UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA

CARRERA PROFESIONAL DE INGENIERIA

AGROINDUSTRIAL
CURSO
BIOQUIMICA DE ALIMENTOS
GUIA DE LABORATORIO
CARACTERIZACION DE ANTOCIANIDINAS

2015

UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA

DOCENTE: NILS L. HUAMAN CASTILLA

INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
CURSO. QUMICA DE ALIMENTOS

PRACTICA DE LABORATORIO
EXTRACCION DE ANTOCIANINAS E IDENTIFICACION DE ANTOCIANIDINAS
I.

OBJETIVOS

II.

Extraer antocianinas, obtener e identificar antocianidinas.

FUNDAMENTO
Las antocianinas son un grupo de pigmentos solubles en agua ampliamente
difundidas en el reino vegetal; son responsables del color atractivo que presentan
muchos productos, como frutas, hortalizas, tubrculos, races y flores. El color de
las antocianinas vara desde el rosado hasta el azul oscuro. Su incorporacin en
alimentos tiene la ventaja de no solo impartir color, sino tambin por sus
propiedades antioxidantes que poseen, se pueden considerar como alimentos
funcionales. Su estructura qumica se caracteriza por un esqueleto carbonatado
C6C3C6, posee dos anillos aromticos, unidos por un puente de tres carbonos a los
cuales pueden estar unidos a uno o ms grupos hidroxilos, siendo esta la
estructura bsica de todo polifenol.
Cuando se hidroliza la mitad del azcar de una antocianina, el aglicn (el producto
no azcar de la hidrlisis) se conoce con el nombre de antocianidina. Se conocen
20 antocianidinas, pero solo 6 son importantes en los alimentos: cianidina,
peonidina, pelargonidina, malvidina, delfinina y petunidina.

UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA

DOCENTE: NILS L. HUAMAN CASTILLA

INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
CURSO. QUMICA DE ALIMENTOS

La utilizacin de estos compuestos como pigmentos se ha limitado por su

susceptibilidad, entre otros factores, al pH y a la temperatura. De acuerdo al valor
del pH, se presenta una variacin del color que adquieren las antocianinas cuando
estn en solucin. Por consiguiente, es posible observar un color rojo o
anaranjado a pH acido de aproximadamente 2 menor, con un pH de 5 la
antocianina es incolora y cuando el pH se incrementa por arriba de 7, la
antocianina se degrada de forma irreversible.
El descubrimiento de antocianinas de tipo acilado, que son mas estables a
cambios de temperatura y pH que las no aciladas, ha venido a reactivar
nuevamente la bsqueda de fuentes naturales de estos compuestos para su uso
como pigmentos de los alimentos.
III.

MATERIALES Y METODOS
III.1. MATERIALES

Materia prima
Fuente de antocianina.
Sugerencia: Oca morada.

Reactivos
HCl 2N
Metanol
Etil Acetato
Metanol acidificado: 0.01% (v/v) de HCl en metanol.
Agua acidificada: 0.01% (v/v)
Acetonitrilo grado HPLC
Acido frmico
Agua extrapura (Agua MiliQ)
Estndares de antocianidina

Materiales
Cartuchos C18 (con adsorbente C18 enlazado en silica: C18 Sep-Pack
Cartidhe (360 mg de adsorbente, Waters Chromatography: ODS-4
Octadecyl Silane (500 mg adsorbente) o equivalentes.
Material de vidrio: Pipetas de 10 ml, beaker de 20,50ml, embudo buchner

Equipos
Balanza Analtica
Rotavapor
Sistema HPLC
Filtros 0.45 m

UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA

DOCENTE: NILS L. HUAMAN CASTILLA

INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
CURSO. QUMICA DE ALIMENTOS

III.2. METODOS
III.2.1. PROCESO DE EXTRACCIN DE ANTOCIANINAS
Este es el mtodo clsico de extraccin de antocianinas de los materiales
vegetales. Este procedimiento consiste en la maceracin o empapado del material
vegetal en metanol que contiene una pequea concentracin de cidos minerales
(por ejemplo, HCl). La extraccin con metanol es un mtodo fcil, rpido y
eficiente para la extraccin de antocianinas. Sin embargo se obtiene un extracto
acuoso crudo con varios contaminantes y la evaporacin del metanol puede
provocar una hidrlisis por ruptura de enlaces acilos lbiles lo cual podra
agravarse por la presencia de HCl. Si fuera el caso ensayar otros mtodos de
extraccin (por ejemplo extraccin por el mtodo de particin con acetona y
cloroformo)

Tomar 50 60 g de muestra
Homogenizar el material con dos volmenes de metanol acidificado (p/v)
proteger en todo momento de la luz. Dejar la muestra una hora con agitacin
continua de lo contrario 24 horas bajo refrigeracin.
Filtrar en un embudo buchner con papel Whatman No. 1. Reextraer en el
residuo con suficiente solucin de metanol acidificado hasta agotar el residuo.
Combinar y concentrar el filtrado bajo vacio a 40 C en un rotavapor. Deber
evitarse tiempos prolongados en esta etapa para minimizar la degradacin
del pigmento.
Redisolver el residuo remanente con una solucin acuosa de HCL al 0.01%.
Si la muestra no es analizada de forma inmediata se recomienda almacenar a
18C.

III.2.2. PURIFICACIN DE ANTOCIANINAS

Esta operacin es necesaria antes de la identificacin debido a que los solventes
usados en la extraccin no son especficos para las antocianinas. Considerables
cantidades de materiales acompaantes pueden ser tambin extraidos y
concentrados con los extractos coloreados, los cuales pueden influir en la
estabilidad y/o anlisis de estos pigmentos (Jackman y Smith, 1996). La
purificacin de antocianinas usando la metodologa de extraccin en fase slida
permite la remocin de varios componentes de interferencia en el extracto crudo.
Mini columnas conteniendo cadenas C-18 enlazadas en silica retienen
componentes orgnicos hidrofbicos (antocianinas, fenlicos), permitiendo el
paso de interferentes como azcares y cidos. El lavado posterior de los
pigmentos retenidos con acetato de etilo permite la remocin de otros compuestos
fenlicos diferentes a la antocianina. Este proceso de purificacin puede
observarse esquemticamente en la Figura 1.

UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA

DOCENTE: NILS L. HUAMAN CASTILLA

INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
CURSO. QUMICA DE ALIMENTOS

Figura 2. Purificacin de antocianinas.

IV.

Activar el cartucho pasando dos volmenes de columna de metanol y tres

volmenes de agua desionizada acidificada
Inyectar el extracto acuoso de antocianina. El volumen de la muestra aplicada
depender principalmente de la cantidad de muestra, el contenido de
antocianina y la cantidad de absorbente empacado en el cartucho.
Usualmente un volumen de muestra de 5 a 10 ml es usado para cartuchos de
extraccin fase slida conteniendo 360 mg de absorbente. Sin embargo esto
deber ajustarse para cada caso en particular.
Lavar el cartucho con dos volmenes de agua acidificada para remover los
componentes no adsorbidos (azcar, acidos y otros solubles)
Seguidamente pasar por el cartucho dos volmenes de acetato de etilo para
remover componentes polifenlicos tales como cidos fenlicos y favonoles.
Extraer las antocianinas adsorbidas en el cartucho con solucin de metanol
acidificado y colectar en un baln de vidrio.
Remover el metanol en un rotavapor a 40C bajo vacio.
Redisolver el pigmento en agua acidulada.
Almacenar el extracto purificado a 4 C si ser analizado en las prximas 24
horas, para periodos ms prolongados almacenar bajo congelacin a 15C o
mas bajas temperaturas.

RESULTADOS Y DISCUSIONES
Analizar los espectros de absorcin y discutir todos los resultados obtenidos en
base a otras investigaciones revisadas.

V.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA

DOCENTE: NILS L. HUAMAN CASTILLA

VI.

INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
CURSO. QUMICA DE ALIMENTOS

BIBLIOGRAFA
1. Cevallos Casals, B. y Cisneros Zevallos, L. (2003). Stoichiometric and
Kinetic Studies of Phenolic Antioxidants from Andean Purple Corn and RedFleshed Sweet potato. J. Agric. Food Chem. Vol. 51. pp. 3313 3319.
2. Giusti MM and Wolrstad RE., (2001). Anthocyanins. Characterization and
measurement with UV-Visible Spectroscopy. In Current protocols in Food
Analytical Chemistry; Wrolstad, R.E., Ed.; John Wiley & Sons: New York.
3. Jakman, R.L. y Smith. J.l. 1996. Anthocyanins and betalains. In Natural Food
Colorant, 2nd ed. (G.A.F. Hendry and J.D. Houghton, eds) pp. 244-309. Blackie
and Son.Ltd.,London.