DX Brucella Abortus Ganad Bovino en Honduras

Universidad Nacional Autnoma
de Honduras
Facultad de Ciencias
Escuela de Microbiologa
Asignatura: Seminario MB087

Seccin: Martes 0700
Catedrtico: Fanny Hidalgo
Diagnstico de Brucella abortus en

ganado bovino en Honduras
Presentado por:
Nombre
Cuenta
Isis Alejandra Buezo Cruz
20112005027
Bryan Quintanilla
20111003443
17/03/15
Ciudad Universitaria, Tegucigalpa
DIAGNOSTICO DE BRUCELLA ABORTUS EN GANADO BOVINO EN
ndice de Contenido
Objetivos
Introduccin
1. Caractersticas Generales
1.1 Morfologa y Tincin
1.2 Estructura y Composicin Celular
1.3 Caractersticas de Crecimiento
1.4 Resistencia
1.5 Diversidad
2. Epidemiologa
2.1 Reservorio Zoolgico y Geogrfico
2.2 Transmisin
2.3 Susceptibilidad Animal
2.4 Susceptibilidad Humana
3. Patognesis
3.1 Mecanismo de Accin
3.2 Factores de Virulencia
3.3 Patologa
4. Manifestaciones Clnicas
5. Aspectos Inmunolgicos
5.1 Mecanismo Inmune en Patognesis
5.2 Mecanismo de Resistencia y Recuperacin
5.3 Inmunizacin Artificial
6. Tcnicas de Diagnstico
6.1 Identificacin del Agente
7. Pruebas Serolgicas
7.1 Rosa de Bengala
7.2 Aglutinacin Tamponada en Placa
7.3 Fijacin de Complejo
7.4 ELISA Indirecto
7.5 ELISA Competitivo
7.6 Polarizacin Fluorescencia
8. Pruebas en Leche
8.1 ELISA Indirecto
8.2 Prueba de Anillo en Leche
9. Brucella abortus en Honduras
9.1 Situacin del pas
9.2 Pruebas Diagnsticas Realizadas
Conclusiones
Referencias Bibliogrficas
Anexos
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Objetivos
Objetivo General
Conocer la importancia del diagnstico de Brucella abortus en el ganado

bovino como la principal causa de abortos del ganado en Honduras.
Objetivos Especficos
Explicar la patogenia y mecanismo de accin de Brucella abortus en

ganado bovino.
Analizar las tcnicas de diagnstico utilizadas en el marco internacional.
Saber distinguir las pruebas utilizadas en nuestro pas.
Conocer la prevalencia de Brucelosis en el ganado hondureo.
Introduccin
La brucelosis es una enfermedad infecto-contagiosa de curso crnico que
afecta tanto al hombre como a los animales domsticos, la fauna silvestre y los
mamferos marinos. Esta enfermedad es de importancia para la salud pblica
debido a los costos generados por la incapacidad fsica que produce en el
enfermo y a las prdidas secundarias ocasionadas por la afectacin del
ganado. (Dra. Cristina E. Fernandez De Kirchner, 2013)
Es causada por microorganismos del gnero Brucella spp, que son un grupo de
bacterias intracelulares, inmviles y de crecimiento lento. Se reconocen
distintas especies, algunas de ellas afectan a animales terrestres (B. abortus,
B. melitensis, B. suis, B. ovis, B. canis, B. neotomae y B. microti) y otras a
mamferos marinos (B. ceti y B. pinnipedialis). Brucella abortus, biovar 1-6 y 9;
B. melitensis, biovar 1-3; B. suis, biovar 1,3-5 y B. canis son patgenas en
humanos. El reservorio lo constituyen especies domsticas de ganado vacuno,
porcino, caprino y ovino. (Dra. Cristina E. Fernandez De Kirchner, 2013)
Brucella spp. es un parsito obligado, requiere de un hospedero para su
mantenimiento. Las infecciones tienden a localizarse en el retculo endotelial y
tracto genital, las manifestaciones clnicas ms comunes son abortos en las
hembras y epididimitis y orquitis en los machos. Infecciones crnicas tambin
son comunes.
Estudios de hibridacin ADN-ADN indican que Brucella spp. pertenece a una
sola genoespecie. La diferenciacin de las diferentes especies de Brucella spp.
exhiben preferencia por hospedero y varan en la severidad de la enfermedad
causada. Tincin y susceptibilidad a fagos junto con bioqumicas, serologa y
caractersticas coloniales se usan para distinguir entre especies.
En Amrica la brucelosis es una de las ms perjudiciales zoonosis por sus
nocivas consecuencias en la salud humana y las graves prdidas econmicas
causadas por su extensa distribucin en la ganadera productora de alimentos
de la mayora de los pases de las Amricas y en especial de Latinoamrica. En
cambio la mayora de los pases y territorios del Caribe gozan de una situacin
sanitaria muy satisfactoria.
La brucelosis en humanos tiene origen en la brucelosis animal y en general no
se transmite de un ser humano a otro aunque han sido informados casos
excepcionales de transmisin interhumana. El hombre y otras especies
animales son huspedes secundarios y accidentales y con frecuencia ocurre la
migracin de las bacterias de los reservorios primarios hacia otras especies
animales. (Morn, 1996)
El Laboratorio del Instituto Hondureo de Investigacin Mdico-Veterinaria, en
colaboracin con la Servicio Nacional de Sanidad Agropecuaria (SENASA), es
responsable de la vigilancia epidemiolgica de esta enfermedad en Honduras y
utilizan diferentes mtodos de diagnstico de tamizaje y confirmatorio para
llevar un registro de los resultados de las fincas y animales infectados o no.
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Brucella
1. Caractersticas Generales
Brucelosis es una enfermedad de infeccin bacteriana causada por miembros
del gnero Brucella. Es una enfermedad de importancia mundial y afecta un
gran nmero de especies de animales. Brucella sp. es un parsito obligado,
requiere de un hospedero para su mantenimiento. Las infecciones tienden a
localizarse en el retculo endotelial y tracto genital, las manifestaciones clnicas
ms comunes son abortos en las hembras y epididimitis y orquitis en los
machos. Infecciones crnicas tambin son comunes.
Estudios de hibridacin ADN-ADN indican que no hay una sola genoespecie de
Brucella sp. La diferenciacin de las variadas especies de Brucella sp. exhiben
preferencia por hospedero y varan en la severidad de la enfermedad causada.
Tincin y susceptibilidad a fagos junto con bioqumicas, serologa y
caractersticas coloniales se usan para distinguir entre especies. Las seis
especies de Brucella son: B. abortus, B. canis, B. melitensis, B. neotomae, B.
ovis y B. suis.
Muchas especies de Brucella son capaces de causar enfermedad en humanos.
Las infecciones son crnicas y debilitantes. Los sntomas de brucelosis en
humanos son relativamente especficos e individuales, usualmente son
tachados de hipocondracos por que las manifestaciones clnicas son muy
vagas.
La brucelosis humana fue conocida antiguamente como la fiebre de Malta,
fiebre ondulante y fiebre mediterrnea, su cuadro clnico fue descrito por
primera vez por Marston en 1859. La historia de esta enfermedad se remonta a
fines del siglo XIX en la isla de Malta, donde las tropas inglesas all apostadas,
sufran el embate de una afeccin que ocasionaba la muerte de un regular
nmero de soldados. Ante esta situacin el Gobierno Ingls en 1904 envi una
comisin investigadora llamada Mediterranean Fever Commission presidida
por el mdico antomo-patlogo militar David Bruce quien ya en 1887, haba
descubierto unos microbios pequeos en bazos hipertrofiados de soldados
fallecidos en Malta. Al cabo de un ao consigui el aislamiento y cultivo de la
bacteria a la que llam Micrococcus Melites. En 1905 el mdico malts
Themistokles Zammit determin el papel de las cabras y el consumo humano
de sus sub-productos (queso, leche, etc.) en la enfermedad. En 1896 el
Veterinario dans Bang, identific al microbio causante del aborto epizotico
bovino, pero fue en 1918 cuando la microbiloga norteamericana Alice Evans,
compar los microbios aislados de Bruce y de Bang comprobando su
semejanza y en 1920 se engloban con el nombre Brucella en honor a su
descubridor.
5
1.1
Morfologa & Tincin
Brucella sp. es un cocobacilo gram-negativo, pequeo, mide entre 0.6 a 1.5

um X 0.5 a 0.7um. Las clulas son uniformes y pueden confundirse fcilmente
por cocos. Usualmente se encuentran individuales, en pares o en cadenas. No
tienen cpsula, flagelo, tampoco producen esporas pero s tienen una capa
externa que se demuestra por microscopa electrnica en B. abortus, B.
melitensis y B. suis. Brucella sp. se tie de rojo con la tincin de Maquiavelo y
Ziehl-Neelsen modificado.
1.2
Estructura & Composicin Celular
Brucella sp. posee una pared celular gram-negativa tpica. Antgenos de

superficie dominantes en el lipopolisacrido. Especficamente antgenos A y M
son encontrados en variadas concentraciones entre las especies de Brucella sp.
La membrana externa contiene otros antgenos de superficie. La protena
porina en la membrana externa se cree que estimulan un tipo de
hipersensibilidad tarda y son responsables por la variable susceptibilidad a las
tinciones observadas en diferentes especies. La capa de peptidoglicanos (3nm
5nm) es ms prominente que la de Escherichia coli. El espacio periplsmico
vara entre 3nm a 30nm. La membrana citoplsmica es una tpica membrana
de tres capas lipoproticas. Las variantes tipo-L son reconocidas y juegan un
rol persistente de infecciones en el hospedero.
El mol% de G + C del ADN es de 57%. ADN plasmtico no se ha demostrado. La
composicin de cidos lipdicos es suficientemente nicos para ser tiles para
la identificacin y propsitos taxonmicos.
1.3
Caractersticas de Crecimiento
En un aislamiento inicial las colonias no son aparentes hasta el 3 o 5 da de

incubacin. La mayora de las colonias son detectadas entre 10 y 14 das, en
algunos casos se requiere una incubacin por 21 das. El crecimiento es mejor
en un ambiente aerbico a 37C pero ocurre entre 20C y 40c. EL pH ptimo
es de 6.6 7.4. Brucella ovis y otros biovares de B. abortus requieren una
concentracin ms elevada de CO2. Medios enriquecidos con 5% de suero son
requeridos parapara B. abortus biovar 2 y B. ovis.
Las colonias de Brucella sp. tienen un color azulado caracterstico cuando se
examina con luz transmitida de manera oblicua. Las colonias varan entre
rugosas y lisas, morfologa determinada por la presencia o ausencia de la
cadena del polisacrido en el lipopolisacrido. Estas variaciones morfolgicas
son el resultado de la mutacin espontnea y son influenciados por factores de
crecimiento especficos. Las colonias lisas son blancas, convexas con un borde
entero y consistencia cremosa. Las colonias rugosas (no lisas) son amarillo
plido, opacas y quebradizas. Son muy difciles de suspender en una solucin y
se aglutinan espontneamente. Las colonias mucosas son similares a las
colonias rugosas excepto por tener una textura aglutinante.
1.4
Resistencia
Brucella sp. sobrevive congelamiento y descongelacin. Bajo las circunstancias

ambientales adecuadas, puede sobrevivir hasta cuatro meses en la leche,
orina, agua y suelo mojado. La mayora de desinfectantes activos contra otras
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bacterias gram-negativas matan Brucella
efectivamente la Brucella sp. en leche.
1.5
sp.
La
Pasteurizcin
mata
Diversidad
La morfologa colonial de Brucella sp. vara de forma rugosa a lisa. Brucella

abortus, B. melitensis, B. suis y B. neotomae son tpicamente aisladas en la
forma lisa pero pueden desarrollar formas rugosas con el paso subsecuente en
el laboratorio. Brucella ovis siempre se encuentra en forma rugosa. Colonias
aisladas de B. canis tienen un aspecto mucoide. En general, las cepas lisas de
Brucella sp. son ms virulentas que las rugosas.
Variacin en el CO2 es requerida, produccin de H2S, produccin de ureasa,
susceptibilidad a concentraciones variadas de ciertas tinciones (tionina y
fucsina bsica) y susceptibilidad a bacterifagos ya sean naturales o derivados
mutagnicos, estas son algunas de las diversidades entre especies y biovares.
Las diferentes especies de Brucella sp. varan en la preferencia de su
hospedero y en el grado de virulencia y entre las especies de animales.
2. Epidemiologa
2.1
Reservorios Zoolgicos y Geogrficos
Como parsitos obligados, Brucella sp. requiere de un animal reservorio. La

preferencia por hospedero es exhibida por las diferentes especies. El tiempo de
sobrevivencia fuera del hospedero vara y depende de la temperatura y
humedad. Climas ms fros extienden el tiempo de sobrevivencia.
El ganado bovino es el hospedero preferido por B. abortus. Otros animales
como los bisontes, camellos y yaks son comnmente infectados. Los diferentes
biovares de B. abortus tienen diferente distribucin geogrfica. Biovares 1 y 2
son distribuidos a nivel mundial, mientras que el biovar 3 se encuentra
predominantemente en India, Egipto y frica. El biovar 5 es ms comn en
Alemania y el Reino Unido.
2.2
Transmisin
Brucella sp. es diseminada por contacto directo o indirecto de animales

infectados. La ingestin es la ruta de entrada ms comn, aunque la exposicin
por la mucosa conjuntiva y genital, la piel y el tracto respiratorio tambin
puede ocurrir. La mayor causa de exposicin a B. abortus es por fetos
abortados, placenta y fluidos uterinos postaborto. El tejido abortado y los
fluidos son tambin transmisor comn de B. suis y B. canis. La infeccin genital
en el ganado bovino dura 30 das despus de que dan a luz y despus de este
tiempo ya no son consideradas infecciosas.
La ingestin de leche de ganado o cabras infectadas es otra fuente de infeccin
para terneros y nios. Transferencia directa en tero tambin ha sido
documentada.
Infecciones de las glndulas sexuales accesorias del macho permiten la
diseminacin de microorganismos a travs del semen. Las infecciones pueden
ocurrir en los rganos sexuales accesorios sin la presencia de lesiones
testiculares o epididimiales.
7

Los
insectos
tambin juegan un
rol minoritario en la
transmisin
y
mantenimiento de
las infecciones en
un ganado. Se ha
demostrado
que
ciertas
moscas
toman y excretan
Brucella sp. en sus
heces.
2.3
Susceptibilidad Animal
La susceptibilidad a la infeccin depende de la edad, sexo, raza y estado de

embarazo. Los animales ms jvenes tienden a ser ms resistentes a
infecciones, aunque pueden tener infecciones latentes. Solo el 2.6% de los
animales infectados al nacer continan infectados como adultos. Animales
sexualmente maduros son mucho ms susceptibles a la infeccin, sin importar
el gnero. La mayora de animales infectados como adultos quedan infectados
de por vida.
El tamao del ganado y la densidad animal son directamente relacionados con
la prevalencia de la enfermedad y la dificultad de controlar la infeccin entre la
poblacin. Las prcticas de parto tambin juegan un rol importante en la
expansin de la brucelosis. Separar las hembras que van a parir permite
minimizar la exposicin de los animales no infectados.
2.4
Susceptibilidad Humana
Los humanos adquieren la infeccin al entrar en contacto con tejido

contaminado con las especies de Brucella sp. Brucella melitensis es
considerada la ms virulenta para humanos, seguido de B. suis, B. abortus, y
B. canis. Brucella ovis y B. neotomae no infectan humanos. Las fuentes ms
comunes de infeccin son los fetos abortados, placentas y fluidos uterinos
postaborto, de los cuales todos contienen una gran cantidad de
microorganismos. Los veterinarios, granjeros y los que trabajan en mataderos
son la poblacin en riesgo de adquirir la infeccin.
Los animales infectados tambin despiden microorganismos en la leche. Leche
cruda u otros productos lcteos sin procesar de ganado bovino u otro origen
son fuentes de infeccin humana. Hay casos de auto-inoculacin con vacunas
de Brucella sp. atenuada que pueden resultar en la enfermedad. Transmisin
de persona a persona es muy rara.
3. Patognesis
Los animales infectados son la principal fuente de dispersin de la bacteria,
siendo las secreciones genitales o mamarias el principal vehculo de
contaminacin. Brucella sp. tiene la capacidad de adherirse y penetrar las
8

conjuntivas o la piel lesionada de humanos, luego es fagocitada por
polimorfonucleares neutrfilos (PMN) y por monocitos, sobreviviendo
intracelularmente, de esta manera evade los mecanismos de defensa celulares
y humorales. As la bacteria se asegura un mecanismo de transporte dentro de
los fagocitos, diseminndose a diferentes rganos y produciendo, cuando
destruye a sus clulas transportadoras, las bacteriemias caractersticas que
definen el cuadro clnico. Brucella sp. tambin es capaz de inducir su propia
internalizacin en clulas que no son fagocticas activas como los fibroblastos y
clulas epiteliales y una vez dentro de la clula consigue establecerse en el
retculo endoplsmico donde permanece y se multiplica. La localizacin final de
Brucella sp. en los tejidos de los animales preados es la placenta, donde
alcanza concentraciones muy altas de aproximadamente 1010 bacterias por
cm3. Esto produce finalmente una placentitis severa con infeccin del feto y
aborto.
3.1
Mecanismo de Accin
Seguido de la exposicin, Brucella sp. penetra la superficie de la mucosa

intacta. En el tracto alimentario, el epitelio que recubre las barreras del ilen y
las placas de Peyer son el sitio de entrada preferido. Despus de penetrar la
barrera de la mucosa, los organismos pueden ser fagocitados. Receptores
especficos en los macrfagos aparentan mediar la unin y tomar la Brucella
sp. Hay varios mecanismos utilizados por la bacteria para permitir sobrevivir
dentro de la clula fagoctica. Son capaces de sobrevivir y multiplicarse dentro
del macrfago inhibiendo la fusin del fagolisosoma. La porcin de Adenina y 5
Guanina monofosfato en ejemplos de suspensiones de Brucella sp. han
demostrado inhibir
el fagolisosoma en neutrfilos. La sobrevivencia
intracelular en los macrfagos y en menor contexto, neutrfilos, aumenta con
la supresin del sistema haluro de la mieloperoxidasa. La produccin de sper
xido dismutasa y catalasa juegan un rol en defensa contra la muerte
oxidativa. Las protenas de estrs han demostrado ser un factor de
sobrevivencia intracelular en el hospedero. Se cree que estas protenas juegan
un rol protegiendo al microorganismo de los sistemas de amenaza de las
enzimas hidrolticas, radicales de oxgeno, y mieloperoxidasa en el
fagolisosoma. El lipopolisacrido de Brucella sp. est directamente asociado a
la virulencia y sobrevivencia intracelular. Se cree que las variaciones en
virulencia observado en las diferentes especies de Brucella sp. son, en parte,
relacionadas a la gran habilidad de algunas especies para evitar las defensas
del hospedero.
Seguido de la entrada al hospedero, los organismos de Brucella sp. son
liberados ya sea en el ambiente extracelular o en las clulas fagocticas
localizadas en los ndulos linfticos. Ah ellas proliferan e infectan otras clulas
o son matadas y terminan la infeccin. Algn ganado aparenta ser ntimamente
resistente. Esta resistencia est relacionada con la resistencia y habilidad para
contener los organismos. Desde la regin de los ndulos linfticos. Brucella sp.
diseminada, hematgena y localizada en el sistema retculo endotelial y tracto
reproductivo.
Hay preferencia por el tracto reproductivo en los animales embarazados.
Factores desconocidos en el tero, llamados fluidos alanticos colectivamente,
9

estimulan el crecimiento de Brucella sp. Eritrol, un alcohol de cuatro carbonos,
es considerado uno de esos factores.
Estudios de infecciones experimentales han demostrado que a nivel celular,
Brucella sp. se localiza en las cisternas del retculo endoplsmico rugoso del
trofoblasto de la placenta. Subsecuentemente, la infeccin se disemina al feto.
El mecanismo exacto del aborto no est bien definido, sin embargo, hay gran
posibilidad de que los abortos se deban a:
-
Interferencia con la circulacin fetal debido a una existente placenttis.
El efecto directo de la endotoxina.
Estrs fetal resultado de la respuesta inflamatoria en el tejido fetal.
Aunque se sabe poco sobre los factores involucrados en la localizacin de

Brucella sp. en el tracto reproductivo de los machos, la presencia de
compuestos para el estmulo de crecimiento pueden ser un factor. La
bacteremia prolongada observa en algunas especies de Brucella sp. pueden
tener un gran parentesco de manifestaciones extragenital.
3.2
Factores de Virulencia
A diferencia de muchas bacterias patgenas intracelulares, Brucella sp. no

posee los tradicionales factores de virulencia como plsmidos o bacterifagos
lisognicos que le confieran virulencia, no produce exotoxinas, no tiene cpsula
que la proteja de la fagocitosis, ni muestra variacin antignica. Sin embargo,
es una bacteria muy virulenta y patognica en su husped natural. En su
contacto inicial con el husped Brucella sp. es fagocitada por el PMN o el
macrfago no activado localizndose dentro de vacuolas intracitoplasmticas.
De alguna manera es capaz de evadir los mecanismos microbicidas
intracelulares permaneciendo y multiplicndose dentro de las vacuolas,
sugiriendo una buena adaptacin a la vida intracelular. Brucella sp es capaz de
evadir o resistir los mecanismos de defensa de los PMN y Monocitos porque ha
demostrado ser muy eficiente en su vida intracelular y tiene gran capacidad de
diseminarse y de producir bacteriemias frecuentes, que se asocian a los
cuadros febriles. Es muy probable que la composicin de la membrana externa
de Brucella sp. y dentro de esta el LPS sea el responsable de esta especial
resistencia a diferentes mecanismos microbicidas. Lo controversial de esta
infeccin es que a pesar de que su agente causal tenga poca actividad
biolgica in vitro e in vivo y que no posea factores de virulencia clsicos, es
muy contagioso, patognico, eficiente en autoperpetuarse en los rebaos y
productor de grave enfermedad en los hospederos no naturales como los
humanos. Adems, la enfermedad es muy difcil de curar y a pesar del
tratamiento con antibiticos es capaz de hacerse crnica y producir
complicaciones mortales.
3.3
Patologa
Hay lesiones crudamente visibles en la placenta asociada con los abortos por
Brucella sp. Engrosamiento intercotiledonario con un fluido amarillo gelatinoso
est presente. Los cotiledones son freceuntemente necrticos de color amarillo
grisceo y cubierto con una gruesa capa caf de exudado. El grado de necrosis
10

vara segn las especies de Brucella sp., siendo la infeccin por B. melitensis la
ms severa entre las cabras. El feto abortado es usualmente edematoso.
Contenidos abomasales son turbios y tienen un color limn amarilloso. El
encuentro histolgico ms comn en el feto es una bronquitis o
bronconeumona con una clula mononuclear infiltrada. En general, Brucella
sp. induce una reaccin inflamatoria granulomatosa.
En los machos un aumento palpable del epiddimo, especficamente en la
porcin alta, es comn. Lesiones epiddimales son caracterizadas por
hiperplasia y degeneracin hidrpica del epitelio tubular. Resultado de la
extravasacin de espermas se llega a la formacin de esperma granuloso. En
los toros con orquitis el escroto est hinchada, debido a una inflamacin de la
tnica y exudado fibrinopurulento en la tnica vaginal. El parnquima testicular
se vuelve necrtico y es reemplazado por pus. La patologa de los rganos
sexuales incluye la prostatitis y vesiculitis seminal fibrinopurulento.
4. Manifestaciones Clnicas
La OMS en 1968 afirm que: la brucelosis es responsable de ms
enfermedades, miserias y prdidas econmicas que cualquier otra enfermedad
animal conocida que afecte a los humanos. Por sus caractersticas, la
brucelosis no puede ser entendida, tratada y mucho menos erradicada, si no es
con trabajo interdisciplinario de Mdicos, Veterinarios, Bioqumicos, Cientficos
y Microbilogos. La brucelosis es una enfermedad que adems de afectar a la
salud humana provoca un gran impacto en las economas regionales que va en
desmedro de la produccin pecuaria y del valor comercial de sus derivados:
puede generar barreras en la comercializacin de los animales y de sus
productos derivados, adems de las prdidas que produce por abortos. La
aparicin de esta patologa en humanos siempre se asocia a la enfermedad en
el ganado. Para lograr un adecuado control de la enfermedad en el hombre es
fundamental el desarrollo de programas de vacunacin del ganado. As mismo,
la vigilancia epidemiolgica en la poblacin expuesta es fundamental, ya que
un diagnstico temprano permite una rpida mejora, que evita las
complicaciones secundarias a la cronicidad de la enfermedad. La bacteria
generalmente se localiza en los tejidos reticuloendoteliales, rganos
reproductivos (orquitis y epididimitis), articulaciones y huesos (osteomielitis o
mal de la cruz en equinos infectados con B. abortus). (Salud, 2000)
La enfermedad acostumbra cursar sin signos externos. Las manifestaciones
clnicas ms frecuentes son los abortos (causa hasta 65% de los abortos en
vacas, cerdos, ovejas y cabras), el nacimiento de animales inviables y las
alteraciones en el aparato genital de los machos. En los animales infectados,
las bacterias son excretadas durante el aborto o parto; se encuentran en
grandes cantidades (hasta diez billones de Brucelas por gramo) en el calostro y
leche, en el exudado vaginal y en los rganos del abortado. Es una enfermedad
netamente reproductiva aunque no venrea (salvo en los cerdos cuya
eyaculacin es intrauterina y en los caninos donde esta va de contagio
tambin es probable) lo que le confiere tanto sanitaria como econmicamente
una importancia que no debe subvalorarse. Es por esta razn que la OMS y
otros organismos han establecido planes para eliminar y erradicar la Brucelosis
tanto en Europa como en Amrica (Salud, 2000).
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La infeccin por brucelosis puede ser adquirida por contacto directo con la
sangre del animal infectado con soluciones de continuidad en piel de humanos
o a travs la mucosa conjuntival, o a travs el tracto digestivo por consumo de
productos lcteos no pasteurizados y muy ocasionalmente por inhalacin de
aerosoles. Por lo tanto, estn expuestos a adquirirla quienes trabajan con
ganado como mdicos veterinarios, laboratoristas y trabajadores de frigorficos
y mataderos. Las labores ms riesgosas para el contacto son: la atencin de
partos, el sacrificio y el procesamiento manual de la carne del animal. La
infeccin interhumana es poco comn, aunque se han reportado casos por
transfusin sangunea y trasplante de mdula.
5. Aspectos Inmunolgicos
5.1
Mecanismo Inmune en la Patognesis
Hay evidencia de que los anticuerpos contra Brucella sp. juegan un doble
papel: protector y daino. Los anticuerpos IgM aparecen al inicio de la infeccin
y los bajos niveles de anticuerpos IgG causan una lisis mediada por
complemento de la Brucella sp. Niveles elevados del anticuerpo IgG, actan
como anticuerpos de bloqueo que modulan la habilidad del complejo de ataque
de la membrana del complemento hacia la lisis celular. Esto ocasiona una
resistencia a la lisis mediada por complemento en vista de un aumento de
anticuerpos altamente especficos y la falta de correlacin entre la proteccin y
los altos ttulos de anticuerpos. Los anticuerpos de bloqueo opsonizan y
promueven la absorcin por las clulas fagocticas de las clulas de Brucella
sp. que han desarrollado mecanismos de sobrevivencia y proliferacin dentro
de stos fagos.
Las clulas fagocticas que no son capaces de eliminar las bacterias juegan un
rol de diseminacin del organismo a otras partes del cuerpo y en la
persistencia de la infeccin.
5.2
Mecanismo de Resistencia y Recuperacin
Naturalmente, una inmunidad efectiva es primordialmente celular. Linfocitos T

especficamente sensibilizados liberan citosinas que activan los macrfagos,
que toman el control de la Brucella sp. por intermediarios de oxgeno reactivo.
Una inmunidad an ms efectiva se desarrolla cuando los animales son
infectados antes de la madurez sexual.
5.3
Inmunizacin Artificial
El ganado es inmunizado por vacunas no viables (B. abortus 45/20) o vivas

atenuadas (B. abortus cepa 19 y RB51). Estos productos proveen una
proteccin al aborto, la principal forma de diseminacin, pero no de la
infeccin. Una sola dosis entre los 3 a 7 y 3 a 10 meses de edad es requerida
con la cepa 19 y RB51 de B. abortus respectivamente. Dos dosis con 6
semanas de diferencia es necesaria en los animales de ms de 5 meses de
edad con B. abortus 45/20. La vacunacin de vacas adultas se realiza a veces
como un esfuerzo regulatorio para controlar la infeccin en el ganado. En
ocasiones la cepa 19 se filtra a la leche y puede ocasionar abortos, la cepa
RB51 rara vez causa abortos en adultos. Los toros no deben vacunarse porque
12

se puede desarrollar una orquitis. El tipo de vacuna usualmente es establecido
por las agencias regulatorias del pas.
6. Tcnicas de Diagnstico
Todos los abortos del ganado bovino en fases tardas de la gestacin, a partir
del quinto mes, deben tratarse como sospechosos de brucelosis y deben
estudiarse. El cuadro clnico no es patognomnico, aunque la historia del
rebao puede servir de ayuda. El diagnstico inequvoco de una infeccin por
Brucella sp. solo puede hacerse mediante el aislamiento y la identificacin de
Brucella sp., pero en situaciones en las que no es posible el anlisis
bacteriolgico, el diagnstico puede basarse en los mtodos serolgicos. No
existe una prueba nica que permita la identificacin de Brucella. Normalmente
se necesita una combinacin de las caractersticas de crecimiento y mtodos
serolgicos, bacteriolgicos y/o moleculares.
6.1
Identificacin del Agente
a. Mtodos de Tincin
El gnero Brucella sp. est formado por cocobacilos o bacilos cortos que miden
0,6-1,5 m de largo por 0,5- 0,7 m de ancho. Normalmente aparecen aislados,
y con menos frecuencia en pares o en grupos pequeos. La morfologa de los
microorganismos del gnero Brucella es bastante constante aunque en cultivos
viejos se observan formas pleomrficas. No es una bacteria mvil. No forma
esporas ni flagelos, ni fimbrias o cpsulas verdaderas. Los microorganismos del
gnero Brucella son Gram negativos y no suelen mostrar tincin bipolar. No son
verdaderamente bacterias cido-alcohol resistentes, pero resisten a la
decoloracin por cidos dbiles y se tien de rojo por la modificacin de Stamp
del mtodo de Ziehl- Neelsen. ste mtodo constituye el procedimiento normal
para el examen de frotis de rganos o lquidos biolgicos, que se fijan
previamente con calor o etanol, y por este mtodo los microorganismos se
tien de rojo frente a un fondo azul. Tambin puede utilizarse una tcnica
basada en un anticuerpo conjugado a un fluorocromo o marcado con
peroxidasa. La presencia de microoorganismos intracelulares con morfologa de
Brucella sp., dbilmente resistentes a cidos, inmunoespecficamente teidos,
es una evidencia preliminar de brucelosis. Sin embargo, estos mtodos
presentan una baja sensibilidad en la leche y en productos lcteos donde los
microorganismos del gnero Brucella se presentan a menudo en nmero bajo,
y donde la presencia de glbulos de grasa impide frecuentemente una
interpretacin correcta. En la interpretacin de los resultados positivos por el
mtodo de Stamp tambin debe tenerse en cuenta que otros microorganismos
que causan aborto son difciles de diferenciar de Brucella sp., como
Chlamydophila abortus (antes Chlamydia psittaci) o Coxiella burnetii. Los
resultados, tanto positivos como negativos, deben confirmarse por cultivo.
Para demostrar el agente en diversas muestras biolgicas se pueden utilizar
mtodos en desarrollo basados en sondas de ADN o en la reaccin en cadena
de la polimerasa (PCR)
13
b. Cultivos
Medios basales
El aislamiento y cultivo directo de Brucella sp. se realiza normalmente en
medio slido. En general, ste representa el mtodo ms satisfactorio porque
permite el desarrollo de colonias aisladas fcilmente reconocibles. Los medios
slidos tambin limitan el establecimiento de mutantes no lisos y el desarrollo
excesivo de contaminantes. Sin embargo, el empleo de medios lquidos puede
recomendarse para muestras voluminosas o con fines de enriquecimiento. Se
dispone de un amplio rango de medios basales comercializados en forma
deshidratada, por ejemplo el medio base para Brucella sp., agar tripcasa (o
triptona)-soja (TSA). Es necesario aadir 2-5% de suero bovino o equino para el
crecimiento de algunas cepas como el biotipo 2 de B. abortus, y muchos
laboratorios lo aaden sistemticamente al medio basal con resultados
excelentes, como en el caso del agar sangre (Oxoid) o agar Columbia
(BioMrieux). Se pueden utilizar otros medios satisfactorios como el agar
suerodextrosa (SDA) o el agar glicerol-dextrosa. El medio SDA es normalmente
el preferido para la observacin de la morfologa colonial. Para el aislamiento
de Brucella sp. de la sangre o de la leche, y de otros lquidos del cuerpo, donde
se aconseja un cultivo de enriquecimiento, se recomienda un medio bifsico no
selectivo conocido como medio de Castaeda. Este medio se emplea porque
las brucelas tienden a disociarse en medio lquido y esto interfiere con la
biotipificacin por tcnicas bacteriolgicas convencionales.
Si el material est contaminado se puede emplear el medio de cultivo bsico
adicionado de antibiticos, aunque las cepas de Brucella sp. muy sensibles
pueden ser inhibidas. Es recomendable sembrar el material por duplicado en el
medio bsico y en el medio con el suplemento de antibiticos.
Para el cultivo masivo de cepas para la preparacin de antgenos o vacunas se
utilizan medios slidos en frascos Roux o medio de cultivo lquido aireado. En
este ltimo caso durante el perodo de incubacin se debe controlar el flujo de
aire, el pH, la agitacin y el nivel de espuma para evitar la disociacin y
optimizar el rendimiento.
Suero dextrosa agar (SDA)
Agar base (BBLTM) 4 g
Agua destilada 100 ml
Disolver en B.M y esterilizar en autoclave a 121oC. Enfriar a 56oC+/-1 y
agregar 5 ml de suero equino esterilizado por filtracin que contenga dextrosa
al 20% p/v.
Medio bsico (BD)
Brucella Agar (BBLTM ) preparado de acuerdo a las instrucciones del envase y
esterilizado en autoclave a 121oC.
Medio bsico con suero equino (BDS)
A Brucella Agar (BBLTM) preparado de acuerdo a las instrucciones del envase,
esterilizado en autoclave y enfriado a 56oC+/-1, agregar suero equino al 3%
previamente esterilizado por filtracin.
14

Caldo para hemocultivos
A medio bsico Brucella Broth (BBLTM) preparado de acuerdo a las
instrucciones del envase, agregar citrato de sodio al 2.5% y esterilizar en
autoclave a 121oC. Una vez enfriado a 56oC+/-1 agregar suero equino al 3 %
previamente esterilizado por filtracin. Distribuir esterilmente 20 ml en frascos
de 50 ml, colocar tapones de goma y casquete metlico e incubar invertidos
durante 72 h.
Medio de Kuzdas Morse
A 100 ml de medio bsico estril y enfriado a 56oC+/-1 agregar 100 mg de
cicloheximida, 25000 U.I de bacitracina y 6000 UI de polimixina B, esterilizadas
por filtracin. Previamente preparar soluciones concentradas en agua destilada
de los antibiticos. La cicloheximida debe ser disuelta en 1 ml de acetona antes
de completar el volumen con agua destilada.
Medios Selectivos
Todos los medios basales indicados antes se pueden emplear para la
preparacin de medios selectivos. Se aaden antibiticos apropiados para
evitar el crecimiento de organismos distintos a Brucella sp. El medio selectivo
ms difundido es el de Farrell, que se prepara aadiendo seis antibiticos a un
medio basal. Se aaden las siguientes cantidades por 1 litro de medio: sulfato
de polimixina B (5.000 unidades = 5 mg); bacitracina (25.000 unidades = 25
mg); natamicina (50 mg); cido nalidxico (5 mg); nistatina (100.000 unidades);
vancomicina (20 mg).
Se ha comercializado un suplemento de antibiticos liofilizado (Oxoid). Sin
embargo, a las concentraciones utilizadas en el medio de Farrell, el cido
nalidxico y la bacitracina pueden tener efectos inhibidores sobre algunas
cepas de B. melitensis. Por ello, la sensibilidad del aislamiento de B. melitensis
aumenta cuando se utilizan tanto el medio de Farrell como el medio de ThayerMartin.
En esencia, el medio modificado de Thayer-Martin se puede preparar con
medio base GC (38 g/litro; Biolife Laboratories, Milan, Italia) suplementado con
hemoglobina (10 g/litro; Difco) y metanosulfonato de colistina (7,5 mg/litro),
vancomicina (3 mg/litro), nitrofurantona (10 mg/litro), nistatina (100.000
Unidades Internacionales [UI]/litro = 17,7 mg) y anfotericina B (2,5 mg/litro). A
diferencia de otros biotipos de B. abortus, el crecimiento de B. melitensis no es
dependiente de la presencia de una atmsfera con 5-10% de CO2.
Como el nmero de microorganismos de Brucella sp. en la leche, en el calostro
y en algunas muestras tisulares, es probablemente menor que en material de
abortos, se recomienda un enriquecimiento. En el caso de la leche, los
resultados tambin mejoran por centrifugacin y cultivo de la capa cremosa y
del precipitado. El enriquecimiento se puede realizar en medio lquido con
suero-dextrosa, con caldo de tripticasa (o triptona)-soja o con caldo para
Brucella sp. suplementado con una mezcla de antibiticos que lleve al menos
anfotericina B (1 g/ml) y vancomicina (20 g/ml) (concentraciones finales). El
medio de enriquecimiento debe incubarse a 37C en atmsfera aerobia con 515

10% (v/v) de CO2 hasta 6 semanas, con subcultivos semanales a un medio
slido selectivo. Si se prefiere, se puede utilizar un sistema bifsico con medio
selectivo lquido y slido en la misma botella (tcnica de Castaeda) para
reducir el subcultivo. Para el aislamiento de Brucella sp. de la leche se
recomienda a veces un medio selectivo bifsico que se compone del medio
basal de Castaeda al que se aaden los siguientes antibiticos en la fase
lquida (las cantidades que se indican son por litro de medio): sulfato de
polimixina B (6000 unidades = 6 mh); bacitracina (25.000 unidades = 25 mg);
natamicina (50 mg); cido nalidxico (5 mg); anfotericina B (1 mg);
vancomicina (20 mg); D-cicloserina (100 mg).
Todos los medios de cultivo deben someterse a controles de calidad y permitir
el crecimiento de cepas difciles de cultivar, como el biotipo 2 de B. abortus, a
partir de inculos pequeos.
En medios slidos adecuados, las colonias de Brucella sp. son visibles despus
de 2 das de incubacin. A los 4 das las colonias son redondas, de 1-2 mm de
dimetro, con bordes lisos. Son translcidas y de color miel plido a la luz del
da en medio transparente. Vistas desde arriba son convexas y de color blanco
perla. Posteriormente las colonias se hacen ms grandes y ligeramente ms
oscuras. Los cultivos lisos de Brucella sp. (S) presentan tendencia a sufrir
variaciones durante el crecimiento, especialmente con subcultivos, y aparecen
formas rugosas (R). Las colonias son entonces mucho menos transparentes,
presentan una superficie mate ms granular y el color vara de blanco mate a
marrn con luz reflejada o transmitida. La comprobacin de esta transicin se
realiza fcilmente por tincin con cristal violeta: las colonias rugosas aparecen
rojas y las lisas de color amarillo plido. Si las colonias son lisas deben
probarse con antisuero contra B. abortus lisa, o preferiblemente con antisueros
monoespecficos contra los antgenos de superficie A y M. En el caso de
colonias rugosas, las colonias deben probarse con antisuero contra el antgeno
R de Brucella sp. Por lo general, los cambios de morfologa colonial se asocian
con cambios en la virulencia, en las propiedades serolgicas y/o en la
sensibilidad a los fagos. La aglutinacin positiva con un antisuero anti-Brucella
sp es una identificacin preliminar de que el aislado corresponde a Brucella sp.
La identificacin posterior completa se realiza mejor en un laboratorio de
referencia.
N-Z-amine-Primatone
N-Z-amine(Humko Sheffield) 16.25 g
Primatone (Humko Sheffield) 5.41 g
Extracto de levaduras 8.00 g
Dextrosa 24.00 g
Fosfato monosdico (PO4H2Na.H2O) 3.16g
Fosfato disdico(PO4HNa2) 1.06g
Agua destilada 1000.00ml
Disolver las peptonas en agua destilada, calentar a 80oC durante 2 h. Dejar
enfriar y agregar el resto de los componentes. Ajustar el pH a 6.4-7.0 y
esterilizar por filtracin. Controlar la esterilidad del medio a 36oC+/-1 durante
72 h.
16
Toma & Cultivo de Muestra

Para el diagnstico de la brucelosis animal mediante cultivo, la eleccin de las
muestras depende en general de los sntomas clnicos observados. Las
muestras ms adecuadas incluyen fetos abortados (contenido estomacal, bazo
y pulmones), membranas fetales, descargas vaginales (frotis), leche, semen y
lquidos artrticos o de los higromas. Los tejidos preferidos para cultivo de las
canales animales son los del sistema retculo-endotelial (ganglios linfticos de
la cabeza, mamarios y genitales, y el bazo), el tero inmediatamente antes o
despus del parto, y las ubres. El crecimiento aparece generalmente despus
de 2-3 das, pero no se deben desechar los cultivos como negativos hasta
despus de 810 das.
Tejidos: Las muestras se toman aspticamente con instrumentos estriles y se
maceran con un Stomacher o en un homogenizador de tejidos con una
pequea cantidad de solucin salina estril tamponada con fostato (PBS), antes
de inocularlas en medios slidos.
Descargas vaginales: Una fuente excelente para recoger Brucella sp. es un
frotis vaginal tomado despus del aborto o del parto, y es menos arriesgado
para el personal que el material del aborto. El frotis se extiende sobre los
medios slidos.
Leche: Las muestras de leche deben recogerse con limpieza despus de lavar
y secar toda la ubre y desinfectar los pezones. Es esencial que las muestras
contengan leche de todas las partes, y se deben tomar 10-20 ml de cada
cuartern. Los primeros chorros se desechan y la muestra se recoge
directamente en un recipiente estril. Debe tenerse cuidado en evitar el
contacto entre la leche y las manos del ordeador. La leche se centrifuga a
2.000 g durante 15 minutos en tubos cerrados (para evitar el riesgo de
formacin de aerosoles que contaminen al personal), y se extienden la capa
cremosa y el precipitado sobre los medios slidos, por separado o
conjuntamente. Si las brucelas estn presentes en la leche completa, su
nmero suele ser muy bajo y es improbable el aislamiento a partir de tales
muestras.
Derivados lcteos: Los productos lcteos, como los quesos, deben cultivarse
en los medios descritos arriba. Como es probable que estos materiales
contengan un nmero pequeo de microorganismos, se recomiendan cultivos
de enriquecimiento. Se necesita que las muestras estn homogenizadas
cuidadosamente antes del cultivo, despus de haberlas sometido a un
triturador de tejidos, a un Stomacher o a una batidora elctrica con un
volumen adecuado de PBS estril. Deben cultivarse las capas superficiales
(corteza y regin adyacente) y el interior del producto. Como las brucelas
viven, crecen y desaparecen rpidamente, su distribucin por las diferentes
partes del producto vara en funcin de las condiciones fsico-qumicas locales
relacionadas con la tecnologa especfica del proceso.
17

Despus de la toma, todas las muestras deben enfriarse rpidamente y
transportarse al laboratorio por el mtodo ms rpido. A su llegada, la leche y
las muestras de tejido deben congelarse si no se cultivan de inmediato.
El empleo de animales de laboratorio debe evitarse a menos que sean
absolutamente necesarios, aunque a veces constituyen el nico medio para
detectar la presencia de Brucella sp, sobre todo cuando las muestras estn
muy contaminadas o contienen un nmero bajo de microorganismos del gnero
Brucella sp. La inoculacin animal puede ser subcutnea o a travs de la piel
afeitada de cobayas o, con preferencia, intravenosa en ratones. Este trabajo
debe realizarse en condiciones de bioseguridad. Los bazos de los ratones se
cultivan 7 das despus de la inoculacin y, en el caso de los cobayas, se
somete una muestra de suero a pruebas especficas a las 3 y 6 semanas de la
inoculacin, y a continuacin se cultivan los bazos.
c. Identificacin y Tipificacin
Cualquier colonia con la morfologa similar a las de Brucella sp. debe analizarse
por la tincin de Gram (o por la coloracin de Stamp). Como en las fases no
lisas se alteran las propiedades serolgicas, tintoriales y de sensibilidad a los
fagos, la morfologa colonial resulta esencial para las pruebas de tipificacin
que se describen ms abajo. Los mtodos recomendados para observar la
morfologa de las colonias son el mtodo de Henry mediante luz reflejada
oblicua, la prueba de la acriflavina descrita por Braun & Bonestell, o el mtodo
de White & Wilson de tincin de colonias con cristal violeta.
La identificacin de los microorganismos se puede realizar mediante una
combinacin de las siguientes pruebas: morfologa celular y tincin de Gram o
de Stamp, propiedades de crecimiento, pruebas de ureasa, oxidasa y catalasa,
y la prueba de aglutinacin en porta con un suero policlonal anti-Brucella sp. La
identificacin de especies y de biotipos requiere pruebas ms elaboradas
(como la lisis por fagos y la aglutinacin con sueros monoespecficos anti-A,
anti-N anti-R), cuya realizacin se lleva a cabo en laboratorios de referencia
con experiencia en estos mtodos. La utilizacin simultnea de varios fagos, es
decir, el Tbilissi (Tb), Weybridge (Wb), Izatnagar (Iz) y RC, representa un
sistema de tipificacin fgica que, con suficiente experiencia, permite
identificar especies lisas y rugosas de Brucella sp. No obstante, algunas
propiedades, como el requerimiento de CO2 para crecer, la produccin de H2S
(detectada por papeles con acetato de plomo) y el crecimiento en presencia de
fucsina bsica y tionina a concentraciones finales de 20 g/ml, se detectan por
pruebas rutinarias que pueden realizarse en laboratorios no especializados
moderadamente equipados. Cuando se envan cepas de Brucella sp a un
laboratorio de referencia para tipificacin, es esencial seleccionar cepas lisas.
Los cultivos se liofilizan y se cierran en ampollas dentro de tubos con tampn
de rosca o se subcultivan en agar inclinado contenido en tubos con tapn de
rosca. Tambin deben enviarse cepas suspendidas en medio lquido (por
ejemplo en el medio de transporte de Ames) pero esto puede suponer una
oportunidad para el establecimiento de mutantes rugosos.
i)
Brucella sp est situada entre las bacterias ms peligrosas con las

que se trabaja, por el riesgo que presenta de producir infecciones
18
ii)
adquiridas en el laboratorio. Para transportar cultivos de Brucella

sp, las tapas de los recipientes deben estar bien cerradas y
selladas con tapones de PVC. Deben envolverse con papel
adsorbente o con lana de algodn, sellarse en bolsas de
polietileno y empaquetarse en un contenedor rgido de acuerdo
con las exigencias de la Asociacin para el Transporte Areo (IATA)
para el envo de muestras peligrosas. Tcnicas de muestreo. Como
los cultivos de Brucella sp son infecciosos, se designan UN2814 y
se debe realizar una Declaracin de Muestras Peligrosas. Los
requisitos para enviar muestras sospechosas son similares y se
deben repasar las regulaciones de la IATA antes del envo.
Tambin deben seguirse otras directrices nacionales e
internacionales.
Antes de enviar cultivos o muestras de diagnstico para cultivo,
debe de contactarse con el laboratorio receptor para determinar si
se necesita algn permiso especial y si el laboratorio tiene la
capacidad de realizar las pruebas solicitadas. Si las muestras
atraviesan las fronteras nacionales, probablemente se necesitar
un permiso de importacin que debe obtenerse antes de
despachar la muestra
d. Mtodos de reconocimiento de cidos nucleicos

La PCR desarrollada recientemente supone un mtodo adicional de deteccin e
identificacin de especies de Brucella sp. Pese al alto grado de homologa del
ADN dentro del gnero Brucella, se han desarrollado varios mtodos que
permiten, hasta cierto punto, la diferenciacin entre especies y algunos de sus
biotipos, como la PCR, el anlisis del polimorfismo de fragmentos de restriccin
(RFLP) y la hibridacin tipo Southern. Se ha desarrollado tambin una
electroforesis en campo pulsante que permite la diferenciacin entre varias
especies de Brucella sp. Sin embargo, ninguno de estos mtodos se ha
evaluado y estandarizado por completo y no son de distribucin amplia.
7. Pruebas Serolgicas
Ninguna prueba serolgica aislada es adecuada en todas y cada una de las
situaciones epidemiolgicas, presentando limitaciones en el anlisis de
animales individuales. Se deben considerar todos los factores que influyen en
la relevancia del mtodo de prueba y de sus resultados para una aplicacin o
interpretacin diagnstica especfica. Los mtodos serolgicos que se
describen son mtodos estandarizados y validados, con caractersticas de
realizacin adecuadas para ser consideradas pruebas obligadas o alternativas
en el comercio internacional. Esto no impide el uso de pruebas modificadas o
similares o la utilizacin de reactivos diferentes. Sin embargo, los mtodos y
reactivos descritos en este captulo suponen un estndar de comparacin
respecto a la realizacin esperada del diagnstico.
Debe resaltarse que la prueba de sueroaglutinacin lenta en tubo (SAT) se
considera inadecuada a efectos del comercio internacional. La prueba de
fijacin de complemento (FC) es ms especfica que la SAT para el diagnstico
19

y adems posee un sistema estandarizado de unidades. Las caractersticas
diagnsticas de algunos inmunoenzimoensayos (ELISAs) y la prueba de
polarizacin de fluorescencia (FPA) son similares o superiores a la FC y, como
son ms fciles de realizar tcnicamente y ms consistentes, es preferible su
utilizacin. Se ha comparado el rendimiento de algunas de estas pruebas.
Para el control de la brucelosis a nivel nacional o local, son adecuadas para el
anlisis las pruebas con antgeno tamponado de Brucella sp., es decir, la
prueba con rosa de bengala (RBT) y la prueba de aglutinacin tamponada en
placa (BPAT), as como ELISA y FPA. Las reacciones positivas deben volverse a
probar utilizando una estrategia confirmativa adecuada.
7.1
Prueba Rosa de Bengala
Esta prueba es una prueba sencilla de aglutinacin puntual que utiliza antgeno
coloreado con rosa de bengala y tamponado a bajo pH, normalmente 3,65 +
0,05.
Produccin de Antgeno
El antgeno para la RBT se prepara depositando clulas muertas de B. abortus
S99 o S1119-3, recogidas por centrifugacin a 23.000 g durante 10 minutos a
4C, y resuspendindolas uniformemente en solucin salina fenicada a razn
de 1 g por cada 22,5 ml. A cada 35 ml de esta suspensin se aade 1 ml de
rosa de bengala (CI No. 45440) al 1% (p/v) en agua destilada, y la mezcla se
agita 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla se filtra por lana de algodn
y se centrifuga a 10.000 g para depositar las clulas teidas, que a
continuacin se resuspenden uniformemente a razn de 1 g de clulas por 7 ml
de diluyente.
El color de esta suspensin debe ser rojo intenso y el sobrenadante de una
muestra centrifugada debe carecer de colorante; el pH debe ser 3,65 + 0,05.
Despus de la filtracin por lana de algodn, la suspensin se filtra dos veces a
travs de un prefiltro de fibra de vidrio Sartorius No. 13430, se ajusta a un PCV
de aproximadamente 8%, dependiendo de la estandarizacin final frente a un
suero calibrado contra el OIEISS, y se guarda a 4C en la oscuridad. El antgeno
nunca debe congelarse.
Procedimiento de la Prueba
1. Llevar las muestras de suero y de antgeno a temperatura ambiente (22
+ 4C); solo debe sacarse del refrigerador el antgeno suficiente para las
pruebas del da.
2. Colocar 25-30 l de cada muestra de suero en una baldosa blanca,
placa esmaltada o de plstico, o en una placa para hemaglutinacin de
la OMS.
3. Agitar bien la botella de antgeno, pero suavemente, y colocar el mismo
volumen de antgeno prximo a la gota de suero.
4. Inmediatamente despus de aadir la ltima gota de antgeno en la
placa, mezclar cuidadosamente el suero y el antgeno (usando un porta
limpio o una varilla de plstico para cada prueba) hasta producir una
zona circular u oval de aproximadamente 2 cm de dimetro.
20

5. La mezcla se agita suavemente durante 4 minutos a temperatura
ambiente en un agitador circular o tridimensional (si la zona de reaccin
es oval o circular, respectivamente)
6. Comprobar la aglutinacin tan pronto como se completa el perodo de 4
minutos. Cualquier reaccin visible se considera positiva. Antes de las
pruebas de cada da se debe probar un suero control que origine una
reaccin positiva mnima para comprobar la sensibilidad de las
condiciones de la prueba.
La RBT es muy sensible. Sin embargo, como toda prueba serolgica, a veces
origina una reaccin positiva debido a vacunacin con S19 o a reacciones
positivas falsas (FPSR). Por tanto, las reacciones positivas deben confirmarse
con estrategias confirmativas (que incluyan tanto la realizacin de otras
pruebas como la investigacin epidemiolgica). Las reacciones negativas falsas
se producen muy raramente, sobre todo debido a fenmenos de prozona y en
ocasiones se pueden detectar diluyendo la muestra de suero o volviendo a
probarla despus de un cierto tiempo. Sin embargo, la RBT parece adecuada
como una prueba de anlisis para detectar rebaos infectados o para
garantizar la ausencia de infeccin en rebaos libres de brucelosis.
7.2
Prueba de Aglutinacin Tamponada en Placa
El antgeno para la BPAT se prepara a partir de B. abortus S1119-3 siguiendo el

procedimiento descrito por Angus & Barton.
Se requieren dos soluciones de colorante: verde brillante (2 g/100 ml) y cristal
violeta (1 g/100 ml) de calidad garantizada disueltos en agua destilada. Una
vez preparadas, las dos soluciones se almacenan por separado durante 24
horas, y luego se mezclan en volmenes iguales en una botella opaca y se
guardan en un refrigerador durante ms de 6 meses antes de uso. La mezcla
de colorantes slo puede usarse entre 6 y 12 meses despus de la preparacin
inicial.
El diluyente tamponado se prepara disolviendo lentamente hidrxido sdico
(150 g) en 3-4 litros de solucin salina estril con fenol. A esta solucin se
aade cido lctico (675 ml) y el volumen final se ajusta a 6 litros aadiendo
solucin salina estril con fenol. El pH de la solucin debe estar entre 3,63 y
3,67.
Las clulas empaquetadas de Brucella abortus S1119-3 se diluyen a una
concentracin de 250 g/litro en solucin salina con fenol; se aaden 6 ml de
colorante por litro de suspensin celular, y la mezcla se agita antes de filtrar
por algodn absorbente estril. Las clulas se centrifugan a 10.000 g a 4C y
las clulas precipitadas se resuspenden a continuacin a una concentracin de
50 g/100 ml en diluyente tamponado (como se describe antes). La mezcla se
agita vigorosamente durante 2 horas y despus se diluye aadiendo 300 ml de
diluyente tamponado por cada 100 ml de clulas resuspendidas (es decir, a
una concentracin final de 50 g de clulas empaquetadas/400 ml de diluyente
tamponado). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 20-24 horas
antes de que la concentracin celular se ajuste al 11% (p/v) con diluyente
tamponado. Esta suspensin se agita durante toda la noche antes de uso.
21

Pendientes de pruebas sobre el control final de calidad, el antgeno se guarda a
4C hasta su empleo. El antgeno tiene una caducidad de 1 ao y no se debe
congelar.
El pH del antgeno tamponado en placa debe ser 3,70 + 0,03 y el pH de una
mezcla suero-antgeno a una proporcin 8:3 debe ser 4,02 + 0,04. La
suspensin al 11% de clulas teidas debe ser azul-verdosa. Cada lote de
antgeno tamponado en placa debe probarse con al menos 10 sueros de
reactividad dbil y comparar los resultados con uno o ms lotes previos de
antgeno.
Se mezcla suero (80 l) con 30 l de antgeno en una placa de vidrio marcada
con cuadros de 4 x 4 cm. Despus de la mezcla inicial, la placa se mueve tres
veces para asegurar la dispersin homognea de los reactivos y se incuba 4
minutos a temperatura ambiente en una cmara hmeda. Se extrae la placa y
se mueve como antes, incubando otros 4 minutos. Despus, se extrae la placa,
se mueve y se observa la aglutinacin. Cualquier reaccin visible se considera
positiva. Como la RBT, esta prueba es muy sensible, especialmente para la
deteccin de anticuerpo inducido por la vacuna, y las muestras positivas deben
volverse a probar con pruebas confirmativas. Pueden producirse reacciones
negativas falsas, debidas por lo general a fenmenos de prozona, la cual puede
eliminarse diluyendo el suero o volviendo a probar despus de cierto tiempo.
7.3
Prueba de Fijacin de Complemento
La FC est ampliamente aplicada y aceptada como prueba confirmativa pese a

la complejidad de su ejecucin y a la necesidad de unas buenas instalaciones y
de personal formado para titular y mantener los reactivos adecuadamente.
Existen muchas variaciones de la FC, pero esta prueba se suele realizar de
forma ms cmoda en formato de microtitulacin. Para la incubacin de suero,
antgeno y complemento, se puede utilizar la fijacin en caliente o en fro: 37
C durante 30 minutos o 4 C durante 14 18 horas. Varios factores influyen en
la eleccin del mtodo: la actividad anticomplementaria de muestras de suero
de baja calidad es ms evidente con la fijacin en fro, mientras que a 37 C
aumenta la frecuencia e intensidad de las prozonas, y se deben probar varias
diluciones para cada muestra.
Se han propuesto varios mtodos para la FC en los que se utilizan diferentes
concentraciones de eritrocitos de oveja (SRBC) frescos o conservados
(normalmente se recomienda una suspensin al 2, 2,5 o 3%). Los SRBC estn
sensibilizados con un volumen igual de suero de conejo anti-SRBC diluido hasta
contener varias veces (en general de dos a cinco) la concentracin mnima
necesaria para producir un 100% de lisis de SRBC en presencia de una solucin
titulada de complemento de cobaya. El ltimo se titula independientemente
(en presencia o ausencia de antgeno, segn el mtodo) para determinar la
cantidad de complemento necesaria para producir el 50% o el 100% de lisis de
los SRBC sensibilizados por unidad de volumen de una suspensin estndar;
estas se definen como la unidad hemoltica de complemento al 50% o al 100%/
dosis hemoltica mnima, respectivamente. Se suele recomendar titular el
complemento antes de cada serie de pruebas, siendo preferible un
micromtodo para la determinacin ptima.
22

El diluyente estndar para la FC es una solucin salina tamponada con barbital
(veronal). Se prepara con comprimidos comerciales; como alternativa, se
puede preparar a partir de una solucin madre de cloruro sdico (42,5 g), cido
barbitrico (2,875 g), dietil barbiturato sdico (1,875 g), sulfato magnsico
(1,018 g) y cloruro clcico (0,147 g) en 1 litro de agua destilada, y se diluye
antes de utilizarla aadiendo cuatro volmenes de una solucin de gelatina al
0,04%.
7.4
ELISA indirecto
Se han descrito muchas variaciones de ELISA indirecto (I-ELISA) utilizando

diferentes preparaciones antignicas, diversos conjugados de antiglobulinas
con enzimas, y varios sustratos/cromgenos. Se dispone de varios I-ELISA
comerciales en los que se utiliza clula entera, lipopolisacrido liso (sLPS) o el
Opolisacrido (OPS) como antgenos que han sido validados en extensos
ensayos de campo, y se utilizan mucho. A efectos de una armonizacin
internacional, los laboratorios nacionales de referencia deben utilizar los tres
Sueros Estndar de la OIE para ELISA con el fin de comprobar o calibrar el
mtodo de la prueba en cuestin.
La prueba debe calibrarse de modo que la densidad ptica (DO) del Suero
Estndar de la OIE para ELISA fuertemente positivo represente un punto de la
parte lineal de una curva tpica de dosis-respuesta, justo por debajo de la
meseta. El Suero Estndar dbilmente positivo de la OIE para ELISA debe dar
siempre una reaccin positiva que est situada en la parte lineal de la misma
curva dosis-respuesta, justo por encima del umbral positivo/negativo. El suero
negativo y el control de tampn deben originar reacciones que estn siempre
por debajo del umbral positivo/negativo. Por ltimo, debe establecerse el punto
de corte de la prueba con tcnicas adecuadas de validacin. Principios de
validacin para las pruebas de diagnstico de enfermedades infecciosas).
El I-ELISA que utiliza sLPS u OPS como antgenos es muy sensible para la
deteccin de anticuerpos anti Brucella sp, pero no permite resolver por
completo el problema de diferenciacin respecto a anticuerpos originados por
la vacunacin -El problema con las FPSR podra resolverse en parte llevando a
cabo un I-ELISA utilizando LPS rugoso (rLPS) o antgenos del citosol. La mayor
parte de las FPSR son resultado de la reaccin cruzada con la porcin del
polisacrido OPS de la molcula sLPS; sin embargo, son menos frecuentes las
reacciones cruzadas entre las regiones centrales del PLS. Para el I-ELISA de
deteccin sistemtica, deben utilizarse preparaciones ricas en sLPS u OPS
como antgeno ptimo. Hay varios protocolos para preparar un antgeno
adecuado. En funcin de la disponibilidad y de las necesidades de rendimiento,
se pueden emplear antiglobulinas mono o policlonales o protena A/G
conjugadas con enzimas. Un MAb especfico para la cadena pesada de la IgG1
bovina puede mejorar la especificidad an a costa de perder sensibilidad,
mientras que una protena A o AG conjugada con enzimas puede proporcionar
un reactivo til para las pruebas con diferentes especies de mamferos.
Se ha observado que el ELISA de competicin (C-ELISA) en el que se emplea un
MAb especfico para uno de los eptopos del OPS de Brucella tiene mayor
especificidad pero menor sensibilidad que el I-ELISA. Esto se lleva a cabo
escogiendo un MAb que tenga mayor afinidad que el anticuerpo que presenta
23

reaccin cruzada. No obstante, se ha comprobado que el C-ELISA elimina
algunas, aunque no todas, las reacciones (FPSR) debidas a bacterias con
reaccin cruzada. El C-ELISA es tambin capaz de eliminar la mayora de las
reacciones debidas a los anticuerpos residuales que se producen como
respuesta a la vacunacin con S19. La eleccin del MAb y su singular
especificidad y afinidad influirn de forma clara en el rendimiento diagnstico
de la prueba. Como en cualquier prueba basada en el MAb, para determinar su
aceptacin internacional y su utilizacin generalizadas tambin se debe tener
en cuenta la disponibilidad general del MAb o del hibridoma.
Se han descrito algunas variaciones de C-ELISA, como antgenos preparados a
partir de otras cepas lisas de Brucella sp. El C-ELISA tambin est disponible
comercialmente. Algunos protocolos son menos sensibles que otros, y por tanto
los resultados obtenidos mediante pruebas distintas no siempre son
comparables. Con vistas a una unificacin internacional, los laboratorios
nacionales de referencia deben utilizar los tres Sueros Estndar de la OIE para
el ELISA a fin de comprobar o calibrar el mtodo analtico en cuestin. La
prueba debe calibrarse de tal modo que la densidad ptica del Suero Estndar
de la OIE fuertemente positivo represente un punto en la parte lineal de una
curva tpica de dosis-respuesta justo por encima de la meseta (es decir,
prximo a la mxima inhibicin). El Suero Estndar de la OIE dbilmente
positivo para ELISA debe dar una reaccin que caiga en la parte lineal de la
misma curva de dosis-respuesta justo por encima del umbral positivo/negativo
(es decir, inhibicin moderada). El suero negativo y el control de tampn/MAb
deben dar reacciones siempre menores que el umbral positivo/negativo (es
decir, inhibicin mnima). Adems, el punto de corte debe establecerse en la
poblacin problema con tcnicas de validacin adecuadas
Prueba de polarizacin de la fluorescencia (La FPA es una tcnica sencilla para
determinar la interaccin antgeno/anticuerpo y puede realizarse en
instalaciones de laboratorio o en el campo. Es una prueba homognea que no
requiere la separacin de los compuestos analizados y que, por tanto, es muy
rpida. El mecanismo de la prueba se basa en la rotacin aleatoria de las
molculas en solucin. El tamao molecular es el factor que ms influye en la
velocidad de rotacin, con una relacin de proporcionalidad inversa. As, una
molcula pequea gira ms deprisa que una grande. Si una molcula se marca
con un fluorocromo, se puede determinar el tiempo de rotacin por un ngulo
de 68,5 C midiendo la intensidad de la luz polarizada en planos verticales y
horizontales. Una molcula grande emite ms luz en un nico plano (ms
polarizada) que una pequea que gira ms deprisa y emite luz ms
despolarizada. En la mayora de las FPA, se marca con un fluorocromo un
antgeno de pequeo peso molecular, inferior a 50 kD, y se aade al suero u
otro lquido problema en el que tenga que detectarse la presencia de
anticuerpos. Si hay anticuerpos, la unin con el antgeno marcado provocar un
descenso en su velocidad rotacional que puede medirse. Para el diagnstico de
la brucelosis, se emplea como antgeno un fragmento de bajo peso molecular
(de 22 kD de media) del OPS del sLPS de la cepa 1119-3 de B. abortus y se
marca con isotiocianato de fluorescena (FITC). Este antgeno se aade a suero
diluido o a sangre completa y 2 minutos (en el caso del suero) o 15 segundos
(en el caso de la sangre) despus de aadir el antgeno se obtiene una medida
24

del contenido de anticuerpos mediante un analizador de la polarizacin de la
fluorescencia.
7.5
ELISA Competitivo
El ELISA competitivo (C-ELISA) que emplea un MAb especfico para uno de los
eptopos de la Brucella sp. OPS parece tener mayor especificidad que el I-ELISA
(33, 45, 58). Se realiza seleccionando un MAb con mayor afinidad que el
anticuerpo con reaccin cruzada. No obstante, se ha comprobado que el CELISA elimina algunas, pero no todas, las reacciones (FPSR) debidas a bacterias
con reaccin cruzada. El C-ELISA es tambin capaz de eliminar la mayora de
las reacciones debidas a anticuerpo residual que se producen en respuesta a la
vacunacin con S19. La eleccin del MAb y su singular especificidad y afinidad
influencian las propiedades diagnsticas de la prueba. Como en cualquier
prueba basada en MAb, se debe considerar la disponibilidad general del MAb o
del hibridoma para su aceptacin internacional y su utilizacin generalizada.
Se han descrito algunas variaciones de C-ELISA. Para una homogenizacin
Sueros Estndar de la OIE para ELISA para comprobar o calibrar el mtodo
concreto.
La prueba debe calibrarse de tal modo que la densidad ptica del Suero
Estndar de la OIE fuertemente positivo represente un punto en la zona lineal
de una curva tpica de dosis-respuesta justo por encima de la meseta (es decir,
prximo a la mxima inhibicin). El Suero Estndar de la OIE dbilmente
positivo debe dar una reaccin que caiga en la porcin lineal de la misma curva
de dosis-respuesta justo por encima del umbral positivo/negativo (es decir,
inhibicin moderada). El suero negativo y el control de tampn/MAb deben dar
reacciones siempre menores que el umbral positivo/negativo (es decir,
inhibicin mnima).
El mtodo que se describe a continuacin es un ejemplo de prueba que se ha
validado internacionalmente y utilizado con amplitud a nivel mundial en
proyectos de cooperacin tcnica y colaboracin cientfica con financiacin
internacional. Los sistemas de tampn son los mismos que los descritos para la
prueba I-ELISA.
7.6
Prueba de polarizacin de fluorescencia
La FPA es una tcnica sencilla para determinar la interaccin

antgeno/anticuerpo y puede realizarse en instalaciones de laboratorio o en el
campo. Es una prueba homognea que no requiere la separacin de los
compuestos analizados y que por tanto es muy rpida. En la fecha de
publicacin, la FPA se ha propuesto como una prueba obligada para el comercio
internacional.
El mecanismo de la prueba se basa en la rotacin aleatoria de las molculas en
solucin. El tamao molecular es el principal factor que influencia la velocidad
de rotacin, con una relacin de proporcionalidad inversa. As, una molcula
pequea gira ms deprisa que una grande. Si una molcula se marca con un
fluorocromo, se puede determinar el tiempo de rotacin a travs de un ngulo
25

de 68,5C midiendo la intensidad de la luz polarizada en planos verticales y
horizontales. Una molcula grande emite ms luz en un nico plano (ms
polarizada) que una pequea que gira ms deprisa y emite luz ms
despolarizada.
En la mayora de las FPAs, se marca con un fluorocromo un antgeno de
pequeo peso molecular, inferior a 50 kD, y se aade suero u otro lquido
problema para detectar la presencia de anticuerpo. Si estn presentes
anticuerpos, la unin con el antgeno marcado provoca un descenso en su
velocidad rotacional que puede medirse.
Para el diagnstico de la brucelosis, se emplea como antgeno un fragmento de
bajo peso molecular (media de 22 kD) del OPS del sLPS de B. abortus y se
marca con isotiocianato de fluorescena. Este antgeno se aade a suero diluido
o a sangre completa y en 2 minutos (para suero) o 15 segundos (para sangre)
se obtiene una medida del contenido de anticuerpos mediante un analizador
de polarizacin de fluorescencia.
La FPA se puede realizar en tubos de vidrio o en formato de placa de 96
pocillos. El suero bovino se diluye 1/100 o, si se emplea sangre tratada con
EDTA, a 1/50 (la sangre tratada con heparina aumenta la variabilidad de la
prueba). El diluyente utilizado es Tris 0,01 M (1,21 g) que contiene cloruro
sdico 0,15 M (8,5 g), 0,05% de Igepal CA630 (500 l) (antes denominado
NP40) y 10 mM de EDTA (3,73 g) por litro de agua destilada, pH 7,2 (tampn
Tris). Despus de mezclar, se obtiene una lectura inicial para determinar la
dispersin de la luz con un analizador de polarizacin de fluorescencia (FPM).
Se aade un antgeno titulado marcado adecuadamente (que por lo general
origine una intensidad de 250.000-300.000), se mezcla y se obtiene con el FPM
una segunda lectura a los 2 minutos para suero y a los 15 segundos para
sangre. Una lectura superior al nivel umbral establecido (en miliunidades de
polarizacin, mP) indica una reaccin positiva. Un nivel umbral tpico es 90-100
mP, aunque la prueba debe calibrarse localmente con un Suero Estndar de
Referencia Internacional. Deben incluirse controles de suero fuertemente
positivo, dbilmente positivo, y negativo, as como suero de animal vacunado
con S19.
8. Pruebas en Leche
Un medio eficaz de analizar vacas lecheras es probar la leche de los tanques
de recogida. De estas fuentes se puede obtener leche de forma ms barata y
frecuente que las muestras de sangre, y habitualmente estn disponibles en
las centrales lecheras. Cuando se obtiene un resultado positivo, todas las vacas
que aportan leche deben probarse individualmente a partir de muestras de
sangre. La prueba I-ELISA en leche es sensible y especfica, y resulta
particularmente til para probar grandes poblaciones de animales. La prueba
del anillo de leche (MRT) es una alternativa adecuada cuando no se dispone de
ELISA.
26
8.1
ELISA Indirecto
Como con el I-ELISA para suero, se utilizan numerosas variaciones del I-ELISA
para leche. Se han comercializado varios I-ELISAs que se han validado en
ensayos de campo y son de uso amplio. A efectos de una armonizacin
Sueros Estndar de la OIE para ELISA con el fin de comprobar o calibrar el
mtodo particular de la prueba en cuestin. El I-ELISA debe estandarizarse de
modo que el estndar fuertemente positivo de la OIE para ELISA diluido a 1/125
en suero negativo y diluido despus a 1/10 en leche negativa se comporte
repetidamente como positivo. Las muestras de leche completa se prueban
generalmente a diluciones mucho ms bajas que el suero, es decir, de 1/2 a
1/10 en tampn de dilucin, y el resto de la prueba es similar a lo descrito para
suero. La prueba C-ELISA no debe utilizarse con leche completa pero puede
usarse con muestras de suero.
8.2
Prueba del anillo de leche
En animales lactantes, la prueba MRT puede emplearse para analizar brucelosis

en rebaos. En poblaciones grandes (>100 terneros lactantes) la sensibilidad
de la prueba tiene menos fiabilidad. Pueden presentarse reacciones positivas
falsas en animales vacunados 4 meses antes de la prueba, en muestras de
leche anormal (como el calostro) o en casos de mastitis. Por tanto, no se
recomienda la utilizacin de esta prueba en granjas muy pequeas, donde
estos problemas presentan un mayor impacto en los resultados de la prueba.
El antgeno para MRT se prepara de suspensiones concentradas de bacterias
muertas de B. abortus S99 o S1119-3, cultivadas como se ha descrito con
anterioridad. Se centrifugan a 23.000 g durante 10 minutos a 4C y se
resuspenden en solucin de colorante hematoxilina. Se emplean varios
mtodos satisfactorios; un ejemplo es el siguiente: se aaden 100 ml de
hematoxilina al 4% (p/v) (Cl No. 75290), disuelta en 95% de etanol, a una
solucin de sulfato amnico alumnico (5 g) en 100 ml de agua destilada y 48
ml de glicerol. A la solucin se aaden 2 ml de iodato sdico al 10% (p/v) recin
preparado. Despus de 30 minutos a temperatura ambiente, la solucin de
color prpura oscuro se aade a 940 ml de sulfato amnico alumnico al 10%
(p/v) en agua destilada. El pH de la mezcla se ajusta a 3,1 y la solucin se deja
envejecer mantenindola a temperatura ambiente durante 45-90 das en la
oscuridad.
Antes de uso, la solucin de colorante se agita y se filtra por lana de algodn.
Las clulas empaquetadas se suspenden en la solucin de colorante a razn de
1 g por 30 ml de colorante y se mantienen a temperatura ambiente durante 48
horas (en vez de esto, algunos laboratorios prefieren calentar 80C durante 10
minutos). Las clulas teidas se depositan por centrifugacin y se lavan tres
veces con una solucin de cloruro sdico (6,4 g), cido lctico al 85% (1,5 ml) e
hidrxido sdico al 10% (4,4 ml) en 1,6 litros de agua destilada, a pH final de
3,0. Las clulas lavadas se resuspenden a razn de 1 g en 27 ml de un
diluyente que consiste en solucin salina con fenol al 0,5%, ajustada a pH 4,0
por adicin de cido ctrico 0,1 M (aproximadamente 2, 5 ml) y fosfato bisdico
0,5 M (aproximadamente 1 ml), y se mantiene a 4C durante 24 horas. La
27

mezcla se filtra por lana de algodn, se comprueba el pH, y se determina el
PCV ajustndolo aproximadamente al 4%.
La sensibilidad del lote nuevo debe compararse con la de un lote previamente
estandarizado utilizando un juego de muestras de varios grados de reaccin
preparado diluyendo un suero positivo en leche. El antgeno debe
estandarizarse frente al OIEISS de modo que una dilucin 1/500 sea positiva y
una dilucin 1/1.000 sea negativa. El antgeno se guarda a 4C sin congelar.
El pH del antgeno debe estar entre 3,3 y 3,7 y su color debe ser azul oscuro.
Se permite la existencia de un poco de colorante libre en el sobrenadante de
una muestra centrifugada. Cuando se diluye en leche de un animal sin
brucelosis, el antgeno debe producir una coloracin uniforme de la capa de
leche sin formar depsitos ni coloracin en la capa cremosa.
La prueba se lleva a cabo sobre muestras del tanque de leche entera. Si es
necesario, las muestras se pueden pretratar con un conservante (formalina al
0,1% o bronopol al 0,02%) durante 2-3 das a 4C antes de uso. La prueba se
lleva a cabo aadiendo 30-50 l de antgeno a 1-2 ml de leche completa (el
volumen de leche puede aumentarse para muestras de poblaciones grandes).
La altura de la columna de leche en el tubo debe ser como mnimo de 25 mm.
Las muestras de leche no deben haber sido congeladas, calentadas, sometidas
a agitacin violenta o guardadas por ms de 72 horas. Normalmente, las
mezclas de leche/antgeno se incuban a 37C durante 1 hora junto con
estndares de trabajo positivos y negativos. Sin embargo, la incubacin
durante la noche a 4C aumenta la sensibilidad de la prueba y permite una
interpretacin ms fcil. Una reaccin fuertemente positiva se indica por la
formacin de un anillo azul oscuro por encima de la columna blanca de leche.
Cualquier anillo azul en la interfase de leche y de crema debe considerarse
positivo y podra ser significativo, especialmente en el caso de grandes
poblaciones. La prueba es negativa si el color de la leche supera al de la capa
cremosa.
9. Brucella abortus en Honduras

9.1 Situacin del pas
En Honduras, la Brucelosis es un problema de salud pblica como animal
siendo el biovar Brucella abortus el ms importante que afecta el bovino
produciendo altas tasas de aborto en hembras e infertilidad en machos, siendo
transmisibles a humanos ocupacionalmente expuestos. Segn reportes de
trabajos realizados por el Servicio Nacional de Sanidad Agropecuaria el
porcentaje de positividad de Brucelosis Bovina es de 3%, para bfalos 20%,
equinos 0.7% en un estudio realizado en la localidad de Francia, municipio de
Limn, departamento de Colon durante los meses de Marzo y abril del 2004.
En humanos se notifican casos espordicamente de Brucelosis a travs de los
aos desconocindose la magnitud real del problema principalmente en zonas
28

endmicas a Brucelosis animal, por lo que se requiere realizar estudios para
conocer la situacin epidemiolgica de la Brucelosis de manera que permita
establecer medidas de prevencin y control oportunas y adecuadas en la
poblacin.
Para el diagnstico de la brucelosis bovina utilizamos diferentes mtodos de
diagnstico, que varan en sensibilidad y especificidad como son: Rosa de
Bengala (RB) y Rivanol (Riv) en suero; como pruebas especfica y confirmativa
respectivamente y en leche el ms utilizado es el Ring Test (RT) o prueba de
anillo en leche (PAL).
El departamento de Francisco Morazn cuenta con un sistema de vigilancia y
control de Brucelosis Bovina, estudios lograron determinar el porcentaje de
prevalencia de Brucelosis en ganado Bovino siendo este de 0.08% evidenciado
de esta forma que el sistema de vigilancia y control de esta enfermedad si
funciona adecuadamente para el departamento de Francisco Morazn.
Actualmente el laboratorio del Instituto Hondureo de Investigacin Mdico
Veterinario en la seccin de Serologa utiliza Rosa de Bengala como prueba de
tamizaje siendo esta prueba serolgica de fcil implementacin, barata y
brinda resultados rpidos. Sumado a esta prueba tambin se utiliza la prueba
de Rivanol como confirmatoria ya que esta cuenta con una mayor sensibilidad
que la anterior.
Durante el ao 2000, en los departamentos de Atlntida y Colon, el Programa
de Brucelosis detect una alta incidencia de brotes con una prevalencia de
5.37%, por lo que SENASA (Servicio Nacional de Sanidad Agropecuaria)
fortaleci las actividades del programa en estos departamentos, obligando a
los productores al sacrificio de animales reactores. En base a lo anterior, los
ganaderos movilizaron el ganado a otros departamentos del pas,
producindose dos efectos:
Migracin ganadera y difusin de los focos a otras regiones.
Reduccin de la prevalencia en Atlntida y Colon a 2.05%.
En el 2006, la prevalencia de esta enfermedad era de 1.64% .En el 2009, la

regin de Atlntida de Honduras y el departamento de Olancho en la regin
centro-oriental, presentaban altos ndices de Brucelosis, alcanzando algunas
regiones hasta un 8%.
9.2 Pruebas Diagnsticas Realizadas en Honduras

*PAL. Prueba de Anillo en Leche, (Feishauer, 1920). Aunque se puede
emplear en distintas especies de animales es de particular utilidad para
29

detectar rebaos bovinos infectados por ser una prueba presuntiva, se ha
diseado para descubrir la presencia de aglutininas en la leche. Este antgeno
tiene una concentracin celular de 4% y un pH de 4.0, coloreado con
hematoxilina o en su defecto pueden usarse sales de Tetrazolio, el antgeno
posee una gran sensibilidad por su baja concentracin celular y no tiene
capacidad amortiguadora. El complejo antgeno/anticuerpo se adhiere a la
superficie de los glbulos de la grasa y ascienden con ellos a la superficie
formando una reaccin. Si la muestra no tiene aglutininas no se colorea,
formando un anillo de color blanco. Si por el contrario la muestra presenta un
anillo azul, se considera positiva. La prueba permite un control ms rpido, su
costo es considerablemente menor, y su exactitud radica en mezclas de leches
de varios rebaos (creles, tanques, cisternas, porongos y en ciertos casos
animales individuales), la exactitud de la prueba radica en la mezcla de varias
vacas cuando menos de 20- 25 animales. El porcentaje de grasa de la muestra
de leche influye sobre los resultados de la prueba de anillo en leche, porque la
formacin del anillo de crema depender del porcentaje de grasa de la leche.
* Prueba de Screening en suero con antgeno tamponado en placa, Es
una prueba tamiz de aglutinacin en placa. Se fundamenta en la inhibicin de
aglutininas inespecficas a bajo pH. Detecta anticuerpos IgG y algunos IgM
especficos. Prueba cualitativa. Interpretacin de la prueba: la formacin de
grumos indica que la prueba es positiva. Si esta prueba resulta positiva, luego
se le hacen pruebas complementarias debido al proceso inmunolgico ya que
IgG especifica la enfermedad sobretodo en la fase aguda.
*Prueba de Rosa de Bengala. La prueba de Rosa de Bengala se utiliza en el
diagnstico de la brucelosis como prueba de criba por su rapidez, sencillez y
sensibilidad, aunque los resultados positivos deben ser confirmados con otras
pruebas
serolgicas
(BRUCELLACAPT
y
ELISA).
Se trata de un mtodo en tarjeta que detecta anticuerpos aglutinantes
empleando clulas de Brucella sp inactivadas, teidas con Rosa de Bengala y
resuspendidas en un tampn cido. El pH cido de la suspensin impide la
aglutinacin inespecfica de las bacterias, contribuyendo as a la especificidad
de la prueba. En la reaccin intervienen anticuerpos aglutinantes de las clases
IgG, IgM e IgA.
*Prueba de Antgeno Buferado (BPA).Antgeno para diagnstico presuntivo

de brucelosis bovina y porcina dentro del Plan Nacional de Control y
Erradicacin de Brucelosis. Se utiliza como prueba tamiz, segn el mtodo de
aglutinacin rpida en placa. Los animales reaccionantes deben someterse a
pruebas de diagnstico complementarias: Seroaglutinacin en tubo (SAT) o
Wright y SAT 2 Mercaptoetanol.
30
Composicion: Antgeno de Brucella abortus cepa 1119-3 inactivado, en

concentracin celular final del 11% y pH 3.8. La lectura de la prueba se realiza
a los 8 minutos.
*Prueba de rivanol. Esta prueba fue descrita por Anderson (1964) y consta
de dos fases: la primera consiste en la precipitacin de las protenas, con
excepcin de las IgG, utilizando una solucin de Rivanol, por lo tanto el Rivanol
sirve para separar las IgG de las IgM detectando as el mismo tipo de
anticuerpo que el 2-ME y la segunda estriba en una aglutinacin rpida
empleando antgeno de aglutinacin en placas, especial para esta prueba,
ajustando el pH de 3.8 - 6.2 y con una concentracin celular del 4%. Esta
menor concentracin celular determina una mayor sensibilidad que compensa
la dilucin al 50% del suero, ocasionada por la previa adicin del Rivanol. Lo
ms importante es que precipita IgM e IgG queda libre y se mide por ttulos.
*Ensayo Inmunoenzimatico, (ELISA). Est basada en que anticuerpos o
antgenos son ligados a una enzima, dicho conjugado (enzima- anticuerpo o
enzima-antgeno) retiene la actividad inmunolgica y enzimtica. En ELISA el
Ag o Ac se absorben en un soporte solido que permite la separacin de los
reactivos acoplados y no acoplados. Entonces el antgeno se fija a la placa y
leemos por espectrofotometra.
Conclusiones
31

La brucelosis es una enfermedad difcil de erradicar, sin embargo,
aplicando la tecnologa disponible para prevenir y diagnosticar la
enfermedad y el sentido comn para segregar y eliminar los animales
positivos se puede llegar a realizar. Sin duda alguna, esta accin
demanda un enorme esfuerzo pero el cumplimiento de este objetivo
traer a nuestro pas un gran beneficio econmico y social.
Segn informes de la OPS/ OMS una de las mejores metodologa para el
diagnstico de brucelosis es la ELISA indirecta en leche bovina y es
exitosamente establecida y evaluada para ser utilizada como una
herramienta diagnstica de la brucelosis bovina.
La sensibilidad y especificidad de los nuevos mtodos de diagnstico
para brucelosis segn estudios son comparables y confiables y
objetividad de resultados, permite recomendarla como reemplazo de la
prueba rpida de anillo en leche.
El diagnstico definitivo de brucelosis se puede
complementar
mediante la utilizacin de otras metodologas (ADN, PCR); una vez
estandarizada y validada, esta ltima compensar las limitaciones
asociadas al proceso de aislamiento del microorganismo.
La brucelosis es un problema complejo y por su naturaleza es necesario
continuar realizando estudios que permitan conocer el comportamiento
dentro de los hatos ganaderos as como el comportamiento de las
vacunas que actualmente se estn utilizando. Por otro lado tambin es
importante seguir investigando las nuevas tcnicas diagnsticas que
sean capaces de detectar con gran confiabilidad cualquier tipo de
reaccin ya que existen una serie de factores que influyen en el control
de la brucelosis.
32
Referencias
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Amrica del Sur.
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33
Organizacin Mundial de Sanidad Animal. Manual de las Pruebas de

Diagnstico y de las Vacunas para los Animales Terrestres. Quinta Edicin,
2004 (Primera edicin en espaol)
Anexos
Fig. 1: Algoritmo Diagnstico: Aislamiento y Tipificacin. Instituto de
Diagnstico y Referencia Epidemiolgico de Mxico.
34
Fig. 2: Algoritmo Diagnstico: Cultivo y tipificacin de cepas usado en el

Instituto de Diagnstico y Referencia Epidemiolgico de Mxico.
35
Fig. 3: Algoritmo Diagnstico: Perfil serolgico usado en el Instituto de

36

Fig. 4:
Cuadro
Diferencial de Caractersticas
usado en el Centro Regional de
Referencia del WHO Global Salm
Surv para Amrica del Sur.
Fig. 5: Flujograma diferencial

usado en el Centro Regional de
Referencia del WHO Global Salm
Surv para Amrica del Sur.
37
Fig. 6: Procedimiento ilustrado Aglutinacin en tubo con 2-ME utilizado en el

Centro Regional de Referencia del WHO Global Salm Surv para Amrica del
Sur.
Fig.
7:
Pruebas
realizadas
Aglutinacin estndar con 2-ME del Instituto de Diagnstico y Referencia

Epidemiolgico de Mxico.
38

Fig. 8: Prueba realizada Rosa de Bengala del Instituto de Diagnstico y
Referencia Epidemiolgico de Mxico.
Fig. 9: Cuadro Interpretacin Rosa de Bengala utilizado en el Instituto de

Visita al Instituto Hondureo de Investigacin Mdico Veterinario

39
Fig. 10 & 11: Caja iluminada para mejor observacin de la aglutinacin del
Instituto Hondureo de Investigacin Mdico Veterinario
40
Fig. 11 & 12: Placas para aglutinacin del Instituto Hondureo de

Investigacin Mdico Veterinario
41

DX Brucella Abortus Ganad Bovino en Honduras

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