UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAR

INSTITUTO DE ESTUDOS COSTEIROS

FACULDADE DE ENGENHARIA DE PESCA

JOEL ARTUR RODRIGUES DIAS

SELEO DE PROBITICO NA AQUICULTURA

ORNAMENTAL DO ACAR BANDEIRA (Pterophyllum
scalare LIECHTENSTEIN, 1823)

BRAGANA
2014

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAR

INSTITUTO DE ESTUDOS COSTEIROS
FACULDADE DE ENGENHARIA DE PESCA

JOEL ARTUR RODRIGUES DIAS

SELEO DE PROBITICO NA AQUICULTURA

ORNAMENTAL DO ACAR BANDEIRA (Pterophyllum
scalare LIECHTENSTEIN, 1823)

Trabalho de Concluso de Curso apresentado a

Faculdade de Engenharia de Pesca, da Universidade
Federal do Par, Instituto de Estudos Costeiros, como
requisito parcial para a obteno do Grau de Bacharel
em Engenharia de Pesca.

Orientador: Prof. Dr. Carlos Alberto Martins Cordeiro

UFPA Campus de Bragana
Co-Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Yudi Fujimoto
EMBRAPA Tabuleiros Costeiros

BRAGANA
2014

JOEL ARTUR RODRIGUES DIAS

SELEO DE PROBITICO NA AQUICULTURA

ORNAMENTAL DO ACAR BANDEIRA (Pterophyllum
scalare LIECHTENSTEIN, 1823)
Trabalho julgado para a obteno do grau de Bacharel em Engenheiro de Pesca do
Curso de Engenharia de Pesca da Universidade Federal do Par, Campus de Bragana.

DATA DE AVALIAO: 17 de Novembro de 2014

CONCEITO:

BANCA EXAMINADORA

Prof.. Dr. Cristiana Ramalho Maciel

IECOS/UFPA

Prof. Msc. Dioniso de Souza Sampaio

IECOS/UFPA

BRAGANA
2014

O xito do trabalho no se mede pelo caminho que

voc conquistou, mas sim pelas dificuldades que
superou em percorre-lo
Adaptado de Abraham Lincoln

Dedico este trabalho aos meus pais, Antnio

Lzaro Meireles Dias e ngela Maria
Rodrigues Dias, pelo apoio, carinho e
credibilidade durante essa caminhada, assim
como aos meus irmos Sileno Julho Rodrigues
Dias que sempre esteve presente em todos os
momentos de minha vida e ao meu irmo
Silvano Sandro Rodrigues Dias.

AGRADECIMENTOS
Por mais que eu no seja uma pessoa muito religiosa, acho que sou muito do
considerado aos olhos de Deus, aqum agradeo incondicionalmente e peo para que
todas as manhs ilumine meu caminho e conceda-me foras para nunca desistir dos
meus objetivos.
Ao Orientador Carlos Alberto Martins Cordeiro e Co-Orientador Rodrigo Yudi
Fujimoto por toda dedicao, amizade, disposio e confiana durante essa trajetria
que se concretiza na realizao de um sonho.
Aos companheiros de Laboratrio Bruna Palheta, Aline, Ryuller, Talita, Rud
Mendes, Henrique Malta, Marcela Gabay, Fabrcio Ramos, Micaelle, Josi, Las e
Debora. Aos amigos que contriburam para a realizao deste trabalho Valria Couto,
Natalino Sousa, Danielle e Arthur. Ao Laboratrio de Gentica Aplicada em especial a
Dr Grazielle Gomes, ao mestrando Raimundo Evereste pela dedicao, apoio e anlise
dos dados genticos, assim como a minha grande amiga Ivana Menezes.
Agradeo incondicionalmente ao Programa de educao tutorial PETpesca, pelas
oportunidades vividas, portas que abrimos e conhecimentos impares adquiridos sobre as
tutorias do Dr Rodrigo Fujimoto 2007/2011 e atual Dr Marileide Alves, que sempre
agiram com afinco para a continuao e xito do programa, assim como aos petianos.
Ao Laboratrio de Camares Marinhos da UFSC, em especial ao Dr Jos Luiz
Mourio, a mestranda Sheila e ps Doutoranda Gabriela, em terem me acolhido e
contribudo com muita ateno e dedicao ao andamento do trabalho.
A todos os lugares que tive oportunidade de estagiar e conhecer um pouco mais
de perto e exercer com afinco as atribuies que cabem ao profissional de Engenharia
de Pesca, Gomes da Costa em especial a Keyti e ao Ado, ao Oceanrio de Pernambuco
com o professor Ricardo, ao sr Robert do Piau, a Maria do Socorro da DNOCS Cear,
ao Blach de Tanguanika Cear, a empresa Poytara, ao sr Victor Uliana do Projeto
Arapaima em Belm, a AMASA ao Eng. De Alimentos Alessandro, ao Eng. De Pesca
Jos Geison da Secretaria de Pesca de Augusto Corra, dentre outros.
A minha excelentssima turma de Engenharia de Pesca 2010 e a turma de tcnico
em pesca 2009 do IFPA. E claro destinar esse singelo espao em agradecimento
aqueles que sempre me deram, apoio, raiva, felicidades, madrugadas em claro fazendo
trabalho, ajuda sempre que possvel no laboratrio, companheirismo, festas e cervejada,
a vocs meus Brothers Gerson Leandro, John Lennon e Diego Bazlio. Sem dvidas

incondicionalmente grato pela beno que Deus me concedeu em coloc-los nesse

captulo de minha vida.
Esse cantinho dedico, para ele, mais uma vez supracitado um parceiro que
somando ao pargrafo anterior tm extrema importncia nessa caminhada, pela sua
parceria, amizade, sinceridade e fidelidade, de uma amizade indescritvel, que alm de
me conceder extremas alegrias de confraternizao, tenho o seu apoio para anlise de
dados, discusso para concretizados e perspectivos trabalhos, nem sempre sai uma
concordncia 100%, mas isso ai quem manda ser inteligente, papo cabea. Caramba!
Como a vida nos surpreendeu nessa jornada, quanto pedra no caminho, retirar? No,
lapidar. E o tempo esta nos dando essa revira volta e como foi difcil sermos julgados
pelos nossos acertos e apedrejados pelos erros alheios hum... hum... Concluindo o
cara, meu amigo de faculdade e com certeza de trabalho, dele mesmo que estou
falando Higo Abe o famoso INHA.
Agradeo tambm com muito carinho, respeito e admirao s pessoas com
quem eu tive a oportunidade de conviver em alguns metros quadrados e adotado a
denominao de famlia. Agradeo sem sombras de dvidas a minha amigona,
Tamyres Barbosa (Tatah), uma menina extremamente iluminada, dedicada e amorosa,
praticamente a irmzinha que tive durante a graduao, assim como agradeo ao Breno
Silva (Gordinho), esse sim fez histria em Bragana e deixou muitas saudades, meu
irmozinho, como estou feliz por voc tambm est concretizando o seu sonho, desejo a
voc e toda a sua famlia muita paz, amor, sucesso e alegrias, voc sabe que cada um
tem um apelidinho especial e carinhoso que os batizei, mas no cabe para esse momento
citar (risos), te amo irmozo. Luciene (Luluh), Matheuzinho (Crazy Life) e ao meu
amigo Bruno Brito (misso).
Agradeo as amizades de Bragana, aos meus grandes amigos Wyller Mello,
Wallacy Mello e Allana Seixas, praticamente oito anos de amizade, vocs esto
concretizados em minha histria.
Aos meus pais Antnio Lzaro e ngela Maria por todo amor, carinho,
pacincia, dedicao, credibilidade e apoio que sempre me deram, para a consolidao
de meus objetivos, nem sempre concordando, mas apoiando as minhas tomadas de
decises. Ao meu grande irmozo Sileno Dias e Silvano Dias, minhas princesas
Clarina e Bia, minhas cunhadas Luciana e Rosa. E por fim a minha querida prima
Andrea Dias, a quem tenho grande amor, companheirismo e amizade e a toda aminha
famlia.

SUMRIO
CAPTULO I
1 INTRODUO GERAL: REVISO
BIBLIOGRFICA.........................................................................................................1
1.1 PISCICULTURA ORNAMENTAL.........................................................................1
1.2 ACAR BANDEIRA Pterophyllum scalare...........................................................2
1.3 PROBITICO NA AQUICULTURA......................................................................4
1.4 Enterococcus faecium...............................................................................................8
1.5 BACTERIOSE NA AQUICULTURA.....................................................................9
1.6 SELEO DE PROBITICOS in vitro................................................................10
2 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS...................................................................13
CAPTULO II
3 RESUMO...................................................................................................................27
3.1 ABSTRACT............................................................................................................28
4 INTRODUO.........................................................................................................29
5 OBJETIVO................................................................................................................32
5.1 OBJETIVO GERAL................................................................................................32
5.2 OBJETIVO ESPECFICO.......................................................................................32
6 MATERIAL E MTODOS.....................................................................................33
6.1 ISOLAMENTO DE BACTRIAS CIDO LCTICAS COM POTENCIAL
PROBTICO.................................................................................................................33
6.2 IDENTIFICAO DA ESPCIE...........................................................................34
6.3 SELEO in vitro...................................................................................................35
6.4 INIBIO DE PATGENOS................................................................................36
6.5 CINTICA DE CRESCIMENTO...........................................................................36
6.6 ANLISE ESTATSTICA......................................................................................37
7 RESULTADOS E DISCUSSO..............................................................................38
8 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
CAPTULO III
9 CONCLUSO...........................................................................................................70
9.1 CONSIDERAES FINAIS..................................................................................70

CAPTULO I

1 INTRODUO GERAL: REVISO BIBLIOGRFICA

1.1 PISCICULTURA ORNAMENTAL

A produo de espcies com potencial ornamental vem se destacando no
mercado aqucola mundial, sendo a modalidade apontada com crescimento de 14%
desde meados da dcada de 90, contribuindo com valores monetrios de
aproximadamente US$ 200 milhes em comercializao, sendo 60% deste capital
oriunda da economia de pases em desenvolvimento (FAO, 2007). Com o progresso da
atividade, diversos pases vm apontando grandes investimentos na cadeia produtiva
comercial das espcies, destacando os Estados Unidos, Japo, Unio Europeia e
Cingapura como os principais pases consumidores nesta rea (LIMA, 2003; PANN,
2008; CARDOSO & IGARASHI, 2009).
Os pases asiticos como principais produtores, enfatizando Cingapura com
produo de US$ 68,00 milhes em 2006 (AVA, 2007). Este comrcio desenvolvem
significativas tendncias que intensificam o seu sistema de produo, relacionando a
variabilidade das espcies, elevadas taxas de retorno e remunerao de capital, melhor
utilizao de espao e instalaes, podendo ser implantado positivamente em centros
urbanos, e atingir elevados valores de produtividade (PRANG, 2007).
Na Amrica do Sul os principais produtores no mercado ornamental so
Colmbia, Peru e Brasil, sendo o territrio brasileiro de grande reconhecimento pelo seu
potencial geogrfico, hdrico e climtico, que favorvel produo de diversas
espcies com potenciais a aquicultura, alm de possuir grande diversidade em sua
ictiofauna ornamental. O potencial produtivo aqucola nacional apontam para
progressivos avanos no setor, com Regies Norte (12,1%), Nordeste (2,1%), Sudeste
(13,2%), Sul (6,1%) e Centro-Oeste (1,3%), destacando como principais espcies
produzidas, as nativas da Bacia Amaznica (IBAMA, 2008; PANN, 2008; TORRES
et al., 2008).
No entanto, a pesca extrativista amaznica que vm contribuindo com dois a
trs milhes de dlares para a economia nacional, com taxa mdia de crescimento de
28,8% anualmente nas exportaes dentre os anos de 2002 a 2005 e US$ 3,9 milhes,
em 2007, comercializando aproximadamente 6,7 milhes destes organismos,
destacando-se o Par e Amazonas, (PANN, 2008; TORRES et al., 2008). Destes
estados, o Par, no ano de 2005, atingiu o ranking nacional de segundo maior produtor
de peixes ornamentais, oriundos do Rio Xingu e Rio Tapajs (TORRES et al., 2008).

O comrcio ornamental, principalmente s espcies nativas, encontra-se em

intensa expanso a nvel internacional, decorrentes da grande variabilidade dentre os
gneros e exuberncia dessa espcie (PRANG, 2007). Entretanto o Brasil apresenta-se
emergente na competitividade dos mercados externos, sendo de suma importncia o
apoio atividade e incentivos em tecnologias de reproduo, nutrio, manejo, gentica
e sanidade que preservem os estoques selvagens e aprimorem as tecnologias de
produo, visando estabelecer uma atividade social, produtiva, econmica e sustentvel
(SALES & JANSEM, 2003; GODINHO, 2007).

1.2 ACAR BANDEIRA Pterophyllum scalare

A espcie pertence famlia Cichlidae apresenta caractersticas fenotpicas
como; corpo triangular, perfil afilado, nadadeiras dorsal e anal longas e eretas,
nadadeira plvica fina e comprida e linha lateral interrompida (DIAS & CHELLAPA,
2003; LIMA, 2003). O acar bandeira, Pterophyllum scalare (LIECHTENSTEIN,
1823), uma espcie endmica da bacia Amaznica, com ampla distribuio,
encontrado nas guas continentais do Peru, Colmbia, Guianas e Brasil. Habita
ectonos dulccolas e lnticos de guas cidas e de baixa dureza, podendo atingir 15 cm
de comprimento. Na natureza so comumente encontrados em cardumes com
estabelecimento de hierarquias nas proximidades de troncos, razes e vegetao
submersa, servindo de abrigo e proteo contra predadores. Se alimentam de pequenos
crustceos, larvas de mosquito e vegetais, considerando-se uma espcie de hbito
alimentar onvoro-carnvora (CACHO et al., 1999; FUJIMOTO et al., 2006;
RODRIGUES & FERNANDES, 2006).
A maturidade sexual da espcie supracitada alcanada entre oito a doze meses
de idade, apontando para uma elevada complexidade em seu comportamento por
competio territorial, coorte, acasalamento e cuidado parental, sendo a atuao do
macho de grande importncia no cuidado da prole contra predadores, alm de adotarem
como caracterstica reprodutiva a monogamia serial. O dimorfismo sexual da espcie
pouco acentuado, possuindo o macho uma maior protuberncia na regio ceflica e a
fmea uma acentuada papila urogenital, que facilita a deposio dos vulos. Sua
reproduo ocorre quando o casal progenitor assepsia o substrato de desova com a boca,
seguido da fmea que pode expelir de 20 a 500 vulos, que so fecundados
posteriormente pelo macho, ficando a prole sobre o cuidado parental do casal dentre

duas a trs semanas, at o consumo do saco vitelnico e natao das larvas (DIAS &
CHELLAPA, 2003; CACHO et al., 2007; BALDISSEROTTO & GOMES, 2010).
As variedades de acar bandeira como: koi, marmorato, leopardo, ouro, preto,
fumaa e palhao, produzidas em sistemas de confinamento, so linhagens
geneticamente modificadas para fins ornamentais desenvolvidas por produtores da
Europa, Estados Unidos e sia a partir de matrizes selvagens da regio amaznica. Com
isso, apresentam valores monetrios de comercializao de at dez vezes mais elevados,
quando comparados aos exemplares naturais (RIBEIRO et al., 2009; VIDAL JNIOR,
2005; HULATA, 2001). O tamanho mnimo de comercializao do organismo de 2,5
cm de comprimento padro, entretanto indivduos de 4-6 cm, so mais atrativos para o
comrcio, consequente de seu perodo de engorda que varia entre trs a quatro meses
para alcanarem o tamanho adulto, apontando para valores monetrios variveis de
acordo com o tamanho do corpo e nadadeiras (VIDAL JNIOR, 2005).
Pesquisas realizadas com o ornamental utilizando dietas peletizadas ou
extrusadas melhoraram o desempenho e P. scalare quando comparados a alimentos
farelados RODRIGUES & FERNANDES (2006) e RIBEIRO et al. (2007), avaliaram as
exigncias proteicas do ornamental, encontrando resultados prximos a 32% de protena
bruta. RIBEIRO et al. (2007), ao analisarem o fornecimento de dietas isoenergticas
com 26 a 32% de PB e ZUANON et al. (2006) com nveis de protena de 34-46% de PB
na dieta de juvenis do acar bandeira, concluram que 32 e 34% de PB, respectivamente,
e 3.200 kcal de ED/kg de rao, atendem as necessidades nutricionais da espcie
(RIBEIRO et al., 2007). Comparando os sistemas de criao da espcie em mono e
policultivo com camaro-da-amaznia (Macrobrachium amazonicum, HELLER 1862),
obteve-se melhores resultados zootcnicos, quando comparados em sistema de criao
em aqurios (VASQUEZ, 2008). Avaliando as exigncias nutricionais de P. scalare,
com dois nveis de arraoamento e duas refeies ao dia concluiu que, o arraoamento
com 6% do peso vivo do animal, proporciona-o melhores resultados.
O ornamental amaznico P. scalare, uma das espcies mais criadas e
comercializadas em mbito nacional e internacional, justificada pela sua fcil
adaptao s condies de confinamento, boa expresso monetria de mercado, fcil
reproduo em cativeiro e boa aceitabilidade as raes industrializadas. Apesar de
grandes perdas de produo pouca tecnologia desenvolvida para a profilaxia e
tratamento de doenas ictiolgicas, sendo a falta de informao tcnica responsvel pela
intensificao da prtica errnea de tratamentos quimioterpicos e antibiticos, que

alm de no solucionar as enfermidades, causam degradao ao meio ambiente,

resistncia dos patgenos e intoxicao da espcie produzida, sendo de grande
importncia a profilaxia e o uso de tecnologias que sessem a presena de
microrganismos que comprometam a sanidade da espcie (FUJIMOTO et al., 2006;
DIAS, 2004; CARROLA et al., 2009).

1.3 PROBITICO NA AQUICULTURA

A definio utilizada para se classificar um probitico na aquicultura segue os
estudos de GASTESOUPE (1999), que resume o termo como micro-organismo vivo
que ao se inserir no sistema de criao coloniza a microbiota intestinal do hospedeiro,
beneficiando a sua sade e equilbrio homeosttico. Alm de contribuir para o
crescimento e melhorar a resposta imunolgica dos organismos produzidos, aponta para
benefcios na qualidade das variveis da gua, na decomposio da matria orgnica,
inibe a propagao de bactrias patgenas no meio de criao, incluindo tambm os
conceitos de biorremediao e biocontrole (MAEDA et al., 1997; GATESOUPE, 1999;
KESARCODI-WATSON et al., 2008).
A produo de alimentos funcionais cresce a taxas de 14% anualmente, valores
que se acentuam comparados produo de alimentos convencionais, que registram
ndices dentre 3% a 4% na produo mundial. A comercializao deste mercado a nvel
nacional aponta para 1% da produo total alimentcia no Brasil, sendo os probiticos
com aproximadamente 65% deste total. Sendo essa tecnologia quando aplicada na
cadeia produtiva das espcies aqucolas uma ferramenta eficaz e no invasiva, que
corrobora na restaurao da flora natural do intestino de seu hospedeiro (ROLFE, 2000;
GRANATO et al., 2010)
Tecnologias que aprimorem o uso de probiticos na produo de organismos
aquticos crescem progressivamente com a exigente demanda empresarial, na busca de
tcnicas mais saudveis no escalonamento produtivo da aquicultura (RAMIREZ et al.,
2013). Os probiticos so suplementos alimentares no digerveis, que alm de atuarem
positivamente no alimento suplementado, surtem efeitos benficos ao seu hospedeiro.
Quando inseridos so capazes de suportar as condies adversas fisiolgicas do
hospedeiro, como: resistir acidez estomacal, colonizar o intestino e resistir s
condies naturais e antrpicas do sistema de criao (GIBSON, 1999; LEE et al.,
1999).

Uma diversidade de micro-organismos pode ser utilizada como organismos

probiticos, sendo o principal grupo estudado os das bactrias cidas lcticas, (RINGO
& GASOUPE, 1998; RINGO et al., 2003). Estas so bactrias Gram positivas,
caracterizadas por possurem morfologia de bacilos e cocos, no esporuladas, inertes,
anaerbicas obrigatrias ou aerotolerantes e produtoras de cido lctico como
fundamental carboidrato durante o processo de fermentao (MELLO et al., 2013).
Essas bactrias apresentam caractersticas de grande interesse aplicao na criao
animal como: fcil multiplicao e resposta imune no especfica do hospedeiro,
pertencente microbiota endgena das espcies aquticas em produo (RINGO et al.,
2003; SALINAS et al., 2006; GATESOUPE, 2008; SOUZA et al., 2010).
O potencial das bactrias lcticas utilizadas como probiticos, referem-se a sua
resistncia no trato gastrointestinal, desempenharem caractersticas teraputicas,
profilticas e promotoras de crescimento, alm de apresentarem um carter seguro, no
havendo o risco de causar enfermidades, modular a resposta imunolgica do hospedeiro,
apropriadas caractersticas organolpticas, pertencer a microbiota natural do intestino do
animal, desempenhar efeito antagnico s bactrias patognicas, na adeso das clulas
epiteliais do intestino, desta forma produzindo defensinas e muco, que inibem o
crescimento patognico na superfcie da mucosa intestinal, tolerar a ao dos cidos
graxos e da bile, transmudar a lactose em cido lctico, reduzindo o pH do trato
gastrointestinal, produzir substncias antimicrobianas (bacteriocinase e perxido de
hidrognio) (OUWEHAND et al., 2002; SENOK et al., 2005; SALINAS et al., 2006;
BALCZAR et al, 2008; SOUZA et al., 2010; GATESOUPE, 2008; LEBEER et al.,
2010).
Inibindo desta forma o crescimento bacteriano patognico pela adeso aos stios
superficiais do epitlio intestinal, competio por nutrientes, de fcil manejo as
condies de armazenamento, ser resistente ao processamento de raes industriais, ser
agente modulador as respostas imunolgicas e contribuir no processo fagocitrio da
rao, proporcionando assim maior ganho de peso e resistncia ao animal (FULLER,
1989; VINE et al., 2006; SUGITA et al., 2007; BALCZAR et al., 2008; REGITANO
& LEAL, 2010; QINGHUI AI et al., 2011; FARIAS, 2012).
A aplicao de bactrias probiticas na nutrio animal pode contribuir
economicamente a cadeia produtiva pisccola, proporcionando menor converso
alimentar e melhores aproveitamentos de nutrientes e aminocidos fornecidos na rao,
tendo em vista que a protena de suma importncia para o crescimento do organismo,

porm esse composto acaba sendo o mais caro e nem tanto aproveitado, desse modo
induo de micro-organismos que facilitem a fagocitose de absoro e digestibilidade
da protena, fundamental reduo dos custos de produo (LIU et al., 2009;
GASTESOUPE, 2008).
As espcies utilizadas para produo de probiticos na criao de camaro
(GARRIQUES & AREVALO, 1995; MORIARTY, 1997) e peixes (SUZER et al.,
2008), esto catalogadas como: Lactobacillus acidophilus, L. amylovorus, L. casei, L.
crispatus, L. delbruechii, L. gallinarum, L. gasseri, L. johnssonii, L. paracasei, L.
plantarum, L reuteri, L. rhamnosus, L. bulgaricus, L. lactis, L. salivarius,
Bifidobacterium adolescentes, B. animalis, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. lactis, B.
longum, Lactococcus lactis, Leuconstoc mesenteroides, Pediococcus acidilactici,
Sporolactobacillus inulinus, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium,
Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus toyoi, Propionibacterium freudenreichii,
Saccharomyces cerevisiae e S. boulardii (GASTESOUPE, 2008; HOLZAPFEL, 2001).
As bactrias presentes na microbiota intestinal de organismos com
potencialidade aquicultura so apresentadas em seu maior volume por microorganismos gram positivo, catalase negativa, no esporulados, morfologia bacilos ou
cocos e produo de cido lctico na fermentao dos carboidratos. A maior gama de
gneros catalogados na literatura com potencial probitico se destacam os
Lactobacillos, Leuconostoc, Pediococcus e Wisella (VINE et al., 2006; MOURIO,
2012).
Os estudos de probiticos na piscicultura ornamental vm crescendo e
apontando para resultados cientficos significativos nos ndices zootcnicos,
imunolgicos e reduo na converso alimentar, quando comparados a animais nutridos
com rao basal utilizando a espcies Xiphophorus helleri Heckel, 1848 (Peixe Espada),
assim como para as espcies de Poecilia reticulata Peters, 1859 (Guppy), Poecilia
shenops Valenciennes, 1846 (Molinsia Negra) e Xiphophorus maculatus Gunther,
1866 (Plati) (GHOSH et al., 2007).
A reduo das bactrias que apresentam patogenicidade ao hospedeiro, podem
ser inibidas com a modificao da microbiota gastrointestinal do animal, fornecendo a
este suplementao alimentar e/ou exposio de bactrias probiticas no sistema de
criao (GOMEZ-GIL et al., 2000; RINGO et al., 2003; RAMIREZ et al., 2006;
VASEEHARAN, 2007; WANG, 2007; TSENG, 2009). Trabalhos comprovam a
modificao da microbiota intestinal com o fornecimento de bactrias probiticas como

suplemento alimentar ou na gua de criao (GULLIAN, 2004; VENKAT et al., 2004;

DIAS et al., 2007; JATOB et al., 2008; RENGPIPAT et al., 2008; DIAS et al., 2011).
A fauna microbiolgica do trato intestinal da espcie em produo, pode ser
apontado como um recurso natural e seguro, no esforo em inibir a proliferao dos
agentes patognicos nas pisciculturas (VAHJEN, et al., 2009). Essa estratgia est
relacionada tecnologia na suplementao das raes funcionais com probiticos, cuja
tcnica desenvolvida visando reduzir a colonizao bacteriana patognica, dos animais
confinados em empreendimentos aqucolas. Apontando como alternativa a adoo dos
antibiticos nos sistemas de criao, cujos atuam no balano microbitico intestinal,
reduzindo desta forma os micro-organismos benficos ao hospedeiro (GOMEZ-GIL et
al., 2000). Alm dos probiticos apontarem como potencialidade a ausncia na
produo de toxinas e resduos, que gerem resistncia ou contaminao ao bioma de
produo (MOURIO et al., 2012).
O perfil na fermentao da glicose, a velocidade de crescimento em distintas
temperaturas, a configurao na produo de cido lctico, a habilidade de crescimento
em solues salinas, assim como sua tolerncia frente acidez ou alcalinidade,
classificam as bactrias cido lcticas em distintos gneros (VAHJEN, et al., 2009).
Como pode ser visto na criao de peixes j existem comprovaes que a
utilizao de probiticos na alimentao dos animais pode melhorar a resistncia
imunolgica e contribuir para o seu bom desempenho (KUMAR et al., 2008; NAYAK,
2010). Compostos antimicrobianos com potencial probitico, apontam para xito no
combate a patogenicidade por bactrias, Li et al., (2006) ao utilizarem o probitico
Arthrobacter XE-7, inibiu o crescimento de Vibrio parahaemolyticus, Vibrio
anguillarum e Vibrio nereis.
Os probiticos alm de beneficiarem o desempenho do animal em produo,
podem agir de forma positiva na qualidade da gua, sendo as bactrias com esse
potencial, gram positivas, que em sistemas aqucolas podem atuar na converso da
matria orgnica em CO2 de forma mais eficaz, assim como minimizar o excesso de
carbono orgnico dissolvido no sistema de produo (DALMIN, 2001). No entanto o
uso dos probiticos na piscicultura ornamental, apesar de emergente, ainda so escassos
exigindo do meio tcnico cientfico maiores estudos afim de contribuir na viabilidade
desta tecnologia na sade animal e fornecer melhorias de viabilidade econmica,
otimizando as respostas ambientais e comerciais da cadeia produtiva aqucola.

1.4 Enterococcus faecium

A espcie Enterococcus faecium classificada como uma bactria cido lctica,
Gram positiva, com distribuio oblqua, no virulenta e no resiste a ao de
antibiticos relevantes, garantindo a sua segurana quando ingerida. Micro-organismo
esse encontrado na fauna microbiolgica intestinal de humanos e animais, assim
tambm como no solo, gua e alimentos fermentados (PIMENTEL, 2007;
BYAPPANAHALLI, 2012), com fundamental importncia na suplementao de
alimentos, produzindo bacteriocinas que inibem a ocorrncia de agentes patognicos no
hospedeiro e conferem as caractersticas organolpticas do produto suplementado,
sobrevivncia ao processo de estocagem e colonizao gastrointestinal nas espcies
produzidas (BHARDWAJ et al., 2008; PIMENTEL, 2012).
Entre a caracterizao das bactrias cida lctica, os gneros Lactobacillus (L.
reuteri, L. johnsonii, L. acidophilus, L. delbrueckii, L. helveticus, L. casei, L.
rhamnosus, L. salivarius, L. fermentum e L. plantarum,) e Bifidobacterium (B.
thermophilum, B. bifidum, , B. lactis, B. longum e B. breve) so mais relatadas, porm
trabalhos avaliando o potencial probitico de outras classes de micro-organimos menos
explorados, constatam o uso probitico na resposta profiltica, teraputica e de
desempenho em animais, como as espcies da variao Lactococcus lactis, Leuconstoc
mesenteroides, Pediococcus acidilactici, Sporolactobacillus inulinus, Streptococcus
thermophilus, Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium, utilizadas com fins
probiticos na produo animal e de compostos lcticos (JIN et al., 2000; SANDERS e
KLAENHAMMER, 2001; POLLMAN et al., 2005).
A incluso de Enterococcus faecium na rao animal corrobora na reduo da
gordura visceral, a partir de estmulos da ativao no sistema enzimtico heptico do
hospedeiro, capacidade de estimular resistncia sanitria e ganho de peso. A espcie
E. faecium denominada como micro-organismos colonizador permanente e/ou
transitrio, no aparelho digestivo animal (DUPRE et al., 2005; POLLMAN et al., 2005;
SIVIERI et al., 2007).
O micro-organismo se acentua dentre outras, pela sua rpida atividade
microbiolgica de crescimento e produo de compostos antimicrobianos, no combate a
flora patognica intestinal, reduzido tempo de duplicao, com reproduo de at trs
vezes mais intensa, elevada resistncia s condies cidas estomacais, com reduzida
capacidade de perda na densidade floral, quando veiculado na suplementao oral e
rpida adeso aos stios de ligao na parede intestinal do hospedeiro, expressiva

capacidade de auto-agregao, caracterstica essa de grande importncia para fins

probitico, pois a sua coagregao em um curto intervalo de tempo contribui a formao
da barreira fsica intestinal, impedindo a colonizao de agentes patognicos
(NALLAPAREDDY et al., 2000; LUND & EDLUND, 2001; KS et al., 2003).
Enterococcus faecium se destaca por apontar uma grande absoro intestinal dos
nutrientes e capacidade de colonizao no intestino do hospedeiro, a partir dos dias
iniciais de suplementao alimentar. Trabalhos utilizando E. faecium para uso
probitico, progridem linearmente na avaliao de diferentes cepas da espcie
suplementao alimentar (MARCIKOVA et al., 2004; POLLMAN et al., 2005;
VAHJEN et al., 2009).
Com satisfatrios resultados em distintas aplicaes, para variadas espcies
animais, Kinouchi (2006) e Sivieri et al. (2007), utilizando fmeas de camundongos
com tumores biologicamente induzidos, obtiveram reao anticarcinognica, nos
tratamentos de indivduos suplementados com E. faecium, na dieta. Assim como na
aquicultura Wang (2007), Merrifield et al. (2010), Kim et al. (2012) e Dias et al. (2007),
comprovam a eficcia probitica na suplementao alimentar de tilpias, linguados,
trutas e rs, utilizando Enterococcus faecium como promotor no desempenho
zootcnico e resistncia imunolgica s espcies.

1.5 BACTERIOSES NA AQUICULTURA

As bacterioses so enfermidades no sistema de produo animal responsveis
pelos incalculveis prejuzos econmicos, comprometendo a sade e comercializao
das espcies (CAMPOS, 2010). Com a expanso da produo aqucola, apontam para
limitaes em sua cadeia produtiva relacionadas aos aspectos sanitrios presentes pela
intensificao da atividade, ocasionadas pela elevada densidade de estocagem e
negligentes manejos, tornando o ambiente propcio ao surgimento de doenas nas
espcies produzidas. Sendo as principais causas dessas atribudas a deteriorao da
matria orgnica, resultado de um errneo manejo alimentar e produtivo,
comprometendo a qualidade da gua, estresse ocasionado pelo imprprio manejo de
transporte e produo, contribuindo a um ambiente susceptvel a proliferao dos
agentes oportunistas e patognicos (ALKAHEM, 1994; SAKAI, 1999; FUJIMOTO et
al, 2005).
Sistemas de produes aqucolas so vulnerveis as enfermidades e condies
ambientais. Apontando para surtos parasitrios como grandes entraves monetrios ao

produtor, podendo impactar na perda parcial ou total de seus recursos produzidos,

consequentes da intensa proliferao patognica bacteriana em curto espao de tempo
(FAO, 2012; PEIXOTO, 2012).
As bacterioses mais frequentes que comprometem significativamente a cadeia
produtiva da piscicultura continental, se destacam as Pseudomonas aeroginosa,
Streptococcus aureus, Enterococcus durans, Micrococcus luteus, Escherichia coli e
Aeromonas durans (MARTINS, 2008). Suas transmisses ocorrem de forma horizontal,
sendo os seus surtos associados s mudanas climticas, ambiente sanitrio produtivo
inadequado, negligentes formas de manejo e transporte (PAVANELLI, 1998; AUSTIN
& AUSTIN, 2007; DUNG, 2008).
Em implantaes aqucolas continentais so causadoras de leses ulcerativas na
derme, equimoses, hemorragias, exoftalmia, acmulo de secreo nos tecidos nos peixes
em confinamento, alm de grande causadoras de anemia, sesses nos rins e fgado,
baixa imunidade e estresse animal (KIROV et al., 2002).
Surtos parasitrios ocasionados por micro-organismos patognicos so
denominados como principais entraves na cadeia produtiva aqucola mundialmente,
neste senrio estas espcies, se encontram com alto grau patognico em ambientes
sanitrios de produo pisccola, principalmente as espcies continentais dulccolas
brasileiras, intervindo em drsticas perdas produtivas e comercializao de peixes
(ZMYSLOWSKA et al., 2009; CARVALHO et al., 2011).
Estes gneros so considerados de grande patogenicidade, tanto na produo
animal, quanto para humanos, micro-organismos gram positivo/negativo autctone da
fauna intestinal de peixes saudveis, porm organismos oportunistas, que em ambientes
sanitrios inapropriados e desequilbrio homeosttico do animal desempenham
patogenicidade na aquicultura, causadoras da septicemia hemorrgica bacteriana.
Apontando como diagnstico a ruptura dos vasos sanguneos, leses na epiderme,
descamao, hemorragias ao longo do corpo do animal, despigmentao corprea,
acentuado batimento opercular, anemia, natao errtica, exoftalmia, curvatura do corpo
e mortalidade (WOO e BRUNO; 2003; DUNG, 2008; SILVA et al., 2012). Espcies
classificadas mais vulnerveis nos empreendimentos aqucolas, capazes de produzirem
enzimas extracelulares e toxinas: citosinas, hemolisinas e proteases (MARTINS, 2000;
KOZINSKA, 2007).

1.6 SELEO DE PROBITICOS in vitro

A seleo de bactrias in vitro de grande importncia para atenderem as

premissas potencialidade probitica. Para isto Vine et al. (2004) ressalta, sendo
fundamental o isolamento de cepas pertencentes fauna intestinal do organismo em
produo e a realizao de ensaios in vitro que instiguem, a no patogenicidade do
micro-organismo, resistncia s aes fisiolgicas do animal, assim como aos efeitos
antrpicos e naturais do sistema de produo, como nas medidas profiltica com NaCl e
as oscilaes das variveis fsico-qumicas do ambiente, inibio de organismos
indesejveis, a partir de compostos inibitrios, e competio por espao e nutriente
microbiota patognica. Com o exposto, apontando como pr-requisito para maior
segurana alimentar animal e ao probitica, ao serem inseridas aos estudos in vivo.
Ensaios de tolerncias das cepas probiticas frente a concentraes salinas
condizem atividade osmtica da parede celular do procarioto, quando expostas aos
sais expelidos pela bile , medidas profilticas e desempenho dos animais em produo e
viabilidade produtiva das espcies continentais com organismos marinhos, apontando
relevante s anlises in vitro para a capacidade de difuso osmtica do probitico
(HILL, 1990; FABREGAT et al., 2006; RIBEIRO, 2011).
A atuao do suco gstrico no aparelho digestivo do animal intervm como
barreira enzimtica com escalas crticas de acidez e ao emulsificante dos sais biliares,
letal aos micro-organismos (HILL, 1990; MARTINS et al., 2005; NITHYA &
HALAMI, 2013). Assim como tambm a alcalinidade, podendo intervir tanto, no
sistema de produo animal, durante os processos de calagem, quanto fisiologia de seu
intestino posterior (MOMOYAMA, 2004; BALCZAR et al., 2008; VINATEA et al.,
2010).
A ao antagnica dos micro-organismos conceituada como uma zona de
inibio do crescimento formado no entorno de discos embebidos em cultura bacteriana
candidatas a probitico, frente a meios de crescimento bacteriano, semeados com
organismo patognicos (VASEEHARAN & RAMASAMY, 2003). A partir de sua
capacidade em produzir compostos como: cidos orgnicos e bacteriocinas, na inibio
de bactrias patognicas gram positivas e perxido de hidrognio, bem como a
produo de cidos orgnicos e cido actico no combate ao crescimento de procariotos
gram negativos (VSQUEZ et al., 2005; GILLOR et al., 2008).
Na avaliao do potencial de crescimento e tempo de duplicao do probitico,
so de grande importncia seus testes in vitro, para eventual viabilidade de produo,
manuteno na densidade microbiolgica intestinal para perspectivas anlise in vivo,

simulando a elevada capacidade em multiplicao para competir por espao e nutriente,

aos agentes patognicos no hospedeiro (VINE et al., 2004; SANZ, 2007; VELEZ et al.,
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CAPTULO II

3 RESUMO
A espcie Pterophyllum scalare aponta para expressivos valores monetrios em
comercializao, sendo exportada principalmente para os pases Europeus, Americanos
e Asiticos. Porm com a intensificao do sistema de produo animal, surtos
parasitolgicos, principalmente atribudos a bactrias patognicas, vm comprometendo
a cadeia produtiva ornamental. Para isso, como alternativa segura e eficaz de combate e
preveno a enfermidades, vm sendo adotado o uso de raes funcionais
suplementadas com imunoestimulantes prebiticos e/ou probiticos, que garantam
melhores valores de desempenho e resposta imunolgica a espcie em produo. Para a
eficcia de cepas probiticas, fundamental o seu isolamento e seleo do animal em
produo, exigindo uma srie de desafios in vitro que comprovem a sua eficcia,
resistindo s barreiras fisiolgicas e produtivas a aqucola ornamental do P. scalare. O
objetivo do trabalho foi isolar e selecionar in vitro cepas de micro-organismos cido
lctico de potencial uso probitico do acar bandeira (Pterophyllum scalare), realizando
uma srie de desafios in vitro fundamentada em mltiplas caractersticas. Definindo o
melhor idetipo, por artifcio das maiores mdias entres as cepas avaliadas frente aos
caracteres tolerncia ao NaCl (0,5: 1,0: 1,5: 2,0: 2,5 e 3%), pH (4, 5, 6, 8 e 9), sais
biliares (5%), halo de inibio contra seis patgenos continentais, velocidade mxima
de crescimento, contagem final de clulas viveis e das menores mdias para o tempo
de duplicao dos procariotos. De cinco cepas isoladas do trato gastrointestinal do
animal com potencial uso probitico, identificadas molecularmente como Enterococcus
faecium nomeadas nas variedades Probc 1, 2, 3, 4 e 5. Dentre as cepas avaliadas a todas
atenderam as premissas para uso probitico animal, com destaque para a variedade
Probc 4 que apontou melhores resultados.

Palavras-chave: Desempenho zootcnico, piscicultura, ornamental, sanidade.

3.1 ABSTRACT
The specie Pterophyllum scalare was point the signficants monetary values in
comercialization, being exported mainly to the Eurpean countries , americans and
asiatics. But with a intensification of a animal production system, pathologics outbreak,
mainly attribute to pathogenics bacteria, was compromising the ornamental production
chain. For this as safe and effective alternative to combat and prevent the diseases, have
been adopted using functional ration supplemented with probiotics immunostimulants
and/or probiotics, that ensure better values of performances and imunes response to
species production. To the effectiveness of probiotics strains, it is fundamental to their
isolation and selection of animal production, resisting physiological barriers

to

productive and ornamental aquaculture of P. scalare . The objective of this research

was isolate and select in vitro micro-organism acid lactic of potential probiotic use for
acara-bandeira (Pterophyllum scalare), to carring a challenge series in vitro unfounded
in multiple characters. Defining the best ideotype, by artificie of biggest measure
between the strains to value in charge the tolerate characters to NaCl (0,5 ; 1,0; 1,5; 2,0;
2,5 and 3%), pH (4, 5, 6, 8 and 9) biliar salts (5%) halo of inhibition against six
continental pathogens, maximum velocity of growth, countdown to feasibles cells and
the smallest measures to the time of duplication of prochariotics. The five strains
isolated in the gastrointestinal tract animal with a potential use probiotics identified by
the molecules as Enterococcus faecium mentioned in varieties Probc 1,2,3,4 and 5.
Between the strains was valued to served the premise to the use of animal probiotic,
with prominent to the variety Probc 4 that was point better results.

Keyboards: Zootechnic performance, fishculture, ornamental, sanity.

4 INTRODUO
A produo de peixes com potencial ornamental cresce linearmente no mercado
internacional, apontando para valores monetrios de aproximadamente US$ 200
milhes em comercializao, com 60% deste capital oriundo da economia de pases em
desenvolvimento (FAO, 2007). Na Amrica Latina, o Brasil se destaca apresentando
grande variedade da ictiofauna ornamental proveniente de suas bacias hdricas
continentais, estando catalogadas mais de 2.500 espcies com distintos fentipos em
cores, tamanhos e formas. Entre essas regies destacam-se os Estados do Baixo
Amazonas, que contribuem para que o Pas ocupe a dcima oitava posio no ranking
dos pases exportadores de peixes ornamentais do mundo (ALBUQUERQUE-FILHO,
2003; GODINHO, 2007; CARDOSO e IGARASHI, 2009; RIBEIRO, 2009).
As espcies ornamentais nativas como o acar-bandeira (Pterophyllum scalare
Liechtenstein, 1823), acar-disco (Simphysodon aequifasciatus Pellegrin, 1904), apaiari
(Astronotus ocellatus Agassiz, 1831) e o cardinal (Paracheirodon axelrodi Schultz,
1956), esto classificadas entre as espcies de maior exportao comercial (CHAPMAN
et al., 2000; GODINHO, 2007). P. scalare um ornamental com grande potencial de
comrcio no mercado nacional e internacional, apontando para atrativas caractersticas
morfolgicas no mercado da aquariofilia e fcil adaptao aos diversos sistemas de
produo animal (LIMA, 2003; PRANG, 2007).
A intensificao dos sistemas de criao de peixes vem acarretando aumento de
enfermidades podendo ocasionar em mortalidades e consequentes prejuzos econmicos
cadeia produtiva (SAKAI, 1999). A responsabilidade por essa problemtica
atribuda principalmente s bactrias patognicas, de caracterstica oportunista a
ambientes sanitrios inadequados, alta densidade de estocagem, manejo alimentar
inapropriado, estresse animal, dentre outros fatores (ALKAHEM, 1994). Para prevenir e
combater as enfermidades bacterianas na piscicultura comumente so administrados
antibiticos, em sua maioria, de forma negligente e errnea, podendo fornecer
resistncia aos micro-organismos patognicos (VSQUEZ et al., 2005; DIAS et al.,
2011), alm do que em ambientes aqucolas esse efluente pode ser fonte de poluio
(BOYD e MASSAUNT, 1999).
Como medida alternativa ao uso de antibiticos nos ltimos anos vem sendo
adotado o fornecimento de raes funcionais suplementadas com imunoestimulantes,
prebiticos e/ou probiticos, aumentando os lucros e reduzindo os impactos ao corpo

hdrico. Essa estratgia produtiva aponta para a preveno de surtos de microorganismos patognicos no sistema de produo (OLIVEIRA et al., 2002).
Os probiticos so micro-organismos com potencialidades antagnicas aos
agentes patognicos, atravs da colonizao destes no trato digestivo do animal,
competindo desta forma por nutrientes e produzindo metablicos inibidores, aplicados
em diversas reas mdicas, na agricultura e na produo animal, tendo aplicao na
aquicultura a partir da dcada de 80, contribuindo significativamente na sanidade
animal, a partir do estmulo de seu sistema imunolgico (KOZASA, 1986; RAMIREZ,
2006; VINE et al., 2006; BALCAZR et al., 2008; GATESOUPE, 2008; TINH et al.,
2008).
Em produes aqucolas os probiticos so definidos como clulas microbianas
que ao serem inseridas no sistema de criao colonizam o trato digestrio dos animais,
contribuindo com o desempenho e resposta imune do animal atravs do estmulo
produtivo de vitaminas, cidos graxos de curta cadeia, minerais e lipdeos, alm de
melhorar o aproveitamento proteico, otimizando a digestibilidade e assimilao dos
nutrientes essenciais, ocasionado pelo aumento da viscosidade intestinal, melhorando,
com isso, o desempenho zootcnico do indivduo (GATESOUPE, 1999; SUGITA e
ITO, 2006; KESARCODI-WATSON et al., 2008; SOUZA et al., 2010).
Dentre os micro-organismos utilizados como probiticos, destacam-se as
bactrias cido lcticas, por apontarem fcil crescimento, produo de compostos
antimicrobianos (cido lctico, perxido de hidrognio, cidos orgnicos e bactericidas)
e estmulos resposta imune no especifica em seu hospedeiro (RINGO e
GATESOUPE, 1998; GATESOUPE, 2008).
A eficcia dos probiticos comprovada quando inseridos nos sistemas de
produo aqucola, de acordo com MORIARTY (1998), ao suplementar a dieta com
micro-organismos probiticos, obtendo melhorias nas variveis da gua e na sanidade
de espcies aquticas, assim como BOYD e MASSAUT (1999) comprovou seu efeito
biorremediador na decomposio da matria orgnica e na qualidade da gua na
aquicultura, promovendo reduo nas taxas de fsforo e dos compostos nitrogenados,
amnia, nitrito e nitrato.
Assim, o isolamento de bactrias com interesse probitico do trato
gastrointestinal da espcie em produo fundamental para a sua eficincia, porm este
processo est associado ao isolamento de centenas de micro-organismos para este fim,
entretanto a abundncia dessas bactrias inviabiliza a realizao de ensaios com todas as

cepas com este potencial, sendo a produo desse suplemento alimentar exige a
realizao de uma srie de desafios de seleo in vitro, para inibio de agentes
patognicos, conhecer a cintica de crescimento, a resistncia a sais biliares e os efeitos
naturais e antrpicos que possam estar presentes no sistema de produo animal (ALY
et al., 2008; BALCAZAR et al., 2008; EH-RHMAN et al., 2009).
Um micro-organismo que atenda as premissas de um probitico deve apontar
para o maior nmero de caractersticas especficas, que garantam a sua eficincia como:
no ser patognico, ausente de genes que resistam a antibiticos, tolerante aos sais
biliares e pH, aderncia mucosa intestinal, elevado crescimento e reproduo,
capacidade de colonizar a superfcie do epitlio intestinal, registro como aditivo
alimentar, boa atividade antagnica aos patgenos com grande expresso de surtos a
espcie produzida, especificidade ao hospedeiro, preferencialmente de origem autctone
do animal (MERRIFIELD, 2010).
Portanto, o objetivo deste trabalho isolar e selecionar in vitro cepas de
micro-organismos cido lcticos de potencial probitico do peixe ornamental
amaznico acar bandeira Pterophyllum scalare baseada em mltiplos desafios.

5 OBJETIVOS

5.1 OBJETIVO GERAL

Isolar e selecionar a bactria com potencial probitico, obtida do trato

gastrointestinal do peixe ornamental amaznico acar bandeira Pterophyllum scalare.

5.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Isolar bactrias cido lcticas do trato gastrointestinal do acar bandeira

Pterophyllum scalare;

Avaliar in vitro as cepas isoladas submetidas a desafios com NaCl, pH, sais
biliares, inibio de patgenos;

Cintica de crescimento; velocidade mxima de crescimento e tempo de

duplicao;

Identificar as cepas com potencial probitico.

6 MATERIAL E MTODOS

6.1 ISOLAMENTO DE BACTRIAS CIDO LCTICAS COM POTENCIAL

PROBTICO.
As cepas das bactrias com potencial probitico foram isoladas do trato
digestrio de dez juvenis saudveis do peixe ornamental amaznico acar-bandeira
Pterophyllum scalare, obtidos a partir de reproduo natural em cativeiro, com valores
zootcnicos de 38,77 0,58mm, 21,95 0,17 mm, 32,63 0,26 mm e 775,71 0,15
mg para comprimento total, comprimento padro, altura e peso, respectivamente,
mensurados com o auxlio de paqumetro e balana de preciso.
Os organismos foram submetidos a jejum de 24 horas, para esvaziamento
intestinal. Os peixes foram eutanasiados com seco na medula espinhal, desinfetados
externamente com soluo de lcool 70%, e eviscerados, realizando a exciso do
intestino do animal em condio estril, com peso de 0,1g, utilizando bisturi, tesoura e
placa de petri previamente esterilizados.
Aps coletado, o material foi macerado em soluo salina de NaCl a 2%,
utilizando gral e pistilo de porcelana, posteriormente transferidos para tubos Falcon
contendo 9 ml de meio de cultura em caldo para Lactobacillus Man Rogosa Sharpe
(MRS), meio exclusivo para o crescimento de bactrias lcticas, homogeneizado com
agitador de tubos vortex e incubados por 24 horas a 35C.
Aps incubada, a soluo foi novamente homogeneizada e semeada em placas
de petri com volume de 15 ml de meio de cultura agar Man Rogosa Sharpe (MRSA) em
duplicata, homogeneizadas com esferas de microprolas, contendo 10% de azul de
anilina como indicador de cepas probiticas (RAMIREZ et al. 2006) e incubadas por
um perodo de 48 horas a 35 C em estufa esterilizada. Os meios de cultura foram
elaborados em solues contendo gua destilada e concentraes de soluto coerente s
instrues do fabricante. Esterilizados em autoclave a temperatura de 120 C durante 20
minutos. Aps o processo, os meios de cultura foram transferidos para a capela de fluxo
laminar, at atingirem a temperatura ambiente, a seguir esterilizados com luz ultra
violeta por 20 minutos, para posteriormente serem semeadas as cepas em meios de
cultura em caldo e placa (BULLER, 2004).
As colnias de interesse (bacilos e cocos gram-positivas), foram isoladas por
esgotamento de estrias em meio agar MRS e avaliadas quanto produo de catalase,

descartando para as etapas de inibio in vitro as cepas catalase positivas (JATOB et

al., 2008).
Aps o isolamento em estrias as colnias desenvolvidas no meio de cultura
foram reconhecidas e classificadas utilizando o mtodo de Gram. As colnias com
relevncia para uso probitico, cocos e bacilos gram-positivas, foram semeadas em um
novo meio de cultura gar MRS para esgotamento em placa.

6.2 IDENTIFICAO DA ESPCIE

O material gentico para identificao das cepas, foi extrado de isolados puros
mantidos em meio semisslido, no Laboratrio de Probiticos da Universidade Federal
do Par. Onde cada cepa foi semeada com o auxlio de uma ala de platina estril em
meio caldo MRS com 10 ml, incubados a 35 C aps 24 horas de crescimento
bacteriano.
Para a extrao do DNA dos procariotos seguiu a metodologia de Sambrook et
al. (1989), adaptado por Jin (2006), sendo aps o cultivo das cepas, 1,4 ml de cada
cultura foi centrifugada a 12000g durante 2 minutos, sendo o pellet ressuspenso em 530
l de TE (100mM de Tris e 1 mM de EDTA), posteriormente adicionada um alquota de
28 l de dodecil sulfato de sdio (SDS) a 20%, e 2 l de proteinase K (2mg/ml).
Mantidas em estufa a 37 C por duas horas sem agitao, para posterior extrao,
utilizando 500l de feno/clorofrmio/lcool isoamlico (25:24:1). Em seguida o
sobrenadante foi retirados e 500l expelidos em um novo micro tbulo com capacidade
de 1,5 ml, adicionado 10 l de NaCl a 5 M, para uma concentrao final de 10 mM, no
precipitado com duplicata de etanol absoluto gelado. Aps esses procedimentos o DNA
foi congelado -20 C durante duas horas, para posterior centrifugao 12000g em
dez minutos, sendo o precipitado lavado com soluo de lcool a 70% e ressuspenso em
100 l de TE e tratado com 2 l de RNAse H (10 mg.ml-1 ). Para posterior anlise de 4
l por eletroforese em gel de agarose a 1 % para quantificao.
A quantificao do DNA extrado foi realizada pela metodologia de
fluorescncia (SAMBROOK & RUSSEL, 2001). Uma vez quantificado o material
gentico das cepas de bactrias com potencial probitico, prosseguiu o processo de
amplificao dos genes selecionados para sequenciamento e posterior identificao dos
isolados do trato-gastrointestinal do acar bandeira. A regio foi isolada e amplificada
via PCR phenylalanyl-tRNA synthase (pheS), utilizando os seguintes iniciadores: pheS21-F

(5'

CAYCCNGCHCGYGAYATGC

3')

pheS-23-R

(5'

GGRTGRACCATVCCNGCHCC 3'), eficaz para analise taxonmica de procariotos

cido lcticos (NAESER et al. (2007). Em seguida foi realizada a amplificao do
fragmento de DNA a partir da tcnica de Reao de Polimerizao em Cadeia (PCR).
As reaes foram conduzidas com um volume de 15 L, sendo 2,4 L de DNTPs (1,25
mM), 1,5 L de tampo (200 Mm Tris-Hcl- PH 8, 500 Mm KCl), 0,6 L de MgCl2 (50
Mm), 0,6 L de cada um dos iniciadores (50 ng/ L), aproximadamente 50 ng de DNA
molde, 0,1 L de Taq Polimerase (5 U/ L ) e gua ultrapura para completar o volume
da reao.
Aps o resultado de PCR o sequenciamento das amostras foi efetuado pelo
mtodo de dideoxiterninal (SANGER et al., 1977), no sequenciador automtico ABI
3500 XL, utilizando reagentes do kit BigDye (ABI Prism TM Dye Terminator Cycle
Sequencing Reading Raction PE Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). As
sequncias foram alinhadas e editadas com o auxlio do programa BioEdit (HALL,
1999).
Aps sequenciado o material gentico foi extrado em um arquivo individual
para cada cepas em formato FASTA, para leitura no programa Basic Local Alignment
Search Tool-BLAST. A identificao das cepas foi realizada inicialmente pela
comparao com sequncias depositadas no acervo mundial de sequncias GenBank
(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/),

sendo

busca

realizada

com

algoritmo

MEGABLAST. Posteriormente, as relaes filogenticas foram estimadas com

construo de uma rvore de agrupamento de vizinhos, utilizando 1000 pseudo-rplicas
de booststrap, sendo estas anlises conduzidas no MEGA v. 6.05 (TAMURA et al.,
2013).

6.3 SELEO in vitro

Para os testes in vitro as cepas das bactrias com potencial probitico isoladas
foram semeadas em tubos Falcon esterilizados contendo volume de 9ml de meio de
cultura caldo MRS, produzidos com distintas concentraes salinas de (0, 0,5, 1,0, 1,5,
2,0, 2,5 e 3%), pH (4, 5, 6, 7, 8 e 9), sais biliares, 5% (p/v), semeados com um ml de
cultura crescida de cada cepa e conduzidas para estufa a 35 C durante o perodo de 24
horas com quatro repeties. Em seguida, realizou-se leitura de 1 (um) ml de cada
cultura em cubetas para anlises no espectrofotmetro a 630 nm de absorbncia. Sendo
a resposta de cada cepa isolada sobre distintas concentraes de NaCl, pH e sais biliares

definidas pelo percentual de reduo da absorbncia em comparao ao meio de cultura

controle com 0% de NaCl, pH (7) e sem adio de sais biliares.

6.4 INIBIO DE PATGENOS

A inibio de patgenos foi aplicada a capacidade antibacteriana das cepas cido
lcticas frente aos agentes patognicos, analisado pelo halo de inibio, denominado
pelo dimetro da zona inibitria das cepas probiticas (HJELM et al., 2004), realizado
pelo mtodo de Ramirez et al. (2006). Com isto as cepas cido lcteas crescidas em
tubos de ensaio com meio de cultura caldo MRS, mantidos por 24 horas incubadas em
estufa a 35C, posteriormente semeadas em placas de petri contendo meio de cultura
agar MRS e incubadas a 35C durante 48 horas.
Onde quatro discos com dimetro de 0,8 cm foram retirados de placa Agar com
cepas de bactrias cido lcticas e ento sobrepostas em meio de cultura Agar Triptona
de Soja (TSA), recm semeadas com os patgenos: Aeromona hydrophyla,
Pseudomonas aeroginosa, Enterococcus durans, Escherichia coli, Staphylococcus
aureus e Micrococcus luteus incubados a 30 C por 48 horas. A inibio do crescimento
dos patgenos foi determinada, pelo dimetro do halo de inibio de crescimento
bacteriano produzido nas extremidades do disco Agar MRS.
As bactrias utilizadas como probiticos apresentam como caracterstica a
competio por nutrientes e espao com os microrganismos patognicos do trato
gastrointestinal de seu hospedeiro, tornando de fundamental importncia uma elevada
taxa de crescimento da cepa utilizada para tal fim (KESARCODI-WATSON et al.,
2008; VINE et al., 2006).

6.5 CINTICA DE CRESCIMENTO

As anlises para determinarem a cintica de crescimento bacteriano foi realizada
a um intervalo de duas horas, retirando uma amostra de 1 ml do meio de cultura para
leitura em espectrofotmetro a 630 nm de absorbncia. Para anlise dos dados as
concentraes dos inculos foram convertidas para unidades formadoras de colnia
UFC/ml. Aps 24 horas de crescimento em meio de cultura lquido, uma alquota de
100 l de todos os frascos foram semeados em meio de cultura agar MRS, pela tcnica
de diluio seriada e inoculadas a 35 C durante 48 horas, para ento serem estimadas
as unidades formadoras de colnia UFC/ml.

Para estes resultados, foram calculadas a velocidade mxima de crescimento

(max) e tempo de duplicao (tdup) das respectivas cepas, seguindo a equao de
JATOB et al. (2008):
Velocidade mxima de crescimento;

Onde;
max = Velocidade mxima de crescimento
Z = Concentrao (UFC/ml)
Z0 = Concentrao inicial do inculo (UFC/ml)
dt = Tempo de cultivo (horas)
Tempo de duplicao;

Onde;

tdup = Tempo de duplicao (horas)

max = Velocidade mxima de crescimento.
6.6 ANLISE ESTATSTICA
As contagens microbiolgicas foram transformadas em log10(x+1), antes de
serem submetidas aos testes estatsticos. Sendo os dados obtidos em cada desafio
submetidos Anlise de Varincia (ANOVA), com significncia (p<0,05) e a diferena
das mdias avaliadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, analisados com o
auxilio do programa estatstico ESTAT.

7. RESULTADOS E DISCUSSO
A importncia na aquisio de um probitico deve seguir o isolamento de
bactrias endgenas intestinais do prprio hospedeiro, garantindo uma maior segurana
como suplemento alimentar, no patognica, habilidade em resistir ao dos sais
biliares, valores estremos de pH e proteases no aparelho digestivo do indivduo. Assim
como testes antagnicos, para comprovar a produo de compostos inibitrios na
competio por nutrientes, dos probiticos frente microbiota patognica (VINE et al.,
2004).

Identificao da espcie
Como resultado das cepas cido lcticas com potencial probitico isoladas do
trato intestinal do acar bandeira Pterophyllum scalare, de 16 morfotipos selecionados,
cinco apontaram catalase negativa e prosseguiram aos demais ensaios in vitro,
identificados molecularmente como Enterococcus faecium. Das variedades analisadas
todas apontaram para uma vasta variabilidade fenotpica, para todos os caracteres
avaliados neste trabalho.
Os resultados da comparao do sequenciamento molecular obtidos da
ferramenta BLAST do banco de dados GenBank, apontaram para os iniciadores
especficos ao gene pheS eficaz na amplificao dos nucleotdeos das amostras, sendo
possvel identificar a espcie trabalhada, com ntida leitura cromatogrfica e
similaridade de identidade igual a 100%, das cinco cepas, com amostras identificadas
como Enterococcus faecium, sendo que estes resultados corroboram com o filograma
(Fig. 1), onde existe um elevado suporte estatstico para o arranjo contendo sequncias
das cinco cepas, das analisadas e sequencias previamente identificadas com E. faecium.
No isolamento e seleo de cepas com potencial probitico estudos que ao
identificarem esses isolados de animais em produo, deparam-se com cepas de mesmas
espcie, porm com variedades distintas. Vieira et al. (2008) ao isolarem bactrias
probiticas da carcinocultura marinha, identificadas bioquimicamente com galerias API
50 CHL, como resposta a melhor cepa que suprisse o perfil probitico, a espcie
Lactobacillus plantarum com a variedade denominada L. plantarium 1, apresentou
melhor ndices de avaliao a seriados testes in vitro.

Figura1. Fenograma das cepas probiticas isoladas do acar bandeira com as sequncias
do gene pheS (aproximadamente 334 pares de base).

Assim como Roselet (2008) ao isolar e identificar molecularmente microorganismo com potencialidade probitica, verificou que uma espcie pode apresentar
comportamentos distintos frete a desafios in vitro. Dosta et al. (2012) ao isolar
diferentes morftipos com potencial probitico de juvenis de Pterophyllum scalare,
identificou molecularmente trs cepas que apontam melhores resultado de seleo in
vitro, utilizando o gene 16S, resultados que classificaram as cepas pertencentes ao
gnero Bacillus sp., com a variedade Bsp2 como melhor respostas as anlises, no
sendo possvel, averiguar agrupamento gentico de similaridade identificao
taxonmica de espcie.
Estudos comprovam a eficcia de Enterococcus faecium com uso probitico
como promotor do desempenho zootcnico, imunolgico e flora predominante no trato
gastrointestinal de animais (BENYACOUB , 2003; TARASOVA, 2010; SUN et al.,
2010). Desempenho probitica do Enterococcus faecium foi relatado por Wang (2007),
ao suplementar na dieta de tilpias nilticas, obtiveram melhores respostas de
desempenho no ganho de peso animal, quando comparadas com os indivduos controle,
no suplementados com o probitico. Ao utilizarem Enterococcus faecium na
ranicultura de Rana catesbeiana, Dias et al. (2007) obteve prsperos ndices

zootcnicos, na menor converso alimentar e efeito imunomodulador durante 28 dias

experimentais, evidenciando a eficcia do probitico.
Entretanto Kim et al. (2012), apontaram maior concentrao de lisozima e
resposta imunolgica de linguado (Paralichthys olivaceus), durante duas semanas de
suplementao com o mesmo probitico. Assim, para trutas alimentadas com rao
contendo o probitico E. faecium, indicou para melhores respostas imunolgicas, na
interao do probitico com as clulas do sistema imune, a partir da observao celular
no epitlio intestinal do animal, induzindo a sua maior produo (MERRIFIELD et al,
2010).
Para a eventual potencialidade das cinco cepas cido lcticas isoladas de P.
escalare, todas identificadas molecularmente pertencentes espcie Enterococcus
faecium, a exigncia dos testes in vitro denominao da melhor variedade, torna-se
relevante na avaliao da resistncia de cada cepa, aos fatores que possam intervir, no
sistema produtivo e fisiolgico do animal. Classificando a melhor variedade para
eventuais viabilidades de produo e segurana a serem inseridas na cadeia produtiva do
ornamental.

Tolerncia ao NaCl
Os sais expelidos pelo suco gstrico e das atividades enzimticas do intestino
dos animais apresentam uma concentrao que varia de 0,5-1% (p/v). Essa secreo
salina, compromete a passagem do procarioto probitico, consequente da difuso
osmtica, at a suposta colonizao no intestino do hospedeiro (HILL, 1990).
Para o desafio de resistncia osmtica das bactrias com potencial probitico
isolados de Pterophyllum scalare, todas demostraram viabilidade de resistncia frente a
distintas concentraes de NaCl, com estatstica significativa (p<0,05) para todas as
concentraes analisadas, expostas durante 24 horas ao desafio (Tab. 1).

Tabela 1. Reduo em porcentagem de absorbncia na avaliao in vitro das bactrias

cidos lcticas isoladas do trato digestrio do ornamental Pterophyllum scalare
submetidos aos desafios frente a concentraes de 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 e 3% de NaCl,
escalas de 4, 5, 6, 8 e 9 de pH e 5% de sais biliares.
Cepas

NaCl0,5 NaCl1,0 NaCl1,5 NaCl2,0 NaCl2,5 NaCl3,0

(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)

pH4
(%)

pH5
(%)

Probc1

57,91
3,58B

58,12
7,83B

57,34
6,99B

41,25
6,05 C

56,56
7,00B

68,53
5,96A

0,0
0,0B

0,0
0,0B

Probc2

34,07
6,91C

28,88
2,69C

24,73
3,73C

21,94
3,00 D

15,99
3,65D

14,51
3,62C

0,0
0,0B

Probc3

80,26
3,04A

72,79
1,64A

74,29
6,28A

68,69
4,85 A

69,89
1,57A

59,64
4,67A

Probc4

34,43
4,56C

32,37
1,54C

33,57
3,11C

28,33
2,45 CD

26,71
1,99C

23,63
1,53C

0,0
0,0B
25,92

0,32A

Probc5
F
CV(%)

66,69
4,94B
**
8,78

70,64
4,78A
**
8,37

67,09
8,61AB
**
11,88

57,31
8,05 B
**
11,63

51,02
6,21B
**
8,99

44,84
8,42B
**
12,17

0,0
0,0B
**
35,21

0,0
0,0B
23,3

2,40A
15,83

2,24A
22,80

9,50A
**
28,05

pH6
pH8
pH9
SB
(%)
(%)
(%)
(%)
17,57 16,47
10,80

0,0

1,89BC 1,66C 0,0C 0,18C

19,10 23, 80 8,82 11,17

2,89B 2,73B 1,02B 0,78C

13,22
17,05

1,07 7,1

0,59CD 0,69D 2,92B 0,42BC

46,06 36,55 34,45 62,96

1,00A 3,75A 1,39A 6,88A

10,35 26,25
23,20

7,1

2,58D 2,20B 1,37B 1,31B

**
**
**
**
9,4
11,7 14,27 17,36

Letras distintas indicam diferena significativa entre os tratamentos na coluna pelo teste
de Tukey (p<0,05).
Os resultados explanaram crescimento bacteriano, em todas as concentraes
(Tab. 2), sendo o seu tempo de exposio bem mais elevado, comparado fisiologia
animal, cuja ao do NaCl e sais biliares apontam para atividades que variam entre duas
e seis horas, indicando aptido de todas as cepas isoladas, em bombear ctions de H +
transportado para o interior celular, tanto em condies hipertnicas quanto ao cida
do meio, atravs da ao enzimtica das F0F1-ATPase, fornecendo as cepas condies
para resistirem em ambientes salobros e as barreiras fisiolgicas qumica de 0,85% de
NaCl do suco gstrico animal, durante longos perodos de exposio (COCORAN et al.,
2005).
Na seleo de cepas com potencial probitico Vieira et al. (2008) obtiveram
menor perda na densidade tica bacteriana, submetidas a desafio com 3% de NaCl, a
espcie Weissella confusa. Assim como, demais autorias apontam a perda na
absorbncia de crescimento de micro-organismos probiticos in vitro, as concentraes
elevadas de NaCl, utilizando Lactobacillus plantarum e Weissella cibaria
(PAPAMANOLI et al., 2003; RICCIARDI et al., 2009). Resultados estes que
corroboram aos obtidos neste trabalho, com cepas probiticas isoladas do cicldeo acar

bandeira, sendo todos os isolados para este fim, apontaram para progressivos resultados
frente ao desafio salobro.
Resposta ao desafio s concentraes de NaCl das cepas isoladas de P. scalare,
apontaram para atividade microbiana de crescimento destas, podendo contribuir para
quando inseridas no sistema de produo animal, resistam ao antrpica de criao,
como no policultivo da espcie ornamental estudada com o camaro marinho
Litopenaeus vannamei (BOONE, 1931) em baixas salinidades, se torna uma estratgia
de criao com relevncia econmica para ambas as espcies de acordo com RIBEIRO
(2011). E resistir s medidas profilticas da aquicultura ornamental, como Fabregat et
al., (2006) ao utilizarem concentraes de NaCl, avaliaram a resistncia das larvas de
Pterophyllum scalare constataram boa resistncia da espcie quando submetida ao
NaCl, proporcionando melhores valores de desempenho zootcnico e medida profiltica
contra agentes patognicos.
Resistncia esta catalogada tambm cepa probitica, Lactobacillus plantarum
salinidade no sistema de produo e atividade antagnica da bactria cido lctica,
alterando a microbiota intestinal de espcies em produo (RAMIREZ et al., 2006;
GATESOUPE, 2008; VIEIRA et al., 2008).
Na suplementao probitica em policultivo de camaro marinho com tilpia do
Nilo, em sistema de produo com gua salinizada, Bezerra (2008) obteve reduo na
contagem de bactrias totais, principalmente para Vibrios sp e Pseudomonas sp, para os
camares e peixes, respectivamente, ao probitica que tambm pode intervir como
biocontrole quando inseridas na criao de organismos aquticos.
O policultivo de espcies dulccolas com organismos marinhos, com destaque
produo de camares, vem contribuindo para resultados otimistas na viabilidade
econmica de produo, taxas de desempenho e reduo de agentes patognicos no
meio produtivo. Hiptese comprovada no policultivo de tilpia com camaro marinho,
que apontou para resultados sanitrios otimistas, na diminuio s contagens de Vibrio
harveyi na gua, reduzindo a contaminao horizontal, comparado com monocultivo do
crustceo, micro-organismo de elevada patogenicidade na cadeia produtiva do camaro
marinho Litopenaeus vannamei (TORRANS & LOWELL, 1987; GRIMON, 2003;
VIEIRIA et al., 2007; VIEIRIA et al., 2008).
A escala produtiva das espcies de gua doce em ambientes salobros visa reduzir
surtos patolgicos em fazendas de camaro, tcnica esta exercida com xito no Equador
e Brasil (GRIMN, 2003; MELLO & FARIAS, 2007). O policultivo de crustceos

marinhos com peixes apontam para bons ndices zootcnicos dos camares, que estaria
associado aos peixes reduzirem o excesso de matria orgnica em suspenso,
colaborando no manejo de um ambiente de produo equilibrado na carcinocultura
(GRIMON, 2003; CANDIDO et al., 2005; MUANGKEOW et al., 2008). Sendo de
grande relevncia a via de administrao do probitico na produo animal, premissas
que apontam resistncia das cepas isoladas de P. escalare, para eventuais criaes
salobras, de policultivo ou media profiltica.

Tolerncia ao pH
No aparelho digestivo dos animais a atuao do suco gstrico intervm, como
barreira enzimtica com escala crtica de acidez, letal aos micro-organismos (HILL,
1990; MARTINS et al., 2005). Os resultados obtidos para esta varivel apontaram
diferena estatstica significativa (p<0,05), pelo teste de Tukey, para todas as escalas de
pH. Apontando para maior resistncia nas escalas extrema de acidez e alcalinidade a
cepa Probc4, com menor percentual de perda em absorbncia aps 24 horas (Tab. 1),
submetidas ao desafio. Ocorrendo separao das mdias as escalas de pH 5, 6 e 8, com
crescimento microbiolgico s cepas Probc2 e Probc5 (Tab. 1).
Para as culturas probiticas exercerem atividades benficas no aparelho
gastrintestinal do hospedeiro, as cepas com esse potencial devem resistir s escalas de
acidez e alcalinidade que interferem tanto, no sistema de produo animal, quanto sua
fisiologia. O suco gstrico expelido no aparelho digestivo das espcies, apontam para
uma escala de pH com carcter extremamente cido. Sendo de suma importncia a
resistncia da cepa probitica a tolerar escalas extremas de acidez (NITHYA &
HALAMI, 2013).
J o potencial hidrogeninico em sistemas de produo aqucolas, uma
varivel de intensa oscilao, atingindo valores cidos e alcalinos, dependendo da
eutrofizao e pluviosidade nos tanques em produes superintensivas (MOMOYAMA,
2004; VINATEA et al., 2010). Sendo de suma importncia a resistncia da cepa
probitica a uma ampla faixa de pH.
A gua do sistema de produo apontada como uma das barreiras fsicoqumicas que podem intervir no crescimento microbiano de bactrias com potencial
probitico, dentre suas variveis o pH crtico para o desempenho das bactrias, tanto
no meio produtivo, cujo pode alcanar valores extremos de acidez e alcalinidade, como
tambm na fisiologia intestinal do animal (MARTINS et al., 2005).

Para a produo de compostos lcticos suplementados com probitico, o pH

dentre as escalas de 4-5, so utilizados garantia microbiolgica do produto durante o
seu perodo til estocado (HELLER, 2001). Sendo de fundamental importncia das
cepas probiticas, resistirem a escalas cidas de pH, para eventual suplementao na
rao animal durante o processo de industrializao.
Realizando testes in vitro na resistncia de 70 cepas do gnero de Enterococcus
frente a diversas escalas de pH, MORANDI et al. (2005), constataram que a espcie
Enterococcus faecium, uma cepa resistente s oscilaes dessa varivel, que quando
expostas em curtos perodos, se mantido o seu ciclo logartmico, resultados que
corroboram aos obtidos no trabalho supracitado, apontando para significativa resistncia
das cepas de E. faecium isoladas do ornamental acar bandeira, expostas durante 24
horas em diferentes concentraes de pH.
Realizando teste in vitro sobre diferentes concentraes de pH, na classificao
de micro-organismos probiticos, Lactobacillus plantarum, apontou reduzida perda de
viabilidade em meios contendo pH cidos (PAPAMANOLI et al., 2003). Vieira et al.
(2008), avaliando cepas probiticas em escalas de pH cido, no obteve xito no
crescimento bacteriano, porm em escalas alcalinas suas espcies apresentaram
tolerncia a essa escala, com valores significativamente maiores

para a espcie

Weissella confusa, apontando para maior cintica bacteriana e efeito probitico da

espcie em escalas mais elevadas de pH. Resultados que corroboram aos alcanados na
seleo de cepas probiticas de Pterophyllum scalare, entre as cinco variedades isoladas
e identificadas, a cepa Probc 4 mostrou maior resistncia s escalas extremas de acidez
e alcalinidade, podendo exercer atividade probitica na gua e no intestino do animal,
de acordo com a sua via de aplicao.
Assim, a resistncia das bactrias probiticas a ao cida do suco gstrico do
animal, so fundamentais para o xito desta tecnologia e atenda as definies de
GATESOUPE (1999), para a colonizao do micro-organismo na mucosa intestinal do
animal. CHAVES et al. (1999) obteve xito em testes in vitro quando submetido o
probitico Lactobacillus acidophilus a concentrao cida de pH, com crescimento
bacteriano de 55,61, 26,14 e 11,70%, da cepa exposta durante 1, 2 e 3 horas,
respectivamente. Para este trabalho os resultados apontam que a variedade Probc3,
Probc 4 e Probc 5 das cepas isoladas, crescem em meio cido e alcalino durante os
perodos de exposio testados no desafio, 24 horas. Caracterstica essa que colabora
potencialidade do probitico a resistir s condies cidas, tanto na fisiologia animal

quanto em seu sistema de produo, sendo esta varivel aponta para intensas oscilaes
na piscicultura, que caso aplicado na gua de produo, se faz necessria a resistncia
do probiticos as escalas cido-base do pH (SIPABA-TAVARES e BACCARIN,
2006; S. 2012).

Tolerncia a Sais Biliares

Para um micro-organismo apontar perfil probitico, uma de suas exigncias a
eficaz colonizao no trato gastrointestinal do hospedeiro, sendo de grande importncia
a sua resistncia aos efeitos emulsificantes dos sais biliares (BALCZAR et al., 2008).
Os resultados obtidos dos micro-organismos isolados do ornamental P. scalare
atenderam a premissa de resistncia frente a sais biliares, que uma bactria necessita
potencialidade de seu uso probitico. Indicando diferena estatstica significativa a 5%
de probabilidade, destacando para menor perda de bactrias probiticas viveis a cepa
Probc4, submetida ao desafio a 5% (p/v) de sais biliares durante 24 horas de incubao
a 35 C, comparada a soluo controle (Tab. 2).
As bactrias utilizadas como probiticos ao passarem pelas condies crticas da
acidez do estmago, tero que enfrentar os desafios fsicos e qumicos do duodeno,
secreo e sais biliares. Devendo o micro-organismo atender como pr-requisito resistir
ao transporte at o trato gastrintestinal, na garantia de promover os efeitos benficos no
hospedeiro. Como principais funcionalidades de resistncia a ao dos sais biliares,
sua ao emulsificante, capacidade de adeso mucosa intestinal, atividade antagonista
frente aos patgenos, tolerncia faixa de pH cidas e alcalinas, no aparelho digestivo
do animal, dentre outros desafios que comprometam a sobrevivncia do organismo no
sistema de produo aqucola (HAVENAAR & HUIS, 1992; VINDEROLA &
REINHEIMER, 2003; HUANG & ADAMS, 2004; PENNACCHIA et al., 2004;
SCHILLINGER et al., 2005).
A bile atua na fisiologia do animal, a partir da ingesto de alimentos, que ao
passarem pelo aparelho digestivo sofrem a ao dos sais biliares, emulsificando as
gorduras contidas no alimento para melhor digesto. Nos micro-organismos esta ao
compromete a ruptura de sua parede celular, constituda por cidos graxos e lipdeos,
desta forma, para uma diversidade de bactrias os sais biliares so crticos para a
sobrevivncia e colonizao da microbiota no hospedeiro (ERKKIL & PETAJA,
2000), para os resultados alcanados com cepas probiticas isoladas de P. scalare,
mostraram crescimento bacteriano, frente ao da bile in vitro, durante 24 horas de

exposio, resultados que colaboram na denominao de micro-organismos resistentes a

este desafio, de acordo com Balcazar et al. (2008).
Os micro-organimos com eventuais potencialidades probitico isolados por
Chaves et al. (1999) apontou resistncia concentrao de 0,3% de sais biliares
submetidos durante um intervalo de oito horas, tempo de atuao dos sais biliares na
fisiologia animal. De acordo com Gilliland et al. (1985), bactrias que resistem ao
dos sais biliares durante um intervalo dentre duas e oito horas, so denominados de
micro-organismos tolerantes a ao da bile quando digerido o alimento. Colaborando
aos dados explanados no trabalho com as cepas isolados do ornamental acara bandeira,
com destaque a cepa Probc4, que apontou para menor perda de densidade tica, quando
exposta ao desafio (Tab. 1).
Balczar et al. (2008), obtiveram baixa perda de viabilidade as cepas L.
plantarum e L. lactis, isoladas de truta arco-ris, pontando como pr-requisito as
premissas para uso probitico. J para isolados de camaro marinho, L. plantarum, para
todas as variedades isoladas, obtiveram maiores resistncia frente a este desafio,
utilizando a concentrao de 5% de sais biliares, durante 24 horas, apontaram
resistncia superior a 60% frente ao desafio (VIEIRA et al., 2008), resultados que se
assemelham aos obtidos com as variedades de E. faecium, isoladas de P. escalare,
sendo a variedade Probc4, mais resistente ao desafio.
A queda no percentual de crescimento das bactrias probiticas frente ao dos
sais biliares ocorre pela mortalidade celular, consequente da lise na camada
fosfolipdica do micro-organismo, porm alguns indivduos reduzem o efeito
emulsificante da bile, hidrolisando os sais biliares, esta ao pode variar entre as
espcies probiticas (PENNACCHIA et al., 2004), deste modo apontando a importncia
na resistncia das bactrias cido lcteas isoladas de P. escalare, e maior credibilidade
destas poderem colonizar o intestino do hospedeiro e agirem na funo probitica.
Capacidade de tolerncia ao estresse estomacal em ensaios in vitro utilizando E.
faecium e L. helveticusI, foi relatado por Redondo (2008), que obteve maior resistncia
ao estresse estomacal, cepa probitica E. faecium, apontando para resultados
reduzidos na perca da densidade tica, durante curtos perodos de desafio, colaborando
com os dados obtidos no presente estudo. Assim como Lund et al. (2002) e Rossi et al.
(1999) determinando a resistncia dos probiticos Enterococcus faecium, Lactobacillus
helveticus, Lactobacillus delbrueckii e Streptococcus thermophillus, frente aos desafio a

sais biliares in vitro, obtiveram menor perda de crescimento microbiolgico as cepas de

Enterococcus faecium e Lactobacillus helveticus.
Capacidade de hidrolise da espcie Enterococcus faecium aos sais biliares
tambm foram analisadas nos ensaios in vitro e in vivo na reduo de 18% do colesterol
sanguneo de coelhos e camundongos hipercolesterolmicos, tratados com este
probitico durante 30 dias experimentais (ROSSI et al., 1994; TARANTO et al., 1996;
ROSSI et al., 1999; REDONDO, 2008), trabalhos que contribuem ao pr-requisito
probitico do E. faecium isolados do trato gastrointestinal de Pterophyllum scalare.
Em estudos avaliando a resistncia de Saccharomyces cerevisiae sobre distintas
concentraes de sais biliares Martins et al. (2005), obteve valores positivos de
crescimento bacteriano frente a este desafio, assim utilizando Lactobacillus fermentum a
uma concentrao de 0,3% (p/v) de sais biliares Yu e Tsen (1993) obtiveram resistncia
microbiolgica de 50% frente aos sais biliares. Resultados que contribuem aos dados
obtidos neste trabalho, apontando um bom crescimento microbiolgico das cepas
isoladas de Pterophyllum scalare, suportando a toxidade dos sais biliares em elevada
concentrao, durante 24 horas de incubao, atendendo como requisito parcial as
premissas para uso probitico.

Inibio de patgenos
A atividade antimicrobiolgica conceituada como uma zona de inibio do
crescimento formado no entorno de discos embebidos em cultura bacteriana candidatas
a probitico (VASEEHARAN & RAMASAMY, 2003). Na microbiota endgena das
espcies com potencial aqucola, as bactrias cidas lcticas so encontradas em
reduzido volume no aparelho gastrointestinal do animal. Entretanto a sua suplementao
na dieta das espcies produzidas so fundamentais para maior predominncia no
intestino do hospedeiro, chegando a ocupar 70% de sua fauna microbiolgica (RINGO
& GATESOUPE, 1998; GILDBERG et al., 2007; SOUZA, 2007).
O perfil antagnico das cepas com potencial probitico fundamental na
preveno de infeces e/ou surtos bacteriolgicos no sistema de produo,
caracterizado por inibir o crescimento patognico no trato gastrointestinal do animal em
produo (ABRIOUEL et al., 2011).
O seu potencial antagnico diz respeito a sua capacidade em produzir e expelir
compostos como: cidos orgnicos, perxido de hidrognio e bacteriocinas, sendo
fundamentais para inibir o crescimento dos agentes patognicos, que possam intervir no

xito da produo aqucola, comprometendo a viabilidade econmica da atividade.

Algumas pesquisas consideram o uso suplementar de probiticos na eficincia de
sanitizao,

sade

preveno

infecciosas

em

empreendimentos

agrrios

(GATESOUPE, 2008; PRIDMORE et al., 2008).

As bactrias com potencial probitico isoladas do acar bandeira, apresentaram
halos de inibio frente a todos os patgenos desafiados, com dimetro superior a
11mm denominado um bom halo inibitrio, atribudo de acordo com Santos (1984).
Com significativa diferena estatstica (p<0,05), com separao das mdias, para os
tratamentos desafiados com Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeroginosa,
Micrococcus luteus e Aeromonas hydrophila (Tab. 2).

Tabela 2. Avaliao in vitro das bactrias cido lcticas isoladas do trato digestrio do
ornamental Pterophyllum scalare submetidos ao desafio antagnico. Halo de inibio
(mm) frente Staphylococcus aureus (StA), Pseudomonas aeroginosa (PA),
Escherichia coli (EC), Enterococcus durans (ED), Micrococcus luteus (ML) e
Aeromonas hydrophila (AH).
Cepas
Probc1
Probc2
Probc3
Probc4
Probc5
F
CV(%)

StA
15,47
1,07A
14,07
0,70A
11,05
0,55B
14,70
1,41A
16,87
2,09A
**
8,96

PA
14,12
0,80AB
15,75
0,79A
13,90
0,82B
14,37
0,89AB
15,42
0,79AB
*
5,61

EC
12,85
0,70A
13,15
0,41A
12,57
1,05A
12,70
1,10A
13,20
1,16A
ns
7,24

ED
12,17
1,18A
13,20
1,69A
14,6
1,13A
11,92
0,62A
14,05
1,43A
ns
9,61

ML
15,72
1,69BC
12,27
0,74C
16,55
1,58B
15,92
0,99BC
25,45
2,85A
**
10,73

AH
11,90
1,48B
13,57
0,37A
12,97
0,22AB
14,00
0,31A
13,62
0,35A
**
5,48

Letras distintas indicam diferena significativa entre os tratamentos na coluna pelo teste
de Tukey (p<0,05).
A inibio das cepas isoladas de P. escalare, podem estar atribudas atividade
dos compostos produzidos pelas variedades de Enterococcus faecium, como as
bacteriocinas, que apresentam ao inibitria contra os micro-organismos gram
positivos (GILLOR et al., 2008), em contra partida essa substncia no apontam xito
na inibio de patgenos gram negativos (VSQUEZ et al., 2005). Para ao inibitria
das bactrias probiticas das variedades de Enterococcus faecium, isoladas do acara
bandeira, contra microbiota gram negativa, pode estar associada produo de

compostos como o perxido de hidrognio, cido orgnico e actico, produzido pelas

bactrias cido lcticas (VAZQUEZ et al., 2005; SUGITA et al., 2007).
O perxido de hidrognio atua como inibidor ao crescimento de microorganismos patognicos com fentipos gram negativos, de acordo com Swain et al.
(2009), que constatou a produo deste composto em Lactobacillus jonhsonnie frente
inibio contra Salmonella sp. Assim como o seu efeito benfico de bactrias
probiticas na produo de cidos orgnicos das categorias lcticas e propinico,
contribuindo inibio de organismos patognicos no sistema de produo.
Teste in vitro que simula a atuao dos micro-organismos probiticos, sendo
alm da produo de compostos antimicrobianos podem atuar como barreira fsica na
mucosa entrica intestinal do animal ao preencherem os stios de ligao, reduzem desta
forma a rea de interao das bactrias patognicas, excluindo-as por espao no
hospedeiro (ROOS et al., 1993; SIWICKI et al., 1998; PANIGRAHI et al., 2005; DAZROSALES et al., 2006; SALINAS et al., 2006). Na avaliao probitica in vitro
Howard et al. (2000) averiguou a produo de biosurfactantes, composto biolgico
capaz de inibir a adeso de Enterococcus durans no hospedeiro. Fator que tambm pode
estar relacionado, ao sensor quorum microbiolgico, a partir do arranjo bacteriano,
sendo crucial ao comportamento populacional dos micro-organismos, na formao de
elevadas concentraes de sinais qumicos, que quando detectados reprimem e/ou
ativam algumas expresses genicas especficas, que impedem o crescimento de colnias
patognicas (BOYER e WISNIEWSKI-DY, 2009).
Ao realizarem o teste de antagonismo com probitico E. faecium, frente ao
patgeno Escherichia coli, Jin et al. (2000), constataram que a bactria cido lctica
inibi o crescimento deste patgeno continental, relevante resultado, que se assemelha a
capacidade probitica de E. faecium das cinco variedades de cepas isoladas de
Pterophyllum scalare, sendo todas condizentes para o bom halo inibitrio, de acordo
com Santos (1984), frente a diversos agentes patognicos, tanto para organismos gram
positivos, quanto gram negativos.
Vieira et al. (2008) utilizando cepas de L. plantarum, isolados de camares
marinhos (Litopnaeus vannamei), obtiveram elevados halos inibitrios de crescimento,
desafiados em meio semeado com bactrias patognicas gram negativas e positivas:
Vibrio harveyi V. alginolyticus, V. anguillarum, Enterococcus durans, Micrococcus
luteus, Escherichia coli, Pseudomonas aeroginosa, Aeromonas hydrophila e Yerseenia
enterocolitica , variando entre 18,22 5,04 e 17,33 4,33 mm de dimetro de inibio.

Estes elevados halos inibitrios podem estar atribudos ao meio utilizado, agar Mueller
Hinton, que no propicia condies de crescimento para bactrias patognicas ou
probiticas. J para o trabalho supra citado, realizando o teste em meio agar Tryptone
Soya, favorvel ao crescimento patognico, apontaram inibio das cepas probiticas
(Tab. 2), cujas atendem a ao probitica frente a organismos patognicos.
Em testes in vitro comprovam a resistncia de bactrias probiticas Lactococcus
lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus frementum em inibir os patgenos
Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Yersinia ruckei e Vibrio anguillarum,
relacionada produo de substncias antimicrobianas e competio por nutrientes
(BALCAZAR, 2008).
Em testes antagnicos in vitro, de bactrias probiticas isoladas de juvenis de
robalo, apontaram satisfatrio crescimento frente aos patgenos V. harveyi e V.
alginolyticus, realizando um dimetro inibitrio, as cepas Lactococcus, contribuindo
sua industrializao em larga escala (SOUZA et al., 2010).
Para testes antagnicos in vitro Lactobacillus acidophilus desafiados frente
Escherichia coli mensuraram halos de inibio forte (>15cm) com 40 horas de
incubao (CHAVES, 1999), j para Bach et al. (2003) utilizando Saccharomyces
cerevisiae obtiveram uma ampla faixa de inibio contra E. coli. Beatty e Jensen (2002)
e Weid (2003) obtiveram satisfatrios resultados na atividade antagonista das cepas do
gnero Paenibacillus frente a uma ampla faixa de micro-organismos causadores de
doenas em animais de elevado valor monetrio. Resultados estes que reforam aos
obtidos neste trabalho, que indicaram halos de inibio moderados frente a uma
considervel diversidade patognica, apontando para todas as cepas desafiadas, capazes
de inibir o crescimento bacteriano patognico continental.
Resultados que tambm corroboram com o trabalho supracitado, na inibio
patognica contra Pseudomonas sp. e M. lutueus in vitro, relatadas utilizando
probiticos Bacillus pumilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus sp. e Bacilus sp,
isolados de salmo, tilpia e camaro, respectivamente (GULLIAN et al., 2004; ALY et
al., 2008; BALCZAR et al., 2008; EH-RHMAN et al., 2009).
Algumas variedades de micro-organismo probiticos contribuem na atividade
produtora enzimtica amilolticas que auxiliam na eficcia digestiva e aproveitamento
dos nutrientes disponveis na rao, intervindo no melhor desenvolvimento do animal e
melhores taxas de converso alimentar (GHADBAN, 2002; BAIRAGI et al., 2004).

A pesar da eficcia das cepas apontarem potencial probitico nos ensaios in

vitro, diversos fatores podem influenciar seu xito, como a via de administrao,
dosagem e tempo de suplementao. Em testes in vivo suplementadas com cepas
probitica Bacillus subtilis, apontaram significativa contribuio no aumento da
produo de clulas relacionada resposta imunolgica do peixe Labeo rohita
produzido (KUMAR et al., 2008).
FARIAS (2012) utilizando bactria probitica da espcie Bacillus subtilis
incorporado na dieta de pacus apontaram para resultados significativos na resistncia
aps desafio com Aeromonas hydrophyla, comparadas dieta controle. Assim
utilizando Bacillus subtilis, em desafios sanitrios na produo de truta arco-ris
(Oncorhynchus mykis), comprovaram o uso probitico, como promotor da resistncia
em peixes contra micro-organismos patognicos (NEWAJ-FYZUL et al., 2007;
WALKER, 2008; SHARIFUZZAMAN & AUSTIN, 2009; SON et al., 2009).
Assim como PICCHIETTI et al. (2007), que obteve maior produo de clulas T
e granulcitos no tecido intestinal do robalo suplementado com Lactobacillus
delbrueckii. Para truta arco-ris suplementada com dieta contendo Carnobacterium
divergens e Carnobacterium maltaromaticum, que indicaram aumento na atividade da
lisozima na mucosa intestinal do hospedeiro, dados estes que contribuem a atividade
fagocitria das bactrias cido lcticas na mucosa intestinal dos animais (BALCAZAR
et al., 2008; KIM & AUSTIN, 2006). Sendo de grande importncia a capacidade
inibitria do probitico, frente ao crescimento bacteriano patognico in vitro, para
atender as premissas de preveno e controle de agentes patognicos quando
administradas em escalas experimental e comercial in vivo.

Cintica de crescimento
Teste fundamental para averiguar o nmero total de colnias probiticas viveis,
para eventual viabilidade de produo em escala comercial. As taxas mnimas para
efeito teraputico dos probiticos dependem de cada espcie, variando a sua dosagem
de atuao entre 105 e 108 Unidades Formadoras de Colnia (UFC) para cada mililitro
(ml) ou grama (g) aplicada suplementao alimentar animal para a ingesto regular do
micro-organismo, sendo de extrema importncia mantena da composio
microbiolgica intestinal do animal em produo, que garanta o efeito probitico na
cadeia produtiva aqucola (GOMES & MALCATA, 1999; BARRETO et al., 2003;

MADIGAN et al., 2004; SANZ, 2007; VASILJEVIC & SHAH, 2008; SWAIN et al.,
2009).
Todas as cepas com eventual potencialidade probitica demonstraram uma
adjetivao faixa na contagem de unidade formadora de colnias viveis, velocidade
mxima de crescimento e tempo de duplicao, apontando para diferena significativa
s trs variveis. Com destaque para os micro-organismos Probc1, Probc2, Probc3 e
Probc4, que apontaram maiores resultados para a contagem final de bactrias,
velocidade mxima de crescimento e menor tempo de duplicao, colaborando para a
viabilidade de sua produo para perspectiva escala comercial (Tab. 4).

Tabela 4. Cintica de crescimento in vitro das bactrias cido lcticas isoladas do trato
digestrio do ornamental Pterophyllum scalare com contagem final de bactrias (CBF),
velocidade mxima de crescimento (VM) e tempo de duplicao (TD).
CEPA
Probc1
Probc2
Probc3
Probc4
Probc5
F
CV(%)

CFB (UFC/mL)
9,87 0,13B
19,24 0,21A
19,28 0,05A
18,86 0,20A
11,42 0,21B
**
7,06

VM(h-1)
0,11 0,00A
0,07 0,00B
0,08 0,00B
0,08 0,01B
0,09 0,00AB
**
11,59

TD(h)
6,06 0,38B
8,68 0,67A
7,90 0,87AB
8,11 1,71AB
7,17 0,26AB
*
12,35

Letras distintas indicam diferena significativa entre os tratamentos na coluna pelo teste
de Tukey (p<0,05).
A propriedade funcional para o uso do probitico ANVISA (2014) aponta que a
quantidade mnima ingerida vivel a suplementao probitica, deve seguir a escala de
108 ml a 109 ml Unidades Formadoras de Colnias (UFC) como dosagem em alimentos
de origem animal e humano. Dentre os micro-organismos que apontam seu efeito
probitico, na produo animal esto catalogados os: Lactobacillus acidophilus,
Lactobacilus

casei

shirota,

Lactobacillus

paracasei,

Lactococcus

lactis,

Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Enterococcus faecium.

REDONDO (2008), ao realizar testes in vitro para a eficcia de dois probiticos,
observou maior unidade formadora de colnias s cepas de Enterococcus faecium,
quando comparadas ao Lactobacillus helveticus em camundongos, resultados que
colaboram a potencialidade da cepa E. faecium, isoladas do trato intestinal do acara
bandeira, que apresentaram crescimento a diluies de 10-8 UFC/ml, atendendo as

premissas ANVISA (2008), no uso de raes funcionais probitica. SOUZA et al.

(2008) selecionando bactrias com potencial probitico in vitro alcanaram crescimento
bacteriano de 2,15 0,25x107 e 3,32 0,75x104 UFC ml-1 de inculo, para cocus e
bacilos, respectivamente, isolados da produo de Robalo-peva (Centropomus
parallelus Poey, 1860), contribuindo para o presente estudo, que apontou para as
variedades de cocos gram positivo, crescimento bacteriano a elevadas diluies, com
acentuado resultado estatstico as variaes de Probc2, Probc3 e Probc4 (Tab. 3) .
Utilizando bactrias probiticas do gnero Paenibacillus Lorentz (2005), obteve
resultados no crescimento microbiolgico aps 24 horas de incubao, s espcies P.
peoriae, P. chibensis e P. validus. Apontando para a fase estacionria de cintica
microbiolgica de suma importncia, sendo neste momento iniciada/intensificada
produo de compostos antimicrobianos. Resultados da cintica de crescimento
microbiolgico que contribuem aos obtidos com as cepas de Enterococcus faecium,
isoladas do acara bandeira, sendo a maior velocidade mxima de crescimento e menor
tempo de duplicao das cepas, fatores que contriburam a ao inibitria do probitico
frente aos patgenos, pela maior produo de compostos antimicrobianos durante a fase
estacionria.
Na avaliao in vitro da velocidade de crescimento, tempo de duplicao e
contagem final de bactrias, de grande relevncia para a eficcia dos processos
produtivos comerciais do probitico, indicando a sua capacidade de proliferao em
competir por espao e nutrientes num menor espao de tempo (VINE et al., 2004).
Contribuindo aos dados obtidos neste trabalho, classificando os micro-organismos
isolados do ornamental P. scalare, com grande potencialidade para uso probitico.

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CAPTULO III

9 CONCLUSO
Os resultados obtidos neste trabalho apontam que as bactrias cido lcticas
cumprem a premissa de uso probitico animal, sendo das cepas isoladas do aparelho
digestrio de Pterophyllum scalare, a espcie Enterococcus faecium. Sendo a cepa
Probc4, de maior potencial probitico.

9.1 CONSIDERAES FINAIS

Com isso, torna-se necessrio futuros estudos in vivo que comprovem a sua
eficcia na melhoria dos parmetros zootcnicos da espcie e condies sanitrias da
cadeia produtiva do animal, para melhor elucidao desta tecnologia alimentar na
fisiologia e imunologia do ornamental.