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Spectroscopy
Gonalo Figueir1
1
Resumo: O estudo da biodisponibilidade de uma molcula (como por exemplo um frmaco) pode ser feito
atravs da interao desta com protenas e biomembranas. Esta parte do projeto tem como objetivo estudar a
interao de uma amina gorda fluorescente, em que uma poro fluorescente de 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4ilo (NBD) se encontrava ligada covalentemente a um grupo amina, a butilamina (NBD-C4), com a protena BSA
usando a espectroscopia de fluorescncia. Foi determinada a constante de ligao do NBD-C4 BSA, Kb, cujo
valor foi de 1,96x104 M-1, na mesma ordem de grandeza de outros estudos, o que indica que esta molcula
anfiptica interage eficientemente com a BSA. Foi tambm analisado o processo de quenching de fluorescncia
da BSA o que permitiu calcular constante de Stern-Volmer e as constantes de ligao para diferentes percursos
ticos (10 mm: Kb=4,51x104 M-1; 5 mm: Kb=0,0508x104 M-1; 3 mm: Kb=0,0336 x104 M-1), que diferem do calculado
pelo mtodo anterior. Assim utilizando mtodos diferentes podemos chegar a concluses diferentes, e por isso
necessrio ter ateno a certos parmetros.
Palavras-chave: Fluorescncia, NDB-C4, BSA, Ligao BSA NBD-C4, Efeito de Filtro Interno, Quenching.
Introduo
A emisso de luz a partir de qualquer
substncia designada de luminescncia, e ocorre
atravs da passagem de estados eletronicamente
excitados para o estado fundamental. A luminescncia
dividida em duas categorias, dependendo do estado
natural do estado excitado: Fluorescncia e
Fosforescncia. Num estado excitado singleto, o
eletro que se encontra na orbital excitada apresenta
um spin oposto ao eletro na orbital do estado
fundamental. Consequentemente, o regresso do
eletro ao estado fundamental permitido pelo spin e
ocorre rapidamente pela emisso de um foto. Atravs
do diagrama de Jablonski (Figura 1) consegue-se
ilustrar os processos que ocorrem entre absoro e
emisso de luz. No diagrama aqui apresentado so
excludas as interaes (como o quenching, a
transferncia de energia e as interaes do solvente)
que podem ocorrer em soluo e influenciar o
processo de fluorescncia [2].
Adaptado:[http://sp3.fotolog.com/photo/35/46/88/pety18rbf/12275
07197144_f.jpg]
2|Pgina
Materiais e Mtodos
Reagentes. A albumina do soro de bovino
(BSA) sem lpidos, HEPES, EDTA bem como NaCl,
NaN3, HCl e NaOH foram obtidos da Sigma-Aldrich
Qumica S.A. (Sintra, Portugal). O composto NBD-C4
foi sintetizado no grupo de Qumica Biologia do
Centro de Qumica de Coimbra, de acordo com o
protocolo estabelecido [1] e gentilmente cedido pela
Dr Maria Joo Moreno. importante referir que a
BSA no possua lpidos, de maneira a que NBD-C4
interagisse simplesmente com a BSA.
Soluo tampo HEPES. Pesou-se 0.596 g
de HEPES, 2.1915 g de NaCl, 73.1 mg de EDTA e 50
mg de NaN3, com o objetivo de fazer uma soluo de
HEPES 10mM com 0.15M de NaCl, 1mM EDTA e
0.02% NaN3. Aps a dissoluo, procedeu-se ao acerto
do pH a 7.4 com uma soluo de NaOH 2.5M.
Soluo NBD-C4 em soluo tampo. O
NDB-C4 fornecido encontrava-se em metanol, pelo
que foi necessrio evaporar esse mesmo de forma a
diluir o fluorforo em soluo tampo, obtendo uma
concentrao inicial de 200 nM.
Estudo da ligao de NBD-C4 Albumina
do Soro Bovino. Com a finalidade de estudar a
afinidade que o NBD-C4 tem pela BSA, variou-se a
concentrao de BSA (de 0 a 150 M) e manteve-se a
concentrao de NBD-C4 constante, no valor 100 nM.
As amostras controlo no possuam NBD-C4 somente
BSA. Antes de realizar a medio da fluorescncia das
amostras, procedeu-se incubao das mesmas
durante 1-2 horas a 25C. A quantidade de NBD-C4
ligada albumina foi avaliada pelo aumento da sua
fluorescncia aps a ligao.
Estudo do quenching da protena. Neste
estudo, alterou-se a concentrao de NBD-C4, variar
de 1 a 68.2 M, e usou-se uma concentrao constante
de BSA, 5 M. As amostras de controlo no
continham BSA mas apenas as diferentes
concentraes de NBD-C4. Quando da obteno dos
espectros de fluorescncia, fez-se variar o percurso
tico (10 mm, 5 mm, 3 mm) influenciando a obteno
dos vrios parmetros e permitindo uma anlise do
quenching pela relao de Stern-Volmer. Tal como na
experincia anterior, antes das medies de
Resultados e Discusso
Estudo ligao da NBD-C4 Albumina do
Soro Bovino.
Antes da realizao dos seguintes estudos
obtiveram-se espectros de absoro do NBD-C4 e da
BSA, em que se observou que o mximo de absoro
ocorria para um de 460 nm e 280 nm, respetivamente
(Figura 4).
A)
=)
B)
=)
140
120
If
100
80
60
40
20
0
0
50
100
[BSA] (M)
150
200
If
160
140
120
100
80
60
40
20
0
1000
900
0,218; 54,839
A)
800
700
2
Abs 280 nm
600
500
400
300
200
100
0
285
335
385
nm
435
485
450
400
B)
350
300
250
If
If
200
150
100
50
0
285
335
385
nm
435
485
250
C)
200
If
150
100
50
0
285
0 M
5 M
20 M
50 M
335
nm 385
1 M
10 M
30 M
68,2 M
435
3 M
15 M
40 M
5|Pgina
Absorvncia (U.A)
Fluorescncia (U.A)
300
350
400 nm 450
500
550
(F0/F) - 1
2,5
2
1,5
1
0,5
0
-0,5
20
40
60
80
[NBD-C4] (M)
Percursos ticos
3 mm
5 mm
10 mm
Kb (x104 M-1)
0,0336
0,0508
4,51
n
0,662
0,666
1,054
A)
=)
Concluso
2
Referncias
B)
C)