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QUIMICA ANALITICA E INTRUMENTAL

Espectrometra molecular por

luminiscencia
Espectroscopia de fluorescencia.

Espectroscopia de fosforescencia.

Quimioluminiscencia.
Evelyn Atehortua.
Danilo Olaya Bernal.

La fluorescencia y fosforescencia se parecen en que la

excitacin se consigue mediante la absorcin de fotones y
por eso se alude a ellas como fotoluminiscencia.
La quimioluminiscencia se basa en la radiacin que emite
una especie excitada que se forma en el curso de una
reaccin qumica.
La medicin de la intensidad de la fotoluminiscencia
facilita la determinacin cuantitativa de un conjunto de
especies inorgnicas y orgnicas importantes cuando
estn presentes en cantidades de trazas.
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Espectroscopia de fluorescencia.
Tambin es llamada fluorometra o espectrofluorimetra.
La fluorescencia es un proceso de emisin en el cual las
molculas son excitadas por la absorcin de radiacin
electromagntica y al relajarse al estado basal liberan el
exceso de energa en forma de fotones.

Una de las caractersticas ms atractivas de los mtodos de

fluorescencia es su sensibilidad, pero estos mtodos se
aplican muy poco debido al nmero relativamente limitado
de sistemas qumicos que se pueden hacer fluorescer.
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La fluorescencia molecular se mide excitando una muestra a

una longitud de onda de absorcin y midiendo la emisin a
una longitud de onda mayor llamada longitud de onda de
emisin o de fluorescencia.
Por ejemplo, la forma reducida de la coenzima
dinucletido de nicontinamida y adenina absorbe
radiacin a 340 nm, y la molcula emite radiacin en
forma de fotoluminiscencia con un mximo de emisin de
465 nm.
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Despus los electrones vuelven al estado

fundamental emitiendo radiacin de estas dos
mismas longitudes de onda en todas las
direcciones, este tipo de fluorescencia, en la
cual la radiacin absorbida se vuelve a emitir sin
cambio de frecuencia se le conoce como
fluorescencia de resonancia.

Espectroscopia de fosforescencia.
La fosforescencia es un fenmeno por el cual ciertas sustancias tienen
la propiedad de absorber energa y almacenarla para poder trasmitirla
posteriormente.

En este mtodo al igual que el de espectroscopia por

fluorescencia, las molculas de analito se excitan para dar una
especie cuyo espectro de emisin suministra informacin para el
anlisis cualitativo y cuantitativo.
La fluorescencia y la fosforescencia se parecen en que la excitacin
se consigue mediante la absorcin de fotones. Como
consecuencia, con frecuencia se alude a los dos fenmenos con el
trmino ms general de fotoluminiscencia.
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La fluorescencia se diferencia de la fosforescencia en que las

transiciones electrnicas responsables de la fluorescencia no
conllevan un cambio en el espn del electrn. Como
consecuencia, la fluorescencia presenta una vida corta
cesando la luminiscencia casi inmediatamente (10-5S).

Por el contrario, las emisiones de fosforescencia estn

acompaadas por un cambio en el espn del electrn, que
hace que la radiacin se mantenga durante un tiempo
despus de haber acabado la irradiacin, a menudo varios
segundos e incluso minutos.
(ver video.)
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Teora de la fluorescencia y fosforescencia.

La fluorescencia tiene lugar en sistemas qumicos gaseosos,
lquidos y solidos, tanto sencillos como complejos.
Muchas
especies
moleculares
tambin
presentan
fluorescencia de resonancia, pero lo mas frecuente es
encontrar bandas de fluorescencia o de fosforescencia
molecular centradas en longitudes de onda mas largas que la
lnea de resonancia.
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Variables que afectan la fluorescencia y la

fosforescencia.
Tanto la estructura molecular como el entorno qumico
determinan que una sustancia sea o no luminiscente. Estos
factores tambin determinan la intensidad de emisin
cuando tiene lugar la luminiscencia. Adems de otros
factores.

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Rendimiento cuntico

Es simplemente la relacin entre el nmero de molculas que

emiten luminiscencia respecto al nmero total de molculas
excitadas.
Para molculas altamente fluorescentes, la eficacia cuntica,
bajo determinadas condiciones, se aproxima a la unidad. Las
especies qumicas que no presentan una fluorescencia
apreciable tienen eficacias que se aproximan a cero.
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Fluorescencia y estructura.
La fluorescencia mas intensa y la mas til es la de los
compuestos que contienen grupos funcionales aromticos con
transiciones de baja energa. Los compuestos que contienen
grupos carbonilo en estructuras alifticas y alicclicas o
estructuras con dobles enlaces altamente conjugados, la
mayora de los hidrocarburos aromticos no sustituidos son
fluorescentes en solucin; la eficacia cuntica aumenta de
ordinario en relacin con la cantidad de anillos y con su grado
de condensacin.
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Efectos de la temperatura y del disolvente

La fluorescencia disminuye en la mayora de las molculas al
aumentar la temperatura ya que cuando la temperatura es elevada
aumenta la probabilidad de desactivacin por conversin externa.
Una disminucin en la viscosidad del disolvente tambin aumenta
la probabilidad de la conversin externa y conduce al mismo
resultado.
La fluorescencia de una molcula se reduce en presencia de
disolventes que contienen tomos pesados o de solutos con
dichos tomos en su estructura cuando se desea resaltar la
fosforescencia, se incorporan a los disolventes compuestos que
contienen tomos pesados.
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Efecto del pH en la fluorescencia.

La fluorescencia de un compuesto aromtico con
sustituyentes cidos o bsicos en el anillo depende del pH. Es
probable que tanto la longitud de onda como la intensidad de
emisin sean diferentes en las formas protonadas y no
protonadas del compuesto.
Los cambios en la emisin de los compuestos de este tipo
surgen del distinto nmero de especies resonantes asociadas
con las formas acidas y bsicas de las molculas.
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Por ejemplo, la anilina tiene varias formas resonantes, pero el

ion anilinio solo tiene una. Es decir, Las formas resonantes
adicionales ocasionan un primer estado excitado mas estable;
la consecuencia es una fluorescencia en la regin ultravioleta.

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Efecto del oxgeno disuelto

La presencia de oxgeno disuelto suele reducir la intensidad de
fluorescencia de una disolucin. Este efecto puede ser el
resultado de una oxidacin de las especies fluorescentes.

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Instrumentos para medir fluorescencia y fosforescencia.

Los componentes de los instrumentos para medir la
fotoluminiscencia son similares a los de los fotmetros o
espectrofotmetros ultravioleta/visible.
Casi todos los instrumentos para la medicin de la
fluorescencia utilizan equipo ptico de doble haz, para
compensar las fluctuaciones en la potencia radiante.
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Otros son los Fluormetros de filtro; Utilizan filtros para

aislar la luz incidente y la luz fluorescente.

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Espectrofluormetros. Usan monocromadores de retculo

de difraccin para aislar la luz incidente y la luz
fluorescente.

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Ambos tipos de instrumentos utilizan el siguiente esquema:

La fluorescencia se mide ms a menudo en un ngulo de 90 en

relacin a la luz de excitacin. Esta geometra se utiliza en lugar
de colocar el sensor en la lnea de la luz de excitacin en un
ngulo de 180 a fin de evitar la interferencia de la luz de
excitacin transmitida.
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Algunos instrumentos son hbridos porque usan un filtro

para seleccionar la longitud de onda de excitacin y un
monocromador para elegir la longitud de onda de emisin;
a menudo se les llama todava Espectrofluormetros.

Los verdaderos Espectrofluormetros facilitan la produccin

de un espectro de excitacin de la fluorescencia o un
espectro de emisin de fluorescencia.

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Componentes de los Fluormetros y de los

Espectrofluormetros.
Fuentes la magnitud de la seal de salida en las mediciones
de luminiscencia es directamente proporcional a la potencia
de la fuente radiante. Por esta razn, se usan fuentes mas
intensas en los mtodos luminiscentes, y ya no las lmparas
de tungsteno o deuterio que se emplean en las mediciones
de absorcin.
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Lmparas La mas comn para los Fluormetros de filtro es la

lmpara de vapor de mercurio a baja presin equipada con una
ventana de slice fundida. Esta fuente emite lneas tiles para
producir la fluorescencia a 254, 302, 313, 546, 578, 691 y 773 nm.
Para los Espectrofluormetros, en los que se requiere una fuente de
radiacin continua, se utiliza normalmente una lmpara de arco de
xenn de alta presin, de 75 a 450 W. Estas requieren una fuente de
alimentacin potente, capaz de producir corrientes continuas de 5 a
20 A y de 15 a 30 V. El espectro de una lmpara de arco de xenn es
continuo desde alrededor de 300 a 1300 nm.
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Filtros y monocromadores.

Los filtros de interferencia y de absorcin se utilizan en los

Fluormetros para seleccionar la longitud de onda tanto del haz de
excitacin como de la radiacin fluorescente resultante.
Los Espectrofluormetros estn equipados con al menos uno y a
veces dos monocromadores de red.

(Ver imagen)
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Detectores.

Las seales de emisin de luminiscencia son de baja intensidad. Por

tanto, se requieren transductores o detectores sensibles.
Los tubos fotomultiplicadores son los transductores que mas se
utilizan en instrumentos de fluorescencia sensibles. Con frecuencia
funcionan en la modalidad de recuento de fotones para mejorar la
relacin seal-ruido con este mismo fin, a veces los transductores se
refrigeran.
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Celdas y compartimientos para las celdas.

Para mediciones de fluorescencia se utilizan celdas o

cubetas tanto cilndricas como rectangulares, fabricadas con
vidrio o con slice. Se debe tener cuidado en el diseo del
compartimiento de la celda para reducir la cantidad de
radiacin dispersada que llega hasta el detector.
A menudo se introducen deflectores en el compartimiento
con este propsito. Mas importante aun que en las medidas
de absorbancia es evitar dejar huellas dactilares en las
cubetas, ya que la grasa de la piel con frecuencia manifiesta
fluorescencia.
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Calibracin del instrumento.

Debido a las variaciones de la intensidad de la fuente, la

sensibilidad y otras variables instrumentales, es imposible
obtener exactamente las mismas lecturas con un Fluormetro o
un espectrofotmetro para una solucin o un conjunto de
soluciones. Por esta razn, es una practica habitual calibrar el
instrumento a un nivel de sensibilidad reproducible. La
calibracin se efecta casi siempre con una solucin patrn de
un fluoroforo estable.
El reactivo mas comn para este cometido es una disolucin
patrn de sulfato de quinina cuya concentracin sea casi 105 M.
Por lo general se excita con una radiacin de 350 nm y emite
radiacin a 450 nm.
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Aplicaciones de los mtodos fotoluminiscentes:

La espectrometra de fluorescencia se utiliza en anlisis

bioqumicos, mdicos, qumicos y de investigacin de
compuestos orgnicos. Tambin se ha utilizado para
diferenciar los tumores malignos de piel de los benignos.
La fluorescencia tambin puede utilizarse para reorientar
los fotones.

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QUIMIOLUMINISCENCIA

La aplicacin de la quimioluminiscencia a la qumica

analtica es reciente. Las reacciones qumicas que producen
quimioluminiscencia son pocas, lo que limita el
procedimiento a un numero relativamente pequeo de
especies.

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La quimioluminiscencia se produce cuando una reaccin

qumica genera una especie electrnicamente excitada que
emite luz cuando vuelve al estado fundamental.
Las reacciones quimioluminiscentes se producen en varios
sistemas biolgicos, en los que el proceso se suele
denominar bioluminiscencia. Entre los ejemplos de especies
que presentan bioluminiscencia estn las lucirnagas,
ciertas medusas, bacterias, protozoos y crustceos.
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GRACIAS.

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