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PEDIDO N
3359 /2013
19 /06 /2015
PERODO PREVISTO
PERODO DE EXECUO
17/08/2014
17/08/2014
20/08/14
20/08/14
25/08/14
14/11/14
25/08/14 14/11/14
Anlise de lminas
11/11/14
18/12/14
11/11/14 18/12/14
Fotografar metfase
15/01/15
20/02/15
15/01/15 20/02/15
Montagem do caritipo
02/03/15
24/04/15
02/03/15 24/04/15
11/05/15
19/06/15
11/05/15 19/06/15
Preparao de reagentes
Coletas Rio Pardo
PERODO DE EXECUO
DIFICULDADES ENCONTRADAS: Durante o perodo deste relatrio, houveram alguns problemas quanto a
locomoo at o local da coleta, devido s ms condies da estrada e devido a chuvas, o que dificultaram o
acesso ao Rio Pardo.
PALAVRAS-CHAVE (trs)
Peixes, citogentica, polimorfismo
INTRODUO (tema/objetivos/hipteses/justificativa)
A regio Neotropical engloba a Amrica do Sul, que possui a maior fauna de peixes de gua doce
conhecida (Graa e Pavanelli, 2007). Os Characiformes representam um grupo dominante entre os peixes de
gua doce da Amrica do Sul, com 18 famlias e cerca de 270 gneros (Nelson, 2006). Dentro desta ordem
destaca-se a famlia Characidade, com 1092 espcies validadas at o presente momento (Eschmemeyer e
Fong, 2015). Considerado um dos gneros mais especiosos em Characidae, Astyanax aloca aproximadamente
207 espcies vlidas de acordo com Froese & Pauly (2015). O fato de ocuparem uma posio bsica na
filogenia dos vertebrados, de constiturem um grande nmero de espcies dentro desse grupo e de estarem
distribudos por uma enorme diversidade de habitats, os torna um material bastante favorvel para a
abordagem de questes evolutivas (Nelson, 2006).
Uma reviso feita por Arai (2011) mostrou que, at esta data, eram conhecidos os nmeros haplides
e/ou diplides de 3.425 espcies, distribudas em 53 ordens e 269 famlias. Contudo, este nmero representa
apenas 12% de toda a diversidade de espcies de peixes. Estas anlises evidenciam uma grande variabilidade
cromossmica, com a presena de cromossomos supranumerrios, diferentes mecanismos de determinao
cromossmica sexual, diversidade cromossmica na localizao de regio (es) de organizadores nucleolares e
diversidade no padro de distribuio da heterocromatina constitutiva.
Segundo Artoni e Matiello (2003), os Characiformes (a maioria dos peixes de escamas sul-americanos)
exibem um padro de diversificao cromossmica, em especial ateno famlia Characidae (ex. Astyanax;
lambaris), mostrando uma grande variabilidade interpopulacional quanto ao nmero e estrutura
cromossmica, provavelmente em decorrncia de um estilo de vida mais sedentrio, propiciando tal
diversificao entre populaes isoladas. Segundo Artoni, Vicari e Bertollo (2000), observam-se grupos com
caritipo bastante heterogneo, ao lado de outros bem mais conservados na estrutura cariotpica.
Segundo Pacheco et al (2010), em um trabalho feito no lago Guaba (Brasil), a respeito da espcie
Astyanax jacuhiensis, da famlia Characidae, foi encontrado o nmero diploide de cromossomos igual a 50.
Resultado parecido com o encontrado por Santos e Morelli (2006), mas este observou caractersticas quanto a
organizao cariotpica e posies da Ag-NOR em espcies distintas. Martinez et al (2012), em um trabalho
encontrou resultados que diferiam quanto ao nmero diploide em duas espcies diferentes de Characidae,
2n=52 e 2n=50, Astyanax altiparanae e Hyphessobrycon eques respectivamente. No trabalho feito por Peres
(2005) foi usado uma maior gama de variedade e mais espcies e foi encontrado variaes desde 2n=50 at
2n=58 e ainda assim com mais de dez formas cariotpicas distintas.
Diante do exposto e a diversidade cariotpica encontrada em exemplares da famlia Characidae, o presente
trabalho tem como objetivo caracterizar citogeneticamente, espcies de peixes de pequeno porte da famlia
Characidae, quanto ao nmero e morfologia de cromossomos, atravs de colorao convencional pelo
Giemsa, bandeamento cromossmico e identificao dos cromossomos portadores da NOR e heterocromatina
constitutiva (banda C).
MTODO (sujeitos/instrumentos/procedimentos)
Para a realizao do presente estudo foram coletados 11 exemplares de Astyanax sp (7 fmeas e 4 machos)
no rio Pardo, regio sudoeste da Bahia (153634.49 S, 401212.92). Todos os exemplares coletados foram
fixados em formol 10% e conservados em lcool 700. Alguns exemplares foram encaminhados ao Museu de
Ictiologia do Nupelia da Universidade Estadual de Maring/Pr para identificao (Figura 1). Os demais foram
depositados na coleo do Museu de Zoologia do Instituto Multidisciplinar em Sade da Universidade Federal
da Bahia.
As clulas mitticas foram obtidas a partir do rim, sendo utilizada, preferencialmente, a poro
posterior, devido ao fato dos resultados terem sido mais satisfatrios em relao ao nmero de metfases
obtidas nas preparaes.
O procedimento utilizado foi descrito por FORESTI et al. (1981), e consistiu em:
a) Injetou-se intraperitonialmente colchicina (0,05%) na proporo de 1 ml para cada 100 g de peso do
animal e deix-lo em aqurio por 50 minutos;
b) O animal foi sacrificado e o rim posterior foi coletado;
c)
Colocou-se o tecido retirado em uma placa de Petri contendo 4 a 6 ml de soluo hipotnica (KCL
0,075 M), dependendo da quantidade de tecido que possa ser retirado;
d) O material foi dissociado at a obteno de uma suspenso de clulas. Para que isso possa ser
possvel, o material foi separado com auxlio de pinas e depois homogeneizado com uma pipeta
Pasteur;
e) A suspenso da placa de Petri foi retirada e colocada em um tubo de centrfuga; este tubo foi deixado
no interior de uma estufa a 370 por 21 minutos;
f)
O tubo foi retirado da estufa, colocou-se 5 gotas de fixador gelado e previamente preparado (metanol
+ cido actico na proporo de 3:1, respectivamente). Agitou-se levemente com uma pipeta Pasteur
e deixado para repousar por 5 minutos em temperatura ambiente;
g) 6 ml de fixador foi adicionado e novamente agitado com pipeta Pasteur e ento centrifugado a 800900 rpm por 10 minutos;
h) Repetiu-se o item g por trs vezes, centrifugando por 7 minutos; e o sobrenadante foi descartado.
i)
j)
2 gotas desta suspenso foi pingada em uma lmina, e deixada para secar a temperatura ambiente;
k) A lmina foi corada com Giemsa, diludo a 5% em tampo Fosfato (pH 6.8) durante 10 minutos;
l)
A lmina, ento, foi levada para o banho-maria a 60C por aproximadamente 5 minutos, at adquirir
uma colorao caramelada.
Por fim, lavada com gua destilada, deixada para secar ao ar, e analisada em microscpio.
Montagem de Caritipo
Os cromossomos foram classificados em metacntricos (m), submetacntricos (sm), subtelocntricos
(st) e acrocntricos (a), de acordo com o mtodo de Levan, et al (1964) para montagem dos caritipos.
RESULTADOS PROPOSTOS/ALCANADOS
Foram realizadas contagens de 260 metfases, sendo encontrado um nmero diploide igual a 50
cromossomos, com a seguinte frmula cariotpica: 4m + 17sm + 1st + 3a. A colorao por AgNOR evidenciou
um sistema de NOR-simples, com marcaes em 2 cromossomos, na poro terminal do brao longo de um
par de cromossomos submetacntricos (figura 2).
Figura 2
CONCLUSES
O nmero diploide encontrado para os exemplares de Astyanax sp analisados neste trabalho o mais
frequentemente encontrado para este gnero. PERES (2005) realizou um trabalho na bacia do Rio So
Francisco, caracterizando algumas espcies de Astyanax, dentre elas o A. lacustres, A. altiparane e A.
scabripinnis, e as 3 espcies compartilham o nmero diploide igual a 50. Kavalco e Toledo (2008) encontraram
resultados diferentes e mais variveis, com o nmero diploide variando de 46 a 50 cromossomos em Astyanax
aff. fasciatus. Pacheco (2010) fez um estudo citogentico em Astyanax jacuhienses no lago Guaba, Brasil, o
caritipo montado consistia em 2n=50. Yano (2011) estudou Astyanax aff. paranae, A. fasciatus, A.
altiparanae obtidos dos riachos Pindorama e Lopei, na bacia do alto rio Paran, os resultados foram diversos,
o A. fasciatus e A. altiparanae apresentaram nmero diploide de 50 cromossomos, enquanto o Astyanax aff.
paranae apresentou 48 cromossomos. Analisando esses dados da observa-se uma grande predominncia do
nmero diploide de indivduos pertencentes ao gnero Astyanax, no presente trabalho foi encontrado 2n=50,
convergindo com a maioria dos casos expostos, caracterizando um padro ligado ao gnero.
A anlise da estrutura cariotpica dos exemplares estudados neste trabalho difere daqueles observados
para outras espcies pertencentes ao gnero Astyanax. No trabalho de Peres (2005), a frmula cariotpica das
espcies estudas so distintas, A. lacuris com 8m+20sm+16st+6a, A. altiparanae apresenta
8m+20sm+12st+10a e o A. scabripinnis 6m+26sm+10st+8a. Santos e Morelli (2006) em uma comparao entre
duas populaes de Astyanax scrabipinnis obteve duas frmulas diferentes, uma com 8m+22sm+12st+8a, a
outra populao tem 6m+26sm+10st+8a. Silva (2014) ao analisar A. paranae, A. bockmanni, A. fasciatus e A.
altiparanae observou a mesma frmula cariotpica em (8m+12sm+14st+16a) em todas as amostras. O
resultado encontrado no presente trabalho, 8m+34sm+2st+6a, no se aproxima de nenhum resultado exposto
acima. Os dados evidenciam uma grande diversidade de frmulas de caritipos para um mesmo gnero, esse
fato pode ser explicado por rearranjos no-Robertsonianos durante o processo evolutivo do gnero, gerando
variaes inter e intraespecficas que se fixaram ao longo da histria evolutiva desse grupo.
A tcnica para deteco de regies organizadoras de nuclolos (NOR) com nitrato de prata, evidenciou
um padro de NOR simples. Na literatura pode-se verificar uma variedade nesse padro em espcies do
gnero Astyanax. Fernandes e Martins-Santos (2006) revelaram colorao por nitrato de prata em um ponto
terminal no brao longo do par 12, encontrado em todas as metfases, alm de outros pontos que apareciam
ao acaso em outros cromossomos de Astyanax fasciatus da bacia do alto rio Paran. PACHECO (2010)
encontrou um padro AgNOR de 2 a 5 cromossomos marcados por metfase. Giongo et al (2014) realizou
estudos com Astyanax asuncionensis na microbacia do rio Sepotuba (Alto Paraguai) e encontrou marcaes de
1 a 2 cromossomos por metfases, em regies do brao curto em submetacntricos. Quando se trata das
regies organizadoras de nuclolos os resultados na literatura so bem diversificados, neste trabalho foi
entrado um padro de 1 par por metfase, o que vai de encontro com alguns dos resultados expostos. Essas
variaes no padro de NOR em peixes podem ser oriundos de eventos de transposies, mas tambm h
processos de rearranjos cromossmicos e permutao de stios ribossomais que podem ser responsveis por
polimorfismos de regies organizadoras de nuclolos em peixes.
Os dados apresentados at o momento para os exemplares do gnero Astyanax tm sugerido um certo
conservadorismo quanto ao nmero diploide para as espcies. No entanto, tem sido evidenciada uma ampla
variabilidade quanto a frmula cariotpica, bem como nas marcaes de AgNOR. H necessidade de ampliao
em estudos citogenticos e moleculares que auxiliem na compreenso dos eventos cromossmicos que
estejam envolvidos na histria evolutiva deste grupo.
1964
MARTINEZ, Emanuel RM et al. Cytogenetic analysis in the incertae sedis species Astyanax altiparanae Garutti and Britzki,
2000 and Hyphessobrycon eques Steindachner, 1882 (Characiformes, Characidae) from the upper Paran river basin.
Comparative cytogenetics, v. 6, n. 1, p. 41, 2012.
NELSON, J. S. (2006). Fishes of the world. 4th Edition. New York, John Willley & Sons, Inc. 601.
PACHECO, Rosiley B. et al. Cytogenetic data on Astyanax jacuhiensis (Characidae) in the lago Guaba and tributaries, Brazil.
Neotropical Ichthyology, v. 8, n. 3, p. 667-671, 2010.
PERES, W.A.M.; Evoluo, e. Anlise da diversidade cariotpica de characidae da bacia do so francisco. 2005
SANTOS, Ana Cristina dos; MORELLI, Sandra. Comparao citogentica de duas populaes de Astyanax scabripinnis
(Pisces, Characidae) da regio do Tringulo Mineiro. Biosci. j, v. 22, n. 1, p. 145-150, 2006.
SILVA, Dulio Mazzoni Zerbinato de Andrade. Estrutura molecular e citogentica de cromossomos B em Astyanax paranae
(Characiformes, Characidae). 2014.
YANO, C. F.; Citogentica em peixes de cabeceiras de dois riachos pertencentes bacia do Alto rio Paran, regio de
Toledo (PR). 2011. Dissertao (Mestrado em Recursos Pesqueiros e Engenharia de Pesca) Centro de Engenharia e
Cincias Exatas. Universidade Estadual do Oeste do Paran (UNIOESTE)
ADEQUADO
PARCIALMENTE
ADEQUADO
INADEQUADO
estabelecidos
OBSERVAES DO ORIENTADOR
Sem consideraes at o momento.
( )REPROVADO
DATA: 04/08/2015
Declaro estar ciente e concordar, para todos os
efeitos legais, com as informaes contidas neste
relatrio.
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Assinatura do(a) Orientador(a)
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Assinatura do(a) Bolsista
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Assinatura da Coordenao PIBIC