Guia Microbiologia Dbio1020 v3 Final

Laboratorio de Microbiologa General
DBIO 1020
GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS
2015
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NORMATIVAS GENERALES EN EL TRABAJO

DE LABORATORIO
Es muy importante para su seguridad y la de sus compaeros observar siempre las siguientes medidas
mnimas de seguridad.
Es obligatorio concurrir al laboratorio con delantal blanco, lpiz dermogrfico o plumn de tinta
permanente y fsforo.
El mesn debe estar libre de todo objeto no til para desarrollar su trabajo; al finalizar, djelo limpio y libre
de material o equipo ajeno a su implementacin normal.
Todo el material que use en el laboratorio debe considerarse como CONTAMINADO y, por lo tanto, debe
manejarse con cuidado procurando no dejarlos en los mesones, elimnelos slo en los recipientes dispuestos
para ello.
En la eventualidad de cualquier accidente, por pequeo que parezca, debe comunicarse inmediatamente al
profesor a cargo de la actividad.
Respete siempre las indicaciones que se darn durante las primeras actividades prcticas respecto al uso del
mechero, asas, tubos u otros materiales.
Est estrictamente prohibido ingerir cualquier tipo de alimento o bebida en el laboratorio.
No haga bromas, ni permita que sus compaeros las hagan, con cultivos bacterianos o material
contaminado. Jams debe sacar material contaminado o cultivos bacterianos fuera del laboratorio.
Antes de abandonar el laboratorio lave cuidadosamente sus manos.
Recuerde!!
El principal responsable de su seguridad es usted
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PRINCIPIOS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO MICROBIOLOGICO

La proteccin del personal y ambiente del laboratorio se logra mediante la aplicacin de tcnicas y normativas
de seguridad ya establecidas.
REGLAS GENERALES PARA EVITAR RIESGOS
I. Riesgos Fsicos.
1. Asegurarse de que todos los equipos tengan lnea de conexin a tierra, realizada por personal idneo.
2. No manipular equipos o realizar conexiones con las manos hmedas.
3. Mantener un elevado nivel de seguridad a irradiaciones por luz ultravioleta u otro tipo de radiaciones.
II. Riesgos Qumicos.
1. Almacenar los materiales voltiles, inflamables y txicos en un gabinete metlico o en una habitacin aislada
del edificio. El lugar debe ser fro y bien ventilado. Estos materiales deben mantenerse en sus envases originales.
2. No transferir grandes volmenes de lquidos peligrosos.
3. Transferir los materiales voltiles o inflamables en habitaciones bien ventiladas, bajo campana.
4. Evitar almacenar juntos reactivos incompatibles o explosivos.
5. Etiquetar todos los reactivos adecuadamente segn el riesgo, indicando con dibujo de una calavera en el caso
que sean productos txicos.
6. Tener disponible neutralizantes para cualquier emergencia.
7. Tener disponibles extintores de incendios.
III. Riesgos Microbianos.
1. Debe darse estricto cumplimiento a las normativas, con el fin de minimizar los riesgos de contaminacin,
enfermedades y asegurar confiabilidad de los anlisis efectuados.
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UNIDAD DE APRENDIZAJE I
ESTRUCTURA Y CRECIMIENTO BACTERIANO
Resultados de aprendizaje
Distingue morfologa, afinidad tintorial y agrupacin bacteriana en preparaciones microscpicas de

acuerdo a tinciones habituales de laboratorio.
Relaciona la modificacin de distintos factores abiticos con las caractersticas del crecimiento
bacteriano en relacin a un medio de cultivo estndar.
Esta unidad se desarrollar en 6 sesiones que incluir las siguientes actividades:

Sesin 1.
Trabajo prctico 1. Introduccin al laboratorio microbiolgico
Sesin 2.
Trabajo prctico 2. Tcnicas bsicas de siembra microbiana
Sesin 3.
Trabajo prctico 3. Estructura bacteriana. Observacin macroscpica de colonias bacterianas
Sesin 4.
Trabajo prctico 4. Estructura bacteriana. Observacin microscpica de bacterias
Sesin 5.
Trabajo prctico 5. Crecimiento bacteriano. Medios y condiciones de cultivo
Sesin 6.
Trabajo prctico 6. Crecimiento bacteriano. Medios y condiciones de cultivo (parte 2). Discusin de resultados
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LAS BACTERIAS:
NUESTRO OBJETO DE ESTUDIO
Las bacterias son organismos unicelulares, cuyo tamao vara de acuerdo a la especie y a las condiciones de
cultivo. Las bacterias que se relacionan con el ser humano tienen un tamao que se encuentra entre 0,5 y 5 m.
El ojo humano tiene un poder de resolucin de aproximadamente 100 m, por lo que tamaos menores a este
resultan imperceptibles.
Dos ejemplos de tamaos bacterianos:
a) Las clulas individuales de bacterias de los gneros Staphylococcus y Streptococcus, comnmente asociadas
a cuadros infecciosos de tipo pigeno, tienen una forma esfrica con un dimetro entre 0,75 y 1,25 m.
b) Escherichia coli, bacteria considerada como habitante normal del intestino de mamferos (incluyendo el
humano), tiene forma de cilindro con un dimetro de 0,5 a 1,0 m y un largo de 2 a 3 m.
Figura 1. A) Tamaos relativos de clulas. B) Comparacin de tamao relativo entre bacterias y virus
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PRINCIPALES HERRAMIENTAS DE TRABAJO MICROBIOLGICO

a) Mechero:
El mechero es el principal elemento que nos ayuda a trabajar en forma estril, este sirve para esterilizar el asa
microbiolgica, la boca de tubos de ensayo, pipetas, portaobjetos, etc. y para mantener un ambiente de trabajo
estril.
b) Placas de Petri:
Placas de vidrio o de plstico en las cuales se deposita una determinada cantidad de medio de cultivo slido
(altura de 4 mm). Consta de una base y una tapa, debe mantenerse cerrada, excepto en los breves momentos
en que debe sembrarse el medio de cultivo.
c) Asas:
Instrumento con un mango y un alambre (nicrom) en la punta. Existen dos tipos: asa recta (que termina en
punta), y asa en anillo (un pequeo crculo en el extremo). Sirven para sembrar muestras bacterianas en
superficie y en profundidad (asa recta) y para sembrar en superficie y trasladar pequeas gotas (asa en anillo).
d) Pipetas Pasteur:
Es un tubo angosto que termina en punta, puede ser de vidrio o de plstico, estriles o no. Sirve para trasladar
material lquido (gotas) o bien para diseminar siembras acodando un extremo o formando un rastrillo. Debe
romperse la punta y esterilizarse antes de ser utilizada.
e) Pipetas Graduadas:
Son las pipetas corrientes utilizadas en qumica, pero que para el uso microbiolgico deben esterilizarse en
horno Pasteur envueltas en papel. Al desenvolverse deben flamearse al mechero.
f) Tubos de ensayo:
En microbiologa los tubos de ensayo deben esterilizarse en horno Pasteur y taponarlos con algodn hidrfobo o
con tapas especiales de goma o plstico. Debe flamearse la boca del tubo cada vez que se saque la tapa y antes
de volver a colocrsela.
g) Microscopio:
En microbiologa se emplea el objetivo 40 X para observaciones sin tincin (al fresco) y el objetivo 100 X para
observaciones por inmersin (con aceite) en preparaciones teidas. El microscopio debe quedar perfectamente
limpio despus de finalizada la observacin correspondiente.
h) Estufa de Cultivo:
Los productos biolgicos o siembras de bacterias en medios de cultivo deben cultivarse en estufas que se
encuentran generalmente a una temperatura de 35 - 37C.
i) Bao Mara:
Consiste en un recipiente con agua de la llave que tiene una fuente de calor para mantener una determinada
temperatura. Generalmente se hace hervir el agua, por ejemplo, para fundir el agar en los tubos con medio de
cultivo slido.
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j) Horno Poupinel o Pasteur:

Es un aparato que sirve para esterilizar todo el material de vidrio que se utiliza en microbiologa. La esterilizacin
se realiza a 180C por una hora Es una esterilizacin en seco.
k) Autoclave:
Es un aparato que sirve para esterilizar medios de cultivo (agares, caldos, etc.) y tambin para esterilizar
material contaminado (placas de Petri con cultivos positivos, caldos con crecimiento, muestras patolgicas, etc.).
La esterilizacin se realiza a 120C por 15 min y es una esterilizacin hmeda.
A
1. can
2. base
3. anillo que regula entrada de aire
(virola)
4. entrada de gas (chicl)
5. tubo de gas
6. llave de paso
Mechero Bunsen
Figura 2. Mechero de Bunsen. A) Nombres de sus partes; B) Tipos de llama.
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Figura 3. Medios de cultivos slidos
Figura 4. Autoclave. A) Vista exterior; B) Esquema de funcionamiento
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Figura 5. A) Horno Pasteur (Poupinel); B) Cmara de anaerobiosis
Figura 6. Microscopio ptico Compuesto
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El microscopio ptico compuesto se conforma de los siguientes sistemas:

Sistema ptico
Ocular: Lente situada cerca del ojo del observador. Ampla la imagen del objetivo
Objetivo: Lente situada cerca de la preparacin. Ampla la imagen de sta
Sistema de iluminacin
Condensador: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin
Diafragma: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador
Foco: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
Sistema mecnico
Soporte: Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo
Platina: Lugar donde se deposita la preparacin
Cabezal: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular
Revlver: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos
Tornillos de enfoque: Macromtrico que aproxima el enfoque y micromtrico que consigue el enfoque correcto.
MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO PTICO
1. Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina completamente. Si el
microscopio se guard correctamente en el uso anterior, ya debera estar en esas condiciones.
2. Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas.
3. Comenzar la observacin con el objetivo de 4x (ya est en posicin) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la
preparacin es de bacterias.
4. Realizar el enfoque de acuerdo a los siguientes pasos:
- Acercar el lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macromtrico. Esto debe hacerse
mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la
preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos.
- Separar lentamente el objetivo de la preparacin con el macromtrico y, cuando se observe algo ntido la
muestra, girar el micromtrico hasta obtener un enfoque fino.
- Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente mover el
micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es
preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso.
- El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin y por ello es fcil que ocurran dos tipos de
percances: incrustarlo en la preparacin si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de
inmersin si se observa una preparacin que ya se enfoc con el objetivo de inmersin.
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5. Observacin con objetivo de inmersin:

- Bajar totalmente la platina
- Subir totalmente el condensador para ver claramente el crculo de luz que nos indica la zona que se va a
visualizar y donde habr que echar el aceite
- Girar el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y el de 40x
- Colocar una gota de aceite de inmersin sobre el crculo de luz
- Terminar de girar el revlver hasta la posicin del objetivo de inmersin
- Mirando el objetivo, subir la platina lentamente hasta que el lente toque la gota de aceite
- Enfocar cuidadosamente con el micromtrico
- Una vez finalizada la observacin de la preparacin se baja la platina y se coloca el objetivo de menor
aumento girando el revlver. En este momento ya se puede retirar la preparacin de la platina. Nunca se debe
retirar con el objetivo de inmersin en posicin de observacin
- Limpiar el objetivo de inmersin con cuidado empleando un papel especial para ptica. Comprobar tambin
que el objetivo 40x est perfectamente limpio.
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TRABAJO PRCTICO 1
INTRODUCCION AL LABORATORIO MICROBIOLOGICO
RESULTADOS ESPERADOS
El alumno conoce las normas de bioseguridad que son utilizadas en el trabajo microbiolgico, segn
parmetros de seguridad aplicados en la universidad
El alumno conoce las normas de evaluacin relacionadas con el laboratorio de microbiologa, segn
parmetros de la facultad de ciencia
Actividades a desarrollar en la sesin prctica
De forma expositiva se muestra al alumno las normas relacionadas al correcto desarrollo del laboratorio
de microbiologa, tanto del punto de vista evaluativo como de las medidas de seguridad, contestado
inquietudes y dudas.
Se muestra a los alumnos distintos materiales que sern utilizados en el desarrollo de las actividades
prcticas como ejemplo del punto anterior: Mechero, Placa de Petri, Asas microbiolgicas, Pipetas
Pasteur, microscopio, porta y cubre objetos, estufa de cultivo, cmara de anaerobiosis (si hubiere),
horno, autoclave.
Se refuerza el manejo del microscopio ptico.
Se refuerzan los conceptos de esterilidad y buen manejo del material de laboratorio
El profesor explica la importancia del rotulado del material e indica a los estudiantes la obligatoriedad
de presentarse con delantal blanco, ropa cerrada, marcadores (tipo Sharpie) y masking tape (cinta de
papel).
El profesor explica en detalle el funcionamiento del mechero, explica a sus estudiantes a encender y
apagar con seguridad el mismo y explica la capacidad calrica de cada uno de los sectores de la llama
El profesor explica a sus estudiantes como trabajar en esterilidad cerca del mechero, explica el manejo
de las micropipetas, asa de Drigalsky y asa microbiolgica en punta y redonda.
El profesor explica procedimiento de esterilizacin del asa Drigalsky con etanol y llama.
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TCNICAS BSICAS DE SIEMBRA MICROBIANA

TECNICAS BASICAS DE CULTIVO BACTERIANO
Para un correcto desarrollo de las actividades en microbiologa es necesario conocer y practicar

las tcnicas bsicas de manejo y cultivo de microorganismos. Estas tcnicas no han variado mucho
desde el estudio sistemtico del mundo microbiano, ya hace ms de dos siglos, pero aun representan
una manera segura y fiable para el estudio microbiolgico.
Un concepto clave en las tcnicas microbiolgicas es la ESTERILIDAD, la cual debe estar presente en
todo momento, especialmente en el manejo del material de trabajo. A continuacin se especifican las
nociones bsicas en el manejo estril del material microbiolgico de importancia y las tcnicas de
sembrado microbiolgico:
A. Esterilizacin de asas y pipetas
Cada vez que se desee utilizar asas de platino o pipetas capilares deben esterilizarse a la llama
del mechero. Para esterilizar el asa, se coloca el alambre en posicin semivertical sobre la llama hasta
que se ponga color rojo vivo, inmediatamente se completa la esterilizacin flameando la parte
metlica del mango.
La esterilizacin de asas y pipetas capilares se realiza antes y despus de haberlas usado con
bacterias. Para tomar bacterias es preciso esterilizar previamente el asa y esperar hasta que est
totalmente fra. El asa se enfra tocando las paredes de vidrio del tubo, la tapa de la placa de Petri, o
bien la zona del medio en que no haya bacterias. Luego se procede a tomar la muestra.
En el caso de las pipetas, la de tipo capilar debe ser rota en el extremo, si se encuentra sellada,
para luego deslizarla sobre la llama girndola suavemente en una extensin muy superior a la que se
introducir en el tubo, luego se enfra del mismo modo que el asa de platino.
Las pipetas aforadas pueden estar en cilindros metlicos o envueltas en papel ya estriles. En el
primer caso, se debe poner el cilindro en forma horizontal, destaparlo y sacar una pipeta sin tocar con
los dedos las otras, en el segundo caso se debe desenvolver la pipeta desde el extremo donde queda
parte del papel suelto, de manera de no tocar su extremo inferior (que estar en contacto con la
muestra).
Figura 7. Forma correcta de esterilizar el asa microbiolgica
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Figura 8. Espacio de trabajo microbiolgico
EL ESPACIO DE TRABAJO MICROBIOLOGICO SIEMPRE DEBE ESTAR ORDENADO Y CON LOS

MATERIALES DISPUESTOS PARA EL TRABAJO INDIVIDUAL
B.
Esterilizacin de tubos de ensayo.
Cada vez que se destape un tubo estril, se debe flamear su boca y repetir la operacin
inmediatamente antes de volver a cerrarlo. Este procedimiento pretende evitar la entrada de
microorganismos al interior del tubo, a travs del aire.
Figura 9. Forma correcta de esterilizar un tubo de ensayo
C. Aislamiento de Bacterias:
Cuando se realiza una siembra en medios slidos es deseable obtener las bacterias en forma de
colonias aisladas. Sin embargo, generalmente las muestras tienen una microbiota mixta, que se
manifiesta por el desarrollo de distintas especies bacterianas: algunas son saprfitas (microbiota
normal) o contaminantes del proceso de muestreo y otras son las que tienen un rol patgeno.
Para realizar diagnstico microbiolgico, el organismo debe ser primero aislado y mantenido puro en
condiciones de laboratorio.
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Si en la placa de agar ha crecido ms de un tipo de bacterias, se debe realizar el aislamiento de

una colonia a otro medio de cultivo semejante o a medios selectivos con fines diagnsticos. En el caso
de los medios lquidos, una vez obtenido el crecimiento bacteriano, se debe realizar un aislamiento de
1 gota o 1 asada del cultivo a un medio slido para obtener colonias aisladas y asegurarnos de su
pureza (todas con caractersticas macroscpicas iguales). Si fuese necesario, las colonias se sometern
a uno o ms re-aislamientos, hasta obtener cultivos puros, es decir que todas las colonias sean
similares, presenten la misma morfologa y microscpicamente correspondan a un solo tipo de
bacteria. Slo en este momento se puede proceder a la identificacin de la especie bacteriana
mediante el traspaso de una colonia a una batera de medios diferenciales.
Aislar una cepa bacteriana significa, por lo tanto, obtener un cultivo en estado de pureza, condicin
indispensable para poder estudiar sus caractersticas morfolgicas y bioqumicas y lograr as su
identificacin correcta.
Tcnicas de Aislamiento
De medio slido, de mezcla bacteriana o de muestra patolgica a Placa de Petri.
1. Estras en zig-zag: Se toma el asa con la muestra y se procede a hacer una estra en zig-zag desde un
extremo a otro de la placa. Sin esterilizar el asa se puede repetir la misma operacin en una segunda o
tercera placa para llegar a obtener colonias aisladas. Es preciso actuar con rapidez para evitar la
contaminacin con microorganismos presentes en el aire. Esta tcnica es poco recomendable para
personas que poseen poca prctica en laboratorio microbiolgico. (Figura A).
2. Estras con movimientos de lateralidad (Tcnica de siembra por agotamiento): Se toma la placa con
la mano izquierda y se distribuye la siembra en una pequea rea junto a su borde. Se esteriliza el asa,
se enfra y se arrastra un poco de la bacteria ya sembrada hasta otra zona de la placa, deslizando el asa
con movimiento en zig-zag, evitando tocar nuevamente la siembra original. Se continan los
movimientos hasta ocupar toda la superficie de la placa. (Figura B).
B
Figura 10. Formas correctas de sembrar un cultivo sobre agar. A) En zigzag; B) por agotamiento
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Los medios de cultivo se pueden encontrar en tres estados fsicos:

1. Medios Lquidos: se utilizan preferentemente para favorecer el desarrollo bacteriano de clulas estresadas
y/o para el enriquecimiento de bacterias presente en una muestra.
2. Medios Slidos: se utilizan para obtener colonias aisladas sobre la superficie del medio de cultivo, para el
estudio de la morfologa de las colonias, lo que no permiten los medios lquidos. Se diferencian de los anteriores
porque tienen una matriz de sostn, que puede ser agar-agar o gelatina.
3. Medios Semislidos: se utilizan para estudiar la motilidad de las bacterias. Tienen un menor porcentaje de
agar que un medio slido, por lo que no solidifican totalmente a temperatura ambiente.
Los medios slidos tienen generalmente agaragar como agente solidificante, espesante o gelificante. El
agar-agar es una sustancia hidroflica de carcter coloidal procedente de diversas especies de algas marinas,
especialmente del tipo Gelidium, que tiene la propiedad de formar un gel. Qumicamente el agar-agar es un
polisacrido de cadena larga. El agar-agar se expende en forma granulada o en polvo, es insoluble en agua fra,
se disuelve solamente a temperatura de ebullicin, se mantiene en forma viscosa a 60 80C y solidifica en
forma de un gel estable a 40 - 45C. Resiste perfectamente la esterilizacin a 121C y por su capacidad de
retener agua no se deshidrata fcilmente, lo que permite almacenar los medios por un perodo de tiempo a 5C.
La gelatina es atacada y descompuesta por muchos tipos de bacterias; sin embrago, se aade a los
medios de cultivo para estudiar si las bacterias son capaces de atacarla (presencia de enzimas gelatinasas) o
cuando las bacterias degradan el agar-agar (enzimas agarasas).
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TRABAJO PRCTICO 2
TCNICAS BASICAS DE SIEMBRA MICROBIANA
El alumno deber ser capaz de realizar siembras en agares en pinchadura y tendido

El alumno deber ser capaz de realizar una correcta separacin de colonias
El alumno deber ser capaz de realizar una siembra en esterilidad

1.- Revisin de resultados y preparacin del reporte
2.- Halo de esterilidad (campo estril)
Los estudiantes destaparn un tubo estril de tripticasa de soya (TSA) y lo pondrn cerca del mechero durante
toda la hora de clases, finalmente lo taparn y pondrn a incubacin. Del mismo modo utilizando otro tubo los
estudiantes destaparn el tubo y lo dejarn lejos del mechero, al finalizar la clase lo taparn y dejarn en la
incubadora.
Manejo del asa microbiolgica
3.- Siembra lquido-lquido. A partir de un inculo saturado de Escherichia coli, los estudiantes debern realizar
una siembra en un caldo estril de Tripticasa de soya (TSA).
4.- Siembra lquido slido. A partir de un inculo saturado de E. coli, los estudiantes debern realizar una
siembra en un agar tendido y un agar vertical de tripticasa de soya, no olvide utilizar el asa microbiolgica
correcta.
5.- Separacin de colonias. A partir de un inculo saturado de E. coli, los estudiantes debern realizar separacin
de colonias en agar tripticasa de soya (TSA).
6.- Propagacin de una colonia bacteriana. A partir de una placa de E. coli donde se aprecien colonias
debidamente separadas, los estudiantes deben tomar una de las colonias con el asa redonda y realizar la
siembra en un caldo tripticasa de soya (TSA).
7.- Preparacin de una 2 muestras para observacin de estructura bacteriana.
a) Los estudiantes introducirn una trula estril previamente humedecida en suero fisiolgico y la pasarn por
la mucosa bucal y sembrarn con tcnica de csped bacteriano.
b) Utilizando una trula estril se debe seleccionar una superficie donde se sospeche deben existir una gran
cantidad de bacterias, posteriormente sern sembradas en agar TSA con tcnica de csped bacteriano.
NO OLVIDAR: Todas las muestras deben ser correctamente rotuladas y dispuestas en la incubadora respectiva,
su espacio de trabajo debe quedar completamente limpio, incluyendo limpieza y orden de microscopio.
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ESTRUCTURA BACTERIANA.
OBSERVACION MACROSCOPICA DE COLONIAS BACTERIANAS
CARACTERIZACIN BACTERIANA
Una etapa importante y bsica en el estudio de las caractersticas de una bacteria es la observacin
directa de su morfologa macroscpica y microscpica. En microbiologa, debido a que las bacterias no se
pueden ver a simple vista, no se pueden estudiar de forma individual, por lo que se trabaja con poblaciones
bacterianas. Estas poblaciones se obtienen despus de cultivar la bacteria de inters en un medio que le
proporcione todos los nutrientes que requiere: materia orgnica, iones inorgnicos, factores de crecimiento y
agua. Adems, se debe cuidar que la temperatura a la cual se va a cultivar sea la adecuada.
En medios slidos las bacterias crecen formando agregados que se pueden observar macroscpicamente
sobre la superficie y que reciben el nombre de colonias. Se asume que cada colonia procede de una sola
bacteria que se ha multiplicado y desarrollado en un medio de cultivo slido hasta formar una colonia visible.
Por lo tanto, una colonia est formada por millones de bacterias.
La bacteria original desde la cual desciende la colonia se conoce como unidad formadora de colonia
(UFC). Este concepto nos ayuda a estimar el nmero de bacterias presentes en una muestra de inters. Para
esto, se cultiva en un medio slido una fraccin conocida de la muestra. Posteriormente, se cuentan las colonias
que se desarrollaron. El resultado del recuento bacteriano se expresa como el nmero de unidades formadoras
de colonia en relacin al volumen (mL) o a la masa (g) de la muestra cultivada. En teora, equivale al nmero de
bacterias originalmente presenten en la muestra, al momento de realizar la siembra.
Las bacterias que crecen en medios lquidos tienen gran libertad de movimiento, y como carecen de una
superficie slida, no dan origen a colonias. El desarrollo de una poblacin bacteriana se evidencia mediante la
turbidez del caldo o la sedimentacin del cultivo.
El anlisis macroscpico se refiere a la observacin detallada de la morfologa de las colonias, en la cual
se puede identificar caractersticas como forma, elevacin, margen, superficie, brillo, color, hemlisis (en agar
sangre). Estos atributos son propios del grupo bacteriano y son estables a travs de las generaciones, por lo que
este anlisis permite un acercamiento a la identificacin de los gneros bacterianos.
COLONIA BACTERIANA
ii
iii
iv
Figura 11. Crecimiento bacteriano. A) Medio slido; B) Medio lquido:

i) Formacin de pelcula en superficie, ii) Formacin de sedimento en profundidad, iv) turbidez completa, v) sin crecimiento
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OBSERVACIN MACROSCPICA DE BACTERIAS. COLONIAS BACTERIANAS

La observacin macroscpica de bacterias es un examen visual de las colonias, en el cual se puede
distinguir caractersticas tales como:
- tamao aproximado de la colonia (muy pequea, puntiformes, pequeas, medianas, grandes)
- color de las colonias (blancas, amarillas, grises, doradas u otro)
- superficie de las colonias (hmeda, seca, viscosa u otra)
- invasividad de las colonias sobre la placa (velo fino de desarrollo microbiano en la superficie del agar)
- otras caractersticas, como por ejemplo, presencia de hemolisina (la hemlisis se observa mirando el medio de
cultivo a contraluz, slo en medios que contienen sangre).
Figura 12. Caractersticas macroscpicas de colonias bacterianas
Figura 13. Aspecto de colonias bacterianas. A) Colonia mucosa/viscosa; B) Colonia de bacteria hemoltica
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Colonias invasivas
Colonias secas (opacas)
Colonias hmedas (brillantes)
Colonias coloreadas
Figura 14. Aspecto de colonias bacterianas. A) Colonias invasivas; B) Colonias secas (opacas); C) Colonias secas, detalle; D) Colonias
hmedas (brillantes); E) Colonias coloreadas
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TRABAJO PRCTICO 3
ESTRUCTURA BACTERIANA. OBSERVACION MACROSCOPICA DE COLONIAS BACTERIANAS
El alumno deber ser capaz de distinguir caractersticas macroscpicas de colonias bacterianas.

2.- Observacin macroscpica:
En el laboratorio encontrar placas de Petri que contienen cultivos de diversas bacterias. A partir de ellas
observe caractersticas morfolgicas de las colonias bacterianas de acuerdo a las instrucciones del profesor.
- Tamao (grande, mediana, pequea, puntiforme)
- Forma (circular, irregular)
- Color (blanca, blanquecina, griscea, dorada, tornasol)
- Aspecto (hmedo, seca, mucosa)
- Capacidad invasiva
- Capacidad hemoltica
Los resultados deben ser documentados inmediatamente en el formato reporte
su espacio de trabajo debe quedar completamente limpio, incluyendo limpieza y orden del microscopio.
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ESTRUCTURA BACTERIANA.
OBSERVACION MICROSCOPICA DE BACTERIAS
La observacin microscpica de bacterias consiste en examinar a las bacterias como clulas independientes, con
ayuda del microscopio y de tinciones que revelan determinadas caractersticas, como forma, agrupacin,
presencia o ausencia de cpsula, esporas, flagelos, movilidad, entre otras.
A. Observacin de bacterias vivas
- Al fresco: Se utiliza para observar bacterias en estado vivo. Se dispone una gota de suspensin bacteriana
(realizada con caldo, agua o suero fisiolgico estril) en un portaobjetos, se coloca un cubreobjeto y se observa
al microscopio, bajo el objetivo con aumento 10x o 40x (sin inmersin), disminuyendo la iluminacin y bajando
el condensador del microscopio. Se puede observar movilidad.
- En campo oscuro: Se emplea para la observacin de bacterias muy pequeas que difcilmente se observan con
el microscopio ptico en condiciones corrientes (ej. Treponema pallidum). Se utiliza un condensador especial
que enva la luz de la lmpara de tal manera que no entra directamente a la preparacin. Los rayos luminosos
son refractados por los microorganismos observndose como cuerpos brillantes sobre un fondo oscuro.
Figura 15. Micrografa de Treponema pallidum en campo oscuro
B. Observacin de bacterias (muertas)

La mayora de las observaciones microscpicas se realizan con tcnicas de coloracin, esto implica que las
bacterias mueren. Al teir las bacterias se pueden percibir con mayor facilidad la forma y el tamao, utilizando
el mayor aumento del microscopio ptico (objetivo 100x, conocido como objetivo de inmersin porque se utiliza
aceite en la observacin de la preparacin).
Por otra parte, las tinciones ofrecen informacin adicional a la morfologa de las bacterias, ya que ponen de
manifiesto caractersticas de la pared celular (Tincin de Gram) o la existencia de estructuras especiales, como
esporas bacterianas (Tincin con Verde Malaquita),cpsulas (Tinta china) u otras.
Para realizar una tincin bacteriana, se requiere preparar un frotis de la muestra.
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Preparacin de frotis bacteriano

Se denomina frotis a la extensin que se realiza de una muestra o un cultivo sobre un portaobjetos, para luego
teirlos. La preparacin de cualquier frotis implica tres etapas fundamentales:
- Extensin: suspender las bacterias a examinar en lquido (en caso de provenir de una colonia bacteriana) o
depositar una gota de caldo (en caso de provenir de un cultivo lquido) sobre el portaobjetos, para extender el
fluido sobre el vidrio con ayuda de un asa.
- Secado
- Fijacin: El objetivo es adherir las bacterias a la superficie del vidrio. La fijacin se puede realizar por medios
fsicos o qumicos
i) Medios fsicos: consiste en exponer el extendido al calor (la forma ms usada).
ii) Medios qumicos: consiste en colocar el extendido en contacto con una sustancia qumica, como
alcohol metlico, ter u otro.
Para la realizacin de un frotis se procede del siguiente modo:
a) Prenda el mechero (recuerde trabajar en la zona estril, calentando el asa al rojo entre un uso y otro).
Asegrese que el portaobjetos est completamente limpio
b) Coloque una gota de agua o suero fisiolgico en el centro de la lmina (slo si la muestra o cultivo es slido)
c) Transfiera con un asa estril una, dos o tres colonias (depende del tamao) y mzclelas con el agua formando
una suspensin apenas opalescente. Deje secar al aire
d) Fije el frotis exponindolo brevemente a la llama del mechero hasta que est completamente seco. Evite que
se recaliente, pues se alterar la morfologa bacteriana (y corre el riesgo de quebrar la lmina de vidrio).
Compruebe el calor del portaobjetos sobre el dorso de su mano.
Una vez extendida y fijada la preparacin se deja actuar sobre ella los colorantes de uso microbiolgico.
Tinciones de uso microbiolgico
La tincin de los microorganismos consiste en dejar actuar una solucin colorante sobre la preparacin ya fijada.
Estas soluciones varan de acuerdo al mtodo de tincin que se emplea.
Tinciones simples: Se basan en el uso de un colorante sobre el frotis bacteriano, por lo que todas las clulas se
observan de un mismo color. Este tipo de tincin sirve exclusivamente para observar forma y agrupacin de las
bacterias.
Procedimiento
1. Realice un frotis de la muestra. Asegrese de fijarlo correctamente.
2. Ubique el portaobjetos en la zona de tincin. Vierta sobre la muestra el colorante escogido, djelo actuar por
1 2 minutos.
3. Lave suavemente el frotis con agua.
4. Seque el portaobjeto inclinndolo sobre papel absorbente para que escurra el agua. Luego puede pasarlo
rpidamente por la llama del mechero para que quede completamente seco.
5. Observar al microscopio, con objetivo de inmersin.
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Figura 16: Esquema del procedimiento para realizar una tincin
Tinciones diferenciales: Estas tinciones utilizan ms de un colorante, de manera que las bacterias de una
muestra se tien de colores distintos de acuerdo a su afinidad por los distintos colorantes. Se ha establecido que
la afinidad tintorial de un grupo bacteriano se correlaciona con una propiedad del grupo, como la estructura de
a nivel de la pared bacteriana, por ejemplo. De este modo, bacterias que quedan teidas de un mismo color
pertenecen al mismo grupo bacteriano tambin. Entre estas tinciones, las ms relevantes son la tincin de Gram
y la tincin de Ziehl - Neelsen.
A. Tincin de Gram
(Christian Gram, 1884)
Esta tincin es probablemente la ms importante en bacteriologa. Permite distinguir, al menos, dos grupos de
bacterias basados en la afinidad por el colorante Cristal Violeta (Gram Positivas, de color azul prpura) o por el
colorante Safranina (Gram Negativas, de color rojo). Esta diferencia en la afinidad tintorial se relaciona con la
ultraestructura de la pared bacteriana. Las bacterias Gram positivas poseen una capa gruesa de peptidoglicn y
carecen de membrana externa, mientras que las Gram negativas tienen una capa ms delgada de peptidoglicn
y poseen una membrana externa.
Existe tambin un tercer grupo de bacterias denominadas Gram variables, pues simultneamente presentan
tincin de Gram positiva y tincin de Gram negativa, aun bajo condiciones ptimas de cultivo. Estas bacterias
poseen una pared con estructura de Gram positiva, aunque la capa de peptidoglicn es ms delgada que en la
mayora de las bacterias Gram positivas.
Procedimiento
1. Prepare un frotis.
2. Cubra toda la muestra con Cristal Violeta o Violeta de Genciana al 1%, deje actuar durante 1 minuto.
3. Elimine el exceso de colorante y lave con agua rpida pero cuidadosamente, manteniendo la lmina inclinada.
4. Cubra la preparacin con la solucin de lugol, deje actuar durante 1 minuto
5. Lave con agua.
6. Decolore con alcohol etlico o alcohol-acetona durante 30 segundos
7. Lave con agua.
8. Cubra el portaobjetos con safranina, deje actuar por 30 segundos
9. Lave con agua.
10. Seque la lmina en forma inclinada sobre papel absorbente. Cuando est completamente seca, puede
observar al microscopio con objetivo de inmersin.
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Principios de la Tincin de Gram

a. Tincin inicial. Las clulas se tien con Cristal Violeta o Violeta de Genciana, el cual es el colorante primario
(qumicamente es una tincin bsica). En este paso todas las clulas se tien de morado o azul prpura.
b. Mordiente. Se adiciona solucin de yodo (lugol), que reacciona con el cristal violeta forma un complejo
insoluble en agua. Todas las clulas continan de color morado.
c. Decoloracin. Se adiciona un solvente orgnico (no polar), el cual acta lavando el complejo de cristal violetayoduro de las clulas Gram negativas. De esta manera las bacterias Gram positivas continan teidas de morado
y las Gram negativas quedan incoloras. Este es el paso crtico del procedimiento, pues si se exagera decolora las
bacterias Gram positivas y si se hace por muy breve tiempo (o muy dbilmente) no decolora a las bacterias
Gram negativas.
d. Tincin de contraste. Estos colorantes reemplazan al colorante primario que ha sido removido de las
bacterias Gram negativas, se utiliza Safranina o Fucsina (esta tincin debe tener una naturaleza qumica distinta
al Cristal Violeta), para obtener un contraste rojo o rosado. Las bacterias Gram positivas son resistentes a este
lavado (complejo insoluble a agua).
La retencin o prdida del colorante en una bacteria ocurre por el lugar de la ultraestructura en el cual se forma
el complejo cristal violeta-yoduro. Bacterias que carecen de membrana externa pero poseen un grueso
peptidoglicn retienen el colorante primario, mientras las bacterias que presentan membrana externa y una
capa de peptidoglicn ms delgada pierden el colorante primario y se tien con la tincin de contraste.
Figura 17. Tincin de Gram. a) Etapas de la tincin; b) Micrografa de muestra con bacterias Gram positivas y Gram negativas
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B. Tincin de Ziehl - Neelsen

Esta tincin se emplea para colorear aquellas bacterias que son difciles de teir con colorantes bsicos (como
los utilizados en la tincin de Gram), porque se muestran impermeables a la coloracin. Solamente utilizando
colorantes enrgicos, como la fucsina fenicada, cuya accin se fuerza con el uso de calor o con un prolongado
tiempo de contacto, estas bacterias logran retener el colorante. Y lo hacen de tal manera, que los decolorantes
fuertes como el alcohol y los cidos no consiguen decolorarlas. Por eso reciben el nombre de bacterias alcoholcido resistente (BAAR).
Esta tincin es empleada para bacterias que poseen una membrana con alto contenido lipdico, caracterstica
por la cual son difciles de teir. Las bacterias del gnero Mycobacterium son BAAR por excelencia, pues el
contenido lipdico de las micobacterias, compuesto por fosfolpidos y ceras principalmente, alcanza hasta un
40% de su peso seco total. La colorante base de la tincin de Ziehl-Neelsen es la fucsina fenicada, como
decolorante se utiliza cido clorhdrico al 3% en alcohol etlico, o cido sulfrico al 1/4 o cido ntrico al 1/3; el
colorante de contraste suele ser azul de metileno, pero tambin se puede usar amarillo victoria o verde
malaquita.
Procedimiento
1. Realizar un frotis con material biolgico del paciente, obtenido de zonas que contienen bacterias, como
expectoracin u orina. La muestra de expectoracin se extiende sobre el portaobjetos de manera homognea
(se puede utilizar otro portaobjetos para extenderla) cubriendo las 2/3 partes de la lmina, para luego fijar con
calor. La muestra de orina debe sedimentar, el sedimento se centrifuga a 1.500 r.p.m. durante 5 minutos. El
frotis se realiza utilizando el pellet; y se debe fijar en la estufa. Esta misma operacin se realiza con otros
lquidos corporales, como L.C.R. o lquido pleural.
2. Luego de realizado el frotis, se cubre la lmina con fucsina fenicada (previamente filtrada) y se calienta hasta
que emita vapores blanquecinos visibles. Repetir este proceso dos veces ms, evitando que el colorante se
seque sobre la lmina. Contabilizar un tiempo total de actuacin del colorante de 8 a 10 minutos.
Cuando aparecen vapores se ha logrado el calentamiento aproximado de 90C con lo que se obtiene una
cubierta crea ms blanda que se deja impregnar por el colorante.
3. Eliminar la fucsina inclinando el portaobjetos hacia adelante, lavar el frotis con un chorro de agua suave sobre
la parte del portaobjetos que no contiene extendido y dejar escurrir el agua sobre la pelcula coloreada de modo
que sta no se desprenda.
4. Cubrir la totalidad de la lmina con alcohol-cido de manera que vaya decolorando y arrastrando suavemente
la fucsina hasta que las partes ms gruesas del extendido conserven slo un ligero tinte rosado. Eliminar el
alcohol-cido y lavar con agua.
5. Cubrir la lmina con azul de metileno durante 1 minuto.
6. Eliminar el azul de metileno y lavar con agua a baja presin por ambos lados.
7. Secar a temperatura ambiente.
Tambin puede realizarse la tcnica en fro, sin necesidad de calentamiento, dejando actuar el colorante
durante 30 minutos.
Las bacterias alcohol-cido resistentes son aquellas que no pierden la coloracin inicial con fucsina por accin
del alcohol-cido y se observarn de color rojo, mientras el resto de la preparacin se observar de color azul.
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Figura 18: Frotis con tincin de Ziehl-Neelsen
Tinciones especiales: El objetivo de estas tinciones es destacar algunos constituyentes de la bacteria, como
flagelos, cpsulas, esporas o grnulos intracitoplasmticos. Los procedimientos de estas tinciones son
complejos, pero permiten precisar detalles de la estructura bacteriana. En general, son tiles en trabajos de
investigacin bacteriolgica, con escasa utilidad en el laboratorio clnico.
Figura 19. Micrografa de bacterias con flagelos teidos
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A. Tincin para cpsula

Se trata de una tincin negativa que permite determinar la presencia de cpsulas polisacridas, usando tinta
china.
Figura 20: Esquema del procedimiento de la tincin de cpsula
Procedimiento
a) Coloque una gota moderada de tinta china sobre una lmina y emulsione sobre ella la bacteria en estudio.
b) Extienda la suspensin de manera que el frotis resulte delgado.
c) Deje secar y fije.
d) Cubra con fucsina o safranina.
e) Lave, seque y observe con objetivo de inmersin.
Figura 21: Cpsulas bacterianas con tincin negativa
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B. Tincin de Esporas
Algunos gneros bacterianos como Bacillus y Clostridium, producen endosporas como una forma de resistencia
a condiciones ambientales adversas, como sequedad o falta de nutrientes. Las endosporas o esporas bacterianas
se caracterizan por ser altamente resistentes al calor, a las radiaciones y a la desecacin. La resistencia de la
espora se debe a la estructura proteica (rica en aminocidos azufrados) de sus capas externas, lo que tambin
las hace resistentes a tincin. Por este motivo las esporas se tien en caliente.
Figura 22: Tincin de esporas. A) Esquema del procedimiento; B) Esporas teidas con verde malaquita
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Morfologa Celular
A pesar de su pequeo tamao las bacterias, pueden presentar una variada morfologa. Sin embargo, la gran
mayora de ellas se pueden caracterizar en las siguientes formas bsicas:
i)
Cocceas, clulas bacterianas de forma esfrica o aproximadamente esfricas
ii)
Bacilares, clulas en las cuales uno de sus ejes es mucho mayor que el otro, adoptando la apariencia de
un bastn o cilindro
iii)
Espiraladas, clulas largas que presentan una torsin alrededor de un eje central
iv)
Curvas, clulas retorcidas pero que no alcanzan una torsin completa
Bacterias cocceas
Bacterias bacilares
Bacterias espirales
Bacterias espiroquetas
Bacterias de formas
no tradicionales
Bacterias filamentosas
Figura 23. Morfologa celular de las bacterias
Al dividirse las bacterias, las clulas hijas pueden quedar unidas o prximas unas a otras dando lugar a
agrupaciones tpicas que ayudan a completar su estudio microscpico.
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Agrupacin de las clulas bacterianas

Las bacterias presentan diversos modelos de agrupacin de acuerdo a los diferentes planos en los que puede
ocurrir la divisin celular, si las clulas hijas permanecen junto a la clula madre una vez realizada la divisin
celular. Cada una de estas disposiciones es tpica para un grupo particular, por lo que esta caracterstica puede
usarse en identificacin.
Se pueden distinguir las siguientes agrupaciones:
Pares: Las clulas se presentan mayoritariamente en parejas posterior a una divisin en un plano. Si la forma
bacteriana es coccea se habla de diplococos (Ej. Neisseria spp.), si la forma de la clula es bacilar se habla
de diplobacilos.
Ttradas: Resultan de la divisin de diplococos en el plano perpendicular al primer plano de divisin. Son 4
clulas unidas entre s (Ej. Micrococcus spp.)
Cubos o sarcina: Se producen cuando una ttrada se divide en un tercer plano formando un paquete cbico
de ocho clulas que asemejan un cubo. Esta agrupacin es caracterstica del gnero Sarcina (coccea).
Racimos: En este caso la divisin celular se produce en tres planos, de forma irregular, dando origen a masas
de clulas que en la observacin microscpica se asemejan a racimos. Esta agrupacin es caracterstica del
gnero Staphylococcus.
Cadenas: Las clulas se ubican en lnea formando cadenas de longitud variable. Esta agrupacin se presenta
porque la divisin celular ocurre en un solo plano y las clulas no se separan despus de la divisin. La
agrupacin en cadena es caracterstica de los gneros Streptococcus (forma coccea), Bacillus y
Lactobacillus (formas bacilares).
Empalizada: Agrupacin que se encuentra slo en bacterias en forma de bacilo. Las clulas se disponen una
al lado de la otra dando la impresin de una empalizada. Ej. Corynebacterium spp.
Letra china: tambin se presenta slo en bacilos. Las clulas se disponen formando diferentes ngulos que
dan la idea de letras chinas Ej. Corynebacterium spp.
La agrupacin de las clulas es una propiedad constante en las bacterias, por esta razn, facilita la identificacin
bacteriana en el laboratorio.
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Sin agrupacin (aislada)
Agrupacin: en pares
Agrupacin: en cadenas
Agrupacin: empalizada y letra china
Figura 24. Agrupacin de bacterias bacilares
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Sin agrupacin (aislada)
Agrupacin: en pares
Agrupacin: en cadenas
Agrupacin: en ttradas
Agrupacin: sarcina
Agrupacin: racimo
Figura 25. Agrupacin de bacterias cocceas
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TRABAJO PRCTICO 4
ESTRUCTURA BACTERIANA. OBSERVACION MICROSCOPICA DE BACTERIAS
El alumno ser capaz de distinguir morfologa, afinidad tintorial y agrupacin bacteriana en

preparaciones microscpicas de acuerdo a tinciones habituales de laboratorio.

1.- Tincin de Gram
- En el laboratorio encontrar diversas placas con cultivos bacterianos, a partir de ellas seleccione 2 bacterias
Gram positivas y 2 bacterias Gram negativas y realice la tincin de Gram correspondiente.
- Las Bacterias deben ser visualizadas y documentadas correctamente indicando forma celular, agrupacin y
color de tincin. Seleccione una colonia de una de las placas de agar que prepar en el prctico nmero 1 y
realice tincin de Gram.
2.- Tincin de Cpsula
- Realice la tincin de cpsula de Klebsiella pneumoniae o Staphylococcus saprophyticus
Agregar con micropipeta una gota (50 l) de tinta china en la orilla de un porta objeto
Agregar 50 l de K. pneumoniae o S. saprophyticus sobre la gota anterior
Esparcir con el cubre objeto en forma de frotis
Fijar al mechero
agregar colorante de contraste fucsina o safranina durante 2 min
Lavar suavemente con agua y secar con papel absorbente
Observe con aumento de 40x y 100x con aceite de inmersin

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CRECIMIENTO BACTERIANO. MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO

CRECIMIENTO BACTERIANO
Los microorganismos en general pueden vivir y multiplicarse sobre substratos nutritivos preparados en
el laboratorio, que son denominados medios de cultivo. Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes,
factores de crecimiento y otros componentes, preparados en el laboratorio de forma estril. Estos suministran
los compuestos necesarios para el desarrollo de los microorganismos, como agua, carbono, nitrgeno,
hidrgeno, calcio, fsforo y hierro.
Algunas bacterias pueden crecer satisfactoriamente en casi cualquier medio de cultivo, otras, en cambio,
necesitan medios especiales y existen algunas que no pueden crecer en ninguno de los medios diseados por el
ser humano. Los microorganismos que requieren factores de crecimiento especficos, como aminocidos,
vitaminas, purinas y otras sustancias que no son capaces de sintetizar, reciben el nombre de microorganismos
exigentes.
Los distintos tipos de medios de cultivo varan segn las necesidades de los microorganismos y segn el
objetivo del estudio, pero todos han de cumplir los siguientes requisitos:
- Contener las sustancias necesarias para el crecimiento del (os) microorganismo (s)
- Mantener condiciones de esterilidad hasta el momento de la siembra
Los requerimientos para el crecimiento microbiano se pueden agrupar en dos categoras:
requerimientos fsicos y qumicos. Entre los primeros se incluyen la temperatura, el pH y la presin osmtica;
entre los requerimientos qumicos se encuentran el agua, las fuentes de carbono y nitrgeno, las sustancias
minerales, el oxgeno y determinados factores orgnicos de crecimiento.
Finalmente, una vez sembradas las bacterias en el medio de cultivo, deben ser incubadas a la
temperatura y tensin de oxgeno adecuadas.
CONDICIONES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
1. Contener sustancias nutritivas necesarias para el desarrollo de los microorganismos (tales como aminocidos,
carbohidratos, polialcoholes, vitaminas, minerales)
2. Tener un pH que permita un desarrollo ptimo
3. Estar previamente esterilizados o preparados en condiciones aspticas
4. Estar protegidos de la contaminacin ambiental por tapones de algodn card, tapones de goma, tapas
metlicas o roscas.
UTILIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
1. Aislamiento de bacterias desde una muestra o material biolgico corporal (secrecin purulenta, orina, rgano,
fecas u otros) o de un alimento (leche, carne, entre otros).
2. Estudio morfolgico de las colonias.
3. Conservacin de cepas identificadas (coleccin de cepas microbianas o cepario)
4. Clasificacin y tipificacin de bacterias por estudio de sus propiedades bioqumicas en medios diferenciales.
5. Obtencin de toxinas o investigacin de sus caractersticas.
6. Cultivo y recoleccin de bacterias para la elaboracin de productos biolgicos (vacunas, antgenos,
bacteriocinas, toxoides, entre otros)
7. Estudio de susceptibilidad antibitica
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Clasificacin de los medios de cultivo

Segn su utilidad prctica
Medios corrientes: Son aquellos medios apropiados para el cultivo y mantencin de la mayora de las bacterias.
Sirven de base para la preparacin de los medios especiales.
- Ejemplos: Caldo nutriente, Agua peptonada, Agar nutritivo.
Medios especiales: Son aquellos medios de cultivo que por su riqueza nutritiva sirven para el cultivo de
bacterias muy exigentes. En su formulacin, pueden contener sustancias inhibidoras de ciertas bacterias,
facilitando el aislamiento y diagnstico de los agentes etiolgicos de las enfermedades infecciosas. Tambin
pertenecen a esta clasificacin aquellos medios que facilitan el diagnstico porque manifiestan caractersticas
bioqumicas de algunas especies microbianas; esto lo logran por la adicin desustancias qumicas determinadas.
Los medios especiales se clasifican en:
Medios Mejorados: Se obtienen aadiendo a los medios de cultivo corrientes sustancias de mayor valor
nutritivo, como sangre desfibrinada (conejo, cordero o caballo), suero sanguneo (equino), suero fetal bovino,
huevo, cerebro, corazn, trozos o extracto de hgado, carne o levadura, entre otros. Estas sustancias tienen el
efecto de proporcionar condiciones favorables para el cultivo de bacterias exigentes, como Streptococcus spp. o
Corynebacterium spp. Como la mayora de estas sustancias son de naturaleza proteica no pueden ser
esterilizadas por autoclave, pues coagulan con el calor. Cuando esto ocurre, las sustancias deben ser
esterilizadas por filtracin y se deben agregar a los medios previamente esterilizados, en condiciones de rigurosa
asepsia.
- Ejemplos de medios mejorados: Agar Sangre, Agar Cerebro Corazn, caldo de Tetrationato, caldo Selenito
(empleado en el aislamiento de Salmonella spp. desde muestras provenientes de excrementos, orina o aguas
residuales).
Medios Selectivos: Los medios selectivos estimulan el desarrollo de ciertas especies bacterianas mientras
inhiben el desarrollo de otras especies; esto permite el aislamiento y diagnstico de bacterias patgenas con
facilidad y rapidez, especialmente cuando el causante del cuadro infeccioso se encuentra en zonas corporales
donde ya existen bacterias de forma natural. Por ejemplo, es frecuente que en fecas, orina, exudados, alimentos
o agua haya presencia de bacterias sin inters diagnstico (que no causan enfermedad), pero que crecern en
los medios de cultivo corrientes enmascarando la presencia del agente patgeno buscado.
Estas caractersticas se obtienen por la adicin de sustancias tales como colorantes de anilinas, sales biliares,
antibiticos, entre otros.
- Ejemplos de medios selectivos: Agar Brucella, Agar McConkey, Caldo Selenito Cistina.
Medios indicadores o diferenciales: Son medios comunes o mejorados a los cuales se le ha adiciona ciertas
sustancias que ponen de manifiesto determinadas propiedades bioqumicas, propias de algunas especies
bacterianas, como por ejemplo: produccin de H2S gas, de cidos o de sustancias alcalinas, accin proteoltica,
accin lipoltica, entre otras. Estas sustancias o indicadores permiten diferenciar rpidamente una especie
microbiana de otra semejante; por este motivo se denominan medios indicadores o diferenciales.
- Ejemplos de medios diferenciales: Agar TSI, Agar LIA, Agar Baird Parker, Agar Rambach.
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PROCESAMIENTO DEMUESTRAS CLNICAS

Muchos microorganismos existentes en la naturaleza viven gran parte de sus vidas en relacin estrecha
(relacin simbitica) con otras especies de seres vivos. El ser humano posee microorganismos simbiticos que se
encuentran normalmente asociados a sistemas anatmicos como la piel, tubo digestivo, sistema respiratorio
superior, sistema urogenital, conjuntiva. Estos microorganismos reciben el nombre de microbiota normal. El feto
humano in utero se encuentra libre de bacterias y otros microorganismos; sin embargo, a las pocas horas de
nacido, el neonato comienza a ser colonizado por una gran diversidad de microorganismos en forma progresiva,
estimndose que un adulto normal posee aproximadamente 1014 bacterias simbiontes.
La mayora de los microorganismos que pertenecen a la microbiota normal estn en relacin comensal
con el hospedador; sin embargo, algunos pueden estar en relacin mutualista o como parsitos; estos ltimos,
junto a los microorganismos patgenos, sern responsables de procesos infecciosos en el ser humano.
El estudio de procesos infecciosos requiere, habitualmente, la recuperacin de los microorganismos
causantes de la infeccin para su caracterizacin. Esto contempla varias etapas:
1. Observacin microscpica del material biolgico: al fresco o teido. El objetivo de esto es visualizar
elementos que nos permitan tomar decisiones preliminares para las siguientes etapas.
2. Cultivo microbiano: Esta tcnica sigue siendo el gold standard para la mayora de los agentes bacterianos.
Consiste en la inoculacin de la muestra en medios de cultivos apropiados, seleccionados de acuerdo al
conocimiento de la fisiologa de las posibles bacterias causantes de la enfermedad y al cuadro clnico. Este
procedimiento permite obtener desarrollo bacteriano suficiente para proceder con la identificacin de la
bacteria, en una extensin de este mismo paso que se realiza con ayuda de medios diferenciales o selectivos.
3. Estudio del comportamiento bacteriano frente a los antimicrobianos y as escoger la terapia emprica local
ms adecuada.
Uno de los eventos ms importante es la recuperacin de microorganismos desde los diferentes sitios
orgnicos. Esta recuperacin comienza con la recoleccin de la muestra y el traslado al laboratorio. Este proceso
consta de cuatro pasos:
a) Seleccionar el sitio anatmico adecuado para la toma de muestra
b) Usar la tcnica de recoleccin ms apropiada
c) Poner la muestra recolectada en un envase que favorezca la viabilidad de los microorganismos causantes del
proceso infeccioso
d) Enviar la muestra en forma rpida y expedita al laboratorio, y en caso que esto no sea posible, asegurarse
que sea almacenada a la temperatura y medios de transporte adecuados
Una muestra mal tomada puede inducir a error en el aislamiento e identificacin del microorganismo
causante del cuadro clnico e iniciar una terapia antibacteriana inadecuada.
La calidad del trabajo realizado en el laboratorio de microbiologa no puede ser superior

a la calidad de la muestra recibida
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Reglas bsicas a considerar en el momento de tomar y enviar una muestra al laboratorio de microbiologa:
a) La muestra debe ser tomada con mximas precauciones de asepsia, usando el instrumento adecuado y
esterilizado (trula, esptula u otro)
b) La muestra debe ser representativa del proceso infeccioso, es decir, debe tomarse desde el sitio de
infeccin, evitando la contaminacin con tejido adyacente, rganos o secreciones
c) Debe ser obtenida en el momento ptimo, esto requiere conocimiento de la historia natural y la
fisiopatologa de la infeccin. El ejemplo ms clsico corresponde a la fiebre tifoidea, cuadro en el cual el
agente etiolgico se encontrar durante las primeras semanas en sangre y posteriormente en deposiciones
d) Se debe obtener una cantidad suficiente de muestra, segn el nmero de exmenes requeridos, y debe
ponerse en recipientes adecuados y estriles
e) Una vez obtenida la muestra, sta debe ser enviada al laboratorio a la brevedad (en medios de transporte
adecuados si el caso lo requiere), debido a que algunos microorganismos tienen baja resistencia a las
condiciones ambientales y en otras muestras (orina) la temperatura ambiente favorece la multiplicacin
bacteriana, induciendo a error en el recuento de colonias
f) En lo posible, para que la muestra tenga un valor significativo, sta debe obtenerse antes de la
administracin de antibiticos. Esto es especialmente importante en el aislamiento de Streptococcus hemolticos (muestras farngeas), Neisseria gonorrhoeae (cultivos genitourinarios), Haemophilus influenzae y
Neisseria meningitidis (lquido cefalorraqudeo). Si el paciente ya se encuentra sometido a tratamiento con
antibiticos, estos debern suspenderse por un mnimo cuatro veces la vida media del frmaco y
posteriormente tomar la muestra
g) La muestra debe rotularse en forma adecuada e ir acompaada de una solicitud de examen que debe indicar
bsicamente:
- Datos del paciente (Nombre completo y edad)
- Nmero de ficha clnica
- Procedencia (hospitalizado, servicio, nmero de cama o si es ambulatorio)
- Tipo de muestra
- Fecha y hora de recoleccin de muestra
- Examen solicitado
- Nombre del mdico
- Otras observaciones (control, tcnica usada en recoleccin, etc.)
El manejo de muestras biolgicas siempre conlleva un riesgo biolgico potencial; por lo tanto, es necesario
cumplir estrictamente las normas de bioseguridad.
DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO
La actividad que desarrolla el laboratorio de microbiologa est orientada esencialmente al diagnstico
microbiolgico de las enfermedades infecciosas. Actualmente este diagnstico est basado en diversos aspectos
de los microorganismos: fisiologa, inmunologa, biologa molecular y reacciones parsito-hospedero
involucrados en el proceso infeccioso. Sin embargo, independientemente de la estrategia utilizada, el
diagnstico microbiolgico incluye la obtencin de la muestra clnicas (una o varias) y la identificacin del
microorganismo causante del cuadro infeccioso, para la determinacin de la sensibilidad a los antimicrobianos
adecuados.
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PACIENTE
DIRECTO
DETECCIN DEL MICROORGANISMO
MUESTRA:
INDIRECTO
DETECCIN DE ANTICUERPOS
(RESPUESTA INMUNE DEL HOSPEDERO)
Sangre
MUESTRA: Sangre
LCR
Heces
Orina
Biopsias de tejido
INMUNOLOGA
MICROBIOLOGA
TRADICIONAL
Deteccin de anticuerpos
NO CONVENCIONAL
ELISA
Western Blot
Observacin microscpica
Cultivo
BIOLOGA MOLECULAR
IMUNOLOGA
Deteccin del material gnico

Hibridacin con sondas
PCR
Deteccin de antgenos
IFI
ELISA
Western blot
Figura 26. Mtodos de diagnstico microbiolgico
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IDENTIFICACIN BACTERIANA
La identificacin de las bacterias consiste esencialmente en el proceso de caracterizacin de un
microorganismo a fin de determinar su clasificacin, su relacin con otros microorganismos similares o
diferentes y, de esta manera, asignarle un nombre.
El nombre de la especie generalmente refleja un rasgo morfolgico o una caracterstica bioqumica del
microorganismo o, tambin, puede estar establecido en relacin a una persona o un lugar famoso. Todas las
especies estn asignadas a un gnero que en general se encuentran morfolgica y bioqumicamente bien
definido. Los gneros a su vez agrupados en tribus y familias, cada uno de los cuales presenta rasgos
morfolgicos, fisiolgicos y bioqumicos generales pero distintivos. El agrupamiento taxonmico se ha basado
histricamente en caractersticas fenotpicas; sin embargo, debido a que se pueden descubrir caractersticas
bioqumicas adicionales, los microorganismos pueden cambiar su designacin. Por lo tanto, el enfoque actual de
la taxonoma y nomenclatura se basa en determinantes genticos que reflejan parentescos (homologa del ADN,
anlisis de secuencias del ADN, como el gen que codifica para ARN ribosomal 16s, entre otros).
Por otra parte, se entiende como cepa bacteriana a los descendientes de un aislamiento a partir de un
cultivo puro. As, una especie bacteriana se puede entender tambin como una coleccin de cepas que
comparten caractersticas comunes. Si bien, cepa no es un rango taxonmico, es una unidad operacional til en
el trabajo microbiolgico.
La funcin primaria del Laboratorio de Microbiologa Clnica es identificar de manera precisa y rpida los
microorganismos recuperados de muestras clnicas y determinar su susceptibilidad y/o resistencia a los agentes
antimicrobianos de uso clnico, para proveer a los mdicos una informacin confiable sobre la cual determinar
terapias antimicrobianas. Para la identificacin de una bacteria se requiere del uso de esquemas que producen
perfiles metablicos del microorganismo. Estos sistemas de identificacin estn basados en cuatro componentes
bsicos:
a. Seleccin e inoculacin de un test. El nmero y tipo de test depende del organismo a ser identificado,
significancia clnica y disponibilidad de mtodos a realizar, adems de ser necesario la inoculacin de
cultivos puros.
b. Incubacin para evidenciar la utilizacin de sustratos y/o crecimiento frente a inhibidores. Su duracin
depende de la multiplicacin bacteriana.
c. Deteccin de actividad metablica (utilizacin de sustrato). La colorimetra, fluorescencia o turbidez son
usados para detectar productos de utilizacin de sustratos. La deteccin se puede realizar en forma visual o
automtica (fotmetro).
d. Anlisis de perfiles metablicos y comparacin con perfiles conocidos y estandarizados (base de datos) de
especies bacterianas con el fin de establecer la identificacin definitiva.
Identificacin fenotpica tradicional
Para la identificacin de una bacteria, en primer lugar, es necesario tener la cepa pura y posteriormente,
mediante el uso de la tincin de Gram (acompaado del anlisis macroscpico de sus colonias) es posible elegir
las pruebas correspondientes para la designacin de un nombre. Estas pruebas son realizadas de forma
convencional, son confiables, fciles de realizar y econmicas.
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Mtodos para la caracterizacin de microorganismos:

1.
2.
3.
4.
5.
Morfologa celular (forma, tamao y disposiciones celulares)

Caractersticas de tincin (Gram positivo, Gram negativo o cido-alcohol resistente)
Movilidad
Presencia o ausencia de esporas
Caractersticas de crecimiento
a) velocidad de crecimiento
b) morfologa de las colonias en el medio de cultivo
c) condiciones atmosfricas ptimas para el crecimiento (requerimientos de oxgeno, dixido de carbono)
d) Temperatura ptima de crecimiento
e) Morfologa de las colonias en medios selectivos, no selectivos y diferenciales
6. Caractersticas bioqumicas (formacin de productos bioqumicos finales, produccin de cidos a partir de
distintos carbohidratos, presencia de ciertas enzimas bacterianas, etc.)
7. Pruebas serolgicas, deteccin directa de antgenos y de anticuerpos formados en respuesta a la infeccin
Reacciones Serolgicas
El cultivo de rutina del agente etiolgico en muchas infecciones virales, fngicas y bacterianas es
tedioso, costoso y, en ocasiones, no practicable. En la actualidad, disponemos de otras tcnicas alternativas de
diagnstico rpido basadas en la deteccin de antgenos o de anticuerpos, genricamente denominadas
Tcnicas o reacciones serolgicas.
Las reacciones serolgicas estn basadas en la visualizacin directa o indirecta de la unin antgenoanticuerpo. Debido a la alta especificidad que existe en la reaccin de estos dos componentes, es posible utilizar
esta metodologa en la identificacin de determinados antgenos, entre los cuales se encuentran las bacterias,
siempre y cuando se cuente con un suero que contenga anticuerpos de actividad conocida. Tambin se puede
afectar la reaccin en sentido contrario, es decir, teniendo un antgeno de origen conocido, se puede investigar
la presencia y tambin la cantidad (ttulo) de anticuerpos presentes en el suero. Las reacciones serolgicas ms
comnmente usadas en microbiologa son las siguientes:
Reaccin de Aglutinacin
Es una reaccin en que podemos visualizar a ojo desnudo, la formacin de grumos (debido a que el
antgeno es de un tamao relativamente grande). Esta reaccin es utilizada en caso de aglutinacin de clulas
bacterianas u otras clulas. Esta tcnica, puede efectuarse tanto en placa (mtodo rpido) o en tubos (mtodo
lento).
Reaccin de Precipitacin
En esta tcnica el antgeno se encuentra generalmente en solucin coloidal, y al producirse la reaccin,
los flculos son sumamente pequeos y difciles de observar a ojo desnudo. El anticuerpo que participa en la
reaccin de aglutinacin es el mismo. El resultado va a depender del estado fsico en que se encuentra el
material antignico. Se puede utilizar varias tcnicas para realizarla, como por ejemplo en tubos capilares o en
placas de agar.
Hemlisis
Hemlisis es la lisis de los glbulos rojos de la sangre presente en el medio de cultivo; esto puede ser
resultado de la accin del complemento, despus de la formacin del complejo antgeno - anticuerpo (por
ejemplo, glbulos rojos hemolisina, que es su anticuerpo especfico) o por la accin de ciertas sustancias
txicas para los eritrocitos (por ejemplo, antiestreptolisina "O").
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TRABAJO PRCTICO 5
CRECIMIENTO BACTERIANO. MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO
El alumno ser capaz de relacionar distintos factores abiticos (nutrientes, condiciones de cultivo) con
las caractersticas del crecimiento bacteriano en relacin a diferentes medio de cultivo utilizados.
El alumno utilizar diferentes medios de cultivos de uso habitual en el laboratorio de microbiologa, as

como ser capaz de realizar algunas tcnicas de siembra.

1.- Batera Bioqumica
A partir de cultivos saturados de diversas bacterias Gram negativo y Gram positivo (S. saprophyticus, Salmonella
sp., S. aureus, S. pyogenes, S. epidermidis, K. pneumoniae, P. mirabilis, B. subtilis, Pseudomonas sp., S.
saprophyticus, Shigella sp.) los estudiantes debern escoger 2 bacterias de inters para realizar una
determinacin fenotpica bioqumica.
a) Utilizando las tcnicas de siembra que usted ya domina deber inocular los caldos:
Caldo glucosado en campana, 2 caldos RMVP (Rojo metilo/Voges Proskauer) (cada caldo RMVP ser revelado
independientemente.
b) Sembrar los siguiente agares en tubos:
Agar TSI, Agar LIA, Agar MIO, Agar citrato de Simmons, Agar Urea
c) Siembra de medios de cultivo diferenciales
Se realizar la siembra de agar Manitol sal y Agar Mc Conkey
d) Registre en su reporte el procedimiento empleado para cada medio de cultivo y registre todas las
caractersticas relevantes no olvide registrar aquellos que requieren un revelado posterior.
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CRECIMIENTO BACTERIANO. MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO (PARTE 2)

Identificacin fenotpica comercial
En los ltimos tiempos, se han agregado pruebas rpidas como prueba de ltex, as como tambin se
han creado sistemas comerciales que permiten, con un mayor nmero de pruebas, la identificacin adecuada de
la mayora de las bacterias. Entre estas tenemos:
Sistema API. Es uno de los sistemas de identificacin ms conocidos. Posee un gran nmero de pruebas
bioqumicas, las que vienen como sustratos liofilizados en una galera de pocillos y se requiere slo de una
emulsin de la cepa (a partir de un cultivo puro menor o igual a 24 horas) y un tiempo de incubacin posterior
que depende de la galera de pruebas que se haya escogido.
Sistema Sens-Ident. Este sistema utiliza placas de microtitulacin y en sus pocillos vienen sustratos liofilizados.
Tambin se debe hacer una emulsin de la cepa (a partir de un cultivo puro menor o igual a 24 horas). El llenado
y la incubacin de las placas se realizan en forma manual y posteriormente se utiliza un lector automatizado
para la obtencin de los resultados.
Sistema VITEK. El sistema VITEK consta de mdulo de vaco-sellador, incubador-lector, ordenador, monitor e
impresora. Permite identificar bacterias hasta en 3 horas. Se utilizan tarjetas con sustratos liofilizados y se
requiere hacer una emulsin de la cepa (a partir de un cultivo puro menor o igual a 24 horas) y es en los
mdulos del equipo donde se realiza el llenado y sellado de las tarjetas, la incubacin y la lectura siendo el
software proporcionado con el ordenador el que analiza las lecturas en cada una de las tarjetas comparndolas
con su base de datos, generando en esta forma el resultado de acuerdo con el teorema de Bayes.
Sistema MicroScan. El sistema MicroScan (Baxter Healthcare Corp., West Sacramento, CA) consiste en placas
plsticas de microtubos, los que llevan incorporados sustratos reactivos para la identificacin de bacterias
aerbicas (enterobacterias, no fermentadores, Haemophilus, Neisseria), bacterias anaerbicas y levaduras.
Algunas placas tambin incluyen microdiluciones en caldo de ciertos antibiticos, lo que permite realizar
estudios de sensibilidad. Existen placas o paneles en que se combinan sustratos para identificacin y
microdiluciones de antibiticos, y son llamados Combo.
Las placas o paneles de MicroScan contienen sustratos o microdiluciones de antibiticos deshidratados.
Los microtubos son inoculados con una suspensin del organismo en identificacin y son incubados a 35C por
15 a 18 horas, despus de este perodo puede realizarse una lectura en forma visual de los paneles o usar un
sistema automatizado de lectura, el que detecta crecimiento bacteriano o cambios de color por diferencias en la
transmisin de luz. Las diferencias en las pulsaciones electrnicas son analizadas automticamente por un
microcomputador que compara los patrones de reaccin con un programa interno para determinar la
probabilidad de identificacin.
Sistema AutoScan-W/A. El AutoScan-W/A (Baxter Healthcare Corp., West Sacramento, CA) es un sistema
automatizado que puede incubar una combinacin de paneles de MicroScan convencionales y/o rpidos en
forma simultnea, agregar reactivos en forma automtica a los paneles convencionales cuanto stos lo
requieren, leer e interpretar los resultados de los paneles e imprimir los resultados sin que se requiera la
intervencin del operador en todos estos paneles.
Adems de los paneles convencionales, existen paneles rpidos (fluorescentes). Los paneles rpidos usan
compuestos fluorescentes marcados y requieren slo de 2 a 3 horas de incubacin para la identificacin
bacteriana.
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Identificacin genotpica.
Con la explosin de la biologa molecular durante los ltimos 30 aos se han puesto en prctica una serie
de metodologas alternativas a las estrategias fenotpicas de identificacin y caracterizacin de
microorganismos. La deteccin y manipulacin de cidos nucleicos (ADN y ARN) seguido de la observacin
directa de genes y sus productos constituyen los mtodos genotpicos en la identificacin microbiana.
Los test de diagnstico molecular estn basados en el conocimiento de la naturaleza, composicin y
estructura de los cidos nucleicos. En general podemos distinguir tres categoras de estas metodologas:
1. Hibridacin
2. Amplificacin
3. Secuenciacin y digestin enzimtica
Hibridacin
Los mtodos de hibridacin estn basados en la complementariedad de bases que presentan dos hebras
de cidos nucleicos para unirse especficamente, a travs de puentes de hidrgeno (se debe considerar que el
patrn de unin entre bases nitrogenadas siempre es el mismo, A-T y G-C). Ya que la hibridacin requiere de
homologa de secuencia de cidos nucleicos, una hibridacin positiva de dos hebras de cidos nucleicos de
diferentes fuentes, indica relacin gentica entre los genes estudiados de los dos organismos donadores de cada
hebra de cido nucleico.
La hibridacin requiere una hebra de cido nucleico con secuencia conocida (sonda), la cual proviene de
un microorganismo de identidad conocida. Utilizando esta hebra se determina el parentesco de la secuencia que
proviene del microorganismo desconocido (secuencia blanco, diana o target), con respecto a la sonda.
Los componentes de cidos nucleicos que pueden ser usados como hebras simples son ARN y ADN,
pudiendo formar dmeros ADN-ADN, ADN-ARN, ARN-ARN, dependiendo del ensayo de hibridacin realizada.
-
Secuenciacin y digestin enzimtica de cidos nucleicos

Los mtodos moleculares que permiten evidenciar parte de la secuencia genmica del patgeno son
herramientas poderosas en el diagnstico microbiolgico. La secuenciacin involucra mtodos que determinan
en forma exacta la secuencia de un gen con valor taxonmico de un microorganismo o un fragmento de l.
La digestin enzimtica y posterior electroforesis de los fragmentos de cidos nucleicos obtenidos es un
mtodo menos exacto que la secuenciacin; sin embargo, en algunos casos provee una valiosa informacin
diagnstica. La digestin de ADN es acompaada de numerosas enzimas conocidas como endonucleasas, las
cuales reconocen secuencia nucleotdica especfica (sitio de restriccin), donde producen un corte en la hebra
de ADN. Como la secuencia es caracterstica de un tipo bacteriano, el patrn de restriccin obtenido en la
electroforesis posterior tambin es caracterstico al tipo de bacteria.
-
Reaccin de la polimerasa en cadena (Amplificacin)

La tcnica denominada reaccin de la polimerasa en cadena (PCR, por sus siglas en ingls) fue
desarrollada por Mullis en el ao 1983 y corresponde a un proceso simple de amplificacin del ADN a travs del
uso de enzimas, de forma in vitro. Esta tcnica tiene un gran nmero de aplicaciones, incluyendo deteccin de
agentes infecciosos presentes en una muestra clnica, deteccin de genes de resistencia, entre otros.
En los aos recientes y despus de algunas modificaciones, la tcnica de PCR ha llegado a ser el mtodo ms
frecuente para amplificar cidos nucleicos, especialmente ADN. Esta tcnica se basa en la repeticin de un
proceso de tres etapas:
1. Denaturacin de ADN de doble hebra (dADN) en ADN de hebra simple (sADN)
2. Hibridacin de partidores (pequeos fragmentos de ADN complementarios a la secuencia de inters)
3. Extensin enzimtica de los partidores
-
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El principio de la amplificacin de un fragmento de ADN es utilizar la hebra simple del gen (el ADN ya est
denaturado) como molde para la reaccin de polimerizacin de nucletidos, que ejecuta una enzima ADN
polimerasa determinada. Los nucletidos que forman el ADN (que deben estar en gran cantidad, para que
durante todo el proceso siempre estn disponibles), se unen enzimticamente para formar la secuencia de ADN
complementaria al fragmento de inters. Durante un segundo ciclo, y todos los siguientes, el segmento original
de ADN y el ADN ya amplificado se convierten en moldes para las prximas reacciones. De este modo, en cada
ciclo de PCR la cantidad de ADN especfico aumenta al doble. Una amplificacin tpica es de 30 a 40 ciclos y
existe un aumento de 106 veces del ADN molde presente en una muestra clnica.
El descubrimiento de la enzima termotolerante ADN polimerasa y desarrollo de procesos automatizados han
facilitado la introduccin de la tcnica de PCR al diagnstico de laboratorio con un aumento creciente de sus
aplicaciones. Se han desarrollado muchos ensayos sensibles y especficos para la deteccin de patgenos de
importancia en microbiologa clnica. Algunos microorganismos fastidiosos tales como hongos y micobacterias,
que requieren largos perodos de incubacin para ser detectados por los mtodos clsicos, pueden ser
detectados por PCR en tiempos ms cortos.
La tcnica de PCR presenta algunos inconvenientes, de los cuales el ms relevante es la contaminacin de la
reaccin, ya sea con ADN forneo o la contaminacin muestra a muestra. Se han descrito varios procedimientos
para la reduccin de contaminacin, y en general para eliminar estos problemas deben existir procedimientos
cuidadosos de laboratorio, as como un control de calidad rgido en la preparacin de las reacciones, el uso de
pipetas slo dedicadas a la tcnica de amplificacin, el uso de reactivos prealicuotados, entre otros.
El mecanismo por el cual la reaccin de polimerasa en cadena genera un aumento exponencial de ADN
molde es tericamente un concepto simple. Sin embargo, requiere la optimizacin de mltiples parmetros ya
sea qumicos (concentracin de reactivos inorgnicos, de enzimas, de partidores, del molde de ADN, etc.) o
fsicos (temperatura y nmero de ciclos, transferencia de calor entre termociclador y el tubo de reaccin, etc.).
Cada una de estas variables puede ser manipulada para obtener un ensayo diagnstico eficiente, sensible y
especfico. Los componentes que estn involucrados en la optimizacin de reacciones de amplificacin
enzimtica son:
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
Concentracin de MgCl2.
Pureza de los reactivos
Partidores adecuados
ADN templado o molde
Taq ADN polimerasa
Desoxinuclotidostrifosfato (dNTPs)
Buffer PCR
Parmetros del termociclador:
- Desnaturacin de doble hebra de ADN (temperatura)
- Hibridacin de partidores
- Extensin de partidores
- Nmero de ciclos
CARACTERSTICAS GENERALES DE GNEROS BACTERIANOS DE IMPORTANCIA CLNICA

A continuacin se mencionan algunas pruebas y tcnicas ms utilizadas en la identificacin de bacterias
de comn aislamiento en el laboratorio y, por lo tanto, frecuentemente agente etiolgico de enfermedades
infecciosas en el ser humano.
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Gnero Staphylococcus
Las bacterias del Gnero Staphylococcus pertenecen a la Familia Micrococcaceae y se caracterizan
morfolgicamente por ser clulas esfricas, agrupadas en racimos. Son especies de fcil desarrollo en medios de
cultivos mejorados y con relativa resistencia a los factores ambientales, lo que favorece su mantencin y
transmisin en el medio ambiente.
Algunas caractersticas fundamentales de estas especies son:
Colonia. Tienen un tamao relativamente grande en relacin con otras cocceas (tienden a ser pequeas), son
redondas, lisas, brillantes y hmedas en su superficie.
Pigmentacin. En general, las colonias de la especie Staphylococcus epidermidis presentan un pigmento de color
blanco porcelana; mientras las colonias de la especie Staphylococcus aureus muestran un pigmento dorado o
crema. Sin embargo, la diferenciacin entre ambas especies no se encuentra en la produccin de pigmento, sino
se deben realizar pruebas especficas.
Hemlisis. En placas de agar sangre, las colonias de Staphylococcus spp. pueden presentar hemlisis (no todas)
dependiendo de la cepa y el tipo de sangre utilizada (humana, equina, cordero).
Produccin de catalasa. Esta es la caracterstica que distingue al gnero Staphylococcus, despus de realizar una
tincin de Gram. En los ambientes acuosos, que contienen oxgeno disuelto, como el citoplasma de las clulas,
aparecen formas txicas derivadas del oxgeno. Las bacterias que viven en ambientes aerobios necesitan un
equipo enzimtico capaz de neutralizar estas formas txicas. Entre estas enzimas se encuentra la catalasa, que
convierte el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno molecular.
El examen puede realizarse agregando una gota de agua oxigenada (perxido de hidrgeno al 3%) sobre
una asada de cultivo (ojala no proveniente de agar sangre), manifestndose reaccin positiva por la formacin
de burbujas de O2 ms agua, lo que comprueba la presencia de enzima catalasa. Esta prueba se emplea para
diferenciar el gnero Staphylococcus (catalasa positivo) del gnero Streptococcus (catalasa negativo).
Produccin de coagulasa. Muchas cepas patgenas, como las pertenecientes a la especie Staphylococcus
aureus, tienen la propiedad de sintetizar la enzima coagulasa, la cual es capaz de producir la coagulacin de
plasma citratado (en ausencia de calcio). Esta prueba es definitiva para identificar a Staphylococcus aureus a
nivel de especie.
Gnero Streptococcus
En 1874, Billroth describe estos microorganismos a partir de muestras de heridas infectadas, los cuales
tienen una morfologa cocoide y crecen formando cadenas; por estas caractersticas al gnero se le denomin
Streptococcus (del griego Streptos: collar y Coccus: cocos).
Los miembros del gnero Streptococcus son cocceas Gram positivas, esfricas ovaladas y
ocasionalmente con aspecto de bacilos cortos (esto puede ocurrir al practicar un Gram desde un medio slido).
Se disponen en pares o formando cadenas de longitud variable. Fisiolgicamente son anaerobios facultativos,
siendo exigentes para su cultivo, por lo que requieren medios mejorados, generalmente adicionados de sangre u
otros lquidos orgnicos.
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En microbiologa mdica se trabaja con dos esquemas de clasificacin:

a. Clasificacin de Schottmueller y Brown.
Es la clasificacin ms sencilla y prctica y se basa en la accin de los Streptococcus spp. sobre el agar sangre
en el cual han sido sembrados. Estos grupos son:
Streptococcus alfa hemoltico (o viridans), caracterizados porque las colonias se evidencian rodeados de
un halo verdoso, producto de una hemlisis parcial de los glbulos rojos. En este grupo se incluye a
Streptococcus pneumoniae y varias otras especies, generalmente comensales de la mucosa orofarngea e
intestinal.
- Streptococcus beta hemolticos (hemolticos), caracterizados porque las colonias pequeas se evidencian
rodeadas de un halo translcido de hemlisis completa. En este grupo se incluye a Streptococcus pyogenes y
a Streptococcus agalactiae.
- Streptococcus gamma hemolticos (inertes), caracterizados por carecer de actividad hemoltica en placas
de agar sangre.
b. Clasificacin de Lancefield.
Adems de la clasificacin anterior, que es eminentemente prctica, existe una clasificacin serolgica que
estableci Rebeca Lancefield basada en la presencia de un componente estructural llamado polisacrido C
que es antignico y diferente para ciertos grupos de Streptococcus.
De los grupos que componen esta clasificacin, los cuales se designan con letras maysculas (A, B, C,
etc.), los ms importantes para el hombre y algunos animales son los cinco primeros grupos:
Grupo A. Streptococcus pyogenes
Grupo B. Streptococcus agalactiae
Grupo C. Streptococcus equis
Grupo D. Sub grupo Enterococcus
Sub grupo no Enterococcus
Grupo G. Streptococcus anginosus
Gnero Enterococcus
Evidencias genticas encontradas por Scheifer y Kilpper-Balz, en 1984, y la presencia de ciertas
propiedades especficas separaron a Streptococcus faecalis y Streptococcus faecium del gnero Streptococcus
formando un gnero independiente llamado Enterococcus.
El gnero Enterococcus incluye bacterias cocceas Gram positivo que se presentan solas, en pares o
cadenas relativamente cortas, no forman endosporas, son anaerobias facultativas, catalasa negativa y de fcil
desarrollo en medios suplementados con sangre.
Estos microorganismos, constantemente presentes en el intestino humano y animal, poseen algunas
caractersticas fisiolgicas que facilitan su caracterizacin. Por ejemplo, crecen en presencia de NaCl al 6.5 %, a
10C y a 45C, adems de degradar esculina en presencia de bilis al 40%.
Identificacin de Gnero:
- Colonias grisceas, relativamente pequeas
- Cocos Gram positivo en pares o cadenas
- Bilis-esculina positiva
- Crecimiento en NaCl 6.5 %
- PYR positivo
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Familia Enterobacteriaceae
Estas bacterias son bacilos Gram negativos, que en general no adoptan agrupaciones caractersticas,
no forman esporas y la mayora de ellas son mviles debido a que poseen flagelos pertricos. Algunos gneros
son inmviles (tricas), como Shigella spp. y Klebsiella spp., caracterstica que debe considerarse para su
identificacin. Son anaerobios facultativos, de fcil crecimiento en medios corrientemente utilizados en el
laboratorio. Las colonias originadas son de aspecto similar, generalmente no pigmentadas, mucosas, hmedas,
de bordes y superficie lisa.
La identificacin de las diferentes enterobacterias fundamentalmente se basa en el estudio de sus
propiedades bioqumicas en una serie de medios de cultivo diferenciales, diseados con este objetivo, los de
mayor utilidad en el esquema simplificado de diagnstico son:
-
Agar TSI (Agar triple azcar-fierro)

Agar LIA (Agar lisina-fierro)
Agar MIO (Agar movilidad-indol-ornitina)
Agar Citrato de Simmons
Caldo o Agar Urea de Christensen
Una caracterstica de importancia en las enterobacterias es que todas fermentan la glucosa y son
oxidasa negativas propiedades que permiten diferenciarlas de otros bacilos Gram negativos.
Identificacin de enterobacterias: Batera Bioqumica

TSI:
Involucra el estudio del comportamiento de la bacteria en condiciones de aerobiosis (en la superficie del
agar) y anaerobiosis (en la profundidad del medio). Se puede observar:
a) fermentacin de glucosa
b) fermentacin de lactosa y/o sacarosa
c) produccin de gas en la fermentacin
d) produccin de cido sulfhdrico (H2S)
Para interpretar el TSI se considera como fermentacin positiva el viraje desde el color rojo al amarillo
del medio de cultivo. La fermentacin de glucosa se evidencia en la parte profunda del medio (anaerobiosis). La
fermentacin de la lactosa y/o sacarosa se evidencia en la parte tendida del tubo mediante un viraje a color
amarillo en la superficie del agar extendido. La formacin de gas por fermentacin de la glucosa se evidencia por
la aparicin de burbujas o la ruptura del medio en su parte profunda. La produccin de H2S se observa por la
aparicin de un precipitado de color negro.
Interpretacin del TSI
A/A
= amarillo/ amarillo
O/A = K/A
= rojo/ amarillo
O/O = K/K
= rojo/ rojo
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LIA:
Al igual que el procedimiento anterior esta prueba involucra la siembra en superficie y en profundidad; y
se puede observar:
a) descarboxilacin de la lisina
b) desaminacin de la lisina
c) Produccin de H2S
d) Formacin de gas
La capacidad de la bacteria para descarboxilar lisina se evidencia en la parte profunda del medio cuando
existe conservacin o intensificacin de su color violceo. El test negativo se caracteriza por el viraje de color
desde violeta a amarillo. La capacidad de desaminacin de la lisina se observa por la aparicin de un color rojo
en el tendido del medio. La formacin de H2S se observa por la aparicin de un precipitado de color negro, el
cual generalmente aparece en los trazos de siembra de la parte profunda del medio.
Interpretacin de LIA
K/K
K/A
R/A
= morado/ morado
= morado/ amarillo
= rojo/ amarillo
La combinacin del agar TSI y el agar LIA otorgan suficiente informacin para poder determinar el gnero de una
cepa bacteriana en estudio.
MIO:
En esta prueba se utiliza un agar semi-slido que permite el estudio de:

Produccin de indol a partir del triptfano.
Movilidad
Descarboxilacin de la ornitina
El indol se evidencia con la formacin de un anillo de color rojo-prpura en la superficie del medio al
agregar reactivo de Kovacs. La movilidad se manifiesta por el desarrollo de la bacteria en toda la masa del agar,
las bacterias inmviles crecen slo en el trazo de siembra. La descarboxilacin de la ornitina se evidencia cuando
el medio conserva o intensifica su color prpura.
a)
b)
c)
Interpretacin MIO
Movilidad positiva
Indol positivo
Ornitina positivo
= turbidez
= anillo rojo en superficie
= morado en profundidad
Citrato de Simmons:
Esta prueba estudia la capacidad de la bacteria para crecer en este medio que slo posee citrato como
nica fuente de carbono. Se evidenciar el crecimiento del microorganismo en la superficie del medio y por el
viraje de ste desde color verde a azul intenso.
Interpretacin de Citrato de Simmons
Positivo
= azul intenso en superficie
Negativo
= verde en superficie
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Ureasa:
Esta prueba permite verificar la presencia de la enzima ureasa en la bacteria en estudio. Se puede
realizar en caldo o agar al que se le ha agregado urea. La presencia de ureasa se evidenciar por un viraje del
agar desde amarillo leve a fucsia y del caldo desde rosado a fucsia.
Interpretacin de Ureasa
Positivo
= fucsia
Negativo
= color del medio
TRABAJO PRCTICO 6
CRECIMIENTO BACTERIANO. MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO, PARTE 2
El alumno ser capaz de interpretar los cambios de color de cada uno de los medios de cultivo
diferenciales e indicadores.
El alumno ser capaz de clasificar a las bacterias de acuerdo a los resultados obtenidos.

1.- Los estudiantes deben revelar los resultados de la prueba MIO agregando 3 gotas de reactivo de Kovacs,
adems deber agregar 4 gotas de rojo de metilo al tubo de caldo glucosado en campana.
2.- Los estudiantes deben revelar los resultados obtenidos de los medios RMVP, a un tubo se le debe agregar la
mezcla KOH/alfa naftol (4 y 6 gotas respectivamente).
3.- Anlisis de resultados: los estudiantes documentan correctamente y construyen una tabla con los datos
obtenidos en su formato reporte.
4.- Los estudiantes deben identificar mediante bsqueda bibliogrfica la bacteria que sembraron de acuerdo a
sus caractersticas bioqumicas, no olvide realizar este trabajo a conciencia pues posteriormente deber analizar
una muestra problema.
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UNIDAD DE APRENDIZAJE II
CONTROL DE MICROORGANISMOS
Contrasta los mtodos de control de microorganismos segn su indicacin de uso de acuerdo a los
resultados obtenidos en la actividad de laboratorio y normativas CLSI.

Sesin 7
Trabajo prctico 7. Control de microorganismos. Agentes fsicos de control
Sesin 8
Trabajo prctico 8. Control de microorganismos. Agentes qumicos de control
Sesin 9
Trabajo prctico 9. Control de microorganismos. Agentes antibacterianos
Sesin 10
Trabajo prctico 10. Control de microorganismos. Agentes antibacterianos, parte 2, discusin de resultados
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CONTROL DE MICROORGANISMOS.
AGENTES FISICOS DE CONTROL
ASEPSIA
Etimolgicamente, el concepto asepsia significa ausencia de podredumbre. El trmino designa al
conjunto de tcnicas que impiden el acceso de las bacterias no deseables al campo de trabajo hospitalario. El
objetivo es lograr o mantener la ausencia de microorganismos infecciosos en los tejidos vivos. Se dice que un
material es asptico cuando est privado de grmenes (por esterilizacin o desinfeccin).
SEPSIS
Hace referencia a la presencia de microorganismos patgenos en una o varias estructuras orgnicas. Una
sepsis, localizada en un punto determinado del cuerpo, puede provocar una respuesta inflamatoria sistmica, si
no es detectada y tratada a tiempo. Cuando la sepsis est localizada en sangre se denomina bacteremia. El
cuadro de sepsis y bacteremia juntos recibe el nombre de septicemia.
ANTISEPSIA
Es la tcnica o el proceso que, por su baja toxicidad, se utiliza para conseguir la asepsia de la piel y de las
mucosas asociadas, en un organismo. La antisepsia normalmente es llevada a la prctica mediante agentes
qumicos. Este trmino no implica la destruccin de todas las formas de vida; ya que, generalmente, los
antispticos poseen un efecto bacteriosttico. Una sustancia qumica bacteriosttica inhibe el crecimiento o
multiplicacin de las bacterias, evitando que aumente la cantidad de microorganismos en el tiempo. Sin
embargo, a veces, los antispticos tienen efecto bactericida; es decir, destruyen a los microorganismos
disminuyendo su viabilidad. Los bacteriolticos son sustancias que, adems de ser bactericidas, lisan las clulas
bacterianas.
Figura 27. Efectos de sustancias antispticas y desinfectantes
ESTERILIZACION
Es un proceso de saneamiento preventivo mediante el cual se alcanza la muerte de todas las formas de
vida microbianas, incluyendo bacterias y formas esporuladas altamente resistentes, hongos y virus. Se entiende
por muerte la prdida irreversible de la capacidad reproductiva del microorganismo.
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La esterilizacin se define como la destruccin completa o eliminacin total de los microorganismos

patgenos y saprfitos que se encuentran en la superficie o en el interior de objetos y sustancias. El criterio
prctico para evaluar la esterilidad es la ausencia de crecimiento microbiano en un medio adecuado.
La eliminacin de los microorganismos puede efectuarse mediante procesos fsicos, mecnicos o
qumicos. Los mtodos fsicos y mecnicos se incluyen en el trmino esterilizacin y los mtodos qumicos en el
concepto de desinfeccin.
El mtodo escogido para esterilizar un producto depende fundamentalmente de su naturaleza y
estabilidad frente al calor u otros agentes esterilizantes. As, por ejemplo, cuando necesitemos agregar suero
equino a un medio de cultivo lquido para enriquecerlo, no podemos aplicar calor para esterilizarlo, ya que se
producira la coagulacin de las protenas del suero alterando su composicin. Situacin semejante ocurre con
otras sustancias o materiales termolbiles, para los cuales se utilizan mtodos de esterilizacin que no alteren su
estabilidad, uniformidad o identidad de dichas sustancias o materiales.
DESINFECCIN
La desinfeccin puede definirse como el proceso encaminado a la eliminacin de microorganismos por
alteracin de su estructura o su metabolismo, con el objetivo de impedir su propagacin. En este proceso se
elimina gran cantidad de bacterias, virus y hongos, pero no necesariamente todas las formas de vida de estos
microorganismos. Por lo tanto, la desinfeccin es un trmino relativo, donde el resultado depender del nivel de
desinfeccin aplicado, desde una desinfeccin qumica (con grado de esterilizacin) a una mnima reduccin del
nmero de microorganismos contaminantes. Estos procedimientos se aplican nicamente a objetos inanimados.
La eficacia del procedimiento de desinfeccin se ve determinada por:
Naturaleza del objeto a desinfectar
El nmero y grado de resistencia de los microorganismos presentes en la superficie
Cantidad de materia orgnica presente.
1. Desinfeccin de Alto nivel: Se utiliza esta desinfeccin para elementos invasivos que no soportan los
mecanismos de Esterilizacin. Tiene eficacia mxima cuando se elimina todo resto de materia orgnica.
2. Desinfeccin de Medio Nivel: Se utilizan en materiales y equipos donde es poco probable la contaminacin
por esporas bacterianas.
3. Desinfeccin de Bajo Nivel: Se utiliza en los materiales que no atraviesan mucosas, solo contacto externo.
CLASIFICACIN DE SPAULDING
La clasificacin de Spaulding, que data y rige desde 1968, es un criterio de indicadores para la desinfeccin de
objetos y materiales que se utilizan en el mbito sanitario y hospitalario, que van a tener contacto con el
paciente, tipificados de acuerdo al riesgo de infeccin.
Crticos: Penetran en los tejidos o cavidades. Normalmente deben estar estriles.

Semicrticos: Entran en contacto con tejidos mucosos. Deben estar libre de bacterias.
No Crticos: Deben por lo menos ser lavados, tienen contacto con piel sana.
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Nivel
Tipo de Equipo
Ejemplo
Mnimo nivel requerido
Crtico
Instrumento inducido
directamente en el torrente
sanguneo o en zonas
estriles del cuerpo.
Instrumentales quirrgicos,
cateterismos cardacos;
Catteres IV, etc.
Esterilizacin
Semicrtico
Objeto en contacto con

mucosa intacta
Endoscopios flexibles, tubos

Desinfeccin de Alto nivel
endotraqueal, laringoscopios, (D.A.N.)
etc.
No Crtico
Objeto en contacto con piel

intacta.
Manguito de presin
sangunea, Otoscopio, etc.
Desinfeccin de Mediano y
Bajo nivel
Figura 28. Cuadro resumen. Criterios de desinfeccin, clasificacin de Spaulding
La esterilizacin y desinfeccin conllevan generalmente a la destruccin, eliminacin o inhibicin de los

microorganismos, y constituyen los principales medios para prevenir infecciones en los hospitales.
Estos procedimientos se realizan mediante tres tipos de agentes:
1) Agentes Fsicos
2) Agentes Qumicos
3) Agentes Mecnicos
CLASIFICACION DE LOS METODOS DE ESTERILIZACION O DESINFECCIN

1. METODOS FISICOS: Se basan en la aplicacin de agentes fsicos naturales como, por ejemplo,
temperatura (calor), luz, radiacin UV, radiacin ionizante, entre otros.
Los mtodos fsicos conducen a la asepsia; es decir, a la ausencia de microorganismos patgenos y
saprfitos.
2. METODOS MECANICOS: Las sustancias que no se pueden esterilizar por mtodos fsicos o qumicos se
pueden tratar por mtodos mecnicos, como la filtracin.
La filtracin se basa en los procesos fsico-qumicos observados entre los cuerpos microbianos o
elementos en suspensin y una sustancia semi-porosa. As se consigue separar y retener los microorganismos de
los lquidos o superficies que los contienen. Los lquidos a filtrar deben atravesar por presin o vaco pequeos
canalculos de manera que los microorganismos queden retenidos en el filtro por adsorcin. En el mecanismo de
adsorcin influyen la viscosidad del lquido, pH, cargas elctricas, tiempo y temperatura. Los filtros (de asbesto,
vidrio, porcelana, celulosa) deben tener un dimetro de poro inferior al dimetro de las bacterias. Un tamao de
poro utilizado ampliamente para este fin es 0.22 m (no retienen virus).
3. METODOS QUIMICOS: Se utilizan sustancias qumicas, como xido de etileno, fenol, alcohol,
halgenos o tensoactivos, para conseguir que el metabolismo bacteriano se detenga.
Los mtodos qumicos conducen a la antisepsia (impedimento o retraso del desarrollo de
microorganismos patgenos en relacin con el organismo humano) o a la desinfeccin (destruccin de
microorganismos patgenos y saprfitos sobre objetos o superficies inanimadas).
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Mtodos Fsicos
I. CALOR SECO
El mecanismo de esterilizacin del calor seco es producir un aumento de las reacciones de oxidacin de
los microorganismos.
A. la llama
La destruccin de los microorganismos mediante la llama es un procedimiento muy eficaz cuando el
material a esterilizar es indestructible o se va a inutilizar. Se usa para esterilizar el asa de platino que se calienta
al rojo blanco (1300C), esptulas, pinzas, pipetas, bocas de tubo o matraces, etc., empleando la llama del
mechero Bunsen por un tiempo de exposicin de 10 segundos (tambin se denomina flameado).
Cuando, adems de matar las bacterias, se destruye mediante el fuego el material que las contiene, se
habla de incineracin. Este procedimiento se utiliza para destruir fluidos y restos orgnicos procedentes del
hospital, animales muertos por enfermedades contagiosas, ropa, vendas y objetos altamente contaminados.
B. Por aire caliente
El aire caliente confinado a temperatura de 160 a 180C mantenido durante 1 hora, destruye con
seguridad todas las bacterias y sus esporas. Para su aplicacin se recurre al uso del horno de aire caliente, siendo
el ms usado el horno Pasteur, que tiene como fuente calrica una resistencia elctrica que est ubicada en la
parte inferior de la cmara. El horno Pasteur se utiliza para esterilizar material de vidrio (tubos, placas Petri,
matraces, etc.), de porcelana, de acero y otros materiales inalterables a esa temperatura. Nunca se emplea para
esterilizar material plstico, lquidos o medios de cultivo.
II. CALOR HUMEDO
El mecanismo de esterilizacin por calor hmedo induce la coagulacin de las protenas del protoplasma
bacteriano y de los cidos nucleicos, y la destruccin de las membranas celulares. Se considera un mtodo ms
efectivo que el calor seco por su mayor poder de penetracin.
A. Por agua en ebullicin
El agua en ebullicin (100C) es suficiente para matar formar vegetativas de bacterias, pero no sus
esporas. Se utiliza para esterilizar material de laboratorio resistente al calor, por ejemplo jeringas, agujas,
pinzas, etc. que se sumergen en un bao con agua a ebullicin por aproximadamente 10 a 20 minutos.
B. Por vapor fluente
Se utiliza para la esterilizacin de instrumentos de ciruga, equipos de lechera, equipos de la industria de
alimentos, entre otros. Se alcanza una temperatura de aproximadamente 100C si se mantiene sin presin y a
nivel del mar. Una exposicin por 15 minutos es suficiente para destruir la forma vegetativa de las bacterias,
pero no sus esporas.
C. Por vapor de agua a presin
Las esporas de algunas bacterias son capaces de resistir los 100C. La esterilidad completa slo se
alcanza con el uso de calor hmedo a temperaturas ms altas, en la forma de vapor saturado bajo presin. En
ausencia de aire, vapor de agua sometido a alta presin, tiene una temperatura constante. Por lo tanto, si
conocemos la presin podemos fcilmente conocer la temperatura que alcanza el vapor:
* vapor de agua a 121C se obtiene con 1 atmsfera o 15 libras /(pulgada)2
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En el laboratorio, el vapor de agua a presin se utiliza para esterilizar medios de cultivo, artculos de
plstico o polipropileno, soluciones u otros materiales para los cuales no se puede utilizar calor seco.
Los equipos empleados para la esterilizacin, bajo estas condiciones, se denominan autoclaves.
Existen distintos modelos de autoclaves (de carga vertical u horizontal), pero en general todos tienen las
siguientes partes: fuente calrica (gas, resistencia elctrica o red de vapor), manmetro (con una escala lb/in2 o
Kg/cm2 o atmsferas), termmetro, llave de escape de vapor, vlvula de seguridad, llave de descarga de agua y
llave de entrada de agua. Los autoclaves siempre deben ser manipulados por personal entrenado y autorizado.
Figura 29. Autoclave. A) Esquema del funcionamiento del autoclave; B) Etapas de autoclavado; C) Aspecto exterior
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III. RADIACIONES
La radiacin es absorbida por el ADN de los microorganismos, produciendo mutaciones letales o
modificaciones qumicas del ADN de manera ya no es posible su proliferacin. Tambin inducen la formacin de
sustancias qumicas como oxhidrilos y tomos de hidrgeno, altamente reactivos con los procesos celulares
vitales. La radiacin ultravioleta acta directamente sobre el ADN en los lquidos que contienen oxgeno y
compuestos orgnicos mediante la produccin de perxidos orgnicos.
A. Luz solar
La luz solar tiene una propiedad bactericida muy eficaz, especialmente entre longitudes de onda de
2.100 a 3.000 Angstroms. Las bacterias esporgenas (productoras de esporas) son ms resistentes que las no
esporgenas (no productoras de esporas). Lo mismo sucede con las bacterias fluorescentes que convierten las
ondas cortas (germicidas) en ondas largas de menor actividad. No es de mucha utilidad su accin esterilizante en
el laboratorio.
B. Radiacin ultravioleta
Los rayos UV tienen escaso poder de penetracin, lo que se utiliza principalmente para esterilizar las
superficies del material expuesto a la irradiacin. En laboratorio, generalmente, se utilizan lmparas que emiten
luz con longitud de onda entre 2.650 y 2.750 Angstroms () en la esterilizacin de aire, de ambientes y
superficies de trabajo o campo quirrgico. Debe mantenerse un registro de las horas de esterilizacin de cada
tubo, ya que tienen una vida til limitada que debe ser controlada.
C. Radiaciones ionizantes
Se utilizan preferentemente rayos gamma, que son radiaciones de alta energa emitidas por un istopo
radioactivo de Cobalto 60 o Cesio 137. Dado su alto poder de penetracin y la no generacin de calor, se
emplean en la esterilizacin de material termosensible como el plstico (tubos, placas, jeringas y bolsas
desechables), hilos de sutura, entre otros.
Mtodos Mecnicos
I. FILTRACION
Los filtros de uso corriente en el laboratorio son:
a) Filtros Seitz: Son discos de asbesto de diferentes dimetros y diferente porosidad. Estos discos se montan en
un aparato metlico donde se coloca el lquido a filtrar. Los discos se desechan despus de su uso. Los filtros y
sus soportes se deben esterilizar en autoclave.
b) Filtros de vidrio poroso: Se fabrican en base a vidrio finamente pulverizado y comprimido.
c) Filtros de membrana: Son discos de steres de celulosa (acetato o triacetato) con 12 porosidades distintas,
segn su uso. Los discos de poros con 0.22 m de dimetro se consideran esterilizantes (para eliminacin de
bacterias).
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TRABAJO PRACTICO 7
CONTROL DE MICROORGANISMOS. AGENTES FISICOS DE CONTROL
El alumno ser capaz de contrastar los mtodos de control de microorganismos segn su indicacin de
uso de acuerdo a los resultados obtenidos en la actividad de laboratorio

1.- Esterilizacin con fuego. A partir de un cultivo (Escherichia coli en placa) sembrar una mitad de placa de agar
Tripticasa con asa curva, previa esterilizacin del asa. Luego la otra mitad tomar el inculo bacteriano, esterilizar
el asa y luego sembrar.
2.- Efecto del agua caliente a distintas temperaturas. En el laboratorio dispondr de 2 baos termorregulados y
una olla con bao mara con las siguientes temperaturas (50, 70 y 100C respectivamente)
A partir de 1 tubo saturado de E. coli y Bacillus subtilis, preparar una dilucin 1:10 en 3 caldos estriles cada uno.
Colocar los tubos y someterlos a las temperaturas 50 70 y 100C por 5 min. Terminado el proceso enfriar al agua
corriente y luego incubar por 24 h a 37C.
3.- Efecto de radiacin UV en el crecimiento bacteriano. Sembrar Escherichia coli y B. subtilis sobre tres placas de
agar tripticasa (en tapiz bacteriano con trula) cada una. Someter las placas a distintos tiempos de radiacin UV:
0 (control), 5, 10 y 15 min. Luego incubar a 37C por 48 h.
3.- Documente los datos necesarios para la preparacin del reporte
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CONTROL DE MICROORGANISMOS.
AGENTES QUMICOS DE CONTROL
Mtodos Qumicos
Los antispticos y desinfectantes son sustancias qumicas ampliamente utilizadas. De acuerdo a su
accin se pueden clasificar en bactericidas (destruyen las bacterias) o bacteriostticos (inhiben el desarrollo
bacteriano, pero ste se reanuda cuando se retira el agente, de modo que tienen una accin reversible).
La actividad germicida de los desinfectantes depende de las condiciones de uso: concentracin, tiempo,
temperatura, pH, cantidad y calidad de la materia orgnica presente, caractersticas de la superficie, tipo y
concentracin de microorganismos, entre otros.
Las sustancias qumicas ms frecuentemente usadas en el laboratorio son los siguientes:
1. ALCOHOLES: El alcohol etlico (etanol) es no txico, es incoloro e inodoro. Es til contra las formas vegetativas
pero ineficaces contra las esporas. Acta por deshidratacin y desnaturalizacin de las protenas. La
concentracin ptima es al 70% (4 volmenes de alcohol 95 ms 1 volumen de agua destilada). El alcohol
isoproplico es ms bactericida que el etanol, por lo que est desplazando al primero, ya que est libre de las
restricciones legales de la ley de alcoholes. Los dems alcoholes no son de uso prctico debido a su insolubilidad,
olor y alto costo. Se usan como antisptico y desinfectante.
2. CLORO: El Hipoclorito de Sodio comercial viene a una concentracin entre el 2,5 % y el 8 %. Para su uso en el
laboratorio se debe diluir al 1 %. El Hipoclorito de Sodio es un desinfectante de accin bactericida mediada por
la oxidacin de los grupos sulfhidrilos libres.
3. YODO: tiene una accin bactericida sobre formas vegetativas y esporas, sobre hongos y algunos virus. Actan
directamente por yoduracin y oxidacin, interfiriendo los procesos de xido reduccin y fosforilacin
bacterianos. Se utiliza como tintura (solucin alcohlica al 2% o 3%), lugol (solucin acuosa al 5%) o para
aumentar la accin bactericida del alcohol etlico (alcohol yodado al 2%).
4. YODOFOROS: es una asociacin de yodo con polmeros (polivinilpirrolidina) generalmente se usa al 10%, lo
que permite una liberacin lenta de yodo (1%). Tiene accin bactericida y se utiliza como antisptico y
desinfectante.
5. FENOL: la solucin al 0.2% tiene una accin bacteriosttica, al 1% es letal para la mayora de las bacterias y al
1.5% es fungicida. Se usa en soluciones acuosas, es de bajo costo tiene un gran poder de penetracin an en la
piel intacta.
6. IONES DE METALES PESADOS: sales de mercurio (Timerosal, Mercurio Cromo), plata (Nitrato de plata), Zinc
(Sulfato de zinc) y cobre (Sulfato de cobre) en concentraciones altas desnaturalizan las protenas. Actan
combinndose a los grupos sulfhidrilos. Se inactivan fcilmente en presencia de materia orgnica y no actan
sobre las esporas.
7. AGENTES ALQUILANTES: sustituyen tomos lbiles de hidrgeno con radicales alquilo. Un ejemplo es el xido
de etileno que se usa para esterilizar materiales plsticos. Tiene una gran penetracin, muy activo contra
esporas y virus. Es extremadamente txico y forma mezclas explosivas con el aire.
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8. DETERGENTES: Slo son desinfectantes, destruyen membranas. Son tensoactivos (o surfactantes), es decir,
disminuyen la tensin superficial y favorecen el arrastre por el agua, dan una funcin de barrido. Los jabones
neutros son poco efectivos, por lo que el mayor efecto sobre los microorganismos se debe a la accin mecnica
con la cual se acompaa la aplicacin. Su actividad disminuye con la materia orgnica y son inefectivos contra M.
tuberculosis, virus de la hepatitis y esporas.
Los detergentes se pueden clasificar, de acuerdo a su naturaleza qumica, en: no inicos, aninicos y
catinicos (sales de amonio cuaternario), que son los ms usados.
La efectividad de los detergentes catinicos (con carga positiva) se atribuye a la capacidad de romper
membranas, inactivar enzimas productoras de energa y a la desnaturalizacin de las protenas externas de la
clula. Son compuestos de amonio cuaternario (NH4), en los que los hidrgenos se sustituyen por cadenas de
carbono. Uno de los ms usados, y el primero que se comercializ (1935), es el cloruro de benzalconio, por su
baja toxicidad y su buena accin detergente. El cloruro de benzalconio se usa en la desinfeccin preoperatoria
de la piel (concentracin del 0.05 - 0.5%) y en toallitas antispticas, posee un nivel de desinfeccin bajo. La
actividad antimicrobiana de los amonios cuaternarios (o Quats, por si siglas en ingls) se inactiva por los
surfactantes aninicos, como los jabones. Sin embargo, los Quats de tercera generacin permanecen activos en
aguas duras y toleran residuos aninicos, por lo que se usan en la limpieza de pisos y paredes. Otros
desinfectantes relacionados son la clorhexidina y la octenidina. Son desinfectantes de material mdico,
alimentacin y antisepsia de la piel.
9. FORMALDEHIDO: puede utilizarse en solucin (Formalina) o al estado gaseoso como gas (formol) para
desinfectar ambientes de trabajo (aire). Al mezclar Permanganato de potasio (1 parte) con Formalina (2 partes),
se libera gas formol que es altamente bactericida y virucida.
Esterilizacin de virus
La velocidad de inactivacin de los virus se relaciona con la concentracin del agente y la duracin de la
exposicin. Los agentes inactivantes de virus son el formaldehdo, la luz ultravioleta, la hidroxilamina y los
elementos radioactivos.
Los agentes activos contra las protenas virales son calor, enzimas proteolticas, cidos dbiles, luz
ultravioleta, compuestos sulfhidrilos y detergentes. Los agentes lipotrficos virales son solventes (como el
cloroformo)
10. CIDOS Y ALCALIS: A pH extremos los microorganismos se inactivan. Sin embargo, algunos microorganismos
toleran pH muy extremos. Esto presenta utilidad, por ejemplo, para detectar M. tuberculosis al resistir pH bsico
(lcalis). Las sustancias qumicas que alteran el pH son utilizados principalmente para la preservacin de otros
compuestos qumicos, como los alimentos en la industria alimentaria. Ejemplos:
- cido benzoico.- Refrescos, alimentos cidos
- cido srbico.- Quesos
- Propionato clcico.- Pan
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TRABAJO PRACTICO 8
CONTROL DE MICROORGANISMOS. AGENTES QUIMICOS DE CONTROL
El alumno ser capaz de contrastar los mtodos de control de microorganismos segn su indicacin de
uso de acuerdo a los resultados obtenidos en la actividad de laboratorio

2.- Efecto de limpiadores y desinfectantes de superficies.
Utilizando placas de agar tripticasa de soya, los estudiantes deben dividir utilizando un marcador la placa en dos
partes. En la primera mitad sembrar una muestra obtenida con una trula humedecida con agua destilada
estril, que se ha pasado por una superficie sucia, posteriormente utilizando los desinfectantes presentes en
el mesn, deber seleccionar uno de ellos y limpiar la misma superficie de la cual ya tom la muestra, no olvide
registrar el tiempo que utiliz para limpiar la superficie y el tiempo en que el desinfectante estuvo actuando.
Posteriormente utilizando una nueva trula estril humedecida se debe volver a tomar una muestra y sembrar
en la otra mitad de la placa. Repetir la operacin segn las indicaciones del profesor.
Desinfectantes propuestos:
Solucin de Cloro (hipoclorito de sodio), solucin de limpiador de piso, solucin limpiador en crema, aerosol
desinfectante, solucin lavalozas, solucin de Soda Caustica, solucin de detergente lquido o en polvo
3.- Desinfeccin corporal.
Para determinar el efecto de antispticos sobre la microbiota normal del cuerpo, se debe realizar el mismo
procedimiento descrito previamente, seleccionando una superficie, tomando la muestra y retomando posterior
a la limpieza.
Solucin Alcohol 70%, solucin Povidona yodada, solucin Alcohol Gel, solucin Cloruro de benzalconio, solucin
Cloruro de cetilpiridinio, solucin de clorhexidina, solucin de triclosan, solucin Jabn lquido, solucin
enjuague bucal.
4.- Documente los datos necesarios para la preparacin del reporte
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CONTROL DE MICROORGANISMOS
AGENTES ANTIBACTERIANOS
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD MICROBIANA A ANTIBITICOS
Los antibiticos son productos naturales de hongos, actinomicetos o bacterias, capaces de matar a los
microorganismos o de inhibir su crecimiento. La produccin de antibiticos se asocia en particular con
microorganismos del suelo, presentes en la naturaleza, que al parecer proporcionan una ventaja selectiva a esos
microbios en su competencia por el espacio y los nutrientes. Aunque la mayora de los agentes antibacterianos y
antimicticos, usados hoy da en clnica, proceden de productos naturales de la fermentacin, la mayor parte de
esos productos despus son modificados qumicamente para mejorar sus propiedades antibacterianas o
farmacolgicas. Sin embargo, otros antibacterianos son completamente sintticos, como las sulfamidas y las
quinolonas. As pues, el trmino antibacteriano se usa con frecuencia en vez del trmino antibitico.
A. Espectro de actividad antibacteriana.
Cada agente antibacteriano puede actuar solamente sobre un determinado nmero de especies
bacterianas, de tal manera que su utilidad clnica se dirige a las infecciones producidas por ese grupo de
microorganismos. Por ejemplo, es ms difcil afectar a las bacterias Gram-negativa que a las Gram positivas,
debido a que la complejidad de la envoltura dificulta la penetracin del antibacteriano el medio intracelular. El
conjunto de especies bacterianas que pueden ser inhibidas o muertas por un agente antibacteriano (que son
susceptibles al antibacteriano) constituye el espectro de actividad antibacteriana, para ese agente en particular.
Generalmente, se acepta que los antibacterianos que actan solamente sobre bacterias Gram-positivas, o bien
solamente sobre Gram-negativas poseen espectro antibacteriano reducido. En cambio, aquellos que pueden
actuar sobre especies de ambos grupos de microorganismos poseen amplio espectro antibacteriano. Es
importante comprender que esta clasificacin de espectro antibacteriano se relaciona a la tendencia del
compuesto para actuar preferentemente sobre uno o los dos grupos bacterianos definidos por la tincin de
Gram.
B. Tipo de actividad antibacteriana.
Los antibacterianos pueden inhibir el desarrollo bacteriano (actividad bacteriosttica) o matar
microorganismos (actividad bactericida). En el laboratorio se expresa la actividad inhibitoria de estos
compuestos a travs de la concentracin mnima inhibitoria (CMI) y la actividad bactericida a travs de la
concentracin mnima bactericida (CMB). La primera (CMI) se define como la concentracin ms baja de
antibacteriano que es capaz de inhibir el crecimiento o desarrollo de una cepa bacteriana, y la segunda (CMB),
como la menor concentracin que produce la muerte del cultivo. Ambas concentraciones se pueden determinar
con relativa exactitud en el laboratorio y son frecuentemente utilizados para evaluar la actividad antibacteriana
de los compuestos antibacterianos.
Un antibacteriano tendr mayor potencia en la medida en que sus CMI y CMB sean ms bajas, es decir, que
las concentraciones requeridas para inhibir o matar una cepa bacteriana sean bajas. Cuando un agente
antibacteriano es administrado en el organismo como tratamiento de un proceso infeccioso, puede manifestar
una actividad bacteriosttica o, bien, una bactericida sobre el agente etiolgico. En el primer caso se denominan
compuestos bacteriostticos y si pueden matar microorganismos in vivo se denominan bactericidas. El efecto
que produce el antimicrobiano in vivo es una consecuencia de la relacin entre la CMI, la CMB y la concentracin
de antibacteriano que se alcanza en el lugar de la infeccin. La mayor posibilidad de obtener un efecto
bactericida in vivo sobre una cepa bacteriana existe cuando la CMB del antibacteriano es muy baja, ya que es
hace factible que en el organismo se sobrepase dicha concentracin.
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Los agentes antibacterianos se clasifican de tres formas:

1. De acuerdo a su accin bactericida o bacteriosttica, es decir, si son capaces de matar a la bacteria o de
inhibir su crecimiento.
2. De acuerdo a la zona diana o blanco donde actan los antibiticos (sntesis de pared celular, sntesis de
protenas, sntesis de cidos nucleicos, funcin de la membrana celular).
3. De acuerdo a su estructura qumica (-lactmicos, sulfas, quinolonas, tetraciclinas, etc.).
Estudios de sensibilidad antimicrobiana:
Los mtodos de susceptibilidad antimicrobiana o antibiogramas son mtodos que determinan in vitro la
sensibilidad de los microorganismos a una variedad de agentes antimicrobianos bajo condiciones especficas y
estandarizadas.
En los diversos test de sensibilidad antimicrobiana, se determina la mnima concentracin de antibitico
que inhibe el crecimiento de un microorganismo in vitro (CIM).
a) Difusin en agar (por disco): Este es un mtodo cualitativo, a diferencia de los otros procedimientos. En este
caso un microorganismo se inocula en la superficie de una placa de agar y luego se colocan discos de papel
impregnados con una concentracin conocida del antibitico. Durante la incubacin el antibitico difunde desde
el disco, de manera radial, a travs del agar. La concentracin va disminuyendo a medida que se aleja del disco.
En un punto determinado, la concentracin del antibitico en el medio es incapaz de inhibir al microorganismo
en estudio y se produce el lmite en el cual la bacteria ya es capaz de desarrollarse, el resultado es una zona
circular de inhibicin del crecimiento bacteriano en torno al disco (halo). El dimetro del halo de inhibicin
permite clasificar la respuesta del microorganismo al antibitico, categorizndolo como susceptible (sensible),
intermedio o resistente, de acuerdo a las tablas publicadas por el CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute). Si
las recomendaciones para realizar este mtodo son fielmente seguidas, las categoras S, I o R se correlacionan
muy bien con los resultados de los otros mtodos. Este mtodo es el ms comnmente usado.
b) Dilucin en agar: Es considerado el mtodo de referencia. Consiste en inocular placas conteniendo una
determinada concentracin de un antibitico con el microorganismo en estudio. Despus de la incubacin (16
a18 horas), se examina si el microorganismo creci o no en cada una de las placas inoculadas, as se determina la
concentracin inhibitoria mnima (CIM) para el antibitico en estudio. Por ejemplo, si una cepa de S. aureus
crece en una placa que contiene una concentracin de oxacilina de 0.06 g/mL, pero no crece en una placa con
una concentracin de oxacilina de 0.12 g/mL, significa que la concentracin mnima de oxacilina que se
requiere para inhibir a ese organismo es 0.12 g/mL.
c) Dilucin en caldo: Para este caso se utilizan tubos (macro dilucin) o microplacas (micro dilucin) que
contienen concentraciones crecientes de un determinado antibitico. El microorganismo en estudio es
inoculado en los diferentes tubos o pocillos de la microplaca y la concentracin inhibitoria mnima es
determinada despus de la incubacin, de la misma forma descrita anteriormente para el mtodo de dilucin en
agar.
d) E-test: Es un mtodo ms simple para obtener una CIM. Utiliza una tira de plstico que contiene
concentraciones crecientes de un determinado antibitico que van desde 0.016 g/mL hasta 256 g/mL. Esta
tira se pone sobre una placa de agar que ha sido inoculada con el organismo en estudio. Despus de incubar la
placa por 16 a 18 horas, se forma un rea de inhibicin en forma elptica y la concentracin inhibitoria mnima se
lee directamente. Este es el mtodo de eleccin para hacer estudios de susceptibilidad en bacterias fastidiosas o
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con requerimientos especiales, como por ejemplo: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes,
Haemophilus influenzae y bacterias anaerbicas.
e) Mtodos automatizados: en este momento existen varios sistemas que ofrecen distintos niveles de
automatizacin y que pueden ser usados por los laboratorios de microbiologa para el estudio de
susceptibilidad. Los instrumentos en el mercado utilizan una medicin turbidimtrica o fluoromtrica para
detectar crecimiento bacteriano en un medio lquido. La mayora de ellos utilizan el mtodo de microdilucin y
perodos de incubacin menores que los habituales. Estos mtodos son bastante confiables para el estudio de
enterobacterias y otras bacterias de crecimiento rpido, pero no son adecuados para microorganismos de
crecimiento lento o requerimientos especiales.
TRABAJO PRACTICO 9
CONTROL DE MICROORGANISMOS. AGENTES ANTIBACTERIANOS
El alumno es capaz de interpretar los resultados de la actividad antibacteriana in vitro de acuerdo a las
normativas CLSI.

2.- Realizacin de antibiograma. En dos placas, una de agar sangre y la otra de agar Mueller Hinton, sembrar una
cepa Gram positivo y una Gram negativo respectivamente. Probar 6 sensidiscos por placa los cuales deben ser
colocarlos con pinzas previa esterilizacin con alcohol puro
Gram negativo: ampicilina, cefuroxima, cefadroxilo, ciprofloxacino, sulfatrimetoprin, gentamicina
Gram positivo: cloxacilina, cefuroxima, cefadroxilo, ciprofloxacino, sulfatrimetoprin, gentamicina
Despus de la incubacin analizar resultados y discuta con sus compaeros
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HALOS DE INHIBICION CLSI: ENERO 2014 M100-S24 Vol.34 N1
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El siguiente cuadro indica consideraciones explicativas
* Staphylococcus spp.
A: Staphylococcus aureus
$: Streptococcus pneumoniae
L: Staphylococcus lugdunensis
Sm: Stenotrophomonas maltophilia
**Staphylococcus coagulasa-negativa
St: Salmonella typhi, extraintestinal spp.
P: Pseudomonas aeruginosa
Ac: Acinetobacter spp.
Eb: Enterobacteriaceae
E: Enterococcus spp.
H: Haemophilus spp.
Sv: Streptococcus grupo viridans
Sb: Streptococcus Beta hemoliticos
B: Burkholderia cepacia
N: Neisseria gonorrhoeae
Nm: Neisseria meningitidis
V: Vibrio cholerae
SDD Susceptible dependiente de la Dosis(dosis mayores a las normales)
NOTAS: Para Burkholderia cepacia slo se informa CAZ y MRP

Para Stenotrophomonas maltophilia slo se informa LVX y SX
Cloramfenicol no se informa en cepas del tracto urinario.
En Salmonella spp. y Shigella spp. las Cefalosporinas de primera y segunda

generacin pueden ser activas in vitro, no son efectivas clnicamente, por lo que no deben
informarse como S.
NOTAS: Klebsiella spp. y Escherichia coli que producen beta-lactamasa de espectro

extentido (BLEE), son clnicamente R a Penicilinas, Cefalosporinas o
Aztreonam a pesar de ser S in vitro.
En cepas de LCR debe informarse CTX y CTR

CFM no es aplicable a Morganella spp.
CPR no es aplicable a Providencia spp. por dar S falsa.
NOTA: Cepas de Staphylococcus aureus resistente a los macrlidos y cepas de

Staphylococcus spp. coagulasa negativo, pueden tener resistencia constitutiva o
inducible a la Clindamicina; o pueden ser resistentes slo a los macrlidos.
La resistencia inducida a la Clindamicina se puede detectar usando el Test de
aproximacin de discos, poniendo el disco de Clindamicina (2 mcg) entre 15 a 26
mm del disco de Eritromicina (15 mcg), como procedimiento normal del mtodo de
difusin del disco.
Despus de la incubacin, los microorganismos que no muestran aplanamiento del halo

de la Clindamicina deberan reportarse como Clindamicina Susceptible, por otra parte,
aquellos que presentan aplanamiento del halo dela Clindamicina adyacente al disco de
Eritromicina (REFERIDA COMO ZONAD) indica Resistencia Inducible a la Clindamicina.
Estas cepas deben informarse como CLINDAMICINA RESISTENTE.
PRINCIPALES NOVEDADES 2014:
IMIPENEM: Cambian los valores de los Halos R-I-S con Acinetobacter spp.
MEROPENEM: Cambian los valores de los Halos R-I-S con Acinetobacter spp.
CEFEPIME: Se introduce el rango SDD (susceptibilidad dependiente de la dosis).
TRABAJO PRACTICO 10
CONTROL DE MICROORGANISMOS. AGENTES ANTIBACTERIANOS 2
El alumno es capaz de interpretar los resultados de la actividad antibacteriana in vitro de acuerdo a las
normativas CLSI.

2.- Los estudiantes revisan las placas y analizan los halos de inhibicin del crecimiento, deben medir utilizando
una regla. CADA GRUPO DEBE LLEVAR UNA REGLA.
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UNIDAD DE APRENDIZAJE III

MICROBIOTA BACTERIANA NORMAL Y PATGENA.
Son capaces de desarrollar una estrategia experimental para distinguir dentro de un set de bacterias
problema
Son capaces de interpretar resultados microbiolgicos y de acuerdo al caso clnico realizar la

identificacin del patgeno presente.
Distinguen las caractersticas de la microbiota normal respecto de la microbiota asociada a un proceso

infeccioso, de acuerdo a los resultados obtenidos en la actividad de laboratorio

Sesin 11
Seleccin de la muestra problema ya anlisis del caso clnico
Sesin 12.
Revisin grupal de la solicitud de materiales y protocolo diseado para la identificacin del patgeno en cuestin
Sesin 13
Desarrollo de la actividad. La actividad se realizar a la semana subsiguiente para recopilar materiales
solicitados.
Sesin 14
Revisin de resultados, interpretacin de datos y plenario final de la actividad
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MICROBIOTA NORMAL DEL CUERPO HUMANO

Los microorganismos no slo estn presentes en el ambiente que rodea al hombre, sino que se
encuentran en toda la bisfera, pues son ubicuos. La colonizacin microbiana del individuo comienza con el
nacimiento. Los primeros microorganismos en establecerse son aquellos transferidos desde la vagina materna y
del rea perineal hacia la piel, la boca, la nariz y regin farngea del nio, al pasar por el canal de parto. Las
microbiotas caractersticas de otras reas en el adulto se desarrollan posteriormente, y derivan y se seleccionan
de diversas fuentes ambientales.
La piel y mucosas hospedan a una gran variedad de bacterias que forman parte de la microbiota normal
y se pueden dividir en:
a) Microbiota residente. Son microorganismos relativamente fijos que se encuentran en un sitio anatmico
determinado. Si esta microbiota se trastorna rpidamente es restablecida. Son microorganismos comensales y
su permanencia en un rea particular depende de factores como temperatura, humedad, nutrientes e
inhibidores.
b) Microbiota transitoria. Son microorganismos que se hospedan en la piel o mucosas en forma transitoria,
provienen del ambiente y no producen enfermedad a no ser que la microbiota residente sufra alteraciones. Si
esto sucede, la microbiota transitoria puede colonizar, proliferar y llegar a producir enfermedad.
Microbiota normal de la piel
La piel, debido a su constante exposicin y contacto con el ambiente, es capaz de albergar muchos
microorganismos transitorios; sin embargo, existe una microbiota residente constante y bien definida,
diferencindose entre los sitios anatmicos. Esto sucede por las condiciones de cada sitio, como la presencia de
secreciones, el hbito de llevar ropa, proximidad de las mucosas, etc. La sudoracin abundante, el lavado y el
hbito de baarse no eliminan ni modificar significativamente a la microbiota normal residente.
Algunos microorganismos de la piel son:
- Staphylococcus epidermidis
- Staphylococcus aureus (pequea cantidad)
- Micrococcus spp.
- Streptococcus alfa hemolticos
- Streptococcus no hemolticos
- Propionibacterium spp.
- Peptococcus spp.
- Otros microorganismos como Candida spp., Acinetobacter spp. entre otros, en personas que trabajan en el
rea de la salud.
Microbiota Normal de la boca y Vas Respiratorias
Las mucosas de la boca y de la faringe son a menudo estriles al nacer, pero son colonizadas en el paso
por el canal vaginal. Entre 4 y 12 horas despus del nacimiento se establecen Streptococcus del grupo viridans
como microbiota residente, junto con Staphylococcus spp., Neisseria spp. y difteroides, en trminos generales
bacterias aerobias y anaerobias.
En la faringe, trquea y fosas nasales se establece una microbiota similar. En los bronquios se
encuentran slo algunas bacterias, pues bronquios y alvolos son normalmente estriles.
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Algunos microorganismos de nasofaringe son:

- Difteroides
- Neisseriaspp. (no patgenas)
- Varias especies de bacterias anaerobias
Microbiota Normal del Intestino
Al nacer el intestino es estril, pero pronto son introducidos los microorganismos con los alimentos y la
saliva.
Microorganismos intestinales:
- Enterobacterias (en gran cantidad) (excepto Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia spp., Vibrio spp.,
Campylobacter spp.)
- Enterococcus spp.
- Levaduras en escasa cantidad
- Anaerobios en gran nmero
- Staphylococcus aureus (escasa cantidad)
Microbiota Normal de Uretra
La porcin anterior de la uretra en ambos sexos contiene un nmero pequeo de los mismos tipos de
microorganismos hallados en piel y perineo.
Microbiota Normal de la Vagina
Poco despus del nacimiento aparecen en la vagina lactobacilos aerobios (bacilos de Doderlein) los
cuales permanecen mientras el pH es cido, cuando el pH se hace neutro (pubertad) aparecen cocos, bacilos y
los lactobacilos en gran cantidad, lo que permite una proteccin contra microorganismos patgenos.
Microorganismos comensales de la vagina:
- Lactobacillus spp.
- Corynebacterium spp.
- Anaerobios
Microbiota Normal del Ojo (conjuntiva)
Los microorganismos del ojo son preferentemente difteroides, Neisseria spp. (no patgenas). La microbiota de la
conjuntiva se mantiene normalmente regulada por el flujo de las lgrimas, ya que stas contienen enzima
lisozima naturalmente (antibacteriano).
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Microorganismos comensales del ojo:

- Difteroides
- Neisserias ssp. (no patgenas)
- Haemophilus ssp. (no patgenos)
- Staphylococcus no hemolticos
Es vlido enfatizar que, en general, los anaerobios estrictos tienden a exceder en nmero a las formas
aerobias y facultativas, por un factor de 10 a 100 o ms. Existe una permanente interaccin tanto entre los
mismos componentes de la microbiota, como con el hospedador; esto conduce a fluctuaciones en la biota, tanto
cualitativamente como cuantitativamente, lo cual manifiesta efectos ms o menos pronunciados en el
hospedador. Estos efectos pueden ser beneficiosos, inaparentes, o incluso, perjudiciales.
En otras zonas del cuerpo existen cantidades menores de microorganismos, a menudo en trnsito (como
el resto del aparato digestivo y respiratorio, la vejiga y el tero). El hallazgo de microorganismos patgenos en
estos sitios es altamente sugestivo de enfermedad, pero no constituye una prueba. En el otro extremo se
encuentran ciertos tejidos y rganos que son normalmente estriles, donde la presencia de microorganismos se
considera de importancia diagnstica, por ejemplo: Sangre, lquido cefalorraqudeo (LCR), lquido de cavidades
estriles (sinovial, pleural, etc.) y los tejidos profundos en general.
Normalmente existe un equilibrio entre los microorganismos de la microbiota y el hospedero. Sin
embargo este equilibrio puede romperse por:
- Aumento de la masa crtica
- Traslado desde el sitio original
- Ruptura de barreras mecnicas por traumatismos.
Esto produce una proliferacin e invasin de los microorganismos, dando origen a una infeccin
endgena. Por lo general, se requieren algunos determinantes para que se produzcan estas enfermedades,
como:
- Deficiencia en el estado inmunitario del hospedero.
- Tratamiento inmunosupresor o con corticoides.
- Cirugas.
- Uso de antibiticos.
Como ejemplos de infeccin endgena se pueden mencionar:
- Infeccin urinaria por Enterobacterias.
- Endocarditis bacteriana por microorganismos de la boca (Streptococcus grupo viridans)
- Diarrea por sobreinfeccin de Clostridium difficile, debido al uso prolongado de antibiticos.
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TRABAJO PRACTICO 11
MICROBIOTA BACTERIANA NORMAL Y PATGENA
El alumno distingue las caractersticas de la microbiota normal y de la microbiota asociada a un proceso
infeccioso, de acuerdo a los resultados obtenidos en la actividad de laboratorio.
PLANIFICACIN
Esta actividad est diseada para ser realizada en cuatro sesiones de laboratorio
Sesin 11
Seleccin de la muestra problema y anlisis del caso clnico
Actividades a desarrollar.
Disee una estrategia, con ayuda de la manual de laboratorio-libros-gua del profesor, que les permita
responder identificar al microorganismo patgeno seleccionado utilizando el caso clnico que se le ha sido
asignado. Se les pide obtener la mayor informacin posible en un tiempo acotado y usando los recursos
disponibles en el laboratorio de microbiologa que disponen.
Usted dispone de una semana para elaborar un listado con los materiales y/o reactivos necesarios para
desarrollar su estrategia, el cual debe ser coherente con los materiales y equipos disponibles en el laboratorio.
Su caso clnico podr referir a tres posibles bacterias, usted deber identificar de cual se trata de acuerdo a la
siguiente pauta:
1. - Staphylococcus sp. / Streptococcus sp. / Enterococcus sp.

2. - Escherichia coli / Proteus sp. / Shigella sp.
3. -Pseudomonas sp. / Klebsiella sp. / Enterococcus sp.
4. - Staphylococcus sp. / Escherichia coli / Enterococcus sp.
5. - Klebsiella sp. / Proteus sp. / Escherichia coli
6. - Shigella sp. /Salmonella sp. /Escherichia coli
7.- Salmonella sp. / Klebsiella sp. / Proteus sp.
EJEMPLO: supongamos que un grupo de estudiantes elige un caso clnico donde puede tratarse de la serie 2.Escherichia / Proteus / Shigella
Los estudiantes revisan la hoja con la descripcin de un caso clnico donde no se especifica que bacteria
presenta el paciente pero aparece alguna descripcin que puede guiar a los estudiantes. De acuerdo a esta
informacin, los estudiantes disponen de una semana para proponer materiales que le permitan identificar a la
bacteria problema dentro de las 3 bacterias presentadas.
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Sesin 12
Revisin grupal de la solicitud de materiales y protocolo diseado para la identificacin del patgeno en cuestin
El profesor revisa los materiales solicitados a los estudiantes y los orienta en caso de que se necesite, el profesor
puede proponer otras pruebas microbiolgicas los estudiantes.
Sesin 13
Desarrollo de la actividad. La actividad se realizar a la semana subsiguiente para recopilar materiales
solicitados.
El profesor (quien conoce la muestra problema) entrega el tubo correspondiente segn la hoja de caso clnico
previamente entregada (no olvide llevarlo).Los estudiantes reciben el material que ellos mismos pidieron, y
desarrollan su actividad,
Sesin 14
Revisin de resultados, interpretacin de datos y plenario final de la actividad
Los estudiantes construyen su reporte final y preparan una exposicin corta de sus resultados y debern
presentarlo oralmente.
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UNIDAD DE APRENDIZAJE IV
MICROORGANISMOS EUCARIONTES
Reconoce hongos y parsitos a partir de muestras macroscpicas y/o microscpicas, segn parmetros
morfolgicos clsicos de identificacin
Esta unidad se desarrollar en 1 sesin de laboratorio que incluir las siguientes actividades:
Sesin 15
Observacin y anlisis de diversas muestras de hongos y parsitos
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HONGOS
Los hongos son organismos eucariontes. El cuerpo o talo de los hongos puede ser unicelular o pluricelular.
Figura 30. Esquema de caractersticas macroscpicas de los hongos
Tanto las levaduras como los hongos filamentosos se siembran en agar Sabouraud, cuyo contenido en
glucosa es mayor que el de otros medios de cultivo y se incuban a 25-30C. El tiempo de incubacin vara de
acuerdo a la especie fngica (levaduras y hongos ambientales 48 horas aprox., hongos dermatofitos 15-30 das).
HONGOS UNICELULARES (LEVADURAS)
Las levaduras son organismos fngicos unicelulares que generalmente se reproducen asexualmente por
yemacin. Los criterios usados para el diagnstico son fundamentalmente morfolgicos (macroscpicos y
microscpicos).
Existen varias levaduras de importancia clnica, entre ellas estn las que pertenecen al gnero Candida.
De las especies de este gnero, Candida albicans es la ms frecuentemente aislada desde muestras clnicas. Su
identificacin se basa en criterios fisiolgicos y escasamente en criterios morfolgicos. El estudio morfolgico de
las levaduras permite orientar o aproximar hacia el gnero, pero la identificacin definitiva se hace siempre
sobre la base de pruebas bioqumicas.
Las pruebas de identificacin de levaduras pueden agruparse en dos categoras:
Pruebas morfolgicas
a) Aspecto de las colonias
b) Observacin microscpica de los cultivos
c) Presencia de ascosporas
Pruebas fisiolgicas
a) Temperatura mxima de crecimiento
b) Crecimiento en presencia de cicloheximida
c) Capacidad de utilizar diversos compuestos como nica fuente de carbono en condiciones de aerobiosis
d) Capacidad de fermentacin de diversos azcares
e) Capacidad de utilizacin de diversos compuestos como fuente nica de nitrgeno
f) Actividad ureasa
g) Capacidad de crecimiento con altas concentraciones de glucosa
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Candida albicans
Levadura capaz de filamentar. Su identificacin se basa en la capacidad de formar un talo germinativo al
ser incubada a 37Cen plasma humano durante 3-4 horas.
- Aspecto macroscpico: Colonias blancas, cremosas, brillantes.
- Aspecto microscpico: Clulas ovoides y presencia de pseudomicelios
- Importancia clnica: De las variadas especies de Candida spp. slo unas pocas se consideran importantes como
patgenos humanos, siendo Candida albicans la que con mayor frecuencia se relaciona con infecciones en
humanos, desde un simple compromiso superficial de la piel y las mucosas hasta cuadros profundos del tipo
invasivo en pacientes inmunocomprometidos.
HONGOS FILAMENTOSOS
La identificacin de los hongos filamentosos est basada principalmente en las caractersticas macro y
microscpicas de las colonias. Entre estas, la morfologa microscpica de los cultivos es la que proporciona los
datos ms importantes: el grosor de los filamentos, el tipo y la distribucin de los septos, y, sobre todo, la forma,
el tamao y la disposicin de las esporas y de las estructuras formadoras de stas. Entre los hongos filamentosos
la cantidad y tipo de esporas son muy variables, y estn afectadas por diferentes factores, como el tipo de medio
y las condiciones de cultivo. A fin de conseguir unas condiciones ptimas de esporulacin, es de gran
importancia ofrecer al hongo las mejores condiciones de crecimiento posibles.
Los principales mtodos aplicados para la observacin microscpica de los cultivos son: la observacin
en fresco, con una solucin adecuada y las preparaciones en cinta adhesiva. Los cultivos observados segn estos
mtodos resultan tiles en la mayora de los casos para identificar las especies, pero en muchas ocasiones no
permiten revelar las principales caractersticas morfolgicas de una especie determinada. En estos casos es
necesario recurrir a un tipo de preparacin ms compleja, como es la realizacin de microcultivos o cultivos en
portaobjetos.
Los hongos filamentosos pueden ser:
- sifonados o no septados
- septados o tabicados
Los hongos sifonados son generalmente multinucleares (Ej. Mucor spp.) y los hongos septados presentan hifas
con tabiques que son prolongaciones de la membrana citoplasmtica (Ej. Aspergillus spp., Microsporum spp.,
Trichophyton spp., entre otros).
Hongos sifonados (Mucor spp.)
- Aspecto macroscpico: Presentan micelio algodonoso.
- Aspecto microscpico: Presencia de hifas especializadas (esporangiforo) que sostiene a una estructura
esfrica (esporangio) dentro de la cual se producen las esporas (endoesporas).
- Importancia clnica: La mucormicosis es el modelo de enfermedad por hongos oportunistas (cuando las
condiciones del hospedero favorecen su desarrollo). Se presenta en las formas clnicas rinocraneal, pulmonar,
gastrointestinal y diseminada.
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Hongos septados
Estos hongos pueden presentarse como contaminantes ambientales (Ej. Penicillium spp.), como patgenos
oportunistas (Ej. Aspergillus spp.) y como patgenos (Ej. Microsporum spp., Trichophyton spp., Epidermophyton
spp.)
Penicillium spp.
Se le considera un contaminante ambiental, se desarrolla en 3-4 das.
- Aspecto macroscpico: Colonias verde-azuladas o verde amarillas. Su superficie es aterciopelada, lanosa,
estriada o lisa, con el reverso incoloro o amarillo.
- Aspecto microscpico: Presenta hifas septadas de las que se origina una prolongacin (conidiforo) que en su
extremo distal presenta clulas conidiognicas con forma de botella (filides). Las filides producen los conidios
(espora asexuada externa) que tienen forma redondeada y los que se disponen en cadenas.
Aspergillus spp.
Hongo patgeno oportunista de crecimiento rpido (aprox. 48 horas).
- Aspecto macroscpico: Colonias aterciopeladas, algodonosas o pulverulentas, coloreadas (crema, verde, caf y
negras).
- Aspecto microscpico: Presenta hifas septadas de las que nace una prolongacin no septada (conidiforo), el
cual se dilata en su extremo distal (vescula) rodendose all de clulas conidiognicas (filides). Las filides
producen conidios, los que se disponen en forma de cadenas. El conjunto vescula, filide y conidios se conoce
como cabeza aspergilar.
- Importancia Clnica: El gnero Aspergillus puede producir reacciones alrgicas por la inhalacin de sus esporas;
colonizacin de vas areas; invasin de tejidos en sujetos con enfermedades de base.
Dermatofitos
Hongos patgenos agrupados en tres gneros (Microsporum, Trichophyton y Epidermophyton) que
producen lesiones de piel, pelo y uas. Son hongos filamentosos septados, queratoflicos, de ramificaciones
hialnicas de desarrollo lento (15-30 das).
- Aspecto macroscpico: Colonias algodonosas pulverulentas o creas. Color segn la especie (blanco. beige,
amarillo, etc.) Con o sin produccin de pigmentos que difunden en el medio de cultivo.
- Aspecto microscpico: Los diversos gneros pueden presentar hifas en bamb, en raqueta de tenis, en espiral,
etc. Las esporas externas pueden presentarse como microconidias (conidias pequeas) que nacen a lo largo de
la hifa y como macroconidias (conidias de gran tamao).
Mtodos de observacin de hongos
El examen microscpico de muestras para estudio de hongos tiene una gran utilidad. El sembrado en medios de
cultivo para aislamiento de especies micticas puede o no ser til, ya que no siempre resulta positivo cuando la
observacin directa es positiva.
Mtodo del KOH
Este tratamiento tiene por objetivo destruir gran parte de la estructura tisular, manteniendo inalterable a los
hongos, lo cual facilita su observacin al microscopio.
- Colocar unas gotas de KOH (con o sin tinta Parker) en un portaobjetos
- Colocar la muestra en el lquido y mezclar cuidadosamente
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Calentar suavemente al mechero sin hervir. La formacin previa de burbujas de gas indica que se aproxima
el momento de suspender el calentamiento.
Colocar un cubreobjetos y observar al microscopio con aumento menor (10x) y luego 40x
Observacin de cultivos
Es importante examinar los cultivos en la medida en que se estn formando porque esto facilita la observacin
de sus estructuras reproductivas caractersticas.
1. Suspensin en lactofenol.
Colocar gotas de lactofenol en portaobjetos con asa de metal sacar una pequea porcin de la colonia y
colocar en el lactofenol. Con dos asas metlicas, separar y extender suavemente la masa micelial y colocar
cubreobjetos. Observar, con bajo aumento, cambiando a aumento mayor. Lamentablemente este mtodo
no preserva la estructura y posicin de conidias, esporas y similares. Sin embargo, es un mtodo que debe
efectuarse.
2. Tcnica del celofn o cinta adhesiva.
Cortar un trocito de cinta adhesiva y formar un crculo con el pegamento hacia el exterior. Con una pinza
pegar sobre la superficie de la colonia del hongo y levantar. Luego abrir el crculo de cinta y colocarlo sobre
una gota de lactofenol en un portaobjetos de tal manera que se pegue al vidrio y observe al microscopio con
los aumentos correspondientes.
Figura 31. Diversidad de hongos, y estructuras fngicas
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PARASITOS
Se conocen como parsitos a los organismos que viven a expensas de otro individuo de distinta especie,
alimentndose de las sustancias que elabora o utilizndolo como nicho. Aunque pueden ser perjudiciales, no
llegan a causar la muerte. El trmino parsito, debido a que hace referencia a una forma de vida y no a una
clasificacin taxonmica, engloba a una gran cantidad de especies muy diversas entre s.
Para fines clnicos, se agrupan en Protozoos (organismos unicelulares eucariontes que no poseen pared
externa), Helmintos (gusanos) y Artrpodos. No todos los protozoos, gusanos o artrpodos son definidos como
parsitos, ya que ser clasificados como parsitos depende de la interaccin con un hospedador y de las
consecuencias de su ciclo infectivo.
En los ciclos de vida indirectos o heteroxnicos, los parsitos necesitan pasar por dos o ms hospederos
de distintas especies para alcanzar su pleno desarrollo. El hospedador infectado elimina al medio ambiente las
formas infectantes, por fecalismo llegan al hospedador intermediario, en ste se desarrolla un estado larval o
metacstodo en los tejidos y llega al husped susceptible a travs del carnivorismo.
CICLO BIOLGICO DE UN PARASITO
El conjunto de etapas y transformaciones que experimenta un organismo superior durante su desarrollo,
se conoce como ciclo de vida o ciclo biolgico. Estos ciclos, en parsitos, pueden ser directos (o monoxnicos), si
el parsito requiere de un solo hospedero para todo su desarrollo, o indirectos (o heteroxnicos) si necesita dos
o ms hospederos.
Figura 32. Ciclos biolgicos de parsitos

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HOSPEDADOR: Se denomina hospedador al ser vivo que alberga un parsito y podemos distinguir:
Definitivo: En el cual el parsito alcanza su madurez sexual y se reproduce
Intermediario: Alberga las formas larvales de los parsitos y se desarrolla parte de su ciclo biolgico
Paratnico: Aqul que transporta al parsito, pero en l no se desarrolla ninguna etapa del ciclo biolgico
CLASIFICACION DE LOS PARSITOS
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TRABAJO PRACTICO 15
El alumno es capaz de reconocer algunos hongos y parsitos a partir de la caracterizacin macro y

microscpica de sus estructuras.

1.- A partir de preparaciones microscpicas comerciales, cada grupo deber seleccionar al menos 2 muestras de
microorganismos eucariontes, 2muestras de parsitos y 2 muestras de artrpodos. Las muestras debern ser
observadas en el microscopio e inmediatamente dibujadas o fotografiadas, en su reporte deber incluir las
estructuras ms importantes observadas a travs del microscopio (al menos 3 por cada muestra) y deber incluir
una descripcin general del organismo analizado y su importancia clnica.
2.- Documente sus resultados en el reporte correspondiente
NO OLVIDAR: Su espacio de trabajo debe quedar completamente limpio, incluyendo limpieza y orden del
microscopio.
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UNIDAD DE APRENDIZAJE V
MICROBIOLOGIA EN EL CAMPO PROFESIONAL
Valida la asignatura, en el contexto de su perfil de egreso, de acuerdo a los conocimientos adquiridos y

obtenida a travs de entrevistas a futuros pares profesionales y otras fuentes de informacin

Sesin 16.
Presentacin del problema a investigar
Sesin 17 y 18.
Exposiciones orales.
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TRABAJO PRACTICO 16
MICROBIOLOGIA EN EL CAMPO PROFESIONAL
El alumno valida la asignatura, en el contexto de su perfil de egreso, de acuerdo a los conocimientos
adquiridos y obtenidos a travs de entrevistas a futuros pares profesionales y otras fuentes de
informacin.
PLANIFICACIN
Esta actividad est diseada para ser realizada en tres sesiones de laboratorio
Sesin 16
Diseen una estrategia de investigacin, a travs de utilizacin de bibliografa, entrevistas a pares profesionales
en sus respectivos ambientes de trabajo, etc., que les permita responder la siguiente inquietud.
Pregunta planteada De qu me sirve la microbiologa en mi futuro profesional?
Proponga la solucin a un problema real en el mbito de su carrera que pueda ser abordado a travs de la
microbiologa, la originalidad creatividad y factibilidad son importantes.
Sesin 17 y 18
Exposicin oral y discusin de los ejemplos encontrados.
Evaluacin: Se realizar a travs de rbricas para las exposiciones y la discusin.
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BIBLIOGRAFIA
Casanova, Egon R. (2006). Sndrome de respuesta inflamatoria sistmica. Revista mdica de Chile, 134(9), 12001202. Recuperado el da 30 de enero de 2015, de http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S003498872006000900018&lng=es&tlng=es. 10.4067/S0034-98872006000900018.
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Editorial Mdica Panamericana
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Laboratorio de Microbiologa General

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Principios de la Tincin de Gram

B. Tincin de Ziehl - Neelsen

Figura 18: Frotis con tincin de Ziehl-Neelsen

Figura 19. Micrografa de bacterias con flagelos teidos

A. Tincin para cpsula

Figura 20: Esquema del procedimiento de la tincin de cpsula

Figura 21: Cpsulas bacterianas con tincin negativa

Figura 23. Morfologa celular de las bacterias

Agrupacin de las clulas bacterianas

Sin agrupacin (aislada)

Agrupacin: empalizada y letra china

Figura 24. Agrupacin de bacterias bacilares

Sin agrupacin (aislada)

El alumno ser capaz de distinguir morfologa, afinidad tintorial y agrupacin bacteriana en

Actividades a desarrollar en la sesin prctica

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CRECIMIENTO BACTERIANO. MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO

Clasificacin de los medios de cultivo

PROCESAMIENTO DEMUESTRAS CLNICAS

La calidad del trabajo realizado en el laboratorio de microbiologa no puede ser superior

Deteccin del material gnico

Figura 26. Mtodos de diagnstico microbiolgico

Mtodos para la caracterizacin de microorganismos: