Inoculacin en plantas

Mtodos de inoculacin

Curso: Mtodos en fitopatologa

Unidad de Fitopatologa
Dto. de Proteccin Vegetal
Facultad de Agronoma.

La inoculacin en plantas la realizamos con el fin de

producir enfermedad a las mismas o, en el caso de

controladores biolgicos, para protegerlas del ataque de
patgenos.
Debemos disponer de inculo viable.
Debemos poner ese inculo en contacto con la planta.
La planta debe estar en un estadio susceptible.
Debemos dar las condiciones necesarias para que ese
inculo colonice la planta y se produzca la enfermedad.

Dr. Pedro Mondino

24 de abril al 5 de mayo de 2012

Inoculacin de plantas

Inoculacin de plantas

El inculo de hongos puede ser: Esporas o

Es muy importante conocer cual es la cantidad

micelio, mientras que en el caso de bacterias es

la propia clula bacteriana.
En general se debe tener en cuenta cual es la
manera en que naturalmente penetra a la planta
dicho inculo.
Por ejemplo: en aquellos casos en que el
patgeno penetra por heridas ser conveniente
depositar el inculo en una herida.

mnima de inculo necesaria para producir

infeccin.
En un ensayo en que inoculamos una serie de
plantas es necesario que todas sean inoculadas
de la misma manera y con cantidades similares
de inculo.
Luego de la inoculacin es comn mantener a
las plantas en condiciones de humedad y
temperatura apropiadas para que el patgeno
pueda desarrollarse.

Inoculacin de plantas
Podemos inocular para probar patogenicidad.

En ese caso, si no lo hacemos de manera

correcta podemos llegar a resultados errneos
en el diagnstico.
Podemos inocular plantas para evaluar el
efecto de alguna medida de control. Por
ejemplo evaluar el efecto de un fungicida o de
un producto biolgico.

Inoculacin de plantas
En los ensayos es esperable que las plantas

testigo manifiesten la enfermedad, mientras que

las plantas tratadas (si el tratamiento es
efectivo) los niveles de enfermedad sean
menores.

Inoculacin de bacterias

Inoculacin de bacterias

Las bacterias pueden inocularse mediante la

aspersin de los rganos de la planta con una

suspensin de clulas bacterianas.
Es necesario saber ajustar la concentracin en

la suspensin de bacterias.

Inoculacin de hojas con una suspensin bacteriana. Mediante

carborundum se producen pequeas heridas.

Inoculacin de bacterias

Resultado de la Inoculacin de hojas.

Inoculacin de bacterias

Inoculacin de bacterias

Embolsado para mantener la humedad de los brotes inoculados.

Inoculacin de bacterias

Inoculacin de Pseudomonas syringae pv papulans en frutos

Aparicin de sntomas.

de manzana mediante aspersin con una suspensin de

esporas.

Inoculacin de bacterias

Inoculacin de bacterias

Papa infectada por Ralstonia solanacearum mostrando la

El racimo de frutos luego de inoculados son embolsados para evitar

zooglea.

inoculaciones naturales.

Inoculacin de bacterias

Planta de papa inoculada con Ralstonia solanacearum

mostrando marchitamiento de la hoja. La inoculacin se

realiz mediante puncin en una yema lateral.

Inoculacin de bacterias

Planta de papa inoculada con Ralstonia solanacearum

mostrando marchitamiento de la hoja.

Inoculacin de bacterias

Planta de papa inoculada con Ralstonia solanacearum

mostrando marchitamiento de la hoja. La inoculacin se

realiz mediante puncin en una yema lateral.

Inoculacin de bacterias

Inoculacion de Xanthomonas campestris pv cucurbitae

mediante aspersion de cotiledones

Test de hipersensibilidad en NO
Husped

Inoculacin de suelo
Ralstonia inoculada mediante riego con suspension

bacteriana

Mtodo de inoculacin mediante infiltracin del mesfilo..

Test de hipersensibilidad en NO
Husped

Test de hipersensibilidad en NO
Husped

Resultado de la inoculacin (mesfilo infiltrado) izq.

Resultado positivo (reaccin de hipersensibilidad) der.

Diferentes tipos de inoculacin

Resultado positivo

Inoculacin de frutos

Inoculacin en plantas de olivo de hojas, tallos, races y cuello

A partir de una colonia esporulada se realiza una suspensin de

conidios en suero fisiolgico estril.

Tallos

Pequeas heridas de 1 a 2 mm de profundidad se practican con

un objeto punzante en la zona ecuatorial de los frutos.

Cada herida es inoculada con 10 microlitros de una suspensin

de esporas de 104 esporas/ml

Cuello
Raz

Hojas

Inoculacion de frutos

Inoculacin de frutos

Inoculacin de frutos ctricos con 10 l una

suspensin de esporas de Penicillium digitatum (104

conidios/ml)

Frutos de manzana inoculados

Inoculacin de frutos
Desinfeccin
superficial

Secado a temp.
ambiente (2hs)

Inoculacin de heridas con

suspensin de antagonista

Almacenamiento 1
mes a 5C

Inoculacin de heridas con

suspensin de patgeno

Inoculacin de frutos
Inoculacin de frutos de kiwi con una suspensin de

Herida
control

Herida protegida

Inoculacin de frutos
Inoculacin se zapallos con Fusarium spp.

esporas de Botrytis cinerea

Inoculacin de frutos
Inoculacin de zapallos con Fusarium spp.

Inoculacin de hojas mediante aspersin

de suspensin de esporas
Manchas de las hojas y fruto de manzanos

causados por Glomerella cingulata en Ro Grande

do Sul, Brasil.
Mtodo: aspersin con una suspensin de 106
conidios/ml

Inoculacion con discos de micelio

Botryosphaeria spp.
Mediante sacabocado se marcan los discos de micelio

sobre la placa

Inoculacion con discos de micelio

Los discos son colocados sobre la rama previamente herida

superficialmente.
Posteriormente se cubre con film

Inoculacin con discos de micelio

Inoculacin con discos de micelio

Cada rama se identifica.

Resultado de la inoculacin con diferentes aislamientos de

Botryosphaeria spp.

Inoculacin con discos de micelio

Resultado de la inoculacin en plntulas de arndano

con discos de micelio de Botryosphaeria clavispora.

Inoculacin de suelo
Pseudocercosporella herpotrichoides (Fron.)

Deighton, agente causal de la mancha ocular del

trigo.
Inoculacin de suelo estril mezclando con trozos de
tallos afectados, y sembrando semillas de una
variedad susceptible, desinfectadas superficialmente.

Inoculacin del sustrato

Inoculacin en bandejas

Inoculacin con discos de micelio de Pythium

Inoculacin de lechuga con discos de micelio de

Sclerotinia sclerotiorum

Inoculacin de tallos mediante discos de

micelio

Inoculacin al suelo.

Mediante riego de una

suspensin de conidios
(haciendo heridas o no)

Inoculacin de semillas

Inoculacin de semillas

Inoculacin de plantines de citrus

Resultado

Inoculacin de semillas

Cuantificacin de esporas
Uso de la cmara de Neubauer

Bacterizacin de semillas

Cmara de Neubauer
Se trata de un portaobjetos con una depresin en el centro.
en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un

Cmara de Neubauer
Esquema

diamante una cuadrcula .

Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separacin entre dos

lineas consecutivas de 0.25 mm.

As pues el rea de un cuadrado corresponde a 1 milimetro

cuadrado.
La depresin central del cubreobjetos est hundida 0.1 mm

respecto a la superficie.
De forma que cuando se cubre con un cubreobjetos ste dista

de la superficie marcada 0.1 milmetro, y el volumen

comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1
milmetro cbico, es decir 0.1 microlitro.

Cmara de Neubauer
Si contamos las cuatro reas sombreada (L)

observando un total de 20 esporas (en las cuatro reas

sumadas)
la concentracin en la suspensin ser :
concentracin en la suspensin (esporas / mL) =
(20/4) y eso multiplicado por 10.000
5 x 104 esporas por mililitro.

Cmara de Neubauer
En la cmara de Neubauer el lmite mnimo de conteo

es de 1 x 104 esporas/ml.

5 esporas por cada 0,1 microlitro

50 por microlitro
50.000 por mililitro

Recuento en placa

Recuento en placa

Consiste en sembrar en placas con medio de cultivo

Se preparan diluciones sucesivas de 1 en 10.

alcuotas de la suspensin de microorganismos.

las condiciones ptimas de conteo se dan cuando se
desarrollan entre 30 y 300 colonias por placa.
Como las colonias pueden originarse tanto de una
clula como de un grupo de clulas, se utiliza el
trmino: UNIDADES FORMADORAS DE
COLONIAS (u.f.c.).

Para la segunda dilucin se toma 1 mL de la primer

dilucin y se descarga en 9 mL de diluyente y as

sucesivamente
Las diluciones a sembrar se eligen segn la carga
esperada o permitida.
Generalmente, se siembran no menos de tres
diluciones consecutivas.

Diluciones

Ej.: 1:10 (10-1), 1:100 (10-2), 1:1000 (10-3).

Diluciones

Recuento en placa

Recuento en placa
Este mtodo permite determinar slo las clulas

microbianas viables

Esquema

Siembra en superficie
Se deposita 0.1 mL de cada dilucin en la superficie

de las placas que ya contienen el medio de cultivo.

Se realiza duplicado para cada dilucin.
Se emplea la misma pipeta para todas las diluciones
comenzando por la ms diluida.
Se debe extender sobre toda la superficie de la placa
usando un rastrillo estril.
Se usa un nico rastrillo para todas las diluciones en el
mismo orden (de la ms diluida a la ms concentrada)

Escala de Mc Farland

Uso de la filtracin
Cuando la concentracin es baja mediante filtracin y

siembra del filtro se pueden medir la concentracin de

bacterias en medio liquido.

Escala de Mcfarland
Tubo

Cl2Ba al 1%

SO4H2 al 1%

u.f.c./ml.

0,1

9,9

3,0 x 108

0,2

9,8

6,0 x 108

0,3

9,7

9,0 x 108

0,4

9,6

1,2 x 109

0,5

9,5

1,5 x 109

0,6

9,4

1,8 x 109

0,7

9,3

2,1 x 109

0,8

9,2

2,4 x 109

0,9

9,1

2,7 x 109

10

1.0

9,0

3,0 x 109

10