INFORME DE BIOLOGIA MOLECULAR

INGENIERIA BIOTECNOLOGICA GRUPO C

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ALEJANDRA CARDENAS REY

1610841

EDWIN ALVAREZ MONTAO

1610791
ASBTRACT

In this laboratory procedure that will transform E. coli with PGLO plasmid containing the
gene encoding a green fluorescent protein (GFP) is used. This gene has been taken from a
jellyfish or "living water" that is fluorescent and bioluminescent, his name Aequorea
victoria. The green fluorescent protein causes the jellyfish bloom and glow in the dark.
Followed by the transformation, the bacterium expresses the acquired jellyfish gene and
produces the fluorescent protein, which causes the colony shine bright green under
ultraviolet light. After performing the transformation, the cells are grown in LB medium in
the presence of ampicillin. Ampicillin prevents transformed bacteria do not grow in the
culture dish. Colonies of transformed cells appear white on plates containing LB medium
and ampicillin. To induce expression of the GFP gene have to grow the bacteria in the
presence of arabinose. The bacteria grown in LB with ampicillin arabinose and fluorescent
will be green instead of white.
Keywords: Escherichia coli, cloning, plasmid PGLO
RESUMEN
En este laboratorio se utilizar un procedimiento que transformar la bacteria E. coli con un
plasmido pGLO que contiene el gen que codifica para una protena fluorescente de color
verde (GFP). Este gen ha sido extrado de una medusa o agua viva que es fluorescente
y bioluminiscente, su nombre: Aequorea victoria. La protena fluorescente verdosa causa
que la medusa florezca y brille en la oscuridad. Seguido del proceso de transformacin, la
bacteria expresa el gen de medusa adquirido y produce la protena fluorescente, la cual
causa que la colonia brille de un verde brillante bajo la luz ultravioleta. Luego de realizar la
transformacin, crecen las clulas en medio LB y en presencia de ampicilina. La
ampicilina

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evita que bacterias no transformadas crezcan en el plato de cultivo. Las colonias de clulas
transformadas aparecen de color blanco en los platos que contienen medio LB y
ampicilina. Para inducir la expresin del gene de GFP tenemos que crecer las bacterias en
presencia de arabinosa. Las bacterias crecidas en LB con arabinosa y con ampicilina se
vern fluorescentes de color verde en lugar de blancas.
Palabras claves: Escherichia coli, Clonacin, plsmido pGLO,

INTRODUCCION
La transformacin es un proceso por el cual las clulas captan DNA libre presente en el
medio. Estas tcnicas se basan en diversos tratamientos qumicos o fsicos que producen
microporos en la clula, lo que permite la introduccin del DNA exgeno (transformacin)
de modo bastante eficiente. Uno de los mtodos fsicos es la electroporacin, consistente en
inducir la competencia mediante la aplicacin de un pulso elctrico muy breve e intenso.
Dicha competencia se puede inducir con tratamientos qumicos utilizando compuestos
como el cloruro clcico. (Inohue H, et; al 1990). Hay que tener en cuenta sin embargo que
tras estos tratamientos no todas las clulas del cultivo se hacen competentes. 1 La
transformacin en el laboratorio es una tcnica rutinaria de enorme utilidad, que nos
permite introducir prcticamente cualquier plsmido en su forma circular o superenrollada
en casi cualquier tipo de bacteria. (Old Rw. 1989).

El mtodo que se describe a

continuacin es, por su simplicidad, uno de los ms utilizados para transformar E. coli. Para
detectar la transformacin, el DNA introducido llevar un marcador seleccionable en el
medio adecuado. El objetivo de esta prctica es introducir el plsmido recombinante
obtenido en una reaccin de ligacin en la estirpe de Escherichia coli. Esta estirpe est
modificada genticamente de manera que es posible inducir en laboratorio la competencia
de las clulas as como mantener el plsmido de forma estable en su interior.
MATERIALES Y REACTIVOS
MATERIAL Y REACTIVOS

INSTRUMENTOS Y EQUIPOS

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Placa sembrada con E.coli

Asas de siembra

Placas agar (1 LB, 2 LB /amp,

1LB/amp/ara
Solucin de transformacion
Caldo LB
Plasmido pGLO rehidratado vial

Pipetas
Gradilla de espuma/corcho
Cubeta con hielo picado
Rotulador
Bao a 42 C y termometro
Estufa a 37 C (opcional)

METODOLOGIA

TRANSFORMACIN DE E. Coli CON pGLO

MATERIALES

van a utilizar en esta prctica son: agar nutriente LB, ampicilina, arabinosa, solucin de transformaci
PREPARACIN DE LAS CAJAS CON SUS
MEDIOS

CAJAS CON MEDIO LB

tilada para servir en 16 cajas previamente marcadas. (3-7 das antes de la transformacin)
Se deben almacenar 2 das a
temperatura ambiente y luego bajo
refrigeracin hasta el momento de
su uso

CAJAS CON MEDIO

LB/AMP

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Se deben almacenar 2
das
a
temperatura
ambiente y luego bajo
refrigeracin
hasta
el
momento de su uso

de solucin de transformacin, homogenizar en vrtex. Seguidamente aadir la ampicilina al agar L

CAJAS CON MEDIO
LB/AMP/ARA
Se deben almacenar 2 das a
temperatura ambiente y luego
bajo
refrigeracin
hasta
el
momento de su uso

Un excesivo calentamiento (50C)

destruye la ampicilina, por lo tanto
hay que regular la temperatura del
agar antes de agregarla.

n homogenizada en vrtex; as mismo agregar la arabinosa al agar LB/Amp, agitar y servir en 8 caja
Un excesivo calentamiento (50C)
destruye la ampicilina, por lo tanto
hay que regular la temperatura del
agar antes de agregarla.

PREPARACIN DE BACTERIAS

acin. A partir de la suspensin de E. coli K12 rehidratada se siembra en una caja con LB por cada g

LO e introduce el asa en la solucin de transformacin, y gira el asa entre tus dedos ndice y pulgar hasta qu

e a cada uno 250 o 150l de la solucin de transformacin (CaCl2). Poner los tubos en hielo.

Rotula un tubo eppendort como +pGLO y otro como pGLO. Pon el nombre de tu grupo. Sital

TRANSFORMACIN DE E. Coli CON pGLO

PROCEDIMIENTO

tiliza la solucin de transformacin porque esta estril y no contiene nucleasas, en su lugar se pued

PREPARACIN DEL PLASMIDO

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e los tubos, y con una nueva pipeta estril, aade 250ml de caldo LB al tubo y cirralo. Repetir la op

e el fondo de los tubos este en contacto con el agua. Pasados los 50 segundos, llevar de nuevo los t

el hielo, etiquetar las placas de agar en la base de a siguiente forma: una placa LB/amp y una LB/a

n un aro para hacer pompas de jabn. Introduce el asa en el tubo +pGLO. Cierra el tubo y vuelve a dejarlo en

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Con una pipeta estril para cada tubo, pasar 100ml de cada tubo a las placas correspondientes.
idamente de izquierda a derecha. NO PRESIONAR MUY FUERTE PARA NO ROMPER EL AGAR. Seguida
CUESTIONARIO
DISCUSIONES
El mtodo de transformacin mediante choque trmico de clulas competentes con cationes
divalentes es muy rutinario dada la facilidad de realizacin del mismo y la no necesidad de
utilizar aparatos sofisticados, a diferencia de la electroporacin o la biobalstica. No
obstante la eficiencia del mismo puede resultar baja, segn el caso. Es congruente que en el

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control no haya habido expresin de pGLO, en donde no hubo colonias, as como en

medios LB/amp donde no haba arabinosa. Esto se debe a que el gen de la protena
fluorescente est inserto en el opern arabinosa en la regin codificadora para las enzimas
que metabolizan la
arabinosa cuando est presente en el medio. Si la arabinosa est presente, entonces el
opern se encuentra activo y la protena fluorescente es expresada, como se pudo observar
en las colonias +pGLO LB/amp/ara. Nuestra eficiencia fue muy pobre ya que no rebas el
50% de las colonias transformadas.

CONCLUSIONES
En base a la investigacin y el trasfondo terico, una cepa de bacteria puede ser mutada
mediante la transformacin de su material gentico al insertrsele un plsmido con vector
como una caracterstica que se desea se exprese en esta. Para este caso la bacteria utilizada
fue E. coli y los rasgos que se quera que se expresaran eran resistencia a ampicilina y
fluorescencia verde.
BIBLIOGRAFIA
Inohue H, Nojima H, Okayama H (1990): High efficiency transformation of Escherichia
coli with plasmids. Gene 96:23-28. Artculo clsico optimizando el mtodo
Old RW, Primrose SB (1989) Principles of gene manipulation. Blackwell Sci. Pub. Oxford.
pp 11-13. Resumen completo del procedimiento.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning. Cold Spring Harbor
Laboratory Press. pp. 1.74-1.84. Excelente recetario con variaciones tiles.

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1. Puedo modificar genticamente un organismo? Que organismo?

Un organismo genticamente modificado (OGM) es aquella planta, animal, hongo o
bacteria a la que se le ha agregado por ingeniera gentica uno o unos pocos genes con el
fin de producir protenas de inters industrial o bien mejorar ciertos rasgos, como la
resistencia a plagas, la calidad nutricional, la tolerancia a heladas, entre otras
caractersticas.
Aunque comnmente el trmino ms nombrado es alimento transgnico para referirse a
aquel que proviene de cultivos vegetales modificados genticamente, es importante recalcar
que tambin se emplean enzimas y aditivos obtenidos de microorganismos transgnicos en
la elaboracin y procesamiento de muchos de los alimentos que ingerimos.
Son los seres vivos ms utilizados en Ingeniera Gentica. La ms utilizada es la
Escherichia coli. Se usa prcticamente en todos los procesos de I.G.
Otra de las aplicaciones ms actuales que se han hecho, ha sido modificar genticamente
bacterias que vivan en el sistema digestivo del ser humano en un lapso mnimo de 6 meses
a 1 ao, con el objetivo de disminuir el apetito. Esta investigacin se basa en N-acilfosfatidiletanolamina, y N-acil-etanolamina, encargadas de mandar seales alhipotlamo,
que es el encargado de la ingesta de alimentos.
Son junto con las bacterias los sistemas ms utilizados. El Saccharomyces cerevisiae fue el
primer sistema eucariota secuenciado completamente. Otra levadura importante es P.
pastoris, utilizada para conseguir proinsulina en cultivo discontinuo y quitinasa en cultivo
continuo. En el campo de los hongos destaca por su labor mdica el Penicillium.
Otra aplicacin ha sido la levadura P. pastoris se ha usado para producir grandes cantidades
de protenas, gracias a que es capaz de crecer en los reactores hasta alcanzar muy altas
densidades celulares. Por ejemplo, se ha utilizado para producir quitinasa humana en
cultivo continuo (0,3 g/L/da) o proinsulina humana en un sistema discontinuo (1,5 g/L).

2. Para modificar genticamente un organismo, se debe insertar un nuevo gen en cada

clula del organismo. Qu organismo ser ms apropiado para ser modificado

genticamente uno pluricelular o uno unicelular?