OBSERVACION DE MICROORGANISMOS

OBJETIVO:
Identificar microorganismos utilizando diferentes tinciones.
Poner en prctica los conocimientos obtenidos acerca de la morfologa de los
microorganismos, as como de las diferentes tinciones que hay.
INTRODUCCIN:
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de
ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la
clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es
la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos
diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes
celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de
actividad respiratoria, etc.
Es por eso que en la siguiente practica se utilizaran diferentes colorantes en
diferentes tincin, por ejemplo a tincin de Gram, que no es ms que una
diferenciacin morfolgica entre las bacterias, esta tincin las clasifica en Gram (+)
o Gram (-), segn la composicin de su pared celular.
Con esto se espera practicar los conocimientos tericos ya adquiridos en clases
anteriores, para as poder identificar los microorganismos, tales como: cocos,
estafilococos, estreptococos, hongos, etc.
MARCO TERICO:
Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de
teirlas, proceso llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms
corriente, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como
formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin, si se aade el colorante,
no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. La fijacin se
realiza habitualmente en clulas que han sido fijadas sobre un portaobjetos,
tratando despus ste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el
proceso de tincin. La fijacin produce habitualmente el encogimiento de las
clulas; la tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo
que son realmente, de manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas
o teidas no pueden realizarse con mucha precisin.

La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna

afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con
frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con
intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como
los cidos nucleicos y los polisacridos cidos.
Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada
con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia
se denomina mordiente; un mordiente habitual es el cido tnico. Si se desea
simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopa, son
suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen
colorante simple que acta sobre todas las clulas bacterianas rpidamente y que
no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares.
Examen de muestras al microscopio: la tincin GRAM
Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la
desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las
bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este
caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrico,
sino simplemente designan dos grupos morfolgicos distintos de bacterias).
Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tien de forma distinta debido a
las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de
la clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como para
prevenir la lisis osmtica. El material de la pared celular bacteriana que confiere
rigidez es el peptidoglicano. La pared de la clula Gram-positiva es gruesa y
consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano as como algo de
cido ticnico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula Gram-positiva es
peptidoglicano. La pared de la clula Gram-negativa, por otro lado, contiene una
capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una
membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas.
Slo 10% - 20% de la pared de la clula Gram-negativa es peptidoglicano.
Bacteria Gram Positiva

Bacteria Gram Negativa

Tiene una capa gruesa de peptidoglicano

(mureina) y dos clases de cidos
teicoicos. cido Lipoteicoico que est en
la superficie, empotrado en la capa de
peptidoglicano y unido a la membrana
citoplsmica. Y cido teicoico de la pared
que est en la superficie y se une slo a
la capa de peptidoglicano. El cido
Teicoico
es
el
responsable
del
determinante antignico del organismo.

Tiene
una
capa
delgada
de
peptidoglicano (mureina) unida a una
membrana exterior por lipoprotenas. La
membrana exterior est hecha de
protena, fosfolpidos y lipopolisacridos.
En el lipopolisacridos, la porcin de
lpido est embebida en el fosfolpidos y
el antgeno O polisacrido est en la
superficie. El lpido se llama Lpido A y
es txico, pero el lipopolisacridos
entero se llama Endotoxina. La pared de
la clula tiene poros llamado Purines
para el transporte de substancias de
peso molecular bajo. Entre la membrana
citoplsmica y la pared celular hay un
espacio periplsmico con enzimas
hidrolticas, enzimas inactivadoras de
antibiticos y protenas de transporte.

PROCEDIMIENTO:
PREPARACION DE FROTIS
1. Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del
material que se va a teir (si es lquido) o se hace rodar el hisopo con que
se tom la muestra.
2. Puede usarse una aguja estril para transferir una pequea cantidad de un
cultivo bacteriano a la superficie del portaobjetos.

3. Este material es suspendido en una gota de agua o solucin salina

previamente colocada sobre el portaobjetos.

4. El material se frota directamente sobre el portaobjetos, donde puede

visualizarse con facilidad.

5. El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire o bien se pasa

varias veces por la zona azul de la llama de un mechero de Bunsen hasta
que el vidrio est tan caliente que moleste al tacto pero no queme.

PREPARACION DE LA TINCION
1. El Frotis fijado con calor se tie 1 min con Violeta Cristal.
2. Se cubre con solucin Yodada durante 1 min y se lava de nuevo con agua.

3. Decolorar con mezcla alcohol etlico/acetona.

4. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 20 seg.

5. Lavar y secar.

OBSERVACIONES:

TINCION DE GRAM:
REALIZANDO UN FROTIS

YO

TINCION CON AZUL DE METILO

TINCION EN SECO

TORTILLA DESCOMPUEST: ME ES MUY DIFICIL IDENTIFICAR EL TIPO DE

MICROORGANISMO QUE ES, PERO POR EL COMPUESTO ORGANICO EN
DESCOMPOSISION QUE SE UTILIZO SE PODRIA DECIR QUE SON HONGOS,
AL IGUAL TIENEN FORMA DE ESTAFILOCOCOS.
AGUA RESIDUAL:

TINCION CON AZUL DE METILO

TINCION EN SECO

TINCION DE GRAM
En la observacin que se le hiso al agua residual se puede apreciar cocos en la
tincin de Gram. en las otras tinciones difcilmente puedo apreciar algo.

CONCLUCION:
Me es muy difcil identificar la morfologa de las bacterias, la practica me ayudo
a tener un poco ms en claro el tipo de morfologa, pero aun as necesito
realizar y observar un poco mas de microorganismo para as poder
identificarlos.

BIBLIOGRAFIA:

http://www.danival.org/notasmicro/tincion/_madre_tincion.html