III Congreso Internacional de Microbiologa Pecuaria

IV Congreso Nacional y XIV Congreso Estudiantil de Microbiologa Pecuaria

24 y 25 de Octubre de 2013
PRODUCCIN DE ENZIMAS FIBROLTICAS DE Phanerochaete chrysosporium y Fomes sp.
CULTIVADOS EN RASTROJO DE MAZ
Carrillo-Daz M.I.1, Alonso-Meneses T.L.2, Miranda-Romero L.A.3
1*

Posgrado en Produccin Animal, Universidad Autnoma Chapingo. 2 Ingeniera en Biotecnologa,

Universidad Tecnolgica de Tecamac. 3Posgrado en Produccin Animal, Universidad Autnoma

Chapingo.
Isabel_2224@live.com.mx
Resumen
La lignocelulosa (celulosa, hemicelulosa y lignina) es el principal componente de la pared celular de las
plantas, representa una fuente de carbono con potencial para solucionar los problemas de energa
actuales. Dentro de los diversos mtodos que mejoran la hidrlisis de la celulosa se encuentran los
hongos ligninolticos, puesto que degradan el material lignocelulsico a travs de la produccin de
enzimas extracelulares. El objetivo de este trabajo fue evaluar la produccin de celulasas y xilanasas
de los hongos Phanerochaete chrysosporium y Fomes sp. cultivados por fermentacin en estado slido
en rastrojo de maz con y si mazorca, con 20% de salvado de trigo como aditivo. El extracto crudo
enzimtico (ECE) se analiz para medir la actividad enzimtica de celulasas y xilanasas con el reactivo
DNS. Los dos hongos y los dos sustratos se evaluaron en un diseo completamente al azar 2x2 con
arreglo factorial con una comparacin de medias con la prueba de Tukey con el programa estadstico
SAS 9.0. La mayor produccin de celulasas y xilanasas se obtuvo con Phanerochaete chrysosporium.
En el caso de de celulasas, el mejor sustrato fue el rastrojo de maz sin mazorca, presentando el mayor
pico de produccin en el da 12. Phanerochaete chrysosporium es un hongo con un alto potencial para
degradacin de materiales fibrosos. Los sustratos con alto contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina
favorecen la produccin de enzimas fngicas que hidrolizan estos materiales.
Palabras Clave: Celulasas, Xilanasas, Hongos ligninolticos.

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Introduccin
Los residuos, desperdicios, desechos agrcolas y de la industria de alimentos constituyen una
proporcin importante, ya que llegan a alcanzar ms del 30% del total de la productividad agrcola
mundial (Ugwuanyi et al., 2009); estos materiales representan un gran potencial para solucionar los
problemas de nutricin animal si se implementan tecnologas adecuadas para el uso apropiado de
dichos desechos. En la actualidad existen productos comerciales obtenidos a partir de hongos que son
utilizados ampliamente para mejorar la digestibilidad de forrajes o granos (Beauchemin et al., 2004).
Entre los aditivos para aumentar la digestibilidad de los alimentos lignocelulsicos, las enzimas
exgenas fibrolticas, al agregarse a estos materiales, pueden mejorar la utilizacin de los polisacridos
de los forrajes (Pinos-Rodrguez et al., 2002). Los hongos de pudricin blanca han sido ampliamente
estudiados, ya que son capaces de producir enzimas hidrolticas, como las celulasas, xilanasas y
lacasas; las cuales han sido probadas para su aplicacin en la industria textil, del papel y en la
produccin de alimentos y biocombustibles (Rodrigues et al., 2008). Se han utilizado diversas cepas de
hongos como Trichoderma reesei, Phanerochaete chrysosporium, Aspergillus humicola, Trametes
versicolor, Bjerkandera adusta, Pleurotus ostreatus y Fomes fomentarius (Prez et al., 2002; Rodrigues
et al., 2008; Ovando y Waliszewski, 2005) para la obtencin de extractos enzimticos en la degradacin
de materiales fibrosos. En diversas investigaciones realizadas con tratamientos enzimticos sobre la
degradacin de los materiales fibrosos, se ha observado un comportamiento favorable, ya que se
incrementa la digestibilidad de manera considerable (Colombatto et al., 2007). El objetivo de este trabajo
fue evaluar la actividad enzimtica producida por los hongos Phanerochaete chrysosporium y Fomes
sp. cultivados en rastrojo de maz con y sin mazorca.

Material y Mtodos
Para el cultivo del hongo se utiliz caldo papa dextrosa (24 g L-1) y agar bacteriolgico (15 g L-1), en
cajas Petri en las cuales se resembr el hongo para su crecimiento. Las cajas Petri con el hongo se
dejaron incubando a 35 C por 10 das. Para la medicin de la actividad enzimtica de celulasas y
xilanasas, se obtuvo un cultivo por fermentacin en estado slido utilizando como sustrato rastrojo de
maz con y sin mazorca, con 20% de salvado de trigo. La humedad de estos materiales fue ajustada al
80%. Los cultivos se prepararon en cajas Petri de vidrio conteniendo 14 g de sustrato. Estos materiales
se esterilizaron a 121C por 40 minutos. A cada caja Petri se le aadieron 4 discos (10 mm de dimetro)
de micelio de cada hongo crecido en PDA y se incubaron a 35C hasta su lectura. Las lecturas
enzimticas se realizaron a los 0, 3, 6, 9, 12 y 15 das de incubacin. Para obtener el extracto enzimtico,
se traspas el cultivo en estado slido a matraces Erlenmeyer de 250 mL y se aadieron 70 mL de agua
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destilada a cada matraz, posteriormente se colocaron en un bao de hielo sobre una agitadora orbital y
se agitaron a 120 rpm por 30 minutos. El lquido fue centrifugado a 7,000 rpm en tubos cnicos de 15
mL. Posteriormente se tomaron 2 mL para colocarlos en una centrfuga refrigerada a 4C a 10,000 rpm
por 15 minutos. El sobrenadante obtenido se utiliz para la medicin de actividad enzimtica,
denominado extracto crudo enzimtico (ECE). Para la medicin de celulasas y xilanasas se utiliz el
mtodo descrito por Miller et al., (1960). Para celulasas se utiliz como sustrato una solucin de
carboximetilcelulosa (Sigma-Aldrich) al 1%, disuelta en amortiguador de citrato de sodio (50 mM, pH
5.0). Para xilanasas, se utiliz como sustrato una solucin de xilano de madera (Sigma-Aldrich) al 0.5%,
el cual fue disuelto en amortiguador de citrato de sodio (50 mM, pH 5.3). Para ambas enzimas, se midi
la absorbancia a una longitud de onda de 595 nm en un espectrofotmetro LAMBDA 35 PerkinElmer a
595 nm. El diseo experimental fue un completamente al azar con arreglo factorial 2x2x6 Se realiz un
anlisis de varianza para comparar la actividad enzimtica de los sustratos, utilizando la prueba de
Tukey con el procedimiento GLM para realizar la comparacin de medias, con el paquete estadstico
SAS 9.

Resultados y Discusin
Para la produccin de celulasas, hubo diferencias significativas respecto al hongo utilizado (p<0.01) ya
que Phanerochaete chrysosporium obtuvo los valores ms altos. Adems se observ que el sustrato
sin mazorca de maz tuvo la mejor respuesta para la produccin de esta enzima (p<0.01). El mejor da
para produccin de enzima fue el da 12 (p<0.01) como se observa en la figura 1. Respecto a xilanasas,
tambin hubo diferencia para los hongos estudiados (p<0.05), ya que Phanerochaete chrysosporium
obtuvo los valores ms altos. Para esta enzima no se presentaron diferencias entre los sustratos
utilizados.

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Figura 1. Produccin de celulasas de Phanerochaete chrysosporium y Fomes sp. Cultivados en

rastrojo de maz.

.
Figura 2. Produccin de xilanasas de Phanerochaete chrysosporium y Fomes sp. Cultivados en rastrojo
de maz.

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Los resultados de produccin de celulasas y xilanasas concuerdan con otros autores, ya que P.
chrysosporium es uno de los ms eficientes en degradar lignina de la madera, adems de liberar varios
tipos de celulasas (Prez et al., 2002), lo cual puede permitir que haya una mayor hidrlisis del complejo
lignocelulsico de los materiales fibrosos. Estudios similares realizados con este hongo cultivado en
rastrojo de maz por fermentacin en estado slido, indican que la mayor hidrlisis de este material
fibroso se obtuvo en el da 9 (Zhang et al., 2012). Probablemente esta diferencia se deba a una mayor
cantidad de sustrato utilizada en el presente estudio.

Conclusiones
El hongo Phanerochaete chrysosporium puede ser utilizado para la produccin de enzimas que
favorecen la degradacin de los materiales lignocelulsicos. El rastrojo de maz sin mazorca promueve
una produccin de celulasas por los hongos ligninolticos.

Literatura citada
Beauchemin, K.A., D. Colombatto and D.P. Morgavi., 2004. A rationale for the development of feed
enzyme products for ruminants. Canadian Journal of Animal Science 84(1): 23-35.
Colombatto, D., F. L Mould., M. K. Bhat and E. Owen. 2007. Influence of exogenous fibrolytic enzyme
level and incubation pH on the in vitro ruminal fermentation of alfalfa stems. Anim. Feed Sci. and
Tech. (137):150-162.
Prez J., J. Muoz-Dorado, T. de la Rubia y J. Martnez. 2002. Biodegradation and biological treatments
of cellulose, hemicellulose and lignin: an overview. Int. Microbiol. (5): 5363
Pinos-Rodrguez, J. M., S. S. Gonzlez, G. D. Mendoza, R. Brcena, M. A. Cobos, A. Hernndez y M.
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alfalfa and rye-grass hay fed to lambs. Journal of Animal Science. (80): 3016-3020.
Miller, G. L., R. Blum, Glennon, W. E., Burton, A. L. 1960. Measurement of carboxymethylcellulase
activity. Analytical Biochemistry. (2): 127-132.
Ovando C.S.L. y K.N. Waliszewski. 2005 preparativos de celulasas comerciales y aplicaciones en
procesos extractivos. Universidad y ciencia, Universidad Jurez Autnoma de Tabasco.
(21):42;113-122.
Pinos-Rodrguez J. M., S. Gonzlez., G. Mendoza., J. C. Garca., L. Miranda., G. A. De La Cruz., y V.
De Lerma. 2005. Efecto de enzimas fibrolticas exgenas en la degradacin in vitro de ingredientes
alimenticios, y en la produccin de leche de vacas holstein. Interciencia (30):12.

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L.M.M. Ferreira, J. Colaco y C.A. Sequeira. 2008. Effect of enzyme extracts isolated from whiterot
fungi on chemical composition and in vitro digestibility of wheat straw. Animal Feed Science and
Technology (141): 326338.
Ugwuanyi, J. O., B. McNeil,. and L. M. Harvey. 2009. Chapter 5 Production of Protein-Enriched Feed
Using Agro-Industrial Residues as Substrates Biotechnology for Agro-Industrial Residues
Utilization, Part II, 78-103.
Zhang J., X. Ren, W. Chen y J. Bao. 2012. Biological pretreatment of corn stover by solid state
fermentation of Phanerochaete chysosporium. Front. Chem. Sci. Eng. 6(2):146-151.

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