Captulo 4

Espectroscopia de Fluorescncia Molecular

120

Captulo 4 Espectroscopia de fluorescncia molecular

4.1 - LUMINESCNCIA MOLECULAR

Fotoluminescncia
- excitao absoro de ftons
- geralmente a radiao emitida tem comprimento de onda maior do que o da
radiao absorvida na excitao
 Fluorescncia
- tempo mdio de vida no estado excitado 10-5 s
- no h alterao no spin do eltron
 Fosforescncia
- tempo mdio de vida no estado excitado >10-5 s
- inverso de spin do eltron

Quimiluminescncia
- emisso de radiao por parte de espcies excitadas formadas durante uma reao
qumica
- nmero de reaes qumicas que produzem quimiluminescncia pequeno
tcnica aplicada a um nmero pequeno de substncias
- mtodo simples, seletivo e com alta sensibilidade
- aplicao qumica analtica recente

4.1.1 - CARACTERSTICAS DAS TCNICAS LUMINESCENTES

- alta sensibilidade
- limites de deteco trs ordens de grandeza melhores do que os da absoro
molecular (nvel de ppb)
- sujeitos a interferncias de espcies presentes na matriz
- faixa linear de concentraes mais amplas
- menos acurados e precisos que absoro molecular no UV/VIS
- campo de aplicao menor nmero de espcies que possuem propriedades
luminescentes pequeno
121

Captulo 4 Espectroscopia de fluorescncia molecular

4.2 - TEORIA DA FLUORESCNCIA E DA FOSFORESCNCIA
Molcula no estado fundamental
- todos os eltrons emparelhados estado eletrnico singlet
- no h desdobramento de energia dos nveis eletrnicos em presena de campo
magntico externo
Radicais livres
- presena de eltron desemparelhado estado eletrnico dublet
- desdobramento de energia duas orientaes do spin eletrnico em presena de
campo magntico externo
Molculas no estado excitado
- par eletrnico excitado
Singlet no h inverso de spin eletrnico
Triplet inverso de spin eltrons excitados no emparelhados

excitado singlet

excitado triplet

fundamental singlet

Transio singlet triplet menos provvel que a singlet singlet

tempo mdio de vida no estado excitado triplet maior (>10-4 s) do que no singlet (10-5
a 10-8 s)

4.3 - PROCESSOS DE RELAXAO

relaxao no radiativa

relaxao radiativa fluorescncia ou fosforescncia
 processo predominante minimizar o tempo de vida no estado excitado
122

Captulo 4 Espectroscopia de fluorescncia molecular

Figura 4.1 Diagramas de energia para sistema fotoluminescente

4.3.1 - RELAXAO NO RADIATIVA

4.3.1.1 - Relaxao ou desativao vibracional
- colises entre molculas excitadas e molculas do solvente
- excesso de energia vibracional transferido para molculas do solvente numa
srie de etapas pequeno aumento da temperatura do meio
- processo muito rpido tempo de vida no estado vibracional excitado < 10-12 s

Se ocorrer fluorescncia transio do nvel vibracional de menor energia do nvel

eletrnico excitado para qualquer nvel vibracional do nvel eletrnico fundamental

Conseqncia banda de fluorescncia de uma dada transio eletrnica aparece

a maiores do que os da banda de absoro deslocamento de Stokes
123

Captulo 4 Espectroscopia de fluorescncia molecular

4.3.1.2 - Converso interna
- relaxao do nvel vibracional de menor energia de um nvel eletrnico excitado para
um outro nvel eletrnico de menor energia sem emitir radiao
- processo menos eficiente que a desativao vibracional tempo de vida no nvel
eletrnico excitado 10-6 a 10-8 s, mas mais eficiente que fluorescncia
- mecanismo no completamente conhecido e compreendido
- processo particularmente eficiente quando os dois nveis de energia so
suficientemente prximos sobreposio de energia dos nveis vibracionais

Conseqncia Absoro bandas centradas em 1, 2 banda de

fluorescncia 3

Figura 4.2 Espectros de absoro e fluorescncia de soluo de quinina

4.3.1.3 - Converso externa

- processo tambm pouco conhecido
- interao e transferncia de energia entre a molcula excitada e molculas do
solvente ou outro soluto
- evidncias do processo influncia da T, do tipo de solvente e da sua viscosidade
nas caractersticas da fluorescncia
124

Captulo 4 Espectroscopia de fluorescncia molecular

4.3.1.4 - Cruzamento intersistema

- processo que provoca inverso de spin no estado excitado
S1 T1

(S0 T1 transio proibida)

- processo eficiente quando h sobreposio de energia dos nveis vibracionais de S1

e T1
- favorecido pela presena de tomos pesados (iodo, bromo) na molcula

4.3.2 - RELAXAO RADIATIVA

4.3.2.1 - Fluorescncia
- retorno da molcula de um nvel eletrnico excitado do tipo singlet para o nvel
fundamental com emisso de radiao eletromagntica
- como podem retornar para qualquer nvel vibracional do nvel eletrnico fundamental
espectro fluorescncia molecular bandas formadas por uma srie de
linhas prximas cuja resoluo difcil

Linhas de ressonncia
- radiao emitida mesma energia (mesmo ) que a radiao absorvida

Deslocamento de Stokes
- radiao emitida menor energia (maior ) que a radiao absorvida
- parte da energia da absoro dissipada por processo de relaxao no
radiativa (relaxao vibracional) que ocorre a taxa elevada
- se a converso interna pouco importante espectros de absoro e
fluorescncia imagens especulares aproximadas e se sobrepem pela
linha de fluorescncia de ressonncia

125

Captulo 4 Espectroscopia de fluorescncia molecular

Figura 4.3 Espectro de fluorescncia para soluo 1 ppm de antraceno em lcool.

(a) absoro; (b) emisso.

4.3.2.2 - Fosforescncia
- retorno da molcula de um nvel eletrnico excitado do tipo triplet para o estado
fundamental com emisso de radiao eletromagntica
- transio T1 S0 baixa probabilidade tempo mdio no estado excitado T1
relativamente grande (>10-4 s)
- compete, com pouco sucesso, com os processos de converso interna e externa
no de espcies fosforescentes muito pequeno
- fosforescncia temperaturas baixas, meio viscoso, molculas adsorvidas em
slidos caractersticas que dificultam os processos de converso interna e
externa
126

Captulo 4 Espectroscopia de fluorescncia molecular

4.4 - FLUORESCNCIA MOLECULAR
4.4.1 - EFICINCIA QUNTICA OU RENDIMENTO QUNTICO (
)
teoricamente todas as espcies que absorvem radiao UV/VIS deveriam fluorescer

na prtica s poucas so fluorescentes

estrutura molecular favorece a relaxao por processos no radiativos que ocorrem a

taxas maiores do que a fluorescncia
Eficincia ou rendimento quntico

sendo:

no de molculas que fluorescem

ou

n o total de molculas excitadas

kf
k f + kr

kf = constante da taxa de relaxao por fluorescncia

kr = soma das constantes das taxas de relaxao por processos no
radiativos

4.4.2 - FLUORESCNCIA E ESTRUTURA

Principais molculas fluorescentes:
- presena de anis aromticos
- outras: compostos carbonlicos
compostos com duplas ligaes conjugadas

Transies * maior eficincia na fluorescncia

no de anis aromticos
grau de condensao dos anis

heterocclicos simples no fluorescem

H
N

piridina

furano

tiofeno

pirrol
127

Captulo 4 Espectroscopia de fluorescncia molecular

exibem fluorescncia

isoquinolina

quinolina

indol
 presena de substituintes no anel deslocamento das bandas de fluorescncia e
influncia sobre a eficincia de fluorescncia

Tabela 4.1 Efeito dos grupos substituintes na fluorescncia do anel benznico

(nm)

(nm)

Benzeno

270-310

10

Fenolato

310-400

10

Tolueno

270-320

17

Anisol

285-345

20

Propilbenzeno

270-320

17

Anilina

310-405

20

Fluorbenzeno

270-320

10

Anilnio

Clorobenzeno

275-345

Ac. Benzico

310-390

Bromobenzeno

290-380

Benzonitrila

280-360

20

Nitrobenzeno

285-365

18

Substncia

Iodobenzeno
Fenol

Substncia

4.4.2.1 - Efeito da rigidez da estrutura

- Fluorescncia favorecida por molculas com estruturas rgidas

Ex 1)

= 0,2

=1

aumento da rigidez da estrutura pela ponte metilnica entre os dois anis aromticos

reduo na taxa de relaxao no radiativa e a fluorescncia acaba ocorrendo a taxa

maior
128

Captulo 4 Espectroscopia de fluorescncia molecular

Ex 2) Agentes complexantes orgnicos

OH

Zn

N
2

no fluorescente

fluorescente

Ex. 3)
Espcies fluorescentes adsorvidas em slidos eficincia de fluorescncia
aumentada

4.4.2.2 - Efeito da temperatura

T

aumento da probabilidade de colises favorecendo aos

processos de relaxao no radiativa (converso
externa)

4.4.2.3 - Efeito do solvente

Viscosidade

aumento da probabilidade de colises

intermoleculares

Presena

de

favorecimento ao cruzamento inter-sistema

tomos

(S1 T1) favorece fosforescncia

pesados

4.4.2.4 - Presena de O2 dissolvido

- reduo na intensidade da fluorescncia
oxidao fotoquimicamente induzida da espcie fluorescente
- propriedades paramagnticas do O2 promoo do cruzamento intersistema
favorece transio S1 T1 reduzindo a fluorescncia
129

Captulo 4 Espectroscopia de fluorescncia molecular

4.4.2.5 - Efeito do pH na fluorescncia
- anis aromticos com substituintes com carter cido ou bsico fluorescncia
afetada pelo pH do meio

posio da banda

diferentes nas formas ionizada e no

intensidade da radiao emitida

ionizada

Ex : anilina e on anilnio

N+

_
_
estruturas de ressonncia da anilina

on anilnio

4.4.3 - EFEITO DA CONCENTRAO NA INTENSIDADE DA FLUORESCNCIA

Sendo

F = K(P0 P)

(1)

P
= 10 -bc
P0

(2)

(Kdepende de )

Substituindo-se (2) em (1)

F = KP0 (1 10-bc)

(3)

Pela expanso do termo potencial em srie de Maclaurin

F = K' P0
Quando

(
- 2,3 bc )2
(- 2,3 bc ) 2 !

(-

2,3 bc )3
- .........
3 !

bc = A < 0,05
F = 2,3 K bc P0
130

Captulo 4 Espectroscopia de fluorescncia molecular

Sendo

P0 = constante

F=Kc

Representao grfica
16

Intensidade

14
12
10
8
6
4
2
0
0

10

12

14

16

18

Concentrao

- baixas concentraes dependncia linear

- concentraes elevadas A > 0,05 perda de linearidade

aumento das colises entre molculas

prprias molculas absorvem a radiao

excitadas

emitida por fluorescncia

favorecimento dos processos de relaxao

reduo na intensidade da radiao emitida

no radiativa (converso externa ou interna)

por fluorescncia

auto supresso

auto absoro

131

Captulo 4 Espectroscopia de fluorescncia molecular

4.4.4 - INSTRUMENTOS PARA MEDIDA DE FLUORESCNCIA

Componentes
- os mesmos da espectrometria de absoro molecular no UV/VIS

Fluormetros filtros para seleo dos

Espectrofluormetros
- filtro ou monocromador limitar a radiao de excitao
- redes de difrao dispersar a radiao de fluorescncia

obteno dos espectros de fluorescncia

Figura 4.4 - Componentes de um fluormetro ou de um espectrofluormetro

Caractersticas

Feixe duplo compensar flutuaes em P0
132

Captulo 4 Espectroscopia de fluorescncia molecular

Feixe de amostra
filtro ou monocromador primrio transmitir a radiao que vai excitar a amostra
e limitar os correspondentes fluorescncia
radiao de fluorescncia emitida pela amostra em todas as direes medida
num ngulo de 90o com o feixe incidente reduzir ou eliminar o efeito do
espalhamento da radiao na soluo e nas paredes da clula
filtro ou monocromador de emisso
- dispersar a radiao de fluorescncia
- selecionar a banda de fluorescncia de interesse

Feixe de referncia
Atenuador reduzir a intensidade a um nvel similar ao da radiao fluorescente

Comercialmente vrios modelos
grau de sofisticao

preo

Fluormetros
mais adequados para anlises quantitativas maior sensibilidade
simples e de fcil utilizao
custo baixo

Componentes

Fontes
maior intensidade que as da espectrometria de absoro no UV/VIS
Fluormetros
- Lmpada de vapor de Hg linhas de excitao 254 302 313 546 578
691 e 773 nm isoladas pelos filtros de absoro
- Compostos fluorescentes fluorescncia induzida por diferentes e pelo
menos um destes ser adequado
133

Captulo 4 Espectroscopia de fluorescncia molecular

Espectrofluormetros
- Lmpada de arco de Xe espectro contnuo de 300 a 1300 nm

Filtros e monocromadores
idnticos aos dos instrumentos para medida da absoro no UV/VIS

Clulas e Compartimentos para amostras
Clulas cilndricas ou retangulares
vidro ou slica fundida
Compartimento de clula
- design adequado de modo a reduzir a incidncia d radiao espalhada

Detetores
Sinal de luminescncia baixa intensidade detetor altamente sensvel
- Tubos fotomultiplicadores (operao sob resfriamento)
- Rede de diodos

Instrumentos tpicos

Figura 4.5 Representao esquemtica de um fluormetro.

134

Captulo 4 Espectroscopia de fluorescncia molecular

Figura 4.6 Reperesentao esquemtica de um espectrofluormetro.

 Padronizao dos instrumentos

Fluormetros / espectrofluormetros potncia da fonte e sensibilidade do detetor
podem variar de um dia para outro

padronizao dos instrumentos de modo a obter-se um nvel de sensibilidade

reprodutvel

Soluo padro de sulfato de quinina 10-5

Perkin Elmer

mol/L

(excitada a 350 nm fluoresce a 450 nm)

kit com 6 padres

135

Captulo 4 Espectroscopia de fluorescncia molecular

4.4.5 - APLICAES DA FLUORESCNCIA MOLECULAR

Espcies inorgnicas
 ction ou nion extrado para soluo orgnica imiscvel com agente quelante
fluorescncia da soluo orgnica medida
 Mtodos diretos
- analito + agente quelante complexo com propriedades fluorescentes
- determinao de ctions
 Mtodos indiretos
- reduo na emisso de fluorescncia de um dado reagente em funo da sua
reao com o analito
- determinao de nions

Estruturas dos agentes quelantes mais comuns

OH

OH

HO

N
HO

N
SO 3 Na

8-hidrxi-quinolina
alizarina garnet R

OH
O

flavanol

OH

C
H

benzona

136

Captulo 4 Espectroscopia de fluorescncia molecular

Tabela 4.2 Mtodos fluoromtricos selecionados para espcies inorgnicas

on

(nm)

Reagente

Abs

S (
g/mL)

Interferentes

alizarina garnet R

470

500

0,007

Be, Co, Cr, Cu, F-,

NO3-, Ni, PO43-, Th, Zr

F-

auto-supresso do
complexo acima

470

500

0,001

Be, Co, Cr, Cu, Fe, Ni,

PO43-, Th, Zr

B4O7-

benzona

370

450

0,04

Be, Sb

Cd2+

2-(o-hidrxifenilbenzoxazola)

365

azul

NH3

Li+

8-hidrxiquinolina

370

580

0,2

Mg

Sn4+

flavanol

400

470

0,1

F-, PO43-, Zr

Zn2+

benzona

verde

10

B, Be, Sb e ons
corados

3+

Al

OBS:
ons de metal de transio
- formao de complexos que absorvem no UV/VIS relaxao no radiativa to
rpida (eficiente) no fluorescem
- muitos so paramagnticos favorece os cruzamentos intersistemas para estado
excitado triplet fluorescncia pouco provvel (aumenta a tendncia a
fosforescncia)
ons de metais no de transio no formam complexos que absorvam radiao na
regio UV/VIS, mas seus complexos com quelantes org6anicos adequados
fluorescentes

FLUORESCNCIA MOLECULAR + ABSORO MOLECULAR NO UV/VIS

complementares para determinao de ctions

Substncias orgnicas/ bioqumicas
Fluorescncia campo de aplicao amplo
- seletividade e sensibilidade elevadas
Ex: hidrocarbonetos aromticos policclicos, adenina, guanidina, indol, naftol,
protenas, aminocidos, produtos alimentares e farmacuticos, produtos naturais.
137