DNA recombinante

El DNA contiene la informacin

biolgica de los seres vivos

Clula procariota

Clula eucariota

access.mmhs.ca

Productos biotecnolgicos
Productos de ADN recombinante
Ejemplos.

Enzimas recombinantes (Insulina, activador tisular de plasmingeno)

Anticuerpos monoclonales o recombinantes (Antivenenos)
Hormonas recombinantes (Hormona de crecimiento)
Citoquinas recombinantes (Interferon alfa, IL-11)
Receptores solubles recombinantes (Receptor de TNF)
Vacunas recombinantes (Anti hepatitis B)
Factores de coagulacin recombinantes (Factor VIII)

Requerimientos para Producir

Protenas Recombinantes
1) Gen de inters
2) Vector
3) Clula para clonacin del gen de
inters
4) Clula para expresin de la protena
codificada por el gen de inters

Vector
DNA pequeo (proveniente de virus,
bacterias, levaduras) que puede ser
introducido y mantenido en una clula
(procariota o eucariota) y en el que se
puede injertar un fragmento de DNA con
el fin de ser clonado.
Clulas anfitrionas:
Eucariotas, procariotas

Tipos de Vectores
Plsmidos

http://products.invitrogen.com/ivgn/product/K30001

Plsmidos Recombinantes

http://www.freepatentsonline.com/6803225-0-large.jpg

Tipos de Vectores
Virus, bacterifagos
Csmidos

Sitios cos + plsmido

Cromosomas artificiales de levaduras (YACs)

Cromosomas artificiales de bacterias

BAC
Plsmido F

PAC
Plsmido P1

Produccin de Vector
Recombinante

1. Aislamiento gen
de inters

2. Secuenciamiento
3.
Recombinacin

Clonacin
1) Aislamiento y purificacin del DNA de inters
2) Escogencia de la clula hospedera y del vector
de clonacin.
3) Obtencin del vector recombinante
4) Trasformacin, transfeccin del vector
recombinante en clula hospedera
5) Seleccin de clulas que contienen DNA
recombinante
6) Deteccin de los clones que contienen el DNA de
inters

6. Seleccin del clon

5. Crecimiento celular,
expancin clonal

4.Transformacin/transfecci
n

Clonacin

Purificacin plsmidos recombinantes

Algunas figuras tomadas de Lodish, 5th Ed

Clulas Anfitrionas
Bacterias
Escherichia coli (E. coli)

Eucariotas
Levaduras
Saccharomyces cerevisiae(S. cerevisiae), Pichia
pastoris (P. pastoris)

Clulas de insectos
Lneas celulares mamferas
Clulas derivadas de ovario de hmster chino
(CHO)

Traduccin
Introduccin de
secuencias que permitan
el reconocimiento del
mRNA por los ribosomas
Optimizacin de la
traduccin
(Utilizacin preferencial
de codones)
Introduccin de seales
que garanticen
estabilidad de la
protena
http://palaeos.info/bacteria/glossary/glossary1.html

Introduccin de seales
que garanticen la
secrecin de la protena

Sistemas de Expresin

Procariotes
E. coli
Cuerpos de inclusin

Eucariotes

Levaduras
S. cerevisiae
P. pastoris

Clulas de insectos

Secretan

Expresin de P.R. en E. coli

17

Glargina
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile
1

10

Cys
11

Ser

Leu

12

13

Tyr
14

Gln
15

Leu
16

Glu

Asn

Tyr

17

18

19

Cys Asn
20

21

Gly

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His
1

Phe
24

Phe
25

Leu

Val

10

11

12

Arg

Arg

Tyr

Thr

Pro

Lys

Ala

26

27

28

29

30

Glu
13

Ala

Leu

Tyr

Leu

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

14

15

16

17

18

19

20

21

22

Gly
23

Adaptado de Vajo Z et al. Endocr Rev 2001 22: 706-717

Insulin biosimilars

By-product profile influenced by folding and cleavage

E.coli cell
5. Isolation of cells
Inclusion body

6. Cell disruption via

homogeniser
7. Isolation and purification Fusion protein
of fusion protein
8. Folding

Preproinsulin
S

10. Prepurification and

concentration via
adsorption

Insulin S
S

9. Enzymatic cleavage
S

S
S

Typical
operations for
inclusion body
processes
Folding
conditions
influence
by-product
pattern
Cleavage
enzyme:
specificity &
selectivity

Cortesa sanofi

Insulin biosimilars

Purity is determined by chromatography steps

S

11.

12.

Ion-exchange
chromatography

Reversed-phase
chromatography

13.

Crystallisation
and lyophilisation Insulin

14.

Blending / filling

Chromatography
defines purity

S
S

Fibrillation
tendency

Cortesa sanofi

Traduccin en Eucariotes

Sntesis de Insulina en Clula Eucariota

Pichia pastoris (P. pastoris)

Atractivos
1)
2)
3)
4)
5)

Rpido crecimiento
Altas densidades
Puede crecer en medios simples
Crece en metanol
Tiene promotores inducibles activados por
metanol y reprimidos por glucosa
6) Modifica protenas
Puentes disulfuro, proteolisis
1) Secreta protenas
2) Altos rendimientos