Am-s

FACULDADE DE FARMCIA
UNIVERSIDADE DE LISBOA

Estudos de estabilidade por HPLC de

um composto hbrido para o tratamento
do glioma

Relatrio da Unidade Curricular de Projecto II

Julho, 2014

Ana Sofia Cruz Fernandes Ferreira

Orientador: Professora Doutora Maria Eduarda Mendes

Co-orientador: Professora Doutora Maria de Jesus Perry

RESUMO
A temozolomida (TMZ) o principal agente antitumoral para gliomas. um
triazeno alquilante do cido desoxirribonucleico (DNA) e, devido sua lipofilia, tem duas
caratersticas que o tornam num antitumoral de eleio: pode ser administrado
oralmente e capaz de atravessar a barreira hemato-enceflica. No entanto, a eficcia
teraputica frequentemente dececionante, devido em grande parte, falta de
seletividade para clulas tumorais, baixa concentrao do frmaco no local de ao e
ocorrncia de resistncias do tumor ao tratamento. importante desenvolver
abordagens teraputicas alternativas.
Os inibidores das deacetilases de histonas (iHDAC) tm vindo a emergir como
potenciais componentes teis teraputica antitumoral devido aos seus efeitos de
aumento da sensibilidade s radiaes usadas em radioterapia, influenciado pela
expresso da protena p53 (codificada pelo gene supressor tumoral p53), e de aumento
da especificidade para as clulas malignas. Estes inibidores induzem a acumulao de
histonas hiperacetiladas que leva ao aumento da expresso de um pequeno conjunto
de genes silenciados e, consequentemente, diminui a proliferao celular maligna,
aumenta o grau de maturao celular (diferenciao) e aumenta a apoptose das clulas
malignas.
Dentro deste mbito, a equipa de investigao esteve envolvida no design de
uma nova molcula com duas unidades, um triazeno antitumoral e um iHDAC, o cido
valprico (VPA). Este hbrido denominado HYBCOM.
Neste trabalho foram feitos estudos cinticos de estabilidade em tampo fosfato
(0.01 M, pH 7.4) e no plasma humano e a determinao das suas propriedades
lipoflicas atravs da cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC).
Palavras-chave: glioma; triazeno; inibidor das deacetilases de histonas
(iHDAC); cido valprico

ii

ABSTRACT
Temozolomide (TMZ) is the most widely used antitumor agent for gliomas. It is a
triazene that alkylates deoxyribonucleic acid (DNA) and, due to its lipophilicity, it has two
features that make it an antitumor of choice: it can be administered orally and is capable
of crossing the blood-brain barrier. However, the therapeutic efficiency is often
disappointing largely due to lack of selectivity for tumor cells, the low concentration of
the drug at the site of action and the occurrence of tumor resistance to the treatment. It
is important to develop alternative therapeutic approaches.
Histone deacetylase inhibitors (iHDAC) are emerging as potentially useful
components of the antitumor therapy due to its effects of increased sensitivity to radiation
used in radiotherapy, influenced by protein p53 expression (encoded by the tumor
suppressor gene p53), and increased specificity for malignant cells. These inhibitors
induce the accumulation of hyperacetylated histones that leads to increased expression
of a small subset of silenced genes and thus reduces the malignant cell proliferation,
increases the level of cell maturation (differentiation) and increases apoptosis in
malignant cells.
Within this context, the research team was involved in the design of a new
molecule with two units, an antitumor triazene and an iHDAC, valproic acid (VPA). This
hybrid is called HYBCOM.
In the present study, kinetic stability studies were made in phosphate buffer (0.01
M, pH 7.4) and in human plasma and the determination of its lipophilic properties by high
performance liquid chromatography (HPLC) was also made.
Keywords: glioma; triazene; histone deacetylase inhibitors (iHDAC); valproic
acid

iii

NDICE
RESUMO ...................................................................................................................... ii
ABSTRACT ..................................................................................................................iii
LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................... v
LISTA DE TABELAS .................................................................................................... vi
LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS..................................................................vii
1. INTRODUO.......................................................................................................... 1
1.1. Gliomas malignos ............................................................................................... 1
1.2. Tratamento do glioma maligno ........................................................................... 1
1.2.1. Triazenos: agentes alquilantes..................................................................... 1
1.2.2. Resistncia das clulas tumorais aos triazenos e inespecificidade do
tratamento ............................................................................................................. 3
1.2.3. Inovaes no tratamento do glioma maligno ................................................ 4
1.3. Objetivos ............................................................................................................ 5
2. MATERIAIS E MTODOS ........................................................................................ 6
2.1. Cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) ................................................. 6
2.2. Determinao do comprimento de onda mximo de absoro dos compostos... 6
2.3. Curvas de calibrao .......................................................................................... 7
2.4. Estudos cinticos ............................................................................................... 7
2.4.1. Tampo fosfato-salino (PBS) (0.01 M, pH=7.4)............................................ 8
2.4.2. Plasma humano (80% v/v) ........................................................................... 8
2.5. Determinao do logaritmo do coeficiente de partio ....................................... 8
2.5.1. Fundamento terico ..................................................................................... 8
2.5.2. Procedimento experimental ......................................................................... 9
2.5.3. Mtodo computacional ............................................................................... 10
3. RESULTADOS E DISCUSSO .............................................................................. 11
3.1. Estudo de estabilidade em tampo fosfato salino ............................................. 11
3.2. Estudo de estabilidade em plasma humano ..................................................... 12
3.3. Determinao do logaritmo do coeficiente de partio ..................................... 13
4. CONCLUSO ......................................................................................................... 15
AGRADECIMENTOS .................................................................................................. 16
BIBLIOGRAFIA ........................................................................................................... 17
ANEXOS..................................................................................................................... 20

iv

LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Representao qumica do composto triazeno genrico ............................... 1
Figura 2 - Mecanismo de ativao da temozolomida e mecanismo de alquilao do DNA
adaptado de [10] .................................................................................................... 2
Figura 3 - Variao da concentrao de pr-frmaco ao longo do tempo no ensaio em
tampo fosfato pH 7.4.......................................................................................... 12
Figura 4 - Variao da concentrao de pr-frmaco ao longo do tempo no ensaio em
plasma humano 80% (v/v) ................................................................................... 13

LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Comprimentos de onda mximos de cada composto. .................................. 6
Tabela 2 - Valores das reas correspondentes ao pr-frmaco detetadas ao longo do
tempo no estudo cintico em tampo fosfato ....................................................... 11
Tabela 3 - Valores das reas correspondentes ao pr-frmaco detetadas ao longo do
tempo no estudo cintico em plasma humano ..................................................... 12
Tabela 4 - Valores das reas correspondentes ao pr-frmaco detetadas no estudo da
determinao do Log P ........................................................................................ 13

vi

LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS

AAI

Amina aromtica inativa

ACN

Acetonitrilo

DNA

cido desoxirribonucleico

iHDAC

Inibidor das deacetilases de histonas

HPLC

Cromatografia lquida de alta eficincia (High-performance liquid

chromatography)
Log P

Logaritmo do coeficiente de partio octanol-gua

MMT

Monometiltriazeno

OGAT

O6-alquilguanina-DNA transferase

OMS

Organizao Mundial de Sade

PBS

Tampo fosfato-salino

PF

Pr-frmaco

RP-HPLC

Cromatografia lquida de alta eficincia de fase reversa

TMZ

Temozolomida

UV

Ultravioleta

Comprimento de onda

vii

1. INTRODUO
1.1. Gliomas malignos
Os gliomas malignos so tumores das clulas gliais (estas clulas protegem,
nutrem e do suporte aos neurnios). O sistema de classificao da Organizao
Mundial de Sade (OMS) agrupa os gliomas em quatro classes histolgicas definidas
por graus crescentes de indiferenciao, anaplasia e agressividade (Anexo I). Segundo
a OMS, os gliomas malignos incluem os tumores de classe III (variantes anaplsicas de
astrocitoma, oligodendroglioma e oligoastrocitoma) e os tumores de classe IV
(glioblastoma e as suas variantes). um dos tipos de tumor maligno mais comuns a
nvel mundial na espcie humana com uma incidncia anual de 5.26 por 100 000
habitantes ou 17 000 novos diagnsticos por ano. Estes tumores so tipicamente
associados a fatores hereditrios e m qualidade de vida. Tm origem principalmente
no encfalo e possuem a capacidade de se infiltrar no tecido cerebral saudvel e formar
tumores satlite. Esta migrao faz com que o tratamento se torne extremamente
complicado e invariavelmente fatal [1, 2].

1.2. Tratamento do glioma maligno

O tratamento de doentes com gliomas malignos paliativo e inclui
cirurgia, radioterapia e quimioterapia. Grande parte dos compostos farmacuticos
antitumorais disponveis no mercado caracteriza-se pela interao com o DNA ou com
os seus percursores, de modo a inibir a replicao celular ou provocando leses
irreparveis na cadeia [3].
A maioria dos agentes quimioteraputicos pode ser dividido em agentes
alquilantes, antimetabolitos e agentes intercalantes de DNA [4, 5, 6].

1.2.1. Triazenos: agentes alquilantes

Os triazenos so espcies qumicas constitudas por cadeias abertas contendo
trs tomos de azoto ligados entre si (grupo diazoamina), como observado na Figura 1.
Estas cadeias de azoto podem ser facilmente estabilizadas por substituintes orgnicos
nos azotos terminais, levando formao de diversos anlogos [7].

Figura 1 - Representao qumica do composto triazeno genrico

Estes compostos so alvo de muitas pesquisas cientficas, uma vez que,

alterando a sua estrutura qumica, os derivados podem adquirir diferentes propriedades,
entre elas: atividade antimicrobiana, antifngica, mutagnica, anticarcinognica e
teratognica [8]. O grupo diazoamina responsvel pelas propriedades qumicas,
fsicas e antitumorais destas molculas [9].
A quimioterapia em monoterapia com agentes quimioteraputicos a estratgia
mais usada no tratamento de gliomas em estado avanado [5]. Os triazenos, como a
temozolomida (TMZ), so agentes alquilantes que so usados atualmente no tratamento
de gliomas malignos como teraputica de primeira linha [10].
A TMZ um agente de alquilao de 2 gerao da classe das imidotetrazinas
que tem sido amplamente utilizado no tratamento de gliomas de alto grau [11]. Pode ser
administrada oralmente, atravessa a barreira hemato-enceflica e tem efeitos
secundrios mnimos (genotoxicidade, nuseas, obstipao, anorexia e fadiga) em
relao a outros frmacos alquilantes usados [12]. uma molcula de baixo peso
molecular que, aps ingesto oral, totalmente absorvida e, aps 8h da ingesto,
completamente eliminada e, por este motivo, representa um risco reduzido de toxicidade
para a medula ssea. A sua eficcia no tratamento de gliomas envolve um primeiro
evento caracterizado por alteraes na organizao da heterocromatina e o seu
silenciamento, que seguido por apoptose e senescncia [13].
A TMZ utilizada em clnica um pr-frmaco (PF), ou seja, um derivado
qumico farmacologicamente inativo que, s aps a sua transformao, quer por
metabolizao quer por hidrlise qumica espontnea, se torna farmacologicamente
ativo, libertando o metabolito de ao citotxica [14, 15, 16] (Figura 2).

Figura 2 - Mecanismo de ativao da temozolomida e mecanismo de alquilao do DNA adaptado de

[10]

Aps a ingesto, a TMZ convertida no seu metabolito ativo, sem necessidade

de desmetilao enzimtica por hidrlise no fgado [12, 17]. Depois de absorvida no
intestino, a TMZ sofre um ataque nucleoflico por parte da gua e d-se a abertura do
anel heterocclico formando-se um derivado do monometiltriazeno citotxico (MMT) e
dixido de carbono. Os MMTs, em meio aquoso, sofrem decomposio espontnea,
resultando na formao de uma amina aromtica inativa (AAI) e do io metildiaznio,
num processo de converso irreversvel dependente do pH. Este io, por sua vez,
alquila os cidos nucleicos impossibilitando a diviso celular. A interao final do agente
com o DNA consiste na transformao da base guanina atravs da metilao nas
posies N7-guanina, O6-guanina e O3-adenina do DNA [10].
Os efeitos citotxicos/mutagnicos deste frmaco baseiam-se na presena de
aductos de O6-Metilguanina que geram desemparelhamentos de bases com a citosina
e a timina. Estes aductos conduzem morte celular ou, se a clula sobreviver, provocam
mutaes pontuais somticas representadas por uma transio C:G T:A na hlice do
DNA [15, 16, 18].
No entanto, as clulas humanas conseguem desenvolver mecanismos de defesa
e de reparao dos danos causados pelos triazenos, o que leva resistncia aos
frmacos [10].

1.2.2.

Resistncia

das

clulas

tumorais

aos

triazenos

inespecificidade do tratamento
A resistncia inata ou adquirida das clulas de glioma terapia com triazenos
um problema que tem surgido devido diminuio da ao alquilante destes agentes.
O mecanismo de resistncia destas clulas est relacionado com a capacidade de
reparao das clulas humanas face aos danos induzidos pelos triazenos. Como foi
referido anteriormente, a O6-Metilguanina a principal leso citotxica e mutagnica.
Aps estas alteraes no DNA d-se a reparao celular mediada pela protena O6alquilguanina-DNA transferase (OGAT), codificada pelo gene O6-metilguanina-DNAmetiltransferase. Esta protena remove os aductos de DNA atravs de um mecanismo
de reao SN2. No considerada uma verdadeira enzima, uma vez que remove o
grupo alquilo da leso por uma reao estequiomtrica e a enzima ativa no
regenerada depois de alquilada, sendo assim referida como uma enzima suicida [19,
20]. Os nveis elevados de atividade de OGAT so o principal elemento responsvel
pela resistncia a estes frmacos. Apesar disto, os triazenos tm a capacidade de
inativar esta protena por mecanismos diretos e indiretos [16, 20, 21].
Os frmacos usados atualmente na prtica clnica com ao antitumoral afetam
clulas em proliferao de modo sistmico, principalmente as clulas em diviso ativa,
3

independentemente da fase em que se encontram. Deste modo, tm capacidade para

eliminar um grande nmero de clulas malignas (que se encontram em diviso
descontrolada) [22]. O maior obstculo destes frmacos a falta de especificidade para
as clulas tumorais, pois a concentrao do frmaco que atinge o tecido-alvo reduzida.
Alm disso, como h uma fraca seletividade, pode provocar uma toxicidade sistmica
pois no existe distino entre as clulas saudveis e as clulas malignas, provocando
grandes alteraes na proliferao das clulas saudveis [23, 24].

1.2.3. Inovaes no tratamento do glioma maligno

Como referido anteriormente, a eficcia teraputica dos triazenos
frequentemente dececionante, devido em grande parte, falta de seletividade para
clulas tumorais, baixa concentrao do frmaco no local de ao e ocorrncia de
resistncias do tumor ao tratamento. Deste modo, importante desenvolver abordagens
teraputicas alternativas, como a sntese de pr-frmacos com melhor atividade
teraputica [25]. A sntese de um pr-frmaco um importante meio de aumentar a
eficincia do frmaco, podendo ser constitudo por vrias molculas que, combinadas,
tenham uma maior eficcia teraputica que o frmaco j existente e usado na prtica
clnica. Um requisito importante do pr-frmaco que este deve ser convertido
rapidamente, ou a uma taxa controlada, no agente teraputico ativo in vivo e, ao mesmo
tempo, ser suficientemente estvel in vitro de modo a que possa ser desenvolvido um
produto farmacutico estvel [26].
Neste mbito, os iHDAC tm vindo a emergir como potenciais componentes teis
teraputica antitumoral. Estes compostos tm um efeito radiossensibilizador, mas a
sua contribuio neste aspeto no clara. Pensa-se que a radiossensibilizao pelos
iHDAC , em alguns casos, influenciada pela expresso da protena p53 [16]. A protena
p53 codificada pelo gene supressor de tumor p53, tendo uma importante funo no
ciclo celular que consiste em reparar o DNA quando ocorre uma mutao nas bases da
molcula. Quando no consegue completar a reparao, a protena induz a apoptose
da clula mutada. Esta protena demonstrou sensibilizar as clulas de glioma TMZ por
supra-regulao da via apopttica extrnseca [27].
Outra caracterstica importante destes inibidores a sua seletividade em termos
de alterao da expresso gnica em clulas transformadas. Os iHDAC induzem a
acumulao de histonas hiperacetiladas. Este aumento da acetilao das histonas leva
ao aumento da expresso de um pequeno conjunto de genes silenciados e,
consequentemente, diminui a proliferao celular maligna, aumenta o grau de
diferenciao celular e aumenta a apoptose das clulas malignas [28, 29]. As
modificaes nas histonas podem criar, estabilizar, romper ou ocluir domnios de
4

interao na cromatina para protenas reguladoras, como fatores de transcrio,

protenas envolvidas na condensao da cromatina e reparao do DNA [30, 31].
O cido valprico (VPA) um antiepiltico da classe dos iHDAC e usado em
combinao com a TMZ por ter um efeito sinergtico, aumentando a eficincia da
apoptose induzida por danos no DNA [32]. Como iHDAC, este aumenta a sensibilidade
aos tratamentos de radiao nas linhas celulares do glioma mediada por alteraes na
expresso gentica [16, 33]. O VPA tem efeitos indutivos em certos genes, suprimindo
fatores relacionados com o fator nuclear eritride 2 (Nrf2), fatores de transcrio redoxsensveis, que participam na resposta antioxidante. Deste modo, induz a produo de
espcies reativas de oxignio, que tm um papel importante na induo da apoptose
[34]. O VPA provoca tambm a depleo de glutationa e a perda do potencial de
membrana mitocondrial, que so efeitos pr-apoptticos, e um potente inibidor da
enzima citocromo P450 do fgado, que possui interaes metablicas importantes com
frmacos utilizados na terapia do glioma. No entanto, a TMZ no necessita de
metabolismo heptico que envolva o sistema P450 e demonstra uma fraca interao
com o VPA [32].
Neste projeto avalia-se a estabilidade de um hbrido em que se combina um
monometiltriazeno e o cido valprico numa s molcula.

1.3. Objetivos
A resistncia dos tumores aos frmacos triazenos um grande obstculo no
tratamento de gliomas. Uma maneira de contornar este problema associar o triazeno
a um composto que diminua a resistncia e aumente sinergeticamente o efeito do
frmaco [32]. Para tal, fez-se uma associao de um triazeno com o cido valprico,
dando origem ao pr-frmaco HYBCOM.
O presente projeto consiste na avaliao deste composto hbrido quanto sua
estabilidade em tampo fosfato salino (pH=7.4) e no plasma humano, assim como a
determinao das suas propriedades lipoflicas para determinar a facilidade de absoro
do pr-frmaco.
Para o efeito, procedeu-se anlise do hbrido HYBCOM por HPLC.

2. MATERIAIS E MTODOS

2.1. Cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC)

HPLC com detetor ultravioleta (UV) um tipo de cromatografia utilizada em
anlise de compostos no volteis ou instveis termicamente, sendo o seu campo de
aplicao muito vasto [35].
Para realizar os estudos de estabilidade por HPLC foi necessrio escolher o
melhor eluente (fase mvel), para que os tempos de reteno de cada um dos
compostos (pr-frmaco e seus produtos de degradao) no ficassem sobrepostos
permitindo calcular as integraes das reas dos mesmos nos cromatogramas. O
eluente (fase mvel) escolhido foi uma mistura de acetonitrilo (ACN) J. T Baker de grau
HPLC, um solvente orgnico polar que dissolve os compostos sem os decompor, e gua
desionizada no aparelho desionizador Millipore Direct-Q UV 3.
Neste estudo, todas as anlises foram realizadas por cromatografia lquida de
alta eficincia de fase reversa (RP-HPLC), em que a fase estacionria escolhida foi uma
coluna RP-18.
Usou-se o detetor Merck Hitachi LaChrom UV Detector L-7400, a bomba Merck
Hitachi LaChrom Pump L-7110 e o integrador Merck Hitachi Integrator D-7500.

2.2. Determinao do comprimento de onda mximo de

absoro dos compostos
Para determinar o comprimento de onda () no qual ocorre o mximo de
absoro do composto hbrido e dos seus produtos de reao recorreu-se
espetroscopia UV/visvel no espetrofotmetro Shimadzu UV-160 no intervalo de 200 a
400 nm de comprimento de onda. Na Tabela 1 encontram-se os valores mximos de
para a amina, MMT e pr-frmaco.

Composto

Comprimento de onda
mximo (nm)

Amina

273.4

MMT

286.0

PF

295.4

Tabela 1 - Comprimentos de onda mximos de cada composto.

Os compostos apresentaram mximos de absoro entre 273.4 e 295.4 nm.

Optou-se por selecionar o comprimento de onda de 300 nm para os estudos em HPLC
pois um valor prximo dos obtidos no espetrofotmetro e todos os compostos
absorvem a esse comprimento de onda.

2.3. Curvas de calibrao

Com o objetivo de identificar e quantificar a amina, o monometiltriazeno e o prfrmaco por comparao com os respetivos padres foram feitas curvas de calibrao.
Recorreu-se a vrias solues-padro com diferentes concentraes de cada composto
em ACN que foram analisadas por HPLC por ordem crescente de concentraes.
Para a amina e o MMT foram preparadas solues-me de concentrao 10-4
mol L-1 pesando rigorosamente a quantidade apropriada de composto, na balana
analtica Mettler Toledo AB204, e dissolvendo em acetonitrilo. A soluo-me do prfrmaco tinha uma concentrao de 1 mol L-1, a partir da qual se fez uma soluo de
concentrao 10-4 mol L-1 para se proceder s diluies nas mesmas condies que as
solues-me preparadas. As solues usadas para a realizao das curvas de
calibrao foram preparadas por diluio a partir das solues previamente referidas
usando como solvente o acetonitrilo.
A tabela com os dados da preparao das solues-padro encontra-se no
Anexo III. As tabelas e representaes grficas das curvas de calibrao podem ser
observadas nos Anexos IV e V.

2.4. Estudos cinticos

A hidrlise do pr-frmaco foi monitorizada por HPLC atravs da quantificao
do desaparecimento do substrato e aparecimento dos produtos da reao. Para
identificar os produtos fez-se a comparao dos seus tempos de reteno com os
tempos de reteno dos padres da amina, MMT e pr-frmaco. Os cromatogramas
efetuados podem ser observados no Anexo II.
Foi realizada uma eluio isocrtica em todos os ensaios e a mistura usada foi
acetonitrilo:gua (65:35) v/v. Antes da anlise, fez-se a desgaseificao da fase mvel
por ultra-sons no aparelho de banho ultrassnico Bandelin Sonorex TK 52 durante 20
minutos para evitar a existncia de bolhas de ar que interferem na anlise.

2.4.1. Tampo fosfato-salino (PBS) (0.01 M, pH=7.4)

Uma alquota de 10 L de uma soluo do PF em ACN com concentrao de 102

M foi adicionada a 10 mL de PBS (0.01 M, pH=7.4) a 37C. A diferentes tempos foram

retiradas vrias alquotas da mistura durante 48 horas e analisadas por HPLC a =300
nm e fluxo de 1.0 mL/min. O ensaio foi feito em duplicado.

2.4.2. Plasma humano (80% v/v)

2.4.2.1. Procedimento geral para a obteno de plasma humano
Foi recolhido sangue de vrios doadores saudveis em heparinato de sdio.
Depois de centrifugado, o sobrenadante foi separado e distribudo por vrios frascos de
vidro contendo cada um 2 mL de plasma. Estes frascos foram conservados a -70C.
Antes da sua utilizao teve o cuidado de se fazer uma descongelao gradual para
evitar uma possvel desnaturao das protenas plasmticas.
2.4.2.2. Estudos cinticos em plasma humano
Uma mistura de 2 mL de plasma humano e 0.5 mL de PBS foi termostatizada a
37C. A esta mistura foi adicionada uma alquota de 10 L de uma soluo do PF de
concentrao 10-2 M em ACN. Vrias alquotas (200 L) da mistura reacional foram
retiradas a diferentes tempos durante 48 horas e colocadas em eppendorfs com 400 L
de ACN em gelo. Os eppendorfs foram centrifugados a 14000 rotaes por minuto por
5 minutos e o sobrenadante foi analisado por HPLC com um fluxo de 1.0 mL/min. O
ensaio foi feito em duplicado.

2.5. Determinao do logaritmo do coeficiente de partio

2.5.1. Fundamento terico
A determinao do logaritmo do coeficiente de partio importante para
entender a solubilidade dos pr-frmacos em meio aquoso, em ambiente fisiolgico e a
sua permeabilidade s membranas celulares (lipdicas). Atravs desta determinao
possvel aferir sobre a capacidade dos pr-frmacos atravessarem as membranas
biolgicas das clulas do glioma [14].
Em estudos prvios verificou-se a existncia de uma correlao entre a
solubilidade de alguns frmacos em lpidos e a sua atividade biolgica. Sendo assim,
surgiu um modelo que simula o transporte dos frmacos at ao seu local de ao: a
capacidade de um composto se distribuir entre o 1-octanol (que simula a membrana
lipoflica) e a gua (que simula a fase aquosa). O 1-octanol constitudo por uma cadeia
alqulica saturada longa e tem um grupo hidroxilo polar que forma ligaes de hidrognio
8

com a gua, o que faz com que se dissolva nesta numa concentrao de 1.7 M, levando
saturao. A combinao das cadeias lipoflicas, grupos hidroflicos e molculas de
gua confere ao 1-octanol propriedades bastante semelhantes s das membranas
naturais [36].
De modo a determinar a lipofilia de um frmaco, foi proposto o logaritmo do
coeficiente de partio (Log P) entre a gua e o 1-octanol:
(composto)

Log P = log [(composto)octanol ]

(Equao 1)

tampo

Este coeficiente indica a tendncia preferencial do frmaco para se dissolver

numa fase ou noutra. Com base nesta equao, possvel verificar que se um composto
for mais solvel na fase aquosa (tampo), P<1, portanto Log P negativo. Se o
composto for mais solvel na fase orgnica (octanol), P>1, logo o valor de Log P
positivo [37].
At um certo limite, os compostos mais lipoflicos interagem mais com a fase
lipdica, ou seja, penetram nas membranas lipoflicas facilmente. Contudo, a relao
entre o Log P e a penetrao no linear, sendo que, para valores extremos, esta
interao torna-se demasiado forte e impede o frmaco de atravessar a fase aquosa ou
de se dissolver nesta pois fica retido na camada lipdica. Inversamente, se o Log P tiver
um valor prximo de zero, o frmaco fica retido na fase aquosa e no atravessa a fase
lipdica. De acordo com estudos de correlao dos fenmenos de dissoluo e
transporte, pode afirmar-se que os frmacos com um coeficiente de partio octanolgua igual ou superior a 100 (Log P>2) so bem absorvidos. O valor de lipofilia ideal,
que corresponde mxima absoro dos frmacos, Log P2 e poder ir at 3 [37,
38]. Segundo a Regra dos 5 de Lipinski, um frmaco ter provavelmente uma m
absoro oral se Log P>5 [39].
A avaliao da lipofilia atravs do valor do logaritmo do coeficiente de partio
pode ser realizada experimentalmente por HPLC. Paralelamente pode ser feita a sua
determinao por um mtodo computacional [40].

2.5.2. Procedimento experimental

A determinao experimental do Log P do pr-frmaco foi realizada no sistema
octanol-tampo fosfato. A saturao deste sistema foi conseguida colocando-se uma
mistura de 1:1 de octanol e tampo fosfato isotnico (pH 7.4) numa ampola de
decantao que ficou em repouso durante a noite.

Para determinar o Log Pexp, num eppendorf adicionou-se aproximadamente 2 mg

de pr-frmaco a um sistema bifsico constitudo por 0.5 mL de octanol (previamente
saturado de tampo fosfato isotnico) e 0.5 mL de tampo fosfato isotnico
(previamente saturado de octanol). A mistura foi agitada no vortex durante 4 minutos,
centrifugada durante 5 minutos e deixada em repouso durante 15 minutos. A alquota
da fase orgnica foi previamente diluda numa proporo de 1:10 em acetonitrilo e s
depois analisada por HPLC. O eluente usado foi a mistura ACN:gua (65:35) e o fluxo
foi de 1 mL/min. A alquota da fase aquosa foi injetada sem qualquer diluio. O Log
Pexp foi obtido pela razo das reas dos picos a 300 nm, correspondentes aos compostos
em questo. O ensaio foi feito em duplicado.

2.5.3. Mtodo computacional

De modo a fazer uma previso terica do valor de Log P, usou-se o programa
ALOGPS 2.1. Atravs da introduo da frmula SMILES (simplified molecular-input lineentry system), que uma especificao para descrever a estrutura de molculas em
forma de notao que usa caracteres ASCII (American Standard Code for Information
Interchange), determinou-se o Log Pterico [41]. O valor dado pelo programa foi 4.53.

10

3. RESULTADOS E DISCUSSO
3.1. Estudo de estabilidade em tampo fosfato salino
Realizou-se o estudo da hidrlise do pr-frmaco com tampo fosfato (0.01 M,
pH=7.4) a 37C, como descrito anteriormente. As reaes foram monitorizadas por
HPLC. Os produtos da reao foram identificados por comparao com os respetivos
padres (Anexo II). No foi possvel visualizar a amina e o MMT pois no foram
detetados no cromatograma picos com os tempos de reteno correspondentes a estes
compostos, portanto no foi feita a quantificao destes produtos da reao. O nico
pico visvel e identificvel foi o pico correspondente ao pr-frmaco. No Anexo VI
possvel observar cromatogramas deste ensaio a diferentes tempos. Na Tabela 2
encontram-se os valores mdios de rea detetados ao longo do tempo, relativos ao prfrmaco.

Tempo / h

rea / mAU

0.00

36570.5

2.50

37657.5

4.75

38802.5

22.50

38967.5

30.50

41008.0

46.50

39552.5

71.75

37795.5

77.00

34463.0

Tabela 2 - Valores das reas correspondentes ao pr-frmaco detetadas ao longo do tempo no

estudo cintico em tampo fosfato

Recorrendo curva de calibrao correspondente ao pr-frmaco (Anexo V),

calculou-se a concentrao do hbrido ao longo do tempo e pode afirmar-se que
estvel em condies semelhantes s fisiolgicas. Na Figura 3 esto representadas as
concentraes do pr-frmaco ao longo de 77 horas.
11

[PF] / mol L-1

6,0

5,0
4,0
3,0
2,0
1,0

0,0
0

20

40
60
Tempo / h

80

100

Figura 3 - Variao da concentrao de pr-frmaco ao longo do tempo no ensaio em tampo

fosfato pH 7.4

Pela anlise da representao grfica observa-se que a concentrao do hbrido

se manteve constante ao longo do tempo. Deste modo, os resultados deste estudo
cintico mostraram que o pr-frmaco suficientemente estvel em condies
fisiolgicas, sendo tambm interessante a avaliao da sua estabilidade em plasma
humano.

3.2. Estudo de estabilidade em plasma humano

O estudo cintico em plasma humano (80% v/v) foi, igualmente, seguido por
HPLC. Tal como no estudo anterior, o nico pico identificvel detetado foi o
correspondente ao pr-frmaco. No Anexo VI possvel observar cromatogramas deste
ensaio a diferentes tempos. Na Tabela 3 encontram-se os valores mdios de rea
detetados ao longo do tempo, relativos ao pr-frmaco.

Tempo / h
0

rea / mAU
1204886.0

2.50

1296815.0

6.50

1281402.0

21.50

1391722.5

26.00

1402908.0

28.00

1382506.0

48.00

1252533.5

Tabela 3 - Valores das reas correspondentes ao pr-frmaco detetadas ao longo do tempo no

estudo cintico em plasma humano

12

Do mesmo modo, recorreu-se curva de calibrao do pr-frmaco (Anexo V)

para calcular a sua concentrao ao longo do tempo com o objetivo de avaliar a sua
degradao. Na Figura 4 esto representadas as concentraes do pr-frmaco ao

[PF] / mol L-1

longo de 48 horas.

180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
0

10

20

30
Tempo / h

40

50

60

Figura 4 - Variao da concentrao de pr-frmaco ao longo do tempo no ensaio em plasma

humano 80% (v/v)

Analisando os resultados obtidos possvel observar-se que o pr-frmaco

apresenta boa estabilidade em plasma humano durante 48 horas pois no houve
grandes variaes da concentrao detetada do hbrido.

3.3. Determinao do logaritmo do coeficiente de partio

Para se conseguir determinar o valor de Log Pexp fez-se a anlise de alquotas
das fases aquosa e orgnica por HPLC.
As anlises foram feitas em triplicado.
Os valores de rea da fase orgnica foram multiplicados por 10 (fator de diluio)
aps a anlise. Na Tabela 4 pode observar-se os valores de rea correspondentes s
duas fases. Os cromatogramas correspondentes podem ser observados no Anexo VIII.
rea / mAU
Fase aquosa

3103.167

Fase orgnica

27628355

Tabela 4 - Valores das reas correspondentes ao pr-frmaco detetadas no estudo da

determinao do Log P

13

De acordo com a Equao 1, efetuou-se o clculo do valor de Log Pexp.

27628355
Log P = log [ 3103.167 ]= 3.95
Comparando os valores dos logaritmos dos coeficientes de partio terico
(4.53) e experimental, verificou-se que o valor experimental se encontra prximo do que
se espera obter teoricamente. Sendo este um valor positivo e superior a 1, indicativo
de que a molcula mais solvel em octanol, ou seja, apresenta um comportamento
lipoflico. Isto tambm permite explicar o fato dos picos do cromatograma da fase aquosa
serem to pequenos, pois o pr-frmaco pouco solvel em gua.

14

4. CONCLUSO
Analisando os resultados obtidos, possvel concluir que o hbrido em estudo
tem uma grande probabilidade de sucesso como pr-frmaco no tratamento do glioma
maligno.
No que respeita aos estudos cinticos de estabilidade em tampo fosfato 0.01 M
pH 7.4 a 37C, o pr-frmaco mostrou ser estvel durante um longo perodo de tempo
(77 horas). Por este motivo, ter uma semi-vida bastante longa pois no se verificou
degradao durante o perodo do estudo.
Relativamente aos ensaios em plasma humano 80% (v/v), estes possibilitam
determinar o comportamento do composto hbrido no plasma, que contm diversas
enzimas que podem ou no interferir no mecanismo do pr-frmaco. Atravs deste
estudo verificou-se que o composto se manteve estvel durante 48 horas estando na
presena de enzimas plasmticas. Isto significa que no foi degradado antes de
alcanar o local alvo, as clulas gliais malignas.
Na determinao do logaritmo do coeficiente de partio, o valor obtido foi
semelhante ao teoricamente previsto, portanto considera-se que os valores so
concordantes. O pr-frmaco apresenta um valor de Log P prximo de 4, o que
demonstra a sua afinidade para com a membrana lipdica. de referir que, como o valor
de Log P desta molcula inferior a 5, o hbrido obedece a um dos parmetros da Regra
dos 5 de Lipinski, tendo uma maior probabilidade de ter uma boa absoro oral.
Um prximo passo neste estudo pode passar por realizar ensaios com culturas
de clulas com o objetivo de averiguar se o hbrido tem uma maior seletividade para as
clulas gliais malignas. Outros estudos podiam ser feitos no sentido de esclarecer a
influncia da ao do cido valprico no pr-frmaco em relao a outros iHDAC.

15

AGRADECIMENTOS
Desejo expressar os meus sinceros agradecimentos a todos aqueles que, direta
ou indiretamente, contriburam para a realizao deste projeto:

Professora Maria Eduarda Mendes pela oportunidade que me deu, pela sua
orientao e disponibilidade prestadas no decorrer do trabalho, assim como
pelas crticas, correes e sugestes apontadas a este documento;

Professora Maria de Jesus Perry pela disponibilidade, auxlio e conhecimentos

transmitidos no decorrer do projeto;

Susana Lucas por todos os conhecimentos transmitidos relativamente aos

aparelhos a utilizar, pela sua pacincia e boa disposio;

A todos os amigos que me ajudaram a concretizar este objetivo, em especial

Sara Reis e Ins Ferreira pela pacincia e prontido na ajuda na reviso do
presente manuscrito. Ao Rodrigo Murteira, Joana Camilo e Bruno Segurado pela
amizade, palavras de encorajamento e fora.

minha famlia por toda a motivao e compreenso durante o decorrer do

projeto.

16

BIBLIOGRAFIA
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19

ANEXOS

Anexo I

Figura A.1 - Classificao da OMS dos tumores do Sistema Nervoso Central [2]

20

Anexo II

Figura A.2 - Cromatograma correspondente ao padro de amina aromtica

Figura A.3 - Cromatograma correspondente ao padro de monometiltriazeno

21

Figura A.4 - Cromatograma correspondente ao padro de pr-frmaco

22

Anexo III

[composto] / mol L-1

Vsoluo-me / mL

Vacetonitrilo

0.50

0.05

9.95

1.00

0.10

9.90

2.50

0.25

9.75

5.00

0.50

9.50

7.50

0.75

9.25

10.00

1.00

9.00

Tabela A.1 - Preparao das solues de amina, MMT e pr-frmaco para as curvas de calibrao

23

Anexo IV

[amina] / mol L-1

0.50

1.00

2.50

5.00

7.50

10.00

rea / mAU
47966
46460
105051
106774
185289
203111
406015
385322
610696
527035
883725
802998

Mdia das reas / mAU

47213.0

105912.5

194200.0

395668.5

568865.5

843361.5

Tabela A.2 - Curva de calibrao para a amina aromtica em ACN

[MMT] / mol L-1

0.50

1.00

rea / mAU

Mdia das reas / mAU

Sinal no
detectado
Sinal no
detectado
66881

2.50

49908

56435.7

52518
5.00

86146
96607

91376.5

114996
7.50

77246

113477.3

148190
10.00

204057
177842

190949.5

Tabela A.3 - Curva de calibrao para o monometiltriazeno em ACN

24

[PF] / mol L-1

0.50

1.00

2.50

5.00

7.50

10.00

rea / mAU

Mdia das reas / mAU

Sinal no
detectado
Sinal no
detectado
20071
23547
42351
44917
63921
63330
87939
82979

21809.0

43634.0

63625.5

85459.0

Tabela A.4 - Curva de calibrao para o pr-frmaco em ACN

25

Anexo V

1000000
y = 80529x + 3535,3
R = 0,9927

rea / mAU

800000
600000
400000
200000
0
0

4
6
8
[amina] / mol L-1

10

12

Figura A.5 Representao grfica da curva de calibrao para a amina aromtica em ACN

250000

rea / mAU

200000

y = 17026x + 6649,2
R = 0,9297

150000
100000

50000
0
0

4
6
8
-1
[MMT] / mol L

10

12

Figura A.6 - Representao grfica da curva de calibrao para o monometiltriazeno em ACN

100000
y = 8437,7x + 896,5
R = 0,9997

rea / mAU

80000
60000
40000

20000
0
0

4
6
8
-1
[PF] / mol L

10

12

Figura A.7 - Representao grfica da curva de calibrao para o pr-frmaco em ACN

26

Anexo VI

Figura A.8 - Cromatograma correspondente ao pr-frmaco no estudo em tampo fosfato (tempo 0

h)

Figura A.9 - Cromatograma correspondente ao pr-frmaco no estudo em tampo fosfato (tempo

30.5 h)

27

Figura A.10 - Cromatograma correspondente ao pr-frmaco no estudo em tampo fosfato (tempo

77 h)

28

Anexo VII

Figura A.11 - Cromatograma correspondente ao pr-frmaco no estudo em plasma humano (tempo

0 h)

29

Figura A.12 - Cromatograma correspondente ao pr-frmaco no estudo em plasma humano (tempo

21.5 h)

30

Figura A.13 - Cromatograma correspondente ao pr-frmaco no estudo em plasma humano (tempo

48 h)

31

Anexo VIII

Figura A.14 - Cromatograma correspondente fase aquosa para a determinao de Log P

32

Figura A.15 - Cromatograma correspondente fase orgnica para a determinao de Log P

33