ANALISIS FITOQUMICO Y DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD

ANTIOXIDANTE DEL EXTRACTO ETANLICO DE LAS HOJAS DE LA

ESPECIE Piper imperiale (Piperaceae)

ANGELA IVONNE JARA BELTRN

UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES U.D.C.A

FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGA
QUMICA
BOGOT D.C.
2013

ANALISIS FITOQUMICO Y DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD

ANTIOXIDANTE DEL EXTRACTO ETANLICO DE LAS HOJAS DE LA
ESPECIE Piper imperiale (Piperaceae)

ANGELA IVONNE JARA BELTRN

Trabajo de grado para optar para el ttulo de qumico

Director
Diego Ricardo Muoz

UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES U.D.C.A

FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGA
QUMICA
BOGOT D.C.
2013

A mis padres Libardo y Rosa,

mis hermanos Edwin, Cesar y Soraya
y sobrinos Samuel y Felipe.

AGRADECIMIENTO
A mis padres Don Libardo y Doa Rosy, a mis hermanos, por todo su apoyo,
compresin, amor y cario, durante toda mi poca de estudios y los momentos
duros.
A mi amiga Jenny Lizarazo por su compaa durante toda la carrera, por su apoyo,
su compresin y por su ayuda para resolver mis dudas.
A mi director de tesis el Profesor Diego Ricardo Muoz y el Profesor Luis Eduardo
Diaz, por ser pacientes, por haber confiado en m y por haberme tenido en cuenta
para este proyecto.
A la Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales, por permitirme hacer parte
del grupo de investigacin y su apoyo econmico para realizar la parte
experimental de mi proyecto de grado.

CONTENIDO
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................ 7
LISTA DE DIAGRAMAS .......................................................................................... 8
Abreviaturas ............................................................................................................. 9
Introduccin ........................................................................................................... 11
1 MARCO TEORICO ............................................................................................ 12
1.1 Generalidades de la familia Piperaceae ....................................................... 12
1.2 Descripcin botnica y taxonoma del genero Piper ..................................... 12
1.3 Distribucin geogrfica del genero Piper ...................................................... 13
1.4 Usos etnobotnicos del genero Piper ........................................................... 14
1.5 Estudios fitoqumicos del genero Piper......................................................... 15
1.5.1 Amidas ................................................................................................... 16
1.5.2 Flavonoides ............................................................................................ 17
1.5.3 Propilfenoles ........................................................................................... 19
1.5.4 Pironas ................................................................................................... 19
1.6.5 Terpenos ................................................................................................ 20
1.5.6 Lignanos y neolignanos .......................................................................... 21
1.6 Actividad biolgica genero Piper .................................................................. 23
1.7 Actividad antioxidante del genero Piper........................................................ 25
1.8 Piper Imperiale.............................................................................................. 26
1.8.1 Morfologa Piper imperiale...................................................................... 26
1.8.2 Clasificacin taxonmica Piper imperiale ............................................... 27
2. Parte experimental ............................................................................................. 28
2.1 Procedimientos generales ............................................................................ 28
2.2 Recoleccin del material vegetal .................................................................. 28
2.3 Preparacin del extracto ............................................................................... 28
2.4 Pruebas fitoqumicas preliminares ................................................................ 29
2.4.1 Anlisis preliminar de alcaloides (Residuo I) .......................................... 30
2.4.3 Anlisis preliminar de cumarinas y lactonas terpenicas ......................... 34
2.5 Fraccionamiento de extracto vegetal ............................................................ 35
2.6 Actividad antioxidante ................................................................................... 36
3. DISCUSIN Y RESULTADOS .......................................................................... 38
3.1 Pruebas fitoqumicas preliminares ................................................................ 38
3.2 Actividad antioxidante ................................................................................... 39
3.3 Elucidacin estructural del compuesto 1. ..................................................... 43
Conclusiones ......................................................................................................... 57
Recomendaciones ................................................................................................. 58

LISTA DE TABLAS
Tabla 1: Clasificacin taxonmica genero Piper.................................................... 13
Tabla 2: Usos etnobotnicos de especies del genero Piper.................................. 15
Tabla 3: Taxonoma especie Piper imperiale[36] .................................................. 27
Tabla 4: Pesos hojas seco y molidas Piper imperiale y su extracto etanlico. ...... 29
Tabla 5: Concentracin de diluciones patrn (Trolox) y extracto etanlico de las
hojas de la especie Piper imperiale ....................................................................... 37
Tabla 6: Resultados pruebas fitoqumicas preliminares ........................................ 38
Tabla 7: Resultados obtenidos de absorbancia DPPH frente al Trolox a diferentes
concentraciones ..................................................................................................... 40
Tabla 8: Resultados obtenidos de absorbancia y DPPH frente al extracto etanolico
de las hojas de la especie P. imperiale .................................................................. 40
Tabla 9: Resultados obtenidos de Porcentaje inhibicion de DPPH frente al Trolox
a diferentes concentraciones ................................................................................. 41
Tabla 10: Resultados obtenidos de Porcentaje de inhibicion de DPPH frente al
extracto etanolico de la hojas de la especie Piper imperiale .................................. 41
Tabla 11: Asignacin de seales 1H y 13C para el compuesto 1 aislado del extracto
etanlico de las hojas de la especie Piper imperiale.............................................. 54
Tabla 12: Comparacion compuesto aislado Hojas Piper imperiale con estructura
sintetizada del ester etlico del cido dihidroferlico .............................................. 55

LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Caractersticas morfolgicas de las partes areas del genero Piper ..... 13
Figura 2: Distribucin geogrfica del genero Piper a nivel mundial[14] ............... 14
Figura 3: Distribucin geografa del genero Piper en Colombia[15] ...................... 14
Figura 4: Piper Imperiale[35] ................................................................................. 27
Figura 5: Estructura del DPPH en su forma radical y no radical ........................... 36
Figura 6: Estructura del agente estndar trolox .................................................... 37
Figura 7: Efecto de degradacin de color del DPPH con disoluciones extracto
etanlico de las hojas especie Piper imperiale ...................................................... 39
Figura 8: % de inhibicin por metodologa DPPH para el patrn Trolox y el
extracto etanlico de las hojas de la especie Piper imperiale ................................ 42
Figura 9: CCD en revelado UV a 365nm del compuesto 1 aislado del extracto
etanlico hojas especie Piper imperiale ................................................................. 43
Figura 10: Espectro RMN 1H (CDCl3, 300MHz) del compuesto 1 aislado del
extracto etanlico de la hojas especie Piper imperiale .......................................... 44
Figura 11: Ampliacin del espectro 1H RMN entre 6.70 a 6.50 ppm para el
compuesto 1 .......................................................................................................... 45
Figura 12: Ampliacin del espectro RMN 1H entre 5.60 y 3.80ppm para el
compuesto 1. ......................................................................................................... 46
Figura 13: Ampliacin del espectro RMN 1H entre 3.0 a 1.0 ppm, para el
compuesto 1. ......................................................................................................... 46
Figura 14: Espectro RMN 13C (CDCl3 75 MHz,) del compuesto 1. ........................ 47
Figura 15: Espectro COSY 1H-1H del Compuesto 1.............................................. 48
Figura 16: Ampliacin espectro HSQC RMN 1H ( 2.0 a 7.0ppm y RMN 13C 25 a
125ppm) del compuesto 1. .................................................................................... 49
Figura 17: Ismeros posibles de la estructura del compuesto 1 aislado del extracto
etanlico de las hojas de la especie Piper imperiale.............................................. 50
Figura 18: Ampliacin del espectro HMBC. Ubicacin cadena aliftica en anillo
aromtico. .............................................................................................................. 51
Figura 19: Ampliacin del espectro HMBC. Ubicacin grupo hidroxilo y metoxilo
en el anillo aromtico. ............................................................................................ 52
Figura 20: Ampliacin espectro HMBC. Ubicacin grupo carbonilo y grupo
metileno unido a un tomo electronegativo oxigeno en cadena aliftica ............... 53
Figura 21: Estructura del compuesto 1 con sus respectivas correlaciones
identificadas por el espectro HMBC 1H - 13C ......................................................... 53
Figura 22: Estructura elucidada del extracto etanlico de la hojas de la especie
Piper imperiale Etil Dihidroferulato. ........................................................................ 54
Figura 23: Estructura del pentadecil ferulato derivado del acido ferlico aislado de
la especie Salicornea herbacea ............................................................................. 56
Figura 24: Derivados del acido ferulico aislados de Plumeria bicolor ................... 56

LISTA DE DIAGRAMAS
Diagrama 1: Tratamiento del material vegetal para realizar pruebas fitoqumicas
preliminares ........................................................................................................... 29
Diagrama 2: Prueba para el reconocimiento de alcaloides. .................................. 31
Diagrama 3: Anlisis de esteroides y/o triterpenoides, nafto y/o antroaquinonas,
taninos y saponinas ............................................................................................... 32
Diagrama 4: Anlisis de cumarinas y lactonas terpenicas .................................... 34
Diagrama 5: Fraccionamiento de Columna del extracto etanlico de las hojas de
la especie Piper imperiale ...................................................................................... 36

Abreviaturas

CCD
L
AcOEt
CC
CDCl3
CH2Cl2

Cromatografa de Capa Delgada

Microlitros
Acetato de Etilo
Cromatografa de Columna
Cloroformo Deuterado
Diclorometano

CHCl3
d
DPPH
EdP
EtOH
HCl
Hz
J
M
MeOH
Mg
MHz
mL
NaOH
Nm
Q
Ppm
RMN
RMN 13C
RMN 1H
S
T
UV

Cloroformo
Doblete
1,1-difenil-2-picril-hidrazil
ter de Petrleo
Etanol
Acido Clorhdrico
Hertz
Constante de acoplamiento
Multiplete
Metanol
Miligramos
MegaHertz
Mililitros
Hidrxido de Sodio
Nanmetros
Cuarteto
Parte por milln
Espectroscopia Resonancia Magntica Nuclear
Resonancia Magntica Nuclear de Carbono 13
Resonancia Magntica Nuclear de Hidrogeno
Singlete
Triplete
Ultravioleta
Desplazamientos qumicos (RMN)

Resumen
A partir del extracto etanlico de las hojas de la especie vegetal Piper imperiale se
realizo la determinacin de la actividad antioxidante por el mtodo de radical libre
DPPH y adicionalmente, a travs del fraccionamiento por CCD y CC se logro el
aislamiento y la identificacin del ester etlico del cido dihidroferlico (-(4hydroxy-3-methoxy-phenyl)-propionato de etilo.
A una parte del extracto etanlico de las hojas de la especie Piper imperiale, se le
realizaron pruebas fitoqumicas preliminares obteniendo resultados positivos para
alcaloides, esteroides, flavonoides, taninos y cumarinas.
Con la actividad antioxidante por la metodologa de radical libre DPPH sobre el
extracto etanlico de las hojas de la especie Piper imperiale se observ que posee
un porcentaje de inhibicin frente a radicales libres como el DPPH de 46,9% a una
concentracin de 500ppm.
El compuesto 1 se aisl a travs del fraccionamiento por cromatografa en
columna del extracto etanlico de la especie Piper imperiale, el cual pudo ser
elucidado por tcnicas espectroscpicas de RMN 1H y 13C de 1 y 2 dimensiones,
obteniendo un metabolito derivado del acido dihiferlico.

10

Introduccin
Colombia se caracteriza por su biodiversidad vegetal y el uso de una gran
variedad de plantas por las comunidades indgenas con fines medicinales y
sociales, plantas que al ser estudiadas por el hombre podran ser una fuente de
nuevos compuestos qumicos que aporten soluciones a varios inconvenientes
medicinales.
Los cambios climticos, la deforestacin y la gran prdida de vegetacin por la
falta de conciencia del hombre podran impedir el estudio de muchos gneros y
especies vegetales y con ellos, los compuestos que estos contengan y les brinden
propiedades medicinales, por esto es necesario realizar pronto un estudio de estas
especies vegetales que han sido poco exploradas por el hombre.
Al norte de los Andes colombianos se puede encontrar la mayor diversidad de
plantas del neotrpico, entre ellas la familia Piperaceae la cual posee una variedad
de especies que pueden ser estudiadas y analizadas[1], obteniendo resultados
que podran ser la solucin para problemas de carcter medicinal. Dentro de la
familia Piperaceae se destacan las especies del genero Piper las cuales en su
mayora son utilizados como condimentos porque sus frutos son aromticos y
picantes, pero tambin se caracterizan por sus propiedades insecticidas,
antibacterianas y anti-inflamatorias como por ejemplo los extractos de acetato de
etilo y hexano de la especie Piper porphyrophyllum que presenta una elevada
actividad frente a bacterias como Staphylococcus aereus y un alta actividad
antiinflamatoria[2, 3].
Pocos estudios sobre la especie Piper imperieale han mostrado que posee cierta
actividad antioxidante frente a metodologas como el DPPH y FRAP, adems se
han logrado identificar una cierta cantidad de compuestos naturales como
polifenoles entre ellos el acido ferlico[4], estos compuestos se caracterizan por
ser antioxidantes y se han convertido en un tema importante debido que ayudan a
prevenir y retrasar la aparicin de enfermedades como el cncer, cirrosis hepatitis
y diabetes causadas por la presencia de radicales libres[5], por esta razn era
necesario realizar un estudio sobre la especie Piper imperiale, sus propiedades
antioxidantes y su composicin, contribuyendo al conocimiento qumico y biolgico
de la especie, y ayudando en avances mdicos frente a enfermedades provocadas
por la presencia de radicales libres.

11

1 MARCO TEORICO
1.1 Generalidades de la familia Piperaceae
La familia Piperaceae es una de las ms antiguas e importantes familias de
plantas que ha proporcionado una gran variedad de medicamentos y fuentes de
alimentos para las civilizaciones del pasado y presente, su origen se dio en el
sudoeste de la India con el uso de su especie ms conocida y cultivada la Piper
nigrum (pimienta) gracias a su utilidad como condimento en las comidas[6, 7]. En
la medicina tradicional latinoamericana algunas especies de la familia han
brindado algunos beneficios como por ejemplo las hojas de P. hispidum aplicada
en forma de ungento para el tratamiento de ulceras cutneas y la P. aduncum
usada para el control de inflamaciones, otra propiedad de las especies de la
familia es su actividad insecticida gracias a que estn constituidas por compuestos
como piperamidas[8, 9].
La familia est distribuida en lugares tropicales y subtropicales, constituida por 10
a 12 gneros entre los que se incluyen: Piper, Peperomia, Trianaeopiper, Ottonia,
Arctottonia, Macropiper, Manekia, Pothomorphea, Sarcorhachis, Verhuellia y
Zippeli[10]. En Colombia se pueden encontrar el Piper, Peperomia, Pothomorphea,
Sarcorhachis y Trianaeopiper[11] y cerca de 2000 especies.
Las especies de la familia Piperaceae se caracterizan por ser arbustos, pequeos
arboles o lianas, sus hojas son simples, enteras con glndulas con aceites
esenciales y sus flores son muy pequeas bisexuales o unisexuales que forman
racimos o espigas[12].
1.2 Descripcin botnica y taxonoma del genero Piper
El gnero Piper es uno de los ms importantes de la familia Piperaceae, est
constituida por ms de 1000 especies, las cuales se caracterizan por ser hierbas
terrestres o epifitas, arboles pequeos en raras ocasiones bejucos o arbustos, de
sexualidad hermafrodita, polgamos o dioicos. Sus tallos tienen forma de nudos
abultados, sus hojas segregan aceites esenciales gracias a que poseen unas
clulas secretoras, sus flores son pequeas , bracteadas y sus inflorescencias son
en forma de espigas flexibles, poseen un ovario unicelular con un ovulo que se
desarrolla en forma de fruto en baya (Figura 1) [13].

12

Figura 1: Caractersticas morfolgicas de las partes areas del genero

Piper
En la Tabla 1 se muestra la clasificacin taxonmica del genero[10, 13]:
Tabla 1: Clasificacin taxonmica genero Piper
Clasificacin taxonmica
REINO
Plantae
DIVISION
Magnoliophyta (Angiospermas)
CLASE
Magnoliopsida (Dicotiledneas)
SUBCLASE
Magnoliidae
ORDEN
Piperales
FAMILIA
Piperaceae
GENERO
Piper
1.3 Distribucin geogrfica del genero Piper
El gnero Piper se encuentra ampliamente distribuido en regiones tropicales y
subtropicales del mundo, sus lugares de mayor concentracin son los trpicos
americanos con alrededor de 700 spp., y el sur de Asia y Amrica Central con 300
spp. En la regin Andina del territorio Colombiano en los bosque hmedos y
tropicales se han encontrado una gran variedad de especies pertenecientes al
gnero y en los alrededores de la Sierra Nevada de Santa Marta (Figura 2 y 3) [14,
15].

13

Figura 2: Distribucin geogrfica del genero Piper a nivel mundial[14]

Figura 3: Distribucin geografa del genero Piper en Colombia[15]

1.4 Usos etnobotnicos del genero Piper
Las especies del genero Piper han sido de gran utilidad para la vida cotidiana, por
su importancia a nivel econmico, comercial y medicinal, entre ellas podemos
encontrar la P. nigrum donde sus frutos secos son pulverizados para obtener la
pimienta[6]. En Colombia las especies de este gnero se conocen como anises y
son utilizadas para el tratamiento de enfermedades como diarrea, disentera,
dolores de estomago, caries dentales y cicatrizantes. Tribus indgenas como los
motilones en el Norte de Santander y los Embera en el Choco las utilizan como
analgsicos, antiinflamatorios y contra picaduras de serpientes[7].
En la Tabla 2 se encuentran algunos usos etnobotnicos del gnero Piper:

14

Tabla 2: Usos etnobotnicos de especies del genero Piper

FORMA DE
NOMBRE
PARTE
USO
USO
Piper angostifolium

Raz

En decoccin

Piper cubeba

Fruto

Extracto del fruto

en agua

Piper erithroxyloides

Tallos

Masticado

Hojas
Piper guineense

En infusin
Semillas

Hojas

Frescas y
trituradas

Piper marginatum
Raz

Piper methysticum

Raz

Piper sylvaticum

Raz

Piper tuberculatum

Hojas

En decoccin

En infusin

Secas y trituradas

Control
de
dolores
menstruales y hemorragias
internas[16].
Uso
como
diurtico
y
antisptico de las vas
urinarias, empleado para
combatir afecciones como
cistitis y uretritis[17].
La tribu Bari usa los tallos
para prevenir la caries y
como
estimulante,
produciendo
un
efecto
narctico que duerme la
lengua[7].
Se emplean como remedios
para la tos.
Usadas como tratamiento
para
los
dolores
de
estomago[8]
Se emplea como astringente
para detener hemorragias
traumticas
y
como
hemosttico externo[18].
Usada
contra
paludismo[19]

el

Se utiliza para el tratamiento

de trastornos de ansiedad,
estrs y tensin nerviosa[20]
Usada como antdoto contra
la picadura de serpiente[10]
Se utilizan para eliminar los
piojos[9].

1.5 Estudios fitoqumicos del genero Piper

Las especies del genero Piper han mostrado gran potencial frente actividades
antitumorales, antibiticos, antifngicos e insecticidas, razones por las que se han
realizado investigaciones fitoqumicas encontrando que las especies estn
compuestas por metabolitos de tipo flavonoide, amida, propinilfenoles, lignanos,
neolignanos, kavapironas y terpenos[21, 22].
15

1.5.1 Amidas
Las amidas (conocidas en el gnero Piper como piperamidas) son los compuestos
ms caractersticos del genero Piper porque han mostrando resultados de
propiedades insecticidas y fungicidas. Especies como la Piper tuberculatum estn
constituidas por amidas como la N-[10-(13,14-metilenedioxifenil)-7(E),9(Z)pentadienoil]-pirrolidina y la arboreumina las cuales poseen propiedades
antifungicas[23].

CH3

O
H

O
H

CH3

H3C

CH3
NH

H3C

CH3H3C

CH3

NH

OH

OH

Arberoumina

De las hojas de la Piper arboreum se han aislados pirrolidinas que son activas
contra el hongo Cladosporium sphaerospermum[23].
O
O

O
N-[10- (13,14-metilenedioxifenil)-7(E)-pentaenoil]-pirrolidina

O
O

O
N-[10-(13,14-metilenedioxifenil)-pentanoil]-pirrolidina

16

De los extractos en diclorometano de las hojas de Piper elonatum y Piper

glabratum se han logrado aislar cuatro amidas como las nombradas a
continuacin[10]:
R

OH

HO

NH

OCH3
O

NH

R2

R1

1 R1= OCH3 R2=OH

2
R1= OH R2=H
3
R= OCH3
4
R=H

4-metoxi-N-[2-(4-metoxi-5-hidroxi-fenil)-etil]-benzamida
4-hidroxi-N-[2-(4-metoxi-fenil)-etil]-benzamida
N-cis-feruloil-tiramina
N-pcumaroil-tiramina

1.5.2 Flavonoides
Los flavonoides de mayor abundancia en el gnero Piper son las chalconas,
flavanonas y dihidrochalconas. Las chalconas y dihidrochalconas por lo general no
poseen sustituyentes en el anillo B pero se han encontrado excepciones como la
asebogenina y flavokavaina C las cuales han sido aisladas de las especies P.
aduncum y P. methysticum. Las dihidrochalconas presentes en el gnero Piper
han demostrado actividad antiparasitaria frente a especies de Leishmania sp. y
Plasmodium falciparum (parasito causante de la malaria)[7].

17

OH

H3CO

OH

OH

Asebogenina
OH

H3CO

OH

OCH 3

Flavokavaina C
Del extracto etanlico de las partes areas de la especie P. septuplinervium, se
han logrado aislar dos compuesto de tipo flavonoide (uvangoletina y chrysina) que
presentan actividad frente dos hongos fitopatogeneticos como el Fusarium
oxysporum f. sp. dianthi y Botrytis cinerea[24].

HO

OH

Chrysina

HO

OCH3

OH

Uvangoletina

18

Flavononas de gran importancia como la pinocembrina y pinostrobina por estar

relacionadas con la inhibicin de crecimiento y toxicidad contra hongos y la
preservacin de la madera se han aislado de la especie Piper steerni[25].

R1O

OH

R1= H
R1=CH3

Pirocembrina
Pirostrobina

1.5.3 Propilfenoles
Compuestos propenilfenolicos como el hidroxichavicol, eugenol, chavibetol y
chavicol se han encontrado en las hojas de ciertas especies del genero Piper
como por ejemplo la P. betle[22].
R5
R4

CH2

R3

R1

R1=R4=R5=H R2=OH R3=OCH3

R1=R4=R5=H R2=OAc R3=OCH3
R1= R2=R4=R5=H R3=OH
R1= R4=R5=H R2= OCH3 R3=OH
R1= R4=R5=H R2=R3=OH

Chavibetol
Chavibetol acetato
Chavicol
Eugenol
Hidroxichavicol

R2

1.5.4 Pironas
Las pironas tambin conocida como kavalactonas se crea que eran compuestos
encontrados solamente en la especie Piper methysticum, pero en algunos estudios
se han logrado aislar de la especie Piper sanctum[9, 20].

19

OCH3
R4

R1

R3
R2

Kavalactonas
10-Methoxyyagonina
Desmethoxyyagonina
Dihydromethusticina
Hydroxykavaina
Kavaina
Methysticina
Yangonina

R1
OCH3

R2

R3
OCH3

R4

C5 C6
=
=

C7 C8
=
=

=
=
=
=

OCH2O
OH
OCH2O
OCH3

1.6.5 Terpenos
Los aceites esenciales del genero Piper esta constituidos por una gran variedad
de monoterpenos como borneol, alcanfor, cineol, eugenol, cubebol y safrol. En la
especie Piper auritum se han identificado compuestos como nonanal, miristicina y
safrol, siendo este ultimo el de mayor concentracin con alrededor de 90%[26].
H3C

CH3

CH3
O

CH3

H3C

H
H3C

OH

Cineol

Borneol

20

OH
OCH3

O
CH2
CH2

Safrol

Eugenol
CH3

CH2

H3C
HO

H3C

Miristicina

H3C

CH3

Cubebol

1.5.6 Lignanos y neolignanos

De especies como la Piper futodadsura se han aislado neolignanos y lignanos
como kadsurenona, (+)-Galbelgin y (+)-Veraguensin[22, 27]. En otras especies
como la Piper sarmentosum se han aislado lignanos de tipo furofuranico como la
sesamina y fargesina[9].

H3CO

H3C

H3CO
CH2

H3CO
O

Kadsurenona

21

O
O

O
H

H
O

H3CO

Sesamina

Fargesina

H3CO

Tambin se han logrado aislar algunos neolignanos de especies P. clarkii, P.

decurrens como el clarkinol, conocorpan y cuneifolin[22].
H3C
CH3
HO
O

Conocorpan

H3C

H3C

CH3
O
CH2

HO
O
HO

Cuneifolin

O
CH3

22

1.6 Actividad biolgica genero Piper

El gnero Piper se ha caracterizado por poseer algunos compuestos
biolgicamente activos, como por ejemplo el extracto etanlico de la especie Piper
aduncum que ha presentado una actividad antiplasmodial estando constituida por
compuestos como la aduncamida, borneol y pinostrobinol[28].

OCH 3

CH3

HO
O

OH

HO
H3C

NH

CH3

Borneol
Aduncamida

OCH 3

La pipernonaline presente en la especie P. longum ha mostrado una actividad

fungicida moderada frente P. grisea, P. infestans[29].
.
O
O

Pipernolanina

Compuestos aislados de los frutos de la especie P. nigrum han mostrados un gran

actividad larvicida contra C. pipiens pallens, A. aegypti y A. togoi. Los compuestos
aislados son la N-isobutilamida pelitorina, guineensina, pipercide, retrofractamida
A y la piperidina[30].

23

CH3
H3C

NH
CH3
O

N-isobulilamida pellitorina

O
CH3
NH
O

CH3
O

Guineensina
O
CH3
NH
O

CH3
O

Pipercida
O
CH3
NH
CH3

O
O

Retrofractamida A

N
O
O

Piperidina

24

1.7 Actividad antioxidante del genero Piper

Durante los ltimos aos se ha descubierto actividad antioxidante en algunas
especies de plantas gracias a que en su composicin se encuentran compuestos
que poseen una gran actividad antioxidante tales como polifenoles, vitaminas y
flavonoides; compuestos que ayudan a combatir enfermedades provocadas por
reacciones entre radicales libres[31].
Especies del genero Piper han mostrado propiedades antioxidantes frente a
radicales libres; especies como la P. Daniel-gonzalezii ha mostrado resultados
positivos frente a metodologas que evalan la capacidad antioxidante como FRAP
(Ferric Reducing Ability of Plasma)[32].
Las hojas de la especie P. peltatum han mostrado prueba positiva frente a pruebas
fitoqumicas para compuestos fenlicos los cuales se caracterizan por su actividad
antioxidante, la cual se ha comprobado con ensayos de DPPH y FRAP[33].
La partes areas (hojas, flores y madera) de la especie P. imperial estn
constituidas por compuestos fenlicos como el acido glico, la catequina,
epicatequina, acido ferlico, resveratrol y quercetina, adems han mostrado un
elevada actividad antioxidantes en ensayos de ABTS y DPPH[4].

OH

O
H3CO
OH

HO

OH
OH

Acido Galico

HO

cido Ferlico

25

OH
OH

OH
OH

HO

HO

O
OH

OH
OH

OH

Quercetina

OH

Catequina

OH

OH

HO

HO

O
OH

OH
OH

Epicatequina

OH

Resveratrol

1.8 Piper Imperiale

Las partes areas de la especie Piper imperiale han mostrado una elevada
actividad antioxidante y actividad antibacterial frente a bacterias causantes de la
tuberculosis, esto puede ser atribuido al elevado contenido de compuestos como
polifenoles, flavonoides y estilbenos que estn presentes en ellas[4].
1.8.1 Morfologa Piper imperiale
rbol o arbusto de 2 a 6 m de alto, con tallos verdes, algo vellosos o con puntas
blandas gruesos de 2 cm de ancho, de pocas ramas. Hojas alternadas, por lo
general dos a lo largo del tallo, verrugosas de 20 a 60 cm de largo y 15 a 35 cm de
ancho, con forma de corazn, pice acuminado, base asimtrica cordaba con un
lado pegado al peciolo. Sus flores de color verde y en algunas ocasiones moradas,
de espigas colgantes hasta de 28 a 55 cm de largo y 8-10 mm de espesor. Fruto
carnoso de color verde a marrn rojizo de 0,2 cm de ancho [34, 35].
26

Figura 4: Piper Imperiale[35]

1.8.2 Clasificacin taxonmica Piper imperiale

Tabla 3: Taxonoma especie Piper imperiale[36]
REINO
DIVISION
CLASE
ORDEN
FAMILIA
GENERO
ESPECIE

Plantae
Magnoliophyta
Magnoliopsida
Piperales
Piperaceae
Piper
Imperiale

27

2. Parte experimental
2.1 Procedimientos generales
En las cromatografas de capa delgada (CCD) se utilizaron placas de slica gel 60
F254 de 20 x 20 cm con 0.20 mm de espesor de marca Merck. Como fase mvil se
utilizo una variedad de sistemas de solventes como EdP/AcOEt, benceno/AcOEt,
CHCl3/acetona, CH2Cl2/acetona, EdP/acetona, EdP/CHCl3, tolueno/AcOEt. Como
agentes reveladores se utilizo lmpara UV de 254 y 365 nm y cmara de yodo.
En el montaje de cromatografas en columna CC se utilizo como fase estacionaria
slica gel 60 de 0,063 0,2 mm marca Merck y como fase mvil se utilizaron los
sistemas de solventes nombrados anteriormente.
Los espectros RMN 1H y 13C fueron tomados en un equipo Bruker 300MHz
utilizando como disolvente cloroformo deuterado CDCl3.
Las pruebas de actividad antioxidante se realizaron con la metodologa de radical
libre difenilpicrilhidrazilo (DPPH), usando concentraciones de 500, 250, 125, 80,
62,5 y 50ppm del extracto en metanol.
Las pruebas fitoqumicas preliminares se realizaron con base a la metodologa del
profesor Antonio Sanabria del Departamento de Farmacia de la Universidad
Nacional de Colombia.
2.2 Recoleccin del material vegetal
La muestra vegetal fue recolectada en el Santuario de Fauna y Flora Guanenta
Alto Rio Fonce ubicado en la Cordillera Oriental en la Regio Andina entre los
departamento de Boyac y Santander cerca al municipio de Charala en la vereda
de Birolin por el profesor Diego Ricardo Muoz. Para confirmar su clasificacin
una muestra de la especie fue enviada al Herbario Nacional Colombiano del
Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de Colombia.
2.3 Preparacin del extracto
De la especie vegetal se separaron las hojas, madera e inflorescencias. Las hojas
se dejaron secar a la sombra por un periodo de tres semanas para luego ser
moliendas y pesadas, obteniendo 350 g. El material vegetal ya molido se someti
a un proceso de extraccin por maceracin con etanol al 96% a temperatura
ambiente. El extracto obtenido fue concentrado a presin reducida en rotavapor a
40 C obteniendo 28 g.
28

Tabla 4: Pesos hojas seco y molidas Piper imperiale y su extracto

etanlico.
Peso Seco Material
Peso Extracto (g)
Vegetal (g)
350
28
2.4 Pruebas fitoqumicas preliminares
La metodologa utilizada para realizar estas pruebas es la recomendada por el
profesor Antonio Sanabria del Departamento de Farmacia de la Universidad
Nacional de Colombia. El siguiente diagrama muestra la obtencin del extracto
vegetal y la divisin del mismo para realizar las pruebas preliminares[37]:
Diagrama 1: Tratamiento del material vegetal para realizar pruebas
fitoqumicas preliminares

Extracto Etanolico

Dividir en tres volmenes diferentes

Volumen II

Volumen I

Volumen III

Eliminar solvente

Eliminar solvente

Extracto III
Residuo I

Residuo II

Pruebas:
Alcaloides

Pruebas:
Esteroides y/o triterpenoides,
Flavonoides
Nafto y/o antraquinonas
Saponinas
Taninos

Pruebas:
Lactonas terpenicas
Cumarinas
cardiotnicas

29

2.4.1 Anlisis preliminar de alcaloides (Residuo I)

Los alcaloides son reconocidos empleando reactivos de precipitacin en donde
sus reacciones se dan de la siguiente manera[38]:

Los reactivos compuestos por yoduro de potasio y cloruro de mercurio

reaccionan formando un precipitado de color rojo yoduro de mercurio, el
cual es soluble en exceso de iones de yoduro por la formacin de un anin
complejo incoloro.
HgCl2 + 2I- 2Cl- + HgI2
HgI2 + I- [HgI4]2Este complejo reacciona con amoniaco formado el oxiyoduro
mecuriamonico un compuesto de color pardo que en exceso de complejo
[HgI4]2- es soluble generando un intenso color amarillo

Hg
NH 2I
O
Hg

Oxiyoduro mercuriamonico

Por la presencia del nitrgeno en los alcaloides, estos actan de forma

similar con reactivos que contienen bismuto, los alcaloides forman yoduros
dobles insolubles BiI3 BHI, en donde B es la base alcaloidal.

30

Diagrama 2: Prueba para el reconocimiento de alcaloides.

Residuo I
(Anlisis alcaloides)
1. Extraer con 20 mL de HCl 5% a 60C
2. Filtrar en frio

Filtrado

Residuo
(Descartar)

En 4 tubos de ensayo colocar

0,5mL del filtrado obtenido

Tubo 1:
2 gotas Reactivo de
Dragendorff.

Tubo 2:
2 gotas Reactivo de
Mayer

Tubo 3:
2 gotas Reactivo de
Valser

Tubo 4:
2 gotas Reactivo
Reineckato de Amonio

Nota: Formacin de
precipitado prueba
positiva para alcaloides

Nota: Formacin de
precipitado prueba
positiva para alcaloides

Nota: Formacin de
precipitado prueba
positiva para alcaloides

Nota: Formacin de
precipitado prueba
positiva para alcaloides

Preparacin de Reactivos.

Reactivo de Dragendorff: Se disuelven 8g de Bi(NO3)35H2O en 20mL de

HNO3 y 27,2g de KI en 50mL de agua. Se mezclan las dos soluciones y se
dejan reposar por 24 horas, luego la solucin se decanta y se afora con
agua a 100mL.

Reactivo de Mayer: Se disuelven 1,36g de HgCl2 en 60mL de agua y 5g de

KI en 10mL de agua. Se mezclan las dos soluciones y se aforan a 100mL.

Reactivo de Valser: Se disuelven 10g de KI en 100mL de agua, se agrega

un exceso de HgI2, dejar en contacto y filtrar.

Reactivo Reineckato de Amonio: Se prepara una solucin saturada de

reineckato de amonio con 0,3g de clorhidrato de hidroxilamina y se acidula
ligeramentc con HCl (conservar refrigerado).

31

2.4.2 Anlisis preliminar de esteroides y/o triterpenoides, nafto y/o

antroaquinonas, taninos y saponinas (Residuo II)
Diagrama 3: Anlisis de esteroides y/o triterpenoides, nafto y/o antroaquinonas,
taninos y saponinas
Residuo II
(Anlisis de esteroides y/o triterpenoides, nafto y/o antroaquinonas, taninos y saponinas)

1. Extraccin con 20mL de EdP

2. Filtrar

Filtrado

Residuo

Concentrar a 5mL de
volumen

1. Extraccin con 20mL de

EtOH/H2O (1:7)
2. Filtrar
Solucin

Residuo

Solucin B
5mL
Nafto y/o
antroquinonas

Solucin C
10mL
Taninos y saponinas

Esteroides y/o
triterpenoides

Tomar los volmenes

Solucin A
5mL
Flavonoides

2.4.2.1 Anlisis preliminar esteroides y/o triterpenoides

Los 5mL del filtrado se adicionan a un tubo de ensayo que contenga 10mL de
solucin MeOH/H2O (9:1), se agita y se deja en reposo hasta la separacin de 2
capas, se toma la fase superior. La fase obtenida se aplica en una placa de CCD y
se corre primero con una mezcla ciclo hexano/AcOEt (95:5) y luego con una
mezcla de EdP/ter etlico/Acido actico (80:20:1), se procede a marcar todas las
manchas (no se toman en cuenta). Rociar sobre la placa Reactivo de LiebermannBurchard y calentar por 5 a 10 minutos a 110C, si aparecen manchas de color
rojo, azul o verde es prueba positiva para esteroides y/o triterpenoides.
32

2.4.2.2 Anlisis preliminar de flavonoides

Los flavonoides que poseen anillo de gammabenzopirona reaccionan con HCl
concentrado y magnesio dando coloraciones[38]:

O
O

Mg/2HCl

MgCl2

O
OH

Reaccin de shinoda: En un tubo de ensayo con 0,5g de magnesio en

polvo, se adicionan 1mL de Solucin A y unas gotas de HCl hasta final de
desprendimiento de hidrogeno, observar cambio de coloracin a rosada,
roja, violeta o naranja, indicando prueba positiva para flavonoides.

Las leucoantocianidinas forman antiocianinas de color rojo intenso en presencia

de HCl y calentamiento[38].

O Cl

HCl

OH

H2O

H2

OH
OH

Reaccin con acido clorhdrico: En un tubo de ensayo adicionar 1mL de

solucin A y 0,5mL de HCl concentrado, calentar al bao mara por 15
minutos una coloracin roja indica prueba positiva para leucoantocianidinas.

2.4.2.3 Anlisis preliminar de nafto y/o antraquinonas

Para las nafto y/o antraquinonas se da la siguiente reaccin:

Reaccin de Borrtrger-krauss: En un tubo de ensayo se adicionan 5mL de

Solucin B, 1mL de agua oxigenada (20 volmenes), 1mL de H2SO4 50% y
se calienta a bao mara por 15 minutos y se hace una extraccin con 5mL
33

de benceno. A 2mL de benceno utilizado para extraccin se le adiciona

1mL de solucin de NaOH 5% con 2% de NH4OH si la capa alcalina toma
una coloracin rosada-roja indica prueba positiva para nafto y/o
antraquinonas.
2.4.2.4 Anlisis preliminar de taninos y saponinas

Reactivo de gelatina-sal: A 1mL de la solucin C adicionar 1mL de reactivo

de gelatina-sal; si hay precipitado, centrifugar y decantar el sobrenadante,
disolver el precipitado en 2mL de solucin de urea 10M si hay dilucin
aadir 3 gotas de FeCl3 la aparicin de un precipitado verde, azul o negro
indica prueba positiva para taninos.

Prueba de espuma: En un tubo de ensayo adicionar 3mL de solucin C,

tapar y agitar vigorosamente, la formacin de una espuma estable indica
prueba positiva para saponinas.

2.4.3 Anlisis preliminar de cumarinas y lactonas terpenicas

Diagrama 4: Anlisis de cumarinas y lactonas terpenicas
Extracto III
(Anlisis de cumarinas y lactonas terpenicas)
1. Sln acetato de plomo 4% con 0,5% acido actico
(hasta precipitacin de clorofilas)
2. Reposar 15min
3. Filtrar al vacio
Filtrado

Residuo
(Desechar)

1. Concentrar partes del volumen.

2. Extraer con 2 volmenes de CHCl3
3. Se adiciona sulfato de sodio anhidro
4. Filtrar
Filtrado

Residuo
1. Concentrar a 3mL
2. Purificar con columna de 10mm de dimetro con silica gel
como fase estacionaria y un sistema CHCl3/MeOH 9:1 como
fase mvil

Solucin 1

34

2.4.3.1 Reconocimiento de lactonas terpenicas

Aplicar en una placa de cromatografia de capa delgada con un capilar 3 veces la
muestra de la solucin 1 y desarrollar con un sistema CHCl3/Acetona 9:1, revelar
con lmpara UV a 254 y 366nm marcar las manchas, rociar con una solucin
etanlica con 1% de vainillina y 10% de acido fosfrico, llevar a la estufa a 110C
por 10 minutos las manchas reveladas con una variedad de colores indican prueba
positiva para lactonas terpenicas.
2.4.3.2 Reconocimiento de cumarinas
Aplicar en una placa de cromatografa de capa delgada con un capilar 2 veces la
muestra de la solucin 1 y desarrollar con un sistema CHCl3/Acetona 9:1, revelar
con lmpara UV a 254 y 366nm marcar las manchas, realizar reaccin de
hidroxamato frrico con una mezcla de clorhidrato de hidroxilamina al 2% en
etanol y NaOH 2N y calentar por 15 minutos en la estufa, dejar enfriar la placa y
rociar con una mezcla de HCl 2N y FeCl3 al 1% en etanol, la aparicin de manchas
de color naranja indica prueba positiva para cumarinas y lactonas terpenicas.
2.5 Fraccionamiento de extracto vegetal
Del extracto etanolico de las hojas de la especie, se tomaron 13,695 g y se realizo
un fraccionamiento por CC utilizando slica gel como fase estacionaria y un
sistema de solventes EdP/AcOEt 7:3 hasta llegar a una polaridad de 5:5, se
obtuvieron 8 fracciones y una de lavado, de las cuales se reunieron en 5
fracciones gracias a su perfil en CCD y se denominaron como C1F1-C1F5.
Con las fracciones obtenidas se realizaron CCD con varios juegos de solventes
buscando la mejor separacin, escogiendo la fraccion C1F3 con un peso de
460.2mg, la cual se fracciono en CC con una fase estacionaria de slica gel y una
fase mvil CH2Cl2/AcOEt 95:5, se recogieron 53 fracciones que se reunieron en 6
fracciones denominadas como C2F1-C2F8.
De las fracciones anteriores se escogi la fraccin C2F3 con un peso de 168.3mg y
se fracciono con un sistema de solventes CHCl3/AcOEt 95:5 como fase mvil y
slica gel como fase estacionaria, recogiendo un total de 30 fracciones y se
reunieron en 5 fracciones denominadas como C3F1-C3F5. De fraccin C3F3 se
obtuvo el compuesto 1 con un peso de 10.2mg.
En el siguiente diagrama se muestra el fraccionamiento total del extracto de las
hojas de la especie Piper imperiale

35

Diagrama 5: Fraccionamiento de Columna del extracto etanlico de las

hojas de la especie Piper imperiale

2.6 Actividad antioxidante

Para determinar la actividad antioxidante se utilizo el mtodo de barrido de
radicales libres difenilpicrilhidrazilo (DPPH). El DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazil)
se caracteriza por ser un radical estable gracias a la deslocalizacin de su electrn
libre y su color violeta oscuro que posee una banda de absorcin de 520nm
aproximadamente cuando se encuentra disuelto en etanol(Figura 5) [39].

NO 2

O 2N

NO 2

NH

NO 2

Difenilpicrilhidrazil (No radical)

O 2N

NO 2

Difenilpicrilhidrazil (Radical libre)

Figura 5: Estructura del DPPH en su forma radical y no radical

36

Cuando una solucin de DPPH se mezcla con una solucin donadora de protones
como un antioxidante, el radical se reduce perdiendo la intensidad de color y su
absorbancia dndose la siguiente reaccin[39, 40]:
DPPH

DPPH + A

AH

Para la metodologa se preparo una solucin de DPPH al 0,004% diluida en

metanol logrando una absorbancia menor a 1. Como agente estndar se utilizo
trolox (cido (S)-(-)-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxlico) (Figura 6)
para el cual se prepararon diluciones al igual que para el extracto etanlico de las
hojas de la piper imperiale como se muestra en la tabla 5[5]:

CH3
HO
O
H3C

CH3 OH

CH3

Trolox
Figura 6: Estructura del agente estndar trolox

Tabla 5: Concentracin de diluciones patrn (Trolox) y extracto etanlico de

las hojas de la especie Piper imperiale
MUESTRA
Trolox
Hojas piper imperiale

CONCENTRACION (mg/mL)
200
500

100
250

75
175

50
125

20
80

5
62,5

50

La reaccin se realizo directamente en las celdas del espectrofotmetro

adicionando en cada una de ellas 0,1 mL de las muestras a sus diferentes
concentraciones y 3 mL de solucin de DPPH, tambin fue necesaria la
preparacin de un blanco de metanol y DPPH. Luego se dio un tiempo de reaccin
de 30 minutos para realizar la lectura en un espectrofotmetro y obtener los
resultados de absorbancia (la medicin se realizo por triplicado).
37

3. DISCUSIN Y RESULTADOS
3.1 Pruebas fitoqumicas preliminares
Tabla 6: Resultados pruebas fitoqumicas preliminares
Extracto etanlico
METABOLITO
PRUEBA
Hojas Piper imperiale
Alcaloides

Dragendorff

Esteroides, terpenos

Liebermann-Burchard,
Vainillina en H2SO4

Flavonoides

Vapores NH3, FeCl3

Quinonas

Borntrger

Taninos

Gelatina-sal

Lactonas Terpenicas

Vainillina en Acido
fosforico

Saponinas

Cloruro de zinc

Cumarinas

KOH en metanol

Como se observa en la tabla, el extracto etanlico de las hojas de la especie Piper

imperiale est compuesta por metabolitos secundarios como alcaloides,
esteroides, flavonoides, taninos y cumarinas.
Los alcaloides son compuestos con estructuras complejas de propiedades
alcalinas con tomos de nitrgeno en anillos heterocclicos que se encuentran
normalmente en las hojas de especies vegetales [41]. En el extracto etanlico de
las hojas de la especie P. imperiale se obtuvo prueba positiva para alcaloides,
corroborando la presencia de compuestos de este tipo en el gnero Piper, ya que
en especies como la P. arboreum se ha logrado aislar alacaloides
pirrolidinicos[23].
Se comprob la presencia de compuestos de tipo terpenoide y esteroles en el
extracto etanlico de las hojas de la especie P. imperiale con un resultado positivo
en las pruebas fitoqumicas preliminares, estudios anteriores mostraron la
presencia de monoterpenos en el genero Piper (P. auritum)[26].

38

Los flavonoides son compuestos que se caracterizan por poseer un esqueleto de

tipo C6C3C6 y en el gnero Piper se ha encontrado la presencia del tipo chalconas,
flavanonas y dihidrochalconas, las pruebas fitoqumicas para flavonoides fueron
positivas en el extracto etanlico de las hojas de la especie P. imperiale
corroborando la presencia de este tipo de compuestos en el gnero Piper y en la
especie.
Compuestos fenilpropanos como las cumarinas que dentro de su estructura
poseen un esqueleto C6 o C6C3, hacen parte de la composicin de las hojas de la
especie P. imperiale por su resultado positivo frente a la pruebas fitoqumicas
preliminares de Gelatina-Sal y KOH en metanol.
Las pruebas fitoqumicas preliminares ayudaron a determinar qu tipo de
compuesto posee el extracto etanlico de las hojas de la especie P. imperiale,
compuestos que quizs sean los causantes de las caractersticas antioxidantes de
la especie, como por ejemplo la presencia de taninos que se caracterizan por
poseer una actividad antioxidante[42]. Pero tambin hay que tener en cuenta la
presencia de flavonoides y alcaloides que le pueden brindar propiedades
antiparasitarias y antifngicas a la especie.

3.2 Actividad antioxidante

El extracto etanlico de la especie P. imperiale mostro actividad antioxidante con
la metodologa de radical libre difenilpicrilhidrazilo (DPPH), notndose una
decoloracin del radical frente a la diferentes disoluciones preparadas del extracto
(Figura 7) y una disminucin en la absorbancia.

Figura 7: Efecto de degradacin de color del DPPH con disoluciones

extracto etanlico de las hojas especie Piper imperiale

39

En las tablas 7 y 8 se muestran los resultados obtenidos de absorbancia

determinados para las disoluciones del patrn Trolox y el extracto etanlico de las
hojas de la especie Piper imperiale.
Tabla 7: Resultados obtenidos de absorbancia DPPH frente al Trolox a
diferentes concentraciones
TROLOX
[ ] g/mL

ABSORBANCIA

200

0,057

0,059

0,057

100

0,067

0,064

0,063

75

0,132

0,125

0,119

50

0,319

0,327

0,312

20

0,583

0,574

0,573

0,741

0,703

0,721

Tabla 8: Resultados obtenidos de absorbancia y DPPH frente al extracto

etanolico de las hojas de la especie P. imperiale
Extracto etanolico hojas Piper
imperiale
[ ] g/mL

ABSORBANCIA

500

0,416

0,425

0,393

250

0,575

0,574

0,481

175

0,648

0,66

0,57

125

0,687

0,663

0,612

80

0,71

0,725

0,641

62,5

0,724

0,717

0,694

50

0,748

0,743

0,755

El porcentaje de inhibicin se determino con la siguiente frmula:

40

Donde Ao corresponde a la absorbancia del blanco 0,7717 y Ab corresponde a la

absorbancia de la muestra.
En las tablas 9 y 10 se reportan los resultados para el Porcentaje Inhibicion del
DPPH, desviacin estndar y error estndar para el patrn Trolox y el extracto
etanlico de las hojas de la especie Piper imperiale.
Tabla 9: Resultados obtenidos de Porcentaje inhibicion de DPPH frente al
Trolox a diferentes concentraciones
Trolox
% INHIBICION

[]
g/mL

MEDICION 1

MEDICION 2

MEDICION 3

PROMEDIO

DESVIACION

ERROR
ESTANDAR

200

92,61

92,35

92,61

92,53

0,15

0,02

100

91,32

91,71

91,84

91,62

0,27

0,03

75

82,89

83,80

84,58

83,76

0,84

0,09

50

58,66

57,63

59,57

58,62

0,97

0,13

20

24,45

25,62

25,75

25,27

0,71

0,14

3,98

8,90

6,57

6,48

2,46

0,97

Tabla 10: Resultados obtenidos de Porcentaje de inhibicion de DPPH

frente al extracto etanolico de la hojas de la especie Piper imperiale
Extracto etanolico Hojas Piper imperiale
% INHIBICION

[]
g/mL

MEDICION 1

MEDICION 2

MEDICION 3

PROMEDIO

500

46,09

44,93

49,07

250

25,49

25,62

175

16,03

125

10,98

80

DESVIACION

ERROR
ESTANDAR

46,70

2,14

0,31

37,67

29,59

7,00

1,29

14,47

26,14

18,88

6,33

1,46

14,09

20,69

15,25

4,96

1,27

8,00

6,05

16,94

10,33

5,81

1,81

62,5

6,18

7,09

10,07

7,78

2,03

0,73

50

3,07

3,72

2,16

2,98

0,78

0,45

41

En el siguiente grafico se muestras los porcentajes de inhibicin para el patrn

Trolox y el extracto etanlico de las hojas de la especie Piper imperiale.

Figura 8: Porcentaje de inhibicin por metodologa DPPH para el patrn

Trolox y el extracto etanlico de las hojas de la especie Piper imperiale

Como agente estndar se utilizo el Trolox un anlogo de la vitamina E capaz de

reaccionar con varios radicales libres[43], con el que se noto que a una mayor
concentracin de Trolox se logra un mayor porcentaje de inhibicin del DPPH
logrando un IC50 de 49.08 g/mL, al comparar este estndar con el porcentaje de
inhibicin del DPPH frente al extracto etanlico de las hojas de la especie Piper
imperiale se nota que es menor, ya que ni siquiera con la mayor concentracin
utilizada de 500 g/mL del extracto se logro un porcentaje de inhibicin de 50,
obteniendo solamente un porcentaje de inhibicin de DPPH de 46.7 2.14, esto
puede ser debido a que en el extracto hay una variedad de compuestos que
pueden disminuir su actividad antioxidante.

42

En estudios previos realizados al extracto etanolico de las hojas de la especie

Piper imperiale se encontr que este posee un IC50 de 27.31.1 g/mL, utilizando
como estndar hidroxiquinona y concentraciones de 2, 4, 6, 8 y 10 g/mL para el
estndar y el extracto[4].
Se hubiera podido obtener unos mejores resultados para el porcentajede inhibicin
del DPPH con el extracto etanlico de las hojas de la especie Piper impereale
utilizando concentraciones mayores del extracto como nos muestra anlisis
previos, pero se debe tener en cuenta una buena solubilidad del extracto en el
metanol porque mientras se realizo el procedimiento no se logro su solubilidad
total.
3.3 Elucidacin estructural del compuesto 1.
El compuesto 1 es de tipo aceito color verde, que se revelaba en la luz ultravioleta
(Figura 9), y con una coloracin caf al reaccionar con yodo.

Figura 9: CCD en revelado UV a 365nm del compuesto 1 aislado del

extracto etanlico hojas especie Piper imperiale
En el espectro de RMN 1H del compuesto 1 (Figura 10), se pueden apreciar 8
seales que integran para alrededor de 20 protones.

43

TMS

CDCl3

Figura 10: Espectro RMN 1H (CDCl3, 300MHz) del compuesto 1 aislado del
extracto etanlico de la hojas especie Piper imperiale
En la ampliacin del espectro de RMN 1H en 6.70 a 6.50ppm se observan dos
seales, la primera de 6.83 (1H, d, J = 7.8 Hz), y la segunda de 6.69 (2H, m, J
= 8.3 Hz y J = 1.84) con una constante de acoplamiento cercana a 8 Hz y a 2Hz
que integran para 1 y para 2 respectivamente, lo que indica la presencia de dos
protones aromticos en posicin orto y un protn en posicin meta con respeto a
alguno de los otros dos protones (Figura 11)
.

44

J=8.30 Hz

J=7.80 Hz

J=1.84 Hz

Figura 11: Ampliacin del espectro 1H RMN entre 6.70 a 6.50 ppm para el
compuesto 1
En la ampliacin del espectro de RMN 1H en 5.60 a 3.80ppm se pueden observar
dos seales de protones en 5.51 (1H, s) y 3.87 (3H, s), que corresponde a un
protn de grupo hidroxilo y a tres protones de un grupo metilo que est unido a un
tomo electronegativo que posiblemente sea oxigeno. En la misma zona se
encuentra una seal con un desplazamiento 4,12 (2H, q, J = 7.21) perteneciente
a dos protones de un grupo metileno tambin unido a un tomo electronegativo
(Figura 12).

45

J=7.21Hz

Figura 12: Ampliacin del espectro RMN 1H entre 5.60 y 3.80ppm para el
compuesto 1.
En la regin de 1.0 a 3.0 ppm se encuentran tres seales que corresponde a
2.88 (2H, t, J = 7.76), 2.58 (2H, t, J = 7.76), 1.24 (7H, m) (Figura 13)
pertenecientes a protones de grupos metilenos y metilos de una cadena aliftica.

J=7.76Hz J=7.76Hz

Figura 13: Ampliacin del espectro RMN 1H entre 3.0 a 1.0 ppm, para el
compuesto 1.
46

Con el espectro de RMN 13C JMOD a 75 MHz (Figura 14) se puede establecer que
el compuesto 1 posee 12 seales de carbono, con las caractersticas de: cuatro
carbonos tipo cuaternario 173.29, 146.39, 143.98, 132.28, dos carbonos tipo
metilo 56.26, 14,23, tres carbonos tipo metileno 60.23, 36.60, 30.75 y tres
seales tipo metino 121.13, 114.49, 110.64.
Las seales de los carbonos cuaternarios pertenecen a: un carbono de un grupo
carboxilo en 173.29 y tres carbonos aromticos sustituidos en 146.39, 143.98,
132.28. Desplazamiento que indican la presentica de una estructura con un anillo
aromtico trisustituido.
Tambin se encuentran tres seales de carbonos de tipo metino en 121.13,
114.49, 110.64 de un anillo aromtico; dos seales en 60.23 y 56.26 de
carbonos de tipo metileno y metilo respectivamente unidos cada uno a un tomo
electronegativo oxigeno, y por ltimo se observan seales en 36.60, 30.75 de
carbonos metilenos y en 14.23 de un carbono metilo los cuales hacen parte de la
cadena aliftica.

Figura 14: Espectro RMN 13C (CDCl3 75 MHz,) del compuesto 1.

47

El espectro COSY 1H 1H del compuesto 1 (Figura 15), muestra la correlacin

entre protones de carbonos vecinos, confirmando la presencia de protones
aromticos en posicin orto por las correlaciones entre 6.83 (d, J = 7.8 Hz, 1H), y
6.69 (d, J = 8.3 Hz, 2H).
En el espectro tambin se muestran otras dos correlaciones; la primera entre los
protones del grupo metileno unido a un tomo electronegativo oxigeno 4.12 y los
protones de tipo metilo 1,24; y la segunda entre protones de tipo metileno con
desplazamientos en 2.88, 2.58. Estos protones hacen parte de la cadena aliftica
presente en la estructura del compuesto.

Figura 15: Espectro COSY 1H-1H del Compuesto 1.

El espectro HSQC (Figura 16) mostro la conectividad entre hidrgenos y sus
respectivos carbonos, designando que hidrogeno pertenece a que carbono con la
correlacin de seales arrojadas por el espectro. Para el anillo aromtico se
notaron conectividades de los tres protones de tipo metino as: el protn de
desplazamiento 6.83 (d, J = 7.8 Hz, 1H), y los dos protones con desplazamiento
6.69 (d, J = 8.3Hz, J = 1.84, 2H) con el carbono de desplazamiento 114.49 y los
dos carbonos con desplazamiento 110.64, 121.13 respectivamente.

48

Tambin se corroboraron correlaciones entre los protones de tipo metilo unido al

tomo electronegativo oxigeno con su carbono correspondiente con
desplazamiento en RMN 1H en 3,87 y un desplazamiento en RMN 13C en
56.23. Otras correlaciones encontradas fueron las de los protones de tipo
metileno 2.58, 2,88 con los carbonos 36.60, 30.75.

Figura 16: Ampliacin espectro HSQC RMN 1H ( 2.0 a 7.0ppm y RMN 13C
25 a 125ppm) del compuesto 1.
Con los espectros de RMN 1H, RMN 13C, COSY y HSQC se pudo determinar que
la estructura del compuesto 1 corresponde a un anillo aromtico con tres protones
(dos en posiciones orto y uno en posicin meta con respecto a los otros dos
protones) y tres sustituciones; un grupo hidroxilo, un grupo metoxilo y una cadena
aliftica con un grupo ester, obteniendo la posibilidad de seis ismeros para la
estructura del compuesto 1 (Figura 17).

49

CH3
O
H

OH

OH

H3C

OH
H

CH3

OH

OH
R
R

O
CH3

CH3

H
R

H
O

H
OH

H3C

Figura 17: Ismeros posibles de la estructura del compuesto 1 aislado del

extracto etanlico de las hojas de la especie Piper imperiale.

Gracias al espectro HMBC se determino la ubicacin de los sustituyentes en el

anillo aromtico y de los carbonos cuaternarios presentes en el compuesto 1,
llegando a un ismero especifico para el compuesto aislado.
La posicin de la cadena aliftica se ubico en el carbono entre los dos protones
aromticos gracias a las correlaciones del protn metileno en 2.88 con los
carbonos de tipo metino en 110.64, 121,13 y el carbono cuaternario en 132.28
(Figura 18).

50

Figura 18: Ampliacin del espectro HMBC. Ubicacin cadena aliftica en anillo
aromtico.

Se determino que la ubicacin del grupo metoxilo en el anillo aromtico esta sobre
el carbono cuaternario 146.39 por su correlacin con los protones en 3,87
(Figura 19). Para el grupo hidroxilo se determino que este se encuentra entre el
carbono con el grupo que posee el grupo metoxilo y un carbono de tipo metino por
sus correlaciones de protn en 5.51 con los carbonos 114.49, 143.97, 146.39
(Figura 19).

51

Figura 19: Ampliacin del espectro HMBC. Ubicacin grupo hidroxilo y

metoxilo en el anillo aromtico.

Para la cadena aliftica se pudo determinar la ubicacin del grupo carbonilo por su
correlacin con protones de tipo metileno 2.88 y 2.52 (Figura 20). Los protones
del grupo metileno unido al tomo electronegativo oxigeno 4,12 poseen una
correlacin con un carbono de tipo metilo 14.23 y con el carbono del grupo
carbonilo 173.29 (Figura 20) dando la ubicacin del grupo ester en la cadena
aliftica.

52

Figura 20: Ampliacin espectro HMBC. Ubicacin grupo carbonilo y grupo

metileno unido a un tomo electronegativo oxigeno en cadena aliftica
Los sustituyentes del carbono aromtico y los carbonos cuaternarios se pudieron
determinar gracias a las correlaciones entre H C a 2 y 3 enlaces como se
muestra en la figura 21:
OH
H

O
CH3

H3C

Figura 21: Estructura del compuesto 1 con sus respectivas correlaciones

identificadas por el espectro HMBC 1H - 13C
53

Gracias a la informacin recolectada con los espectros RMN 1H, RMN 13C, COSY,
HSQC Y HMBC se realizo la designacin completa para cada uno de las seales
con sus respectivos desplazamientos para el compuesto 1 aislado del extracto
etanlico de las hojas de la especie Piper imperiale. En la figura 22 se muestra la
estructura para el compuesto 1 y en la tabla 11 las asignaciones para cada uno de
sus tomos de Carbono e Hidrogeno.
OH

3a

CH3

5
2
H

9
O

H3C

1
7

1'

2'

Figura 22: Estructura qumica para el compuesto 1.

Tabla 11: Asignacin de seales 1H y 13C para el compuesto 1 aislado del
extracto etanlico de las hojas de la especie Piper imperiale
1

POSICION

RMN H

1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
2
3a
4a

6.69 (m, J=1.84Hz)

6.85 (d, J=7.8 Hz)
6.69 (m, J=8.3, 1.84 Hz)
2.85 (t, J=7.76)
2.52 (t, J=7.76)
4.12 (q, J=7.21)
1.24 (m)
3.87 (s)
5.51 (s)

RMN

13

C (JMOD)

132.28 (C)
121.13 (CH)
146.39 (C)
143.97 (C)
114.49 (CH)
110.64 (CH)
30.75 (CH2)
36.60 (CH2)
173.29 (C)
60.23 (CH2)
14.23 (CH3)
56.23 (CH3)
-

HMBC

C1, C3, C4, C6,

C1, C3, C4
C1, C2, C7
C1, C2, C6, C8, C9
C1, C7, C9
C9, C2
C1
C3
C3, C4, C5

54

El compuesto 1 es un metabolito secundario por primera vez aislado del extracto

etanlico de las hojas de la especie Piper imperiale, derivado del acido
dihidroferlico. Para verificar la elucidacin del compuesto aislado se realizaron
revisiones bibliogrficas y se pudo encontrar los RMN 13C para la estructura
sintetizada del ester etlico del cido dihidroferlico [44] comparando sus
desplazamientos (Tabla 12), y se encontr que la mayoria de estos coincidan con
la estructura elucidada corroborando que el compuesto aislado si es el ester etlico
del cido dihidroferlico
Tabla 12: Comparacion compuesto aislado Hojas Piper imperiale con
estructura sintetizada del ester etlico del cido dihidroferlico
RMN

13

POSICION

Estructura aislada Hojas Piper

imperiale

Estructura
sintetizada

1
2
3
4
5
6

132.28 (C)
121.13 (CH)
146.39 (C)
143.97 (C)
114.49 (CH)
110.64 (CH)

132.5 (C)
120.9 (CH)
146.6 (C)
144.1 (C)
114.5 (CH)
111,1 (CH)

30.75 (CH2)

30.8 (CH2)

36.60 (CH2)

36.5 (CH2)

173.29 (C)

173.2 (C)

60.23 (CH2)

60.5 (CH2)

14.23 (CH3)

14.3 (CH3)

3a

56.23 (CH3)

55.9 (CH3)

De la especie Salicornea herbacea se han logrado aislar compuesto derivados del

acido ferulico similares al ester etlico del cido dihidroferlicopero con cadenas
alifticas con un mayor numero de carbonos como por ejemplo el pentadecil
ferulato (Figura 23), adems se demostr que este posee caractersticas
antioxidantes evaluadas con la metodologa de radical libre DPPH[45]

55

CH3

CH3

O
HO

Figura 23: Estructura del pentadecil ferulato derivado del acido ferlico
aislado de la especie Salicornea herbacea

Otros compuestos de este tipo son el 34-hidroxi tetratriacontanil ferulato y 34-Oacetil tetratriacontanil ferulato, dos metabolitos derivados del acido ferulico (Figura
24) aislados de la especie Plumeria bicolor, que al igual que el pentadecil ferulato
han presentado actividad antioxidante frente a pruebas como el DPPH y
FRAP[46].

HO

H3C

1
2

R=H
R=COCH3

34-Hydroxi tetratriacontanIl ferulato

34-O-acetil tetratriacontanil ferulato

(CH 2)32
OR

Figura 24: Derivados del acido ferulico aislados de Plumeria bicolor

El ester etlico del cido dihidroferlico aislado del extracto etanolico de la especie
P. imperiale es un metabolito secundario que podra poseer caractersticas de
actividad antioxidante ya que estructuras similares como las nombradas
anteriormente han sido estudiadas y dado prueba positiva frente a metodologas
de DPPH y FRAP, adems se ha encontrado que el acido ferulico posee actividad
antioxidante[47] una caracterstica que tambin podran tener sus derivados,
adems en estudios previos se logro identificar la presencia del acido ferulico en el
extracto etanolico de las hojas de la especie Piper imperiale[4].

56

Conclusiones
Del extracto etanlico de las hojas de la especie Piper imperiale se logro el
aislamiento e identificacin de un compuesto derivado del Acido ferlico
compuesto que no haba sido aislado hasta ahora, ya que en este extracto
solamente se haba logrado identificar la presencia de polifenoles como el Acido
ferlico, Acido glico, Catequina, Quercetina, sin embargo se han encontrado
reportes de compuestos derivados del acido ferlico aislados de otras especies
como la Salicornea herbacea y Plumeria bicolor, pero se debe tener en cuenta que
no en especies del genero Piper.
La actividad antioxidantes (DPPH) del extracto etanlico de las hojas de la especie
Piper imperiale resulto ser positiva, donde se demostr que con una concentracin
de 500ppm de extracto se logra un porcentaje de inhibicin del 46%, esto quizs
sea por la presencia de compuestos antioxidante de tipo fenlico.
Las pruebas fitoqumicas preliminares indican que el extracto etanlico de las
hojas de la especie P. imperiale est compuesto por metabolitos secundarios
como alcaloides, flavonoides, taninos y cumarinas.

57

Recomendaciones

Se recomienda realizar pruebas de actividad antioxidante al compuesto 1

aislado del extracto etanlico de las hojas de la especie Piper imperiale
para confirmar si este es uno de los que le brinda dicha la actividad
antioxidante a la especie.

Durante el tratamiento del extracto vegetal se debe controlar la temperatura

a la que se realiza la maceracin, que el extracto se encuentre seco y el
solvente sea de alta pureza para evitar reacciones de los compuestos
presentes en la planta.

Para establecer que el compuesto aislado es un producto de la biosntesis

de la planta y no un artefacto que se formo durante la extraccin se
recomienda hacer la extraccin con otros solventes y realizar un
seguimiento por HPLC.

58

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1.
2.
3.
4.
5.

6.

7.

8.
9.

10.

11.
12.
13.

14.

Callejas, R., Especies nuevas de Piperaceae de los Andes al Sur de

Colombia. Novon, 1997. 7.
Celis, A., Mendoza C., Extractos vegetales utilizados como biocontroladores
con enfasis en la familia Piperaceae. Agronomia Colombiana, 2008. 26.
Ahmad, F., Emrizal, Antimicrobial and anti-inflammatory activities of Piper
porphyrophyllum (Fam. Piperaceae). Arabian Journal of Chemistry, 2010.
Diaz, L., Muoz D., Prieto R., Cuervo S., Antioxidant, Antitubercular and
Cytotoxic Activitier of Piper imperiale. Molecules, 2012. 17.
Chen, X., Yuan K., Phenolic contents and antioxidant activities in ethanol
extracts of Citrus reticulata Blanco cv. Ougan fruit. Journal of Food,
Agriculture & Evironment, 2010. 8.
Vargas, W., Guia Ilustrada De Las Plantas De Las Montaas Del Quindio y
Los Andes Centrales, ed. Universidad de Caldas. 2002, Manizales
Colombia.
Plazas E., Cuca L., Delgado W., Flavonoides Aislados de Las
Inflorescencias de Piper hispidum Kunth (Piperaceae) y Derivados
Acetilados. Revista Colombiana de Quimica, 2008. 37.
Scott, I., A Review of Piper spp. (Piperaceae) Phytochemistry Insecticidal
Activity and Mode of Action. Spinger Science, 2008.
Parra J., Contribucion al estudio fitoquimico de la parte aerea de Piper cf.
cumanense Kunth, Quimica. 2011, Universidad Nacional de Colombia:
Bogota.
Jimenez I., Lopez I., Metabolitos Secundarios Biactivos de Especies del
Genero Piper de la Flora Boliviana, in Ciencia y Tecnologia. 2006,
Universidad de La Laguna.
Calle J., Contribucion al Estudio de Algunas Especies de la Familia
Piperaceae. Universidad Nacional de Colombia, 1999.
Pareja, M., Seminario Taller Ciencias de la Malesa, ed. Catie. 1986,
Guatemala.
Abreu O., Morgado M., Farmacognosia, farmacobotanica, farmacogeografia
y farmacoetimologia del platanillo de Cuba (Piper aduncum subespecie
ossanum). Revista Cubana de Plantas Medicinales, 2012. 17.
Jaramillo M., Manos P., Phylogeny and patterns of floral diversity in the
genus Piper (Piperaceace). American Journal of Botany, 2001.
59

15.
16.
17.
18.
19.
20.

21.

22.
23.
24.

25.
26.

27.
28.

29.

30.
31.

32.

Quijano A., Areas of endemism and distribution patterns for Neotropical

Piper species (Piperaceae). Journal of Biogeography, 2006. 33: p. 1266.
Ponz, E., La Medicina Tradicional de los Tacana y Machineri, ed. F. PIEB.
2005, La Paz Bolivia.
Lifchitz, A., Plantas medicinales. Guia Practica de Botanica Universal, ed.
Kier. 2006, Buenos Aires.
Melendez, E., Plantas Medicinales de Puerto Rico, ed. Universidad
de.Puerto Rico. 1982, Puerto Rico.
Lopera P., El milagro de las plantas: aplicaciones medicinales y
orofaringeas., ed. S. Pablo. 2005.
Xuan T., Wei C., Efficacy of extracting solvents to chemical components of
kava (Piper methysticum) roots. The Japanese Society of Pharmacognosy
and Spinger, 2007.
Peres V., Chemical composition and cytotoxic, mutagenic and genotoxic
activities of the essential oil from Piper gaudichaudianum Kunth leaves.
Food and Chemical Toxicology, 2009.
Parmar V., Kirpal S., Phytochemistry Of The Genus Piper. Phytochemistry,
1996. 46.
Silva, R., Kato M., Antifungal amides from Piper arboreum and Piper
tuberculatum. ELSEVIER, 2001.
Avila M., Prieto J., Cuca L., Flavonoides con Actividad Antifungica Aislados
de Piper septuplinervium (Miq.) C. DC. (Piperaceae). Revista Colombiana
de Quimica, 2011. 40.
Posso R., Diaz A., Estudio qumico de Piper steerni. Revista Colombiana de
Qumica, 1994. 23.
Garcia A., Rene J., Determinacion de la composicion qumica y actividad
antioxidante in vitro del aceite esencial de Piper auritum kunth (Piperaceae)
difundida en la costa colombiana. Universidad Tecnologica de Pereira,
2007.
Boluda C, Lignanos (2): actividad farmacologica. Revista de Fitoterapia,
2005.
Mesa A., Cardona F., Actividad antiplasmodial y citotoxica de extractos
etanolicos de especies de gnero Piper. Boletin Latinoamericano y del
Caribe de Plantas Medicinales y Aromaticas, 2012.
Sung-Eun Lee, Fungicidal activity of pipernonaline, a peperidine alkaloid
deriver from long pepper, Piper longum L., against phytopathogenic fungi.
Cop Protection, 2000.
Park K., Larvicidal activity of isobutylamides identified in Piper nigrum fruits
against three mosquito species. Agricultural and food chemistry, 2002.
Aguirre J., Belmares R., Actividad antioxidante de algunas plantas
tropicales, subtropicales y semideserticas. Revista cientifica de la
Universidad Autonona de Coahuila, 2012.
Cardona G., Rojano B., Actividad leishmanicida y antioxidante de extractos
de Piper daniel-gonzalezzi Trel. (Piperaceae). Medigraphic.
60

33.

34.
35.

Puertas M., Rojano B., Capacidad antioxidante in vitro de fracciones de

hojas de Piper peltatum L. Revista Cubana de Plantas Medicinales, 2009.
14.
Escobar E., Presentacion de Yotoco "Reserva Natural", ed. Universidad
Nacional de Caldas. Palmira. 2001, Palmira
Margaret B. Gargiullo, B.M., Larry Kimball, A Field Guide to Plans of Costa
Rica, ed. O.U. Press. 2008, New York.

36.

37.

38.
39.

40.
41.
42.

43.
44.
45.
46.
47.

http://www.biovirtual.unal.edu.co/ICN/?controlador=ShowObject&acci
on=show&id=121834. [cited.
Galindo A., Analisis Fitoquimico Preliminar. Metodologia y su aplicacion en
la evaluacion de 40 plantas de la familia Compositae, ed. Universidad
Nacional de Colombia. 1983.
Bilbao, M., Analisis Fitoquimico Preliminar. Quimica de Productos
Naturales, ed. Universidad del Quindio. 1997, Armenia.
Molyneux, P., The use of the stable free radical diphenylpicryohydrazyl
(DPPH) for estimating antioxidant activity. Songklanakarin J. Sci. Technol,
2004.
Martirosyan, D., Functional Foods for Cardiovascular Diseases. 2005.
Gros E., Pomilio A., Introduccion al estudio de los productos naturales, ed.
S.g.d.l.o.d.l.E. Unidos. 1985, Washington D. C.
Gonzalez Y., Pea M., Taninos de diferentes especies vegetales en la
prevencion del fotoenvejecimiento. Revista Cubana de Investigaciones
Biomedicas, 2001. 20.
Hatano, Y., Katsumura Y., Charged Particle and Photon Interactions with
Matter, ed. C. Press. 2011, United States of America.
Beck, J., Kim J., Campbell B., Fungicidal Activities of Dihydroferulic Acid
Alkyl Ester Analogues. Journal of Natural Products, 2006. 70.
Xiaomin W., Pentadecyl ferulate, a potent antioxidant and antiproliferative
agent from the halophyte Salicornia herbacea. Elsevier, 2013. 141.
Dobhal M., Aidross M., Ferulic acid esters from Plumeria bicolor. Pergamon,
1999.
Maurya, D. Paul T., Antioxidant and prooxidant nature of hydroxycinnamic
acid derivatives ferulic and caffeic acids. Food and Chemical Toxicology,
2010. 48.

61