DETECCIN

DE

MUTACIONES

CROMOSMICAS.

La INESTABILIDAD GENTICA constituye uno de los fenmenos asociados al

inicio y progresin de tumores y de algunas enfermedades hereditarias con
predisposicin al cncer. Los mecanismos que caracterizan la inestabilidad
gentica son: La INESTABILIDAD DE MICROSATLITES, manifestado por un
elevado porcentaje de errores en la replicacin de nucletidos repetidos no
reparados y la INESTABILIDAD CROMOSMICA, donde las alteraciones, de
todo
tipo,
ocurren
a
nivel
de
segmentos
cromosmicos.
INESTABILIDAD DE MICROSATLITES
Los microsatlites son excelentes marcadores genticos y constituyen una
valiosa herramienta para el estudio indirecto de errores en la
reparacin/replicacin ya que su estructura repetitiva propicia que la ADN
polimerasa se equivoque al copiar la hebra molde del ADN.
Existe una gran variedad de metodologas para la determinacin de la
inestabilidad de los microsatlites. Se basan, fundamentalmente, en la
amplificacin
mediante
PCR
de
microsatlites
preferiblemente
mononucletidos y monomrficos, tanto en ADN procedente de sangre
(lnea germinal) como en ADN procedente de muestra tumoral (lnea
somtica). La deteccin de nuevos alelos en la muestra tumoral indica la
inestabilidad
de
microsatlites
(Fig.
1).
INESTABILIDAD CROMOSOMICA
La inestabilidad cromosmica es un proceso progresivo de prdida y
ganancia de todo o parte de uno o muchos cromosomas en cada ciclo
celular. Esta inestabilidad puede derivar en la adquisicin de mutaciones en
genes responsables del mantenimiento de la integridad del genoma
(Housekeeper genes) y/o en genes que controlan directamente la
proliferacin celular (Gatekeeper genes).
La hiptesis aceptada del origen de la inestabilidad cromosmica, se inicia
por el proceso conocido como acortamiento de los telmeros (determinado
por la ausencia de secuencias TTAGGG). Este fenmeno compromete a los
extremos terminales de los cromosomas que quedan desprotegidos
provocando la formacin de anillos y cromosomas dicntricos. Estas
alteraciones cromosmicas pueden originar, en la siguiente divisin,
puentes anafsicos que daran lugar a nuevas roturas cromosmicas
(alteraciones estructurales) y/o induciran fallos en la cariocinesis como
clulas binucleadas y mitosis multipolares en la siguiente divisin
(alteraciones numricas). Se inicia as el caos cromosmico que define la
inestabilidad cromosmica. (Fig.2) Las mutaciones cromosmicas se
clasifican, por tanto, en:
Mutaciones numricas; pueden ser causadas por prdida o ganancia de
unos pocos cromosomas en metafase/anafase (aneuploida) o por divisiones

multipolares o errores en la cariocinesis asociadas con prdidas y ganancias

de gran nmero de cromosomas y estructura de centrosomas. (Figura 3)
Mutaciones estructurales; Las inversiones y las translocaciones pueden
causar rupturas en los genes supresores de tumores, fusionar genes que
producen protenas cancergenas o mover genes a nuevas ubicaciones,
donde quedan bajo la influencia de diferentes secuencias reguladoras
(Figura 3).
Un incremento en el porcentaje de mutaciones cromosmicas resulta en una
elevada frecuencia de otras anomalas, algunas de ellas pueden promover la
proliferacin de las clulas tumorales y su viabilidad. Este elevado nmero
de mutaciones cromosmicas parecen ser un prerrequisito para el proceso
oncogentico -inactivacin de genes supresores de tumor y amplificacin de
oncogenes-. En cualquier caso, el total de alteraciones cromosmicas es
proporcional al riesgo de metstasis.
TCNICAS CITOGENTICAS
CARIOTIPO Los cromosomas poseen una serie de caractersticas, como la
forma, el tamao, la posicin del centrmero y las bandas que presentan al
teirse. Este conjunto de particularidades que permite identificar los
cromosomas, recibe el nombre de cariotipo. Esta tcnica incluye: Cultivo
celular, sacrificio del mismo mediante choque hipotnico y limpieza de la
muestra. Los cromosomas as obtenidos son bandeados segn tcnicas
convencionales y analizados al microscopio. (Figura 4)
Con esta tcnica se diagnostican las mutaciones cromosmicas
estructurales y numricas. Este mismo procedimiento, con algunas
modificaciones, puede detectar fenmenos citogenticos que indican la
inactivacin de genes supresores y amplificacin de oncogenes:
* Prdida de heterocigosidad (LOH) proceso importante en la inestabilidad
cromosmica ya que acelera la inactivacin de genes supresores
* Microncleos dobles (DM) incluyen copias extra de oncogenes (Myc, Ras,
receptor del factor de crecimiento epitelial,..)
* Regiones de tincin homognea (HSR) fenmeno por el cual aparecen
mltiples copias de un segmento de ADN.
* Incremento en el nmero de intercambios de cromtidas hermanas
TCNICAS DE CITOGENTICA-MOLECULAR
La mayora de stas tcnicas estn basadas en la hibridacin del ADN.
Tienen dos principales ventajas:
1. Se pueden obtener resultados tanto de todo un genoma en un
microarray, como de un simple loci en una clula.
2. Es posible analizar la organizacin genmica, la estructura y el
comportamiento en una simple clula a nivel de ADN y ARN.

 FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) Esta metodologa consiste en

hibridar sondas marcadas con fluorescencia con ADN para su visualizacin
cromosmica tanto en metafase como en interfase.
o CEP-FISH (Chromosome-specific centromeric Enumeration Probes - FISH)
Las sondas corresponden a secuencias repetidas (secuencias alfa y beta)
localizadas en los centrmeros de los cromosomas. Tcnica empleada para
el anlisis de parejas de homlogos en interfase o detectar alteraciones
numricas. (Figura 5)
o TEL-FISH (Telomeric-FISH), Las sondas contienen la secuencia repetida
TTAGGG para hibridar con cada uno de los telmeros cromosmicos (Figura
5).
o LSI-FISH (Locus Specific Identifier-FISH) Emplea sondas de ADN especficas
(YACs, BACs, PACs, cosmidos) y generalmente se utiliza para el mapeo
cromosmico, deteccin de microdeleciones y de microduplicaciones y
estudio de locis no mayores de 1Mb. En interfase se puede analizar la
organizacin de los genes en el ncleo y su impacto en la actividad
transcripcional (Figura 5).
o WCP-FISH (Whole Chromosome Painting Probes - FISH) Este mtodo
consiste en la hibridacin de todo un cromosoma. Es utilizado en el
diagnstico citogentico-molecular para la deteccin de alteraciones tanto
numricas como estructurales.
o M-FISH (Multiplex- FISH) Las sondas se obtienen por microdiseccin de
locis cromosmicos que son marcadas con combinaciones de varios
fluorocromos. Con un mnimo de 5 se pueden diferenciar los 24
cromosomas. Para el anlisis de las seales de hibridacin son necesarios
diferentes filtros para cada uno de los fluorocromos. Se obtienen as bandas
de colores llamadas pseudo-G. (Figura 6)
o Fiber-FISH Esta tcnica est basada en la hibridacin fluorescente in situ
en fibras de ADN alargadas artificialmente. Es la tcnica de citogentica
molecular de ms alta resolucin (alrededor de 2.3Kb). Esta tcnica se
aplic primero para el mapeo fsico de fragmentos de ADN y ahora, es
frecuentemente empleada, en el anlisis de la organizacin genmica en
cromosomas metafsicos, incluyendo grandes deleciones en secuencias
gnicas.
o SKY (Spectral Karyotyping) genera un cariotipo codificado por colores. Se
hibridan simultneamente los 24 cromosomas. Cada cromosoma es
amplificado por PCR con un oligo-primer, para luego marcarlos con una
combinacin de fluorocromos hasta detectar 31 variantes de colores.
PNA (Peptide Nucleic Acid probing) y PRINS (Primed In Situ labelling
reaction) Estas tcnicas de marcaje de sondas tambin pueden aplicarse al
anlisis de secuencias hibridadas en cromosomas. Sus ventajas frente a las

sondas habitualmente utilizadas en citogentica molecular derivan de su

menor tamao.
CGH (Comparative Genomic Hybridization) La CGH es una tcnica
cuantitativa que compara las seales de hibridacin en clulas
cromosomicamente normales, de un ADN control, marcado con fluorocromo
verde y otro ADN tumoral marcado con fluorocromo rojo. Los ADNs compiten
por hibridar dando seales que van del el rojo al verde pasando por el
amarillo. La CGH permite, por tanto, slo la deteccin de ganancias y
prdidas de regiones cromosmicas en todo el genoma del tumor por la
comparacin de las intensidades de las seales de hibridacin. (Figura 7)
La posibilidad de combinar m-FISH con SKY y con CGH permite conocer en
detalle todos los estadios que originan las alteraciones cromosmicas en
clulas tumorales y es una poderosa herramienta para investigar el proceso
de transformacin neoplsica.
INDICACIONES DE TCNICAS CITOGENTICAS Y DE CITOGENTICAMOLECULAR
1. Una mutacin cromosmica germinal
RETINOBLASTOMA. Es un sndrome gentico con un incremento del riesgo
de cncer de retina. Las formas hereditarias se transmiten de forma
dominante con un 90% de penetrancia. Se caracteriza por la presencia en
lnea germinal de una delecin del cromosoma 13, en la regin q14, donde
se localiza el gen RB. Este gen acta como supresor de tumor; la mutacin
germinal sera la primera mutacin de Knudson (desaparece un alelo del
gen RB) y la segunda, la mutacin del otro cromosoma 13 (desaparece la
segunda copia del supresor), en este caso adquirida. Dependiendo de la
magnitud de la delecin puede detectarse por cariotipo convencional o por
LSI-FISH. (Figura 8)
Tumor de Wilms (Nefroblastoma).
Es la neoplasia urogenital ms frecuente en la infancia (80%) La edad media
de diagnstico es 3,5 (50%). La etiologa de este tumor es similar al
retinoblastoma. La primera mutacin (Knudson) consiste en la inactivacin
del primer alelo del gen supresor WT1 localizado en el cromosoma 11,
regin p13. La segunda mutacin puede depender de ms de un gen
supresor: WT2 (11p15.5), WT3 (16q), WT4 (17q12-q21), y WT5 (7p15p11.2).
El tumor de Wilms puede ser espordico (80%-90%), asociados a sndromes
genticos (10%) o familiar (2%). Los tumores espordicos se originan
fundamentalmente por deleciones cromosmicas en 11p13 y 11p15. El
riesgo de desarrollar este tumor se incrementa en nios con el sndrome de
Beckwith Wiedemann, el sndrome de Denys-Drash, el sndrome de Bloom y
en el sndrome WAGR.

2. Los sndromes clsicos de inestabilidad cromosmica

Son sndromes caracterizados por un alto porcentaje de roturas
cromosmicas y un incremento en la incidencia de tumores con respecto a
la poblacin normal. Se deben a mutaciones germinales que dan lugar a la
prdida de funcin de enzimas de reparacin, originando un incremento
espectacular de mutaciones de todo tipo. Estos sndromes presentan un
patrn hereditario autosmico recesivo. Los heterocigotos tambin
presentan un mayor riesgo de cncer (Tabla 1). Por ejemplo, la anemia
Fanconi es un sndrome de inestabilidad cromosmica originado por
mutaciones en al menos 8 loci implicados en la reparacin de ADN. Del
mismo modo, las mujeres portadoras de Ataxia Telangiectaxia muestran un
riesgo del 100% de padecer cncer de mama.
3. Algunas mutaciones cromosmicas adquiridas o heredadas
Algunas alteraciones cromosmicas adquiridas o heredadas son especficas
de tumor y constituyen marcadores de ayuda para confirmar el diagnstico
y establecer el pronstico. Estas anomalas son caractersticas en leucemias
y sarcomas: t (9;22) en leucemia mieloide crnica, t(3;13)(q35;q14) en el
rabdosarcoma alveolar, etc. En tumores slidos son muchos los marcadores
identificados: en cncer de cabeza y cuello, la amplificacin del gen CCND1,
localizado en 11q13, esta asociado a puentes anafsicos del cromosoma 11.
Otros tumores presentan LOH en muchos supresores de tumores, por
ejemplo, FHIT en 3p14, INK4A en 9p21 y TP53 en 17p13. En tumores
lipomatosos en la mayora de los puentes anafsicos se encuentra
amplificadas secuencias en 12q13 incluyendo los oncogenes (SAS, CDK4,
HMGIC y MDM2) (Tabla 2). Otros sndromes genticos clsicos que implican
prdidas o ganancias de cromosomas tambin tienen un mayor riesgo de
padecer determinados tipos de tumores con respecto a la poblacin tumoral
(Tabla 3).
4. Mapeo gentico
El mapeo gentico consiste en la asignacin fragmentos de ADN a cada
cromosoma creando as un mapa gentico. Existen dos tipos: el mapeo
gentico que da lugar a una estimacin indirecta de la distancia entre dos
grupos de fragmentos, utilizando como unidad de medida los centimorgans,
y el mapeo fsico (Figura 9) que estima una distancia real medida en pares
de bases. La resolucin de estos mapas comenz con los mapas
citogenticos con la resolucin de 1 banda cromosmica de ms o menos
10.000.000 pares de bases, al mapeo de restriccin mediante el empleo de
enzimas con un resolucin 10 veces mayor, ms tarde el mapa csmido que
emplea secuencias solapadas de ms de 40.000 pares de bases y que
consigue resoluciones entre 10.000 y 100.000 pares de bases y por fin el
mapeo de secuencias que emplea todas las secuencias conocidas
colocndolas en orden en los 46 cromosomas humanos. Supone ms de 3
billones de pares de bases y contiene entre 20.000 y 25.000 genes que

codifican para protenas. Para ello se emplean las tcnicas ms modernas

de biloga molecular, muchas de ellas englobadas en la citogentica
molecular.

Figura 1. Inestabilidad de microsatlites

A) Estabilidad de microsatlites en lnea germinal. Los pentanucletidos C y
D tienen alelos hipervariables y sirven para confirmar origen comn de los
dos tipos de muestras. B) Inestabilidad de microsatlites en lnea somtica.
Todos los microsatlites tienen un nuevo alelo

igura 2. Inestabilidad cromosmica

A) Degradacin de telmeros que provoca la formacin de cromosomas
dicntricos y anillos. B) En la siguiente generacin mittica se forman
puentes anfasicos C) Los cromosomas con los extremos terminales rotos se
fusionan formando en las clulas hijas nuevos dicntricos y anillos D) Del
mismo modo los puentes anafsicos provocan alteraciones en la cariocinesis
o mitosis multipolares que dan lugar a las alteraciones numricas.

Figura 3. Tipos de mutaciones cromosmicas

A) Alteraciones estructurales. En el cariotipo obtenido de mdula sea se
seala una translocacin que implica a tres cromosomas. Las flechas indican
los cromosomas alterados: un derivado de un cromosoma 9, un derivado del
cromosoma 14 y un derivado del cromosoma 22 (cromosoma Filadelfia). B)
Alteraciones numricas. Cariotipo triploide obtenido de mdula sea.

Figura 4. Cariotipo Humano

A) Corresponde a una metafase obtenida de sangre perifrica B) Los
cromosomas son colocados en parejas de homlogos alineados por el
centrmero y de mayor a menor formando un CARIOTIPO

A) Ncleo en interfase hibridado con una sonda centromrica del

cromosoma 21. B)
Metafase hibridada con sondas telomricas. C) Metafase hibridada con una
sonda LSI (WHSCR). D) Metafase hibridada con una combinacin de sondas
FISH elegidas para identificar un mutacin cromosmica estructural.

Hibridacin in situ fluorescente mltiple (M-FISH).

La flecha indica que el cromosoma derivado de un 4 presenta una
duplicacin de la banda pseudo-G 4q21

A) ADN extrado de una muestra control (verde) y de una muestra del

paciente (roja). B) Los fragmentos de ADN mezclados hibridan con la
muestra control empleando como soporte metafases o microarrays. C)
Metafase de la muestra control; mediante anlisis microscpico se
identifican y localizan las regiones donde hay un exceso (rojo) o un defecto
(verde) de ADN del paciente. D) Los fragmentos de ADN hibridan en un
microarray, dando lugar a un gradiente de colores que va del rojo al verde
pasando por el amarillo que pueden ser descifrados en un analizador de
microarrays.

A) Se representa un cromosoma 13 normal junto a un derivado de un 13

originado por una mutacin constitucional que consiste en una delecin que
engloba, al menos, la banda 13q14, donde se localiza el gen responsable
RB. Esta alteracin se detecta a nivel microscpico. B) El cromosoma 13
normal ha adquirido una mutacin que incluye al menos al gen RB
responsable. Esta mutacin puede detectarse por LSI-FISH

Mapa fsico (National Center for Biotechnology Information). A) Ideograma

de un cromosoma 3 donde se seala la regin que se analiza (3p22.2
3p22.1). B) Mapa 1. Se muestran 50 genes de los 1361 identificados y
localizados en una secuencia de 18Mb-179Mb. C). Mapa 2. Se muestran 30
genes de los 67 identificados y localizados en esta regin cromosmica
(3p22.2 3p22.1).