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Grupo 5QM2
FUNDAMENTO
El mtodo de Lowry basa en el desarrollo de color, mediante una reaccin que se efecta
en dos etapas. La primera de ellas consiste en la formacin de un complejo colorido entre
el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptdicos en medio bsico. Cu2+ se acompleja
con 4 NH. La segunda es la reduccin del reactivo de Folin-Ciocalteu por el complejo
cobre-protena, dando finalmente un color azul, la intensidad de coloracin es
directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces peptdicos) que se lee a
590nm, la coloracin permanece estable por 2 horas. El color producido depende del
contenido de tirosina y triptfano en la protena.
El mtodo de Bradford para la determinacin de protenas implica la reaccin del azul
brillante de Coomassie G-250 con las protenas, originando un complejo colorido que se
lee a 595 nm, el color desarrollado permanece estable por 1 hora. Esta reaccin es
independiente de la composicin de aminocidos de las protenas. Este mtodo es
sensible (1-15 g), simple, rpido, barato y pocas sustancias interfieren en su
determinacin. Entre las sustancias que interfieren estn los detergentes y las soluciones
bsicas.
OBJETIVOS
RESULTADOS
Lowry Albumina
Curva de calibracin por mtodo de Lowry.
No. Tubo
Cantidad de protena (g)
A 590 nm
Serie "a"
Serie "b"
1
25
0.073
n/a*
2
50
0.111
n/a*
3
75
0.123
0.152
Replicas para el anlisis estadstico
4
100
0.157
0.161
No. Tubo
A 590 nm
Cantidad de protena
5
125
0.199
0.188
(g)
1
0.211
89.037
0.177
76.444
0.179
77.185
0.196
83.481
0.209
88.296
0.192
82.000
0.205
86.815
0.159
69.778
0.165
72.000
10
0.263
108.296
0.073
0.111
0.137
0.159
0.387
83.33
S
S^2
11.014
121.30
% C.V.
13.22
91.211414
7
75.455251
9
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Sustancia
A
Cantidad de
Tipo de Interferencia
590
protena
nm
(g)
Tris 1 M, pH 7.0
0.08
42.37
Negativa
5
Glicerol al 1%
0.05
31.63
Negativa
(v/v)
6
Detergente
0.01
16.44
Negativa
comercial 1%
5
SDS al 1.0%
0.04
27.93
Negativa
6
TCA al 5%
0.03
25.33
Negativa
9
Fenol al 1%
0.21
91.26
Positiva
7
Mercaptoetanol
0.02
19.41
Negativa
al 0.1%
3
Tris 1 M, pH 10.0
0.05
32.37
Negativa
8
Prueba "t" de Student
Urea al 5%
0.04
27.93
Negativa
61.67
6Hay diferencia significativa
(NH4)2SO4
0.03
22.74
Negativa
2
0.45
0.4
0.35
0.3
f(x)==0.75
R
0x - 0.03
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
20
40
60
80
100
120
Bradford Albumina
Curva de calibracin por mtodo de Bradford.
No. Tubo
Cantidad de protena (g)
Serie "a"
1
25
0.233
2
50
0.33
3
75
0.471
4
100
0.481
5
125
0.501
Replicas para el anlisis estadstico
No.
Tubo
A 590
nm
Cantidad de
protena (g)
0.444
93.000
174.21
30.415
0.435
172.000
S^2
925.06
0.424
167.926
17.46
0.474
186.444
0.47
184.963
0.507
198.667
0.495
194.222
0.458
180.519
0.432
170.889
10
0.493
193.481
% C.V.
195.96708
9
152.45513
3
A 590 nm
Serie "b"
0.214
0.336
0.415
0.449
0.518
0.224
0.333
0.443
0.465
0.510
No.
Tubo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
158.36
Tris 1 M,
pH 7.0
Glicerol al 1% (v/v)
Detergente comercial
1%
SDS al 1.0%
TCA al 5%
Fenol al 1%
Mercaptoetanol al
0.1%
Tris 1 M, pH 10.0
Urea al 5%
(NH4)2SO4
Hay diferencia354.22
significativa
0.927
0.932
356.07
0.921
352.00
0.324
0.877
1.013
0.967
130.89
335.70
386.07
369.04
Negativa
Positiva
Positiva
Positiva
0.97
0.975
0.908
370.15
372.00
347.19
Positiva
Positiva
Positiva
0.6
0.5
f(x) = 0x + 0.18
R = 0.93
0.4
0.3
0.2
0.1
0
20
40
60
Positiva
Positiva
Positiva
80
100
120
Lowry Hemoglobina
No. Tubo
1
2
3
4
5
0.098
0.205
0.251
0.337
0.409
80.90
5
0.273
78.965
6
0.264
76.016
S
5.576
S^2
31.10
7
0.305
89.450
8
0.25
%71.429
C.V.
6.89
9
0.296
86.501
84.8866339
10
0.276
79.948
76.90891
No.
Tubo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Tris 1 M, pH 7.0
Glicerol al 1% (v/v)
Detergente comercial
1%
SDS al 1.0%
TCA al 5%
Fenol al 1%
Mercaptoetanol al
0.1%
Tris 1 M, pH 10.0
Urea al 5%
(NH4)2SO4
0.14
0.227
0.198
35.39
63.89
54.39
Negativa
Negativa
Negativa
0.224
0.194
2.033
0.245
62.91
53.08
655.64
69.79
Negativa
Negativa
Positiva
Negativa
0.162
0.267
0.288
42.60
77.00
83.88
Negativa
Negativa
Negativa
37.28
0.45
0.4
f(x)==0.99
R
0x + 0.03
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
20
40
60
80
100
120
Bradford Hemoglobina
0.249
0.379
0.490
0.519
0.523
96.22
Replicas para el anlisis estadstico
No.
A 590 nm
Cantidad de protena
Tubo
(g)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
No.
Tubo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0.478
91.715
0.492
96.802
0.486
94.622
0.489
95.712
0.5
99.709
0.47
88.808
0.472
89.535
0.479
92.078
0.52
106.977
0.518
106.250
Efecto de sustancias no protenicas en el Mtodo de Bradford
Sustancia
A 590 nm Cantidad de protena
Tipo de Interferencia
S
6.401
(g)
S^2
40.97
Tris 1 M, pH 7.0
0.518
106.25
Positiva
%
C.V.
6.65
Glicerol al 1% (v/v)
0.505
101.53
Positiva
100.79930
Detergente comercial
0.494
97.53
Positiva
9
1%
91.642551
SDS al 1.0%
0.119
-38.74
Negativa
3
TCA al 5%
0.501
100.07
Positiva
Fenol al 1%
0.488
95.35
Positiva
Mercaptoetanol al 0.1%
0.532
111.34
Positiva
Tris 1 M, pH 10.0
0.513
104.43
Positiva
Urea al 5%
0.504
101.16
Positiva
(NH4)2SO4
0.507
102.25
Positiva
0.6
0.5
f(x) = 0x + 0.23
R = 0.85
0.4
0.3
0.2
0.1
0
20
40
60
80
100
120
- Curva de calibracin
La grafica relaciona valores de absorbancia con la concentracin conocida de nuestros
estndares, se observa que hay un aumento en el valor de absorbancia relacionado al
aumento de la concentracin, donde se podra suponer que cumple la Ley de Bouguer y
Beer; sin embargo los lmites establecidos donde el error es mnimo en el estudio
espectrofotomtrico de una sustancia estn entre 0.2 y 0.8 para la absorbancia.
Comparando los datos obtenidos, que sealan que la mxima absorbancia trabajada fue
de 0.405; podemos decir que la curva tipo posee un error considerable para la
determinacin de Hemoglobina, ya que el mtodo es poco sensible y es recomendado
para la determinacin de protenas a concentraciones mayores a 100 g/mL.
-Anlisis estadstico
De acuerdo a la tcnica, las replicas eran del tubo numero tres de la curva de calibracin,
la concentracin utilizada de protena fue de 75 g/mL, de acuerdo a las lecturas de
absorbancia las concentraciones utilizadas fueron de 80.90 g/mL en promedio. Esto nos
indica que el mtodo de lowry es menos sensible en comparacin con el mtodo de
Bradford, esto se ve reflejado en los resultados de este anlisis, esto quiere decir que
podemos tener mas margen de error en lowry, esta variacin pudo deberse a una mala
medicin de los volmenes del analista.
El coeficiente de variacin nos dio de 6.89, podemos decir que existe error en cuanto a
precisin en los resultados, pues el valor mximo aceptado es del 5%.
-Interpretacin de los resultados del efecto de las interferencias.
Segn los lmites de confianza calculados, obtenemos que una interferencia positiva es
aquella que aumenta la lectura de absorbancia sobre los intervalos de confianza para la
concentracin y una interferencia negativa aquella que provoca una disminucin en los
valores de absorbancia sobre los lmites de confianza para la concentracin.
Y de acuerdo a la bibliografa consultada los agentes que acidifican la reaccin en este
caso el Tris, el EDTA y los reductores de Cu como el mercaptoetanol, sern interferentes
de la reaccin. El fenol por su estructura dara falsos positivos.
DISCUSION DE RESULTADOS DE BRADFORD
-Curva de calibracin
Al igual que en el mtodo de Lowry, se observa que hay un aumento en el valor de
absorbancia relacionado al aumento de la concentracin de la Hemoglobina, sin embargo
aqu la pendiente es mayor, esto nos indica que la sensibilidad de este mtodo es mayor
que en el mtodo de Lowry, ya que permite trabajar con concentraciones ms bajas de
protena.
-Anlisis estadstico.
A pesar de que el mtodo de Bradford es ms sencillo y rpido, el % de coeficiente de
variacin obtenido fue mayor que en Lowry, que podemos adjudicarlo a la sensibilidad del
mtodo.
-Comparacin entre los dos mtodos para Hemoglobina
Albumina
Diferenci
a
3.963
Di - D-
(Di - D-)2
93
M de
Estndar(L)
89.037
-86.914
172
76.444
95.556
4.679
3
4
167.926
186.444
77.185
83.481
90.741
102.963
-0.136
12.086
5
6
7
184.963
198.667
194.222
88.296
82.000
86.815
96.667
116.667
107.407
5.790
25.790
16.530
180.519
69.778
110.741
19.864
9
10
170.889
193.481
72.000
108.296
98.889
85.185
8.012
-5.692
7554.0498
3
21.888882
1
0.0185464
146.05975
8
33.520669
665.1241
273.24702
2
394.58732
4
64.192144
32.402237
1
No.
Tubo
1
M. de Prueba (B)
90.877
Hemoglobina
No. Tubo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
M. de
Prueba (B)
91.715
96.802
94.622
95.712
99.709
88.808
89.535
92.078
106.977
106.25
M de
Estndar(L)
83.552
86.501
79.948
76.671
78.965
76.016
89.450
71.429
86.501
79.948
Diferencia
Di - D-
(Di - D-)2
8.163
10.301
14.674
19.041
20.744
12.792
0.085
20.649
20.476
26.302
-7.159
-5.021
-0.648
3.719
5.422
-2.530
-15.237
5.327
5.154
10.980
51.2479783
25.2069797
0.41935385
13.8306978
29.4022768
6.39952068
232.15219
28.3814952
26.5672692
120.569725
15.322
n <t tablas
t calculada= D
SD
37.28 > 2.262 Existe diferencia significativa en la exactitud entre los dos mtodos.
50.94 > 2.262 Existe diferencia significativa en la exactitud entre los dos mtodos.
Fcalculada =
S 2 mayor
< F tablas
S 2 menor
1.31< 3.78 No existe diferencia significativa en precisin entre los dos mtodos.
Mtodo
Lowry
Bradford
Mtodos colorimtricos
Rango de
Ventajas
sensibilidad
(g)
25-100 a 500 Tiene bastante
nm
Sensibilidad
2-30 a 660 nm
Presenta alta estabilidad
1-2 a 750 nm
1-15
Muy sensible
Rpido
y
desarrollo
de
fcil
Desventajas
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFA
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Proteinas_8075.pdf
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/27%20M%C3%89TODOS%20PARA%20LA
%20CUANTIFICACI%C3%93N%20DE%20PROTE%C3%8DNAS.pdf