INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL
INTERDISCIPLINARIA DE
BIOTECNOLOGA
DEPARTAMENTO DE BIOINGENIERA
ACADEMIA DE INGENIERA DE
BIOCONVERSIONES
LABORATORIO DE BIORREACTORES

PRCTICA 6
MANTENIMIENTO DE
ASEPSIA EN
BIORREACTORES
PROFESORES:
M. EN I. AGUSTN ALTAMIRANO
SEGOVIA
M. EN C. JONS MARTNEZ LIMN
ING. JOS LEN RANGEL RAMREZ
EQUIPO 2
INTEGRANTES
CARAVANTES CHVEZ JULIO CSAR
ESCOBAR ROSALES MONTSERRAT
FIGUEROA ROMERO JORGE LUIS
GRUPO: 3BV1

FECHA DE ENTREGA: 1 DE JULIO DEL 2015

INDICE GENERAL
OBJETIVOS........................................................................................................... 4
OBJETIVOS ESPECFICOS..................................................................................... 4
INTRODUCCIN................................................................................................... 4
DESARROLLO EXPERIMENTAL.............................................................................. 9
RESULTADOS..................................................................................................... 10
DISCUSIN........................................................................................................ 12
CONCLUSIONES................................................................................................. 13
REFERENCIAS CONSULTADAS............................................................................ 13

INDICE DE ILUSTRACIONES
Ilustracin
Ilustracin
Ilustracin
Ilustracin
Ilustracin
Ilustracin
Ilustracin
Ilustracin
Ilustracin
Ilustracin

1. Clasificacin de mtodos de esterilizacin....................................5

2. Saccharomyces cerevisiae.............................................................9
3.Biorreactor para produccin de biomasa (Vista frontal).................9
4. Biorreactor para produccin de biomasa (Vista lateral).................9
5. Toma de muestra para la tincin de Gram...................................10
6. Inoculacin del biorreactor para arrancar la cintica...................10
7. Tincin de gram en cultivo en lote alimentado............................11
8. Tincin de gram en cultivo en lote...............................................11
9. Flujo difusivo................................................................................ 11
10. Intrusin de agua.......................................................................12

PRCTICA 6
MANTENINIENTO DE ASEPSIA EN BIORREACTORES
1. OBJETIVO GENERAL

Conocer las pruebas de intrusin de agua y de mantenimiento de

la presin para probar la integridad de filtros de aire con los que se
garantice la operacin en biorreactores.
Identificar claramente las diferencias entre condiciones aspticas,
estriles, sanitarias y desinfeccin.
Determinar la importancia de la asepsia en procesos
biotecnolgicos.

2. OBJETIVOS ESPECFICOS

Verificacin de la asepsia en un cultivo en lote, lote alimentado y

continuo en un biorreactor.
Conocimiento de las buenas prcticas de laboratorio en la
realizacin de una buena cintica en el Laboratorio de
Biorreactores.

3. INTRODUCCIN
Un microorganismo es un agente microscpico vivo e imperceptible a los
sentidos que generalmente est agrupado en colonias, aunque bien
puede estar como una unidad formadora de colonias (U.F.C.), la que se
desarrolla en un medio apropiado para formar colonias perceptibles. Los
microorganismos
pueden
ser
patgenos
(productores
de
ciertas enfermedades) o inocuos (los habitualmente hallados en
los alimentos, el aire, el polvillo ambiental, que no perjudican al hombre.
El hecho de que existan distintos tipos de grmenes en el
medio ambiente,
crea
grandes
dificultades
en
los
estudios
bacteriolgicos, cuando es necesario obtener las especies microbianas
en estado de pureza, ya que tanto el instrumental como los medios de
cultivo son invadidos con suma facilidad por los microbios del medio
ambiente.

Los microorganismos pueden clasificarse en Crifilos (-5 a 14 C);

Mesfilos (25 a 47 C) y Termfilos (50 hasta 113 C). Por ejemplo,
muchos hongos se destruyen con la temperatura, pero sus esporas an
son viables y cuando encuentran un medio apropiado, rico en nutrientes
y humedad, se reproducen. Por tal motivo la tecnologa para su
destruccin debe considerar stas variables.
La esterilizacin y el mantener condiciones aspticas es un proceso a
travs del que se logra la destruccin total de los microorganismos
viables presentes en un determinado material, o se busca reducirlos lo
ms posible.
Este procedimiento es de gran utilidad dentro del campo biotecnolgico,
ya que existen muchos procesos que requieren la utilizacin de
materiales estriles. Entre stos podemos destacar:

El acondicionamiento del material (pipetas, tubos, placas de Petri,

pinzas, etc.) que va a ser utilizado en los laboratorios de
microbiologa.
La preparacin de medios de cultivo que sern empleados con
diferentes propsitos (cultivo de microorganismos, control de
ambiente, equipos o personal, anlisis microbiolgico de
medicamentos, cosmticos, alimentos, etc.)
La descontaminacin de material utilizado.
Produccin de metabolito a partir de un microorganismos puro.
Desinfeccin: tiene por objeto la destruccin de microorganismos
mediante agentes de naturaleza qumica (desinfectantes), con el
fin de disminuir el nmero de formas vegetativas a niveles
mnimos.
Desinfectante: es la sustancia qumica que inhibe o destruye
microorganismos al aplicarla sobre material inerte sin alterarlo
significativamente.
Asepsia: trmino que se aplica a los procedimientos utilizados para
prevenir que los microorganismos progresen en un medio
determinado (quirfano, laboratorio, etc.)
Antispticos: son agentes desinfectantes que se utilizan sobre
superficies corporales con el fin de reducir la cantidad de flora
normal y de contaminantes microbianos de carcter patgeno.
Tienen un menor grado de toxicidad que los desinfectantes y
generalmente menor grado de actividad. Determinados
preparados pueden utilizarse como antispticos o como
desinfectantes indistintamente, pero a diferentes concentraciones
en cada caso.
5

Antimicrobianos: son sustancias qumicas producidas por

microorganismos o sintetizadas qumicamente que a bajas
concentraciones son capaces de inhibir e incluso de destruir
microorganismos sin producir efectos txico en el husped.

METODOS DE ESTERILIACIN.

Hay diversos tipos de esterilizacin que pueden clasificarse segn su

naturaleza u origen como se muestra en la ilustracin 1.

Ilustracin 1. Clasificacin de mtodos de esterilizacin.

*AGENTES FSICOS.
Calor.
El calor se puede aplicar como agente esterilizante de dos formas: el calor
hmedo el cual destruye a los microorganismos por desnaturalizacin de las
protenas y el calor seco que destruye a los microorganismos por oxidacin de
sus componentes celulares. El calor es considerado como el mtodo de
esterilizacin por excelencia siempre y cuando el material a esterilizar soporte
altas temperaturas sin sufrir ningn tipo de dao.
Radiacin.
La radiacin permite esterilizar mediante la transmisin de ondas que generan
la destruccin de los microorganismos. Existen distintos tipos de radiaciones.
Radiacin ionizante: Este tipo de radiacin genera sustancias que son un
veneno para el metabolismo bacteriano. Como los radicales oxhidrilo y
radicales perxidos entre otros. Estos radicales atacan a las protenas y
enzimas afectando su estructura de forma inmediata deteriorando
definitivamente su metabolismo.
Radiacin ultravioleta: Esta radiacin no es tan penetrante. Afecta en la
superficie y ataca principalmente a las molculas de ADN. Estas molculas
tienen mucha absorbancia justamente dentro del rango del UV por eso son tan
sensibles. Es ideal para esterilizar material de quirfano.
6

Radiacin Gama: La radiacin gamma es muy penetrante a diferencia de la

anterior. Es ideal para esterilizar contenidos enlatados como alimentos o
productos de farmacia que estn cerrados. En estos casos el calor los puede
destruir por eso son ms aconsejables este tipo de procedimientos.
*AGENTES MECNICOS.
La esterilizacin por filtracin se utiliza para eliminar bacterias de los medios
lquidos que sean susceptibles al calor. Por ejemplo, las disoluciones
enzimticas o de vitaminas.
La esterilizacin se efecta pasando la muestra lquida a travs de un filtro con
un tamao de poro de 0.42 m (o menor). Las bacterias normales quedan
retenidas en el filtro y el lquido se esteriliza.
Hay que tener presente que este sistema no elimina los virus ya que son de
menor tamao que el poro (virus filtrables).
La filtracin permite la remocin de todos los microorganismos presentes en un
lquido o un gas retenindolos sobre la superficie de un material.
Filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air): Est compuesto por pliegues de
acetato de celulosa que retienen las partculas (includos los microorganismos)
del aire que sale de una campana de flujo laminar.
Filtracin por membrana: Son discos de steres de celulosa con poros tan
pequeos que previenen el paso de los microorganismos. Existen distintos
tipos de filtro dependiendo del tamao de poro. Estos filtros son desechables.
Adems de utilizarse en la esterilizacin de lquidos se usan en el anlisis
microbiolgico de aguas ya que concentran los microorganismos existentes en
grandes volmenes de agua.
Es una tcnica recomendada por la mayora de las farmacopeas y envuelve la
filtracin de fluidos a travs de un filtro de membrana estril, cualquier
microorganismo presente es retenido en la superficie del filtro. Tambin se
pueden analizar slidos solubles en agua, los cuales pueden ser disueltos en un
diluyente apropiado y procesados por medio de esta tcnica.
Se basa en hacer pasar la muestra a travs de una membrana porosa delgada,
elaborada con plsticos de celulosa inerte, los poros son de tamao uniforme lo
suficientemente pequeos para retener los microorganismos.
*AGENTES QUMICOS.
Algunas sustancias qumicas pueden ser usadas como agentes esterilizantes
porque tienen la capacidad de promover una o ms reacciones qumicas
capaces de daar los componentes celulares de los microorganismos
(protenas, membranas, etc.)
Todos los procesos de esterilizacin se deben controlar para poder asegurar
que han sido efectivos. Para ello se pueden utilizar indicadores fsicos, qumicos
y/o biolgicos, los cuales deben ser colocados en cada carga de esterilizacin.
7

Indicadores fsicos
Entre los principales indicadores fsicos se encuentran los medidores de presin
y los termmetros los cuales permiten constatar las condiciones fsicas dentro
de la cmara de esterilizacin. Tambin existen los termgrafos los cuales,
adems de registrar la temperatura alcanzada en el proceso, permiten conocer
durante cunto tiempo sta se mantuvo.
Indicadores qumicos
La mayora de estos indicadores son cintas adhesivas que se adhieren al
material a esterilizar. Estas cintas estn impregnadas con una sustancia
qumica que cambia de color cuando el material ha sido sometido al proceso de
esterilizacin. Este tipo de cintas no son completamente confiables debido a
que muchas veces slo indican que se lleg a la temperatura deseada, pero no
indican por cuanto tiempo sta se mantuvo. Tambin existen cintas diseadas
de manera que el cambio de color es progresivo, estas cintas son un poco ms
seguras porque permiten estimar si el tiempo de esterilizacin fue el adecuado.
Indicadores biolgicos
Son preparaciones de una poblacin especfica de esporas de
microorganismos, las cuales son altamente resistentes a un proceso de
esterilizacin en particular. Estos indicadores se deben colocar junto con la
carga de esterilizacin, en el sitio que se considera que es ms difcil que
llegue el vapor y despus del proceso, se deben incubar durante 24 horas en
condiciones adecuadas. Si despus de este periodo hay evidencia de
crecimiento microbiano (por ejemplo cambio de color del medio de cultivo), el
proceso de esterilizacin no fue satisfactorio.
Cuando se utilizan indicadores biolgicos se debe verificar:

Tipo de microorganismo
Tipo de proceso de esterilizacin
Nmero de lote
Fecha de expiracin
Medio de cultivo utilizado
Condiciones de incubacin del indicador despus de aplicado el proceso
de esterilizacin
Mtodos de descontaminacin para evitar la diseminacin de esporas en
el medio ambiente

Con este tipo de indicadores se controlan la esterilizacin por vapor a presin,

por calor seco y la esterilizacin con xido de etileno.
Una vez que un material est estril puede mantener esta condicin si est
protegido en la forma apropiada. Es decir, la duracin de la esterilidad de un
material no est relacionada directamente con el tiempo, sino con factores que
comprometen su exposicin al medio ambiente.
Los materiales estriles pierden su esterilidad cuando:
8

Se produce cualquier ruptura, accidental o no, del material que lo

recubre durante su transporte o almacenamiento.
Al humedecerse el material de empaque.
Es importante no manipular los materiales estriles con las manos
hmedas, ni colocarlos sobre superficies mojadas.

Al almacenar los materiales

precauciones, tales como:

estriles

se

deben

tomar

una

serie

de

Controlar el acceso a las reas de almacenamiento de materiales

estriles.
Mantener el rea de almacenamiento limpia, libre de polvo, sucio e
insectos.
Controlar la temperatura y la humedad de las reas de almacenamiento.
La temperatura ideal debe estar por debajo de los 26 C y la humedad
relativa entre 30 y 60%.
Los periodos prolongados de almacenamiento en lugares tibios y
hmedos, pueden producir condensacin de humedad sobre el material
de empaque.
Utilizar, preferiblemente, estantes cerrados para colocar el material.
Dejar que los materiales que salen del horno o el autoclave alcancen la
temperatura ambiente antes de ser almacenados; de esta forma se evita
la condensacin dentro del empaque

Morfologa de Saccharomyces cerevisiae.

Las caractersticas de esta levadura son: morfologa elptica u ovoide,

alta capacidad fermentativa, formadora de esporas (ascosporas con 4
esporas),
no
asimila nitratos ni
escinde
arbutina,
su
crecimiento
puede
ser
en
etanol,
fermenta
y
asimila glucosa,
galactosa,
maltosa,
sacarosa
y
rafinosa,
no
fermenta
ni
asimila lactosa.
Ilustracin 2. Saccharomyces
cerevisiae.

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
PROCEDIMIENTOS USADOS EN EL LABORATORIO PARA
MANTENER LA ASPXIA DURANTE LOS EXPERIMENTOS.
9

Previo a la prctica se realiz la esterilizacin por calor hmedo en el

biorreactor, as como los aditamentos que fueron las mangueras, y para
la jeringa se compr nueva.
La esterilizacin por calor hmedo es uno de los mtodos ms simples
pero igualmente efectivos, se busca la muerte microbiana mediante
altas temperaturas, provocando la desnaturalizacin de las protenas,
rompimiento de las estructuras de las clulas e inhibicin del
crecimiento.
Es ampliamente utilizado este mtodo debido a que es barato, rpido y
es muy efectivo pues se da una distribucin uniforme gracias al vapor
hmedo.
Para los filtros se esterilizaron por calor seco, se introdujeron en los
hornos elctricos por los cuales el aire caliente circula. Sabemos que
para este mtodo de calor seco, se lleva un mayor tiempo y mayor
temperatura en comparacin con el calor hmedo.

Ilustracin 3. Biorreactor
para
produccin
de
biomasa (Vista lateral).

Ilustracin
produccin
frontal).

4.Biorreactor
de
biomasa

para
(Vista

La sepa a cultivar fue Saccharomyces cerevisiae la cual llevaba una

incubacin de aproximadamente 18 horas, necesarias para su
inoculacin al biorreactor en su fase exponencial y de esta manera
reducir significativamente la fase lag o de acoplamiento, lo cual se logra
inoculando en el mismo medio.
La inoculacin se realiz con las lmparas de alcohol encendidas
buscando reducir de manera importante la probabilidad de contaminarse
el biorreactor. As como el uso de guantes de ltex con el mismo fin
asptico.
Del mismo medio de cultivo se tom el respectivo blanco que se
preservo tapndolo con parafilm para las lecturas de absorbancia,
manteniendo condiciones de asepsia con los mecheros prendidos.

10
Ilustracin 5. Inoculacin
del
biorreactor
para
arrancar la cintica.

Ilustracin 6. Toma de
muestra para la tincin de
Gram.

Los microorganismos ms comnmente que se encuentran en el medio

ambiente son E. Coli, estreptococos, Salmonella y estafilococos,
bacterias las cuales pueden crecer de buena manera en casi cualquier
medio, de modo que si nuestra rea de trabajo no es asptica, el matraz
semilla se infectara y por lo tanto la produccin de biomasa se vera
inhibida o alterada.
En la prctica de produccin de biomasa en cultivo continuo, al final en
la toma de las 8 pm, las mangueras de toma de cultivo nuevo dejaron de
funcionar, el problema fue que ya no sala medio, sino ms bien se
tomaba del tanque de salida, el cual ya estaba contaminado, por lo
tanto, al final de la prctica se concluy que se contamin.
En las absorbancias se ve claramente un estancamiento y al paso de 12
horas aproximadamente hay una drstica cada en las mediciones. Es un
ejemplo claro de falta de asepsia.

5. RESULTADOS
TINCIONES DE MUESTRAS TOMADAS EN LOS CULTIVOS.
Recordemos que una tincin de Gram nos ayuda a determinar si nuestra
cepa (sea cual sea) es pura, es decir, que nicamente en el microscopio
se observen Saccharomyces cerevisiae.
Se toman las muestras para el frotis, siempre manteniendo condiciones
de aspticas, con el uso correcto de guantes de ltex y mecheros.
Se observaron claramente levaduras ovoides, Gram negativo. As se
pudo confirmar que la cepa fue inoculada y aislada de excelente manera
por la pureza de la muestra. Esto fue al inicio de la prctica de cultivo
por lote.
Posteriormente se realiz una segunda tincin para el cambio de cultivo
en lote por cultivo alimentado. En ninguna de las dos tinciones se
observa una posible contaminacin pues se observa claramente que son
nicamente bacilos.

11

Hizo falta una tercer tincin para cambio de alimentado a continuo. Y por
ltimo una al final de todo el proceso para determinar claramente si el
trabajo realizado fue asptico y correcto.

Ilustracin 7. Tincin
de gram en cultivo en
lote alimentado.
Algunas razones por las que un biorreactor debe trabajar bajo
condiciones aspticas al efectuar una biorreaccin son debido a que los
microorganismos
contaminantes
pueden
competir
con
el
microorganismo cultivado por el substrato. Poseer una velocidad de
crecimiento mayor. Producir metabolitos txicos para el microorganismo
cultivado. Ocasionar bajos rendimientos de substrato, ocasionando
perdida productiva.
Ilustracin 8. Tincin
de gram en cultivo en
lote.

FUNCIONAMIENTO
DIFUSIVO.

DE

PRUEBA

DE

FLUJO

A presiones de gas diferenciales por debajo del

punto de burbuja, las molculas migran a
travs de los poros llenos de agua de una
membrana humedecida siguiendo la ley de
difusin de Fick - la ecuacin utilizada para
definir la ley de Fick establece una relacin
entre flujo, coeficiente de difusin D, rea a
travs de la cual difunde la sustancia A,
variacin de concentracin y una longitud L,
que puede ser el largo del tubo a travs del
que se produce la difusin. - La tasa de flujo de
difusin de gas para un filtro es proporcional a
la presin diferencial y la superficie total del
filtro.
A una presin de aproximadamente el 80% del
Ilustracin 9. Flujo difusivo.
punto de burbuja mnimo, el gas que se
difunde a travs de la membrana se mide para determinar la integridad

12

de un filtro. El flujo de gas es muy bajo en pequeas reas del filtro, pero
es significativo en grandes reas del filtro.
Se han determinado especificaciones del flujo de difusin mximo para
las membranas y dispositivos especficos y se utilizan para predecir los
resultados de pruebas de retencin de bacterias.
Cuando la presin comienza a exceder el punto de burbuja, el volumen
del flujo de gas es el resultado. Hay rdenes de magnitud de la
diferencia entre el flujo de difusin y el flujo a granel.
En la prueba de difusin, la presin se aplica a 80% de la presin del
punto de burbujeo del filtro sometido a prueba. Cuando hay
lquido por debajo del filtro, el volumen de flujo de gas se determina
mediante la medicin de la velocidad de flujo de agua desplazada.
FUNCIONAMIENTO DE INTRUSIN
DE AGUA.
En WIT, la carcasa del filtro ya
montado en la lnea de proceso se
sumerge con agua y se somete a una
presin mayor que la atmosfrica pero
menor que la presin de la irrupcin
de agua para el filtro dado.
El filtro de membrana hidrfobo evita
que el agua lquida penetre los poros.
En su lugar, el vapor de agua
atraviesa el filtro a una velocidad que
disminuye inicialmente en el tiempo
Ilustracin 10. Intrusin de agua.
como resultado de la compactacin de
los pliegues de membrana y la eliminacin del aire atrapado en la
membrana de filtro.

6. DISCUSIN
Durante la prctica no se obtuvieron los resultados esperados, en un
inicio las condiciones estriles y de asepsia s fueron los adecuados, no
hubo desatenciones y se monitoreo la produccin por lote de biomasa en
los horarios establecidos y las muestras fueron tomadas correctamente,
no se contamin nuestro medio y fueron los resultados en general los
13

esperados de acuerdo a la literatura. Por otro lado, la produccin de

biomasa por lote alimentado y continuo los resultados obtenidos no
fueron los esperados de acuerdo a la literatura, pues hubo
desatenciones, no se mantuvieron las condiciones aspticas del cultivo,
de modo que se contamin y hubo demasiadas variaciones en las
mediciones que se realizaron. Hubo fallas claras respecto al correcto uso
de la jeringa para tomar muestras, al uso de guantes de ltex, usar un
cubre bocas, etc. Los resultados en general fueron inadecuados, no se
cumpli con ciertas caractersticas como que los materiales estriles
deben tener claramente sealado a travs de un control su condicin de
tal, deben estar vigentes, si hay dudas sobre la esterilizacin deben
descartarse, si la envoltura no est indemne o hmedos, pierden su
esterilidad.
Debimos haber creado y manteniendo el campo estril durante el
desarrollo de la intervencin, En el laboratorio es imprescindible trabajar
con material y soluciones estriles con objeto de que los resultados que
se obtengan correspondan al microorganismo o microorganismos que
estn presentes en la muestra en estudio y no a contaminantes que
procedentes del medio o los materiales, puedan desarrollarse y falsear
las pruebas.

7. CONCLUSIONES
La conservacin asptica es vital para los variados procesos
biotecnolgicos en la industria, como lo es la fermentacin, y as
evitar tener riesgos de contaminacin.
Para poder lograr la asepsia del biorreactor y de las tuberas
asociadas a l, se deben proponer desde la etapa de diseo, una
geometra interna y arreglos de tuberas, que eviten la
acumulacin de substancias al llevar a cabo el vaciado de ellos.
Existen microorganismos ajenos a nuestra cepa que buscan
consumir la cantidad de sustrato disponible, por lo cual se
produce una inhibicin del microorganismo de nuestro inters.

8. REFERENCIAS CONSULTADAS
Black, J. 1999. Microbiology Principles and Exploration. Fourth
edition. John Wiley & Son, Inc.
Murray, P. 1999. Manual of Clinical Microbiology. 7th edition.
American Society for Microbiology. Washington, DC.
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 The Pharmacopeia of the United States of America. Sterilization

and Sterility Assurance of Compendial Articles. Cap 1211. 32
Edition. Rockville: USP; 2008.
S. Moreno Grau, J. Bayo Bernal. Diseo de biorreactores y
enzimologa. Primera edicin. Espaa, 1997. Pgina 118.

15