Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
MICROBIOLOGA GENERAL
ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA:
MTODOS CUALITATIVOS Y
CUANTITATIVOS
Q.F. JULIO REYNALDO RUIZ QUIROZ
LIMA AGOSTO 2012
INTRODUCCIN
ENFERMEDADES INFECCIOSAS
Bacterias
Hongos
Virus
Parsitos
Problemas de
Salud Pblica
INTRODUCCIN
INVESTIGACIN ACTUAL: PLANTAS
COMPLEJIDAD QUIMICA
NO DISPONIBILIDAD DE
CULTIVOS ESTANDARIZADOS
DISMINUCIN INTERES
INDUSTRIA
FARMACUTICA
INTRODUCCIN
VALIDACIN Y SELECCIN DE ENSAYOS DE
SCREENING PRIMARIOS
Rpidos
Muestras grandes
Bajo costo
TIENE VENTAJAS
ES EL GOLD STANDARD
M.O. FCILES DE CULTIVAR
IMPORTANTE DISCRIMINAR ACCIN DE EFECTOS
TXICOS
Evaluacin de citotoxicidad
Inclusin de un panel de m.o. (bacterias, hongos,
virus y parsitos)
ACTIVIDAD ACTIBACTERIANA:
Mtodos cualitativos y Cuantitativos
MTODOS CUALITATIVOS
Difusin
Bioautografa
MTODOS CUANTITATIVOS
Dilucin
El gran inconveniente es que no existe a la fecha ningn
organismo que haya estandarizado la metodologa para el uso
de productos naturales.
Por esta razn se toma como base las tcnicas desarrolladas
para compuestos antimicrobianos puros de las siguientes
organizaciones
CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)
EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing)
ISO
SCREENING METHODS TO DETERMINE ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF NATURAL PRODUCTS Brazilian Journal of Microbiology (2007) 38:369-380
Gram positivas
Staphylococcus aureus ATCC 25933
Staphylococcus epidermidis cepa clnica
Bacillus subtillis cepa clnica
Gram negativas
Escherichia coli cepa clnica
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Inculo: 1 x 104 UFC/mL
Muestra: 100 uL (25 mg/mL)
Controles:
Oxacilina ( 1 g/disco)
Positivos Cloranfenicol ( 30 g/disco)
Norfloxacino (10 g/disco)
Negativo Etanol 95
Incubacin: 24 h a 37 C
Interpretacin: positiva halo de inh.
> 18 mm
Medio de cultivo:
Agar Mueller Hinton
METODOS BIOAUTOGRFICOS
Este mtodo consiste en incluir los cromatogramas obtenidos por
cromatografa en capa fina en un medio de cultivo.
METODOS BIOAUTOGRFICOS
El ensayo de bioautografa puede dividirse en 3 tipos:
a. BIOAUTOGRAFA DIRECTA: Donde los
microorganismos crecen directamente sobre la
capa fina cromatogrfica.
b. BIOAUTOGRAFA DE CONTACTO: Donde los
componentes antimicrobiales son transferidos de
la fina capa cromatogrfica y son inoculados en
una placa de agar a travs de contacto directo.
METODOS BIOAUTOGRFICOS
Cromatografa de Capa Fina (CCF)
Los extractos etanlico y de acetato de etilo se analizaron para CCF.
El volumen de inyeccin de ambos extractos se fij en 3l (20 mg / ml)
Se us placas cromatogrficas de silica gel 60 F254 (Merck).
Para detectar los flavonoides tres diferentes
sistemas de solventes se utilizaron:
acetato de etilo: cido frmico: metil etil
acetona: agua (5:1:3:1)
acetato de etilo: cido frmico: agua: metanol
(10:2:2:1)
etanol: cloroformo (1:3).
METODOS BIOAUTOGRFICOS
Bioautografa
Las placas desarrolladas de CCF se cubrieron con una capa de 1-2
mm del medio suave (agar BHI 0,6%) conteniendo 0,1% (w / v) de
cloruro de 2,3,5 trifeniltetrazolio (rojo tetrazolio) y una suspensin
de S. aureus a una concentracin final de 107 UFC / ml.
Las placas se colocan en una bandeja estril sellada para evitar que
la delgada capa de agar se seque, y se incuba a 37 C durante 24 h.
METODOS BIOAUTOGRFICOS
MTODOS DE DILUCIN
Se dividen en 2
- Dilucin en caldo
- Dilucin en agar
DILUCIN EN CALDO es una tcnica en la que los contenedores estn
llenos con volmenes iguales de caldo inoculado e idnticas volmenes de
una solucin de antibiticos, pero con un aumento de las concentraciones
forma incremental (por lo general geomtrica) del antibitico, y un inculo
definido.
El
objetivo de este mtodo es la determinacin de la ms baja
concentracin que inhibe el crecimiento bacteriano Concentracin Mnima
Inhibitoria (CMI)
El mtodo de dilucin en caldo puede ser realizado por macrodilucin o
microdilucin
MACRODILUCIN: Esto denota la ejecucin del mtodo en tubos que
contengan un mnimo de 2 ml
500
ul
por
pozo
MTODOS DE DILUCIN
PROCEDIMIENTO MACRODILUCIN
MTODOS DE DILUCIN
PROCEDIMIENTO MACRODILUCIN
MTODOS DE DILUCIN
PROCEDIMIENTO MACRODILUCIN
0,5 ml sol.
Producto
natural
Descartar 0,5 ml
Una vez terminada
La dilucin
Tubo
Control
Crec.
Tubo
Control
Esterilidad
El proced. Se
Repite hasta
el tubo 9
Homogenizar
0,5 ml MH caldo
Tubos 2 al 11
INCUBAR
Toda la noche
A 35-37 C
0,5 ml del inculo
(1,0 x 106 UFC/ml)
LECTURA: La ms baja concentracin de agente antibitico que inhiba el crecimiento del
m.o. ensayado, detectado por la prdidad de la visualidad de la turbidez, pareado con el
Control negativo, es conocido como la CMI.
MTODOS DE DILUCIN
PROCEDIMIENTO MACRODILUCIN
MTODOS DE DILUCIN
Microdilucin
MTODOS DE DILUCIN
CONTROL
NEG.
DROGAS
DE
REFERENCIA
CONTROL
POSITIVO
Determination of minimum inhibitory concentrations (MICs) of antibacterial agents by agar dilution Clinical
Microbiology and Infection, 2000; 6 (9): 509-515
MTODOS DE DILUCIN
Dilucin en agar: deteccin del CMI es visual
Dilucin en caldo
turbidez
VISUAL
ESPECTROFOTOMTRICO
CMB
julioruizquiroz@gmail.com