REA DE SUSTENTABILIDAD PARA EL DESARROLLO

PROGRAMA ACADMICO DE QUMICA

ESPECIALIDAD TECNOLOGA AMBIENTAL

GRUPO
QU-304

MATERIA
Microbiologa ambiental

TEMA
Reporte diagnostico microbiologico en sitio alterado Presa Blanca ( Puente 1)
de acuerdo a la norma NMX-AA-042/1-SCFI-2008 y NMX-AA-042/ 1-SCFI-1987.

PROFESOR
Dra. Rosy Rico Mata

PRESENTAN
vila Araujo Ilse Vernica
Gmez Navarro Mara Guadalupe
Guerra Navarro Janet Valeria
Rendn Delgado Reyna Mara Guadalupe

GENERACION 2014-2016

22 DE JUNIO DEL 2015

Antecedentes
La Presa Blanca se ubica en el estado de Guanajuato en el municipio de Len,
localizado en una altura de 1784 metros sobre el nivel del mar .Tiene una latitud
(decimal) de 21.091667 N y la longitud en el sistema decimal es -101.69944 O .

Ilustracin 1 Ubicacin de la presa blanca, sealando con

los puntos amarillos en el rea de muestreo

La creciente actividad industrial en el estado de Guanajuato ha trado consigo

la generacin de grandes cantidades de efluentes (0.35 Hm3 d-1), parte de los
cuales se descargan sin tratamiento a los ros, capta las descargas de aguas
residuales en la presa Blanca y la ciudad de San Francisco.
Debido a esta problemtica se tom la iniciativa de muestrear esta zona
contaminada de la Ciudad de Len, Guanajuato. Tomando como referencia un punto
especfico de este lugar el cual se encuentra con coordenadas en N a 210536.11 y
O a 1014225.5.Y a partir de ello se tomaron muestras de agua y suelo para
posteriormente realizar una serie de anlisis microbiolgicos.

Ilustracin 2: Punto de muestreo de

agua

Ilustracin 3: Punto de muestreo de suelo

Relatora del muestreo

Comenzamos a alistarnos para nuestro muestreo desde las 8 a.m. del da 11
de junio del 2015, recogiendo el material de laboratorio como; los frascos para
guardar las muestras, las cajas Petri con medio de cultivo Agar Bilis Rojo Violeta, la
hielera, hisopos, entre otras cosas.
Partimos de la universidad a las 9:30 a.m. con destino al sitio de muestreo que
est ubicado en Presa Blanca en Len, Guanajuato, con coordenadas N a
210536.11 y O a 1014225.5.

Ilustracin 4: Partida de la UTL al lugar

del muestreo Presa Blanca.

Llegamos a dicho lugar a las 10:20 a.m., nuestro punto de muestreo estaba
ubicado en el puente 1. El clima del lugar era soleado con una temperatura de
28C.

Ilustracin 5: Llegada al lugar de

muestreo puente Presa Blanca

Comenzamos bajando el material del camin, para posteriormente empezar a

buscar un punto de muestreo, este punto est ubicado en las coordenadas N a
210536.0 y O a 1014224.5.

Ilustracin 6: Acomodando las

cosas
para
posteriormente
seguir con el muestreo.

Ilustracin 7: Ubicacin del punto de

muestreo para suelo.

Siendo las 10:48 a.m. nuestra compaera Reyna Rendn comenz el

muestreo superficial en la caja Petri ya preparada con Agar Bilis Rojo Violeta,
tomando con un hisopo estril una pequea muestra y haciendo la siembra en modo
zig-zag posterirmente la conservamos a 4C resguardndola en una hielera
especialmente para microbiologa, terminando el muestreo a las 11:00 am.

Ilustracin 8: siembra de la muestra de

suelo superficial.

Ilustracin 9: siembra en zigzag de suelo

superficial

A las 11:05 a.m., hicimos un orificio de 30 cm de profundidad en el suelo

utilizando una barrena, para hacer la siembra en otra caja Petri con medio de cultivo
Agar Bilis Rojo Violeta. Nuestra compaera Ilse vila Introdujo el hisopo en la
profundidad del suelo, tom la muestra y repiti el procedimiento de volver a
sembrar en modo zigzag. Al final se etiquetaron las cajas Petri sembradas de suelo
y se conservaron a 4C. Terminamos de sembrar las muestras de suelo a las 11:15
a.m.

Ilustracin 10: Cavando un una

barrena para hacer el orificio de
30 cm

Ilustracin 11: Orifico listo

para la siembre a 30 cm de
profundidad de suelo

Ilustracin 12: Siembra

profundidad.

Ilustracin 13: Trmino de la siembra de suelo a

profundidad

a 30 cm de

Finalmente a las 12:14 p.m. Guadalupe Gmez tom la muestra de agua del puente
1.

Ilustracin 14; Punto de muestreo de agua

Cuidadosamente se tom con una jeringa estril, 1 ml de agua residual,

abrimos la caja Petri con el mismo medio de cultivo que las anteriores (Agar BRV) y
la sembramos vertiendo el contenido de la jeringa en la caja Petri. Esta siembra fue
realizada por Valeria Guerra

Ilustracin 15: siembra de la muestra de agua

Se termin de sembrar agua y suelo a las 12:33 pm y se conserv a 4C en

una hielera para posteriormente trasladarla al laboratorio de la Universidad
Tecnolgica de Len, siendo las 2:30 de la tarde partimos del lugar de muestreo
rumbo al laboratorio de la escuela.

Las incubacin de las muestras fue a las 3:20 de la tarde esto lo realizo Ilse
vila, terminando a las 3:30 p.m.
Dando por finalizado un aprendizaje ms a las 3:40 pm

Ilustracin163: Incubacin de las muestras de suelo y

agua sembradas

Tcnica de muestreo
Lista de materiales
Lista de materiales y herramientas (en campo)
1 Esptula pequea
Piceta
1 Pipeta de 1, 5 y 10 mL
Plumas
10 Hisopos
Pico y pala
3 Pro-pipetas
Termmetro
4 Frascos de vidrio
GPS
(esterilizados)
5 Cajas Petri.
Hielera
7 Bolsas / bolsas tipo ziploc
Hielos
Bitcora de campo
Papel aluminio.
Cinta masking-tape
Plumn indeleble.
Plano del rea del
Cuerda
muestreo con
coordenadas
EPP (Guantes, cubrebocas,
zapatos de seguridad, bata, y
lentes)

Las muestras para el anlisis de coliformes fecales se toman en frascos de

vidrio o bolsas Whirl-pak de 300 mL.
Agregar 1 gota de solucin de tiosulfato de sodio al 1% a cada frasco para
muestra de agua (Nota 1).
Se esterilizan los frascos de vidrio en autoclave a 121C, 15 lb de presin por
15 minutos, con un capuchn de papel estraza o aluminio cubriendo el tapn hasta el
cuello, dicho capuchn no se quitar hasta el momento de tomar la muestra.
Para la recoleccin de las muestras, se toma la muestra en el centro del canal
o colector donde el flujo sea turbulento, se sumerge el recipiente en el agua con el
cuello hacia abajo hasta una profundidad de 15 a 30 cm, abrir y enderezar el
recipiente ligeramente hacia arriba, procurando que sea a contracorriente, se
destapa el recipiente y se llena hasta 2/3 partes, se tapa y se retira.

Preservacin y conservacin de la muestra:

Tabla. Especificaciones de almacenamiento de la muestra

Volumen
de
muestra

Parmetros

ORGANISMOS
COLIFORMES

ORGANISMOS
COLIFORMES
TERMOTOLER
ANTES

Escherichia coli
PRESUNTIVA

Tipo de
recipiente

Temperatura

Agente
Preservador

Tiempo de
almacenamiento

Norma NMX

125 mL

frascos mbar
estriles
o
bolsas
whirlpack o ziploc

4 +/- 1 C

N/A

No exceder las 24 h

NMX-AA-102SCFI-2006

125 mL

frascos mbar
estriles
o
bolsas
whirlpack o ziploc

4 +/- 1 C

N/A

No exceder las 24 h

NMX-AA-102SCFI-2006

125 mL

frascos mbar
estriles
o
bolsas
whirlpack o ziploc

4 +/- 1 C

N/A

No exceder las 24 h

NMX-AA-102SCFI-2006

Actividades en campo para llevar a cabo el muestreo de microbiologa.

1.-Llegar al sitio del muestreo (Presa Blanca)
2. Ubicar los puntos de muestreo (suelo y agua)
3.-Realizar una siembra superficial de suelo, con un hisopo en una caja Petri con
agar bilis rojo violeta, etiquetar y guardar en una bolsa ziploc la caja Petri e introducir
en la hielera a 4C.
4.-Realizar una siembra a profundidad de suelo de 30 cm, con un hisopo en una caja
Petri con medio bilis rojo violeta, etiquetar y guardar en una bolsa ziploc la caja Petri
e introducir en la hielera a 4C.
5.- Tomar 1 mL de muestra de agua y distribuir en una caja Petri con medio bilis rojo
violeta, etiquetar y guardar en una bolsa ziploc la caja Petri e introducir en la hielera
con un temperatura de 4C, sin que la caja Petri quede invertida para que la muestra
no se derrame.
6.- Tomar 600 mL de muestra de agua, en 2 frascos esterilizados, si enjuagar,
cuidando que el volumen de agua este a la mitad o tres cuartos del frasco, para
permitir la respiracin de los microorganismos, etiquetar y preservar en la hielera a
4C.
7.- Tomar 200 g de suelo e introducir en dos frascos esterilizados y preservar en la
hielera a 4C.
Nota 1. Preparacin del tiosulfato de sodio al 1%.
Pesar 1g de tiosulfato de sodio (Na2S2O3) y disolver en 100 ml de agua
destilada, agitando continuamente hasta su total disolucin.

Prueba presuntiva para coliformes totales (NMP)

Lista de Materiales, Equipos y Reactivos
Materiales
Equipo
Reactivos
15 Campanas Durham
Autoclave
Caldo lactosado
9
tubos
microbiolgicos Incubadora
18x150 mm
3 charolas de aluminio
1 Agitador
1 Esptula
1 Probeta de 100 mL
Piceta
Pipeta de 1 mL
4 vasos de precipitados de
250 mL
1 Matraz aforado de 1000 mL
1 Gradilla

Purpura de bromocresol

Preparacin de medios de cultivo

Medio de cultivo Caldo Lactosado
Pesar 1.82 g de caldo lactosado y aadir 70 mL de agua destilada. Para
obtener un medio de cultivo de doble concentracin.
Pesar aproximadamente 1.69 g de caldo lactosado y aadir 130 mL de agua
destilada. Para obtener un medio de cultivo de concentracin sencilla.
Purpura de bromocresol
Se prepara una solucin etanolica al 1% (v/v).
Procedimiento
Para muestras de agua
Diluir 5 mL de muestra en 45 mL de agua destilada previamente esterilizada
en autoclave a 121C por 45 min. (1:10).

Para muestras de suelo

Pesar 5 g de suelo y aadirlos a 50 mL de agua destilada previamente
esterilizada.

Inoculacin del medio

Preparar 6 tubos de ensayo de 18x15mm con 10 mL de medio de cultivo caldo
lactosado con concentracin 1:2 en cada uno de los tubos.
Agregar 3 gotas del indicador purpura de bromocresol a los tubos de
concentracin simple y 2 gotas a los tubos de concentracin doble.
A cada uno de los tubos introducir una campana Durham.
Posteriormente esterilizarlos a 121 por 45 min y meterlos a incubar en un
periodo de 24h.
Retirar los tubos de la incubadora despus del tiempo cumplido.
Inocular en 3 tubos de ensayo con caldo lactosado, tomando un volumen de
10 mL, 1 mL y 0.1 mL de muestra de agua con ayuda de una pipeta estril.
Realizar el paso anterior pero ahora con la muestra de suelo ya diluida.
Incubacin de los tubos
Incubar los tubos inoculados ya sea a 308 1K (35 1C) o 340 1K (371C)
durante 24 horas.
Examen de los tubos
Examinar los cultivos de los tubos despus de 18 a 24 horas
Considerar como resultados positivos a aquellos que muestren turbidez
debida al crecimiento bacteriano y formacin de gas en los tubos internos
invertidos (Durham) junto con produccin de cido si el medio de aislamiento
contiene un indicador de pH.
Re-incubar aquellos tubos que no muestran alguno o todos estos cambios y
examinarlos nuevamente para detectar reaccionan positivas a las 48 horas.
Fundamento de la prueba
La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del
Nmero ms Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo
microbiano de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas al incubarlos a
35C 1C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares.
En la fase presuntiva se utiliza caldo lauril sulfato triptosa con prpura de
bromocresol (concentracin 0,01 g/l de medio) el cual permite la recuperacin de los
microorganismos daados que se encuentren presentes en la muestra y que sean
capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono y campanas de fermentacin
el medio de cultivo para observar la produccin de gas. Durante la fase confirmativa
se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es
selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar
tanto las sales biliares como el verde brillante.
La determinacin del nmero ms probable de microorganismos coliformes
fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se
fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas
cuando son incubados a una temperatura de 44.5 0.1C por un periodo de 24 a 48
h.

Prueba confirmativa para coliformes totales

Prueba de gas en Caldo Bilis Verde Brillante
Lista de Materiales, Equipos y Reactivos
Materiales
Medio de cultivo
Equipo
18 campanas Durham
Peptona
Balanza analtica
18 tubos de 18 x 150
Lactosa
Incubadora
mm
1 Agitador de vidrio
Bilis Ox dehisdratado
Parrilla
Verde
Brillante
en
1 Esptula
Potencimetro
solucin acuosa 1%
1 Gradilla
Agua destilada
Autoclave
2 Matraz Erlenmeyer
de 250 mL
2 Pipeta de 10 mL
1 Pro-pipeta
3 Charolas de aluminio
1 Probeta estril
1 Vaso de precipitado
1 Aza de nicromo
1 Mechero Bunsen

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Preparacin del Medio Caldo Bilis Verde Brillante:

Disolver 10 g. de peptona en 500 mL de agua destilada.
Agregar 20 g de bilis Ox deshidratada en 200 mL de agua destilada.
Ajustar el pH entre 7,0 y 7,5.
Completar a aproximadamente 975 mL con agua destilada.
Agregue 10 g. de lactosa.
Ajuste el pH a 7,4.
Agregue 13 mL de la solucin al 1% masa de verde-brillante y complete a
1000 mL con agua destilada.

Procedimiento:
1. Distribuir volmenes de 10 mL de Caldo Lactosado Bilis Verde Brillante en los
tubos de prueba conteniendo un tubo de Durham invertido.
2. Esterilizar a 121 por 15 min.
3. Inocular una azada en los tubos con Caldo Bilis Verde Brillante de los cultivos
positivos de la prueba presuntiva con Caldo Lactosado.
4. Incubar 48 h a 37 C.

Fundamentacin de la prueba
En este medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el
adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes selectivos
que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepcin
de coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono fermentable.
Es una propiedad del grupo coliforme, la fermentacin de la lactosa con
produccin de cido y gas.
Es por eso que este medio est recomendado para el recuento de coliformes
totales y fecales, por la tcnica del nmero ms probable

Prueba de la produccin de indol (PROY-NMX-AA-042-SCFI-2005)

Para confirmar la presencia de E. colli presuntiva.
Lista de Materiales, Equipos y Reactivos
Materiales
Equipo
Reactivos
1 matraz Erlenmeyer de
Autoclave
20,0 g de Triptona
250 mL
5,0 g de Cloruro de sodio
3 tubos microbiolgicos
Incubadora
(NaCl)
1000 mL de agua
2 charolas de aluminio
Parrilla
destilada
1 Agitador
Reactivo Kovacs
5,0 g 1,4
1 Esptula
dimetilaminobenzaldehdo
(C6H4 [H(CH3)2] CHO).
75 mL Alcohol amlico
2 Probeta de 100 mL
(CH3 (CH2) 4CH)
25 mL cido clorhdrico
1 Piceta
concentrado (HCL)
1 Gradilla
2 vasos de precipitado
100 mL

Preparacin del medio para la produccin de indol

Agua de triptona.
Hay algunas peptonas que dan resultados satisfactorios a 37C pero no son
satisfactorias para la prueba de indol. A 44C, se ha encontrado que la triptona es
satisfactoria y por lo tanto es la que se recomienda.
Disolver los componentes (20,0 g de Triptona y 5,0 g de Cloruro de sodio
(NaCl) en agua y ajustar a pH 7,5. Distribuir en volmenes de 5 mL y colocar en
autoclave a 115C durante 10 min
Reactivo de Kovacs para Indol:
Disolver el aldehdo en alcohol. Aadir el cido concentrado con cuidado.
Proteger de la luz y almacenar a 4C.
Nota 3: El reactivo debe tener una coloracin entre amarillo claro y caf claro;
algunas muestras de Alcohol Amlico son insatisfactorias y dan una coloracin oscura
con el Aldehdo.

Procedimiento
1. Preparar el agua triptona como se indica en la parte de preparacin del
medio para la produccin de indol.
2. Aadir 20 mL de agua triptona a 3 tubos microbiolgicos y tomar con un
asa de nicromo una muestra del tubo de Agar Bilis Verde Brillante incubado
anteriormente y sembrarla en el agua triptona.
3. Incubar los tubos de agua de triptona para detectar la formacin de indol a
44.0C 1 C durante 24h.
4. Despus del tiempo transcurrido, aadir de 0.2 a 0.3 mL de reactivo de
Kovacs al tubo de agua de triptona
5. Los resultados positivos se muestran por el desarrollo de un anillo de color
rojo despus de agitar suavemente que denota la presencia de indol. Un resultado
negativo se muestra amarillo. Un resultado variable puede ocurrir cuando se muestra
un color naranja.
Nota.- La deteccin de E. coli presuntiva se considera una evidencia
satisfactoria de contaminacin fecal. Sin embargo, pueden efectuarse mayores
pruebas para la confirmacin de E. coli si se considera necesario.

Fundamentacin de la prueba
La prueba
de
indol
es
una prueba
bioqumica realizada
en especies bacterianas para determinar la habilidad del organismo de romper
el indol del aminocido triptfano. Esta divisin molecular es lograda por una serie
de enzimas intracelulares diferentes, un sistema que en conjunto se le llama con
frecuencia triptofanasa.
El indol es generado por una desaminacin reductiva del triptfano a travs de
la molcula intermediaria cido indol-pirvico. Las triptofanasas catalizan la reaccin
de desaminacin, durante el cual se remueve el grupo amino (NH2) de la molcula de
triptfano. Los productos finales de la reaccin son el indol, cido pirvico,
amonaco (NH3) y energa. Como coenzima de la reaccin se requiere al fosfato de
piridoxal.

Prueba de oxidasa (PROY-NMX-AA-042-SCFI-2005)

Prueba confirmativa para E. coli presuntiva
Lista de Materiales, Equipos y Reactivos
Material y equipo
Materiales
Reactivos
Horno de aire caliente para
1 Membrana
Reactivo de
esterilizacin con calor seco
filtrante
oxidasa
Clorhidratado de
1 Pinzas de
Autoclave.
tetrametil-pbordes lisos
fenilendiamina
Incubadora

1 Gotero

Medidor de pH.

1 Varilla de vidrio

Equipo para filtracin con membrana

2 Papel filtro

Agar nutritivo

1 Cajas Petri

Preparacin de agar y reactivo oxidasa

Agar nutritivo
El agar nutritivo es un medio de cultivo usado normalmente como rutina para
todo tipo de bacteria. Es muy til porque permanece slido incluso a relativas altas
temperaturas. Adems, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la
superficie, por lo que se distinguen mejor las colonias pequeas.
El agar nutritivo contiene normalmente (p/v):1

0,5 % de peptona;
0,3 % de extracto de carne/extracto de levadura;
1,5 % de agar;
0,5 % de cloruro de sodio;
agua destilada;
pH casi neutro (6,8) a 25 C.

Reactivo oxidasa

Clorhidratado de tetrametil-p-fenilendiamina 0,1 g

Agua para aforar a 1 000 mL

Este reactivo no es estable y por consiguiente debe prepararse para ser

utilizado en pequeas cantidades cada vez que se necesite.
Procedimiento
Llevar a cabo la prueba de la oxidasa con subcultivos puros de organismos
fermentadores de lactosa, desarrollado en medio de Agar Nutritivo, de la siguiente
manera:
1. Colocar dos o tres gotas de reactivo de oxidasa preparado recientemente en
un papel filtro colocado sobre una caja Petri;
2. Con una varilla de vidrio de punta redonda, untar una pequea porcin del
crecimiento sobre el papel filtro preparado.
Considerar la aparicin de un color azul-morado profundo en un lapso de 10
segundos como una reaccin positiva
Fundamentacin de la prueba
Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La
reaccin de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromo-oxidasa que
activa la oxidacin del citocromo que es reducido por el oxgeno molecular que
produce agua o perxido de hidrgeno segn la especie bacteriana. El oxgeno acta
por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de
electrones. Por lo general, el sistema citocromo-oxidasa slo se encuentra en los
organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algn
microaerfilo, pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa.
Se investiga la presencia del enzima citocromo-oxidasa en la bacteria en
estudio.
Bsicamente es la deteccin de la enzima oxidasa, muy til en la identificacin
de bacterias Gram (-). La reaccin de la oxidasa se debe a la presencia del sistema
de citocromo-oxidasa, la cual activa citocromos reducidos por oxgeno molecular, por
la transferencia de un aceptor al estado terminal del sistema de transferencia de
electrones.

Referencias
Fuente: Tomasini Ortz, A. C. (s/f). Serie autodidctica de medicin de la
calidad
del
agua.
Recuperado
de:
http://www.conagua.gob.mx/CONAGUA07/Noticias/Bactereologicos.pdf
Primus laboratorios de Mxico (2014). Muestreo microbiolgico de agua.
Recuperado
de
http://www.primuslabs.com/spanish/services/guia_de_muestreo_para_aguas.p
df
Serrano, B. (2009). Tcnicas para el Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2
ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
Escol Rives, M. (2002). Mtodos de anlisis microbiolgicos de los alimentos.
Espaa. Editorial Daz de Santos.