HIDROLISIS DE LOS LPIDOS DE LA LECHE CON LIPASA Y SALES BILIARES

Objetivo general:

Verificar la actividad enzimtica de la enterasa lipasa en la hidrolisis y

desnaturalizacin de los lpidos.

Objetivo Especficos.

Comprobar in vitro la importancia de las sales biliares (tauroclorato de

sodio) en la digestin de los lpidos.
Establecer la efectividad de la hidrolisis de las enterasas en presencia de
sales biliares haciendo usos de los clculos qumicos.
Observar la actividad de la enzima lipasa indirectamente por titulacin de
los cidos grasos liberados utilizando como base al hidrxido de potasio.

Introduccin
En las clases de enzimas que catalizan la hidrlisis de diversos steres hay
diferencia entre las lipasas y las esterasas. Esta diferencia se basa en su
especificidad preferencial y grasas, o sea triglicridos de cidos grasos, de cadena
larga, mientras que los substratos naturales de las esterasas, son los esteres
sencillos de cidos de bajo peso molecular. Sin embargo las dos clases de
enzimas son sumamente inespecficas en cuanto a su accin, y la naturaleza del
cido graso o del alcohol tiene efecto no en la especificidad sino en la velocidad
de reaccin.
La hidrlisis de los triglicridos que consumen los animales superiores se lleva a
cabo principalmente en el intestino delgado, por medio de enzimas lipolticas
elaboradas en el pncreas. Las lipasas pancreticas existen en dos tipos: las
especficas para romper la unin ster en la posicin alfa o alfa prima de los
triglicridos, y las especficas para las uniones beta. La hidrlisis completa de los
triglicridos procede entonces por pasos. Primero se hidrolizan rpidamente las
uniones alfa y alfa prima, luego lentamente se rompe las uniones beta.

Marco terico.
Lipasa:
La lipasa (EC.3.1.1.3) (triacil glicerol acil hidrogenasa). Tambin llamada
antiguamente esteapsina, extrada de diferentes fuentes biolgicas, contiene
siempre diversas fracciones proteicas de muy diversos pesos moleculares, que
van desde 39,000 hasta 200,000, todas ellas con actividad lipolca. Estas
esterasas hidrlisis substratos emulsificador, y no ataca a substratos en verdadera
solucin. Se cree que esto se debe a que la enzima se absorbe a su substrato
emulsificador, y a la velocidad inicial de reaccin est en funcin del nmero de
molculas de enzima adsorbidas en la interfase. Se le llama Pancreatina a un
extracto de pncreas con fuerte actividad lipolitica. El mtodo titrimtrico para
determinar la accin de la lipasa, consiste en estimar por titulacin la cantidad de
cidos grasos liberados de los steres.
La triacilglicerol lipasa cataliza la hidrlisis de los steres de glicerol con cidos
grasos de cadena larga. Acta sobre los enlaces ster de los carbonos 1 y 3. El 2monoacilglicrido resultante isomeriza lentamente a 3-monoacilglicrido, lo que
permite la posterior hidrlisis del tercer cido graso por la lipasa. Para que la
enzima acte, el sustrato debe estar emulsionado con sales biliares u otros
emulgentes. Asimismo, precisa de otra protena denominada colipasa.
La lipasa es producida mayoritariamente por las clulas acinosas del pncreas y
es vertida al duodeno con el jugo pancretico, con la funcin fisiolgica de
hidrolizar las grasas en el intestino delgado para facilitar su absorcin. Por el
contrario su concentracin en la sangre es muy escasa.
La mayor parte de la lipasa presente en el plasma sanguneo procede del
pncreas aunque tambin contienen lipasa el hgado, tejido adiposo, mucosa
intestinal y otros. Debido a su pequea masa, filtra en el glomrulo renal, pero es
completamente reabsorbida en los tbulos, por lo que es indetectable en orina. No
se han descrito formas moleculares de inters para el laboratorio clnico.
Como muestra debe emplearse suero ya que existen dudas sobre el posible efecto
interferente de los anticoagulantes. La lipasa es muy estable en suero, por lo que
puede almacenarse varios das a temperatura ambiente. La concentracin
cataltica de lipasa puede medirse con mtodos titrimtricos, turbidimtricos y
colorimtricos. Tambin existen varios tipos de inmunoanlisis para medir su
concentracin de masa. De los mtodos antes mencionados, las ms modernas y
con mejores prestaciones son los colorimtricos, en los que se acoplan varias
reacciones enzimticas a la principal hasta conseguir la formacin de un producto
coloread.

Metodologa:
Materiales:

5 Tubos de ensayo - (gradilla)

6 Erlenmeyer de 100 ml
2 Pipetas de 5 y 10 ml
1 Probeta de 50 ml
1 Bureta de 25 ml
1 Pipeteador.
1 Pipeta volumtrica 10 ml
1 vaso precipitado de 250 ml
1 Pinzas de tubo de ensayos
1 Termmetro
1 Cubeta de aluminio
Placa de calentamiento.
Bao de agua termosttica.

Reactivo:

Extracto pancretico 1% lipasa

Hidrxido de potasio 0,05 M
Fenolftalena al 0,1% en etanol
Etanol 96%
Tauroclorato de sodio al 1%
Agua destilada.

Diagrama de proceso.
Ensayo 1: Extracto pancretico y Lipasa.
Preparacin del blanco.
En un erlenmeyer
agregar 10 ml de
leche homogenizada
Calentar 3 ml de
extracto pancretico
Adicionar 2 ml de
tauroclorato de
sodio y mezclar en
el erlenmeyer

Calentar durante
20 minutos a 37C

Agregar 3 gotas de
fenolftalena

Titular con
Hidrxido de

Accin del extracto pancretico lipasa sobre los lpidos de la leche.

En 4 erlenmeyer
agregar 10 ml de
leche
homogenizada en
cada
Titular con KOH al 0,05 %
agitando contantemente.

A los 4 erlenmeyer agregar 3 ml

de extracto pancretico 1% y
calentar a 37C

Cada 20 minutos retirar uno a

uno los erlenmeyer y agregar
10 ml de etanol con 3 gotas de

Ensayo 2: Extracto pancretico lipasa ms tauroclorato de sodio.

Preparacin del Blanco
En 4 erlenmeyer
agregar 10 ml de
leche
homogenizada en
cada
Titular con KOH al 0,05 %
agitando contantemente.

A los 4 erlenmeyer agregar 3 ml de

extracto pancretico 1%, a cada
erlenmeyer agregar 2 ml de
tauroclorato y mezclar. Calentar a

Cada 20 minutos retirar uno a

uno los erlenmeyer y agregar
10 ml de etanol con 3 gotas de
fenolftalena

Accin del extracto pancretico (lipasa) y el tauroclorato en la hidrolisis de los

lpidos de la leche.
En 4 erlenmeyer
agregar 10 ml de
leche
homogenizada en
cada

A los 4 erlenmeyer agregar 3 ml de

extracto pancretico 1% y 2 ml de
tauroclorato 1%, mezclar. Calentar a
bao maria a 37C

Cada 20 minutos retirar uno a

uno
Titular con KOH al 0,05 % los erlenmeyer y agregar 10
agitando contantemente.ml de etanol con 3 gotas de
fenolftalena

Ensayo 3: tauroclorato:
Preparacin del Blanco
En 4 erlenmeyer
agregar 10 ml de
leche
homogenizada en
cada

Calentar en ebullicin 3 ml de
extracto pancretico 1%, aadir a la
leche el extracto acompaado de 2 ml
de tauroclorato 1%.

Titular con KOH al 0,05 %

agitando contantemente.

Calentar a 37C en bao mara,

retirar cada tubo en intervalos de 20
min y agregar 10 ml de etanol con 3
gotas de fenolftalena.
Accin del tauroclorato de sodio en la hidrolisis de los lpidos.
En 4 erlenmeyer
agregar 10 ml de
leche
homogenizada en
cada

A los 4 erlenmeyer agregar 2 ml de

extracto de tauroclorato 1%

Titular con KOH al 0,05 %

agitando contantemente.

Calentar a 37C en bao mara,

retirar cada tubo en intervalos de 20
min y agregar 10 ml de etanol con 3
gotas de fenolftalena.

Resultados:
Tabla N1. Lpidos de la leche ms extracto pancretico lipasa.
Erlenmeye
r

Tiempo
minutos

Blanco
1
2
3
4

20
20
40
60
80

volumen base volumen base

consumida(ml) consumida(lts)
de KOH 0,05M de KOH 0,05M
9
34
24.35
9.75
7.5

0.009
0.034
0.02435
0.00975
0.0075

Moles de
cido
presentes

Moles de cido
producidas por
la hidrlisis

0.00045
0.00170
0.00122
0.00049
0.00038

0.0000000
0.0012500
0.0007675
0.0000375
-0.0000750

Tabla N2. Lpidos de la leche ms extracto pancretico ms tauroclorato.

Erlenmeye
r

Tiempo
minutos

Blanco
1
2
3
4

20
20
40
60
80

volumen base volumen base

consumida(ml) consumida(lts)
de KOH 0,05M de KOH 0,05M
15.6
19.5
22.4
24.7
25.2

0.0156
0.0195
0.0224
0.0247
0.0252

Moles de
cido
presentes

Moles de cido
producidas por
la hidrlisis

0.00078
0.00098
0.00112
0.00124
0.00126

0.0000000
0.0001950
0.0003400
0.0004550
0.0004800

Moles de
cido
presentes

Moles de cido
producidas por
la hidrlisis

0.0005
0.0005
0.0005
0.0005
0.0005

0
0
0
0
0

Tabla N3. Lpidos de la leche ms tauroclorato.

Erlenmeye
r

Tiempo
minutos

Blanco
1
2
3
4

20
20
40
60
80

volumen base volumen base

consumida(ml) consumida(lts)
de KOH 0,05M de KOH 0,05M
10
10
10
10
10

0.01
0.01
0.01
0.01
0.01