Las muestras de hisopos traqueales se conservaron en tubos eppendorf a -20 C hasta su

procesamiento en el laboratorio. No se uso ningn tipo de medio de transporte o preservante en

las muestras.
EXTRACCIN DE ADN
Extraccin de ADN bacteriano por choque trmico.

Se realiz la extraccin de ADN a partir de los hisopos, mediante un procedimiento :

Se retir una alcuota de 1 ml de muestra,
se centrifug a 10000 rpm durante 20 minutos.
Se lav el pellet tres veces con 1 ml de PBS, se centrifug 10 minutos a 14000 rpm.
Tras el ltimo lavado se re suspendi el pellet en 25 l de PBS,
se someti a un choque trmico : 10 minutos a 100 C y 10 minutos en hielo.

Enfriamiento de -20 C por diez min.

Finalizando con una centrifugacin a 14000 rpm por diez min y transferencia de los
sobrenadantes a un tubo libre de nucleasas, conservndose a -20 C hasta su uso.
Para verificar la calidad del ADN extrado se utiliz como Housekeeping celular, (Tabla 1), una
porcin del gen 28S de Gallus gallus (Suzuki et al., 2009), normalizado con las siguientes
condiciones: 2 l de buffer para PCR 10 X (Invitrogen Buffer PCR 10 X), 0,8 l de MgCl 50
mM (Invitrogen MgCl 50 mM), 0,4 l de nucletidos a 10 mM (dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Invitrogen), 0,4 l de primer F (50 M Invitrogen) y 0,4 l de primer R (50 M
Invitrogen), Taq Platino 0.125 l de 5 U (Invitrogen Taq Platino 5 u/l), 13,88 l de agua y 2
l de ADN.
Extraccin de ADN bacteriano por el kit comercial Mini Qiamp ADN de la firma
Qiagen. A partir del pool de 30 muestras se toma una alcuota de 600 l, a partir de la cual
se ha extrado ADN bacteriano utilizando el kit Mini Qiamp ADN de la firma Qiagen siguiendo
las recomendaciones del fabricante (Handobook Quiagen).
Extraccin de ADN bacteriano por el mtodo clsico utilizando un buffer de lisis.
Del pool de 30 muestras se tom un alcuota de 1,5 ml. Se sigui el protocolo de extraccin
de ADN bacteriano descrito por Zacco 8, al cual se realiz modificaciones en la cantidad de los
reactivos a usar, adaptndolas al volumen de muestra.
En el protocolo original el volumen de muestra era de 50 ml; entonces los reactivos
estuvieron en funcin a este volumen, por ejemplo para el primer reactivo que es el buffer
de lisis, se utiliz 10 ml. En el protocolo modificado, el volumen de muestra fue de 1.5 ml y
la cantidad de buffer de lisis a usar es de 800 l.
Amplificacin y deteccin del ADN bacteriano con el sistema TAQMAN. Para la
deteccin simultnea de estos dos patgenos se utiliz el kit Multiplex Aviar Micoplasma de
la firma LSI TaqVet siguiendo el protocolo de amplificacin descrito por el fabricante (LSI
TaqVet).
Seleccin de iniciadores que van a ser usados en la elaboracin del kit de
diagnstico molecular de PROINPA. Para la seleccin de iniciadores se realiz una
revisin bibliogrfica de trabajos de investigacin. La secuencia de los cebadores utilizados
en este trabajo se encuentra en la Tabla 1.

Tabla 1. Secuencia de cebadores para

Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma
synoviae5

Amplificacin por PCR en tiempo real usando el sistema Syber Green con el kit de
diagnstico molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae
elaborado por el laboratorio de Biologa Molecular PROINPA. La amplificacin por PCR
en tiempo real usando el fluorocromo SYBR Green se realiz con 5 l de ADN molde y un
volumen final de reaccin de 15 l. Los diferentes reactivos se prepararon en dos soluciones
diferentes, que fueron preparadas para la deteccin simultnea de Mycoplasma gallisepticum
y Mycoplasma synoviae.
Para el anlisis de las curvas de disociacin, se aadi un ciclo en el que tiene lugar un
incremento paulatino de temperatura desde 55 a 90 C, durante 35 min.

RESULTADOS
Sistemas de extraccin 1: Extraccin de ADN bacteriano mediante el kit Mini Qiamp
ADN de la firma Qiagen y amplificacin - deteccin por el kit Multiplex Aviar
Mycoplasma de la firma LSI TaqVet. En la Fotografa 1 se muestra la curva de
amplificacin Mycoplasma gallisepticum (Mg) y Mycoplasma synoviae (Ms) de la granja 1 y
en la Fotografa 2, se muestra la curva de amplificacin de la granja 2.

Fotografa 1. Resultados de la amplificacin

y deteccin de Mg y Ms utilizando un kit de

extraccin Qiagen y kit de deteccin LSI

TAQVET de granja 1

Fotografa 2. Resultados de la amplificacin

y deteccin de Mg y Ms utilizando un kit de
extraccin Qiagen y kit de deteccin LSI
TAQVET de granja 2
Tambin se observ la amplificacin de una curva que corresponde al control positivo interno
(IPC), con este control se verific que la extraccin fue eficaz.
Se observ tambin una lnea recta horizontal donde se encuentra el punto de interseccin
de una curva de amplificacin con el umbral, denominada Ct (Threshold Cycle). Este punto
indica el ciclo en el que la fluorescencia alcanza el valor umbral.
En la Fotografa 1 se observ que para Mycoplasma gallisepticum se tiene un ct de 30,23 y
para Mycoplasma synoviae un ct de 31,5. En la Fotografa 2 Mycoplasma gallisepticum
presenta un ct 27,22 y Mycoplasma synoviae un ct de 31,10.
Sistemas de extraccin 2: Extraccin de ADN bacteriano por choque trmico y
amplificacin -deteccin por el kit Multiplex Aviar Mycoplasma de la firma LSI
TaqVet. En la Fotografa 3 se observ curvas de amplificacin para Mycoplasma
gallisepticum (Mg) y Mycoplasma synoviae (Ms) de la granja 1 y en la Fotografa 4 se
observ los resultados de la granja 2.

Fotografa 3. Resultados de la amplificacin

y deteccin de Mg y Ms utilizando el mtodo
de extraccin choque trmico y kit de
deteccin LSI TAQVET de granja 1

Fotografa 4. Resultados de la amplificacin

y deteccin de Mg y Ms utilizando el mtodo
de extraccin choque trmico y kit de
deteccin LSI TAQVET de granja 2
La eficacia de este mtodo se puede verificar con la curva amplificada que corresponde al
IPC (control positivo interno) ilustrada en las Fotografas 3 y 4. Se observaron en estas
fotografas que en los pollos de granja 1 y granja 2, estn presentes las bacterias M.

gallisepticum y M. synoviae.
Sistemas de extraccin 3: Extraccin de ADN bacteriano mediante el mtodo
clsico usando un buffer de lisis y amplificacin - deteccin por el kit Multiplex
Aviar Micoplasma de la firma LSI TaqVet. La Fotografa 5 muestra la curva de
amplificacin Mycoplasma gallisepticum (Mg) y Mycoplasma synoviae (Ms) de la granja 1 y la
Fotografa 6 de la granja 2.

Fotografa 5. Resultados de la amplificacin

y deteccin de Mg y Ms utilizando el mtodo
de extraccin clsico con buffer de lisis y kit
de diagnostico LSI TAQVET de granja 1

Fotografa 6. Resultados de la amplificacin

y deteccin de Mg y Ms utilizando el mtodo
de extraccin clsico con buffer de lisis y kit
de diagnstico LSI TAQVET de granja 2.
Este mtodo demostr ser eficaz, lo cual se verific con la amplificacin del IPC que se
observ en las Fotografas 5 y 6. En estas fotografas tambin se observaron la amplificacin
de las curvas que corresponden a las bacterias de M. gallisepticum y M. synoviae.
No se observ diferencia grfica con el mtodo de extraccin del kit comercial.

PROTOCOLO DE AMPLIFICACIN PARA M. gallisepticum

Se usaron primers previamente reportados (Garca et al., 2005), (Tabla 1), que amplifican una
regin polimrfica del gen mgc2., el cual codifica para protenas de superficie que estn
relacionadas con la citoadherencia (Hnatow et al., 1998; Bencina, 2002) y permite la
diferenciacin de algunas cepas de MG directamente y mediante pruebas pos-PCR como la RFLP
(Restriction Fragment Length Polimorphism).
El volumen final de cada reaccin fue de 20 l, y se usaron los siguientes volmenes y
concentraciones: 2 l de buffer para PCR 10 X (Invitrogen Buffer PCR 10 X), 0,52 l de MgCl
50 mM (Invitrogen MgCl 50 mM), 0,4 l de nucletidos a 10 mM (dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Invitrogen), 0,16 l de primer F (50 M Invitrogen) y primer R (50 M Invitrogen), Taq
Polimerasa 0.08 l de 5 U (Invitrogen Taq Polimerasa 5 u/l), 14,68 l de agua y 2 l de ADN.
PROTOCOLO DE AMPLIFICACIN PARA M. synoviae
Se utilizaron primers previamente reportados (Wetzel et al., 2010), ver Tabla 1, que anillan con el
gen vlhA, el cual es altamente polimrfico y codifica para protenas del tipo hemaglutininas
(Bencina, 2002).
El volumen final de cada reaccin fue de 20 l, con los siguientes volmenes y concentraciones:
2 l de buffer para PCR 10 X (Invitrogen Buffer PCR 10 X), 0,8 l de MgCl 50 mM
(Invitrogen MgCl 50 mM), 0,4 l de nucletidos a 10 mM (dATP, dCTP, dGTP, dTTP
Invitrogen), 0,2 l de primer F (50 M Invitrogen) y primer R (50 M Invitrogen), Taq
Polimerasa 0.08 l de 5 U (Invitrogen Taq Polimerasa 5 u/l), 14,32 l de agua y 2 l de ADN.
Como controles positivos de las reacciones se emplearon cepas vacunales: para el caso de MG se
us F-VAX-MG que contiene la cepa F (Intervet-Schering Plough) y para MS la vacuna
MSBac que contiene la cepa WVU-1853 (Fort Dodge Animal Health). Se uso ADN de tejidos
de pollo como control positivo del housekeeping celular. Los amplificados fueron obtenidos en
un termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient, programado as: una denaturacion inicial a
94 C por 3 min, 39 ciclos de 94 C por 30 seg, 53 C por 30 seg, 72 C por 90 seg y una
extensin final de 72 C por 5 min. Para el housekeeping se uso el siguiente programa: una
denaturacion inicial de 94 C por 5 min, 35 ciclos de 94 C por 30 seg, 58 C por 30 seg, 72 C
por 60 seg y una extensin final de 72 C por 10 min.

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versin impresa ISSN 1813-5363
BIOFARBO v.19 n.1 La Paz jun. 2011
ARTICULO ORIGINAL

Desarrollo de un servicio comercial de diagnstico

molecular de enfermedades en pollos de granja (Gallus
gallus)
Development of a commercial molecular diagnosis for disease in
chickens(Gallus gallus)
Marisol Campero M.1, Zulema Bustamante G.1, Silene Veramendi T.2, Jorge Rojas B.2
1

Facultad de Ciencias Bioqumicas y Farmacuticas, Universidad Mayor de San Simn.

Cochabamba, Bolivia.
2
Laboratorio de Biologa Molecular y Bioinformtica PROINPA. Cochabamba, Bolivia.

Direccin para correspondencia: Marisol Campero Montano. Facultad de Ciencias Bioqumicas

y Farmacuticas, Universidad Mayor de San Simn. Cochabamba, Bolivia. Telfonos:
79377447, 4408474, 4577455 E mail: yazidsol@hotmail.com
Recibido para publicacin en 27/01/11
Aceptado en 18/06/11
RESUMEN
La produccin de pollos de granja es una de las actividades ms difundidas en el
departamento
de
Cochabamba-Bolivia,
donde
los
productores
se
encuentran
permanentemente frente a grandes desafos cmo la aparicin de nuevas enfermedades
como la micoplasmosis causada por Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae. La
micoplasmosis causa grandes prdidas econmicas debido a que esta enfermedad se
propaga muy rpido. Hoy en da el diagnstico de estos patgenos se realiza por mtodos
serolgicos, sin embargo, estas tcnicas consumen mucho tiempo y a veces conducen a
identificaciones errneas. Las tcnicas moleculares basadas en PCR en tiempo real son ms
ventajosas que las tcnicas serolgicas, ya que son rpidas, sensibles y especficas. Adems
pueden ser econmicas en el anlisis de diversos patgenos en un nico ensayo (PCR
multiplex). En este estudio se compararon los diferentes mtodos para el diagnstico
molecular de M. gallisepticum y M. synoviae a fin de establecer un servicio comercial. Para
realizar este trabajo, se utilizaron muestras de hisopado traqueal, tomadas de las vas

respiratorias. Se extrajo ADN por tres mtodos (kit de extraccin Mini Qiamp ADN de la
firma Qiagen, mtodo de choque trmico y mtodo convencional con buffer de lisis) y luego
fueron analizados por un kit comercial (lsi TaqVet) y el uso de un kit de diagnstico
molecular desarrollado en este estudio. El mtodo de extraccin con un buffer de lisis, junto
con el kit de diagnstico molecular desarrollado en este estudio gener resultados ptimos
es decir se demostr mejor especificidad, sensibilidad y bajo costo.
Palabras Clave: PCR en tiempo real, Taqman, SyberGreen, diagnstico, Mycoplasma.
ABSTRACT
Poultry breeding is one of the most widespread activity in the department of CochabambaBolivia, where producers are permanently facing major challenges as the emergence of new
diseases like mycoplasmosis caused by Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma
synoviae. Mycoplamosis causes significant economic losses because this disease spreads
very fast. Today the diagnosis of these pathogens is performed by serological methods;
however, these techniques are time consuming and sometimes lead to misidentifications.
Molecular techniques based on real-time PCR are more advantageous than serological
techniques as they are rapid, sensitive and specific. Moreover they can be less expensive
when analyzing various pathogens in a single assay (multiplex PCR). The aim of this study
was to compare the different methods for molecular diagnosis of M. gallisepticum and M.
synoviae to establish a commercial service. To achieve this goal, we used tracheal swab
samples obtained from the airways. DNA was extracted by three methods (kit DNA
extraction Mini signature Qiamp Qiagen, heat shock method and conventional method of
lysis buffer) and then the samples were analyzed by a commercial kit (LSI TaqVet) and by a
molecular diagnostic kit developed in this study. The method of extraction with a lysis buffer
together with the molecular diagnostic kit developed in this study generated the best results
and demonstrated better specificity, sensitivity and low cost for the molecular diagnosis of
avian mycoplasmosis .
Key Words: Real-time PCR, Taqman, SyberGreen, diagnostic, Mycoplasma

INTRODUCCIN
Cochabamba es uno de los departamentos donde la produccin avcola es una de las ms
difundidas e importantes. El productor avcola frecuentemente se enfrenta a la aparicin y
difusin de enfermedades, entre stas Mycoplasmosis aviar. Esta es una enfermedad
respiratoria que provoca prdidas econmicas significativas en las granjas avcolas de
Cochabamba.
La Mycoplasmosis aviar se detecta clsicamente mediante mtodos serolgicos, pero dichos
mtodos no presentan una alta especificidad y sensibilidad. Tambin se requiere que la
enfermedad evolucione para ser detectada, es decir que con las pruebas serolgicas no se
pude detectar Mycoplasmosis aviar en la etapa de incubacin de dicha enfermedad. Otra
desventaja de dichas pruebas es la presencia de falsos negativos o falsos positivos.1,2
El diagnstico molecular es un mtodo de deteccin de enfermedades, que permite
identificar el agente patgeno con criterios genotpicos. El mismo, permite un diagnstico
precoz de las enfermedades, pudiendo realizarse una deteccin pre sintomtica,
proporcionando de esta manera beneficios mltiples para el paciente.3
La PCR en tiempo real tiene varias ventajas sobre el mtodo clsico serolgico. Es una
tcnica ms sensible porque permite procesar muestras biolgicas muy pequeas, con una
especificidad elevada ya que detecta secuencias genticas presentes en el patgeno y es
rpida dado que la amplificacin y la deteccin se producen en el mismo tubo de reaccin,

sin precisarse ninguna manipulacin posterior que pueda contaminar la muestra.4,5,6

El objetivo de esta investigacin es desarrollar un servicio comercial de diagnstico
molecular mediante PCR en tiempo real para Mycoplasmosis aviar adaptando un mtodo de
extraccin convencional y desarrollando un kit de diagnstico molecular propio y reduciendo
de esta manera los costos en pruebas moleculares por la tcnica PCR en tiempo real.

MATERIAL Y MTODOS
Toma de muestra para la extraccin de ADN bacteriano. Las muestras se tomaron de
dos granjas de pollos (1 y 2) ubicadas en el departamento de Cochabamba, provincia
Cercado a 2.558 metros sobre el nivel del mar.
La poblacin fue escogida en funcin al diagnstico presuntivo.
Para la toma de muestras se utilizaron hisopos estriles, dichos hisopos fueron introducidos
en la trquea del pollo hasta ser completamente embebidos de secrecin traqueal y despus
fueron depositados en 1 ml de solucin PBS para la conservacin de la muestra hasta su
posterior proceso.
Antes del proceso de extraccin se realiz un paso previo que es la preparacin de muestras,
en esta etapa se centrifugaron las muestras a 10000 rpm, para asegurar que estn libres
completamente del hisopo y luego se retiran los hisopos, dejando en los tubos slo la
muestra.
Despus se agruparon las muestras de esta manera: se sac un alcuota de 1 ml de cada
tubo para formar el pool de 30 muestras y este pool fue procesado como si fuese una sola
muestra y para la extraccin por los diferentes mtodos se sac un alcuota de 600 l o 1 ml
del pool de 30 muestras, la cantidad depende del mtodo de extraccin a usar.
Extraccin de ADN bacteriano por el kit comercial Mini Qiamp ADN de la firma
Qiagen. A partir del pool de 30 muestras se toma una alcuota de 600 l, a partir de la cual
se ha extrado ADN bacteriano utilizando el kit Mini Qiamp ADN de la firma Qiagen siguiendo
las recomendaciones del fabricante (Handobook Quiagen).
Extraccin de ADN bacteriano por choque trmico. Del pool de 30 muestras se retir
una alcuota de 1 ml de muestra, se centrifug a 10000 rpm durante 20 minutos. Se lav el
pellet tres veces con 1 ml de PBS, se centrifug 10 minutos a 10000 rpm. Tras el ltimo
lavado se re suspendi el pellet en 25 l de PBS, se someti a un choque trmico: 10
minutos a 100 C y 10 minutos en hielo. Por ltimo se centrifug 5 minutos a 10000 rpm,
pasando el sobrenadante a otro tubo. En este se encuentra el ADN preparado listo para su
estudio7
Extraccin de ADN bacteriano por el mtodo clsico utilizando un buffer de lisis.
Del pool de 30 muestras se tom un alcuota de 1,5 ml. Se sigui el protocolo de extraccin
de ADN bacteriano descrito por Zacco 8, al cual se realiz modificaciones en la cantidad de los
reactivos a usar, adaptndolas al volumen de muestra.
En el protocolo original el volumen de muestra era de 50 ml; entonces los reactivos
estuvieron en funcin a este volumen, por ejemplo para el primer reactivo que es el buffer
de lisis, se utiliz 10 ml. En el protocolo modificado, el volumen de muestra fue de 1.5 ml y
la cantidad de buffer de lisis a usar es de 800 l.
Amplificacin y deteccin del ADN bacteriano con el sistema TAQMAN. Para la
deteccin simultnea de estos dos patgenos se utiliz el kit Multiplex Aviar Micoplasma de
la firma LSI TaqVet siguiendo el protocolo de amplificacin descrito por el fabricante (LSI
TaqVet).
Seleccin de iniciadores que van a ser usados en la elaboracin del kit de
diagnstico molecular de PROINPA. Para la seleccin de iniciadores se realiz una

revisin bibliogrfica de trabajos de investigacin. La secuencia de los cebadores utilizados

en este trabajo se encuentra en la Tabla 1.

Tabla 1. Secuencia de cebadores para

Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma
synoviae5

Amplificacin por PCR en tiempo real usando el sistema Syber Green con el kit de
diagnstico molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae
elaborado por el laboratorio de Biologa Molecular PROINPA. La amplificacin por PCR
en tiempo real usando el fluorocromo SYBR Green se realiz con 5 l de ADN molde y un
volumen final de reaccin de 15 l. Los diferentes reactivos se prepararon en dos soluciones
diferentes, que fueron preparadas para la deteccin simultnea de Mycoplasma gallisepticum
y Mycoplasma synoviae.
Para el anlisis de las curvas de disociacin, se aadi un ciclo en el que tiene lugar un
incremento paulatino de temperatura desde 55 a 90 C, durante 35 min.

RESULTADOS
Sistemas de extraccin 1: Extraccin de ADN bacteriano mediante el kit Mini Qiamp
ADN de la firma Qiagen y amplificacin - deteccin por el kit Multiplex Aviar
Mycoplasma de la firma LSI TaqVet. En la Fotografa 1 se muestra la curva de
amplificacin Mycoplasma gallisepticum (Mg) y Mycoplasma synoviae (Ms) de la granja 1 y
en la Fotografa 2, se muestra la curva de amplificacin de la granja 2.

Fotografa 1. Resultados de la amplificacin

y deteccin de Mg y Ms utilizando un kit de
extraccin Qiagen y kit de deteccin LSI
TAQVET de granja 1

Fotografa 2. Resultados de la amplificacin

y deteccin de Mg y Ms utilizando un kit de
extraccin Qiagen y kit de deteccin LSI
TAQVET de granja 2
Tambin se observ la amplificacin de una curva que corresponde al control positivo interno
(IPC), con este control se verific que la extraccin fue eficaz.
Se observ tambin una lnea recta horizontal donde se encuentra el punto de interseccin
de una curva de amplificacin con el umbral, denominada Ct (Threshold Cycle). Este punto
indica el ciclo en el que la fluorescencia alcanza el valor umbral.

En la Fotografa 1 se observ que para Mycoplasma gallisepticum se tiene un ct de 30,23 y

para Mycoplasma synoviae un ct de 31,5. En la Fotografa 2 Mycoplasma gallisepticum
presenta un ct 27,22 y Mycoplasma synoviae un ct de 31,10.
Sistemas de extraccin 2: Extraccin de ADN bacteriano por choque trmico y
amplificacin -deteccin por el kit Multiplex Aviar Mycoplasma de la firma LSI
TaqVet. En la Fotografa 3 se observ curvas de amplificacin para Mycoplasma
gallisepticum (Mg) y Mycoplasma synoviae (Ms) de la granja 1 y en la Fotografa 4 se
observ los resultados de la granja 2.

Fotografa 3. Resultados de la amplificacin

y deteccin de Mg y Ms utilizando el mtodo
de extraccin choque trmico y kit de
deteccin LSI TAQVET de granja 1

Fotografa 4. Resultados de la amplificacin

y deteccin de Mg y Ms utilizando el mtodo
de extraccin choque trmico y kit de
deteccin LSI TAQVET de granja 2
La eficacia de este mtodo se puede verificar con la curva amplificada que corresponde al
IPC (control positivo interno) ilustrada en las Fotografas 3 y 4. Se observaron en estas
fotografas que en los pollos de granja 1 y granja 2, estn presentes las bacterias M.
gallisepticum y M. synoviae.
Sistemas de extraccin 3: Extraccin de ADN bacteriano mediante el mtodo
clsico usando un buffer de lisis y amplificacin - deteccin por el kit Multiplex
Aviar Micoplasma de la firma LSI TaqVet. La Fotografa 5 muestra la curva de
amplificacin Mycoplasma gallisepticum (Mg) y Mycoplasma synoviae (Ms) de la granja 1 y la
Fotografa 6 de la granja 2.

Fotografa 5. Resultados de la amplificacin

y deteccin de Mg y Ms utilizando el mtodo
de extraccin clsico con buffer de lisis y kit
de diagnostico LSI TAQVET de granja 1

Fotografa 6. Resultados de la amplificacin

y deteccin de Mg y Ms utilizando el mtodo
de extraccin clsico con buffer de lisis y kit
de diagnstico LSI TAQVET de granja 2.
Este mtodo demostr ser eficaz, lo cual se verific con la amplificacin del IPC que se
observ en las Fotografas 5 y 6. En estas fotografas tambin se observaron la amplificacin
de las curvas que corresponden a las bacterias de M. gallisepticum y M. synoviae.

No se observ diferencia grfica con el mtodo de extraccin del kit comercial.

Deteccin simultanea de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae por
PCR en tiempo real mediante el sistema Syber green utilizando un kit de
diagnstico molecular elaborado en el Laboratorio de Biologa Molecular de
PROINPA. En este ensayo se combin dos pares de iniciadores (Mg y Ms) usando en el
sistema Syber Green por la tcnica PCR en tiempo real. SYBR Green acta intercalndose a
la doble hlice de ADN.
Se realiz el diagnstico molecular de M. gallisepticum y M. synoviae simultneamente
usando el kit elaborado por el laboratorio de Biologa Molecular y Bioinformtica PROINPA
realizando las pruebas con los diferentes mtodos de extraccin.
Con el Kit de extraccin Qiagen los resultados que se obtuvieron fueron favorables, y
reproducibles con los resultados obtenidos con el sistema Taqman.
En la Fotografas 7 y 8 se observaron las curvas de disociacin, que permiten diferenciar
entre M. gallisepticum y M. synoviae en funcin a la temperatura de disociacin (Tm).

Fotografa 7. Curvas de fusin obtenidas

utilizando el kit de extraccin Qiagen y el kit
de deteccin molecular elaborado por el
laboratorio de Biologa Molecular PROINPA de
granja 1

Fotografa
8.
Curvas
de
disociacin
obtenidas utilizando el kit de extraccin
Qiagen y el kit de deteccin molecular
elaborado por el laboratorio de Biologa
Molecular PROINPA de granja 2
Con el mtodo de extraccin choque trmico tambin se observ las curvas de amplificacin
en las Fotografas 9 y 10, pero en las curvas de disociacin slo se observ para M.
gallisepticum tanto en la granja 1 como en la granja 2 y no se ilustra la curva de disociacin
para M. synoviae, debido a que con el mtodo extraccin, el ADN obtenido no cuenta con la
suficiente concentracin para la deteccin molecular de Mycoplasmosis aviar usando el
sistema Syber Green.

Fotografa 9. Curvas de disociacin

obtenidas utilizando el mtodo de extraccin

choque trmico y el kit de deteccin
molecular elaborado por el laboratorio de
Biologa Molecular PROINPA de granja 1

Fotografa
10.
Curvas
de
obtenidas
utilizando el mtodo de extraccin choque
trmico y el kit de deteccin molecular
elaborado por el laboratorio de Biologa
Molecular PROINPA de granja 2.
Las muestras de la granja 1 y 2 extradas por el mtodo convencional usando un buffer de
lisis y procesadas por el kit elaborado en el laboratorio de Biologa Molecular de PROINPA
usando el sistema Syber Green dieron resultados positivos a M. gallisepticum y M. synoviae.
En las Fotografas 11 y 12 se observaron las curvas de disociacin y una temperatura de
disociacin diferente tanto para M. gallisepticum y M. synoviae.
Este mtodo de extraccin result ser eficiente y especfico para el diagnstico molecular de
Micoplasmosis aviar.

Fotografa 11. Curvas de disociacin

obtenidas utilizando el mtodo de extraccin
clsico con buffer de lisis y el kit de deteccin
molecular elaborado por el laboratorio de
Biologa Molecular PROINPA de granja 1.

Fotografa 12. Curvas de disociacin

obtenidas utilizando el mtodo de extraccin
clsico con buffer de lisis y el kit de deteccin
molecular elaborado por el laboratorio de
Biologa Molecular PROINPA de granja 2.

DISCUSIN

Los resultados obtenidos utilizando el kit comercial Qiagen mostraron que dicho kit es eficaz,
lo cual se verifica con la amplificacin de la curva del control positivo interno (IPC) ilustradas
en las Fotografas 1 y 2.
Otra ventaja de este kit es que el proceso de extraccin es corto. La extraccin de ADN por
el kit Mini Quiamp ADN de la firma Qiagen es un mtodo eficaz y presenta una sensibilidad
cercana al 100 %10.
Con el mtodo de extraccin choque trmico se observaron que las curvas de amplificacin
no tienen diferencia grfica comparando con las obtenidas por el kit.
Choque trmico es un mtodo sencillo y el ADN obtenido por este mtodo dio buenos
resultados al ser usado por la tcnica PCR en tiempo real7.
Tambin se utiliz un mtodo de extraccin clsico utilizando un buffer de lisis. De esta
forma se obtuvo buenos resultados, lo que se verific grficamente con las curvas
amplificadas del IPC (control interno positivo) y los patgenos Mg y Ms. El mtodo clsico
resulto ser eficaz, ya que el ADN extrado presenta una buena pureza con una relacin
A260/A280 igual 1.89.
Los reactivos utilizados en el mtodo de extraccin convencional con un buffer de lisis no son
de alto precio en comparacin al Kit de extraccin Mini Qiamp ADN de la firma Qiagen.
El sistema Taqman ha demostrado ser muy especifico y sensible en la deteccin de M.
gallisepticum y M. synoviae como se observan en los resultados obtenidos usando los
diferentes mtodos de extraccin y la aplicacin del kit comercial (kit Multiplex Aviar
Micoplasma de la firma LSI TaqVet)10.
La tcnica PCR en tiempo real usando el sistema Taqman, presenta una alta especificidad ya
que tiene un sonda interna, existe sensibilidad y reproducibilidad de los resultados
verificndose con la deteccin de M. gallisepticum en muestras clnicas del tracto
respiratorio1,10.
Comparando los dos sistemas de PCR en tiempo real, los resultados obtenidos en este
estudio muestran una elevada equivalencia entre el sistema SYBR Green y el sistema
TaqMan. Estos resultados coinciden con estudios recientes para la deteccin de
Staphylococcus aureus11,12, mientras que discrepan con los resultados de un estudio similar
en el que se obtiene una mayor sensibilidad con el sistema TaqMan desarrollado para
Staphylococcus aureus en queso9. Sin embargo encuentran ms sensible el sistema de SYBR
Green desarrollado para Staphylococcus aureus que el sistema TaqMan11. Este caso podra
deberse a la optimizacin de la reaccin, puesto que el SYBR Green emite ms fluorescencia
por amplificado que las sondas TaqMan, por lo que el nivel umbral de fluorescencia se
alcanza mucho antes obteniendo valores de CT menores. As mismo, el sistema SYBR Green
desarrollado por Fricker13 para cepas emticas de Bacilus cereus result 10 veces ms
sensible que el sistema TaqMan, lo que podra explicarse por la influencia de utilizar
diferentes oligonucletidos para cada sistema.
En conclusin, el servicio comercial de diagnstico molecular de enfermedades aviares
perteneciente al laboratorio de Biologa Molecular de la Fundacin PROINPA, cuenta con tres
mtodos de extraccin de ADN bacteriano, los cuales fueron optimizados para extraer un
ADN de buena calidad que no presente problemas durante la amplificacin deteccin de
patgenos por la tcnica PCR en tiempo real.
El mtodo de Qiagen empleado para la extraccin de ADN ha funcionado satisfactoriamente,
sin necesidad de tratamientos previos, para la extraccin de ADN de los patgenos M.
gallisepticum y M. synoviae.
Entre los mtodos convencionales probados, choque trmico es un mtodo corto por PCR en

tiempo real mediante el sistema Taqman los resultados fueron reproducibles a comparacin
de las muestras extradas con el Kit comercial Qiagen. El sistema Syber green no present
buenos resultados.
El mtodo clsico result ser el mejor mtodo utilizado en comparacin a choque trmico y
choque trmico con resina, tomando en cuenta: calidad de ADN, sensibilidad del mtodo y
costo del anlisis molecular. Con las curvas amplificadas, se verific que la calidad del ADN
es similar a las extradas por el kit comercial Qiagen.
Los dos sistemas empleados para la deteccin molecular de M. gallisepticum y M. synoviae,
SYBR Green y TaqMan, ofrecen niveles similares de cuantificacin y sensibilidad.
No obstante, se propone el sistema de SYBR Green desarrollado por el Laboratorio de
Biologa Molecular de la Fundacin PROINPA que tienen un costo menor a comparacin del
sistema Taqman, lo que representa una ventaja en el anlisis rutinario de un elevado
nmero de muestras.

AGRADECIMIENTOS
A la Fundacin PROINPA por el financiamiento de este trabajo; a la Facultad de Bioqumica y
Farmacia.

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2015 2007 Colegio de Bioqumica y Farmacia de Bolivia

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BIOFARBO
versin impresa ISSN 1813-5363
BIOFARBO v.19 n.1 La Paz jun. 2011
ARTICULO ORIGINAL

Desarrollo de un servicio comercial de diagnstico

molecular de enfermedades en pollos de granja (Gallus
gallus)
Development of a commercial molecular diagnosis for disease in
chickens(Gallus gallus)
Marisol Campero M.1, Zulema Bustamante G.1, Silene Veramendi T.2, Jorge Rojas B.2
1

Facultad de Ciencias Bioqumicas y Farmacuticas, Universidad Mayor de San Simn.

Cochabamba, Bolivia.
2
Laboratorio de Biologa Molecular y Bioinformtica PROINPA. Cochabamba, Bolivia.

Direccin para correspondencia: Marisol Campero Montano. Facultad de Ciencias Bioqumicas

y Farmacuticas, Universidad Mayor de San Simn. Cochabamba, Bolivia. Telfonos:
79377447, 4408474, 4577455 E mail: yazidsol@hotmail.com
Recibido para publicacin en 27/01/11

Aceptado en 18/06/11
RESUMEN
La produccin de pollos de granja es una de las actividades ms difundidas en el
departamento
de
Cochabamba-Bolivia,
donde
los
productores
se
encuentran
permanentemente frente a grandes desafos cmo la aparicin de nuevas enfermedades
como la micoplasmosis causada por Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae. La
micoplasmosis causa grandes prdidas econmicas debido a que esta enfermedad se
propaga muy rpido. Hoy en da el diagnstico de estos patgenos se realiza por mtodos
serolgicos, sin embargo, estas tcnicas consumen mucho tiempo y a veces conducen a
identificaciones errneas. Las tcnicas moleculares basadas en PCR en tiempo real son ms
ventajosas que las tcnicas serolgicas, ya que son rpidas, sensibles y especficas. Adems
pueden ser econmicas en el anlisis de diversos patgenos en un nico ensayo (PCR
multiplex). En este estudio se compararon los diferentes mtodos para el diagnstico
molecular de M. gallisepticum y M. synoviae a fin de establecer un servicio comercial. Para
realizar este trabajo, se utilizaron muestras de hisopado traqueal, tomadas de las vas
respiratorias. Se extrajo ADN por tres mtodos (kit de extraccin Mini Qiamp ADN de la
firma Qiagen, mtodo de choque trmico y mtodo convencional con buffer de lisis) y luego
fueron analizados por un kit comercial (lsi TaqVet) y el uso de un kit de diagnstico
molecular desarrollado en este estudio. El mtodo de extraccin con un buffer de lisis, junto
con el kit de diagnstico molecular desarrollado en este estudio gener resultados ptimos
es decir se demostr mejor especificidad, sensibilidad y bajo costo.
Palabras Clave: PCR en tiempo real, Taqman, SyberGreen, diagnstico, Mycoplasma.
ABSTRACT
Poultry breeding is one of the most widespread activity in the department of CochabambaBolivia, where producers are permanently facing major challenges as the emergence of new
diseases like mycoplasmosis caused by Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma
synoviae. Mycoplamosis causes significant economic losses because this disease spreads
very fast. Today the diagnosis of these pathogens is performed by serological methods;
however, these techniques are time consuming and sometimes lead to misidentifications.
Molecular techniques based on real-time PCR are more advantageous than serological
techniques as they are rapid, sensitive and specific. Moreover they can be less expensive
when analyzing various pathogens in a single assay (multiplex PCR). The aim of this study
was to compare the different methods for molecular diagnosis of M. gallisepticum and M.
synoviae to establish a commercial service. To achieve this goal, we used tracheal swab
samples obtained from the airways. DNA was extracted by three methods (kit DNA
extraction Mini signature Qiamp Qiagen, heat shock method and conventional method of
lysis buffer) and then the samples were analyzed by a commercial kit (LSI TaqVet) and by a
molecular diagnostic kit developed in this study. The method of extraction with a lysis buffer
together with the molecular diagnostic kit developed in this study generated the best results
and demonstrated better specificity, sensitivity and low cost for the molecular diagnosis of
avian mycoplasmosis .
Key Words: Real-time PCR, Taqman, SyberGreen, diagnostic, Mycoplasma

INTRODUCCIN
Cochabamba es uno de los departamentos donde la produccin avcola es una de las ms
difundidas e importantes. El productor avcola frecuentemente se enfrenta a la aparicin y

difusin de enfermedades, entre stas Mycoplasmosis aviar. Esta es una enfermedad

respiratoria que provoca prdidas econmicas significativas en las granjas avcolas de
Cochabamba.
La Mycoplasmosis aviar se detecta clsicamente mediante mtodos serolgicos, pero dichos
mtodos no presentan una alta especificidad y sensibilidad. Tambin se requiere que la
enfermedad evolucione para ser detectada, es decir que con las pruebas serolgicas no se
pude detectar Mycoplasmosis aviar en la etapa de incubacin de dicha enfermedad. Otra
desventaja de dichas pruebas es la presencia de falsos negativos o falsos positivos.1,2
El diagnstico molecular es un mtodo de deteccin de enfermedades, que permite
identificar el agente patgeno con criterios genotpicos. El mismo, permite un diagnstico
precoz de las enfermedades, pudiendo realizarse una deteccin pre sintomtica,
proporcionando de esta manera beneficios mltiples para el paciente.3
La PCR en tiempo real tiene varias ventajas sobre el mtodo clsico serolgico. Es una
tcnica ms sensible porque permite procesar muestras biolgicas muy pequeas, con una
especificidad elevada ya que detecta secuencias genticas presentes en el patgeno y es
rpida dado que la amplificacin y la deteccin se producen en el mismo tubo de reaccin,
sin precisarse ninguna manipulacin posterior que pueda contaminar la muestra.4,5,6
El objetivo de esta investigacin es desarrollar un servicio comercial de diagnstico
molecular mediante PCR en tiempo real para Mycoplasmosis aviar adaptando un mtodo de
extraccin convencional y desarrollando un kit de diagnstico molecular propio y reduciendo
de esta manera los costos en pruebas moleculares por la tcnica PCR en tiempo real.

MATERIAL Y MTODOS
Toma de muestra para la extraccin de ADN bacteriano. Las muestras se tomaron de
dos granjas de pollos (1 y 2) ubicadas en el departamento de Cochabamba, provincia
Cercado a 2.558 metros sobre el nivel del mar.
La poblacin fue escogida en funcin al diagnstico presuntivo.
Para la toma de muestras se utilizaron hisopos estriles, dichos hisopos fueron introducidos
en la trquea del pollo hasta ser completamente embebidos de secrecin traqueal y despus
fueron depositados en 1 ml de solucin PBS para la conservacin de la muestra hasta su
posterior proceso.
Antes del proceso de extraccin se realiz un paso previo que es la preparacin de muestras,
en esta etapa se centrifugaron las muestras a 10000 rpm, para asegurar que estn libres
completamente del hisopo y luego se retiran los hisopos, dejando en los tubos slo la
muestra.
Despus se agruparon las muestras de esta manera: se sac un alcuota de 1 ml de cada
tubo para formar el pool de 30 muestras y este pool fue procesado como si fuese una sola
muestra y para la extraccin por los diferentes mtodos se sac un alcuota de 600 l o 1 ml
del pool de 30 muestras, la cantidad depende del mtodo de extraccin a usar.
Extraccin de ADN bacteriano por el kit comercial Mini Qiamp ADN de la firma
Qiagen. A partir del pool de 30 muestras se toma una alcuota de 600 l, a partir de la cual
se ha extrado ADN bacteriano utilizando el kit Mini Qiamp ADN de la firma Qiagen siguiendo
las recomendaciones del fabricante (Handobook Quiagen).
Extraccin de ADN bacteriano por choque trmico. Del pool de 30 muestras se retir
una alcuota de 1 ml de muestra, se centrifug a 10000 rpm durante 20 minutos. Se lav el
pellet tres veces con 1 ml de PBS, se centrifug 10 minutos a 10000 rpm. Tras el ltimo
lavado se re suspendi el pellet en 25 l de PBS, se someti a un choque trmico: 10
minutos a 100 C y 10 minutos en hielo. Por ltimo se centrifug 5 minutos a 10000 rpm,
pasando el sobrenadante a otro tubo. En este se encuentra el ADN preparado listo para su

estudio7
Extraccin de ADN bacteriano por el mtodo clsico utilizando un buffer de lisis.
Del pool de 30 muestras se tom un alcuota de 1,5 ml. Se sigui el protocolo de extraccin
de ADN bacteriano descrito por Zacco 8, al cual se realiz modificaciones en la cantidad de los
reactivos a usar, adaptndolas al volumen de muestra.
En el protocolo original el volumen de muestra era de 50 ml; entonces los reactivos
estuvieron en funcin a este volumen, por ejemplo para el primer reactivo que es el buffer
de lisis, se utiliz 10 ml. En el protocolo modificado, el volumen de muestra fue de 1.5 ml y
la cantidad de buffer de lisis a usar es de 800 l.
Amplificacin y deteccin del ADN bacteriano con el sistema TAQMAN. Para la
deteccin simultnea de estos dos patgenos se utiliz el kit Multiplex Aviar Micoplasma de
la firma LSI TaqVet siguiendo el protocolo de amplificacin descrito por el fabricante (LSI
TaqVet).
Seleccin de iniciadores que van a ser usados en la elaboracin del kit de
diagnstico molecular de PROINPA. Para la seleccin de iniciadores se realiz una
revisin bibliogrfica de trabajos de investigacin. La secuencia de los cebadores utilizados
en este trabajo se encuentra en la Tabla 1.

Tabla 1. Secuencia de cebadores para

Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma
synoviae5

Amplificacin por PCR en tiempo real usando el sistema Syber Green con el kit de
diagnstico molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae
elaborado por el laboratorio de Biologa Molecular PROINPA. La amplificacin por PCR
en tiempo real usando el fluorocromo SYBR Green se realiz con 5 l de ADN molde y un
volumen final de reaccin de 15 l. Los diferentes reactivos se prepararon en dos soluciones
diferentes, que fueron preparadas para la deteccin simultnea de Mycoplasma gallisepticum
y Mycoplasma synoviae.
Para el anlisis de las curvas de disociacin, se aadi un ciclo en el que tiene lugar un
incremento paulatino de temperatura desde 55 a 90 C, durante 35 min.

RESULTADOS
Sistemas de extraccin 1: Extraccin de ADN bacteriano mediante el kit Mini Qiamp
ADN de la firma Qiagen y amplificacin - deteccin por el kit Multiplex Aviar
Mycoplasma de la firma LSI TaqVet. En la Fotografa 1 se muestra la curva de
amplificacin Mycoplasma gallisepticum (Mg) y Mycoplasma synoviae (Ms) de la granja 1 y
en la Fotografa 2, se muestra la curva de amplificacin de la granja 2.

Fotografa 1. Resultados de la amplificacin

y deteccin de Mg y Ms utilizando un kit de
extraccin Qiagen y kit de deteccin LSI
TAQVET de granja 1

Fotografa 2. Resultados de la amplificacin

y deteccin de Mg y Ms utilizando un kit de
extraccin Qiagen y kit de deteccin LSI
TAQVET de granja 2
Tambin se observ la amplificacin de una curva que corresponde al control positivo interno
(IPC), con este control se verific que la extraccin fue eficaz.
Se observ tambin una lnea recta horizontal donde se encuentra el punto de interseccin
de una curva de amplificacin con el umbral, denominada Ct (Threshold Cycle). Este punto
indica el ciclo en el que la fluorescencia alcanza el valor umbral.

En la Fotografa 1 se observ que para Mycoplasma gallisepticum se tiene un ct de 30,23 y

para Mycoplasma synoviae un ct de 31,5. En la Fotografa 2 Mycoplasma gallisepticum
presenta un ct 27,22 y Mycoplasma synoviae un ct de 31,10.
Sistemas de extraccin 2: Extraccin de ADN bacteriano por choque trmico y
amplificacin -deteccin por el kit Multiplex Aviar Mycoplasma de la firma LSI
TaqVet. En la Fotografa 3 se observ curvas de amplificacin para Mycoplasma
gallisepticum (Mg) y Mycoplasma synoviae (Ms) de la granja 1 y en la Fotografa 4 se
observ los resultados de la granja 2.

Fotografa 3. Resultados de la amplificacin

y deteccin de Mg y Ms utilizando el mtodo
de extraccin choque trmico y kit de
deteccin LSI TAQVET de granja 1

Fotografa 4. Resultados de la amplificacin

y deteccin de Mg y Ms utilizando el mtodo
de extraccin choque trmico y kit de
deteccin LSI TAQVET de granja 2
La eficacia de este mtodo se puede verificar con la curva amplificada que corresponde al
IPC (control positivo interno) ilustrada en las Fotografas 3 y 4. Se observaron en estas
fotografas que en los pollos de granja 1 y granja 2, estn presentes las bacterias M.
gallisepticum y M. synoviae.
Sistemas de extraccin 3: Extraccin de ADN bacteriano mediante el mtodo
clsico usando un buffer de lisis y amplificacin - deteccin por el kit Multiplex
Aviar Micoplasma de la firma LSI TaqVet. La Fotografa 5 muestra la curva de
amplificacin Mycoplasma gallisepticum (Mg) y Mycoplasma synoviae (Ms) de la granja 1 y la
Fotografa 6 de la granja 2.

Fotografa 5. Resultados de la amplificacin

y deteccin de Mg y Ms utilizando el mtodo
de extraccin clsico con buffer de lisis y kit
de diagnostico LSI TAQVET de granja 1

Fotografa 6. Resultados de la amplificacin

y deteccin de Mg y Ms utilizando el mtodo
de extraccin clsico con buffer de lisis y kit
de diagnstico LSI TAQVET de granja 2.
Este mtodo demostr ser eficaz, lo cual se verific con la amplificacin del IPC que se
observ en las Fotografas 5 y 6. En estas fotografas tambin se observaron la amplificacin
de las curvas que corresponden a las bacterias de M. gallisepticum y M. synoviae.

No se observ diferencia grfica con el mtodo de extraccin del kit comercial.

Deteccin simultanea de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae por
PCR en tiempo real mediante el sistema Syber green utilizando un kit de
diagnstico molecular elaborado en el Laboratorio de Biologa Molecular de
PROINPA. En este ensayo se combin dos pares de iniciadores (Mg y Ms) usando en el
sistema Syber Green por la tcnica PCR en tiempo real. SYBR Green acta intercalndose a
la doble hlice de ADN.
Se realiz el diagnstico molecular de M. gallisepticum y M. synoviae simultneamente
usando el kit elaborado por el laboratorio de Biologa Molecular y Bioinformtica PROINPA
realizando las pruebas con los diferentes mtodos de extraccin.
Con el Kit de extraccin Qiagen los resultados que se obtuvieron fueron favorables, y
reproducibles con los resultados obtenidos con el sistema Taqman.
En la Fotografas 7 y 8 se observaron las curvas de disociacin, que permiten diferenciar
entre M. gallisepticum y M. synoviae en funcin a la temperatura de disociacin (Tm).

Fotografa 7. Curvas de fusin obtenidas

utilizando el kit de extraccin Qiagen y el kit
de deteccin molecular elaborado por el
laboratorio de Biologa Molecular PROINPA de
granja 1

Fotografa
8.
Curvas
de
disociacin
obtenidas utilizando el kit de extraccin
Qiagen y el kit de deteccin molecular
elaborado por el laboratorio de Biologa
Molecular PROINPA de granja 2
Con el mtodo de extraccin choque trmico tambin se observ las curvas de amplificacin
en las Fotografas 9 y 10, pero en las curvas de disociacin slo se observ para M.
gallisepticum tanto en la granja 1 como en la granja 2 y no se ilustra la curva de disociacin
para M. synoviae, debido a que con el mtodo extraccin, el ADN obtenido no cuenta con la
suficiente concentracin para la deteccin molecular de Mycoplasmosis aviar usando el
sistema Syber Green.

Fotografa 9. Curvas de disociacin

obtenidas utilizando el mtodo de extraccin

choque trmico y el kit de deteccin
molecular elaborado por el laboratorio de
Biologa Molecular PROINPA de granja 1

Fotografa
10.
Curvas
de
obtenidas
utilizando el mtodo de extraccin choque
trmico y el kit de deteccin molecular
elaborado por el laboratorio de Biologa
Molecular PROINPA de granja 2.
Las muestras de la granja 1 y 2 extradas por el mtodo convencional usando un buffer de
lisis y procesadas por el kit elaborado en el laboratorio de Biologa Molecular de PROINPA
usando el sistema Syber Green dieron resultados positivos a M. gallisepticum y M. synoviae.
En las Fotografas 11 y 12 se observaron las curvas de disociacin y una temperatura de
disociacin diferente tanto para M. gallisepticum y M. synoviae.
Este mtodo de extraccin result ser eficiente y especfico para el diagnstico molecular de
Micoplasmosis aviar.

Fotografa 11. Curvas de disociacin

obtenidas utilizando el mtodo de extraccin
clsico con buffer de lisis y el kit de deteccin
molecular elaborado por el laboratorio de
Biologa Molecular PROINPA de granja 1.

Fotografa 12. Curvas de disociacin

obtenidas utilizando el mtodo de extraccin
clsico con buffer de lisis y el kit de deteccin
molecular elaborado por el laboratorio de
Biologa Molecular PROINPA de granja 2.

DISCUSIN

Los resultados obtenidos utilizando el kit comercial Qiagen mostraron que dicho kit es eficaz,
lo cual se verifica con la amplificacin de la curva del control positivo interno (IPC) ilustradas
en las Fotografas 1 y 2.
Otra ventaja de este kit es que el proceso de extraccin es corto. La extraccin de ADN por
el kit Mini Quiamp ADN de la firma Qiagen es un mtodo eficaz y presenta una sensibilidad
cercana al 100 %10.
Con el mtodo de extraccin choque trmico se observaron que las curvas de amplificacin
no tienen diferencia grfica comparando con las obtenidas por el kit.
Choque trmico es un mtodo sencillo y el ADN obtenido por este mtodo dio buenos
resultados al ser usado por la tcnica PCR en tiempo real7.
Tambin se utiliz un mtodo de extraccin clsico utilizando un buffer de lisis. De esta
forma se obtuvo buenos resultados, lo que se verific grficamente con las curvas
amplificadas del IPC (control interno positivo) y los patgenos Mg y Ms. El mtodo clsico
resulto ser eficaz, ya que el ADN extrado presenta una buena pureza con una relacin
A260/A280 igual 1.89.
Los reactivos utilizados en el mtodo de extraccin convencional con un buffer de lisis no son
de alto precio en comparacin al Kit de extraccin Mini Qiamp ADN de la firma Qiagen.
El sistema Taqman ha demostrado ser muy especifico y sensible en la deteccin de M.
gallisepticum y M. synoviae como se observan en los resultados obtenidos usando los
diferentes mtodos de extraccin y la aplicacin del kit comercial (kit Multiplex Aviar
Micoplasma de la firma LSI TaqVet)10.
La tcnica PCR en tiempo real usando el sistema Taqman, presenta una alta especificidad ya
que tiene un sonda interna, existe sensibilidad y reproducibilidad de los resultados
verificndose con la deteccin de M. gallisepticum en muestras clnicas del tracto
respiratorio1,10.
Comparando los dos sistemas de PCR en tiempo real, los resultados obtenidos en este
estudio muestran una elevada equivalencia entre el sistema SYBR Green y el sistema
TaqMan. Estos resultados coinciden con estudios recientes para la deteccin de
Staphylococcus aureus11,12, mientras que discrepan con los resultados de un estudio similar
en el que se obtiene una mayor sensibilidad con el sistema TaqMan desarrollado para
Staphylococcus aureus en queso9. Sin embargo encuentran ms sensible el sistema de SYBR
Green desarrollado para Staphylococcus aureus que el sistema TaqMan11. Este caso podra
deberse a la optimizacin de la reaccin, puesto que el SYBR Green emite ms fluorescencia
por amplificado que las sondas TaqMan, por lo que el nivel umbral de fluorescencia se
alcanza mucho antes obteniendo valores de CT menores. As mismo, el sistema SYBR Green
desarrollado por Fricker13 para cepas emticas de Bacilus cereus result 10 veces ms
sensible que el sistema TaqMan, lo que podra explicarse por la influencia de utilizar
diferentes oligonucletidos para cada sistema.
En conclusin, el servicio comercial de diagnstico molecular de enfermedades aviares
perteneciente al laboratorio de Biologa Molecular de la Fundacin PROINPA, cuenta con tres
mtodos de extraccin de ADN bacteriano, los cuales fueron optimizados para extraer un
ADN de buena calidad que no presente problemas durante la amplificacin deteccin de
patgenos por la tcnica PCR en tiempo real.
El mtodo de Qiagen empleado para la extraccin de ADN ha funcionado satisfactoriamente,
sin necesidad de tratamientos previos, para la extraccin de ADN de los patgenos M.
gallisepticum y M. synoviae.
Entre los mtodos convencionales probados, choque trmico es un mtodo corto por PCR en

tiempo real mediante el sistema Taqman los resultados fueron reproducibles a comparacin
de las muestras extradas con el Kit comercial Qiagen. El sistema Syber green no present
buenos resultados.
El mtodo clsico result ser el mejor mtodo utilizado en comparacin a choque trmico y
choque trmico con resina, tomando en cuenta: calidad de ADN, sensibilidad del mtodo y
costo del anlisis molecular. Con las curvas amplificadas, se verific que la calidad del ADN
es similar a las extradas por el kit comercial Qiagen.
Los dos sistemas empleados para la deteccin molecular de M. gallisepticum y M. synoviae,
SYBR Green y TaqMan, ofrecen niveles similares de cuantificacin y sensibilidad.
No obstante, se propone el sistema de SYBR Green desarrollado por el Laboratorio de
Biologa Molecular de la Fundacin PROINPA que tienen un costo menor a comparacin del
sistema Taqman, lo que representa una ventaja en el anlisis rutinario de un elevado
nmero de muestras.

AGRADECIMIENTOS
A la Fundacin PROINPA por el financiamiento de este trabajo; a la Facultad de Bioqumica y
Farmacia.

REFERENCIAS
1. RavivA Z. y Kleven S. The Development of diagnostic real-time TaqMan PCRs for the four
pathogenic avian mycoplasmas. Avian Diseases. 2008; 53.
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3. Oliva Virgili R. Gentica Mdica. 3ra ed. Barcelona: Universitat; 2004.
4. Guarner C. Hepatitis C. Barcelona: Marge Books; 2007.

[ Links ]

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