DETERMINACIN DE AMINAS BIOGENAS

(HISTAMINA)
Mtodo HPLC
Seccin Qumica de
Alimentos y Nutricin

1.

ME-711.04-070

Emisin:
2002
Versin: 3
Actualizacin:
05-05-2014
Pgina 1 de 8

OBJETIVO

Determinar histamina y otras aminas bigenas por HPLC con detector UV.
2.

CAMPO DE APLICACIN Y ALCANCE

El mtodo es aplicable a los alimentos sospechosos de contener histaminas y otras aminas

bigenas, principalmente productos hidrobiolgicos frescos o procesados, harina de pescado,
quesos y cecinas, recepcionados en la Seccin Qumica de Alimentos.
3.

FUNDAMENTO

Extraccin de aminas bigenas en cido tricloroactico, derivatizacin precolumna mediante

cloruro de dansilo y posterior anlisis de los respectivos derivados dansilados por HPLC con
detector UV.
4.

DOCUMENTOS DE REFERENCIAS

Norma Chilena NCh 2637.Of 2001 Productos hidrobiolgicos Determinacin de histamina y

otras aminas bigenas- Mtodo HPLC con detector UV.
5.

TERMINOLOGA

5.1

Aminas bigenas: compuestos alergnicos generados por la degradacin de

aminocidos que estn contenidos en pescados y otros alimentos como derivados
lcteos, cecinas, hgado de vacuno y ave, cacao, vinos y cerveza, los que al ser
consumidos pueden causar reacciones alrgicas o cuadros de intoxicacin.

5.2

HPLC

6.

: Cromatografa lquida de alta resolucin

REACTIVOS, INSUMOS Y EQUIPOS

6.1

REACTIVOS

6.1.1

Acetona p.a.

6.1.2

Solucin de bicarbonato de sodio 0.25 M (PM=84).

6.1.3

Cloruro de dansilo 10 mg/mL. Solucin de cido tricloroactico (TCA) al 5% con

estndar interno de efedrina 250 ppm

6.1.4

Fase mvil: metanol HPLC y agua desionizada y filtrada (se usa gradiente).

DUEO DE PROCESO:
Encargado Laboratorio de
Toxinas Marinas y
Micotoxinas

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6.1.5

6.2

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Estndares:
Aminas bigenas:

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Putrecina
Cadaverina
Tiramina
Histamina
Espermidina

INSUMOS

6.2.1

Tubos de centrfuga con tapa rosca de 50 mL

6.2.2

Papel filtro Whatman N 1, 4 o equivalente

6.2.3

Filtros de membrana de 0.22 m

6.2.4

Viales con tapa de 2 a 3 mL

6.2.5

Columna C-18 fase reversa, 125-4 (5 m) o equivalente

6.3

EQUIPOS

6.3.1

Equipo HPLC con detector UV de longitud de onda variable.

6.3.2

Balanza analtica 0.0001 g.

6.3.3

Balanza de precisin 0.01 g

6.3.4

Agitador mecnico de tubos

6.3.5

Bao termorregulado a 60 C

6.3.6

Centrfuga 2000 a 3000 rpm

6.3.7

Micropipetas de 100 1000 L

7.

Emisin:
2002
Versin: 3

DESCRIPCIN DE ACTIVIDADES

Antes de comenzar a trabajar con las muestras, asegurarse de que todo lo mencionado en
punto materiales, insumos y reactivos est disponible.
A continuacin se describe el mtodo analtico, es crucial si no se dispone de prctica
con el mtodo leer completo este procedimiento antes de comenzar a trabajar.
Es necesario utilizar guantes para este trabajo analtico como medida de bioseguridad.

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7.1

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MUESTREO / MUESTRA

7.1.1

Chequear que antecedentes de la muestra en gua de ingreso coincidan con los

rotulados en la muestra.

7.1.2

Una vez recibida la muestra en el laboratorio se debe realizar el anlisis lo ms

pronto posible. En caso de ser necesario postergar el anlisis, sta se debe
mantener a 18 C si la muestra proviene de producto congelado; entre 0 C y 4 C
si la muestra corresponde a un producto fresco refrigerado, no debiendo superar
ms de 36 h en esta condicin y a temperatura ambiente si la muestra corresponde
a pescado seco, harina de pescado u otro producto con baja humedad.

7.1.3

Al finalizar el trabajo y una vez informada la muestra, si la cantidad restante lo

permite, almacenar aproximadamente 20 g de muestra como contramuestra y
eliminar lo restante en bolsa de eliminacin de desechos de laboratorio (Bolsa roja
y/o amarilla). Anotar fecha de eliminacin de la muestra en los antecedentes de la
misma en Registro 711.00-074 Registro de ingreso de muestras al Laboratorio de
Toxinas Marinas y Micotoxinas

7.2

PREPARACIN DE REACTIVOS

7.2.1

Solucin de bicarbonato de sodio 0.25 M (PM=84). Pesar 5.25 g de NaHCO 3 y llevar

a un matraz de 250 mL, aforando con agua desionizada filtrada.

7.2.2

Cloruro de dansilo 10 mg/mL. Pesar 50 mg de cloruro de dansilo y llevar a un matraz

de 5 mL aforando con acetona p.a. Guardar refrigerado en envase mbar bien
cerrado.

7.2.3

Solucin de cido tricloroactico (TCA) al 5% con estndar interno de efedrina 250

ppm. Pesar 25 g de TCA en un matraz aforado de 500 mL, agregar 0.125 g de
efedrina p.a. y aforar con agua para anlisis.

7.2.4

Estndares:
Aminas bigenas:

7.2.5

Putrecina
Cadaverina
Tiramina
Histamina
Espermidina

Preparar una solucin patrn de 1000 mg/L de cada una de las aminas bigenas:
Pesar 50 mg de cada una y aforar a 50 mL con solucin de TCA 5% con estndar
interno.

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7.3

PREPARACIN DE CURVA DE CALIBRACIN

7.3.1

Preparar a partir de las soluciones patrones, una mezcla que contenga al menos 3
niveles desde 50 a 500 g/mL para la curva de calibracin. Aforar cada vez con TCA
5% con estndar interno.

7.4

PREPARACIN DE CONTROLES

7.4.1

Preparar un fortificado al lmite de cuantificacin del mtodo.

7.5

PREPARACIN DE LA MUESTRA O ETAPAS PREVIAS A REALIZAR LA

MEDICIN

7.5.1

Conservas: Si el lquido de cobertura es comestible, se recomienda homogeneizar

todo el contenido del envase de lo contrario drenar el producto y homogeneizar en
procesadora de alimentos a alta velocidad durante 60 s.

7.5.2

Congelados: Descongelar dejando a temperatura ambiente por un mximo de 4 h y

drenar.

7.5.3

Productos pesqueros salados: Preparar una solucin saturada de cloruro de sodio y

sumergir en ella el producto en salazn algunos segundos para retirar la sal superficial.
Sacar la muestra de la solucin y secar con papel absorbente, eliminar las espinas,
trozar y preparar el homogeneizado del producto en procesadora de alimentos a alta
velocidad durante 60 s.

7.5.4

Productos seco-salados, apanados, ahumados, quesos y derivados crnicos: Preparar

el homogeneizado del producto en procesadora de alimentos a alta velocidad durante
60 s.

7.5.5

Pescado fresco: limpiar, descamar, eviscerar y preparar el homogeneizado durante 60

s como se indica a continuacin:
a) Pescados de tamao pequeo ( 15 cm): en su totalidad.
b) Pescados de tamao mediano: Sacar y descartar cabeza, cola, aletas y espinas;
cortar en filetes para obtener toda la carne y piel.
c) Pescados de tamao grande: De cada uno de ms de tres pescados cortar tres
rebanadas en sentido transversal de 2.5 cm cada una, detrs de la aleta pectoral,
en el medio y despus de la abertura anal. Eliminar las espinas.

7.5.6

Mariscos frescos refrigerados y/o vivos: lavar, drenar y desconchar.

7.5.7

Homogeneizar la muestra en procesadora de alimentos de alta velocidad por un

minuto.
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7.5.8

Pesar 5 g en un tubo de centrfuga de 50 mL y agregar exactamente 10 mL de TCA

5% con estndar interno y tapar.

7.5.9

Agitar por 30 min en agitador mecnico.

7.5.10 Centrifugar a 2000-3000 rpm por 15 min.

7.5.11 Filtrar el sobrenadante a travs de un embudo con papel filtro.
7.5.12 Filtrar el extracto a travs de filtro 0.22 m.
7.5.13 Realizar reaccin de dansilacin de la siguiente manera:
En un vial de vidrio con tapa adicionar consecutivamente:
100 L de extracto o soluciones estndares
400 L de bicarbonato de sodio 0.25 M (pH 8 a 9)
200 L de solucin de cloruro de dansilo
300 L de acetona p.a.
7.5.14 Cerrar hermticamente el vial e incubar a 60 C en bao termorregulado por 1 hora.
7.5.15 Enfriar a temperatura ambiente.
7.5.16 Inyectar 20 L de la muestra en HPLC.
7.5.17 Utilizar como blanco solucin de TCA 5% con estndar interno y dansilar de igual
forma que los estndares y las muestras
7.6

ANLISIS DE LA MUESTRA O REALIZACIN DE LA MEDICIN. CONDICIONES

INSTRUMENTALES.

7.6.1 CONDICIONES CROMATOGRFICAS

Flujo de la fase mvil: 1 mL/min
Longitud de onda: 254 nm
Volumen de inyeccin: 20 L
Temperatura del horno de columna: 25C
Programa de gradiente de fase mvil
Tiempo (min)
Metanol (%)
0
70
20.0
75
20.1
100
22.0
100
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Agua (%)
30
25
0
0

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22.1
30

70
70

30
30

7.6.1

Estabilizar por 15 minutos.

7.6.2

Todas las soluciones deben sonicarse si el equipo HPLC no cuenta con desgasificador
on line.

7.6.3

Limpiar la jeringa y el inyector con agua despus de cada inyeccin.

7.6.4

Al final del trabajo lavar la columna con: 70% metanol y 30% agua por 15 a 30 min.

7.6.5

Los tiempos de retencin aproximados son:

Amina bigena

7.7

Tiempo de retencin (min)

Efedrina

4a6

Putrecina

6a7

Cadaverina

7a9

Histamina

12 a 14

Tiramina

19 a 21

Espermidina

22 a 25

CLCULO DE RESULTADOS

7.7.1

Calcular el nivel de histamina en g/mL entregado por el HPLC utilizando estndar

interno usando la siguiente frmula:
Cm = {(Am/Asi)-b} / m
Cm

= Concentracin de la amina bigena en el HPLC g/mL

Am

= rea de la amina bigena de la muestra

= Pendiente de la curva de calibracin

= Intercepto de curva de calibracin

Asi

= rea del estndar interno

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7.7.2

La concentracin total de aminas bigenas se realiza sumando las concentraciones

de cada amina bigena.

7.7.3

Para determinar la concentracin de cada amina bigena en la muestra, usar la

siguiente frmula:
C = Cm x 10
g
Donde:
C

= concentracin de amina biognica en mg/kg, de la muestra

Cm = concentracin de amina biognica de la muestra en g/mL obtenida de la

curva de calibracin
g

7.8

= peso de la muestra en gramos

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DEL ENSAYO

Se efectuarn controles sistemticos y peridicos para comprobar la validez de los
ensayos realizados con el mtodo de ensayo recogido en este procedimiento. Los
controles de calidad quedan agrupados en tres niveles de control:
a. Nivel I: Ensayos de intercomparacin, segn disponibilidad.
b. Nivel II: Materiales de referencia sin certificacin externa y muestras fortificadas
por el analista.

7.9

EXPRESIN DE LOS RESULTADOS

La forma como se expresan los resultados en el informe de ensayo es en mg/100g
de Histamina.

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8.

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REGISTRO

IDENTIFICACION

RGG-700.00-034
Registro
preparacin de
soluciones
estndares puros
RG-711.00-080
Registro de
anlisis de Toxinas
marinas y
micotoxinas

9.

RESPONSABLE

TIEMPO

Tcnico y
profesional del
laboratorio

5 aos

Tcnico y
profesional del
laboratorio

5 aos

ALMACENAMIENTO
LUGAR
MEDIO
RESPONSABLE/
SOPORTE
RECUPERACION

Papel
Laboratorio de Toxinas
marinas y micotoxinas/
Carpeta de estndares

Papel
Laboratorio de Toxinas
marinas y micotoxinas/
Cuaderno foliado

DISPOSICION

Picado en
trozos, basura
normal

Picado en
trozos, basura
normal

TABLA DE MODIFICACIONES

VERSION

10.

PRINCIPALES
PUNTOS
MODIFICADOS

FECHA

05-05-2014

05-05-2014

--7.6

CUADRO DE RESPONSABILIDADES

Ejecuta el mtodo

Elabora el informe de
resultados

Tcnico o Encargado Encargado

de Laboratorio
Laboratorio

11.

RESUMEN DE MODIFICACIONES

Se modifica documento a nuevo formato institucional,

pasa de PRT a ME
Se agregan condiciones cromatogrficas

Aprueba el informe de resultados

de Jefe de Seccin Qumica de Alimentos y Jefe

de Subdepartamento Alimentos y Nutricin

ANEXOS

No Aplica
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