Tese Vitamina C - Ana Salomé Pires PDF

Faculdade de Cincias e Tecnologia
Universidade de Coimbra
Departamento de Fsica
Citotoxicidade da vitamina C
em clulas tumorais
Estudos in-vitro e in-vivo atravs de mtodos

bioqumicos e de imagiologia nuclear
Trabalho realizado por: Ana Salom dos Santos Pires

Trabalho orientado por: Prof Doutora Maria Filomena Botelho
Trabalho co-orientado por: Prof Doutora Ana Bela Sarmento e Doutor Paulo Crespo
Coimbra, Julho de 2008
Agradecimentos
Muitos foram aqueles que de forma directa ou indirecta, no palco ou nos bastidores,
contriburam para o findar desta etapa da minha vida acadmica, marcado por este projecto.
Gostaria de agradecer Professora Doutora Maria Filomena Botelho, orientadora
deste projecto, pela sua dedicao, disponibilidade e apoio, pelo seu contagiante sentido de
organizao e por todo o partilhar de conhecimento.
Ao Doutor Paulo Crespo agradeo por ter estado na origem deste projecto to
aliciante e pelas suas palavras de apoio sempre com um toque de motivao.
Professora Doutora Ana Bela Sarmento agradeo pela co-orientao, apoio na
anlise de resultados e na elaborao desta dissertao.
Margarida Abrantes, um exemplo de trabalho e dedicao, que me ensinou quase
tudo o que aprendi durante este ltimo ano, o meu sincero obrigado por todas as horas
dispendidas, por todos os ensinamentos, pela pacincia, pela disponibilidade e apoio que me
ajudaram a ultrapassar cada etapa de forma mais leve.
Mafalda Laranjo pela cooperao nas mais variadas tarefas, professora Elisa
Serra pela ajuda fornecida aquando da marcao da vitamina C, Professora Brbara
Oliveira pela disponibilidade em me ajudar na anlise estatstica dos resultados, Cristina
Gonalves pelo tempo dispendido para que os experimentos de citometria fossem concretizados,
aos estagirios de Medicina Nuclear da ESTS do Porto pela ajuda que me deram ao longo do
ano, Cludia Caridade pelo apoio em pequenos mas valiosos gestos dirios e aos restantes
elementos do servio da biofsica que de alguma forma tero contribudo para este trabalho.
Agradeo aqueles que diariamente me acompanharam e tornaram os dias no IBILI
agradveis, repletos de boa disposio e de contnuos gestos de amizade, Sara, Joo, Mnica,
Ana Pratas e Lus.
V
Daniela Roque, Daniela Gaspar, Diana e Elsa, minhas colegas de casa, pelo apoio e
preocupao diariamente demonstrados e pelo bem-estar caseiro proporcionado no findar de
cada dia.
Aos meus pais e irmos, que sempre me apoiaram, obrigado pelo carinho e preocupao
continuamente demonstrados.
Ao Tiago, meu namorado, a quem no tenho palavras para agradecer a presena e
apoio constantes, ajuda e pacincia, e o transformar de cada pedra de tropeo num degrau que
permitisse subi-la e ultrapass-la.
E por ltimo, mas no topo de importncia, agradeo a Deus pela contnua presena,
por ter colocado no meu caminho todas estas pessoas, assim como, muitas outras no
mencionadas, e pelo incessante amparo na concretizao deste projecto.
VI
Resumo
A vitamina C uma substncia essencial no metabolismo das clulas vivas, com

inmeras propriedades fisiolgicas, apresentando-se maioritariamente sob duas
formas, a reduzida e a oxidada. O cido ascrbico (AA), a forma reduzida da vitamina
C, um potente antioxidante hidrossolvel, na medida em que neutraliza os radicais
livres, constituindo um potencial mecanismo anticancergeno. A vitamina C actua
tambm como pr-oxidante, promovendo a formao de espcies reactivas de
oxignio (ROS), como o perxido de hidrognio (H2O2), que comprometem a
viabilidade celular. Por outro lado, a maioria das clulas tumorais no transporta
directamente o AA para o seu interior, razo pela qual as clulas obtm a vitamina C
na sua forma oxidada, o cido dehidroascrbico (DHA). As clulas tumorais
demonstram ainda outra particularidade, a diminuio da catalase (enzima
responsvel pela destoxificao do H2O2), num factor entre 10 e 100, relativamente s
clulas normais. Assim, o aumento da produo de H2O2, acoplado deficincia da
actividade da catalase nas clulas neoplsicas e presena de metais de transio,
poder redundar na citotoxicidade selectiva da vitamina C e na consequente revelao
do seu potencial teraputico.
O objectivo deste trabalho avaliar o metabolismo das duas formas da
vitamina C e mostrar o efeito citotxico das mesmas, em clulas de adenocarcinoma
do clon, recorrendo a mtodos bioqumicos e de imagiologia nuclear.
Primeiramente, efectuou-se a marcao da forma reduzida da vitamina C com
tecncio, de forma a obter um complexo radioactivo (99mTc-AA) passvel de ser usado
em imagiologia nuclear.
Posteriormente, realizaram-se estudos in vitro, com a linha celular de
adenocarcinoma do clon (WiDr), que incluram estudos de captao com
99m
Tc-AA,
IX
estudos de estabilidade por HPLC e estudos de avaliao da citotoxicidade da vitamina

C. Estes incluram a anlise do seu efeito na proliferao, na viabilidade e na morte das
clulas WiDr, recorrendo a tcnicas de colorimetria e citometria de fluxo.
Por ltimo, foram feitos estudos in vivo, com ratinhos Balb/c nu/nu, com o
intuito de comprovar os resultados obtidos no controlo de qualidade do
99m
Tc-AA, e
obter informao sobre a biodistribuio e vias de excreo e metabolizao do

mesmo.
Assim, foi desenvolvido um procedimento adequado de marcao radioactiva,
assim como, um mtodo de controlo de qualidade do 99mTc-AA, por HPLC, permitindo
atingir uma elevada eficincia de marcao. Os resultados obtidos dos estudos in vitro
revelaram que ambas as formas da vitamina C induzem um efeito anti-proliferativo e
citotxico nas clulas de adenocarcinoma do clon, embora em diferentes
concentraes e tempos de exposio, podendo eventualmente constituir uma nova
abordagem teraputica no tratamento do cancro do clon. Os estudos in vivo
comprovaram o elevado grau de pureza radioqumica do complexo 99mTc-AA.
Lista de Abreviaturas
AA cido Ascrbico
ADN cido Desoxirribonucleico
ATP Trifosfato de Adenosina
Bq Becquerel (uma desintegrao por segundo - unidade do sistema internacional)
CAT Catalase
CPM Contagens por Minuto
CPS Contagens por Segundo
Da Dalton
DCF 2,7 Dichlorofluorescein
DHA cido Dehidroascrbico
DHE Dihidroetdeo
DMEM Dubelccos Modified Eagles Medium
g Unidade de fora centrfuga relativa
GLUT Transportadores de Glicose
GPx Peroxidase do Glutatio
HPLC High Performance Liquid Chromatography
H2O2 Perxido de Hidrognio
IP Iodeto de Propdeo
JC-1 5,5,6,6-tetrachloro-1,1,3,3-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide
Km Constante de Michaelis
LEHR Low Energy High Resolution
MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide]
p.a. pro analysis
PBS Phosphate Buffer Solution
RIA - Radioimunoensaio
Rf Retention Factor
RNS Reactive Nitrogen Species
XIII
ROI Region of interest

ROS Reactive Oxygen Species
SO Stresse Oxidativo
SOD Superoxide Dismutase
SVCT Sodium Vitamin C Cotransporters
UV - Ultravioleta
V Volte
XIV
ndice
Agradecimentos ........................................................................................................................... III

Resumo........................................................................................................................................ VII
Lista de Abreviaturas .................................................................................................................... XI
ndice ........................................................................................................................................... XV
Captulo I ....................................................................................................................................... 1
1.
Introduo ............................................................................................................................. 1
1.1.
Funes ......................................................................................................................... 4
1.2.
Metabolismo ................................................................................................................. 5
1.2.1.
Absoro, Armazenamento e Excreo ................................................................ 5
1.2.2.
Transporte ............................................................................................................. 6
1.3.
1.2.2.1.
Transporte indirecto via GLUTs ..................................................................... 8
1.2.2.2.
Transporte directo via SVCTs ........................................................................ 9
Vitamina C & Cancro ................................................................................................... 13
1.3.1.
Administrao i.v. vs. oral ................................................................................... 17
1.3.2.
Stresse Oxidativo ................................................................................................. 19
1.3.2.1.
Efeito antioxidante ...................................................................................... 22
1.3.2.2.
Efeito pr-oxidante ..................................................................................... 24
1.3.3.
Citotoxicidade selectiva ....................................................................................... 25
Captulo II .................................................................................................................................... 29
2.
Mtodos .............................................................................................................................. 29
2.1.
Estudos de Qumica ..................................................................................................... 32
2.1.1.
Preparao do 99mTc-AA ...................................................................................... 32
2.1.2.
Controlo de Qualidade do 99mTc-AA .................................................................... 33
2.2.
2.1.2.1.
HPLC ............................................................................................................ 34
2.1.2.2.
Microcromatografia ascendente ................................................................. 38
Estudos in vitro ............................................................................................................ 41
2.2.1.
Culturas celulares de adenocarcinoma do clon ................................................ 42
XVII
2.2.2.
Estudos de Captao ........................................................................................... 42
2.2.3.
Determinao da Viabilidade e Celular ............................................................... 44
2.2.4.
Estudos de estabilidade da vitamina C ................................................................ 45
2.2.4.1.
2.2.5.
Avaliao do meio extracelular ................................................................... 46
Determinao da citotoxicidade da vitamina C .................................................. 47
2.2.5.1.
Avaliao da proliferao celular por colorimetria ..................................... 48
2.2.5.2.
de fluxo
Avaliao da viabilidade, morte celular e produo de ROS por citometria

49
2.2.5.2.1. Avaliao da morte celular ....................................................................... 49

2.2.5.2.2. Avaliao da presena de perxidos ........................................................ 50
2.2.5.2.3. Avaliao da produo de O2- ................................................................. 52
2.2.5.2.4. Avaliao do potencial de membrana mitocondrial ................................ 53
2.3.
Estudos in vivo ............................................................................................................. 54
2.3.1.
Estudos de Biodistribuio com 99mTc-AA ........................................................... 54
2.3.2.
Imagiologia com 99mTc-AA ................................................................................... 55
2.4.
Anlise Estatstica ........................................................................................................ 57
Captulo III ................................................................................................................................... 59

3.
Resultados ........................................................................................................................... 59
3.1.
Estudos de qumica ..................................................................................................... 61
3.1.1.
3.2.
Preparao e controlo de qualidade do 99mTc-AA ............................................... 61
3.1.1.1.
HPLC ............................................................................................................ 61
3.1.1.2.
Microcromatografia ascendente ................................................................. 65
Estudos in vitro ............................................................................................................ 66
3.2.1.
Estudos de captao do 99mTc-AA........................................................................ 66
3.2.2.
Estudos de estabilidade da vitamina C ................................................................ 68
3.2.2.1.
3.2.3.
Determinao da citotoxicidade da vitamina C .................................................. 76
3.2.3.1.
XVIII
Avaliao do meio extracelular ................................................................... 71
Avaliao da proliferao celular ................................................................ 76
3.3.
3.2.3.2.
Avaliao da viabilidade e morte celular .................................................... 78
3.2.3.3.
Avaliao dos mecanismos envolvidos na citotoxicidade da vitamina C .... 80
3.2.3.4.
Avaliao do potencial de membrana mitocondrial ................................... 83
Estudos in vivo ............................................................................................................. 84
Captulo IV ................................................................................................................................... 89
4.
Discusso ............................................................................................................................. 89
Concluso .................................................................................................................................. 101

Bibliografia ................................................................................................................................ 107
XIX
Captulo I
1. Introduo
Introduo
O cido ascrbico (AA), tambm denominado vitamina C ou ascorbato, uma

lactona (C6H12O6) cujo peso molecular 176,13 Da. Foi isolado pela primeira vez em
1928, pelo bioqumico e Prmio Nobel Szent-GyorGyi. No seu estado natural, a
vitamina C aparece na forma de cristal ou p, e pode apresentar uma tonalidade desde
o branco ao amarelo. O AA uma vitamina hidrossolvel e encontra-se nos frutos,
principalmente os pertencentes famlia dos citrinos, tais como laranjas, limes, limas
e tangerinas, sendo todavia tambm abundante nos vegetais verdes foliformes. O AA
um antioxidante instvel, facilmente oxidvel e cujas ligaes podem ser quebradas
pelo oxignio, por bases alcalinas e temperaturas elevadas. Deste modo, existem duas
formas: a forma reduzida e a forma oxidada. As estruturas moleculares do AA e da sua
forma oxidada, cido dehidroascrbico (DHA dehydroascorbic acid), so semelhantes
da glicose devido existncia de vrios grupos hidroxilo (OH) prximos uns dos
outros (Figura 1). A enzima que medeia a reaco de oxidao que origina o DHA a
partir do AA a reductase (Agus, et al., 1999; Gonzlez, et al., 2005; Wilson, 2005;
Iqbal, et al., 2004).
(AA)
(DHA)
Figura 1 - Reaco de oxidao do AA com formao de DHA. Retirado de (Corpe, et

al., 2004).
Citotoxicidade Selectiva da Vitamina C
1.1. Funes
O ser humano incapaz de sintetizar a vitamina C, tendo por isso de a obter a
partir da ingesto exgena, sendo necessria, em pequenas concentraes, para o
cumprimento das funes fisiolgicas normais. Uma das funes bsicas e conhecidas
do AA o facto de este ser um dador de electres, funo que se destaca no seu
envolvimento na acelerao de reaces de hidroxilao (nomeadamente, do
colagnio), na regulao do sistema nervoso atravs da biossntese da carnitina, da
dopamina, da noradrenalina e da adrenalina, no metabolismo da tirosina, do cido
flico e triptofano, assim como, na amidao de hormonas peptdicas. Em muitas
destas reaces, o AA fornece electres a enzimas que necessitam de ies metlicos
prostticos para atingirem actividade enzimtica mxima. Assim, o ascorbato tem
tambm um papel de elevada relevncia no crescimento de tecidos e processos de
cicatrizao de feridas, na formao de neurotransmissores e no aumento da absoro
de ferro ao nvel dos intestinos. Como antioxidante, protege as clulas dos efeitos
nefastos dos radicais livres, apesar do papel antioxidante da vitamina C ainda no ser
conhecido na sua totalidade. Este ltimo aspecto ser com maior pormenor
desenvolvido posteriormente (Padayatty, et al., 2001; Gonzlez, et al., 2005; Wilson,
2005; Iqbal, et al., 2004).
Doses elevadas de vitamina C so usadas no tratamento e preveno de um
vasto nmero de doenas, tais como diabetes, cataratas, glaucoma, degenerao
macular, arteriosclerose, derrame cerebral, doenas cardacas e cancro. Por outro
lado, a deficincia em vitamina C resulta na subhidroxilao do colagneo necessrio
para o tecido conjuntivo, nomeadamente dos ossos e dentina (constituinte maioritrio
Introduo
dos dentes). Outras consequncias da carncia de vitamina C so anemia, escorbuto,

fraqueza, depresso, reteno de fluidos, hemorragia ao nvel das gengivas,
degenerao muscular, cicatrizao lenta de feridas aumentando a susceptibilidade s
infeces, hemorragias capilares e distrbios nervosos (Iqbal, et al., 2004).
1.2. Metabolismo
1.2.1.
Absoro, Armazenamento e Excreo
Os humanos apenas obtm a vitamina C exogenamente, cuja absoro ocorre

na mucosa bucal, estmago e intestino delgado. A ingesto do AA ou da sua forma
oxidada, DHA, aumenta a concentrao plasmtica de ascorbato (a forma
predominante da vitamina C a pH fisiolgico) em indivduos normais. A administrao
de 1 a 1,5 g resulta numa absoro de 50 % enquanto, uma taxa de absoro de 98 %
atingida com uma administrao inferior a 20 mg, isto , a taxa de absoro intestinal
diminui medida que aumenta a dose de AA administrada. Aps a absoro pelas
clulas epiteliais do intestino delgado, a vitamina C difundida para os capilares
circundantes e posteriormente para o sistema circulatrio. No rim, o AA filtrado
pelos capilares glomerulares para a cpsula de Bowman pelo mecanismo normal de
filtrao glomerular. Ao passar pelo tbulo contornado proximal, o AA reabsorvido
para os capilares circundantes atravs das clulas epiteliais renais por transportadores
activos especficos. Assim, a diferena entre a quantidade de AA filtrado e reabsorvido
constitui a excreo renal. Desta forma, a absoro intestinal e a excreo renal
determinam a biodisponibilidade de vitamina C, ou seja, a concentrao intracelular
mxima efectiva da vitamina C (Wilson, 2005; Iqbal, et al., 2004; Helwig; Li, et al.,
2007).
A vitamina C armazenada pelos tecidos e sangue, e est presente nos tecidos
em concentraes 3 a 10 vezes superiores s do plasma, devido aco de sistemas
(bombas) de transporte activo. A quantidade total de vitamina C no corpo humano
estima-se em 20 mg/Kg, o que corresponde a uma concentrao plasmtica de 57 M.
Encontra-se em maiores concentraes nas glndulas pituitrias e adrenais e no
cristalino, ao contrrio da saliva e plasma onde se encontra em menores
concentraes. Est tambm presente em nveis intermdios noutros tecidos, tais
como, rins, crebro, fgado, pulmes e tiride. Por outro lado, as suas propriedades
hidrossolveis determinam que a eliminao da vitamina C seja essencialmente renal,
no permitindo o seu armazenamento no tecido adiposo. De salientar que os rins
desempenham o papel de maior relevncia tanto na excreo como na reteno da
vitamina C, na medida em que, regulam a sua concentrao tecidular. Se o nvel basal
for inferior ou igual a 1500 mg, o AA e o DHA podem ser reabsorvidos pelos tbulos
renais. Neste caso, no ocorrer excreo urinria da vitamina C. Contudo, para nveis
entre 1500 e 3000 mg verificar-se- a saturao dos tecidos e consequentemente a
excreo atravs da urina. De facto, o threshold renal dos nveis de ascorbato no
plasma entre 0.8 e 1.4 mg/dL (Gonzlez, et al., 2005; Helwig).
1.2.2.
Transporte
Os sistemas de transporte associados membrana plasmtica celular

determinam a distribuio da vitamina C entre os fluidos extra e intracelulares. A
6
Introduo
difuso simples, a difuso facilitada e os mecanismos de transporte activo contribuem

para o transporte do AA ao nvel da membrana celular. A difuso simples poder
ocorrer ao nvel da boca e do estmago, porm, considera-se ser apenas uma pequena
percentagem de captao. Isto porque, o facto de ser um composto polar e de possuir
massa molecular relativamente grande no lhe permite atravessar rapidamente a
membrana. Assim sendo, o fluxo da vitamina C para dentro e fora da clula
essencialmente controlado por difuso facilitada e transporte activo, os quais so
mediados por protenas membranares de classes distintas, transportadores de glicose
(GLUT glucose transporters) e transportadores de vitamina C dependentes de sdio
(SVCT sodium vitamin C cotransporters), respectivamente (Padayatty, et al., 2001;
Wilson, 2005; Li, et al., 2007).
Tal como supracitado, quando actua como antioxidante ou cofactor enzimtico,
o AA oxidado em DHA. Para ambos os sistemas que medeiam o transporte do AA e
do DHA, as taxas de uptake inicial saturam com o aumento da concentrao de
substrato externo, reflectindo interaces de elevada afinidade que podero ser
robustamente modeladas pela cintica de Michaelis-Menten. A equao de MichaelisMenten (1) descreve a relao quantitativa entre a velocidade inicial V0, a velocidade
mxima Vmx, a concentrao inicial de substrato [S] e a constante de Michaelis Km, que
representa a concentrao de substrato necessria para atingir metade da Vmx,
medindo a afinidade de uma enzima pelo substrato (Wilson, 2005; Mariotto, 2006).
(1)
1.2.2.1.
Transporte indirecto via GLUTs
O DHA passa atravs da membrana por um mecanismo especfico de difuso

facilitada, transporte a favor do gradiente, mediado pelos GLUT. Este mecanismo
usado indirectamente pela clula para transportar a forma reduzida da vitamina C, o
AA, para o seu interior, atravs de trs passos: oxidao extracelular do AA com
formao de DHA, seguida do transporte do DHA pelos GLUT para o interior da clula
e, posteriormente, a reduo intracelular do DHA em AA (Figura 2). Este processo
desenrola-se devido ao facto da glicose inibir a captao de AA, mas no o de DHA.
Contudo, verifica-se uma competio entre as molculas de DHA e glicose pelas GLUT,
a qual dependente do tipo de clulas em questo e, consequentemente, interfere na
captao de ambas. Alm da inibio pela glucose, os GLUT esto tambm sujeitos a
um controlo hormonal (Wilson, 2005; Li, et al., 2007).
Figura 2 - Mecanismo de transporte da vitamina C pelas GLUT. No meio extracelular o AA

oxidado a DHA. O DHA importado pelos GLUT a favor do gradiente de concentrao e
novamente reduzido a AA no interior da clula. Retirado de (Li, et al., 2007).
Introduo
Tendo por base a afinidade do DHA para os GLUT, estudos realizados

comprovam que entre as vrias isoformas GLUT, as GLUT1 e GLUT3 so responsveis
pelo influxo do DHA. Estas esto essencialmente presentes nos osteoblastos, clulas
musculares e retinianas, mediando assim o influxo de DHA nas mesmas. As GLUT1 so
tambm expressas nas clulas endoteliais da barreira hemato-enceflica e podero ser
parcialmente responsveis pela acumulao da vitamina C no crebro o que, no
entanto, se torna insignificativo face acumulao da mesma pelos SVCT (Wilson,
2005; Li, et al., 2007).
de suma importncia referir que o mecanismo de difuso facilitada pelas
GLUT tem sido implicado na proteco contra o stresse oxidativo, assunto que ser
abordado com maior detalhe posteriormente (Wilson, 2005; Li, et al., 2007).
1.2.2.2.
Transporte directo via SVCTs
Como referido anteriormente, a vitamina C pode ser directamente

transportada para o interior das clulas por mecanismos de transporte activo
controlado pelas SVCT (Figura 3). Baseado nos valores de constantes Km, os SVCT tm
maior afinidade para o AA do que os GLUT e so, por isso, considerados os
transportadores com maior afinidade para a vitamina C. Este mecanismo um
exemplo de transporte activo secundrio, visto que permite o transporte do AA
atravs da membrana celular, a favor do gradiente electroqumico de sdio, mantido
pela bomba sdio-potssio (Wilson, 2005; Li, et al., 2007).
Figura 3 - Mecanismo de transporte da vitamina C pelos SVCT. O AA transportado por um

mecanismo de transporte acoplado ao sdio. Consequentemente, o excesso de sdio
intracelular activamente exportado por troca de potssio extracelular atravs da bomba
sdio-potssio ATPase. Retirado de (Li, et al., 2007).
Tal como os GLUT, os SVCT possuem duas isoformas: SVCT1 e SVCT2, cuja
anlise revela que o SVCT2 tem maior afinidade, porm, menor capacidade de
transporte do AA que o SVCT1. Contudo, ainda desconhecido se esta caracterstica
do SVCT1 uma propriedade inerente mesma ou se simplesmente resultado da
existncia desta protena em maior concentrao na membrana plasmtica do que o
SVCT2. Para alm desta diferena, estas duas isoformas possuem tambm
distribuies e funes distintas: o SVCT1 expressa-se predominantemente nas clulas
epiteliais, nomeadamente do intestino, rim e fgado, e pode transportar quantidades
de ascorbato superiores s necessidades destas clulas. Por outro lado, o SVCT2 est
presente em clulas especializadas e metabolicamente activas, tais como, clulas do
crebro, olho e placenta e pensa-se estar envolvido na manuteno dos nveis
intracelulares de vitamina C vitais para a funo neuronal e proteco contra o stresse
10
Introduo
oxidativo. De realar que a maior capacidade de transporte do SVCT1 apropriada s

clulas epiteliais que transportam quantidades de AA superiores s que necessitam
para o seu uso interno. Por outro lado, as afinidades de ambas as protenas so
suficientemente elevadas para permitir s clulas absorver eficazmente o AA do fluido
extracelular onde, na maioria dos tecidos, excepto estmago, olho e sistema nervoso
central, a concentrao de AA aproximadamente os 20 80 M normalmente
encontrados no plasma (Wilson, 2005; Li, et al., 2007).
O cotransporte do AA dependente de sdio pode ser cineticamente regulado
pela alterao das concentraes dos substratos transportados ou pelo potencial de
membrana. A expresso do SVCT1 atenuada por elevadas concentraes de AA in
vitro. Consequentemente, a subregulao do SVCT1 pode limitar a concentrao
mxima de vitamina C plasmtica atingvel por ingesto oral. De modo semelhante, o
SVCT2 sensvel a alteraes dos nveis intracelulares de AA, o que poder
desempenhar um papel regulador na manuteno da homeostase do AA no interior da
clula (Wilson, 2005; Li, et al., 2007).
medida que a concentrao intracelular do AA aumenta a nveis
farmacolgicos, a taxa de transporte do mesmo atenuada. Consequentemente, os
nveis fisiolgicos normais do AA so restabelecidos, o que constitui um obstculo s
estratgias de obteno de doses elevadas de vitamina C, tendo em vista a proteco
antioxidante e/ou outro benefcio clnico conferido pela mesma. Uma consequncia
importante da regulao do substrato poder ser a maior eficincia verificada na
absoro ao nvel do intestino, na conservao pelo rim e na captao pelas clulas
alvo de doses descontinuadas, mais do que a eficincia revelada com a administrao
contnua de AA. Tal como referido anteriormente, o fluxo de AA pode tambm ser
11
controlado por alteraes do potencial de membrana, na medida em que os

transportadores SVCT implicam o envolvimento de dois caties sdio para cada anio
ascorbato transportado. As variaes do potencial de membrana conduzem
alterao do gradiente electroqumico e, consequentemente, da energia livre do
sistema de transporte. Mais particularmente, a despolarizao da membrana abranda
a captao de AA para o interior da clula (Wilson, 2005; Li, et al., 2007).
Para alm dos factos referidos, o transporte do AA pode tambm ser regulado
pelo pH, sendo 7,5 o valor considerado ptimo para que ocorra o transporte atravs
dos SVCT. Isto , a acidificao dos meios extracelular e/ou citoplasmtico inibe o
transporte do AA, visto que a potncia dos protes excede aquela que pode ser
explicada pela protonao do ascorbato; assim sendo, os protes inibem os sistemas
de transporte podendo actuar directamente nas protenas transportadoras, reduzindo
assim, a afinidade das mesmas para o ascorbato (Wilson, 2005).
deveras importante enfatizar que os mecanismos de transporte da vitamina C
variam conforme os tipos celulares em questo, nas quais o transporte pode ser
alterado consoante a afinidade de ligao do substrato, a capacidade de translocao
de cada transportador ou o nmero de protenas transportadoras presentes na
membrana plasmtica (Wilson, 2005; Li, et al., 2007).
Em suma, os dois maiores transportadores de vitamina C, os GLUT e os SVCT,
regulam os nveis da mesma, tendo por isso que ser considerados em tratamentos que
tm como objectivo atingir nveis elevados de vitamina C intracelular. Mtodos
alternativos de administrao de vitamina C, tais como a administrao intravenosa
(i.v.), permitem aumentar temporariamente a concentrao efectiva de vitamina C
intracelular a nveis farmacolgicos. Por outro lado, tratamentos que alteram a
12
Introduo
actividade dos transportadores de vitamina C especficos podem potenciar a

acumulao localizada de ascorbato e por isso ser utilizados em casos em que o alvo
da terapia um tecido especfico. Contudo, algumas destas estratgias requerem o
conhecimento mais aprofundado da actividade fisiolgica e distribuio nos tecidos
dos vrios transportadores in vivo (Li, et al., 2007).
1.3. Vitamina C & Cancro

O cancro um problema global de sade pblica com nveis de mortalidade
acrescidos nos ltimos anos (Figura 4). Durante as ltimas trs dcadas, tentativas
extensivas tm sido feitas tendo em vista o tratamento do cancro e,
consequentemente, os considerveis benefcios para o doente que se podero atingir
(Lee, et al., 2003).
Figura 4 - Total de mortes por ano devido a cancro nos Estados Unidos nos anos 1971 e 2002.
Retirado de (Lee, et al., 2003).
A eficcia das terapias antitumorais padro como a cirurgia, a quimioterapia e a

radioterapia, parece ter atingido um patamar. Consequentemente, abordagens
adicionais e inovadoras para o tratamento do cancro devero ser desenvolvidas. Uma
13
das promissoras abordagens que se tem evidenciado relaciona-se com as vitaminas

antioxidantes, de tal forma que nos ltimos anos, o seu potencial quimiopreventivo
tem sido consideravelmente analisado. Estudos epidemiolgicos e laboratoriais
indicam que um elevado consumo de vegetais e frutos ricos em antioxidantes podero
diminuir o risco de cancro. Paralelamente, elevadas concentraes destes inibem o
crescimento de vrias clulas tumorais, reduzem a toxicidade nas clulas normais e
melhoram o efeito dos agentes teraputicos in vitro e in vivo. Contudo, os aspectos
crticos do uso de doses elevadas de antioxidantes em combinao com a radio e a
quimioterapia residem essencialmente no receio de que as vitaminas antioxidantes
protejam tanto as clulas normais como as tumorais dos radicais livres produzidos pela
irradiao e pela maioria dos agentes quimioteraputicos. No entanto, tais
preocupaes j foram consideradas invlidas com base em vrios estudos
experimentais e/ou clnicos realizados e publicados (Moss, 2006; Walingo, 2005; Lee,
et al., 2003; Prasad, et al., 1999).
No que diz respeito aos mecanismos de aco dos antioxidantes, sabido que
muito ainda h para explorar; contudo, existem dados considerveis que permitem
sugerir que determinados antioxidantes, administrados sob circunstncias controladas,
podero significativamente aliviar os efeitos indesejveis das j referidas terapias, e
longe de prejudicar os seus benefcios, podero mesmo contribuir para a melhoria das
mesmas. Cada vez mais doentes tm usado suplementos nutricionais que incluem
antioxidantes a par das terapias convencionais. De facto, 60% dos doentes portadores
de cancro usam vitaminas, e tm reportado melhor qualidade de vida do que os
restantes (Deuter; Moss, 2006; Walingo, 2005; Lee, et al., 2003).
14
Introduo
Os antioxidantes protegem o organismo da exposio a factores ambientais e a

radicais livres destrutivos, produzidos aquando da utilizao do oxignio para produzir
energia. O efeito dos antioxidantes no crescimento, diferenciao e morte das clulas
tumorais tem sido estudado em modelos de culturas celulares, em modelos animais
com tumores, nomeadamente, em ratinhos atmicos e em doentes com determinado
tipo de tumores. Estes estudos tm revelado que as vitaminas, quando usadas
isoladamente, podem induzir apoptose selectiva e inibir ou estimular o crescimento
das clulas cancergenas, dependendo da concentrao. Estes efeitos dependem do
tipo, forma, taxa de administrao e concentrao das vitaminas e do tipo de tumor
(Moss, 2006; Walingo, 2005; Lee, et al., 2003; Prasad, et al., 1999).
A vitamina C tem sido considerada um dos mais importantes antioxidantes, e
consequentemente, das vitaminas com maior potencial para a terapia do cancro.
Assim, o seu estudo tem incidido essencialmente em duas vertentes: os efeitos de
elevadas concentraes de AA no desenvolvimento e progresso de tumores e os
mecanismos de aco que podero contribuir para o seu efeito anti-cancergeno.
Apesar de ter uma histria bastante controversa na terapia do cancro, contudo, cada
vez mais se considera o AA um importante agente teraputico para o tratamento do
cancro (Gonzlez, et al., 2005; Li, et al., 2007).
Alguns estudos em doentes portadores de cancro evidenciam que a
concentrao de vitamina C plasmtica est inversamente relacionada com a
mortalidade devido a cancro. Contudo, resultados contraditrios tm tambm sido
reportados. A inconsistncia da correlao vitamina C cancro e a escassez de dados
validados para a sua aco teraputica tm sido pontos de impedimento
15
exequibilidade do uso da vitamina C no tratamento e preveno do cancro (Gonzlez,

et al., 2005; Li, et al., 2007; Walingo, 2005).
A ideia do uso da vitamina C como agente teraputico foi inicialmente proposta
h cerca de 50 anos atrs por McCormick, que postulou que o AA conferia proteco
contra o cancro pela sua aco no aumento da sntese de colagnio. Posteriormente,
Cameron et al. num estudo controverso mostrou que a administrao de elevadas
concentraes de AA contribua para a reduo do crescimento de vrios tumores
humanos, assim como, para o aumento do tempo de sobrevivncia de doentes com
cancro terminal. Cameron e Campbell em 1974 publicaram um estudo que inclua 50
pacientes, de entre os quais alguns pareceram demonstrar benefcios do tratamento
com elevadas doses de AA em administrao contnua por via intravenosa (i.v.) e oral.
Cameron e Pauling continuaram os estudos, mas agora em doentes nos quais a terapia
convencional se mostrou ineficaz. Concluram ento que doses elevadas de AA
aumentavam a sobrevivncia e contribuam para a melhoria da qualidade de vida e
bem-estar (Cameron, et al., 1974; Padayatty, et al., 2005; Li, et al., 2007; Padayatty, et
al., 2006).
A inconsistncia do potencial teraputico da vitamina C surgiu em
consequncia dos estudos realizados por Cameron no terem sido randomizados nem
ter havido um grupo controlo, levando sua no-aceitao pela comunidade cientfica.
Paralelamente, Moertel efectuou dois estudos, estes sim randomizados e incluindo
grupo controlo, com cerca de 100 doentes com cancro em estado avanado, aos quais
foram administradas doses elevadas de AA via oral. Os resultados por Moertel obtidos
no revelaram quaisquer benefcios para os doentes. Ambos os factos conduziram
16
Introduo
durante anos descredibilizao do efeito teraputico da vitamina C (Padayatty, et al.,

2004; Padayatty, et al., 2005; Padayatty, et al., 2006; Li, et al., 2007).
Contudo, novos conhecimentos da farmacocintica e da farmacodinmica do
AA, assim como, a disponibilidade de novos dados clnicos tm permitido uma
compreenso mais completa destes aspectos crticos, na medida em que tm
aperfeioado a compreenso, tanto da regulao dos mecanismos de transporte da
vitamina C, como da evidncia da eficcia teraputica da mesma, estimulando o
interesse da reavaliao da sua aplicao na preveno e tratamento do cancro
(Padayatty, et al., 2001; Chen, et al., 2005; Gonzlez, et al., 2005; Li, et al., 2007).
1.3.1.
Administrao i.v. vs. oral
Tal como citado anteriormente, aps Cameron, Campbell e Pauling reportarem

efeitos benficos do uso de elevadas doses de vitamina C no tratamento do cancro,
estudos clnicos aleatrios realizados por Moertel no apresentaram quaisquer
benefcios para os doentes, e consequentemente, o potencial teraputico do AA foi
julgado como ineficaz, e descartado. Porm, um facto de extrema relevncia pode
explicar os resultados contraditrios: as diferentes concentraes de vitamina C
plasmtica atingidas por diferentes mtodos de administrao. Nos estudos de
Cameron et al. a vitamina C foi administrada via i.v. e oral, enquanto nos estudos de
Moertel foi administrada unicamente por via oral, o que invalida a comparao dos
resultados (Padayatty, et al., 2004; Padayatty, et al., 2005; Li, et al., 2007).
As taxas de administrao oral ou i.v. podem produzir concentraes
plasmticas de vitamina C substancialmente diferentes. Resultados obtidos em
17
estudos farmacocinticos realizados em pessoas saudveis demonstram que, quando

administrada oralmente, as concentraes plasmticas de vitamina C so
restritamente controladas. Tanto a toma de suplementos orais como a ingesto de
alimentos ricos em vitamina C no alteram em grande escala os valores normais das
concentraes plasmticas da mesma. O consumo de frutos ou vegetais 5 a 9 vezes
por dia permite atingir concentraes plasmticas de 80 M ou at menos; mesmo
com a administrao oral diria de 3 g (em 6 vezes) os valores no excedem os 220
M. Por outro lado, doses intravenosas podero originar concentraes 30 a 70 vezes
superiores ao mximo de doses orais toleradas, isto , pode atingir concentraes
superiores a 15000 M. Esta discrepncia pode ser devida ao facto da administrao
oral ser limitada pela eliminao do excesso de AA pelos rins. Por sua vez, a injeco
i.v. como prescinde do sistema de reabsoro renal, permite a obteno de
concentraes de AA plasmtico muito mais elevados. De referir que ambos os
resultados tm relevncia clnica, visto que estudos realizados mostram que possvel,
in vivo e por injeco i.v., manter os nveis de AA suficientemente elevados para que
este possa actuar como um agente teraputico (Padayatty, et al., 2004; Li, et al., 2007).
Estudos in vitro revelam que concentraes fisiolgicas de AA (0,1 mM) no
mostraram quaisquer efeitos nem em clulas tumorais nem em normais. Todavia, em
concentraes farmacolgicas (0,3-20 mM), atingveis in vivo via i.v., o AA mata
selectivamente clulas tumorais. Esta aco citotxica explicada pela propriedade
pr-oxidante da vitamina C, a qual, em concentraes elevadas, medeia a produo de
espcies reactivas de oxignio (ROS reactive oxygen species), que actuam como
potentes oxidantes intracelulares (Li, et al., 2007).
18
Introduo
1.3.2.
Stresse Oxidativo
Paralelamente, e correlacionados com os estudos clnicos que tm sido feitos

para avaliar os efeitos anti-cancergenos das elevadas doses da vitamina C, estudos
experimentais tm sido desenvolvidos, com o objectivo de investigar os mecanismos
de aco do AA que contribuem para o seu efeito teraputico. Estes estudos incluem
as funes antioxidante e pr-oxidante da vitamina C, a sua capacidade de modular a
transduo de sinal e a expresso gnica, e o seu potencial papel citotxico nas
metstases tumorais. Embora a vitamina C seja conhecida por estimular a funo
imunitria, inibir a formao de nitrosaminas e bloquear a activao metablica de
carcinogneos, os seus efeitos preventivos podero estar sobretudo associados
proteco contra o stresse oxidativo. Em concentraes fisiolgicas, a vitamina C um
potencial removedor de radicais livres no plasma, protegendo as clulas de leso
oxidativa causada pelas espcies reactivas de oxignio (Li, et al., 2007; Lee, et al., 2003;
Valko, et al., 2007; Ribeiro, 2000; Lutsenko, et al., 2002)).
Radicais livres podem ser definidos como molculas ou fragmentos de
molculas contendo um ou mais pares de electres desemparelhados em orbitais
atmicas ou moleculares, o que usualmente lhes confere um grau de reactividade
qumica elevado (Valko, et al., 2007).
As ROS, tais como perxido de hidrognio (H2O2), radical superxido (O2-),
radical hidroxilo (OH) e o oxignio singleto (1O2) so produtos do metabolismo celular
normal, produzidos pelas clulas por vrias vias, sendo o seu maior produtor a
mitocndria. Mais especificamente, so normalmente produzidas por enzimas
altamente reguladas, como as isoformas das NADPH oxidase, embora a sobreproduo
19
das ROS resulte, essencialmente, da reduo incompleta do oxignio na cadeia

respiratria mitocondrial. Aqui ocorre o transporte de electres, atravs de vrios
complexos enzimticos, com reduo de oxignio a gua e consequente sntese de
ATP. A reduo incompleta do oxignio ou a estimulao excessiva da NADPH oxidase
por citocinas so ento mecanismos responsveis pela formao destas espcies
reactivas (Lee, et al., 2003; Valko, et al., 2007).
As ROS, apesar de reactivas, possuem uma semi-vida biolgica curta e,
consequentemente, uma aco a nvel celular de carcter transitrio. A Figura 5
apresenta algumas das reaces de formao das ROS. A presena de metais de
transio descompartimentalizados conduz formao do radical hidroxilo altamente
reactivo, pelas reaces de Fenton (eq. 2) e Haber-Weiss (eq. 3) (Valko, et al., 2007;
Ribeiro, 2000).
Figura 5 - Formao das ROS e sua relao com os sistemas biolgicos. Esto ainda
representadas as defesas antioxidantes enzimticas, a superxido dismutase (SOD) e a catalase
(CAT), responsveis pela destoxificao do radical superxido (O2 ) e do perxido de hidrognio
(H2O2), respectivamente.
20
Introduo
H2O 2 + Fe 2 +
OH + Fe 3 + + OH
(2)
Fe 3 + + O 2 Fe 2 + + O 2
(3)
As ROS e o stresse oxidativo (SO) tm sido implicados em mltiplos processos

fisiolgicos, tais como, no envelhecimento, na activao de vias de transduo de sinal
envolvidas no crescimento, diferenciao e morte celular, na funo imunitria e em
vrias doenas, como a aterosclerose e o cancro. Alguns destes processos esto
relacionados com a concentrao das ROS e, consequentemente, com o nvel de SO.
Em baixas concentraes, as ROS podem induzir a proliferao celular, enquanto que
em elevadas concentraes podem activar vias de sinalizao celular que conduzem
paragem do ciclo celular e morte celular por apoptose e/ou necrose (Figura 6)
(McEligot, et al., 2005; Li, et al., 2007; Ribeiro, 2000).
A apoptose um processo de morte celular programada, resultado da
activao de um programa gentico de suicdio celular, dependente de ATP (trifosfato
de adenosina). So caractersticas de morte por apoptose a retraco de volume, a
formao de blebs na membrana plasmtica, que se mantm ntegra, e a
fragmentao nuclear com formao de corpos appticos. Pelo contrrio, a necrose
um tipo de morte celular muito mais violenta, que ocorre quando a clula exposta a
um estado de stresse extremo; neste caso, a membrana plasmtica destruda, o
contedo citoplasmtico extravasa para o exterior e apenas o ncleo mantm a sua
integridade (Ribeiro, 2000).
21
Figura 6 - Participao do stresse oxidativo na proliferao e morte celular. Retirado de

(Ribeiro, 2000).
O balano entre ambos os efeitos das ROS obtido por mecanismos de

regulao redox, responsveis pela proteco dos seres vivos do stresse oxidativo e
manuteno do equilbrio redox, permitindo o funcionamento celular normal. Em
condies patolgicas o estado redox da clula pode ser alterado para valores
divergentes dos normais , originando o estado de doena (Li, et al., 2007; Lee, et al.,
2003; Valko, et al., 2007).
1.3.2.1.
Efeito antioxidante
Como vimos, apesar da produo de ROS resultantes do metabolismo celular, a

homeostasia mantida por sistemas que envolvem: mecanismos de preveno, de
reparao, defesas fsicas e defesas antioxidantes enzimticas e no-enzimticas. As
defesas antioxidantes enzimticas incluem: a superxido dismutase (SOD) enzima
responsvel pela dismutao do O2-, a peroxidase do glutatio (GPx) que actua na
remoo do H2O2, a catalase (CAT) responsvel pela destoxificao do H2O2. Por outro
22
Introduo
lado, as no-enzimticas so, entre outras, o AA, o -tocopherol (vitamina E), a

glutationa reduzida (GSH), os carotenides e os flavonides (Valko, et al., 2007).
Um elevado estado oxidativo no interior da clula pode ser extremamente
nocivo, resultando na produo de radicais livres, que por sua vez conduzem
peroxidao lipdica, mutaes do ADN implicadas na iniciao de tumores, e
nitrosilao e formao de ligaes dissulfeto em protenas. Por sua vez, o aumento da
produo de ROS causado pela exposio a agentes carcinognicos, actuando nas
clulas normais, pode resultar na iniciao, promoo e consequente progresso do
cancro e outras doenas degenerativas (Figura 7) (Li, et al., 2007; Lee, et al., 2003).
Figura 7 Relao entre o nvel de stresse oxidativo e os processos de promoo do tumor, de

mutagnese e de apoptose/necrose. Retirado de (Valko, et al., 2007).
O desequilbrio redox celular induzido pelo stresse oxidativo relaciona-se com a

estimulao oncognica, visto ter sido descoberto estar presente em vrias clulas
cancergenas em comparao com clulas normais. Como referido anteriormente as
ROS lesam o ADN e interferem na expresso de alguns genes envolvidos na regulao
de vrias vias de transduo de sinal, podendo estar implicadas no processo de
carcinognese. Consequentemente, os antioxidantes podero ajudar a prevenir e
23
tratar o cancro por vrios mecanismos, tais como, pela preservao da regulao do
ciclo celular normal, pela inibio da proliferao celular anmala e induo da
apoptose, pela inibio da invaso tumoral, angiognese e inflamao (Valko, et al.,
2007).
Como antioxidante, o principal papel da vitamina C neutralizar os radicais
livres, pois estes necessitam de um par de electres para recuperar a sua estabilidade.
Como a vitamina C uma excelente fonte de electres pode doar-lhes electres e
extinguir a sua reactividade, reflectindo desta forma a sua capacidade como agente
redutor, reduzindo potencialmente o stresse oxidativo. Este mecanismo manifesto
numa srie de funes citopreventivas sob condies fisiolgicas, as quais incluem a
preveno de mutaes do ADN, impedindo a oxidao das bases, a proteco dos
lpidos membranares da leso peroxidativa e a reparao de resduos aminocidos
oxidados mantendo assim a integridade proteica. Tendo em conta, que as mutaes
do ADN so as maiores responsveis pelo desenvolvimento do cancro, a atenuao da
oxidao
intracelular
pela
vitamina
constitui
um
potencial
mecanismo
anticancergeno (Li, et al., 2007; Lee, et al., 2003).
1.3.2.2.
Efeito pr-oxidante
Paradoxalmente, estudos em vrias linhas celulares diferentes revelam que

elevadas concentraes de AA produzem efeitos citotxicos associados inibio da
proliferao celular. Estes estudos tm associado este efeito citotxico do AA ao facto
deste poder desempenhar funes como pr-oxidante, isto , promovendo o stresse
oxidativo. A actividade pr-oxidante da vitamina C pode ocorrer devido presena de
24
Introduo
metais livres de transio como o cobre e o ferro. Assim, o AA in vitro reduz o io ferro
livre, o qual pela reaco de Fenton (eq. 2) produz radicais hidroxilo a partir de H2O2.
Este radical, extremamente reactivo, reage rapidamente com macromolculas
celulares crticas, como o ADN, o que poder originar a mutagnese e consequente
iniciao do cancro. O potencial pr-oxidante intrnseco da vitamina C poder
contribuir para as suas propriedades citotxicas selectivas, visto que se revela ser mais
evidente em clulas tumorais causando a sua morte (Gonzlez, et al., 2005; Li, et al.,
2007; Lee, et al., 2003).
Sumariamente, as funes da vitamina C como pr-oxidante e/ou antioxidante
so determinadas, pelo menos, por trs factores: o potencial redox no ambiente
celular, a presena ou ausncia de metais de transio e as concentraes locais de AA
(Li, et al., 2007).
1.3.3.
Citotoxicidade selectiva
Para alm das vantagens supracitadas, a vitamina C possui outras vantagens

que a distinguem de outros agentes quimioteraputicos. Alm de matar
preferencialmente as clulas neoplsicas, no suprime o sistema imunitrio, como
outros agentes citotxicos, nem provoca a supresso da medula ssea. Para alm
disso, aumenta a resistncia animal e humana a agentes infecciosos, melhorando a
linfopoiese e a imunidade celular, a actividade bactericida dos neutrfilos e a
modulao de protenas complementares. Refere-se tambm a sua importncia no
fortalecimento da integridade estrutural da matriz extracelular, a qual responsvel
pela resistncia do estroma invaso por clulas malignas (Riordan, et al., 1994).
25
Dados
recentemente
obtidos
revelam
algumas
informaes
deveras
importantes para a abordagem deste trabalho. Estudos in vitro mostram que

concentraes farmacolgicas de AA (0,3-20 mM) matam as clulas tumorais,
preservando as clulas normais (efeito verificado em vrias linhas celulares diferentes).
Esta resposta anti-cancergena selectiva dependente do tempo de incubao do AA e
da sua concentrao extracelular, sendo independente da concentrao intracelular do
mesmo. Quanto ao mecanismo de transporte da vitamina C nas clulas tumorais, sabese que efectuado somente pelos GLUT. Por outro lado, a morte celular pode
depender da formao de ROS mediada pela oxidao metablica do AA em DHA. De
referir que as concentraes de AA necessrias para este efeito citotxico selectivo
podem ser atingidas por administrao i.v. e em condies que reflectem um potencial
uso clnico (Agus, et al., 1999; Chen, et al., 2005; Riordan, et al., 1994; Padayatty, et al.,
2005; Li, et al., 2007).
Apesar de tudo, o mecanismo de citotoxicidade selectiva ainda no
conhecido; no entanto, existem algumas possibilidades que incluem a estimulao das
vias apoptticas e o dano pr-oxidante acelerado que no pode ser reparado pelas
clulas tumorais. Estes factores esto estreitamente relacionados com vrias
propriedades intrnsecas das clulas tumorais, nomeadamente, a diminuio das
concentraes de enzimas antioxidantes (como a catalase e a SOD), o aumento da
disponibilidade de metais de transio e o aumento da oxidao do AA que em
elevadas concentraes plasmticas, associado sobrexpresso das GLUT, promove a
acumulao do metabolito instvel DHA, o que poder ser txico. Todas estas
propriedades intrnsecas contribuem para o incremento das concentraes
intracelulares de ROS (Padayatty, et al., 2005; Li, et al., 2007).
26
Introduo
Assim, o aumento da produo de ROS mediado pela vitamina C, associado

deficincia da actividade da catalase nas clulas neoplsicas e deficincia de metais
de transio descompartimentalizados poder redundar na citotoxicidade selectiva da
vitamina C e consequente revelao do seu potencial teraputico (Gonzlez, et al.,
2005; Drisko, et al., 2003; Riordan, et al., 1997).
27
Captulo II
2. Mtodos
Mtodos
O potencial teraputico da vitamina C tem vindo a ser, cada vez mais, alvo de
ateno por muitos autores, adquirindo maior nfase na ltima dcada. Todavia, os
mecanismos de citotoxicidade selectiva ainda no so conhecidos, o que abre caminho
para novos estudos que forneam conhecimento sobre os mesmos.
No presente trabalho, pretende-se avaliar a citotoxicidade das duas formas da
vitamina C, recorrendo a estudos bioqumicos e imagiolgicos.
Para tal, pretendeu-se desenvolver uma formulao farmacutica, pela
marcao radioactiva da forma reduzida do cido ascrbico (AA) com
99m
Tc, com a
optimizao das diferentes condies, para obteno de um elevado grau de pureza

radioqumica. Aps obteno do complexo marcado (99mTc-AA), pretendeu-se realizar
estudos com imagiologia
99m
Tc-AA, com o intuito de averiguar a presena intra e
extracelular da vitamina C, usando uma linha celular de adenocarcinoma do clon

(WiDr), estudos que puderam ser complementados com estudos de estabilidade das
duas formas da vitamina C, por HPLC.
Paralelamente, pretendeu-se avaliar a citotoxicidade do AA e do cido
dehidroascrbico (DHA) em clulas de adenocarcinoma do clon (WiDr), recorrendo a
diversos mtodos bioqumicos, nomeadamente, colorimetria e citometria de fluxo.
Desta forma, pretendeu-se avaliar a proliferao, viabilidade e morte celular, assim
como, possveis intervenientes nos mecanismos responsveis pela citotoxicidade da
vitamina C, tais como, espcies reactivas de oxignio e o potencial de membrana
mitocondrial.
31
2.1. Estudos de Qumica

2.1.1.
Preparao do 99mTc-AA
A marcao radioactiva do cido ascrbico necessita da adio de um agente

redutor, previamente mistura com o
99m
Tc, constituindo-se assim uma formulao
farmacutica. Para a constituio desta formulao, usmos inicialmente o cloreto de

estanho dihidratado (SnCl2.2H2O); contudo, este agente redutor tornou-se ineficaz,
pelo que foi abandonado, dada a reduzida pureza radioqumica e estabilidade
temporal do composto obtido. Posteriormente, testou-se o cloreto de ferro (III) (FeCl3),
o que permitiu atingir valores de estabilidade muito maiores. A optimizao desta
marcao radioactiva foi obtida aps variao da concentrao do ligando e do agente
redutor, da actividade do radionuclido, da temperatura e do pH. Aps a avaliao
destas condies, desenvolvemos uma metodologia de marcao em duas fases. Na
primeira fase, actividade de 296-370 MBq de pertecnetato de sdio (99mTcO4Na),
num volume de 3 mL, adicionaram-se, em frasco previamente argonado, 0,2 mL de
FeCl3 0,1 N (em HCl 0,1 N). Na segunda fase, 200 mg de cido ascrbico (A5960, Sigma)
so adicionados soluo inicialmente obtida. Aps leve agitao, o pH foi levado a
6,5 pela adio de 1,2 mL de uma soluo de NaOH 1 M, o que foi confirmado pelo
mtodo de comparao de cores (pH-Fix 4.5-10.0, Machenerey-Nagel). Todo o
procedimento de marcao decorreu em atmosfera argonada e com proteco da luz
e, aps marcao, a soluo foi mantida a 0 oC durante pelo menos 3 horas.
32
Mtodos
2.1.2.
Controlo de Qualidade do 99mTc-AA
Posteriormente ao processo de marcao da forma reduzida da vitamina C, foi

realizado o controlo de qualidade com o objectivo de determinar a pureza
radioqumica do complexo. A pureza radioqumica de um radiofrmaco a fraco da
radioactividade na forma qumica desejada em relao radioactividade total. As
impurezas radioqumicas so decorrentes da possvel ineficincia do processo de
marcao, resultando da decomposio do complexo devido a aces do solvente,
mudanas de temperatura ou pH, aco da luz, presena de agentes redutores ou
oxidantes, e radilise dos constituintes. Exemplos destas so o tecncio livre (99mTcO4-)
e o tecncio reduzido e hidrolizado (99mTc-RH). O 99mTcO4- a forma resultante do facto
de no ter sido reduzido pelo agente redutor ou de estar em maior quantidade
estequiomtrica relativamente ao ligando. O
99m
Tc-RH constitui complexos
hidrofbicos e coloidais de tecncio reduzido e hidrolizado no ligado provenientes da

hidrlise do pertecnetato, sendo a principal causa deste facto o excesso de agente
redutor. A presena destes compostos na soluo do radiofrmaco resulta na
diminuio da qualidade das imagens devido diferente biodistribuio das impurezas
radioqumicas em relao ao complexo marcado, donde resulta uma elevada
actividade no sangue e nos tecidos, que constitui a actividade de fundo. Para alm
disso, redunda em irradiaes desnecessrias, com o consequente aumento da
dosimetria no paciente (Robbins, 1984; Saha, 2003).
A pureza radioqumica foi determinada recorrendo a dois mtodos
cromatogrficos: o HPLC High Performance Liquid Chromatography (cromatografia
lquida de alta preciso) e a microcromatografia ascendente em camada fina.
33
A cromatografia um processo fsico de separao baseado na distribuio dos

componentes de uma mistura entre uma fase estacionria e uma fase mvel
(solvente), tendo em conta as afinidades fsico-qumicas entre os componentes e as
fases.
2.1.2.1.
HPLC
A cromatografia lquida de alta preciso um mtodo de separao de

substncias, que constitui uma ferramenta de anlise baseada em princpios de
cromatografia de camada fina e cromatografia de coluna, cujo desempenho tem sido
optimizado em termos de resoluo, deteco, quantificao e tempo de anlise. Isto
, ao invs de, ao longo de uma coluna, o solvente gotejar impelido pela fora da
gravidade, este forado a tal sob elevadas presses, superiores a 400 atmosferas, o
que diminui o tempo de anlise do composto. Esta optimizao inclui tambm a
utilizao de partculas de tamanho mais reduzido no material de enchimento da
coluna, melhorando a rea de superfcie na qual se daro as interaces entre a fase
estacionria (coluna) e a fase mvel (solvente). So precisamente as foras
intermoleculares entre a amostra e a fase estacionria, e entre a amostra e a fase
mvel, que permitem a separao dos componentes das amostras. Assim, a coluna
retm os componentes que interagem mais fortemente com esta, enquanto aqueles
que possuem menor afinidade qumica so arrastados pela fase mvel e, por isso,
primeiramente detectados. Contudo, para que o processo se desenvolva essencial
que o solvente apresente caractersticas especficas. Assim sendo, imprescindvel que
a fase mvel dissolva a amostra sem que ocorram quaisquer interaces qumicas
34
Mtodos
entre elas, possua elevado grau de pureza (para que se possam fazer anlises de
elevada sensibilidade), seja compatvel com o detector utilizado e que possua
polaridade adequada para a separao dos componentes da amostra.
Dos vrios tipos de HPLC disponveis, usmos o HPLC de fase-reversa, no qual
se utiliza uma fase estacionria no polar, e fases mveis aquosas moderadamente
polares, como o caso da gua misturada com solventes orgnicos miscveis, de que
so exemplo o metanol e o acetonitrilo. Por vezes, para obter uma separao ptima
dos vrios componentes da amostra, usam-se dois solventes. Neste caso, necessrio
ajustar-se um gradiente entre os dois com o intuito de obter a melhor separao. Aps
a passagem da amostra pela coluna necessrio fazer a deteco dos seus
componentes, a qual pode ser realizada por espectrofotometria, electroqumica,
fluorescncia, espectrofotometria de massa, deteco de eventos por cintilao, entre
outros. No existe nenhum detector cujas propriedades o tornem ideal, e por isso no
so versteis nem universais, no entanto, possuem propriedades especficas da
aplicao a que se destinam. Na anlise de radiofrmacos, tanto o monitor ultravioleta
(UV) como o detector de radiao so frequentemente usados para medir a
concentrao dos diferentes componentes da amostra. O monitor UV mede a
absorvncia de luz do eluato, a qual proporcional concentrao do soluto presente
no mesmo. O detector de radiao usado para medir a concentrao dos
componentes radioactivos no eluato. A maioria dos monitores de deteco por
radioactividade possui cristais cintiladores entre dois fotomultiplicadores de elevada
eficincia de contagem. Os sinais medidos por estes so amplificados e,
posteriormente, quantificados. Esta quantificao efectuada por um processo de
integrao grfica das deteces, por cintilao, obtidas (cromatograma). O
35
cromatograma obtido pela relao entre o valor real da deteco da substncia e o

seu tempo de reteno. Por sua vez, o tempo de reteno o tempo que o composto
leva a percorrer a distncia desde a coluna at ao detector, o qual se inicia no
momento em que a amostra injectada e termina no instante em que a altura do pico,
referente a este composto, mxima. O cromatograma obtido em contagens por
segundo (CPS) em funo do tempo (min) e em milivoltes (mV) em funo do tempo
(min) para a deteco por radioactividade e UV, respectivamente (Clark, 2007).
Desta forma, torna-se possvel separar os vrios componentes do radiofrmaco
preparado: o AA e o FeCl3 por deteco UV e o
99m
Tc-AA, o
99m
TcO4- e o
99m
Tc-RH por
radioactividade. Para a anlise por HPLC foi utilizado um equipamento Gilson

composto por UV/VIS-151 Detector, 321-PUMP e 506-C System Interface. A definio
dos mtodos de corrida e o processamento dos resultados feito usando o software
Gina-Star, cuja base de dados armazena automaticamente todos os dados obtidos.
O mtodo de HPLC para o controlo de qualidade do
99m
Tc-AA foi desenvolvido
usando como fase estacionria uma coluna Nucleosil com pr-coluna (Hichrom, NC100-5C18-250AF), como fase mvel um gradiente de KH2PO4 (0.025 M, pH 3) e
metanol na proporo de 96/4 (v/v) e o fluxo constante de 1 mL/min. A deteco UV
foi efectuada com o comprimento de onda de 205 nm.
Primeiramente, realizou-se uma passagem pelo sistema durante 60 minutos e
com as mesmas caractersticas que sero utilizadas para o controlo de qualidade, mas
sem a injeco de qualquer amostra. Esta passagem serve unicamente para
estabilizao
do
equipamento,
nomeadamente,
dos
detectores
UV
de
radioactividade. Aps estabilizao, so injectados 25 L de uma soluo

correspondente ao gradiente da fase mvel, para confirmar o desempenho do sistema.
36
Mtodos
Aos 30, 60, 120 min e 24 horas, aps a preparao do complexo
99m
Tc-AA,
foram retirados 25 L do mesmo. Nos devidos tempos cada uma das amostras foi
transferida para a micro seringa do HPLC (Hamilton) e injectada no loop, iniciando-se o
mtodo anteriormente descrito. Cada passagem teve a durao de 30 min. Obtiveramse tambm cromatogramas de amostras de
99m
Tc-O4-, AA frio e FeCl3, para tornar
possvel a interpretao dos cromatogramas obtidos no controlo de qualidade do

99m
Tc-AA.
Aps a obteno dos cromatogramas desejados, efectuou-se uma outra
passagem que constitui um mtodo de lavagem, com as seguintes caractersticas: fase

mvel com um gradiente de H2O e metanol (p.a.)/H2O (9/1) iniciado na proporo de
90/10 e finalizado em 95/5 (v/v), fluxo constante de 1 mL/min, comprimento de onda
de 205 nm, e durao de 60 min.
A quantificao dos componentes presentes no radiofrmaco foi feita por
integrao grfica do cromatograma. A integrao grfica foi feita desenhando ROIs
(regies de interesse) do tipo BB, BD e/ou DB com o intuito de minimizar o erro
resultante da proximidade dos diferentes componentes do kit, e do consequente
afastamento do cromatograma da linha basal entre os 3 e os 7 minutos. As ROIs do
tipo BB so desenhadas quando os extremos do pico coincidem com a linha basal.
Quando tal no acontece, desenham-se ROIs do tipo BD ou DB, traando-se
perpendiculares do lado do extremo do pico que se encontra afastado da linha basal.
Desta forma, obtiveram-se as reas sob a curva correspondentes quantidade de
radioactividade total de cada composto e foi feita a avaliao das respectivas
quantidades percentuais em funo da radioactividade total detectada. A pureza
radioqumica do radiofrmaco preparado (99mTc-AA) traduz-se na equao (1):
37
%99m Tc AA = 100 % 99mTcO4 + % 99mTc - RH
2.1.2.2.
(1)
Microcromatografia ascendente
A microcromatografia ascendente em camada fina, ao contrrio do HPLC,

constitui um procedimento rpido, simples e no dispendioso de separao dos
componentes de uma mistura e consequente determinao da pureza radioqumica. O
princpio deste mtodo analtico a subida da fase mvel (solvente) ao longo da fase
estacionria (adsorvente). A fase estacionria constitui uma camada fina formada por
um slido granulado, disposta verticalmente e assente num suporte inerte. Uma
pequena amostra da mistura a analisar previamente colocada a 1 cm da extremidade
inferior da fase estacionria, denominada origem, conforme a Figura 8. medida que o
solvente se move ao longo do adsorvente, estabelece-se um equilbrio para cada
componente da amostra, entre as molculas da mesma que so adsorvidas na fase
estacionria e as molculas do solvente. Consequentemente, as diferentes espcies
radioqumicas migram a diferentes velocidades e distribuem-se ao longo do
adsorvente dependendo da sua solubilidade, capacidade de adsoro e carga (foras
electrostticas). A distncia que cada componente da amostra migra representada
pelo valor de Rf (factor de reteno), o qual varia entre 0 e 1. Rf igual a 0, significa que
o composto permaneceu no ponto de aplicao (origem), enquanto, Rf igual a 1,
significa que o composto migrou at frente do solvente (Peres, 2002).
A pureza radioqumica calculada como a razo (em %) entre a radioactividade
do composto marcado, neste caso, 99mTc-AA, e a actividade total aplicada. Assim, com
o intuito de se ter um mtodo simples, eficiente e barato de realizar o controlo de
38
Mtodos
qualidade do complexo, desenvolvemos dois sistemas cromatogrficos, a partir dos

quais se pretende separar o
99m
TcO4- e o
99m
Tc-RH. Por sua vez, a percentagem de
99m
Tc-AA obtida pelo clculo da equao (1) anteriormente descrita.

No sistema A utilizou-se, para fase mvel, uma soluo de cloreto de sdio
(0,9%) e, para fase estacionria, tiras de Instant Thin Layer Cromatography Slica Gel
(ITLC-SG, Pall Corporation) de 1,5x20 cm. Com este sistema, usando um solvente
hidroflico, pretende-se separar o
99m
Tc-RH, o qual permanece na origem. Devido s
propriedades hidrossolveis do AA, espera-se que o

solvente arrastando o
99m
Tc-AA suba na frente do
99m
TcO4-. Por outro lado, no sistema B, utiliza-se um solvente
orgnico, com o intuito de separar o

enquanto o
99m
Tc-AA e o
99m
TcO4- que migra na frente do solvente,
99m
Tc-RH permanecem na origem. Assim, neste sistema
utiliza-se, para fase mvel, butanona e para fase estacionria, tiras de 31-ET (Merck)
de 1x10 cm. As tiras de papel que constituem a fase estacionria foram previamente
marcadas levemente, com lpis de carvo, nos comprimentos referidos na Figura 8, a
partir do incio da tira, consoante se trata de um tira longa ou curta.
39
Bf
Figura 8 - Representao esquemtica dos dois sistemas de microcromatografia desenvolvidos.
Primeiramente, os solventes foram colocados nos respectivos frascos, num

sistema tapado para saturarem. Aos 10, 20, 30, 45, 60, 90 e 120 minutos aps a
marcao, uma alquota de 2 L do composto marcado foi, posteriormente, colocada
na origem de cada uma das tiras, as quais foram rapidamente transferidas para os
respectivos frascos. Aps a subida do solvente, as tiras foram retiradas e cortadas, a
8,5 e 3,5 cm da origem para o sistema A e B, respectivamente. As duas pores de
cada tira foram colocadas em tubos de RIA (radioimunoensaio) e, seguidamente,
contadas num contador de poo (DPC Gamma C12), o qual possui 12 detectores de
radiao constitudos por cristais de iodeto e sdio activado com tlio (NaI(Tl))
acoplados a tubos fotomultiplicadores. O nmero de interaces no cristal detector do
contador, dado em CPM (contagens por minuto), proporcional actividade presente
em cada poro das tiras. Desta forma, foi quantificada a percentagem de pureza
40
Mtodos
radioqumica atravs da equao (1) e da quantificao prvia da percentagem de

99m
TcO4- e de 99mTc-RH pelas expresses (2) e (3).
%99m Tc AA = 100 % 99mTcO4 + % 99mTc - RH
99m
Tc - RH =
% 99m TcO 4 - =
CPMparte inferior da tira 1 sistema

CPM tira do 1 sistema completa
CPMparte superior da tira 2 sistema

CPMtira do 2 sistema completa
(1)
100
(2)
100
(3)
2.2. Estudos in vitro

Para avaliar os efeitos citotxicos e a cintica de entrada da vitamina C foram
realizados estudos in vitro, utilizando uma linha celular humana, de adenocarcinoma
do clon (WiDr), obtida na American Type Culture Collection (ATCC). A linha celular
WiDr foi depositada na ATCC, como uma linha celular estabelecida a partir de um
doente do sexo feminino, de 78 anos de idade, e etnia caucasiana. No entanto, foi
mais tarde demonstrado que se tratava da linha celular HT-29, estabelecida em 1964, a
partir do tumor primrio de um doente de 44 anos com adenocarcinoma do clon
(LGC/ATCC, 2006).
de referir que todo o material de manipulao das culturas celulares foi
devida e previamente esterilizado. Da mesma forma, todos os procedimentos foram
efectuados nas condies de esterilizao e assepsia necessrias.
41
2.2.1.
Culturas celulares de adenocarcinoma do clon
A linha celular de adenocarcinoma do clon (Widr, ATCC) foi descongelada e

ampliada em cultura em monocamada a 37C, com 5% de CO2 (incubadora HeraCell
150) utilizando o meio Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Sigma D-5648)
suplementado com 100 M de piruvato de sdio (Gibco 11360), 4,5 g/L de glicose, Lglutamina (2 mM), 10% de soro bovino fetal (Gibco 2010-09) e 1% de
antibitico/antimictico (100 U/mL de penicilina e 10 g/mL estreptomicina; Gibco
15140-122).
Com esta linha celular, e com o objectivo de compreender o comportamento in
vitro das duas formas da vitamina C, foram realizados estudos de captao com 99mTcAA, estudos de estabilidade da molcula recorrendo ao HPLC, assim como, estudos de
citotoxicidade
utilizando
mtodo
do
MTT
[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-
diphenyltetrazolium bromide] para avaliao da proliferao celular e a citometria de

fluxo para avaliao da viabilidade e morte celular.
2.2.2.
Estudos de Captao
A realizao dos estudos de captao implicou a preparao prvia de uma

suspenso celular com 2x106 clulas/mL. A cultura celular de adenocarcinoma do clon
foi incubada com 3 mL de uma soluo de tripsina-EDTA a 0,25% (Gibco 25200)
durante trs minutos, para assim ocorrer desagregao celular. Seguidamente, e para
inactivar a tripsina, foram adicionados suspenso celular cerca de 8 mL de DMEM, a
qual foi posteriormente centrifugada a 1000 rotaes por minuto (rpm/min) durante 5
42
Mtodos
minutos (Heraeus Multifuge 1L-R; raio do rotor 18,7 cm). As clulas foram ento
ressuspensas em meio de cultura, para obteno de uma concentrao de 2x106
clulas/mL. Com o intuito de recuperarem do stresse causado pela aco enzimtica
da tripsina, foram deixadas a repousar durante 60 minutos, em dois frascos de 25 cm2,
temperatura de 37 C e numa atmosfera contendo 5% de CO2.
Aps a preparao da suspenso celular, foi adicionado um volume de 99mTc-AA
a cada um dos frascos, de forma a obter uma concentrao de cerca de 0,925 MBq/mL
e de 1,850 MBq/mL. Tubos de eppendorf contendo 500 L de uma soluo de tampo
fosfato (Phosphate Buffer Solution PBS 0,5 mg/mL ajustado a pH 7,4), foram
previamente colocados no gelo para que, ao colocar as amostras da suspenso, o
metabolismo celular seja reduzido. Passados 5, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210,
240 e 300 minutos aps a adio da molcula marcada, retiraram-se trs amostras de
200 L da suspenso presente nos frascos. Para permitir a separao do sedimento e
sobrenadante centrifugaram-se as amostras a 10000 rpm/min durante 60 segundos. O
sobrenadante foi ento transferido para um tubo identificado. Adicionaram-se mais
500 L de PBS gelado ao tubo de eppendorf contendo o sedimento e repetiu-se o
procedimento de centrifugao para obter a completa rentabilizao do sobrenadante.
Posteriormente, pela contagem de ambas as fraces (sedimentos e
sobrenadantes) no contador de poo (DPC Gamma C12) em CPM, quantificou-se a
captao percentil do 99mTc-AA traduzida pela expresso (4):
% Captao =
CPMsedimento
100
CPMsedimento + sobrenadan te
Os valores percentis de captao do
(4)
99m
Tc-AA pela linha celular de

43
adenocarcinoma do clon foram posteriormente normalizados para 106 clulas.

Para alm deste estudo de captao, foi realizado outro com o mesmo
procedimento, no entanto, com a incubao somente de
99m
Tc-O4-, para efectuar a
comparao com a percentagem de captao obtida com a molcula marcada.

Na amostra incubada durante 240 minutos foi determinada a viabilidade da
suspenso, pelo mtodo descrito seguidamente.
2.2.3.
Determinao da Viabilidade e Celular
A viabilidade celular foi determinada recorrendo ao mtodo de excluso do

azul de tripano. Este mtodo baseado no princpio de que as clulas viveis possuem
membranas celulares intactas que excluem qualquer corante vital, tal como o azul
tripano. Nas clulas mortas, o corante atravessa a membrana celular, devido ao facto
desta se encontrar permeabilizada. Por conseguinte, observadas ao microscpio, as
clulas mortas podem ser distinguidas pois aparecem coradas de azul, enquanto as
vivas se encontram com aspecto brilhante (no coradas de azul). Este facto possibilita
a determinao da percentagem de clulas viveis, pela expresso (5):
Viabilidad e Celular =
N clulas vivas
100
N clulas vivas + N clulas mortas
(5)
Para o efeito, a 20 L da suspenso celular adicionou-se, num tubo de
eppendorf, 20 L de azul tripano. A mistura foi homogeneizada utilizando uma

micropipeta e colocada num hemocitmetro para observar ao microscpio ptico
44
Mtodos
(Motic AE31) com ampliao de 10x. Efectuou-se a contagem das clulas vivas
(brilhantes) e das clulas mortas (coradas de azul) nos quatro quadrantes do
hemocitmetro.
Posteriormente,
calculou-se
viabilidade
das
clulas
de
adenocarcinoma do clon, em percentagem, utilizando a expresso acima referida.
2.2.4.
Estudos de estabilidade da vitamina C
A anlise por HPLC permitiu no s determinar a pureza radioqumica do

radiofrmaco
99m
Tc-AA, mas possibilitou tambm a anlise dos compostos presentes
nas culturas celulares de adenocarcinoma do clon, permitindo estudar a estabilidade

e at esclarecer os mecanismos de entrada das diferentes formas da vitamina C. Sendo
as principais substncias em questo o AA e DHA (D8132, Sigma), utilizou-se o mesmo
mtodo desenvolvido para o controlo de qualidade, portanto, nas condies
anteriormente referidas de fase estacionria, fase mvel e respectivo gradiente, fluxo,
comprimento de onda, volume injectado e durao da deteco. Os cromatogramas de
todas as amostras foram obtidos e os respectivos tempos de reteno,
posteriormente, analisados.
Definido o mtodo no HPLC, injectaram-se as amostras, de concentraes e/ou
aps os tempos de incubao referidos na Tabela 1. Esta anlise foi feita para obter
resultados controlo, averiguando os tempos de reteno dos vrios compostos, e
verificando qual o efeito que o pH do meio exerce sobre as duas formas da vitamina C.
45
Tabela 1 Amostras sem metabolismo celular injectadas no HPLC.
Amostra
2.2.4.1.
Tempo de incubao Concentrao
AA
10 mM
DHA
10 mM
DHA filtrado
10 mM
DMEM
DMEM + AA
1h
10 mM
DMEM + DHA
1h
10 mM
DMEM
72 h
DMEM + AA
72 h
10 mM
DMEM + DHA
72 h
10 mM
Avaliao do meio extracelular
Para a avaliao do meio extracelular foi realizada a anlise por HPLC com o AA
e com o DHA, agora, com o metabolismo celular.
Uma suspenso celular com 40 000 clulas/mL em meio de cultura foi
distribuda por placas de 48 poos contendo cada poo 600 L da mesma. Para a
anlise da estabilidade das duas formas da vitamina C por HPLC, estas foram incubadas
com as concentraes e durante os tempos referidos na Tabela 2. Passado o respectivo
tempo de incubao, as amostras foram filtradas, usando filtros de 0,2 M (Whatman
FP30/0,2 Schleider & Schnell), e injectadas no HPLC para obteno dos respectivos
cromatogramas.
46
Mtodos
Tabela 2 Amostras com metabolismo celular injectadas no HPLC.
Amostra
2.2.5.
Tempo de incubao Concentrao
Controlo
24 h
AA
24 h
3 mM
AA
24 h
7 mM
AA
24 h
10 mM
DHA
24 h
3 mM
DHA
24 h
7 mM
DHA
24 h
10 mM
Controlo
48 h
AA
48 h
3 mM
AA
48 h
7 mM
AA
48 h
10 mM
DHA
48 h
3 mM
DHA
48 h
7 mM
DHA
48 h
10 mM
Controlo
72 h
AA
72 h
7 mM
AA
72 h
8 mM
AA
72 h
10 mM
DHA
72 h
8 mM
Determinao da citotoxicidade da vitamina C
Com o objectivo de estudar os efeitos citotxicos da vitamina C, as clulas Widr

foram tratadas com concentraes crescentes das duas formas da molcula, AA e DHA,
e por diferentes perodos de tempo. Aps incubao foi avaliada a proliferao celular,
por colorimetria, e a viabilidade e a morte celular, por citometria de fluxo.
47
2.2.5.1.
Avaliao da proliferao celular por colorimetria
Para avaliar os efeitos da vitamina C na proliferao das clulas de

adenocarcinoma do clon foi realizado um teste colorimtrico, o MTT.
O mtodo do MTT baseado na capacidade da enzima mitocondrial
dehidrogenase, presente nas clulas viveis, clivar os anis tetrazlio do MTT e formar
cristais formazan de cor azul escura. Quando as membranas celulares esto ntegras,
estes cristais atravessam-nas, o que induz sua acumulao nas clulas viveis.
Consequentemente, o nmero de clulas vivas proporcional quantidade de cristais
de formazan produzidos (Mosmann, 1983).
Assim, para estes estudos, e semelhana do descrito para os estudos de
captao, foi necessria uma suspenso celular com 40 000 clulas/mL em meio de
cultura. Esta suspenso foi distribuda por placas de 48 poos, contendo cada poo 600
L da suspenso, e aps 24h as clulas foram incubadas com diferentes concentraes
de AA (0,05; 0,25; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10 mM) e de DHA (0,05; 0,25; 0,5; 1; 2; 3;
4; 5; 7; 10 mM). Para cada uma das concentraes dos frmacos, a proliferao celular
foi avaliada s 24, 48, 72 e 96 horas, de forma a construir curvas dose-resposta.
Desta forma, depois de passado o respectivo tempo de incubao, o meio das
culturas celulares foi retirado, adicionou-se 900 L de PBS para lavagem e,
posteriormente, 150 L de uma soluo de MTT (M2128, Sigma) em PBS. Passadas 3
horas, acrescentou-se 150 L de uma soluo de isopropanol cido, com 0,04 M de
cido clordrico (37 % fumante), e as clulas foram ressuspensas utilizando uma pipeta
de Pasteur. O contedo de cada poo foi transferido para uma placa de 96 poos e a
48
Mtodos
absorvncia foi quantificada a 570 nm com um filtro de referncia de 620 nm, usando
o espectrofotmetro ELISA (SLT - Spectra).
2.2.5.2.
Avaliao da viabilidade, morte celular e produo de ROS por
citometria de fluxo
A citometria de fluxo uma tcnica que permite analisar e quantificar clulas

ou outras partculas biolgicas, pela disperso frontal (forward scatter/FSC) e lateral da
luz (side scatter/SSC) emitida por uma fonte de luz (ex. raio laser) e pela fluorescncia
emitida por fluorocromos ligados a anticorpos monoclonais ou outros (Silva, et al.).
2.2.5.2.1. Avaliao da morte celular
Para a avaliao da morte celular efectuou-se a dupla marcao com anexina-VFITC e iodeto de propdeo (IP). H evidncias de que na fase inicial da apoptose, ocorre
a translocao da fosfatidilserina, um fosfolpido do folheto interno da membrana
celular, para o folheto externo. A anexina V possui elevada afinidade para fosfolpidos
carregados negativamente, tais como a fosfatidilserina e, por isso, quando conjugada
forma o composto fluorescente isotiocianato de fluorescena (anexina V-FITC), capaz
de identificar clulas em apoptose. Por outro lado, nas fases mais avanadas da
apoptose e/ou necrose ocorre ruptura da membrana celular permitindo a entrada de
iodeto de propdeo (IP), uma molcula que se intercala no ADN, emitindo
fluorescncia. Assim, torna-se possvel detectar clulas viveis (no marcadas, ou
negativas, para ambos os fluorocromos), clulas em apoptose inicial (positivas, ou
marcadas, para a anexina-V e negativas para o IP), clulas em apoptose tardia e/ou
49
necrose (positivas para ambos) e clulas em necrose (negativas para a anexina-V e

positivas para o IP) (Darzynkiewicz, et al., 1997).
Nesta dupla marcao, foi utilizada uma suspenso celular contendo 106
clulas. Estas foram centrifugadas, a 1000 xg durante 5 min, e o sobrenadante
retirado. O sedimento foi ressupenso em PBS e lavado por centrifugao nas condies
referidas anteriormente. Seguidamente, o novo sedimento foi incubado com 100 L de
tampo de ligao (KIT Immunotech), 1 L de anexina-V-FITC (KIT Immunotech) e 5 L
de iodeto de propdeo (KIT Immunotech), durante 15 minutos, a 4 C, e na ausncia de
luz. Posteriormente, foi feita a deteco por citometria de fluxo, utilizando um
citmetro FACSCalibur e os comprimentos de onda de excitao de 525 e 640 nm, para
a anexina-V-FITC e para o IP, respectivamente. Foram adquiridos 10 000 eventos e os
dados obtidos foram analisados e quantificados usando o Paint-a-Gate 3.02,
Machintosh Software. Os resultados so expressos em percentagem de clulas

identificadas em cada uma das subpopulaes e baseada na positividade e/ou
negatividade de marcao para a AV/IP (Chen, et al., 2008).
2.2.5.2.2. Avaliao da presena de perxidos
A presena de ROS pode ser detectada pela marcao das clulas de

adenocarcinoma do clon com o 2,7 dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA), um
composto lipossolvel, estvel e no-fluorescente. Este composto, ao entrar nas
clulas, clivado por esterases intracelulares originando o 2,7 dichlorofluorescin
diacetate (DCFH), que fica retido no interior da clula. Na presena de perxidos,

ocorre oxidao do DCFH com formao de dichlorofluorescein (DCF), um composto
50
Mtodos
altamente fluorescente (Figura 9). Este emite fluorescncia a 522 nm, aps excitao
no comprimento de onda de 498 nm, a qual proporcional concentrao de
perxidos intracelulares, nomeadamente, perxido de hidrognio. Os resultados so
assim expressos em mdia de intensidade de fluorescncia (MIF) detectada (Tarpey, et
al., 2003; Dikalov, et al., 2007).
Figura 9 - Formao do composto fluorescente DCF a partir de DCFH-DA.

Primeiro ocorre clivagem do DCFH-DA a DCFH pelas esterases
intracelulares. O DCFH reage com H2O2, formando DCF.
Centrifugou-se uma suspenso celular contendo 106 clulas, a 300 xg durante 5

minutos. Retirou-se o sobrenadante e adicionou-se PBS para lavar. O sedimento foi
ressuspenso em 100 L de PBS, e incubado durante 60 minutos a 37 C, com DCFH2-DA
(35845, Sigma) de modo a obter a concentrao final de 5 M, A suspenso foi lavada
com PBS e ressuspensa em 400 L do mesmo. Posteriormente, foi feita a deteco por
citometria de fluxo, utilizando um citmetro FACSCalibur (excitao e emisso nos
comprimentos de onda de 504 e 529 nm, respectivamente). Foram adquiridos 10 000
eventos e os dados obtidos foram analisados e quantificados usando o Paint-a-Gate
3.02, Machintosh Software. Os dados obtidos foram analisados em termos da mdia

das intensidades de fluorescncia (MIF) (Sarkar, et al., 2005).
51
2.2.5.2.3. Avaliao da produo de O2A avaliao da produo de radical superxido (O2-), nas clulas incubadas na
presena e na ausncia das duas formas da vitamina C, foi efectuada por citometria de
fluxo com recurso ao dihidroetdio (DHE). O DHE atravessa facilmente as membranas
celulares e convertido pelo radical superxido a etdeo (Figura 10), composto
fluorescente de cor vermelha que se intercala no ADN, permanecendo no interior da
clula. Esta reaco relativamente especfica para o O2-, com oxidao mnima pelo
H2O2, ONOO- ou cido hipocloroso (HOCl) (Zhao, et al., 2005).
Figura 10 - Reaco de formao do composto fluorescente etdeo a partir da

reaco do DHE com o radical superxido.
Tal como na marcao com DCF, utilizaram-se 106 clulas obtidas aps
centrifugao de uma suspenso celular a 300 xg durante 5 minutos. O sobrenadante
foi retirado e o sedimento lavado uma vez com PBS. De seguida, o sedimento foi
ressuspenso em 1000 L de PBS, adicionou-se DHE (Sigma) na concentrao final de 5
M e incubou-se, durante 10 minutos a 37 C. Aps a incubao, a suspenso foi
lavada com PBS e ressuspensa em 400 L do mesmo tampo. A deteco foi efectuada
pelo mesmo procedimento e usando o mesmo equipamento, descritos anteriormente
para a marcao com DCF e DHE, contudo, utilizando o comprimento de onda de
excitao de 620 nm (Budd, et al., 1997).
52
Mtodos
2.2.5.2.4. Avaliao do potencial de membrana mitocondrial
O potencial de membrana mitocondrial foi determinado usando uma sonda

fluorescente,
5,5,6,6-tetrachloro-1,1,3,3-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine
iodide (JC-1). O potencial de membrana mitocondrial determina a captao selectiva

do JC-1 pela mitocndria. O JC-1 um catio lipoflico, que existe em duas formas,
monmeros (M) e agregados (A), consoante o estado de polarizao/despolarizao da
membrana mitocondrial, emitindo fluorescncia a comprimentos de onda diferentes.
Quando o potencial de membrana elevado, forma agregados que emitem
fluorescncia vermelha (590 nm). Por sua vez, medida que o potencial de membrana
mitocondrial diminui, ou em casos em que a membrana se encontra despolarizada, o
JC-1 excludo da mitocndria e mantm-se no citoplasma sob a forma de
monmeros, que emitem fluorescncia verde (529 nm). Assim, a razo entre a
fluorescncia verde e vermelha (M/A), determinada por citometria de fluxo, fornece
uma estimativa do potencial de membrana mitocondrial (Yao, et al., 2008).
Na marcao com JC-1, efectuou-se o mesmo procedimento descrito para o
DHE, tendo as clulas sido incubadas com a concentrao final de 5 mg/mL de JC-1
(Invitrogen, USA) durante 15 min, a 37 C. Posteriormente, a suspenso foi novamente
lavada com PBS e ressuspensa em 400 L do mesmo tampo. A deteco foi efectuada
pelo mesmo procedimento e usando o mesmo equipamento, descritos anteriormente
para a marcao com DCF, contudo, utilizando o comprimento de onda de excitao
de 488 nm. Os resultados obtidos so expressos como mdia das intensidades de
fluorescncia (MIF) para os agregados (A) e para os monmeros (M), tendo-se
calculado posteriormente a razo M/A (Yao, et al., 2008).
53
2.3. Estudos in vivo

Com o objectivo de esclarecer alguns dos resultados obtidos no controlo de
qualidade do complexo 99mTc-AA, foram realizados estudos in vivo utilizando ratinhos
Balb/c nu/nu. A escolha destes animais justifica-se pelo facto de serem animais que
possuem vescula biliar, dado importante para a obteno de informao sobre a
biodistribuio do composto.
Estes estudos permitiram tambm inferir acerca das vias de metabolizao e
excreo, assim como, dos rgos-alvo do radiofrmaco em questo.
2.3.1.
Estudos de Biodistribuio com 99mTc-AA
Os ratinhos Balb/c nu/nu normais foram primeiramente anestesiados com uma

soluo de ketamina (77 %) e cloropromazina (23 %) (ketamina, Ketalar, Porke-Davis
e cloropromazina, Largactil, Laboratrios Vitria), administrada por via subcutnea.
Posteriormente, para proceder aos estudos de biodistribuio, foi-lhes administrada
uma actividade de cerca de 3,256 e 4,366 MBq (correspondente a 43907798 e
58876366 CPM, converso necessria para clculos posteriores) por injeco
intravenosa (i.v.) na veia dorsal da cauda, sobre o colimador de uma cmara-gama.
Aps a realizao do experimento, os ratinhos foram sacrificados por
deslocamento cervical, de acordo com a legislao em vigor. O sacrifcio dos animais
foi efectuado 30 e 60 minutos depois da injeco do 99mTc-AA, tempos nos quais foram
realizadas as autpsias dos mesmos. Foi, ento, feita a colheita de vrios rgos,
54
Mtodos
nomeadamente, fgado, bao, pulmo, corao, intestino delgado, intestino grosso,

tiride, crebro, cerebelo, bexiga, genitais, estmago, rim e vescula biliar. Da mesma
forma foram colhidos alguns tecidos, tais como, sangue, osso, cartilagem e msculo,
assim como, fluidos de excreo, blis e urina. Cada um dos rgos, tecidos ou fluidos
foi colocado num tubo de RIA, previamente pesado. Cada tubo, agora com o
respectivo contedo da autpsia, foi pesado (em gramas) e posteriormente contado
num contador de poo para quantificao da actividade presente (em CPM).
% Dose injectada/ grama =
CPM totais do rgo / massa rgo

CPM actividade total administra da
100
(6)
Tornou-se ento possvel a determinao da percentagem de dose de

radiofrmaco
99m
Tc-AA injectado/grama de rgo, tecido ou fluido. Este clculo
traduzido na expresso (6).
2.3.2.
Imagiologia com 99mTc-AA
Os estudos de imagiologia nuclear incluram a aquisio de imagens dinmicas e

estticas. A aquisio dinmica foi concretizada para assegurar a entrada do
radiofrmaco. As caractersticas das aquisies, dinmica e esttica, esto sumariadas
no Quadro 1. Ambas foram feitas usando uma cmara-gama (GE 400 AC) controlada
por um computador de aquisio GenieAcq e incorporando um colimador paralelo de
baixa energia e alta resoluo (LEHR low energy and high resolution).
55

Quadro 1 - Caractersticas das aquisies dinmicas e estticas.
Caracterstica
Aquisio Dinmica Aquisio esttica
N Imagens
25
Durao Individual (seg)
450
60
Matrizes (pixels)
128x128
128x128
Zoom
1,7
1,7
Colimador
LEHR
LEHR
Dois ratinhos Balb/c nu/nu foram anestesiados, segundo o protocolo

supramencionado nos estudos de biodistribuio. Imediatamente aps a injeco de
3,256 e 4,366 MBq de
99m
Tc-AA na veia dorsal da cauda de cada um dos animais,
iniciou-se a aquisio dinmica, com o intuito de confirmar a entrada do radiofrmaco.

Aps a aquisio das imagens dinmicas, procedeu-se aquisio das imagens
estticas dos ratinhos 1 e 2, aos 15 e 30 minutos e aos 15, 30 e 60 minutos,
respectivamente, aps a administrao do radiofrmaco 99mTc-AA.
Depois de adquiridas as imagens estticas, estas foram transferidas para uma
estao de trabalho Xeleris, para posterior processamento e anlise. Para o
processamento das imagens estticas desenharam-se regies de interesse (ROIs) para
os vrios rgos, nomeadamente, tiride, estmago, fgado, rim, bexiga. As ROIs foram
desenhadas em rgos a partir dos quais se poderia obter informao sobre a
existncia de impurezas radioqumicas, presentes no radiofrmaco. Sabendo-se que
normalmente a acumulao de
99m
Tc-O4- se d ao nvel da tiride e estmago, e que,
por sua vez, a acumulao de 99mTc-RH se verifica ao nvel do fgado e bao, tornou-se
possvel inferir e comprovar os valores de pureza radioqumica do 99mTc-AA obtidos por
56
Mtodos
HPLC. Por outro lado, ROIs foram tambm desenhadas em zonas de maior actividade,
para permitir a anlise das vias de metabolizao e excreo do complexo injectado.
2.4. Anlise Estatstica

Para aumentar o rigor da interpretao dos resultados obtidos, atravs dos
procedimentos anteriormente descritos, fizemos a anlise estatstica dos mesmos.
Para tal, utilizmos uma aplicao de tratamento estatstico de dados, o SPSS
(Statistical Package for Social Sciences), verso 16.
Em todos os estudos foram utilizados testes no paramtricos, visto que as
amostras de dados so reduzidas e no seguem uma distribuio normal. Em casos em
que se pretendia fazer a comparao de valores emparelhados, isto , por exemplo
duas variveis (p.ex. AA e DHA) ao longo do tempo, utilizmos o teste de Wilcoxon. Por
outro lado, usmos o teste de Mann-Whitney para comparar duas amostras
independentes (p.ex. uma determinada concentrao com o controlo) dentro da
mesma varivel (p.ex. tempo).
57
Captulo III
3. Resultados
Resultados
Os procedimentos anteriormente descritos permitiram a obteno de

resultados que constituem uma mais-valia no estudo do potencial teraputico da
vitamina C. O presente captulo apresentar os resultados obtidos na formulao e
controlo de qualidade do radiofrmaco desenvolvido, nos estudos in vitro na linha
celular de adenocarcinoma do clon e com as duas formas da vitamina C, AA e DHA,
nomeadamente, estudos de captao, estabilidade e citotoxicidade, e nos estudos in
vivo como a biodistribuio e imagiologia com o 99mTc-AA.
3.1. Estudos de qumica

3.1.1.
Preparao e controlo de qualidade do 99mTc-AA
Aps vrias tentativas no sentido de optimizar o processo de marcao, a

eficincia de marcao atingiu o seu mximo com a seguinte constituio da
formulao farmacutica desenvolvida: 296-370 MBq de pertecnetato (em 3 mL de
NaCl 0,9 %), 0,2 mL de FeCl3 0,1 N (em HCl 0,1 N), 200 mg de AA, pH acertado a 6,5
(com soluo de NaOH 1 M), temperatura de 0 C durante no mnimo 3 horas, e a
formulao continuamente mantida em atmosfera de rgon e protegida da luz.
3.1.1.1.
HPLC
Aps marcao, avaliou-se a pureza radioqumica por HPLC, tendo-se

determinado as impurezas radioqumicas. Esta determinao implicou a deteco
prvia das amostras no-radioactivas de AA e FeCl3 (Grfico 1 e Grfico 2) que, sendo
detectadas por UV, no esto presentes no complexo marcado. Paralelamente,
61
efectuou-se, tambm, a avaliao prvia dos cromatogramas de amostras de 99mTc-O4(deteco por radioactividade), cujo tempo de reteno se verificou ser
aproximadamente aos 3,4 minutos (3,40,22 min), como apresentado no Grfico 3 e na
Tabela 1.
Grfico 1 Cromatograma do AA. A amostra de AA (10 mM) frio foi injectada no HPLC, e determinado o
respectivo tempo de reteno por integrao grfica.
Grfico 2 - Cromatograma do FeCl3. A amostra de FeCl3 (0,1 N) frio foi injectada no HPLC, e
determinado o respectivo tempo de reteno por integrao grfica.
Grfico 3 - Cromatograma do 99mTc-O4-. A amostra de 99mTc-O4- foi injectada no HPLC, e determinado o

respectivo tempo de reteno por integrao grfica.
De referir que no foi injectada a amostra de 99mTc-RH, contudo, os compostos

hidrofbicos so os ltimos a ser detectados; consequentemente, o
99m
Tc-RH, por
excluso de partes, ser o ltimo pico do cromatograma.

Com estes estudos obtiveram-se os respectivos tempos de reteno
evidenciados nos Grfico 1,Grfico 2 eGrfico 3 e que esto sumariados na Tabela 3. Os
62
Resultados
valores apresentados na tabela representam a mdia, com n=3, de trs kits escolhidos
aleatoriamente.
Tabela 3 - Tempos de reteno referentes ao controlo de qualidade determinados por HPLC.
Composto Tempo de reteno (min) Tipo de deteco

FeCl3
AA
99m
Tc-AA
99m
Tc-O499m
Tc-RH
2,41 0,03
3,40 0,22
2,69 0,03
3,88 0,23
5,76 0,49
UV
UV
Radioactividade
Radioactividade
Radioactividade
Baseado nos dados da tabela foi ento possvel determinar a eficincia de

marcao dos diferentes complexos.
O Grfico 4 representa um cromatograma obtido a partir da deteco por
radioactividade de uma formulao com reduzida eficincia de marcao (54,75 %). A
partir deste, podem-se observar claramente os tempos de reteno dos diferentes
compostos radioactivos presentes no complexo, distinguindo-se o 99mTc-AA, 99mTc-O4- e
o
99m
Tc-RH. Desta forma, considerar-se- este cromatograma como ponto de
comparao para os restantes, obtidos por deteco por radioactividade,

apresentados.
Grfico 4 Cromatograma da formulao 55. O controlo de qualidade da formulao 55 foi realizado,

por HPLC, 30 minutos aps a adio de ligando, tendo sido obtido o cromatograma evidenciado, o
qual expressa reduzida eficincia de marcao (54,75 %).
63
O Grfico 5 apresenta o cromatograma de um kit com elevada eficincia de

marcao (98,37 %). Os compostos no-radioactivos (deteco UV) e os radioactivos
(deteco por radioactividade) esto representados nos Grfico 5-A e Grfico 5-B.
Grfico 5 - Cromatograma da formulao 54. O controlo de qualidade da formulao 55 foi realizado,

por HPLC, 24 horas aps a adio de ligando, tendo sido obtido o cromatograma evidenciado, o
qual expressa elevada eficincia de marcao (98,37 %).
O Grfico 6 representa as eficincias de marcao de algumas formulaes

marcadas.
Grfico 6 Anlise das eficincias de marcao de algumas formulaes ao longo do tempo. O

controlo de qualidade das formulaes 47, 48, 49 e 50 foi realizado, por HPLC, nos tempos
indicados no grfico e as respectivas eficincias de marcao, posteriormente, determinadas.
64
Resultados
Da anlise dos diversos resultados obtidos, podemos verificar que, mesmo as

formulaes cuja eficincia de marcao era inicialmente reduzida, 24 h aps a adio
de ligando, se obtinham eficincias de marcao bastante elevadas (Grfico 7). Este
dado permite aferir que as reaces que do origem ao complexo so lentas.
Grfico 7- Anlise das eficincias de marcao de algumas formulaes ao longo do tempo. O

controlo de qualidade das formulaes 54 e 55 foi realizado, por HPLC, 24 horas aps a adio
de ligando, e as respectivas eficincias de marcao, posteriormente, determinadas.
3.1.1.2.
Microcromatografia ascendente
Aps optimizao da eficincia de marcao, visto poder ser controlada por

HPLC, tentmos desenvolver um mtodo rpido de avaliao da pureza radioqumica
do
99m
Tc-AA, tendo por base a microcromatografia ascendente. Como, basicamente,
podem coexistir dois contaminantes, tais como, o 99mTc-O4- e o 99mTc-RH, associados ao

complexo
99m
Tc-AA, a nossa ideia foi arranjar um conjunto de dois sistemas
complementares. Um permitiria isolar o
99m
Tc-O4- dos restantes compostos, usando
um solvente orgnico como fase mvel, enquanto o segundo sistema isolaria o 99mTcRH, usando como fase mvel o soro fisiolgico ou gua desionizada. Dos mltiplos
sistemas usados, usando diferentes fases estacionrias e diferentes fases mveis,
nunca conseguimos obter resultados concordantes com a avaliao realizada por
65
HPLC. Desta forma, foi dada prioridade ao controlo de qualidade por HPLC, visto que
este se baseia em mtodos de maior rigor e preciso. Fica em aberto a necessidade de
optimizao dos sistemas de microcromatografia ascendente por ns desenvolvidos,
de modo a haver um mtodo rpido, barato e eficiente de realizar o controlo de
qualidade do complexo 99mTc-AA.
3.2. Estudos in vitro

Realizmos estudos in vitro com clulas de adenocarcinoma do clon, os quais
permitiram obter resultados sobre o influxo da vitamina C, atravs dos estudos de
captao do
99m
Tc-AA e dos estudos de HPLC, assim como, sobre a citotoxicidade das
duas formas da vitamina C, AA e DHA, recorrendo a estudos de proliferao celular e

citometria de fluxo. Cada estudo realizado foi normalizado para o mesmo nmero de
clulas.
3.2.1.
Estudos de captao do 99mTc-AA
Nos estudos de captao efectuados, primeiramente, comparmos a

percentagem de captao de
99m
Tc-AA para duas concentraes diferentes, 0,925
MBq/mL e 1,850 MBq/mL (Grfico 8).

Pelos resultados evidenciados no Grfico 8 e no Quadro 2, a percentagem de
captao do
99m
Tc-AA menor para concentraes mais elevadas, contudo, este
aumento apenas estatisticamente significativo aos 15, 30 e 45 minutos (p<0,05). Para

ambas as concentraes observa-se uma tendncia crescente na captao de 99mTc-AA
ao longo do tempo.
66
Resultados
99m
Grfico 8 Anlise da captao de

Tc-AA ao longo do tempo. As clulas WiDr foram
99m
incubadas com diferentes concentraes de
Tc-AA, 0,925 e 1,850 MBq/mL, e
determinada a captao do complexo marcado por estudos de influxo. Os dados
expressam a mdia de seis experincias independentes.
Quadro 2 - Anlise da varincia da captao das duas concentraes de
Tempo (min)
15
30
45
60
90
99m
Tc-AA em cada instante.
120
150
35,000 14,000 13,000 8,000 24,000 22,000 22,000 23,000
-0,094 -2,060 -2,154 -2,622 -1,124 -1,311 -1,311 -1,218
0,964 0,041 0,032 0,007 0,291 0,213 0,213 0,250
Para alm disso, foi tambm comparada a captao de
Tc-O4- com a do
99m
radiofrmaco, na mesma concentrao (0,925 MBq/mL). Os resultados so

apresentados no Grfico 9 e no Quadro 3, e demonstram alteraes significativas entre
os 60 e os 90 minutos, sendo a captao do
superior do
99m
Tc-O4-, neste perodo de tempo,
99m
Tc-AA (p<0,05). Nos restantes tempos no se verificam diferenas
significativas, observando-se, no entanto, que a captao do
99m
Tc-O4-
maioritariamente superior do radiofrmaco.
67
Grfico 9 - Anlise da captao de 99mTc-AA ao longo do tempo. As clulas WiDr foram incubadas com a
mesma concentrao de 99mTc-AA e 99mTc-O4-. Posteriormente, foi determinada a captao dos
compostos radioactivos por estudos de influxo. Os dados expressam a mdia de trs duplicados.
Quadro 3 - Anlise da varincia da captao de 99mTc-AA e de 99mTc-O4- em cada instante.
Tempo
(min)
15
30
45
60
5,00 11,00 16,00 13,00 3,00
90
120
150
180
210
240
270
300
0,00 11,00 5,00 12,00 10,00 8,00
3,00
0,00
-1,876 -1,010 -0,289 -0,722 -2,165 -2,598 -1,010 -1,876 -0,277 -0,647 -1,017 -0,655 -1,732
0,070 0,365 0,840 0,536 0,031 0,004 0,365 0,070 0,864 0,600 0,373 0,700 0,200
3.2.2.
Estudos de estabilidade da vitamina C
Os resultados obtidos a partir dos estudos por deteco UV de HPLC permitem

compreender o influxo das duas formas da vitamina C, AA e DHA, e dessa forma
estudar a sua estabilidade nas culturas celulares de adenocarcinoma do clon.
De referir que, a anlise dos cromatogramas foi efectuada pela comparao dos
diferentes compostos presentes numa mesma amostra e pela comparao da
quantidade de um composto em amostras sujeitas a diferentes condies. A primeira
foi possvel pela determinao dos tempos de reteno, que so especficos de cada
substncia, e a segunda pela quantificao das reas de integrao de diferentes
cromatogramas.
68
Resultados
Primeiramente, foram injectadas amostras individuais, fora do ambiente

celular, de DMEM (meio), de AA e de DHA, para se averiguarem os respectivos tempos
de reteno. As duas formas da vitamina C foram injectadas com a mesma
concentrao, isto , de 10 mM. Os resultados obtidos esto evidenciados no Grfico
10.
B
Grfico 10 - Cromatogramas das amostras de AA (A), DHA (B) e DMEM (C). Amostras de AA 10 mM,
DHA 10 mM e DMEM foram injectadas no HPLC e, posteriormente, determinado(s) o(s) respectivo(s)
tempo(s) de reteno por integrao grfica.
O tempo de reteno do AA 3,4 0,22, valor j determinado anteriormente

no controlo de qualidade do
99m
Tc-AA (Grfico 1). Por sua vez, os cromatogramas
referentes a DMEM e DHA, demonstram no s um pico de deteco mas sim vrios,

indicando que so compostos por diferentes substncias. O meio para cultura celular
constitudo por vrios compostos diferentes pois tm que ser capazes de fornecer s
clulas os nutrientes que estas necessitam. Por sua vez, o DHA um composto cujas
propriedades ainda no foram exploradas na sua totalidade, o que pode estar na
origem do cromatograma obtido. Contudo, visto que a anlise por HPLC feita por
comparao, este facto no afecta a anlise dos resultados obtidos e, por isso mesmo,
no foram averiguadas individualmente as substncias correspondentes a cada pico de
69
DMEM e DHA. Consequentemente, identificaram-se os tempos de reteno de cada

um dos picos, de DMEM e de DHA, como DMEM 1, DMEM 2, , e DHA 1, DHA 2, etc,
respectivamente. A Tabela 4 apresenta os tempos de reteno determinados.
Tabela 4 Mdia dos tempos de reteno (com n=3) referentes s amostras de AA, DHA e DMEM
analisadas por HPLC.

AA
DHA 1
DHA 2
DHA 3
DMEM 1
DMEM 2
DMEM 3
DMEM 4
3,550,22
2,34 0,01
2,91 0,01
11,52 0,11
2,47 0,64
4,04 0,19
8,56 0,97
14,70 1,72
UV
UV
UV
UV
UV
UV
UV
UV
Tornou-se tambm necessrio averiguar qual o efeito do pH nas reaces das

duas formas da vitamina C, isto , quais as possibilidades de que o pH do meio pudesse
ser suficiente para a oxidao do AA em DHA ou para a reduo do DHA em AA. Para
tal, foram feitas incubaes durante 1 e 72 horas com DMEM e AA e com DMEM e
DHA, cujos resultados obtidos esto manifestos nos Grfico 11e no Grfico 12.
Grfico 11 Anlise do efeito do pH nas duas formas da vitamina C. Foi incubado DMEM com AA 10
mM (A) e DMEM com DHA 10 mM (B), durante 1 h. Uma amostra de cada incubao foi injectada
no HPLC e, posteriormente, analisados os tempos de reteno e reas por integrao grfica.
70
Resultados
Grfico 12 - Anlise do efeito do pH nas duas formas da vitamina C. Foi incubado DMEM com AA 10
mM (A) e DMEM com DHA 10 mM (B), durante 72 h. Uma amostra de cada incubao foi
injectada no HPLC e, posteriormente, analisados os tempos de reteno e reas por integrao
grfica.
Primeiramente, importante realar que foi analisado individualmente o meio

celular aps 72 h de incubao, e comparado com o cromatograma referente 1 h de
incubao (Grfico 10-C), no se verificando alteraes significativas nos tempos de
reteno e respectivas reas de integrao. Desta forma, admissvel comparar os
cromatogramas de amostras referentes a diferentes tempos de exposio.
Comparados os tempos de reteno obtidos com os dados da Tabela 4, verificase que, em ambos os tempos de exposio, na incubao com AA no se forma DHA.
Da mesma forma, na incubao com DHA no se observa qualquer pico semelhante ao
AA e, por isso, no h reduo do DHA em AA.
3.2.2.1.
Avaliao do meio extracelular
Para avaliar a estabilidade da vitamina C nas clulas e, indirectamente, os

mecanismos de transporte da mesma, foram realizados estudos por HPLC. Estes
estudos visam a avaliao dos compostos presentes no meio extracelular. Os
resultados obtidos esto evidenciados nos Grfico 13 e Grfico 15 referentes
incubao com AA e DHA, respectivamente.
71
24h
48h
3 mM
7 mM
10 mM
Grfico 13 - Estudo comparativo para avaliao do meio extracelular aps incubao com AA. As
clulas WiDr foram tratadas, durante 24 e 48 h, na ausncia (C) e na presena de AA, em diferentes
concentraes referidas no grfico. Foram injectadas amostras de cada uma no HPLC e
comparados os tempos de reteno e respectivas reas por integrao grfica.
Primeiramente, foi necessrio identificar os tempos de reteno da amostra

controlo, tendo-se obtido os valores evidenciados na Tabela 5.
72
Resultados
Tabela 5 - Mdia dos tempos de reteno (com n=3) referentes amostra controlo analisada por HPLC.

C1
C2
C3
C4
2,49+0,03
3,89+0,26
6,43+0,10
11,11+0,12
UV
UV
UV
UV
A observao dos grficos permite aferir que, independentemente da

concentrao de AA e do perodo de incubao, o pico do AA detectado por volta dos
3,33 minutos. Contudo, de referir que, a rea de integrao da amostra de AA (10
mM), representada no Grfico 1, 460,03 mV*s. Por sua vez, a mesma concentrao de
AA (10 mM), no ambiente celular, origina um pico referente ao AA de reas 388,65 e
175,37 mV*s, para as 24 e 48 h de incubao, respectivamente. Tendo em conta que,
na anlise por HPLC, o volume de amostra injectado sempre o mesmo (25 L) em
ambos os casos, podemos aferir que a quantidade de AA, com que so incubadas as
clulas, superior quantidade que detectada no meio extracelular.
Por outro lado, a partir desta anlise directa dos cromatogramas, no se
observam picos correspondentes ao DHA. Contudo, comparando os tempos de
reteno do AA, do DHA e do controlo (Tabela 4 e Tabela 5) e tendo em conta que as
reas de integrao da amostra de DHA so muito reduzidas, coloca-se a hiptese de
que os picos de DHA possam estar sobrepostos e, consequentemente, no ser visveis.
Este facto pode, no entanto, ser averiguado pela anlise dos valores das reas de
integrao referentes a cada um dos picos do controlo (C1, C2, C3 e C4).
A partir da anlise das Tabela 4 e Tabela 5 e pela posterior comparao dos
tempos de reteno do DHA (DHA 1, DHA 2, DHA 3) e do controlo (C1, C2, C3 e C4),
possvel perceber que, caso haja sobreposio de picos, esta ser mais evidente nos
73
picos C1 e C4. Assim, um aumento significativo das reas de integrao do C1 e C4,

poder ser um indcio da presena de DHA no meio extracelular.
Grfico 14 Anlise da presena de DHA no meio extracelular. Aps integrao grfica dos
cromatogramas evidenciados no grfico 13 compararam-se as reas de integrao dos picos da
amostra controlo, para os cromatogramas obtidos 24 (A) e 48 (B) horas aps incubao com AA,
para as diferentes concentraes do mesmo.
O Grfico 14 evidencia as reas de integrao dos picos C1, C2, C3 e C4 em

funo da concentrao de AA. No Grfico 14-A no se verificam alteraes
significativas. No Grfico 14-B verifica-se um aumento da rea de integrao C1 que, no
entanto, no acompanhada pelo aumento da rea C4, a qual se mantm constante.
Consequentemente, poder-se- inferir a inexistncia de DHA no meio extracelular.
Os resultados obtidos aps as incubaes com DHA esto apresentados no
Grfico 15. A anlise directa dos cromatogramas no evidencia qualquer existncia de
AA no meio extracelular em qualquer dos perodos de incubao, visto que no se

observa nenhum pico correspondente ao tempo de reteno do AA (Grfico 1). Quanto
existncia de DHA, com o aumento da concentrao verifica-se a presena de um
pico com rea de integrao muito reduzida que poder corresponder ao DHA 2. Para
averiguar este facto, procedeu-se anlise das reas de integrao dos picos da
amostra controlo, tal como foi feito anteriormente.
74
Resultados
24 h
48 h
3 mM
7 mM
10 mM
Grfico 15 - Estudo comparativo para avaliao do meio extracelular aps incubao com DHA. As
clulas WiDr foram tratadas, durante 24 e 48 h, na ausncia (C) (controlo evidenciado no grfico
13) e na presena de DHA, em diferentes concentraes referidas no grfico. Foram injectadas
amostras de cada uma no HPLC e comparados os tempos de reteno e respectivas reas por
integrao grfica.
Os resultados da comparao das reas de integrao dos quatro picos da

amostra controlo so apresentados no Grfico 16. A partir deste verifica-se que, com o
aumento da concentrao de DHA, h um aumento acentuado da rea C1 e um
aumento ligeiro da rea C4, tanto 24 como 48 h aps incubao. Este facto pode
comprovar a presena de DHA no meio extracelular, podendo ser significativa para
incubaes com concentraes elevadas de DHA.
75
Grfico 16 - Anlise da presena de DHA no meio extracelular. Aps integrao grfica dos
cromatogramas evidenciados no grfico 15 compararam-se as reas de integrao dos picos da
amostra controlo, para os cromatogramas obtidos 24 (A) e 48 (B) horas aps incubao com DHA,
DHA, para as diferentes concentraes do mesmo.
De referir que foram efectuados estudos tambm para 72 horas de perodo de

incubao. No entanto, os resultados foram semelhantes aos apresentados para as 24
e 48 horas, pelo que se torna desnecessria a sua apresentao.
3.2.3.
3.2.3.1.
Determinao da citotoxicidade da vitamina C

Avaliao da proliferao celular
Para avaliarmos os efeitos biolgicos da vitamina C em clulas de

adenocarcinoma do clon em cultura, fomos analisar o efeito das duas formas da
vitamina C, o AA e o DHA, em diferentes concentraes e por diferentes perodos de
tempo, na proliferao das clulas, recorrendo ao mtodo do MTT.
Os Grfico 17 e Grfico 18 representam as curvas dose-resposta do AA e do DHA,
respectivamente. Ao controlo, que constitui o termo de comparao, foi atribudo o
valor de 100 %.
76
Resultados
Como se pode observar no Grfico 17, o AA em baixas concentraes (inferiores a

0,5 mM) induz aumento da proliferao celular estatisticamente significativa s 72 e 96
h, atingindo valores de 30 a 40 % superiores relativamente ao controlo. Pelo contrrio,
para concentraes elevadas de AA (superiores a 7 mM), induz inibio da proliferao
celular, de forma dependente da dose, atingindo o IC50 s 48 h quando as clulas so
tratadas com AA na concentrao de 10 mM (p<0,05).
Grfico 17 - Curvas dose-resposta do AA. Os grficos representam o efeito do AA na proliferao das

clulas de adenocarcinoma do clon (WiDr), aps 24, 48, 72 e 96 horas de exposio, nas
concentraes referidas na figura. Os resultados expressam a mdia de seis experincias
independentes.
Quando as clulas foram tratadas com DHA, verificou-se um aumento

significativo da proliferao celular para baixas concentraes deste composto,
embora para concentraes superiores s obtidas para o AA, ou seja,
aproximadamente de 0,25 a 0,5 mM. Por outro lado, o DHA induziu a diminuio da
proliferao celular proporcional ao aumento da dose (p<0,05), embora para
concentraes muito inferiores s de AA utilizadas, uma vez que se atingiu 50 % da
77
proliferao celular (IC50) logo aps as 24h de exposio das clulas a DHA 5-7 mM
(Grfico 18).
Grfico 18 Curvas dose-resposta do DHA. Os grficos representam o efeito do DHA na proliferao

das clulas de adenocarcinoma do clon (WiDr), aps 24, 48, 72 e 96 horas de exposio, nas
concentraes referidas na figura. Os resultados expressam a mdia de seis experincias
independentes.
Assim, de salientar que, o DHA evidenciou um efeito antiproliferativo mais

eficaz que o AA, visto que o IC50 atingido mais precocemente e para concentraes
mais baixas.
3.2.3.2.
Avaliao da viabilidade e morte celular
A avaliao da viabilidade e morte celular foi realizada por citometria de fluxo,

recorrendo dupla marcao com anexina-V-FITC e iodeto de propdeo (IP).
78
Resultados
Como referido anteriormente, esta tcnica permite-nos distinguir diferentes

populaes celulares: clulas viveis (V), clulas em apoptose inicial (A), clulas em
apoptose tardia e necrose (A/N) e clulas em necrose (N) (Grfico 19).
Grfico 19 Dot-plot representativo da marcao com anexina-V e iodeto de

propdeo (AV/IP). As clulas WiDr foram tratadas com 7 mM de DHA, durante 48
h, e marcadas com AV/IP e analisadas por citometria de fluxo. Legenda de cores:
a vermelho - clulas viveis; a azul - clulas em apoptose inicial; a verde - clulas
em apoptose tardia e necrose; e a amarelo - clulas em necrose.
Os estudos de citometria vieram confirmar a inexistncia de morte celular

quando as clulas so tratadas com AA em concentraes inferiores a 2 mM, como se
evidencia no Grfico 20. Porm, na concentrao de 7 mM, observa-se uma diminuio
de 6,5 % de clulas viveis, com aumento da percentagem de clulas em apoptose
tardia/necrose. Pelo contrrio, quando as clulas so incubadas com DHA, observa-se
um efeito antiproliferativo e citotxico mais acentuado. De facto, verificamos que o
DHA induz diminuio da viabilidade de forma dependente da dose, induzindo morte
celular por apoptose/necrose. Como podemos ver no Grfico 20, o DHA, na
concentrao de 7 mM, reduz a viabilidade das clulas em aproximadamente 40 %,
79
relativamente ao controlo (C), aumentando simultaneamente a percentagem de

clulas em apoptose tardia/necrose.
AA
DHA
Grfico 20 Anlise da viabilidade e morte celular por citometria de fluxo recorrendo dupla
marcao com anexina-V e IP. Est representada a percentagem de clulas viveis (V), em
apoptose (A), em apoptose/necrose (A/N) e em necrose (N), aps 48 h de incubao com AA
(esquerda) e DHA (direita). Os dados expressam a mdia de duas experincias independentes.
3.2.3.3.
Avaliao dos mecanismos envolvidos na citotoxicidade da vitamina C
Dada a importncia que as ROS podero ter nos mecanismos de citotoxicidade

da vitamina C, determinmos a presena de perxidos e radical superxido nas clulas
WiDr tratadas com as duas formas da vitamina C, usando as sondas DCFH2-DA e a DHE,
respectivamente.
Como j referimos na seco de mtodos, a determinao de perxidos
possvel tendo em conta que o DCFH2-DA entra na clula e, por aco de esterases,
clivado originando o DCFH, o qual na presena de perxidos origina o composto
fluorescente DCF. Quanto maior a produo de perxidos, maior a intensidade de
fluorescncia desta molcula.
No Grfico 21 observa-se um dot-plot representativo da anlise da produo de
perxidos intracelulares, por citometria de fluxo, recorrendo sonda fluorescente DCF.
80
Resultados
Grfico 21 Dot-plot representativo da anlise de perxidos intracelulares, aps

marcao com DCFH2-DA. As clulas WiDr foram incubadas com DHA 7 mM,
durante 48 h, marcadas com DCFH2-DA e, posteriormente, analisadas por
citometria de fluxo.
Como se pode observar no Grfico 22, quando as clulas so tratadas com DHA
em concentraes de 0,5 e 2 mM, observa-se um aumento de 36,1 % na produo de
perxidos, relativamente ao controlo. Pelo contrrio, nas concentraes mais elevadas
(5 mM), o efeito citotxico foi mais acentuado, observando-se uma diminuio da
produo de perxidos intracelulares de 70,6 %.
Grfico 22 Avaliao de perxidos intracelulares por citometria de fluxo. As clulas

WiDr foram tratadas com AA e DHA, durante 48 h, e a produo de perxidos
detectada, por citometria de fluxo, pela marcao com DCFH2-DA. Os resultados so
expressos em termos da mdia de intensidade de fluorescncia (MIF) e expressam a
mdia de duas experincias independentes.
81
Para avaliarmos a produo do radical superxido (O2-) recorremos marcao

com DHE e anlise das intensidades de fluorescncia por citometria de fluxo. A partir
da anlise dos Grfico 23 e Grfico 24 podemos verificar que, enquanto que as clulas
tratadas com AA apresentam baixas concentraes de O2- relativamente ao controlo,
quando incubadas com DHA, uma tendncia para o contrrio observada, embora
sem significado estatstico.
Grfico 23 Dot-plots representativos da produo de radical superxido (O2-), obtidos por

citometria de fluxo. As clulas WiDr foram tratadas, durante 48 h, na ausncia (controlo A), e na
presena de AA 7 mM (B) e de DHA 7 mM (C). Posteriormente, foram marcadas com DHE e
analisadas por citometria de fluxo.
Grfico 24 Anlise da produo de radical superxido (O2 ) por citometria de fluxo. As clulas
WiDr foram tratadas com AA e DHA, durante 48 h, nas concentraes indicadas no grfico.
Posteriormente, foram marcadas com DHE e o O2 detectado por citometria de fluxo. Os
resultados expressam a mdia de duas experincias independentes.
82
Resultados
3.2.3.4.
Avaliao do potencial de membrana mitocondrial
Para avaliarmos a participao da mitocndria nos efeitos biolgicos da

vitamina C, fomos avaliar o potencial de membrana mitocondrial, recorrendo sonda
fluorescente JC-1 (Grfico 25). Este fluorocromo um catio lipoflico que entra
selectivamente na mitocndria. Este existe na forma de monmeros (M) (fluorescncia
verde), e na forma de agregados (A) (fluorescncia vermelha), dependendo do
potencial de membrana mitocondrial. Assim, emitida fluorescncia que muda do
vermelho para o verde, quando as mitocndrias despolarizam, ou seja, quando diminui
o potencial de membrana mitocondrial.
Grfico 25 Dot-plot representativo da anlise do potencial de membrana

mitocondrial por citometria de fluxo. As clulas foram incubadas na ausncia
de AA e DHA, marcadas com JC-1 e analisadas por citometria de fluxo.
O Grfico 26 mostra a razo M/A nas clulas WiDr tratadas com AA e DHA.
Como podemos observar, ocorre um aumento significativo da razo M/A nas clulas
incubadas com DHA 7 mM, indicativo de diminuio do potencial de membrana
mitocondrial.
83
Grfico 26 Avaliao do potencial de membrana por citometria de fluxo. As clulas

WiDr foram tratadas com diferentes concentraes de AA e DHA, referenciadas no
grfico, durante 48 h. Posteriormente, foram marcadas com a sonda fluorescente
JC-1 e analisadas por citometria de fluxo. Os resultados expressam a mdia de duas
experincias independentes.
3.3. Estudos in vivo

Com o objectivo de estudar o composto marcado e esclarecer os resultados
obtidos no controlo de qualidade, foram realizados estudos in vivo que incluram
estudos de biodistribuio e imagiologia com
99m
Tc-AA, em ratinhos Balb/c nu/nu
normais.
A anlise do Grfico 27, obtido aps os estudos de biodistribuio com 99mTc-AA
e respectiva quantificao de dose injectada por grama de rgo, mostra,
essencialmente, excreo por via urinria (rim, urina e bexiga) e, tambm, via ciclo
entero-heptico (fgado, vescula biliar e blis). De facto, no se verifica captao de
99m
Tc-AA por nenhum rgo preferencial. Com a progresso no tempo, ou seja, dos 30
para os 60 minutos, existe uma diminuio da percentagem de captao por grama de

sangue, o que se observa tambm com o fgado e com a vescula biliar. O contrrio se
84
Resultados
verifica em rgos como o intestino delgado, a bexiga e os genitais, em que a

percentagem de captao do 99mTc-AA aumenta.
99m
Grfico 27 (A) Biodistribuio do Tc-AA. Depois de passados 30 e 60 minutos da administrao do

radiofrmaco, os ratinhos foram sacrificados, os rgos colhidos e a percentagem de dose
injectada por grama de tecido quantificada. (B) Fraco percentual do grfico A.
As imagens adquiridas nos estudos imagiolgicos foram processadas e

normalizadas a uma escala de cores linear, onde o preto corresponde ao mnimo de
actividade e o branco ao mximo. Foram, ento, desenhadas regies de interesse
(ROIs) nos seguintes rgos: tiride, estmago, fgado, rim e bexiga, como
exemplificado na Figura 11. Desta forma, avalimos no s a existncia de impurezas
radioqumicas, na medida em que a acumulao de 99mTc-O4- se d ao nvel da tiride e
do estmago e, por sua vez, a acumulao de 99mTc-RH se verifica ao nvel do fgado e
do bao, mas tambm as vias de excreo (urinria e hepato-biliar).
85
Rato 1
15 min
Figura 11- Imagem representativa das ROIs desenhadas. Aps a

aquisio das imagens estticas em cmara-gama, estas foram
processadas, desenhando ROIs e, posteriormente, quantificada a
actividade.
A partir da quantificao das ROIs foi tambm determinada a razo rgo

alvo/fundo. Considerando que, quanto mais a razo rgo alvo/fundo se aproxima de
1, mais semelhante a acumulao de 99mTc-AA no respectivo rgo com a do fundo,
verifica-se que a acumulao ao nvel da tiride e estmago reduzida e ao nvel do
rim e fgado ligeiramente superior (Grfico 28). Estes dados so concordantes com os
da biodistribuio revelando excreo renal e hepato-biliar, assim como, a reduzida
presena de impurezas radioqumicas.
86
Resultados
Grfico 28 - Razo rgo alvo/fundo. Aps a obteno das imagens

estticas por cmara-gama, estas foram processadas e ROIs em
determinados
rgos
de
interesse
foram
desenhadas.
Posteriormente, foi determinada a razo rgo alvo/fundo,
evidenciada no grfico.
A Figura 12 apresenta imagens estticas adquiridas 15, 30 e 60 minutos aps a

injeco do radiofrmaco, a partir das quais possvel observar uma diminuio da
actividade de fundo ao longo do tempo. Por outro lado, tambm visvel a elevada
acumulao do 99mTc-AA ao nvel da bexiga e rins.
Rato 2
15 min
Rato 2
30 min
Rato 2
60 min
99m
Figura 12 - Imagens estticas adquiridas em cmara-gama. O complexo

Tc-AA foi administrado ao
ratinho 2 e, 15, 30 e 60 minutos depois, foram adquiridas imagens estticas e processadas a uma
escala de cores linear.
87
Captulo IV
4. Discusso
Discusso
O presente trabalho permitiu alcanar alguns avanos, tanto ao nvel da

medicina nuclear como da biologia molecular. Os resultados por ns obtidos podero
ter grande utilidade na to antiga e controversa histria da vitamina C no tratamento
do cancro.
A primeira fase deste trabalho incidiu na marcao radioactiva da vitamina C.
Inicialmente, e baseados numa formulao publicada (Yigit, et al., 2006), utilizmos
como agente redutor o cloreto de estanhoso dihidratado. Contudo, para alm desta
formulao se ter mostrado ineficaz, o controlo de qualidade no permitia a
determinao da pureza radioqumica. Devido a estas razes, esta formulao foi
abandonada. Posteriormente, e aps consulta de algumas publicaes dos anos 70
(Hauser, et al., 1971; Stapleton, et al., 1967; Persson, et al., 1975), experimentou-se
usar como agente de redutor o cloreto de ferro (III) (FeCl3).
Para a marcao radioactiva da forma reduzida da vitamina C (AA), foi
necessrio ter em conta alguns aspectos qumicos dos diferentes compostos em
questo. O pertecnetato de sdio (Na99mTcO4), eludo a partir de um gerador
99m
Mo/99mTc, o composto a partir do qual se obtm tecncio no estado de oxidao
+7 e, por isso, fortemente deficiente em electres. Contudo, para marcar o ligando

(neste caso, o AA) o 99mTc tem que ser reduzido a estados de oxidao inferiores (III ou
IV), da a necessidade de um agente redutor. Por outro lado, para ceder electres ao
99m
Tc, e assim diminuir o seu estado de oxidao, o cloreto de ferro (III) necessita de
passar a cloreto de ferro (II). Supomos que o AA tenha um papel de extrema

importncia neste processo.
Assim, aliando os aspectos qumicos mencionados e os procedimentos de
marcao efectuados, o processo a partir do qual sugerimos que ocorra a formao do
91
complexo
99m
Tc-AA descrito seguidamente. Ao se adicionar o FeCl3 ao
99m
Tc, como
primeiro passo do procedimento de marcao, estes no reagem entre si, visto que o
agente redutor no possui electres para ceder. S posteriormente, quando
adicionado o AA, que ir ocorrer a oxidao do cloreto de ferro (III) com a formao
de cloreto de ferro (II). Por sua vez, o cloreto de ferro (II) cede electres ao 99mTc(VII)
reduzindo-o a
99m
Tc(III) ou
99m
Tc(IV). Nestes estados de oxidao torna-se ento
possvel a formao do complexo de 99mTc-AA, que poder, ou no, incluir o cloreto de

ferro na sua constituio. A relativa complexidade da reaco de formao do
complexo 99mTc-AA pode ser a razo pela qual esta se processa to lentamente, de tal
modo que, em determinados casos, as eficincias de marcao elevadas s foram
atingidas 24 horas aps a adio do ligando.
A pureza radioqumica do complexo foi controlada por HPLC, permitindo assim
averiguar as condies ptimas para a obteno de elevado grau de pureza. Foram
testados diversos volumes de cloreto de ferro (0,1 N) e diferentes concentraes de
AA, at se terem atingido as condies ptimas de agente redutor e ligando, que
foram de 0,2 mL de FeCl3 e 200 mg de AA. Para alm disso, verificmos que quando o
processo de marcao era realizado em locais em que a temperatura ambiente era
mais elevada, a eficincia de marcao era consideravelmente mais baixa. Por esta
razo, minimizmos o efeito da temperatura, procedendo marcao em gelo (0-4C),
tendo-se obtido um aumento considervel na pureza radioqumica. Por outro lado,
aps vrias tentativas, verificmos tambm que o pH era outro factor que influenciava
a eficincia de marcao. Assim, verificou-se que, quando o pH era de 6,5 e, quando os
componentes se encontravam em atmosfera argonada a eficincia de marcao era
maior. de referir tambm, que a microcromatografia ascendente dever ser
92
Discusso
optimizada com o intuito de se obter resultados de forma eficiente e de maneira mais

simples.
Para analisarmos os efeitos biolgicos da vitamina C no cancro do clon, a par

do processo de marcao do AA foram tambm realizados estudos in vitro com uma
linha celular de adenocarcinoma do clon, as clulas WiDr. Comemos por analisar o
influxo das duas formas da vitamina C, oxidada (AA) e reduzida (DHA) recorrendo a
estudos de captao e de estabilidade por HPLC.
A partir dos estudos de captao do
99m
Tc-AA podemos concluir que no h
captao significativa do complexo pelas clulas de adenocarcinoma do clon. De

facto, e apesar das variaes na percentagem de captao em ambas as concentraes
analisadas, verifica-se que estas no excedem os 2,5 % (Grfico 8). Por outro lado,
quando comparmos as percentagens de captao do
99m
Tc-AA e do
Tc-O4-,
99m
verificamos que so semelhantes e, quando no so, a do 99mTc-O4- maioritariamente

superior (Grfico 9). Assim, podemos concluir que a captao verificada pode ser
devida existncia desta impureza radioqumica (99mTc-O4-) na soluo de
99m
Tc-AA.
Estes resultados esto de acordo com estudos efectuados por outros autores que
mostram que as clulas tumorais no so capazes de transportar directamente o AA
(Agus, et al., 1999), o que justifica os valores reduzidos de captao da forma reduzida
da vitamina C marcada nas nossas clulas.
Uma vez que o pH pode influenciar as reaces de oxidao-reduo e como o

tratamento das clulas WiDR com vitamina C diminui o pH extracelular, fomos analisar,
por HPLC, o efeito do pH na oxidao do AA em DHA e/ou na reduo do DHA a AA.
Assim, quando ao meio DMEM acidificado se adicionou AA, na ausncia de clulas, no
93
observmos a presena de nenhum pico correspondente ao DHA, o que sugere que

no ocorreu oxidao do AA em DHA (Grfico 11). Da mesma forma, quando ao meio
DMEM adicionmos DHA, os cromatogramas obtidos no revelaram a existncia de
AA, o que nos permite concluir que no ocorre reduo do DHA a AA.
Consequentemente, lcito afirmar que o pH no suficiente para que ocorram
reaces que permitam a interconverso das duas formas da vitamina C, o que sugere
que a alterao do pH no influencia os efeitos biolgicos da vitamina C observados
nas nossas clulas. No entanto, estas observaes no excluem a possibilidade da
acidificao inibir o transporte de AA, interferindo com a sua eficcia biolgica, como
descrito por alguns autores (Wilson, 2005).
Para verificarmos qual ou quais da(s) forma(s) de vitamina C atravessam a

membrana celular para o interior das clulas WiDR, fomos avaliar a presena de AA e
de DHA no meio extracelular. Assim, nas clulas tratadas com AA, detectmos a
existncia de um pico referente ao AA, e nenhum relativo ao DHA (Grfico 13). Estes
resultados esto de acordo com os estudos de captao e com o descrito por outros
autores (Agus, et al., 1999) e sugerem que o AA no capaz de atravessar a membrana
das clulas, o que justifica a sua permanncia no meio extracelular. No entanto, a
quantidade de AA detectada por HPLC no meio extracelular inferior quantidade
com que as clulas foram incubadas, o que indica que poder ter ocorrido oxidao do
AA com formao de DHA. Ora, o DHA capaz de atravessar as membranas celulares
atravs do sistema de transporte GLUT1 e, uma vez no interior das clulas,
convertido em AA por uma reductase. Este AA permanece no interior das clulas que
no possuem sistemas de transporte para este composto (Agus, et al., 1999). Estas
94
Discusso
observaes podem explicar a diminuio de AA e a ausncia de DHA no meio

extracelular. Por outro lado, nas clulas tratadas com DHA no detectmos a presena
de AA (Grfico 15), o que nos leva a concluir, como seria de esperar, que no ocorre
formao de AA por reduo do DHA no meio extracelular. No entanto, nos
cromatogramas obtidos verifica-se a presena de DHA que, apesar de reduzida, pode
ser significativa, quando as clulas foram tratadas com concentraes elevadas de
DHA. Este facto poder ser hipoteticamente explicado por uma saturao ao nvel dos
transportadores de membrana que, na presena de elevadas concentraes do
composto, deixam de o poder transportar (Agus, et al., 1999; Rumsey, et al., 1997).
Aps confirmarmos qual a forma de vitamina C predominante no meio

extracelular das nossas clulas, fomos avaliar a sua potencial utilizao teraputica no
cancro do clon. Para o efeito, tratmos clulas obtidas de um doente com
adenocarcinoma do clon, as clulas WiDR, com as duas formas de vitamina C e
avalimos os seus efeitos na proliferao e na viabilidade celular, por colorimetria e
por citometria de fluxo.
Os nossos resultados mostram que o AA e o DHA em baixas doses (at 0,5 mM)
induzem proliferao celular, enquanto que em doses elevadas possuem um efeito
anti-proliferativo nas clulas de adenocarcinoma do clon, sobretudo quando as
clulas so tratadas com DHA (Grfico 17 e Grfico 18). De facto, quando as clulas
foram tratadas com DHA observmos inibio de 50% na proliferao celular (IC50),
mais precocemente e para concentraes inferiores s utilizadas para o AA (Grfico 17
e Grfico 18). Os efeitos antiproliferativos observados podem estar relacionados com a
capacidade do DHA impedir a activao do IKK, uma enzima essencial fosforilao
95
do inibidor do NF-kB, o IkB. Se o IkB no estiver fosforilado, no degradado,

permanecendo ligado ao NF-kB, impedindo a sua aco. Ora, o NF-kB um factor de
transcrio que est envolvido na transcrio de mltiplos genes que codificam
protenas com vrias funes na clula, nomeadamente na progresso do ciclo celular
(Crcamo, et al., 2004).
Este efeito anti-proliferativo, predominantemente, do DHA acompanhado de

um efeito citxico, como demonstram os estudos efectuados por citometria de fluxo
recorrendo dupla marcao com anexina V e iodeto de propdeo (IP). De facto, nas
clulas tratadas com DHA, na concentrao de 7 mM, observmos diminuio da
percentagem de clulas viveis e aumento do nmero de clulas em apoptose tardia
e/ou necrose (Grfico 20). Esta tcnica, como j referimos, baseia-se no facto de que,
quando as clulas entram em apoptose, a fosfatidilserina, um fosfolpido
habitualmente do folheto interno da membrana celular, exterioriza-se e liga-se
anexina. Desta forma as clulas que entram em apoptose marcam positivamente para
este fluorocromo. Por outro lado, numa fase mais avanada de apoptose, e/ou quando
as clulas entram em necrose, a membrana celular torna-se permevel, permitindo a
entrada do iodeto de propdeo na clula, o qual ao intercalar-se no ADN emite
fluorescncia. Pelo contrrio, as clulas viveis no apresentam positividade para
nenhum dos fluorocromos (Grfico 19) (Chen, et al., 2008).
Um dos mecanismos que tem sido sugerido para o efeito citxico selectivo da
vitamina C nas clulas tumorais envolve o stresse oxidativo (Chen, et al., 2005). De
facto, nos processos de interconverso da vitamina C ocorre formao de espcies
reactivas de oxignio (ROS). Por outro lado, h evidncias de que as clulas tumorais
96
Discusso
possuem uma diminuio da concentrao de catalase num factor de 10 a 100. De

salientar que a catalase responsvel pela destoxificao do H2O2. Desta forma, a
diminuio da catalase nas clulas tumorais promove a acumulao de H2O2 formado a
partir da oxidao da vitamina C. Este facto pode assim estar na origem do efeito proxidante da vitamina C e, consequentemente, explicar os efeitos citotxicos
evidenciados (Drisko, et al., 2003; Li, et al., 2007).
Tendo em conta a argumentao anterior, fomos avaliar a presena de ROS,
nomeadamente de perxidos intracelulares e de anio superxido. Para o efeito
recorremos marcao das clulas com DCFH2-DA e com DHE, respectivamente, e
posterior anlise por citometria de fluxo. O DCFH2-DA, uma molcula lipossolvel no
fluorescente, entra dentro das clulas, hidrolisada por esterases, libertando o DCFH.
Este liga-se aos perxidos intracelulares, com formao de DCF, que emite
fluorescncia (Tarpey, et al., 2003). Por sua vez, o DHE atravessa facilmente as
membranas celulares e convertido pelo radical superxido a etdeo, composto
fluorescente de cor vermelha que se intercala no ADN, permanecendo no interior da
clula (Zhao, et al., 2005).
Como j referimos, os nossos resultados mostram nas clulas tratadas com
DHA, em baixa concentrao, um aumento dos perxidos, enquanto que, em
concentraes elevadas, observmos o efeito contrrio (Grfico 22). Em nenhuma das
condies observmos variaes significativas de anio superxido (Grfico 24).
Apesar de termos observado citotoxicidade para nveis elevados de vitamina C,
sobretudo de DHA, e de nestas condies verificarmos diminuio acentuada dos
nveis de perxidos, sugerimos que estas espcies podero ter sido convertidas em
espcies mais lesivas para a clula como o radical hidroxilo (OH) e/ou perxido nitrito
97
(ONOO-). Estas espcies reactivas no foram medidas, no entanto, esta justificao

extremamente plausvel, na medida em que, na presena de ferro livre, o perxido de
hidrognio transformado pela reaco de Fenton/Habber Weiss em radical OH, e o
anio superxido, na presena de xido ntrico NO, pode ser convertido em ONOO-.
Estes radicais livres so bastante reactivos e txicos para a clula podendo induzir
morte celular (Li, et al., 2007; Valko, et al., 2007).
Sabe-se que, consoante as concentraes em que estiverem presentes, as ROS
podem, tanto ter efeitos proliferativos, como efeitos citotxicos nas clulas.
Normalmente, os efeitos proliferativos verificam-se quando as ROS se encontram em
baixas concentraes, e podem ser traduzidos pela activao de genes e, consequente,
induo e manuteno das vias de transduo de sinal, assim como, pela promoo da
funo imunitria. Por outro lado, quando presentes em altas concentraes, as ROS
podem provocar a morte celular pela leso oxidativa de biomolculas (DNA, lpidos,
protenas e acares), assim como, pela promoo da disfuno mitocondrial (Valko, et
al., 2007). Estas evidncias explicam os efeitos antagnicos provocados pela vitamina C
na proliferao e viabilidade celulares.
Para confirmarmos a participao da mitocndria nos efeitos biolgicos da
vitamina C fomos avaliar o potencial de membrana mitocondrial pela marcao com
JC-1. Como j referimos, esta molcula existe sob duas formas, monmeros (M) e
agregados (A), dependendo do potencial de membrana mitocondrial. Desta forma,
quanto maior a razo M/A, menor o potencial de membrana (), o que implica
alteraes na funo mitocondrial e, consequentemente, morte celular por apoptose
e/ou necrose. Por outro lado, a diminuio da razo M/A, traduz o aumento do
98
Discusso
potencial de membrana (), o que pode estar relacionado com a proliferao celular
(Yao, et al., 2008).
Os nossos estudos esto de acordo com o referido anteriormente e confirmam

os resultados obtidos nos estudos de proliferao. De facto, observmos diminuio da
razo M/A, nas condies em que a vitamina C induziu proliferao celular, e um
aumento muito acentuado desta razo nas concentraes em que observmos morte
celular, ou seja, com concentraes elevadas de DHA (Grfico 26). Tais resultados
sugerem que a diminuio do potencial de membrana mitocondrial, poder estar
relacionado com o efeito citotxico da vitamina C nas clulas de adenocarcinoma do
clon.
Como verificmos, os efeitos citotxicos e anti-proliferativos da vitamina C so

mais precoces e para concentraes mais baixas de DHA do que de AA. Este facto pode
ser explicado pela anlise do metabolismo das duas formas da vitamina C, a forma
reduzida, AA, e a forma oxidada, DHA, que efectumos por HPLC. A forma reduzida,
no entra directamente nas clulas tumorais, entrando de forma indirecta, por
oxidao em DHA o qual atravessa as membranas celulares utilizando o transportador
GLUT-1 (Agus, et al., 1999). Existem evidncias de que as clulas tumorais no
possuem transportadores dependentes de sdio (SVCTs), logo no transportam AA,
mas apresentam sobrexpresso do transportador GLUT (Li, et al., 2007), um sistema de
transporte utilizado pelo DHA. Assim, podemos concluir que, tanto a sobrexpresso
dos transportadores (GLUT) como o transporte directo do DHA pelos mesmos, sejam
factores que promovam a acumulao do DHA intracelular, a sua consequente reduo
a AA, e posteriormente, a induo da formao das ROS responsveis pelo efeito
99
citotxico. Este processo ser hipoteticamente mais rentvel com o transporte directo
do DHA para o interior da clula do que com o transporte indirecto de AA. Estes factos
podem justificar os efeitos anti-proliferativo e citotxicos tardios da forma reduzida da
vitamina C, o AA.
A partir dos estudos in vivo foi possvel averiguar as vias de excreo e

metabolizao do composto marcado e o controlo de qualidade do mesmo recorrendo
tecnica de HPLC. A partir dos estudos de biodistribuio, assim como, dos estudos
imagiolgicos com 99mTc-AA, pudemos verificar que a excreo do complexo se efectua
via renal e hepato-biliar (Grfico 27 e Figura 12). Para alm disso, a partir destes estudos
verificmos uma
reduzida
acumulao do radiofrmaco em rgos onde
preferencialmente se acumulam impurezas radioqumicas, tais como, tiride,

estmago, fgado e bao. Estes dados levam-nos a concluir que a formulao
farmacutica desenvolvida e analisada possua um elevado grau de pureza
radioqumica, e que poderia ser usada para o objectivo proposto.
100
Concluso
Concluso
Seguidamente, apresentam-se as principais concluses que foram obtidas a

partir da anlise dos resultados do nosso trabalho, envolvendo a marcao radioactiva
da vitamina C e os estudos biolgicos efectuados in vitro e in vivo.
De todo o trabalho realizado, desde a preparao da formulao farmacutica,
at obteno de imagem, passando pelo desenvolvimento de todo um conjunto de
procedimentos para controlo de qualidade da pureza radioqumica, em relao
marcao radioactiva do cido ascrbico (AA), a forma reduzida da vitamina C,
conclumos que:
Foi desenvolvida e optimizada uma formulao farmacutica, para obteno do

complexo
99m
Tc-AA, com elevado grau de pureza radioqumica, como mostram os
estudos de HPLC.
Foi igualmente desenvolvido por HPLC, um mtodo de controlo de qualidade,

que tornou possvel a separao dos diferentes compostos radioactivos presentes na
formulao farmacutica.
A reaco de formao do complexo
99m
Tc-AA lenta, na medida em que se
obtiveram elevadas eficincias de marcao, 24 horas aps a adio de ligando.
A microcromatografia ascendente em camada fina dever ser ainda optimizada,

com o intuito de se obterem resultados de forma mais eficiente e simples.
Relativamente aos estudos in vitro, realizados em clulas de adenocarcinoma

do clon, WiDr, pudemos retirar as seguintes concluses:
103
As clulas de adenocarcinoma do clon no so capazes de transportar

directamente o AA, visto que a captao do complexo
99m
Tc-AA por estas muito
reduzida.
O pH no influencia os efeitos biolgicos da vitamina C observados nas clulas

de adenocarcinoma do clon, dado que a acidificao do meio, na ausncia de clulas,
no se mostrou ser suficiente para permitir a interconverso das duas formas da
vitamina C. Pode, contudo, interferir no transporte desta vitamina atravs das
membranas celulares.
Os nossos estudos sugerem que o AA no atravessa a membrana celular das

nossas clulas, contudo, no meio extracelular, este composto poder ser oxidado,
formando DHA.
A diminuio de DHA no meio extracelular das clulas tratadas com este

composto, sugere que o DHA atravessa a membrana das clulas de adenocarcinoma
do clon e, no citoplasma, rapidamente convertido em AA, o qual fica retido no
interior das clulas. De facto, no meio extracelular, no observmos aumento da
concentrao de AA nas clulas tratadas com DHA.
As duas formas da vitamina C induzem um efeito na proliferao das clulas de

adenocarcinoma do clon, de forma dependente da dose. Baixas concentraes de AA
e DHA (at 0,5 mM) induzem a proliferao celular, enquanto que concentraes mais
elevadas tm um efeito anti-proliferativo.
No entanto, o efeito anti-proliferativo do DHA mais acentuado que o do AA.

De facto, o IC50 atingido mais precocemente e para concentraes inferiores de DHA
relativamente s de AA.
104
Concluso
O efeito anti-proliferativo acompanhado de um efeito citotxico, dada a

diminuio da viabilidade celular e, consequente, aumento de morte celular por
apoptose tardia e necrose que verificmos.
O efeito citotxico do DHA poder estar relacionado com a produo de ROS,

nomeadamente, pela converso de perxidos em espcies bastante reactivas e
txicas, tais como, o radical hidroxilo e o perxido nitrito, o que est de acordo com a
morte celular por apoptose tardia/necrose que observmos.
A disfuno mitocondrial, avaliada pela diminuio do potencial de membrana

mitocondrial, outro dos mecanismos que est relacionado com o stresse oxidativo e
que pode contribuir para o efeito citotxico de elevadas doses de vitamina C nas
clulas de adenocarcinoma do clon.
Os nossos resultados sugerem que, nas clulas WiDR, o transporte directo do

DHA para o interior das clulas dever estar relacionado com a sobrexpresso dos
GLUT. Por outro lado, o DHA, directamente ou por posterior reduo a AA, pode
induzir a morte das clulas de adenocarcinoma do clon podendo constituir uma
abordagem terputica neste tipo de neoplasias.
Por ltimo, podemos retirar algumas concluses dos estudos in vivo realizados:
O complexo 99mTc-AA excretado por via renal e hepato-biliar.

A formulao farmacutica de
99m
Tc-AA possui uma elevada eficincia de
marcao, sustentada por estudos de biodistribuio e imagiolgicos, a qual permitiu a

utilizao do composto para o objectivo proposto.
105
Trabalho Futuro
Com o intuito de melhorar os resultados por ns obtidos, sugere-se a marcao
da forma oxidada da vitamina C, recorrendo adio de ascorbato oxidase
formulao farmacutica por ns desenvolvida para marcao da forma reduzida. Este
protocolo tem sido seguido, por muitos autores, em processos de marcao do DHA
com 14C (Mauln, et al., 2002; Crcamo, et al., 2004; Agus, et al., 1997; Savini, et al.,
2000; Holmes, et al., 2002).
Dadas as dificuldades que surgiram na anlise da presena de DHA por HPLC,
sugere-se que, futuramente, seja desenvolvido um mtodo de HPLC que permita
separar claramente este composto. Um possvel protocolo apresentado por Savini, et
al., 2000.
Considerando que a citotoxicidade da vitamina C s foi avaliada por citometria
de fluxo, aps tratamento das clulas de adenocarcinoma do clon durante 48 horas,
sugere-se que seja determinada para outros tempos de exposio de AA e DHA,
permitindo assim fazer uma avaliao ao longo do tempo. Para confirmarmos os
mecanismos envolvidos na citotoxicidade da vitamina C, sugere-se a medio do
radical hidroxilo (OH) e das espcies reactivas de nitrognio, nomeadamente, do
perxido nitrito (ONOO-).
106
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Faculdade de Cincias e Tecnologia

Estudos in-vitro e in-vivo atravs de mtodos

Trabalho realizado por: Ana Salom dos Santos Pires

A vitamina C uma substncia essencial no metabolismo das clulas vivas, com

estudos de estabilidade por HPLC e estudos de avaliao da citotoxicidade da vitamina

obter informao sobre a biodistribuio e vias de excreo e metabolizao do

ROI Region of interest

Agradecimentos ........................................................................................................................... III

Absoro, Armazenamento e Excreo ................................................................ 5

Transporte indirecto via GLUTs ..................................................................... 8

Transporte directo via SVCTs ........................................................................ 9

Vitamina C & Cancro ................................................................................................... 13

Administrao i.v. vs. oral ................................................................................... 17

Stresse Oxidativo ................................................................................................. 19

Efeito antioxidante ...................................................................................... 22

Efeito pr-oxidante ..................................................................................... 24

Citotoxicidade selectiva ....................................................................................... 25

Estudos de Qumica ..................................................................................................... 32

Preparao do 99mTc-AA ...................................................................................... 32

Controlo de Qualidade do 99mTc-AA .................................................................... 33

Microcromatografia ascendente ................................................................. 38

Estudos in vitro ............................................................................................................ 41

Culturas celulares de adenocarcinoma do clon ................................................ 42

Estudos de Captao ........................................................................................... 42

Determinao da Viabilidade e Celular ............................................................... 44

Estudos de estabilidade da vitamina C ................................................................ 45

Avaliao do meio extracelular ................................................................... 46

Determinao da citotoxicidade da vitamina C .................................................. 47

Avaliao da proliferao celular por colorimetria ..................................... 48

Avaliao da viabilidade, morte celular e produo de ROS por citometria

2.2.5.2.1. Avaliao da morte celular ....................................................................... 49

Estudos in vivo ............................................................................................................. 54

Estudos de Biodistribuio com 99mTc-AA ........................................................... 54

Imagiologia com 99mTc-AA ................................................................................... 55

Anlise Estatstica ........................................................................................................ 57

Captulo III ................................................................................................................................... 59

Estudos de qumica ..................................................................................................... 61

Preparao e controlo de qualidade do 99mTc-AA ............................................... 61

Microcromatografia ascendente ................................................................. 65

Estudos in vitro ............................................................................................................ 66

Estudos de captao do 99mTc-AA........................................................................ 66

Estudos de estabilidade da vitamina C ................................................................ 68

Determinao da citotoxicidade da vitamina C .................................................. 76

Avaliao do meio extracelular ................................................................... 71

Avaliao da proliferao celular ................................................................ 76

Avaliao da viabilidade e morte celular .................................................... 78

Avaliao dos mecanismos envolvidos na citotoxicidade da vitamina C .... 80

Avaliao do potencial de membrana mitocondrial ................................... 83

Estudos in vivo ............................................................................................................. 84

Concluso .................................................................................................................................. 101

O cido ascrbico (AA), tambm denominado vitamina C ou ascorbato, uma

Figura 1 - Reaco de oxidao do AA com formao de DHA. Retirado de (Corpe, et

Citotoxicidade Selectiva da Vitamina C

dos dentes). Outras consequncias da carncia de vitamina C so anemia, escorbuto,

Absoro, Armazenamento e Excreo

Os humanos apenas obtm a vitamina C exogenamente, cuja absoro ocorre

Citotoxicidade Selectiva da Vitamina C

Os sistemas de transporte associados membrana plasmtica celular

difuso simples, a difuso facilitada e os mecanismos de transporte activo contribuem

Citotoxicidade Selectiva da Vitamina C

Transporte indirecto via GLUTs

O DHA passa atravs da membrana por um mecanismo especfico de difuso

Figura 2 - Mecanismo de transporte da vitamina C pelas GLUT. No meio extracelular o AA