p/v de deoxicolato de sodio) y filtrar
con un flujo de 1 ml/min, usando el m is
mo buffer.
h) Recoger en tubos o monitorear las DO^g,,
para determinar la presencia de protena.
Reunir los tubos que dieron lectura posi
tiva a esa longitud de onda, colocarlos
en un tubo de dilisis y concentrar con
PEG-20 (Polietilenglicol).
i) D espus de la concentracin aju star a
1 mg m i ' por adicin de buffer TrisNaDoc. La protena as preparada est en
condiciones de ser incorporada en ISCOMs.
2. Preparacin de ISCOMs conteniendo p ro
tenas tratadas con cido palmtico
a) A 10 mg de protena tratada con cido
palm tico disueltos en 10 ral de buffer
Tris-NaDoc, aadirle 185 mg de NaDoc
para llevar la concentracin de ste a 2%
(p/v).
b) Por cada mi de solucin de protena aa
dir 10 |J,1 de la mezcla de lpidos (Proto
colo 1, inciso 3).
c) Remover el cloroformo de la mezcla lpido/protena por calentamiento a ~45C,
al vaco. Decantar la mezcla en un frasco
cnico, suficientemente grande como pa
ra que la mezcla cubra el fondo. Aadir
una barra de agitacin y colocar el frasco
en un bao de agua caliente. Sellar con
film p lstico e in sertar a travs del
mismo la parte final de una pipeta de vi
drio. Sellar el orificio de plstico con se
llante plstico y unir la parte superior de
la pipeta a una bomba de vaco. Aplicar
vaco y agitacin, calentando a 45C has
ta que la mezcla aclare. Normalmente se
requieren 15-20 minutos para que la ope
racin se complete.
d) Aadir Quil A hasta concentracin final
de 1 m g/m l, m ezc lan d o p e rm a n en te
mente.
e) Continuar en la forma indicada en el Pro
tocolo I, incisos 4, 5 y 6.

955

Nota: La formacin de los ISCOMs depen

de de las interacciones entre colesterol, Q uil A
y los residuos hidrofbicos de la protena a in
corporar. Dado que el Quil A a usar, que es
una mezcla heterognea de saponinas isoterpen o id es o b ten id a de la p lan ta o rig in a ria de
A m rica del Sur, Q uillia saponaria, p u ed e
provenir del procesado de diferentes lotes, o
ser provisto por otros fabricantes distintos de
Sigma, no siempre es posible obtener ISCOMs
con las caractersticas deseadas. Si ello ocurre
es reco m end ab le rep etir el proceso u sando
Quil A de otra partida u otra procedencia.
P R E P A R A C I N D E LIPO SOM A S''
Existen diferentes mtodos de obtencin de
liposom as, difiriendo las vesculas form adas
en su tamao, estructura y capacidad de encapsulacin.
Las etapas para la preparacin de liposomas
son las siguientes:
1. Disolucin de los lpidos en un solvente or
gnico.
2. Evaporacin al vaco del solvente orgnico.
3. D ispersin de los lpidos secados en una
solucin acuosa.
4. Disolucin de la sustancia a encapsular en
la soluci(5n orgnica o en la solucin acuosa
en funcin del balance lipoflico/hidroflico.
5. Eliminacin de las sustancias no encapsuladas por tcnicas de separacin como: filtra
cin por geles, dilisis, centrifugacin, etc.
La fig u ra AP-1 esquematiza este proceso.
El mtodo C|ue se describir a continuacin
est referido a la obtencin de liposomas cons
tituidos por vesculas m ultilam inares, en las
que se habr de incorporar una protena antig
nica.
M aterial necesario
Disolver en cloroformo o cloroformo: m eta
nol (3:1) fosfatidii colina (PM 780) {KochLiglt), Colesterol (PM.387) (Sigma), octadecilam ina o stearylamlne (PM.269) (Polyciences
Inc) d io leil-fo sfatid iletan o lam in a (PM .744)
(Sigma) en las proporciones 7:2:0,5:0,5 mM,
respectivamente.
Disolver el inmungeno a incorporar (1 mg
m f ) en NaCl 0,15 M ,p H 7,4.
Mtodo
En un baln de vidrio de 50 mi introducir 4
mi de la solucin de lpidos y evaporar el sol
vente por agitacin rotativa y vaco, a 20-40C.

956

Apndices

Colesterol

JL
Lecitina

Fosfolpidos

Fig. AP-1.

Esquem atizacin del m todo de preparacin de liposom as.

La agitacin aumenta la evaporacin. Cuando

el solvente orgnico es totalmente eliminado se
obtiene una capa delgada (film) de fosfolpi
dos sobre la pared del baln. El vaco se rompe
con una corriente de nitrgeno. Incorporar al
baln 5 mi de la solucin de inmungeno y dis
persar la capa lipdica por agitacin con un
Vortex, durante 15 minutos, a 60C. Despus
de mantener la suspensin a tem peratura am
biente se efectan 3 sonicados de 30 seg. cada
uno, con interrupciones de 15 seg. entre ciclo y
ciclo, usando para ello un sonicador adecuado.
Despus de 1 hora a tem peratura ambiente
los liposomas estn bien formados, han incor
porado el inmungeno y estn en condiciones
de ser usados. La protena no encapsulada se
puede eliminar por centrifugacin. Dosando la
protena del sobrenadante de centrifugacin se
puede calcular la protena encapsulada.
Una buena dosis a inocular en ratn es la

cantidad de liposomas que contienen en total +

30 ^tg de inmungeno.
BIBLIOGRAFIA
1. V accination antidiphtrique et anticoqueluclieiise. Organi.sation M ondiale de la Sant. Serie de repporls techniques, W H O , 61: 58, 19.53.
2. V accination antidiphtrique et anticoquelucheuse. Organisation M ondiale de la Sant. Serie de repports teehniques. W H O , 61: 60, 1953.
3. Freund, J: Thom pson, K J; Flough, H B; Som m er, F[ E;
Pisani, T M: y Im munol, 60: 383, 1948.
4. Bellstedt, D U; H uman, P A; Row land, G F; M erw e, K
J V: A eidic-treted, naked b acteria as im m une carriers
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5. M ow at, A. M. e I., Reid, G. P reparation o f im m une stimulating com plexes: (ISC O M S) as adyuvants . En: Current Protocols in linm unology. C oligan, .1. E., Kruisbeek, A. M. y col. (eds.). Vol. I: 2.11.1-2.11.12, 1993.
6 . Fattale, C. P., C ouvreur, P., Puisieux, F. M thodes de
prparation de.s liposom es . En: Les Lipsoomes, J. Delattre (ed.) cap.2, p. 43-68, Les Editions IN SERM , 1993.

Apndice II

RICARDO MARGNI

SOLUCIONES BUFFER MS
COM UNES USADAS EN IN M U N O LO G A
A continuacin se indican una serie de solu
ciones buffer de uso corriente en inmunologa e
inmunoqumica. Algunas de uso particular han
sido ya descritas en el texto.
Buffer de acetato (0,1 M, pH 3,6-5,6)
Solucin A (cido actico 0,2 M): disolver
11,55 mi de cido actico glacial en agua desti
lada, completando un litro.
Solucin B (acetato de sodio 0,2 M): disol
ver 27,2 g de acetato sdico (3H 20) en agua
destilada, completando un litro.

Solucin A
(mi)

Solucin B
(mi)

A gua
destilada
(rnl)

pH

463
440
410
368
305
255

37
60
90
132
195
245
300
352
395
412
452

500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500

3,6
3,8
4
4,2
4,4
4,6
4,8
5
5,2
5,4
5,6

200
148
105

88
48

Para obtener soluciones buffer de acetato 0,2

M, se elimina el agua destilada de la mezcla.
Una manera muy til de lograr soluciones
buffer de pH intermedio correctamente ajusta
das, es colocar en un vaso de precipitacin la
solucin /4, dentro del cual se introduce el elec
trodo de un pH-metro y la barra de un agitador
magntico. Se dispone todo de manera que pue
da efectuarse la agitacin, comenzando entonces
con el aadido de la solucin B hasta que el apa
rato de medida indique el pH deseado.

Si
lo que se desea obtener es un buffer 0,2
M, la solucin est lista para su uso, pero se lo
deber diluir en partes iguales con agua destila
da si se lo prefiere 0,1 M.
E ste procedim iento puede em plearse para
cualquiera de las soluciones buffer que se indi
can a continuacin.
Buffer de borato-cloruro (borato 0,1 M ,
cloruro 0,1 M, pH 8,1-10)
Solucin A (H 3BO 3 0,2 M, KCl 0,2 M ): di
solver 12,4 g de H 3BO 3 en 400 mi de agua des
tilada, completando luego a 500 mi. En otro re
cipiente disolver 14,91 g de KCl en 400 m i de
agua destilada, llevando a volumen de 500 mi.
M ezclar ambas soluciones.
Solucin B (NaOH 0,2 N): disolver 8 g de
NaOH en 500 mi de agua destilada, com pletan
do a un litro. Controlar la normalidad con solu
cin valorada de HCl.

Solucin A
(m i)

Solucin B
(mi)

500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500

49
60
72

86
101
118
137
158
181
208
236
264
293
321
346
369
389
406
422
437

Agua
destilada
(m i)
451
440
428
414
399
382
363
342
319
292
264
236
207
179
154
131

111
94
78
63

pH

8,1
8,2
8,3
8,4
8,5

8,6
8,7

8,8
8,9
9
9,1
9 .2
9.3
9 ,4
9,5 ^
9,6
9,7
9 ,8
9 ,9

10

958

Apndices

Buffer de carbonato (pH 9-10,8 - fuerza

inica 0,1)
Solucin A (bicarbonato de sodio I M): di
solver 84 g de NaHCOj en suficiente cantidad
de agua destilada, completando a un litro.
Solucin B (carbonato de sodio I M): 106 g
de Na CO 3 anhidro se disuelven en agua desti
lada, llevando a volumen final de un litro.

Solucin A
(ml)

Solucin B
(ml)

Agua
destilada
(ml)

76,8
67.6
-56,8
45.3
34.3
24.6
17

7,7
10,8
14.4
18,2
21,9
25,1
27.6
29.5
30,8
31.7

915.5
921.6
928.4
936.5
943,8
950.3
955.4
959,3
962.1
964.2

11,2
7.1
4.1

pH

9,2
9,4
9,6
9.8
10,2

10,4
10,6
10.8

Buffer de glicina
Glicina H C l (glicina 0,1 M, p H 2,2-3,6)
Solucin A (glicina 1 M): disolver 75,07 g de
glicina en suficiente cantidad de agua destilada,
completando un litro.
Solucin B: HCl 1 N.

100
100
100
100
100
100
100
i 00

Solucin B
(ml)

88
64,8
48,4
33,6

22,8
16,4

12,8
10

Solucin A
(ml)

100
100
100
100
100
100
100
100
100
100

S olucin B
(ml)

A gua
destilada
(ml)

8
12

888

17,6
24
33,6
44,8
54,4
64
77,2
91

882,4
876
866,4
8.55,2
845,6
836
822,8
809

pH

8,6
8,8

892

9
9,2
9,4
9,6
9,8

10
10,2
10,4

10

Si se desean soluciones buffer de molaridad

determ inada, proceder de acuerdo al mtodo
general indicado en buffer de acetato. Mezclan
do las soluciones A y B hasta ajustar el pH de
seado, se obtiene una solucin 1 M. Por dilu
ciones del producto final se pueden lograr otras
molaridades.

Solucin A
(ml)

Solucin B (NaOH 1 N); disolver 40 g de

NaOH en agua destilada, completando a un li
tro. Verificar la normalidad con solucin valo
rada de HCl.

destilada
(ml)

pH

2,2

812
835,2
851,6
866,4
877,2
883,6
887,2
890

2,4

2,6
2,8
3
3,2
3,4
3,6

Glicina-NaOH (glicina 0,1 M, p f i 8,6-10,4)

1

Solucin A (glicina 1 M): se prepara disol

viendo 75,07 g de glicina en agua destilada,
completando un litro.

Para preparar soluciones buffer de glicinacloruro a diferentes pH, se incorpora a las solu
ciones A indicadas, NaCl a una molaridad diez
veces superior a la deseada.
Buffer de fosfatos (fosfatos 0,1 M, pH 5,7B)
Solucin A (N a H /O , 0,2 M): disolver 27,6
g de NaH2P04. H 2 0 en agua destilada, com
pletando a un litro.
Solucin B (Na,HPQ^ 0,2 M); 53,65 g de
N a2HP04. 7H 2 0 se disuelven en agua destila
da, llevando a volumen final de un litro.
Si se desea molaridad 0,2 se suprime el agua
destilada. Para molaridades inferiores se efec
tan las soluciones correspondientes.

Solucin A
(ml)

Solucin B
(ml)

Agua
destilada
(ml)

467,5
460
450
438,5
425
407,5
387,5
367,5
342,5
312,5
282,5
255
225
195
165
140
115
95
80
65
52,5
42,5
35
26,5

32,5
40
50
61,5
75
92,5
112,5
132,5
157,5
187,5
217,5
245
275
305
335
360
385
405
420
435
447,5
457,5
465
473,5

500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500

pH
5,7
5,8
5,9

6
6,1
6,2
6,3
6,4
6,5

6,6
6,7

6,8

6,9
7
7,1
7,2
7,3
7,4
7,5
7,6
7,7
7,8
7,9

Apndice II
Para molaridades superiores y pH determina
dos se emplea el mtodo general de prepara
cin descrito.

Solucin A (Tris 0,2 M): se obtiene d isol

viendo 24,23 g de Tris en agua destilada, lle
vando a volumen de un litro.
Solucin B: HCl IN.
Agua
destilada
(mi)

Solucin B
(mi)
44,2
41,4
38,4
32,5
26,8
21,9
16,5

250
250
250
250
250
250
250
250
250
250

12,2
8,1
5

pH
7,2
lA
Ifi
7,8

705,8
705,6
711,6
717,5
723,2
728,1
733,5
737,8
741,9
745

8
8,2
8,4

8,6
8,8
9

Buffer de Veronal
Veronal- Veronal sdico-cloruro sdico
(pH 7,4-8,9 - fuerza inica 0,1)
Solucin A (Veronal 0,025 M): se prepara
disolviendo 4,605 g de Veronal en agua desti
lada, completando a un litro.
Solucin B (Veronal sdico 0,05 M): disol
ver 10,309 g de Veronal sdico en agua destila
da; volumen final un litro.
Solucin C (cloruro de sodio 0,5 M): 29,2 g
de NaCl se disuelven en agua destilada, com
pletando a un litro.
Agua
Solucin A Solucin B Solucin C destilada
(mi)
(m i)
(m.l)
(mi)
639
403
636
401
506
639
403
509
321

10
10
25
25
50

190
190
175
175
150

100
100
200
200

100
100
0
0

161
397
164
399
294
161
397
291
479

Veronal sdico HCl

(Ph 6,8-9,6)
Solucin A (Veronal sdico 0,5 M): disolver
103,09 g de Veronal sdico en agua destilada y
completar a un litro.

Buffer de T ris (Tris hidroxim etil-am ino

metano) - HCl (T ris 0,05 M, pH 7,2-9)

Solucin A
(mi)

9 59

Solucin B: HCl 1 N.

Solucin A
(mi)

Solucin B
(mi)

104,2
107,2

47,8
46,4
44,6
41,9
38,5
33,8
28,4
23,1
17,8
12,9
9,2
6,4
4,8

110,8
116,2
123,2
132,4
143,2
153,8
164,7
174,2
181,2
187,2
190,4
194,8
197

2,6
1,5

A gua
destilada
(mi)
848
846,4
844,6
841,9
838,3
833,8
828,4
823,1
817,5
812,9
809,6
806,4
804,8
802,6
801,5

pH

6.8
7
7.2
7,4
7.6
7,8

8
8,2
8.4

8,6
8.8
9
9.2
9.4
9.6

Soluciones de Veronal- Veronal sdico

para electroforesis

Veronal
(g)

Veronal
sdico (g)

Agua
destilada

4,90
3,41
2,34

17,40
18,95
20,62

h asta 1 litro
hasta 1 litro
hasta 1 litro

pH
8,4

8,6
8,8

Para otras soluciones buffer vase c ap tu

lo 36.
pH
lA
7,6
7,8

8
8,2
8,4

8,6
8,8
8,9

Apndice

RICARDO MARGNI

Coeficientes de extincin molar

loga

) de sustancias de bajo peso molecular usadas en inmuno

Sustancia

A cido D~bencl penicilnico

cido p-diinetilam inobencen-arsnico
A cido p-iodobencen-arsnico
B enceno
o-N itroanilina
p-N itroanilina
o -N itrofenol
m -N itrofenol
p-N itrofenol
T olueno
2,4-D initroanilina
m -D initrobenceno
A cido 3,5-D initrobenzoico
2,4-D initrobrom obenceno
2,4-D initrofenol (2,4-D NP)
cido 2,4~DNP am inocaproico
cido 2,4-D N P am inobutrico
(2,4-D N P-G A BA )
e-N -2,4-D N P-L-lisina
2,4-D initrotolueno
2,4,6-Trinitrofenol (2,4,6-TN P)
cido 2,4,6-Trinitrobenzoico
cido 2,4,6-TN P am inocaproico
e-N -2,4,6-TN P-L -lisina
2,4,6-Trinitrotolueno
Fluorescena
Lisam inarodam ina B-200 (sal disdica)

323
45,5
238
204
410
370
410
3.50
403
207
345
244
238
265
358
365
355
360
250
355
251
250
348
230
490
573

7
17.600

!/E

Solvente

16.400
7.400
4.640
12.600
15.120
14.520
16.000
7.000
14.000
14.300
16.770
10.300
14.900
17.800

0,0000568
0,0000471
0,0000609
0,0001351
0,0002155
0,0000793
0,0000661
0,0000688
0,0000625
0,0001428
0,0000714
0,0000699
0,0000596
0,0000971
0,0000671
0,0000562

Etanol 95o
B uffer borato 0,1 M, pH 9,5
N aO H 0,1 M
A gua destilada
Tris-cloruro 0,1 M, pH 7,6
Tris-cloruro 0,1 M, pH 7,6
Tris-cloruro 0,1 M, pH 7,6
Tris-cloruro 0,1 M , pH 7,6
Tris-cloruro 0,1 M , pH 7,6
A gua destilada
Fosfato 0,05 M, pH 7,4
Fosfato 0,05 M, pH 7,4
Tris-cloruro 0,01 M, p H 7 ,4
Fosfato 0,05 M, pH 7,4
Fosfato 0,05 M, pH 7,4
Fosfato 0,05 M, pFI 7,4

17.500
17.400
13.300
14.400
15.400
15.400
15.400
17.300
53.000
73,000

0,0000571
0,0000574
0,0000752
0,0000694
0,0000650
0,0000650
0,0000650
0,0000578
0,0000189
0,0000137

N aCl 0,15 M , fosfato 0,01 M, pH 7,6

Fosfato 0,05 M, pH 7,4
Fosfato 0,05 M, pH 7,4
Fosfato 0,02 M , pFI 7,6
Tris-cloruro 0,1 M , pH 7,5
Fosfato 0,01 M , pH 7,4
Fosfato 0,01 M , pH 7,4
A gua destilada
N aC l 0,15 M, fosfato 0,02 M, pH 7,4
N aC l 0,15 M , fosfato 0,02 M, pH 7,4

21.200

M u ltip lica n d o /E'^'|

p o r la le c tu ra esp e ctro fo to m tric a a !a lo n g itu d de o n d a (k ) in d icad a en ca d a caso, se ob tien e la m o larid ad c o rre s p o n
d ien te a la sustan cia en ensayo.

Apndice III
Coeficientes de extincin porcentual E',]
Sustancia
Papana
O voalbm ina
S eroalbm ina bovina
Seroalbm ina liiimana
S eroalbm ina de conejo
H em ocianina (L. polyphem us)
IgG (iumana)
IgM (hum ana)
Protena de Bence-Jones (lappa)
Protena de Bence-Jones (iam bda)
IgG (caballo)
IgA (caballo)
Cadenas H (IgG ) caballo
Cadenas L (IgG ) caballo
IgG (conejo)
Cadenas H (IgG ) conejo
Cadena L (IgG ) conejo
F (ab )2 (IgG ) conejo
Fab (IgG) conejo
Fd (IgG) conejo
Fe (IgG) conejo
Inm unoglobulina y l, cobayo
Inm unoglobulina y2, cobayo
F (ab )2 (Inm unoglobulina y2), cobayo
Inm unoglobulina (yl), oveja
Inm unoglobulina (y2), oveja
IgG (rata)

961

de protenas usadas en inmunologa

e Z,

iO/E'il,i

280
280
280
280
280
278
280
280
278
278
280
280
280
280
278
280
280
280
280
280
278
278
278
280
280
280
280

2,5
7,3

4,000
1,370
1,515
1,790
1,470
0,892
0,812
0,840
0,709
0,704
0,793
0,699
0,657
0,735
0,625
0,730
0,847
0,675

6,6
.5,6

6,8
11,2
12,3
11,9
14,1
14,2

12,6
14,3
15,2
13,6
16
13,7

11,8
14,8
15
14,4

12,2
15
13,2
15,4
14,9
14,3
14,5

0,666
0,694
0,820
0,663
0,757
0,650
0,671
0,699
0,687

Solvente
N a C 1 0 ,I5 M
N aCl 0,15 M
N aC l 0,15 M
N aC l 0,15 M
N aC l 0,15 M
N a C I0 ,1 5 M
N aC l 0,15 M, fosfato 0,01
N aC l 0,15 M, fosfato 0,01
Fosfato 0,04 M , pH 7,4
Fosfato 0,04 M, pH 7,4
N aC l 0,15 M, fosfato 0,01
N aC l 0,15 M, fosfato 0,01
cido propinico 1 N
A cido propinico 1 N
Fosfato 0,04 M, pH 7,4
H Cl 0,01 N
H Cl 0,01 N
Fosfato 0,01 M, pH 7,5
F osfato 0,01 M, pH 7,5
H C L 0,01 N
Fosfato 0,01 M, pH 7,6
NaCI 0,15 M , fosfato 0,01
N aCl 0,15 M , fosfato 0,01
N aC l 0,15 M, fosfato 0,01
N aC l 0,15 M , fosfato 0,01
N aC l 0,15 M, fosfato 0,01
N aC l 0,15 M , fosfato 0,01

M , p H 7,6
M, p H 7,6

M , p H 7,6
M , p H 7,6

M,
M,
M,
M,
M,
M,

pH
pH
pH
pF!
pH
pH

7,6
7,6
7,6
7,6
7,6
7,6

M u ltip lica n d o 10/E ]

p o r la lec tu ra esp e clro fo lo in tric a a la lo n g itu d de o n d a (k ) in dicada en ca d a caso, se o b tien e la c o n c e n tra c i n en
rng.inl-1 d e la p ro ten a en ensayo.

Apndice IV
Nomenclatura de los aminocidos

RICARDO MARGNI

NOMENCLATURA DE LOS AMINOCIDOS SEGN LAS CLAVES

DE 3 LETRAS Y DE 1 LETRA
RESIDUOS NO POLARES (Hidrofbicos)
Alanina (Alanine)
Isoleucina (Lsoleucine)
Leucina (Leucine)
Metionina (Methionine)
Fenllalanina (Phenylalanine)
Prolina (Proline)
Triptfano (Tryptophane)
Valina (Valine)
Asparagina (Asparagine)
Cistena (Cysteine)
Glutamina (Glutamine)
Glicina (Glycine)
Serina (Serine)
Treonina (Threonine)
Tirosina (Tyrosine)

Ala
lie
Leu
Met
Phe
Pro
Trp
Val
Asn
Cys
Gln
Gly
Ser
Thr
Tyr

A
1
L
M
F
P
W
V
N
C
Q
G
S
T
Y

Arg
Fis
Lys

R
H
K

Asp
Glu

D
B

Asx
Glx

X.
B

RESIDUOS POLARES (Hidrofiicos)

Residuos cargados positivamente
Arginina (Arginine)
Histidina (Histidine)
Lisina (Lysine)
Residuos cargados negativamente
cido asprtico (Aspartic acid)
cido glutmico (Glutamic acid)
RESIDUOS INDEFINIDOS
cido asprtico o asparagina
cido glutmico o glutamina

N ota: la escritura entre parntesis corresponde al nom bre de los am inocidos en idiom a ingls, de los que fueron teinadas
las 3 letras para ia elaboracin de la tabla.

ndice analtico

A dyuvantes, preparacin, 953

adyuvante de Freund, 953
bacterias tratadas con cido actico a 100C, 953
gel
de fosfato de alum inio, 953
de hidrxido de alum inio, 953
ISC OM s (im m une stim ulating com plexes), 954
construccin de, conteniendo protenas m odificadas por
tratam iento con cido palm tieo, 954
incorporacin de protenas integrales de m em brana,
954
de liposom as, 955
m aterial necesario, 955
m todo, 955
A gente(s)
infeccioso, 476
virales, com plejidad estructural de los, 533
A glutinacin, 192
reacciones de, 193
bloqueo, 195
conglutinacin, 195
fenm eno de prozona, 194
m todo(s)
de C oom bs o de la antiglobulina, 195
cualitativos, 193
valoracin
de anticuerpos incom pletos o bloqueantes, 194
de antisueros, 194
A glutininas de plantas e invertebrados, 121
A islam iento
de linfocitos
inm unom agntico, por seleccin negativa, 737
por lisis especfica m ediada por antieuerpo-com plemento, 734
por el intodo de inm unoplaqueo o panning, 735
de poblaciones celulares inm unocom petentes, 730
por m edio de gradientes, 730
separacin
con FicoU -Hypaque, 731
con gradientes de Percoll, 732
representacin grfica de los resultados, 744
A lergia, 639
atpiea, 656
prueba de transferencia de Prausnitz-K stner, 656

fsica, 662
retardada, 660
A m inocidos, nom enclatura, 962
claves de 3 letras y d e 1 letra, 962
A nafilaxia, 640, 722
activa, 6 4 1 ,7 2 2
cutnea, 6 5 1 ,6 5 3 ,7 2 2
choque anafiletico, 641
local, 649, 722
desgranulacin de m astocitos, 650, 722, 723
m todo de Sehultz-D ale, 649
agregada o por agregados, 654
desensibilizacin, 658
m ediadores
qum icos, 642
enzim as, 643
factores quim iotcticos, 643
histam ina, 642
m ecanism o de liberacin, 647
serotonina, 642
que se sintetizan, 644
bradiquinina, 647
calidinas o plasm aquininas, 647
citoquinas, 647
factor de agregacin plaquetaria, 647
derivados del cido araquidnico, 644
factor FQE-A, 645
leueotrienos, 644
prostaglandinas, 645
sustancia de reaccin lenta (SR S-A ), 644
pasiva, 652, 722, 723
A nlisis
antignico, 71
radioinm unom trico (IR M A ), 170
A nticuerpo(s), 75-130
anafilcticos, 654
anticentrm ero, 589
antinucleares, 585
antinucleolares, 590
anti-R h incom pletos, 359
anti-ScI-70, 589
asim tricos de las clases IgG, 345, 353
funcin de los, 356
por qu aglutinan eritrocitos sensibilizados, 354
leetinas, 121
especificidad para eritrocitos hum anos, 122

Apndice IV
Nomenclatura de los aminocidos

RICARDO MARGNI

NOMENCLATURA DE LOS AMINOCIDOS SEGN LAS CLAVES

DE 3 LETRAS Y DE 1 LETRA
RESIDUOS NO POLARES (Hidrofbicos)
Alanina (Alanine)
Isoleucina (Isoleucine)
Leucina (Leucine)
Metionina (Methionine)
Fenllalanina (Phenylalanine)
Prolina (Proline)
Triptfano (Tryptophane)
Valina (Valine)
Asparagina (Asparagine)
Cistena (Cysteine)
Glutamina (Glutamine)
Glicina (Glycine)
Serina (Serine)
Treonina (Threonine)
Tirosina (Tyrosine)

Ala
lie
Leu
Met
Phe
Pro
Trp
Val
Asn
Cys
Gln
Gly
Ser
Thr
Tyr

A
1
L
M
F
P
W
V
N
C
Q
G
S
T
Y

Arg
His
Lys

R
H
K

Asp
Glu

D
B

Asx
Glx

X.
B

RESIDUOS POLARES (Hidroflicos)

Residuos cargados positivamente
Arginina (Arginine)
Flistidina (Histidine)
Lisina (Lysine)
Residuos cargados negativamente
cido asprtico (Aspartic acid)
cido glutmico (Glutamic acid)
RESIDUOS INDEFINIDOS
cido asprtico o asparagina
cido glutmico o glutamina

N ota: la escritura entre parntesis corresponde al nom bre de los am inocidos en idiom a ingls, de los que fueron tom adas
las 3 letras para ia elaboracin de la tabla.

ndice analtico

A dyuvantes, preparacin, 953

adyuvante de Freund, 953
bacterias tratadas con cido actico a 100C, 953
gel
de fosfato de alum inio, 953
de hidrxido de alum inio, 953
ISC OM s (im m une stim ulating com plexes), 954
construccin de, conteniendo protenas m odificadas por
tratam iento con cido palm tico, 954
incorporacin de protenas integrales de m em brana,
954
de liposom as, 955
m aterial necesario, 955
m todo, 955
A gente(s)
infeccioso, 476
virales, com plejidad estructural de los, 533
A glutinacin, 192
reacciones de, 193
bloqueo, 195
conglutinacin, 195
fenm eno de prozona, 194
m todo(s)
de C oom bs o de la antiglobulina, 195
cualitativos, 193
valoracin
de anticuerpos incom pletos o bloqueantes, 194
de antisueros, 194
A glutininas de plantas e invertebrados, 121
A islam iento
de linfocitos
inm unom agntico, por seleccin negativa, 737
por lisis especfica m ediada por anticuerpo-com plemento, 734
por el m todo de inm unoplaqueo o panning, 735
de poblaciones celulares inm unocom petentes, 730
por m edio de gradientes, 730
separacin
con FicoU -Hypaque, 731
con gradientes de Percoll, 732
representacin grfica de los resultados, 744
A lergia, 639
atpica, 656
prueba de transferencia de Prausnitz-K stner, 656

fsica, 662
retardada, 660
A m inocidos, nom enclatura, 962
claves de 3 letras y d e 1 letra, 962
A nafilaxia, 640, 722
activa, 6 4 1 ,7 2 2
cutnea, 6 5 1 ,6 5 3 ,7 2 2
choque anafilctico, 641
local, 649, 722
desgranulacin de m astocitos, 650, 722, 723
m todo de Schultz-D ale, 649
agregada o por agregados, 654
desensibilizacin, 658
m ediadores
qum icos, 642
enzim as, 643
factores quim iotcticos, 643
histam ina, 642
m ecanism o de liberacin, 647
serotonina, 642
que se sintetizan, 644
bradiquinina, 647
calidinas o plasm aquininas, 647
citoquinas, 647
factor de agregacin plaquetaria, 647
derivados del cido araquidnico, 644
factor FQE^A, 645
leucotrienos, 644
prostaglandinas, 645
sustancia de reaccin lenta (SR S-A ), 644
pasiva, 652, 722, 723
A nlisis
antignico, 71
radioinm unom trico (IR M A ), 170
A nticuerpo(s), 75-130
anafilcticos, 654
anticentrm ero, 589
antinucleares, 585
antinucleolares, 590
anti-R h incom pletos, 359
anti-S cl-70, 589
asim tricos de las clases IgG, 345, 353
funcin de los, 356
por qu aglutinan eritrocitos sensibilizados, 354
lectinas, 121
especificidad para eritrocitos hum anos, 122

964

Indice analtico

A nticuerpo(s) {cont.)
clonotpicos, 789
coprecipitantes, 345
asim etra m olecular en los, 352
por cju no precipitan ei antgeno, 349
propiedades biolgicas de los, 348
estudios inmunociumicos, 345
fenm enos de la coprecipitacin, 347
deteccin de, contra antgeno nuclear extractable (ENA),
719
determ inacin de, por m edio del RIA , 839
ensayo
de titulacin, 8 4 1
de unin de radioligando (RBA ), 839
deteccin de, en el sobrenadante de cultivo, 795
diversificacin de los, 131
expresin de los genes: prom otores y enhancers, 140
fam ilia de genes de cadena
liviana
kappa (k), 133
lambda(A,), 134
pesada, 135
m ecanism os de reordenam iento gentico, 137
espaciador, 137
heptm ero, 137
m aquinaria enzim tica, 138
nonm ero, 137
RAG" I y R A G -2 (gen activante de la recom bina
cin , 138
recom binasa, 138
secuencias de reconocim iento, 137
m utacin som tica, 139
recom binacin som tica, 138
diversificacin N -term inal, 139
im precisiones en la, 139
reordenam iento
de los genes de inm unoglobulinas durante la ontoge
nia, 132
experim entos
de Hozumi y T onegaw a, 132
de P. Leder y col., 132
y expresin durante la m aduracin linfocitaria, 141
cadena liviana sustitua, 141
exclusin altica, 142
receptor pre-B, 141
teoras sobre el origen de la, 131
de D re y e ry Bennet, 131
de Erhlich, de los receptores celulares especficos,
131
instructivas, de H aurovitz y de Pauling, 131
de la seleccin o expansin elonal, de B urnett y Jerne, 131
fragm entos de, y biblioteca genm ica com binatoria, 793
generalidades, 75
m todos para la identificacin y cuantificaein, 697
investigacin de anticuerpos anti-Rh, 718
por bloqueo, 719
por dilucin en m edio album inoideo, 718
por m odificacin enzim tica de la superficie de los
hem ates, 718
por la prueba de Coom bs indirecta, 719
en inm unoterapia antitum orai, 677
m onoclonales, 781
aplicaciones, 788, 789
deteccin de tum ores, 789
inm unotoxina, 789
identificacin y aislam iento de clulas, 788
purificacin de protenas, 788
mtodos, 794
clonado, 796
en aear sem islido, 796

por dilucin lm ite, 796

congelacin de clulas, 796
descongelacin de clulas, 796
expansin de clones positivos, 796
fusin
clulas que se deben usar en la, 795
de clulas en suspensin, 795
otros m todos, 795
m edio(s)
buffer G K N , 795
de congelacin, 794
solucin de agente fusgeno, 794
produccin de lquido ascftico, 796
y polielonales, diferencias, 787
avidez, 787
especificidad, 788
estabilidad, 787
reactividad secundaria, 787
no precipitantes, 345
producidos en plantas, 794
purificacin. V ase P urificacin de anticuerpos, 937
quim ricos y hum anizacin de, 790
SS-A y SS-B, 590
A ntigenicidad, dem ostracin de la, 71
A ntgeno(s), 47
adyuvantes, 72
com plejos lipoflicos inm unom oduladores (ISCOM s),
73
de Freund, 73
liposom as, 73
muramil dipptido (M D P), 73
alrgenos, 656
alteracin de los, 54
desnaturalizacin, 54
oxidacin, 55
reduccin, 55
digestin, 55
acidificacin y alcalinizacin, 55
desam inacin, 55
esterificacin, 55
bacterianos, 58
cido teichoico, 929
aislam iento y separacin, 924
obtencin
de cultivos, 924
de flagelina, 926
por lipopolisacrido, 930
com ponentes
endocelulares, 924
intracelulares, 930
esferoplastos, 924
exocelulares, 926
exopolisacridos, 926
que se solubilizan en m edios lquidos, 926
polisacridos neum occicos, 927
Vi, 59
flagelos, 923, 926
H, 58
K, 58
lipopolisacridos, 929
obtencin, 929
separacin, 929
m em brana citoplasm tica, 924, 929
O, 58
pared celular, 923, 924, 925, 928
flagelina, 59
polisacrido del neum ococo, 59
M , 59
T, 59
cera D, 60
tubereulinas, 60

Indice analtico
caractersticas de las ciiie depende la antigenicidad o ca
pacidad para inducir respuesta, 50
tam ao m olecular, 50
grupos qum icos activos, 50
posicin de los radicales en el ncleo arom tico, 51
h idrofilicidad y prediccin de epitopes, 53
m todos p ara determ inar hidrofilicidad y estructura se
cundaria, 53
papel de la m ovilidad atm ica en al antigenicidad e inm unogenicidad de protenas, 54
com posicin qum ica de los, 55
m odificados qum icam ente, 56
T-dependientes, 55
T -independientes, 55
constituyentes antignicos de los glbulos rojos hum a
nos, 67
factores Ix w is , Le,^ y Le^, 68
M y N , 68
S, P, Rh, 70
sistem a ABO, 67
sustancia
A, 67
H, 67
individuos
no secretores, 68
secretores, 68
d iferentes tipos, 58
P.P.D ., 60
especficos de especies y rganos, 65
heterfilos, 66
de Forssm an, 66
de histocom patibilidad, 70
H LA , 70
dinm ica de los, 7 1
generalidades, 47
determ inante(s) antignico(s)
conform acional, 47
continuo, 47
discontinuos, 47
topogrficos, 47
epitope, 47
epitipo, 47
haptenos, 47
inm ungeno, 50
paratope, 48
H LA -G , 683
m todos p ara la identificacin y cuantificacin, 697
aglutinacin. V ase tam bin A glutinacin, 707
fijacin del com plem ento. V ase tam bin Fijacin del
com plem ento, 714
precipitacin. V ase tam bin Precipitacin, 697
m itgenos y superantgenos, 70
concanavalina A (Con A), 70
fitohernaglutinina (PH A ), 70
lipopolisacridos bacterianos (LPS), 70
p okew eed (PW M ), 70
endgenos M is, 70
otros, com partidos, 66
proteicos, 932
aislam iento y purificacin, 932
de gam m aglobulina, 933
de lisozim a, 933
de ovoalbtjm ina. 932
de protena de Bence .Iones, 932
de seroalbm ina bovina, 933
introduccin de nuevos determ inantes antignicos, 933
copulacin de com puestos de diazonio, 934
fijacin de pequeos pptidos m ediante carbodiim idas, 935
mtodo
del 2-4 dinitrobenceno sulfonato de sodio, 934

965

clculo del nm ero de grupo D N P por m o lcu la

de BSA, 934
de flor-dinitrobenceno, 933
obtencin de m eiubranas
a partir de rganos, 935
a partir de cultivos celulares
y liberacin de protenas unidas a, 935
p reparacin de albm ina bovina dinitrofenoiada, 933
relacionados con los grupos sanguneos, 684
de rickettsias y virus, 6 1
teinpo de perm anencia d e los, 74
toxinas m icrobianas, 62
dosis, 62, 63
endotoxinas, 62
exotoxina(s), 62
diftrica, 62
tetnica, 62
lm ite
m uerte (L-i-), 63
nulo (Lo), 62
tum orales, 669
clnales, 674
de diferenciacin, 673
detectados por anticuerpos, 673
em brionarios y fetales, 673
hum anos, 674
reconocidos por LT, 669
venenos
de origen animal, 64
crotlicos, 64
de vegetales superiores, 63
de zooparsitos, 64
A ntitoxinas, valoracin por neutralizacin, 720
A utoantgenos, 566
clonado m olecular, 591
A utoinm unidad, 559
enferm edades autoinm unes. V ase tam bin E n ferm e d a
des autoinm unes, 574
etiologa, 560
factores genticos, 560
com plejo m ayor de histocotnpatibilidad, 561
inm unoglobulinas, 562
receptor de linfoticot T, 562
en infecciones virales, 543
m odelos experim entales, 571, 574
artritis reum atoidea, 571
autoinm unidad espontnea, 571
enferm edad de G raves, 572
esclerosis mltiple, 571
m iastenia gravis, 571
tiroiditis de flash im o to , 5 7 1
patogenia, 569

B
B acterias
extraceJulares, 485
intracelulares, 487
prototipo, estructura, 924
Biologa m olecular, tcnicas bsicas en, 852
ADN
com plem entario, 853
recom binante, 852
tem peratura de m elting o de fusin, 854
biblioteca genm ica, 853
clonado m olecular, 853
crom osom as, 852
ensayos de hibridizaein, 853
dot hibridization , 854
in situ, 855

Indice analtico
B iologa m olecular (con.)
touch blot , 855
genom a, 852
reaccin en cadena de la polim erasa (PCR), 855
aplicaciones, 864
anlisis
de genes, 865
de m utaciones, 865
secuenciacin directa de (xagmentos de A DN,
864
m etodologa, 860
deteccin de los productos am plificados, 861
diseo de los ciclos, 861
opdm izacin de la PCR, 863
preparacin
de la m ezcla de reaccin, 8 6 1
de la m uestra, 860
B ioseguridad
m aterial de origen hum ano susceptible de estar infectado,
730
decontam inacin, 730
m anipulacin, 730
norm as de proteccin del operador, 730

C
C aractersticas inm unolgicas de las clulas que participan
de la respuesta inm une, 747
evaluacin
de la activacin iinfocitaria, 747
de la funcionalidad celular, 753
ensayos para evaluar la funcin citotxica m ediada
por linfocitos T, 753
generacin de linfocitos T citotxicos in vitro, 754
m arcacin de las clulas blanco, 755
m edicin de la actividad citotxica, 755
de la proliferacin Iinfocitaria, 749
de clulas m ononucleares inducida por un m itgeno,
750
expresin e interpretacin de los resultados, 753
inducida por estim ulacin antignica, 752
pruebas funcionales in vitro, 747
reaccin de cultivo mixto linfocitario unidireccional, 75 J
C aracterizacin fenotpica de las clulas que participan en
la respuesta inm une, 74)
citom etra de flujo, 742
inm unofluorescencia, 742
linfocitos form adores de rosetas con eritrocitos de carne
ro, 741
utilidad en el diagnstico de enferm edades, 740
Carcinognesis, 664
Clulas
indiferenciadas m ultipotentes, 14
cido hialurnico, 15
CD 44, 15
fam ilia de las integrinas, 16
inm unocom petentes, 14
m todos para la evaluacin, 729
nive , 21
natural killer (NK), citotoxicidad, 756
RecT(VY7+), 314
que sintetizan IgA, 307
S te m c e lls , 14
T originadas en el intestino, funcionalidad, 314
trofoblsticas, expresin antignica, 683
C itom etra de flujo, 742
anlisis del A D N y del ciclo celular, 746
clasificacin de clulas, 746
deteccin de antgenos de linfocitos hum anos, 743
fluorocrom os utilizados. 745

C itoquinas, 231
clasificacin funcional de las, 231
m ediadoras de la respuesta inm une innata, 233
que actan com o factores estim ulatorios de la hem ato
poyesis, 233
reguladoras
de la activacin, del crecim iento y la diferenciacin
Iinfocitaria, 233
de las respuestas efectoras e inflam atorias, 233
deteccin de la produccin, 762
factor(es)
estim ulantes de colonias (C SFs), 2 3 1, 252
G -CSF, 253
de necrosis tum oral (TN F), 254
transform ante del crecim iento celular (TG F), 253
interfern(es).V ase tam bin Interfern(es), 250
linfoquinas. V ase tam bin IJnfoquinas, 2 3 1
C itotoxicidad
de clulas natural Idller (N K ), 378, 756
dependiente de anticuerpos, 380, 757
inducida por interleuquina 2, 380
m ediada por linfocitos T, 376
C oeficientes de extincin
m olar (E ,,) de sustancias de bajo peso m olecular, 960
porcentual ( E * ,) de protenas, 961
C om plejo(s)
funciones de las m olculas de histocom patibilidad, 217
genes
de clase I, 207, 209
de clase II, 2 I 3
inm unes, 494
deteccin, 725
por fijacin a eritrocitos de pollo, 727
por precipitacin con polietilenglicol, 727
dosaje, 725
fijadores de com plem ento, determ inacin, 726
m ayor de histocom patibilidad, 123, 201, 561, 593
antecedentes histricos, 593
conceptos generales, 201
estructura y funcin, 593
m olculas
de clase I, 203, 593
cadena pesada a , 203
especificidades, 204, 205, 594
estructura tridim ensional, 205, 596
ligandos peptdicos, 206, 596
P,-m icroglobulina, 203
polim orfism o, 594
topografa de la unin de pptidos a las, 205
de clase 1 1 ,2 1 1 ,5 9 7
distribucin, 597
estructura, 597
tridim ensional, 599
ligandos peptdicos, 599
polim orfism o, 597
productos de clase II, 597
organizacin gentica del sistem a
HLA. V ase tam bin H LA , 600
H -2, 202
haplotipo, 202
polim orfism o y evolucin de la regin I del FI-2, 214
reconocim iento T por el CMFI, 202
regin S, 215
relacin con la respuesta inm une, 201
Com plem ento, 386
actividad funcional del, por va alterna, 425
cintica de la inm unohem lisis por accin del, 391
com ponentes del
m icroscopia electrnica, 388
nom enclatura, 386, 387
que intervienen en la va clsica, 387

Indice analtico
receptores de, 404
valoracin, 427
valorados com o antgenos, 431
curva de iem lisis en funcin del, 414
definiciones, 386
en las diferentes especies anim ales, 412
evolucin ontognica y filognica, 414
genes que codifican para protenas del, 412
interrelacin con otros sistem as, 4 1 1
lisis de glbulos rojos por, 414
m ecanism os
inm unolgicos en los que participa, 409
anafilotoxinas, 409
factor leucocito-quim iotctico, 410
inm unoconglutinacin y conglutinacin, 410
inm unoadherencia y fagocitosis, 41)
quininas, 4 1 1
regulatorios de la activacin, 406
origen del, 413
reactivos para la valoracin tlel, 415
diluyente, 415
hem olisina, 416
obtencin de m uestras y conservacin para dosaje, 418
preparacin de la suspensin de hem ates, 415
valoracin del, 418
ecuacin de von K rough, 419
en dosis hem olticas 50% (CH,), 419
determ inacin del 100% de hem lisis, 418
factores que m odifican los resultados, 421
accin del pH , 423
concentracin de hem olisina, 421
fuerza inica, 422
iones calcio y m agnesio, 423
nm ero de hem ates, 422
tem peratura, 422
v olum en final de la reaccin, 422
variaciones de los niveles sricos, 414
va de activacin
alterna, 401
capacidad de diferentes sistem as, 426
p roperdina, 404
clsica, 387
C rom atoenfocado, 882
m atrices y solventes, 883
m etodologa, 883
C rom atografa, 869
de afinidad, 883
m atrices y solventes, 884
colum nas preparadas con anticuerpos activados, 886
inm unoadsorbentes preparados con Sephai'osa, 886
leetinas, 886
unin de anticuerpos a geles de protena A/G, 885
m etodologa, 887
fijacin y elucin de anticuerpos, 889
solventes, 887
crom atoenfocado, 882
m atrices y solventes, 883
m etodologa, 883
activacin de resinas, 883
gradientes continuos de elucin, 883
evaluacin de los perfiles crom atogrficos: resolucin,
903
de exclusin (filtracin po r geles), 870
aplicaciones, 878
caracterizacin de pesos m oleculares, 879
desalado de solutos, 878
separacin de solutos de pesos m oleculares diferen
tes, 879
m atrices, 872
Bio-G el, 877
colum nas preem paquetadas, 874

en polvo, 873
propiedades fisicoqum icas y estabilidad, 873
S ephacryl, 875
Sephadex, 873
Sepharosa, 876
en suspensin, 874
U ltrogel AcA, 876
preparacin de la m uestra, 877
solventes, 878
en fase reversa, 889, 892
m atrices, 892
solventes, 892
por interaccin hidrofbica, 889, 890
antiflica, 891
charge transfer, 891
fundam entos, 889
m atrices, 892
solventes, 892
verdadera, 8 9 1
de intercam bio inico, 879
m atrices y solventes, 880
lquidas de alta resolucin, 893
de alta presin (H PL C ), 893
aplicaciones, 899
aislam iento
de la cadena L, 900
del fragm ento Fd, 900
obtencin del fragm ento Fab, 900
purificacin de pptidos, 900
F PL C (Fas Protein, Peptide and Polynucleotid L iq u id
C hrom atography), 900
aplicaciones, 903
m atrices, 901
M onobeads, 902
Sepharosa, 902
caractersticas del soluto que se desea analizar, 897
instrum entacin, 895
colum nas, 897
detectores, 897
m todos utilizados, 894
principios generales, 869
C rom om icosis, 512

D ecidua, 684
endom etrial, 685
D erm atofitias, 510
D iversificacin de los anticuerpos. V ase Anticuerpos
D esrdenes linfoproliferativos
crnicos de la serie T, 775
de la serie B madura, 774

E
Electroforesis, 906
en gel de poliacrilam ida, 906
coloracin(es)
alternativas, 9 )4
p or C oom assie Blue, 914
determ inacin de pesos m oleculares relativos, 915
reactivos, 908
preparacin de la m uestra para SD S-PA G E, 909
purificacin de drogas, 908
soluciones de reserva, 908
secado de los geles, 915
inm unotransferencia (im m unoblotting), 917
isoelectroenfocado, 916
en placas, 912

968

Indice analtico

Electroforesis (cont.)
arm ado del equipo, 912
corrida electrofortica, 9 12
m ini-geles, 914
en tubos cilindricos, 909
gel
de apilam iento (stacking), 911
de resolucin, 911
ELISA . V ase EnzimoininunoanlLsLs
E L ISPO T (plaqueo inm unoenzim tico), 762
Endotoxinas, 480
E nferm edad(es)
autoinm unes, 494
am pollares (pnfigo), .582
anem ia hem oltiea autoinm une (A H A I), 581
artritis reum atoidea, 587
derm atom iositis y polim iositis, 588
escleroderm ia, 589
organoespecficas, 574
diabetes m ellitus, 577
enferm edad de G raves, 577
esclerosis m ltiples, 580
m iastenia gravis, 579
tiroideas, 574
tiroiditis de H ashim oto, 576
no organoespecficas (sistm icas), 583
lupus eritem atoso sistm ico (LES), 584
de la piel, 582
sndrom e prim ario de Sjgren (SS), 590
del sistem a hem atopoytieo, 580
del suero, 659
tratam iento de las, 591
vaseulitis, 581
de las cadenas pesadas, 632
Enriquecim iento en poblaciones linfocitarias, 733
Enzim oinm unoanlisis (ELISA ), 172, 798
clasificacin de los, 798
heterogneos, 798
de am plificacin de actividad, 799
de captura, 799
de m odulacin de actividad, 799
hom ogneos, 798
conceptos bsicos, 798
deteccin de produccin de citoquinas por, 762
determ inacin de IL-2, 764
distintas m odalidades, 815
TE R ELISA , 815
G ED ELISA , 815
DIG^ELISA , 815
dot-blot, 816
ensayos cuantitativos, 808
com petitivos
con A c inm ovilizado en fase slida, 8 1 1
con Ag inm ovilizado en fase slida, 8 1 1
no com petitivos
con A c inm ovilizado en fase slida, 810
con A g inm ovilizado en fase slida, 810
p arte experim ental, 817
de am plificacin, para la titulacin de sueros, 818
clculo de la capacidad de saturacin de placas, con peroxidasa, 817
de captura, 818
distribucin de reactividad de sueros norm ales y clcu
lo
del valor de corte, 819
m arcacin de anticuerpos con peroxidasa, 817
m odulacin de actividad para la cuantificacin de ant
geno, 819
procesam iento de datos y expresin de resultados, 8 12
clculo del ttulo de un suero, 812
m edida de la absorbancia a dilucin sim ple, 813
titulacin a punto final, 8 12

en unidades arbitrarias por com paracin con un suero

patrn, 813
clculo del valor de corte, 813
sistem as alternativos de reconocim iento, 799
avidina-biotina, 799
protena A, 800
enzim as utilizadas en, 802
fosfatasa alcalina, 803
peroxidasa, 802
ureasa, 803
inm ovilizacin de inm unorreactantes en fse slida, 806
preparacin de conjugados enzim ticos, 803
Esporotricosis, 513
Estim ulacin antignica, 265
en linfocitos, 265
Estructura y organizacin gentica del receptor T. V ase
R eceptor T
Exotoxinas (toxinas extracelulares), 479

F
Factor(es). V ase tam bin Citoquinas
activador
de clulas m ononucleares (M CF), 235
de leucocitos (LA F), 235
de osteoclastos (O AF), 239
de dm ocitos epidrm icos (ETAF), 239
B cell grow th fa c to r //, 244
B cell stim ulating fa c to r, 242, 243
cytotoxic lym phocyte m aturation fa c to r, 248
estim ulador de glucosilacin (FEG), 657
estim ulantes de colonias, 231, 242, 252
high m olecular w eight B cell grow th fa c to r (HM W B CG F), 249
inductor de protelisis (PIF), 239
inhibidor
del crecim iento de m elanom as, 239
de glucosilacin (FIG), 657
inhibidor de la sntesis de citoquinas (C SIF), 247
linfocitarios m oduladores de la respuesta inm une, 693
m acrophage-activating fa cto r (M AFs), 251
m ast cell grow th factor, 242
natural killer stim ulatory fa c to r (NKSF), 248
de necrosis tum oral, 254
de proliferacin de fibroblastos, 239
sinovial (SF), 239
T cell grow th fa c to r (TCG F), 240
T cell replacing fa c to r (TRF), 244
transform ante del crecim iento celular (TG F), 253
F agocitosis, 382
caractersticas de las clulas efectoras, 383
m ecanism os Uticos en la, 383
opsoninas, 383
sistem as m icrobicidas
dependientes del oxgeno, 384
independientes del oxgeno, 384
F enm eno
de A rthus, 658
de Sannarelli-Schw artzm ann, 660
F ijacin del com plem ento, 197
sueros anticom plem entarios, 197
Fraccionam iento de inm unoglobulinas, 945
degradacin enzim tica de IgM , 949
digestin
papanica de IgG 1, 947
ppsica de IgG 1, IgG 2a, IgG 2b e IgG 3, 948
m todos enzim ticos, 945
fraccionam iento
papanico, 945
ppsico, 946

Indice analtico
trptico, 946
obtencin de F(ab)2, Fab y C de diferentes Ig, 947
m todos qum icos, 949
obtencin
del fragm ento Fd de IgG, 947
de hem im olcias, 949
de IgM m onom rica (IgM s, 7S), 949
de pptidos L y H, 949
preparacin y aislam iento de hbridos, 950

G am m opatas m onoclonales, 627

benigna (G M B), 633
enferm edad de las cadenas pesadas, 632
m acroglobulinem ia, 632
m alignas
alteraciones hum orales asociadas, 631
de la hem ostasia, 631
anem ia, 631
hipercalcem ia, 631
inm unodepresin, 632
proteinuria de B ence Jones, 631
urem ia, 631
etiopatogenia, 629
factores predisponentes, 630
m ielom a m ltiple (M M ), 628
inm unoiregulacin en, 634
origen celular, 629
secundarias o asociadas, 633
sinnim os, 627
G lbulos rojos, lisis de
com plem ento por, en ausencia de anticuerpos, 414
m todos, 769

H
Flem oaglutinacin
inhibicin de, 721
neutralizacin de, 721
por virus, 721
H em olisis
cintica de la, por com plem ento lim itado, 424
curva de, en funcin del com plem ento, 414
placas de, en sntesis de inm unoglobulinas policlonales,
759
H ibridom as, 781
anticuerpos m onoclonales, 786
clonado, 786
m onitoreo, 786
produccin, 786
purificacin, 787
a clulas T, 794
clulas de m ielom a y m todos de seleccin, 782
cultivo de, 783
consideraciones generales, 781
fusin, 783
heterohibridom as, 790
hbridos o heteroconjiigados, 897
hum ano-hum ano, 790
hum anos , 790
inm unizacin, 783
teoras y aspectos generales de la produccin, 782
H ipersensibilidad
alergia, 639
anafilaxia. V ase tam bin A nafilaxia, 641
por contacto, prueba de, 767
enferm edad del suero, 659
especfica, 639

fenm eno de Arthus, 658

inespecfica, 660
m anifestaciones de tipo anafilctico, 640
reacciones de, 640
retardada, 660
pruebas cutneas de, 765
tarda, 296, 298
de tipo
IV, 298
Jones-M ote, 660
H istam ina, factor liberador de (HRF), 654
HLA
alelo, 595
y enferm edad, 604
y gentica poblacional, 604
haplotipo, 600
loci
de clase I, 600
de clase 11,601
de clase 111,601
organizacin y expresin de los genes
de clase I, 601
de clase II, 602
tipificacin del sistem a, 603
alelos del locus D, 604
determ inacin del fenotipo, 603
reaccin en cadena d e la polim erasa, 604
tipificacin m olecular, 604
y trasplante. Va,se tam bin Trasplante, 606
organizacin gentica del sistem a, 600

I
Im plantacin, 685
factor estim ulador de colonias de m acrfagos, 686
Infeccin(es)
agente infeccioso, 476
bacterias
extracelulares, 485
intracelulares, 487
defensas del husped, 481
endotoxinas, 480
y enferm edad, 475
exotoxinas, 479
m ecanism os de la, 3
que im piden la, 4
parasitarias, inm unologa de, 521
virales
diagnstico serolgico, 538
inm unologa, 531
sndrom es inducidos por, 538
tipos de, relacin con la patogenia, 535
Inflam acin
aguda, 471
caractersticas del proceso, 435
crnica, 471,
dinm ica de la respuesta, 463
iniciacin de la, 463
m ovilizacin de las clulas inflam atorias, 463
acvacin, 465, 467
acum ulacin de eosinfilos, 468
adhesin, 466, 467
leucocitosis, 462
m igracin, 465, 466, 467
reclutam iento celular, 464
rodam iento leucocitario, 465, 466
elem entos que intervienen en la respuesta, 436
factores plasm ticos, 436
sistem a
de activacin por contacto, 436

969

970

Indice analtico

Inflam acin (cont.)

de com plem ento, 436
de las quininas, 437
bradiquinina, 437
calicrena, 438
quiningeno, 438
fibrinoltico, 440
plasm ingeno, 440
uroquinasa, 440
funcin del endotelio vascular en la, 469
respuesta
al factor de perm eabilidad vascular, 470
de las clulas endoteliales a las citoquinas, 469
produccin de quim ioquinas, 470
tono y perm eabilidad vascular, 471
m ediadores lipideos de la respuesta, 440
citoquinas, 451
factor
activador de plaquetas (PA F), 448
de necrosis tum oral(T N F), 453
histam ina, 449
interleuquinas, 451, 455
leucotrienos, 445
lipoxinas, 446
xido ntrico, 449
prostaglandinas, 441
quim ioquinas, 455
seales para la liberacin del precursor, 440
cido araquidnico, 440
eicosanoides, 440
fosfolipasa A, 440
transform acin del precursor, 441
ciclo-oxigenasas, 441
lipoxigenasas, 441
trom boxano, 441
respuesta de fase aguda, 461
induccin, 461
negativa, 462
positiva, 462
sistem a celular de defensa, 456
prim era lnea de, 457
basfilos y clulas m astoideas, 459
eosinfilos, 458
neutrfilos, 457
segunda lnea de, 460
m onocitos y m acrfagos, 460
Inm unidad
activa, 10
adoptiva, 10
adquirida, 10
antiinfecciosa, 10
hum oral, 499
innata, 5
local, 12
m ecanism os, 8
m ediada por clulas, 296, 498
im portancia fisiolgica de la, 302
en el rechazo de injertos y tum ores, 302
p atologa de la, 302
derm atitis de contacto, 303
infecciones, 302
pruebas para la deteccin de, 304
funcionales, 765
reaccin
blasto-m itognica, 304
de M antoux, 304
natural del husped, 8, 521
pasiva, 10
tipos, 8
Inm unizacin
activa, 362

con pptidos sintticos, 367

pasiva, 362
seroterapia, 369
vacunoterapia, 362
Inm unoanlisis radiom tricos, 821
otras tcnicas, 846
m arcacin m etablica de protenas e inm unoprecipitacin, 846
radioinm unoensayo (RIA). V ase R adioinm unoensayo
(RIA), 821
Inm unocom plejos en infecciones virales, 544
Inm unodeficiencias
prim arias, 609
asociadas a otras anom alas, 618
ataxia telangiectasia, 618
sndrom e
de Di George, 6 18
de W iskott-A ldrich, 618
clasificacin, 612
com binada severa (ID CS), 612
deficiencias predom inantes de anticuerpos, 615
agam m aglobulinem ia ligada al X, 615
com n variable, 617
deficiencia
de inm unoglobulinas con hiper IgM , 616
selectiva de inm unoglobulina A, 6 16
de subclases de IgG, 616
hipogam m aglobulinem ia transitoria de la infancia,
618
estudios para valorar la com petencia inm unolgica, 622
cuantificacin
de inm unoglobulinas, 622
de linfocitos B y T, 623
determ inaciones de ADA y PNP, 623
estim ulacin de linfocitos in vitro (cultivo), 623
evaluacin del sistem a fagoctico, 623
m uerte intracelular, 623
pruebas cutneas, 623
quim iotaxis, 623
test del nitroblue-tetrazolio (N BT), 623
etiologa y patogenia, 610
generalidades, 609
gentica, 6 10
m anifestaciones clnicas, 6 1 1
otros sndrom es asociados
con respuesta inadecuada al virus de Epstein-B arr,
619
de albinism o parcial, 619
deficiencias
en la expresin de protenas de adhesin, 620
de la fagocitosis, 619
de la respuesta inm une inespecfica, 619
del sistem a com plem ento, 619
enferm edad granulom atosa crnica, (EG C), 620
de hiper IgE, 618
secundarias o adquiridas, 625
asociadas a otras patologas, 625
por drogas, 625
tratam iento de las, 623
sustitutivo con gam m aglobulina, 624
trasplante de m dula sea, 624
Inm unodiagnstico, 528
Inm unoenzim ologa, 725
Inm unofluorescencia (IF), 169, 723, 742
mtodo
directo, 724
indirecto, 725
Inm unogentica, aplicaciones al diagnstico de leucem ias
y linfom as, 772
Inm unoglobulina(s). V ase tam bin Anticuerpos
A (IgA), 95

Indice analtico
cam ino hepatobiliar de la, 315
gnesis y m antenim iento del ciclo celular de la, 308
secretoria, utilidad de la produccin por inm unizacin
oral, 315
am plificacin de A D N de dom inios variables, 791
D (IgD ), 97
de diferentes clases de vertebrados, 102
E (IgE), 97
m edicin, 658
fraccionam iento. V ase Fraccionam iento de inrnunoglohuinas
G (IgG ), 79
hidratos de carbono en las m olculas de, 99
hom ogeneidad y heterogeneidad de las, 104
M (IgM ), 91
m ecanism o de retroalim entacin por, 337
m onoclonales, el laboratorio en el estudio de, 635
nom enclatura de las, 122
esc]uema para, 122
otras m olculas relacionadas con las, 123
policlonales, form acin de placas de hem lisis para su
m edicin, 759
receptores de, 123
para Fe, 126
sitios activos de las m olculas de, 104
superfam ilia de las, 123
antgenos
asociados a P^m icroglobulina, 123
localizados en cerebro y linfocitos, 123
de superficie de linfocitos, 123
com plejo
m ayor de histocom patibilidad, 123
RCT^CD3, 123
m olculas de adhesin, 123
variaciones
alotpicas de las, 118
alotipos ms frecuentes del hom bre y el conejo, I 19
idiotpicas de las, 121
isoalotipos, 120
nom enclatura de los alotipos, 120
Inm unologa
de las crom om icosis, 512
de las esporotricosis, 513
de las infecciones
bacterianas, 475
parasitarias, 521
inm unodiagnstico, 528
relacin husped-parsito, 521
vacunas, 529
virales, 531
de las m icosis. V ase tam bin M icosis, 496
de los m icetom as, 513
de la reproduccin, 6 8 1
tum oral, 664
funcin de los antgenos del CM H , 666
m ecanism os efectores, 666
anticuerpos, 666
clulas natural k iller, 667
linfocitos T, 666
m acrfagos, 667
respuesta inm une antitum oral, 665
vigilancia inm unolgica, 667
him unopatologa, 473
Inm unotransferencia (im m unoblotting), 917
equipos, 920
m odo operativo:920
p aite experim ental, 919
reactivos, 919
sistem a autom atizado, 921
Interfern(es), 6
inm une. 251

971

m edicin de IFNy, 765

d e tipo I, 250
receptores de (IF N -R l), 250
de tipo II, 2 5 1
Interleuquinas, 235
1 (IL -I), 235
receptor de (IL-IR), 240
2 (IL-2), 240
determ inacin por EL ISA , 764
m edicin, 763
receptor de (1L-2R), 241
3 (IL~3), 242
receptor de (IL^3R), 243
4 (TL~4), 243
recep to r de (IL-4R ), 244
5 (lL -5), 244
receptor de (IL-5R ), 244
6 (IL -6), 244
receptor de (IL-6R ), 245
7 (IL -7), 245
receptor de (IL7R), 246
8 (IL -8), 246
receptor de (IL-8R ), 246
9 (IL -9), 246
receptor de (IL^9R), 246
10 (IL -10), 247
receptor de (IL-IO R), 247
11 (IL ^ II),2 4 7
receptor de (IL-I IR ), 247
12 (IL^12), 248
receptor de (IL-12R ), 248
1 3 (IL -1 3 )
receptor de (IL-13R ), 249
14 ( IL -14), 249
15 (1L -15),249
Isoeleetroenfocado, 916
parte experim ental, 916

L
Leucem ia(s)
aplicaciones de la inm unogentica al diagnstico de, 772
aspectos tcnicos, 777
interpretacin de los resultados, 780
bifenotpicas agudas, 774
linfoblsticas agudas (I,LA ), 773
T (LL A -T), 773
m ieloides agudas (LM A ), 773
L infocitos, 16
activacin, 257
B
anergia, 18
caractersticas y ontogenia, 16
C D 23, 18
clula Pre-B, 16
clula Pro-B, 16
deoxinucleotidil transferasa term inal (TdT), 16
funcionalidad de, 759
linaje m aduro, 17
m arcadores celulares que identifican a las c lu las de li
naje B, 18
receptor antignico, 17
reordenam iento de genes
clulas con mem oria, 16
T
caractersticas y ontogenia, 19
citotoxicidad m ediada por, 376
efectores , 16
funcionalidad de, 762
m aduros, 20

972

Indice analtico

Linfocitos (con!.)
proti m ocitos, 19
receptor antignico, 19
reguladores , 16
reordenam iento de genes, 20
tim o, 16
Te, 20
Th, 20
T H 1, TH 2, 20, 42, 299
tim osina, 19
responsable de los fenm enos de supresin (Ts), 20
seleccin
apoptosis o m uerte program ada, 21
positiva y negativa, 20
Linfom a(s), aplicaciones de la inm unogentica al diagns
tico de, 772
Linfoquinas, 231
accin autocrina y endocrina, 232
efecto paracrino, 232
pleiotropism o, 232
receptores de, 233

M
M acrfagos
activacin de los, 300
cam bios en el sistem a inm une, 300
estados fisiolgicos de los, 300
inhibicin de la m igracin de los, 301
M ecanism os
bsicos de la inflam acin, 435
citotxicos m ediados por clulas, 375
clula blanco (target cell), 375
de defensa, 3
efectores de la respuesta inm une, 373
de escape tum oral, 668
de la infeccin, 3
inespecfcos, 4
de la inm unidad antiinfecciosa, 10
inm unolgicos en los que participa el com plem ento, 409
que im piden la infeccin, 3
regulatorios de la activacin del com plem ento, 406
de retroalim entacin por inm unoglobulinas, 337
de transduccin en linfocitos, 261, 262
M etodologas
para la evaluacin de clulas inm unocom petentes, 729
para la identificacin y cuantificacin de antgenos y an
ticuerpos, 697
M todos
inm unoqum icos, 867
crom atogrficos. V ase tam bin C rom atografa, 869
clasificacin, 869
M icetom as, 513
M icosis
oportunistas, 503
aspergilosis, 507
candidiasis, 504
zigom icosis, 509
sistm icas, 496
M olculas
de adhesin, 219
accesorias, 219
intercelulares (ICA M s), 222
leucointegrinas, 221
selectinas, 221
superfam ilia de las integrinas, 219
V C A M -l/IN C A M -n O , 222
marcadores de Is clulas T m igrantes, 227
m ecanism os de adhesin que median el trfico de linfo
citos, 224

migracin de Is clulas T, 224

transm igracin, 224, 227, 229
m igracin transendotelial de las clulas T en la infla
m acin crnica, 224
recirculacin normal de los linfocitos, 225
reclutacin de los linfocitos en los sitios inflam ados,
225
unin de las clulas T, 226
de histocom patibilidad
evolucin, 602
respuesta inm une, 603

O
O btencin
de clulas ganglionares m urinas, 739
de esplenocitos m urinos, 738
de linfoblastos, 738
de m acrfagos y m onocitos, 740
peritoneales de ratn, 740
separacin de m onocitos-m acrfagos por adhrencia al
plstico, 740
de tim ocitos m urinos, 739

Perforinas, 6
Placenta, 681
estructura y funcin, 682
form acin, 681
citotrofoblasto, 682
cotiledones, 682
sincitiotrofoblasto, 681
Plaqueo inm unoenzim tico o ELISPO T, 762
P recipitacin, 176
en m edios con geles, 183
contrainm unoelectroforesis, 189
crossing-over eleetroforesis, 189
difusin sim ple
bidim ensional, 184
en placa o difusin radial, 186
m onodim ensional, 183
tcnica de O udin, 183
doble difusin bidim ensional, 184
m todo de O uchterlony, 184
electroendsm osis, 188
eleetroforesis cruzada, 190
electroinm unodifusin o rocket eleetroforesis.
190
inm unoelectroforesis, 187
radioinm unoelectroforesis, 191
reoforesis, 187
en m edios lquidos, 177
cualitativa, 177
cuantitativa, 177
zona o punto de equivalencia, 179
inhibicin por haptenos de la, 181
reaccin de floculacin, 182
Properdina
dosaje de la actividad funcional, 433
valoracin, 4 3 1
m aterial, 431
m todo, 433
Prueba(s)
cutneas de hipersensibilidad retardada, 765
interpretacin de las, 768
m ltiple, 767
de tul)erculina, 766
de dinitroclorobenceno, 767

Indice analtico
funcionales para evaluar la inm unidad mediada por clu
las, 765
de hipersensibilidad p or contacto, 767
P urificacin
de anticuerpos, 939
y aislam iento
anti-D N P elaborados por el cobayo, 944
de IgG a, IgG b e IgG c de caballo, 944
de IgG 2 e IgG l de oveja, 943
m todos
especficos, 942
anticuerpos antipolisacridos, 942
anticuerpos anti-R h, 943
por acidificacin, 943
elucin por calentam iento, 943
tratam iento con .solventes no polares, 943
cuando el anticuerpo es especfico para un hapteno,
942
cuando el antgeno es una protena com pleja, 942
m ediante inm unoadsorbentes, 943
inespecficos, 939
de IgG
po r crom atografa de afinidad, 940
en presencia de cido caprlico, 940
de IgG, IgA e IgM por crom atografa en D EA E-celulosa y filtracin por geles, 940, 941
obtencin de IgA secretoria y com ponente secretorio:941
precipitacin alcohlica, 939
IgG purificada, 939
m ezcla de IgM e IgA , 939
precipitacin salina, 939
sulfato de am onio, 939
sulfato de sodio, 939
de clulas por tcnicas inm unom agnticas, 737
de linfocitos B, T y subpoblaciones T, 734
de protenas con m todos crom atogrficos, 869

R
R adioinm unoensayo (R IA ), 170, 821
control de calidad en el, 833
ensayos en preequilibrio, 833
heterlogo, 838
principio general, 822
requerim ientos bsicos del, 842
anticuerpos especficos, 843
antgenos marcados, 844
patrones de antgenos fros, 846
tcnicas separativas, 846
secuencia experim ental, 822
clculos de los parm etros de la interaccin prim aria,
826
ensayo
de desplazam iento, 822
de titulacin o curva de calibracin, 822
en sistem as bifsicos (en fase slida), 841
variante del, 842
tcnicas, 848
en fase lquida, 848
separacin de la,s m arcas libre y unida, 849
en fase slida (en tubos plsticos), 849
calibracin de la ad,sorcin de antisueros, 850
ensayos de desplazam iento, 851
m arcacin con '^-^1, 848
m todo subestequiom rico, 848
m todo estequiom trico, 848
teora m atem tica del, 826
anlisis de curvas dosis-respuesta, 830
antgeno trazador , 829

973

clculo de B, 829
criterios de evaluacin del, 831
ensayos en preequilibrio, 833
grfico de Scatchard, 827
m odelo
anticuerpo hom ogneo-trazador hom logo-antgeno
com petidor, 836
bsico, 827
reactividad cruzada con anticuerpos heterogneos, 838
RIA s con m ulticom ponentes, 834
afinidades prom edio, 835
heterogeneidad
en la afinidad, 834
en el antgeno, 835
variante del RIA
R A ST (radioallergosorbent test), 658
R eaccin(es)
antgeno anticuerpo in vitro
interaccin prim aria, 154
anlisis regresivo, 168
m todo de los cuadrados m nim os, 168
clculo de K,|, n.a. A c, 165
constante de afinidad m edia pesada o p o n d erad a
(K av), 166
nm ero de receptores y determ inantes antignicos
en la m em brana celular, 166
capacidad fijadora d e antgeno (ABC; antigen binding capacity), 167
determ inacin de K (constante de asociacin in trn
seca prom edio), 160
equilibrio de dilisis, 160
extincin iquenching) de fluorescencia, 163
precipitacin con sulfato de am onio de los c o m p le
jo s anticuerpo-hapteno, 164
generalidades, 154
afinidad y avidez, 158
anticuerpos heteroclticos, 159
clculo de K|,, 156
m todo de Scatchard, 156
constante
de afinidad (K.^), 155
de asociacin intrnseca m ediana, 155
ecuacin de Sips, 158
tipos de reacciones cruzadas, 159
interaccin secundaria, 176
fijacin del com plem ento. V ase tam bin F ija ci n del
com plem ento, 197
inm unofijacin, 192
neutralizacin o inhibicin del efecto, 200
otros tipos de reacciones, 199
inm unoadherencia, 199
opsonizacin, 199
precipitacin. V ase tam bin Precipitacin, 176
usadas para la deteccin de, 169
anlisis radioinm unom trico (IR M A ), 170
inm unofluorescencia (IF), 169
radioinm unoanlisis (RIA), 170
enzim oinm unoanlisis (ELISA ), 172
inm unoanlisis con reactivos m arcados con su sta n
cias lum iniscentes, 172
term odinm ica de la interaccin hapteno-anticuerpo,
160
en cadena de la polim erasa (PCR). V ase tam bin B io lo
g a m olecular, 855
am plificacin de ADN de dom inios variables de in m u
noglobulinas, 791
m etodologa, 860
producto de am plificacin o am plicn, 859
de derm atitis por contacto, 767
de inm unidad
hipersensibilidad tarda o retardada, 298

ndice analtico
R eaccin(es) (cont.)
m ediadas por linfocitos tipo T h 1 , 298
p or activacin de m acrfagos, 296
por inyeccin intravenosa del anti'geno, 299
producidas por m icroorganism os patgenos, 299
inm unopatolgicas, 493
com plejos inm unes, 494
enferm edades autoinm unes, 494
hipersensibilidad m ediada por clulas, 494
prim aria, 176
secundaria, 176
terciarias, 176
Reactivos
colum na de lana de nylon, 770
lquido de centelleo, 770
m edio de cultivo
IM DM com pleto, 770
RPM I com pleto, 770
solucin
de G ey, 770
de H anks, 770
para lisar glbios rojos (tris-cloruro de am onio), 770
sana
fosfatada de Dulbecco, 770
laiTiponada (SST), 770
tam ponada
stock, 770
de trabajo, 770
de V eronal-V eronal sdico, 959
R eceptor(es)
antignico del linfocito
B y reconocim iento riel antgeno, 257
T y reconocim iento del antgeno, 259
d e com ponentes del sistem a del com plem ento, 404
T
cori'elacin entre a estructura 'iel, y la especificidad
antignica, 148
diversidad de los, 151
estructura y organizacin gentica, 144
antecedentes histricos, 144
efectos de Aes m onoclonales sobre el reconocim iento
'f, 144
estrategia de aislam iento de los genes del, 145
de fragm entos de inm unoglobulinas. Y ase Anticuerpos
funcin del, 148, 150
gentica del, 147, 149
fetero d m eros, 147, 149
para IgE, 655
m ecanism os de reordenamienlo gentico, 151
m olculas accesorias, 152, 153
R econocim iento del ar.tigeiio, 257
R egulacin
d e la respuesla inm une, 327
n euroendocrina de la innruridad de rnuccsas, 317, 322
p o r interacciones idiotpicas. 339
teora de Jem e, 339
R elacin husped-parsito, 52!
R espuesta inm une, 14
anticuerpos
vida m edia de los, 291
obtencin in vitro, 292
tipo de, 293
transferencia de la m adre al feto, 294
antitum oral, 665
bases celulares de la, 33
rganos iinfoides prim arios y secundarios, 33, 34
concepto, 34
linfocitos B y T, 33
tim o, 34
clulas nodri/.as, 35
2 0 4 iidfoxil'estei oide dehidrogenasa, 35

organizacin, 35
origen y desarrollo, 34
seleccin negativa y positiva, 35
tim ocitos, 34
rganos
prim arios del sistem a B, 35
bursa de Fabricius, 35
m dula sea, 35
placas de Peyer, 35
secundarios, 36
clulas veladas, 36
organizacin
de los ganglios linfticos, 36
del bazo, 37
tejido linfoide asociado a las m ucosas, 37
la m dula sea com o, 38
captacin de los antgenos en, 38
m aduracin del sistem a inm une, 38
' linfocitos B, 39
capping, 39
plasm ocitos, 40
m aduracin de los linfocitos T, 40
seleccin, 41
subpoblaciones funcionales de los linfocitos T, 41
linfocitos, 42
clulas de la lnea m onocito-m acrfago, 42
fagocitosis y lisis, 43
estallido m etablico, 43
m ieloperoxidasa, 43
interaccin con el sistem a inm une especfico, 43
caractersticas del husped que la m odifican, 491
edad, 492
factores genticos y nutricionales, 493
clulas
accesorias, 21
m acrfagos, 21
m onocitos, 21
dendrticas, 21
astrocitos, 21
de Langehans, 21
interleuquina 1 (IL -1), 2 1
CPA, 21
antgenos del C M H , 21
indiferenciadas m ultipotentes, 14
clusters de diferenciacin (CD) leucoeitarios, 29
colaboracin celular en la, 328
citoquinas, 328
interaccin T-T , 334
linfocito l -linfocito B, 333
m acrfagos/linfocitos T, 330
contra m olculas de histocom patibilidad, 215
alogeneica, 216
reconocim iento indirecto de aloantgcnos, 216
en las disglobulinernias, 289
factores linfocitarios reguladores de la, 693
en hepatitis B, 550
hum oral, 278
parlisis inm unolgica, 287
produccin de anticuerpos, 281
tolerancia inm unolgica, 287
en la infeccin
herptiea hum ana, 547
con H IV, 556
viral aguda, 541
con persistencia de virus, 543
inm unoglobulinas, biosntesis de, 281
linfocitos, 16
materna, 686
im portancia para el xito de la preez, 690
m ecanism os, 686
produccin de anticuerpos, 687

Indice analtico
respuesta a antgenos, 687
m ecanism os efectores de la, 373
m ediada po r clulas, hacia el trofoblasto, 689
en poliom ielitis, 544
procesado y presentacin del antgeno, 22
proteosom as (PR T), 22
unidades transportadoras (TAP), 22
endosom as, 23
vesculas lisosom ales, 23
pptido, 24
agretope, 25
epitope, 25
respuesta inm une
prim aria, 26
secundaria, 26
regulacin de la, 327
en rubola, 546
Resultados serolgicos, consideraciones para su correcta
interpretacin, 358
R IST (radioim m unosorbent te s f)> 658

S
Seroterapia, 369
antisueros
control de los, 370
especficos hom logos, 369, 3'70
com plicaciones de la, 370
gam m aglobulina, 369, 370
Sntesis
de A D N , cuantificacin por ensayo colorim trico de
M TT, 769
de inm unoglobulinas m ediante plaqueo inm unoenzim ti
co, 7 62'
Sistem a inm une. V ase tam bin An/cMerpas, 14
clulas
accesorias, 14
inm unocom petentes, 14,
d eteccin e individualizacin de las clulas que co m p o
nen el, 44
evolucin, 267
de la IgA secretoria, 306
m odelo probable del, 316
transcitosis, 306
de los invertebrados, 267
aglutininas/opsoninas, 269
citoquinas, 269
citotoxicidad, 268
encapsulacin, 268
fagocitosis, 267
form acin de nodulos, 268
inm unoprotenas no inm unoglobulinas, 269
linfocitos, 269
Usinas, 268
reconocim iento alogeneico, 269
respuestas hum orales, 268
de m ucosas, 306
clulas 1 en las, 33
com tjn a todas las, 311
regulacin neuroendocrina, 317, 322
postulaciones de Ehrlich y M etchnikoff, 14
teoras, 14
de los vertebrados, 272
anticuerpos e inm unoglobulinas, 272
citoquinas, 277
com plejo m ayor de histocom patibilidad (CM H),
272
linfocitos y rganos linfoides, 274
tejido linfoide asociado al tracto intestinal
(T L A 1),274

975

S oluciones. V ase tam bin Reactivos

btiffer usadas en inm unologa, 957
d e acetato, 957
de borato-cloruro, 957
de carbonato, 958
d e fosfatos, 958
de glicina HCl y glicina-N aO H , 958
de Tris-H C l, 959
de V eronal, 959
S ueros inm tuies, 937
aglutinantes, 937
hem olticos, 938
m onoespecficos, 938
obtencin, 937
precipitantes, 938

Tejidos linfoides asociados a las m ucosas, 311

T erapia antiturnoral, 674
con citoquinas, 679
estim ulacin de m ecanism os efectores, 675
inm unizacin activa, 675
inm unoterapia
celular adoptiva, 678
pasiva, 677
T im idina tritiada, m arcacin para determ inar poliferacin
celular, 769
T olerancia, 340
autotolerancia, 341
concepto, 340
del individuo inm unolgicam ente maduro,
343
fetal, 341
T rasplante, 606
de corazn, 607
de hgado, 607
H L A y, 606
injertos, 607
de m dula sea, 608
de rin, 606
rechazo, 606
T rastornos inm unoproliferativos. V ase G am m opatas mf)nocionales, 628
T rofoblasto, factores inm unom oduladores secretad o s por
el, 690
inm unoestim uladores, 692
inm unosupresores
estrgenos, 6 9 1
progesterona, 691
gonadotrofina corinica, 691
horm onas, 691
protenas y glucoprotenas, 692

Vacuna(.s)
controles para determ inar la eficacia de las, 366
en enferm edades infecciosas, 529
ensayos de seguridad, 369
nuevas estrategias en la elaboracin, 366
por recom binacin de A D N , 367
V acunacin(es)
edad para la, 365
com plicaciones de las, 365
V acunoterapia, 362
inm ungeno(s), 362
vacunas virales, 362
vas de introduccin del, 364

ndice analtico
V iabilidad celular, determ inacin, 768
por el m todo de exclusin del azul tripn, 768
V igilancia inm unolgica, 667
Virus
A D N con capacidad tum oral, 672
A RN con capacidad tum oral, 672

de Epstein-B arr, transform acin de linfocitos por, 790

de la influenza, 61
de la hepatitis B (H BV), 61
del sndrom e de inm unodeficiencia adquirida (SIDA)
(H IV), 61
de la vacuna, 61